DD229427A5

DD229427A5 - Verfahren zur gewinnung eines polypeptids

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Publication number: DD229427A5
Application number: DD84265320A
Authority: DD
Inventors: Haim Aviv; Marian Gorecki; Avigdor Levanon; Amos Oppenheim; Tikva Vogel; Elisha Zeelon; Menachem Zeevi
Original assignee: Bio Technology General Corp
Priority date: 1983-07-15
Filing date: 1984-07-16
Publication date: 1985-11-06
Also published as: ES8602947A1; HUT34543A; IL72396A0; ES534321A0; IL91828A0; ES544976A0; JPH0799990A; NZ208897A; HU209878B; AU3034584A; DK347184A; AU577298B2; BG49721A3; DE3486425D1; FI90564B; IE922469A1; CA1254527A; DE3485003D1; EP0319049A3; SK524684A3

Abstract

Beschrieben wird ein verbesserter Vektor, der nach Einfuegung in eine geeignete Bakterienwirtzelle mit dem thermolabilen Repressor CI die Wirtzelle nach Erhoehung ihrer Temperatur auf eine Temperatur, bei der der Repressor zerstoert wird, zur Expression eines in den Vektor eingebauten gewuenschten Gens und Produktion des durch das Gen kodierten Polypeptids befaehigt. Bei dem Vektor handelt es sich um ein Doppelstrang-DNS-Molekuel, welches in der Reihenfolge 5 bis 3 folgendes umfasst: Eine DNS-Sequenz mit dem Promotor und Operator PLOL eines Lambda-Bakteriophagen; die N-Nutzungsstelle zur Bindung von durch die Wirtzelle gebildetem Antiterminator N-Protein; eine DNS-Sequenz mit einer Ribosomenbindungsstelle zur Befaehigung der m-RNS des gewuenschten Gens zur Bindung an Ribosomen in der Wirtzelle; ein ATG-Initiationscodon oder eine DNS-Sequenz, die bei Einfuegung des gewuenschten Gens in den Vektor in ein ATG-Initiationscodon uebergeht und eine Restriktionsenzymstelle zum Einbau des gewuenschten Gens in den Vektor in Phase mit dem ATG-Initiationscodon. Der Vektor enthaelt ferner eine DNS-Sequenz mit einem Replikationspunkt aus einem zur autonomen Replikation in der Wirtzelle faehigen bakteriellen Plasmid, sowie eine DNS-Sequenz mit einem einem waehlbaren oder identifizierbaren Phaenotypusmerkmal zugeordneten Gen, das sich bei Anwesenheit des Vektors in der Wirtzelle zu erkennen gibt.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines Wachstumshormons oder Analogen desselben. Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Ein Aspekt der Gentechnologie umfaßt die Einfügung von aus eukaryotischen Quellen stammenden fremden DNS-Sequenzen in Escherichia coli oder sonstige Mikroorganismen. Eine weitere Verfeinerung der Gentechnologie ist damit befaßt, die erhaltenen Mikroorganismen dazu zu veranlassen, durch die fremde DNS kodierte Polypeptide zu produzieren. Die Produktion von Polypeptiden ist als zweistufiges Verfahren, bei dem jede Stufe wieder in zahlreiche Unterstufen unterteilt ist, anzusehen. Die beiden Stufen sind die Transkription und die Translation. Um wirksam und quantitativ herstellen zu können, müssen beide Verfahrensstufen wirksam durchführbar sein. Unter einer „Transkription" ist die Bildung von mRNS aus dem Gen (DNS), unter „Translation" die Bildung des Polyptids aus der mRNS zu verstehen.

Eine kritische Unterstufe der Transkription ist die Initiation, d. h. die Bindung von RNS-Polymerase an einen Promotor/Operator-Bereich. Die Sequenz der Desoxyribonukleotidbasen, die den Promotorbereich bilden, kann variieren und dabei die relative Wirksamkeit des Promotors beeinflussen. Die Wirksamkeit hängt von der Affinität der RNS-Polymerase zu dem Promotor ab. Die Wirksamkeit der Translation wird durch die Stabilität der mRNS beeinträchtigt. Eine erhöhte Stabilität der mRNS gestattet eine verbesserte Translation. Obwohl die genauen Determinanten der mRNS-Stabilität noch nicht genau geklärt sind, ist bekannt, daß die mRNS-Sekundärstruktur, die sich aus der Sequenz ihrer Basen ergibt, im Hinblick auf die Stabilität eine Rolle spielt.

Die einleitende Unterstufe der Translation umfaßt eine Bindung des Ribosoms an eine Basensequenz an der mRNS, die als Shine-Dalgarno-Sequenz oder Ribosomenbindungsstelle (RBS) bekannt ist. Die Synthese von Polypeptiden beginnt, wenn das Ribosom längs der mRNS zu dem AUG-Initiationskodon bzw. -Startkodon für eine Translation wandert. In der Regel finden sich diese Kondons etwa zehn Basen „unterhalb" der Shine-Dalgarno-Stelle. Faktoren, die die Wirksamkeit der Translation steigern, sind solche, die die Bindung der Ribosomen an die Shine-Dalgarno-Stelle begünstigen. Es hat sich gezeigt, daß die Sekundärstruktur der mRNS im Bereich der Shine-Dalgarno-Sequenz und dem des AUG-Kodons und der Abstand zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz und AUG-Kodon jeweils eine kritische Rolle bei der Bestimmung der Wirksamkeit der Translation spielen. Andere Faktoren, die die Wirksamkeit der Translation beeinflussen, sind eine verfrühte Termination und eine Verdünnung (attenuation). Die Wirksamkeit der Translation läßt sich durch Entfernen der Attenuationsstellen verbessern. Eine bei Versuchen zur Gewinnung großer Mengen an eukaryotischen Polypeptiden in Bakterienzellen auftretende Schwierigkeit besteht in der Unfähigkeit der große Mengen an mRNS produzierenden Zellen, wirksam zu wachsen. Diese Schwierigkeit läßt sich durch Verhindern einer Transkription durch ein als Repression bekanntes Verfahren eliminieren. Bei der Repression werden durch die Wirkung eines Proteininhibitors (Repressorprotein), das eine Transkription durch Bindung an den Operatorbereich verhindert, Gene blockiert bzw. ausgeschaltet. Nachdem die Mikroorganismen bis zu der gewünschten Zelldichte gewachsen sind, werden die „unterdrückten" Gene durch Zerstörung des Repressors oder durch Zusatz von Molekülen, die als Induktionsmittel zur Überwindung des Einflusses des Repressors bekannt sind, aktiviert. In der Literatur gibt es zahlreiche Veröffentlichungen betreffend die Klonung eukaryotischer Gene in Plasmide mit dem PL-Promotor von λ-Bakteriophagen (vgl. H.V.Bernard und Mitarbeiterin „Gene" 5,59 (1979); C.Derom und Mitarbeiterin „Gene" 17,45 (1982); D.Gheysen und Mitarbeiterin „Gene" 17,55 (1982); J.Hedgpeth und Mitarbeiterin „Mol. Gen. Genet." 163,197 (1978); E.Remautund Mitarbeiterin „Gene" 15,81 (1981) und R.Derynckund Mitarbeiterin „Nature" 287,193(1980)). Darüber hinaus sind aus EP-A-041 767 Expressionsvektoren mit dem P_L-Promotor aus λ-Bakteriophagen bekannt. Keine der genannten Literaturstellen beschreibt jedoch die Nutzung derCn-Ribosomenbindungsstelle.

Die Ausnutzung eines Vektors mit dem P_L-Promotor aus einem λ-Bakteriophagen und die Cn-Ribosomenbindungsstelle sind bekannt (vgl. A.B.Oppenheim und Mitarbeiter in „J.Mol.Biol." 158,327 (1982) und H.Shimatake und M.Rosenberg in „Nature" 292,128 (1981)). Diese Veröffentlichungen beschreiben die Produktion von größeren Mengen an Cn-Protein, sie verlieren jedoch kein Wort über die Produktion eukaryotischer Proteine.

1982 präsentierten Shatzman und Rosenberg auf dem 14. Miami Winter Symposium (A. R.Shatzman und M.Rosenberg, 14 Miami Winter Symposium, abstract S.98 (1982)) einen Vorschlag. In dem genannten Abstract findet sich eine nicht nacharbeitbare Erläuterung für die Verwendung eines Vektors mit P_L aus einem λ-Bakteriophagen, Nut und der Cu-Ribosomenbindungsstelle zur Synthese eines „eukaryotischen" Polypeptide (SV40 kleines T-Antigen ist in der Tat kein eukaryotisches Polypeptid, sondern ein Virusprotein) in einer Menge von mehr als 5% des Zellproteins in einem ungenannten Bakterienwirt. Der verwendete Operator ist nicht definiert. Ferner ist auch weder ein Replikationspunkt noch ein Gen für einen wählbaren Phänotypus identifiziert. Dieses System, mit dem der Vektor verwendet wird, ist beschrieben als „bestimmte Wirtlysogene, in die der Vektor stabil transformiert werden kann".

Die Erfindung besitzt in einer Ausführungsform, d.h. hinsichtlich pMGIOO, bestimmte Ähnlichkeiten zu diesem Vektor. Es wird jedoch nicht in ein Wirtlysogen, sondern vielmehr in geeignete E.coli-Wirtstämme, die zwar den thermolabiien Repressor C₁ und das N-Gen enthalten, aus denen jedoch der Rest des Lysogens entfernt wurde, transformiert. Darüber hinaus wird es zur Gewinnung von bGH- und hGH-Analogen in Mengen von mehr als 20% des gesamten Zellproteins eingesetzt. Darüber hinaus werden in anderen Ausführungsformen der Erfindung Ribosomenbindungsstellen, die sich von C_M unterscheiden, ausgenutzt. Bei den derzeit bevorzugtesten Vektoren pND5 und seinen Derivaten, wurden nicht-essentielle Sequenzen entfernt, um einen Vektor zu schaffen, der eine Polypeptidproduktion in Mengen, die mehr als 10% über den mit pMGIOO erreichbaren Mengen liegen, gestattet.

