CZ20013341A3 - Protein k blokování adheze destiček - Google Patents

Description

Vynález se týká protein k blokování adheze krevních dest i ček.

Dosavadní stav techniky

Při hemostázi nebo trombóze ulpívají destičky na vnější buněčné matrici poškozené cévy nebo pokrývají povrch poškozené oblasti. Preventivně zabránit tomuto významnému počátečnímu stupni patogeneze trombózy a uzavření tepen by mělo mít terapeutickou výhodu při úsilí o prevenci trombotických nemocí. Kolagen se považuje za nejvíce trombogenní povrchovou složku a ukázalo se, že je silným podporovatelem adheze destiček, srážení a uvoňování jejich granulí vedoucí k navození (Ruggeri, Z.M. a kol.: Seminars in Hematology, 31, str. 229 až 239, 1994) přídavných destiček do takové oblasti k vytváření sraženin a trombu. Počáteční kontakt destiček s povrchem cévy je zprostředkováván kolagenem vázaným von Wi 11ebrandovým faktorem (vWF) a specifickým receptorem vWF na destičky, glykoproteinovým komplexem Ib-V-IX. Kromě toho ADP, epinefrin a cirkující srážecí faktory podporují další aktivaci destiček, přičemž současné narůstání trombinové aktivity přispívá k vytváření zesítěné fibrinové sraženiny. Agregace destiček k destičkám podporuje tento proces a je hlavně podporována fibrinogenem jako zprostředkovatelem, který přemosťuje buňky prostřednictvím receptoru glykoprotei nu Ilb/IIIa.

Tato normální fyziologická odezva.je dosti kritická v průběhu patologického procesu, kdy destičky ulpívají na kolagenech obnažených ve sklerotických poraněních (Van der Rest M. a • ·

kol, FASEB Journal 5, str, 2814 až 2823, 1991) a začínají vytvářet okluze. V závislosti na umístění a na rozsahu mohou mít okluze vážné dusleky, jako je infarkt myokardu, mrtvice, zánět nebo ebolie plic.

Jako přímo působící protitrombické činidlo blokuje heparin aktivitu trombinu a tak zabraňuje tvoření trombů bohatých na fibrin a je v současné době běžně nejznámější drogou používanou v protitrombických zákrocích. Heparinu se používá v široké míře všude tam, kde jde o nestabilní angínu a akutní infarkt myokardu. Avšak přes široké použití, zůstávají dosud nevyřešené některé závažné problémy, jako je intravenosní aplikace, potřeba anti -trombi nu-111 jako kofaktoru, snížená afinita pro trombin vázaný na shluky, jeho inaktivace některými plasmovými proteiny, případné vyvolání trombocytopenie a biologická různorodost. V důsledku toho nebyly dosud překonány důsledky používání heparinu v klinické praxi.

Poslední vývoj heparinu s nízkou molekulovou hmotností přispěl k možnosti subkutánní aplikace, avšak terapeutická výhodnost oproti standardnímu heparinu je mírná. Totéž platí i o jiných přímo působících antitrombinech jako je Hirudin, Hirulog a Warfarin. Jako jeden z hlavních problémů se jeví zvýšená produkce trombinu při antitrombickém léčení (Rao, A.K. a kol., Circulation 94, str. 389 až 2395, 1996).

Jiné nové přístupy se proto zaměřovaly na proces protrombinové aktivace, která je poporována faktorem Xa. Výzkum se zaměřil na konstrukci vhodných inhibitorů zaměřených na tento faktor. Celkově nutmo konstatovat, že plný terapeutický potenciál intervence tohoto typu nebyl dosud realizován.

Jiná skupina terapeut ik je reprezentována trombolytickými režimy a vývoj se zaměřuje na stafylokinázy, streptokinázy, urokinázy typu plasminogenového aktivátoru, tkáně typu Plasmi-

nogenového Aktivátoru a na anisoylovaný plasminogenstreptokinázový aktivátorový komplex. Rozdíly v čase, potřebném k vyvolání reperfuse, se významně liší u každého z těchto trombolytických činidel, avšak pokrok vyjádřený snížením celkové úmrtnosti je stejný u všech těchto produktů. Kromě toho jsou častými komplikace reokluse nebo prodloužené krvácení. To může být způsobeno poměrně nízkou specifičností pro fibrin a krátkým poločasem těchto sloučenin v plasmě. Běžně se testují různé aplikační režimy a kombinace různých fibrinolytických principů k překonání některých běžných nedostatků v trombolytické terapii. Očekávaná zlepšení jsou však spíše malá.

V poslední době se objevila nová skupina pacientů s problémy, jako je akutní trombotická okluze a pozdní restenóza, způsobenými zákroky jako je angiopiastie, aterotomie, arteriální štěpování nebo stentování cévní stěny. Možné terapeutické zákroky zahrnují protidestičkové, antitrombotické a trombolytické strategie. Různá jiná činidla, jako je ticlopdin, působící jako ADP antagonist nebo ionofor vápníku A-23187, a zejména aspirin mají přímý vliv na funkci destiček a byla navrhována nebo používána k prevenci nebo k minimalizaci shlukování destiček. Nová látka proti adhezi destiček podle vynálezu by mohla také pomoci překonávat tyto klinické komplikace, je-li aplikována v průběhu chirurgického zákroku.

Jiná komplikace týkající se tohoto problému nastává, dostanou-1 i se umělé povrchy do styku s krví. Mají pak vzrůstající tendenci navozovat trombotické příhody aktivací destiček a/nebo navozováním srážení. Tyto jevy mohou způsobovat poruchu cévních štěpů, srdečních chlopní, stentů, katetrů nebo jekéhokoli jiného zařízení nebo materiálu přicházejícího do styku s krví. Schopnost proteinu podle vynálezu vytvářet netrombogenické povrchy může být proto využita imobilizací tohoto proteinu na materiálech a shora uvedených zařízeních. Takové zpracování by mělo takovým materiálům a zařízením dodat ····· ·· · · ·· · • 4 « · ♦ · · f·*· • · · · · · ··· • · · · ······ · · ·· ·· ···· ···· ·· ·· ·· ··· biokompatibi1 i tu a učinit je tromboresistantními. Vzhledem k omezením souvisejícím s dostupnými antitrombotickými činidly existuje aktuální potřeba nových alternativních strategií a léčebných postupů.

K dalšímu zlepšování léčby kardiovaskulárních poruch mohou přispět přístupy podle vynálezu, které přímo narušují adhezi destiček vyvolanou kolagenem a nebo vWF faktorem. Některými novými inhibitory, které brání adhezi destiček jsou monoklonální protilátky zaměřené na vWF. Již je známo, že glykoproteinové inhibitory Ilb/IIIa mohou být vhodné k inhibici adheze destiček. Některé z těchto inhibitorů, c7E3 byly již klinicky testovány, zatímco bitory KGD a RGDF se stále studují. Avšak jako monoklonální Ab ostatní, jako inhispecifičnost většiny těchto nových inhibitorů není příliš dobře prostudována, takže spektrum vedlejších účinků, které budou vyvolány použitím těchto inhibitorů je stále otevřené a vyžaduje pečlivé prozkoumán í.

zdrojem kolagenem živočichů pro skríning nových vyvolanou adhesí saj ících krev.

něko1 i k př í rodn í ch izolovaný z Hirudo světový

B1 ood a protein

Bohatým terferuj í s prostřednictvím mo, že bylo izolováno 65 kD nazývaný calin, patentový spis

92/07005) (Munro R. 2, str. 179 až 184, číslo 5 587360, a kol., 1991) sloučenin, které indestiček, je příroda Z literatury je znáinhibitorů: protein A medicinalis (americký spis číslo WO F ibr i nolys i s izolovaný ze patentový

Coagulation and

16kD (LAPP) slinných žláz pijavky Haementeria officinalis (americký patentový spis číslo 5 324715).

