DE889824C - Verfahren zur Herstellung von reinem Toxoplasma-Antigen - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung von reinem Toxoplasma-Antigen Man hat bereits versucht, Antigene für die Toxoplasmose-Komplementbindungsreaktion herzustellen, da der Nachweis der Toxoplasmose mittels anderer Teste, z.B. dem Kaninchenhauttest und dem Serofarbtest nach Satin und Feldman, entweder nicht genügend zuverlässig oder technisch für die Routineuntersuchung nicht durchführbar ist. Die bisherigen Extrakte aus infizierten Organen (Milz, Leber, Gehirn) oder aus infiziertem Peritonealexsudat riefen jedoch infolge ihres Gehalts an Wirtsgewebe unspezifische Reaktionen hervor. Auch Antigenextrakte aus infizierter Chorioallantois des Hühnereies waren wegen ihrer technisch schwierigen Herstellung, der Notwendigkeit des Aufbewahrens bei 7200 und dem Vorhandensein von zahlreichen Ballaststoffen nicht den Anforderungen der Praxis gewachsen.
• Es wurde nun gefunden, daß man reines Toxoplasma-Antigen für die Komplementbindungsreaktion und für eine Dermalreaktion beim Patienten herstellen kann, indem man Exsudat von toxoplasmainfizierten Tieren, zweckmäßig Peritonealexsudat von Mäusen, bereits intraperitoneal mit Alkalicitrat vermischt, die citrathaltige Mischung durch mehrmalige Filtration und Verreibung der Rückstände in eine feine citrathaltige Zellsuspension verwandelt, diese zentrifugiert, den zelligen Bodensatz wieder in Citratlösung zu einer feinen Zellsuspension aufnimmt, die bis zur Zerstörung des Protoplasmas der Wirtszellen und zur vollständigen Zusammenballung der Wirtszellkerne mit Ultraschall behandelt wird. Durch Filtration und anschließendes Zentrifugieren werden die in der Suspension frei verbliebenen Toxoplasmen von den geballten bzw. gelösten Wirtszellbestandteilen befreit. Die so gereinigten Toxoplasmen werden in physiologischer Kochsalzlösung wieder suspendiert, durch intensive Beschallung völlig aufgeschlossen und in an sich bekannter Weise extrahiert, wobei zweckmäßig eine Eiweißdenaturierung mittels Phenolzusatz und Erwärmung der antigenhaltigen Lösung auf etwa 56 mit anschließender Zentrifugierung eingeschaltet wird.
• Da auf diese Weise praktisch reine Toxoplasmen zur Extraktgewinnung dienen, entfällt die Notwendigkeit der Kontrollreaktion, wie es z. B. mit dem Antigenextrakt aus Chorioallantois erforderlich war. Der Extrakt wird so stabilisiert, daß er für längere Zeit unter normalen Bedingungen haltbar ist. Die Herstellung ist technisch einfach und wirtschaftlich. Der reagierende Antikörper erweist sich auch bei Serumeinsendungen als stabil.
• Das gGrundprinzip der Gewinnung reiner Toxoplasmen ist hierbei die fraktionierte Anwendung von Ultraschall, wobei z. B. die Leuko- und Histiocyten des infizierten Peritonealexsudats der Versuchstiere leichter zerstört und aufgelöst werden als die Toxoplasmen. Dieses Prinzip wird verbunden mit einer Kolloidionisierung durch Citrationen.
• Bei den Leukocyten werden durch die fraktionierte Beschallung die äußeren, negativ geladenen Plasmabestandteile aufgelöst. Durch die Anlagerung der negativen Citrationen an die positiven, inneren Leukocytenreste, also vorwiegend an die Zellkerne, werden diese in den Bereich ihres isoelektrischen Punktes gebracht, so daß sie infolge der lebhaften Bewegung im Ultraschallkegel in kürzester Zeit zu einem klebrigen, schnell an die Oberfläche steigenden weißen Schaum zusammenballen. Sonstige restliche Gewebeteile sinken schnell zu Boden. Die gegen Ultraschall widerstandsfähigeren Toxoplasmen erfahren durch die Anlagerung der Citrationen lediglich eine Verstärkung ihrer negativen Oberflächenladung. Darum verbleiben sie in der sich klärenden Flüssigkeitssäule fein suspendiert. Einschließlich der Zelltrennung durch Kombination der fraktionierten Beschallung und Zellkolloidionisierung sind sieben Reinigungsprozesse in die hier zu besprechende Extraktherstellung eingebaut.