In einer derzeit noch nicht veröffentlichten US-Patentanmeldung wird zwar ausgeführt, daß der Wirt eine erhebliche Bedeutung besitzt, es werden jedoch keine geeigneten Wirte identifiziert. Ferner soll das (derzeit nicht nacharbeitbare) Verfahren vom Einsatz einer nichtspezifizierten λ-Mutante abhängen. In der genannten Patentanmeldung heißt es ferner, daß der Wirt im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung, bei der der Wirt nicht lysogen ist, Lysogene enthält. Es finden sich Hinweise auf eine Klonung und Expression eines eukaryotischen Gens, nämlich eines Affenmetallothioneingens, Details werden jedoch nicht angegeben. Ferner heißt es in der US-Patentanmeldung, daß weder die Sequenz noch die Lage irgendeines Nukleotids in dem C||-Ribosomenendbereich finding region) geändert sind. Erfindungsgemäß ist dagegen eine solche Änderung möglich. Eine erfolgreiche Expression von Rinderwachstumshormonen oder menschlichen Wachstumshormonen mittels eines P_L-Cnhaltigen Vektorsystems, die Gewinnung von bGH- oder hGH-Analogen mit biologischer Aktivität, solche Analoge enthaltende Massen oder deren Verwendung oder Induktionsverfahren zur Gewährleistung einer Polypeptidproduktion in Mengen von mehr als 20% des von dem Wirt produzierten Gesamtproteins sind bisher in der Literatur nicht beschrieben. Der einzige Hinweis auf die Produktion von bGH-Analogen durch Wirte, die mit Hilfe von durch Gentechnologie erzeugten Vektoren transformiert wurden, findet sich bei P. H. Seeburg und Mitarbeitern in „DNA" 2,37 (1983). Gemäß dieser Veröffentlichung wird derTrp-Promotorzur Gewinnung eines bGH-Analogen mit der Aminosäure Met am N-Ende der Phenylalaninform von natürlichem bGH benutzt.

Der einzige Hinweis auf die Gewinnung von hGH-Analogen durch Wirte, die mit Hilfe von durch Gentechnologie erzeugten Vektoren transformiert wurden, findet sich bei D.V.Goedell und Mitarbeitern in „Nature" 281,544(1979). Gemäß dieser Veröffentlichung werden die Lac- und Trps-Promotoren zur Gewinnung eines Analogen von hGH mit der Aminosäure Met am N-Ende von natürlichem hGH herangezogen.

Ziel der Erfindung

Mit der Erfindung soll ein Verfahren zur Gewinnung eines Wachstumshormons oder Analogen desselben bereitgestellt werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man ein.Wirt-Vektor-System mit einem Plasmid, enthaltend

a) einen Vektor, der nach dem Einbau in eine geeignete bakterielle Wirtzelle mit dem thermolabiien Repressor C| die Wirtzelle nach Erhöhung ihrer Temperatur auf eine Temperatur, bei der der Repressor zerstört wird, zur Expression eines in den Vektor eingebauten gewünschten Gels und zur Bildung eines durch das Gen kodierten Wachstumshormons oder Analogen desselben befähigt und

1) ein Doppelstrang-DNS-Molekül, welches in der Reihenfolge 5'bis 3'

— eine DNS-Sequenz mit dem Promotor und Operator P_LO_L eines λ-Bakteriophagen;

— die N-Nutzungsstelle zur Bindung von durch die Wirtzelle gebildeten Antiterminator-N-Protein;

— eine DNS-Sequenz mit einer Ribosomenbindungsstelle zur Befähigung der mRNS des gewünschten Gens zur Bindung an Ribosomen in der Wirtzelle;

— ein ATG-Initiationscodon oder eine DNS-Sequenz, die bei Einfügung des gewünschten Gens in den Vektor in ein ATG-Initiationscodon übergeht, und

— eine Restriktionsenzymstelle zum Einbau des gewünschten Gens in den Vektor in Phase mit dem ATG-Initiationscodon

enthält, sowie

2) zusätzlich eine DNS-Sequenz mit einem Replikationspunkt aus einem zur autonomen Replikation in der Wirtzelle fähigen bakteriellen Plasmid sowie eine DNS-Sequenz mit einem einem wählbaren oder identifizierbaren Phänotypusmerkmal zugeordneten Gen, das sich bei Anwesenheit des Vektors in der Wirtzeile zu erkennen gibt, umfaßt und

b) ein das Polypeptid oder ein Analoges desselben kodierendes und in die Restriktionsenzymstelle eingefügtes Gen in einem geeigneten Wirt, unter die Bildung des Wachstumshormons oder Analogen desselben gestattenden geeigneten Bedingungen wachsen läßt und das gebildete Wachstumshormon oder Analoge desselben abtrennt.

Bevorzugte Vektoren sind pMGIOO und pND5.

Gene, d. h. cDNSn, mit Kodierung für die gewünschten Wachstumshormone, wie Rinder-, Schweine- oder Hühnerwachstumshormone oder menschliche Wachstumshormone, oder Analoge derselben können zur Erzeugung von Plasmiden in die Restriktionsenzymstelle des Vektors eingebaut werden. Die Plasmide ihrerseits können in geeignete Wirte, in denen eine Genexpression und eine Prouktion des gewünschten Wachstumshormons oder Analogen desselben stattfinden können, eingebaut werden. Bevorzugte Plasmide für bGH sind pRec 2/3 und pR011 und für hGH pTV 18(1) und pTV 104(2). Geeignete Wirte sind Escherichia coli-Stämme A1637, A1645, A2602 und A1563, vorzugsweise der Stamm A1637. Die gebildeten Wirt-Vektor-Systeme können zur Gewinnung von Wachstumshormonen oder von Analogen derselben herangezogen werden. Die die Plasmide enthaltenden Wirtzellen werden unter geeigneten Bedingungen, die eine Produktion von Wachstumshormonen oder Analogen derselben gestatten, wachsen gelassen, worauf das gebildete Wachstumshormon oder Analoge desselben abgetrennt wird. Derzeit bevorzugte Wachstumsbedingungen sind: 10-30min, insbesondere 15min, bei etwa 42°C, und so langes Weiterwachsen bei etwa 37-39^cC, bis die gesamte Wachstumsdauer etwa 60-90 min beträgt. Das Weiterwachsen dauert vorzugsweise etwa 75 min bei 38-39°C. Derzeit bevorzugte Wachstumsmedien sind mit Glucose oder Gehirn/Herz-Aufschwemmung (Infusion) versetztes Lactalbuminhydrolysat.

- 5 - DOJ CM

Unter Verwendung der Wirt-Vektor-Systeme wurden bGH- und hGH-Analoge hergestellt. Diese Analogen können tierärztlichen Zubereitungen oder Humanarzneimitteln einverleibt werden. Die jeweiligen analogen können direkt oder in Form entsprechender Zubereitungen zur Stimulierung der Milch- oder Fleischproduktion bei Rindern oder zur Behandlung von Defiziten an menschlichem Wachstumshormon eingesetzt werden.

Die Erfindung wird anhand der Zeichnungen näher erläutert:

Fig. 1 —Aufbau des pMGIOO-Expressionsvektors.

Dieses Plasmid wird durch Einfügen eines Fragments von λ-Phagen-DNS zwischen den Restriktionsstellen Haelll (Lage 38150) und Sau3a (Lage 38362) in eine mit Hpal und BamH1 gespaltene pKC30-Plasmid-DNS aufgebaut. Das Haelll-Sau3a-Fragment trägt nut_R, t_R1, cy~ und eine Ribosomenbindungsstelle von Cn-Protein (Cn-RBS). Eine Subklonung von CnRBS mit DNS in pKC3 führt zu pMGIOO, das eine einzige BamH1-Restriktionsstelle unmittelbar nach dem ATG-Initiationskodon von C_n-RBS und eine Ndel-Restriktionsstelle in dem ATG-Triplett (Einfügung im untersten Teil — bottom inset) enthält. Die Zahlen in Klammern bezeichnen die Lage der Restriktionsstellen auf derX-Phagen-DNS.

Fig.2 — Aufbau des pRec 2/3-Plasmids.

Ein bGH cDNS enthaltendes Plasmid, D₄, wird mit Haell verdaut. Ein hierbei erhaltenes, 1 600 bp großes Fragment wird gereinigt und einer 5minütigen Verdauung bei 37⁰C mit fünf Einheiten S1-Exonuklease unterworfen. Durch Ligation wird nun ein synthetischer EcoR1 -Linker mit der Sequenz

GGAATTCC

CCTTAAGG

„angehängt". Das erhaltene Produkt wird mit EcoR1 gespalten und in mit EcoR1 gespaltenes pBR322 eingefügt. Nach Isolierung eines Klons pALR1 liefert dieses bei Spaltung mit EcoR1 ein 1200 bp-Fragment mit der Sequenz AATTCCCA...

GGGT...

am 5'-Ende. Die Bildung dieser Sequenz zeigt, daß pALR1 eine EcoR1-Restriktionsstelle mit dem TTC-Kodon für eine Restzahl 1 (Phenylalanin) authentischen bGH's enthält. pALR1 wird einer Teilspaltung mit Pst1 unterworfen. Das Verdauungsprodukt wird mit Hindlll-Linkem gebunden und mit EcoR1 und Hindill gespalten. Das pGH cDNS enthaltende Fragment wird isoliert und in pBR322 zwischen EcoR1- und Hindlll-Restriktionsstellen subgeklont, wobei pAL500 entsteht. Das subgeklonte bGH cDNS-Fragment wird dann aus pAL500 mit EcoR1 und Hindill herausgeschnitten, mit einem DNS-Polymerase „Klenow"-Fragment „aufgefüllt" (filled.in) und in den an der BamH1-Stelle geöffneten pMG100-Expressionsvektor(Fig.1) eingefügt und ferner — wie geschildert — „aufgefüllt". Mit Hilfe des gebildeten Vektors pREC 2/2 erfolgt eine Expression von modifiziertem bGH, das an seinem Aminoende wie folgt geändert ist:

MetAspGinPhe^ro^-.bGH

Das Plasmid pREC 2/2 wird mit Pst1 verdaut, worauf das den P_L-Promotor und das 5'-Ende des bGH-Gens (als „Fragment A" bezeichnet) enthaltende Fragment isoliert wird. Dieses Fragment wird an ein Pst1-Fragment aus pAL500 gebunden (als „Fragment B" bezeichnet). Mit dem danach erhaltenen Vektor pRec 2/3 erfolgt eine Expression von modifiziertem bGH, das an seinem Aminoende wie folgt geändert ist:

MetAspG1nPhe¹Pro²...bGH

Fig.3 - Aufbau der Expressionsvektoren pND5, pND55 und pRO11.

