NO328908B1

NO328908B1 - In vitro anvendelse av et polypeptid som er i stand til a inhibere interaksjonen mellom preseniliner og APP.

Info

Publication number: NO328908B1
Application number: NO20002001A
Authority: NO
Inventors: Luc Mercken; Christian Czech; Laurent Pradier; Soline Reboul-Becquart
Original assignee: Aventis Pharma Sa
Priority date: 1997-10-24
Filing date: 2000-04-17
Publication date: 2010-06-14
Also published as: HUP0004605A3; HUP0004605A1; CA2305816C; NO20002001D0; NO20002001L; AU766522B2; KR100626475B1; CZ303226B6; BR9813105A; WO1999021886A1; CY1112236T1; CN100429230C; EP1025121B1; AU3129500A; IL135751A0; EP1025121A1; CZ20001462A3; CA2305816A1; IL135751A; KR20010024541A

Abstract

Nye polypeptider i stand til i det minste delvis å inhibere interaksjonen mellom presenilin 1 eller presenilin 2 på den ene side og forløperen av amyloidpeptid og/eller (3-amyloidpeptid på den annen side.Videre beskrives in vitro-tester for påvisning av molekyler og særlig små molekyler i stand til å inhibere interaksjonen.Oppfinnelsens anvendelse på det farmasøytiske området beskrives.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår in vitro anvendelse av et nærmere definert polypeptid for å inhibere interaksjonen mellom preseniliner og amyloid forløperpeptid (APP).

Amyloidpeptidet Ap på 37 til 42 aminosyrer er hovedproteinkomponenten i senilplaque som er karakteristisk for Alzheimers sykdom. Dette peptid produseres ved spalting av dets forløper, amyloidforløperpeptid (APP). Mutasjoner i genet for APP er ansvarlige for visse tidlige familiære former av Alzheimers sykdom. Imidlertid er hovedandelen av disse former forbundet med nærværet av mutasjoner på to gener, presenilin PSI (til å begynne med kalt Sl82) og PS2 (til å begynne med STM2), nylig identifisert ved posisjonell kloning (Hardy, 1997). Disse former er dominante og samtlige av deres anomalier gir missense mutasjoner bortsett fra en som medfører delesjon av et exon. Presenilinene er hydrofobe membran proteiner med en molekylmasse på rundt 45-50 kDa og oppviser 67 % identitet seg imellom. De er homologe med to proteiner av C. elegans, SPE4 og Sel-12, som er indirekte involvert henholdsvis i den intracellulære transport og i signaleringen av Notch-reseptorer. Imidlertid er den fysiologiske funksjon av presenilinene fremdeles ukjent. Koblingen av to så beslektede proteiner med Alzheimers sykdom synes å tyde på at presenilinene virker på en essensiell fysiologisk reaksjonsvei i etiologien av denne patologi.

Proteinet PSI omfatter 467 aminosyrer og PS2 omfatter 448. Begge har struktur som et membranprotein med 6 til 8 potensielle transmembrandomener. Hvert av presenilinene undergår in vivo en nøyaktig proteolytisk spalting som resulterer i to fragmenter, generelt kalt N(amino)- og C(karboksy)-terminale fragmenter (Thinakaran et al, 1996). Denne spalting er kartlagt mellom restene 291 og 299 av PSI (Podlisny et al., 1997) og et homologt område av PS2. Utrykket "N-terminale (N-ter) fragment" viser generelt til fragmentet fra posisjon 1 til omtrent 291 av PSI, og med det C-terminale fragmentet menes generelt det gjenværende. Selv om den nøyaktige topologi av presenilinene i lipidmembranene ikke er helt tydelig fastslått, er det foreslått at deres N- og C-terminale [RCl]-ender samt den store hydrofile sløyfe er til stede i det cytosoliske rom (Doan et al., 1995, se skjemafigur 1).

Det er nu påvist at muterte former av preseniliner induserer en økning i produksjonen av det lange amyloidpeptid Ap 1-42 i forhold til Ap 1-40 like mye hos bærerpasienter (Scheuner et al., 1996) som transfekterte celler (Borchelt et al., 1996) eller transgene mus (Duff et al., 1996). Det amyloide peptid AP som danner senilplaque, en lesjon som er karakteristisk for patologien, og dennes forskjellige former, er avledet fra katabolismen av amyloid forløperprotein, APP. Særlig er det beskrevet to essensielle former av det amyloide peptid, en med 40 rester, A(340, og den andre med to ytterligere rester ved karboksylterminalen, A042. In vitro oppviser peptidet Ap sterke aggregeringsegenskaper som økes for formen Ap42 og den sistnevnte synes effektivt å danne de første detekterbare aggregater i patologien. Videre blir formen AP42 spesifikt produsert efter kranietrauma hos mennesker, noe som utgjør en av de best fastslåtte omgivelsesrisiko for Alzheimers sykdom. Videre, de tidlige genetiske former av sykdommen forbundet med mutasjoner både på APP (hvorav det er seks) og nå på presenilinene 1 og 2, bidrar alle til en økning av forholdet Ap42:ap40. Alle disse faktorer synes å utpeke Ap42 som nøkkelforbindelsen for patologien både i de genetiske former og de sporadiske former av sykdommen og en klargjøring av deres dannelsesmekanisme anses som et fundamentalt spørsmål.

I denne forbindelse, har det blitt rapportert dannelse av et kompleks, i den samme cellulære kappe, mellom forløperen av p-amyloidpeptidet og PSI eller PS2 (Weidemann et al., 1997, Xia et al., 1997), men man kjenner ikke den nøyaktige art av de evenementer som er ansvarlige for produksjonen av P-amyloidpeptidet og ingen forbindelse har til nu kunnet fastslås mellom den mulige rolle for disse komplekser og produksjonen av P-amyloidpeptidet AP42. Det er imidlertid ikke desto mindre verdt å merke seg at peptidet AP42, men ikke AP40, synes å være lokalisert i den endoplasmiske reticulum i neuronale celler (Hartmann et al., 1997).

Tilsvarende til hva som ble rapportert av Weidemann et al, er det i Journal of Molecular Neuroscience, 1997, vol. 9, side 49-54 utført en studie hvor ulike fragmenter av PSI og PS2 ble koutrykkt med APP i et gjær to-hybrid system for å vise en direkte interaksjon mellom presenilinene og APP.

Foreliggende oppfinnelse er resultatet av identifiseringen og karakteriseringen av spesielle regioner av presenilin 1 (PSI) og presenilin 2 (PS2) samt spesielle regioner i forløperen av p-amyloidpeptidet (APP) som er involvert i dannelsen av kompleksene APP/PS1 ogAPP/PS2.

Foreliggende oppfinnelse er særlig resultatet av påvisningen av evnen hos det N-terminale hydrofile området (aminosyrene 1-87) av PS2 og gjenkjenner forskjellige domener av APP. Den stammer videre fra påvisningen av tilsvarende egenskaper for det N-terminale området av PSI (fragment 1-213). Den er videre et resultat av påvisningen av evnen hos polypeptider avledet fra de ovenfor definerte regioner av presenilinene til å inhibere dannelsen av komplekser mellom APP og presenilinene.

Foreliggende oppfinnelse er videre resultatet av påvisningen av den uventede spesielle cellulære lokalisering av interaksjons-regionene i forhold til lipidmembranen. Oppfinnelsen er videre basert på det faktum at disse interaksjoner kan skje ikke bare i membranen, men også i endoplasmiske reticulumrom og i det ekstracellulære rom. Dette er uventet dithen at det N-terminale området av PS (implisert i interaksjonen) generelt anses for å være lokalisert i cytoplasmaet under standardbetingelser.

Et første aspekt ved oppfinnelsen vedrører således in vitro anvendelse av et polypeptid for å inhibere interaksjonen mellom preseniliner og APP, hvor nevnte peptid består av hele eller en del av sekvensen 1-87 av PS2 og eventuellt en signalsekvens.

Et andre aspekt ved oppfinnelsen vedrører in vitro anvendelse av et polypeptid for å inhibere interaksjonen mellom preseniliner og APP, hvor nevnte peptid består av hele eller en del av sekvensen 1-213 av PSI og eventuellt en signalsekvens.

Det er vist i eksemplene i foreliggende søknad at inhiberingen av denne interaksjon med de nevnte polypeptider fører til en reduksjon av produksjonen av intracellulært amyloidpeptid ApÅ inhibere denne interaksjonen og således å inhibere produksjonen av Ap 1.42, representerer som et resultat et terapeutisk mål når det gjelder sykdommer som implikerer denne form for amyloidpeptid.

I en første utførelsesform ifølge oppfinnelsen inneholder polypeptidet en signalsekvens. Nevnte signalsekvens er foretrukket valgt blant signalpeptidsekvensen av IgkB, signalpeptidet av APP, signalpeptidene til de muskulære og sentrale acetylkolin nikotiniske reseptor subenheter.

Karakteriseringen av interaksjonsdomenene av APP og presenilinene og påvisningen av de forskjellige cellulære lokaliseringer for disse interaksjoner tillater å ta sikte på fremstilling av nye polypeptider som kan benyttes farmasøytisk.

Et tredje aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører in vitro anvendelse av et polypeptid, som definert i nevnte første eller andre aspekt av oppfinnelsen, i en fremgangsmåte for påvisning eller isolering av forbindelser som kan inhibere interaksjonen mellom enten i) peptid Ap 1.42 og den N-terminale ende av preseniliner; eller ii) APP og den N-terminale ende av preseniliner, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter minst ett trinn med detektering av inhibering av interaksjonen enten mellom peptid Ap 1.42 eller P-amyloidforløperpeptidet og den N-terminale ende av et presenilin. I en første utførelsesform ifølge det tredje aspekt ved oppfinnelsen omfatter nevnte fremgangsmåte ytterligere minst et trinn med merking av presenilinene og/eller APP eller amyloid-P 1-42 peptidet.

I en andre utførelsesform ifølge det tredje aspekt ved oppfinnelsen er fremgangsmåten kjennetegnet ved at de følgende trinn blir utført: - peptidet Ap 1.42 absorberes i forkant på en nitrocellulosemembran ved inkubering; - et bakterieekstrakt inneholdende den N-terminale ende av et presenilin tilsettes deretter for inkubering med molekylet eller en blanding inneholdende forskjellige molekyler som skal testes; - tap av interaksjon mellom presenilinet og peptidet Ap 1.42 på nitrocellulosefilteret påvises ved hjelp av presenilin markør proteiner.

Markørproteinene som benyttes er fortrinnsvis

a) fikseringsproteinet av S-tag, koblet til alkalifosfatase eller til en fluorescent kromofor eller

b) et anti-PSNT-antistoff, det vil si rettet mot den N-terminale ende av et presenilin.

I en tredje utførelsesform ifølge det tredje aspekt ved oppfinnelsen omfatter

fremgangsmåten følgende trinn:

- peptidet Ap 1 ^2 absorberes i forkant på en nitrocellulosemembran ved inkubering; - et bakterieekstrakt inneholdende den N-terminale ende av et presenilin tilsettes derefter for inkubering med molekylet eller en blanding inneholdende forskjellige molekyler som skal testes; - tap av interaksjon mellom presenilinet og peptidet Ap 1.42 på nitrocellulosefilteret påvises ved hjelp av presenilin markør proteiner, hvori et av markør proteinene er fikseringsproteinet av S-tag koblet til alkalisk fosfatase.

