DD155004A5 - Verfahren zur herstellung eines dns-transfervektors - Google Patents

Abstract

Eine DNA mit einer menschliches Proinsulin codierenden Basensequenz sowie eine DNA mit einer menschliches Pre-Proinsulin codierenden Basensequenz wurden kloniert und es wurden neue rekombinante DNA-Transfer-Vektoren hergestellt, die diese klonierten DNAs enthalten. Neue Mikroorganismen wurden durch Transformation mit den rekombinanten Transfer-Vektoren erhalten.Bestimmte dieser transformierten Mikroorganismen zeigten die Faehigkeit zum Exprimieren der klonierten DNAs unter Synthese eines Proteins, das menschliches Proinsulin enthaelt und eines Proteins mit menschlichem Pre-Proinsulin.

Description

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2 2 3 8 7 3 - Al-Verfahren zur Herstellung eines DNS-Transfervektors

Anv/endungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von isoliertem und gereinigtem (nachsthend "kloniert" bezeichnet), .Proinsulin codierendes menschliches Gen und Pre-Proinsulin codierendes menschliches Gen, Verfahren zur Isolierung und Reinigung der Gene und ein Verfahren zum Übertragen der Gene · in einen Mikroorganismus und zu ihrer dortigen Eeplikation. Die klonierten Gene werden durch einen Wirts-Mikroorganismus exprimiert nach Fusion mit einem vom Wirt exprimierbaren prokaryontisehen Gen. Beide Gene sind brauchbar zur Herstellung von menschlichem Insulin für therapeutische Zwecke.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Insulin ist ein Hormon, das hauptsächlich von den B-Zellen der Bauchspeicheldrüse produziert wird. Die Verwendung dieses Hormons zur Behandlung von Diabetes ist hinreichend bekannt. Obgleich von Schlachthöfen Rinder- und Schweine-Bauchspeicheldrüsen als Insulin-Quellen geliefert werden, entwickelt sich eine Knappheit bei diesem Hormon, da die Zahl der Diabetiker weltweit ansteigt. Außerdem entwickeln manche Diabetiker allergische Reaktionen gegen Rinder- und Schwe ineinsulin mit nachteiligen Wirkungen.

Insulin besteht aus zwei Polypeptidketten, die als A- und ' B-Kette bekannt sind und die über Disulfidbrücken verknüpft sind. Die Α-Kette besteht aus 21 Aminosäuren, die B-Kette aus 30 Aminosäuren. Diese Ketten werden in vivo nicht unab-

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hängig voneinander synthetisiert, sondern sie entstammen einem direkten Vorläufer, der als Proinsulin bezeichnet V3ird, Proinsulin ist eine einzige Polypeptidkette, in der ein Peptid, das als C~Peptid bezeichnet wird, die A- und B-Ketten verknüpft (vergleiche Steiner, D₀ F·, et al., Science, 157, 697 (1967))₀ Dieses C-Peptid wird beim Einlagern des Insulins in die Sekrstionsgranulen der B« Zellen der Bauchspeichesdrüse vor der Sekretion ausgeschnitten, vergleiche Tager, H. S₁₆, et al_e, Ann« Eev_e Biochem_e fT3, 509 (197²O₀ ^Dio heutige Ansicht über die Funktion des C-Peptids geht dahin, daß es nur zur Bildung der dreidimensionalen Molekülstruktur dient_e Die Arainsäuresequenz des menschlichen Proinsulins ist in Tabelle 1 dargestellte In dieser Tabelle besteht die B-Kette aus den Aminosäuren 1 bis 30, das C-^eptid aus den Aminosäuren . 31 bis 65 und die A-Kette aus den Aminosäuren 66 bis 86_e

Tabelle 1

1 10

NHg-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu~Cys~Gly~Ser-His-Le u-Val-Glu-

20 AIa-Le u~Tyr-Le U-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Try-Thr-

• 30 40

i-Gl u-Asp-Le u-Gln-Val-Gly-Gln-

50 Val-Glu-Le u~Gly-Gly»Gly-Pro~Gly-Ala-Gly~Ser~Le u-GIn-Pro-

60 Le u-Aia-Le u-Glu-Gly-Ser-Le u-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-

70 80

GIn-Cy c-Cys-^hr-Ser-Ile-Cys-Ser-Le u-Tyr-Gln-Le u-Glu-Asn-86

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Die chemische Synthese dieser Sequenz aus 86 Aminosäuren ist zwar mit konventionellen Verfahren machbar, jedoch schwierig,

In den B-Zellen der Bauchspeicheldrüse ist das ursprüngliche Übertragungsprodukt nicht das Proinsulin selbst, sondern ein Pre-Proinsulin, das mehr als 20 zusätzliche Aminosäuren am Amino-Ende des Proinsulins besitzt; vergleiche Cahn, S. J., et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 71, 1964 (1976) und Lomedico, P. T., et al., Nucl. Acid Res., 2. · 381 (1976).-Die zusätzliche Aminosäuresequenz wird als Signal-Peptid bezeichnet. Im menschlichen Pre-Proinsulin (vergleiche Fig. 2) besitzt das Signal-Pept id 24 Aminosäuren der Sequenz

-24 -20

NHp-Met-Ala-Leu-Trp-Me t—Arg-Le u-Le u-Pro-Le u-Le u-Ala-Le u— Ie u-Ala-Le u~frp-Gly-Pro-Asp-Pro-Ala~Ala-Ala. Es wird angenommen, daß die Sequenz aus 24 Aminosäuren ein spezifisches ^sxg_nai für den vektorialen:, Transport des Polypeptide in das endoplasmische Eeticulum der B-Zellen darstellt, sie wird in dieser Phase vom Proinsulin .abgespalten (vergleiche Blobel, G., et al., J_e Cell. Biol., 67 835 (1975).

Es sind mehrere Fälle von Signal-Peptiden für eukaryontische Proteine bekannt, die durch Membranbarrieren transportiert werden. Ein spezifisches Spaltungsenzym wurde in einem zellfreien System beobachtet, das die Peptidbindung zwischen Signal-Peptid und aktivem Protein gleichzeitig bei der Passage durch eine Zellmembran hydrolysiert (siehe Blobel, G., et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 21* 361 (1978))..

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Die neueren Fortschritte in der Biochemie und der Technologie der Neukombination von DNA machten die Synthese von spezifischen Proteinen unter kontrollierten Bedingungen unabhängig vom höheren Organismus, aus dem die Proteine gewöhnlich isoliert werden, möglich« Öiese biochemischen synthe— tischen Methoden verwenden Enzyme und subzellulare Komponenten des Proteinsyntheseapparats lebender Zellen entweder in vitro in zellfreien Systemen oder in vivo in Mikroorganismen« In jedem Fall ist das Schlüsselelement die Bereitstellung einer Deoxyribonucleinsäure (DNA) spezifischer Sequenz, die die für die gewünschte Aminosäuresequenz erforderliche Information enthält, ^ine solche spezifische DNA wird als Gen bezeichnet« Die Code-Beziehung, bei der eine Deoxynucleotidsequenz verwendet wird zur Beschreibung der Aminosäuresequenz eines Proteins, wird nachstehend kurz erläutert, sie basiert auf Grundprinzipien, die im gesamten Gebiet der lebenden Organismen gelten«

Ein kloniertes Gen kann verwendet werden, um die. Aminosäuresequenz von in-vitro~=3ystemen synthetisierten Proteinen aufzuklären» Auf DNA ausgerichtete Protein-synthetisierende Systeme sind bekannt, siehe z. B, Zubay, G₆, Ann, Rev_e Gene~ ties, 2.» ²⁶7 (1973)» Ferner kann eine einsträngige DNA in vitro die Wirkung einer mess enger-= ENA erhalten, woraus eine sehr genaue translation der DNA-Sequenz folgt (Salas, J₉, et al., J* Biol_e Chem» 2££, 1012 (1968). Andere bekannte Techniken können in Kombination mit obigen Verfahrensweisen zur Verbesserung der Ausbeuten verwendet werden«

Die Entwicklung der Metboden der DNA-Neukombination machte es möglich, spezifische Gene oder Teile davon aus höheren Organfemen zu isolieren, z, B_e vom Menschen und anderen

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Säugetieren, und.diese Gene oder Fragmente in einen Mikroorganismus, ζ, B. eine Bakterie oder Hefe, zu übertragene Das übertragene Gen wird repliziert und vermehrt sich mit der Implikation des transformierten Mikroorganismus, Als Ergebnis kann der transformierte Mikroorganismus die Fähigkeit erhalten, jedes Protein zu erzeugen, das das Gen oder Gen-Fragment codiert, handle es sich um ein Enzym, ein Hormon, ein Antigen oder einen Antikörper oder ein Stück davon« Der Mikroorganismus vererbt diese Fähigkeit seinen Nachkommen, so daß in der Tat die Übertragung zu einem neuen Stamm mit der genannten Fähigkeit führt (siehe z« B« Ullrich, A. et al._t Science, 1^6j. 1313 (1?77) und Seeburg, P. J*, et al«, Nature, 270, 486 (1977))« Eine Voraussetzung, die der Anwendung dieser Technologie auf die Praxis zugrunde liegt, besteht darin, daß die DNA aller lebenden Organismen, von Mikroben bis zum Menschen, chemisch ähnlich ist und aus den gleichen 4 Nucleotiden besteht, Die signifikanten Unterschiede liegen in den Sequenzen dieser Nucleotide im polymeren DNA-Molekül, Die Nucleotide Sequenzen dienen zur -Beschreibung der Aminosäuresequenzen von Proteinen, die den Organismus bilden» Obgleich die meisten Proteine verschiedener Organismen sich voneinander unterscheiden, ist die Code—Beziehung zwischen Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz für alle - Organismen im Grunde gleich, iüie Nucleotidsequenz, die z, B» die Aminosäuresequenz von menschlichem.Wachstumshormon in menschlichen Hypophysenzellen codiert, codiert nach Übertragung in einen Mikroorganismus die gleiche Aminosäuresequenz«

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Die vorliegend verwendeten Abkürzungen sind aus Tabelle ersichtlich:

Tabelle 2

DNA - Deoxyribonucleinsäure ENA - Ribonucleinsäure cDNA - komplementäre DNA

(enzymatisch synthetisiert aus einer mENA-Sequenz) mENA - messenger™ENA ÖATP -« Deoxyadenosintriphosphat dGTP - DeoxyguanoBintriphosphat dCTP - Deoxycytidintriphosphat A - Adenin T - Thymin

G — Guanin G - Cytosin U - Uracil

ATP - Adenosintriphosphat TTP - Thymidintriphosphat EDTA - Ethylendiamintetraessigsäure

Die Code-Beziehung zwischen Nucleotidsequenz in DNA und Aminosäuresequenz in Protein ist als genetischer Code bekannt, siehe Tabelle 3s

Tabelle 3 . Genetischer Code

Phenylalanin TPhe) TTK . ·

Leucin (Leu) XTY

Isoleucin (He) ATM

ψ 2 2 3 8 7 3 -τ*- 27.3.1981

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Methionin (Met)	ATG
Valin (VaI)	GTL
Serin (Ser)	QES
PaX)Iin (Pro)	CCL
Threonin (Thr)	ACL
Alanin (AIa)	GCL
Tyrosin (Tyr)	TAK
Terminat ionss ignal	TAJ
Terminat ionss ignal	TGA
Histidin (His)	CAK
Glutamin (GIn)	CAJ
Asparagin (Asn)	AAK
Lysin (Lys)	AAJ
Asparginsäure (Asp)	GAK
Glutaminsäure (GIu)	GAJ
Cystein (Cys)	TGK
Tryptophan (Try)	TGG
Arginin (Arg)	WGZ
Glycin (GIy)	GGL

Schlüssel: Jedes Deoxynucleotid-Tripiett aus drei Buchstaben stellt ein Trinucleötid der mBNA dar, mit einem 5«-Ende links und einem 3'-Ende rechts. Alle vorliegend angegebenen DNA-Sequenzen sind diejenigen des Strangs, dessen Sequenz der mBNA-Sequenz entspricht j vsobei Uracil durch Thymin ersetzt ist. Die Buchstaben stehen für die Purin- oder Pyrimidinbasen, die die Deoxynucleotidsequenz bilden:

A s Adenin . .

