CZ303226B6 - Zpusob detekce nebo izolace sloucenin použitelných pri lécení Alzheimerovy nemoci - Google Patents

Abstract

Zpusob detekce nebo izolace sloucenin použitelných pri lécení Alzheimerovy nemoci, který je založen na skutecnosti, že tyto slouceniny jsou schopny inhibovat interakci mezi presenilinem 1 (PS1) nebo presenilinem 2 (PS2) a prekurzorem .beta.-amyloidového peptidu (APP). Uvedený zpusob zahrnuje krok, ve kterém se oznací preseniliny a/nebo APP, a dále krok detekce inhibice interakce mezi celým APP a preseniliny. Místo celého presenilinu pritom muže být použita pouze jeho cást obsahující sekvenci aminokyselin 1 až 213 z PS1 nebo 1 až 87 z PS2.

Description

Způsob detekce nebo izolace sloučenin použitelných při léčení Alzheimerovy nemoci

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká polypeptidů schopných alespoň částečně inhibovat interakci mezi presenilinem 1 nebo presenilínem 2 na jedné straně a prekurzorem β-amyloidového peptidu a/nebo β-amyloidovým peptidem na straně druhé. Konkrétně se vynález týká způsobu detekce nebo izolace sloučenin použitelných při léčení Alzheimerovy nemoci, jež jsou schopny inhibovat interakci mezi presenilinem 1, označovaným PSI, nebo presenilinem 2, označovaným PS2, a prekurzorem β-amyloidového peptidu.

Dosavadní stav techniky

Αβ-amyloidový peptid (Αβ-amyloid) obsahující 37 až 42 aminokyselin je hlavní proteinovou složkou tzv. senilních plaků charakteristických pero Alzheimerovu nemoc. Tento peptid vzniká štěpením prekurzoru, prekurzorového proteinu amyloidového peptidu (APP). Mutace genu pro APP jsou zodpovědné za familiární předčasné formy Alzheimerovy nemocí. Avšak většina forem je spojena s výskytem mutací ve dvou genech presenilínu, a sice PSI (původně zvaný S182) a PS2 (původně STM2), které byly nedávno identifikovány pomocí pozičního klonování. Tyto formy jsou dominantní a anomálie odpovídají mutacím, které mění smysl kodonu, kromě jediné, která vede k deleci exonu. Preseniliny jsou hydrofobní membránové proteiny s molekulovou hmotností 45 až 50 kDa a mají navzájem 67% homologii. Jsou také homologní se dvěma proteiny zC. elegans, a sice SPE4 a Sel-12, které se nepřímo účastní intracelulámího transportu a v signální transdukci „Notch“ receptorů, v uvedeném pořadí. Avšak fyziologická funkce preseni linu je dosud neznámá. Účast v Alzheimerově nemoci těchto dvou navzájem podobných proteinů vede k domněnce, že se tyto preseniliny nějak podílejí na nezbytném fyziologickém mechanismu, který je součástí etiologie tohoto onemocnění.

Protein PSI obsahuje 461 aminokyselin a PS2 obsahuje 448 aminokyselin. Oba mají strukturu membránového proteinu s 6 až 8 potenciálními transmembránovými doménami. Každý z presenilinů je předmětem přesného proteo lyrického štěpení, jehož výsledkem jsou dva fragmenty obecně zvané N-koncový (aminokoncový) a C-koncový (karboxykoncový) fragment (Thankaran et al.,

1996) . Toto štěpení bylo mapováním lokalizováno mezi zbytky 291 a 292 PSI (Podlisny et al.,

1997) a v homologním úseku PS2. Výrazy „N-koncový fragment“ nebo „fragment N-terc“ se týkají fragmentu od pozice 1 do pozice 291 v PSI, a výraz „C-koncový fragment“ označuje fragment představovaný zbytkem. Ačkoliv přesná topologie presenilinů v lipidové membráně nebyla dosud jasně určena, má se za to, že jejich N-koncové a C-koncové úseky (RC1) a také velké hydrofilní smyčky, jsou přítomny v cytosolickém kompartmentu (Doan et al., 1996, viz schéma na obr. 1).

Bylo ukázáno, že mutované formy presenilinů indukují zvýšení tvorby dlouhého Αβι^₂ amyloidového peptidu na rozdíl od formy Αβι^ο, která je přítomna u pacientů-nositelů (Scheuner et al., 1986), a také v transfekovaných buňkách (Borchelt et al., 1996) nebo transgenních myších (Duffet al., 1996). Αβ-amyloidový peptid, který tvoří senilní plaky, což jsou léze charakteristické pro tuto nemoc, a jeho různé formy pocházejí z ketabolismu amyloidového prekurzorového proteinu, APP. Byly popsány zejména dvě esenciální formy amyloidového peptidu, jedna obsahující 40 aminokyselinových zbytků, Αβ40, a druhá obsahující navíc 2 aminokyselinové zbytky na svém karboxylovém konci, Αβ42. Αβ peptid projevuje in vitro silné agregační vlastnosti, které jsou zvýšeny u formy Αβ42, a tato forma zřejmě účinně vytváří první agregáty detekovatelné pri nemoci. Navíc forma Αβ42 je specificky tvořena po úrazu lebky u člověka, přičemž takový úraz představuje jeden z nejlépe definovaných vnějších rizikových faktorů Alzheimerovy nemoci. Dále je známo, že časné genetické formy nemoci spojené s mutacemi jak v APP (kde jich je šest), a nyní i v presenilinu 1 a 2, přispívají ke zvýšení poměru Αβ42/Αβ40. Vzhledem ktéto řadě faktorů se Αβ42 jeví jako klíčové agens jak v genetických tak i sporadických formách Alzheimerovy nemoci a zjištění mechanismu jeho tvorby je zcela základním úkolem.

Bylo popsáno vytváření komplexu mezi prekurzorem β-amyloidového peptidu a PSI nebo PS2 ve stejné membráně (Weidemann et al., 1997, Xia et al., 1997), avšak přesná povaha událostí zodpovědných za tvorbu β-amyloidu není známa a zatím nebylo zjištěno žádné spojení mezi možnou rolí těchto komplexů a tvorbou formy β-amyloidu Αβ42. Nicméně je důležité poznamenat, že peptid Αβ42, nikoliv však Αβ40, je zřejmé lokalizován v endoplazmatickém retikulu v nervových buňkách (Hartman et al., 1997).

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález na základě výzkumu původce umožňuje identifikovat a charakterizovat specifické úseky presenilinu I (PSI) a presenilinu 2 (PS2), a také specifické úseky prekurzorového peptidu β-amyloidu (APP), které se účastní tvorby komplexů APP/PS1 a APP/PS2.

Předkládaný vynález je zejména výsledkem toho, že byla ukázána schopnost hydrofilního N-koncového úseku (aminokyseliny 1 až 87) PS2 rozpoznávat různé domény APP. Je také výsledkem toho, že byla ukázána podobná schopnost N-koncového úseku PSI (aminokyseliny l až 213). Předkládaný vynález je také výsledkem toho, že byla ukázána schopnost polypeptidů získaných z výše uvedených úseků presenilinu inhibovat tvorbu komplexů mezi APP a preseniliny. Preseniliny podle předkládaného vynálezu odpovídají v podstatě presenilinu 1 (PSI) a/nebo presenilinu 2 (PS2).

Předkládaný vynález je také výsledkem toho, že byla ukázána neočekávaná specifická buněčná lokalizace úseků, které interagují s buněčnou membránou. Zejména jde o skutečnost, že tyto interakce se vyskytují nejen na úrovni membrány, ale také na úrovni lumen endoplazmatického retikula a v extracelulámím kompartmentu. To je velmi nečekané vzhledem ktomu, že N-koncový úsek presenilinů (účastnící se interakce) je všeobecně považován za úsek, který je za standardních podmínek lokalizován v cytoplazmě.

Charakterizace domén interakce APP a presenilinů a demonstrace různých buněčných lokalizací těchto interakcí umožňují navrhnout přípravu nových polypeptidů, které lze farmaceuticky využít.

Předmětem předkládaného vynálezu je způsob detekce nebo izolace sloučenin použitelných při léčení Alzheimerovy nemoci, jež jsou schopny inhibovat interakci mezi presenilinem 1, označovaným PSI, nebo presenilinem 2, označovaným PS2, a prekurzorem β-amyloidového peptidu, označovaným APP, spočívající v tom, že zahrnuje alespoň jeden krok, v němž se označí preseniliny a/nebo APP a krok detekce inhibice interakce mezi celým APP a preseniliny, přičemž místo celého presenilinu může být použita pouze jeho část, obsahující sekvenci 1 až 213 z PSI nebo 1 až 87 z PS2.

Schopností inhibovat interakci se v popisu předkládaného vynálezu rozumí to, že přítomnost polypeptidů podle vynálezu a/nebo ligandů a/nebo molekul detekovaných způsobem podle předkládaného vynálezu je dostatečná alespoň k částečné inhibici uvedené interakce mezi presenilinem a/nebo jeho N-koncovým úsekem a prekurzorem β-amyloidového peptidu a/nebo β-amyloidovým peptidem a výhodně peptidem Αβι^₂·

V příkladech předkládané přihlášky je ukázáno, že inhibice interakce s jedním popsaným polypeptidem vede ke snížení tvorby intracelulámího amyloidového peptidu Αβ₁^,₂- Tento funkční následek lze předvídat u kteréhokoliv popsaného polypeptidů a/nebo ligandu a/nebo molekuly

-2CZ 303226 B6 detekované způsobem podle vynálezu. Inhibice této interakce a v jejím důsledku inhibice tvorby Αβι_4₂ představuje tudíž terapeutický cíl volby u nemocí, které jsou spojeny s touto formou amyloidového peptidů.

Ve specifickém provedení popsané polypeptidy obsahují alespoň část presenilinu 2 (PS2) dovolující interakci s prekurzorem β-amyloidového peptidů a/nebo β-amyloidovým peptidem. Výhodně jsou popsané polypeptidy charakteristické tím, že část PS2 odpovídá hydrofilnímu fragmentu N-konce PS2. Výhodněji popsaný polypeptid obsahuje celou nebo část peptidové sekvence odpovídající sekvenci id. č. 1 nebo sekvenci z ní odvozené (derivátu sekvence).

V jiném provedení podle vynálezu polypeptidy obsahují alespoň část presenilinu 1 (PSI) dovolující interakci s prekurzorem β-amyloidového peptidů a/nebo β-amyloidovým peptidem. Výhodně popsané polypeptidy obsahují celou nebo Část peptidové sekvence odpovídající sekvenci id. č. 2 nebo sekvenci z ní odvozené (derivátu sekvence).

V jiném popsaném provedení obsahují polypeptidy alespoň společný homologní úsek odpovídající sekvenci id. č. 1 a sekvenci id. č. 2.

V dalším provedení vynálezu polypeptidy obsahují alespoň část prekurzoru β-amyloidového peptidů (APP). Výhodně popsané polypeptidy obsahují část APP jinou než úsek odpovídající β-amyloidovému peptidů. Ještě výhodněji, popsané polypeptidy jsou charakteristické tím, že část prekurzoru β-amyloidového peptidů obsahuje celý fragment 1 až 596 nebo jeho část. Ještě výhodněji popsané polypeptidy obsahují část nebo celou sekvenci vybranou ze sekvence odpovídající fragmentu 1 až 596 ze sekvence id. č. 3 nebo sekvence z ní odvozené.

Pro účely předkládaného vynálezu označuje termín „odvozená polypeptidové sekvence“ nebo „derivát polypeptidové sekvence“ každou póly peptidovou sekvenci lišící se od sekvencí uvedených v sekvenci id. č. 1 nebo sekvenci id. č. 2, nebo navržených fragmentů sekvence id. č. 3, která je získána jednou nebo více modifikacemi genetické a/nebo chemické povahy a která má schopnost alespoň částečně inhibovat interakci mezi presenilinem 1 nebo presendinem 2 a prekurzorem β-amyloidového peptidů a/nebo β-amyloidovým peptidem, Výraz „modifikace genetické a/nebo chemické povahy“ znamená jakoukoliv mutaci, substituci, deleci, adici a/nebo modifikaci jednoho nebo více zbytků. Takové odvozené sekvence (deriváty) se mohou vytvářet s různými záměry, jako je zejména cíl zvýšit afinitu peptidů k místu interakce, zvýšit produkovanou hladinu, zvýšit odolnost vůči proteázám, zvýšit terapeutickou účinnost nebo snížit jejich vedlejší účinky, nebojím propůjčit nové farmakokinetické a/nebo biologické vlastnosti.

Popisují se také sloučeniny jiné než peptidové povahy nebo sloučeniny, které nejsou výlučně peptidové povahy, a které lze farmaceuticky využít. Konkrétně je možné, pokud vyjdeme z polypeptidových jednotek popsaných v předkládané přihlášce, připravit molekuly, které alespoň částečně inhibují interakci mezi presenilinem 1 nebo presendinem 2 a prekurzorem β-amyloidového peptidů a/nebo β-amyloidovým peptidem, a které nejsou výlučně peptidové povahy a přitom jsou farmaceuticky kompatibilní. V tomto ohledu je popsáno použití výše popsaných peptidů pro přípravu nepeptidových molekul nebo molekul, které nejsou výlučně peptidové povahy, které jsou farmakologicky aktivní, tím, že se stanoví strukturní prvky těchto polypeptidů, které jsou důležité pro jejich aktivitu a tyto prvky se reprodukují nepeptidovými strukturami nebo strukturami, které nejsou výlučně peptidové. Jsou rovněž popsány farmaceutické přípravky obsahující jednu nebo několik takto připravených molekul.

Popsané polypeptidy mohou obsahovat sekvence, které jim dovolují přesnou buněčnou lokalizaci, tak aby inhibovaly interakci mezi presendinem 1 nebo presenilinem 2 a prekurzorem β-amyloidového peptidů a/nebo β-amyloidovým peptidem. Výhodně jsou to polypeptidy odvozené ze sekvencí id. č. I nebo id. č. 2, které obsahují exogenní sekvence pro buněčnou lokalizaci a ještě výhodněji je to polypeptid obsahující N-koncový úsek PSI nebo PS2. Jako příklady takových

-3CZ 303226 B6 sekvencí lze uvést sekvence signálních peptidů jako je např. sekvence signálního peptidu IgkB, signální peptid APP, signální peptidy svalových a centrálních podjednotek acetylcholinových nikotinových receptorů a pod.

Mezi zvláště výhodné polypeptidy patří polypeptidy obsahující prvních 87 aminokyselinových zbytků N-konce PS2 a signální peptid IgkB.

Dalším popsaným předmětem jsou jakékoliv nukleotidové sekvence kódující proteiny schopné alespoň částečně inhibovat interakci mezi presenilinem 1 nebo presenilínem 2 a prekurzorem io β-amyloidového peptidu a/nebo β-amyloidovým peptidem.

Ve specifickém provedení je to nukleotidová sekvence obsahující celou nebo částečnou sekvenci id. č. 1 či její deriváty. V jiném provedení je to nukleotidová sekvence obsahující celou nebo částečnou sekvencí id. č. 2 či její deriváty. Výhodně je to nukleotidová sekvence obsahující is homologní zóny společně nukleotidovým sekvencím id. č. 1 a id. č. 2. V jiném provedení je to nukleotidová sekvence odpovídající fragmentu 1 až 596 (nukleotidy 1 až 1788) sekvence id č. 3 nebo sekvence z ní odvozené.