I en fjerde utførelsesform ifølge det tredje aspekt ved oppfinnelsen omfatter fremgangsmåten følgende trinn: - peptidet AP M2 inkuberes i forkant på en plate; - den N-terminale ende av et renset rekombinant presenilin tilsettes derefter med molekylet eller en blanding av forskjellige molekyler som skal testes, for inkubering; - efter vasking, skjer påvisning av interaksjonen av presenilin med peptid Ap \ ai på platen ved hjelp av presenilin markørproteiner, hvor tap av interaksjon mellom preseniliner og forløperen av p-amyloidpeptidet og/eller p-amyloidpeptidet detekteres efter visualisering med et kolorimetrisk substrat, ved spektrofotometri.

I det spesielle tilfellet der man benytter fikseringsproteinet av S-tag koblet til alkalifosfatase som markørprotein, detekteres signalet efter påvisning med kolorimetrisk substrat, ved 450 nm.

I en femte utførelsesform ifølge det tredje aspekt ved oppfinnelsen omfatter fremgangsmåten følgende trinn: - peptidet Ap 142 inkuberes i forkant på en plate; - den N-terminale ende av et renset rekombinant presenilin tilsettes derefter med molekylet eller en blanding av forskjellige molekyler som skal testes, for inkubering; - efter vasking, skjer påvisning av interaksjonen av presenilin med peptid Ap1.42 på platen ved hjelp av presenilin markørproteiner, hvori et av markør proteinene er fikseringsproteinet av S-tag koblet til alkalisk fosfatase og tap av interaksjon mellom preseniliner og forløperen av P-amyloidpeptidet og/eller P-amyloidpeptidet detekteres efter visualisering med et kolorimetrisk substrat ved 450 nm, ved spektrofotometri.

I en femte utførelsesform ifølge det tredje aspekt ved oppfinnelsen omfatter fremgangsmåten følgende trinn: - et molekyl eller en blanding inneholdende forskjellige molekyler bringes i kontakt med peptidet Ap 142 syntetisert med et biotin og en arm av 3P-alaniner eller av 3 lysiner ved den N-terminale ende; - den ovennevnte reaksjonsblanding innkuberes med den N-terminale ende av et renset presenilin merket ved hjelp av en første fluorofor; - et streptavidin koblet til en andre fluofor, som er i stand til å kunne eksiteres ved emisjonsbølgelengden til den første fluofor, blir tilsatt slik at den begunstiges av en

overføring av fluorescens hvis de to fluoroforer befinner seg nær hverandre; og

- inhibering av interaksjonen detekteres ved spektrofluorometri ved emisjonsbølgelengden for den første fluofor og/eller ved å måle reduksjonen av signalet ved emisjonsbølgelengden for den andre fluofor.

I henhold til en spesiell utførelsesform er den andre fluorofor XL665 som er allofyco-cyanin, kjemisk fornettet for å øke sin fluorescens ved 665 nm (CisBiointernational). Uteblivelsen av interaksjonen detekteres således ved fiuorometri ved emisjonsbølge-lengden for den første fluofor og ved reduksjon av signalet av XL665 hvis emisjons-bølgelengde er ved 665 nm.

Denne fremgangsmåte er meget fordelaktig fordi den tillater direkte å påvise interaksjonen mellom presenilinene og APP og/eller AP-peptidet i flytende og homogen fase og som en konsekvens å påvise molekylene som inhiberer denne interaksjon. Således er fremgangsmåten basert på overføringen av fluorescensen mellom to fluoroforer hvis de to kromoforer befinner seg i fysisk nærhet (som når det gjelder interaksjon med Ap^2 og det rekombinante protein).

I henhold til en foretrukken variant av prosessen er den første fluofor Europium-kryptat, båret av det merkede, rekombinante protein (eksitert ved 337 nm) og som reagerer med streptavidin-XL665 fiksert på peptid biot-Ap og særlig på peptidet biot-Ap^-Uteblivelsen av fluorescens ved 665 nm og økning av fluorescensen ved 620 nm som er karakteristisk for Europium-kryptat, indikerer en inhibering av interaksjonen mellom presenilinene eller deres N-terminale ender og APP og/eller peptidet Ap på grunn av de søkte molekyler.

I henhold til en variant av prosessen, kan molekylet eller blandingen inneholdende de forskjellige molekyler bringes i kontakt først med den N-terminale ende av et markert, renset presenilin ved hjelp av Europium-kryptat (PSNT-K) og så med peptidet AP 1.40 eller AP 1.42 som bærer et biotin og en arm på 3p-alaniner (eller 3 lysiner) ved den N-terminale ende. Påvisningen av de nye molekyler som er i stand til å modulere eller i det minste delvis å inhibere interaksjonen mellom presenilin 1 eller presenilin 2 og forløperen av P-amyloidpeptidet og/eller p-amyloidpeptidet skjer likeledes efter forening av det markerte streptavidin med XL665, ved spektrofluorometri i henhold til prosessen ovenfor og særlig ved avlesning av fluorescensen ved 665 nm.

I en sjette utførelsesform ifølge det tredje aspekt ved oppfinnelsen er fremgangsmåten kjennetegnet ved at de følgende trinn blir utført: - et molekyl eller en blanding inneholdende forskjellige molekyler bringes i kontakt med peptidet Ap 1.42 syntetisert med et biotin og en arm av 3P-alaniner eller av 3 lysiner ved den N-terminale ende; - den ovennevnte reaksjonsblanding innkuberes med den N-terminale ende av et renset presenilin merket ved hjelp av en første fluorofor, hvor nevnte fluofor er europium kryptat; - et streptavidin koblet til en andre fluofor, som er XL665, som er i stand til å kunne eksiteres ved emisjonsbølgelengden til den første fluofor, blir tilsatt slik at den begunstiges av en overføring av fluorescens hvis de to fluoroforer befinner seg nær hverandre; og - inhibering av interaksjonen detekteres ved spektrofiuorometri ved emisjonsbølgelengden for den første fluofor og/eller ved å måle reduksjonen av signalet ved emisjonsbølgelengden for den andre fluofor.

I en syvende utførelsesform ifølge det tredje aspekt ved oppfinnelsen er fremgangsmåten kjennetegnet ved at de følgende trinn blir utført: - et molekyl eller en blanding inneholdende forskjellige molekyler bringes i kontakt med peptidet APm2 syntetisert med et biotin og en arm av 3p-alaniner eller av 3

lysiner ved den N-terminale ende;

- den ovennevnte reaksjonsblanding innkuberes med den N-terminale ende av et renset presenilin merket ved hjelp av en første fluorofor, hvor nevnte fluofor er europium

kryptat;

- et streptavidin koblet til en andre fluofor, som er XL665, som er i stand til å kunne eksiteres ved emisjonsbølgelengden til den første fluofor, blir tilsatt slik at den begunstiges av en overføring av fluorescens hvis de to fluoroforer befinner seg nær

hverandre; og

- inhibering av interaksjonen detekteres ved spektrofiuorometri ved emisjonsbølgelengden for den første fluofor og/eller ved å måle reduksjonen av signalet ved emisjonsbølgelengden for den andre fluofor ved 665nm.

I en åttende utførelsesform ifølge det tredje aspekt ved oppfinnelsen er fremgangsmåten kjennetegnet ved at de følgende trinn blir utført: - en blanding av a) cellelysater inneholdende N-terminale ende av et presenilin; b) cellelysater inneholdende APP, lysater som er oppnådd fra celler infisert med virus;

og c) molekylet eller blandingen inneholdende forskjellige molekyler som skal

testes; bringes i kontakt

- proteinene som er oppløseliggjort og tilsvarer presenilinene eller APP eller peptidet

Ap blir ko-immunopresipitert ved hjelp av egnede antistoffer; og

- tapet av ko-immunoprecipitering av presenilinene og APP blir visualisert ved westernblot med markørantistoffer som indikerer at de testede molekyler har den ønskede inhiberende egenskap.

Det er således mulig, ut fra de polypeptidiske deler som er beskrevet i foreliggende søknad, å realisere molekyler som inhiberer i det minste delvis interaksjonen mellom presenilin 1 eller presenilin 2 og forløperen av P-amyloidpeptidet og/eller P-amyloidpeptidet, og som ikke utelukkende er peptidisk og kompatibelt med en farmasøytisk anvendelse.

I denne forbindelse angår oppfinnelsen anvendelsen av polypeptider som beskrevet ovenfor for isolering av ikke-peptidiske molekyler eller utelukkende peptidiske molekyler, med farmakologisk aktivitet, ved bestemmelse av strukturelle elementer hos disse polypeptider som er viktige for deres aktivitet og reproduksjon av disse elementer med ikke-peptidiske strukturer eller ikke utelukkende peptidiske slike. De isolerte molekyler kan inngå i farmasøytiske preparater.

Polypeptidene som anvendes ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved at man dyrker en celle inneholdende en nukleotidsekvens som koder for polypeptidet under ekspresjonsbetingelser for sekvensen, og så gjenvinner det fremstilte polypeptid. I dette tilfellet er partiet som koder for polypeptidet generelt satt under kontroll av signaler som tillater ekspresjonen i en vertscelle. Valget av disse signaler (promotere, terminatorer, sekvensleder for sekresjonen, og så videre) kan variere som funksjon av den benyttede vertscelle. Videre kan nukleotidsekvensene være del av en vektor som kan replikeres autonomt eller integrativt. Mer spesielt fremstilles vektorer med autonom replikasjon ved å benytte sekvenser for autonom replikasjon i den valgte vert. Dreier det seg om integrative vektorer kan disse fremstilles for eksempel ved å benytte sekvenser som er homologe med visse områder av genomet av verten for å tillate integrering av vektoren ved homolog rekombinasjon.

Vertscellene som kan benyttes for fremstilling av de anvendte peptidene på rekombinant måte kan være både eukaryotiske og prokaryotiske verter. Blant de eukaryotiske verter som egner seg kan nevnes animalske celler, gjær eller sopp. Når det dreier seg om gjær kan man særlig nevne gjær av genus Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces eller Hansenula. Dreier det seg om animalske celler, kan man nevne cellene COS, CHO, C127, humanneuroblastomer, og så videre. Blant soppene kan man særlig nevne Aspergillus ssp. eller Trichoderma ssp. Som prokaryotiske verter foretrekker man å benytte bakteriene E.coli, Bacillus eller Streptomyces.

Vertscellene er fortrinnsvis rekombinante gjærstammer.

Nevnte nukleotidsekvens kan benyttes for konstruksjon av en ekspresjonskassett som igjen kan benyttes i en ekspresjonsvektor. Særlig tjener ekspresjonskassetten til produksjon av polypeptidet som anvendes i foreliggende oppfinnelsen.

Polypeptidene som anvendes i oppfinnelsen kan oppnås ved ekspresjon i en cellulær vert av en nukleotidsekvens som beskrevet ovenfor, eventuelt innarbeidet i rekombinant

DNA, under anvendelse av i og for seg kjente teknikker, eller ved en kombinasjon av slike teknikker.

Fortrinnsvis utgjør nukleinsekvensene en del av en vektor som benyttes for å indusere ekspresjonen av polypeptidene in vivo, ex vivo og/eller in vitro. Den benyttede vektor kan stamme fra forskjellige opprinnelser, men må være i stand til å transformere animalske celler og fortrinnsvis humane nerveceller. Det kan dreie seg om en viral, en ikke-viral eller en plasmidisk vektor. Foretrukken benyttes en viral vektor som kan stamme fra adenoviruser, retroviruser, adeno-assosierte vimser (AAV), herpesvirus, cytomegalovirus (CMV), vaksinevirus, og så videre. Vektorer avledet fra adenoviruser, retroviruser eller AAV som inkorporerer heterologe nukleinsyresekvenser er beskrevet i litteraturen [Akli et al., "Nature Genetics", 3 (1993) 224; Stratford-Perricaudet et al., "Human Gene Therapy", 1 (1990), 241; EP 185 573; Levrero et al., "Gene", 101 (1991) 195; Le Gal la Salle et al., "Science", 259 (1993) 988; Roemer og Friedmann, "Eur. J. Biochem.", 208 (1992) 211; Dobson et al., "Neutron", 5 (1990) 353; Chiocca et al., "New Biol.", 2 (1990) 739; Miyanohara et al., "New Biol.", 4 (1992) 238; WO 91/18088].