Oba proteiny byly popsány jako inhibi tory agregace podle testů statickým zkoumáním adheze destiček způsobované kolagenem.

Přes úspěšné důkazy in vitro, selhalo působení LAPP v několika dobře zavedených modelech in vivo (Schaffer L.W. a kol., Arteriose1er. Thromb. 13, str. 1593 až 1601, 1993; a • · · · ·· ···

Connolly T.M. a kol., Thromb. Haemostas. 69, str. 589, 1993). Měkké klíště Ornithodoros moubata také obsahuje protidestičkový protein (moubatin), který působí v prevenci kolagenem způsobované agregace destiček (Waxman L. a kol., J. Biol. Chem. 268, str. 5445 až 5449, 1993). Jiný inhibitor agregace destiček u krev sající štěnice objevili Noeske-Jungblut C. a kol. (světový patentový spis číslo WO 9309137). Smith a kol. izoloval protein 50 kDA z hadího jedu a protein 19 kDa byl izolován ze slin krev sající štěnice Triatoma pal 1idipennis. Zjistilo se, že protein obsahuje faktor, který specificky inhibuje kolagenem způsobovanou agregaci destiček. Protein 19 kDa, nazývaný pallidipin, inhibuje kolagenem způsobovanou agregaci destiček v plasmě. Nezjistila se žádná inhibice agregace stimulovaná jinými činidly (ADP, thrombin, thromboxan A2 mimetický U46619, phorbolester). Pallidipin neměl žádný účinek na adhezi destiček kolagenem, inhiboval však uvolňování ATP z destiček. Byl v opačné interakci s destičkami a mohl se spojit s kolagenem v jejich společném cíli. Přesný mechanismus působení a terapeutický zisk z tohoto proteinu se právě zkoumá. Gan a kol. popisuje eschistatin jako inhibitor vázající receptor fibrinogenu GPIIa/IIIb (J. Biol. Chem. 283, str. 19827 až 32, 1988).

Přes tento intenzivní vývoj, pokračuje snaha vyvinout další protisrážlivé a protitrombinové prostředky, které mají větší účinnost při inhibici tvoření shluků, aktivaci destiček vyvolané vWF nebo aktivaci endothelových buněk a které by byly použitelné farmaceuticky a které by se mohly vyrábět v průmyslově proveditelných množstvích. Jelikož žádný ze známých dosud popsaných proteinů nebyl dosud vyvinut do podoby sloučeniny s ideálním terapeutickým profilem, zaměřil se vynález na tento problém.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je polypeptid izolovaný z H. medicína lis mající molekulovou hmotnost přibližně 12 000 ± 1 kD a biologickou aktivitu inhibitoru adheze destiček závislé na kolagenu.

Vynález se tedy týká ihibitoru izolovaného z H. medicinalis, který působí přímo na interakci kolagen-destičky, takže inhibuje aktivaci destiček a časnou interakci destičky-destičky.

Dosud se v i teratuře nevyskytl pozitivní příklad, který by naznačil, že agregace stejně použitím skríningu by se vyloučily inhibitory jako lytické proteiny ze zdrojů přírodně se vyskytujících sloučenin, které by identifikovaly nové antiad hesivní mechanismzmy nebo sloučeniny. Tohoto přístupu se však využilo v tomto vynálezu. Jelikož je známo nejméně šest různých destičkových povrchových glykoproteinů, které se podílejí na kolagenové adhesi a přidávání několika sloučenin odvozených z destiček, jako je Willebrandův faktor, fibronektin a throm bospondin, se ukázalo se jako nepřímí zprostředkovatelé adheze kolagen-destičky, bylo jen málo optimismu v úsilí započít identifikovat nové inhibitory adheze.

Nicméně bylo tohoto přístupu použito ke skríningu slin

H i rudo medicinalis, přičemž se vědělo, že ne všechny dokumentované nebo neznámé inhibitory odvozené z vWF stejně jako sloučeniny působící přímo na receptory destiček by mohly být vyloučeny. Proto byl výsledek skríningu překvapením:

nový protein nazvaný Saratin s protiadhesivní aktivitou pro destičky, který je možno izolovat z tkání a sekretů dobře prozkoumané pijavky druhu Hirudo medicinalis.

Vynález se týká aktivního polypeptidu Saratinu izolovaného z pijavek Hirudo medicinalis. Protein byl izolován ze slin kombinací tlakované dialyzy a alespoň jednoho chromatografického kroku podobného anexové chromatografií a alespoň jednoho • · kroku vysoce výkonné reversní fázové chromatografie (RP-HPLC). Ukázalo se, že tlaková dialyza je absolutně rozhodující v průběhu získávání Saratinu ze slin, jelikož silná koncentrace slin napomohla k překonání jinak vvwýrazné ztráty bioaktivního Saratinu. Izolovaný Saratin se váže silně na několik kolagenů a blokuje adhezi destiček ke kolagenu povlečenému takovými povrchy způsobem závislým na dávce.

K optimalizaci byla vyvinuta skrinovaci kaskáda současně dostupných technik k rozlišení adheze destiček a agregace destiček: zjišťuje se schopnost destiček zpomalovat nebo zastavit průtok vlákny, příspěvek destiček k vytváření shluků in vitro, adheze na skleněných kuličkách, nebo průtoky plné krve přes filtr a adheze destiček antikoagulováné plasmy bohaté na destičky na filtrech sestávajících ze skleněných vláken nebo z kolagenu pod regulovaným tlakovým gradientem.

Protein (pojmenovaný Saratin) je charakterizován sekvencemi aminokyselin vyznačenými v sekvenci (SEQ.ID.NO.2) a sestává ze 103 aminokyselin, které zaujímají teoretickou relativní molekulovou hmotnost přibližně 12068 daltonů ± 1 kDa. Protein vykazuje jedinečnou primární strukturu bez významné podobnosti s jinými dříve objevenými sekvencemi. Protein je bohatý na asparagovou a glutamovou kyselinu, které přispívají k nízké isoe1ektrické hodnotě pH 3,7 +0,5 molekuly, měřeno IEF-PAGE.

Analýza SDS-PAGE prokázala silný posun mobility po redukci proteinu elektroforézou, naznačující posttranslační modifikace. Sekvencování polypeptidu ukázalo šest cystě inových molekul, které by mohly tvořit posttranslační modifikace proteinu. Hmotová spektrometrie Sarafinu elektronovým paprskem ukázala aktuální molekulou hmotnost 12061, což naznačuje, že ve formování sekundární struktury nativní formy proteinu se zúčastňují až tři disulfidické vazby. Inhibitor adheze podle vynálezu je nový, jelikož se liší od známých inhibitorů agregace izolovaných z pijavic, zvláště z Calin nebo LAPP molekulovou hmotností, isoelektrickém bodem, sekvencí aminokyselin a biologickými aktivitami.

