CZ296576B6

CZ296576B6 - Nukleosidový analog a oligonukleotidový analog a farmaceutický prostredek, sonda a primer s jeho obsahem

Info

Publication number: CZ296576B6
Application number: CZ20012574A
Authority: CZ
Inventors: Kaneko@Masakatsu; Morita@Koji; Imanishi@Takeshi
Original assignee: Sankyo Company Limited; Sankyo Lifetech Company Limited
Priority date: 1999-02-12
Filing date: 2000-02-10
Publication date: 2006-04-12
Also published as: IL144338A0; EP1152009B2; US20110009471A1; CA2361318C; HK1040084A1; EP1152009A1; US7314923B2; BRPI0008131B1; PL208245B1; DE60017711T3; US20030207841A1; DK1152009T4; NO20013899D0; CN1347418A; KR100573231B1; DE60017711T2; TR200102328T2; HU228398B1; ZA200106544B; BR0008131A

Abstract

Nukleosidový analog obecného vzorce 1, oligonukleotidový analog obecného vzorce 2, vykazující protismyslnou nebo antigenní aktivitu. Je popsán farmaceutický prostredek nebo sonda s jeho obsahem pro specifický gen nebo primer s jeho obsahem vhodný pro zacátek amplifikace.

Description

Nukleosidový analog a oligonukleotidový analog a farmaceutický prostředek, sonda a primer s jeho obsahem

Oblast techniky

Vynález se týká nových oligonukleotidových analogů, které vykazují protismyslnou nebo antigenní aktivitu, výbornou stabilitu nebo vykazují výbornou aktivitu jako detekční činidlo (sonda) pro specifický gen nebo jako primer pro počátek amplifikace, a nových nukleosidových analogů, které mohou zprostředkovat jejich produkci.

Dosavadní stav techniky

Očekává se, že oligonukleotidové analogy, které vykazují výbornou protismyslnou nebo antigenní aktivitu a které jsou v těle stabilní, se budou moci použít jako farmaceutické prostředky. Navíc oligonukleotidové analogy, které vykazují vysoký stupeň schopnosti tvořit stabilní komplementární řetězec s DNA nebo mRNA, se mohou použít jako detekční činidla vhodné pro specifický gen nebo jako primery pro začátek amplifikace.

Naopak je známo, že přirozeně se vyskytující oligonukleotidy se rychle rozkládají pomocí různých nukleáz, které jsou přítomny v rvi a v buňkách. V některých případech přirozeně se vyskytující oligonukleotidy nevykazují dostatek citlivosti při použití jako detekční činidlo pro specifické geny nebo jako primery pro začátek amplifikace, což je způsobeno jejich afinitou vůči sekvencím komplementárních bází.

Za účelem překonat nedostatky se připravily různé nepřirozeně se vyskytující oligonukleotidové analogy, které jsou určeny pro použití jako farmaceutické prostředky nebo detekční činidla pro použití jako farmaceutické prostředky nebo detekční činidla pro specifické geny. Jmenovitě známé příklady takových nepřirozeně se vyskytujících oligonukleotidových analogů zahrnují ty, kde atom kyslíku zachycený na atomu fosforu ve fosfordiesterové vazbě oligonukleotidu je nahrazen atomem síry, dále ty, kde uvedený atom kyslíku je nahrazen atomem bóru a ty, ve kterých cukerná část a báze oligonukleotidu je upravena chemickou cestou. Například společnost ISIS Corp. vyvinula thioátový typ oligonukleotidu ISIS2922 (Vitravene) jako terapeutický prostředek vhodný pro lidský zánět sítnice způsobený cytomegalovirem a tento prostředek se uvedl na trh v USA.

Sloučeniny mající protismyslnou nebo antigenní aktivitu jsou popsány v WO-A-98/39352. Liší se od sloučenin podle předloženého vynálezu tím, že mají mezi uhlíkovými atomy 2' a 4' jsoucími v kruhu spíše můstek -CH₂-O- nežli -A-CH₂-O-. Sloučeniny podle předloženého vynálezu vykazují překvapivě zvýšenou nukleázovou aktivitu ve srovnání sWO-A-98/39352.

Když se však zvažuje potenciální protismyslné a antigenní aktivity shora popsaných nepřirozeně se vyskytujících oligonukleotidových analogů, jmenovitě pak schopnost tvořit stabilní komplementární řetězec s DNA nebo mRNA, stabilita s ohledem na různé nukleázy a zobrazení nežádoucích vedlejších účinků způsobených nespecifickým navázáním na různé proteiny v těle, je nutné připravit nepřirozeně se vyskytující oligonukleotidový analog, který má dokonce lepší stabilitu v těle a malý výskyt vedlejších účinků a vysoký stupeň schopnosti tvořit komplementární řetězec.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje nepřirozeně se vyskytující oligonukleotidové analogy, které vykazují výbornou protismyslnou nebo antigenní aktivitu, výbornou stabilitu v těle a nízký výskyt nežádoucích

-1 CZ 296576 B6 vedlejších účinků. Zjistilo se, že oligonukleotidové analogy nebo nukleosidové analogy vykazující etherovou vazbu v uvedených molekulách je možné použít jako protismyslné nebo antigenní prostředky mající výbornou stabilitu, jako detekční činidla (sondy) vhodné pro specifický gen, jako primer pro začátek amplifikace nebo jako meziprodukt pro jejich přípravu.

Nové nukleosidové analogy podle vynálezu jsou sloučeniny obecného vzorce 1:

kde symboly R¹ a R² jsou stejné nebo různé a reprezentují atom vodíku, hydroxylovou chránící skupinu, skupinu kyseliny fosforečné, chráněnou skupinu kyseliny fosforečné nebo -P(R³)R⁴, kde symboly R³ a R⁴ jsou stejné nebo různé a reprezentují hydroxylovou skupinu, chráněnou hydroxylovou skupinu, merkaptoskupinu, chráněnou merkaptoskupinu, aminoskupinu, alkoxyskupinu, která obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, alkylthioskupinu, která obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, kyanalkoxyskupinu, která obsahuje 1 až 5 atomů uhlíku, nebo aminoskupinu substituovanou alkylovou skupinou, která obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, symbol A reprezentuje alkandiylovou skupinu, která obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku a symbol B reprezentuje skupinu purin-9-yl, 2-oxopyrimidin-l-yl nebo substituovanou skupinou purin-9-yl nebo substituovanou skupinu 2-oxopyrimidin-l-yl mající substituent 'vybraný z následující skupiny a, nebo jejich soli.

Oligonukleotidové analogy podle vynálezu jsou oligonukleotidové analogy, které mají jednu nebo dvě nebo více struktur obecného vzorce 2:

kde [symbol A reprezentuje alkandiylovou skupinu, která má 1 až 4 atomy uhlíku a symbol B reprezentuje skupinu purin-9-yl, 2-oxopyrimidin-l-yl a substituovanou skupinu purin-9-yl nebo substituovanou skupinu 2-oxopyrimidin-l-yl mající substituent vybraný z následující skupiny a], nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli.

Skupina a je:

hydroxylová skupina chráněná hydroxylová skupina alkoxyskupina s 1 až 4 atomy uhlíku, merkaptoskupina chráněná merkaptoskupina alkylthioskupina s 1 až 4 atomy uhlíku aminoskupina chráněná aminoskupina aminoskupina substituovaná alkylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku a halogenový atom.

Termín „alkyldiylová skupina, která obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku“ symbolu A ve shora uvedeném vzorci 1 nebo 2 může zahrnovat methylenovou, ethylenovou, trimethylenovou a tetramethylenovou skupinu, přičemž je výhodnější methylovaná skupina.

Termín „hydroxylová chránící skupina“ symbolu R¹ a R² „chráněná hydroxylová skupina“ symbolu R³ a R⁴ nebo skupina a ve shora uvedeném vzorci 1 nebo 2 znamená chrámci skupinu, kterou je možné štěpit chemickou metodou jako je hydrogenolýza, rozklad, hydrolýza, elektrolýza a fotolýza nebo biologickou metodou, jako je hydrolýza v těle člověka. Takové chránící skupiny mohou zahrnovat „alifatickou acylovou skupinu“ jako je alkylkarbonylová skupina, což je například formy, acetyl, propionyl, butyryl, izobutyryl, pentanoyl, pivaloyl, valeryl, izovaleryl, oktanoyl, nonanoyl, dekanoyl, 3-methylnonanoyl, 8-methylnonanoyl, 3-ethyloktanoyl, 3,7—di— methyloktanoyl, undekanoyl, dodekanoyl, tridekanoyl, tetradekanoyl, pentadekanoyl, hexadekanoyl, 1-methylpenta-dekanoyl, 14—methylpentadekanoyl, 13,13-dimethyltetradekanoyl, heptadekanoyl, 15-methylhexadekanoyl, oktadekanoyl, 1-methyl-heptadekanoyl, nonadekanoyl, eikosanoyl a heneikosanoyl, karboxylovaná alkylkarbonylová skupina, je to například sukcinoylová, glukaroylová a adipoylová skupina, halogen nižší alkylkarbonylová skupina, například chloracetylová, dichloracetylová, trichloracetylová a trifluoracetylová, nižší alkoxyalkyl karbonylová skupina, což je například methoxyacetyl, a nesaturovaná alkoxykarbonylová skupina, což je například (Eý-2-methyl-2-butenoyl.

Termín „aromatická acylová skupina“, jako například arylkarbonylová skupina je například

2-brombenzoylová a 4-chlorbenzoylová, nižší alkylovaná arylkarbonylová skupina, což je například 2,4,6-trimethylbenzoyl a 4-toluoyl, nižší alkoxylovaná arylkarbonylová skupina, což je například 4-anizoyl, karboxylovaná arylkarbonylová skupina, což je například 2-karboxybenzoylová, 3-karboxybenzoyl a 4-karboxybenzoyl, nitrovaná arylkarbonylová skupina, což je například 4-nitro-benzoyl a 2-nitrobenzoyl, nižší alkoxykarbonylová arylkarbonylová skupina, což je například 2-(methoxykarbonyl)benzoylová a arylová arylkarbonylová skupina, což je například 4-fenylbenzoyl.

Termín „tetrahydropyranylová skupina nebo tetrahydrothiopyranylová skupina“ je například tetrahydropyran-2-yl, 3-bromotetrahydropyran-2-yl, 4-methoxytetrahydropyran-4-yl, tetrahydropyran-2-yl a 4-methoxytetrahydrothiopyran-4-yl.

Termín „tetrahydrofuranylová skupina nebo tetrahydrothiofuranylová skupina“ je například tetrahydrofuran-2-yl a tetrahydrothiofuran-2-yl.

Termín „silylová skupina“ zahrnuje například silylovou skupinu obsahující tři nižší alkyly, což je například trimethylsilyl, triethylsilyl, izopropyldimethylsilyl, t-butyldimebutyldimethylsilyl,

-3CZ 296576 B6 methyldiizopropylsilyl, methyldi-t-butylsilyl a triizopropylsilyl a silylová skupina obsahující tři alkyly substituovaná jednou nebo dvěma arylovými skupinami, což je například difenylmethylsilyl, difenylbutylsilyl, difenylizopropylsilyl a fenyladiizopropylsilyl.

Termín „nižší alkoxymethylová skupina“ je například methoxymethyl, 1,1-dimethyl-l-methoxymethyl, ethoxymethyl, propoxymethyl, izopropoxymethyl, butoxymethyl a t-butoxymethyl.

Termín „nižší alkoxylová nižší alkoxymethylová skupina“ je například 2-methoxyethoxymethyl.

Termín „halogenovaná nižší alkoxymethylová skupina“ znamená například 2,2,2-trichlorethoxymethyl a bis(2-chlorethoxy)methyl.

Termín „nižší alkoxylovaná ethylová skupina“ znamená například 1-ethoxyethyl a l-(izopropoxy)ethyl.

Termín „methylovaná skupina substituovaná jednou až třemi arylovými skupinami“ znamená například benzyl, a-naftylmethyl, β-naftylmethyl, difenylmethyl, trifenylmethyl, a-naftyl-difenylmethyl a 9-antrylmethyl.

Termín „methylová skupina substituovaná jednou až třemi arylovými skupinami, kde uvedený arylový kruh je substituován nižším alkylem, nižší alkoxyskupinou, halogenem nebo kyanoskupinou“ zahrnuje například 4-methylbenzyl, 2,4,6-tri-methylbenzyl, 3,4,5-trimethylbenzyl, 4-methoxybenzyl, 4-methoxyfenyldifenylmethyl, 4,4'-dimethoxytrifenylmethyl, 2-nitrobenzyl, 4-nitrobenzyl, 4-chlorbenzyl, 4—brombenzyl a 4-kyanobenzyl.

Termín „nižší alkoxykarbonylová skupina“ zahrnuje například methoxykarbonyl, ethoxykarbonyl, t-butoxykarbonyl a izobutoxykarbonyl.

Termín „nižší alkoxykarbonylová skupina substituovaná halogenem nebo „silylová skupina obsahující tři nižší alkyly“ zahrnuje 2,2,2-trichlorethoxykarbonyl a 2-trimethylsilylethoxykarbonyl.

Termín „alkenoyloxykarbonylová skupina“ zahrnuje vinyloxykarbonyl a alyloxykarbonyl.

Termín „aralkyloxykarbonylová skupina, kde uvedený arylový kruh se může substituovat jednou nebo dvěmi alkoxy nebo nitroskupinami“ zahrnuje například benzyloxykarbonyl, 4-methoxybenzyloxykarbonyl, 3,4—dimethoxybenzyloxykarbonyl, 2-nitrobenzyloxykarbonyl a 4-nitrobenzylkarbonyl.

„Hydroxylová chránící skupina“ symbolu R¹ a R² přednostně zahrnuje „alifatickou acylovou skupinu“, „aromatickou acylovou skupinu“, „methylovou skupinu substituovanou jednou až třemi arylovými skupinami“, „methylovou skupinu substituovanou 1 až třemi arylovými skupinami, kde arylový kruh se substituoval nižší alkylovou, nižší alkoxy, kyanoskupinou nebo halogenem“ nebo „silylovou skupinu“. Výhodnější je acetylová skupina, benzoylová skupina, benzylová skupina, p-methoxybenzoylová skupina, dimethoxytritylová skupina, monomethoxytritylová skupina nebo íerc-butyldifenylsilylová skupina.

Chrániči skupina „chráněné hydroxylové skupiny“ symbolu R³ a R⁴ nebo skupina a může s výhodou zahrnovat „alifatickou acylovou skupinu“ nebo „aromatickou acylovou skupinu“, výhodnější je benzoylová skupina.

Chránící skupina „chráněné skupiny kyseliny fosforečné“ symbolu R¹ a R² ve shora uvedeném vzorci 1 reprezentuje chránící skupinu, která se může štěpit chemickou metodou, jako je hydrogenolýza, hydrolýza, elektrolýza a fosfolýza a biologickou metodou, jako je hydrolýza v lidském těle. Takové chránící skupiny mohou zahrnovat „nižší alkoxylovou skupinu“ jak oje methyl, ethyl, n-propyl, izopropyl, a-butyl, izobutyl, s-butyl, terc-butyl, n-pentyl, izopentyl, 2-methyl-4CZ 296576 B6 butyl, neopentyl 1-ethylpropyl, n-hexyl, izohexyl, 4-methylpentyl, 3-methylpentyl, 2-methylpentyl, 1-methylpentyl, 3,3-dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 1,1-dimethylbutyl, 1,2-dimethylbutyl, 1,3-dimethylbutyl, 2,3-dimethylbutyl a 2-ethylbutyl.

„Nižší alkylová skupina substituovaná kyanoskupinou“ zahrnuje například 2-kyanoethyl a

2- kyano-1,1 -dimethylethyl.

„Ethylová skupina substituovaná silylovou skupinou“ zahrnuje například 2-methyldifenylsilylethyl, 2-trimethylsilylethyl a 2-trifenylsilylethyl.

„Halogenovaná nižší alkylová skupina“ zahrnuje například 2,2,2-trichlorethyl, 2,2,2-tribromethyl, 2,2,2-trifluorethyl a 2,2,2-trichlor-l,l-dimethylpethyl.

„Nižší alkenylová skupina“ zahrnuje například ethenyl, 1-propenyl, 2-propenyl, l-methyl-2propenyl, 1-methyl-1-propenyl, 2-methyl-l-propenyl, 2-methyl-2-propenyl, 2-ethyl-2-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, l-methyl-2-butenyl, l-methyl-2-butenyl, 1-methyl-1-butenyl,

3- methyl-2-butenyl, l-ethyl-2-butenyl, 3-butenyl, l-methyl-3-butenyl, 2-methyl-3-butenyl,

1- ethyl-3-butenyl, 1-pentenyl, 2-pentenyl, l-methyl-2-pentenyl, l-methyl-2-pentenyl, 3-pentenyl, l-methyl-3-pentenyl, 2-methyl-3-pentenyl, 4-pentenyl, l-methyl-4-pentenyl,

2- methyl-4-pentenyl, 1-hexenyl, 2-hexenyl, 3-hexenyl, 4-hexenyl a 5-hexenyl.

„Cykloalkylová skupina“ zahrnuje například cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklohexyl, cykloheptyl, norbomyl a adamantyl.

„Kyanátovaná nižší alkenylová skupina“ je například 2-kyanobutenyl.

„Arylalkylová skupina“ zahrnuje například benzyl, α-naftylmethyl, indenylmethyl, fenantrenylmethyl, antracenylmethyl, difenylmethyl, trifenylmethyl, 1-fenethyl, 2-fenethyl, 1-naftylethyl,

2- naftylethyl, 1-fenylpropyl, 2-fenylpropyl, 3-fenylpropyl, 1-naftylpropyl, 2-naftylpropyl,

3- naftylpropyl, 1-fenylbutyl, 2-fenylbutyl, 3-fenylbutyl, 4—fenylbutyl, 1-naftylbutyl, 2-naftylbutyl, 3-naftylbutyl, 4-naftylbutyl, 1-fenylpentyl, 2-fenylpentyl, 3-fenylpentyl, 4-fenylpentyl,

4- fenylpentyl, 5-fenylpentyl, 1-naftylpentyl, 2-naftylpentyl, 3-naftylpentyl, 4—naftylpentyl,

5- naftylpentyl, 1-fenylhexyl, 3-fenylhexyl, 4-fenylhexyl, 5-fenylhexyl, 6-fenylhexyl, 1-naftylhexyl, 2-naftylhexyl, 3-naftylhexyl, 4-naftylhexyl, 5-naftylhexyl a 6-naftylhexyl.

„Aralkylová skupina, kde uvedený arylový kruh se substituoval nitroskupinou nebo halogenovým atomem“ zahrnuje 4-chlorbenzyl, 2-(4-nitrofenyl)ethyl, o-nitrobenzyl, 4—mtrobenzyl, 2,4-dinitrobenzyl a 4-chlor-2-nitrobenzyl.

„Arylová skupina“ zahrnuje fenyl, indenyl, naftyl, fenantranyl a antracenyl a „arylová skupina substituovaná nižší alkylovou skupinou, atomem halogenu nebo nitroskupinou“ zahrnuje 2-methylfenyl, 2,6-dimethylfenyl, 2-chlorfenyl, 4-chlorfenyl, 2,4-dichlorfenyl, 2,5-dichlorfenyl, 2-bromofenyl, 4-nitrofenyl a 4-chlor-2-nitrofenyl.

Výhodné jsou „nižší alkylová skupina“, „nižší alkylová skupina substituovaná kyanoskupinou“, „aralkylová skupina“ nebo „aralkylová skupina, kde uvedený arylový kruh se substituuje nitroskupinou nebo halogenovým atomem“. Výhodnější je 2-kyanoethylová skupina, 2,2,2-trichlorethylová skupina nebo benzylová skupina.