En nukleinsyre som definert ovenfor og som koder for et polypeptid som anvendes ifølge oppfinnelsen kan fortrinnsvis være inskutt i genomet til et rekombinant virus.

Fortrinnsvis er den rekombinante virus en defektiv virus. Uttrykket "defektiv virus" er ment å betegne en virus i stand til å replikere seg i målcellen. Generelt er genomet av defektive vimser berøvet i det minste de sekvenser som er nødvendige for replikasjon av vimsen i den infiserte celle. Disse områder kan være eliminert (helt eller delvis), gjort ikke-funksjonelle eller erstattet med andre sekvenser. Fortrinnsvis bevarer imidlertid den defektive vims de sekvenser i sitt genom som er nødvendig for enkapsidering av de virale partikler.

Det er spesielt fordelaktig å benytte nukleinsyrer som koder for proteinene som anvendes ifølge oppfinnelsen i innkorporert form i en adenovirus, en AAV eller en defektiv, rekombinant retrovirus. Foretrukket dreier det seg om en adenovirus.

Det eksisterer forskjellige serotyper av adenoviruser hvis struktur og egenskaper varierer noe. Blant disse serotyper foretrekker man å benytte de humane adenoviruser av type 2 eller 5 (Ad2 eller Ad5) eller adenoviruser av animalsk opprinnelse, se WO 94/26914. Blant adenovirusene av animalsk opprinnelse som kan benyttes, kan nevnes adenoviruser av canin, bovin, murin (for eksempel Mavl, se Beard et al., "Virology", 75 (1990) 81), ovin, porcin, aviær eller også simien (for eksempel SAV) opprinnelse. Fortrinnsvis er adenovirusene av animalsk opprinnelse en canin-adenovirus og aller helst en adenovirus CAV2 (for eksempel stamme manhattan eller A26/61 (ATCC VR-800)). Fortrinnsvis benytter man adenoviruser av human eller caninopprinnelse eller av blandet opprinnelse. Fortrinnsvis er i det minste området El ikke-funksjonelt i adenovirusets genom. Det angjeldende virale gen kan gjøres ikke-funksjonelt på en hvilken som helst kjent måte og særlig ved total suppresjon, substitusjon, partiell delesjon eller addisjon av en eller flere baser i det eller de angjeldende gener. Andre områder kan likeledes modifiseres og særlig gjelder dette området E2 (WO 95/02697), E2 (WO 94/28938), E4 (WO 94/28152, WO 94/12649, WO 95/02697) og L5 (WO 95/02697). Foretrukket omfatter adenovirusen en delesjon i områdene El og E4. Alternativt omfatter den en delesjon i området El i hvilket område E4 og den kodende sekvens er skutt inn. I virusene løper delesjonen i området El fortrinnsvis fra nukleotidene 455 til 3329 i sekvensen av adenovirus Ad5. Alternativt er den exogene nukleinsyresekvens skutt inn i delesjonen i El området.

De defektive, rekombinante vimser kan fremstilles ved homolog rekombinasjon mellom en defektiv vims og et plasmid som blant annet bærer nukleotidsekvensen som definert ovenfor (Levrero et al., "Gene", 101 (1991) 195; Graham, "EMBO J.", 3(12) (1984) 2917). Den homologe rekombinasjon skjer efter kotransfeksjon av vimsene og plasmidet inn i en egnet cellelinje. Den benyttede cellelinjen må fortrinnsvis (i) være transformerbar med disse elementer og (ii) omfatte de sekvenser som er i stand til å komplementere genomdelen av den defektive vims, fortrinnsvis i integrert form for å unngå risiko for rekombinasjon. Som eksempel på linje som kan benyttes for fremstilling av defektive, rekombinante adenoviruser, kan man nevne den humane, embryonære nyrelinje 293 (Graham et al., "J. Gen. Virol.", 36 (1977) 59) som særlig, integrert i sitt genom, inneholder den venstre del av genomet av en adenovims Ad5 (12%). Som eksempel på linje som kan benyttes for fremstilling av defektive, rekombinante retrovimser, kan man særlig nevne linjen CRIP (Danos og Mulligan, "PNAS", 85 (1988) 6460). Til slutt blir vimsene som er multiplikert gjenvunnet og renset i henhold til klassiske teknikker innen molekylærbiologien.

Defektive, rekombinante vimser kan også omfatte en heterolog nukleinsekvens som koder for polypeptidet som anvendes i oppfinnelsen.

Polyklonale eller monoklonale antistoffer eller fragmenter av slike antistoffer kan genereres på i og for seg kjent måte. Særlig kan antistoffene fremstilles ved immunisering av et dyr mot et polypeptid hvis sekvens fortrinnsvis er valgt blant sekvensene SEQ ID nr. 1 eller SEQ ID nr. 2 eller fragmenter kalt SEQ ID nr. 3 med etterfølgende avhenting av blod og isolering av antistoffene. Disse antistoffer kan likeledes genereres ved preparering av hybridomer i henhold til kjente teknikker. Antistoffene eller fragmenter av antistoffene kan særlig benyttes for i det minste delvis å inhibere interaksjonen mellom presenilin 1 eller presenilin 2 og forløperen av det P-amyloide peptid og/eller det P-amyloide peptid.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av de vedlagte, ikke-begrensede eksempler under samtidig henvisning til figurene, der:

Figur 1 viser

A) Skjema av de tronkerte PS2-konstruksjoner

B) Ekspresjon i COSI-celler.

Figur 2 viser interaksjonen av de tronkerte former av PS2 med APP.

Figur 3 viser

A) Interaksjonen av N-termen sekretert av PS2 (SecPS2NT), men ikke den cytoplasmiske form (myc-PS2NT) og det ekstracellulære APP. B) Påvisning av interaksjonen SecPS2NT/APP, men ikke av myc-PS2NT/APP i ekstracellulært medium.

Figur 4 viser interaksjonen av PS2 med tronkerte former av APP:

A) Interaksjonen av PS2 med formen SPA4CT av APP, men ikke med den cytoplasmiske domene av APP (MC45F).

B) Interaksjonen av PS2 med formelen Cl00 av APP.

Figur 5 viser interaksjonen av PS1DC2 med APP og dennes korte form:

A) Interaksjonen av PSI med hele formen av APP og den tronkerte form

SPA4CT.

B) Interaksjon av den tronkerte form av PSI (PS1AC2) av APP.

Figur 6 viser interaksjonen av PSI og av APP i insektsceller:

A) Anti-histidin-immunoprecipitat (etikett på PS 1), påvisning APP.

B) Anti-PS 1-immunoprecipitat, påvisning APP.

C) Invers anti-APP immunoprecipitater, påvisning PSI.

Figur 7 viser interaksjonen av den sekreterte form av PS2NT med Ap-peptidet i ekstracellulært medium. Figur 8 viser rekonstitusjon av interaksjonen Ap/PS2Nt in vitro på nitrocellulosefilter:

A) Doseavhengighet som funksjon av konsentrasjonen av PS2Nt.

B) Doseavhengighet som funksjon av konsentrasjonen av Ap.

Figur 9 viser interaksjonen in vitro av de fullstendige former av PSI og APP:

A) Anti-histidin-immunoprecipitater.

B) Anti-P S1 -immunoprecipitater.

Figur 10 viser forskyvningen av den N-terminale ende av PS2 som foregås av et signalpeptid (SecPS2NT) for interaksjon mellom PSI og fragmentet SPA4CT. Figur 11 viser interaksjonen av PS2NT med peptidet Ap 1-42 in vitro, påvist ved 96

brønners platetesten (ELISA).

Figur 12 viser interaksjonen av PS2NT med peptidet AP142, påvist ved HTRF-fluore-scensoverføringstesten (homogen tidsoppløst fluorescens). Figur 13 viser blokkeringen av interaksjonen APP/PS1 med SecPS2NT gjennomført for inhibering av produksjonen av det intracellulære APM2-amyloidpeptid: A) Påvisning av at blokkeringen av interaksjonen APP/PS1 med SecPS2NT fører til inhibering av produksjonen av det intracellulære amyloid-APi42-peptid. B) Kontroll av ekspresjonen av SecPS2NT ikke influerer på ekspresjonen av forskjellige transgener. Figur 14: Detektering av interaksjonen av PS2 med endogent APP av COS-celler ved hjelp av farmakologisk behandlet med lactacystin. Figur 15: Interaksjon av PS2 og PS2NT med et annet område av APP, forskjellig fra

peptidet Ap.

Materiell og metoder

A. MATERIELL

1. Konstruksjoner som uttrykker presenilinene

Oppnåelsen av ekspresjonsvektor (vertsvektor, pcDNA3, InVitrogen) i mammifære celler av humantproteinene PSI og PS2 er beskrevet tidligere (Pradier et al., 1996). Flere suksessive delesjoner ved C-term-enden av PS2 har vært generert (se figur IA). Nummereringen skjer fra initieringskodonet av PS2 som posisjon 1.

Restriksjonsfragmentet Hindlll av vektoren PS2 (fra den 5'-ikke-kodende posisjon -55 til det interne sete ved posisjon 1080) har vært renset og bragt til ligering med vektoren pcDNA3, linearisert med Hindlll og behandlet med alkalifosfatase. Det tronkerte PS2 som fremstilles på denne måte (PS2AC1) løper fra den N-terminale ende til rest 361 pluss 7 rester bragt til ved 3'-enden og således omfattende de første seks transmembranære domener og en stor del av den hydrofile sløyfe (figur IA).

PS2AC2 har vært konstruert ved digestering av plasmid PS2 med Pstl (internt sete ved posisjon 679) og ligering med det tilsvarende fragment Pstl til den ikke-kodende 3'-del av vekten PS2. Det tronkerte protein PS2AC2 løper fra posisjon 1 til resten 228 av PS2 pluss 18 supplementære rester tilveiebragt av enden 3'. Den inkluderer de fire første transmembranære domener av PS2.