Ein Plasmid pOG7 (vgl. A.Oppenheim, S.Gottesman und M.Gottesman in „J.Mol. Biol." 158, 327 [1982]) wird mit Nde1 gespalten. Die Enden des großen Fragments, das den P_L-Promotor nut_L, t_R und C_n-RBS trägt, wird einer Ligation unterworfen, wobei der pND5-Expressionsvektor entsteht. Diese pND5-Vektor-DNS wird mit Nde1 geöffnet. Bei Einfügung desjenigen Nde1-Fragments aus pRec 2/3 (Fig. 2), welches bGH cDNS enthält, entsteht ein Plasmid pRO11, das ein besserer Expressor für das modifizierte bGH gemäß Fig.2 sein dürfte als pRec 2/3. Die Einfügung von synthetischen Linkern mit der Sequenz:

TATGAGCTCA

ACTCGAGTAT

in mit Nde1 gespaltenes pOG7 führt zu einem Expressionsvektor pND55, der eine einzige Sad-Restriktionsstelle vor ATG aufweist. Wenn pND55 mit Sac1 gespalten und mit einem DNS-Polymerase „Klenow"-Fragment behandelt wird, entsteht ein ATG-Initiationscodon, das dem P_L-Promotor und C_n-RBS folgt. Dieser Vektor eignet sich zur Expression der verschiedensten eukaryotischen Gene ohne ATG-Initiationscodon.

Fig.4 —Aufbau von pTV 18(1) und pTV 104(2).

Durch Klonen von cDNS mit Kodierung für hGH in die Hindlll-Stelle von pBR322 nach Standardmethoden erhält man ein Plasmid pTVHGH. Dieses Plasmid wird mit Hindlll verdaut. Das erhaltene 800 Basepaarfragment wird gereinigt, mit FnuDII weiterverdaut und mit einem DNS-Polymerase „Klenow"-Fragment „aufgefüllt". Diese Behandlung entfernt die Codons für die ersten 16 Aminosäuren von hGH. Das gebildete DNS-Fragment wird mit einem synthetischen Linker verbunden. Letzterer stellt die Codons für die Sequenz von hGH aus Met¹⁴ wieder her und regeneriert eineNdei-Restriktionsstelle vor dem ATG-Kodon für Met¹⁴. Nach der Behandlung mit Nde1 wird diese halbsynthetische DNS in den mit Nde1 geöffneten pND5-Vektor eingebaut.

Mit Hilfe des erhaltenen Plasmids pTV 18(1) erfolgt eine Expression hGH unter Kontrolle des P₁-PrOmOtOrS. Dieses hGH stellt ein Analoges ohne die ersten 13 Aminosäurereste mit Met¹⁴ an seinem N-Ende dar.

Das Plasmid pTV 18(1) wird mit Nde1 teilverdaut und mit einem synthetischen Linker, der die Codons für die Aminosäuren 1-13 von hGH enthält:

TATGTTCCCAACCATTCCATTATCCCGTCTGTTCGACAACGC

ACAAGGGTTGGTAAGGTAATAGGGCAGACAAGCTGTTGCGAT.

verbunden.

Der Linker ist ebenfalls komplementär zu der Nde1-Stelle an pTV 18(1) und bringt das komplette hGH-Gen in Phase mit dem ATG-Initiationscodon des pNDö-Expressionsvektors (Fig.3). Somit erfolgt mit Hilfe des erhaltenen Plasmids pTV 104(2) eine Expression von nativem hGH mit einem Extra-Methionin am N-Ende.

Fig.5 zeigt den Vektor pALTrp 46, der den Trp-Promotor und die ersten sieben Aminosäuren des durch Transkription an das ß-Galactosidasegen „angeschmolzenen" Trp Ε-Gens enthält.

Fig. 6,7 und 8 zeigen eine Reihe von Expressionsvektoren (Tac) mit einem Teil des Trp-Promotors und Lac-Operators im Anschluß an die bzw. nach den Restriktionsstellen für die Einfügung eines gewünschten Gens und Expression von bGH unter Kontrolle des Tac-Promotors.

Fig.9 und 10 zeigen Expressionsvektoren mit bGH cDNS unter Kontrolle des Histidinpromotors.

Fig. 11 zeigt die Einfügung des bGH-Gens in einen Expressionsvektor unter Kontrolle des Lac-Promotors.

Fig. 12 zeigt die Expression von bGH-Gen unter Kontrolle von Omp F-Promotor.

Fig. 13 —,Aufbau des Met⁴-bGH-Analogen pAL401 und der Expressionsvektoren pND6 und pND11 mit geänderten Restriktionsstellen.

pAL401, mit dessen Hilfe eine Expression einer modifizierten Form von bGH ohne die ersten drei Aminosäuren am Aminoende von bGH (Met⁴ bGH) erfolgt, wird durch Dreifach-Verknüpfung wie folgt gewonnen:

a) ein aus pAL500 ausgeschnittenes bGH DNS-Fragment von 623 Basepaaren mit Pvull und Hindill;

b) ein durch Synthese von zwei DNS-Strängen, die nach der Reinigung unter Bildung von: CCATATGTCCTTGTCCGGCCTGTTTGCCAACGCTGTGCT GCGACACGAGGCCCGAGTCGTGGACGTGGTCGACG

vereinigt (annealed) wurden, gebildeter Linker, der mit einem DNS-Polymerase „Klenow"-Fragment aufgefüllt und dann mit Nde1 und Pvull gespalten wird. Hierbei erhält man ein 58 Basepaar-Fragment, das abgetrennt und gereinigt wird.

c) pND11, welches man wie folgt erhält: Ein Expressionsvektor pOG7 wird durch Eliminieren von Hindlll und einer der Nde1-Stellen (im Abstand von dem ATG-Initiationscodon) zu pND6 geändert. Danach werden in eine Sal1-Stelle Hindlll-Linkers eingeführt, wobei pND11 erhalten wird.

Fig. 14 —' Aufbau von am Aminoende mit Methionin modifiziertem, authentischem bGH und verschiedene Analoge von bGH.

a) Das Plasmid pAL401 wird mit Nde1 behandelt. In die Nde1-Stelle wird ein synthetischer DNS-Linker mit einem ATG-Initiationssignal und dem Kodon für die ersten drei Aminosäuren am Aminoende von nativem bGH eingebunden. Der gebildete Vektor pAL601 führt zur Expression von nativem bGH mit einem Extra-Methioninrest am Aminoende.

b) In der unter a) geschilderten Weise, jedoch unter Modifizieren der Struktur des Oligodesoxyribonukleotid-Linkers läßt sich eine Klasse von Vektoren mit Kode für eine Reihe modifizierter Rinderwachstumshormone aufbauen. Die modifizierten Wachstumshormone beginnen mit Methionin am N-Ende. Es folgen dann irgendwelche der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren in jeder der Stellungen 1 und 2 und irgendeine der zwanzig Aminosäuren mit Ausnahme von GIu, GIn, Lys, Met oder Trp in Stellung 3. Von Stellung 4 bis zum COOH-Ende ist die Sequenz mit der Sequenz von nativem bGH identisch.

Fig. 15— Schienbein-bzw. Tibia-Test.

Diese Figur zeigt einen Vergleich zwischen der Wirkung des pRec 2/3-bGH-Analogen und authentischem bGH auf das Knochenplattenwachstum von hypophysektomisierten Ratten.

Erfindungsgemäß wurde nun ein Vektor entwickelt, mit dessen Hilfe sich in größerem Ausmaß eine Genexpression und eine Expression von Wachstumshormonen und Analogen derselben erreichen lassen. Bei dem Vektor handelt es sich um ein Doppelstrang-DNS-Molekül. Nach Einführung in eine geeignete Bakterienwirtzelle mit dem thermolabilen Repressor Q und Erhöhen der Temperatur des Wirts auf eine Temperatur, bei der der Repressor zerstört wird, befähigt der Vektor die Wirtzelle zur Expression eines in den Vektor eingebauten gewünschten Gens und zur Produktion eines durch das Gen kodierten Wachstumshormons oder Analogen desselben

Der Vektor umfaßt in der Reihenfolge 5' bis 3' folgende Bauteile: Eine DNS-Sequenz mit dem Promotor und Operator P_LO_L aus einem λ-Bakteriophagen; die N-Nutzungsstelle zur Bindung von durch die WirtzeMe produziertem Antiterminator N-Protein; eine DNS-Sequenz mit einer Ribosömenbindungsstelle, welche die mRNS des gewünschten Gens zur Bindung der Ribosomen in der Wirtzelle befähigt;

ein ATG-Initiationscodon oder eine DNS-Sequenz, die nach Einbau des gewünschten Gens in den Vektor in den ATG-Initiationscodon übergeht, und

eine Restriktionsenzymstelle zum Einbau des gewünschten Gens in den Vektor in Phase mit dem ATG-Initiationskodon. Der Vektor beinhaltet ferner eine DNS-Sequenz, die einen Replikationspunkt (origin of replication) aus einem zur autonomen Replikation in der Wirtzelle fähigen Bakterienplasmid und eine DNS-Sequenz mit einem Gen, dem ein sich bei der Anwesenheit des Vektors in der Wirtzelle manifestierendes, wählbares oder identifizierbares Phänotypmerkmal zugeordnet ist, enthält. Der Wirt zur Verwendung mit dem Vektor ist Escherichiacoli. Zweckmäßigerweise werden als Wirte die Escherichiacoli-Stämme A1637, A1645, A2602und A1563, vorzugsweise A1637, verwendet. Man erhält ihn aus C600 durch Einfügung eines Transposons mitTetracyclinresistenzgen im Galactoseoperon sowie des λ-Systems zur Expression, das dicht am Galactoseoperon liegt. Er wurde bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, Vereinigte Staaten von Amerika, hinterlegt und enthält — wie nach näher beschrieben werden wird — verschiedene Plasmide. Sämtliche Hinterlegungen entsprechen den Vorschriften des Budapester Vertrags betreffend die Internationale Anerkennung der Mikroorganismus-Hinterlegung. A1645 erhält man aus A1637 durch Selektion auf GaI⁺ (Fähigkeit zur Galactosefermentierung) sowie auf den Verlust an Tetracyclinresistenz. Er enthält noch das λ-Expressionssystem, ein Teil des Transposons ist jedoch durch Selektion entfernt. Sein Phänotyp ist C600 r"m⁺ gal⁺ thr leu~ Iac Z~ (Acl857 ΔΗ1 ΔΒΑΜ N+).

A2602 und A1563 sind von SA500 abgeleitet. Ihr jeweiliger Phänotyp ist SA500 his~ilu~ gal⁺ Δ8 (λΰΙ857ΔΗ1ΔΒΑΜ Ν + ) bzw. SA500his"ilu-gal⁺A8lacZxA21 (ACI859 int2 xis1 nutL3AH1).