Vynález se týká rovněž izolované DNA zaujímající polynukleotid kódující inhibitor adheze destiček odvozený z pijavic, mající sekvence aminokyselin, jak ukázáno pro protein. Sekvence nukleotidů představující klon cDNA je v SEQ.ID.NO.1. Poloha 1 až 63 sekvence nukleotidů reprezentuje domnělou vůdčí sekvenci 21 aminokyselin a poloha 64 až 372 obsahuje otevřený čtecí rámec kódující polypeptid zbytků 103 aminokyselin a sekvenci aminokyselin uvedenou pro přírodní protein v SEQ.ID.NO.2

Vynález se týká také rekombinantních vektorů, které obsahují syntetický gen kódující inhibitor adheze destiček odvozený v pijavic podle vynálezu a hostitelských buněk, obsahujících rekombinantní vektory. Způsoby k získávání a izolování expresovaných proteinů byly založeny na technologiích značení nebo byly převzaty z čisticího schéma vyvinutého pro přírodně se vyskytující Saratin. V závislosti na individuálních protokolech používaných pro extracelulární a intracelulární expresi v buňkách kvasnicových, hmyzích , ledvinových, v buňkách mláďat křečků a v buňkách E.coli transformovaných vhodnými vekto ry, je třeba upravit kroky k získávání rekombinantního proteinu ze supernatantu nebo ze sedimentů způoby známými pracovníkům v oboru. Výtečná exprese ti tel i, kde per iplasmatická sekvence pelB. Bylo dosaženo coli (E.coli) (přibližně 5 V souběžném experimentu bylo byla nalezena v E.coli jako hosexprese přispěla začleněním vůdčí získávání produktů z Escherichia mg/1) po osmolýze a odstředění.

použito Saccharomyces cerevisiae (S.cerevisiae) (kultivační lázeň >10 mg/1) s alternativním, z kvasnic převzatým vektorem v paralelním materiál byl izolován odstředěním. Čištění pokusu. Sekretováný bylo dosaženo příčnou f i 1trac í a ionexovou chromatograf i í.

U ostatních expresí

9 ·· ··· • · « «>»· ' I *' • · ·····’· • · ♦· ·♦··♦· t♦ • · · ♦ « ♦ · · · ·9 9 · používajících buněk buď COS nebo CHO byla exprese přibližně 750 ng/ml. Elektroforetickou a chromatografickou analýzou bylo prokázáno, že vyčištěný rekombinantní materiál je čistý a homogenní a identický se slinami odvozenými ze Saratinu, jak dokládá sekvencování aminokyselin a stanovení molekulové hmotnosti .

Vynález se týká také způsobu izolace aktivního proteinu ze surových slin pijavic a měření jeho aktivity vůči destičkám statickými a dynamickými zkušebními způsoby stejně jako použití těchto způsobů k izolování rekombinantního proteinu.

Způsoby výroby Saratinu objasňují příklady 6, 7, 8 a 13, avšak použité způsoby exprese nejsou omezeny na tyto příklady. K expresování Saratinu může být stejně použito například transgenních myší nebo jiných organismů včetně jiných savců.

Proteiny podle vynálezu zahrnují varianty, které konzer vují aktivity objevených sekvencí, včetně fragmentů nebo sub jednotek, přírodně se vyskytujících variant, allelových variant, nahodile generovaných umělých mutantů sekvencí jako je adice, které konzervuje nebo subjednotky se týkají kterékoli části sáhuje méně aminokyselin než úplný protein, a záměrných variant aktivitu. Fragmenty sekvence, která obnapříklad sekvence vyřazující části N- nebo C-zakončení úplného proteinu.

Dále se vynález týká také hybridních proteinů, jako jsou fúzní proteiny nebo proteiny pocházející z exprese množství genů v expresním vektoru a mohou zahrnovat polypeptid mající specifickou aktivitu objeveného proteinu řízenou peptidovými vazbami na druhý polypeptid. Jmenovitě vynálezu zahrnuje varianty proteinů, obzvláště veškeré varianty, které se liší od izolováného proteinu pouze konzervativní substitucí aminokyseliny. Takové konzervativní substituce aminokyselin definoval Taylor a kol. (J. Mol. Biol. str. 188 až 233, 1986).

···:

• ·

9999 * ·· • 4 4«

499 9

9· • 44·

Zahrnuty jsou také způsoby používání proteinu k prevenci nebo zpožďování aktivace destiček inhibici interakcí kolagen/ destičky. Protein se hodí k prevenci, k profylaxi, k terapii a k léčení trombotických chorob. Na rozdíl od těchto dříve popsaných proteinů, které působí na různé povrchové proteiny na destičce, má protein podle vynálezu jedinečný mechanizmus působení. Váže se pevně na povrch kolagenu a jeden z jeho mechanizmů působení je dán pokrytím specifických stran kolagenu, které už nejsou k disposici pro interakce a vázání destiček. Typ nového mechanizmu má velkou přednost v tom, že během aplikace proteinu zůstanou destičky funkčně nedotčeny, takže z tohoto ošetřování lze očekávat velmi malé nebo dokonce žádné krvácení .

Jinou velkou oblastí použití je ošetřování různých povrchů proteinem, aby se staly neadhezivní pro destičky a tím vytvářejí zařízení kompatibilní s krví.

Jak bylo shora uvedeno, hodí se polypeptidy podle vynálezu jako farmaceuticky účinné sloučeniny pro farmaceutické prostředky a kombinace.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu mohou případně obobsahovat přídavné aktivní přísady jako je aspirin, protisrážlivé prostředky jako je hirudin nebo heparin nebo trombolytxcká činidla jako je plasminogenový aktivátor nebo streptok i náza.

Nové polypeptidy podle vynálezu mohou vytvářet farmaceuticky přijatelné soli se všemi netoxickými, organickými nebo anorganickými kyselinami. Jako příklady anorganických kyselin se uvádějí kyselina chlorovodíková, bromovodíková, sírová, nebo fosforečná a kovové soli jako natriummonohydrogenortofosfát a kal iumhydrogensulfát. Jako organické kyseliny se příkladně uvádějí kyseliny mohokarboxylové, dikarboxylové a tri1 1 φφφ · * * I φ φ ♦ * φ 4 4«φ • φ · φ * ΦΦΦΦ

karboxylové, jako je kyselina octová, glykolová, mléčná, pyrohroznová, malonová, jantarová, glutarová, fumarová, jablečná, vinná, citrónová, askorbová, maleinová, hyroxymaleinová, benzoová, hydroxybenzoová, fenyloctová, sklořicová, salicylová a sulfonové kyseliny, jako kyselina methansulfonová. Soli aminokyseliny s karboxylovým zakončením zahrnují netoxické karboxylové kyseliny vytvořené s jakoukoliv anorganickou nebo organickou zásadou. Tyto solí zahrnují například soli alkalických kovů, jako je sodík a draslík, kovů alkalických zemin, jako je vápník a hořčík, lehkých kovů skupiny IIIA včetně hliníku a organických primárních, sekundárních a terciáních aminů, jako jsou tria1ky1aminy včetně triethylaminu, prokainu, dibenzylaminu, 1-ethenaminu, N,Ν’ -dibenzy1ethy1endiaminu, dihydroabietylaminu a N-alkylpiperidinu.

Pojmem farmaceuticky přijatelný nosič se zde rozumí inertní netoxické nebo tekuté plnidlo, ředidlo nebo zapouzdřovací materiál, neragující nepříznivě s účinnou sloučeninou nebo s pacientem. Vhodné, s výhodou kapalné nosiče jsou v oboru dobře známy, jako sterilní voda, solanka, vodná dextróza, cukerné roztoky, ethanol, glykol a oleje, včetně minerálního, ž i voč i šného, rošt1 i ného nebo syntetického původu, například podzemn i cového, sojového a minerálního oleje.