G β» Guanin

C = Cytosin

T = Thymin

X=T oder C, falls Y=A oder G

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XsC, falls Y s C oder T

Y = A, 6, G oder T, falls X=C

Y s A oder G, falls X=T W=C oder A, falls Z=A oder G V/ = C, falls Z = C oder T

Z = A, G, C oder 0?, falls W=C

Z=A oder G, falls W=A

QH = TC, falls S _s A, G, C oder T

QE = AG, falls S=T oder C

S = A, G, C oder T, falls QE = TC

S = T oder C, falls QE = AG

J=A oder G

K = T oder C

L β A, T, G oder G

M= A, C oder T .

Ein nichtiges Merkmal des Öodes ist die Tatsache, daß jede Aminosäure beschrieben wird durch eine Trinucleotidsequenz, die auch als Nucleotid-Triplett bekannt ist. Die Phosphodi« ester-Bindungen, die benachbarte Tripletts verbinden, sind chemisch von allen anderen Internucleotid-Bindungen der DNA nicht zu unterscheiden« Daher kann die Nucleotidsequenz nicht als Code für eine einzige Aminosäuresequenz gelesen werden, ohne daß zusätzliche Information über den Leseraäter vorliegt, womit die Gruppierung der Tripletts erkannt wird und in der Zelle die Entschlüsselung der genetischen Nachricht erfolgt.

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Verschiedene Techniken der DNA-Neukombination verwenden zwei Klassen von Verbindungen, Transfer-Vektoren und Restriktionsenzyme, die nacheinander beschrieben werden. Ein Transfer-Vektor ist ein DNA-Molekül, das unter anderem die genetische Information enthält, die die eigene Implikation nach Übertragung in den Stamm eines Wirts-Mikroorganismus sicherstellte Beispiele für häufig verwendete Transfer-Vektoren sind Plasmide und die DNAs bestimmter Bakteriophagen« Bei den vorliegenden Arbeiten wurden zwar Plasmide als Transfer-Vektoren verwendet, doch können auch andere Arten von Transfer-Vektoren eingesetzt werden« Unter einem Plasmid versteht man eine sich autonom replizierende DNA-Einheit, die in einer Mikroorganismus-Zelle neben dem Genom der Wi_rtszelle selbst vorliegen kann« ^in Plasmid ist.mit dem Chromosom der '^irtszelle nicht genetisch verknüpft, Plasmid-DNAs liegen als doppeIsträngige Ringe mit einem Molekulargewicht im allge-. meinen in der GiOßenordnung von einigen Million Dalton vor« Obgleich in manchen Fällen auch Molekulargewichte von mehr

als 10 Dalton vorkommen. Sie stellen gewöhnlich nur eine kleine prozentuale Menge der gesamten DNA der.Zelle dar« Eine Transfer-Vektor-DNA läßt sich gewöhnlich von der DNA der Wirtszelle aufgrund der erheblichen Größenunterschiede absondern,, Transfer-Vektoren tragen genetische Information, die sie zur Replikation in der Wirtszelle befähigt, in den meisten Fällen unabhängig von der Geschwindigkeit der Zellteilung, Einige Plasmide besitzen die Eigenschaft, daß ihre Replikationsgeschwindigkeit durch Veränderung der Wachstumsbedingungen gesteuert werden kann. Mit geeigneten Techniken kann der ^ing der Plasmid-DNA geöffnet werden, ein Fragment einer heterologen DNA wird inseriert, und der Ring wird erneut geschlossen, wobei ein vergrößertes Molekül entsteht,

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das das inserierte DNA-Segment enthält» Bakteriophagen-DNA kann ein Segment heterologer DNA inseriert enthalten anstelle bestimmter nichtessentieller Phagengene, In jedem Fall dient der Transfer-Vaktor ^als Übertrager oder Vektor eines inserierten Fragments aus heterologer DNA«,

Die Übertragung erfolgt in einem Verfahren* das als Transformation bezeichnet wird..-Während der transformation nehmen mit Plasmid-DNA vermischte Bakterienzellen gesamte Plasmidmoleküle in die Zellen auf«, Obgleich der Mechanismus des Vorgangs unbekannt ist, ist es möglich, den Anteil der zur Aufnahme von Plasmid-DNA und damit zur Transformation befähigten Bakterienzellen zu maximleren durch bestimmte, empirisch ermittelte Behandlungen* Sobald die Zelle ein Plasmid einverleibt hat, wird dieses in der Zelle repliziert, und die Plasmid-Wiederholungen werden bei der Zellteilung auf die Tochterzellen verteilte Im Prinzip kann jede genetische Information, die in der Nucleotidsequenz der Plasmid~DNA enthalten ist, in der ^irtszelle exprimiert werden« Typischerweise erkennt man eine transformierte Wirtszelle daran, daß sie.vom Plasmid beigesteuerte Züge angenommen hat, wie z, B«, Resistenz gegen bestimmte Antibiotika, Verschiedene Plasmide erkennt man an verschiedenen Fähigkeiten oder der Kombination von Fähigkeiten, die sie den Wirtszellen vermitteln,, Jedes Plasmid kann vermehrt werden, indem man eine reine Kultur plasmidhaltiger Zellen vermehrt und die Plasmid-DNA daraus isoliert*

Restriktions-Endonucleasen sind hydrolytische Enzyme, die eine stellungsspezifische Spaltung von DNA-Molekülen katalysieren» Die Wirkungsstelle der Kestriktions-Endonuclease

ΛΛ

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wird durch das Vorliegen einer spezifischen Nucleotidsequenz bestimmt. ^Diese Sequenz nennt man die Erkennungsstelle der Restriktions-Endonuclease. Restriktions~Endonucleasen aus verschiedenen Quellen wurden isoliert und bezüglich der Nucleotidsequenz ihrer Brkennungsstellen cha— rakterisiert. ^Einige Restriktions-Endonucleasen hydrolysieren die Phosphodiester-Bindungen in beiden Strängen an der gleichen Stelle, so daß stumpfe Enden entstehen» Andere katalysieren die Hydrolyse von Bindungen, die um einige Nucleotide voneinander entfernt sind, wobei freie einsträngige Legionen an jedem Ende des gespaltenen Moleküls entstehen«, Diese einsträngigen Enden sind selbst komplementär und daher kohäsiv, sie können zur Wiedervereinigung der hydrolysierten DNA verwendet v/erden. Da jede DNA, die durch ein solches Enzym spaltbar ist, die gleiche Erkennungsstelle besitzen muß,^ entstehen gleiche kbhäsive Enden, so daß es möglich ist, heterologe DNA-Sequenzen zu verknüpfen, die mit einer Restriktions-Endonuclease.behandelt wurden (vergleiche Roberts, R₉ J., Cri*. Rev_e Biochem«, 4, 123 (1976))* Erkennungsstellen sind relativ selten, jedoch wurde die allgemeine Anwendbarkeit der Restriktions-Bndonucleasen erheblieh erweitert durch chemische Synthese doppe1strängiger Oligonucleotide mit der Sequenz der Erkennungsstelle. Man kann daher praktisch jedes Segment einer DNA mit einem anderen Segment verknüpfen, indem man einfach das entsprechen-» de Restriktions-Oligonucleotid an die Molekülenden anhängt und das Produkt der hydrolytischen Wi_rk;ung der entsprechenden Restriktions-^Bndonuclease unterwirft, wobei die erforderlichen kohäsiven Enden entstehen (vergleiche Heynecker, H₀ L., et al,, Nature, 26£, 74-8 (1976) und Scheller, R„ H., et al.,

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Science, 1^6, 177 (1977)» ^Ein wesentliches Merkmal der Verteilung von Erkennungsstellen von Res trikt ions—Endonuo-leasen ist die Tatsache, daß sie in bezug auf das Leseraster zufällig verteilt sind» Folglich kann die Spaltung durch Restriktions-Endonuclease zwischen benachbarten Codons oder innerhalb eines Codons erfolgen«,

Weitere allgemeine Methoden zur DNA-Spaltung oder zur Modifizierung der Endsequenz stehen zur Verfügung» Mit verschiedenen nichtspezifischen Endonucleasen kann DNA zufällig gespalten werden, wie nachstehend noch beschrieben wird« End-» Sequenzen können modifiziert werden, indem man Oligonucleotid-Schwänze aus dA an einem Ende und dT am anderen Ende oder aus dG und dC bildet,, um Bindungsstellen zu erzeugen_s die keiner spezifischen Bindegliedsequenzen bedürfen.

Die Bezeichnung "Expression" wird verwendet in Anerkennung der Tatsache, daß ein Organismus nur selten, wenn überhaupt, alle ihm genetisch zustehenden Fähigkeiten zu einem bestimmten Seitpunkt ausnützte Sogar bei relativ einfachen Organismen wie Bakterien werden zahlreiche Proteine, zu deren Synthese die Zelle befähigt ist, nicht gebildet, obgleich sie unter geeigneten Milieubedingungen entstehen können,, Wird das durch ein bestimmtes Gen codierte Proteinprodukt vom Organismus synthetisiert, so sagt man, daß das Gen exprimiert wird* Entsteht das Proteinprodukt nicht, so wird 'das Gen nicht exprimiert» Gewöhnlich wird die Expression von Genen in E« coli, wie nachstehend allgemein beschrieben, reguliert, derart, daß Proteine, deren Funktion in einem gegebenen Milieu nicht nützlich ist, nicht synthetisiert werden und

