CZ301524B6 - Polypeptid z H. medicinalis, zpusob jeho prípravy a použití, farmaceutický prostredek, polynukleotid, expresní vektor, hostitelská bunka, protilátka a její použití - Google Patents

Abstract

Polypeptid izolovaný z H. medicinalis mající molekulovou hmotnost približne 12 000 .+-. 1 kD s biologickou aktivitou inhibitoru na kolagenu závislé adheze krevních desticek, který vykazuje v celé délce alespon z 80 % identitu s aminokyselinovou sekvencí SEQ.ID.NO.2. Izolovaný polynukleotid se sekvencí DNA SEQ.ID.NO.1 kódující tento polypeptid, expresní vektor obsahující tuto sekvenci DNA, hostitelská bunka obsahující tento expresní vektor a expresní systém obsahující tuto hostitelskou bunku. Zpusob prípravy tohoto polypeptidu kultivací shora uvedeného expresního systému a izolací vzniklého polypeptidu. Protilátka imunospecifická pro polypeptid se sekvencí SEQ.ID.NO.2. Farmaceutický prostredek, který obsahuje výše uvedený polypeptid. Použití tohoto polypeptidu pro výrobu léciva na lécení tromboembolických onemocnení a pro ex vivo aplikace, jako je potahování umelých povrchu, modifikace nitroocních cocek, kovalentní zesítení materiálu cocky. Použití uvedené protilátky a polypeptidu na merení polypeptidu pri jeho príprave nebo u léceného subjektu.

Description

Polypeptid z H. medicinalis, způsob jeho přípravy a použití, farmaceutický prostředek, polynukleotid, expresní vektor, hostitelská buňka, protilátka a její použití

Oblast techniky

Vynález se týká polypeptidu z H. medicinalis, způsobu jeho přípravy a použití, farmaceutického prostředku $ jeho obsahem, polynukleotidu kódujícího tento polypeptid, expresního vektoru obsahujícího tuto sekvenci DNA, hostitelské buňky obsahující tento expresní vektor a expresního io systému obsahujícího tuto hostitelskou buňku. Dále se také týká protilátky imunospecifické pro tento polypeptid a jejího použití. Polypeptid podle vynálezu blokuje adhezi krevních destiček.

Dosavadní stav techniky

Při hemostáze nebo trombóze ulpívají destičky na buněčně-extracelulární matrici poškozené cévy nebo pokrývají povrch poškozené oblasti. Preventivně zabránit tomuto významnému počátečnímu stupni patogeneze trombózy a okluzi tepen by mělo být terapeuticky užitečné při úsilí o prevenci trombotických nemocí. Kolagen se považuje za nejvíce trombogenní povrchovou slož20 ku a ukázalo se, že je silným podporovatelem adheze destiček, srážení a uvolňování jejich granulí vedoucí k navedení (Ruggeri, Z. M. a kol.: Seminars in Hematology, 31, str. 229 až 239, 1994) přídavných destiček do této oblasti k vytváření sraženin a trombu. Počáteční kontakt destiček s povrchem cévy je zprostředkováván kolagenem vázaným von Willebrandovým faktorem (vWF) a specifickým receptorem vWF na destičky, glykoproteinovým komplexem Ib-V-IX. Kromě toho ADP, epinefrin a cirkulující srážecí faktory podporují další aktivaci destiček, přičemž současné narůstání trombinové aktivity přispívá k vytváření zesítěné fibrinové sraženiny. Agregace destiček k destičkám podporuje tento proces a je hlavně podporována fibrinogenem jako zprostředkovatelem, ktetý přemosťuje buňky prostřednictvím receptorů glykoproteinu Ilb/IÍIa.

Tato normální fyziologická odezva je dosti kritická v průběhu patologického procesu, kdy destičky ulpívají na kolagenech obnažených ve sklerotických poraněních (Van der Rest M. a kol., FASEB Journal 5, str. 2814 až 2823, 1991) a začínají vytvářet okluze. V závislosti na umístění a na rozsahu mohou mít okluze vážné důsledky, jako je infarkt myokardu, mrtvice, zánět nebo embolie plic.

Jako přímo působící protitrombotické činidlo blokuje heparin aktivitu trombinu a tak zabraňuje tvoření trombú bohatých na fíbrin a je v současné době běžně nejznámější drogou používanou v protitrombických zákrocích. Heparinu se používá v Široké míře všude tam, kde jde o nestabilní angínu a akutní infarkt myokardu. Avšak přes široké použití, zůstávají dosud nevyřešené některé závažné problémy, jako je intravenosní aplikace, potřeba anti-trombinu-III jako kofaktoru, snížená afinita pro trombin vázaný na shluky, jeho inaktivace některými plazmovými proteiny, případné vyvolání trombocytopenie a biologická různorodost. V důsledku toho nebyly dosud překonány důsledky používání heparinu v klinické praxi.

Poslední vývoj heparinu s nízkou molekulovou hmotností přispěl k možnosti subkutánní aplikace, avšak terapeutická výhodnost oproti standardnímu heparinu je mírná. Totéž platí i o jiných přímo působících antitrombinech jako je Hirudin, Hirulog a Warfarin. Jako jeden z hlavních problémů se jeví zvýšená produkce trombinu při antitrombotickém léčení (Rao, A. K. a kol., Circulation 94, str. 389 až 2395,1996).

Jiné nové přístupy se proto zaměřovaly na proces protrombinové aktivace, která je podporována faktorem Xa. Výzkum se zaměřil na konstrukci vhodných inhibitorů zaměřených na tento faktor. Celkově nutno konstatovat, že plný terapeutický potenciál intervence tohoto typu nebyl dosud realizován.

-1CZ 301524 Bó

Jiná skupina terapeutik je reprezentována trombolytickými režimy a vývoj se zaměřuje na styťylokinázy, streptokinázy, urokinázy typu plazminogenového aktivátoru, tkáně typu Plazminogenového Aktivátoru a na anisoylovaný plazminogenstreptokinázový aktivátorový komplex. Rozdíly v čase, potřebném k vyvolání reperfuse, se významně liší u každého z těchto trombolytických činidel, avšak pokrok vyjádřený snížením celkové úmrtnosti je stejný u všech těchto produktů. Kromě toho jsou častými komplikace reokluse nebo prodloužené krvácení. To může být způsobeno poměrně nízkou specifičností pro fibrin a krátkým poločasem těchto sloučenin v plazmě. Běžně se testují různé aplikační režimy a kombinace různých fibrinolytických principů k překonání některých běžných nedostatků v trombolytické terapii. Očekávaná zlepšení jsou však spíše malá.

V poslední době se objevila nová skupina pacientů s problémy, jako je akutní trombotická okluze a pozdní restenóza, způsobenými zákroky jako je angioplastie, aterotomie, arteriální štěpování nebo stentování cévní stěny. Možné terapeutické zákroky zahrnují protidestičkové, antitrombotic15 ké a trombolytické strategie. Různá jiná činidla, jako je ticlopdin, působící jako ADP antagonist nebo íonofor vápníku A-23187, a zejména aspirin mají přímý vliv na funkcí destiček a byla navrhována nebo používána k prevenci nebo k minimalizaci shlukování destiček. Nová látka proti adhezi destiček podle vynálezu by mohla také pomoci překonávat tyto klinické komplikace, je-li aplikována v průběhu chirurgického zákroku.

Jiná komplikace týkající se tohoto problému nastává, dostanou-li se umělé povrchy do styku s krví. Mají pak vzrůstající tendenci navozovat trombotické příhody aktivací destiček a/nebo navozováním srážení. Tyto jevy mohou způsobovat poruchu cévních štěpů, srdečních chlopní, stentů, katétrů nebo jakéhokoli jiného zařízení nebo materiálu přicházejícího do styku skrví.

Schopnost proteinu podle vynálezu vytvářet netrombogenické povrchy může být proto využita imobilizací tohoto proteinu na materiálech a shora uvedených zařízeních. Takové zpracování by mělo takovým materiálům a zařízením dodat biokompatíbilitu a učinit je tromboresístentními. Vzhledem k omezením souvisejícím s dostupnými antitrombotickými činidly existuje aktuální potřeba nových alternativních strategií a léčebných postupů,

K dalšímu zlepšování léčby kardiovaskulárních poruch mohou přispět přístupy podle vynálezu, které přímo narušují adhezi destiček vyvolanou kolagenem a nebo vWF faktorem. Některými novými inhibitory, které brání adhezi destiček jsou monoklonální protilátky zaměřené na vWF. Již je známo, že glykoproteinové inhibitory Ilb/HIa mohou být vhodné k inhibici adheze destiček.