Vorzugsweise handelt es sich bei dem Vektor um ein kovalent geschlossenes, ringförmiges Doppelstrangmolekül. Der Vektor muß jedoch nicht unbedingt kovalent geschlossen sein.

Der Vektor erreicht seinen erhöhten Expressionsgrad, nachdem die Wirtzelle auf eine Temperatur erwärmt wurde, bei der der C|-Repressor zerstört wird. Zu diesem Zweck reicht eine Temperatur oberhalb etwa 42°C aus. Da eine Wärmeschädigung der Wirtzeile soweit wie möglich vermieden werden soll, soll die Erwärmungstemperatur zweckmäßigerweise niemals mehr als einige wenige Grade über 42⁰C liegen.

Eine wesentliche Komponente des Vektors ist die Ribosömenbindungsstelle. Geeignete Stellen sind Cn von λ-Bakteriophagen der Sequenz:

TAAGGAAATACTTACAT

ATTCCTTTATGAATGTA.

Ein synthetisches Oligonukleotid der Sequenz:

TAAGGAAGTACTTACAT

ATTCCTTCATGAATGTA und

das Hauptkopfproteingen von bakteriophagen Lambda der Sequenz:

I I I I I I IACGGGAI I I I I I IATG

AAAAAAATGCCCTAAAAAAATAC.

Eine weitere Komponente des Vektors ist die Restriktionsenzymstelle zum Einbau der gewünschten Gene in den Vektor in Phase mit dem AGR-Initiationskodon. Zahlreiche derartige Stellen können verwendet werden. Die derzeit bevorzugten Stellen sind BamH1, Sad und Nde1.

Der Vektor enthält ferner einen Replikationspunkt (origin of replication) aus einem zur autonomen Replikation in der Wirtzelle fähigen Bakterienplasmid. Geeignete derartige Replikationspunkte lassen sich aus einer Reihe von Quellen gewinnen. Derzeit bevorzugte Replikationspunkte stammen von pBR322 oder pR1.

Eine weitere Komponente des Vektors bildet eine DNS-Sequenz mit einem Gen, dem ein sich bei Anwesenheit des Vektors in der Wirtzelle manifestierendes, wählbares oder identifizierbares Phänotypmerkmal zugeordnet ist. Geeignet Gene sind solche mit Temperaturempfindlichkeit oder Arzneimittelresistenz, beispielsweise Ampicillin-, Chloramphenicol- oder Tetracyclin-Resistenz.

Anders als die bisher in der wissenschaftlichen Literatur beschriebenen Vektoren können die erfindungsgemäßen Vektoren für eine gesteigerte Expression der verschiedensten Gene mit Kodierung für Wachstumshormone, z. B. Rinder-, Schweine- oder Hühnerwachstumshormone oder menschliche Wachstumshormone oder Analoge derselben. Unter Analogen sind Wachstumshormone derselben Aktivität, wie sie das natürlich vorkommende Wachstumshormon aufweist, jedoch mit einer oder mehreren unterschiedlichen Aminosäure(n) am N-Ende des Wachstumshormons (Polypeptids) zu verstehen.

Den Vektor erhält man nach üblichen bekannten Verfahren. Solche Verfahren sind in den genannten Veröffentlichungen in allen Einzelheiten beschrieben, so daß eine detaillierte Beschreibung im vorliegenden Falle nicht erforderlich sein dürfte.

Ein derzeit bevorzugter Vektor ist pMGIOO mit der in Fig. 1 dargestellten Restriktionskarte. Dieser Vektor hatte in seine BamH1-Restriktionsstelle ein cDNS mit Kodierung für Rinderwachstumshormon eingebaut. Das gebildete Plasmid ist mit pRec 2/3 bGH bezeichnet. Dessen Restriktionskarte ist in Fig.2 dargestellt. Das Plasmid pRec 2/3 bGH wird nach üblichen Transformationsmethoden in den Escherichia coli-Stamm A1637 eingebaut. Das hierbei erhaltene Wirt-Vektor-System ist unter der Hinterlegungsnummer ATCC No.39385 hinterlegt.

Ein zweiter derzeit bevorzugter Vektor ist pND5 mit der in Fig. 3 dargestellten Restriktionskarte. In seine Nde1-Restriktionsstelle ist Rinderwachstumshormon cDNS eingefügt. Das erhaltene Plasmid ist mit pR011 bezeichnet. Dessen Restriktionskarte findet sich ebenfalls in Fig.3. Das Plasmid pR011 ist durch Transformation in den Escherichia coli-Stamm A1637 eingebaut. Das hierbei erhaltene Wirt-Vektor-System ist unter der Hinterlegungsbezeichnung ATCC No.39390 hinterlegt.

Der Vektor pND5 wurde auch zur Klonung von menschlichem Wachstumshormon verwendet. Durch Einbau von hGH cDNS in die Nde1-Restriktionsstellen wurden ein mit pTV 18(1) bezeichnetes Plasmid und ein mit pTV 104(2) bezeichnetes anderes Plasmid geschaffen. pTV 18(1) ist in Fig.4 erläutert. Es wurde durch Transformation in den Escherichia coli-Stamm A1637 eingebaut. Das hierbei erhaltene Wirt-Vektor-System ist unter der Hinterlegungsbezeichnung ATCC No.39386 hinterlegt. Das Plasmid pTV 104(2) ist ebenfalls in Fig.4 erläutert. Es wurde in den Escherichia coli-Stamm A1637 eingebaut. Das hierbei erhaltene Wirt-Vektor-System ist unter der Hinterlegungsbezeichnung ATCC No.39384 hinterlegt.

In derselben Weise wurden auch andere Plasmide geschaffen, indem in die Restriktionsenzymstelle eines Vektors gemäß der Erfindung ein Gen mit Kodierung für ein gewünschtes Wachstumshormon oder Analoges desselben eingefügt wird.

Bei dem speziell genannten Wirt-Vektor-System ist E.coli A1637 beteiligt. Wie jedoch bereits ausgeführt, wurden auch andere Escherichia coli-Stämme, nämlich die Stämme A1645, A2606 und A1563 verwendet. Diese Wirt-Vektor-Systeme können (ebenfalls) zur Produktion von z.B. Rinderwachstumshormon und menschlichem Wachstumshormon, herangezogen werden.

Zu diesem Zweck wird das Wirt-Vektor-System unter geeigneten Bedingungen, die die Produktion des Wachstumshormons oder Analogen desselben gestatten, wachsen gelassen. Das gebildete Wachstumshormon oder Analoge desselben wird schließlich abgetrennt.

Geeignete Bedingungen bestehen in einem Wachsenlassen des Wirt-Vektor-Systems während einer geeigneten Zeitdauer bei einer Temperatur von etwa 42°C und einem Weiterwachsenlassen bei etwa 37-39^cC während einer zusätzlichen Zeitdauer, wobei das Wachstum auf einem geeigneten Medium erfolgt.

Zweckmäßigerweise erfolgt daseinleitende Wachsenlassen für etwa 10-30 min bei42°C. Danach wird das Wirt-Vektor-System so lange bei 37-39°C weiterwachsen gelassen, bis die Gesamtwachstumsdauer etwa 60-90 min beträgt. Vorzugsweise erfolgt das Wachstum zunächst etwa 15min bei 42°C und dann etwa 75min bei 38-39°C.

Geeignete Medien sind beispielsweise mit Glucose und Gehirn/Herz-Aufguß versetztes Lactalbuminhydrolysat. Um den Vektor im Wirt stabil zu halten, ist es kritisch, den Wirt unter selektivem Druck, beispielsweise durch Zusatz eines Antibiotikums, zu halten.

In der geschilderten Weise wurden zahlreiche bGH- und hGH-Analoge geschaffen. Diese besitzen die Aktivität der natürlich vorkommenden Hormone oder können eine solche Aktivität besitzen.

bGH-Analoge besitzen die Aktivität von natürlichem bGH und eine identische Aminosäuresequenz mit Ausnahme von Änderungen am N-Ende von bis zu fünf (5) Aminosäuren. Beispiele hierfür sind:

1. An das N-Ende der Phenylalaninform von bGH addierte Aminosäure Methionin.

2. An das N-Ende der Alaninform von bGH addierte Aminosäure Methionin.

3. An das N-Ende der Phenylalaninform von bGH addierte Aminosäuresequenz Met-Asp-Gln.

4. An das N-Ende der Alaninform von bGH addierte Aminosäuresequenz AIa-GIy.

5. An das N-Ende der Alaninform von bGH addierte Aminosäuresequenz Met-Gly.

6. An das N-Ende der Alaninform von bGH addierte Aminosäuresequenz Met-Asp-Pro-Met-Gly.

7. An das N-Ende der Phenylalaninform von bGH addierte Aminosäuresequenz Met-Asp-Pro.

8. An das N-Ende der Phenylalaninform von bGH addierte Aminosäuresequenz Met-Thr-Arg.

9. Vom N-Ende der Phenylalaninform von bGH bis zum Methionin (Stellung 4) entfernte Aminosäuren.

Ein Analoges von bGH besitzt die Aminosäuresequenz: Met-(X)_n-Y-Met..

_wq ri η bede ute η: Met das N-Ende; X eine der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren;

Y eine der zwanzig Aminosäuren mit Ausnahme von GIu, GIn, Lys, Met oder Trp; η eine ganze Zahl von Obis 6 und

Met... die Sequenz von natürlichem bGH von Stellung 4 biszum COOH-Ende (Stellung 191).

hGH-Analoge mit der Aktivität von natürlichem hGH und einer identischen Aminosäuresequenz mit Ausnahme von Änderungen am N-Endesind:

1. Am N-Ende von natürlichem hGH addierte Aminosäure Methionin.

2. Vom N-Ende von hGH bis zum Methionin (Stellung 14) entfernte Aminosäuren. Ein Analoges vom hGH besitzt die Aminosäuresequenz: Met-(X)_n-Y-Met...

worin bedeuten:

Met das N-Ende;

X eine der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren;

Y einederzwanzig Aminosäuren mitAusnahmevon GIu,GIn, Lys, Met oder Trp; η eineganzeZahlvon0bis13und

Met... die Sequenz von natürlichem hGH von Stellung 14 bis zum COOH-Ende (Stellung 191).