„Alkoxyskupina zahrnující 1 až 4 atomy uhlíku“ symbolu R³ a R⁴ nebo skupina a ve shora uvedeném vzorci 1 a 2 může zahrnovat methoxy, ethoxy, n-propoxy, izopropoxy, a-butoxy, izobutoxy, s-butoxy nebo terc-butoxyskupinu. Výhodná je methoxyskupina nebo ethoxyskupina.

Chránící skupina „chráněné merkaptoskupiny“ symbolu R³ a R⁴ nebo skupina a ve shora uvedeném vzorci 1 a 2 může zahrnovat mimo hydroxylových chránících skupin uvedených shora

-5CZ 296576 B6 v textu „skupinu, která tvoří disulfíd“ jako je alkylthioskupina, což je například methylthioskupina, ethylthioskupina, terc-butylthioskupina a aralkylthioskupina jako je benzylthioskupina. Výhodná je „alifatická acylová skupina“ nebo „aromatická acylová skupina“, výhodnější je benzoylová skupina. Termín „alkylthioskupina, která vykazuje 1 až 4 atomy uhlíku“ symbolu R³a R⁴ nebo skupina a ve shora uvedeném vzorci 1 nebo 2 může zahrnovat methylthioskupinu, ethylthioskupinu, propylthioskupinu, izopropylthioskupinu, butylthioskupinu, s-butylthioskupinu a terc-butylthioskupinu. Výhodná je methylthioskupina nebo ethylthioskupina.

Chrániči skupina „chráněné aminoskupiny“ skupiny a ve shora uvedeném vzorci 1 a 2 zahrnuje „alifatickou acylovou skupinu“ jako je alkylkarbonylová skupina, a to například formyl, acetyl, propionyl, butyryl, izobutyryl, pentanoyl, pivaloyl, valeryl, izovaleryl, oktanoyl, nonanoyl, dekanoyl, 3-methylnonanoyl, 8-methyl-nonanoyl, 3-ethyloctanoyl, 3,7-dimethylokranoyl, undekanoyl, dodekanoyl, tridekanoyl, tetradekanoyl, pentadekanoyl, hexadekanoyl, 1-methyl-pentadekanoyl, 14-methylpentadekanoyl, 13,13-dimethyltetra-dekanoyl, heptadekanoyl, 15-methylhexa-dekanoyl, oktadekanoyl, 1-methylheptadekanoyl, nonadekanoyl, eikosanoyl a heneikosanoyl a karboxylovaná alkylkarbonylová skupina, jako je například sukcinoyl, glutaroyl a adapoyl, halogen nižší alkylkarbonylová skupina, cožje například chloracetyl, dichloracetyl, trichloracetyl a trifluoracetyl, nižší alkoxy nižší alkylkarbonylová skupina, jako je například methoxyacetyl a nesaturovaná alkylkarbonylová skupina, cožje například (E)-2-methyl-2-butenoyl.

„Aromatická acylová skupina“ je například arylkarbonylová skupina, což je například benzyl, oc-naftoyl a β-naftoyl, halogenoarylkarbonylová skupina, jako je například benzoyl, α-naftoyl a β-naftoyl, halogenarylkarbonylová skupina, což je například 2-brombenzoyl a 4—chlorbenzoyl, nižší alkylovaná arylkarbonylová skupina, což je například 2,4,6-trimethylbenzoyl a 4-toluoyl, nižší alkoxylovaná arylkarbonylovaná skupina, jako je například 4-anizoyl, karboxylová arylkarbonylová skupina, což je například 2-karboxybenzoyl, 3-karboxybenzoyl a 4-karboxybenzoýl, nitrovaná arylkarbonylová skupina, cožje například 4-nitrobenzoyl a 2-nitrobenzoyl, nižší alkoxykarbonylovaná arylkarbonylovaná skupina, což je například 2-(methoxykarbonyl)benzoyl a arylovaná arylkarbonylová skupina, cožje například 4-fenylbenzoyl.

„Nižší alkoxykarbonylová skupina“, což je například methoxykarbonyl, ethoxykarbonyl, t-butoxykarbonyl a izobutoxykarbonyl.

„Nižší alkoxykarbonylová skupina substituovaná halogenem nebo silylová skupina s třemi nižšími alkyly“ zahrnuje například 2,2,2-trichlorethoxykarbonyl a 2-trímethylsilylethoxykarbonyl.

„Alkenyloxykarbonylová skupina“ zahrnuje například vinyloxykarbonyl a alyloxykarbonyl.

Termín „aralkyloxykarbonylová skupina“ kde uvedený arylový kruh se může substituovat nižší alkoxyskupinou nebo nitroskupinou“ zahrnuje benzyloxykarbonyl, 4-methoxybenzyloxykarbonyl, 3,4-dimethoxybenzyloxykarbonyl, 2-nitrobenzyloxykarbonyl a 4-nitrobenzoyloxykarbonyl, přičemž je výhodná „alifatická acylová skupina“ nebo „aromatická acylová skupina“. Více se upřednostňuje benzoylová skupina.

„Aminoskupina substituovaná alkylovou skupinou zahrnující 1 až 4 atomy uhlíku“ symbolu R³ a

R⁴ nebo skupina a ve shora popsaném vzorci 1 a 2 může zahrnovat methylamino, ethylamino, propylamino, izopropylamino, butylamino, izobutylamino, s-butylamino, terc-butylamino, dimethylamino, diethylamino, dipropylamino, diizopropylamino, dibutylamino, diizobutyl-amino, di(s-butyl)amino a di(terc-butyl)amino, přičemž je výhodné použít skupinu methylamino, ethylamino, dimethylamin, diethylamino nebo diizopropylamino.

-6CZ 296576 B6

Termín „kyanoalkoxyskupina vykazující 1 až 5 atomů uhlíku“ symbolu R³ a R⁴ ve shora uvedeném vzorci 1 reprezentuje skupinu, ve které shora opsaná „alkoxyskupina vykazující 1 až 4 atomy uhlíku“ se substituovala kyanoskupinou. Taková skupina může zahrnovat kyanomethoxy,

2-kyanoethoxy, 3-kyanopropoxy, 4-kyanobutoxy, 3-kyano-2-methylpropoxy nebo 1-kyanomethyl-l,l-dimethyhnethoxy. Výhodná je 2-kyanoethoxyskupina.

Termín „alkylová skupina zahrnují 1 až 4 atomy uhlíku“ skupina a ve shora uvedeném vzorci 1 nebo 2 může zahrnovat methyl, ethyl, propyl, izopropyl, butyl, izobutyl, s-butyl a terc-butyl. Upřednostňuje se methylová a ethylová skupina.

Termín „atom halogenu“ skupina a ve shora uvedeném vzorci 1 nebo 2 může zahrnovat atom fluoru, chloru a bromu nebo jodu. Výhodný je atom jodu nebo chloru.

Preferované skupiny „purin-9-yl“ a „substituovaná skupina purin-9-yl“ symbolu B ve shora v textu uvedeném vzorci 1 nebo 2 může zahrnovat jako celek 6-aminopurin-9-yl (to je adeninyl), aminoskupinu chráněnou skupinou 6-aminopurin-9-yl, 2,6-diaminopurin-9-yl, 2-amino-

6-chlorpurin-9-yl, aminoskupinu chráněnou skupinou 2-amino-6-chlorpurin-9-yl, aminoskupinu chráněnou skupinou 2-amino-6-fluorpurin-9-yl, 2-amino-6-brompurin-9-yl, aminoskupinu chráněnou skupinou 2-amino-6-brompurin-9-yl, 2-amino-6-hydroxypurin-9-yl chráněný aminoskupinou a hydroxylovou skupinou, 6-ammo-2-methoxypurin-9-yl, 6-amino-2-chlorpurin-9-yl, 6-amino-2-methoxypurin-9-yl, 2,6-dimethoxypurin-9-yl, 2,6-dichlorpurin-9-yl nebo 6-merkaptopurin. Výhodnější je 6-benzylaminopurin-9-yl, adeninyl, 2-izobutyrylamino6-hydroxypurin-9-yl nebo guaninylová skupina.

Výhodné skupiny „skupiny 2-oxopyrimidin-l-yl“ a „substituovaná skupina 2-oxopyrimidin-lyl“ symbolu B ve shora v textu uvedeném vzorci 1 a 2 mohou zahrnovat jako celek 2-oxo-4aminopyrimidin-l-yl (to je cytosinyl), aminoskupinu chráněnou skupinou 2-oxo-4-aminopyrimidin-l-yl, 2-oxo-4-amino-5-fluorpyrimidin-l-yl, aminoskupinu chráněnou skupinou 2-oxo-4-amino-5-fluorpyrimidin-1 -yl, 4-amino-2-oxo-5-chlorpyrimidin-1 -yl, 2-oxo-4methoxypyrimidin-1 -y 1, 2-oxo-4-merkaptopyrimidin-1 -yl, 2-oxo-4-hydroxypyrimidin-1 -yl (to je uracinyl), 2-oxo-4-hydroxy-5-methylpyrimidin-l-yl (to je thyminyl) nebo 4-atomy-5methyl-2-oxopyrimidin-l-yl (to je 5-methylcytosinyl). Výhodnější je skupina 2-oxo-4benzoylaminopyrimidin-l-yl, cytosinyl, thyminyl, uracinyl, 2-oxo-4-benzoylamino-5-methylpyrimidin-l-yl nebo 5-methylcytosinylová skupina.

Termín „nukleosidový analog“ znamená nepřirozený typ nukleosidu, ve kterém purinové nebo pyrimidinová skupina je zachycena na cukru.

Termín „oligonukleotidový analog“ zahrnuje nepřirozený typ derivátu „oligonukleotidu“, který zahrnuje 2 až 50 „nukleosidů“ a mohou být stejné nebo odlišné a váží se pomocí diesterové vazby kyseliny fosforečné a takové analogy mohou přednostně zahrnovat cukerné deriváty, ve kterých se upravuje cukerná složka. Dále zahrnuje deriváty thioátu, ve kterých část vázaná diasterovou vazbou kyseliny fosforečné je thioátována. Dále zahrnuje esterové produkty, kde je esterifikována terminální část kyseliny fosforečné a amidové produkty, kde aminoskupina na purinové bázi je amidována. Výhodné jsou cukerné deriváty, ve kterých se cukerná složka upravuje a deriváty thioátu, kde část diasteru kyseliny fosforečné je thioátována.

Termín Jejich sůl“ znamená sole sloučeniny obecného vzorce 1 podle vynálezu, poněvadž se mohou převést na sole a takové sole mohou s výhodou zahrnovat anorganické sole například sole kovů, jako jsou sole alkalických kovů, například sodné sole, draselné sole a lithné sole, sole kovů alkalických zemin, například vápenaté sole a sole hořečnaté, sole hlinité, sole železité, sole zinku, mědi, niklu a kobaltu. Dále může zahrnovat sole aminů, jako jsou anorganické sole, například sole amonné, organické sole, například sole t-oktylaminu, sole dibenzylaminu, sole morfolinu, sole glukozaminu, sole fenylglycinalkylesteru, sole ethylendiaminu, sole vV-methylglukaminu, sole guanidinu, sole diethylaminu, sole thiethylaminu, sole dicyklohexylaminu, Λζ/VMibenzyl-7CZ 296576 B6 ethylendiaminu, sole chlorprokainu, sole prokainu, sole diethanolaminu, sole V-benzylfenylhylaminu, sole piperazinu, tetramethylaminné sole a sole tris(hydroxymethyl)aminomethanu. Dále zahrnuje sole anorganických kyselin, jako jsou sole halogenovodíkových kyselin, například sole kyseliny fluorovodíkové, sole kyseliny chlorovodíkové, sole kyseliny bromovodíkové a sole kyseliny jodovodíkové, sole kyseliny dusičné, sole kyseliny chloristé, sole kyseliny sírové a sole kyseliny fosforečné. Dále zahrnuje sole organických kyselin, jako jsou sole kyseliny nižší alkenylsulfonové, například sole kyseliny methansulfonové, sole kyseliny trifluormethansulfonové a sole kyseliny ethansulfonové, sole kyseliny arylsulfonové, například sole kyseliny benzensulfonové a sole kyseliny p-toluensulfonové, sole kyseliny octové, sole kyseliny máselné, sole kyseliny mravenčí, sole kyseliny jantarové, sole kyseliny citrónové, sole kyseliny vinné, sole kyseliny šťavelové a sole kyseliny máselné a sole aminokyselin, jako jsou například sole glycinu, sole lyzinu, sole argininu, sole omitinu a sole kyseliny glutamové a sole kyseliny asparagové.

Poněvadž upravené oligonukleotidy nebo polynukleotidové analogy podle vynálezu se mohou převést na sůl, termín Jejich farmaceuticky přijatelné sole“ může s výhodou zahrnovat anorganické sole, jako jsou například sole kovů, což jsou například sole alkalických kovů, například sodné sole, draselné sole a litné sole, sole kovů alkalických zemin, například vápenaté sole a sole hořečnaté, sole hlinité, sole železité, sole zinku, mědi, niklu a kobaltu. Dále může zahrnovat sole aminů, jako jsou anorganické sole, například sole amonné, organické sole, například sole t-oktylaminu, sole dibenzylaminu, sole morfolinu, sole glukozaminu, sole fenylglycinalkylesteru, sole ethylendiaminu, sole TV-methylglukaminu, sole guanidinu, sole diethylaminu, sole triethylaminu, sole dicyklohexylaminu, Ν,Ν'-dibenzyl-ethylendiaminu, sole N-benzylfenethylaminu, sole piperazinu, tetramethylamonné sole a sole tris(hydroxymethyl)aminomethanu. Dále zahrnuje sole anorganických zemin, jako jsou sole halogenovodíkových kyselin, například sole kyseliny fluorovodíkové, sole kyseliny chlorovodíkové, sole kyseliny bromovodíkové a sole kyseliny jodovodíkové, sole kyseliny dusičné, sole kyseliny chloristé, sole kyseliny sírové a sole kyseliny fosforečné. Dále zahrnuje sole organických kyselin, jako jsou sole kyseliny nižší alkensulfonové, například sole kyseliny methansulfonové, sole kyseliny trifluormethansulfonové a sole kyseliny ethansulfonové, sole kyseliny arylsulfonové, například sole kyseliny benzensulfonové a sole kyseliny p-toluensulfonové, sole kyseliny octové, sole kyseliny máselné, sole kyseliny mravenčí, sole kyseliny jantarové, sole kyseliny citrónové, sole kyseliny vinné, sole kyseliny šťavelové a sole kyseliny máselné a sole aminokyselin, jako jsou například sole glycinu, sole lyzinu, sole argininu, sole omitinu a sole kyseliny glutamové a sole kyseliny asparagové.

Ze sloučenin podle obecného vzorce 1 a jejich solí podle vynálezu výhodné sloučeniny mohou zahrnovat (1) sloučeniny, ve kterých symbol R¹ představuje atom vodíku, alifatickou acylovou skupinu, aromatickou acylovou skupinu, methylovou skupinu substituovanou jednou až třemi arylovými skupinami, methylovou skupinu substituovanou jednou až třemi arylovými skupinami, přičemž arylový kruh je substituovaný nižším alkylem, nižší alkoxyskupinu, halogenem nebo kyanoskupinou nebo silylovou skupinu, a její sole, (2) sloučeniny, kde symbol R¹ představuje atom vodíku, acetylovou skupinu, benzoylovou skupinu, benzylovou skupinu, p-methoxybenzylovou skupinu, dimethoxytritylovou skupinu, monomethoxytritylovou skupinu nebo řerc.-butyldifenylsilylovou skupinu, a její sole, (3) sloučeniny, ve kterých symbol R² představuje atom vodíku, alifatickou acylovou skupinu, aromatickou acylovou skupinu, methylovou skupinu substituovanou jednou až třemi arylovými skupinami, methylovou skupinu substituovanou jednou až třemi arylovými skupinami, přičemž arylový kruh je substituovaný nižším alkylem, nižší alkoxyskupinou, halogenem nebo kyanoskupinou nebo silylovou skupinou, skupinou fosforamiditu, fosfonylovou skupinu, skupinou kyseliny fosforečné nebo chráněnou skupinou kyseliny fosforečné, a její sole,

-8CZ 296576 B6 (4) sloučeniny, kde symbol R² představuje atom vodíku, acetylovou skupinu, benzoylovou skupinu, benzylovou skupinu, p-methoxybenzylovou skupinu, terc-butyldifenylsilylovou skupinu, -P(OCH₂H₄CN)(NCH(CH₃)₂), -P(OCH₃)(NCH(CH₃)₂, fosfonylovou skupinu nebo 2-chlorfenyl nebo skupinu kyseliny 4-chlorfenylfosforečné a jejich sole, (5) sloučeniny kde symbol A představuje methylenovou skupinu a jejich sole, (6) sloučeniny, kde symbol B představuje 6-aminopurin-9-yl (to je adeninyl), aminoskupinu chráněnou skupinou 6-aminopurin-9-yl, 2,6-diaminopurin-9-yl, 2-amino-6-chlorpurin9—yl, aminoskupina chráněná skupinou 2-amino-6-chlorpurin-9-yl, 2-amino-6-fluorpurin-9-yl, aminoskupina chráněná skupinou 2-amino-6-fluorpurin-9-yl, 2-amino-6-brompurin-9-yl, aminoskupina chráněná skupinou 2-amino-6-brompurin--9-yl, 2-amino-6hydroxypurin—9—yl (to je guaninyl), aminoskupina chráněná skupinou 2—amino—6—hydroxypurin-9-yl, hydroxylová skupina chráněná skupinou 2-amino-6-hydroxypurin-9-yl, 6-amino-6-chlorpurin-9-yl, 2-amino-6-fluorpurin-9-yl, 2,6-dimethoxypurin-9-yl, 2,6dichlorpurin-9-yl, 6-merkaptopurin-9-yl, 2-oxo-4-amino-pyrimidin-l-yl (to je cytosinyl), aminoskupina chráněná skupinou 2-oxo-4-aminopyrimidin-l-yl, 2-oxo-4-amino-5fluorpyrimidin-l-yl, aminoskupina chráněná skupinou 2-oxo-4-amino-5-fluorpyrimidin-

1— yl, 4-amino-2-oxo-5-chlorpyrimidin-l-yl, 2-oxo-4-methoxypyrimidin-l-yl, 2-oxo-

4-merkaptopyrimidin-l-yl, 2-oxo-4-hydroxypyrimidin-l-yl (to je uracinyl), 2-oxo-4hydroxy-5-methylpyrimidin-l-yl (to je thyminyl), 4-amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-lyl (to je 5-methylcytosinyl) nebo aminoskupina chráněná skupinou 4-amino-5-methyl-2oxopyrimidin-l-yl, a jejich sole a (7) sloučeniny, kde symbol B představuje 6-benzoylaminopurin-9-yl, adeninyl, 2-izobutyrylamino-6-hydroxypurin-9-y, guaninyl, 2-oxo-4-benzoylaminopynmidm-l-yl, cytosinyl,

2- oxo-5-methyl^4-benzoylaminopyrimidm-l-yl, 5-methylcytosinyl, uracinyl nebo thiminyl, a jejich sole.

Shora uvedené sloučeniny v odstavcích (1) a (2), (3) a (4) nebo (6) a (7) označují výhodné sloučeniny, jejichž počet se stává ve vzorci 1 vyšší. Sloučenina získaná výběrem symbolu R¹ ze skupin popsaných v odstavcích (1) a (2), výběrem symbolu R² ze skupin popsaných v odstavcích (3) a (4), výběrem symbolu A ze skupin popsaných v odstavci (5) a výběrem symbolu B ze skupin opsaných v odstavci (6) a (7) nebo jejich kombinací, a její sole je výhodná. Zvláště výhodné jsou sloučeniny a jejich sole vybrané z následujících skupin.