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Stoffwechselenergie gespart wird. Die Steuerung der Gen-Expression in E. coli ist als Ergebnis umfangreicher Studien im Verlauf der letzten 20 Jahre gut bekannt (siehe Hayes, W», The Genetics of Bacteria and their Viruses, 2. Aufl., John Wjjey & Sons, Inc,, New York (1968) und Watson, J. D., $he Molecular Biology of the Gene, 3« Aufl·,· Benjamin, Menlo Park, California (1976))* ^Diese Untersuchungen haben ergeben, daß mehrere Gene, gewöhnlich solche, die Proteine zur Ausführung verwandter Funktionen in der Zelle codieren, als Cluster in kontinuierlicher Sequenz vorliegen«, Das Cluster wird als Operon bezeichnet» Alle Gene im Operon werden in gleicher Richtung transkribiert, beginnend mit den die N~terminale Aminosäuresequenz des ersten Proteins der Sequenz codierenden Codons und fortlaufend bis zum C-terminalen Ende des letzten Proteins im Operon. Am Anfang des Operons, benachbart zum N-terminalen Aminosäure-Codon, liegt eine Region der DNA, die als Kontrollregion bezeichnet wird und die eine Vielzahl steuender Elemente umfaßt wie den Operator, Promotor und Sequenzen für ribosomale Bindungsstellen. Die Funktion dieser Stellen besteht darin, daß die Expression der unter ihrer Kontrolle stehenden Gene auf die Bedürfnisse des Organismus reagiert. Beispielsweise werden Gene, die Enzyme codieren, welche ausschließlich dem Lactose-Abbau dienen, gewöhnlich nicht in erheblicher Menge exprimäert, wenn nicht Lactose oder ein Analogon davon tatsächlich im Medium vorhanden ist» Die Funktion der Kontrollregion, die vorhanden sein müssen, damit Expression stattfindet, sind der Beginn der Transkription und Beginn der Translation, Die Expression des ersten Gens der Sequenz wird eingeleitet durch die Einleitung von Transkription und Translation in der die N-terminale

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Aminosäure des ersten Proteins des Operons codierenden Stellung«, ^ie Expression jedes Gens stromabwärts von dieser Stelle beginnt ihrerseits, mindestens bis ein Terminationssignal oder ein anderes Operon mit dessen eigener Kontrollregion eingreifen, die auf eine andere Kombination von Milieubedingungen reagieren« Bei zahlreichen Variationsmöglichkeiten dieses allgemeinen Schemas besteht die wichtige Tatsache darin, daß ein Gen zur Expression in einem Prokaryonten wie I, coli in bezug auf eine Kontrollregion mit einem Initiator für T_ranskription und einem Initiator für Translation richtig angeordnet sein muß₀

Bs wurde gezeigt, daß Gene, die kein üblicher Teil eines bestimmten Operons sind, in das Operon inseriert und von diesem gesteuert werden.können. Die klassische Demonstration erfolgte durch Eacob, P. et al., J, Mol. Biol*, 1^, 704 (1965)β ^ei diesem ^ersuch wurden G_Qne, die Enzyme einer Purin-Biosynthese codierten, in eine durch das Lactose-Operon kontrollierte Kegion übertragen,. Die Expression des Enzyms der Purin-Biosynthese wurde dann in Abwesenheit von Lactose oder einem Lactose-Analogon unterdrückt und blieb unbeeinfluß von den Milieubedingungen, die gewöhnlich diese Expression regulieren.

Zusätzlich zur Operator-Region, die die Einleitung der !Transkription von Genen stromabwärts reguliert, gibt es Codons, die als Stopp-Signale wirken und das C-terminale Ende eines bestimmten Proteins anzeigen (vergleiche Tabelle 3). Diese Dodons sind als Terminationssignale· und auch als Null-Codons bekannt, da sie gewöhnlich keine Aminosäure codieren«, Die Streichung eines Terminationssignals zwischen strukturellen G_Qnen eines Operons erzeugt ein fusioniertes Gen, das zur Synthese eines chimärischen Proteins führen

AS

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könnte, das aus zwei von benachbarten Genen codierten AminosäureSequenzen besteht, die über eine Peptidbindung verknüpft sind. Die Bildung solcher chimärischen Proteine bei Gen-Fusion wurde von Benzer, S. und Champe, S. P«, Proc_e Nat, Acad. Sei, USA, 48, 114 (1962) gezeigt*

Sobald ein bestimmtes Gen isoliert, gereinigt und in einen Transfer-Vektor inseriert wurde, was man als "Klonierung" des Gens bezeichnet, ist die Verfügbarkeit in ausreichenden Mengen sichergestellt. Das klonierte Gen wird in einen geeigneten Mikroorganismus übertragen, in dem es sich repliziert und aus dem es nach konventionellen Verfahren wieder isoliert werden kann« Man erhält auf diese Weise eine stetig erneuerbare Quelle des Gens für weitere Versuche, Abwandlungen und Transfer in andere Vektoren oder an anderen Stellen des gleichen-Vektors.

Die Expression wird erzielt, indam man das klonierte Gen bei richtiger Orientierung und Leseraster in eine Kontrollregion einführt, derart, daß das Ablesen des prokaryontischen G_{ens Z}ur Synthese eines chimärischen Proteins führt, welches vom klonierten ^Gen codierte irminosäuresequenz enthält«, Zahlreiche spezifische ProteinspaLtungsverfahren können eingesetzt werden, um das chimärische Protein an einer gewünschten Stelle zu spalten, so daß die gewünschte Aminosäuresequenz frei wird, die dann in konventioneller Weise gereinigt werden kann. Techniken zum Aufbau eines Expressions-Transfer—Vektors mit dem klonierten Gen in geeigneter Stellung zu einer Kontrollregion wurden beschrieben von Polisky, B., e-t al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 21» 3900 (1976);

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Itakura, K., et al., Science, 1^8, 1056 (1977); Villa-Komaroff, L·, et al., Proc, Nat. Acad, Sci_o USA, ££> 3727 (1978); Mercereau-Puijalon, 0·, et al., Nature, 275, 505 (1978); Chang, A. C* Y,, et al., Nature, 22£, 617 (1978) und in der US-PS (US-Patentanmeldung 933 035).

Das Verfahren, durch das ein Säugetierprotein wie z. B„ menschliches Pre-Proinsulin oder Proinsulin mit Hilfe der Technologie der DNA-Rekombination erzeugt wird, erfordert zunächst die Klonierung des Säugetiergens_ö Nach Klonierung kann das Gen in Mengen produziert, chemisch oder enzymatisch reiter modifiziert und in ein Expressions-Plasmid transferiert werden. Das klonierte Gen eignet sich auch zur Isolierung verwandter Gene oder*, bei Klonierung e5n.es Frag«» mentSj zur Isolierung des gesamten Gens, wobei das klonierte Gen als Hybrid is ie rungsansatiz .verwendet wird_e Ferner ist das klonierte Gen brauchbar, um durch Hybridisierung die Identität oder Homologie unabhängiger Isolate des gleichen oder verwandter Gene nachzuweisen« Aufgrund des genetischen Codes bestimmt das klonierte Gen nach Translation im geeigneten Leseraster die Produktion nur der Aminosäuresequenz, die es codiert, und keiner anderen.

Über die Isolierung und Einigung von Rat ten-Pro insulin wurde bereits gearbeitete Ullrich, A., et al., loc« cit«, und "ViI Ia-Ko maro ff, L«, et al., loc. cito beschreiben die Isolierung und Reinigung von Eatten-Proinsulingeη und ein Verfahren zur Übertragung dieses Gens in einen Mikroorganismus und dessen Replikation dort, Ullrich et al,, erhielten mehrere rekombinante Plasmide, die die Codier-Sequenz für Proinsulin, die 3^f-untranslierte Region und einen Teil des

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Vorpeptids enthielten. Die Expression der Ratten-DNA mit der Codier-^equenz für Insulin ist in der US-PS (US-PaimtanmeIdung 933 035) beschrieben. Villa-Komaroff et ale erhielten ein rekombinantes Plasmid, das die Codier-Sequenz für die Aminosäuren 4 bis 86 von Proinsulin enthielt, üiese Proinsulin-Sequenz wurde von den Aminosäuren 24 bis 182 der Penicillinase (jß-Lactamase) getrennt durch die Codier-Sequenz von 6 Glycinen_e ^Diese Codier-Sequenz für Penicillinase-Proinsulin wurde exprimiert zur Bildung eines Fusionsproteins, In den genannten Literaturstellen werden einige der Grundverfahren der Technologie der DNA-Rekombination beschrieben. Nicht beschrieben wird jedoch die Isolation und Reinigung von menschlichem Pre-Proinsulin«= gen oder menschlichem Proinsulingen.

Einen anderen Versuch zur Herstellung von.menschlichem Insulingen unternahmen Crea, R₄,, et al„, Proc_o Nat. Acad. Sci_e USA* Hi 5765 (1978), Hierbei folgte chemische Synthese der Codier-Sequenzen für (1) die A-Kette und (2) die B-Kette von menschlichem Insulin unter Verwendung von Codons, die von E. coli bevorzugt werden,. Diese beiden Sequenzen können dann in Plasmide inseriert werden, die bei der Expression die A- und B-Ketten bilden«, Menschliches Insulin könnte dann erzeugt werden durch Ausbildung der.korrekten Disulfidbrücken zwischen den beiden Proteinketten.

Das klonierte Gen für menschliches Pre-Proinsulin ist in verschiedener Weise brauchbar. Die Transposition in einen Expressions-Transfer-^Vektor erlaubt die Synthese von Pre-Proinsulin durch einen Wirts-Mikroorganismus, der mit dem

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das klonierte Gen tragenden Vektor transformiert wurde* Das Wachstum des transformierten Wirts führt zur Synthese von Pre-Proinsulin als Teil eines chimärischen Proteins_e Ist der prokaryontische Teil des Fusionsprote ins das Signalstück eines ausgeschnittenen oder anderweitig abgeteilten Wjbrfcsproteins, so können Ausschnitt oder Abteilbildung erfolgen und Stabilität und Eeinigungsfähigkeit des Pre«Proinsulin/Pusionsproteins erheblich verbessern. Ist der prokaryontische Anteil kurz, so kann ein Ausschnitt aus dem prokaryontischen Wirt erleichtert werden durch das Vorpeptid selbst, falls die Pre-Sequenz im prokaryontischen Wirt so wirkt wie in der eukaryontischen Zelle, Das Pre-Proinsulingen kann auch verwendet werden, um Proinsulingen auf nachstehend beschriebene Weise zu erhaltene

Das klonierte Pre-Proinsulingen kann bei verschiedenen Techniken zur Produktion von Pre-Proinsulin eingesetzt werden, Pre-Proinsulin ist von Nutzen, da es nach bekannten enzymatischen oder chemischen Verfahren in Proinsulin umgewandelt werden kann» Beispielsweise kann das Vorpeptid entfernt werden durch ein lösliches enzymatisches Präparat, siehe Blobel, G„, et al», loc«, cit,, das spezifisch Signalpeptide entfernt. Das klonierte Proinsulingen kann in verschiedenen Verfahren zur Herstellung von Proinsulin eingesetzt werden. Das mit dem einen oder anderen Gen prodt>« zierte Proinsulin läßt sich durch bekannte enzymatische oder chemische Verfahren.in Insulin überführen, siehe Kemmber, W., et al., J. BiOl₀ Chest. 242, 6786 (1971).