Pro účely předkládaného vynálezu označuje termín „odvozená nukleotidová sekvence“ nebo „derivát nukleotidové sekvence“ každou sekvenci, která se liší od uvažované sekvence v důsledku degenerace genetického kódu, a která je získána jednou nebo více modifikacemi genetické a/nebo chemické povahy, a také každou sekvenci hybridizující s těmito sekvencemi nebo jejich fragmenty, přičemž sekvence kóduje polypeptid podle vynálezu. Výraz „modifikace genetické a/nebo chemické povahy“ znamená jakoukoliv mutaci, substituci, delecí, adici a/nebo modifikaci jednoho nebo více zbytků.

Termín „derivát“ také zahrnuje sekvence homologní k uvažované sekvenci, které pocházejí z jiných buněčných zdrojů a zejména z buněk lidského původu nebo z jiných organismů. Takové homologní sekvence mohou být získány hybridizačními pokusy. Hybridizace se provádějí s použitím knihovny nukleových kyselin, pri použití nativní sekvence nebo jejího fragmentu jako sondy za měnících se hybrid izačních podmínek (Maniatis et al., 1982).

Popsané nukleotidové sekvence mohou být arteficiálního či jiného původu. Mohou to být sekvence genomové, sekvence cDNA nebo RNA, hybridní sekvence nebo syn tetické či semisyntetické sekvence. Tyto sekvence mohou být získány například pomocí screeningu DNA knihoven (cDNA knihovna, knihovna genomové DNA) použitím sond vytvořených na základě sekvencí uvedených výše. Tyto knihovny mohou být připraveny z buněk různého původu obvyklými technikami molekulární biologie, které jsou odborníkům známé. Nukleotidové sekvence podle vynálezu mohou být také připraveny chemickou syntézou nebo alternativně smíšenými metodami včetně chemické nebo enzymové modifikace sekvencí získaných screeningem knihoven. Obecně mohou být popsané nukleové kyseliny připraveny jakýmkoliv způsobem, který je odborníkovi znám.

Dále je popsán způsob přípravy popsaných polypeptidů, podle kterého je buňka obsahující popsa45 nou nukleotidovou sekvenci pěstována za podmínek vhodných pro expresi uvedené sekvence a je získáván vytvářený polypeptid. V tomto případě obecně je část kódující uvedený polypeptid umístěna pod kontrolu signálů umožňujících její expresi v buněčném hostiteli. Výběr těchto signálů (promotory, terminátory, sekreční vedoucí sekvence, apod.) se může lišit podle použitého buněčného hostitele. Kromě toho popsané nukleotidové sekvence mohou být částí vektoru, který může být autonomní nebo integrující replikující vektor. Konkrétněji autonomně replikující se vektory mohou být připraveny s použitím autonomně se replikujících sekvencí ve vybraném hostiteli. Co se týče integrujících vektorů, ty mohou být například připraveny s použitím sekvencí homologních k určitým oblastem hostitelského genomu, což umožňuje integraci vektoru pomocí homologní rekombinace.

ss

-4CZ 303226 B6

Dále jsou popsány hostitelské buňky transformované nukleovou kyselinou obsahující popsanou nukleotidovou sekvenci. Buněční hostitelé, kteří mohou být použiti pro produkci popsaných peptidů pomocí rekombinantního způsobu, jsou jak eukaryotičtí, tak prokaryotičtí hostitelé. Z vhodných eukaryotických hostitelů lze uvést buňky zvířecího původu, kvasinky nebo houby.

Konkrétně v případě kvasinek lze uvést kvasinky rodu Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces nebo Hensenula. V případě buněk zvířecího původu se mohou zmínit buňky COS, CHO, 027 nebo buňky lidského neuroblastomu apod. Ž hub se mohou konkrétně uvést Aspergillus ssp. nebo Trichoderma ssp. Z prokaryotických hostitelů je výhodné použít bakterie E. coli, Bacillus nebo Streptomyces.

io

Podle výhodného provedení jsou hostitelské buňky výhodně představovány rekombinantními kmeny kvasinek pro expresi popsaných nukleových kyselin, jakož i pro produkci proteinů z nich pocházejících.

Výhodně hostitelská buňka obsahuje alespoň jednu sekvenci nebo jeden fragment sekvence vybrané ze sekvence id. Č. 1 nebo sekvence id. č. 2 nebo fragmentů označených jako sekvence id. č. 3 pro produkci popsaných proteinů.

Popsané nukleotidové sekvence se mohou užít při genové terapii, zejména po přidání signálního peptidů k derivátům sekvence id. č. 2 a sekvence id. č. 2, pro in vivo produkci a přenos polypeptidů schopných alespoň částečně inhibovat interakci mezi presenilinem l nebo presenilinem 2 a prekurzorem β-amyloidového peptidů a/nebo β-amyloidovým peptidem. Konkrétně bylo ukázáno v předkládané přihlášce, že zcela neočekávaně, signální peptid je potřebný pro zaměření popsaných polypeptidů do lumen endoplazmatického réti kula a pro udělení biologické aktivity polypeptidů odvozeným ze sekvence id. ě. 1 a sekvence id. č. 2 s cílem inhibovat interakci mezi presenilinem 1 nebo presenilinem 2 a prekurzorem β-amyloidového peptidů a/nebo β-amyloidovým peptidem.

Popsané nukleotidové sekvence jsou v jiném provedení užity ke konstrukci expresní kazety, kterou lze užít v expresním vektoru. Konkrétně expresní vektor slouží k produkci popsaných polypeptidů.

Polypeptidy popsané v popise lze získat expresí v hostitelské buňce nukleotidové sekvence, jak byla popsána výše, která je vložena do rekombinantní DNA, a sice metodami, které jsou odborníkům známy, nebo kombinací takových způsobů.

Výhodně jsou popsané sekvence částí vektoru, který je vhodný pro indukci exprese in vivo, ex vivo a/nebo in vitro popsaného peptidů. Použitý vektor může být různého původu, za předpokladu, že je schopen transformovat živočišné buňky, výhodné lidské nervové buňky. Může to být virový nebo nevirový vektor nebo také ptazmidový vektor.

Ve výhodném provedení se užije virový vektor, který je odvozen z adeno viru, retrovirů, adeno-asociovaného viru (AAV), viru herpes, cytomegaloviru (CMV), viru vakcinie a dalších. Vektory odvozené zadenovirů, retrovirů nebo AAV obsahující heterologní nukleové kyseliny byly popsány v odborné a patentové literatuře (Akli et al., Nátuře Genetics 3, 1993, 224, Stratford-Pericaudet et al., Human gene Therapy 1, 1990, 241, EP 185 573, Levrero et al., Gene 101, 1991, 195, Le Gal la Salle et al., Science 259, 1993, 988, Roemer a Friedmann, Eur.

J. Biochem. 208, 1992, 211 Dobson et al., Neuron 5, 1990, 353, Chiocca et al., New Biol. 2, 1990, 739, Miyanoharaet al., New Biol. č, 1992, 238 a WO 91/18088).

Popisuje se také jakýkoliv rekombinantní vir obsahující, vloženou ve svém genomu, sekvenci nukleové kyseliny definovanou výše, která kóduje popsaný polypeptid.

Výhodně je rekombinantním virem defektní virus. Termín „defektní virus“ znamená virus, který není schopen replikace v cílové buňce. Obecně genom defektního viru v kontextu předkládaného

-5CZ 303226 B6 vynálezu postrádá alespoň jednu sekvenci požadovanou k tomu, aby se virus mohl replikovat v infikované buňce. Tyto úseky mohou být buďto z viru odstraněny (zcela nebo částečně), jejich funkce inaktivována, nebo nahrazeny jinými sekvencemi, zejména popsanými nukleovými kyselinami. Výhodně defektní virus nicméně uchovává ve svém genomu sekvence, které jsou nutné pro enkapsidaci virových částic.

Je zvláště výhodně použít popsané sekvence nukleové kyseliny ve formě inkorporované do defektní ho rekombinantního adenoviru, AAV nebo retro viru. Ve výhodném provedení vynálezu je to adenovirus.

Existují různé sérotypy adenovirů, jejichž struktura a vlastnosti se poněkud liší. Z těchto sérotypů jsou pro použití podle předkládaného vynálezu výhodné lidské adenoviry typu 2 a 5 (Ad 2 nebo Ad 5) adenoviry zvířecího původu (viz patentová přihláška WO 94/26914). K adenovirům zvířecího původu, které mohou být užity podle předkládaného vynálezu, patří viry psího, hovězího, myšího (např. Mávl, Beard et al., Virology 75, 1990, 81), ovčího, prasečího, ptačího a opičího původu (např. SAV). Výhodně je adenovirus zvířecího původu psí adenovirus, výhodněji adenovirus CAV2 (např. kmen Manhattan nebo A26/61, ATCC VR-800), Výhodně se v předkládaném vynálezu užijí adenoviry lidského nebo psího původu nebo adenoviry smíšeného původu. Výhodně je v genomu adenoviru alespoň úsek El nefunkční. Inaktivace tohoto genu může být provedena jakýmkoliv v oboru známým způsobem, zejména celkovou supresí, substitucí, částečnou delecí nebo adicí jedné nebo několika bází genu /genů). I jiné úseky mohou být modifikovány, úsek E3 (WO95/02697), úsek E2 (WO94/28938), úsek E4 (WO94/28152, WO94/12648 a WO95/02697), nebo úseky kteréhokoliv z pozdních genů Ll až L5.

Ve výhodném popsaném provedení má adenovirový vektor delecí v úseku El a E4. V jiném výhodném provedení obsahuje deleci v úseku El do kterého je vložen úsek E4 a kódující sekvence. Ve viru podle předkládaného vynálezu delece v El výhodně zaujímá úsek od nukleotidu 455 do 3329 v sekvenci adenoviru Ad5. V dalším výhodném provedení je exogenní nukleová kyselina vložena do delece v úseku El.

Replikačně defektní rekombinantní adenoviry, jež jsou zde popsány, mohou být připraveny například homologní rekombinací mezi defektním virem a plazmidem nesoucím, kromě jiného, sekvenci nukleové kyseliny popsanou výše (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). K homologní rekombinací dojde v důsledku kontransfekce uvedeného adenoviru a plazmidu do vhodné buněčné linie. Vhodná buněčná linie, která se může použít, výhodně musí i) být transformovatelná uvedenými prvky a i i) obsahovat sekvence, které jsou schopny kompletovat část genomu replikace defektního adenoviru, výhodně v integrované formě, aby se zabránilo riziku rekombinace. Příkladem buněčné linie, která se může užít, je linie lidských buněk 293 z embryonální ledviny (Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 1977, 59), která obsahuje levou část genomu adenoviru Ad5 (12 %) integrovanou do svého genomu. Příkladem linie, kterou lze užít k přípravě defektních rekombinantních retrovirů, je linie CR1P (Danos a Mulligan, PNAS 85, 1988, 6460). Viry se po namnožení získají purifikací běžnými metodami molekulární biologie, které jsou odborníkovi známy.

Jsou rovněž popsány defektní rekombinantní viry obsahující heterologní sekvence nukleové kyseliny kódující popsaný polypeptid.

Dále jsou popsány polyklonální nebo monoklonální protilátky nebo protilátkové fragmenty. Tyto protilátky se mohou připravovat způsoby, které jsou odborníkovi známé. Konkrétně mohou být tyto protilátky připraveny imunizací zvířete proti polypeptidů, jehož sekvence je vybrána ze sekvence id. č. 1 nebo sekvence id. č. 2 nebo navržených fragmentů dle sekvence id. č. 3, s následujícím odběrem krve a izolací protilátek. Tyto protilátky mohou být také připraveny pomocí hybridomů využitím technik, které jsou odborníkovi známé. Protilátky nebo protilátkové fragmenty podle předkládaného vynálezu mohou být konkrétně použity pro alespoň částečnou inhibi-6CZ 303226 Β6 ci interakce mezi presenilinem l nebo presenilinem 2 a prekurzorem β-amyloidového peptidu a/nebo β-amyloidovým peptidem.

Předmět předkládaného vynálezu se tedy týká způsobu identifikace sloučenin schopných alespoň částečně modifikovat nebo inhibovat interakci mezi presenilinem 1 nebo presenilinem 2 a prekurzorem β-amyloidového peptidu a/nebo β-amyloidovým peptidem. Způsob podle vynálezu se může zejména užít jako test pro screening molekul pro identifikaci takových inhibujících sloučenin.

Tento test je založen zejména na detekci inhibice obecné interakce mezi preseniliny (1 nebo 2) a APP nebo Αβ peptidem a zvláště pak mezi Αβι^₂ peptidem a N-koncovým úsekem PS2. Konkrétně, použitím markerových proteinů vázaných na preseniliny nebo jejich fragmenty a vhodného detekčního systému, zejména imunoprecipitace, nebo použitím chromoforů nebo fluoroforů, je dobře možné detekovat inhibici interakce proteinů nebo jejich fragmentů, jak byly popsány výše. Způsoby obsahují alespoň jeden krok, kdy se preseniliny a/nebo APP a/nebo jejich fragmenty označí a krok, kdy se detekuje inhibice interakce buďto mezi preseniliny (1 nebo 2) a APP nebo Αβ-peptidem a zvláště pak mezi Αβι^₂ peptidem a N-koncovým úsekem presenilinů, výhodně PS2, nebo mezi celým APP a preseniliny.

V jednom provedení způsobu podle vynálezu se detekce a identifikace takových sloučenin provádí v následujících krocích:

- peptid Αβι^ je preabsorbován inkubací na nitrocelulózovou membránu, bakteriální extrakt obsahující celý nebo část presenilinu (PSI nebo PS2) a výhodně jeho N-koncový úsek, je pak přidán pro inkubaci s molekulami nebo směsí obsahující různé testované molekuly,

- po opláchnutí je interakce mezi presenilinem a peptidem Αβι na nitrocelulózovém filtru detekována pomocí proteinů presenilin-marker. Požadovaná molekula inhibuje interakci a tak snižuje intenzitu signálu z markerového proteinu.

Markerový protein je výhodně a) S-tag-vazebný protein, konjugovaný s alkalickou fosfatázou nebo fluorescentním chromoforem, nebo b) protilátka anti-PSNT, tj. protilátka namířená proti N-koncovému úseku presenilinu.

V jiném provedení způsobu podle vynálezu se vyhledávání nových sloučenin provádí následujícím způsobem:

- peptid Αβ[_42 je preinkubován na destičce s jamkami (formát 96 jamek nebo více),

- N-koncový úsek purifikovaného rekombinantního presenilinu je pak pro inkubaci přidán k molekulám nebo směsi obsahující různé testované molekuly,

- po opláchnutí je interakce mezi presenilinem a peptidem Αβ,^ζ na destičce detekována pomocí proteinů presenilin-marker. Ztráta interakce mezi preseniliny a prekurzorem β-amyloidového peptidu a/nebo β-amytoidovým peptidem je pak detekována spektrofotometricky.

Ve specifickém případě, kdy se užije S-tag-vazebný protein konjugovaný s alkalickou fosfatázou jako markerový protein, po vytvoření kolorimetrického substrátu je signál detekován při 450 nm.