Některé z těchto inhibitorů, jako monoklonální Ab c7E3 byly již klinicky testovány, zatímco ostatní, jako inhibitory KGD a RGDF se stále studují. Avšak specifičnost většiny těchto nových inhibitorů není příliš dobře prostudována, takže spektrum vedlejších účinků, které budou vyvolány použitím těchto inhibitorů je stále otevřené a vyžaduje pečlivé prozkoumání.

Bohatým zdrojem pro skríning nových sloučenin, které interferují s kolagenem vyvolanou adhezí destiček, je příroda prostřednictvím živočichů sajících krev, Z literatury je známo, že bylo izolováno několik přírodních inhibitorů: protein A 65 kD nazývaný calin, izolovaný z Hirudo medicinalis (americký patentový spis US 5 587 360, mezinárodní patentová přihláška číslo WO 92/07005) (Munro R. a kol., Blood Coagulation and Fibrinolysis 2, str. 179 až 184, 1991) a protein 16kD (LAPP) izolovaný ze slinných žláz pijavky Haementeria officinalis (americký patentový spis US 5 324 715). Oba proteiny byly popsány jako inhibitory agregace podle testů statickým zkoumáním adheze destiček způsobované kolagenem.

Přes úspěšné důkazy in vitro, selhalo působení LAPP v několika dobře zavedených modelech invivo (Schaffer L. W. a kol., Arterioscler. Thromb. 13, str. 1593 až 1601, 1993; a Connoly Τ. M. a kol., Thromb. Haemostas. 69, str. 589, 1993). Měkké klíště Omithodoros moubata také obsahuje protidestičkový protein (moubatin), který působí v prevenci kolagenem způsobované agregace destiček (Waxman L. a kol., J. Biol. Chem. 268, str. 5445 až 5449,1993). Jiný inhibitor agregace destiček u krev sající štěnice objevili Noeske-Jungblut C. a kol. (patentový dokument číslo WO 93/09137). Smith a kol. izoloval protein 50 kDA z hadího jedu a protein 19 kDa byl

-2CZ .3111324 BO izolován ze slin krev sající štěnice Triatoma pallidipennis. Zjistilo se, že tento protein obsahuje faktor, který specificky inhibuje kolagenem způsobovanou agregaci destiček. Protein 19 kDa, nazývaný pallidipin, inhibuje kolagenem způsobovanou agregaci destiček v plazmě. Nezjistila se žádná inhibice agregace stimulovaná jinými činidly (ADP, thrombin, thromboxan A2 mímetický

U46619, phorbolester). Pallidipin neměl žádný účinek na adhezi destiček kolagenem, inhiboval však uvolňování ATP z destiček. Reverzibilně reagoval s destičkami a mohl by sdílet s kolagenem společný cíl na destičkách. Přesný mechanismus působení a terapeutický zisk z tohoto proteinu se právě zkoumá. Gan a kol. popisuje eschistatin jako inhibitor vázající receptor fibrinogenu GPIIa/IIIb (J. Biol. Chem. 283, str. 19827 až 32, 1988).

Přes tento intenzivní vývoj, pokračuje snaha vyvinout další protisrážlivé a protitrombinové prostředky, které by měly větší účinnost při inhibici tvoření shluků, aktivaci destiček vyvolané vWF nebo aktivaci endothelových buněk a které by byly použitelné farmaceuticky a mohiy se vyrábět v obchodně dostupných množstvích. Jelikož žádný ze známých dosud popsaných proteinů nebyl dosud vyvinut do podoby sloučeniny s ideálním terapeutickým profilem, zaměřil se vynález na tento problém.

Podstata vvnálezu

Předmět vynálezu zahrnuje tyto aspekty:

- Polypeptid izolovaný z H medicinalis mající molekulovou hmotnost přibližně 12 000 ± 1 kD s biologickou aktivitou inhibitoru na kolagenu závislé adheze krevních destiček, který vykazuje v celé délce alespoň z 80 % identitu s aminokyselinovou sekvencí SEQ.ID.NO.2.

- Izolovaný poíynukleotid kódující výše uvedený polypeptid.

- Izolovaný poíynukleotid obsahující sekvenci DNA SEQ.ID.NO.l nebo sekvenci DNA komple30 mentami k sekvenci DNA kódující tento polypeptid.

- Poíynukleotid obsahující sekvenci DNA, která vykazuje v celé délce alespoň 80% identitu se sekvencí SEQ.ID.NO.l.

- Expresní vektor obsahující sekvenci DNA tohoto polynukleotidu.

- Hostitelskou buňku obsahující tento expresní vektor.

- Expresní systém obsahující výše uvedenou hostitelskou buňku.

- Způsob přípravy výše uvedeného polypeptidu, při němž se výše uvedený expresní systém kultivuje za podmínek postačujících pro produkci polypeptidu a polypeptid se izoluje ze supematantu kultury nebo z buněčného zbytku.

- Protilátku imunospecifickou pro polypeptid se sekvencí SEQ.ID.NO.2.

- Farmaceutický prostředek, který obsahuje výše uvedený polypeptid a farmaceuticky přijatelný nosič nebo jeho excipient.

so - Farmaceutický prostředek uvedený výše pro použití na léčení tromboembolických procesů.

- Použití výše uvedeného polypeptidu pro výrobu léčiva pro léčení tromboembolických onemocnění.

- Použití výše uvedeného polypeptidu pro ex vivo potahování umělých povrchů.

-3CZ 301524 B6

- Použití výše uvedeného polypeptidu pro ex vivo modifikaci nitroočních Čoček na zmírnění trombogenicity materiálu čočky.

- Použití výše uvedeného polypeptidu pro ex vivo kontaktování povrchu čočky.

- Použití výše uvedeného polypeptidu pro ex vivo kovalentní zesítění k modifikaci materiálu čočky.

io - Použití výše uvedených protilátek a polypeptidu na ex vivo měření polypeptidu produkovaného výše uvedeným způsobem nebo u léčeného subjektu.

Vynález se tedy především týká inhibitoru izolovaného z H. medicinalis, který působí přímo na interakci kolagen-destičky, takže inhibuje aktivaci destiček a časnou interakci destičky-destičky.

Dosud se v literatuře nevyskytl pozitivní příklad, který by naznačil, že použitím skríningu, kterým by se vyloučily inhibitory agregace stejně jako lytické proteiny ze zdrojů přírodně se vyskytujících sloučenin, by bylo možno identifikovat nové antiadhezivní mechanismy nebo sloučeniny. Tohoto přístupu se však využilo v tomto vynálezu. Jelikož je známo nejméně šest různých destič20 kových povrchových glykoproteinů, které se podílejí na kolagenové adhezi a kromě toho je známo několik sloučenin odvozených z destiček, jako je Willebrandův faktor, fíbronektin a trombospondin, které se ukázaly být nepřímými zprostředkovateli adheze kolagen-destičky, bylo na počátku jen málo optimismu, že budou identifikovány nové inhibitory adheze.

Nicméně bylo tohoto přístupu použito ke skríningu slin Hirudo medicinalis, přičemž se vědělo, že ne všechny zdokumentované nebo neznámé inhibitory podobné vWF ani sloučeniny působící přímo na receptory destiček by mohly být vyloučeny. Proto byl výsledek skríningu překvapením: byl zjištěn nový protein nazvaný Saratin s protíadhezivní aktivitou pro destičky, který je možno izolovat z tkání a sekretů dobře prozkoumané pijavky druhu Hirudo medicinalis.

Vynález se týká aktivního polypeptidu Saratinu izolovaného zpijavek Hirudo medicinalis. Protein byl izolován ze slin kombinací tlakované dialýzy a alespoň jednoho chromatografického kroku podobného anexové chromatografii a alespoň jednoho kroku vysoce výkonné chromatografie na reverzní fázi (RP-HPLC). Ukázalo se, že tlaková dialýzaje absolutně rozhodující v prů35 běhu získávání Saratinu ze slin, jelikož silná koncentrace slin napomohla k překonání jinak výrazné ztráty bioaktivního Saratinu. Izolovaný Saratin se váže silně na několik kolagenů a blokuje adhezi destiček ke kolagenu povlečenému takovými povrchy způsobem závislým na dávce.