2 2 3 8 73 -*fc-- 27.3.1981

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Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, mit dem menschliches Insulin in für den Weltbedarf ausreichenden Mengen hergestellt werden kann. ,

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Gene herzustellen, die in Mikroorganismen inseriert und zur Herstellung von menschlichem Insulin verwendet werden können*

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines DNA« Transfer-Vektors zur Erhaltung und Keplikation einer menschliches Pre-Proinsulin codierenden Deoxynucleotidsequenz, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine menschliches Pre-Proinsulin codierende Deoxynucleotidsequenz mit einem DNA-Molekül umsetzt, das durch Spaltung eines Transfer-Vektors mit einem Restriktionsenzym erhalten wurde«

Dabei umfaßt die menschliches Pre-Proinsulin codierende Döoxynucleotidsequenz einen plus-Strang folgender Sequenz:

5 •-ATG_₂₄GCL_-23X„₂₂TY_i_₂₂TGG_Ä21

—Ί7 "^—Ί7^·^— 16^"—15^—15^·—Ί4^—Ί4^^—13^"—Ί 2^—12^—11 —

2 2 3 8 7 3 -3O- 27 ·3.1981

AP C 12 Ν/223 (58 145 / 18)

₁₉

GCL_2OGAJ

_2O

TTK₀,. TTK_{0 c}TAK_orACL_or7CCL_oftAA J₀₀ACLo _nWo _Λ ^GZ ο λ Wo oGZ^ _oGA J £4 do cx> d/ do dy J>\j 5Ί J I $d j)d

ATI^₅TGK₇₆QE₇₇S₇₇X₇₈TY₇₈TAIi₇₉CAJ₈₀X₈₁TY₈₁GAJ₈₂AAK₈₃TAK₈₄

A = Deoxyadenyl, G = Deoxyguanyl C = Deoxycytosyl ¹S = Thymidyl J=A oder G K ss T oder C L s A, T, α oder G " M rs A, C oder T X_n = T oder C, falls Y_n = A oder G_t und C, falls Y_n = C oder T

Y s A, G, C oder T, falls X_n = C, und A oder G, falls

ss C oder A, falls Z_n = G oder A, und C, falls X_n a C oder T

2 2 3 8 7 3 _34~ ' 27o3«1981

AP C 12 N/223 873 (58 145 / 18)

Z_n = A, G, C oder T, falls W_n s C, und A oder G, falls W_n = A

QE_n = TC, falls S_ß s A, G, C oder 0?, und AG, falls S_n s .

T oder C

S_n s A, G, C oder T, falls QE_n =s TC, und T oder C, falls QE_{n s} AG

und die tiefgestellten Ziffern η die Stellung in der Aminosäuresequenz des menschlichen Proinsulins, dem jedes Triplett in der Nucleotidsequenz entspricht, nach dem genetischen Code bedeuten, wobei die Aminosäurestellungen vom Amino-JSndo her beziffert sind«,

Kloniert wurde eine cDNA mit der menschliches Pre-Proinsulin codierenden Basensequenzen und eine cDNA mit der menschliches Proinsulin codierenden Basensequenz. Die Struktur der klonierten cDNAs wurde durch Nucleotidsequenzanalyse aufgeklärt«

Die ursprüngliche Quelle des genetischen Materials war ein Insulin produzierender menschlicher Tumor_o Aus den Zellen wurde die mENA isoliert.

Zur isolierten mENA komplementäre DNA (oDNA) wurde synthetisiert unter Vervsendung von reverser Transkriptase in zwei EeaktionseyeIeη, wobei doppeIsträngige cDNA erzeugt wurde. Die ungespaltene, heterogene, doppeIsträngige cDNA wurde so behandelt, daß spezifische VerbindungsoligonucleotidT Sequenzen an jedem Ende entstanden, um die Inserierung an einer Stelle mit gleicher Eestriktionsspezifität in einem Transfer-Vektor zu ermöglichen.

&2

2 2 3 8 7 3 „^ _; . 27.3.1981

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Zur Klonieriing wurde ein Transfer-Rektor mit guten Selektions- und beständigen Eeplikationseigenschaften ausgewählt. Die vorbehandelte cDNA wurde in einen Transfer-Vektor an vorbestimmter Stelle der Vektor-DNA inseriert unter Bildung eines rekombinanten Transfer-Vektors, unter Anwendung der gängigen Techniken_e Die Zellen des Wirts-» Mikroorganismus wurden durch den rekombinanten Vektor transformiert, die Transformationsprodukte wurden selektioniert nach den Kriterien, die für Inserierungen an vorbestimmter Stelle entwickelt wurden,, linzelkolonien, jeweils entstammend aus einer einzelnen transformierten Mikroorganismuszelle, wurden herausgenommen und in Einzelkulturen gezüchtet, um die Implikation der,rekombinanten Transfer— vektor-DNA-Clone zu ermöglichen«, Die Transfervektor DNA wurde in einer modifizierten Hybridis ierungsmethode auf Insulinsequenzen untersucht* Kolonien, die rekombinante Transfervektor-DNA für Insulinsequenzen ergaben, wurden in größeren Einzelkulturen gezüchtet₉ um Transfervektor-DNA zu gewinnen und zu analysieren«, Geeignete Clone wurden zur entgültigen Identifizierung der Nucleotidsequenz der klonierten Pre-Proinsulin- oder Proinsulingene ausgewählt und zur Übertragung in geeignete Expressionsplasmide»

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung einer Deoxynucleotidsequenz, die menschliches Proinsulin codiert, welches zur Synthese von menschlichem Insulin dient, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die 3'-Enden einer menschliches Pre-Proinsulin codierenden Deoxynucleotidsequenz, erhalten und repliziert gemäß der Erfindung, in ein oder mehreren Cyclen einer stufenweisen exonucleolytischen Digerierung hydrolysiert, die durch T^-DNA-PoIy-

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merase katalysiert wird, welche in Gegenwart von Deoxynucleotidtriphosphat wirksam ist, dann die 5'-Enden der Deoxynucleotidsequenz hydrolysiert durch eine nucleolytische Digerierung, die durch ein Nucleaseenzym katalysiert wird, welches spezifisch ist für einsträngige DNA mit einem 5«-Ende.

Dabei wird die menschliches Pre-Proinsulin codierende Sequenz vor der T4—DNA-Polymerase-Digerierung an einer spezifischen Stelle hydrolysiert durch eine Reaktion, die durch Hhal-Endon uc lease katalysiert wird«,

Insbesondere wird das Verfahren zur Herstellung einer menschliches Proinsulin codierenden Deoxynucleotidsequenz' zur Synthese von menschlichem Insulin in der Weise ausgeführt, daß man ein einen Teil des menschlichen Proinsulins codierendes cDNA-Fragment, das hergestellt wurde durch

. Spaltung einer menschliches Pro-Preinsulin codierenden cDNA, mit einer Restriktions-Endonuclease mit einer einzigen Erkennungsstelle in der Deoxynucleotidsequenz, mit einer

• chemisch synthetisierten DNA umsetzt, deren Deoxynucleotidsequenz den vom genannten cDNA-Fragment nicht codierten Teil des menschlichen Proinsulins codiert, in einer durch DNA-Ligase katalysierten Verknüpfungsreaktion stumpfer Enden. *

Als Restriktions-Endonuclease wird dabei AIuI verwendet.

Die menschliches Proinsulin codierende Deoxynucleotiidse·· quenz umfaßt einen plus-Strang der Sequenz:

an

2 3 8 7 3 "³^ 27.3.1981·

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5 '-TTK₁ GTL₂AAK₃CAJ₄CAK₅X₆TI₅TGK₇GGL₈Oe₉X₉CAK₁ QX₁₁TY_{1 λ} GTL

GCL₃₄GAJ_{3 5}GAK₃^₃₇TY₃₇CAJ₃₈GTL₃qGGL^qCAJ₄₁GTL₄₂GAJ₄₃X₄₄

CCL₅₅X₅₆TY₅₆GCL₅₇X₅₈TY₅₈GAJ₅₉GGL₆₀QE₆₁S₆₁X₆₂TT₆₂CAj₆₃AAJ₆₄

AM₇₅TGI^₇₆QE₇₇S₇₇X₇₈TY₇₈TAK₇₉CAJ₈₀X₈₁TY₈₁GAJ₈₂AAKg₃TAKg₄ TGK₈₅AAK₈₆TAG-3«

A =: Deoxyadenyl,, G = Deoxyguanyl C = Deoxycytosyl T ss Thymidyl J=A oder G K-T oder C L s A, T, C oder G M = A, C oder T X_n"a T oder C, falls Y_n = A oder G, und C, falls Y_n = C oder T Y_n s A, G, C oder T, falls X=C, und A oder G, falls

W_n = C oder A, falls Z_n = G oder A, und C₅ falls Z_n = C oder T Z_n s A, G, C oder T, falls W_n =s G, und A oder G, falls W_n = A

22 3 8 73 _^ 27·3.1981

AP C 12 Ν/223 (58 145 / 18)

_n s TC, falls S_n s A₁ G₁ C oder T, und AG, falls S_n β T oder C

S_n s A, G, C oder T, falls QE_n - TC, und T oder C, falls QR_n-AG

und die tiefgestellten Ziffern η die Stellung in der Aminosäuresequenz von menschlichem Proinsulin, dem jedes Triplett in der Nucleotidsequenz nach dem genetischen Code entspricht, bedeuten, wobei die Aminosäurestellungen vom Amino-Ende her beziffert sind.

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren*zur Herstellung eines DNA-Transfer-Vektors, der zur Erhaltung und Replikation einer menschliches Proinsulin codierenden Deoxynucleotid— sequenz dient, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine menschliches Proinsulin codierende Deoxynucleotidsequenz mit einem DNA-Molekül umsetzt, das durch Spaltung eines Transfer-Vektors mit einem Restriktionsenzym erhalten wurde*.

Bei der Herstellung des Plasmids pcHP wird in der Weise gearbeitet, daß das durch Spaltung eines Transfer-Rektors mit einem Eestrikt ionsenzym hergestellte DNA-Molekül pBE 322 und das Res trikt ions enzym Pstl«-Endonuclease ist.

Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Expressions-transfer-Vektors zum Exprimieren einer menschliches Pre-Proinsulin oder menschliches Proinsulin codierenden Deoxynucleotidsequenz, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das DNA-Molekül, das durch Spaltung eines Transfer-Vektors mit einem Restriktionsenzym hergestellt wurde, an einer Stelle innerhalb einer exprimierbaren Kontrollregion gespalten ist.

2 2 3 8 7 3 -36- 27.3o1981

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Weiterhin umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins, das die Aminosäuresequenz von menschlichem Pre—Proinsulin als C-terminale Sequenz und einen Teil eines prokaryentischen Proteins als N-terminale Sequenz aufweist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus inkubiert, der transformiert wurde, durch einen Expressions-Transfer-Vektor mit einer menschliches Proinsulin oder menschliches Pre-Proinsulin codierenden Deoxynucleotidsequenz,

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Synthese von menschlichem Proinsulin, das A- und B-Peptide durch ein C-Peptid voneinander getrennt enthält_f das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus inkubiert, welcher durch einen Expressions-TransferVektor transformiert wurde, der eine Deoxynucleotidsequenz enthält, welche menschliches Proinsulin codiert, unter zur Expression der codierenden Sequenz geeigneten Bedingungen, und das menschliche Proinsulin aus dem Lysat oder Kulturmedium des Mikroorganismus reinigt_e

Dabei umfaßt die B-Kette von menschliches Insulin codierender Deoxynucleotidsequenz einen plus-Strang der Sequenzi

5*-TTK₁GTL₂AAK₃CAJ₄CAk₅X₆TY₆TGK₇GGL₈QR₉S ^CAK₁QX_{1 λ} TI₁₁GTL₁₂

-.30^f

und die die A-Kette codierende Deoxynucleotidsequenz einen plus-Strang der Sequenz umfaßt:

2 2 3 8 7 3 --39- 27.3.1981

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A = Deoxyadenyl

G - ^eoxyguanyl

C = Deoxycytosyl

T = ^hymidyl

J=A oder G

K=O? oder C

L=A, TC oder G

M=A, C oder T

X_n = T oder C, falls Y_n = A oder G, und C, falls Y_n = C oder T

Y_n a A, G, C oder T, falls X^ = C, und A oder G, falls X₁₁=T

W_n = C oder A, falls Z_n = G oder A, und C, falls Z_n = C oder 0?