Ve výhodném provedení způsobu podle předkládaného vynálezu se detekce a/nebo izolace sloučenin schopných alespoň částečně modifikovat nebo inhibovat interakci mezi presenilinem 1

-7CZ 303226 B6 nebo presenilinem 2 a prekurzorem β-amyloidového peptidu a/nebo β-amyloidovým peptidem, konkrétně mezi Αβί ₄₂ peptidem a N-koncovým úsekem PS2 provádí v následujících krocích:

molekula nebo směs obsahující různé molekuly se uvede do kontaktu se syntetizovaným 5 peptidem Αβ₁₄₂, přičemž tento syntetizovaný peptid nese biotin a rameno 3 β-alaninů (nebo lysinu) na jeho N-koncovém úseku („upstream“, proti směru transkripce od pozice 1),

- uvedená reakční směs se inkubuje s N-koncovým úsekem purifikovaného presenilinu značeného prvním fluoroforem. Výhodně fluorofor je kryptát europia.

- streptavidin (který se váže na biotin v peptidu biot-Ap_k42), konjugovaný s druhým fluoroforem, se přidá, přičemž druhý fluorofor je schopen excitovat při vlnové délce emise prvního fluoroforu, takže má prospěch z přenosu fluorescence, pokud tyto dva fluorofory jsou navzájem blízko,

- detekce nových sloučenin, které inhibují interakci, se provádí fluorometrií v emisní vlnové délce prvního fluoroforu a/nebo měřením redukce signálu v emisní vlnové délce druhého fluoroforu.

Ve specifickém provedení vynálezu je druhý fluorofor XL665, což je allofykocyanin, chemicky zesítěn, aby se zvýšila jeho fluorescence při 665 nm (CisBio International). Ztráta interakce je tedy detekována fluorometricky v emisní vlnové délce prvního fluoroforu a redukcí signálu XL665, jehož emisní vlnová délka je 665 nm.

Způsob podle předkládaného vynálezu je výhodný, neboť umožňuje přímou detekci interakce mezi preseniliny a APP a/nebo Αβ peptidem v kapalné, homogenní fázi, a tudíž dovoluje detekci molekul, které inhibují uvedenou interakci. Specificky tento proces je založen na přenosu fluorescence mezi dvěma fluorofory, pokud jsou tyto fluorofory fyzicky dostatečně blízko (jak je tomu v případě interakce mezi Αβι_4₂ a rekombinantním proteinem). Tudíž v jedné výhodné variantě způsobu první fluorofor je kryptát europia, nesený značeným rekombinantním proteinem (excitovaný při 337 nm), který reaguje se streptavidin-XL665 navázaným na biot-Αβ peptid, zejména biot- Αβι ₄₂ peptid. Výhodně značený protein obsahuje N-koncový úsek jednoho z presenilinů (PSNT-K). Ztráta fluorescence v 665 nm a zvýšení fluorescence v 620 nm, charakteristické pro kryptát europia, indikuje inhibici interakce mezi preseniliny nebo jejich

N-koncovým úsekem a APP a/nebo Αβ peptidem, způsobenou požadovanou testovanou molekulou.

V jiné variantě způsobu podle vynálezu je molekula nebo směs obsahující různé molekuly uvedena do kontaktu nejdříve s N-koncovým úsekem purifikovaného presenilinu značeného kryptátem europia (PSNT-K) a pak s peptidem Αβ1-40 nebo ΑβΙ-42 nesoucím biotin a rameno 3 β-alaninů (nebo 3 lysinů) na N-konci. Detekce nové molekuly schopné alespoň částečně modifikovat nebo inhibovat interakci mezi presenilinem 1 nebo presenilinem 2 a prekurzorem β-amyloidového peptidu a/nebo β-amyloidovým peptidem se také provede, a sice po přidání XL665 značeného streptavidinem, spektrofluorometricky výše uvedeným způsobem, konkrétně změřením fluorescence při 665 nm.

V dalším provedení způsobu podle vynálezu pro detekcí sloučenin, které inhibují interakci obecně mezi preseniliny (1 nebo 2) a APP nebo Αβ peptidem, a specificky mezi peptidem Αβ^₂ a Nkoncovým úsekem PS2, obsahuje následující kroky:

do kontaktu se přivede směs a) buněčných lyzátů obsahujících celý nebo úsek presenilinu (PSI nebo PS2) a výhodně N-koncový úsek, b) buněčných lyzátů obsahujících APP, kteréžto lyzáty jsou získány z buněk infikovaných virem a zejména bakuloviry, a c) testovaná molekula nebo směs obsahující různé testované molekuly,

-8CZ 303226 B6

- solubilizované proteiny odpovídají presenilinům nebo APP nebo peptidů Αβ jsou koimunoprecipitovány pomocí vhodných protilátek, které jsou odborníkovi známy,

- ztráta koimunoprecipitace presenilinů a APP je detekována pomocí westernového přenosu („western blotting“) se značenými protilátkami, což indikuje, že testovaná molekula má požadované inhibiční vlastnosti.

Ve specifickém provedení je způsob podle vynálezu upraven pro detekci a/nebo izolaci ligandů, io agonistů a antagonistu interakce mezi preseniliny a prekurzorem β-amyloidového peptidů a/nebo β-amyloidovým peptidem.

Dále se popisuje použití popsaných polypeptidů k detekci ligandů pro polypeptidy, ale zejména ligandů pro preseniliny, pro prekurzor β-amyloidového peptidů a/nebo β-amyloidový peptid is a výhodně pro peptid Αβ1-42 a/nebo N-koncový úsek PS2, a také sloučenin schopných alespoň částečné inhibice interakce mezi presenilinem i nebo presenilinem 2 a prekurzorem β-amytoidového peptidů a/nebo β-amyloidovým peptidem.

Dále se popisuje použití ligandu nebo modifikátoru identifikovaného a/nebo získaného způsobem popsaným výše, jako léčiva. Vzhledem k jejich schopnosti interferovat s interakcí mezi preseniliny a prekurzorem β-amyloidového peptidů a/nebo β-amyloidovým peptidem, tyto ligandy nebo modifikátory mohou modifikovat produkci Αβι^₂ amyloidového peptidů a umožnit léčení určitých neurologických poruch a zejména Alzheimerovy nemoci.

^Ί5 Dále se popisuje vývoj testu interakce mezi preseniliny a prekurzorem β-amyloidového peptidů a/nebo β-amyloidovým peptidem, výhodně mezi Αβί ₄₂ peptidem a N-koncovým úsekem PS2, kterýžto test obsahuje alespoň jeden krok, kdy dojde k přenosu fluorescence mezi dvěma fluorofory vázanými na molekulu uvedenou výše a krok, kdy se detekuje interakce měřená spektrofotometricky. Jak již bylo zmíněno výše, tento test se užívá také k detekci molekul, které proje30 vují uvedenou interakci, podle způsobu k detekci inhibice interakce, popsaného v předkládaném vynálezu.

Popisuje se rovněž také jakýkoliv farmaceutický přípravek obsahující jako aktivní složku alespoň jeden polypeptid, jak je definován výše.

Popisuje se rovněž jakýkoliv farmaceutický přípravek obsahující jako aktivní složku alespoň jednu protilátku a/nebo protilátkový fragment, jakjsou definovány výše, a/nebojeden „antisense“ oligonukleotid, nebo alespoň jeden ligand definovaný výše. Popisuje se také jakýkoliv farmaceutický přípravek obsahující jako aktivní složku alespoň jednu nukleotidovou sekvenci, jak je definována výše.

Kromě toho se popisují farmaceutické přípravky, ve kterých peptidy, protilátky a nukleotidové sekvence definované výše nebo jejich fragmenty jsou kombinovány se sebou navzájem nebo s dalšími aktivními složkami.

Popisují se také přípravky, ve kterých jsou popsané nukleotidové sekvence inkorporovány do virových nebo nevirových rekombinantních vektorů.

Popsané farmaceutické přípravky mohou být použity k tomu, aby alespoň částečně inhibovaly interakci mezi presenilinem 1 nebo presenilinem 2 a prekurzorem β-amyloidového peptidů a/nebo β-amyloidovým peptidem. Výhodněji jsou to farmaceutické přípravky určené k léčení neurodegenerativních nemocí, jako je například Alzheimerovou nemoc.

-9CZ 303226 B6

Dále se popisuje použití polypeptidů popsaných výše k alespoň částečné inhibici interakce mezi presenilinem a prekurzorem β-amyloidového peptidu a/nebo β-amyloidovým peptidem, a výhodně použití těchto peptidů k přípravě léčiva určeného k léčení neurodegenerativních nemocí, zejména Alzheimerovy nemoci.

Pro popsané použití jsou polypeptidy na jedné straně nebo jakákoliv molekula schopná alespoň částečně inhibovat interakci mezi presenilinem a prekurzorem β-amyloidového peptidu a/nebo β-amyloidovým peptidem, a odpovídající sekvence nukleové kyseliny na straně druhé, nebo alternativně výše popsané vektory, výhodně kombinovány s jedním nebo několika farmaceuticky io přijatelnými nosiči a jsou formulovány do lékové formy pro topické, perorální, intranazální, intravenózní, intramuskulámí, subkutánní, intraokulámí, transdermální a další způsoby podávání.

Výhodně jsou užívány v perorální formě. Nicméně i injikovatelná forma je vhodná a lze ji formulovat s isotonickými sterilními roztoky solí (hydrogenfosforečnan nebo dihydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, draselný, vápenatý nebo hořečnatý nebo směsi těchto solí), a nebo suché přípravky, zejména lyofílizované přípravky, které, v závislosti na druhu, po přidání sterilní vody nebo fyziologického roztoku, vytvoří injikovatelný přípravek.

Dávky vektoru a zejména viru použití k podávání mohou být upraveny v závislosti na různých faktorech, zejména závisí na místě podávání (orgán, nervová tkáň nebo svalová tkáň), počtu injekcí, exprimovaném genu nebo požadované době léčení. Obecně rekombinantní adenoviry podle předkládaného vynálezu jsou formulovány pro podávání v dávkách 10⁴ až 10ⁱ⁴ pfu, a výhodně 10⁶ až 10^H pfu. Termín „pfu“ („plaque forming unit“) odpovídá infekčnosti roztoku viru, jak se stanoví infikováním vhodné buněčné kultury a měřením, obecně po 2 týdnech, počtu plaků infikovaných buněk. Způsoby stanovení titru pfu virového roztoku jsou v odborné litera25 ture dostatečně popsány.

Je rovněž popsán účinný prostředek pro léčení nemocí, na kterých se podílí interakce mezi presenilinem a prekurzorem β-amyloidového peptidu a/nebo β-amyloidovým peptidem, výhodně zejména pro léčení neurodegenerativních nemocí a zvláště Alzheimerovy nemoci.

Předkládaný vynález je dále podrobněji popsán a vysvětlen v příkladech, které jsou pouze ilustrativní a nijak rozsah vynálezu neomezují.

Popis obrázků na výkresech

Obrázek 1: A) Schéma zkráceného konstruktu PS2,

B) Exprese v buňkách COS 1

Obrázek 2: Interakce zkrácené formy PS2 s APP.

Obrázek 3: A) Interakce secemovaného N-konce PS2 (SecPS2NT) s extracelulámím APP. K interakci nedochází u cytoplazmatické formy PS2 (myc-PS2NT).

B) Detekce interakce SecPS2NT/APP, ale nikoliv myc-PS2NT/APP v extracelulámím médiu.

Obrázek 4: Interakce PS2 se zkrácenou formou APP:

A) Interakce PS2 s formou APP SPA4CT, ale nikoliv s cytoplazmatickou doménou APP (MC45F).

B) Interakce PS2 s formou APP Cl00.

- 10CZ 303226 B6

Obrázek 5: Interakce PSI a PS1AC2 s APP ajeho zkrácenou formou.

A) Interakce PSI s celým APP ajeho zkrácenou formou SPA4CT

B) Interakce zkrácené formy PSI (PS1AC2) s APP.

Obrázek 6: Interakce PSI a APP v hmyzích buňkách:

A) Imunoprecipitáty anti-histidin (značka na PS 1), detekce s APP, io

B) Imunoprecipitáty anti-PSl, detekce s APP,

C) Invertované precipitáty anti-APP, detekce s PSI.

is Obrázek 7: Interakce mezi secemovanou formou PS2NT s peptidem a Αβ peptidem v extracelulámím médiu.

Obrázek 8: Rekonstituce interakce Ap/PS2NT in vitro na nitrocelulózovém filtru:

A) Závislost na dávce jako funkce koncentrace PS2NT

B) Závislost na dávce jako funkce koncentrace Αβ.

Obrázek 10: Nahrazení interakce mezi PSI a fragmentem SPA4CT N-koncovým úsekem PS2, 25 kterému předchází signální peptid (SecPS2NT).

Obrázek 11: Interakce PS2NT s peptidem Αβι-42 in vitro: Detekce pomocí testu ELISA na 96-jamkové destičce.

Obrázek 12: Interakce PS2NT s peptidem Αβ₁₄2 detekovaná HTRF (homogenní časově rozložená fluorescence) testem přenosu fluorescence.

Obrázek 13: Blokování interakce APP/PSl SecPS2NT vede k inhibici intracelulární tvorby amyloidového peptidu Αβι^₂:

A) Demonstrace toho, že blokování interakce APP/PSl SecPS2NT vedlo k inhibici intracelulární tvorby amyloidového peptidu Αβ| ₄2·

B) Kontrola, že exprese SecPS2NT neovlivnila expresi různých transgenů.

Obrázek 14: Detekce interakce PS2 s endogenním APP v buňkách COS pomocí farmako log ického ošetření laktylcystinem.

Obrázek 15: Interakce PS2 a PS2NT s druhým úsekem APP, odlišným od peptidu Αβ.

Materiály a metody použité ve vynálezu A) materiály

1. Konstrukty exprimující preseniliny

Příprava expresního vektoru (hostitelský vektor pcDNA3, InVitrogen) v savčích buňkách pro lidské proteiny PSI a PS2 byla již dříve popsána (Pradier et al., 1996). Několik postupných deleci

-11 CZ 303226 B6

Ckoncového úseku PS2 bylo provedeno (viz obr. 1A). Číslování, které je uvedeno, vychází z pozice 1 start-kodonu PS2,

Restrikční fragment HindlII z vektoru PS2 (od nekódujícího úseku 5-konce, pozice -55, do vnitřního místa v pozici 1080) byl purifikován a ligován s vektorem pcDNA3 linearizovaným HindlII a ošetřeným alkalickou fosfatázou. Takto vytvořený zkrácený PS2 (PS2AC1) zahrnuje N-koncový úsek ke zbytku 361 a 7 zbytků poskytnutých 3 -koncem a tudíž obsahuje prvních šest transmemhranových domén a velkou část hydrofilní smyčky (obr. 1 A).

PS2AC2 byl zkonstruován štěpením plazmidu PS2 Pstl (vnitřní místo v pozici 679) a ligaci s Pstl fragmentem odpovídajícím nekódujícímu úseku 3'-konce vektoru PS2. Zkrácený protein PS2AC2 zahrnuje PS2 od pozice l do zbytku 228 a 18 dalších zbytků poskytnutých 3-koncem. Obsahuje tak první čtyři transmembránové domény PS2.

Byl také připraven podobný konstrukt nesoucí mutaci N1411, označený PS2AC2*.