K optimalizaci byla vyvinuta skrínovací kaskáda současně dostupných technik k rozlišení adheze destiček a agregace destiček: zjišťuje se schopnost destiček zpomalovat nebo zastavit průtok vlákny, příspěvek destiček k vytváření shluků in vitro, adheze na skleněných kuličkách, nebo průtoky plné krve přes filtr a adheze destiček antikoagulované plazmy bohaté na destičky na filtrech sestávajících ze skleněných vláken nebo z kolagenu pod regulovaným tlakovým gradientem.

Protein (pojmenovaný Saratin) je charakterizován sekvencemi aminokyselin vyznačenými v sekvenci (SEQ.ID.NO.2) a sestává ze 103 aminokyselin, které zaujímají teoretickou relativní molekulovou hmotnost přibližně 12068 daltonů ± 1 kDa. Protein vykazuje jedinečnou primární strukturu bez významné podobnosti s jinými dříve objevenými sekvencemi. Protein je bohatý na asparagovou a glutamovou kyselinu, které přispívají k nízké isoelektrické hodnotě pH 3,7 ± 0,5 molekuly, měřeno IEF-PAGE.

Analýza SDS-PAGE prokázala silný posun mobility po redukci proteinu elektroforézou, naznačující posttranslační modifikace. Sekvencování polypeptidu ukázalo šest cysteinových molekul, které by mohly tvořit posttranslační modifikace proteinu. Hmotová spektrometrie Saratinu elek55 tronovým paprskem ukázala aktuální molekulou hmotnost 12061, což naznačuje, že formování

-4CZ JU13Z4 BÓ sekundární struktury nativní formy proteinu se zúčastňují až tri disulfidické vazby. Inhibitor adheze podle vynálezu je nový, jelikož se liší od známých inhibitorů agregace izolovaných z pijavic, zvláště od Calin nebo LAPP molekulovou hmotností, isoelektrickým bodem, sekvencí aminokyselin a biologickými aktivitami.

Vynález se týká rovněž izolované DNA zahrnují polynukleotid kódující inhibitor adheze destiček odvozený z pijavic, mající sekvenci aminokyselin, jak ukázáno pro protein. Sekvence nukleotidů představující klon cDNA je v SEQ.ID.NO. 1. Poloha 1 až 63 sekvence nukleotidů reprezentuje domnělou vedoucí sekvenci 21 aminokyselin a poloha 64 až 372 obsahuje otevřený čtecí rámec io kódující polypeptid tvořený 103 aminokyselinovými zbytky se sekvencí aminokyselin uvedenou pro zralý protein v SEQ.ID.NO.2.

Vynález se týká také rekombinantních vektorů, které obsahuji syntetický gen kódující inhibitor adheze destiček odvozený z pijavic podle vynálezu a hostitelských buněk, obsahujících rekombi15 nantní vektory. Způsoby k získávání a izolování exprimovaných proteinů byly založeny na technologiích značení nebo byly převzaty z čisticího schéma vyvinutého pro přírodně se vyskytující Saratin. V závislosti na individuálních protokolech používaných pro extracelulámí a intracelulámí expresi v buňkách kvasnicových, hmyzích, ledvinových, v buňkách mláďat křečků a v buňkách E.coli transformovaných vhodnými vektory, je třeba upravit kroky k získávání rekombi20 nantního proteinu ze supematantu nebo ze sedimentů způsoby známými pracovníkům v oboru. Výtečná exprese byla nalezena v E.coli jako hostiteli, kde periplazmatická exprese přispěla začleněním vůdčí sekvence pelB. Bylo dosaženo získávání produktů z Escherichia coli (E.coli) (přibližně 5 mg/1) po osmolýze a odstředění. V souběžném experimentu bylo použito Saccharomyces cerevisiae (S.cerevisiae) (kultivační lázeň >10 mg/1) s alternativním, z kvasnic převzatým vektorem. Sekretovaný materiál byl izolován odstředěním. Čištění bylo dosaženo příčnou filtrací a ionexovou chromatografií. U ostatních expresí používajících buněk buď COS, nebo CHO byla exprese přibližně 750 ng/ml. Elektroforetickou a chromatografickou analýzou bylo prokázáno, že vyčištěný rekombinantní materiál je čistý a homogenní a identický se Saratinem získaným ze slin, jak dokládá sekvencování aminokyselin a stanovení molekulové hmotnosti.

Vynález se týká také způsobu izolace aktivního proteinu ze surových slin pijavic a měření jeho aktivity vůči destičkám statickými a dynamickými zkušebními způsoby stejně jako použití těchto způsobů k izolování rekombinantního proteinu,

Způsoby výroby Saratinu objasňují příklady 6, 7, 8 a 13, avšak použité způsoby exprese nejsou omezeny na tyto příklady. K exprimování Saratinu může být stejně použito například transgenních myší nebo jiných organismů včetně jiných savců.

Proteiny podle vynálezu zahrnují varianty, které konzervují aktivity objevených sekvencí, včetně fragmentů nebo subjednotek, přírodně se vyskytujících variant, alletových variant, nahodile generovaných umělých mutantú a záměrných variant sekvencí jako je adice, které konzervuje aktivitu. Fragmenty nebo subjednotky se týkají kterékoli části sekvenci, která obsahuje méně aminokyselin než úplný protein, například sekvence vyřazující části N- nebo C-zakončení úplného proteinu.

Dále se vynález týká také hybridních proteinů, jako jsou fuzní proteiny nebo proteiny pocházející z exprese množství genů v expresním vektoru a mohou zahrnovat polypeptid mající specifickou aktivitu objeveného proteinu spojený peptidovými vazbami s druhým polypeptidem. Jmenovitě vynález zahrnuje varianty proteinů, obzvláště veškeré varianty, které se liší od izolovaného proso teinu pouze konzervativní substitucí aminokyseliny. Takové konzervativní substituce aminokyselin definoval Taylor a kol. (J. Mol. Biol. str. 188 až 233, 1986).

Zahrnuty jsou také způsoby používaní proteinů k prevenci nebo zpožďování aktivace destiček inhibicí interakcí kolagen/destičky. Protein se hodí k prevenci, k profylaxi, k terapií a k léčení trombotických chorob. Na rozdíl od těchto dříve popsaných proteinů, které působí na různé povr-5CZ 301524 B6 chove proteiny na destičce, má protein podle vynálezu jedinečný mechanizmus působení. Váže se pevně na povrch kolagenu a jeden z jeho mechanizmů působení je dán pokrytím specifických stran kolagenu, které už nejsou k dispozici pro interakce a vázání destiček. Typ nového mechanizmu má velkou přednost v tom, že během aplikace proteinu zůstanou destičky funkčně nedot5 ceny, takže z tohoto ošetřování lze očekávat velmi malé nebo dokonce žádné krvácení.

Jinou velkou oblastí použití je ošetřování různých povrchů proteinem, aby se staly neadhezivní pro destičky a tím vytvářejí zařízení kompatibilní s krví.

io Jak bylo shora uvedeno, hodí se polypeptidy podle vynálezu jako farmaceuticky účinné sloučeniny pro farmaceutické prostředky a kombinace.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu mohou případně obsahovat přídavné aktivní přísady jakoje aspirin, protisrážlivé prostředky jako je hirudin nebo heparin nebo trombolyticka činidla jako je plazminogenový aktivátor nebo streptokináza.

Nové polypeptidy podle vynálezu mohou vytvářet farmaceuticky přijatelné soli se všemi netoxickými, organickými nebo anorganickými kyselinami. Jako příklady anorganických kyselin se uvádějí kyselina chlorovodíková, bromovodíková, sírová, nebo fosforečná a kovové soli jako natriummonohydrogenortofosfát a kaliumhydrogensulfát. Jako organické kyseliny se příkladně uvádějí kyseliny monokarboxylové, dikarboxylové a trikarboxylové, jako je kyselina octová, glykolová, mléčná, pyrohroznová, malonová, jantarová, glutarová, fumarová, jablečná, vinná, citrónová, askorbová, maleinová, hydroxymaleinová, benzoová, hydroxybenzoová, fenyloctová, skořicová, salicylová a sulfonové kyseliny, jako kyselina methansulfonová. Soli aminokyseliny s karboxylovým zakončením zahrnují netoxické karboxylové kyseliny vytvořené s jakoukoliv anorganickou nebo organickou zásadou. Tyto soli zahrnují například soli alkalických kovů, jako je sodík a draslík, kovů alkalických zemin, jako je vápník a hořčík, lehkých kovů skupiny HIA včetně hliníku a organických primárních, sekundárních a terciárních aminů, jako jsou trialkylaminy včetně triethylaminu, prokainu, dibenzylaminu, 1-ethenaminu, N,N'-dibenzy lethylendi30 aminu, dihydroabietylaminu a N-alkylpiperidinu.