En tilsvarende konstruksjon er gjennomført for PS2 som bærer mutasjonen N141I, PS2AC2<*>. ;Restriksjonsfragmentet Hindlll (-55)/MscI(590) av kontraksjonen PS2AC2 er derefter blitt klonet i vektoren pcDNA3 behandle med Hindlll og således er Apal-enden gitt frisk spiss. Denne konstruksjon PS2AC3 forløper fra N-term-enden av resten 198 pluss 2 ytterligere rester og omfatter således de tre første transmembranære domener av PS2. ;Restriksjonsfragmentet av PS2AC2, Hindlll (-55/NcoI(504) som er gjort frisk ved Ncol-enden ved behandling med Klenow-rfagmentet av DNA-polymerase er reklonet i den samme vektor pcDNA3 Hindlll//Apal med frisk spiss) for å konstruere PS2AC4 som forløper helt til resten 158 av PS2 pluss 3 ytterligere rester. ;Konstruksjonen av den hydrofile, N-terminale ende av PS2 er oppnådd ved forsterkning av sekvensen PS2 med oligonukleotider ext5': (som omfatter den opprinnelige ATG i fet skrift og innfører et understreket restriksjonssete EcoRI), og ext3': ;(som innfører et stoppkodon efter resten 90 av PS2 samt et understreket restriksjonssete Xhol). ;Efter kloning i vekten pCRII ved TA-klonemetoden (InVitrogen) verifiseres konformi-teten av fragmentet av PCR ved sekvensering. Dette fragment (EcoRI/XhoI) innføres derefter i en vektor pcDNA3 i fase med en sekvens tilsvarende epitopen mye ved dennes N-terminale ende: mycPS2Nter. ;For ikke å prejudisere topologien av PS2, er det samme fragment Nter reklonet i vektoren pSectagB i fase med sekvensen av peptidsignalet av IgkB for å styre sekresjonen av proteinet pS2Nter: SecPS2-Nter. C-term-enden av PS2 er konstruert på tilsvarende måte ved hjelp av restriksjonsfragmentet Hindlll (1080)/PstI (ved ikke-kodende 3'), omklonet i vektoren pSecTagB Hindlll/Pstl, SecPS2Cter som løper fra rest 361 til den C-terminale ende, eller i vektoren pcDNA3myc i fase med myc-epitopen. ;Videre er en tronkert konstruksjon av PSI oppnådd. Vektoren pcDNA3-PSl er digerert med Pflml (sete ved posisjon 636 av nukleinsekvensen som koder PSI) og Xhol i den ikke-kodende 3' av sekvensen av PSI. Disse seter har vært transformert til spisse ender ved behandling med polymerase DNA T4. Vektorfragmentet, renset på agarosegel, ble religert på seg selv for å gi en ekspresjonsvektor for en tronkert PSI som forløper fra N-ter av PSI til resten Ile213 (efter det 5. transmembranære domenet) pluss 12 supplementære rester. Denne konstruksjon tilsvarer kimen AC2 og kalles PSI AC2. ;2. Konstruksjon som uttrykker APP ;2.1. APP- konstruksjoner ;De forskjellige komplette APP-konstruksjoner (isoform 695) og SPA4CT (de 100 siste rester av APP (aminosyre 597-695) som foregås av et signalpeptid for innføring i membraner) er tidligere nevnt (Dyrks et al., 1993). Vektorene, for ekspresjon av Cl00 og det cytoplasmiske domenet av APP, er oppnådd på følgende måte: cDNA'er har vært oppnådd ved enzymatisk forsterkning av DNA (PCT (polymerasekjedereaksjon)) under anvendelse av de følgende oligonukleotider som syntesesonder: for C100: oligonukleotidene 8172 til 8181; for det cytoplasmiske området av APP: oligonukleotidene 8171 til 8181. ;inneholder ;- et gjenkjennelsessete for restriksjonsenzymet Bglll (understreket) ;- sekvensen som koder for aminosyrene 597-602 av APP (i fet skrift) [nummerering av APP på 695 aminosyrer]. ;inneholder ;- et gjenkjennelsessete for restriksjonsenzymet Noti (understreket) ;- den komplementære sekvens til sekvensen som koder for aminosyrene 691-695 av ;APP (i fet skrift) [APP-nummerering på 695 aminosyrer]. ;- sekvensen komplementær til sekvensen Asp-Tyr-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys tilsvarende epitopen FLAG (i italique). ;inneholder ;- et gjenkjennelsessete for restriksjonsenzymet Bglll (understreket) ;- sekvensen som koder for aminosyrene 650-655 av APP (i fet skrift) [APP-nummerering på 695 aminosyrer]. ;Produktene fra den enzymatiske forsterkning av DNA er klonet i vektoren pCRII. Nukleotidsekvensen er verifisert ved metoden med spesifikke terminatorer av DNA. ;cDNA'ene er derefter innført ved ligering i ekspresjonsplasmidet avledet fra plasmid pSV2 og, i den samme leseramme, inneholdende en MYC-epitop. ;2.2. Konstruksjon av oppløselige former av APP: a- sAPP og fi- sAPP cDNA'er som tilsvarer de utskilte former av APP som slutter ved a- og P-spaltings-setene er oppnådd ved PCR. ;Oligonukleotid 1: ;;- en stoppkodon (understreket invers komplementær sekvens) efter posisjon 1788 av ;APP tilsvarende p-spaltingssetet, og ;- et restriksjonssete Clal. ;Oligonukleotid 2: ;;- en stoppkodon (understreket invers kokmplementær sekvens) efter posisjon 1836 av ;APP tilsvarende a-spaltingssetet, og ;- et restriksjonssete Clal. ;Oligonukleotid 3: ;;felles for de to former, tilsvarer området 1583 til 1600 av APP inkludert det interne restriksjonssetet av APP SacI (understreket). ;cDNA til APP ble amplifisert ved hjelp av PCR ved bruk av parene oligo-3-oligo-l og oligo-3-oligo-2 for henholdsvis P-sAPP og a-sAPP. De amplifiserte produktene ble subklonet som tidligere i pCRII og sekvensene verifisert ved sekvensering. For hver ble restriksjonsfragmentet Sacl-Clal renset og reklonet i ekspresjonsvektoren APP (se ;ovenfor) som også styres ved Sacl-Clal for å erstatte C-terminalpartiet i APP med C-terminalfragmentene til henholdsvis P-sAPP og a-sAPP og rekonstituere de komplette proteinene. ;3. Baculovirus-konstruksjoner ;Oppnåelsen av en overføringsvektor for baculovirus som koder for et humane PSI er oppnådd fra en ekspresjonsvektor for mammifære celler (Pradier et al., 1996). cDNA'et som koder for proteinet PSI ble ekstrahert ved en digestering med restriksjonsenzymene Xhol og Noti og så klonet inn i overføringsplasmidet pAcHTLB (6 histidiner-fusjons-proteinet) og pAcSG2 (nativt protein). Oppnåelsen av rekombinante baculoviruser skjer i henhold til leverandørens protokoll (Pharmingen) og består i å kotransfektere 2 x IO<6 >insektsceller (sf9) med 1 \ xg av overføringsplasmidet inneholdende genet av interesse og 0,5 ug viral DNA (Baculogold). Efter 5 dager ved 27°C blir cellene skrapet og så sentri-fugert og supernatanten benyttes som viralt forråd for forsterkning og bestemmelse av den virale titer, idet ekspresjonen av proteinet visualiseres ved western blot på den cellulære pute. ;Oppnåelsen av baculovirus som uttrykker human APP (695) er beskrevet tidligere (Essalmani et al., 1996). ;For studiet av ekspresjonen av PSI og APP blir sf9-celler koinfektert til en M.O.I. på 2 med baculoviruser som uttrykker human APP (695), det humane protein presenilin 1 eller PSI med en 6 histidin-tag ved N-terminalen (6HisPSl) eller kontrollproteinet av Pseudomonas putrida XylE med en 6 histidin-tag ved N-terminalen (6HisYylE), og oppløseliggjøres så med en buffer Tris 10 mM, NaCl 130 mM, Triton X100 1%, NP 40 1%, pH 7,5. ;De oppløseliggjorte proteiner immunoprecipiteres med et anti-histidin-antistoff (A), antiPSl (1805) (B), eller antiAPP (22C11) (C). Nærværet av APP eller PSI påvises ved western blot med antiAPP aCT43-antistoff (A), 22C11 (B) eller antiPSl 95/23-antistoff ;(C). ;De oppløseliggjorte fraksjoner inneholdende APP, PSI eller 6HisPSl blandes og ;immunoprecipiteres så i nærvær av anti-histidiner-antistoff eller antiPSl-antistoff over natten ved 4°C. Koimmunoprecipitering av APP påvises ved western blot med antistoffene aCT43 eller 22C11. ;4. Plasmidene ;Plasmidene som benyttes ifølge oppfinnelsen er de følgende: ;- pcDNA er et kommersielt plasmid (InVitrogen) som benyttes for kloning og ekspresjon av mammifære celler med sekvensene PSI og PS2 og deres tronkerte former. - pCRII er et kommersielt plasmid (InVitrogen) som benyttes for kloning av PCR-fragmenter. - pSecTagB er et kommersielt plasmid (InVitrogen) som benyttes for kloning og ekspresjon i mammifære celler av cDNA hvor til det er føyet et sekresjonssignal (signalpeptid lg k). - pSV2 er et kommersielt plasmid fra Pharmacia som benyttes for kloning og ekspresjon i mammifære celler av cDNA. - pAcHTLB er et kommersielt plasmid fra Pharmingen for innføring av en epitop (His)6 i cDNA'er og homolog rekombinasjon med baculoviruser. - pAcSG2 er et kommersielt plasmid fra Pharmingen for homolog rekombinasjon med baculoviruser. - pET29a er et kommersielt plasmid fra Novagen for ekspresjon av cDNA i bakterier. ;B. METODER ;1. Transfeksjon av celler ;Metoden som er etablert for COSI- eller CHO-celler består i å benytte en lipofektant i et forhold på 1:8 vekt:vekt i forhold til DNA og et syntetisk peptid Hl (sekvens: KTPKKAKKPKTPKKAKKP) i det samme forhold for å optimalisere kompakteringen av DNA og transfeksjonseffektiviteten. Denne metode er særlig basert på nøytralisering av ladningene i fosfatene i DNA med lipofektantens positive ladninger. ;COSI-cellene dyrkes i inkubator ved 37°C, 95% fuktighet og 5% C02 i DMEM-medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) inneholdende 4,5 g/l glucose (Gibco-BRL) supplert med 3% L-glutamin, 1% penicillin-streptomycin og 10% føtalt kalve-serum. ;Dagen før transfeksjonen blir cellene sådd ut i en densitet av 2,5 x IO6 celler pr. skål på 100 mm. Transfeksjonsdagen skylles cellene to ganger med PBS (fosfatbuffersaltopp-løsning) og en gang med OptiMEM (patentert blanding, Gibco-BRL) for en habituering på minst 15 minutter i inkubator. ;Pr. ekvivalentskål på 100 mm, tilsettes det totalt 8 ug plasmidisk DNA til 300 ul OptiMEM og 64 fig peptid Hl. Efter vorteksering i 10 sekunder, venter man i 5 minutter og så tilsettes lipofektamin (32 ul, det vil si 64 Lig), fortynnet i 300 ul OptiMEM, til den oppnådde blanding. Det hele vortekseres nok en gang heftig og man setter det hen i 30 minutter. 5 ml OptiMEM tilsettes pr. rør og den vortekserte blanding plasseres på cellene (der mediet på forhånd er beluftet). Cellene plasseres så i inkubator i 4 timer i løpet av hvilket blandingen erstattes med komplett medium. ;2. Lysering av cellene og bestemmelse av proteinene ;Cellene blir som regel lysert 48 timer efter transfeksjonen (vanlig maksimum av ekspresjonen). Lyseringsbuffer inneholdende 10 mM Tris pH 7,5, ImM EDTA, 1% Triton XI00,1% NP40 og en proteaseinhibitorcocktail (Complete©, Boehringer-Mannheim). For hver plate tilsettes, efter en skylling med PBS, 800 ul kold buffer. Lysatene underkastes så en sonikering fulgt av en omrøring med magnetstav ved 4°C over natten. En sentrifugering i 30 minutter ved 15 000 omdr./min. skiller kaken fra supernatanten. De oppløselige proteiner bestemmes så ved hjelp av en BCA-kit (Pierce) for å normalisere de etterfølgende forsøk. ;3. Immunoprecipiteringer ;Antistoffer, rettet mot peptidet av N-term av PS2, 95041, (Blanchard et al., 1997) og ;mot de 20 første aminosyrer av PSI (Duff et al., 1996) oppnås fra kaniner ved immunisering med syntetiske peptider. For immunoprecipitering blir 100 ug proteiner fortynnet i 400 ul modifisert RIPA (150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 8,0,1% Triton X100 v/v, 1% NP40 v/v). 