Restrikční fragment HindlII (-55)/MscI(590) konstruktu PS2AC2 byl klonován do vektoru pcDNA3 předem štěpeného HindlII, jehož Apal konec byl zatupen. Tento konstrukt zahrnuje N-koncový úsek PS2 do zbytku 198 a 2 další zbytky, obsahuje tak první tři transmembránové domény PS2,

Restrikční fragment HindlII (-55)/Ncol(504) konstruktu PSAC2 byl na svém Notl konci zatupen Klenowovým fragmentem DNA polymerázy, klonován do stejného vektoru pcDNA3 Hindill/(Apal tupý konec), čímž vznikl konstrukt PS2AC4 zahrnující N-koncový úsek PS2 do zbytku 168 a 3 další zbytky.

Konstrukce hydrofilního úseku N-konce PS2 byla provedena amplifikaci sekvence PS2 pomocí oligonukleotidu ext5' (sekvence id. č. 4):

⁵ ' -CGGAATTCATCGATOCCACCATCCTCACATTCATGGCC-»3 ' (překrývající počáteční kodon ATG, vyznačen tučně, a vnesené restrikční místo EcoRI je podtrženo), a druhým oligonukleotidem ext3' (sekvence id. č. 5):

' - CCGCTCGAGTCATTGTCGACCATGCTTCGCTCCGTATTTGAGG - 3 ' (vnesený stop-kodon po zbytku 90 PS2 a restrikční místo Xhol, podtrženy).

Po klonování do vektoru pCRII metodou TA klonování (InVitrogen) byla správnost PCR fragmentu ověřena sekvencováním DNA. Tento fragment (EcoRI/Xho) byl pak vložen do vektoru pcDNA3 ve shodné fázi se sekvencí odpovídající epitopů myc na jeho N—konci: mycPS2Nter.

Aby nebyla narušena topologie PS2, stejný Nter fragment byl klonován do vektoru pSectagB, ve fázi se sekvencí signálního peptidů IgkB, aby se nasměrovala sekrece proteinu PS2Nter: SecPS2-Nter.

C-koncový úsek PS2 byl zkonstruován podobným způsobem užitím restrikčního fragmentu HindlII (1080)Pstl (nekódující 3'-konec) klonovaného do vektoru pSecTaqB HindlII/Pstl, přičemž SecPS2Cter obsahuje C-konec od zbytku 361, nebo do vektoru pcDNA3myc ve fázi s epitopem myc.

Zkrácený konstrukt PSI byl získán podobným způsobem. Vektor pcDNA3-PSl byl naštěpen Pflml (místo v pozici 636 kódující sekvence PSI) a Xhol v nekódujícím úseku 3'-konce sekvence PSI. Tato místa byla transformována na tupé konce T4 DNA polymerázou. Fragment

-12CZ 303226 B6 vektoru purifikovaný na agarózovém gelu byl spojen, čímž vznikl zkrácený expresní vektor PSI obsahující N-koncový úsek PSI do zbytku Ile213 (za pátou transmembránovou doménou) a navíc 12 dalších aminokyselinových zbytků. Tento konstrukt odpovídá chiméře AC2 a byl označen PS1AC2.

2. Konstrukty exprimující APP

2.1. Konstrukty APP ío Již dříve byly popsány různé konstrukty použité zde: celý APP (isoforma 695) a SPA4CT (posledních 100 zbytků APP (aminokyseliny 597 až 695) se signálním peptidem pro inzerci do membrány) (Dyrks et al., 1993). Vektory pro expresi Cl00 a cytoplazmatické domény APP byly získány následujícím způsobem: odpovídající cDNA byly připraveny enzymatickou amplifikaci DNA (PCR, polymerázová řetězová reakce) užitím následujících syntetických oligonukleotidů jako primerů:

Pro C100 oligonukleotidy 8172 a 8181, pro cytoplazmatickou doménu APP oligonukleotidy 8171 a 8181.

Olígonukleotid 8172 (sekvence id. č. 6):

5; CAAAGATCTGATGCAGAATTCCGACAT 3 * obsahuje:

- rozpoznávac í m í sto pro restri kčn í enzym Bg l II (podtrže no)

- kódující sekvenci aminokyselin 597 až 602 APP (tučně) (APP je číslován do 695 aminokyselin).

olígonukleotid 8181 (sekvence id. č. 7):

' CAA.GCGGCCGCTCATCCCTTGTCATCGTCGTCCT TGTAGTCTCCGTTCTGCATCTGCTC 3 ' obsahuje:

- rozpoznávací místo pro restrikční enzym Notl (podtrženo)

- sekvenci komplementární ke kódující sekvenci pro aminokyseliny 691 až 695 APP (APP je číslován do 695 aminokyselin) sekvenci komplementární k sekvenci Asp-Tyr-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys odpovídající epitopu FLAG (kurzívou).

Olígonukleotid 8171 (sekvence id. č. 8):

5' CAAAGATCTAAGAAAťZAGTACACATCC 3' obsahuje:

- rozpoznávací místo pro restrikční enzym Bg III (podtrženo)

- kódující sekvenci aminokyselin 650 až 655 APP (tučně) (APP je číslován do 695 aminokyselin).

Produkty enzymatické amplifikace DNA byly klonovány do vektoru pCRÍI. Nukleotidová sekvence byla ověřena sekvencováním specifickou terminačni metodou.

- 13CZ 303226 B6 cDNA pak byly vloženy ligací do expresního plazmidu odvozeného z plazmidu pSV2, kteiý obsahoval ve shodném čtecím rámci epitop MYC.

2.2. Konstrukce rozpustných forem APP: a-sAPP a β-sAPP cDNA odpovídající secernovým formám APP končící buďto a- nebo β-štěpným místem byly získány metodou PCR s následujícími oligonukleotidy.

io Oligonukleotid 1 (sekvence id. č, 9):

5'-ccatcgafcggctaCATCTTCACTTCAGAG-3 ' vnesl:

- stop kodon (invertovaná komplementární sekvence je podtržena) za pozici 1788 APP odpovídající β-štěpenému místu restrikční místo Clal.

Oligonukleotid 2 (sekvence id. č. 10):

* -ccatcgatggctaTTTTTGATGATGAACTTC- 3 ' vnesl:

stop kodon (invertovaná komplementární sekvence je podtržena) za pozici 1836 APP odpovídající α-štěpnému místu

- restrikční místo Clal.

Oligonukleotid 3 (sekvence id. č. II):

5'-CCGTGGAGCTCCTCCCG-3' je společný pro obě formy, odpovídá úseku 1583 až 1600 APP a zahrnuje vnitřní restrikční místo Sací (podtrženo).

cDNA APP byla amplifikována v PCR užitím párů oligonukleotidů oligo3—oligol a oligo3-oligo2 pro β-sAPP a α-sAPP, v uvedeném poradí. Produkty amplifikace byly subklonovány jak bylo již popsáno výše do pCRII a sekvence byly ověřeny sekvencováním. Restrikční fragment Sacl-Clal z každého produktu byl purifikován a klonován do expresního vektoru pro APP (viz výše), který byl štěpen Sacl-Clal, aby se C-koncový úsek APP nahradit C-koncovým fragmentem β-sAPP nebo α-sAPP a rekonstituoval se tak celý protein.

1. Bakulovirové konstrukty

Příprava bakulovirových transferových vektorů kódujících lidský protein PSI byla provedena pomocí expresního vektoru pro savčí baňky (Pradier et al., 1996). cDNA kódující protein PSI byla získána štěpením restrikčními enzymy Xhol a Notl a pak klonována do přenosového plazmidu pAcHTLB (6 His-fúzní protein) a pAcSG2 (nativní protein). Produkce rekombínantních bakulovirů probíhala podle pokynů výrobce (Pharmingen) a spočívala v transfekci 2 x IO⁹ hmyzích buněk (sf9) 1 μg transferového plazmidu obsahujícího požadovaný gen a 0,5 μg virové DNA (Baculogold). Po 5 dnech v 27 °C byly buňky setřeny a eentrifugovány, supematant byl použit jako zásobní roztok pro amplifikaci a stanovení titru viru, a exprese proteinů byla so vizualizována westernovým přenosem buněčného peletu.

- 14CZ 303226 B6

Příprava bakuloviru exprimujícího lidský APP(695) byla již drive popsána (Essalmani etal., 1996).

Pro studium exprese PSI a APP byly buňky sf9 koinfikovány při M.O.Í. 2 bakulovirem exprimujícím lidský APP(695), lidský presenilin 1 (PSI) nebo PSI se značnou 6-His na N-konci (óHisPSl) nebo kontrolní protein XylE z Pseudomonas putrida se značkou 6-His na N-konci (6HisXylE), a pak solubilizovány pufrem obsahujícím: lOmM Tris, 130mM NaCl, 1% Triton X100, 1%NP4O, pH 7,5.

Sol ubil izované proteiny byly imunoprecipitovány s protilátkou anti-histÍdin(A) a protilátkou anti-PSl(l805) (B) nebo anti-APP (22C11) (C). Přítomnost APP nebo PSI byla detekována westernovým přenosem s protilátkou anti-APP aCT43 (A), 22C11 (B) nebo protilátkou anti-PSl 95/23 (C).

Solubilizovaná frakce obsahující APP, PSI nebo ÓHisPSl byly smíchány a pak imunoprecipitovány v přítomnosti protilátek anti-histidin nebo anti-PSl přes noc ve 4 °C. Koimunoprecipitace APP byla detekována po westernovém přenosu protilátkami aCT43 nebo 22C11.

2. Plazmidy

Ve vynálezu byly použity následující plazmidy:

pcDNA je komerčně dostupný plazmid (InVitrogen) užitý pro klonování a expresi sekvencí PSI a PS2 jejich zkrácených forem v savčích buňkách,

- pCRII je komerčně dostupný plazmid (InVitrogen) užitý pro klonování PCR fragmentů,

- pSecTagB je komerčně dostupný plazmid (InVitrogen) užitý pro klonování a expresi cDNA s připojeným signálem pro sekreci (signální peptid Igk) v savčích buňkách, pSV2 je komerčně dostupný plazmid (Pharmacia) užitý pro klonování a expresi cDNA v savčích buňkách,

- pAcHTLB je komerčně dostupný plazmid (Pharmingen) užitý pro inzerci epitopu (His)6 do cDNA a homologní rekombinaci s bakuloviry, pAcSG2 je komerčně dostupný plazmid (Pharmingen) užitý pro homologní rekombinaci s bakuloviry,

- pET29 je komerčně dostupný plazmid (Novagene) užitý pro expresi cDNA v bakteriích B. Metody

1. Transfekce buněk

Metoda zavedená pro buňky COSI nebo CHO spočívá v použití iipofektantu v poměru od 1 do 8 (hmotnost/hmotnost) relativně k DNA a syntetického peptidu H1 (sekvence KTPKKAKKPKTPKKAKKP) ve stejném poměru, aby se optimalizovala kondenzace DNA a transfekční účinnost. Tato metoda je založena zejména na neutralizaci nábojů fosforečnanu DNA pozitivními náboji Iipofektantu.

Buňky COSI jsou pěstovány v inkubátoru ve 37 °C, 95% vlhkosti a 5% CO₂ v médiu DMEM (Dutbeccos Modified Eagles Medium) obsahujícím 4,5 g/l glukózy (Gibco BRL), doplněném 3% L-glutaminem, 1% pěnic i lin-streptomy cínem a 10% fetálním telecím sérem.

- 15CZ 303226 B6

Den před transfekcí jsou buňky naočkovány v hustotě 2,5 x 10^ύ buněk na lOOmm misky. V den transfekce jsou buňky dvakrát omyty s PBS (fyziologický roztok pufrovaný fosfáty) a jednou s médiem OptiMEM (patentovaný přípravek, Gibco BRL) a ponechány pro adaptaci alespoň 15 minut v inkubátoru.

pg plazmidové DNA celkem je přidáno ke 300 μΐ média OptiMEM a 64 pg peptidu Hl, množství odpovídající lOOmm misce. Po důkladném protřepání 10 sekund na vortexu je po pětiminutovém čekání k předcházející směsi přidán lipofektamin (32 μί, což je 64 pg) naředěný ve 300 μί OptiMEM. Celek je opět důkladně protřepán na vortexu a pak se ponechá stát 30 minut. Do každé zkumavky je přidáno 5 ml OptiMEM a protřepaná směs je přelita přes buňky (ze kterých nebylo dříve odsáto médium). Buňky jsou pak umístěny do inkubátoru na 4 hodiny a po této době je směs nahrazena kompletním médiem.

2. Lýze buněk a testy proteinů

Buňky jsou obvykle lyžovány 48 hodin po transfekcí (v obvyklém maximu exprese). Lyzovací pufr obsahuje lOmM Tris, pH 7,5, lmM EDTA, 1% Triton XI00, 1% NP40 a „koktejl“ inhibitorů proteáz (Complete , Boehringer Mannheim). Po opláchnutí PBS je na každou misku přidáno 800 μί studeného pufru. Lyzáty jsou pak podrobeny sonikaci, po které následuje míchání megnetickou tyčinkou ve 4 °C přes noc. Centrifugace 30 minut v 15 000 x g oddělí pelet do supematant.

Rozpustné proteiny jsou pak testovány pomocí soupravy BCA (Pierce) tak, aby bylo možné normalizovat následující experimenty.

3. ímunoprecipitace

Protilátky namířené proti N-koncovému peptidu PS2 95041 (Blanchard et al., 1997) a proti prvním dvaceti aminokyselinám PSI (Duff et al., 1996) byly získány z králíků imunizací syntetickými peptidy. Pro imunoprecipitaci 100 μg proteinů bylo naředěno ve 400 μΐ modifikovaného pufru RIPA (150mM NaCl, 50mM Tris pH 8,0, 1% Triton X100 (objem/objem), 1% NP40 (objem/objem). 30 μΙ suspenze sefarózy s proteinem A (0,1% hmotn./objem) v PBS) a 3 μΐ roztoku protilátky bylo přidáno. Suspenze se jemně promíchávala na rotačním míchadle ve 4 °C přes noc. Komplex sefarózy s proteinem A byl 3x propláchnut 0,5 ml modifikovaného RIPA a jednou oplachovacím pufrem C (lOmM Tris pH 7,5).

4. Imunoprenos

Vzorky (buněčné lyzáty) byly denaturovány ve stejném objemu nanášecího pufru (125mM Tris, pH 6,8, 4% (hmotnost/objem) SDS, 20% glycerol, 0,02% bromfenolová modř, 50mM dithiothreítol) v 95 °C po 5 minut. Pro analýzu exprese presenilinů byly vzorky denaturovány v přítomnosti 8M močoviny a ve 37 °C, aby se zabránilo agregaci, ke které specificky při 95 °C dochází u presenilinů.

Vzorky byly naneseny na Tris-glycinové gely (Novex) s různým procentem akry lam idu v závislostí na molekulové hmotnosti, která má být rozlišena. Byl také nanesen standard molekulové hmotnosti (Broad Range, Biorad). Migrace probíhala přibližně 2 hodiny v lx SDS pufru (Novex) při konstantním napětí 100 V. Gel se pak přenášel na nitrocelulózovou membránu nebo membránu PVDF (lx výsledný transferový pufr (Novex) s 10% methanolem) po 2 hodiny při konstantním proudu 150 mA.