Pojmem „farmaceuticky přijatelný nosič“ se zde rozumí inertní netoxické nebo tekuté plnidlo, ředidlo nebo zapouzdřovací materiál, nereagující nepříznivě s účinnou sloučeninou nebo s pacientem. Vhodné, s výhodou kapalné nosiče jsou v oboru dobře známy, jako sterilní voda, solan35 ka, vodná dextróza, cukerné roztoky, ethanol, glykol a oleje, včetně minerálního, živočišného, rostlinného nebo syntetického původu, například podzemnicového, sojového a minerálního oleje.

Prostředky podle vynálezu se mohou podávat v jednotkových dávkách obsahujících běžné netoxické farmaceuticky přijatelné nosiče, ředidla, pomocná činidla a pojidla, které jsou typické pro parenterální podávání.

Pojem „parenterální“ zahrnuje subkutánní, intravenózní, intraartikulámí a intratracheální injekční a infuzní techniku. Vhodné jsou též jiné způsoby podávání, jako orální a topické. Parenterální prostředky a kombinace jsou nejvýhodněji podávány intravenózně, buď v bolusové formě, nebo jako konstantní fúze podle známých způsobů.

Tablety a kapsle pro orální podávání obsahují konvenční excipienty, jako jsou pojivá, plnidla, ředidla, tabletovací činidla, mazadla, desintegrační činidla a smáčedla. Tablety mohou být povlečeny v oboru známým způsobem. Orální kapalné prostředky mohou být ve formě vodných nebo olejových suspenzí, roztoků, emulzí, sirupů a vodiček, nebo mohou být podávány jako suchý produkt ke smísení s vodou nebo s jiným vhodným nosičem před použitím. Takové tekuté prostředky mohou obsahovat obvyklé přísady, jako suspenzační činidla, emulgátory, nevodné nosiče a konzervační činidla. Topické prostředky mohou být ve formě vodných nebo olejových suspenzí, roztoků, emulsí, želé a s výhodou emulzních mastí.

-6CZ 3U1524 B6

Jednotkové dávky podle vynálezu mohou obsahovat denní potřebné množství proteinu podle vynálezu, nebo jeho podíly k vytvoření požadované dávky. Optimální terapeuticky přijatelná dávka a rychlost pro daného pacienta (savce včetně lidí) závisí na mnoha činitelích, jako jsou účinnost specifické použité účinné látky materiálu, věk, tělesná hmotnost, celkový zdravotní stav, pohlaví, dieta, doba a cesta podávání, rychlost vylučování, aktivita enzymu (jednotek/mg proteinu), účel ošetřování, to znamená terapie nebo profylaxe a povaha trombotické ošetřované nemoci, požadovaná protidestičková nebo antikoagulační aktivita.

Proto v prostředcích a kombinacích pro léčeného pacienta (in vivo) je farmaceuticky účinná io denní dávka proteinu podle vynálezu přibližně 0,01 až 100 mg/kg tělesné hmotnosti s výhodou

0,1 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti. Podle formy podání může jedna samotná dávka obsahovat 0,5 až 10 mg trombinového inhibitoru. K dosažení antikoagulaěního účinku vmimotělní krvi je farmaceuticky účinné množství peptidů podle vynálezu 0,2 až 150 mg/í, s výhodou 1 až 20 mg/! mimotělní krve,

Vynález se také týká implantovaných nebo mimotělních medicinálních zařízení pro použití ve styku s tělesnými kapalinami, přičemž povrchům těchto zařízení je dodána tromboresistence povlečením imobilizovaným polypeptidem podle vynálezu. Polypeptid podle vynálezu se imobilizuje na medicinálním zařízení tak, aby byl povrch biokompatibilní a tromboresistentní. Takové zařízení má někdy povrchové vlastnosti, které navozují agregaci destiček, což je nevýhodné při záměru jejich použití pro implantovatelná nebo mimotělní medicinální zařízení, která mají přicházet do styku s krví nebo s jinou lidskou kapalinou. Jakožto příklady takových zařízení, která se zpravidla vyrábějí z plastů, se uvádějí protézy, umělé orgány, oční čočky, sutury, umělé cévní segmenty, katétry, dyalyzátory, trubičky a cévy pro vedení krve.

Posteriomí zkalení pouzdra („posterior capsuíe opacification“ =PCO) je běžnou komplikací po extrakci kataraktu přes moderní chirurgické způsoby a čočky, které se pro tyto účely používají. PCO je způsobeno proliferaci a migrací čočkových epitelových buněk posteriomím pouzdrem, čímž se snižuje zraková ostrost. Fyzikální ošetření, jakož také chemicky modifikované čočky byly navrženy ke snížení PCO. Pro snížení PCO byly navrženy heparinové povlaky čoček nebo topické heparinové oční kapky, což naznačuje, že trombogenní mechanizmy se podílejí na vytváření PCO.

Ukázalo se, že Saratin má významné přednosti oproti heparinu v prevenci a blokování tromboge35 nicity. Vynález se proto dále týká povlaku obsahujícího Saratin, kteiý sníží trombogenicitu materiálu čoček, používaného pro refrakční anteriomí nebo posteriomí pouzdro očních implantátů, které se mohou chirurgicky implantovat do oka. Tento nový typ povlaku čelí problémů se stimulovaným růstem buněk. V kombinaci s ostatními léčivy, která například způsobují smrt buněk, pomáhá Saratinový povlak k úplnému předcházení PCO.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 Separace složek slin. Eluce Saratinu je vyznačena *.

a) Separační profil slin po DEAE anexové výměně. Frakce Saratinu se sbírají z píku 3. (příklad 2)

Na ose x je množství v ml, na ose y jsou jednotky AU.

Pufry: A) 20 mM Tris, B) pufr A, lMNaCl. Průtočná rychlost 10 ml/min

b) Rechromatografie shromážděných frakcí na Mono Q HR5/5. Vzorky se shromažďují z poslední části hlavního píku, jak naznačeno čarou (příklad 2)

Na ose x je množství v ml, na ose y je absorbance 280 nm.

Pufry: A) 20 mM Tris, B) pufr A, ÍM NaCl. Průtočná rychlost 1 ml/min.

-7CZ 301524 B6

c) Poslední chromatografický krok semí-preparativní analytické RP-HPCL pozitivních frakcí Saratinu shromážděných z Mono Q HR5/5 (příklad 2). Aktivní Saratin získán z hlavního píku (pík 3)

Na ose x je čas v min, na ose y jsou jednotky AU.

Pufry A: H₂O.0,l% TFA B: CH₃CN.O,1TFA

Obr. 2 SDS-PAGE shromážděných frakcí z RP-HPLC.

Positivní frakce Saratinu jsou označeny * (příklady 2 a 3) io

Obr. 3 Expresní vektor E.coli pro Saratin (příklad 7)

Obr. 4 Baculo donorový plazmid pro Saratin (příklad 8)

Obr. 5 Plná krev byla vystavena umělému kolagenovému povrchu a adheze destiček se zviditelnila vybarvením. Saratinu se použilo jako inhibitoru (protein #607) příklad 9 Rychlost smyku: 1300 s“¹. Lidská krev. Kollagen typu III z lidské placenty. 30 μΙ/sklíčko na překrytí mikroskopického vzorku (i na obr. 6 a 7 se sklíčkem myslí sklíčko na překrytí mikroskopického vzorku). První obrazec se týká kontroly, druhý proteinu # 607.

Obr. 6 Inhibice adheze destiček na sklíčko povlečené kolagenem typu III za smykových podmínek. Porovnání slin a Saratinu. Příklad 9.

Kollagen typu III z lidské placenty.

Sliny # 616 0,11 mg/ml: 30 μΐ na sklíčko n-4

Protein # 607 0,11 mg/ml: 30 μΐ na sklíčko n=2

Na ose x jsou: v prvním sloupci kontroly, ve druhém sloupci roztok, ve třetím sloupci kontroly, ve druhém sloupci roztok, ve třetím sloupci sliny # 616, ve čtvrtém sloupci protein # 607. Procentový údaj u třetího a čtvrtého sloupce udává procento inhibice.