Z_n = A, G, C oder T, falls W_n = C, und A oder G, falls W_n = A

= TC, falls S_n = A, G, C oder T, und AG, falls S_n = T oder C

S_n = A, G, C oder T, falls QR_n = TC, und T oder C, falls QR_n = AG .

und die tiefgestellten Ziffern η die Stellung in der Amino säuresequenz von menschlichem Proinsulin, dem jedes Triplett in der Nucleotidsequenz nach dem genetischen Code entspricht, bedeuten, wobei die Aminosäurestellungen vom Amino-Ende her beziffert sind.

22 3 8 73 -38- 27.3.1.981

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Insbesondere umfaßt die menschliches Proinsulin codierende Deoxynucleotidsequenz einen plus-Strang mit (a) der Deoxynucleotidsequenz (^N _aN_bN_c) . mit einem 5'- und 3'-Ende, worin N , Nv und N A₁ T, G oder C bedeuten und y eine ganze Zahl von 0 bis 100 darstellt, derart, daß"N_aN_bN wieder TGA, TAA noch TAG wird, (b) einer der B-Kette von menschlichem Insulin codierenden Deoxynucleotidsequenz, gebunden an das 5^t"=^fl.de von (N_QN_KN_) ., und (c) einer die A-Kette

a ο c j

von menschlichem Insulin codierenden Deoxynucleotidsequenz, an das 3'-Ende von (N_QN,N ) _. gebunden»

a ο c 3

Die Erfindung betrifft ferner ein ^erfahren zur Synthese von menschlichem Insulin, das dadurch gekennzeichnet ist_s daß man die Sulfhydry!gruppen in den A- und B-Peptiden von menschlichem Proinsulin oxydiert unter Bildung von Disulfide brücken zwischen A- und B-Peptiden und dann das C-Pept id ausschneidet durch eine Hydrolyse, die von einem Enzym katalysiert wird, welches für die Bindungen spezifisch ist, die das C-Peptid mit den A- und B-Peptiden verbinden*

Die vorliegende Erfindung offenbart die essentiellen genetischen Elemente, die man zur Erzeugung von menschlichem Insulin in Verfahren benötigt, die auf industriellem Maßstab eingerichtet werden können. Das natürlich vorkommende Strukturgen wurde kloniert, S_eine Expression in einer geeigneten Wirtszelle fürht zu einem Proteinprodukt, das nach bekannten Verfahren in Insulin überführt werden kann. Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Proinsulin-Molekül und benutzt die Tatsache, daß der C-Peptidbereich des Proinsulin-Moleküls eine spontane Faltung ermöglicht, derart, daß die A~ und B-Ketten richtig nebeneiander liegen«, In der Konfi-

2 2 3 8 7 3 -33- 27.3.1981

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guration wird die korrekte Paarung der Sulfhydry!gruppen hergestellt, und die Bildung der Disulfidbrücken, die im aktiven Insulinmolekül vorliegen, erfolgt leicht. Das Ausschneiden des C-Peptids erfolgt durch kombinierte Anwendung von Trypsin oder einem -^nzym mit ähnlicher Substratspezifität und Carboxypeptidase B oder Cathepsin-B unter Entfernung eines C-terminalen Arginins aus der B-Kette, wie dies bereits beschrieben wurde _a

Der gesamte Codierungsanteil des menschlichen Insulingens wurde, wie vorliegend beschrieben, kloniert, einschließlich einem Teil der 5^f-untranslatierten Region, der gesamten Vorpeptidsequenz, der gesamten Codier-Sequenz für die B-, C- und A-^eptide und der gesamten 3^f--untranslatierten Region. Die ^wahl der Wirtszelle hat Einfluß darauf, welche Teile des klonierten Gens verwendet werden« Die gesamte Pre-Proinsulin codierende Sequenz ist verwendbar zur Transformierung bestimmter Arten von höheren eukaryontischen Zellen, da die Pre-Sequenz als ein ^inzelpeptid wirkt, um die Abgabe des Peptids aus der Zelle zu fördern« Außerdem katalysieren diese zur Reaktion auf das Signalpeptid befähigten eukaryontischen Zell-Linien die spezifische Entfernung der Pre-Sequenz.während des Transportes des Proteins durch die Zellmembran, Ferner können solche Zellen das abgegebene Produkt weiterverarbeiten, indem sie das C-Protein nach der katalysierten Bildung der richtigen Disulfidbrücken ausschneiden.

In prokaryontischen ^irtszellen wird heute die Verwendung der Proinsulin codierenden Sequenz bevorzugt. Die Stufe der Umwandlung von Proinsulin in Insulin erfolgt nach bekannten Methoden. Zwei Arten der Expression sind heute bekannt, die beide die Inserierung der Proinsulin codierenden ^sequenz in

3Ö

2 2 3 8 7 3 -*®- 27,3.1981

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eine Region der Transfer-Vektor-DNA umfassen, deren Expression durch einen prokaryontischen Promotor gesteuert wird» In einzigen Fällen wird ein Teil des prokaryontischen Strukturgens und die Promotorkontrolle zwischengeschaltet, derart, daß das Produkt der Expression ein Fusionsprotein ist, dessen N-terminaler Teil aus dem N-terminalen Teil des prokaryontischen Proteins und dessen C-terminaler Teil die klonierte ^equenz, in diesem Fall Proinsulin, ist. Die Expression von Proinsulin in ^orm eines menschlichen Proteins hat den Vorteil, daß in der Wirtszelle das Fusionsprotein beständiger sein kann als Proinsulin selbst«, Ist das prokaryontische Protein ferner ein Protein, das normalerweise von der Wirtszelle abgegeben wird, so kann das Fusionsprote in ebenfalls abgegeben werden, wodurch die Reinigung des Expressionsprodukts erleichtert wird» Die Verwendung von Fusionsproteinen besitzt? ο inen Nachteil, der darin besteht, daß sie spezifisch gespalten weiten müssen, um das gewünschte Produkt zu ergeben. Im Fall von Proinsulin gibt es Verfahren, die die Aminosäuresequenz des Proteins zur spezifischen Spaltung eines Fusionsproteins nützen, siehe Beispiel 2«

Die klonierte Codiersequenz kann auch direkt in der prokaryontischen Zelle exprimiert werden, indem man die Sequenz direkt benachbart zu einem Promotor inserierte Der Vorteil liegt hier darin, daß eine spezifische Spaltung überflüssig wird. Der wesentliche Nachteil besteht in der Notwendigkeit einer weiteren Reinigung,, .

Die Expression von Säugetiergenen in 1, coIi wird heute er-

22 3 8 73 -j*- 27·3.1981

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zielt durch Inserierung in der Nähe der Iac-, trp- und ß-Lactamase-Promotoren* Der lac-Promotor ist geeignet, da seine genetischen Eigenschaften gut charakterisiert sind. Es gibt zwei mögliche Inserierungsstellen, die lange und kurze prokaryontisehe Führungen für das Fusionsprotein ergeben. Eine Vielzahl genetischer Varianten steht zur Verfügung mit verschiedenen Mengen des endogenen Repressers, die durch Temperatur induzierbar sind und dergleichen* Der trp-Promotor hat den Vorteil, daß nach Induktion hohe Expression erfolgt, Expressionsplasmide mit Inserierungsstellen im trp—Promotor stehen für alle drei Leseraster zur Verfügung« Der ß-Lactamase—Promotor bewirkt, was einem pro— kaiyontischen Signalprotein zukommt, da die Lactamase gewöhnlich abgegeben wird« Das ß-Lactamase-iusionsprodukt viird ebenfalls abgesondert oder im periplasmischen Raum gefunden. Als Ergebnis sind weniger Reinigungsstufen zur Erzielung von reinem Proinsulin erforderlich.

Die vorliegende Erfindung nützt die Funktion des C-Peptids von Proinsulin aus, nämlich die Erleichterung- der spontanen Faltung des Proinsulins, so daß die A- und B-Ketten in korrekter Konfiguration zusammenkommen, derart, daß Sulfhydrylgruppen richtig gepaart sind und korrekte Disulfidbrücken.entstehen, wie sie in natürlichem Insulin gefunden werden,, Der Vergleich der C-Peptidsequenzen bei verschiedenen A_rten zeigt, daß diese während der Evolution nicht konserviert wurden. Daher sind zahlreiche Substituenten in der Aminosäuresequenz des C-Peptids möglich. Die Funktion des C-Peptids kann einfach darin bestehen, daß eine Aminosäureschleife entsprechender Länge gebildet wird,

22 3 87 3 -*β- 27.3.1981

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die zur Faltung der A- und B-Kette in geeigneter Konfiguration führt. Daher kann praktisch jede Codier-Sequenz anstelle der C-^eptidsequenz von menschlichem Proinsulin inseriert werden, ohne daß diese Hauptfunktion wesentlich verändert wird» Bestimmte Vorteile sprechen allerdings für die "Verwendung des natürlichen C-~Peptidss beispielsweise muß die Entfernung des Peptids aus den Insulinpräparaten nicht vollständig sein, da das C-^eptid ein natürlicher Bestandteil von Insulinpräparaten ist. Ferner kann ein gewisser Vorteil bezüglich der korrekten Konfiguration des Insulins oder bezüglich der Abspaltung durch Enzyme vorhanden sein«,

Die vorliegende Erfindung demonstriert den universalen Charakter des genetischen Cosäes,, Von Säugetierzellen bevorzugte Codons werden korrekt in Έ_ο coli translatiert» Ersatz-* Codons, die die gleiche Aminosäure codieren, können in der Sequenz substituiert werden, ohn<3 daß Sequenz oder Funktion des exprimierten Proteins beeinträchtigt werden« Die vorliegende Erfindung umfaßt daher die Verwendung sämtlicher synthetischer Codier-Varianten der beschriebenen Codier-* sequeuz, sowie diese Varianten menschliches Pre-Proinsulin und menschliches Proinsulin codieren «

Ausführungsbeispiel .». ' .