(Skupina sloučenin)

2'-O,4'-C-ethylenguanosin 2'-O,4'-C-ethylenadenosin 3',5'-di-0-benzyl-2'-C,4'-C-ethylen-6-7V-benzoyladenosin 3',5'-di-O-benzyl-2'-(9,4'-C-ethylen-2-AMzobutyrylguanosin 5'-0-dimethoxytrityl-2'-0,4'-C-ethylen-6-7V-benzoyladenosin 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-2-AMzobutyrylguanosin 2'-O,4'-C-ethylen-2-AMzobutyrylguanosin

2'-O,4'-C-ethylen-6-;V-benzoyladenosin 5'-O-dimethoxytrityl-2'-C>,4'-C-ethylen-6-2V-benzoyladenosin-3'-O-(2-kyanoethyl-N,N-diizopropyl)fosforamidit

5'-O-dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-2-2V-osobutyrylguanosin-3'-(9-(2-kyanoethyl-A(?/diizopropyl)fosforamidin

2'-O,4'-C-ethylenuridin

2'-O,4'-C-ethylen-5-methyluridin

2'-O,4'-C-ethylencytidin

2'-O,4'-C-ethylen-5-methylcytidin

-9CZ 296576 B6 ',5 '-di-O-benzyl-2 '-(9,4'C-ethylenuridin 5'-0-dimethyoxytrityl-2'-0,4'-C-ethylenuridin 3', 5 -di-O-benzyl-2'-CM'-C-ethylen-5-methyluridin 5'-O-dimethoxytrityl-2'-C>,4-C-ethylen-5-methyluridin 3', 5 '-di-0-benzyl-2'-0,4'-C-ethylen-4-.N-benzoylcytidm 5'-0-dimethoxytrityl-2'-0,4-C-ethylen-4-V-benzoylcytidin 3' ,5 '-di-O-benzyl-2'-O,4'-C-ethylen-4-N-benzoyl-5-rnethyluridin 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-4-V-benzoyl-5-methylcytidin 2'-O,4'-C-ethylen-4-V-benzoylcytidm 2'-O,4'-C-ethylen-4-7V-benzoyl-5-methylcytidin 5'-O-dimethoxytrityl-2'-C>,4-C-ethylenuridin-3'-(9-(2-kyanoethyl-VA-diizopropyl)fosforamidin 5'-O-dimethoxytrityl-2'-(7,4'-C-ethylen-5-methyluridin-3'-O-(2-kyanoethyl-V,V-diizopropyl)fosforamidit

5'-O-dimethoxytrityl-2'-(9,4'-C-ethylen-4-V-benzoylcytidin-3'-O-(2-kyanoethyl-2V,7V-diizopropyl)fosforamidit a

5'-0-dimethoxytrityl-2'-(9,4'-C-ethylen-5-methyluridin-3'-0-(2-kyanoethyl-V_>V-diizopropyl)fosforamidit.

Výhodné sloučeniny zahrnující oligonukleotidové analogy obsahující jednu nebo dvě nebo více struktur obecného vzorce 2 a jejich farmaceuticky přijatelné sole podle vynálezu mohou zahrnovat (8) oligonukleotidové analogy, kde symbol A představuje methylenovou skupinu, a jejich farmaceuticky přijatelné sole, (9) oligonukleotidové analogy, kde symbol B představuje 6-aminopurin-9-yl (to je adeninyl), aminoskupinu chráněnou skupinou 6-aminopurin-9-yl, 2,6-diaminopurin-9-yl, 2-amino6-chlor-purin-9-yl, aminoskupina chráněná skupinou 2-amino-6-chlorpurin-9-yl, 2-amino-6-fluorpurin-9-yl, aminoskupina chráněná skupinou 2-amino-6-fluorpurin-9-yl, aminoskupina chráněná skupinou 2-amino-6-fluorpurin-9-yl, 2-amino-6-brompurin-9-yl, aminoskupina chráněná skupinou 2-amino-6-brompurin-9-yl, 2-amino-6-hydroxypurin9-yl (to je guaninyl), aminoskupina chráněná skupinou 2-amino-6-hydroxypurin-9-yl, hydroxylová skupina chráněná skupinou 2-arnino-6-hydroxypurin-9-yl, 6-amino-6-chlorpurin-9-yl, 2-amino-6-fluorpurin-9-yl, 2,6-dimethoxypurin-9-yl, 2,6-dichlorpurin-9-yl, 6-merkaptopurin-9-yl, 2-oxo-4-amino-pyrimidin-l-yl (to je cytosinyl), aminoskupina chráněná skupinou 2-oxo-4—arninopyrimidin-l-yl, 2-oxo-4-amino-5-fluorpyrirnidin-lyl, aminoskupina chráněná skupinou 2-oxo^l-amino-5--fluorpyrimidin-l-yl, 4-amino-2oxo-5-chlorpyrimidin-l-yl, 2-oxo-4-methoxypyrimidin-l-yl, 2-oxo-4-merkaptopyrimidin-l-yl, 2-oxo-4-hydroxypyrimidin-l-yl (to je uracinyl), 2-oxo-4-hydroxy-5-methylpyrimidin-l-yl (to je thyminyl), 4-amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-l-yl (to je 5-methylcytosinyl) nebo aminoskupina chráněná skupinou 4-amino-5-methyl-2--oxopyrimidin-lyl, a jejich sole a (10) oligonukleotidové analogy, kde symbol B představuje 6-benzoylaminopurin-9-yl, adeninyl, 2-izobutyrylamino-6-hydroxypurin-9-yl, guaninyl, 2-oxo-4-benzoylaminopyrimidin-lyl, cytosinyl, 2-oxo-5-methyl-4-benzoylaminopyrimidin-l-yl, 5-methylcytosinyl, uracinyl nebo thyminyl, a jejich farmaceuticky přijatelné sole.

Odstavce (9) a (10) shora v textu označují nejvýhodnější oligonukleotidové analogy, jejichž počet se zvyšuje, a preferují se oligonukleotidové analogy získané výběrem symbolu A z odstavce (8) a výběrem symbolu B z odstavce (9) a (10) nebo jejich kombinace a jejich farmaceuticky přijatelné sole.

-10CZ 296576 B6

Specifické sloučeniny zahrnuté ve sloučenině shora uvedeného obecného vzorce 1 podle vynálezu jsou uvedeny v tabulce č. 1 a 2. Avšak sloučeniny podle vynálezu se neomezují na zde uvedené sloučeniny.

V tabulce č. 1 a 2 zkratka Př. č. slouč. reprezentuje příklad sloučeniny číslo, Me představuje methylovou skupinu, Bn představuje benzylovou skupinu, Bz představuje benzoyíovou skupinu, PMB prezentuje p-methoxybenzoylovou skupinu, Tr reprezentuje trifenylmethylovou skupinu, MMTr reprezentuje 4-methoxytrifenylmethylovou (monomethoxytritylovou) skupinu, DMTr reprezentuje 4,4'-dimethoxytrifenylmethylovou (dimethoxytritylovou) skupinu, zkratka TMTr ío reprezentuje 4,4',4''-trimethoxytrifenylmethylovou (trimethoxytritylovou) skupinu, TMS reprezentuje trimethylsilylovou skupinu, TBDMS reprezentuje Zerc-butyldimethylsilylovou skupinu, TBDPS reprezentuje Zerc-butyldifenylsilylovou skupinu a TIPS reprezentuje triizopropylsilylovou skupinu.

(Γ)

- 11 CZ 296576 B6

Tabulka č. 1:

Př. slouč. č.	A	R¹	R²	_R3a	R^4a
1-1	ch₂	H	H	H	H
1-2	ch₂	H	H	H	nh₂
1-3	ch₂	H	H	H	OH
1-4	ch₂	H	H	OH	H
1-5	ch₂	H	H	OH	nh₂
1-6	ch₂	H	H	OH	OH
1-7	ch₂	H	H	nh₂	Η
1-8	ch₂	H	H	nh₂	nh₂
1-9	ch₂	H	H	nh₂	Cl
1-10	ch₂	H	H	nh₂	F
1-11	ch₂	H	H	nh₂	Br
1-12	ch₂	H	H	nh₂	OH
1-13	ch₂	H	H	OMe	H
1-14	ch₂	H	H	OMe	OMe
1-15	ch₂	H	H	OMe	nh₂
1-16	ch₂	H	H	Cl	H
1-17	ch₂	H	H	Br	H
1-18	ch₂	H	H	F	H
1-19	ch₂	H	H	Cl	Cl
1-20	ch₂	H	H	SH	H

-12CZ 296576 B6

1-21	ch₂	Bn	H	NHBz	H
1-22	ch₂	Bn	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-23	ch₂	Bn	Bn	NHBz	H
1-24	ch₂	Bn	Bn	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-25	ch₂	PMB	H	NHBz	H
1-26	ch₂	PMB	H	OH	NHČOCH(CH₃)₂
1-27	ch₂	PMB	PMB	NHBz	H
1-28	ch₂	PMB	PMB	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-29	ch₂	Tr	H	NHBz	H
1-30	ch₂	MMTr	H	NHBz	H
1-31	ch₂	DMTr	H	NHBz	H
1-32	ch₂	TMTr	H	NHBz	H
1-33	ch₂	Tr	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-34	ch₂	MMTr	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-35	ch₂	DMTr	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-36	ch₂	TMTr	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-37	ch₂	TMS	H	NHBz	H
1-38	ch₂	TBDMS	H	NHBz	H
1-39	ch₂	TBDPS	H	NHBz	H
1-40	ch₂	TIPS	H	NHBz	H
1-41	ch₂	TMS	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-42	ch₂	TBDMS	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-43	ch₂	TBDPS	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-44	ch₂	TIPS	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-45	(CH₂)_z	H	H	H	H
1-46	(CH₂)₂	H	H	H	nh₂
1-47	(CH₂)₂	H	H	H	OH
1-48	(CH₂)₂	H	H	OH	H
1-49	(CH₂)₂	H	H	OH	NH₂
1-50	(CH₂)₂	H	H	OH	OH
1-51	(CH₂)₂	H	H	nh₂	H
1-52	(CH₂)₂	H	H	nh₂	nh₂

- 13 CZ 296576 B6

1-53	(CH₂)₂	H	H	nh₂	Cl
1-54	(CH₂)₂	H	H	nh₂	F
1-55	(CH₂)₂	H	H	nh₂	Br
1-56	(CH₂)₂	H	H	nh₂	OH
1-57	(CH₂)₂	H	H	OMe	H
1-58	(CH₂)₂	H	H	OMe	OMe
1-59	(CH₂)₂	H	H	OMe	nh₂
1-60	(CH₂)₂	H	H	Cl	H
1-61	(CH₂)₂	H	H	Br	H
1-62	(CH₂)₂	H	H	F	H
1-63	(CH₂)₂	H	H	Cl	Cl
1-64	(CH₂)₂	H	H	SH	H
1-65	(CH₂)₂	Bn	H	NHBz	H
1-66	(CH₂)₂	Bn	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-67	(CH₂)₂	Bn	Bn	NHBz	H
1-68	(CH₂)₂	Bn	Bn	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-69	(CH₂)₂	PMB	H	NHBz	H
1-70	(CH₂)₂	PMB	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-71	(CH₂)₂	PMB	PMB	NHBz	H
1-72	(CH₂)₂	PMB	PMB	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-73	(CH₂)₂	Tr	H	NHBz	H
1-74	(CH₂)₂	MMTr	H	NHBz	H
1-75	(CH₂)₂	DMTr	H	NHBz	H
1-76	(CH₂)₂	TMTr	H	NHBz	H
1-77	(CH₂)₂	Tr	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-78	(CH₂)₂	MMTr	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-79	(ch₂)₂	DMTr	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-80	(CH₂)₂	TMTr	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-81	(CH₂)₂	TMS	H	NHBz	H
1-82	(CH₂)₂	TBDMS	H	NHBz	H
1-83	(CH₂)₂	TBDPS	H	NHBz	H
1-84	(CH₂)₂	TEPS	H	NHBz	H

- 14CZ 296576 B6

1-85	(CH₂)₂	TMS	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-86	(CH₂)₂	TBDMS	H	OH	ŇHCOCH(CH₃)₂
1-87	(CH₂)₂	TBDPS	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-88	(CH₂)₂	TIPS	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-89	(CH₂)₃	H	H	H	H
1-90	(CH₂)3	H	H	H	NH₂
1-91	(CH₂)3	H	H	H	OH
1-92	(CH₂)3	H	H	OH	H
1-93	(CH₂)₃	H	H	OH	NH₂
1-94	(CH₂)3	H	H	OH	OH
1-95	(CH₂)3	H	H	NH₂	H
1-96	(CH₂)3	H	H	nh₂	nh₂
1-97	(CH₂)3	H	H	nh₂	Cl
1-98	(CH₂)j	H	H	nh₂	F
1-99	(CH₂)3	H	H	nh₂	Br
1-100	(CH₂)3	H	H	nh₂	OH
1-101	(CH₂)3	H	H	OMe	H
1-102	(CH₂)₃	H	H	OMe	OMe
1-103	(CH₂)3	H	H	OMe	nh₂
1-104	(CH₂)3	H	H	Cl	H
1-105	(CH₂)3	H	H	Br	H
1-106	(CH₂)3	H	H	F	H
1-107	(CH₂)3	H	H	Cl	Cl
1-108	(CH₂)3	H	H	SH	H
1-109	(CH₂)3	Bn	H	NHBz	H
1-110	(CH₂)3	Bn	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-111	(CH₂)3	Bn	Bn	NHBz	H
1-112	(CH₂)3	Bn	Bn	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-113	(CH₂)3	PMB	H	NHBz	H
1-114	(CH₂)3	PMB	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-115	(CH₂)3	PMB	PMB	NHBz	H
1-116	(CH₂)3	PMB	PMB	OH	NHCOCH(CH₃)₂

-15 CZ 296576 B6

1-117	(CH₂>3	Tr	H	NHBz	Η
1-118	(CH₂)3	MMTr	H	NHBz	H
1-119	(CH₂)3	DMTr	H	NHBz	H
1-120	(CH₂)j	TMTr	H	NHBz	H
1-121	(CH₂)3	Tr	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-122	(CH₂)3	MMTr	H	OH	NHCÓCH(CH₃)₂
1-123	(CH₂)j	DMTr	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-124	(ch₂)₃	TMTr	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-125	(CH₂)₃	TMS	H	NHBz	H
1-126	(CH₂)j	TBDMS	H	NHBz	H
1-127	(CH₂)3	TBDPS	H	NHBz	H
1-128	(CH₂)3	TIPS	H	NHBz	H
1-129	(CH₂)3	TMS	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-130	(CH₂)3	TBDMS	H	OH	NHCOCH(CH3)₂
1-131	(CH₂)3	TBDPS	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-132	(CH₂)j	TIPS	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-133	(C1I₂)₄	H	11	H	H
1-134	(CH₂)₄	H	H	H	NH₂
1-135	(CH₂)₄	H	H	H	OH
1-136	(CH₂)₄	H	H	OH	H
1-137	(CH₂)₄	II	H	OH	nh₂
1-138	(ch₂)₄	H	H	OH	OH
1-139	(CH₂)₄	H	H	nh₂	H
1-140	(CH₂)4	H	H	nh₂	nh₂
1-141	(ch₂)₄	H	H	nh₂	Cl
1-142	(CH₂)4	H	H	nh₂	F
1-143	(CH₂)4	H	H	nh₂	Br
1-144	(CH₂)₄	H	H	nh₂	OH
1-145	(CH₂)₄	H	H	OMe	H
1-146	(CH₂)4	H	H	OMe	OMe
1-147	(CH₂)₄	H	í	OMe	nh₂
1-148	(ch₂)₄	H	H	Cl	H

- 16CZ 296576 B6

1-149	(CH₂)₄	H	H	Br	H
1-150	(Ch₂)₄	H	H	F	H
1-151	(CH₂)₄	H	H	Cl	ČI
1-152	(CH₂)₄	H	H	SH	H
1-153	(CH₂)₄	Bn	H	NHBz	H
1-154	(CH₂)₄	Bn	H	OH	ŇHCOCH(CH₃)₂
1-155	(CH₂)₄	Bn	Bn	NHBz	H
1-156	(CH₂)₄	Bn	Bn	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-157	(CH₂)₄	PMB	H	NHBz	H
1-158	(CH₂)₄	PMB	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-159	(CH₂)₄	PMB	PMB	NHBz	H
1-160	(CH₂)4	PMB	PMB	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-161	(CH₂)₄	Tr	H	NHBz	H
1-162	(CH₂)₄	MMTr	H	NHBz	Ϊ1
1-163	(Cřl₂)₄	DMTr	H	NHBz	H
1-164	(CH₂)₄	TMTr	H	NHBz	H
1-165	(CH₂)₄	Tr	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-166	(CH₂)₄	MMTr	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-167	(CH₂)4	DMTr	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-168	(CH₂)₄	TMTr	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-169	(CH₂)₄	TMS	H	NHBz	H
1-170	(CH₂)4	TBDMS	H	NHBz	H
1-171	(CH₂)₄	TBDPS	H	NHBz	H
1-172	(CH₂)4	T1PS	H	NHBz	H
1-173	(CH₂)₄	TMS	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-174	(CH₂)4	TBDMS	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-175	(CH₂)₄	TBDPS	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-176	(CH₂)₄	TIPS	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-177	ch₂	H	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-178	ch₂	H	H	NHBz	H
1-179	(CH₂)₂	H	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-180	(CH₂)₂	H	H	NHBz	H

- 17CZ 296576 B6

1-181	(CH₂)₃	H	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-182	(CH₂)₃	H	H	NHBz	H
1-183	(CH₂)₄	H	H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-184	(CH₂)₄	H	H	NHBz	H
1-185	ch₂	DMTr	P(N(iPr)₂)(OC₂H₄CN)	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-186	ch₂	DMTr	P(N(iPr)₂)(OC₂H₄ČN)	NHBz	H
1-187	(CH₂)₂	DMTr	P(N(iPr)₂)(OC₂H₄CN)	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-188	(CH₂)₂	DMTr	P(N(iPr)₂)(OC₂H₄ČN)	NHBz	H
1-189	(CH₂)₃	DMTr	P(N(iPr)₂)(OC₂H₄CN)	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-190	(CH₂)j	DMTr	P(N(iPr)₂)(OC₂H₄CN)	NHBz	H
1-191	(CH₂)₄	DMTr	PíNíiPrhXOC^CN)	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-192	(CH₂)₄	DMTr	P(N(iPr)₂)(OC₂H₄ČŇ)	NHBz	H
1-193	ch₂	DMTr	P(N(iPr)₂)(OCH₃)	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-194	ch₂	DMTr	P(N(iPr)₂)(OCH₃)	NHBz	H
1-195	(CH₂)₂	DMTr	P(N(iPr)₂)(OCH₃)	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-196	(CH₂)₂	DMTr	P(N(iPr)₂)(OCH₃)	NHBz	H
1-197	(CH₂)₃	DMTr	P(N(iPr)₂)(OCH₃)	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-198	(CH₂)₃	DMTr	P(N(iPr)₂)(OCH₃)	NHBz	H
1-199	(CH₂)₄	DMTr	P(N(ÍPr)₂)(OCH₃)	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-200	(CH₂)₄	DMTr	P(N(iPr)₂)(OCH₃)	NHBz	H
1-201	ch₂	DMTr	P(O)(OH)H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-202	ch₂	DMTr	P(O)(OH)H	NHBz	H
1-203	(CH₂)₂	DMTr	P(O)(OH)H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-204	(CH₂)₂	DMTr	P(O)(OH)H	NHBz	H
1-205	(CH₂)₃	DMTr	P(O)(OH)H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-206	(CH₂)₃	DMTr	P(O)(OH)H	NHBz	H
1-207	(CH₂)₄	DMTr	P(O)(OH)H	OH	NHCOCH(CH₃)₂
1-208	(CH₂)₄	DMTr	P(O)(OH)H	NHBz	H