Prostředky podle vynálezu se mohou podávat v jednotkových dávkách obsahujících běžné netoxické farmaceuticky přijatelné nosiče, ředidla, pomocná činidla a pojidla, které jsou typické pro parenterální podávání.

Pojem parenterální zahrnuje subkutánní, intravenozní, intraartikulární a intratracheální injekční a infuzní techniku. Vhodné jsou též jiné způsoby podávání, jako orální a topické. Parenterální prostředky a kombinace jsou nejvýhodněji podávány intravenozně, buď v bolusové formě nebo jako konstantní fúze podle známých způsobů.

• ·· ·

Tablety a kapsle pro orální podávání obsahují konvenční excipienty, jako jsou pojivá, plnidla, ředidla, tabletovací činidla, mazadla, desintegrační činidla a smáčedla. Tablety mohou být povlečeny v oboru známým způsobem. Orální kapalné prostředky mohou být ve formě vodných nebo olejových suspenzí, roztoků, emulzí, syrupů a vodiček, nebo mohou být podávány jako suchý produkt ke smísení s vodou nebo s jiným vhodným nosičem před použitím. Takové tekuté prostředky mohou obsahovat obvyklé přísady, jako suspenzační činidla, emulgátory, nevodné nosiče a konzervační činidla. Topické prostředky mohou být ve formě vodných nebo olejových suspenzí, roztoků, emulsí, želé a s výhodou emulžních mastí.

Jednotkové dávky podle vynálezu mohou obsahovat denní potřebné množství proteinu podle vynálezu, nebo jeho podíly k vytvoření požadované dávky. Optimální terapeuticky přijatelná dávka a rychlost pro daného pacienta (savce včetně lidí) závisí na mnoha činitelech, jako jsou účinnost specifické použité účinné látky materiálu, věk, tělesná hmotnost, celkový zdravotní stav, pohlaví, dieta, doba a cesta podávání, rychlost vylučování, aktivita enzymu (jednotek/mg proteinu), účel ošetřování, to znamená terapie nebo profylaxe a povaha trombotické ošetřované nemoci, požadovaná protidestičková nebo asntikoagulační aktivita.

Proto v prostředcích a kombinacích pro léčeného pacienta (in vivo) je farmaceuticky účinná denní dávka proteinu podle vynálezu přibližně 0,01 až 100 mg/kg tělesné hmotnosti s výhodou 0,1 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti. Podle formy podání může jedna samotná dávka obsahovat 0,5 až 10 mg thrombi nového inhibitoru. K dosažení antikoagulačního účinku v mimotělní krvi se farmaceuticky účinné množství peptidu podoe vynálezu 0,2 až 150 mg/1, s výhodou 1 až 20 mg/1 mimotělní krvi.

Vynalez se také týká implantovatelných nebo mimotělních

• ·· · ·· ·· ♦· ··· medicinálních zařízení pro použití ve styku s tělesnými kapalinami, přičemž povrchům těchto zařízení je dodána tromboresistence povlečením imobi 1 izovaným polypeptidem podle vynálezu. Polypeptid podle vynálezu se imobilizuje na medicinálním zařízení tak, aby byl povrch biokompatibilni a tromboresístentní. Takové zařízení má někdy povrchové vlastnosti, které navozují agregaci destiček, což je nevýhodné při záměru jejich použití pro implantovate1ná nebo mimotělní medicinální zařízení, která mají přicházet do styku s krví nebo s jinou lidskou kapalinou. Jakožto příklady takových zařízení, která se zpravidla vyrábějí z plastů, se uvádějí protézy, umělé orgány, oční čočky, sutury, umělé cévní segmenty, katetry, dyalyzátory, trubičky a cévy pro vedení krve.

Posteri orní zkalení pouzdra (posterior capsule opacification =PCO) je běžnou komplikací po extrakcí kataraktu přes moderní chirurgické způsoby a čočky, které se pro tyto účely používá. PCO je způsobeno proliferací a migrací čočkových epitelových buněk posteriorním pouzdrem, čímž se snižuje zraková ostrost. Fyzikální ošetření, jakož také chemicky modifikované čočky byly navrženy ke snížení PCO. Pro snížení PCO byly navrženy heparinové povlaky čoček nebo topické heparinové oční kapky, což naznačuje, že trombogenní mechanizmy se podílejí na vytváření PCO.

Ukázalo se, že Saratín má významné přednosti oproti heparinu v prevenci a blokování trombogeneci ty. Vynález se proto dále týká povlaku obsahujícího Saratín, který sníží trombogenec i tu materiálu čoček, používaného pro refrakční anteriorní nebo posteri orní pouzdro očních implantátů, které se mohou chirurgicky implantovat do oka. Tento nový typ povlaku čelí problémům se stimulovaným růstem buněk. V kombinaci s ostatními léčivy, která například způsobují smrt buněk, pomáhá Sarati nový povlak k úplnému předcházení PCO.

- 14 4 4444 44 ····

4* 4 4444444

4 4 · · · · ·

4 44 44444«4

4 4 4 4 4 ·

Přehled obrázků na výkrsech

Obr.l Separace složek slin. Eluce Saratinu je vyznačena * .

a) Separační profil slin po DEAE anexové výměně. Frakce Saratinu se sbírají z píku 3. (příklad 2)

Na ose x je množství v ml, na ose y jsou jednotky AU. Pufry: A) 20 mM Tris, B) pufr A, 1M NaCl. Průtočná rychlost 10 ml/min

b) Rechromatografie shromážděných frakcí na Mono Q HR5/5. Vzorky se shromažďují z poslední části hlavního píku, jak naznačeno čarou (příklad 2)

Na ose x je množství v ml, na ose y je absorbance 280 nm. Pufry: A) 20 mM Tris, B) pufr A, 1M NaCl. Průtočná rychlost 1 ml/min.

c) Poslední chromatografický krok semi - preparát ivní analytické RP-HPCL pozitivních frakcí Saratinu shromážděných z Mono Q HR5/5 (příklad 2). Aktivní Saratin získán z hlavního píku (pík 3)

Na ose x je čas v min, na ose y jsou jednotky AU.

Pufry: ft: H₂0.0,l% TFA B= CH₃CN.O,1TFA

Obr.2 SDS-PAGE shromážděných frakcí z RP-HPLC.

Positivní frakce Saratinu jsou označeny * (příklady 2 a 3)

Obr.3 Expresní vektor E.coli pro Saratin (příklad 7)

Obr.4 Baču1o donorový plasmid pro Saratin (příklad 8)

Obr.5 Plná krev byla vystavena umělému kolagenovému povrchu a adheze destiček se zviditelnila vybarvením. Saratinu se použilo jako inhibitoru (protein 11607) příklad 9 Rychlost smyku: 1300 s^-1.Lidská krev. Kollagen typu III z lidské placenty. 30 yl/sklíčko na překrytí mikroskopického vzorku (i na obr. 6 a 7 se sklíčkem myslí sklí• · ·

9·· 9 9 * čko na překrytí mikroskopického vzorku). První obrazec se týká kontroly, druhý proteinu tt 607.

• ·9 • ·· ♦ ·· •9 ·· • 9 ·

9· 9·

Obr.6 Inhibice adheze destiček na sklíčko povlečené kolagenem typu III za smykových podmínek. Porovnání slin a Saratinu. Příklad 9.

Kollagen typu III z lidské placenty.