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert,

Beispiel 1 ·

Kloniertes menschliches Pre-Proinsulingen

22 3 873 * -*3t- 27,3.1981

AP C 12 N/223 873 (58 145 / 18)

Das menschliche Insulingen wurde kloniert aus ENA, die aus einem menschlichen Insulin^produzlobenden Sumor nach dem "Verfahren von Ullrich et al», loc. cit.zur Isolierung von ENA aus Inselzellen isoliert worden war» Die ENA, die nach dem Zentrifugieren in 5,7-molarer Cäsiumchloridlösung, enthaltend 100 Millimol Ethylendiamintetraessigsäure, als Pellet erhalten worden war, wurde ohne weitere Eeinigung als Vorlage für die cDNA-Synthese eingesetzt unter Verwendung von reverser Transkriptase und Sl-Nuclease, siehe Ullrich et al«, loc« cit« Aus 130/Ug unfraktionierter ENA wurden etwa 40 ng doppelsträngiger cMA erhalten«

Die unfraktionierte cDNA wurde mit terminaler Transferase in Gegenwart von dCTP behandelt zur Erzeugung von Oligo-C-Schwanzen an den 3'-jinden der cDNA-Moleküle_e Ebenso wurde der Plasmid-Transfer-Vektor pBE322 mit der Eestriktions~ Endonuclease PstI gespalten und mit terminaler Transferase in Gegenwart von dGTP behandelt unter Erzeugung von OligodG-Schwänzen an den 3'-Enden der linearen Plasmid-DNA₀ Die so behandelte Plasmid-DNA kann keine ringförmige DNA bilden, da die einsträngigen Enden nicht komplementär sind. Jedoch sind die Oligo-dC-Bnden der behandelten cDNA komplementär mit den Oligo-dG-Enden des Plasmids und können daher verwendet werden zur Bildung ringförmiger Plasmide, bei denen die cDNA in der Pstl-gtellung inseriert ist» Ferner regeneriert die Inserierung beide Enden der Pstl-Erkennungssequenzen an beiden Enden der Insertion, womit für den Ausschnitt der inserierten ^equenzen gesorgt wird (Vergleiche Villa-Komeroff et al., loc. cit.)_e

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Das obige Verfahren zum Anbringen von Endstücken wurde angewandt zur Erzeugung von pBR-322-Plasmiden einer heterogenen Population von cDNA-Insertionen an der PstI~Stelle„ Solche Plasmide sollten' gegen Ampicillin empfindlich, da sich die Pstl-Stelle im ß-Lactamasegen befindet, gleichzeitig aber Tetracyclin-restistent sein_e Ein E₀ coli-Stainm X 1776 wurde mit der Insertionen enthaltenden Plasmid-DNA transformiert«, 525 Tetracyclin-resistente ^f-^rans forma ti ons produkte wurden erhalten« Diese wurden auf Replica-Platten (replicaplated) auf Insulinsequenzen ausgesucht durch Kolonienhybridisierung in situ, im wesentlichen nach der Vorschrift von Gruenste in und Hogness, Proc. Nat, Acad« Sei* USA, 22? 3961 (1975)· ^iö vorher klonierte Pre~Proinsulin~cDNA aus Ratten (Ullrich, A., et al», loc. cit») wurde als Hybrid is ierungsansat ζ verwendet, nach Markierung der KattencDNA durch translation unter Verwendung von DNA-PoIymerase I· Da die ibiinosäuresequenzen von Ratteninsulin und menschlichem Insulin sehr ähnlich sind (Insulin zu 92 % homolog, Pro*» insulin zu 83 % homolog) wurde vorausgesetzt, daß die klonierte Ratten-cDNA unter den bekannten Bedingungen verminderter Schärfe mit menschlichen Insulinsequenzen kreuzhybridisieren würde. Die Autoradiographie ergab, daß zwei von 525 Kolonien mit dem klonierten Ratten-Pre-Proinsulin I hybridisierten» Beide Kolonien waren gegen Ampicillin empfindlich« Die aus den Kolonien isolierten Plasmide waren etwa um 250 Basenpaare und 500 Basenpaare langer als pBR322„ Das größere. Plasmid erhielt die Bezeichnung pcHI-1%-

Die Nucleotidsequenz des inserierten cDNA-Fragments von pcHI-1 wurde nach der Methode von Maxam und Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 74, 560 (1977) bestimmt» Ein schema-

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tisches Diagramm der Insertion zeigt Fig_e 1, Die gesamte Codierungsregion für menschliches Pre-Proinsulin vaar in der Insertion enthalten, zusammen mit einem Teil der 5'-untranslatierten Region, der.gesamten 3^l-"Untranslatierten Region und einem Teil der 3^f-PoIydA-Region«, Die Restriktionsstellen zur Abspaltung der Insertion für die Sequenzierung sind ebenfalls in Fig_e 1 gezeigt, zusammen mit der Richtung der Sequenzierung in jedem Fragment und den Überlappungsregionen«, .

Die aus der cDNA-Sequenz erhaltene mRNA-Sequenz und die aus einem der Leseraster abgeleitete Aminosäureseqeunz zeigt Fig. 2. Die Grundstruktur von auf diese Weise bestimmtem menschlichem Proinsulin stimmt genau überein mit der Struktur, die aus früheren Öequenzbestimmungen resultiert (siehe Dayhoff, M* D,, Atala of Protein Sequence and Structure, £, Supply 2, S, 127 bis 130 (1976) und Suppl, 3, S_e 15O bis 151 (1978)» Die Aminosäuren der Proinsulin codierenden Sequenz werden mit 1 bis 86 beziffert, die der Prosequenz mit -24 bis -1_e Fig_e 2 zeigt ferner den Ort bestimmter Restriktionsstellen, die zum Bau des Proinsulingens aus der pcHI-1-Insert ion brauchbar sind» Selbstverständlich ist die cDM-Sequenz des codierenden Strangs der pcHI-1-Insertion gleich der in Fig* 2 gezeigten, mit der Abweichung, daß Thymin T anstelle von Uracil U steht₀

Große Mengen an pcHI-1 und anderen Plasmiden werden hergestellt, indem man damit E. coli HB-101 transformiert„ Der Stamm HB-101 dient als geeigneter Wirt zur Erhaltung und Replikation von Plasmiden mit den vorliegend beschriebenen klonierten Insert ionen«,

2 2 3 8 7 3 _4€- 27.3.1981

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Beispiel 2

Bau des Proinsulin-Transfer-Vektors

Die inserierte cDNA von pcHI-1 enthält die gesamte Codiersequenz für menschliches Pre-Proinsulin*, Bei bestimmten Verwendungen viie dem Transfer in eine andere Art eukaryontischer Zellen können bei normaler Weiterverarbeitung und Entfernung von Pre-Sequenz und C-Peptid die Erzielung einer korrekt gefalteten Konfiguration und Bildung von aktivem Insulin erwartet werden« Unter anderen Umständen kann man vom transfer in eine prokaryontische Zelle wie z» B«, ein Bakterium die Bildung von unbehandeltem Protein erwarten. Im letzteren Fall ist der Bau einer Codier-Sequenz für Proinsulin von Vorteil, da Proinsulin nach bekannten Verfahren leicht in vitro in aktives Insulin umgewandelt werden kann, vergleiche Kemmler, W, et al., J. Biol. Chem. 24_2, 6786 (1971). Drei alternative Methoden zum Bau einer Proinsulin codierenden Sequenz werden vorliegend beschrieben. Bin Plasmid-^Transfer-Vektor, enthaltend pBE322 mit einer inserierten Proinsulin codierenden Sequenz, wird als pcHP-1 bezeichnet«

A. Sine chemisch synthetisierte Codier-Sequenz für die B-Kette von menschlichem Insulin wurde von Crea, R.., et al., Proc, Nat. Acad. Sei. USA, 7J5, 5765 (1978) beschrieben. Die synthetische Nucleotidseque.nz unterscheidet sich von der natürlich vorkommenden, vorliegend beschriebenen Sequenz, da die synthetische Sequenz dazu bestimmt war, Codon-Zuordnungen ausfindig zu machen, die von einem prokaryontischen Wirt wie E. coli stärker bevorzugt werden. Ferner wurde ein Methion in codierendes Triplett direkt vor der Amino-

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säure 1 (Phe) eingefügt. Zufällig jedoch sind die beiden Sequenzen in der Begion der Aminosäure 13 bis 14 identisch, die die einzige, beiden Seiten gemeinsame AIuI-SteHe enthält» Die Plazierungen der AIuI-Steilen in der natürlichen Sequenz zeigt Fig. 2.

Synthetische Proineulin-DNA wird mit Alul-lndonuclease behandelt, wobei man zwei Fragmente aus 43 bzw« etwa 56 Basenpaaren erhält* Ferner wird die cMA- Insert ion von poHI-1, vorzugsweise erhalten durch Hhal-S'paltung gemäß Beispiel 2B, gespalten durch eine partielle, mit Alul-Endonuclease katalysierte Hydrolyse unter Bildung von Fragmenten aus etwa 75, 90, 110, 135, 165, 200, 245, .275, 375 bzw. 455 Basenpaaren. Diese werden durch Gel-Elektrophorese fraktioniert, wobei man das Fragment mit 375 Basenpaaren erhält» Ergebnis einer Spaltung an einer einzigen Stelle im Codon für Aminosäure Rr. 14,

Die Spaltungsfragmente des synthetischen Gens und das Spaltungsfragment aus 375 Basenpaaren der cDNA-Insert ion werden über stumpfe Enden verknüpft. Die korrekte Verbindung des synthetischen Fragments mit 43 Basenpaaren mit dem cDNA-Fragment mit 375 Basenpaaren wird maximiert, indem man vorsieht, daß die cDNA mit 375 Basenpaaren in molarem Überschuß vorhanden ist. Die Möglichkeiten einer unrichtigen Verbindung werden auch vermindert durch die Tatsache, daß die synthetischen Fragmente einsträngige vorstehende Enden besitzen, die mit den Enden des cDNA-Fragments mit 375 Basenpaaren nicht komplementär sind.

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Das verknüpfte Molekül, eine Zusammensetzung aus der synthetischen ^sequenz, die Methionin gefolgt von den Aminosäuren 1 bis 13 codiert, und der natürlich vorkommenden Sequenz, die die Aminosäuren 14 bis 86 von Proinsulin codiert, ergibt eine Codier~^sequenz für Proinsulin, Die Proinsulin codierende ^sequenz kann in ein beliebiges Expressionsplasmid in·?? seriert werden, entweder durch Füllung oder Ausschneiden ein« strängiger Enden und Anbringen der entsprechenden Bindungs-Oligonucleotide»

Die Expression ergibt ein Fusionsprote in, das am Methioninrest gespalten vjerden kann durch Behandlung mit Bromcyan, wobei das Pro insulin erhalten wird* Pro insulin vaird nach ÖQT Methode von Eemmler et al_e, loc_e cit» in Insulin überführt*

B. Die cDNA-Insertion von pcHI~1 besitzt eine Hhal-Stellung in der die Aminosäuren -14 bis -43 codierender Sequenz, wie aus Fig_e 2 ersichtlich. Ferner besitzt der Iransfer-Vektor pBE322 mit Hhal-Stellung, 22 Basenpaare entfernt von der Pstl-Stelle am 5'-⁵³^e der Insertion, Es ist daher möglich, eine Sequenz erneut zu isolieren,· die die gesamte Proinsulin codierende Sequenz und eine Eegion aus 22 Basenpaaren von pBE322-DNA umfaßt, indem man pcHI-1 mit Hhal-Endonuclease behandelt» Dieses Verfahren wird der erneuten Isolierung der Insertion mit PstI-Endonuclease vorgezogen, da die Insertion zvsei innere Pstl-^tellen enthält und die Ausbeute an intakter Insertions-DNA durch Behandlung mit Pstl-Endonuclease niedrig ist. Die Hhal-isolierte ^sequenz ist ebenfalls zur Verwendung in den Verfahren der Beispiele 2A und 2C hervorragend geeignet.