Man kann die verschiedensten veterinärmedizinischen Zubereitungen bzw. Tierarzneimittel herstellen, indem man wirksame Mengen eines oder mehrerer bGH-Analogen (Analoger) mit einem geeigneten Träger vermischt. Solche Träger sind dem Fachmann bekannt. Die Analogen können zur Erhöhung der Milch- oder Fleischproduktion direkt oder in Form von Mischungen mit Trägern oder sonstigen Bestandteilen verfüttert werden.

Durch Vermischen wirksamer Mengen eines oder mehrerer hGH-Analogen (Analoger) mit geeigneten Trägern kann man pharmazeutische Zubereitungen bzw. Humanarzneimittel herstellen. Solche Träger sind dem Fachmann bekannt. Die Analogen können an Patienten, beispielsweise an Zwergenhaftigkeit leidende Patienten, zur Bekämpfung von Mangelerscheinungen bei der hGH-Produktion durch den betreffenden Patienten direkt oder in Form von Arzneimittelmischungen verabreicht werden.

Ausführungsbeispiele

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen. Sie enthalten keine detaillierten Angaben bezüglich üblicher bekannter Verfahren zum Aufbau von Vektoren, zum Einbau von Genen mit Kodierung für interessierende Wachstumshormone oder Analoge derselben in solche Vektoren oder zur Einführung der erhaltenen Plasmide in Bakterienwirte.

Solche Verfahren sind dem Fachmann bekannt und in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben. Solche Veröffentlichungen sind beispielsweise:

Principles of Gene Manipulation, An Introduction to Genetic Engineering, 2. Ausgabe, Herausgeber R. W.OId und S. B. Primrose, Univ. of Calif. Press (1981); Met. Enzymol., Band 68, Recombinant DNA, Herausgeber Ray Wu.

Met Enzymol., Band 65, Nucleic Acids (Teil 1), Herausgeber Lawrence Grossman und Kivie Moldave; T.Maniatis, E. F. Fritsch und J.Sambrook „Molecular Clonin"; A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, NY

H. V. Bernard und Mitarbeiter in „Gene" 5, 59 (1979);

A.B.Oppenheim und Mitarbeiterin „J.Mol.Biol." 158,327(1982) und

E.Remautund Mitarbeiterin „Gene" 15,81 (1981).

Beispiel 1 Expressionsvektoren

Der Ausdruck „Expressionsvektor" bezieht sich hier und im folgenden auf eine zur Expression der gewünschten Gene in Bakterien, insbesondere in E.coli, geeignete Gruppe von Plasmiden. Das gewünschte Gen kann in den Expressionsvektor eingebaut werden. Andererseits können die Promotoren aus dem Expressionsvektor herausgeschnitten und vor das gewünschte Gen plaziert werden. _

I. PL-Expressionsvektoren

A. pMGIOO

pMG 100 (Fig. 1) besteht aus in das Multikopie-Plasmid pBR322 eingefügter λ-DNS. Die hervorspringendsten Merkmale der\- DNS sind, daß sie den X-P_L-Promotor, N-Nutzungsstellen L und R (nut_L und nut_R), eine Terminations-R1-Stelle (t_R1), die C,_r Ribosomenbindungsstelle und ein ATG-Initiationskodon enthält. Weitere Merkmale ergeben sich aus Fig. 1.

pMGIOO erhält man auspKC30. pKC30 seinerseits erhält man durch Subklonen des \-P_L-Promotors auf folgende Weise:

λ-Phagen DNS wird mit Xho1- und Sma1-Restriktionsendonukleasen verdaut, worauf das einzige Fragment mit 6393 Basepaaren gereinigt und dann mit Hinlll- und BamH1-Restriktionsendonukleasen verdaut wird. Das gebildete Fragment enthält 2397 Basepaaren und den P_L-Promotor. Es wird gereinigt und dann mit einem aus dem Hindill- und BamH1-Verdauungsgemisch isolierten großen pBR322 DNS-Fragment verknüpft. Das durch Koloniehybridisierung identifizierte Subklon wird abgetrennt, worauf eine Isolierung der Plasmid-DNS erfolgt (vgl. A.Oppenheim und Mitarbeiter in „J.Mol.Biol." 158, 327 (1982)).

Dieses Plasmid und seine Derivate mit eukaryotischen Genen können in geeigneten E.coli-Wirten erhalten werden. Das wichtigste Merkmal des Wirtes ist, daß er für den wärmeempfindlichen Repressor CI857 und das Antiterminations-N-Protein sorgt (vgl. M.E.Gottesman und Mitarbeiter in „J.Mol.Biol." 140,197 (1978)).

Dieser Vektor besitzt gegenüber bisher beschriebenen Expressionsvektoren zahlreiche Vorteile, z.B.:

1. Extrem hohe Expressionsgrade.

Dieser Vektor ist zur direkten Expression von Fremdproteinen in E.coli in Mengen bis zu 15-25% des gesamten Zellproteins fähig.

2. Wärmeinduzierbare Steuerung der Expression.

Der P_L-Promotor ist inaktiv, wenn der Cl-Repressor daran gebunden ist. Der CI857-Repressor ist wärmeempfindlich, d. h. er ist an den Promotor bei 30^cC gebunden, jedoch bei 42⁰C inaktiviert. Somit läßt sich durch Erhöhung der Fermentationstemperatur auf 42°C das Wirtbakterium zur Produktion des gewünschten Proteins anregen. Die Vorteile eines solchen Systems sind folgende:

a) Ein für E.coli toxisches Fremdprotein läßt sich auf Wunsch erzeugen, so daß man ein Absterben der Zellen zu einem frühzeitigen Zeitpunkt während der Fermentation vermeiden kann.

b) Eine Überproduktion eines Proteins kann es stabilisieren und einen proteolytischen Abbau.verhindern (vgl. J.E.Cheng und Mitarbeiterin „Gene" 14,121 (1981)). Somit kann eine „augenblickliche" Überproduktion unter Verwendung eines enggesteuerten Promotors, z. B. P_L gegenüber einer kontinuierlichen Produktion geringer Mengen bevorzugt werden.

3. Hohe Kopiezahl.

Der P_L-Promotor in pMGIOO findet sich auf einem Plasmid mit hoher Kopiezahl im Unterschied zu λ selbst, das in E.coli nur in niedrigen Kopiezahlen vorliegt. Hierdurch erhöht sich der Expressionsgrad.

4. Ribosomenbindungsstelle und Initiationscodon.

Dieser Expressionsvektor enthält eine starke prokaryotische Ribosomenbindungsstelle (RBS) sowie ein Translationsinitiationscodon (ATG). Auf diese Weise läßt sich jedes eukaryotische Gen ohne die Notwendigkeit eines Zusatzes eines Initiationscodons klonen. Weiterhin erhöht die wirksame RBS den Expressionsgrad.

5. Bequeme Restriktionsstelle.

Der Expressionsvektor besitzt eine BamHI-Stelle direkt im Anschluß an das ATG-Initiationscodon. Hierdurch kann man das gewünschte Gen im Hinblick auf eine optimale Expression in geeigneter Weise plazieren.

6. Nut-Stelle.

Durch den Wirt bereitgestelltes N-Protein geht mit der Nut-Stelle am Expressionsvektor eine Bindung ein, wodurch eine Termination bzw. Beendigung der Transkription an der t_R1-Stelle verhindert wird.

B. pNDS

Wie aus Fig.3 hervorgeht, enthält pND5 den P_L-Promotor und die anderen wichtigen Komponenten des erfindungsgemäßen Expressionsvektors. pND5 enthält eine einzige Nde1-Stelle unmittelbar nach der Ribosomenbindungsstelle. Die Ribosomenbindungsstelle unterscheidet sich von der normalen Cn-Stelle. Es liegt folgende Sequenz vor:

TAAGGAAGTACTTACAT

ATTCCTTCATGAATGTA

Man erhält pND5 aus einer Mutante oder durch chemische Synthese. Wie bereits im Zusammenhang mit der Figurenbeschreibung näher erläutert, ist pND5 von pOG7 abgeleitet (vgl. A.Oppenheim und Mitarbeiter in „J.Mol.Biol." 158, 327 (1982)). Dieser Vektor enthält kein Translationsinitiationscodon. Offensichtlich gestattet er eine bessere Expression von modifiziertem bGH und hGH, insbesondere eine verbesserte Ausbeute, bezogen auf pMGIOO mit einem bGH-Analogen.

C. pND55

pND55 ist ein Derivat von pND5 mit der üblichen Restriktionsstelle Sac1 vor Cn-RBS und einem ATG-Initiationscodon. Die Spaltung des Plasmids an dieser Stelle und eine anschließende Behandlung mit einem DNS-Polymerase-„Klenow"-Fragment liefert ein ATG-Initiationscodon, mit dem jedes beliebige Gen verknüpft werden kann (vgl. Fig.3 und die zugehörige Beschreibung).

II. TRP-Expressionsvektor

A. pAL Trp 46

pAL Trp 46 enthält den Trp-Promotor und die ersten sieben Aminosäuren des Trp Ε-Gens angeschmolzen an das ß-Galactosidasegen (vgl. Fig. 5). Das gewünschte Gen läßt sich in eine BamHI-Stelle, die den sieben Aminosäuren vom Trp E folgt, einfügen.

B. pAL Trp 47; Trp 46 mit beseitigtem Abschwächer bzw. Dämpfer (Attenuator)

Hierbei handelt es sich um eine Schöpfung basierend auf Trp 46, bei der der Dämpfungsbereich des Trp-Promotors vernichtet bzw. beseitigt wurde.

C. Trp-Lac-Fusionen

Die Konstruktion dieses Promotors auf dem Plasmid p4754ist in Fig. 6 und 7 dargestellt. Eine Variation dieser Konstruktion ergibt sich aus Fig. 8.

III.Histidinpromotor-Expressionsvektoren

Die Konstruktion dieses Expressionsvektors veranschaulichen Fig.9 und 10

IV. Andere verwendete Promotoren

A. Lac

Dieser Promotor wird beim Aufbau von pYL 301 verwendet (vgl. Fig. 11).

B. Omp F

Hierbei handelt es sich um ein Promotorsystem, mit dessen Hilfe eine Expression eines an einer Signalsequenz hängenden Proteins möglich ist. Die Signalsequenz wird entfernt, wenn das Protein über die Membran transloziert bzw. bewegt wird (vgl. Fig.12).

Beispiel 2 Rinderwachstumshormon

Der Ausgangspunkt für bGH cDNS-Modifikationen ist das bereits beschriebene Plasmid D₄ (vgl. E. Keshet und Mitarbeiter in „Nucleic Acids Research", 9,19 (1918)). Dieses Plasmid ist bei der American Type Culture Collection in einem E.coli-Wirt unter der Hinterlegungsnummer ATCC No. 31826 hinterlegt.