Sliny tt 616 0,11 mg/ml: 30 yl na sklíčko n=4

Protein tt 607 0,11 mg/ml: 30 μ1 na sklíčko n=2

Na ose x jsou: _v prvním sloupci kontroly, ve druhém sloupci roztok, ve třetím sloupci sliny tt 616, ve čtvrtém sloupci protein tt 607. Procentový údaj u třetího a čtvrtého sloupce udává úrocento inhibice.

Na ose y je pokrytá plocha (.%) .

Obr.7 Saratin objasňuje na dávce závislou inhibici vazební adheze destiček na skíčkách povlečených kolagenem typu III za smykových podmínek. (Příklad 9).

Protein tt 607. Kollagen typ III z lidské placenty

První sloupec se týká roztoku

Na ose x je koncentrace [pg/mll, na ose y je % inhibice.

Obr.8 Kvasnicový expresní vektor pro Saratin (příklad 13). Vůdčí oř-faktor Saratinu.

Vynález blíže objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Skríning inhibitoru adheze

Funkčním základem pro skríning čtyř složek slin je adheze

16 -
9	9999 99	99 99 9
··	9 9 9	9 9 9 9	9 9
•	9 9 9	9 9 9 ·	9
•	9 9 9 9	99999 9	9
•	9 9 9	9 9 9	•
999	9 ·♦	99 99	99 9

destiček na kolagenu. Čtyři přídavné testy jsou vhodné pro posouzení různého působení antitrombotických drog, jako je zkouška AZOCOLL, zkouška aktivity amidázy, von Willebrandův test vázání a zkouška agregace destiček, k vyloučení funkčních vlastností, které by ideálně nebyly vázány na inhibitor adheze. Jelikož většina zde použitých testů jsou standardní zkoušky, je třeba zkoušku adheze destiček modifikovat, aby vyhovovala specifickým potřebám studie. Podstata testu: Horm kolagenem (Nycomed) se povléknou 96-důlkové destičky (Nunc) za použití okyseleného kolagenu v koncentraci 20 yg/ml a destičky se inkubují přes noc. Po promytí destiček třikrát PBS se blokuje zbylý povrch důlků 1% BSA. Destičky izolované čerstvě z lidské citrony1 ováné krve se přidají současně s frakcemi odvozenými z jednotlivých sloupcových stupňů. Případně se provede předběžná aktivace destiček jejich inkubací před použitím TBS v přítomnosti hořečnatých iontů. K porovnání inhibiční aktivity se použije jako standardu surových slin, standardizovaných na celkovou koncentraci proteinu 200 jug/ml. Ukázalo se, že test inhibice destiček je velmi choulostivý na změny pufru a zvýšené koncentrace soli. Ačkoli byly všechny vzorky zpracovány ionexovou chromatografií, ukázalo se, že přímé testování frakcí ve zkoušce inhibice je komplikované a nespolehlivé. Proto byly všechny testované vzorky aplikovány na koncentrační stupeň na Centrikonové bázi, který současně snižuje iontovou sílu a podporuje koncentraci před měřením.

Příklad 2

Čištění přírodního inhibitoru

Vynález používá slin shromážděných od H. medicinalis, o kterých je známo, že obsahují řadu bíoaktivních proteinů jako je hirudin, elastázové inhibitory, kolagenázy a inhibitory agregace destiček, jako je calin (Munro, R. a kol., Blood Coagulation and Fibrinolysis 2, str. 179 až 184, 1991) a LAPP ··*« (Schaffer L.W. a kol., Arterioskler. Thromb. 13, str. 1593 až 1601, 1993). Vedle těchto charakterizovaných proteinů zůstává stále neznámou většina přibližně 80 proteinů zjistitelných SDS-PAGE. Podle vynálezu je použito v příkladu 1 popsaných frakcionovaných slin a skrínovací strategie pro nové proteiny, které přímo interferují s interakcí destiček a kolagenu.

Ukázalo se, že kritickým úkolem je oddělení aktivity inhibitoru adheze od surových slin, hlavně pro nevratnou ztrátu většiny inhibiční aktivity v prvním chromatografickém stupni. Munro R.a kol. doporučuje aditiva jako 12% ethanol a dvojmocné kationty, což situaci nezlepšuje. Avšak vysoká koncentrace soli slin v kombinaci s celkově nízkou koncentrací proteinu (190 až 250 pg/ml) si vyžaduje počáteční koncentraci a stupeň výměny pufru. Proto se zkoumaly různé strategie pro obohacení, koncentraci nebo výměnu pufru. Tradiční dialýza vedla k úplné ztrátě aktivity. Většina ostatních standardních technik, jako jsou iontoměniče, afi ni tni sloupce vyloučující velikosti (ztráta byla neodpovídající pryskyřici sloupce) selhala nezávisle na povaze separační technologie nebo pufru a použitých aditivech. S překvapením se ukázalo, že tlaková dialýza 500 ml slin byla úspěšnou metodou ke zkoncentrování proteinů slin (přibližně (30 až 40 krát), které se současně se zbavily nežádoucích složek pufru. Neočekávaně se stal surový materiál slin, zpracovaný tímto způsobem, ideálním výchozím materiálem pro další čištění a vytěžení bioaktivity antiadhezních složek ze slin již nebylo nadále reálným problémem. Jelikož se ukázalo, že katexy a afinitní sloupce jsou nedostatečným stupněm čištění, použilo se slabých anexů jako DEAE-Eastf1ow nebo EMD-DEAE-Fraktogel. Vyzkoušel se 12% ethanol a dvojmocné kationty, avšak výsledky byly podobné s těmito aditivy i bez nich. Další optimalizace chromatografických operací vedla k sekvenci sloupce DEAE, Mono Q-sloupce a jako konečného kroku ke sloupci reversní fáze RP18. Optimalizace chromatografických podmínek se prováděla chromatografickým systémem BiaCore používajícím • ««·« ·· 9· ·· · » · Φ · * · Φ Φ· • Φ · Φ Φ Φ · · · • Φ Φ· ΦΦΦΦΦφ Φ Φ φ · * · Φ · Φ Φ

ΦΦ Φ · ΦΦ ΦΦ ΦΦ ·<· analytických sloupců (obchodní produkt společnosti Pharmacia. Gradienty k ovládání sloupce DEAE, Mono-Q-sloupce a sloupců RP18, jsou uvedeny na obr. la, b, c. Separace založená na BiaCore byla vyvážena použitím techniky FPLC. Optimalizované běžné podmínky byly přímo převedeny na poloprovozní měřítko separace podle instrukcí výrobce s výjimkou stupně se sloupcem RP18, který byl zachován technikou Biacore k minimalizaci ztrát vyčištěného materiálu. Výtěžek vyčištěného proteinu z posledního chromatografického stupně RP se provedl rychlým vakuovým odstředěním. Vzorky, spojené z posledního stupně RP, se shromáždily a analyzovaly pomocí SDS-PAGE (obr. 2). Pak se vzorky resuspendova1y v PBS a použily k provedení analytických i funkčních testů. Zpravidla se získalo přibližně 750 Mg/1 Saratinu z nezpracovaných slin.

Příklad 3

Biochemická charakteristika

Čištění Saratinu podle příkladu 1, vedlo v podstatě k čistému proteinu se zdánlivou molekulovou hmotností přibližně 21 kDa, jak je předvedeno za redukčních podmínek v SDS-PAGE (obr. 2). Kompletní aminokyselinová sekvence se získala přímým sekvencováním prvních 48 aminokyselin vyčištěného proteinu a byla doplněna sekvencováním několika vnitřních peptidů pocházejících z enzymatické degradace. Úplná sekvence proteinů je uvedena v SEQ.ID.NO.2.