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Die Behandlung beider Isolate mit Hhal-Endonuclease führt zur Spaltung des plus«Strangs zwischen den Aminosäuren und -13 der Pre-Sequenz (der plus-Strang ist derjenige Strang, dessen Nucleotidsequenz der mKNA-Sequenz entspricht, der minus-Strang ist derjenige Strang, dessen Sequenz zur mENA-Sequenz komplementär ist)» Die restliche Pre-Sequenz kann spezifisch entfernt werden^ indem man die 3*- bis 5'-Exonuclease-Aktivität von T4-DNA-Polymerase ausgenutzt, die auf den minus-Strang am Code-Ende der Pre-Sequenz und auf den plus-Strang am entgegengesetzten Ende wirkt» Die exonucleolytische Reaktion kann bei einem bestimmten Nucleotid gestoppt werden, indem man das gleiche Nucleotid als ^riphosphat in das Eeaktionsgemisch einführte Der ezonucleolytischen Wirkung wirkt dann die Polymeraseaktivität des Enzyms entgegen, das stetig das spezifische Nucleotid ersetzt, siehe Englund, P. T₀, J* Biol, Chem«, 246, 3269 (1971) und J_e Mol. Biol·, 66, 209 (1972).

Die verbleibende Pre-Sequenz wird spezifisch zum N-terminalen Phenylalanin-Codon der Aminosäure Nr_e 1, digeriert durch 3 Cyclen einer W--Polymerase-D'igerierung. Der Cyclus erfolgt in Gegenwart von TTP, das die Digerierung gegenüber von A des Glycin-Codons in Aminosäure-Stellung -7 beendet. Cyclus 2 erfolgt in Gegenwart von dCTP, das die Digerierung gegenüber G von Codon-Stellung -5 (Asp) beendet. Cyclus j erfolgt in Gegenwart von dATP, das die Digerierung gegenüber T beendet, welches das erste Nucleotid in Stellung 1 von Prqinsulin ist. .

Nach jedem Cyclus der T4—Polymerase-Digerierung muß das Triphosphat im gerade beendeten Cyclus entfernt und das Tri-

ho

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phosphat des nächsten Cyclus eingeführt werden* Zum Abtrennen der Triphosphate aus dem Eeaktionsgemisch werden Minisäulen mit "Sephadex G-75" (Pharmacia Inc*, Uppsala, Schweden) verwendet» Die Säulen werden mit einem geeigneten Puffer ins Gleichgewicht gebracht, das Sammeln der Proben erfolgt mit einem Puffer, der das Triphosphat des folgenden Cyclus enthält» Auf diese V/eise kann zusammen mit der DNA wanderndes Enzym die DNA nicht über den nächsten ausgewählten Stopp-Punkt digerieren. Um eine Digerierung im unteren Teil der Säule nach Abtrennung des vorangehenden Triphosphat zu verhüten, erfolgt die Chromatographie in der Kälte (M- ⁰C), und die Eluierung wird durch Zentrifugieren beschleunigte

Ferner kann man auch das Enzym vor der Chromatographierstufe durch Wärmeeinwirkung (65 ⁰C) inaktivieren,, Der folgende Cyclus wird dann eingeleitet unter Zusatz von frischem aktivem Enzym«, Ais Ergebnis der 3 Digeriercyclen mit T4~Polymerase wird der minus-Strang der DNA vollständig und insbesondere bis zum ersten Codon der Proinsulin codierenden Sequenz digeriert« Die Sequenz des plus-Strangs am entgegengesetzten Ende des Moleküls, die ebenfalls ein 3'-Ende besitzt, ist derart, daß nur einige wenige Nucleotide bei den obigen Digeriercyclen entfernt werden.

Der plus-Strang am Pre-Sequenzende wird dann mit Sl-Exonuclease spezifisch digeriert, wobei diese auf einsträngige Enden einwirkt und ein stumpfendiges Molekül ergibt, Sorgfalt muß darauf verwendet werden, eine partielle Digerierung durch Sl-Nuclease über den Beginn des ersten Codons hinaus zu verhindern«, Diese partielle Digerierung kann eintreten

HI

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wegen des "Atmens' der Helix, einer teilweisen und vorübergehenden Unpaarung von DNA-Strängen. Das Atmen tritt im ganzen Molekül auf, jedoch am häufigsten in A-T-reichen Regionen und an den Enden der DNA-Moleküle. Sine vorübergehende Unpaarung des A-T-reichen Godons Nr „ 1 könnte eine Sl-nucleolytische Wirkung über den gewünschten Stopp-Punkt hinaus erlauben« Ein solches Ergebnis wird verhindert, indem man die Sl-Digerierung unter Bedingungen maximaler HeIix-Integrität niedriger Temperatur (Raumtemperatur oder weniger) und hohem Salzgehalt ausführt, der gewöhnlich in S1-Reaktionspuffern vorliegt.

Proben von DNA, die in aufeinanderfolgenden Stufen der Sl-HucIeasedigerierung erhalten werden, werden nach bekannten Methoden in einen geeigneten Transfer-Vektor kloniert. Die Sequenz-Analyse des kleinsten Alul-Fragments solcher Klone wird verwendet, um Proinsulin codierende Klone auszusondern, bei denen die gesamte Pre-Sequenz entfernt ist.

Ein interessantes Verfahren zum Klonieren νon"Proinsulin codierender cDNA umfaßt den Einbau von Oligo-A—^Bnden mit terminaler Transferase an den 3^f-Enden der cDNA_e Oligo-T-Bnden werden am 3^t~^Ende ^an geeigneter Stelle eines Expressions-Transfer-Vektors erzeugt, z. B. an der EcoRl-Stelle im ß-Galactosidasegen im Plasmit pTS-1 (Ullrich, A., et al.), siehe auch die US-PS (US-Patentanmeldung 933 035). Die Inserierung der Proinsulin codierenden cDNA nach dem obigen Verfahren führt zu einer korrekt orientierten Insertion in Phase, bezogen auf den Leseraster, mit dem ß-Glactosidasegen des Plasmids bei 1/6 Wahrscheinlichkeit, Die Expression der Oligo Α-Enden führt zur Einführung von Lysin-Resten direkt vor Beginn der Proinsulinsequenz. Eine milde Trypsin-Dige-

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rierung des Fusionsproteins ergibt Proinsulin, das auf vorstehend beschriebene Weise in aktives Insulin überführt wird« Ferner ergibt das Fusionsprote in bei Behandlung mit einer Kombination aus Trypsin und Carboxypapt idasβ Β (oder Cathepsin B) aktives Insulin aus dem Fusionsprotein in einer einzigen Reaktion;

C, Sine Proinsulin codierende Sequenz wird aufgebaut durch selektive Spaltung an einer Innenstelle in der Proinsulin codierenden Eegion, gefolgt von einer Anknüpfung einer chemisch synthetisierten Sequenz, die den Teil der Proinsu·» lin codierenden Eegion codiert, der bei der vorangegangenen Spaltung entfernt wurde» Als Quelle der Proinsulin codierenden Eegion wird das Plasmid pcHI-1 verwendet, das selektiv ausgeschnitten wird durch Behandlung mit Pstl-33ndonuclease oder vorzugsweise durch Behandlung mit Hhal-Endonuclease, siehe Beispiel 2B_e

Nach der Isolierung wird jedes Fragment mit alkalischer Phosphatase behandelt zur Entfernung der 5^f-terminalen Phosphatgruppe, dann gespalten durch Behandlung mit einer Eestriktions-Endonuclease mit einer einzigen Spaltungsstelle in der Proinsulin codierenden S_eqa_Qnz_e Vorzugsweise befindet sich die Eestriktionssteile nahe einem Ende der Proinsulincodierenden ^sequenz. Die AIuI-SteHe im Bereich der Aminosäuren 13 bis 14 liefert eine geeignete Spaltstelle (vergleiche Fig. 2). Das Hhal-Fragment von pcHI~1 wird mit Alul-^ndonuclease partiell gespalten und ergibt 2 Fragmente aus etwa 76 bzw* 375 Basenpaaren» Die AIuI-Fragmente werden durch Gelektrophorese fraktioniert (siehe Beispiel 2A), und das Fragment der 375 Basenpaare wird gewonnen·

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Nach der Phosphotrieater-Methode von Itakura, K«, et al,, J. Biolo Chem., 2J?0, 4592 (1975) und Itakura, K., et al., J„ Am« Chem» Soc, 2Z, 7327 (1975) wird eine die ersten 13 Aminosäuren von Proinsulin codierende Nucleotidsequenz mit einem 5^f~terminalen G (am plus-Strang) zur Komplettierung des Codons für Alanin in Stellung 14 synthetisiert» Der plus-Strang der synthetischen DNA besitzt die Sequenz 3^S-TTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAG-S*, entsprechend der natürlichen Sequenz« Jedoch können auch andere, die gleichen Aminosäuren codierende Sequenzen synthetisiert vaerden» Im allgemeinen lautet die Sequenz 3^f-TTKGTIAAKCAJCA KXTITGKGGLQESCAKXTYGTLCAJG-S'. ^Die resultierende Sequenz wird mit stumpfen Enden mit dem Fragment mit etwa 375 Basenpaaren des Hhal-Fragment von pcHI-1 verknüpft«, Da letzteres nur am zu verknüpfenden Ende eine 5'-Phosphatgruppe besitzt, Zierden die 2 Fragmente in korrekter Reihenfolge verbunden» Das synthetische Fragment vurd in etwa 50 % der Reaktionen korrekt mit dem größeren Fragment verknüpft»

Die mit Ligase behandelte DNA wird kloniert in ein geeignetes Expressionsplasmid, entweder durch Bildung von Gligo Α-Enden (siehe Beispiel 2B) oder-durch Anknüpfung von Bindegliedern und Inserierung in Expressionsplasmide mit bekannten Leserastern. Im Fall von Insertionen mit Oligo A-^nden vsird Expression des Proinsulins in etv/a 1/12 der Klone beobachtet. Im Fall der direkten Inserierung, wo man weiß, daß das Leseraster korrekt ist,, beträgt die Häufigkeit der Expressionsklone etväa 50 %·

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Beispiel 3

¹¹¹¹ ' ' " " ⁿ · · ο

Expression von menschlichem Pre-Proinsulin und Proinsulin

Die Pre-Proinsulin (Beispiel 1) oder Proinsulin (Beispiel 2) codierenden klonierten Insert ionen werden in einen Expressions-Transfer-Vektor inseriert, Erfolgt die Inserierung in korrekter Orientierung in bezug auf den Beginn der Translation an der Inserierungsstelle und befindet sich die Insertion in einer LeserasteivPhase mit dem Promotor in der Ribosom-Bindungsstelle, so wird das Proteinprodukt des klonierten Gens synthetisiert durch aktive metabolisierende Wirtszellen, die durch den Transfer-Vektor transformiert wurden«, Das Proteinprodukt ist ein Fusionsprotein, falls der Expressions-Transfer-Vektor einen Teil eines prokaryontischen Gens zwischen Promotor und der Inserierungsstelle enthält« Die Inserierung kann jedoch direkt benachbart zu einer Promotorstelle ausgeführt werden. In solchen Fällen wird das von der Insertion codierte Protein direkt synthetisierte Beide Techniken zeigen Vor- und Nachteile« Fusionsproteine besitzen den Vorteil, daß sie zur Stabilisierung des vom inserierten Gen codierten FreraQproteins neigen* Auch werden erwünschte funktionale Eigenschaften wie Abgabe aus der Wirtszelle durch Fusion mit bestimmten ^irtsproteinen wie z, Be ß-Lactamase beigetragen« Andererseits wird die Reinigung der inserierten Code-Sequenz kompliziert durch den generellen Wunsch, den Wirtsteil des Fusionsprote ins spezifisch zu entfernen. Diese Entfernung erfolgt durch bekannte Techniken, die in den Beispielen 2A und 2B beschrieben sind. Die direkte Synthese des gewünschten Proteins umgeht die Notwendigkeit einer spezifischen Spaltung, schließt jedoch im allgemeinen die Möglichkeit der Abgabe aus der Wirtszelle aus«,