I. pRec2/3bGH

Die Konstruktion von pRec2/3 ist in Fig. 2 und der dazugehörigen Beschreibung erläutert. bGH cDNS aus D₄ wurde vor.Einfügung in PMG100 manipuliert, um die richtige Leseweise sicherzustellen.

pRec 2/3 wurde durch Transformation in üblicher bekannter Weise in verschiedene E.coli-Stämme, einschließlich des Stammes A1637, eingeführt. A1637 mit pRec 2/3 ist unter der Hinterlegungsnummer ATCC No. 39385 hinterlegt. Dieser Stamm liefert beim Wachstum und bei Induktion ein Analoges von bGH mit der an das N-Ende der Phenylalaninform von natürlichem bGH addierten Aminosäuresequenz Met-Asp-Gln. Die Menge an durch pRec 2/3 produziertem bGH-Analogen beträgt etwa 23% des durch das Bakterium produzierten Gesamtproteins (errechnet durch Abtastung von coomasiegefärbten SDS-Polyacrylamidgelen).

Die Konstruktion von pR011 ergibt sich aus Fig.3 und der dazugehörigen Beschreibung. Der pND5-Vektor DNS hat mit Nde1 eine Restriktion erfahren. Die Einfügung des Nde1-FragmentsauspRec2/3 (Fig. 2), welche bGH cDNS enthält, führt zu dem Plasmid pR011.

pR011 ist durch Transformation in E. coli A1637 eingefügt. Das erhaltene Wirt-Vektorsystem ist unter der Hinterlegungsnummer ATCC No.39390 hinterlegt. Wird dieser Stamm wachsen gelassen und induziert, liefert er dasselbe Analoge wie pRec2/3. Vorversuche zeigen, daß pR011 bis zu 20% mehr bGH-Analoges liefert als pRec2/3. Die zum Wachsenlassen des Stammes und zur Gewinnung und Reinigung des erhaltenen bGH-Analogen angewandten Methoden entsprechen den in Beispiel 1 für pRec2/3 angewandten Methoden.

III. pAL401

Die Konstruktion von pAL401 ergibt sich aus Fig. 13 und der dazugehörigen Beschreibung. Wie Fig. 13 zeigt, ist in pND11 bGH cDNS aus D₄ über pAL-500 (Fig.2) eingefügt.

pAL401 kann durch Transformation in E. coli A1637 eingebaut werden. Der erhaltene Stamm liefert ein bGH-Analoges, bei dem sich am N-Ende Met⁴ von natürlichen bGH befindet und die Met⁴ vorangehenden Aminosäuren beseitigt sind.

IV. pAL601

Die Konstruktion von pAL601 ergibt sich aus Fig. 14 und der dazugehörigen Beschreibung. Es handelt sich hierbei um ein Derivat von pAL401 (Fig. 13).

pAL601 kann durch Transformation in E. coli A1637 eingebaut werden. Der erhaltene Stamm liefert ein bGH-Analoges, bei dem an das N-Ende der Phenylalaninform von bGH Met addiert ist.

Beispiel 3 Menschliches Wachstumshormon

Der Ausgangspunkt für hGH cDNS ist die Klonung der cDNS aus mRNS, die aus einem Hypophysentumor von an Acromegalie erkrankten Patienten reindargestellt wurde, an die Hindlll-Stelle von pBR322.

Die Konstruktion von PTV18(1) ergibt sich aus Fig.4 und der dazugehörigen Beschreibung. hGH cDNS wird vor dem Einbau in pND5 manipuliert, um den richtigen Ableserahmen sicherzustellen.

pTV18(1) ist durch Transformation in E. coli A1637 eingebaut. Das erhaltene Bakterium ist unter der Hinterlegungsnummer ATCC No. 39386 hinterlegt. Dieser Stamm liefert beim Wachstum nach Induktion ein hGH-Analoges der Sequenz von natürlichem hGH, beginnend mit Met¹⁴ und ohne die Aminosäuren 1-13. Die Menge an durch pTV 18(1) produziertem hGH-Analogen beträgt etwa 8% des durch das Bakterium produzierten Gesamtproteins.

II. pTV 104(2)

Die Konstruktion von pTV 104(2) ergibt sich aus Fig.4 und der dazugehörigen Beschreibung. Vor dem Einbau in pND5 ist die hGH cDNS manipuliert worden, um den richtigen Ableserahmen zu gewährleisten.

pTV104(2) ist in E. coli A1637 durch Transformation eingebaut. Das erhaltene Bakterium ist unter der Hinterlegungsnummer ATCC No.39384 hinterlegt. Dieser Stamm liefert beim Wachstum und nach Induktion ein hGH-Analoges mit der Sequenz von natürlichem hGH, eingeleitet durch Met am N-Ende. Die Menge an durch pTV 104(2) produziertem hGH-Analogen beträgt mehr als 25% des von dem Bakterium insgesamt produzierten Proteins.

Beispiel 4 Wachstum von pRec2/3

Vorratskulturen:

Vorratskulturen von pRec2/3 in A1637 werden auf BHI-Medium (vgl. Inokulum) wachsen gelassen, dann zweifach mit 87% Glycerin enthaltendem Phosphateitratpuffer verdünnt und bei -70-⁰C gelagert.

Inokulum:

Das Inokulum wird in BHI-Medium (37 g/l) Gehirn/Herz-Aufguß fortgepflanzt. Zu diesem Zweck wird steriles Medium in Schüttelflaschen aus der Vorratskultur beimpft und 15h lang auf einem mit 200 Umdrehungen/min umlaufenden Rüttler bei 3O⁰C inkubiert. Die nachfolgenden Stufen bei der Inokulumfortpflanzung werden in gerührten und belüfteten Gärbottichen durchgeführt. Steriles Medium wird mit 0,2ml Flaschenkultur pro 1 beimpft und 15h lang bei einem pH-Wert von 7 ± 0,5 unter Bewegen und Belüftung (zur Aufrechterhaltung eines Gehalts an gelöstem Sauerstoff über 20% Luftsättigung) 15h lang bei 3O⁰C inkubiert.

Produktion:

Das Produktionsmedium enthält:

Lactalbuminhydrolyst (enzymatisch) 20 g/l

Hefeextrakt 10 g/l

K₂HPO₄ 2,5 g/l

NaCI 10 g/l

Ampicillin 0,1 g/l

Biotin 0,1 mg/l

Thiamin 1 mg/l

Spurenelemente-Lösung 3 ml/l.

Ampicillin, Biotin und Thiamin in Lösung werden getrennt filtrationssterilisiert und dem sterilen Produktionsmedium vor der Beimpfung zugesetzt. Eine sterile Glucoselösung wird zunächst zur Bereitstellung von 10g/l zugegeben, und während der Induktion und Expression wird dann soviel sterile Glucoselösung ergänzt, daß ein Glucosegehalt über 10g/l aufrechterhalten bleibt.

Die Spurenelemente-Lösung enthält:

MgSO₄-7H₂O 170g/l

FcCI₃ 16 g/l

ZnCI₂-4H₂O 2 g/l

CoCI₂-6H₂O 2 g/l

Na₂MoO₄-2H₂O 2 g/l

CaCI₂ -2H₂O 1 g/l

CuCI₂ 1 g/l

H₃BO₃ 0,5 g/l

konz.HCL 100 ml/l.

Das Medium wird mit 5-10% Inokulumkultur beimpft und bei 30⁰C inkubiert. Die Bewegungs/Belüftungs-Werte werden so eingestellt, daß der Gehalt an gelöstem Sauerstoff über 20% Luftsättigung bleibt. Der pH-Wert wird durch Zusatz von NH₃ auf 7 ± 0,2 gehalten. Nachdem die Zellkonzentration etwa 3g/l (OD₆₆₀ =10) erreicht hat, wird mit der Induktion begonnen.

Die Temperatur wird auf 42°C erhöht, 15 min lang auf diesem Wertgehalten und dann auf 38°C gesenkt. Nach 60-bis90minütiger Inkubation bei 38°C wird die Kultur abgeschreckt, worauf die Zellen durch Zentrifugieren zur Hormonreinigung abgetrennt werden.

Reindarstellung von bGH

1 kg Bakterienzellen wird in 10 Volumina einer Lösung mit 5OmM Tris-Cl (pH-Wert: 7,4), 5OmM Ethylendiamintetraessigsäure und 25% Saccharose in einem Warring-Mischer suspendiert. Hierbei wird die Mischergeschwindigkeit derart gesteuert, daß das Ganze nur minimal schäumt. Die homogene Suspension wird kontinuierlich durch einen handelsüblichen Zellenbrecher laufengelassen. Die hierbei erhaltenen homogene Suspension zerbrochener Zellen wird zunächst durch Zentrifugieren in einer Sharpless-Zentrifuge und anschließendes kontinuierliches Zentrifugieren mit 20000 Umdrehungen/min in einer Sorvall-Zentrifuge geklärt. Der Niederschlag aus beiden Zentrifugierstufen wird gesammelt, mit 5OmM Tris-Cl (pH-Wert: 7,4) gewaschen und in 500ml desselben Puffers resuspendiert. Nach Zusatz von Lysozyme bis zu einer Endkonzentration von 2mg/ml wird die Suspension 1 h lang bei 37°C inkubiert. Danach wird Triton X-100 bis zu einer Endkonzentration von 1 % zugesetzt. Nun wird die Suspension auf 4°C gekühlt und 20 min lang mit 20000 Umdrehungen/min in einem Sorvall SS34-Rotor zentrifugiert. Der gesammelte Niederschlag wird zweimal mit 5OmM Tris-Cl gewaschen, in 500ml 5OmM Tris-Cl (pH-Wert: 7,4) resuspendiert und mit und mit 5mM MgCI₂ und Desoxyribonuclease bis zu einer Endkonzentration von 20//,g/ml versetzt. Nach 30minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wird der Niederschlag in der geschilderten Weise gesammelt, zweimal mit 500 ml 2OmM Tris-Cl (pH-Wert: 7,4), 10OmM NaCI und 1OmM Ethylendiamintetraessigsäure gewaschen und schließlich noch zweimal mit 500ml destilliertem Wasser gewaschen. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren gesammelt und läßt sich unbeschränkt lange bei —20⁰C lagern. In dieser Stufe ist bGH 80% rein (Schätzung aufgrund einer Natriumdodecylsulfat-Gelelektrophorese). Die Ausbeute beträgt etwa 15g bGH.