Protein se skládá ze 103 aminokyselin s vypočtenou molekulovou hmotností 12067,9 a s aktuální molekulovou hmotností 12061,9 jak bylo doloženo hmotovou spektrometrií ESl-Mass spectrometry. Tyto rozdíly teoretické a naměřené molekulové hmotnosti naznačují, že všech šest cysteinů, identifikovaných v Saratinu, se podílí na tvorbě můstků S-S. Tento poznatek je podporován pozorovanou silnou změnou mobility proteinu, je-li ti· ·♦

9 9 ···· »

podroben chromatografií v SDS-PAGE za redukčních nebo neredukčních podmínek. Protein je kromě toho obohacen kyselými kyselinami, jako je Glu a Asp. Isoelektrické zaostření technikou IEF-PAGE (Immobilin) ukázalo isoe1ektrický bod pH 3, 7 + 0,5. V porovnávací studii se jako referenčního použilo vyčištěného pijavkového proteinu a porovnával se s fyzikálně-chemickými vlastnostmi rekombinovaného Saratinu, odvozeného 2 exprese baculo, kvasnic a E.coli. Ukázalo se, že všechy tři proteiny jsou ve svých vlastnostech identické. Charakterizace proteinu pomocí SDS-PAGE, zviditelněno Coomassií (obr. 2), nebo stříbrným zabarvením a nebo analýzou Western blot ukázala, že protein je homogenní a v neglykolyzované formě.

Příklad 4

Příprava mRNA a syntéza cDNA

Připraví se RNA z lékařských pijavic Hirudo medicinalis za použití guanidinthiokyanátového způsobu. mRNA se čistí od RNA jako celku za použití soupravy Oligotex mRNA kit“ (QIAGEN). Syntetizuje se cDNA za použití soupravy Marathon cDNA Amplificati on kit (CLONTECH) . Sekvence DNA kódující Saratin se napřed zesílí použitím oligonukletidových primerů PCR podle doporučení výrobce. Po syntéze cDNA se k oběma koncům cDNA připojí univerzální adaptor. Sekvence univerzálního adaptoru a univerzálních primerů API nebo AP2 se volí podle instrukcí dodavatele soupravy.

Příklad 5

Zesílení a izolování Saratinového genu pomocí PCR

Na bezprostředním konci N-zakončení reversní translatované aminokyselinové sekvence Saratinu se syntetizují degenerované primery. Tyto primery 01 a 02 byly zkonstruovány k hybridizaci

«	• 999	··	• 9	9
• 9	•		9	9 9	9 9	9 9
«	9	•	•	• 9	• 9	•
*	•	9 9	•	• 99	9 9 9	9
•	•	•	*	Λ	9 9	9
• 9 ·	9	«9	99	99	999

specificky na 5 -zakončení cDNA Saratinu. Konstrukce primeru je založena na reverzně translatované sekvenci aminokyselin experimentálně určených osmi aminokyselinami N-zakončení vyčištěnho proteinu Saratinu, Oba primery, 01 a 02, se syntetizují za pokud možné nízké degenerace a k dodání primerům na kritickém 3 -zakončení roztažení 8 párů bází perfektně souhlasících se sekvencí cDNA Saratinu k zajištění účinného a specifického zesílení matrice cDNA. Podle DNA degenerovaná abeceda (IUPAC code) R=A nebo G; M=A nebo C, Y=C nebo T a N=A nebo G nebo C nebo T. Reakce 3 -RACE PCR se provede za použití směsi primeruOl a primeru02 a univerzálního primeru API nebo AP2. Produkty PCR se klonují do TA klonovacího vektoru pCR2.1 nebo pCR Skript SK(+) vektor a sekvencují se. Když se po sekvencování získá několik fragmentů 3 -RACE PCR, získá se sekvence genu Saratinu, s výjimkou 5 netrsanslatované oblasti, signální peptidové sekvence a sekvence kódující prvních osm aminokyselin z N-zakončení zralého proteinu. K získání této chybějící Saratinové cDNA sekvencové informace se provede experiment 5 -RACE použitím gen specifického primeru ze středu Saratinové cDNA a jednoho z univerálních primerů API nebo AP2. Po sekvencování několika z výsledných fragmentů 5 -RACE PCR se získá úplná sekvence genů Saratinu. Zesílením genů Saratinu PCR pomocí gen-specifických nedegenerovaných primerů z obou 3 -zakončení a 5 -zakončení genů Saratinu se získá plná délka genu Saratinu.

Sekvencování DNA se provede s více než 15 různými klony PCR. Nalezla se však pouze jedna významná změna, která způsobila změnu aminokyselinové sekvence pouze v jednom klonu. Je velmi pravděpodobné, že tuto změnu způsobil PCR. Nalezlo se jiných pět tichých změn, které nezpůsobují změnu aminokyselinové sekvence. Není tedy pravděpodobné, že byly tyto změny způsobeny PCR, jelikož stejné změny byly nalezeny v odlišných klonech.

•	···· ·♦	·· *· ·
··	• · ·	• · · ·	··
•	« · ·	• · e ·	•
•	• · · ·	··· · · ·	9
•	• · ·	• · ·	•
>··	• t·	Λ* ··	···

Gen Saratinu ORF je 372bp a obsahuje 21 aminokyselinovou signální sekvenci a 103 aminokyselinovou sekvenci kódující zralý protein. Zjistilo se, že aminokyselinová sekvence, odvozená z klonu PCR, je totožná se sekvencí získanou sekvencováním proteinu, odvozeného z přírodních slin.

Příklad 6

Exprese v buňkách COS a detekce expresovaného proteinu

K expresování genu Saratinu do savčích buněk jako COS nebo CHO, se gen Saratinu odstřihne z vektoru pCR Skript SK(+) pomocí Xhol+Xbal a klonuje se do expresního vektoru savčí buňky pCl neo (Promega). Zvolena byla pCl-neo, jelikož obsahuje promotor T7 a T3 pro expresi in vivo a neomycinu odolávající gen pro selekci G418 a může jí být použito jak v buňkách COS tak CHO. Přídavně k signální sekvenci a k sekvenci zralého proteinu obsahuje insert sekvenci Koz na 5 -zakončení pro účinnou translaci a his-konec (his-tag) MRGS(H)ď na 3 -zakončení (C-terminál) pro detekci exprese proteinu, vyčištění a koncentraci. Plasmidový konstrukt má název pNC-31. Použije se pNC-31 plasmidu DNA k transfekci buněk COS. Buňky COS, rostoucí na dlouhé fázi, se promyjí dvakrát PBS a rozpustí se v PBS v koncentraci lxl0⁷/ml. Přidá se 12 jjg plasmidu DNA (méně než 50 jjl ve vodě nebo TE-pufru) do 0,7 až 0,8 ml suspense buněk COS a míchá se v e1ektroporační kývete. Elektroporace se provádí 10 minut při 1,9 kV a směs se přenese se na 90 mm-destičku. Po přidání 8 ml media DMEM obsahujícího 10 % FCS a antibiotika se buňky nechají růst 3 dny. Supernatantů a buněk se použije k další izolaci proteinu a k detekci. Expresovaný protein se detekuje metodou western blottingu pomocí protlátky anti-MRGS(H)6. Čištění se provede cheláty jako je NTA nebo imidooctová kyselina imobi 1 izovaná na matrici sloupce a modifikuje se kovovými ionty, například kobaltu, niklu nebo mědi.