Po přenosu byla membrána blokována 2 hodiny při teplotě místnosti v 50 ml PBS-T (PBS s 0,5% Tween) obsahujícím 2% odstředěné mléko (Merck). Primární protilátka (naředěná na optimální

- 16CZ 303226 B6 koncentraci řádově 1/000 až 1/5000 PBS-T s 2% odstředěným mlékem nebo bez něj) byla ponechána přes noc ve 4 °C. Po krátkém opláchnutí PBS-T byla membrána inkubován 45 minut v přítomnosti sekundární protilátky (proti-myší nebo proti—králičí IgG v závislosti na případě, konjugovaná s křenovou peroxidázou) ředěné 1/5000 takzvaným „ECL“ pufrem (20mM Tris, s 150mM NaCl, 0,1% Tween).

Membrána pak byla 4 x opláchnuta 15 minut v „ECL“ pufru. Může se ukázat, že reagencií ECL je nutné připravovat čerstvou, a to smícháním stejného objemu dvou pufrů, ze kterých se skládá. Provedly se proto různé expozice fotografického filmu (Hyperfilm ECL, Amersham), po kterých io následovalo vyvolání.

5. In vitro fixace PS2NT s Αβ amyloidovým peptidem

5.1. Příprava rekombinantního proteinu PS2 NT v bakteriích

Pro vytvoření bakteriálního expresního vektoru pro PS2NT (aminokyseliny 1 až 87) byla cDNA PS2 amplifikována v PCR užitím oligonukleotidů:

3' (CCGCTCGAGTCATTGTCGACCATGCTTCGCTCCGTATTTGAGG) ^a 5' (CCGGAATTCATCGATTCCACCATGCTCACATTCATGGCC)

Výsledný fragment byl klonován do pCRII a sekvence pak byla ověřena sekvencováním. Tento fragment pak byl klonován do vektoru pET29a (Novagene) ve fázi se značící sekvencí S-tag. Protein byl produkován v bakteriích BL21. Po 5hodinové indukci IPTG byly bakterie izolovány centrifugací (10 minut pri 6000 rpm) a buněčný pelet pak byl resuspendován v pufru RIPA (objem byl vypočten násobením OD buněčné kultury po indukci objemem kultury a dělen 23). Bakterie byly lyžovány sonikací a lyzát byl centrifugován 20 minut při 13000 rpm ve 4°C.

Supernatant (celkový extrakt) byl použit pro vazebné studie.

Rekombinantní protein PS2NT byl také purifikován z celkového extraktu na niklové koloně (značka poly-His byla poskytnuta vektorem pET29a) postupem doporučeným výrobcem (Novagene).

5.2 Testy vazby Ρ82ΝΤ/Αβ42 na nitrocelulózou membránu

Syntetický peptid Αβ (v roztoku) byl nanesen na nitrocelulózovou membránu (Schleicher and Schuell) pomocí 96-jamkového zařízení pro tečkový přenos („dot-blot“). Po nanesení byl filtr blokován (vzhledem k k nespecifickým vazebným místům pro proteiny) že lati novým blokovacím činidlem (Novagen) naředěným 10 x v TBST, Po blokování byl filtr vložen zpět do přenosového zařízení a byl přidán bakteriální extrakt PS2NT do jamek a membrána se inkubovala 2 hodiny při teplotě místnosti. Jako kontrola se užil bakteriální extrakt obsahující prázdný plazmid pET29 ve dvojím opakován. Filtr byl pak opláchnut pufrem RIPA, vyjmut ze zařízení a ještě třikrát opláchnut PBST (15 minut každé oplachování). Detekce značky S-tag pak byla provedena podle návodu výrobce (Novagen) s kolorimetrickým substrátem. Kvantifikace kolorimetrické reakce (precipitátu) byla provedena optickým proměřením každé jamky pomocí programu Tina 2.1 (Raytest).

5.3. Test interakce Ρ82ΝΤ/Αβ42 ve formátu ELISA

Syntetické peptidy Αβ (1-40 a 1^42) (100 μ|, 2 pg/ml) byly inkubovány přes noc v 96jamkové destičce, aby se navázaly na plastovou hmotu destičky. Destičky pak byly opláchnuty 2 x PBS a nespecifická vazebná místa byla saturována inkubací s 5% (hmotn./objem) bovinním sérovým albuminem v PBS. Purifikovaný rekombinantní protein (způsobem popsaným v části 5.1) PS2NT, naředěný v pufru (25mM Tris/HCl pH 7,5, 0,5% Triton X-100, 0,5% NP4%) byl přidán

- 17CZ 303226 B6 a destička se inkubovala 4 hodiny při teplotě místnosti. Po opláchnutí dvakrát v PBS-O.5% Tween, protein PS2NT, který zůstal zachycen na destičce (díky interakci s peptidem Αβ), byl detekován inkubací s vazebným proteinem pro S-tag konjugovaným s alkalickou fosfatázou. Signál byl detekován spektrofotometricky při 450 nm.

5.4. Test interakce PS2NT/Api-42 ve formátu HTRF (homogenní časově rozlišená fluorescence)

Purifikovaný protein PS2NT (připravený způsobem popsaným v části 5.1) byl označen pomocí io fluoroforů kryptátu europia (PS2NT-K). Peptidy Αβι^₀ a Αβ_τ byly syntetizovány s biotinem a oddělovacím ramenem 3 β-alaninů (nebo 3 lysinu) na jejich N-konci (od pozice 1 proti směru transkripce Αβ peptidů) a dvěma argininy (R) na C-konci pro usnadnění syntézy biotínyl ováných peptidů biot-3K-Ap40RR a biot-3K-Ap42RR.

Reakce interakce PS2NT-K s biot-A340RR nebo biot-Aβ42RR se prováděla v lOmM HEPES pufru, pH 7,2, obsahujícím 150mM NaCl, 3,4mM EDTA a 3mM CHAPS (detergent). Značený protein PS2NT (výsledná koncentrace 6nm, tj. 40 μΙ počátečního 15nM roztoku) byl inkubován s peptidem biot-Ap40RR nebo biob^42RR (výsledná koncentrace 2μΜ, tj. 40 μΐ počátečního 5μΜ roztoku a 20 μΙ pufru) 10 minut, pak následovalo přidání streptavidinu značeného XL665 (XL665 je zesíťovaný allofykocyanin, CisBio International) v koncentraci 8 μg/ml (tj. 100 μΙ počátečního roztoku 16 μg/ml) ve lOOmM HEPES pufru pH 7,0 obsahujícím 400mM KF, !33mM EDTA a 1 g/1 BSA. Reakce byla inkubována buďto 4 hodiny pri teplotě místnosti nebo 24 hodin pri 4 °C a destičky pak byly odečteny na čtecím zařízení Packard Discovery Counter, kde se měřila emise kryptátu europia v 620 nm po excitaci v 337 nm na jedné straně a emise

XL665 v 665 nm po přenosu fluorescence v 620 nm z kryptátu europia na XL665 na straně druhé. Vytvoření komplexu XL665-streptavidin/biot-A342/PS2NT-kryptát vedlo k přenosu fluorescence z kryptátu na XL665, která byla na uvedeném zařízení měřena pri 665 nm. Pokud komplex XL665-streptavidin/biot-Ap42/PS2NT-kryptát chyběl, kryptát europia fluoreskoval v 620 nm.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Interakce mezi APP a PS2 a mapování zóny interakce na PS2

Cílem tohoto příkladu bylo určit zónu interakce PS2 a detekovat interakci mezi uvedeným úsekem a APP.

Interakce mezi APP a proteinem PS2 v savčí buňce je pro příklad uvedena na obr. 2, Lyzát z buněk COS transfekovaných PS2 a APP byl imunoprecipitován s protilátkou namířenou proti N-koncovému úseku PS 2 (95041, Blanchard et al,, 1997). Imunoprecipitát byl pak analyzován imunopřenosem s protilátkou anti-APP. APP byl jasně detekován v imunoprecipitátu buněk kotransfekovaných APP a PS2, ale nikoliv v nepřítomnosti PS2 (obr, 2, dráha 6 ve srovnání s dráhou 7) jak bylo již dříve popsáno (Weidemann et al., 1997). Aby bylo možné zmapovat zónu interakce mezi těmito dvěma proteiny, bylo zkonstruováno několik zkrácených forem PS2. Pro zachování membránové topologie PS2, která je obecně určována N-koncovým úsekem membránových proteinů byl progresivně zkracován C-konec PS2 tak, že zkrácený produkt končil za různými transmembránovými doménami, a sice za TM6 (PS2AC1), TM4 (PS2AC2), TM3 (PS2AC3) a TM2 (PS2AC4) (viz schéma na obr. 1A). Hydrofilní úsek N-konce (87 aminokyselinových zbytků) PS2 byl také zkonstruován v cytoplazmatické formě (nativní sekvence) nebo v secemované formě, kdy byl vložen navíc signální peptid pro řetězec IgkB. Exprese těchto

- 18CZ 303226 B6 různých forem je znázorněna na obr. IB, kdy byla detekována protilátkou anti-PS2 (95041). Konstrukty obsahující hydrofobní domény dodatečně představují pásy odpovídající monomemím formám s očekávanou molekulovou hmotností (v tomto případě vytvářejí uzavřené dublety), dimerické formy a agregáty s vysokou molekulovou hmotností typickou pro PS2 (obr. 1B, dráhy

3 až 5), Zejména pro celý PS2 pouze tyto agregáty jsou detekovatelné, zatímco monomemí formy jsou nedetekovatelné (dráha 6). Dva konstrukty hydrofilního N~konce PS2, a sice mycPS2NT a SecPS2NT, poskytly dva pásy s očekávanou molekulovou hmotností (obr. IB, dráhy 1 a 2). Konstrukt SecPS2NT byl také secemován do extracelulámí ho média (obr. 3B, dráha 2), zatímco konstrukt mycPS2NT sám je cytoplazmatický.

Tyto konstrukty byly kontransfekovány jednotlivě s APP. Detergentem rozpustná frakce buněčných lyzátů byla imunoprecipitována s protilátkou namířenou proti N-koncovému úseku PS2 a tyto imunoprecipitáty byly dále analyzovány imunopřenosem. Stejně jako u celého PS2, APP byl detekovatelný v imunoprecipitátech se všemi zkrácenými formami PS2, PS2AC2 až

PSAC4 (obr. 2, dráhy 3 až 5), což ukazuje, že na interakci mezi APP a těmito formami se podílí N-konec PS2. Tato interakce mezi APP je zachována u konstruktu N-konce PS2 v secemované formě (obr. 2, dráha 2), což ukazuje, že ukotvení PS2NT v lipidové membráně není nezbytné pro tuto interakci. Naproti tomu cytoplazmatická forma mycPS2NT nejeví interakci s APP (obr. 2, dráha l).

Obrácený experiment s imunoprecipitací s protilátkou anti-APP a detekcí pomocí protilátky proti N-konci PS2 umožnil potvrdit interakci mezi APP a SecPS2NT v odlišných experimentálních podmínkách.

V kultivačním médiu pro buňky kotransfekované s APP a SecPS2NT, interakce těchto dvou proteinů byla také demonstrována koimunoprecipitací (obr. 3A, dráha 4 a obr, 3B, dráha 3). Forma mycPS2NT nevstupuje do interakce s APP v médiu (obr. 3B, dráha 2), Přítomnost této interakce v médiu ukazuje, že komplex APP/PS2NT je relativně stabilní v průběhu procesu sekrece.

Příklad 2

Interakce mezí APP a PS2 a mapování zóny interakce na APP

Cílem tohoto příkladu bylo ukázat zónu interakce na APP a detekovat interakci mezi touto zónou a presenilinem 2.

Pro tento účel byly užity zkrácené formy APP, aby se omezily úseky interakce na APP.

Konstrukt obsahující posledních 100 aminokyselinových zbytků APP buďto pod kontrolou signálního peptidu nebo bez (SPA4CT a Cl00, Dyrks et al., 1993) a konstrukt obsahující pouze cytoplazmatickou doménu (posledních 45 zbytků APP) byly použity a jejich přítomnost byla detekována protilátkou namířenou proti cytoplazmatické doméně APP (aCT43, Stephens aAusten, 1996). V buňkách kotransfekovaných PS2 je možné detekovat interakcí SPA4CT, ale nikoliv cytoplazmatické domény APP, s PS2 (obr. 4A, dráha 4 a 5). Interakce PS2 s konstruktem Cl00 (bez signálu pro sekreci) byla také demonstrována (obr. 4B, dráha 7). Dokonce kombinací cytoplazmatické domény APP s membránou v chimérickém konstruktu s alfa-receptorem IL2, není pozorována žádná interakce. Tento příklad ukazuje, že dochází k interakci s SPA4CT (zbytky 597 až 695 APP), ale nikoliv s cytoplazmatickou doménou (zbytky 651 až 695), což ukazuje na to, že v APP jsou úsek Αβ (zbytky 597 až 637) a zbytek transmembránového segmentu (po zbytek 650) dostatečné k interakci s PS2.

-19CZ 303226 B6

Příklad 3

Interakce PSI s APP a počáteční mapování

Cílem tohoto příkladu bylo stanovit zónu interakce na PSI a potvrdit interakci mezi touto zónou a APP.

Analogicky k pokusům s PS2 (viz příklady 1 a 2) byla studie interakce PSI s APP provedena se stejnými buňkami COSI. Po koimunoprecipitaci s protilátkou namířenou proti úseku posledních io 20 aminokyselin PSI (Duff et al,, 1996), SPA4CT, C-koncový fragment APP byl detekován a precipitován (obr. 5A, dráha 4). APP také interaguje sPSI. Podobně zkrácená forma PSI,

PSIAC2 (I až 213), interaguje s APP (obr. 5B, dráha 4). Tato první data umožnila predikovat, že úseky interakce mezi APP a PSI by měly být v těsné blízkosti obdobných úseků ukázaných v předchozích příkladech s PS2.

Aby byla ověřena obecná platnost interakce PS1/APP, byly užity různé buněčné systémy, kde byly hmyzí buňky infikovány rekombinantní bakuloviry, které exprimovaly PSI buďto se značkou His6 nebo bez ní a APP (viz část Materiály a metody). Studie s buněčnými lyzáty umožnila detekci APP v imunoprecipitátech s anti-His6 (PSl-His6, obr. 6A, dráha 4) nebo anti20 PSI (PSI s nebo bez His6, obr. 6B, dráhy 4 a 5), když byly buňky koinfíkovány dvěma typy rekombinantního viru, ale nikoliv, když byl exprimován pouze jeden z proteinů (odpovídají dráhy 1, 2 a 3). A zase naopak, v anti-APP imunoprecipitátech jsou PSl-His6 a PSI proteiny detekovatelné (obr. 6C, dráhy 4 a 5) při dvojité infekci. Tyto pokusy umožnily potvrdit interakci v opačném smyslu s různými protilátkami.