• Beispiel 1 Gesunde, große vveiße Mäuse werden intraperitoneal mit Toxoplasma gondii infiziert. Als Infektionsmaterial dient eine parasitenreiche Aufschwemmung des Peritonealexsudats weißer Mäuse, die mit einem adaptierten, virulenten Stamm beimpft wurden. Die Antigenmäuse werden mit etwa 0,5 ccm Exsudataufschwemmung i. p. infiziert. Die Entnahme des parasitenreichen Peritonealexsudats der Antigenmäuse erfolgt im Höhepunkt der Parasitenentwicklung, im vorliegenden Fall am dritten Tag. Hierfür werden die Mäuse in Äther oder Chloroform getötet und in Rückenlage auf einem Brett mit Nadeln aufgespannt. Mittels einer 2- bis 3-ccm-Spritze werden jetzt 2 ccm einer 3,80/oigen wäßrigen Natriumcitratlösung (neutrales Natriumcitraf) durch das Fell hindurch in den Peritonealraum injiziert. Durch leichte Massage wird das vorhandene Exsudat mit der Citratlösung vermengt und mittels derselben Spritze wieder entnommen. Durch nochmalige Injektion und Em:-nahme von etwa 0,5 bis I,0 ccm Na-citrat erfolgt die vollständige Ausschwemmung und Entleerung des Peritonealraumes. Das Exsudat jeder Maus wird im Frischpräparat auf Parasitengehalt und Reinheit geprüft, bevor es in Reagenzgläsern gesammelt wird.
• Die erste Reinigung der Exsudataufschwemmungen erfolgt mittels Filtration durch feine Drahtgaze. Die auf dem Sieb verbleibenden Exsudatklumpen können noch zahlreiche Parasiten enthalten. Sie werden darum entweder mittels eines geeigneten Glaspistills auf dem Sieb verrieben und mit Natriumcitratlösung weiterhin filtriert. Die Zerkleinerung kann auch durch wiederholte Füllung und Entleerung einer so-ccm-Spritze mit der Restaufschwemmung in Natriumcitrat oder bei größeren Mengen auch durch ein geeignetes Rührsystem erfolgen. Die gesamte Exsudataufschwemmung wird nochmals durch die feinmaschige Drahtgaze filtriert, so daß tatsächlich nur eine feine Zellsuspension weiterverarbeitet wird.
• Die zweite Reinigung erfolgt durch Zentrifugieren dieser Zellsuspension in 50- bis Ioo-ccm-Zentrifugengläsern, 20 Minuten bei 3500 bis 4000 Umdrehungen pro Minute. Durch anschließendes Abgießen der gesamten Flüssigkeit werden alle gelösten Bestandteile von den im Bodensatz verbleibenden zelligen Elementen entfernt.
• Die dritte Reinigung ist die Haupt reinigung des Antigens. Der verbleibende zellige Bodensatz wird wiederum in 3,80/oiger Natriumcitratlösung fein suspendiert. Hierfür wird der Bodensatz des Exsudats von je fünf Mäusen mit etwa 4 ccm Natriumcitrat überschichtet. Durch wiederholtes schnelles Aufsaugen und Ausspritzen der Lösung mittels einer 5o-ccm-Spritze mit festsitzender weiter Kanüle gelingt die Suspendierung leicht. Die so gewonnenen Suspensionen werden gesammelt und mit nochmals 4 ccm Natriumcitrat auf je fünf Mäuse, mit denen die Zentrifugengläser sauber ausgespült werden, vereinigt. Je 8 ccm, die somit das Exsudat von fünf Mäusen enthalten, werden anschließend in dünnwandige Reagenzgläser gefüllt. in denen sodann die entscheidende Beschallung erfolgt. Der nach oben zeigende Beschallungskopf des Ultraschallgeräts erhält einen mit einem Dichtungsring angeschlossenen Zylinderaufsatz, der mit langsam fließendem Wasser gefüllt ist Das zu beschallende Reagenzglas wird bis zu 1 cm mit der Kuppe im Zentrum des Schallkegels eingetaucht und festgeklemmt. Bei inschaltung der Beschallung wird dann plötzlich die Stärke erreicht, bei der das schon obenerwähnte IBallungsphänomen der Wirtszellkerne, also der Leukocytenreste, einsetzt. Die Beschallungsstärke wird dann nur noch wenig erhöht. Die ganze Beschallung dauert gut 2t/2 Minuten, dann wird das nächste Reagenzglas eingespannt, so daß alle 3 Minuten das Exsudat von fünf Mäusen beschallt ist.
• Die hier genannten Mengen und Zeiten sind für ein Ultrakust-Ultra-Sonator erprobt, bei dem die durch das Ballungsphänorlen charakterisierte Leistungsintensität bei etwa 0,07 bis o,o8 mA erreicht wird. Eine Überprüfung der richtigen Leistung kann am besten durch die Untersuchung eines Frischpräparats im Phasenkontrastmikroskop durchgeführt werden.
• Nach Abschluß der Beschallung wird die deutlich klarer gewordene Suspension vorsichtig vom eventuell gebildeten Bodensatz unter Drehung des Reagenzglases derart abgegossen, daß der klebrige Oberflächenschaum an der Wandung des Reagenzglases haftenbleibt. Zur Vorsicht erfolgt dieses Angießen wiederum durch ein feines Drahtgazesieb, das dennoch mitlaufenden Schaum zurückhält.
• Die vierte Reinigung des Antigens besteht bei Benutzung von 50 ccm fassenden Zentrifugengläsern in einem etwa 5 Minuten langen Zentrifugieren bei rund 500 Umdrehungen pro Minute, um trotzdem durchgelaufene Leukocytenballungen niederzuschlagen. Die gesamte überstehende Flüssigkeit wird von dem geringen Bodensatz in andere Zentrifugengläser abgegossen.