Příklad 7

Konstrukce expresního vektoru E.coli a exprese

I když je použití variabilního kodonu v různých biologických systémech, některé kodony se používají velmi zřídka v E. coli. K umožnění exprese optimalizovaná verze v E.coli se gen převedl na E.coli kodon o sobě známými způsoby.

Exprese E.coli se provádí pomocí modifikované verse plasmidu pASK75, který nese tet promotorovou oblast. (Skerra A. a kol., Gene 151, str. 131 až 135, 1994). V podstatě se modifikace provede klonováním nového spojovníku mezi místy Xbal a Hind III (obr.3). Nový spojovník obsahuje vedoucí sekvenci ompA, jiné násobné klonovací místo a 6xHis-konec místo strep-konce.

Ke konstrukci expresního vektoru pro Saratin bylo nutno zavést restrikční místa 5 Cla I a 3 Eco47III způsobem PCR. Proto se použil 5 -primer03 a 3 -primer04. Produkt PCR se napřed klonuje do vektorového systému PCR II (Invitrogen) a sekvencuje se. Ve druhém kroku se gen Saratínu klonuje do modifikovaného vektoru pASK75 pomocí restrikčních míst 5 Clal a 3 Hind III.

Po expresování a prokázání aktivity tohoto rekombinantního Saratinu ve druhé reakci PCR se His-konec vyjme a startovací codon Saratinového genu se přímo fúzuje do vůdčí sekvence omp A. Primery 5 -primer05 a 3 -primer06 pro tuto reakci PCR jsou v seznamu sekvencí.

Jako příklad pro expresí v E.coli se expresní vektor PRG72 (obr.3). který obsahuje strukturní gen Saratinu fúzovaný do vůdčí sekvence ompA transformuje do kompetentních buněk W3110. Buňky se indukují po růstu do fáze mid-log. Po jedné • · · ·

hodině je mošno zřetelně zjišťovat rekombinantní Saratin.

Příklad 8

Konstrukce Baču1 o donorového plasmidu a exprese

K expresi Saratinu v expresním systému Baculo viru se použije expresního systému Bac-To-Bac™ Baculo Expression Systému (společnosti Gibco Life Technologies). K získání selekčního systému byla fúzována vůdčí sekvence včelího mel itinu do genu Saratinu a k zavedení restrikčních míst 5 BamHI a 3 Kpnl se provede jediná reakce PCR pomocí primerů 5 primer07 a 3 primer 08. Odpovídající produkt PCR se klonuje do vektoru PCRII (Invitrogen) a sekvencuje se. Pak se klonuje fúze Melitin-Saratin do vektoru pFastBac pomocí restrikčních míst 5 BamHI a 3 Kpnl a výsledkem je pTD13 (obr.4). Generace rekombinantních baculovírů a exprese Saratinu se provede systémem Bac-To-Bac Expression Systém. Donorový plasmid pTD13 se transformuje do kompetentních buněk DHlOBac, které obsahují bacmid s cílovým místem mini-attTn7 a pomocný plasmid. Element mini-Tn7 na donorovém plasnmidu ca se přemístí do cílového místa mini-attTn7 na bacmidu v přítomnosti transpozičních proteinů poskytnutých pomocným plasmidem. Kolonie, obsahující rekombinantní bacmid, se identifikují disrupcí lacZ genu. Vysokomolekulární mini-prep DNA se připraví ze selektovaných E.coli klonů obsahujících bacmid a a tato DNA se pak použije k transfektování hmyzích buněk. Podrobné návody jsou v instrukčním příručce expresní soupravy.

Příklad 9

Adhese destiček ke kolagenu za průtočných podmínek (dynamická zkouška)

Při zkoušce adheze destiček se nechá procházet plná lids24

ká krev komůrkou s paralelním průtokem ke zkoumání adhezní aktivity destiček na kolagenem povlečená sklíčka na překrytí mikroskopického vzorku (dále se výrazem sklíčka rozumí sklíčka na překrytí mikroskopického vzorku) při průtoku s velkým smykem, (simulace tepenných podmínek in vivo), kterou popsal Sakariassen a kol. (Meth. Enz. 169, str. 37 až 70, 1988). Ma vyčištěná sklíčka (18x18 mm) se retušovacím vzduchovým kartáčkem nanese lidský placentový kolagen typu III (Sigma) rozpuštěný v 50 mmol/1 octové kyseliny. Sklíčka se uloží v PBS při teploo tě 4 C přes noc.

Čerstvá předehřátá lidská krev (opatřená antikolagenním heparinem s nízkou molekulovou hmotností, 20 U/ml) se předeo hřeje během 10 minut na teplotu 37 C před použitím. Pipetou se na sklíčka nanesou proteinové prostředky podle vynálezu (30 μ 1 na sklíčko) a inkubují se 10 minut ve vlhké komůrce při teplotě místnosti než se vloží do perfusní komůrky. Krev se o nechá procházet komůrkou (při teplotě 37 C 5 minut smykovou rychlostí 1300/s.

Pak se sklíčka sejmou, opláchnou se PBS a fixují se 30 minut v 0,25% gluteraldehydu, načež se vybarví barvivém May-Grunwald Giemsa. Obr. 9 je typickým příkladem. Extensivní povlečení vybarvenými destičkami je patrné na neošetřeném kontrolním povrchu. Porovnávací povrch předběžně zpracovaný Saratinem ukazuje dramaticky sníženou (o 80%) vazbu na destičky. Adhese destiček se kvantifikuje světelným mikroskopem, jak je patrno na obr. 5 (při 1000-násobném zvětšení), připojeným na počítačový analyzátor obrazu (Leica). Výsledky jsou vyjádřeny procentem povrchu pokrytého destičkami a destičkovými agregáty

Inhibiční působení slin je porovnáno s vyčištěným proteinem (obr. 6). Adhese destiček na destičkách povlečených kolagenem typu III při rychlosti smyku 1300/s se surovými slinami (M616) vytváří inhibici přibližně 48% ve srovnání s kontrolou.

• ···· ·· ·· ·· • · · ···· ·*· • · ···· · · • · ·· ······ · • ·· · · · ·· ·· · · ·

Vyčištěný protein ( tt607);

Saratin) dokládá snížení úsady destiček přibližně o %

při standardizovaných koncentracích proteinu. Inhibice na dávce s vyššími vyvolaná Saratinem se zvyšuje v závislosti koncentracemi čištěného proteinu (obr. 7).

Příklad 10

Imunizace a protilátky

S první partií vysoce vyčištěného přírodního proteinu, která byla k disposici, se hned započalo s imunizací zvířat.

Imunizační séra se zvýšila u králíků a pro další skríning byla k disposici vysoce titrovaná reakční činidla. Dostupnými se stala další antiséra, když byly k disposici peptidové sekvence úplného proteinu a syntetizovaly se tři syntetické peptidy (sekvence aminokysel in 83-103, 13-30, 58-69) připojené ke KLH standardním vazebným postuper. a použilo se jich pro imunizaci.

Ustavila se tři séra zaměřená na segment N-zakončení peptidu pro C-koncové peptidy. S vysoce titrovanými imunitními séry, která byla k disposici, bylo možno zavést a použít technologie El i sa ke sledování a kvantifikování vyčištění přírodně čištěného, stejně jako rekombinantního pro teinu. Tak mohla být časově náročná a dosti pracná zkouška intentzivní inhibice destiček nahrazena a pouhým potvrzením in hibičního potenciálu konečně vyčištěného proteinu.