Na ose y je pokrytá plocha (%).

Obr. 7 Saratin objasňuje na dávce závislou inhibici vazební adheze destiček na sklíčkách povlečených kolagenem typu III za smykových podmínek. (Příklad 9).

Protein # 607. Kollagen typ III z lidské placenty

První sloupec se týká roztoku

Na ose x je koncentrace [pg/ml], na ose y je % inhibice.

Obr. 8 Kvasnicový expresní vektor pro Saratin (příklad 13).

Vůdčí α-faktor Saratinu,

Vynález blíže objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Skríning inhibitorů adheze so Funkčním základem pro skríning čtyř složek slin je adheze destiček na kolagenu. Čtyři přídavné testy jsou vhodné pro posouzení různého působení antitrombotických drog, jako je zkouška AZOCOLL, zkouška aktivity amidázy, von Willebrandův test vázání a zkouška agregace destiček, k vyloučení funkčních vlastností, které by ideálně nebyly vázány na inhibitor adheze. Jelikož většina zde použitých testů jsou standardní zkoušky, je třeba zkoušku adheze destiček modifiko-8CZ 31H524 B6 vat, aby vyhovovala specifickým potřebám studie. Podstata testu: „Horm“ kolagenem (Nycomed) se povléknou 96-důlkové destičky (Nunc) za použití okyseleného kolagenu v koncentraci pg/ml a destičky se inkubují přes noc. Po promytí destiček třikrát PBS se blokuje zbylý povrch důlků 1% BSA. Destičky izolované čerstvě z lidské citronylované krve se přidají součas5 ně s frakcemi odvozenými z jednotlivých sloupcových stupňů. Případně se provede předběžná aktivace destiček jejich inkubaci před použitím TBS v přítomnosti hořečnatých iontů. K porovnání inhibiční aktivity se použije jako standardu surových slin, standardizovaných na celkovou koncentraci proteinu 200 pg/ml. Ukázalo se, že test inhibice destiček je velmi choulostivý na změny pufru a zvýšené koncentrace soli. Ačkoli byly všechny vzorky zpracovány ionexovou chromatoio grafií, ukázalo se, že přímé testování frakcí ve zkoušce inhibice je komplikované a nespolehlivé. Proto byly všechny testované vzorky aplikovány na koncentrační stupeň na Centrikonové bázi, který současně snižuje iontovou sílu a podporuje koncentraci před měřením.

is Příklad 2

Čištění přírodního inhibitoru

Vynález používá slin shromážděných od H. medicinalis, o kterých je známo, že obsahují řadu bíoaktivních proteinů jako je hírudin, elastázové inhibitory, kolagenázy a inhibitory agregace destiček, jako je calin (Munro, R. a kol., Blood Coagulation and Fibrinolysis 2, str. 179 až 184, 1991) a LAPP (Schaffer L. W. a kol., Arterioskler. Thromb. 13, str. 1593 až 1601, 1993). Vedle těchto charakterizovaných proteinů zůstává stále neznámou většina z přibližně 80 proteinů zjistitelných SDS-PAGE, Podle vynálezu je použito v příkladu 1 popsaných ťrakcionovaných slin a skrínovací strategie pro nové proteiny, které přímo interferují s interakcí destiček a kolagenu.

Ukázalo se, že kritickým úkolem je oddělení aktivity inhibitoru adheze od surových slin, hlavně pro nevratnou ztrátu většiny inhibiční aktivity v prvním chromatografíckém stupni. Munro R. a kol. doporučuje aditiva jako 12% ethanol a dvojmocné kationty, což situaci nezlepšuje. Avšak vysoká koncentrace soli slin v kombinaci s celkově nízkou koncentrací proteinu (190 až 250 pg/ml) si vyžaduje počáteční koncentraci a stupeň výměny pufru. Proto se zkoumaly různé strategie pro obohacení, koncentraci nebo výměnu pufru. Tradiční dialýza vedla k úplné ztrátě aktivity. Většina ostatních standardních technik, jako jsou iontoměniče, afinitní sloupce vylučující velikosti (ztráta byla neodpovídající pryskyřici sloupce) selhala nezávisle na povaze separační technologie nebo pufru a použitých aditivech. S překvapením se ukázalo, že tlaková dialýza 500 ml slin byla úspěšnou metodou ke zkoncentrování proteinů slin (přibližně (30 až 40 krát), které se současně zbavily nežádoucích složek pufru. Neočekávaně se stal surový materiál slin, zpracovaný tímto způsobem, ideálním výchozím materiálem pro další čištění a vytěžení bioaktivity antiadhezních složek ze slin již nebylo nadále reálným problémem. Jelikož se ukázalo, že katexy a afinitní sloupce jsou nedostatkovým stupněm čištění, použilo se slabých anexů jako DEAE-Fastflow nebo EMD-DEAE-Fraktogel. Vyzkoušel se 12% ethanol a dvojmocné kationty, avšak výsledky byly podobné s těmito aditivy i bez nich. Další optimalizace chromatografických operací vedla k sekvenci sloupce DEAE, Mono Q-sloupce a jako konečného kroku ke sloupci reverzní fáze RP18. Optimalizace chromatografických podmínek se prováděla chromatografic45 kým systémem BiaCore používajícím analytických sloupců (obchodní produkt společnosti Pharmacia. Gradienty k ovládání sloupce DEAE, Mono-Q-sloupce a sloupců RP18, jsou uvedeny na obr, la, b, c. Separace založená na BiaCore byla vyvážena použitím techniky FPLC. Optimalizované běžné podmínky byly přímo převedeny na poloprovozní měřítko separace podle instrukcí výrobce s výjimkou stupně se sloupcem RP18, který byl zachován technikou Biacore k minimali50 zaci ztrát vyčištěného materiálu. Výtěžek vyčištěného proteinu z posledního chromatografického stupně RP se provedl rychlým vakuovým odstředěním. Vzorky, spojené z posledního stupně RP, se shromáždily a analyzovaly pomocí SDS-PAGE (obr. 2). Pak se vzorky resuspendovaly v PBS a použily k provedení analytických i funkčních testů. Zpravidla se získalo přibližně 750 gg/l Saratinu z nezpracovaných slin.

-9CZ 301524 B6

Příklad 3

Biochemická charakteristika

Čištění Saratinu podle příkladu 1, vedlo v podstatě k čistému proteinu se zdánlivou molekulovou hmotností přibližně 21 kDa, jak je převedeno za redukčních podmínek v SDS-PAGE (obr. 2). Kompletní aminokyselinová sekvence se získala přímým sekvencováním prvních 48 aminokyselin vyčištěného proteinu a byla doplněna sekvencováním několika vnitřních peptidů procházejíio cích z enzymatické degradace. Úplná sekvence proteinů je uvedena v SEQ.ID.NO.2.

Protein se skládá ze 103 aminokyselin s vypočtenou molekulovou hmotností 12067,9 a s aktuální molekulovou hmotností 12061,9 jak bylo doloženo hmotovou spektrometrií ESl-Mass spectrometry. Tyto rozdíly teoretické a naměřené molekulové hmotnosti naznačují, že všech šest cystei15 nů, identifikovaných v Saratinu, se podílí na tvorbě můstků S-S. Tento poznatek je podporován pozorovanou silnou změnou mobility proteinu, je-li podroben chromatografii v SDS-PAGE za redukčních nebo neredukčních podmínek. Protein je kromě toho obohacen kyselými aminokyselinami, jako je Glu a Asp, Isoelektrické zaostření technikou IEF-PAGE (Immobilin) ukázalo isoelektrický bod pH 3,7 ± 0,5. V porovnávací studii se jako referenčního použilo vyčištěného pijavkového proteinu a porovnával se s fyzikálně—chemickými vlastnostmi rekombinovaného Saratinu, odvozeného z exprese baculo, kvasnic a E.coli. Ukázalo se, že všechny tri proteiny jsou ve svých vlastnostech identické. Charakterizace proteinu pomocí SDS-PAGE, zviditelněno Coomassií (obr. 2), nebo stříbrným zabarvením a nebo analýzou Western blot ukázala, že protein je homogenní a v neglykozylované formě,

Příklad 4

Příprava mRNA a syntéza cDNA

Připraví se RNA z lékařských pijavic Hirudo medicinalis za použití guanidinthiokyanátového způsobu. mRNA se Čistí od RNA jako celku za použití soupravy „Oligotex mRNA kit“ (QIAGEN). Syntetizuje se cDNA za použití soupravy „Marathon cDNA Amplification kit“ (CLONTECH). Sekvence DNA kódující Saratin se napřed amplifikuje použitím oligonukleotido35 vých primerů PCR podle doporučení výrobce. Po syntéze cDNA se k oběma koncům cDNA připojí univerzální adaptor. Sekvence univerzálního adaptoru a univerzálních primerů API nebo AP2 se volí podle instrukcí dodavatele soupravy.