• Die fünfte Reinigung ist wieder eine Hauptreinigung. Die noch suspendierten, beschallten Toxoplasmen werden 30 Minuten bei 3500 bis Aooo Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Dann wird die gesamte überstehende Flüssigkeit abgegossen, die neben zahlreichen Zelltrümmern das ganze Protoplasma der Leukocyten enthält. Der verbleibende Bodensatz besteht im wesentlichen aus ganzen oder beschädigten Toxoplasmen. Die eventuell noch verbleibenden Reste von Lymphocvtenkernen, die am widerstandsfähigsten sind, treten gegenüber der Toxoplasmamasse weit zurück und werden durch die folgenden Verfahrensmaßnahmen noch ausgeschaltet.
• Der Bodensatz wird jetzt mittels einer kleineren Spritze (5-ccm-Spritze) mit aufgesetzter Kanüle in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert.
• Einschließlich Nachspülflüssigkeit soll die Kochsalzlösung auf 0,5 ccm pro Maus bemessen werden.
• Diese Suspension wird zu etwa 12 ccm wiederum in dünnwandige Reagenzgläser gefüllt, die je 15 bis 20 Minuten zwecks Zerstörung und Aufschlie-Bung der Toxoplasmen voll beschallt werden, d. h. heim Ultrakust-Ultra-Sonator mit o,o8bis o,og mA, wobei diesmal die Gläser bis zur Höhe der Toxoplasmensuspension im Bereich des Schallkegels eingetaucht sind. Im Reagenzglas soll ein feiner Schallkegel sichtbar werden. Anschließend wird die Toxoplasmensuspension, in der jetzt die Toxoplasmen durch die Beschallung aufgeschlossen sind, in eine Flasche gefüllt. Sollten sich während der Beschallung nochmals Ballungen gebildet haben, so können diese im ersten Beschallungsgang nicht erfaßten geringen Leukocytenkernreste jetzt durch ein Drahtgazesieb noch abgefangen werden. Die so vorbereitete Suspension, die die Basis des Antigenextraktes bildet, wird jetzt mit der gleichen Menge einer I O/o Phenol enthaltenden physiologischen Kochsalzlösung versetzt und im Kühlraum zur Extraktion aufbewahrt. Zur Extraktion wird die verschlossene Flasche täglich ein- bis zweimal geschüttelt. Die Extraktion ist nach 3 bis 4 Tagen beendet, kann jedoch länger ausgedehnt werden.
• Der Phenolzusatz dient nicht nur zur bakteriziden Konservierung, die auch durch andere Mittel vorgenommen werden kann, er leitet zugleich eine Denaturierung von unerwünschten Eiweißen des Extraktes ein.
• Durch I6- bis 24stündige Einstellung des 0,50/o Phenol enthaltenden Extraktansatzes in einem Thermostaten bei 560 C wird der Extrakt 30 Minuten bei 3500 bis 4000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert und als schwach opalisierende oder getrübte Lösung vom Bodensatz sauber abgegossen und anschließend wie üblich kühl aufbewahrt. Bei der Antigenherstellung für die Dermalreaktion kann die Wärmeinaktivierung entfallen.
• Beispiel 2 Mit Toxoplasma gondii intraperitoneal infizierte Meerschweinchen werden 3 bis 4 Tage nach der Infektion zweimal mit 20 ccm 3,80/oiger Natriumcitratlösung intraperitoneal ausgespült. Die weitere Behandlung des Exsudates erfolgt gemäß dem Beispiel I, wobei das Exsudat von einem Meerschweinchen dem von sechs Mäusen gleichgesetzt wird.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUC1 Verfahren zur Herstellung von reinem -Toxoplasma-Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß man Exsudat von toxoplasmainfizierten Tieren, zweckmäßig Peritonealexsudat von Mäusen, bereits intraperitoneal mit Alkalicitrat vermischt, die citrathaltige Mischung durch mehrmalige Filtration und Verreibung der Rückstände in eine feine citrathaltige Zellsuspension verwandelt, durch Zentrifugieren die zelligen Elemente von den gelösten Stoffen trennt, den zelligen Bodensatz wieder in Citratlösung fein suspendiert, diese Zellsuspension bis zur Zerstörung des Wirtszellprotoplasmas und Zusammenballung und Abtrennung der ';VVirtszellkerne mit Ultraschall behandelt und durch Filtrieren und fraktioniertes Zentrifugieren die Toxoplasmen von fremden Zellbestandteilen befreit, die verbleibenden freien Toxoplasmen in physiologischer Lösung durch intensive Beschallung völlig aufschließt und in an sich bekannter Weise extrahiert, wobei zweckmäßig zur Herstellung des Antigens für die Komplementbindungsreaktion eine Eiweißdenaturierung mittels Phenolzusatz und Erwärmung der antigenhaltigen Lösung auf etwa 560 mit anschließender Zentrifugierung eingeschaltet wird.