Příklad 4

Interakce Αβ a PS2 v buňkách

Za předpokladu, že úsek interakce mezi APP a PS2 zahrnuje v APP amyloidový peptid (od pozice 595 do 635) a na PS2 hydrofiíní N-koncovou doménu, tento příklad ukazuje, že PS2 interaguje přímo s amytoidním peptidem (Αβ) tvořeným buňkami. Exprese SPA4CT (odpovídá posledním 100 aminokyselinovým zbytkům APP se signálním peptidem) v buňkách COS vede k silné produkci amyloidového peptidu, částečně proto, že SPA4CT je považován za biologický prekurzor Αβ. Buňky COS byly transfekovány samotným SPA4CT, SPA4CT a SecPS2NT nebo samotným SecPS2NT. Odpovídající extracelulámí média byla imunoprecipilována s protilátkou antiPS2 a peptid Αβ byl detekován pomocí specifické protilátky W02 (Nida et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, 22908-914) (obr. 7). Peptid Αβ byl identifikován pouze v buňkách kotrans40 fekovaných SecPS2NT a SPA4CT jako pás s nízkou intenzitou (obr. 7, dráha 1), ale nikoliv u jednotlivých kontrol (dráhy 2 a 3). Navíc další pás přibližné velikosti 40 kDa byl detekován specificky pro dvojitě transfekované buňky. Po opláchnutí filtru se detekcí pomocí PS2 protilátky jevilo, že pás shodné velikosti je imunoreaktivní také s PS2 (obr. 7, dráha 4). Tento pás byl také přítomen u buněk transfekovaných SecPS2NT, jak se očekávalo. Takže u dvojitě trans45 fekovaných buněk tento pás představoval SDS-stabilní komplex mezi SecPS2NT a Αβ, který může potvrdit interakci mezi těmito dvěma molekulami. Malý rozdíl v molekulové hmotnosti díky peptidu Αβ (4 kDa) by vysvětlil, proč není detekovatelný rozdíl ve velikosti u buněk transfekovaných samotným SecPSNt. Výsledky těchto pokusů umožnily učinit závěr, že secemovaná forma PS2 (SecPS2Nt) interaguje in vitro s peptidem Αβ (zbytky 597 až 637 v AP695).

Příklad 5

Rekonstituce interakce Αβ a PS2Nt v testu in vitro na nitrocelulóžové membráně

-20CZ 303226 B6

Cílem tohoto příkladu bylo ukázat rekonstituci interakce PS2Nt-APP(Ap) v podmínkách in vitro.

K potvrzení interakce mezi peptidem Αβ a PS2Nt (N-koncový úsek PS2) byl vyvinut in vitro vazebný test. Fúzní protein PS2Nt nesoucí značkovací/markerový peptid S (S-tag) na svém N-konci byl zkonstruován a exprimován v bakteriích. Peptidy Αβ, ₄₀ a Αβ,₄₂ byly navázány na nítrocelulózovou membránu, která byla inkubována v přítomnosti bakteriálních extraktů exprimujících proteinů PS2Nt. Markér S-tag byl detekován kolorimetrickou reakcí pomocí S-tag vazebného proteinu konjugovaného s alkalickou fosfatázou. Protein S-tag-PS2Nt se skutečně io v tomto in vitro testu vázal na peptidy Αβ (obr. 8A). Jako kontroly byly inkubovány duplikáty v přítomnosti bakteriálního extraktu exprimujícího pouze peptid S, což bylo užito jako kontrola hladiny nespecifické vazby na Αβ peptid (formy 1—40 a 1—42). Sériové ředění bakteriálního extraktu umožnilo zjistit, že tato vazba je závislá na dávce aje saturovatelná. V tomto pokusu byla vazba silnější v případě Αβ, 42 než v případě Αβ_Μ0, i když s určitou mírou variability. Např.

vazba na PS2Nt je závislá na dávce Αβ nanesené na membránu, zatímco Αβι₄o a Αβ, .₄₂ vykazují stejné vazebné hodnoty.

Tento příklad poskytl tedy ukázku rekonstituce interakce PS2Nt-APP(Ap) v testu in vitro mezi syntetickým Αβ a PS2NT bakteriálního původu. Za předpokladu, že patologické mutace v PS2 vedou ke zvýšení poměru Αβι. ₄₂/Αβι^₀ v mnoha systémech a navíc je zde fyzická interakce mezi PS2 a APP, zdá se, že tato fyzická interakce se může účastnit produkce peptidů Αβ, ₄₂. Tudíž inhibíce této interakce představuje mimořádný nový terapeutický přístup pri léčení Alzheimerovy nemoci.

Příklad 6

Test interakce Αβ42/Ρ82ΝΤ ve formátu 96 jamek (ELISA formát, viz obr. 11)

Příklad 5 poskytuje výsledky demonstrující přímou interakci mezi peptidem Αβ a proteinem PS2NT na nitrocelu lóžové membráně. Cílem tohoto příkladu bylo potvrdit výsledky z příkladu 5 a popsat detekci interakce ve formátu testu na 96jamkové destičce. Peptid Αβ (Αβ,_₄<) nebo Αβ|₄₂) byl navázán inkubací na 96jamkové plastové destičky. Destičky pak byly inkubovány s rekombinantním proteinem PS2NT. Po opláchnutí byla detekce interakce (Αβ/Ρ52ΝΤ) prove35 děna navázáním S-tag vazebného proteinu na jamky a kolorimetrickým vyhodnocením. PS2NT se váže způsobem závislým na dávce na peptid Αβι_4₂ (obr. 11) ale nikoliv na peptid Αβ,^ο nebo na peptid s invertovanou sekvencí Αβ₄ο-ι, ani na jiný peptid generující amyloid, a sice amylin. Množství peptidů Αβ,₄₂ a Αβ,.₄η navázané na destičky bylo identické, jak bylo potvrzeno imunodetekcí. Vazebná konstanta pro PS2NT na Αβ42 je 0,18μΜ. Specifícita PS2NT pro formu peptidů Αβ42 vzhledem k Αβ40 byla pouze naznačena v příkladu 5. Tento příklad specificitu určil a potvrdil, zeje plně reprodukovatelná v popsaném testu.

Tento formát testu interakce Ap42PS2NT umožňuje bezprostředně navrhnout test pro screening molekul, které inhibují uvedenou interakci.

Příklad 7

Test interakce Αβ42/Ρ82ΝΤ interakce ve formátu HTRF

V příkladech 5 a 6 byla demonstrována přímá interakce mezi peptidem Αβ42 a proteinem PS2NT nejdříve na nitrocelulózové membráně a podruhé na 96jamkové destičce (typu ELISA).

-21 CZ 303226 B6

Cílem tohoto příkladu je potvrdit tyto údaje a popsat detekci uvedené interakce v kapalné/homogenní fázi pomocí techniky založené na přenosu fluorescence.

Princip testu popsaného v části Materiály a metody (5.4) je založen na přenosu fluorescence.

Rekombinantní protein PS2NT označený kryptátem europia (PS2NT-K) interaguje s peptidem biot-Ap42, jak je ukázáno na obr. 12 (sloupec č. 3). Tento signál se snížil a tak interakce PS2NT-K/biot-Ap42 byla nahrazena nadbytkem neznačeného PS2NT (IC™ = 400nM). Detekovaný fluorescenční signál byl Časově stálý: od 4 hodin pri teplotě místnosti do 24 hodin ve 4 °C (v závislosti na vybraných podmínkách, viz Materiály a metody).

io

Tato interakce je závislá na dávce pro peptid biot-Ap42 (zóna linearity signálu je od 0 do 2,5μΜ) a pro PS2NT-K (zóna linearity signálu je od 0 do 7,5nM). Jak je ukázáno na obr. 12 (sloupec 5) nedochází k žádné interakci mezi PS2NT-K a biot-Ap40 peptidem nesoucím další specifický prvek. Specificita PS2NT pro formu Αβ42 ve srovnání s Αβ40, která byla pouze naznačena v příkladu 5, byla v příkladu 6 a v tomto příkladu potvrzena.

Test interakce PS2NT a Αβ42 ve formátu HTRF (odrážející interakci APP/PS v buňce) umožňuje identifikovat molekuly chemických látek, které projevují tuto interakci, metodou screeningu s velkou kapacitou zpracovaných vzorků.

Příklad 8

Rekonstituce interakce APP/PS 1 in vitro

Cílem toholo příkladu bylo ukázat, že interakce mezi celým APP a proteinem PSI může být znovu vytvořena užitím různých buněčných lyzátů smíchaných dohromady pouze kvůli detekci interakce.

Jelikož bakulovirový expresní systém dovoluje expresi velkého množství rekombinantních proteinů, lyzáty buněk jednotlivě infikovaných každým ze třech virů byly užity jako zdroj proteinů APP, PSI a PSl-His6. Solubilizované frakce obsahující APP, PSI nebo PSl-Hisó byly smíchány dohromady a imunoprecipitovány v přítomnosti protilátek ani-histidin nebo anti-PSl přes noc ve 45 °C. APP byl jasně detekován v imunoprecipitátech (obr. 9A, dráha 3 a obr. 9B, dráha 3), což ukazuje, že interakce APP s PSI-His nebo PSI byla rekonstituována in vitro společnou inkubací těchto dvou proteinů. Samotný APP byl slabě precipitován protilátkou anti-PSl (obr. 9B, dráha 1), ale vůbec neprecipitoval s protilátkou anti-histidin, což potvrdilo specificitu interakce ve druhém případě. Tyto výsledky umožnily vyvinout test in vitro interakce dvou celých proteinů APP a PSI.

Příklad 9

SecPS2NT blokuje interakci APP a PSI v transfekovaných buňkách

Bylo ukázáno v předchozích příkladech, že APP interaguje sPSl obdobným způsobem jako s PS2 a že v případě PS2 konstrukt SecPS2NT je postačující k interakci s APP. Cílem tohoto příkladu je vyhodnotit, zda vazba secPS2Nt na APP blokuje interakci sPSl křížovým (heterologním) způsobem. V systému buněk COSI, SPA4CT (odpovídající posledním 100 aminokyselino nám APP s vpředu umístěným signálním peptidem) může být detekován v imunoprecipitátech s anti-PSl z buněk exprimujících SPA4CT a PSI divokého typu (wt) nebo mutovaný PSI, a sice

PSI* (obr. 10A, dráha 1 a 2), Kromě toho, když je SecPS2N také kotransfekován, signál SPA4CT v podstatě zmizí v imunoprecipitátech s anti-PSl (obr. 10A, dráhy 3 a 4). Po imunoprecipitaci s anti-PS 1 se supematanty (frakce nenavázané na sefarózu s proteinem A) podrobí

-22CZ 303226 B6 druhé imunoprecipitaci s protilátkou anti-PS2, SPA4CT byl jasně detekován v buňkách kotransťekovaných PS 1 a SecPS2NT (obr. 1 OB, dráha 3 a 4), což ukazuje, že v těchto buňkách, když se naváže, SecPS2Nt nahradí vazbu SPA4CT kPSl. Tento pokus umožnil dojít k závěru, že SecPS2Nt je molekula schopná nejen vázat se na APP, ale také nahradit vazbu APP na PSI a dost pravděpodobně i PS2. Tudíž SecPS2Nt může být užit v buňkách jako „vějička“’ k blokování interakce APP se dvěma preseniliny, PSI a PS2. Specificky výsledky mapování interakce PSI/APP potvrdily, že zúčastněné zóny interakce jsou podobné zónám v PS2.

io Příklad 10

Blokování interakce APP/PSl vede k inhibici tvorby intracelulámího Αβ42 amyloidového peptidu

Předcházející příklady ukázaly, že exprese SecPS2NT může blokovat interakci mezi APP a PSI nebo mutovaným PSI. Předkládaný příklad analyzuje důsledky této inhibice z hlediska tvorby amyloidového peptidu, zejména jeho dvou forem Αβ)._4Ο a Αβι^₂· Konkrétně k tomuto bylo již dříve popsáno v odborné literatuře, že patologické mutace presenilinů (PSI nebo PS2) vedly ke zvýšení poměru dlouhé formy Αβ peptidu, tj. formy Ap_{t 4}2, k formě Αβι^₀, tj. poměru

Αβ42/Αβ40 (Borchelt et al„ 1996 a přehled Hardy, 1997).

SPA4CT byl koexprimován s PSI divokého typu (obr. 13A, dráha 1 a 3) nebo s mutovaným PSI (obr. 13A, dráha 2 a 4) buďto bez (dráhy 1 a 2) nebo s SecPS2NT (dráhy 3 a 4). Buněčné lyzáty a kondiciovaná buněčná média byly analyzovány na produkci amyloidového peptidu. Formy

Αβ40 a Αβ42 byly analyzovány imunoprecipitaci s protilátkami, které specificky rozpoznávají C-koncový úsek Αβ450 (FCA3340) nebo Αβ42 (FCA3542, Barel li et al„ 1997) a imunoprecipitáty byly dále analyzovány imunopřenosem s protilátkou, která rozpoznává obě formy.

V buněčných lyzátech exprese mutovaného PSI skutečně vedla ke zvýšení tvorby Αβ42 (1,5 až 2x) a jeho multimemích forem ve srovnání s PS 1 divokého typu a k malé variaci v hladinách

Αβ40 (srovnej obr. 13A, dráhy 1 a 2, panely buněčných lyzátů Αβ42 a Αβ40), jak se očekávalo.

V přítomnosti SecPS2NT hladiny Αβ42 (a multimerů) byly podstatně sníženy (obr. 13A, dráhy 3 a 4) jak s PSI divokého typu tak s mutovaným PSI. V extracelulámím médiu hladiny Αβ42 byly také sníženy, ale v menší míre. Nebyly žádné rozdíly v hladině amyloidového peptidu Αβ40 pro různé podmínky, což ukazuje, že účinek na Αβ42 je specifický a není způsoben celkovou změnou hladiny exprese. To bylo také potvrzeno analýzou exprese různých transfekovaných genu: SPA4CT, SecPS2NT a PSI (obr. 13B). V tomto příkladu bylo tedy ukázáno, že interakce PSI/APP geneticky dominantním SecPS2NT vede ke snížení hladiny produkovaného intracelulámího Αβ42 jak s mutovaným PSI tak s PSI divokého typu. Vzhledem k primární úloze připisované Αβ42 ve vývoji Alzheimerovy nemoci, tento příklad poskytuje ukázku toho, že inhibice interakce APP/PS představuje terapeuticky důležitý cíl jak pro genetické tak i sporadické formy této nemoci.

Příklad 11

Detekce interakce PS2 s endogenním APP v buňkách COS pomocí farmako logického ošetření

Cílem tohoto příkladu je demonstrovat, že výsledky získané v předchozích příkladech (tyto výsledky v buňkách odpovídaly nadměrné expresi obou partnerů interakce: APP a PS, PSI nebo

PS2) jsou platné také pro endogenní proteiny exprimované v normální (nikoliv nadměrné) hladině. Konkrétně velmi silná nadměrná exprese obou proteinů by mohla vést k artefaktům. Detekce interakce v podmínkách, kdy nedochází k současné nadměrné expresi obou partnerů byla tedy zkoumána v tomto příkladu.

- 23 CZ 303226 B6

Buňky COS exprimují endogenně APP, i když v nízké hladině. Buňky COS byly transfekovány samotným PS2. Buněčné lyzáty byly analyzovány imunoprecipitací s protilátkou namířenou proti N-koncovému peptidu PS2 a pak detekovány imunopřenosem s protilátkou anti-APP, WO2. Homí panel na obr. 14 ukazuje, že transfekce samotným PS2 neumožnila detekovat žádnou interakci s endogenním APP koimunoprecipitací (obr. 14, dráha 1).