30 ul suspensjon av protein A Sepharose (0,1% m/v i oppløsning i PBS) og 3 ul antistoff tilsettes. Suspensjonen blandes forsiktig i en rotasjonsrører ved 4°C over natten. Komplekset av protein A Sepharose vaskes tre ganger med 0,5 ml modifisert RIPA og en gang med 0,5 ml vaskebuffer "Wash C" (10 mM Tris, pH 7,5). ;4. Immunooverføring ;Prøvene (lysater av celler) denatureres i et likt volum forrådsbuffer (125 mM Tris pH 6,8,4% m/v SDS, 20% glycerol, 0,02% bromfenol blått, 50 mM ditiotreitol) ved 95°C i 5 minutter. For analyse av ekspresjonen av presenilinene, blir prøvene denaturert i nærvær av 8M urea og ved 37°C for å unngå egenaggregering av presenilinene ved 95°C. ;Prøvene avsettes på tris-glycingeler (Novex) med en varierende prosentandel akrylamid i henhold til molekylvekten som skal diskrimineres. En molekylvektsmarkør avsettes også (Broad Range, BioRad). Migreringen finner sted i rundt 2 timer ved 100 Volt konstant i en buffer SDS IX final (Novex). Gelen overføres derefter på en membran av nitrocellulose eller PVDF (overføringsbuffer IX final (Novex) med 10% metanol) i 2 timer ved 150 mA konstant. ;Efter overføring blokkeres membranen i 2 timer ved omgivelsestemperatur i 50 ml PBS-T (PBS med 0,5% Tween) inneholdende 2% avfettet melk (Merck). Primær-antistoffet (fortynnet til optimal konsentrasjon i størrelsesorden l:1000e til l:5000e i PBS-T med eller uten 2% avfettet melk) settes hen over natten ved 4°C. Efter en kort skylling med PBS-T inkuberes membranen i 45 minutter i nærvær av det andre antistoff (anti-muse- eller anti-kanin-IgG alt ettersom, koblet til Raifort-peroksydase) fortynnet til 1:5000e i en buffer kalt "ECL" (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, Tween 0,1 %). ;Membranen skylles så i 4 x 15 minutter i "ECL"-bufferen. Den kan så bestemmes ved ECL-reaktant (Amersham) bestående av to buffere som blandes umiddelbart før bruk i like volumer. Forskjellige eksponeringer med fotografisk film (Hyperfilm ECL, Amersham) gjennomføres fulgt av fremkalling. ;5. Fiksering in vitro av PS2NT med amyloidpeptid Ap ;5.1. Produksjon av det rekombinante protein PS2NT i bakterier ;For å oppnå en bakterieekspresjonsvektor av PS2NT (aminosyrene 1 til 87) blir cDNA av PS2 forsterket ved PCR med oligonukleotidene: ;Det resulterende ;fragment klones i pCRII og sekvensen bekreftes. Dette fragment subklones derefter i vektoren pET29a (Novagen) i fase med sekvensen av etiketten S-tag. Proteinet fremstilles i bakterien BL21. Efter induksjon med IPTG i 5 timer, gjenvinnes bakteriene ved sentrifugering (10 minutter ved 6000 omdrVmin.) og celleklumpen oppløses i RIPA-buffer (beregnet volum ved å multiplisere OD for kulturen efter induksjon med volumet ;av kulturen dividert med 23). Bakteriene lyseres ved sonikering og lysatet sentrifugeres ved 13 000 omdr./min. i 20 minutter ved 4°C. Supernatanten (totalekstrakt) benyttes for fikseringsstudiene. ;Det rekombinante protein PS2NT ble også renset ved total ekstrahering på en Nickkel-kolonne (poly-His-etikett bragt i vektoren pET29a) som beskrevet av leverandøren (No vågen). ;5.2. Test av fiksering PS2NT/ A/ M2 på nitrocellulosemembranen ;Syntetisk AP-peptid (i oppløsning) avsettes på nitrocellulosemembranen (Schleicher og Schuell) ved å benytte en dot-blot-apparatur på 96 brønner. Efter avsetning blokkeres filteret (mot ikke-spesifikke seter for fiksering av proteiner) med en gelatinblokkreak-tant (Novagen) fortynnet i 10. i TBST. Efter blokkering erstattes filteret med dot-blot-apparaturen og bakterieekstrakten PS2NT tilsettes i brønnene for en inkubering på 2 timer ved omgivelsestemperatur. Som kontroll benyttes det en bakterieekstrakt inneholdende det tomme plasmid pET29 i brønnene i duplikat. Filteret vaskes derefter en gang med RIPA-buffer, og trekkes så ut fra apparaturen og vaskes tre ganger med PBST (15 minutter for hver vasking). Detekteringen av S-tag-etiketten skjer derefter som beskrevet av leverandøren (Novagen) med et kolorimetrisk substrat. Kvantifisering av den kolorimetriske reaksjon (precipitat) gjennomføres ved optisk scanning av filteret og kvantifisering av intensiteten i hver brønn med programmet Tina 2.1 (Raytest). ;5.3. Interaksjonstest PS2NT/ A042 i ELISA- format ;Syntetisk peptid Ap (1-40 og 1-42) (100 ul, 2 ug/ml) inkuberes over natten på 96 brønners plater for fiksering på plasten. Platene skylles to ganger med PBS og ikke-spesifikke fikseringsseter mettes ved inkubering med 5% (vekt/volum) kalveserum-albumin av PBS. Det rensede, rekombinante protein (i henhold til den protokoll som er beskrevet under 5.1), PS2NT, fortynnet med buffer (25 mM Tris/HCl, pH 7,5, 0,5% Triton X-100, 0,5% NP40) tilsettes og inkuberes i 4 timer ved omgivelsestemperatur. Efter to skyllinger med PBS-Tween 0,5%, blir proteinet PS2NT som er holdt tilbake på platen (i interaksjon med peptidet AP) fastslått ved inkubering med fikserende protein av S-Tag koblet til alkalifosfatase som ovenfor. Detekteringen av signalet gjennomføres i et spektrofotometer ved 450 nm. ;5.4. Interaksjonstest PSNR/ A/ 3J- 42 i format HTRF (Homogeneous Time-Resolved Fluorescence) ;Det rensede protein PS2NT (produkt i henhold til protokollen som beskrevet under 5.1) merkes ved hjelp av fluoroforen Europium-kryptat (PS2NT-K). Peptidene APi_4o og syntetiseres med et biotin og en skillearm på 3 P-alaniner (eller 3 lysiner) fra den N-terminale ende (oppstrøms posisjon 1 av AP-peptidene) og to argininer (R) ved den C-terminale ende for å lette syntesen, peptidene biot-3K-ApORR og biot-3K-Ap42RR. ;Interaksjonsreaksjonen med PS2NT-K og biot-Ap40 eller biot-Ap42 gjennomføres i en buffer 10 mM HEPES, pH 7,2, inneholdende 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA og 3 mM CHAPS (detergens). Det merkede protein PS2NT (sluttkonsentrasjon 6 nM, det vil si 40 ul initialoppløsning med 15 nM) inkuberes med peptid biot-AP40 eller biot-AP42 (sluttkonsentrasjon 2 uM, det vil si 40 ul initialoppløsning på 5 uM og 20 ul buffer) i 10 minutter, fulgt av tilsetning av XL665-merket streptavidin (XL665 er et fornettet allo-fycocyanin fra CisBio Internation) til en konsentrasjon på 8 ug/ml (det vil si 100 ul initialoppløsning av 16 ug/ml) i en HEPES-buffer 100 mM pH 7,0, inneholdende 400 mM KF, 133 mM EDTA og 1 g/l BSA. Reaksjonen inkuberes enten i 4 timer ved omgivelsestemperatur eller i 24 timer ved 4°C og platene avleses under en Packard Discovery-teller som måler på den ene side emisjonen av Europium-kryptat ved 620 nm efter eksitering ved 337 nm og på den annen side emisjonen av XL665 ved 665 nm efter overføring av fluorescens ved 620 nm fra Europium-kryptat på XL665. Dannelsen av komplekset XL665-streptavidin/biot-Ap42/PS2NT-kryptat fører til en fluorescens-overføring fra kryptat mot XL665 som måles av telleren ved 665 nm. I fravær av dannelsen av et kompleks XL665-streptavidin/biot-Ap42/PS2NT-kryptat, fluorescerer Europium-kryptat ved 620 nm. ;EKSEMPLER ;Eksempel 1. Interaksjon mellom APP og PS2 og kartograf! av interaksjonssonen ;på PS2 ;Dette eksempel har til formål å bestemme interaksjonssonen på PS2 ved å påvise en interaksjon mellom området og APP. ;Interaksjonen mellom proteinene APP og PS2 i mammifære celler er eksemplifisert i figur 2. Lysatet av COS-celler transfektert med PS2 og APP underkastes en immunoprecipitering med et antistoff rettet mot N-term av PS2 (95041, Blanchard et al., 1997). Immunoprecipitatet analyseres derefter ved immunooverføring med et antistoff mot APP. APP detekteres tydelig i immunoprecipitatene av celler kotransfektert med APP og PS2, men ikke i fravær av PS2 (figur 2, spor 6 i forhold til spor 7) som beskrevet tidligere (Weidemann et al., 1997). For å kartlegge interaksjonen mellom disse to proteiner, konstrueres det flere tronkerte former av PS2. For å bevare membrantopolo-gien av PS2 som er bestemt generelt ved N-term-delen av de membranære proteiner produseres progressive tronkasjoner av C-term-enden av PS2 og som slutter efter forskjellige transmembranære områder TM6 (PS2AC1), TM4 (PS2AC2), TM3 (PS2A C3) og TM2 (PS2AC4), skjema figur IA. Den hydrofile N-term-ende (87 rester) av PS2 konstrueres også i cytoplasmisk form (nativ sekvens) eller i sekretert form ved innføring av signalpeptidet av Igk-kjeden. Ekspresjonen av disse forskjellige former eksemplifi-seres i figur IB, fremkalt ved hjelp av antistoffet anti-PS2 (95041). Konstruksjonene som har hydrofobe områder oppviser i tillegg bånd tilsvarende monomere former med ventede molekylvekter (her under dannelse av til nærmede dubletter), dimere former og aggregater med karakteristiske høye molekylvekter av PS2 (figur IB, spor 3-5). Særlig for komplett PS2 er kun disse aggregater detekterbare i denne figur, mens monomer-formen ikke er detekterbar (spor 6). De to konstruksjoner av den hydrofile N-term av PS2: mycPS2Nt og SecPS2Nt gir opphav til bånd med ventede molekylvekter (figur IB, spor 1 og 2). Konstruksjonen SecPS2Nt utskilles likeledes i ekstracellulært medium (figur 3B, spor 2), mens konstruksjonen mycPS2Nt er cytoplasmisk. ;Konstruksjonene kotransfekteres individuelt med APP. Den detergensoppløselige fraksjon av cellelysatene immunoprecipiteres med antistoffet rettet mot N-termen av PS2 og disse immunoprecipitater analyseres ved immunoblot. Som med komplett PS2, er APP detekterbar i immunoprecipitatene med alle de tronkerte former av PS2, PS2 AC2 til PS2 AC4 (figur 2, sporene 3-5), noe som viser interaksjon mellom APP og formene inneholdende N-termen av PS2. Denne interaksjon med APP bevares med konstruksjonen N-term av PS2 i sekretert form (figur 2, spor 2), noe som viser at forandringen av PS2Nt i det lipidiske membran ikke er nødvendig for denne interaksjon. I motsetning interagerer ikke den cytoplasmiske form mycPS2NT med APP (figur 2, spor 1). ;Forsøk med immunoprecipitering med et antistoff anti-APP og detektering med antistoff N-term av PS2 tillater å bekrefte interaksjonen mellom APP og SecPS2Nt under forskjellige eksperimentelle betingelser. ;I kulturmediet av celler kotransfektert med APP og SecPS2Nt vises likeledes en interaksjon mellom disse to proteiner ved koimmunoprecipitering (figur 3 A, spor 4 og figur 3B, spor 3). Formen mycPS2NT interagerer ikke med APP i mediet (figur 3B, spor 2). Nærværet av denne interaksjon i mediet viser at komplet APP/PS2Nt er relativt stabilt under sekresjonsprosessen. ;Eksempel 2. Interaksjon mellom APP og PS2 og kartlegging av interaksjonssonen ;på APP ;Dette eksempel har til formål å bestemme interaksjonssonen hva angår APP og å påvise en interaksjon mellom området og presenilin 2. ;For dette formål blir tronkerte former av APP benyttet for å begrense interaksjonssonen på APP. En konstruksjon som omfatter de 100 siste rester av APP under eventuell kontroll av et sekresjonspeptid (SPA4CT og Cl00, Dyrks et al., 1993) og en konstruksjon som kun omfatter det cytoplasmiske domenet (de 45 siste rester av APP) benyttes og deres nærvær detekteres ved hjelp av et antistoff rettet mot det cytoplasmiske domenet av APP (aCT43, Stephens og Austen, 1996). I cellene som er kotransfektert med PS2, har man kunnet påvise en interaksjon av SPA4CT, men ikke av det cytoplasmiske domenet av APP med PS2 (figur 4A, sammenlign sporene 4 og 5). Interaksjonen av PS2 med konstruksjonen Cl00 (uten sekresjonssignal) er også påvist (figur 4B, spor 7). Selv ved å kombinere det cytoplasmiske domenet av APP med membranen i en kimer konstruksjon med reseptoren a av IL2, kan ingen interaksjon med PS2 observeres. Dette eksempel viser at det eksisterer en interaksjon med SPA4CT (restene 597 til 695 av APP), men ikke det cytoplasmiske domenet (restene 651 til 695), noe som således antyder at på APP er området Ap (restene 597 til 637) og resten av det transmembranære segment (helt til rest 650) tilstrekkelig