-18CZ 296576 B6

(1)

Tabulka č. 2

Př. slouč. č.	A	R¹	R^z	R⁵	R⁶
2-1	ch₂	H	H	OH	H
2-2	ch₂	H	H	OH	CH₃
2-3	ch₂	H	H	nh₂	H
2-4	ch₂	H	H	nh₂	ch₃
2-5	ch₂	H	H	nh₂	F
2-6	ch₂	H	H	Cl	H
2-7	ch₂	H	H	OMe	H
2-8	ch₂	H	H	SH	H
2-9	ch₂	Bn	H	OH	H
2-10	ch₂	Bn	Bn	OH	H
2-11	ch₂	PMB	H	OH	H
2-12	ch₂	PMB	PMB	OH	H
2-13	ch₂	Tr	H	OH	H
2-14	ch₂	MMTr	H	OH	H
2-15	ch₂	DMTr	H	OH	H
2-16	ch₂	TMTr	H	OH	H
2-17	ch₂	TMS	H	OH	H
2-18	ch₂	TBDMS	H	OH	H
2-19	ch₂	TBDPS	H	OH	H

- 19CZ 296576 B6

2-20	ch₂	TIPS	H	OH	H
2-21	ch₂	Bn	H	OH	ch₃
2-22	ch₂	Bn	Bn	OH	ch₃
2-23	ch₂	PMB	H	OH	ch₃
2-24	ch₂	PMB	PMB	OH	ch₃
2-25	ch₂	Tr	H	OH	ch₃
2-26	ch₂	MMTr	H	OH	ch₃
2-27	ch₂	DMTr	H	OH	ch₃
2-28	ch₂	TMTr	H	OH	ch₃
2-29	ch₂	TMS	H	OH	ch₃
2-30	ch₂	TBDMS	H	OH	ch₃
2-31	ch₂	TBDPS	H	OH	ch₃
2-32	ch₂	TIPS	H	OH	ch₃
2-33	ch₂	Bn	H	NHBz	H
2-34	ch₂	Bn	Bn	NHBz	H
2-35	ch₂	PMB	H	NHBz	H
2-36	ch₂	PMB	PMB	NHBz	H
2-37	ch₂	Tr	H	NHBz	H
2-38	ch₂	MMTr	H	NHBz	H
2-39	ch₂	DMTr	H	NHBz	H
2-40	ch₂	TMTr	H	NHBz	H
2-41	ch₂	TMS	H	NHBz	H
2-42	ch₂	TBDMS	H	NHBz	H
2-43	ch₂	TBDPS	H	NHBz	H
2-44	ch₂	TIPS	H	NHBz	H
2-45	ch₂	Bn	H	NHBz	ch₃
2-46	ch₂	Bn	Bn	NHBz	ch₃
2-47	ch₂	PMB	H	NHBz	ch₃
2-48	ch₂	PMB	PMB	NHBz	ch₃
2-49	ch₂	Tr	H	NHBz	ch₃
2-50	ch₂	MMTr	H	NHBz	ch₃
2-51	ch₂	DMTr	H	NHBz	ch₃

-20CZ 296576 B6

2-52	ch₂	TMTr	H	NHBz	ch₃
2-53	ch₂	TMS	H	NHBz	ch₃
2-54	ch₂	TBDMS	H	NHBz	ch₃
2-55	ch₂	TBDPS	H	NHBz	ch₃
2-56	ch₂	TIPS	H	NHBz	ch₃
2-57	(CH₂)₂	H	H	OH	H
2-58	(CH₂)₂	H	H	OH	ch₃
2-59	(CH₂)₂	H	H	NH₂	H
2-60	(CH₂)₂	H	H	nh₂	ch₃
2-61	(CH₂)₂	H	H	nh₂	F
2-62	(CH₂)₂	H	H	Cl	Η
2-63	(CH₂)₂	H	H	OMe	Η
2-64	(CH₂)₂	H	H	SH	Η
2-65	(CH₂)₂	Bn	H	OH	Η
2-66	(Cli₂)₂	Bn	Bn	OH	Η
2-67	(CH₂)₂	PMB	H	OH	Η
2-68	(CH₂)₂	PMB	PMB	OH	Η
2-69	(CH₂)₂	Tr	H	OH	Η
2-70	(CH₂)₂	MMTr	H	OH	Η
2-71	(CH₂)₂	DMTr	H	OH	Η
2-72	(CH₂)₂	TMTr	H	OH	Η
2-73	(CH₂)₂	TMS	H	OH	Η
2-74	(CH₂)₂	TBDMS	H	OH	Η
2-75	(CH₂)₂	TBDPS	H	OH	Η
2-76	(CH₂)₂	TIPS	H	OH	Η
2-77	(CH₂)₂	Bn	H	OH	ch₃
2-78	(CH₂)₂	Bn	Bn	OH	ch₃
2-79	(CH₂)₂	PMB	H	OH	ch₃
2-80	(CH₂)2	PMB	PMB	OH	ch₃
2-81	(CH₂)₂	Tr	H	OH	ch₃
2-82	(CH₂)₂	MMTr	H	OH	ch₃
2-83	(CH₂)₂	DMTr	H	OH	CH₃

-21 CZ 296576 B6

1 2-84	(CH₂)₂	TMTr	H	OH	ch₃
2-85	(CH₂)₂	TMS	H	OH	ch₃
2-86	(CH₂)₂	TBDMS	H	OH	ch₃
2-87	(CH₂)₂	TBDPS	H	OH	ch₃
2-88	(CH₂)₂	TIPS	H	OH	ch₃
2-89	(CH₂)₂	Bn	H	NHBz	H
2-90	(CH₂)₂	Bn	Bn	NHBz	H
2-91	(CH₂)₂	PMB	H	NHBz	H
2-92	(CH₂)₂	PMB	PMB	NHBz	H
2-93	(CH₂)₂	Tr	H	NHBz	H
2-94	(CH₂)₂	MMTr	H	NHBz	H
2-95	(CH₂)₂	DMTr	H	NHBz	H
2-96	(CH₂)₂	TMTr	H	NHBz	H
2-97	(CH₂)₂	TMS	H	NHBz	H
2-98	(ch₂)₂	TBDMS	H	NHBz	H
2-99	(CH₂)₂	TBDPS	H	NHBz	H
2-100	(CH₂)₂	TIPS	H	NHBz	H
2-101	(CH₂)₂	Bn	H	NHBz	ch₃
2-102	(CH₂)₂	Bn	Bn	NHBz	ch₃
2-103	(CH₂)₂	PMB	H	NHBz	ch₃
2-104	(CH₂)₂	PMB	PMB	NHBz	ch₃
2-105	(CH₂)₂	Tr	H	NHBz	ch₃
2-106	(CH₂)₂	MMTr	H	NHBz	ch₃
2-107	(CH₂)₂	DMTr	H	NHBz	ch₃
2-108	(CH₂)₂	TMTr	H	NHBz	ch₃
2-109	(CH₂)₂	TMS	H	NHBz	ch₃
2-110	(CH₂)₂	TBDMS	H	NHBz	ch₃
2-111	(CH₂)₂	TBDPS	H	NHBz	ch₃
2-112	(čh₂)₂	TIPS	H	NHBz	ch₃
2-113	(CH₂)₃	H	H	OH	H
2-114	(CH₂)₃	H	H	OH	ch₃
2-115	(CH₂)₃	H	H	NH₂	H

-22CZ 296576 B6

2-116	(CH₂)₃	H	H	nh₂	ch₃
2-117	(CH₂)₃	H	H	nh₂	F
2-118	(C’H₂)₃	H	H	Cl	H
2-119	(CH₂)₃	H	H	OMe	H
2-120	(CH₂)₃	11	H	SH	H
2-121	(CH₂)₃	Bn	H	OH	H
2-122	(CH₂)₃	Bn	Bn	OH	H
2-123	(CH₂)₃	PMB	H	OH	H
2-124	(CH₂)₃	PMB	PMB	OH	H
2-125	(CH₂)₃	Tr	H	OH	H
2-126	(CH₂)₃	MMTr	H	OH	H
2-127	(CH₂)₃	DMTr	H	OH	H
2-128	(CH₂)₃	TMTr	H	OH	H
2-129	(CH₂)₃	TMS	H	OH	H
2-130	(CH₂)₃	TBDMS	H	OH	H
2-131	(CH₂)₃	TBDPS	H	OH	H
2-132	(CI1₂)₃	TIPS	H	OH	H
2-133	(CH₂)₃	Bn	H	OH	CH₃
2-134	(CH₂)₃	Bn	Bn	OH	ch₃
2-135	(CH₂)₃	PMB	H	OH	CH₃
2-136	(CH₂)₃	PMB	PMB	OH	ch₃
2-137	(cii₂)₃	Tr	H	OH	CHj
2-138	(CH₂)₃	MMTr	H	OH	ch₃
2-139	(CH₂)₃	DMTr	Ή	OH	CHa
2-140	(Cll₂)₃	TMTr	H	OH	CHa
2-141	(Cll₂)₃	TMS	H	OH	CHa
2-142	(CH₂)₃	TBDMS	H	OH	CHa
2-143	(Cll₂)a	TBDPS	H	OH	CHa
2-144	(CH₂)₃	TIPS	H	OH	CHa
2-145	(CH₂)₃	Bn	H	NHBz	H
2-146	(CH₂)₃	Bn	Bn	NHBz	H
2-147	(CH₂)₃	PMB	H	NHBz	H

-23 CZ 296576 B6

2-148	(CH₂)j	PMB	PMB	NHBz	_H
2-149	(CH₂)₃	Tr	H	NHBz	H
2450	(CH₂)₃	MMTr	H	NHBz	H
2-151	(CH₂)₃	DMTr	H	NHBz	H
2-152	(CH₂)s	TMTr	H	NHBz	H
2-153	(CH₂)₃	TMS	H	NHBz	H
2-154	(CH₂)3	TBDMS	H	NHBz	H
2-155	(CH₂)₃	TBDPS	H	NHBz	H
2-156	(CH₂)3	TIPS	H	NHBz	H
2-157	(CH₂)3	Bn	H	NHBz	CH₃
2458	(ch₂)₃	Bn	Bn	NHBz	ch₃
2-159	(CH₂)3	PMB	H	NHBz	cii₃
2-160	(CH₂)₃	PMB	PMB	NHBz	ch₃
2461	(CH₂)3	Tr	H	NHBz	ch₃
2-162	(CH₂)3	MMTr	H	NHBz	ch₃
2-163	(CH₂)₃	DMTr	H	NHBz	ch₃
2-164	(CH₂)3	TMTr	H	NHBz	CH₃
2-165	(CH₂)₃	TMS	H	NHBz	ch₃
2-166	(ch₂)₃	TBDMS	H	NHBz	ch₃
2-167	(CH₂)3	TBDPS	H	NHBz	ch₃
2468	(Ch₂)₃	TIPS	H	NHBz	ch₃
2-169	(CH₂)₄	H	H	OH	Η
2-170	(CH₂)4	H	H	OH	ch₃
2-171	(CH₂)₄	H	H	nh₂	H
2472	(CH₂)4	H	H	nh₂	ch₃
2-173	(CH₂)4	H	H	nh₂	F
2474	(CH₂)₄	H	H	Cl	H
2-175	(ch₂)₄	H	H	OMe	H
2-176	(ch₂)₄	H	H	SH	H
2477	(CH₂)4	Bn	H	OH	H
2-178	(CH₂)4	Bn	Bn	OH	Η
2-179	(ch₂)₄	PMB	H	OH	H

-24CZ 296576 B6

2-180	(CH₂)₄	PMB	PMB	OH	H
2-181	(CH₂)₄	Tr	H	OH	H
2-182	(CH₂)₄	MMTr	H	OH	H
2-183	(CH₂)₄	DMTr	H	OH	H
2-184	(CH₂)₄	TMTr	H	OH	H
2-185	(CH₂)₄	TMS	H	OH	H
2-186	(CH₂)₄	TBDMS	H	OH	H
2-187	(CH₂)₄	TBDPS	H	OH	H
2-188	(CH₂)₄	TIPS	H	ÓH	H
2-189	(CH₂)₄	Bn	H	OH	ch₃
2-190	(CH₂)4	Bn	Bn	OH	ch₃
2-191	(CH₂)₄	PMB	H	OH	ch₃
2-192	(CH₂)₄	PMB	PMB	OH	ch₃
2-193	(CH₂)4	Tr	H	OH	ch₃
2-194	(CH₂)₄	MMTr	H	OH	ch₃
2-195	(CH₂)4	DMTr	H	OH	ch₃
2-196	(CH₂)4	TMTr	H	OH	ch₃
2-197	(CH₂)4	TMS	H	OH	ch₃
2-198	(CH₂)₄	TBDMS	H	OH	ch₃
2-199	(CH₂)4	TBDPS	H	OH	ch₃
2-200	(CH₂)₄	TIPS	H	OH	ch₃
2-201	(CH₂)₄	Bn	H	NHBz	H
2-202	(CH₂)4	Bn	Bn	NHBz	H
2-203	(CH₂)₄	PMB	H	NHBz	H
2-204	(CH₂)₄	PMB	PMB	NHBz	H
2-205	(CH₂)₄	Tr	H	NHBz	H
2-206	(CH₂)₄	MMTr	H	NHBz	H
2-207	(CH₂)₄	DMTr	H	NHBz	H
2-208	(CH₂)₄	TMTr	H	NHBz	H
2-209	(CH₂)₄	TMS	H	NHBz	H
2-210	(CH₂)4	TBDMS	H	NHBz	H
2-211	(CH₂)₄	TBDPS	H	NHBz	H

-25 CZ 296576 B6

2-212	(CH₂)₄	TIPS	H	NHBz	H
2-213	(CH₂)₄	Bn	H	NHBz	CH₃
2-214	(CH₂)₄	Bn	Bn	NHBz	ch₃
2-215	(CH₂)₄	PMB	H	NHBz	ch₃
2-216	(CH₂)₄	PMB	PMB	NHBz	čh₃
2-217	(CH₂)₄	Tr	H	NHBz	čh₃
2-218	(CH₂)4	MMTr	H	NHBz	ch₃
2-219	(CH₂)4	DMTr	H	NHBz	ch₃
2-220	(CH₂)4	TMTr	H	NHBz	ch₃
2-221	(CH₂)4	TMS	H	NHBz	ch₃
2-222	(CH₂)₄	TBDMS	H	NHBz	ch₃
2-223	(CH₂)4	TBDPS	H	NHBz	ch₃
2-224	(CH₂)4	TIPS	H	NHBz	ch₃
2-225	ch₂	H	H	NHBz	Η
2-226	ch₂	H	H	NHBz	ch₃
2-227	(ch₂)₂	H	H	NHBz	H
2-228	(CH₂)₂	H	H	NHBz	ch₃
2-229	(CH₂)j	H	H	NHBz	Η
2-230	(CH₂)₃	H	H	NHBz	ch₃
2-231	(CH₂)4	H	H	NHBz	H
2-232	(CH₂)4	H	H	NHBz	ch₃
2-233	ch₂	DMTr	P(N(iPr)₂)(OC₂H₄CN)	OH	Η
2-234	ch₂	DMTr	P(N(iPr)₂)(OC₂H₄CN)	OH	ch₃
2-235	ch₂	DMTr	P(N(iPr)₂)(OC₂H4CN)	NHBz	Η
2-236	ch₂	DMTr	PÍNCiPrhXOCztUCN)	NHBz	ch₃
2-237	(CH₂)₂	DMTr	P(N(iPr)₂)(OC₂H₄CN)	OH	Η
2-238	(CH₂)₂	DMTr	P(N(iPr)₂)(OC₂H4CN)	OH	ch₃
2-239	(CH₂)₂	DMTr	P(N(iPr)₂)(OC₂H₄CN)	NHBz	Η
2-240	(CH₂)₂	DMTr	P(N(iPr)₂)(OC₂H₄CN)	NHBz	ch₃
2-241	(CH₂)₃	DMTr	P(N(iPr)₂)(OC₂H₄CN)	OH	H
2-242	(CH₂)₃	DMTr	P(N(iPr)₂)(OC₂H₄CN)	OH	CH₃
2-243	(CH₂)3	DMTr	P(N(iPr)₂)(OC₂H4CN)	NHBz	H

-26CZ 296576 B6

2-244	(CH₂)₃	DMTr	P(N(iPr)₂)(OC₂H4CN)	NHBz	CH₃
2-245	(CH₂)4	DMTr	P(N(iPr)₂)(OC₂H4CN)	OH	H
2-246	(CH₂)4	DMTr	P(N(iPr)₂)(OC₂H₄CN)	OH	CH₃
2-247	(CH₂)4	DMTr	P(N(iPr)₂)(OC₂H4CN)	NHBz	H
2-248	(CH₂)4	DMTr	P(N(iPr)₂)(OC₂H4CN)	NHBz	ch₃
2-249	ch₂	DMTr	P(N(iPr)₂)(OCH₃)	OH	Η
2-250	ch₂	DMTr	P(N(iPr)₂)(OCH₃)	OH	ch₃
2-251	ch₂	DMTr	P(N(iPr)₂)(OCH₃)	NHBz	H
2-252	ch₂	DMTr	P(N(iPr)₂)(OCH₃)	NHBz	ch₃
2-253	(CH₂)₂	DMTr	P(N(iPr)₂)(OCH₃)	OH	Η
2-254	(CH₂)₂	DMTr	P(N(iPr)₂)(OCH₃)	OH	ch₃
2-255	(CH₂)₂	DMTr	P(N(iPr)₂)(OCH₃)	NHBz	Η
2-256	(CH₂)₂	DMTr	P(N(iPr)₂)(OCH₃)	NHBz	ch₃
2-257	(CH₂)₃	DMTr	P(N(iPr)₂)(OCH₃)	OH	Η
2-258	(CH₂)₃	DMTr	P(N(iPr)₂)(OCH₃)	OH	ch₃
2-259	(CH₂)₃	DMTr	P(N(iPr)₂)(OCH₃)	NHBz	H
2-260	(CH₂)3	DMTr	P(N(iPr)₂)(OCH₃)	NHBz	ch₃
2-261	(CH₂)4	DMTr	P(N(iPr)₂)(OCH₃)	OH	H
2-262	(CH₂)4	DMTr	P(N(iPr)₂)(OCH₃)	OH	ch₃
2-263	(CH₂)4	DMTr	P(N(iPr)₂)(OCH₃)	NHBz	H
2-264	(CH₂)4	DMTr	P(N(iPr)₂)(OCH₃)	NHBz	ch₃

V tabulce č. 1 a 2 uvedené shora v textu výhodné sloučeniny zahrnují (1-5), (1-7), (1-23), (1-24), (1-31), (1-35), (1-39), (1-43), (1-49), (1-51), (1-67), (1-68), (1-75), (1-83), (1-87), (1-93), (1-95), (1-111), (1-112), (1-119), (1-123), (1-127), (1-131), (1-137), (1-139), (1-155), (1-156), (1-163), (1-167), (1-171), (1-175), (1-177), (1-178), (1-185), (1-186), (1-193), (1-194), (1-201), (1-202), (2-1), (2-2), (2-4), (2-10), (2-15), (2-19), (2-22), (2-27), (2-31), (2-34), (2-39), (2-43), (2-46), (2-51), (2-55), (2-57), (2-58), (2-59), (2-60), (2-66), (2-71), (2-75), (2-78), (2-83), (2-87), (2-90), (2-95), (2-99), (2-102), (2-107), (2-111), (2-113), (2-114), (2-115), (2-116), (2-122), (2-127), (2-131), (2-134), (2-139), (2-143), (2-146), (2-151), (2-155), (2-158), (2-163), (2-167), (2-169), (2-170), (2-171), (2-172), (2-178), (2-183), (2-187), (2-190), (2-195), (2-199), (2-202), (2-207), (2-211), (2-214), (2-219), (2-223), (2-225), (2-226), (2-233), (2-234), (2-235), (2-236), výhodnější sloučeniny mohou zahrnovat