Navíc jelikož interakce APP/PS vede k tvorbě Αβ42 amyloidového peptidu (viz předchozí příklad) a tak ke ketabolizmu APP v endoplazmatickém retikulu, může se také podílet proteosom, který je proteolytickým degradačním systémem v tomto buněčném kompartmentu. Účinek laktaio cystinu, selektivního inhibitoru proteosomů, byl analyzován. Po inkubaci buněk transfekovaných

PS2 v přítomnosti laktacystinu, endogenní APP v COS buňkách byl jasně detekován v imunoprecipitátech s PS2 (obr. 14, dráha 5, pád ve 110 kDa). Tato interakce s endogenním APP má stejné vlastnosti jako dříve popsaná, neboť může být nahrazena geneticky dominantním SecPS2NT (obr. 14, dráhy 6 a 7) s účinkem závislým na dávce. Konkrétně dráha 7 ukazuje že při střední dávce SecPS2NT je pás s nízkou intenzitou odpovídající endogennímu APP vždy viditelný. Při vyšší dávce SecPS2NT (dráha 6) pás odpovídající endogennímu APP je velmi slabý a vykazuje závislost na dávce. Slabý reziduální signál je vždy přítomen (pás velikosti asi 110 kDa) a je způsoben komplexem mezi APP a SecPS2NT, který je rychle secemován (jelikož SecPS2NT již nemá membránovou kotvicí doménu) a tudíž se neakumuíuje intracelulámě.

Obr. 14 (střední a spodní panely) ukazuje, že ošetření laktacystinem neovlivnilo celkovou hladinu ani buněčného ani secemovaného APP. Pásy odpovídající hladinám exprese APP měly skutečně konstantní intenzitu. Specificita účinku laktacystinu tak byla demonstrována na subpopulaci APP integrujícího s PS2.

Na základě těchto výsledků je možné ukázat, že interakce APP/PS2 může být detekována s endogenním APP v buňkách COS, když jsou inhibovány proteosomy. Kromě toho tyto výsledky ukázaly, že interakce APP/PS2 může být detekována i v artificiálních podmínkách. Avšak tato interakce je velmi labilní. Aby byla získána výraznější detekce, byl použit buďto inhibitor proteo30 lytické degradace (v tomto příkladu) nebo nadměrná exprese obou partnerů interakce (v předchozích příkladech). Tento příklad tedy ukázal, že výsledky získané v předchozích příkladech s nadměrnou buněčnou expresí partnerů interakce (APP a PSI nebo PS2) platí i v případě endogenních proteinů s normální hladinou exprese.

Příklad 12

PS2 interaguje s druhým segmentem APP odlišným od Αβ

Cílem tohoto příkladu bylo ukázat, že další segment APP interaguje s PS2.

V předchozích příkladech bylo ukázáno, že SecPS2NT interaguje v extracelulámím médiu se secemovanou formou APP (obr. 3 A, dráha 4). Secemovaná forma APP je uvolňována po štěpení buďto v β-místě (pozice 595), odpovídajícím počátku Αβ peptidu, nebo α-místně (pozice 612) uvnitř peptidu. Tyto výsledky vedou k návrhu, že PS2NT také interaguje s N-koncovým úsekem APP jiným než je Αβ Zkrácené formy APP byly zkonstruovány vložením stop-kodonu do βmísta (β-sAPP) a do a-místa (α-sAPP) a byly testovány. Celý PS2 a SecPS2NT účinně interagovaly s α-sAPP (obr. 15, dráhy 3 a 5) a β-sAPP (obr. 15, dráhy 4 a 6). Tyto výsledky vedly k závěru, že segment APP mezi pozicí 1 a 595 (a tudíž odlišný od Αβ) je také schopen interakce s PS2 a PS2NT. Tyto výsledky také umožnily potvrdit, že k interakci PS2NT/APP dochází také i když chybí ukotvení obou partnerů v membráně a ve vnitřním (nebo extracelulámím) kompartmentu buňky.

-24 CZ 303226 B6

Seznam citované literatury

- Doan et al. (1996) Protein topology of presenilin 1. Neuron 17: 1023-1030.

- Thinakaran et al., (1996) Endoproteolysis of Presenilin 1 and accumulation of processed derivatives in vivo. Neuron 17: 181-190

- Podlisny et al., (1997) Presenilin proteins undergo heterogeneous endoproteolysis between Thr291 and Ala299 and occur as stable N- and C-terminal fragments in normál and Alzheimer brain tissue. Neurobiology ofDisease 3: 325-337

- Pradier, L., Czech, C Mercken, L., Revah, F. and Imperato, A. (1996) Biochemical characterization of presenilins (S182 and STM2) proteins. Neurobiol. Aging 17: S137

- Scheuner et al., (1996) Secreted amyloid b-protein similar to that in the senile plaques of Alzhemeris dsease is increased in vivo by the presenilin 1 and 2 and APP mutations linked to familial Alzheimer's disease. Nátuře Med. 2: 864—870

Dyrks, T„ Dyrks, E., Monning, U., Urmoneit, B., Turner, J. and Beyreuther, K. (1993) Generation of bA4 from the amyloid protein precursor and fragment thereof. FEBS Letí. 335: 89-93

Weidemann, A., Paliga, K., Důrrwang, U., Czech, C., Evin, G., Masters C., & Beyreuther,

K. (1997). Formation of stable complexes between two Alzheimers disease gene products: Presenilin-2 and b-Amyloid precursor protein. Nátuře Medicine 3: 328-332

- Blanchard, V., Czech, C., Bonici, B., Clavel, N., Gohin, M., Dalet, K., Revah, F., Pradier, L., Imperato, A. and S. Moussaoui. (1997) Immunohistochemical analysis of presenilin 2 expression in the mouše brain: distribution pattem and co-local ization with presenilin l protein. Brain Res. 758: 209-217

Borcheilt, D. R., Thinakaran, G., Eckman, C., Lee, Μ. K., Davenport, F., Ratovitsky, T., Prada, C.-M., Kim, G., Seekins, S., Yager, D., Slunt, Η. H., Wang R., Seeger, M., Lavey, A. I., Gandy, S. E., Copeland, N. G., Jenkins, N., Price, D. L., Younkin, S. G. and S. Sisodia (1996) Familial AIzheimer's disease-linked presenilin 1 variants elevate Abl-42/1-40 ratio in vitro and in vivo. Neuron 17: 1005-1013

Duff, K., Eckman, C., Zehr, C., Yu, X., Prada, C.-M., Perez-tur, J., Hutton, M., Buee, L., Harigaya, Y., Yager, D., Morgan, D., Gordon, Μ. N., Holcomb, L., Refolo, L., Zenk, B., Hardy, J. and S. Younkin (1996) Increased amyloid-b42(43) in brains of mice expressing mutant presenilin 1. Nátuře 383: 710-713.

- Hardy, J. (1997) Amyloid, the presenilins and Alzheimer's disease. Trend in Neurosci, 20: 154-159.

Stephens, D. J. and Β. M. Austen (1996) Metabolites of the b-amyloid precursor protein generated by b-secretase localise to the Trans-Golgi Network and latě endosome in 293 cells. J. Neurosci. Res. 46: 211-225.

Essalmani, R., Guiltaume, J.-M., Mercken, L., and Octave, J.-N. (1996) BaculovirusInfected Cells Do not Produce the Amyloid Peptide of Alzheimer s Disease from its Precursor. FEBS Letí. 389: 157-161

- Barelli et al., (1997), Characterization of new polyclonal antibodies specific for 40 and 42 amino acid-long amyloid β peptides: their use to examine the cell biology of presenilins and the ímmunohistochemistry of sporadic Alzheimer's disease and cerebral amyloid angiopathy cases. Molecular Medecine 3: 695-707.

SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 261 párů bází

-25CZ 303226 B6 (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne io (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..261 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

ATG Het 1

CTC ACA Leu Thr

TTC Phe

ATG Het 5

GCC TCT

GAC AGC GAG

GAA GAA GTG TGT

GAT A-SO 15

GAG GlU

48

Ala

Ser

Asp

Ser

Glu 10

Glu

Glu Val

CV3

CGG

ACG TCC

CTA

ATG

TCG

GCC

GAG

AGC

ccc

ACG

CCG CGC

TCC

TGC

CAG

96

Acg

The ser

Leu 20

Met

Ser

Ala

Glu

Ser 25

Pro

The

ťra Arg

Ser 30

=y>

Gin

GAC

GCC ACC

CAG

CGC

CCA

GAG

GAT

GGA

GAG

AAT

ACT GCC

CAC

TGG

AGA

144

Glu

Gly Arg 25

Gin

Giy

Pro

Giu

Asp 43

Gly

Glu

Asn

Thr Ala 45

Gin

Trp

Arg

AGC

CAC CAC

AAC

GAG

GAG

GAC

GGT

GAG

GAG

GAC

CCT GAC

CGC

TAT

GTC

192

Sec

Gin Glu 50

Asn

Glu

Glu

Asp 55

Gly

Glu

Glu

Asp

Pro Asp 60

Arg

Tyr

Val

TCT AGT CGG i

CTT

ccc

GGG i

CGG .

CCG

CCA

GGC

CTG

GAG GAA

GAG

CTG

ACC

240

Cys Sei Gly Val 65

Pro

Cly Arg Pro 70

Pro Gly

Leu 75

Glu GlU

Glu

Leu

Thr eo

CTC AAA TAC GGA GCG AAG CAT Leu Lys Tyc Gly Ala Lys His (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 243 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..243

-26CZ 303226 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

AT G ACA GAG

TTA Leu

CCT ?rn

GCA Aia

CCG ?:o

TTG Leu

TCC Ser

TAC TTC

CAG Gin

AAT Asr.

GCA CAG

ATG Hec

4 3

1

Thr

Glu

Tyr 10

Phe

Ala

Gin 15

TCT

GAG

GAC

AAC

CAC

CTG

j-iGC

AAT

ACT

GTA

CGT

AGC

CAG

AAT

GAC

AAT

36

Ser

Glu

Asp

Asn 20

His

Leu

ser

Asn

*25

Val

Arg

Ser

51 n

Asn 30

Asp

Asn

AGA

GAA

CGG

CAG

GAG

CAC

AAC

GAC

AGA

AGC

CTT

GGC

CAC

CCT

GAG

144

A- 3

Glu

Arg 35

Gin

Glu

His

AS Λ

Asp 40

Arg

Arg

Ser

Leu

Slv ó

His

Pru

Glu

CCA

TTA

TCT

AAT

GCA

CGA

CCC

CAG

GGT

AAC

TCC

CGG

CAG

GTC

GTG

GAG

1?2

?:o

Leu 50

Asn

Gly

Arg

?ro 55

Gin

Gly

Asn

Ser

Arg 60

Gin

Val

Val

Glu

CAA

GAT

GAG

GAA

GAA

GAT

GAG

GAG

CTG

ACA

TTG

AAA

TAT

GGC

GCC

AAG

240

Gin $5

Asp

GlU

Glu

Glu

As o ?‘o

Glu

Glu

Leu

Thr

Leu 75

Lys

Tyr

Gly

Ala

Lys SO

CAT

Hta (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

243 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2088 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité io (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..2088 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

-27CZ 303226 B6

atg Met 1

CTG CCC GGT

TTG Leu 5

GCA CTG

CTC Leu

CTG Leu

C i G Leu 10

GCC Ala

GCC Ala

TGG Trp

ACG Thr

GCT Ala 15

CGG Arg

48

Leu

Pro

Gly

Aia

Leu

GCG

CTG

GAG

GTA

CCC

ACT

GAT

GCT

AAT

CCT

CCC

CTC

CTC

CC?

GAA

CCC

96

Ale

Leu

Glu

Val 20

Pro

Thr

Asp

Gly

Asn 25

Ala

Gly

Leu

Leu

Λ1 a 30

Glu

pro

CAG

ATT

GCC

ATG

TTC

TGT

GsjC

ACA

CTG

AAC

ATG

CAC

ATG

AAT

GTC

CAG

144

Gin

Ile

Ala 35

Met

Phe

Cys

Gly

Arg 40

Leu

Asn

Ha:

ni s

Met 45

Asn

Val

Gin

AAT

GGG

AAG

TGG

GAT

TCA

CCA

TCA

GGu

ACC

AAA

ACC

TGC

ATT

GAT

192

Asn

Cly 50

Lys

Trp

Asp

Ser

Asp 55

Pro

Ser

Gly

Thr

Lys 60

Thr

Cys

Ile

Asp

ACC

Aag

GAA

GGC

ATC

CTG

CAG

TAT

TGC

CAA

GAA

GTC

TAC

CCT

GAA

CTG

240

Thr £5

Lys

GlU

Gly

Ile

Leu 70

Gin

Tyr

Cys

Gin

Glu 7S

Val

Tyr

Pro

Glu

Leu 8 0

CAG

ATC

ACC

AAT

GTC

GTA

GAA

GCC

AAC

CAA

CCA

GTG

ACT

ATC

CAG

AAC

233

Gin

t; ·

Thr

Asn

Val as

Val

Glu

Ala

Asn

Gin 90

Pro

Val

Thr

Ile

Gin 95

Asn

TGG

TCC

AAG

CCG

GGC

CGC

AAG

CAG

TGC

AAG

ACC

CAT

CTC

CAC

TTT

GTG

33S

Trp

Cys

Lys

Arg 100

Gly

Arg

Lys

Gin

Cys 105

Lys

Thr

His

Pro

His 110

Phe

Val

ATT

CCC

TAC

ccc

TGC

TTA

3TT

GGT

GAG

TTT

GTA

AGT

GAT

GCC

CTT

CTC

334

Ile

Pro

Tyr 115

Arg

Cys

Leu

Val

Gly 120

Giu

Phe

Val

Sec

Asp 125

Ala

Leu

Leu

CTT

CCT

CAC

AAG

TCC

AAA

TTC

TTA

CAC

CAG

GAG

AGG

ATG

GAT

GTT

TGC

432

Val

Pro 130

Asp

Lys

Cys

Lys

Phe 135

Leu

His

Gin

Glu

Arg 140

Met

Aap

Vál

Cya

28CZ 303226 B6

GAA AGT CAT CTT

CAC TGG

CAC His

ACC GTC

GCC Ala

AAA Lvs 1ŠS

GAG Glu

ACA Thr

TGC Cys

AGT Sec

GAG Glu 160

Glu Thr 145

His

Leu.

His

Trp 150

The

Val

AAC

AGT

ACC

AAC

TTG

CAT

GAC

TAC

CCC

ATG

TTG

CTG

CCC

TCC

CGA

ATT

Lys

Ser

Thr

Asn

Leu

His

Asp

Tyr

Giy

Hec

Leu

Leu

2ro

Cys

Gly

Ile

165

170

175

GAC

AAG

TTC

CGA

GGG

GTA

GAG

TTT

GTG

TGT

TGC

CCA

CTG

GCT

GAA

GAA

Asp

Lys

Phe

Arg

Gly

Val

Glu

Bhe

Val

Cys

cys

?ro

Leu

Ala

Giu

Giu

130

18S

190

AGT

3AC

AAT

GTG

GAT

TCT

GCT

GAT

GCG

GA3

GAG

GAT

GAC

TCG

GAT

GTC

Ser

Asn 195

Val

Asp

Ser

Aia

Asp 200

Ala

Giu

Glu

Aap

Asp 205

Ser

Asp

Val

TGG

TGG

GGC

GCA

GCA

GAC

ACA

GAC

TAT

GCA

GAT

AGT

GAA

GAC

AAA

Tr?