for interaksjon med PS2. ;Eksempel 3. Interaksjon mellom PSI og APP og initialkartlegging ;Dette eksempel har til formål å bestemme interaksjonssonen på PSI og å validere interaksjonen mellom dette området og APP. ;I analogi til resultatene som oppnås for PS2 (eksemplene 1 og 2) realiseres studien av interaksjonen mellom PSI og APP i det samme COSI-cellesystem. Efter koimmunoprecipitering med et antistoff rettet mot de 20 siste aminosyrer fra PSI (Duff et al., 1996), har SPA4CT, det C-terminale fragment av APP, kunnet detekteres i precipitatene (figur 5A, spor 4). APP interagerer også med PSI. På samme måte interagerer den tronkerte form av PSI, PSI AC2(1-213) med APP (figur 5B, spor 4). Disse første verdier tillater å ta sikte på at interaksjonsområdene mellom APP og PSI må være naboer til de som er eksemplifisert tidligere med PS2. ;For å verifisere validiteten og generaliteten av denne interaksjon PSI/APP, har det vært benyttet et annet cellesystem i hvilket insektscellene er infektert med rekombinante baculoviruser som uttrykker PSI med eller uten etiketten His6 og APP (jevnfør Materiell og Metoder). Et studium av cellelysatene har tillatt å detektere APP i antiHis6-immunoprecipitatene (for PSl-His6, figur 6A, spor 4) eller antiPSl (for PSI med eller uten His6, figur 6B, spor 4 og 5) når cellene koinfekteres med de to typer rekombinante viruser, men ikke når et enkelt av proteinene eksprimeres (de tilsvarende spor 1,2 og 3). Derimot er proteinene PSl-His6 og PSI detekterbare (figur 6C, sporene 4 og 5) i immunoprecipitatene anti-APP for doble infeksjoner. Dette forsøk tillater å bekrefte interaksjonen på omvendt måte med forskjellige antistoffer. ;Eksempel 4. Interaksjon mellom Ap og PS2 i celler ;Gitt at interaksjonsområdet mellom APP og PS2 på APP implikerer et område som inkluderer amyloidpeptidet (fra 595 til 635) og på PS2, dets hydrofile N-term-domenet, er det i dette forsøk vist at dette sistnevnte interagerer direkte med amyloidpeptidet AP som produseres av cellene. Ekspresjonen av SPA4CT (tilsvarende de 100 siste rester av APP foregått av et signalpeptid) i COS-celler fører til en sterk produksjon av amyloidpeptidet, delvis fordi SPA4CT anses som den biologiske forløper for Ap. COS-cellene transfekteres med SPA4CT alene, SPA4CT og SecPS2Nt eller med SecPS2Nt alene. De tilsvarende ekstracellulære medier immunoprecipiteres med antistoffet antiPS2 og peptidet Ap detekteres ved hjelp av det spesifikke antistoff W02 (Nida et al. (1996), "J. Biol. Chem.", 271,22908-914) (figur 7). Peptidet Ap identifiseres kun for celler kotransfektert med SecPS2Nt og SPA4CT som et bånd med liten intensitet (figur 7, spor 1), men ikke med de individuelle kontroller (sporene 2 og 3). Videre er et supple-mentært bånd på ca. 40 kDa også detektert på spesifikk måte for de dobbelttransfekterte celler. Efter vasking av filteret og detektering med antistoffet PS2, synes det som om kun et bånd med samme molekylvekt likeledes er PS2-immunoreaktivt (figur 7, spor 4). Dette bånd er også til stede for celler transfektert med SecPS2Nt som ventet. I cellene som er dobbelttransfektert representerer således dette bånd et SDS-kompleks som er stabilt mot SecPS2Nt og Ap og kan bekrefte interaksjonen mellom disse to entiteter. Den lave differanse av massen som bringes av peptidet Ap (4 kDa) forklarer det ikke er noen detekterbar størrelsesforskjell mellom de transfekterte celler og kun SecPS2Nt. Resultatene fra disse forsøk tillater å trekke konklusjonen at den sekreterte form av PS2 (secPS2Nt) interagere in vitro med peptidet Ap (restene 597-637 av APP695). ;Eksempel 5. Rekonstitusjon av interaksjonen av AP og PS2Nt i test in vitro på ;nitrocellulosemembraner ;Dette eksempel har til hensikt å vise rekonstitueringen av interaksjonen PS2Nt-APP(AP) in vitro. ;For å bekrefte interaksjonen mellom peptidet Ap og PS2Nt (N-terminal ende av PS2) ble det utviklet en fikseringstest in vitro. Et fusjonsprotein PS2Nt med peptidetikett/ markør S (S-tag) ved den N-terminale ende konstrueres og uttrykkes i bakterie. Peptidene Ap mo og Ap i-42 avsettes på nitrocellulosemembraner som er inkubert i nærvær av en bakterieekstrakt som uttrykker proteinet PS2Nt. S-tagen påvises derefter av fikseringsproteinet av S-tag koblet til alkalisk fosfatase og ved kolorimetrisk reaksjon. Proteinet S-tag-PS2Nt fikserer seg godt til Ap-peptider i in vitro-testen (figur 8A). Som kontroller ble duplikater inkubert i nærvær av en bakterieekstrakt som ikke uttrykker annet enn peptidet S som benyttes som ikke-spesifikt fikseringsnivå på peptidet AP (formene 1-40 og 1-42). Seriefortynninger av bakterieekstrakten tillater å fastslå at denne fiksering er dosisavhengig og mettbar. I dette forsøk synes fikseringen å være mer betydningsfull på APm2 enn på Ap mo med imidlertid en viss variabilitet. For eksempel er fikseringen av PS2Nt avhengig av dosen av Ap som avsettes på membranen, mens Ap mo og APm2 oppviser ekvivalente fikseringsverdier. ;Dette eksempel gir således en påvisning av rekonstitueringen av interaksjonen PS2Nt-APP(AP) in vitro mellom syntetisk Ap og PS2NT av bakteriell opprinnelse. Forutsatt at de patologiske mutasjoner av PS2 fører til en økning av forholdet APm2: AP mo i de tallrike systemer og at det videre er fysisk interaksjon mellom PS2 og APP, synes det som om denne fysiske interaksjon kan være implikert i produksjonen av peptidet APm2-Således anses inhiberingen av denne interaksjon som en ekstremt original terapeutisk til nærming for Alzheimers sykdom. ;Eksempel 6. Interaksjonstest Ap42/PS2NT i 96 brønners format (av typen ;ELISA). Figur 11 ;Eksempel 5 gir resultater som direkte viser interaksjonen mellom peptidet Ap og proteinet PS2NT på nitrocellulosemembran. Dette eksempel har til hensikt å bekrefte informasjonen i eksempel 5 og å beskrive påvisningen av interaksjonen i et 96 brønners format. Peptidet Ap (AP40 eller Ap42) fikseres ved inkubering på 96 brønners plast-plater. Platene inkuberes derefter med rekombinant protin PS2NT. Efter skylling skjer detekteringen av interaksjonen (Ap/PS2NT) med fiksering av fikseringsproteinet av S-tag i brønnene og kolorimetrisk påvisning. PS2NT fikserer seg på dosisavhengig måte på peptidet A|3m2 (figur 11), men ikke på peptidet APmo eller på det inverse sekvens-peptidet Ap40-1 og heller ikke på et annet amyloidogent peptid, amylin. Mengdene av peptidene APm2 eller Ap mo som er fiksert på platene er identiske slik det verifiseres ved immunodetektering. Fikseringskonstanten av PS2NT på Ap42 er 0,18 uM. Spesifisiteten for PS2NT for formen Ap42 av peptidet i forhold til Ap40 er ikke antydet i eksempel 5. Dette eksempel fastslår at denne spesifisitet er absolutt reproduserbar i den herværende test. ;Dette interaksjonstestformat for AP42/PS2NT tillater således å ta sikte på en lett test for avsøking av molekyler som inhiberer denne interaksjon. ;Eksempel 7. Test av interaksjonen AP42/PS2NT i HTRF-format ;I eksemplene 5 og 6 er den direkte interaksjon mellom peptidet Ap42 og proteinet PS2NT påvist på den ene side på nitrocellulosemembranen og på den andre side på 96 brønners plater (ELISA-typen). ;Dette eksempel har til formål å bekrefte disse informasjoner og beskriver påvisningen av interaksjonen i flytende/homogen fase under anvendelse av fluorescensoverførings-teknikken. ;Hovedprinsippet av testen er beskrevet i Materiell og Metoder (5.4) og er basert på fluorescensoverføring. Det rekombinante protein PS2NT, merket med Europium-kryptat (PS2NT-K) interagerer med peptidet biot-Ap42 som vist i figur 12 (stolpe nr. 3). Dette signal reduserer og således forskyves interaksjonen PS2NT-K/biot-Ap42 av et over-skudd av ikke-merket PS2NT (Cl40 = 400 nM). Det detekterte fluorescenssignal er stabilt i tidsperioden 4 timer ved omgivelsestemperatur til 24 timer ved 4°C (i henhold til de valgte betingelser, beskrevet i Materiell og Metoder). ;Denne interaksjon er doseavhengig for peptidet biot-Ap42 (linearitetssone for signalet fra 0 til 2,5 uM) og for PS2NT-K (linearitetssone for signalet fra 0 til 7,5 nM). Som antydet i figur 12, stolpe nr. 5, er det ingen interaksjon av PS2NT-K med peptidet biot-AP40 som bærer et ytterligere spesifisitetselement. Spesifisiteten for PS2NT for formen Ap42 av peptidet i forhold til AP40 som ikke har vært nevnt i eksempel 5, bekreftes i eksempel 6 og i det foreliggende eksempel. ;Denne HTRF-test for interaksjon mellom PS2NT og Ap42 (som reflekterer interaksjonen APP/PS i celler) tillater således identifisering av kjemiske molekyler som inhiberer denne interaksjon, ved en avsøking ved høy fluks. ;Eksempel 8. Rekonstitueringen av interaksjonen APP/PS1 in vitro Dette eksempel har til formål å vise at interaksjonen mellom de komplette proteiner APP og PSI kan skapes igjen fra forskjellige cellelysater, kun blandet for å påvise interaksjonen. ;Baculovirusekspresjonssystemet tillater ekspresjon i store mengder av rekombinante proteiner og det benyttes lysater av celler som er infektert individuelt hver med tre ;vimser som kilde for proteinene APP, PSI og PSl-His6. De oppløseliggjorte fraksjoner inneholdende APP, PSI eller 6HisPSl blandes og immunoprecipiteres derefter i nærvær av et anti-histidin-antistoff eller antiPSl-antistoff over natten ved 40°C. APP detekteres tydelig i immunoprecipitatene (figur 9A, spor 3 og figur 9B, spor 3), noe som viser at interaksjonen APP med PSI-His eller PSI rekonstitueres in vitro ved inkubering av de to proteiner. APP alene synes å precipitere lite ved antistoffet anti-PSl (figur 9B, spor 1), men ikke med antistoffet anti-His, noe som bekrefter spesifisiteten for interaksjonen i den sistnevnte. Disse resultater tillater anvendelsen av en interaksjonstest in vitro for de to komplette proteiner APP og PSI. ;Eksempel 9. SecPS2Nt blokkerer interaksjonen av APP og PSI i transfekterte ;celler ;Det er i de foregående eksempler vist at APP interagerer med PSI på en måte lik PS2 og at for denne sistnevnte konstruksjonen SecPS2Nt er tilstrekkelig til interaksjon med APP. Dette eksempel har til formål å bedømme hvorvidt fikseringen av SecPS2Nt på APP kan blokkere interaksjonen med PSI på øket måte (heterolog). I systemet COSI kan SPA4CT (tilsvarende de 100 siste rester av APP, foregått av et peptidsignal) detekteres i anti-PSl-immunoprecipitater fra celler som uttrykker SPA4CT og PSlwt eller PSI mutant, PSI<*> (figur 10A, spor 1 og 2). Når videre SecPS2NT likeledes kotransfekteres, forsvinner signalet SPA4CT kvasi i anti-PSAl-immunoprecipitatene (figur 10A, spor 3 og 4). Efter anti-PSl-immunoprecipitering blir supernatantene (fraksjon som ikke er bundet til protein A Sepharose) underkastet en andre immunoprecipitering med antistoff anti-PS2. SPA4CT detekteres tydelig i celler kotransfektert med PSI og SecPS2Nt (figur 10B, spor 3 og 4), noe som viser at i disse celler fortrenger SecPS2Nt ved sin fiksering, fikseringen for SPA4CT på PSI. Dette forsøk tillater således å trekke den konklusjon at SecPS2Nt er et molekyl som er i stand til ikke bare å feste seg på APP, men også å fortrenge fikseringen av APP på PSI og sannsynligvis PS2. SecPS2Nt kan således i celler tjene til å blokkere interaksjonen APP med de to preseniliner PSI og PS2.1 realiteten bekrefter resultatene av kartleggingen av interaksjonen PS1/APP at interaksjonssonene som kommer i betraktning tilsvarer de til PS2.