2'-O,4'-C-ethylenguanosin (1-5) 2'-O,4'-C-ethylenadenosin (1-7) 3' ,5'-di-0-benzyl-2'-C>,4'-C-ethylen-6-7V-benzoyladenosin (1-23) 3',5'-di-O-benzyl-2'-(9,4'-C-ethylen-2-ŤV-izobutyrylguanosin (1-24)

-27CZ 296576 B6

5'-0-dimethoxytrityl-2'-0,4 '-C-ethylen-6-A-benzoyladenosin (1-31)

5'-O-dimethoxytntyl-2'-0,4'-C-ethylen-2-7V-izobutyrylguanosin (1-35) 2'-O,4'-C-ethylen-2-V-izobutyrylguanosin (1-177)

2-0,4 '-C-ethylen-6-A-benzoyladenosin (1-178) 5'-0-dimethoxytrityl-2'-0,4'-C-ethylen-6-/V'-benzoyladenosin-3'-0-(2-kyanoethyl-N,Ndiizopropyl)fosforamidit (1-185) 5'-0-dimethoxytrityl-2'-0,4'-C-ethylen-2-2V-osobutyrylguanosin-3'-0-(2-kyanoethyl-A^r,Adiizopropyl)fosforamidin (1-186)

2'-O,4'-C-ethylenuridin (2-1)

2'-O,4'-C-ethylen-5-methylundin (2-2)

2'-O,4'-C-ethylencitidin (2-3) 2'-O,4'-C-ethylen-5-methylcytidin (2-4)

3', 5 '-di-O-benzyl-2 '-O,4'-C-ethylenuridin (2-10)

5'-O-dimethyoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylenuridin (2-15) 3',5'-di-O-benzyl-2'-O-4'-C-ethylen-5-methylundm (2-22) '-O-dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-5-rnethyluridin (2-27) 3',5'-di-O-benzyl-2'-O,4'-C-ethylen^l-/V-benzoylcytidin (2-34) 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O,4M>-ethylen-4-/V-benzoylcytidin (2-39) 3',5'-di-O-benzyl-2'-(9,4'-C-ethylen^4-7V-benzoyl-5-methyluridin (2^46) 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-4-7V-benzoyl-5-methylcytidin (2-51) 2'-O,4'-C-ethylen-4-jV-benzoylcytidin (2-225) 2'-O,4'-C-ethylen-4-A^f-benzoyl-5-methylcytidin (2-226) 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O,4-C-ethylenuridin-3'-O-(2-kyanoethyl-A,A'-diizopropyl)fosforamidin (2-233) 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-5-methyluridin-3'-O-(2-kyanoethyl-V,A'-diizopropyl)fosforamidit (2-234) '-O-dimethoxytrityl-2 '-O,4'-C-ethylen—4-A^r-benzoylcytidi n-3 '-O-(2-kyanoethyl-/V, TV-diizopropyl)fosforamidit (2-235) a 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-5-methyluridin-3'-O-(2-l<yanoethyl-/V,7V-diizopropyl)fosforamidit (2-36).

Postup A

-28CZ 296576 B6

A-6

Při postupu A, symbol X reprezentuje chránící skupinu, symbol Y reprezentuje chránící skupinu, symbol A reprezentuje to samé, jak se uvádí shora v textu, zatímco symbol B¹ reprezentuje skupinu purin-9-yl, substituovanou skupinu purin-9-yl nebo substituovanou skupinu 2-oxopyrimidin-l-yl, uvedené substituenty se vybraly ze shora uvedených substituentů a, ale s výjimkou nechráněné aminoskupiny „aminoskupiny“ která se může chránit“, zatímco symbol B² reprezentuje skupinu purin-9-yl, substituovanou skupinu purin-9-yl nebo substituovanou skupinu 2-oxopyrimidin-l-yl, uvedené substituenty se vybraly ze shora uvedených substituentů a, ale s výjimkou chráněných aminoskupin „aminoskupiny, která se může chránit“. Symbol R⁷ reprezentuje skupinu, která tvoří odstupující skupinu a symbol R⁸ reprezentuje alifatickou acylovou skupinu, která obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku.

Chrániči skupina vyjádřená symbolem X je stejná skupina jako je „hydroxylová chránící skupina“ ve shora v textu uvedeném symbolu R¹.

Chránící skupina Y je stejná skupina jako „hydroxylová chránící skupina“ ve shora uvedeném symbolu R².

„Skupina, která tvoří odstupující skupinu, symbolu R⁷ může zahrnovat nižší alkylsulfonylovou skupinu, jako je methansulfonyl a ethansulfonyl, nižší alkylsulfonylovou skupinu substituovanou halogenem, jako je trifluormethansulfonyl a arylsulfonylová skupina, jako je p-toluensulfonyl, přičemž je výhodná methansulfonová skupina nebo p-toluensulfonylová skupina.

„Alifatická acylová skupina zahrnující 2 až 4 atomy uhlíku“ symbolu R⁸ může zahrnovat acetylovou, propionoylovou, butylovou skupinu a podobně. Výhodná je acetylová skupina.

Dále v textu se každý krok postupu A popisuje detailně.

KrokA-1

Účelem je připravit sloučeninu obecného vzorce 4 reakcí sloučeniny obecného vzorce 3, která se může připravit způsobem B až D popsaným dále v textu s činidlem vhodným pro zavedení odstupující skupiny v přítomnosti bazického katalyzátoru v inertním rozpouštědle.

Použitelné rozpouštědlo může zahrnovat alifatické uhlovodíky, jako je hexan, heptan, ligroin a petroleter. Dále může zahrnovat aromatické uhlovodíky, jako je benzen, toluen, a xylen, halogenované uhlovodíky, jako je methylchlorid, chloroform, chlorid uhličitý, dichlorethan, chlorbenzen a dichlorbenzen, estery, jako je ethylformát, ethylacetát, propylacetát, butylacetát a diethylkarbonát, ethery, jako je diethylether, diizopropylether, tetrahydrofuran, dioxan, dimethoxyethan a diethylenglykoldimethylether, ketony, jako je aceton, methylethylketon, methylizobutylketon, izoforon a cyklohexanon, nitrosloučeniny, jako je nitroethan a nitrobenzen, nitrily, jako je acetonitril a izobutylronitril, amidy, jako je formamid, Α,Α-dimethylformamid, ΛζΑ-dimethylacetamid, 7V-methyl-2-pyrolidon, TV-methylpyrolidon a hexamethylfosforečný triamid, sulfoxidy, jako je sulfolan a pyridinové deriváty, přičemž výhodný je pyridin.

Zde použitý bazický katalyzátor může přednostně zahrnovat bázi, jako je triethylamin, pyridin a dimethylaminopyridin.

-29CZ 296576 B6

Činidlo pro zavedení odstupující skupiny může zahrnovat alkylsulfonylové halidy, jako je meťhansulfonylchlorid a ethansulfonylbromid a arylsulfonylové halidy, jako je p-toluensulfonylchlorid, přičemž výhodný je methansulfonylchlorid a p-toluensulfonylchlorid.

Reakční teplota kolísá v závislosti na počátečním materiálu, na rozpouštědle, na činidle pro zavedení odstupující skupiny a bazického katalyzátoru, ale je použitelný při teplotě 0 až 50 °C. Výhodná je teplota 10 až 40 °C.

Reakční čas kolísá v závislosti na počátečním materiálu, na rozpouštědle, na činidle pro zavedení odstupující skupiny a na bazickém katalyzátoru a reakční teplotě, ale je obvykle 10 minut až 24 hodin. Výhodný čas je 1 až 10 hodin.

Po reakci se požadovaná sloučenina obecného vzorce I získala například neutralizací reakčního roztoku, koncentrací reakční směsi, přidáním organického rozpouštědla nemísitelného s vodou, jako je ethylacetát, promýváním vodou, separací organické vrstvy obsahující požadovanou sloučeninu, sušením nevodným síranem hořečnatým a rozpouštědlo se odstranilo destilací.

Takto získaný požadovaný produkt se dále čistil, je-li to nutné, konvenčním způsobem, například rekrystalizací a chromatografíi na koloně se silikagelem.

KrokA-2

Dalším krokem je příprava sloučeniny obecného vzorce 5 reakcí sloučeniny obecného vzorce 4 v kroku A-l s kyselým anhydridem v přítomnosti kyselého katalyzátoru v rozpouštědle.

Zde použitelné rozpouštědlo může zahrnovat ethery, jako je diethylether, dioxan a tetrahydrofuran, nitrily, jako je acetonitril a izobutyronitril, amidy, jako je formamid ΛΑ/V-dimethylformamid, ΛζΝ-dimethylacetamid, N-methyl-2-pyrrolidin, /V-methylpyrrolidin a triamid kyseliny hexamethylfosforečné a organická kyselina, jako je kyselina octová. Výhodné je použití kyseliny octové.

Zde použitelný kyselý katalyzátor může zahrnovat anorganické kyseliny, jako je kyselina chlorovodíková, kyselina sírová a kyselina dusičná. Výhodná je kyselina sírová (zvláště koncentrovaná kyselina sírová).

Zde použitelný kyselý anhydrid může zahrnovat anhydrid nižší alifatické karboxylové kyseliny, jako je kyselý anhydrid a anhydrid kyseliny propionové, upřednostňuje se kyselý anhydrid.

Reakční teplota kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle, kyselém katalyzátoru a kyselém anhydridu a je obvykle 0 až 50 °C. Výhodné je 10 až 40 °C.

Reakční směs kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle, kyselém katalyzátoru, kyselém anhydridu a reakční teplotě, aleje obvykle 10 minut až 12 hodin. Výhodný čas reakce je 30 minut až 3 hodiny.

Po reakci požadovaná sloučenina obecného vzorce 5 se získala například zakoncentrováním reakční směsi, přidáním organického rozpouštědla nemísitelného s vodou, jako je etylacetát, promytím vodou, separací organické vrstvy, která obsahuje požadovanou sloučeninu, sušením na síranu hořečnatém a rozpouštědlo se odstranilo destilací.

Takto získaný požadovaný produkt se dále čistil, je-li to nutné, běžnou metodou, například rekrystalizací, chromatografíi na koloně se silikagelem a podobně.

-30CZ 296576 B6

Krok A-3

Dalším krokem je příprava sloučeniny obecného vzorce 6 reakcí sloučeniny obecného vzorce 5 v kroku A-2 s trimethylsilylovou sloučeninou odpovídající purinu nebo pyrimidinu, který může zahrnovat požadovaný substituent připravený podle publikace H. Vorbrggen, K. Krolikiewicz and B. Bennua, Chem. Ber., 114, 1234-1255 (1981) v přítomnosti katalyzátoru v inertním rozpouštědle.

Použitelné rozpouštědlo může zahrnovat aromatické uhlovodíky, jako je benzen, toluen, xylen, halogenované uhlovodíky, jako je methylenchlorid, chloroform, chlorid uhličitý, 1,2-dichlorethan, chlorbenzen a dichlorbenzen, nitrily, jako je acetonitril a izobutyronitril, amidy, jako je formamid, ΛζΑ-dimethylformamid, VM-dimethylacetamid, A-methyl-2-pyrrolidm, TV-methylpyrrolidinon a triamid kyseliny hexamethylfosforečné, sulfid uhličitý. Výhodný je 1,2-di-chlorethan.

Zde použitelný kyselý katalyzátor může zahrnovat Lewisovy kyselé katalyzátory, jako je A1C1₃, SnCl₄, TiCl₄, ZnCl₂, BF₃, trimethylsilyltrifluormethansulfonát. Výhodný je trimethylsilyltrifluormethansulfonát.

Reakční teplota kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle a kyselém katalyzátoru, ale obvykle se pohybuje od 0 do 100 °C. Výhodná je teplota 50 až 80 °C.

Reakční čas kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle, kyselém katalyzátoru a reakční teplotě, ale obvykle se pohybuje od 1 hodiny do 24 hodin. Výhodná je doba reakce 1 až 8 hodin.

Po reakci se požadovaná sloučenina obecného vzorce 6 získala například zakoncentrováním reakční směsi, přidáním organického rozpouštědla nemísitelného s vodou, jako je ethylacetát, promývání vodou, separací organické vrstvy obsahující požadovanou sloučeninu, sušení nevodným síranem hořečnatým a rozpouštědlo se odstranilo destilací.

Takto získaný požadovaný produkt se dále čistil, je-li to nutné, konvenčním způsobem, například rekrystalizací a chromatografií na koloně se silikagelem a podobně.

Krok A-4

Dalším krokem je příprava sloučeniny obecného vzorce la podle vynálezu cyklizací sloučeniny obecného vzorce 6 připravené v kroku A-3 v přítomnosti bazického katalyzátoru v inertním rozpouštědle.

Použitelný rozpouštědlo může zahrnovat vodu, pyridinové deriváty, acetonitrily, jako je acetonitril a izobutyronitril, amidy, jako je formamid, ΛζΑ-dimethylformamid, Λζ-V-dimethylacetamid, V-methyl-2-pyrrolidin, A-methylpyrrolidinon a triamid kyseliny hexamethylfosforečné a jejich směsi. Výhodná je směs vody a pyridinu.

Zde použitelný bazický katalyzátor může zahrnovat hydroxidy alkalických kovů, jako je hydrid sodný a hydroxid draselný, uhličitany alkalických kovů, jako je uhličitan sodný a uhličitan draselný, alkoxidy alkalických kovů, jako je methoxid sodný a ethoxid sodný a vodný amoniak. Výhodné jsou hydroxidy alkalických kovů (zvláště pak hydroxid sodný).

Teplota reakce kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle a bazickém katalyzátoru, ale obvykle její hodnota je od 0 do 50 °C. Výhodná je teplota od 10 °C do 30 °C. Reakční čas kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle, kyselém katalyzátoru areakční teplotě, aleje obvykle od 1 minuty do 5 hodin. Výhodný je čas reakce 1 minuta až 30 minut.

-31 CZ 296576 B6

Po reakci se požadovaná sloučenina obecného vzorce 6 získala například zakoncentrováním reakční směsi, přidáním organického rozpouštědla nemísitelného s vodou, jako je ethylacetát, promývání vodou, separací organické vrstvy obsahující požadovanou sloučeninu, sušením na nevodném síranu hořečnatém a rozpouštědlo se odstraní destilací.

Takto získaný požadovaný produkt se dále čistí, je-li to nutné, běžným způsobem, například rekrystalizací a chromatografíí na koloně se silikagelem a podobně.

Krok A-5

Dalším krokem je příprava sloučeniny obecného vzorce lb reakcí sloučeniny obecného vzorce la připravené v kroku A-4 v přítomnosti činidla odstraňující ochrannou skupinu v inertním rozpouštědle.

Metoda odstranění ochranné skupiny závisí na druhu ochranné skupiny a není omezena. Způsobuje vedlejší reakce a může se například provést způsobem popsaným v publikaci „Protective Groups in Organíc Synthesis“, Theodora W. Greene and Peter G. m. Wuts, 1999, Published A. Wiley-Interscience Publication).

Odstranění ochranné skupiny je možné zvláště provést následujícím způsobem, kde ochranná skupina je (1) alifatická acylová skupina nebo aromatická acylová skupina, (2) methylová skupina, substituovaná jednou nebo třemi arylovými skupinami nebo methylovou skupinou substituovanou jednou až třemi arylovými kruhy, které jsou substituovanými nižším alkylem, nižší alkoxyskupinou, halogenem nebo kyanoskupinou nebo (3) silylovou skupinou.

(1) V případě, že ochranná skupina je alifatická acylová skupina nebo aromatická acylová skupina, reakce odstraňující ochrannou skupinu je obvykle provedena ošetřením alkalickým činidlem v inertním rozpouštědle.

Zde použitelné rozpouštědlo není omezeno, pokud je jednoduše mísitelné s vodou, neinhibuje reakci a rozpouští počáteční materiál a může zahrnovat vodné anevodné amidy, jako je dimethylformamid a dimethylacetamid, halogenované uhlovodíky, jako je methylenchlorid, chloroform, 1,2-dichlorethan nebo tetrachlorid uhlíku a ethery, jako je tetrahydrofuran, diethylether a dioxan. Výhodné jsou ethery. Výhodnější je tetrafuran.

Zde použitelné alkalické činidlo může zahrnovat hydroxidy alkalických kovů, jako je hydroxid lithný, hydroxid draselný a hydroxid sodný, uhličitany alkalického kovů, jako je methoxid sodný a ethoxid sodný a roztok amoniaku, jako je roztok amoniaku ve vodě a roztok amoniaku v methanolu.

Reakční teplota je od 0 do 60 °C. Výhodná je teplota 20 až 40 °C. Reakční čas je od 10 minut do 24 hodin. Výhodná je doba reakce 1 až 3 hodiny.

Po reakci se požadovaná sloučenina obecného vzorce lb získala například zakoncentrováním reakční směsi, přidáním organického rozpouštědla nemísitelné s vodou, jako je ethylacetát, promývání vodou, separací organické vrstvy obsahující požadovanou sloučeninu, sušením na nevodném síranu hořečnatém a rozpouštědlo se odstraní destilací.

Takto získaný požadovaný produkt se dále čistí, je-li to nutné, konvenčním způsobem, například rekrystalizací a chromatografíí na koloně se silikagelem a podobně.

(2) V případě, že ochranná skupina je methylová skupina substituovaná jednou až třemi arylovými skupinami nebo methylovou skupinou substituovanou jednou až třemi arylovými kruhy, které jsou substituovanými nižším alkylem, nižší alkoxyskupinou, halogenem nebo kyanoskupinou, reakce se provádí v inertním rozpouštědle za použití redukčního činidla.

-32CZ 296576 B6

Zde použitelné rozpouštědlo zahrnuje přednostně alkoholy, jako je methanol, ethanol izopropanol, ethery, jako je diethylether, tetrahydrofuran a dioxan, aromatické uhlovodíky, jako je toluen, benzen a xylen, alifatické uhlovodíky, jako je hexan a cyklohexan, estery, jako je ethylacetát a propylacetát, organické kyseliny, jako je kyselina octová nebo směsi těchto organických rozpouštědel a vody.

Zde použitelné redukční činidlo není zvláště omezeno, pokud se může použít pro katalytickou redukci a je výhodné, aby zahrnovalo paládium na uhlíku, Raneyův nikl, oxid platiny, platinovou čerň, oxid rhodičito-hlinitý, chlorid trifenylfosfmrhodičitý a síran paladičito-bamatý.

Tlak není nijak omezen, aleje obvykle od 1 do 10 atmosfér.

Reakční teplota je od 0 do 60 °C. Výhodná je teplota od 20 do 40 °C.

Reakční čas je od 10 minut do 24 hodin. Výhodná je jedna hodina až tri hodiny.

Po reakci se požadovaná sloučenina obecného vzorce lb získala například zakoncentrováním reakční směsi, přidáním organického rozpouštědla nemísitelného s vodou, jako je ethylacetát, promytím vodou, separací organické vrstvy obsahující požadovanou sloučeninu, sušením na nevodném síranu hořečnatém a rozpouštědlo se odstraní destilací.