Reinigung des bGH

100g Niederschlag werden in 40ml destilliertem Wasser suspendiert und durch Titration mit 0,5M NaOH (pH-Wert: 11,8) in Lösung gebracht. Die Lösung erfährt dann eine 2minütige Ultraschallbehandlung. Anschließend wird sie durch 20minütiges Zentrifugieren mit 20000 Umdrehungen/min in einem Sorvall SS34-Rotor geklärt. Nun wird die Lösung auf eine Sepharose Cl-6B-Säule (5 x 100cm), die mit 6,5mM Boratpuffer (pH-Wert: 11,8) ins Gleichgewicht gesetzt ist, aufgegeben. Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit von 100ml/h entwickelt, wobei Fraktionen in einer Menge von 12ml aufgefangen werden. Der erste Ablauf der Säule wird verworfen. Die folgenden beiden Abläufe werden getrennt und gesammelt. Der erste^entspricht aggregiertem bGH niedriger Aktivität, der zweite bGH hoher Aktivität.

Eine DEAE-Sephacel (25g/100g äquivalent ppt)-Säule wird mit 6,5mM Boratpuffer (pH-Wert: 9,0) ins Gleichgewicht gesetzt. Der zweite bGH-Peak wird mit auf die DEAE-Sephacel-Säule mit einer Geschwindigkeit von 250 ml/h aufgebrachter HCI auf einen pH-Wert von 9,0 gebracht. Die Säule wird mit 7,5ml 6,5 mM Boratpuffer (pH-Wert: 9,0) gewaschen und mit 6,5mM Boratpuffer (pH-Wert: 9,0) mit 75mM NaCI eluiert. Die Fraktionen mit OD₂₈₀ über 0,3 werden gesammelt, gegen H₂O in einer Millipore Pecillon-Dialysevorrichtung dialysiert und dann lyophilisiert.

Beispiel 5 Aktivität des durch pRec2/3 produzierten bGH-Analogen

1. Radioimmunotestvergleich des bGH-Analogen mit natürlichem bGH.

Eine Lösung mit 100ng/ml bGH-Analogem in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1 % BSA) wird in einer Reihenverdünnung auf Konzentration von 50,25,12,5,6,25,3,12,1,56 und 0,78 ng/l verdünnt. Doppelte 0,1 ml aliquote Teile dieser Lösungen werden nach einem Doppelantikörperverfahren einem Radioimmunotest unterworfen. Die Verdünnungskurve ist mit der mit natürlichem bGH erhaltenen Verdünnungskurve vergleichbar.

2. Radiorezeptorbindungstest.

Nach dem von T.Tushima und H.G.Freisen in „Y. Chin.", Endocr. Metab. 37,334(1973) beschriebenen Verfahren wird ein Radiorezeptorbindungstest mit Kaninchenlebermembranen durchgeführt. Zur Aufstellung von Eichkurven werden als Isotopenindikator ¹²⁵l-hGH und authentische bGH-Lösungen verwendet. Dreifachproben werden 2 h lang bei Raumtemperatur in 0,3ml Testpuffer (5OmM Tris, 15mM CaCI₂ und 5mg/ml Rinderserumalbumin, pH-Wert: 7,6) inkubiert. Die Röhrchen enthalten ¹²⁵l-hGH (20000cpm einer Präparation von 30-60juci//i,g), 150-250^g Lebermembranprotein und entweder natürliches bGH (1-100 ng) oder Extrakte von bakteriellem bGH. Die Ergebnisse zeigen, daß die bGH-Aktivität des bGH-Analogen der Aktivität von natürlichem bGH vergleichbar ist.

3. Schienbein-bzw. Tibia-Test.

Die Bioaktivität des aus den gemäß Beispiel 4 geschaffenen Bakterienzellen gewonnenen pRec2/3 bGH-Analogen wird nach dejn von A. F. Parlowund Mitarbeitern in „Endocrinology", 77,1126 (1965) beschriebenen Schienbein-oder Tibia-Test getestet.

Bei 28-3Od alten Ratten wird die Hypophyse entfernt, worauf sie 10—14d lang ohne Behandlung bleiben. Rinderwachstumshormon aus Rinderhypophysen oder rekombiniertem E. coli wird in 0,15M NaCI + 0,01 M Borat (pH-Wert: 10,0) gelöst. Ratten (4 bis 7 Versuchstiere/Gruppe) erhalten 5 Tage lang bei normaler Nahrung (Purina Rat-Chow und Wasser ad-libitum) eine tägliche subkutane Injektion der bGH-Lösungen (5-125^g/Tag in 0,2 ml). Am 6.Tag werden die Versuchstiere getötet, die Vorderbein-Kniescheiben entnommen, längsgeschnitten, in Aceton fixiert und mit 2% AgNO₃ angefärbt. Danach wird durch Betrachtung durch ein Präparierbinokular die Breite der Epiphysenplatten ermittelt. Zum Aufstellen von Logdosis-Ansprech-Kurven werden Mittelwerte von 40 Ablesungen pro Ratte herangezogen. Die Ergebnisse zeigt Fig. 15.

Beispiel 6 bGH-Analoge

Die folgende Tabelle I enthält Angaben über eine Reihe von geschaffenen Plasmiden und daraus hergestellte Analoge.

Tabelle I

Plasmide	Aminoende der bGH-Analogen
Rec2/3	Met Asp Gin Phe²
pB1	Met Asp Pro Met GIy Ala Phe²
pM4	MetAspProPhe²
pM1	Met Ala¹ Phe²
pM2	Met Ala¹ Phe²
ρ AL 401	Met⁴
pYL301	Met GIy Ala¹ Phe²
pAL302	11 A.A + Ala¹Phe²
pHis129	MetThr Arg Phe²
pAL312	Met GIy Ala¹ Phe²
pAL322	Met GIy Ala¹ Phe²
pAL601R	Met GIy Ala¹ Phe²
p18	Met GIy Ala¹ Phe²
PBTG-800	Met GIu Phe²
pORF2-12	Ala GIyAIa¹ Phe²

Beispiel 7 Einfluß des pRec2/3 bGH-Analogen auf die Milchbildung von Milchkühen

Die milchbildende Wirkung von bGH ist in der wissenschaftlichen Literaturgut dokumentiert ,(vgl. J. Bines und Mitarbeiterin „Brit. J. Nutri."43,179 [1980], C. Peel und Mitarbeiterin „J. Nutr." 111,1662 [1981]). D.Bauman und Mitarbeiter berichten in „J. Dairy Sei.", Vol. Supp. 1, Abst 86 (1982), daß die Milchproduktion durch rDNS bGH gesteigert wird. Es wurde ein Versuch durchgeführt, um im Vergleich zu natürlichem bGH den Einfluß von pRec2/3 bGH auf die Milchbildung zu ermitteln. Achtzehn Holsteiner Kühe eines Alters von 141 bis 154d werden willkürlich für eine Behandlung bestimmt und entsprechend der Milchproduktion nach folgendem Schema geblockt: Vorbehandlung Behandlung Tägliche GH-Injektion

Kochsalzlösung

25 mg/d während 10 d 25 mg/d während 10 d

Kontrollversuch	5d
natürliches bGH	5d
pRec2/3bGH	5d

Die bGH's werden unmittelbar vor jeder täglichen Injektion mit wäßrigem 0,1 M NaHCO₃-Puffer (pH-Wert: 8,2) in einer Konzentration von 1 mg/ml in Lösung gebracht. Die Kühe erhalten die Placebo- oder bGH-lnjektionen täglich während 1Od an eine subkutane Stelle im Nackenbereich. Während der 5tägigen Vorbehandlung erfolgt keine Injektion.

Die Kühe werden zweimal täglich um etwa 6 Uhr morgens und 5 Uhr abends gemolken. Die Milchgewichte werden nach dem Boumatic-System aufgezeichnet und in das tägliche Datensystem eingegeben.

Die durchschnittlichen Milchproduktionswerte für die Vorbehandlungs- und bGH-Behandlungsdauer finden sich in der folgenden Tabelle II. Der Produktionsgrad der Vergleichskühe ändert sich nicht, während das Milchvolumen bei beiden bGH-Gruppen in ähnlichem Maße steigt. Das natürliche bGH bedingt eine 11,9%ige Zunahme der Milchproduktion während der lOtägigen Behandlungsdauer. Die Behandlung mit dem bGH-Analogen ergibt eine 10,2%ige Erhöhung der Milchproduktion.

Die Ergebnisse werden wegen der geringen Anzahl von Versuchstieren nicht auf ihre statistische Signifikanz hin analysiert. Die Größenordnung der Zunahme entspricht jedoch in etwa einschlägigen Literaturangaben.

Aus den Ergebnissen läßt sich der Schluß ziehen, daß pRec2/3 bGH die Milchproduktion bei Milchkühen ähnlich stimuliert wie natürliches bGH.

Tabelle Il

Einfluß von Rinderwachstumshormon auf die Milchproduktion Natürliches bGH gegen pRec2/3 bGH

	Nr.	Durchschnittliche tägliche Milchpro	Während der	prozentuale
Behandlung		duktion in kg/d	GH-Behandlung	Zunahme
Gruppe		Vorbehand	(1Od)	gegenüberder
		lung (5d)		Vorbehandlung
	6		25,97	—

Kontrollversuch	5	25,95	29,71	11,9
natürliches
bGH		26,55
25mg/d	6		28,73	10,2
pRec 2/3
bGH	26,07
25mg/d

Jede Kuh erhält während 10 eine tägliche subkutane Injektion von entweder dem Placebo oder eine bGH-Lösung.