Příklad 5

Amplifikace a izolování Saratinového genu pomocí PCR

Na bezprostředním konci N-zakončení reverzní translatované aminokyselinové sekvence Sara45 tinu se syntetizují degenerované primery. Tyto primery 01 a 02 byly zkonstruovány k hybridizaci specificky na 5'-zakončení cDNA Saratinu. Konstrukce primerů je založena na reverzně translatované sekvenci aminokyselin experimentálně určených osmi aminokyselinami N-zakončení vyčištěného proteinu Saratinu. Oba primery, 01 a 02, se syntetizují za pokud možné nízké degenerace a k dodání primerům na kritickém 3-zakončení roztažení 8 párů bází perfektně souso hlásících se sekvencí cDNA Saratinu k zajištění účinné a specifické amplifikace matrice cDNA. Podle DNA degenerovaná abeceda (IUPAC code) R=A nebo G; M=A nebo C, Y=C nebo T aN=A nebo G nebo C nebo T. Reakce 3-RACE PCR se provede za použití směsi primeruOl aprimeru02 a univerzálního primem API nebo AP2. Produkty PCR se klonují do TA klonovacího vektoru pCR2.1 nebo pCR Skript SK(+) vektoru a sekvencují se. Když se po sekvencování získá několik fragmentů 3-RACE PCR, získá se sekvence genu Saratinu, s výjimkou 5' netrans- 10CZ 301524 B6 latované oblasti, signální peptidové sekvence a sekvence kódující prvních osm aminokyselin zN-zakončení zralého proteinu. K získání této chybějící Saratinové cDNA sekvencové informace se provede experiment 5-RACE použitím gen specifického primerů ze středu Saratinové cDNA a jednoho z univerzálních primerů API nebo AP2. Po sekvencování několika z výsled5 ných fragmentů 5-RACE PCR se získá úplná sekvence genů Saratínu. Amplifikaci genů Saratinu PCR pomocí gen-specifických nedegenerovaných primerů zobou 3-zakončení a 5zakončení genů Saratinu se získá plná délka genu Saratínu.

Sekvencování DNA se provede s více než 15 různými klony PCR. Nalezla se však pouze jedna io významná změna, která způsobila změnu aminokyselinové sekvence pouze v jednom klonu.

Je velmi pravděpodobné, že tuto změnu způsobil PCR. Nalezlo se jiných pět tichých změn, které nezpůsobují změnu aminokyselinové sekvence. Není tedy pravděpodobné, že byly tyto změny způsobeny PCR, jelikož stejné změny byiy nalezeny v odlišných klonech.

Gen Saratinu ORF je 372bp a obsahuje 21 aminokyselinovou signální sekvenci a 103 aminokyselinovou sekvenci kódující zralý protein. Zjistilo se, že aminokyselinová sekvence, odvozená z klonu PCR je totožná se sekvencí získanou sekvencováním proteinu, odvozeného z přírodních slin.

Příklad 6

Exprese v buňkách COS a detekce expresovaného proteinu

K expresi genu Saratinu v savčích buňkách jako COS nebo CHO, se gen Saratinu odstřihne z vektoru pCR Skript SK(+) pomocí Xhol+Xbal a klonuje se do expresního vektoru savčí buňky pCl neo (Promega). Zvolena byla pCl-neo, jelikož obsahuje promotor T7 a T3 pro expresi in vivo a gen rezistence z neomycinu pro selekci G418 a může jí být použito jak v buňkách COS, tak CHO. Přídavně k signální sekvenci a k sekvenci zralého proteinu obsahuje insert Koz.

sekvenci na 5-zakončení pro účinnou translaci a his-konec („his—tag“) MRGS(H)_é na 3-zakončení (C-terminal) pro detekci exprese proteinu, vyčištění a koncentraci. Plazmidový konstrukt má název pNC-31. Použije se pNC-31 plazmidu DNA k transfekci buněk COS. Buňky COS, rostoucí v log fázi, se promyjí dvakrát PBS a rozpustí se v PBS v koncentraci lxl0⁷/ml. Přidá se 12 gg plazmidu DNA (méně než 50 μΐ ve vodě nebo TE-pufru) do 0,7 až 0,8 ml suspense buněk

COS a míchá se v elektroporační kyvetě. Elektroporace se provádí 10 minut při 1,9 kV a směs se přenese se na 90mm destičku. Po přidání 8 ml média DMEM obsahujícího 10 % FCS a antibiotika se buňky nechají růst 3 dny. Supematantú a buněk se použije k další izolaci proteinu a k detekci. Exprimovaný protein se detekuje metodou western blottingu pomocí protilátky antiMRGS(H)6. Čištění se provede cheláty jako je NTA nebo imidooctová kyselina imobilizovaná na matrici sloupce a modifikuje se kovovými ionty, například kobaltu, niklu nebo mědi.

Příklad 7

Konstrukce expresního vektoru E.coli a exprese

Kvůli různému využití kodonu v různých biologických systémech, se některé kodony používají velmi zřídka v E.coli. K umožnění exprese optimalizovaná verze v E.coli se gen převedl do kodonů využívaných E.coli o sobě známými způsoby.

Exprese v E.coli se provádí pomocí modifikované verse plazmidu pASK75, který nese tet promotorovou oblast. (Skerra A. a kol., Gene 151, str. 131 až 135, 1994). V podstatě se modifikace provede klonováním nového spojovníku mezi místy Xbal a Hind III (obr. 3). Nový spojovník obsahuje vedoucí sekvenci ompA, jiné násobné klonovací místo a 6xHis-konec místo strep55 konce.

- 11 CZ 301524 B6

Ke konstrukci expresního vektoru pro Saratin bylo nutno zavést restrikční místa 5'Cla I a 3'Eco47IIl způsobem PCR. Proto se použil 5'-primer03 a 3'-primer04. Produkt PCR se napřed klonuje do vektorového systému PCR II (Invitrogen) a sekvencuje se. Ve druhém kroku se gen

Saratinu klonuje do modifikovaného vektoru pASK75 pomocí restrikčních míst 5'Clal a3'Hind III.

Po exprimování a prokázání aktivity tohoto rekombinantního Saratinu ve druhé reakci PCR se His-konec vyjme a startovací kodon Saratinového genu se přímo fúzuje do vůdčí sekvence omp io A. Primery 5'-primerO5 a 3'-primer06 pro tuto reakci PCR jsou v seznamu sekvencí.

Jako příklad pro expresi v E.coli se expresní vektor pRG72 (obr. 3), který obsahuje strukturní gen Saratinu fúzovaný do vůdčí sekvence ompA transformuje do kompetentních buněk W3110. Buňky se indukují po růstu do fáze mid-log. Pojedná hodině je možno zřetelně zjišťovat rekom15 binantní Saratin.

Příklad 8

Konstrukce Baculo donorového plazmidu a exprese

K expresi Saratinu v expresním systému Baculo viru se použije expresního systému Bac-ToBac Baculo Expression Systému (společnosti Gibco Life Technologies). K získání selekčního systému byla fúzována vůdčí sekvence včelího melitinu do genu Saratinu a k zavedení restrikč25 nich míst 5'BamHI a 3'Kpnl se provede jediná reakce PCR pomocí primerů 5'primer07 a 3'primer08. Odpovídající produkt PCR se klonuje do vektoru PCRII (Invitrogen) a sekvencuje se. Pak se klonuje fúze Melitin-Saratin do vektoru pFastBac pomocí restrikčních míst 5'BamHI a 3'Kpnl a výsledkem je pTD13 (obr. 4). Generace rekombinantních baculovirů a exprese Saratinu se provede systémem Bac-To-Bac Expression System. Donorový plazmid pTD13 se transformuje do kompetentních buněk DHlOBac, které obsahují bacmid s cílovým místem mini-attTn7 a pomocný plazmid. Element mini-Tn7 na donorovém plazmidu ca se přemístí do cílového místa mini-attTn7 na bacmidu v přítomnosti transpozičních proteinů poskytnutých pomocným plazmidem. Kolonie, obsahující rekombinantní bacmid, se identifikují disrupcí lacZ genu. Vysokomolekulámí mini-prep DNA se připraví ze selektovaných E.coli klonů obsahujících bacmid a tato

DNA se pak použije k transfekování hmyzích buněk. Podrobné návody jsou v instrukční příručce expresní soupravy.