Trp

Gly

Gly

Ala

Asp

Thr

Asp

Tyr

Aia

Asp

Giy

Ser

Giu

Asp

Lys

210

215

220

CTA

GTA

GAA

GTA

GCA

GAG

GAG

GAA

GAA

GTG

GCT

GAG

G L vj

GAA

GAA

GAA

Val

Val

Glu

Val

Ala

Glu

Glu

Glu

Glu

Val

Ala

Glu

Val

Glu

Glu

Glu

225

230

235

240

GAA

GCC

GAT

GAT

GAC

GAG

GAC

GAT

GAG

GAT

GGT

GAT

GAG

GTA

GAG

GAA

Glu

Ala

Asp

Asp

Asn

Glu

Asp

Asp

Glu

Asn

Gly

Asp

GiU

Val

Glu

Giu

24Š

2S0

255

GAG

GCT

GAG

GAA

CCC

TAC

GAA

GAA

GCC

ACA

GAG

AGA

ACC

ACC

AGC

ATT

Glu

Ala

Glu

Glu

Prp

Tyr

GlU

Glu

Ala

Thr

Glu

Arg

Thr

Thr

Ser

Ile

260

255

270

GCC

ACC

ACC

ACC

ACC

ACC

ACC

ACA

GAG

TCT

GTG

GAA

GAG

GTG

GTT

CGA

Ala

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

GlU

ser

VaL

Glu

Glu

val

Val

Arg

275

220

225

GTT·

CCT

ACA

ACA

GCA

GCC

AGT

ACC

CCT

GAT

GCC

GTT

GAC

AAG

TAT

CTC

Val

Pro

Thr

Thr

Ala

Ala

Ser

Thr

Pro

Asp

Ala

Val

Asp

Lys

Tyr

Leu

230

295

300

GAG

ACA

CCT

GGG

GAT

GAG

AAT

GAA

CAT

wCC

CAT

TTC

CAG

AAA

GCC

AAA

Glu

Thi

Pro

Gly

Asp

Glu

Asn

Glu

HiS

Ala

H:s

Phe

Gin

Lys

Al a

Lvs *

305

310

325

320

CAG

AGG

CTT

GAG

GCC

AAG

CAC

CGA

GAG

AGA

ATG

TCC

CAG

GTC

ATG

AGA

Glu

Arg

Leu

Glu

Ala

Lys

His

Arg

Glu

Acg

Met

Ser

Gin

Val

Me:

Arg

32 5

330

333

GAA

TGG

gaa

GAG

GCA

GAA

CGT

CAA

GCA

AAG

AAC

TTG

CCT

AAA

GCT

GAT

Glu

Trp

Glu

Glu

Ala

Glu

Arg

Gin

Ala

Lys

Asn

LsU

Pro

Lvs

Ala

Asp

3 40

345

350

AAG

aag

GCA

GTT

ATC

CAG

CAT

TTC

CAG

GAG

AAA

GTG

GAA

TCT

TTG

GAA

Lys

Lys

Ala

Val

Ile

Gin

HiS

Phe

Gin

Glu

Lys

Val

Glu

šer

Leu

Glu

356

360

365

CAG

GAA

GCA

GCC

AAC

sí/V,/

AGA

CAC

CAG

CTG

GTG

GAG

ACA

CAC

ATG

GCC

Gin

Glu

Ala

Ala

Asn

Glu

Arg

Gin

Gin

Leu

Val

Glu

Th£

His

Met

Ala

370

375

380

AGA

GTG

GAA

GCC

ATG

CTC

AAT

GAC

CGC

CGC

CGC

CTG

GCC

CTG

GAG

AAC

Axg

Val

Clu

Ala

Mec

Leu

Asn

Asp

Arg

Arg

Arg

Leu

Aia

Leu

Glu

Asn

365

390

395

400

420

523

576

4

672

720

763

1 ά

364

312

360

1OCS105S

110 4

1152

1200

-29CZ 303226 B6

TAC

ATC

ACC

GCT CTC CAC

GCT

GTT

CCT

CCT

CGG

CCT

CCT

CAC

GTG

TTC

1249

Tyr

Ile

Thr

Ala Leu Gin 405

Ala

Val

Pra

Pro 410

Arg

Pro

Arg

His

Val 415

Phe

AAT

ATG

CTA

AAG AAG TAT

I*·***-» ÚLs-

CGC

GCA

GAA

CAG

AAG

GAC

AGA

CAG

CAC

1296

Asn

Mer

Leu

Lys Lys Tyr 420

Val

Arg

Ala 425

Glu

Gin

Lys

Asp

Arg 430

Gin

His

ACC

CTA

AAG

CAT TTC- GAG

CAT

gtg

CGC

ATG

GTG

GAT

CCC

AAG

AAA

GCC

1344

Thr

Leu

Lya 435

Kis Phe Glu

His

Val <40

Arg

Met

Val

Asp

Pro 445

Lys

Lys

Ala

GCT

CAG

ATC

CGG TCC CAG

GTT

ATG

ACA

CAC

CTC

CGT

GTG

ATT

TAT

GAG

1392

Ala

Gin 450

Ile

Arg Ser Gin

Val 4SS

M.ec

Thr

His

Leu

Arg 4 S0

Val

IIa

Tyt

Clu

CGC

ATG

AAT

CAG TCT CTC

TCC

CTG

CTC

TAC

AAC

GTG

CCT

GCA

gtg

GCC

1440

Arg· 465

Met

Asn

Gin Ser Leu 470

Ser

Leu

Leu

Tyr

Asn 475

Val

Prc

Ala

val

Ala 430

GAG

GAG

ATT

CAG GAT GAA

GTT

GAT

GAG

CTG

CTT

CAG

AAA

GAG

CAA

AAC

1483

Glu

Glu

Ile

Gin Asp Glu 485

Val

Asp

Giu

Lau 490

Leu

Gin

Lys

Glu

Gin 495

Asn

TAT

TCA

GAT

GAC GTC TTG

GCC

AAC

ATG

ATT

AGT

GAA

CCA

AGG

ATC

AGT

1536

Tyr

Ser

Asp

Asp Val Leu 500

Ala

Asn

Met 505

11«

Ser

Glu

Pra

510

Ile

Ser

TAC

GGA

AAC

GAT GCT CTC

ATC

CCA

TCT

TTG

ACC

GAA

ACG

AAA

ACC

ACC

1534

Tyr

Gly

Asn 515

Asp Ala Lau

Mer

?rs 520

Ser

Leu

Thr

Glu

Thr 525

Lys

Thr

Thr

GTG

GAG

CTC

CTT CCC gtg

-AAT

GGA

GAG

TTC

AGC

CTG

GAC

GAT

CTC

CAG

1632

Val

Glu 530

Leu

Leu Pro Val

Asn 535

Gly

Glu

Phe

Ser

Leu 540

Asp

Asp

Leu

Gin

CCG

ι GG

CAT

TCT TTT CGG

GCT

GAC

TCT

GTG

CCA

GCC

AAC

ACA

GAA

AAC

1680

Pro 545

Trp

His

Ser Phe Gly 550

Ala

Asp

Ser

Val

Pro 555

Ala

Asn

Thr

Glu

Asn 560

GAA

GTT

GAG

CCT GTT GAT

GCC

CGC

CCT

GCT

GCC

GAC

CGA

GGA

CTC

ACC

1723

Glu

Val

Glu

Pro Val Asp

Ala

Arg

Pro

Ala

Ala

Asp

Arg

Gly

Leu

Thr

565 570 575

ACT CGA CCA

CGT TCT GGG TTG ACA AAT ATC AAG

Thr

GAG GAG

ATC Ile

TCT Ser

1776

Thr

Arg

Pro

Gly 580

Ser Gly Leu

Thr

Asn 585

Ile

Lys

Glu

Glu 550

GAA

GTG

AAG

ATG

GAT

GCA

GAA

TTC

CGA

CAT

GAC

TCA

GGA

TAT

GAA

GTT

1324

Glu

Val

Lys

Met

Asp

Ala

Glu

Phe

Arg

Has

Asp

Ser

Gly

Tyr

Glu

Val

5SS

600

605

CAT

CAT

CAA

AAA

TTG

GTG

TTC

TTT

GCA

GAA

GAT

GTG

GGT

TCA

AAC

AAA

1372

Hus

His

Gin

Lys

Leu

Val

Phe

Phe

Ala

Glu

Asp

val

Gly

Ser

Asn

Lys

610

eis

62 0

30CZ 303226 B6

GGT

GCA

ATC

ATT

GGA

CTC

ATG

GTG

GGC

GGT

GTT

GTC

ATA GCG

ACA

GTG

1920

Gly

Ala

Ile

Ile

Gly

Leu

MeZ

Val

Gly

Gly

Val

Val

Ile Ala

Thr

Val

□ 25

620

635

640

ATC

GTC

ATC

ACC

TTG

GTG

ATG

CTG

AAG

AAG

AAA

CA.G

TAC ACA

TCC

ATT

1963

Ile

Val

Zle

Thr

Leu

val

Mez

Leu

Lys

Lys

Lys

Gin

Tyr The

Ser

Ile

645

650

555

CAT

CAT

GGT

GTG

GTG

GAG

GTT

GAC

GCC

GCT

GTC

ACC

CCA GAG

GAG

CGC

2016

His

his

Gly

Val

Val

Glu

Val

Asp

Ala

Ala

Val

Thr

Pro Glu

Glu

Arg

660

□ 65

670

CAC

CTG

TCC

AAG

ATG

CAG

CAG

AAC

GGC

TAC

GAA

AA.T

CCA ACC

TAC

AAG

2064

Kis

Lea

Ser

Lye

Her

Gin

Gin

Asn

Gly

Tyr

Glu

As a

Pro Thr

Tyr

Lys

S75

630

685

TTC

TTT

GAG

CAG

ATG

CAG

AAC

TAG

2008

Phe

Glu

Gin

Mez

Gin

Asn

630

635

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 4: Oligonukleotid (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární io (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne 15 (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..38 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

CGGAATTCATCGATTCCACCATGCTCACATTCATGGCC 3 S (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 5: Oligonukleotid (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 43 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE. lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:

-31 CZ 303226 B6 (A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..43 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5: CCGCTCGAGTCATTGTCGACCATGCTTCGCTCCGTATTTGAGG 43 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 6: Oligonukleotid 8172 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů bází ίο (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: L.27 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6: CAAAGATCTGATGCAGAATTCCGACAT 27 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 7: Oligonukleotid 8181 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 59 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..59 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7: CAAGCGGCCGCTCATCCC77G?CATCGTCGTCCTTGTAGTCTCCGTTCTGCATCTGCTCS9 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 8: Oligonukleotid 8171

-32CZ 303226 B6 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne io (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS 15 (B) POZICE: L.27 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8: CAAAGATCTAAGAAACAGTACACATCC 27 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 9: Oligonukleotid (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 29 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineami (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS 35 (B) POZICE: 1..29 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9: ccatcgatggctaCATCTTCACTTCAGAG 2 9 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 10: Oligonukleotid (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA

-33CZ 303226 B6 (iti) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1.31 io (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

cca c=ga cggctaTTTTTGATGATGAACTTC 31 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S ID. Č. 11: Oligonukleotid (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..17 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

CCGTGGAGCTCCTCCCG 17

Claims (8)

1. 35 1. Způsob detekce nebo izolace sloučenin použitelných při léčení Alzheimerovy nemoci, jež jsou schopny inhibovat interakci mezi presenilinem 1, označovaným PSI, nebo presenilinem 2, označovaným PS2, a prekurzorem β-amyloidového peptidu, označovaným APP, vyznačující se tím, že zahrnuje alespoň jeden krok, v němž se označí preseniliny a/nebo APP a krok detekce inhibice interakce mezi celým APP a preseniliny, přičemž místo celého presenilinu

   40 může být použita pouze jeho část, obsahující sekvencí 1 až 213 z PSI nebo 1 až 87 z PS2.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se provedou následující kroky: peptid APP se preabsorbuje inkubací na nitrocelu lóžovou membránu,

   - bakteriální extrakt který obsahuje celý presenilin PSI nebo celý presenilin PS2 nebo části,

   45 obsahující sekvenci 1 až 213 z PSI nebo 1 až 87 z PS2, se přidá pro inkubaci s testovanou molekulou nebo směsí obsahující různé testované molekuly,

   -34CZ 303226 B6

   - interakce presenilinů s peptidem APP na nitrocelulózovém filtru se detekuje pomocí markeřových proteinů presenilinů v kroku uvedeném v nároku 1, přičemž hledaná molekula inhibující interakci snižuje intenzitu signálu markerových proteinů.

   5
3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že jeden z markerových proteinů je

   S-tag-vazebný protein konjugovaný s alkalickou fosfatázou.
4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se provedou následující kroky:

   - peptid APP se preinkubuje na destičce s jamkami formátu 96 jamek nebo více io - N-koncový úsek purifikovaného rekombinantního presenilinů, odpovídající sekvenci aminokyselin I až 213 z PSI nebo sekvenci aminokyselin 1 až 87 z PS2, se přidá pro inkubaci s testovanou molekulou nebo směsí obsahující různé testované molekuly,

   - po opláchnutí se interakce presenilinů s peptidem APP na destičce detekuje pomocí markerových proteinů presenilinů v kroku uvedeném v nároku 1, přičemž ztráta interakce t5 mezi preseniliny a prekurzorem β-amyloidového peptidu se detekuje spektrofotometričky pro zviditelnění kolorimetrickým substrátem.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že jeden z markerových proteinů je S-tag-vazebný protein konjugovaný s alkalickou fosfatázou a detekce ztráty interakce se provádí

   20 při 450 nm.
6. 6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se provedou následující kroky:

   - molekula nebo směs obsahující různé molekuly se uvede do kontaktu se syntetizovaným peptidem APP, přičemž tento syntetizovaný peptid APP nese biotin a rameno 3 β-alaninů

   25 nebo 3 lysinů na svém N-konci,

   - reakční směs se inkubuje s aminokyselinovou sekvencí 1 až 213 purifikovaného PSI nebo s aminokyselinovou sekvencí 1 až 87 purifikovaného PS2 značeného prvním fluoroforem,

   - přidá se streptavidin konjugovaný s druhým fluoroforem, přičemž druhý fluorofor je schopen excitace při vlnové délce emise prvního fluoroforu, takže využívá přenosu fluorescence,

   30 pokud jsou oba fluorofory ve vzájemné blízkosti,

   - detekce nových sloučenin inhibujících interakci se provádí spektrofotometricky při vlnové délce emise prvního fluoroforu a/nebo měřením snížení signálu při vlnové délce emise druhého fluoroforu.

   35
7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že prvním fluoroforem je kryptát europía a druhým fluoroforem je XL665.
8. 8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se provedou následující kroky:

   - směs a) buněčných lyzátů obsahujících celý presenilin PSI nebo celý presenilin PS2 nebo

   40 části obsahující sekvenci aminokyselin 1 až 213 z PSI nebo 1 až 87 z PS2, a b) buněčných lyzátů obsahujících APP, získaných z buněk infikovaných viry, zejména bakuloviry, a c) testované molekuly nebo směsi obsahující různé testované molekuly, se přivedou do kontaktu,

   - solubilizované proteiny odpovídající presenilinům nebo APP jsou pomocí vhodných proti45 látek koimunoprecipitovány,

   - ztráta koimunoprecipitace presenilinů a APP se detekuje značenými protilátkami westernovým přenosem, přičemž tato ztráta indikuje, že testované molekuly mají požadované inhibiční vlastnosti.