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Es wurden Expressionsplasmide entwickelt, in denen die Expression durch den lac-Promotor kontrolliert wird (siehe Itakura et al., Science, 22§» 1°56 (1977), Ullrich, A., et al., Excerpta Medica, (1979))» durch den trp-Promotor (siehe Martial et al., Sei,, 2O£, 602 (1979) oder durch den ß-Lactamase-Promotor (siehe US-PS (US-Patentanmeldung Nr. 647)),

Die Expression wird festgestellt über ein Produkt, das befähigt ist, sich immunoehemisch mit einem Anti-Insulin-Antikörper oder einem Anti-Proinsulin-Antikörper zu verbin den. Man wendet Badioimmuntests, bei denen der Antikörper radioaktiv markiert is τ; und Ant igen/Antikörper-Paare durch ein Präparat aus hitzegetöteten Staphyloccoccus aura us C ausgefällt wurden, an (vergleiche Morgan und Lazarow, Diabetes, 12, 115 (1963) und Kessler, S. W„, J. Immunol», 11g, 1617 (1975))« Zur feststellung der Expression in Bakterienkolinien verwendet man das Radioimmun-Screening, siehe Erlich, H. A., et al.., Cell, IC), 681 (1978) oder Broome, S, und Gilbert, W., Proc, Nat. Acad. Sei. USA, ££, 2746 (1978)

Eine Expressions anzeigende Fusionsproteine werden ermittelt, indem man die Molekulargewichte von Wirtsprotein, welches den N-terminalen Teil des Fusionsproteins beisteuert, in Wirtszellen vergleicht, die durch Expressionsplasmide mit und ohne Insertion transformiert wurden. Eine bevorzugte VerfahrensVariante besteht in der Verwendung des Minizellen produzierenden Stamms von E₀ coli P 678-54 als Wirt, Radioaktiv markierte Aminosäuren werden den Mini zellenproteinen einverleibt, wobei Stämme mit Expressions-

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Transfer-Vektoren mit und ohne inserierter Proinaulin codierender Sequenz verglichen werden» Die Proteine werden durch SDS-Acrylarnid-Gelelektrophorese fraktioniert, und die Proteinpositionen werden autoradiographisch festgestellt. Die Expression von Proinsulin ergibt sich aus der Anwesenheit einer markierten Proteinbande, die nur bei Minizellen gefunden -wird, die durch das Proinsulin-Expressionsplasmid transformiert wurden» Die Lage der elektrophoretischen Bande gibt ein Maß für das Molekulargewicht des exprimierten Proteins und stimmt überein mit der bekannten Länge des inserierten Gens und des N-terminalen prokaryontischen Anteils«

Die Entfernung des prokaryontischen Anteils und die Umwandlung von Proinsulin in Insulin in vitro erfolgen nach bekannten Verfahren, die vorstehend bereits beschrieben wurde»·

Claims (9)

1. Erfindungsanspruch

   * Verfahren zur Herstellung eines DHS-Transfervektors für die Erhaltung und Replikation von Deoxynucleotidsequenzen für Vorstufen von menschlichem Insulin, gekennzeichnet durch

   a) Umsetzen einer menschliches Pre-Proinsulin codierenden Deoxynucleotid-Sequenz mit einem DNS-Molekül durch Schneiden eines Transfervektors mit einem Restriktions- ' enzym und

   b) gegebenenfalls Hydrolysieren der 3'-Enden einer menschliches Pre-Proinsulin codierenden Deoxynucleotidsequenz, die aus einem DliS-Transfervektor abgeleitet und gemäß Stufe a) erhalten und repliziert wurde, durch einen oder mehrere Zyklen stufenweiser exonucleolytischer Digerierung, die durch T4-DlS-Polymerase in Gegenwart eines Deosynucleotid-Triphosphats katalysiert wird, anschließend Hydrolysieren der 5'-Enden der Deoxynucleotidsequenz durch ein für einzelsträngige DNS mit einem 5'-Ende spezifisches Huclease-Enzym und Umsetzen der auf diese Y/eise erhaltenen und menschliches Proinsulin codierenden Deoxynucleotidsequenz mit einem DUSrMolekül, das durch. Schneiden eines Transfervektors mit einem Restriktionsenzym hergestellt wurde.
2. 2 0 O Q 7
   £. O O /

   W₆₅GZ₆₅GGL₆₆ATM₆₇GTL₆₈GAJ₆₉CAJ₇₀TGIi₇₁TGK₇₂ACL₇₃QR₇₄S₇₄ ATM₇₅TGK₇₆QR₇₇S₇₇ X₇₈TY₇₈TAIi₇₉CAJ₈₀X₈₁ TY₈₁ GAJ₈₂AAK₈₃TAIi₈₄ TGK₈₅AAK₈₆TAG-3^!, worin

   A = Deoxyadenyl;

   G = Dasxyguanyl; · .

   C = Deoxycytosyl;
   T = Thymidyl;
   J=A oder G;
   K=T oder C;
   L = A, T, C oder G;
   M = A, C oder T;

   X_n= T oder C, v/enn Y^A oder G, und C, falls Y_n= cskder T;

   Y_n= A₅ G, C oder T, falls X_n = C, und A oder G wenn X_n = T; W_n = C oder A, falls Z_n = G oder A, und C, falls X_n = C oder T;

   Z e A, 'G, C oder T, v/enn W_n = C, und A-oder G, falls W_n=A;

   QR_n = TC, wenn S_n = A, G, C oder T und AG, falls S_n = T oder C;

   S_n = A, G, C oder T, wenn QR_n = TC, und T oder C-, falls QR_n = AG; .

   und die tiefgestellten Zahlen η die Stellung in der Aminosäuresequenz des menschlichen Proinsulins,dem jedes Triplett in der Nucleotidsequenz entspricht, nach dem genetischen Code bedeuten, wobei die Aminosäurestellungen vom Aminoende her beziffert sind.

   223873

   - 2-

   2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die menschliches Pre-Proinsulin codierende Deoxynucleotidsequenz einen Plusstrang mit folgender Sequenz aufweist:
3. 3· Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß man den Transfervektor von Stufe (a) mit Pstl-Endonuclease schneidet, um das DHS-Molekül pBR322 zu erhalten und dieses DNS-Molekül mit der menschliches Pre-Proinsulin codierenden Deoxynucleotidsequenz umsetzt, um au dem Plasmid pcHI-1 zu gelangen.
4. 4. Verfahren nach Punkt 1, 2 oder 3, gekennzeichnet dadurch, daß die menschliches Pre-Proinsulin codierende Sequenz vor der T4-DNS-Polymerase-Digerierung an einer spezifischen Stelle durch eine Reaktion hydrolysiert wird, die durch Hhal-Endonuclease katalysiert wird.
5. 5. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4» gekennzeichnet dadurch, daß die menschliches Proinsulin codierende Deoxynucleotidsequenz einen Plus-Strang mit folgender Sequenz enthält:

   ttk₂₄ttk₂₅taii₂₆acl₂₇ccl₂₈aaj₂₉acl₃₀yz₃₁gz₃₁^z₃₂gz₃₂gaj₃₃ GCL₃₄GAJ₃₅GAK₃₆X₃₇TY₃₇CAJ₃₈GTL₃₉Gc-L₄₀CAJ₄₁GTL₄₂GAJ₄₃X₄₄

   worin

   A = Deoxyadenyl,
   G = Deoxyguanyl,
   C = Deoxycytosyl,
   T a Thymidyl,
   J=A oder G,
   K=T oder C,

   223873

   L = A, T, C oder G,
   Μ = A, C oder T,

   X_n = T oder C, falls Y_n = A oder G, und C, falls Y_n = C oder T,

   t_n = A, G, G oder T, wenn X=C, und A oder G, falls X=T; W_n = C oder A, wenn Z_n = G oder A, und G, falls Z_n = C oder T; Z_n = A, G, Coder T, wenn W_n = C, und A oder G, falls W_n . β A;

   QR_n = TC, wenn S_n = A, G, C oder T, und AG,falls S = T oder C;

   S_n = A, G, C oder T, wenn QR_n = TC, und.T oder C, falls QR_n = AG;

   und die tiefgestellten Zahlen η die Stellung in der Aminosäuresequenz des menschlichen Proinsulins, dem jedes Triplett in der Hucleotidsequenz entspricht, nach dein genetischen Code bedeuten, wobei die Aminosäurestellungen vom Aminoende her beziffert sind.

   5 ^t-

   GTL₂AAK₃CAJ₄CAK₅X₆TY₆TGK₇GGL₈QR₉S₉CAIi₁ QX₁ .,GTL₁₂GAJ₁₃
6. 6· Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5* gekennzeichnet dadurch, daß der Transfervektor aus Stufe (b) mit Pst I-Endonuclease geschnitten wird, um das DNS-Molekül pBR322 zu erhalten, und dieses DMS-Molekül mit der menschliches Proinsulin codierenden Deoxynucleotidsequenz umgesetzt . wird, um zu dem Plasmid pcHP-1 zu gelangen.
7. 7.- Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 6 zur Herstellung ' · - eines MS-lxpressionstraiisfervektors zum Exp,imieren einer menschliches Pre-Proinsulin oder menschliches Proinsulin codierenden Deoxynucleotidsequenz, gekennzeichnet dadurch, daß das DUS-Molekül,· das durch Schneiden eines Transfervektors mit einem Sestriktionsenzym hergestellt wurde, an einer Stelle innerhalb einer exprimierbaren Kontrollregion geschnitten wird.

   223873 _
8. 8. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß man ein einen Teil des menschlichen Proinsulinß codierende^ cDNS-Fragmentr, das durch Schneiden einer menschliches Pre-Proinsulin codierenden eDHS-Sequenz mit einer Restriktionsendonuclease mit einer einzigen Erkennungsstelle innerhalb der Deoxynucleotidsequenz hergestellt wurde, mit einer chemisch synthetisierten DNS umgesetzt wird, deren Deoxynucleotidsequenz den vom genannten cDNS-Fragment nicht codierten Seil des menschlichen Proinsulins codiert, in einer durch DliS-Ligase katalysierten Verknüpfungsreaktion stumpfer Enden.
9. 9· Verfahren nach Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß die Restriktionsendonuclease AIuI ist.

   Hierzu... ^..„Seiten Zeichnungen