Claims

- 1 - DOJ ZV

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung eines Wachstumshormons oder Analogen desselben, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Wiirt-Vektorsystem mit einem Plasmid, enthaltend

a) einen Vektor, der nach dem Einbau in eine geeignete bakterielle Wirtzelle mit dem thermolabilenRepressorCi die Wirtzelle nach Erhöhung ihrer Temperatur auf eine Temperatur, bei der der Repressor zerstört wird, zur Expression eines in den Vektor eingebauten gewünschten Gens und zur Bildung eines durch das Gen kodierten Wachstumshormons oder Analogen desselben befähigt und

1) ein Doppelstrang-DNS-Molekül, welches in der Reihenfolge 5' bis 3'

— eineDNS-SequenzmitdemPromotorundOperatorPLOLeinesX-Bakteriophagen;

— die N-Nutzungsstelle zur Bindung von durch die Wirtzelle gebildetem Antiterminator-N-Protein;

— eine DNS-Sequenz mit einer Ribosomenbindungsstelle zur Befähigung der mRNS des gewünschten Gens zur Bindung an Ribosomen in der Wirtzelle;

— ein ATG-Initiationscodon oder eine DNS-Sequenz, die bei Einfügung des gewünschten Gens in den Vektor in ein ATG-Initiationscodon übergeht und

— eine Restriktionsenzymstelle zum Einbau des gewünschten Gens in den Vektor in Phase mit dem ATG-Initiationscodon

enthält, sowie

2) zusätzlich eine DNS-Sequenz mit einem Replikationspunkt aus einem zur autonomen Replikation in der Wirtzelle fähigen bakteriellen Plasmid sowie eine DNS-Sequenz mit einem einem wählbaren oder identifizierbaren Phänotypusmerkmal zugeordneten Gen, das sich bei Anwesenheit des Vektors in der Wirtzelle zu erkennen gibt, umfaßt, und

b) ein das Wachstumshormon oder ein Analoges desselben kodierendes und in die Restriktionsenzymstelle eingefügtes Gen in einem geeigneten Wirt, unter die Bildung des Wachstumshormons oder eines Analogen desselben gestattenden Bedingungen wachsen läßt und das gebildete Wachstumshormon oder Analogen desselben abtrennt.

die Sequenz:

I I I I I I IACGGGAI I I I I HATG

AAAAAAATGCCCTAAAAAAATAC

aufweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirt Escherichia coli ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei Escherichia coli um den Stamm A1637, A1645, A2602 oder A1563 handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Doppelstrang-DNS-Molekül ringförmig ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur oberhalb etwa 42^CC liegt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ribosomenbindungsstelle C_M von einem λ-Bakteriophagen ist und die Sequenz:

TAAGGAAATACTTACAT

ATTCCTTTATGAATGTA

aufweist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ribosomenbindungsstelle ein synthetisches Oligonukleotid der Sequenz:

TAAGGAAGTACTTACAT

ATTCCTTCATGAATGTA
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ribosomenbindungsstelle aus dem Hauptkopfproteingen eines Bakteriophagen λ herrührt und die Sequenz:

MINI IACGGGAI I I I I I IATG

AAAAAAATGCCCTAAAAAAATAC

aufweist.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Restriktionsenzymstelle BamH1, Sac1 oder Nde1 ist.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Replikationspunkt von pBR322 herrührt.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Replikationspunkt von pR1 herrührt.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Phänotypusmerkmal aus einer Arzneimittelresistenz oder Temperaturempfindlichkeit besteht.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Arzneimittelresistenz aus einer Ampisillin-, Chloramphenicol- oder Tetracyclinresistenz besteht.
14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das gewünschte Gen Rinderwachstumshormon oder Analoge desselben kodiert.
15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das gewünschte Gen menschliches Wachstumshormon oder Analoge desselben kodiert.
16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das gewünschte Gen Schweinewachstumshormon oder Analoge desselben kodiert.
17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das gewünschte Gen Hühnerwachstumshormon oder Analoge desselben kodiert.
18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Vektor pMGIOO mit einer in Fig. 1 dargestellten Restriktionskarte, der bei der American Type Culture Collection unter der ATCC No. 39385 hinterlegt ist und eine in eine BamH1-Restriktionsstelle klonierte bGH cDNS aufweist (vgl. Fig.2), verwendet.
19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Vektor pND5 mit einer in Fig.3 dargestellten Restriktionskarte, der bei der American Type Culture Collection unter den ATCC Nos.39384 und 39386 hinterlegt ist und eine in eine Nde1-Restriktionsstelle klonierte hGH cDNS aufweist (Fig.4), verwendet.
20. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Plasmid verwendet, das neben dem in Anspruch 1 gekennzeichneten Vektor ein Rinderwachstumshormon oder ein Analoges desselben kodierendes und in die Restriktionsenzymstelle eingefügtes Gen enthält.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man das Plasmid pRec 2/3 bGH, das die Restriktionskarte gemäß Fig. 2 aufweist und bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC No.39385 hinterlegt ist, verwendet.
22. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man das Plasmid pROi 1, das die Restriktionskarte gemäß Fig.3 aufweist und bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC No. 39390 hinterlegt ist, verwendet.
23. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Plasmid verwendet, das neben dem in Anspruch 1 gekennzeichneten Vektor ein ein menschliches Wachstumshormon oder ein Analoges desselben kodierendes und in die Restriktionsenzymstelle eingefügtes Gen enthält.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man das Plasmid pTV 18(1), das die Restriktionskarte gemäß Fig.4 aufweist und bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC No.39386 hinterlegt ist, verwendet.
25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man das Plasmid pTV 104(2), das die Restriktionskarte gemäß Fig.4 aufweist und bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC No.39384 hinterlegt ist, verwendet.
26. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es der Gewinnung von Rinderwachstumshormon dient und mit dem Plasmid nach Anspruch 21 in einem geeigneten Wirt durchgeführt wird.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirt A1637, A1645, A2602 oder A1563 ist.
28. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es der Gewinnung von Rinderwachstumshormon dient und mit dem Plasmid nach Anspruch 22 in einem geeigneten Wirt durchgeführt wird.
29. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es der Gewinnung von Rinderwachstumshormon dient und mit dem Plasmid nach Anspruch 23 in einem geeigneten Wirt durchgeführt wird.
30. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es der Gewinnung von menschlichem Wachstumshormon dient und mit dem Plasmid nach Anspruch 24 in einem geeigneten Wirt durchgeführt wird.
31. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirt A1637, A1645, A2602 oder A1563 ist.
32. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es der Gewinnung von menschlichem Wachstumshormon dient und mit dem Plasmid nach Anspruch 25 in einem geeigneten Wirt durchgeführt wird.
33. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es der Gewinnung von menschlichem Wachstumshormon dient und mit dem Plasmid nach Anspruch 26 in einem geeigneten Wirt durchgeführt wird.
34. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Wachstumsbedingungen derart wählt, daß man das Wirt-Vektor-System eine geeignete Zeit lang bei etwa 42^CC wachsen und dann zusätzlich bei einer Temperatur von etwa 37-39⁰C weiterwachsen läßt,

wobei das Wachsen auf einem geeigneten Medium erfolgt.
35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß man das Wirt-Vektor-System etwa 10-30 min lang bei 42°C wachsen und so lange bei 37-39°C weiterwachsen läßt, bis die Gesamtwachstumsdauer etwa 60 min bis 90 min beträgt.
36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß man das Wirt-Vektor-System etwa 15 min lang bei 42°C wachsen und etwa 75min bei 38-39°C weiterwachsen läßt.
37. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß man als geeignetes Wachstumsmedium ein mit Glucose oder Gehirn/Herz-Aufguß bzw. Ansatz versetztes Lactalbuminhydrolysat verwendet.
38. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß man das Wirt-Vektor-System unter die Bildung von bGH gestattenden geeigneten Bedingungen wachsen läßt und das gebildete bGH abtrennt.
39. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß man das Wirt-Vektor-System unter die Bildung von bGH gestattenden geeigneten Bedingungen wachsen läßt und das gebildete bGH abtrennt.
40. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß man das Wirt-Vektor-System unter die Bildung von hGH gestattenden geeigneten Bedingungen wachsen läßt und das gebildete hGH abtrennt.
41. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß man das Wirt-Vektor-System unter die Bildung von hGH gestattenden geeigneten Bedingungen wachsen läßt und das gebildete hGH abtrennt.
42. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Analoges zu bGH einer ähnlichen Aminosäuresequenz, die sich von der Sequenz von natürlichem bGH um bis zu 5 Aminosäuren am N-Ende unterscheidet, herstellt.
43. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Analoges herstellt, das am N-Ende der Phenylalaninform von bGH die Aminosäure Methionin aufweist.
44. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Analoges herstellt, das am N-Ende der Alaninform von bGH die Aminosäure Methionin aufweist. "
45. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Analoges herstellt, das am N-Ende der Phenylalaninform von bGH die Aminosäuresequenz Met-Asp-Gln aufweist.
46. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Analoges herstellt, das am N-Ende der Alaninform von bGH die Aminosäuresequenz AIa-GIy aufweist.
47. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Analoges herstellt, das am N-Ende der Alaninform von bGH die Aminosäuresequenz Met-Gly aufweist.
48. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Analoges herstellt, das am N-Ende der Alaninform von bGH die Aminosäuresequenz Met-Asp-Pro-Met-Gly aufweist.
49. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Analoges herstellt, das am N-Ende der Phenylalaninform von bGH die Aminosäuresequenz Met-Asp-Pro aufweist.
50. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Analoges von bGH mit der Aminosäuresequenz Met-(X)_n-Y-Met..., worin Met das N-Ende darstellt, Yfür eine der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren steht, Y eine von GIu, GIn, Lys, Met oder Trp verschiedene der zwanzig Aminosäuren bedeutet, η einer ganzen Zahl von 0 bis 6 entspricht und Met... die Sequenz von natürlichem bGH von der Stelle 4 bis zum COOH-Ende (Stelle 191) darstellt, herstellt.
51. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Analoges mit der Aminosäuresequenz der Phenylalaninform von bGH nach Entfernung der Aminosäuren bis zum Methionin (Stellung 4) am N-Ende herstellt.
52. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Analoges mit der Aminosäuresequenz Met-Thr-Arg am N-Ende der Phenylalaninform von bGH herstellt.
53. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Analoges von hGH mit der Aktivität von natürlich vorkommendem hGH und einer ähnlichen Aminosäuresequenz, die jedoch von der Sequenz von natürlich vorkommendem hGH abweicht, herstellt.
54. Verfahren nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Analoges von hGH nach Entfernung der Aminosäuren bis zum Methionin (Stellung 14) am N-Ende herstellt.
55. Verfahren nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Analoges mit der Aminosäure Methionin am N-Ende von natürlich vorkommendem hGH herstellt.
56. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Analoges von hGH mit der Aminosäuresequenz MeHX)_n-Y-Met..., worin Met das N-Ende darstellt, Y für eine der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren steht, Y eine von GIu, GIn, Lys, Met oderTrp verschiedene der zwanzig Aminosäuren bedeutet, η einer ganzen Zahl von 0 bis 13 entspricht und Met... die Sequenz von natürlichem hGH von der Stelle 14 bis zum COOH-Ende (Stelle 191) darstellt, herstellt.

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