Příklad 9

Adheze destiček ke kolagenu za průtočných podmínek (dynamická zkouška)

Při zkoušce adheze destiček se nechá procházet plná lidská krev komůrkou s paralelním průtokem ke zkoumání adhezní aktivity destiček ke kolagenem povlečeným sklíčkům na překrytí mikroskopického vzorku (dále se výrazem sklíčka rozumí sklíčka na překrytí mikroskopického vzorku) při průtoku s velkým smykem, (simulace tepenných podmínek in vivo), kterou popsal Sakariassen a kol. (Meth. Enz. 169, str. 37 až 70, 1988). Na vyčištěná sklíčka (18x18 mm) se retušovacím vzduchovým kartáčkem nanese lidský placentový kolagen typu III (Sigma) rozpuštěný v 50 mmol/1 octové kyseliny. Sklíčka se uloží v PBS při teplotě 4 °C přes noc.

Čerstvá předehřátá lidská krev (opatřená antikolagenním heparinem s nízkou molekulovou hmotností, 20U/ml) se předehřeje během 10 minut na teplotu 37 °C před použitím. Pipetou se na sklíčka nanesou proteinové prostředky podle vynálezu (30 μΐ na sklíčko) a inkubují se 10 minut

- 12CZ 3U15Z4 Bb ve vlhké komůrce při teplotě místnosti než se vloží do perfusní komůrky. Krev se nechá procházet komůrkou (při teplotě 37 °C 5 minut smykovou rychlostí 1300/s.

Pak se sklíčka sejmou, opláchnou se PBS a fixují se 30 minut v 0,25% glutaraldehydu, načež se vybarvil barvivém May-Grlinwald Giemsa. Obr. 9 je typickým příkladem. Extensivní povlečení vybarvenými destičkami je patrné na neošetřeném kontrolním povrchu. Porovnávací povrch předběžně zpracovaný Saratinem ukazuje dramaticky sníženou (o 80%) vazbu na destičky. Adheze destiček se kvantifikuje světelným mikroskopem, jak je patrno na obr. 5 (při 1000-násobném zvětšení), připojeným na počítačový analyzátor obrazu (Leica). Výsledky jsou vyjádřeny procenio tem povrchu pokrytého destičkami a destičkovými agregáty.

Inhibiční působení slin je porovnáno s vyčištěným proteinem (obr. 6). Adheze destiček na destičkách povlečených kolagenem typu III při rychlosti smyku 1300/s se surovými slinami (#616) vytváří inhibici přibližně 48% ve srovnání s kontrolou. Vyčištěný protein (#607); Saratin) doklá15 dá snížení depozice destiček přibližně o 81 % při standardizovaných koncentracích proteinu. Inhibice vyvolaná Saratinem se zvyšuje v závislosti na dávce s vyššími koncentracemi čištěného proteinu (obr. 7).

Příklad 10

Imunizace a protilátky

S první partií vysoce vyčištěného přírodního proteinu, která byla k dispozici, se hned započalo s imunizací zvířat. Imunizační séra se zvýšila u králíků a pro další skríning byla k dispozici vysoce titrovaná reakční činidla. Dostupnými se stala další antiséra, když byly k dispozici peptidové sekvence úplného proteinu a syntetizovaly se tři syntetické peptidy (sekvence aminokyselin 83103, 13-30, 58-69) připojené ke KLH standardním vazebným postupem a použilo se jich pro imunizaci. Ustavila se tři séra zaměřená na segment N-zakončení peptidu a dvě séra specifická pro C-koncové peptidy. S vysoce titrovanými imunitními séry, která byla k disposici, bylo možno zavést a použít technologie Elisa ke sledování a kvantifikování vyčištění přírodně čištěného, stejně jako rekombinantního proteinu. Tak mohla být časově náročná a dosti pracná zkouška intenzivní inhibice destiček nahrazena a byla použita pouze pro potvrzení inhibičního potenciálu konečně vyčištěného proteinu.

Přikladli

Imunitní zkoušky ke stanovení vazby Saratinu

K povlečení 96-důlkových mikrotitračních destiček (Nunc) se použije 50 μΐ okyseleného Hormkolagenu (Nycomed) a přes noc se povléknou roztokem kolagenu (20 pg/ml). Před zkouškou se destičky promyjí třikrát PBS a inkubují se s roztokem BSA (1%), aby se zabránilo nespecifické adhezi. V sérii zředění se přidá 50 μΐ Saratinu a inkubuje se 1 hodinu. Před použitím se destičky omyjí třikrát protilátkou anti-Saratin k detekci. Po další jednohodinové inkubaci se přebytečná protilátka odstraní a sekundární biotinem značená protilátka se použije k detekci. Konečný závěr se provede cestou barevné reakce streptavidinem katalyzovaným POD se substráty jako jsou tablety ODB (Dako) měřenými při 490 nm.

- 13CZ 301524 B6

Příklad 12

Konkurenční zkouška pro skrínování inhibitorů

Rekombinantní tagovaný Saratin (His-tag) připravený podle příkladu 7 se porovnává s nativním netagovaným Saratínem z hlediska vazby ke kolagenu. Způsobem popsaným v příkladu 11 se připraví destičky povlečené okyseleným Horm-kolagenem (Nycomed). Detekce se provede protilátkami králičího anti-Saratínu. Tagovaný a netagovaný Saratin vykazuje totožné vazebné ío vlastnosti. Alternativně se netagovaná verse Saratinu modifikuje biotinylací (Pierce, biotinylační kit) a porovná s nemodifikovaným Saratínem. Vazebné vlastnosti na kolagen jsou totožné. Dále byly provedeny pokusy za použití biotinylovaného Saratinu s konkurenčním nemodifikovaným

Saratínem, peptidu, Saratinu odvozeného ze slin, úplných slin nebo protilátek zaměřených na Saratin. Vazba různých „konkurentů“ ke kolagenu byla testována stanovením vazby biotínylova15 ného Saratinu s pomocí konjugátu streptavidin-POD a ODB-substrátu reakcí k detekci. Této zkoušky s biotinylovaným Saratínem se používá zpravidla ke stanovení koncentrace Saratinu ve slinách (750 pg/l), epitopového mapování na Saratin zaměřených protilátek, vyhodnocování bioaktivního Saratinu, mutovaného Saratinu. K prozkoumání potenciálu testu blokování a neblokování se používá anti-Saratinových protilátek obohacených specifickými peptidy Saratinu.

Příklad 13

Kvasnicový expresní vektor a exprese

Jako typického příkladu exprese kvasnic se používá pichia multi copy expresního systému (Invitrogenu). Konstrukce kvasnicového expresního vektoru je znázorněna na obr. 8. K vytvoření expresního vektoru pro Saratin se použije PCR amplifikační metody ke generování restrikčních zakončení (5'EcoR I, 3'Not I) kompatibilních s vazbou do příslušného vektoru PePIC9K). Násle30 duje 5'primer09 a 3-primerlO.

Před transformováním sferoplastů Pichia se expresní vektor linearizuje se Sal I. Skrínují se kolonie pro His* Mut*-pozitivní mutanty k zaručení integrace Saratinového genu. Typickými podmínkami růstu jsou: teplota 28 až 30 °C až do optické hustoty OD 2-6. Indukce exprese se provádí po resuspendování odstředěných buněk v médiu a přidání methanolu až do konečné koncentrace 0,5 % a uchování těchto podmínek po delší dobu, kterou je zpravidla 24 hodin. Po typické šestidenní fermentaci se produkt získá ze supematantu a analyzuje se způsoby SDSPAGE a ELISA.

Průmyslová využitelnost

Peptid působící proti srážení krve vhodný pro výrobu farmaceutických prostředků pro ošetřování tromboembolických nemocí.