Takto získaný požadovaný produkt se dále čistí, je-li to nutné, konvenčním způsobem, například rekrystalizací a chromatografíi na koloně se silikagelem a podobně.

V případě, že ochranná skupina je methylová skupina substituovaná třemi arylovými skupinami, to znamená tritylová skupina, reakce odstraňující tritylovou skupinu může také proběhnout za použití kyseliny.

V případě, že zde použitelné rozpouštědlo zahrnuje aromatické uhlovodíky, jako je benzen, toluen a xylen, halogenované uhlovodíky, jako je methylenchlorid, chloroform, chlorid uhličitý, 1,2dichlorethan, chlorbenzen a dichlorbenzen, alkoholy, jako je methanol, ethanol, izopropanol a terc-butanol, nitrily, jako je acetonitril a izobutyronitril, amidy, jako je formamid, N,N-dimethylformamid, N,N-dimethylacetamid, N-methyl-2-pyrrolidon, N-methylpyrrolidon a triamid kyseliny hexamethylfosforečné a organické kyseliny, jako je kyselina octová. Výhodné jsou organické kyseliny (zvláště kyselina octová), nebo alkoholy (zvláště terc-butanol).

Zde použitelná kyselina může s výhodou zahrnovat kyselinu octovou nebo kyselinu trifluoroctovou.

Reakční teplota je od 0 do 60 °C. Výhodná je reakční teplota od 20 do 40 °C.

Reakční čas je od 10 minut do 24 hodin. Výhodná je doba reakce 1 až 3 hodiny.

Po reakci se požadovaná sloučenina obecného vzorce lb získala například zakoncentrováním reakční směsi, přidáním organického rozpouštědla nemísitelného s vodou, jako je ethylacetát, promývání vodou, separací organické vrstvy obsahující požadovanou sloučeninu, sušením na nevodném síranu hořečnatém a rozpouštědlo se odstraní destilací.

Takto získaný požadovaný produkt se dále čistí, je-li to nutné, běžným způsobem, například rekrystalizací a chromatografíi na koloně se silikagelem a podobně.

(3) V případě, že ochranná skupina je silylová skupina, může se obvykle odstranit ošetřením se sloučeninou produkující fluorid, jako je tetrabutylamoniumfluorid, kyselina fluorovodíková, kyselina fluorovodíková-pyridin a fluorid draselný nebo organické kyseliny, jako je kyselina

-33CZ 296576 B6 octová, kyselina methansulfonová, kyselina paratoluensulfonová, kyselina trifluoroctová a kyselina trifluormethansulfonová nebo organické kyseliny, jako je kyselina chlorovodíková.

V případě, že se ochranná skupina odstraní fluoride, reakce se někdy podpoří přidáním organických kyselin, jako je kyselina mravenčí, kyselina octová a kyselina propionová.

Zde použitelné rozpouštědlo není omezeno, pokud neinhibuje reakci a rozpouští počáteční materiál a může s výhodou použít ether, jako je tetrahydrofuran, diethylether, diizopropylether a dioxan, dimethoxyethan a diethylenglykoldimethylether, nitrily, jako je acetonitril a izobutyronitril, voda, organické kyseliny, jako je kyselina octová a jejich směsi.

Reakční teplota je od 0 do 100 °C. Výhodná je reakční teplota od 20 do 70 °C.

Reakční čas je od 5 minut do 48 hodin. Výhodná je doba reakce 1 až 24 hodin.

Po reakci se požadovaná sloučenina obecného vzorce lb získala například zakoncentrováním reakční směsi, přidáním organického rozpouštědla nemísitelného s vodou, jako je ethylacetát, promývání vodou, separací organické vrstvy obsahující požadovanou sloučeninu, sušení na nevodném síranu hořečnatém a rozpouštědlo se odstraní destilací.

Krok A-6

Dalším krokem je příprava sloučeniny obecného vzorce Ic reakcí sloučeniny obecného vzorce lb připravené v kroku A-5 v přítomnosti činidla odstraňujícího ochrannou skupinu v inertním rozpouštědle.

Metoda odstranění ochranné skupiny závisí na druhu ochranné skupiny a není omezena. Způsobu vedlejší reakce a může se například provést způsobem popsaným v publikaci „Protective Groups in Organic Synthesis“, Theodora W. Greene and Peter G. M. Wuts, 1999, Published A. Wiley-Interscience Publication).

Odstranění ochranné skupiny je možné zvláště provést následujícím způsobem, když ochranná skupina je alifatická acylovaná skupina nebo aromatická acylová skupina, reakce odstraňující ochrannou skupinu je obvykle provedena ošetřením alkalickým činidlem v inertním rozpouštědle.

Zde použití rozpouštědla není omezeno, pokud je jednoduše mísitelné s vodou, neinhibuje reakci a rozpouští počáteční materiál a může zahrnovat vodné a nevodné alkoholy jako je methanol a ethanol, amidy, jako je dimethylformarnid a dimethylacetamid, halogenované uhlovodíky, jako je methylenchlorid, chloroform, 1,2-dichlorethan nebo chlorid uhličitý a ethery, jako je tetrahydrofuran, diethylether a dioxan. Výhodné jsou alkoholy. Výhodnější je methanol.

Zde použitelné alkalické činidlo může zahrnovat hydroxidy alkalických kovů, jako je hydroxid lithný, hydroxid draselný a hydroxid sodný, uhličitany alkalického kovu, jako je uhličitan sodný a uhličitan draselný, alkoxidy alkalických kovů, jako je methoxid sodný a ethoxid sodný a roztok amoniaku. Výhodný je amoniak.

Reakční teplota je od 0 do 50 °C. Výhodné je teplota od 10 do 40 °C.

Reakční čas je od 10 minut do 24 hodin. Výhodná je doba reakce 10 minut až 15 hodin.

Po reakci se požadovaná sloučenina obecného vzorce lc získala například zakoncentrováním reakčním směsi, přidáním organického rozpouštědla nemísitelného s vodou, jako je ethylacetát,

-34CZ 296576 B6 promývání vodou, separací organické vrstvy obsahující požadovanou sloučeninu, sušení na nevodném síranu hořečnatém a rozpouštědlo se odstraní destilací.

Takto získaný požadovaný produkt se dále čistí, je-li to nutné, konvenčním způsobem, například 5 rekrystalizací a chromatografií na koloně se silikagelem a podobně.

Meziprodukt obecného vzorce 3 popsaný shora v textu se může připravit způsobem B až D, jak se popisuje dále v textu.

Způsob B

-35CZ 296576 B6

Při způsobu B a D symboly X a Y mají stejný význam jako se definuje shora v textu. Symbol R⁹ reprezentuje skupinu, která tvoří odstupující skupinu, symbol E reprezentuje ethylen, trimethylen nebo tetramethylen a symbol Z reprezentuje jednoduchou vazbu, methylenovou nebo ethylenovou skupinu.

Skupina, která tvoří odstupující skupinu symbolu R⁹ může zahrnovat skupinu popsanou shora v textu pro symbol R⁷. Výhodná je trifluormethansulfonylová skupina.

Symboly R¹¹ a R¹² jsou stejné a reprezentují vodíkový atom a dohromady tvoří atom kyslíku.

V případě, kdy symbol R¹¹ a R¹² dohromady tvoří atom kyslíku, symbol R¹⁰ reprezentuje alkylovou skupinu, která má 1 až 4 atomy uhlíku, jako je metyl, ethyl, propyl, izopropyl, butyl, izobutyl, .se/c-butyl a terc-butyl. Výhodná je methylová skupina. V případě, že symboly R¹¹ a R¹² jsou stejné a reprezentují atom vodíku, symbol R¹⁰ může zahrnovat aralkylovou skupinu, jako je benzylová skupina, alkoxyalkylová skupina, jako je methoxymethylová skupina, arylkarbonyloxymethylovou skupinu, jako je benzoyloxymethylová skupina, aralkyloxymethylová skupina, jako je benzyloxymethylová skupina, alkoxyalkoxyalkylová skupina, jako je methoxyethoxymethylová skupina, silylová skupina, jako je trimethylsilyl, í-butyldimethylsilyl, difenylmethylsilyl, difenylbutylsilyl, difenyl-izopropylsilyl a fenyldiizopropylsilyl.

Sloučenina obecného vzorce 7, to znamená počáteční materiál používaný v postupu B nebo v postupu C, se může připravit následujícím způsobem.

Sloučenina odpovídající sloučeniny obecného vzorce 6, jejíž část „X“ je atom vodíku, se připravila z 1,1,5,6-diizopropyliden-D-glukosy podle způsobu uvedeného v publikaci R.D. Youssefyeh, J.P.H. Verheyden, J.G. Moffatt, J. Organ. Chem., 44, 1301-1309 (1979) a následně sloučenina obecného vzorce 6 se může připravit podle metody popsané v publikaci T. Waga, T. Nishizaki, I. Miyakawa, H. Ohrui, H. Meguro, Biosci. Biotechnol. Biochem., 57, 1433-1438 (1993) (v případě, že symbol Xje Bn).

Způsob B

Krok B-l

V tomto kroku se připravuje sloučenina obecného vzorce 8 reakcí sloučeniny obecného vzorce 7 připravené shora v textu popsanou metodou s činidlem vhodným pro zavedení odstupující skupiny v přítomnosti alkalického katalyzátoru v inertním rozpouštědle.

Použitelné rozpouštědlo může zahrnovat amidy, jako je dimethylformamid a dimethylacetamid, halogenované uhlovodíky, jako je methylenchlorid, chloroform, 1,2-dichlorethan nebo chlorid uhličitý a ethery, jako je hydrofuran, diethylether a dioxan. Výhodný je methylenchlorid.

Použitelný alkalický katalyzátor s výhodou může zahrnovat alkalické činidlo, jako je triethylamin, pyridin a dimethylaminopyridm.

Činidlo pro zavedení odstupující skupiny může zahrnovat s výhodou chlorid trifluormethansulfonové kyseliny nebo anhydrid kyseliny trifluormethansulfonové.

Reakční teplota kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle a kyselém katalyzátoru, ale je obvykle -100 až -50 °C. Výhodná je teplota od -100 do -70 °C. Obvyklá teplota je od -100 do -50 °C. Výhodná je teplota -100 až -70 °C.

Reakční čas kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle a kyselém katalyzátoru, ale obvykle je od 30 minut do 12 hodin. Výhodná je doba reakce 30 minut až 3 hodiny.

-36CZ 296576 B6

Po reakci se požadovaná sloučenina obecného vzorce 8 získala například zakoncentrováním reakční směsi, přidáním organického rozpouštědla nemísitelného s vodou, jako je ethylacetát, promývání vodou, separací organické vrstvy obsahující požadovanou sloučeninu, sušením na nevodném síranu hořečnatém a rozpouštědlo se odstraní destilací.

Takto získaný požadovaný produkt se dále čistí, je-li to nutné, běžným způsobem, například rekrystalizací a chromatografií na koloně se silikagelem a podobně.

Krok B-2

V tomto kroku se připravuje sloučenina obecného vzorce 9 reakcí sloučeniny obecného vzorce 8, která se připravila v kroku B-l s činidlem pro zavedení kyanoskupiny v inertním rozpouštědle.

Zde použitelné rozpouštědlo může zahrnovat amidy, jako jsou methylenchlorid, chloroform, 1,2-dichlorethan, chlorid uhličitý, ethery, jako je tetrahydrofuran, diethylether a dioxan, acetonitril, dimethoxysulfoxid a podobně. Výhodné jsou amidy (dimethylformamid).

Použitelné činidlo pro zavedení kyanoskupiny může zahrnovat KCN, NaCN a kyanid trimethylsilanu. Významný je NaCN.

Reakční teplota kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědlu a činidlu vhodném pro zavedení kyanoskupiny, ale obvykle je od 0 do 100 °C. Výhodná je teplota 30 až 70 °C.

Reakční doba kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle, činidlu pro zavedení kyanoskupiny a teplotě reakce, aleje obvykle 30 minut až 12 hodin. Výhodná je reakční doba od 1 do 3 hodiny.

Po reakci se požadovaná sloučenina obecného vzorce 9 získala například zakoncentrováním reakční směsi, přidáním organického rozpouštědla nemísitelného s vodou, jak oje ethylacetát, promývání vodou, separací organické vrstvy obsahující požadovanou sloučeninu, sušením na nevodném síranu hořečnatém a rozpouštědlo se odstraní destilací.

Takto získaný požadovaný produkt se dále čistí, je-li to nutné, konvenčním způsobem, například rekrystalizací a chromatografií na koloně se silikagelem a podobně.

KrokB-3

V tomto kroku se připraví sloučenina obecného vzorce 10 reakcí sloučeniny obecného vzorce 9 v kroku B-2 s redukčním činidlem v inertním rozpouštědle.

Zde použitelné rozpouštědlo může zahrnovat halogenované uhlovodíky, jako je methylenchlorid, chloroform, chlorid uhličitý, 1,2-dichlorethan, alifatické uhlovodíky, jako je hexan, heptan, ligroin a petrolether. Dále může zahrnovat aromatické uhlovodíky, jako je benzen, toluen a xylen, ethery, jako je diethylether, diizopropylether, tetrahydrofuran, dioxan, dimethoxyethan a diethylenglykoldimethylether, ketony, jako je aceton, methylethylketon, methylizobutylketon, izoforon acyklohexanon. Výhodné jsou halogenované uhlovodíky (zvláště methylenchlorid).

Zde použitá redukční činidla mohou zahrnovat diizobutylhydrid hlinitý a triethoxyhydrid hlinitý. Výhodný je diizobutylhydrid hlinitý.

Reakční teplota kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle a redukčním činidlu, aleje obvykle -100 °C a -50 °C. Výhodná je teplota -90 až -70 °C.

-37CZ 296576 B6

Reakční doba kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle, redukčním činidlu a reakční teplotě. Doba reakce je obvykle od 30 minut do 12 hodin. Výhodná doba reakce je hodina až 5 hodin.

Po reakci se požadovaná sloučenina obecného vzorce 9 získala například zakoncentrováním reakční směsi, přidáním organického rozpouštědla nemísitelného s vodou, jako je ethylacetát, promývání vodou, separací organické vrstvy obsahující požadovanou sloučeninu, sušením na nevodném síranu hořečnatém a rozpouštědlo se odstraní destilací.

Krok B-4

V tomto kroku se připraví sloučenina obecného vzorce (3a), která je počátečním materiálem v postupu A s reakční sloučeninou obecného vzorce 10 připravené v kroku B-3 s redukčním činidlem v inertním rozpouštědle.

Zde použitelné rozpouštědlo může zahrnovat alkoholy, jako je methanol, ethanol, n-propanol, izopropanol, n-butanol, izobutanol, izoamylalkohol, diethylenglykol, terc-butanol, diethylenglykol, glycerin, oktanol, cyklohexanon a methylcelosolv a kyselina octová. Výhodné jsou alkoholy (zvláště ethanol).

Použitelné redukční činidlo může zahrnovat borovodík alkalického kovu, jako je borovodík sodný a borovodík litný, sloučeniny hydridu litného jako je hydrid litno-hlinitý a triethoxid litný— hydrid hlinitý a boran. Výhodný je hydrid sodnoboritý.

Reakční teplota kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle a redukčním činidle, aleje obvykle 0 až 50 °C. Upřednostňuje se teplota do 10 do 40 °C.

Reakční doba kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle, redukčním činidlu a reakční teplotě. Doba reakce je obvykle od 10 minut do 12 hodin. Výhodná doba reakce je 30 minut až 5 hodin.

Po reakci se požadovaná sloučenina obecného vzorce 3a získala například zakoncentrováním reakční směsi, přidáním organického rozpouštědla nemísitelného s vodou, jako je ethylacetát, promýváním vodou, separací organické vrstvy obsahující požadovanou sloučeninu, sušením na nevodném síranu hořečnatém a rozpouštědlo se odstraní destilací.

Postup C

Krok C-l

V tomto kroku se připravuje sloučenina obecného vzorce 11 reakcí sloučeniny obecného vzorce 7 připravené v postupu s oxidačním činidlem v inertním rozpouštědle.

Použitelné rozpouštědlo může zahrnovat alifatické uhlovodíky, jako je hexan, heptan, ligroin a petrolether. Dále může zahrnovat aromatické uhlovodíky, jako je benzen, toluen a xylen, halogenované uhlovodíky, jako je benzen, toluen a xylen, halogenované uhlovodíky, jako je methylenchlorid, chloroform, chlorid uhličitý, dichlorethan, chlorbenzen a dichlorbenzen, estery, jako je ethylformát, ethylacetát, propylacetát, butylacetát a diethylkarbonát, ethery, jako je diethylether, diizopropylether, tetrahydrofuran, dioxan, dimethoxyethan a diethylenglykoldimethylether,

-38CZ 296576 B6 ketony, jako je aceton, methylethylketon, methylizobutylketon, izoforon a cyklohexanon.

Výhodné jsou halogenované uhlovodíky (zvláště methylenchlorid).

Zde použitelná oxidační činidla zahrnují Swernovo činidlo pro oxidaci, Dess-Martinovo činidlo pro oxidaci, komplex oxidu chromového, jako je komplex pyridinhydrochlorid/oxid chromový (pyridinium chlorchromát a pyridinium dichromát). Výhodné je Swernovo činidlo pro oxidaci (jmenovitě dimethylsulfoxidoxalylchlorid).

Reakční teplota kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědla a oxidačním činidle, ale je obvykle od -100 do -50 °C. Výhodná je teplota -100 až -70 °C.

Reakční doba kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle, redukčním činidlu a reakční teplotě. Doba reakce se obvykle od 10 minut do 12 hodin. Výhodná doba reakce je 30 minut až 5 hodin.

Po reakci se požadovaná sloučenina obecného vzorce 11 získala například rozložením oxidačního činidla, zakoncentrováním reakční směsi, přidáním organického rozpouštědla nemísitelného s vodou, jako je ethylacetát, promývání vodou, separací organické vrstvy obsahující požadovanou sloučeninu, sušením na nevodném síranu hořečnatém a rozpouštědlo se odstraní destilací.

Krok C-2

V tomto kroku se připravuje sloučenina obecného vzorce 12 reakcí sloučeniny obecného vzorce 11 připravené v kroku C-l s činidlem zvyšujícím počet uhlíku v inertním rozpouštědle.

Použitelné rozpouštědlo může zahrnovat alifatické uhlovodíky, jako je hexan, heptan, ligroin a petrolether. Dále může zahrnovat aromatické uhlovodíky, jako je benzen, toluen a xylen, halogenované uhlovodíky, jako je methylenchlorid, chloroform, chlorid uhličitý, dichloroethan, chlorobenzen a dichlorobenzen, estery, jako je ethylformát, ethylacetát, propylacetát, butylacetát a diethylkarbonát, ethery, jako je diethylether, diizopropylether, tetrahydrofuran, dioxan, dimethoxyethan a diethylenglykoldimethylether, ketony, jako je aceton, methylethylketon, methylizobutylketon, izoforon a cyklohexanon. Výhodné jsou halogenované uhlovodíky (zvláště methylenchlorid).

Zde použitelná oxidační činidla zahrnují Wittingovo činidlo, Homer-Emmonsovo činidlo, Petersonovo reakční činidlo, reakční činidlo systému TiC14-CH₂Cl₂-Zn a Tebbeho činidlo. Výhodné je Wittingovo činidlo, Horner-Emmosovo činidlo a Tebbeho činidlo.

Reakční teplota kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědlo a oxidačním činidle, aleje obvykle od -20 do 20 °C. Výhodná je teplota 0 °C.

Reakční doba kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle, redukčním činidlu a reakční teplotě. Doba reakce je obvykle od 30 minut do 12 hodin. Výhodná doba reakce je jedna až 5 hodin.