Příklad 11

Imunitní zkoušky ke stanovení vazby Saratinu

K povlečení

96-důlkových mikrotitračních destiček (Nunc) se použ i j e 50 μ 1 okyseleného Horm-kolagenu (Nycomed) a přes noc se povléknou roztokem kolagenu (20 yg/ml). Před zkouškou se destičky promyj í třikrát PBS a i nkubuj í se s roztokem BSA (1%), aby se zabránilo nespecifické adhezi.

V sérii zředění se

přidá 50 μ 1 Saratinu a inkubuje se 1 hodinu. Před použitím se destičky omyjí třikrát protilátkou anti -Sarati nu k detekci. Po další jednohodinové inkubaci se přebytečná protilátka odstraní a sekundární biotinem značená protilátka se použije k detekci. Konečný závěr se provede cestou barevné reakce streptavidinem katalyzovaným POD se substráty jako jsou tablety ODB (Dako) měřenými při 490 nm.

Příklad 12

Konkurenční zkouška pro skrínování inhibitorů

Rekombinantní taggovaný Saratin (His-tag) připravený podle příkladu 7 se porovnává s nativním netaggovaným Saratinem z hlediska vazby ke kolagenu. Způsobem popsaným v příkladu 11 se připraví destičky povlečené okyseleným Hora-kolagenem ( Nycomed). Detekce se provede protilátkami králičího anti-Saratinu. Taggovaný a netaggovaný Saratin vykazuje totožné vazební vlastnost i.

Alternativně se netaggovaná verse

Sarat i nu módi f i kuje biotinylací (Pierce, biotinylační kit) a porovná s nemodifikovaným Saratinem. Vazební vlastnosti na kolagen jsou totožné. Dále byly provedeny pokusy za použití biotinylovaného Saratinu s konkurečním nemodifikovaným Saratinem, peptidů, Sa ratinu odvozeného ze slin, úplných slin nebo protilátek zamě řených na Saratin. Vazba různých konkurentů ke kolagenu byla testována stanovením vazby biotinylovaného Saratinu s pomocí konjugátu streptavidin-POD a ODB-substrátu reakcí k detekci. Této zkoušky s biotinylovaným Saratinem se používá zpravidla ke stanovení koncentrace Saratinu ve slinách (750 pg/1), epi topového mapovaní na Saratin zaměřených protilátek, vyhodnocování bioaktivního Saratinu, mutovaného Saratinu. K prozkoumání potenciálu testu blokování a neblokování se používá anti-Sarati nových protilátek obohacených specifickými peptidy Saratinu.

- 27 ····· ·· · · ·· · • · « · · · · «.·* • · ···· ··· • · ·· ······ * .

• · . · *·*· *··· ·· ·· ·· ···

Příklad 13

Kvasnicový expresní vektor a exprese

Jako typického příkladu exprese kvasnic se používá pichia mul ti copy expresního systému (Invitrogenu). Konstrukce kvasnicového expresního vektoru je znázorněna na obr. 8. K vytvoření expresního vektoru pro Saratin se použije zesilovací metody ke generování restrikčních zakončení (5 EcoR I, 3 Not I) kompatibilních s vazbou do příslušného vektoru PePIC9K). Následuje 5 primer09 a 3 -primer 10.

Před transformováním sferoplastů Pichia se expresní vektor linearizuje se Sal I. Skrínují se kolonie pro Hisx Mutx-pozitivní mutanty k zaručení integrace Saratonového genu. Typickýo mi podmínkami růstu jsou: teplota 28 až 30 C až do optické hustoty OD 2-6, Zavedení exprese se provádí po resuspendování odstředěných buněk v mediu a přidání methanolu až do konečné koncentrace 0,5% a uchování těchto podmínek po delší dobu, kterou je zpravidla 24 hodin. Po typické šestidenní fermentaci se produkt získá ze supernatantu a analyzuje se způsoby SDS-PAGE a ELISA.

Průmyslová využitelnost

Peptid působící proti srážení krve vhodný pro výrobu farmaceutických prostředků pro ošetřování tromboembolických nemocí.

Claims (24)

1. PATENTOVÉ

   1. Polypeptid izolovaný z H. medicinalis mající molekulou hmotnost přibližně 12 000 + 1 kD s biologickou aktivitou inhibitoru na kolagenu závislé adheze destiček.
2. 2, Polypeptid podle nároku 1 s isoelektrickým bodem pH 3,7 ± 0,5.
3. 3. Polypeptid podle nároku 1 nebo 2 se šesti cystě i novým i molekulami schopnými vytvářet S-S můstky.
4. 4. Polypeptid podle nároku 1, s aminokyselinovou sekvencí SEQ.ID.NO.1.
5. 5. Polypeptid s aminokysli novou sekvencí podle nároku 4 alespoň z 80 % totožnou s aminokyselinovou sekvencí SEQ,ID. NO.1 v ce1é dé1ce.
6. 6. Izolovaný polynukleotid kódující polypeptid podle nároku 1 až 5.
7. 7. Izolovaný polynukleotid obsahující sekvenci DNA SEQ. ID.NO.2 nebo sekvenci DNA komplementární k sekvenci DNA kódující polypeptid podle nároku 1 až 5.
8. 8. Polynukleotid podle nároku 7, obsahující sekvenci DNA, která je alespoň z 80 % totožná se sekvencí aminokyselin SEQ. ID.NO.l v celé délce.
9. 9. Expresní vektor obsahující sekvenci DNA podle nároků 6 až 8.
10. 10.

    9.

    Hostitelská buňka mající expresní vektor podle nároku
11. 11. Expresní systém obsahující hostitelskou buňku podle nároku 10.
12. 12. Způsob výroby polypeptidů podle nároku 1 až 5, vyznačující se tím, že se hostitelská buňka podle nároku 10 kultivuje za podmínek postačujících k produkci polypeptidů a k získání polypeptidů ze supernatantu kultury nebo z buněčného zbytku.
13. 13. Protilátka imunospecifická pro polypeptid podle nároku 1 až 5.
14. 14. Farmaceutický prostředek vyznačuj ící se tím, že obsahuje polypeptid podle nároku 1 až 5 a farmaceuticky přijatelný nosič nebo jeho excipient.
15. 15. Farmaceuticky účinné činidlo podle nároku 14 pro léčeni tromboembolických procesů.
16. 16. Farmaceutický prostředek podle nároku 14 nebo 15, vyznačující se tím, že obsahuje přídavné drogy volené ze souboru zahrnujícího aspirin, heparin nebo streptokinázu nebo jejich kombinace.
17. 17. Použití polypeptidů podle nároku 1 až 5 k výrobě léčiva pro ošetřování tromboembolických nemocí.
18. 18. Použití polypeptidů podle nároku 1 až 5 k povlékání umělých povrchů.
19. 19. Použití polypeptidů podle nároku 1 až 5 k modifikaci vnitroočních čoček ke zmírnění trombogenici ty materiálu čočky.
20. 20. Použití polypeptidů podle nároku 1 až 5 ke kontaktování povrchu čočky.
21. 21. Použití polypeptidu podle nároku 1 až 5 pro kovalentní zesítění k modifikaci materiálu čočky.
22. 22. Použití protilátek podle nároku 13 a polypeptidu podle nároku 1 až 5 k měření vzorků podle nároku 12 nebo ošetřovaného subjektu.
23. 23. Způsob identifikace sloučenin, vyznačuj ící se t í m, že se inhibuje (antagonizuuje) nebo agonizuje polypeptid podle nároku 1 až 5, pozorováním vazby nebo stimulace nebo inhibice funkční odezvy.
24. 24. Agonist identifikovaný způsobem podle nároku 23.