Eksempel 10. Blokkering av interaksjonen APP/PS1 som fører til inhibering av

produksjonen av intracellulært peptidamyloid A(342.

Eksemplet foran viser at ekspresjonen av SecPS2NT kan blokkere interaksjonen mellom APP og PSI eller PSI mutant. Dette eksempel analyserer konsekvensen av denne inhibering på produksjonen av amyloidpeptidet, særlig de to former Ap40 og AP42. Således er det tidligere beskrevet i litteraturen at de patologiske mutasjoner av presenilinene (PSI eller PS2) fører til en økning av forholdet mellom den lange form av peptid, AP, formen Ap42, på formen Ap40, forholdet Ap42:Ap40 (Borchelt et al., 1996 for tidsskriftet "Hardy", 1997).

SPA4CT er koeksprimert med PSI wt (figur 13A, sporene 1 og 3) eller med PSI mutant (figur 13 A, sporene 2 og 4), enten i fravær (sporene 1 og 2) eller i nærvær av SecPS2Nt (sporene 3 og 4). Cellelysatene og de kondisjonerte cellemedier analyseres med hen-blikk på produksjon av amyloidpeptid. Formene Ap40 og AP42 analyseres ved immunoprecipitering med antistoffer som spesifikt gjenkjenner de terminale ender Ap40 (FCA3340) eller Ap42 (FCA3542, Barlelli et al., 1997), og immunoprecipitatene analyseres ved immunoblot med et antistoff som gjenkjenner de to former.

I cellelysatene fører ekspresjonen av PSI mutant til en økning av produksjonen av Ap42 (1,5 til 2 ganger) og av dennes multimere former i forhold til PSlwt og lite variasjon i mengden av Ap40 (sammenlign figur 13 A, sporene 1 og 2, platene AP42- og AP40-cellelysater) som ventet. I nærvær av SecPS2NT blir nivået av AP42 (og multimerer) betydelig redusert (figur 13A, sporene 3 og 4), så vel med PSlwt som PSI mutant. I det ekstracellulære medium synes nivået av AP42 også redusert, men på mindre betydelig måte. Det er ikke variasjoner i mengden av amyloidpeptid AP40 mellom de forskjellige betingelser, noe som viser at virkningen på AP42 er spesifikk og skyldes ikke noen total modifikasjon av ekspresjonsnivået. Dette bekreftes ved analyse av ekspresjonen av forskjellige transfekterte gener: SPA4CT, SecPS2NT og PSI (figur 13B). I dette eksempel er det således vist at inhibering av interaksjonen PSI/APP med genetisk dominant SecPS2NT fører til en reduksjon av nivåene av produksjonen av intracellulært AP42, så vel med PSI mutant som med PSI wt. Når det gjelder primordiale rolle, forbundet med AP42 i utviklingen av Alzheimers sykdom, tilveiebringer dette eksempel en påvisning at inhiberingen av interaksjonen APP/PS således representerer en betydelig terapeutisk mulighet både for de genetiske former som for de sporadiske former av sykdommen.

Eksempel 11. Detektering av interaksjonen av PS2 med APP, endogent til COS-cellene ved hjelp av en farmakologisk behandling

Dette eksempel har til formål å vise at de oppnådde resultater i de foregående eksempler (disse resultater i celler som tilsvarer overekspresjon av de to interaksjonspartnere APP og PS (PSI eller PS2)) er likeledes verdifulle med overeksprimerte eller endogene proteiner. Således kan den sterke overekspresjon av de to proteiner føre til en kunstig interaksjon. Detekteringen av interaksjonen under disse betingelser implikerer ikke at den samtidige overekspresjon av de to partnere er søkt i dette eksempel.

COS-cellene uttrykker APP på endogen måte om enn i lave nivåer. COS-cellene er således transfektert med kun PS2. Cellelysatene er analysert ved immunoprecipitering med antistoffer rettet mot peptidet av N-term av PS2 og bestemt ved immunoblotting med anti-APP-antistoffet, W02. Tavlen over figur 14 viser at transfeksjonen med kun PS2 ikke tillater å detektere interaksjon med endogent APP ved koimmunoprecipitering (figur 14, spor 1).

Fordi videre interaksjonen av APP/PS fører til produksjon av amyloidpeptidet A042 (foregående eksempel), således til katabolisme av APP, i endoplasmisk reticulum, kan proteasomet som er systemet av proteolytisk nedbrytning i dette cellulære rom være implikert. Virkningen av lactacystin, en selektiv proteasominhibitor, er analysert. Efter inkubering av celler transfektert med PS2 i nærvær av lactacystin, kan endogent APP i COS-celler klart påvises i immunoprecipitatene PS2 (figur 14, spor 5, bånd ved 110 kDa). Denne interaksjon med endogent APP oppviser de samme karakteristika som tidligere fordi den kan være fortrengt av den genetisk dominante SecPS2NT (figur 14, spor 6 og 7) med en doseavhengig effekt. Således viser spor 7 at ved en moderert dose av SecPS2NT er et bånd med svak intensitet tilsvarende endogent APP hele tiden syn-lig. Ved en høyere dose av SecPS2NT (spor 6) opptrer det tilsvarende bånd av endogent APP svakere og viser den doseavhengige karakter. Et svakt APP-restsignal er alltid til stede (bånd på rundt 110 kDa) og skyldes komplekset mellom APP og SecPS2NT som hurtig sekreteres (når SecPS2NT ikke har transmembrane forankringsdomener) og akkumuleres således ikke intracellulært.

Figur 14 (midtre og nedre tavle) viser at behandlingen med lactacystin ikke påvirker de totale APP-nivåer, cellulære som sekreterte. Således er båndene som tilsvarer ekspresjonsnivået for APP så å si konstant når det gjelder intensitet. Spesifisiteten av virkningen av lactacystin vises således på subpopulasjonen av APP i interaksjon med PS2.

Ved disse resultater har man kunnet vise at interaksjonen APP/PS2 kan detekteres med endogent APP fra COS-celler hvis proteasomet inhiberes. Videre viser disse resultater at interaksjonen APP/PS2 kan detekteres under mindre kunstige betingelser. Imidlertid er denne interaksjon meget labil. For således å oppnå en mer markert detektering, har man tydd til enten en proteolytisk nedbrytningsinhibitor i det foreliggende eksempel eller til overekspresjon av de to partnere i det foregående eksempel. Dette eksempel viser således at de oppnådde resultater i eksemplene ovenfor med overekspresjon i cellen av de to interaksjonspartnere (APP og PSI eller PS2) er like gyldige med ikke-eksprimerte eller endogene proteiner.

Eksempel 12: PS2 interagerer med et andre segment av APP, forskjellig fra AP Dette eksempel har til formål å vise at et annet segment av APP interagerer med PS2.

Det er tidligere vist at SecPS2NT interagerer i det ekstracellulær medium med sekreterte former av APP (figur 3A, spor 4). De sekretert former av APP frigis efter spaltingen enten ved P-setet (posisjon 595) tilsvarende begynnelsen av peptidet Ap, eller ved a-setet (posisjon 612) i det samme peptid. Disse resultater antyder at PS2NT interagerer også med et N-term-område av APP forskjellig fra Ap. De tronkerte former av APP konstrueres ved innskyting av stoppkodon i setene P (P-sAPP) og a (a-sAPP) og testes. Komplett PS2 og SecPS2NT interagerer effektivt med a-sAPP (figur 15, sporene 3 og 5) og P-sAPP (figur 15, sporene 4 og 6). Disse resultater fastslår at et segment av APP mellom posisjon 1 og 595 (og således forskjellig fra AP) likeledes er i stand til å interagere med PS2 og PS2NT. Disse resultater tillater videre å bekrefte at interaksjonen PS2NT/APP kan finne sted i fravær av forankring til membranen når det gjelder de to partnere og i luminalrommet (eller det ekstracellulære rom) av cellen.