Po reakci se požadovaná sloučenina obecného vzorce 12 získala například zakoncentrováním reakční směsi, přidáním organického rozpouštědla nemísitelného s vodou, jako je ethylacetát, promývání vodou, separací organické vrstvy obsahující požadovanou sloučeninu, sušením na nevodném síranu hořečnatém a rozpouštědlo se odstraní destilací.

-39CZ 296576 B6

Krok C-3

V tomto kroku se připravuje sloučenina obecného vzorce 3a selektivně zavádějící hydroxylovou skupinu na koncový uhlík olefinu sloučeniny obecného vzorce 12 připravené v kroku C-2 v inertním rozpouštědle.

Použitelné rozpouštědlo může zahrnovat alifatické uhlovodíky, jako je hexan, heptan, ligroin a petrolether. Dále může zahrnovat aromatické uhlovodíky, jako je benzen, toluen a xylen, halogenované uhlovodíky, jako je methylenchlorid, chloroform, chlorid uhličitý, dichlorethan, chlorbenzen a dichlorbenzen, estery, jako je ethylformát, ethylacetát, propylacetát, butylacetát a diethylkarbonát, ethery, jako je diethylether, diizopropylether, tetrahydrofuran, dioxan, dimethoxyethan a diethylenglykoldimethylether, ketony, jako je aceton, methylthylketon, methylizobutylketon, izoforon a cyklohexanon. Výhodné jsou ethery (zvláště tetrahydrofuran).

Zde použitelná oxidační činidla zahrnují boranovodík, disiamylboran, thexylboran, 9-BBN (9-borabicyklo[3,3,l]nonan). Výhodný je 9-BBN.

Reakční teplota kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle a oxidačním činidle, ale je obvykle od 0 do 50 °C. Výhodná je teplota 10 až 40 °C.

Reakční doba kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle, redukčním činidle a reakční teplotě. Doba reakce je obvykle od 6 hodin do 48 hodin. Výhodná doba reakce je 12 až 24 hodin.

Postup D

Krok D-l

V tomto kroku se připravuje sloučenina obecného vzorce 13 reakcí sloučeniny obecného vzorce 11 připravené v kroku C-l s činidlem zvyšujícím počet uhlíků v inertním rozpouštědle.

Použitelné rozpouštědlo může zahrnovat alifatické uhlovodíky, jako je hexan, heptan, ligroin a petrolether. Dále může zahrnovat aromatické uhlovodíky, jako je benzen, toluen a xylen, halogenované uhlovodíky, jako je benzen, toluen, a xylen, halogenované uhlovodíky, jako je methylenchlorid, chloroform, chlorid uhličitý, dichlorethan, chlorbenzen a dichlorbenzen, estery, jako je ethylformát, ethylacetát, propylacetát, butylacetát a diethylkarbonát, ethery, jako je diethylether, diizopropylether, tetrahydrofuran, dioxan, dimethoxyethan a diethylenglykoldimethylether, ketony, jako je aceton, methylethylketon, methylizobutylketon, izoforon a cyklohexanon. Výhodné jsou halogenované uhlovodíky (zvláště methylenchlorid).

Zde použitelná činidla ke zvyšování počtu uhlíků zahrnují Wittingovo činidlo, HomerEmmonsovo činidlo.

Reakční teplota kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle a činidle, aleje obvykle do -20 do 40 °C. Výhodná je teplota 0 až 20 °C.

-40CZ 296576 B6

Reakční doba kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle a činidle a reakční teplotě. Doba reakce je obvykle od 30 minut do 12 hodin. Výhodná doba reakce je jedna až 5 hodin.

Po reakci se požadovaná sloučenina obecného vzorce 13 získala například zakoncentrováním reakční směsi, přidáním organického rozpouštědla nemísitelného s vodou, jako je ethylacetát, promývání vodou, separací organické vrstvy obsahující požadovanou sloučeninu, sušením na nevodném síranu horečnatém a rozpouštědlo se odstraní destilací.

KrokD-2

V tomto kroku se připravila sloučenina obecného vzorce 14 reakcí sloučeniny obecného vzorce 13 připravené v kroku D-l s redukčním činidlem v inertním rozpouštědle.

Tento krok se provedl podle odstavce (2) v kroku A-5. V případě, kde symbol R¹⁰ je substituován benzylovou skupinou a symboly R¹¹ a R¹² jsou atomy vodíku, se sloučenina 3b může přímo připravit v tomto kroku.

KrokD-3

V tomto kroku se připravila sloučenina obecného vzorce 3b, který je jeden z počátečních materiálů postupu A reakcí sloučeniny obecného vzorce 14 připravené v kroku D-2 s redukčním činidlem.

(a) Případ, kde symbol R¹¹ a R¹² dohromady tvoří atom kyslíku.

Použitelné rozpouštědlo může zahrnovat alkoholy, jako je methanol, ethanol, n-propanol, izopropanol, n-propanol, izopropanol, n-butanol, izobutanol, izoamylalkohol, terc-butanol, diethylenglykol, glycerin, oktanol, cyklohexanol a methylcelosolv a kyselina octová. Vhodné jsou alkoholy (zvláště ethanol).

Použitelné redukční činidlo může zahrnovat borovodík alkalického kovu, jako je borovodík sodný a borovodík litný, sloučeniny hydridu litného jako je hydrid litno-hlinítý a triethoxid litný-hydrid hlinitý a boran. Výhodná je hydrid sodnoboritý.

Reakční teplota kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle a redukčním činidle, aleje obvykle 0 až 50 °C. Upřednostňuje se teplota od 10 do 40 °C.

Po reakci se požadovaná sloučenina obecného vzorce 3 b získala například zakoncentrováním reakční směsi, přidáním organického rozpouštědla nemísitelného s vodou, jako je ethylacetát, promývání vodou, separací organické vrstvy obsahující požadovanou sloučeninu, sušením na nevodném síranu horečnatém a rozpouštědlo se odstraní destilací.

(b) Případ, kdy symboly R¹¹ a R¹² jsou vodíkové atomy a symbol R¹⁰ je skupina jiná nebo benzylová skupina.

-41 CZ 296576 B6

V případě, kdy symbol R¹⁰ je silylová skupina, se tento krok provede podle metody popsané v odstavci (3) krok A-5.

V případě, že symbol R¹⁰ je aralkylová skupina, jako je benzylová skupina, alkoxyalkylová skupina, jako je methoxymethylová skupina, arylkarbonyloxymethylová skupina, jako je benzoyloxymethylová skupina nebo aralkyloxymethylenová skupina, jako je benzyloxymethylová skupina a alkoxyalkoxyalkylová skupina, jako je methoxyethoxymethylová skupina, se použije kyselý katalyzátor a ten může zahrnovat v tomto případě organickou kyselinu, jako je /i-toluensulfonovou kyselinu, trifluoroctovou kyselinu a dichloroctovou kyselinu a Lewisovou kyselinu, jako je BF₃ a A1C1₃.

Použitelné rozpouštědlo může zahrnovat aromatické uhlovodíky, jako je benzen, toluen a xylen, halogenované uhlovodíky, jako je methylenchloríd, chloroform, chlorid uhličitý, 1,2-dichlorethan, chlorbenzen a dichlorbenzen, nitrily, jako je acetonitril a izobutyrinitril, amidy, jako je formamid, 7V,7V~dimethylformamid, Λζ/V-dimethylacetamid, V-methyl-2-pyrrolidon, N-methylpyrrolidinon a triamid kyseliny hexamethylfosforečné a sulfid uhličitý.

Reakční teplota kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle a kyselém katalyzátoru, aleje obvykle až 50 °C. Upřednostňuje se teplota do 10 do 40 °C.

Reakční doba kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle, kyselém katalyzátoru a reakční teplotě. Doba reakce je obvykle od 10 minut do 12 hodin. Výhodná doba reakce je 30 minut až 5 hodin.

Po reakci se požadovaná sloučenina obecného vzorce 3b získala například zakoncentrováním reakční směsi, přidáním organického rozpouštědla nemísitelného s vodou, jako je ethylacetát, promývání vodou, separací organické vrstvy obsahující požadovanou sloučeninu, sušením na nevodném síranu hořečnatém a rozpouštědlo se odstraní destilací.

Oligonukleotidy obsahující upravený nukleosid nebo jeho thioátový derivát se mohou připravit podle postupu E, jak se popisuje dále v textu za použití sloučeniny obecného vzorce 1 podle vynálezu.

E-2

oligonukleotid

-42CZ 296576 B6

V postupu E symbol A a B mají stejný význam jak se definuje shora v textu, symbol R¹³ reprezentuje hydroxylovou ochrannou skupinu (zvláště tritylovou skupinu, která se může substituovat methoxyskupinou), symbol R¹⁴ reprezentuje fosfonylovou skupinu a skupinu tvořenou reakcí monosubstituovaných chlor(alkoxy)fosfinů nebo dvakrát substituovaných alkoxyfosfinů popsaných dále v textu.

Postup E

KrokE-1

V tomto kroku se připravuje sloučenina obecného vzorce 15 reakcí sloučeniny obecného vzorce 1 připravené postupem A s ochranným činidlem v inertním rozpouštědle.

Použitelné rozpouštědlo může zahrnovat aromatické uhlovodíky, jako je benzen, toluen a xylen, halogenované uhlovodíky, jako je methylenchlorid, chloroform, chlorid uhličitý, dichlorethan, chlorbenzen a dichlorbenzen, estery, jako je ethylformát, ethylacetát, propylacetát, butylacetát a diethylkarbonát, ethery, jako je diethylether, diizopropylether, tetrahydrofuran, dioxan, dimethoxyethan a diethylenglykoldimethylether, ketony, jako je aceton, methyl-ethylketon, methylizobutylketon, izoforon a cyklohexanon, nitrátované sloučeniny, jako je nitroethan a nitrobenzen, nitrily, jako je acetonitril a izobutyronitril, amidy, jako je formamid, dimethylformamid (DMF), dimethylacet-amid a triamid kyseliny hexamethylfosforečné, sulfoxid, jako je dimethylsulfoxid a sulfolan, alifatické terciální aminy, jako je trimethylamin, triethylamin a N-methylmorfolin a aromatické aminy, jako je pyridin a pikolin. Výhodné jsou halogenované uhlovodíky (zvláště methylenchlorid) a aromatické aminy (zvláště pyridh).

Použitelné chránící činidlo není nijak omezeno pokud se může selektivně chránit pouze 5'-poloha a může se odstranit za kyselých nebo neutrálních podmínek. Může s výhodou zahrnovat triarylmethylhalidy, jako je tritylchlorid, monomethoxytritylchlorid a dimethoxytritylchlorid.

V případě triarylmethylhalidů se použitá ochranné činidlo, obvykle používané alkalické činidlo.

V takovém případě zde použitelné alkalické činidlo může zahrnovat heterocyklické aminy, jako je pyridin, dimethylaminopyridin a pyrrolidinpyridin a alifatické terciální aminy, jako je trimethylamin a triethylamin. Výhodný je pyridin, dimethylaminopyridin a pyrrolidinpyridin.

V případě, že se jako rozpouštědlo použije kapalné alkalické činidlo, protože samotné alkalické činidlo funguje jako kyselé zachycovací činidlo, není potřeba přidat jiné alkalické činidlo.

Reakční teplota kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle a činidle, aleje obvykle od 0 do 150 °C. Výhodná je teplota 20 až 100 °C.

Reakční doba kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle, redukčním činidle a reakční teplotě. Doba reakce je obvykle od 1 do 100 hodin. Výhodná doba reakce je 2 až 5 hodin.

Po reakci se požadovaná sloučenina obecného vzorce 15 získala například zakoncentrováním reakční směsi, přidáním organického rozpouštědla nemísitelného s vodou, jako je ethylacetát, promývání vodou, separací organické vrstvy obsahující požadovanou sloučeninu, sušením za použití nevodného síranu hořečnatého a rozpouštědlo se odstraní destilací.

KrokE-2

V tomto kroku se připravuje sloučenina obecného vzorce 16 reakcí sloučeniny obecného vzorce 15 připravené v kroku E-l s chlor(alkoxy)fosfiny s jednou substitucí nebo alkoxyfosfiny s dvěma substitucemi, které se obvykle používají při amidaci v inertním rozpouštědle.

-43 CZ 296576 B6

Použitelné rozpouštědlo není omezeno pokud neovlivňuje reakci a může přednostně zahrnovat ethery, jako je tetrahydrofuran, diethylether a dioxan a halogenované uhlovodíky, jako je methylenchlorid, chloroform, chlorid uhličitý, dichlorethan, chlorbenzen a dichlorbenzen.

Chlor(alkoxy)fosfiny s jednou substitucí mohou zahrnovat fosfinové deriváty, jako je chlor(morfolinjmethoxyfosfin, chlor(morfolin)kyanoethoxyfosfín, chlor(dimethylamino)methoxyfosfín, chlor(diizopropylamino)methoxyfosfin a chlor(diizopropylamino)kyanoethoxyfosfin. Výhodný je chlor(morfolin)methoxyfosfin, chlor(morfolin)kyanoethoxyfosfm, chlor(diizopropylamino)kyanoethoxyfosfin.

V případě chlor(alkoxy) s jednou substitucí se používá kyselé zachytávací činidlo a toto činidlo může zahrnovat heterocyklické aminy, jako je pyridin adimethylaminopyridin a alifatické aminy, jako je trimethylamin, triethylamin a diizopropylamin. Výhodné jsou alifatické aminy (zvláště diizopropylamin).

Zde použitelné alkoxyfosfmy se dvěmi substitucemi mohou zahrnovat deriváty fosfínů, jako je bis(diizopropylamino)kyanoethoxyfosfín, bis(diethylamino)methansulfonylethoxyfosfín, bis(diizopropylamino)2,2,2-trichlorethoxy)fosfín a bis(diizopropylamino)(4chlorfenylmethoxyjfosfin. Výhodný j e bis(diizopropylamino)kyanoethoxyfosfin.

V případě kde se použijí alkoxyfosfmy s dvojitou substitucí se použije kyselina. V takovém případě používaná kyselina může s výhodou zahrnovat tetrazol, kyselinu octovou nebo kyselinu ptoluensulfonovou.

Reakční teplota není nijak omezena, ale obvykle je v rozmezí 0 až 80 °C. Výhodná je teplota místnosti.

Reakční doba kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle, redukčním činidlu a reakční teplotě. Doba reakce je obvykle od 5 minut až 30 hodin. Výhodná doba reakce je od 30 minut do 10 hodin.

Po reakci se požadovaná sloučenina obecného vzorce 16 získala například neutralizací reakční směsi, odstraněním nerozpustných částic filtrací, jestliže existují, přidáním organického rozpouštědla nemísitelného s vodou, jako je ethylacetát, promývání vodou, separací organické vrstvy obsahující požadovanou sloučeninu sušením na nevodném síranu hořečnatém a rozpouštědlo se odstraní destilací.

Takto získaný požadovaný produkt se dále čistí, je-1 to nutné, konvenčním způsobem, například rekrystalizací a chromatografií na koloně se silikagelem a podobně.

V jiném případě se v tomto kroku připraví sloučenina obecného vzorce 16 reakcí sloučeniny obecného vzorce 15 připravené v kroku E-l s tris-(l,2,4-triazolyl)fosfitem v inertním rozpouštědle (s výhodou jde o halogenované uhlovodíky, jako je methylenchlorid). Následuje adice vody za účelem dosažení H-fosfonace.

Reakční teplota není nijak omezena, ale obvykle je v rozmezí -20 až 100 °C. Výhodná je teplota 10 až 40 °C.

Reakční doba kolísá v závislosti na počátečním materiálu, rozpouštědle, redukčním činidlu a reakční teplotě. Doba reakce je obvykle 5 minut až 30 hodin. Výhodná doba reakce je 30 minut v případě, že reakce se provedla při teplotě místnosti.

Po reakci se požadovaná sloučenina obecného vzorce 16 získala například neutralizací reakční směsi, odstraněním nerozpustných částic filtrací, jestliže existují, přidáním organického roz-44CZ 296576 B6 pouštědla nemísitelného s vodou, jako je ethylacetát, promývání vodou, separací organické vrstvy obsahující požadovanou sloučeninu, sušením na nevodném síranu hořečnatém a rozpouštědlo se odstraní destilací.

Krok E-3

V tomto kroku se připravuje oligonukleotidový analog pomocí DNA syntetizéru za použití alespoň jedné sloučeniny obecného vzorce 16 připravené v kroku E-2 a obecně dostupného fosforamiditového činidla nutného při produkci oligonukleotidového analogu požadované nukleotidové sekvence v souladu s běžnými metodami.

Oligonukletidový analog vykazující požadovanou nukleotidovou sekvenci se může syntetizovat DNA syntetizérem jako je Perkin-Elmer model 392 za použití fosforamiditové metody v souladu s metodou popsanou v publikaci (Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)).

Navíc v případě převedení thioátu derivát thioátu se může získat v souladu s metodou popsanou v publikaci Tetrahedron Letters, 32, 3005 (1991, J. Am. Chem. Soc., 112, 1253 (1990) za použití činidla, které tvoří thioát reakcí s trivalentní kyselinou fosforečnou, jako je tetraethylthiuramdisulfid (TETD, Applied Biosystems, lne.) nebo Beacageovo činidlo (Millipore Corp.).

Výsledný surový oligonukleotidový analog se může čistit chromatografícký na koloně s reverzní fází OligoPak a čistota produktu se může potvrdit analýzou HPLC.

Délka řetězce výsledného oligonukleotidového analogu je v normálním případě 2 až 50 jednotek a s výhodou 10 až 30 jednotek v jednotkách nukleosidů.

Schopnost tvořit komplementární řetězec a odolnost vůči nukleázám výsledného oligonukleotidového analogu se může stanovit způsoby popsanými shora v textu.

Testovací metoda 1

Schopnost tvořit hydrid oligonukleotidového analogu podle vynálezu s ohledem na komplementární DNA a RNA se může stanovit teplotní hybridizací různých výsledných oligonukleotidových analogů s oligonukleotidovým analogem, který zahrnuje přirozeně se vyskytující DNA nebo RNA, které má komplementární sekvenci a měřitelnou teplotu denaturace (hodnota Tm).

Vzorek roztoku obsahující stejné množství oligonukleotidového analogu a přirozeně se vyskytujícího komplementárního oligonukleotidu v pufru fosforečnanu sodného se vložil do lázně s vroucí vodou a pak se pomalu ochlazoval při teplotě místnosti (teplotní hybridizace). Teplota roztoku v cele spektrofotometru (například Shimadzu UV-2100PC) pak postupně trochu vzrostla z 20 až 90 °C. Pak následuje měření absorbce ultrafialového světla při vlnové délce 260 nm.

Testovací metoda 2. Měření rezistence na nukleázy

K oligonukleotidu v pufru se přidala nukleáza a směs se zahřála. Příklady použitých nukleáz zahrnují fosfodiesterázu hadího jedu, endonukleázu PÍ a Sl. Ačkoli neexistuje žádné zvláštní omezení v použitém pufru, doporučuje se pufir vhodný pro enzymy, v případě fosfodiesterázy hadího jedu se použil Tris-HCl, zatímco v případě endonukleázy PÍ se použil pufr acetát sodný.

Navíc je-li to nezbytné k roztoku pufru se přidaly ionty kovů. Příklady iontů kovů zahrnují v případě fosfodiesterázu hadího jedu ionty hořečnaté a v případě endonukleázy ionty zinečnaté.

Reakční teplota je s výhodou 0 až 100 °C. Výhodná je teplota v rozmezí 30 až 50 °C.

-45 CZ 296576 B6

Po předem stanovené době se přidá kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA) a pak se směs zahřívá na teplotu 100 °C po dobu 2 minuty za účelem ukončit reakci.