SEQUENCE LISTING [0080] < 110> Merck Patent GmbH <120> Protein for blocking platelet adhezion <130> Saratin Sequence

-14CZ 3V1524 B6 <140>

<141>

<160> 12 5 <170 Patentln Ver.2.1 <210> 1 <211> 375 io <212>DNA <213> Hírudo medicinalis <220 <221>CDS <222> (64)..(372) <400> 1 atgaagtatt tcttgatttc cttcctttgc ctcgcaagct tgctgatctc aactacttct 60

tca gaa

gaa cgt gaa

gat Aap 5

tgt tgg acg ttt tac gcg aac aga aaa tat

108

Glu 1

Glu

Arg

Glu

Cys Trp

Thr

Phe

Tyr 10

Ala

Asn

Arg

Lys

Tyr 15

aca

gac

ttc

gat

aaa

tet

ttt

aag

aag

tec

tet

gat

ctt

gac

gaa

tgc

156

Thr

Asp

Phe

Asp

Lys

Ser

Phe

Lys

Lys

Ser

Ser

Asp

Leu

Asp

Glu

Cys

20

25

30

aaa

aaa

aca

tgt

ttc

aag

acg

gag

tac

tgc

tac

atc

gtt

ttt

gaa

gac

204

Lys

Lys

Thr

Cys

Phe

Lys

Thr

Glu

Tyr

Cys

Tyr

Ile

Val

Phe

Glu

Asp

3S

40

45

acg

gtc

aac

aag

gaa

tgt

tac

tac

aat

gtc

gtt

gat

ggt

gaa

gag

tta

252

Thr

Val

Asn

Lys

Glu

Cys

Tyr Tyr

Asn

Val

Val

Asp Gly

Glu

Glu

Leu

50

55

60

gac

caa

gaa

aaa

ttt

gtt

gtc

gac

gaa

aac

ttc

acg

gaa

aat

tat

ttg

300

Asp

Gin

Glu

Lys

Phe

Val

Val

Asp

Glu

Asn

Phe

Thr

Glu

Asn

Tyr

Leu

65

70

75

aca

gac

tgc

gag

ggt

aaa

gat

gca

ggt

aat

gcg

gca

ggt

aca

ggt

gac

348

Thr

Asp

Cys

Glu

Gly

Lys

Asp

Ala

Gly

Asn

Ala

Ala

Gly

Thr

Gly

Asp

80

85

90

95

gag

tca

gat

gaa

gtt

gat

gaa

gat

taa

375

Glu

Ser

Asp

Glu

Val

Asp

Glu

Asp

100 <210> 2 <211> 103 <212> PRT <213> Hírudo medicinalis

-15CZ 301524 B6 <400> 2

Glu

Glu

Arg

Glu

Asp

Cys

Trp

Thr

Phe

Tyr

Ala

Asn

Arg

Lys

Tyr

Thr

1

5

10

15

Asp

Phe

Asp

Lys

Ser

Phe

Lys

Lys

Ser

Ser

Asp

Leu

Asp.

Glu

Cys

Lys

20

25

30

Lys

Thr

Cys

Phe

Lys

Thr

Glu

Tyr

Cys

Tyr

Ile

Val

Phe

Glu

Asp

Thr

35

40

45

Val

Asn

Lys

Glu

Cys

Tyr

Tyr

Asn

Val

Val

Asp

Gly

Glu

Glu

Leu

Asp

50

55

60

Gin

Glu

Lys

Phe

Val

Val

Asp

Glu

Asn

Phe

Thr

Glu

Asn

Tyr

Leu

Thr

65

70

75

60

Asp

Cys

Glu

Gly

Lys

Asp

Ala

Gly

Asn

Ala

Ala

Gly

Thr

Gly

Asp

Glu

65

90

95

Ser

Asp

Glu

Val

Asp

Glu

Asp

100 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence io <220 <223> Description of Artificial Sequence degenerate primerOl <400 3 gargarmgng argaytgttg gac <210 4 <211> 23 <212>DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Description of Artificial Sequence.degenerate primer02 <400> 4 gargarmgng argaytgcrg gac <210>5 <211> 24 <212>DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Description of Artificial Sequence: primer03

-16CZ JU1524 BĎ <40O> 5 gcategatgg aagaacgtga agac <210>6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence io <220>

<223> Description of Artificial Sequence: primer04 <400> 6 cagcgctttt gaegtegtcg tea 23 <21O> 7 <211> 26 <212>DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Description of Artificial Sequence: primerOS <400> 7 gaagaaegea aggatgagga ttatcg 26 <210> 8 <211>25 <212>DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Description of Artificial Sequence: primerOó <400> 8 aagcttctag tcttcgtcaa cttcg 25 <210> 9 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Description of Artificial Sequence: primer07 <400> 9 cggatccatg aaattcttag tcaacgttge ccttgttttt atggtcgtat acatctctta 60 catctatgcg gaagaacgtg aagattgttg gact 94

-17CZ 301524 B6 <2I0> 10 <211>24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Description of Artificial Sequence: primer08 io <400> 10 ggtaectcac atatcttcat caac 24 <210> 11 15 <211>30 <212>DNA <2t3> Artificial Sequence <220>

<223> Description of Artificial Sequence: primer09 <400> 11 gcatgcggcc gcctaatctt catcaacttc 30 <210> 12 <211> 27 <212>DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Description of Artificial Sequence: primerlO <400> 12 35 gcatgaattc gaagaacgtg aagattg 27

Claims (21)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polypeptid izolovaný z H. medicinalis mající molekulovou hmotnost přibližně

   45 1 2 0 00 ± 1 kD s biologickou aktivitou inhibitoru na kolagenu závislé adheze krevních destiček, který vykazuje v celé délce alespoň z 80 % identitu s aminokyselinovou sekvencí SEQ.ID.NO.2.
2. 2. Polypeptid podle nároku 1 s isoelektrickým bodem pH
3. 3,7 ± 0,5.

   so 3. Polypeptid podle nároku 1 nebo 2 se šesti cysteinovými molekulami schopnými tvořit S-S můstky.
4. 4. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, s aminokyselinovou sekvencí SEQ.ID.NO.2.

   - 18CZ 301524 B6
5. 5. Izolovaný polynukleotid kódující polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.
6. 6. Izolovaný polynukleotid obsahující sekvenci DNA SEQ.ID.NO. 1 nebo sekvenci DNA 5 komplementární k sekvenci DNA kódující polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.
7. 7. Polynukleotid obsahující sekvenci DNA, která vykazuje v celé délce alespoň 80% identitu se sekvencí SEQ.ID.NO. 1.

   io
8. 8. Expresní vektor obsahující sekvenci DNA podle nároku 6 nebo 7.
9. 9. Hostitelská buňka obsahující expresní vektor podle nároku 8.
10. 10. Expresní systém obsahující hostitelskou buňku podle nároku 9.
11. 11. Způsob přípravy polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků laž4, vyznačující se tím, že se expresní systém podle nároku 10 kultivuje za podmínek postačujících pro produkci polypeptidu a polypeptid se izoluje ze supematantu kultury nebo z buněčného zbytku.

    20
12. 12. Protilátka imunospecifická pro polypeptid se sekvencí SEQ.ID.NO.2.
13. 13. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 a farmaceuticky přijatelný nosič nebo jeho excipient.

    25
14. 14. Farmaceutický prostředek podle nároku 13 pro použití na léčení tromboembol ických procesů.
15. 15. Farmaceutický prostředek podle nároku 13 nebo 14, vyznačující se tím, že obsahuje přídavná léčiva zvolená z aspirinu, heparinu nebo streptokinázy nebo jejich kombinace.
16. 16. Použití polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 pro výrobu léčiva pro léčení tromboembolických onemocnění.
17. 17. Použití polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 na ex vivo potahování umělých 35 povrchů.
18. 18. Použití polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 na ex vivo modifikaci nitroočních čoček na zmírnění trombogenicity materiálu čočky.

    40
19. 19. Použití polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 na ex vivo kontaktování povrchu

    Čočky.
20. 20. Použití polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 na ex vivo kovalentní zesítění k modifikaci materiálu čočky.
21. 21. Použití protilátek podle nároku 12 a polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 na ex vivo měření polypeptidu produkovaného způsobem podle nároku 11 u léčeného subjektu.

    9 výkresů