Litteraturreferanser

- Doan et al. (1996), "Protein topolygy of presenilin 1", "Neuron", 17,1023-1030.

- Thinakaran et al. (1996), "Endoproteolysis of Presenilin 1 and accumulation of processed derivatives in vivo", "Neuron", 17,181-190. - Podlisny et al. (1997), "Presenilin proteins undergo heterogeneous endoproteolysis between Thr291 and Ala299 and occur as stable N- and C-terminal fragments in

normal and Alzheimer brain tissue", "Neurobiology of Disease", 3, 325-337.

- Pradier, L., Czech, C, Mercken, L., Revah, F. og Imperato, A. (1996), "Biochemical characterization of presenilins (Sl82 and STM2) proteins", "Neurobiol. Aging", 17, S137 - Scheuner et al. (1996), "Secreted amyloid b-protein similar to that in the senile plaques of Alzheimer's disease is increased in vivo by the presenilin 1 and 2 and APP mutations linkes to familial Alzheimer's disease", "Nature Med.", 2, 864-870. - Dyrks, T., Dyrks, E., Monning, U., Urmoneit, B., Turner, J. og Beyreuther, K. (1993), "Generation of bA4 from the amyloid protein precursor and fragment thereof,

"FEBS Lett.", 335, 89-93.

- Weidemann, A., Paliga, K., Diirrwand, U., Czech, C, Evin, G., Masters, C. og Beyreuther, K. (1997). "Formation of stable complexes between two Alzheimer's disease gene products: Presenilin-2 and b-Amyloid precursor

protein.", "Nature Medicine", 3, 328-332.

- Blanchard, V., Czech, C, Bonici, B., Clavel, N., Gohin, M., Dalet, K., Revah, F., Pradier, L., Imperato, A. og S. Moussaoui (1997), "Immunohistochemical analysis of presenilin 2 expression in the mouse brain: distribution pattern and

co-localization with presenilin 1 protein", "Brain Res.", 758,209-217.

- Borchelt, D.R., Thinakaran, G., Eckman, C, Lee, M.K., Davenport, F., Ratovitsky, T., Prada, C.-M., Kim, G., Seekins, S., Yager, D., Slunt, H.H., Wang, R., Seeger, M., Levey, A.I., Gandy, S.E., Copeland, N.G., Jenkin, N., Price, D.L., Younkin, S.G. og S. Sisodia (1996). "Familial Alzheimer's disease-linked presenilin 1 variants elevate Abl-42/1-40 ratio in vitro and in vivo", "Neuron", 17,1005-1013. - Duff, K., Eckman, C, Zehr, C, Yu, X., Prada, C.-M., Perez-tur, J., Hutton, M., Buee, L., Harigaya, Y., Yager, D., Morgan, D., Gordon, M.N., Holcomb, L., Refolo,

L., Zenk, B., Hardy, J. og S. Younkin (1996), "Increased amyloid-b42(43) in

brains of mice expressing mutant presenilin 1", "Nature", 383, 710-713.

- Hardy, J. (1997), "Amyloid, the presenilins and Alzheimer's disease", 'Trends in Neurosci.", 20,154-159. - Stephens D.J. og B.M. Austen (1996), "Metabolites of the b-amyloid precursor protein generated by b-secretase localise to the Trans-Golgi Network and late endosome

in 293 cells", "J. Neurosci. Res.", 46, 211-225.

-Essalmani, R., Guillaume, J.-M., Mercken, L., og Octave, J.-N. (1996), "Baculovirus-Infected Cells Do not Produce the Amyloid Peptid of Alzheimer's Disease from

its Precursor", "FEBS Lett.", 389,157-161.

- Barelli et al. (1997), "Characterization of new polyclonal antibodies specific for 40 and 42 amino acid-long amyloid p peptides : their use to examine the cell biology of presenilins and the immunohistochemistry of sporadic Alzheimer's disease and cerebral amyloid angiopathy cases", "Molecular Medicine", 3, 695-707.

Claims

1. In vitro anvendelse av et polypeptid for å inhibere interaksjonen mellom preseniliner og APP, hvor nevnte peptid består av hele eller en del av sekvensen 1-87 av PS2 og eventuellt en signalsekvens.

2. In vitro anvendelse av et polypeptid for å inhibere interaksjonen mellom preseniliner og APP, hvor nevnte peptid består av hele eller en del av sekvensen 1-213 av PSI og eventuellt en signalsekvens.

3. In vitro anvendelse av et polypeptid ifølge ett av kravene 1-2, hvor polypeptidet inneholder en signalsekvens.

4. In vitro anvendelse av et polypeptid ifølge krav 3, hvor signal sekvensen er valgt blant signalpeptidsekvensen av IgkB, signalpeptidet av APP, signalpeptidene til de muskulære og sentrale acetylkolin nikotiniske reseptor subenheter.

5. In vitro anvendelse av et polypeptid som definert i krav 1 eller 2 i en fremgangsmåte for påvisning eller isolering av forbindelser som kan inhibere interaksjonen mellom enten i) peptid AP M2 og den N-terminale ende av preseniliner; eller ii) APP og den N-terminale ende av preseniliner, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter minst ett trinn med detektering av inhibering av interaksjonen enten mellom peptid APm2 eller p-amyloid-forløperpeptidet og den N-terminale ende av et presenilin.

6. In vitro anvendelse ifølge krav 5, hvor nevnte fremgangsmåte ytterligere omfatter minst et trinn med merking av presenilinene og/eller APP eller amyloid-P 1-42 peptidet.

7. In vitro anvendelse ifølge krav 5, hvor nevnte fremgangsmåte er kjennetegnet ved at de følgende trinn blir utført: - peptidet Ap absorberes i forkant på en nitrocellulosemembran ved inkubering; - et bakterieekstrakt inneholdende den N-terminale ende av et presenilin tilsettes derefter for inkubering med molekylet eller en blanding inneholdende forskjellige molekyler som skal testes; - tap av interaksjon mellom presenilinet og peptidet AP M2 på nitrocellulosefilteret påvises ved hjelp av presenilin markør proteiner.

8. In vitro anvendelse ifølge krav 5, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter de følgende trinn: - peptidet Ap\ ai absorberes i forkant på en nitrocellulosemembran ved inkubering; - et bakterieekstrakt inneholdende den N-terminale ende av et presenilin tilsettes derefter for inkubering med molekylet eller en blanding inneholdende forskjellige molekyler som skal testes; - tap av interaksjon mellom presenilinet og peptidet Ap m2 på nitrocellulosefilteret påvises ved hjelp av presenilin markør proteiner, hvori et av markør proteinene er fikseringsproteinet av S-tag koblet til alkalisk fosfatase.

9. In vitro anvendelse ifølge krav 5, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter de følgende trinn: - peptidet Ap M2 inkuberes i forkant på en plate; - den N-terminale ende av et renset rekombinant presenilin tilsettes derefter med molekylet eller en blanding av forskjellige molekyler som skal testes, for inkubering; - efter vasking, skjer påvisning av interaksjonen av presenilin med peptid Ap \ ja på platen ved hjelp av presenilin markørproteiner, hvor tap av interaksjon mellom preseniliner og forløperen av P-amyloidpeptidet og/eller P-amyloidpeptidet detekteres efter visualisering med et kolorimetrisk substrat, ved spektrofotometri.

10. In vitro anvendelse ifølge krav 5, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter de følgende trinn: - peptidet Apinkuberes i forkant på en plate; - den N-terminale ende av et renset rekombinant presenilin tilsettes derefter med molekylet eller en blanding av forskjellige molekyler som skal testes, for inkubering; - efter vasking, skjer påvisning av interaksjonen av presenilin med peptid APm2 på platen ved hjelp av presenilin markørproteiner, hvori et av markør proteinene er fikseringsproteinet av S-tag koblet til alkalisk fosfatase og tap av interaksjon mellom preseniliner og forløperen av P-amyloidpeptidet og/eller P-amyloidpeptidet detekteres efter visualisering med et kolorimetrisk substrat ved 450 nm, ved spektrofotometri.

11. In vitro anvendelse ifølge krav 5, hvori følgende trinn blir utført: - et molekyl eller en blanding inneholdende forskjellige molekyler bringes i kontakt med peptidet APi^ syntetisert med et biotin og en arm av 3P-alaniner eller av 3 lysiner ved den N-terminale ende; - den ovennevnte reaksjonsblanding innkuberes med den N-terminale ende av et renset presenilin merket ved hjelp av en første fluorofor; - et streptavidin koblet til en andre fluofor, som er i stand til å kunne eksiteres ved emisjonsbølgelengden til den første fluofor, blir tilsatt slik at den begunstiges av en overføring av fluorescens hvis de to fluoroforer befinner seg nær hverandre; og - inhibering av interaksjonen detekteres ved spektrofiuorometri ved emisjonsbølgelengden for den første fluofor og/eller ved å måle reduksjonen av signalet ved emisjonsbølgelengden for den andre fluofor.

12. In vitro anvendelse ifølge krav 5, hvori følgende trinn blir utført: - et molekyl eller en blanding inneholdende forskjellige molekyler bringes i kontakt med peptidet Ap^2 syntetisert med et biotin og en arm av 3P-alaniner eller av 3 lysiner ved den N-terminale ende; - den ovennevnte reaksjonsblanding innkuberes med den N-terminale ende av et renset presenilin merket ved hjelp av en første fluorofor, hvor nevnte fluofor er europium kryptat; - et streptavidin koblet til en andre fluofor, som er XL665, som er i stand til å kunne eksiteres ved emisjonsbølgelengden til den første fluofor, blir tilsatt slik at den begunstiges av en overføring av fluorescens hvis de to fluoroforer befinner seg nær hverandre; og - inhibering av interaksjonen detekteres ved spektrofiuorometri ved emisjonsbølgelengden for den første fluofor og/eller ved å måle reduksjonen av signalet ved emisjonsbølgelengden for den andre fluofor.

13. In vitro anvendelse ifølge krav 5, hvori følgende trinn blir utført: - et molekyl eller en blanding inneholdende forskjellige molekyler bringes i kontakt med peptidet Ap 1^ 2 syntetisert med et biotin og en arm av 3p-alaniner eller av 3 lysiner ved den N-terminale ende; - den ovennevnte reaksjonsblanding innkuberes med den N-terminale ende av et renset presenilin merket ved hjelp av en første fluorofor, hvor nevnte fluofor er europium kryptat; - et streptavidin koblet til en andre fluofor, som er XL665, som er i stand til å kunne eksiteres ved emisjonsbølgelengden til den første fluofor, blir tilsatt slik at den begunstiges av en overføring av fluorescens hvis de to fluoroforer befinner seg nær hverandre; og - inhibering av interaksjonen detekteres ved spektrofiuorometri ved emisjonsbølgelengden for den første fluofor og/eller ved å måle reduksjonen av signalet ved emisjonsbølgelengden for den andre fluofor ved 665nm.

14. In vitro anvendelse ifølge krav 5, hvori følgende trinn blir utført: - en blanding av a) cellelysater inneholdende N-terminale ende av et presenilin; b) cellelysater inneholdende APP, lysater som er oppnådd fra celler infisert med virus; og c) molekylet eller blandingen inneholdende forskjellige molekyler som skal testes; bringes i kontakt - proteinene som er oppløseliggjort og tilsvarer presenilinene eller APP eller peptidet AP blir ko-immunopresipitert ved hjelp av egnede antistoffer; og - tapet av ko-immunoprecipitering av presenilinene og APP blir visualisert ved westernblot med markørantistoffer som indikerer at de testede molekyler har den ønskede inhiberende egenskap.