Příklady metod používané k testování množství zbývajícího oligonukleotidu zahrnují metodu, při které se oligonukleotid značí radioizotopem, přičemž pak následuje testování štěpící reakce produktu analyzátorem obrazu, což je metoda, při které se produkt štěpící rekce testuje HPLC s reverzní fází a způsobem, při kterém se produkt štěpící reakce testuje barvivém (jako je ethidiumbromid) a obraz se zpracovává na počítači.

Formy dávek oligonukleotidového analogu mající jednu nebo dvě nebo více struktur obecného vzorce 2 podle vynálezu mohou být tablety, kapsle, granule, prášek nebo sirup, které se používají pro orální aplikaci, nebo to mohou být injekce nebo čípky pro parenterální aplikace. Tyto dávkové formy se připravují dobře známými metodami za použití přídavných činidel, jako je ekcipienti, například organické ekcipienti, jako jsou cukerné deriváty, například laktóza, sacharóza, glukóza, manitol a sorbitol, deriváty škrobu, jako je například kukuřičný škrob, bramborový škrob, oc-škrob a dextrin, deriváty celulózy, jako je například krystalická celulóza, arabská guma, dextran a pululan a anorganické ekcipienti, jako jsou silikátové deriváty, například anhydrid křemičitý, syntetizovaný křemičitan hlinitý, křemičitan vápenatý a metakřemičitan hořečnatohlinitý, fosforečnany, jako je například hydrogenfosforečnan vápenatý, uhličitany, jako je například uhličitan vápenatý a sírany, jako je například síran vápenatý, lubrikační prostředek (například kyselina stearová, kovové sole kyseliny stearové, jako je stearát vápenatý a stearát hořečnatý, talek, koloidní silika, vosky, jako je včelí vosk a spermacet, kyselina boritá, kyselina adipová, sulfáty, jako je například síran sodný, glykol, kyselina mravenčí, benzoát sodný, DL-leucin, sodná sůl mastné kyseliny, laurylsulfáty, jako je laurylsulfát sodný a laurylsulfát hořečnatý, kyselina orthokřemičitá, jako je anhydrid křemičitý a kyselý hydrát křemičitý a shora uvedené deriváty škrobu), pojidlo (například hydroxypropylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, polyvinylpyrrolidon, Macrogol a sloučeniny podobné shora uvedeným ekcipientům), desintegrační činidla (například deriváty celulózy, jako je málo substituovaná hydroxypropylcelulóza, karboxymethylcelulóza, karboxymethylcelulóza vápníku a karboxymethylcelulóza sodíku s vnitřními můstky a chemicky upravené škrob-celulózy, jako je karboxymethylový škrob, karboxymethylový škrob sodíku a polyvinylpyrrolidon s můstky), stabilizátory (paraoxybenzoáty, jako je methylparaben a propylparaben, alkoholy, jako je chlorbutanol, benzylalkohol a fenylethylalkohol, benzalkoniumchlorid, deriváty fenolu, jako je fenol a kresol, thimerosal, kyselina dehydrooctová a kyselina sorbová), látky korigující smyslově nepřijatelné vlastnosti léku (například sladidla, kyselící činidla), ředidla atd.

Zatímco dávka bude kolísat v závislosti na stavu onemocnění, věku pacienta, metodám aplikace atd., například v případě orální aplikace je nutné aplikovat aktivní látku v množství v rozmezí 0,01 kg/kg tělesné hmotnosti (upřednostňuje se 0,1 mg/kg tělesné hmotnosti) až 1000 mg/kg tělesné hmotnosti (s výhodou jde o dávku 100 mg/kg tělesné hmotnosti) a v případě intravenózní aplikace je nutné aplikovat aktivní složku v množství od 0,001 mg/kg tělesné hmotnosti (s výhodou 0,01 mg/kg tělesné hmotnosti) až 100 mg/kg tělesné hmotnosti (výhodná je dávka 10 mg/kg tělesné hmotnosti) ve formě jediné dávky za den nebo se dávka rozdělí do několika dávek za den.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 3',5'-di-O-benzyl-2'-O,4'-C-ethylen-4-V-benzoylcytidin (příklad sloučeniny číslo 2-34)

Vodný roztok 2N hydroxidu sodného (68 ml) se přidal k roztoku sloučeniny získané v příkladu (6,80 g, 8,86 mol) v pyridinu (136 ml) při teplotě 0 °C a směs se míchala při teplotě místnosti po dobu jedné hodiny. Reakční směs se neutralizovala přidáváním po kapkách 20% vodného roztoku kyseliny octové a extrahovala se chloroformem. Vrstva chloroformu se promyla saturo-46CZ 296576 B6 váným vodným roztokem chloridu sodného a koncentrovala se ve vakuu. Zbytek se čistil chromatograficky na koloně se silikagelem (jako eluent se použila směs dichlormethan:methanol =

100:3), aby se získala sloučenina uvedená v názvu (3,3 g, 6,02 mmol, výtěžek je 68 %).

‘H-NMR (400 MHz, CDC1₃): 8,64 (2H, brs), 7,89 (2H, d, 7,6 Hz), 7,64-7,60 (1H, m), 7,54-7,51 (2H, m), 7,48-7,37 (3H, m), 7,36-7,26 (8H, m), 6,18 (1H, s), 4,70 (1H, d, 11Hz), 4,60 (1H, d, 11Hz), 4,46 (1H, d, 2,9Hz), 4,42 (1H, d, 11Hz), 4,10-4,02 (2H, m), 3,89 (1H, d, 2,9 Hz), 3,75 (1H, d, 11Hz), 3,62 (1H, d, 11Hz), 2,34-2,26 (1H, m), 1,39-1,36 (1H, m).

FAB-MAS (mNBA): 554 (M+H)⁺

Příklad 2 2'-O,4'-C-ethylen-4-?Z-benoylcytidin (příklad sloučeniny č. 2-225)

Roztok (31,7 ml) 1,0 M trichlorboranu v dichlormethanu se přidal po kapkách do roztoku sloučeniny získané v příkladu 1 (2,06 mg 3,72 mmol) v nevodném methylenchloridu (317 ml) při teplotě -78 °C a směs se míchala při teplotě -78 °C po dobu jedné hodiny. Reakční směs se pomalu zahřívala na teplotu -20 °C a reakční nádoba se umístila do ledové lázně s chloridem sodným a směs se míchala při teplotě mezi -20 a -10 °C po dobu 2 hodin. Do směsi se pomalu přidával methanol (12 ml) a směs se míchala po dobu 10 minut. Hodnota pH reakční směsi se upravila na hodnotu 7 až 8 tak, že se po kapkách přidával saturovaný vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného. Směs se zahřála na teplotu místnosti a koncentrovala ve vakuu. Zbytek se čistil chromatografií na koloně se silikagelem (jako eluent se použila směs dichlormethan:methanol=100:5), aby se získala sloučenina uvedená v názvu (1,21 g, 3,24 mmol, výtěžek je 87 %) ve formě bílé pevné látky.

’Η-NMR (500 MHz, DMSO-d₆): 11,23 (1H, brs), 8,70 (1H, d, 7,2 Hz), 8,00 (2H, d, 7,5 Hz), 7,3-6(4H, m), 5,97 (1H, s), 5,35 (1H, dd, 5 a 10 Hz), 4,10 (1H, dd, 5 a 10 Hz), 4,03 (1H, d,

3,2 Hz), 3,95-3,85 (2H, m), 3,83 (1H, d, 3,2Hz), 3,65-3,51 (2H, m), 2,06-1,98 (1H, m), 1,26 (1). FAB-MAS (mNBA): 374 (M+H)⁺

Příklad 3 2'-<9,4'-C-ethylencytidin (příklad sloučeniny č. 2-3)

Roztok sloučeniny získané v příkladu 2 (0,1 g, 0,268 mmol) v methanolu saturovaném v amoniaku (12 ml) se nechal stát přes noc. Směs se zakoncentrovala do sucha, přičemž vzniká sloučenina uvedená v názvu (0,054 g, výtěžek je 75 %) ve formě bílé pevné látky.

‘H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆): 8,18 (1H, d, 7,4 Hz), 7,10 (2H, br), 5,84 (1H, s), 5,69 (1H, d,

7.6 Hz), 5,27-5,24 (2H, m), 3,86 (1H, d, 3,2 Hz), 3,90-3,78 (2H, m), 3,76 (1H, d, 3,2 Hz), 3,56 (1H, dd, 5,5 a 12 Hz), 3,49 (1H, dd, 5,5 a 12 Hz), 2,01-1,93 (1H, dt, 7,5 a 12 Hz), 1,22 (1H, dd,

3.6 a 13 Hz).

FAB-MAS (mNBA): 270 (M+H)⁺

Příklad 4 5 '-<9-dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-4-yV-benzoylcitidm (příklad sloučeniny č. 2-39)

Roztok sloučeniny získané v příkladu 2 (1,29 g, 3,46 mmol) v nevodném pyridinu se azeotropicky refluxoval za účelem odstranit vodu. Produkt se rozpustil v bezvodém pyridinu (26 ml) v atmosféře dusíku a do roztoku se přidal 4,4'-dimethoxytritylchlorid (1,76 g, 5,18 mmol). Směs se míchala při teplotě místnosti přes noc. Do reakční směsi se přidalo malé množství methanolu a z reakční směsi se rozpouštědlo odpařilo ve vakuu. Zbytek se rozdělil mezi vodu a chloroform a organická vrstva se promyla saturovaným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a

-47CZ 296576 B6 saturovaným vodným roztokem chloridu sodného ve vakuu. Zbytek se čistil chromatografícky na koloně se silikagelem (jako eluent se použila směs dichlormethanokmethanol = 100:5), přičemž se získala sloučenina uvedená v názvu (2,10 g, 3,11 mmol, výtěžek je 90 %) ve formě bezbarvé amorfní pevné látky.

‘H-NMR (270 MHz, DMSO-d₆): 11,27 (1H, brs), 8,59 (1H, m), 6,92-8,01 (19H, m), 6,03 (1H, s), 5,56 (1H, m), 4,17 (1H, m), 4,08 (1H, m), 3,86 (2H, m), 3,77 (6H, s), 3,24 (2H, m), 1,98 (lH,m).

FAB-MAS (mNBA): 676 (M+H)⁺

Příklad 5 5 '-0-dimethoxytrityl-2-0,4'-C-ethylen-4-/V-benzoylcytidin-3 '-O-(2-kyanoethyl-AjTY-diizopropyljfosforamidit (příklad sloučeniny č. 2-235)

Roztok sloučeniny získané v příkladu 4 (6,53 g, 9,66 mmol) v bezvodém pyridinu se azeotropicky refluxovalo za účelem odstranit vodu.Produkt se rozpustil za podmínek atmosféry dusíku vnevodném dichlormethanu (142 ml). Do roztoku se přidal ΛζΑ-dnzopropylarnin (2,80 ml 16,1 mmol) a pak se po kapkách do ledové lázně přidal 2-kyanoethyl-7V,A-dnzopropylchlorfosforamidit (2,16 ml, 9,66 mmol). Směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 6 hodin. Reakční směs se promyla saturovaným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a saturovaným vodným roztokem chloridu sodného a zakoncentrovala se ve vakuu. Zbytek se čistil chromatografícky na koloně se silikagelem (jako eluent se používá směs dichlormethan:triethylamin = 50:1 - dichlormethan:ethylacetát:triethylamin = 60: 30:1), za účelem získání sloučeniny uvedené v názvu (7,10 g, 8,11 mmol, výtěžek je 84 %), ve formě bílé látky.

‘H-NMR (270 MHz, CDC1₃): 1,1-1,2 (12H, m), 1,35 (1H, m), 2,11 (1H, m), 2,3 (2H, m), 3,35-3,7 (6H, m), 3,8 (6H, m), 3,9-4,1 (2H, m), 4,33 (1H, m), 6,23 (1H, m), 6,12 (1H, s), 6,9 (4H, s), 7,3-7,9 (15H, m), 8,7-8,8 (1H, m).

Příklad 6 3',5'-di-O-benzyl-2'-O,4'-C-ethylen-5-methyluridin (příklad sloučeniny č. 2-22)

Do sloučeniny získané v příkladu 10 (418 mg, 0,62 mmol) ve směsi pyridin:methanol:voda = 65:30:5 (5 ml) při teplotě 0 °C se přidal 2N roztok hydroxidu sodného a roztok směsi (5 ml), která obsahuje pyridin:methanol:voda = 65:30:5 a směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 15 minut. Reakční směs se neutralizovala IN kyselinou chlorovodíkovou a extrahovala se ethylacetátem (přibližně 30 ml). Organická vrstva se promyla saturovaným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (přibližně 30 ml) a saturovaným vodným roztokem chloridu sodného (přibližně 30 ml), sušila se na bezvodém síranu hořečnatém a pak se koncentrovala ve vakuu. Zbytek se čistil chromatografícky na koloně se silikagelem (jako eluent se použila směs hexan:ethylacetát = 1:1), aby se získala bezbarvá amorfní pevná látka (228 mg, 0,49 mmol, výtěžek je 79 %).

‘H-NMR (400 MHz, CDC1₃): 1,35 (1H, d, 13 Hz), 1,41 (3H, s), 2,28 (1H, dt, 9,4 a 13 Hz), 3,60 (1H, d, 11Hz), 3,76 (1H, d, 11Hz), 3,94 (1H, d, 3,0 Hz), 4,10 (1H, d, 7,0 Hz), 4,14 (1H, d, 7,0 Hz), 4,31 (1H, d, 3,0 Hz), 4,51 (1H, d, 12 Hz), 4,54 (1H, d, 12 Hz), 4,58 (1H, d, 12 Hz), 4,75 (1H, d, 12 Hz), 6,06 (1H, s), 7,3 (10H, m), 7,91 (1H, s), 8,42 (1H, brs).

FAB-MAS (mNBA): 465 (M+H)⁺

Příklad 7 2'-O,4'-C-ethylen-5-methylundin (příklad sloučeniny č. 2-2)

-48CZ 296576 B6

Roztok sloučeniny získané v příkladu 6 (195 mg, 0,42 mmol) v methanolu (10 ml) se míchal v atmosféře vodíku za atmosférického tlaku v přítomnosti hydrogenačního katalyzátoru po dobu 5 hodin. Reakční směs se filtrovala za účelem odstranit katalyzátor a filtrát se koncentroval ve vakuu. Zbytek se čistil chromatografií na koloně se silikagelem (jako eluant se použila směs dichlormethan/methanol = 10:1) za účelem získat bezbarvý prášek (v množství 76 mg, 0,268 mmol a výtěžek je 64 %).

'H-NMR (400 MHz, CD₃OD): 1,33 (1H, dd, 3,8 a 13 Hz), 1,86 (3H, D, 0,9 Hz), 1,94 (1H, ddd, 7,5, 11,7 a 13 Hz), 3,86 (1H, d, 12 Hz), 3,75 (1H, d, 12 Hz), 3,9-4,0 (2H, m), 4,05 (1H, d,

3,2 Hz), 4,09 (1H, d, 3,2 Hz), 6,00 (1H, s), 8,28 (1H, d, 1,1 Hz).

FAB-MAS (mNBA): 285 (M+H)⁺

Příklad 8 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-5-methyluridin (příklad sloučeniny č. 2-27)

Roztok sloučeniny získané v příkladu 7 (1,45 g, 5,10 mmol) v nevodném pyridinu se azeotropicky refluxoval za účelem odstranění vody. Produkt se rozpustil v bezvodém pyridinu (44 ml) za atmosféry dusíku a 4,4'-dimethoxytritylchloridu (2,59 g, 7,65 mmol) a přidal se k roztoku. Směs se míchala při teplotě místnosti přes noc. Do reakční směsi se přidalo malé množství methanolu a pak se rozpouštědlo odpařilo ve vakuu. Zbytek se rozdělil mezi vodu a chloroform a organická vrstva se promyla saturovaným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a saturovaným vodným roztokem chloridu sodného a koncentrovala se ve vakuu. Zbytek se čistil chromatograficky na koloně se silikagelem (jako eluant se použila směs dichlormethan:methanol = 100 : 10) za vzniku sloučeniny uvedené v názvu (2,42 g, 4,13 mmol, výtěžek je 81 %) ve formě bezbarvé amorfní pevné látky.

*H-NMR (270 Mhz, DMSO-d₆): 11,36 (1H, s), 7,68 (1H, s), 6,90-7,44 (13H, m), 5,89 (1H, s), 5,55 (1H, d), 4,09 (1H, m), 4,04 (1H, d), 4,04 (1H, d), 3,82 (2H, m), 3,74 (6H, s), 3,19 (2H, m), 1,99 (1H, m), 1,36 (1H, m), 1,17 (3H, s).

FAB-MAS (mNBA): 578 (M+H)⁺

Příklad 9 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-5-methyluridin-3'-<9-(2-kyanoethylÝV,7V-diizopropyl)fosforamidit (příklad sloučeniny č. 2-234)

Roztok sloučeniny získané v příkladu 8 (4,72 g, 8,05 mmol) v bezvodém pyridinu se azeotropicky refluxoval za účelem odstranit vodu. Produkt se rozpustil v atmosféře dusíku v nevodném dichlormethanu (142 ml). K roztok se přidal ΛζΑ-diizopropylamin (2,80 ml, 16,1 mmol) a pak 2-kyanoethyl-WA-diizopropylchorfosforamidit (2,16 ml, 9,66 mmol) přidal po kapkách do ledové lázně. Směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 6 hodin. Reakční směs se promyla saturovaným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a saturovaným vodným roztokem chloridu sodného a koncentrovala se ve vakuu. Zbytek se čistil chromatografícky na koloně se silikagelem (jako eluát se použila směs hexan:ethylacetát:triethylamin = 50:50:1 - hexan:ethylacetát:triethylamin = 30:60:1) za účelem získání sloučeniny uvedené v názvu (5,64 g, 7,17 mmol, výtěžek je 89 %) ve formě bezbarvé amorfní pevné látky.

Ή-NMR (400 MHz, CDC1₃): 1,1-1,2 (15H, m), 1,4 (1H, m), 2,08 (1H, m), 2,4 (2H, m), 3,2-4,0 (14H, m), 4,38 (2H, m), 4,47 (1H, m), 6,06 (1H, s), 6,8-6,9 (4H, m), 7,2-7,5 (9H, m), 7,91 (1H, m).

FAB-MAS (mNBA): 787 (M+H)⁺

-49CZ 296576 B6

Příklad 10 3',5'-di-<?-benzyl-2'-č),4-C-ethylen-6-V-benzoyladenosin (příklad sloučeniny č. 1-23)

K sloučenině získané v příkladu 12 (238 mg, 0,30 mmol) ve směsi pyridin:methanol:voda = 65:30:5 (5 ml) při teplotě 0 °C se přidal vodný 2N roztok hydroxidu sodného a roztok směsi (5 ml) obsahující pyridin:methanol:voda = 65:30:5. Směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 15 minut. Reakční směs se neutralizovala IN kyselinou chlorovodíkovou a extrahovala se ethylacetátem (přibližně 30 ml). Organická vrstva se promyla saturovaným vodným roztokem uhličitanu sodného (přibližně 30 ml) a saturovaným vodným roztok chloridu sodného (přibližně 30 ml), sušila se na bezvodém síranu hořečnatém a pak se koncentrovala ve vakuu. Zbytek se čistil chromatografícky na koloně se silikagelem (jako eluát se použila směs dichlormethan:methanol = 50:1) za účelem získat bezbarvou amorfní pevnou látku (133 mg, 0,23 mmol, výtěžek je 78 %).

’Η-NMR (400 MHz, CDC1₃): 1,44 (1H, d, 13 Hz), 2,31 (1H, dd, 13 a 19 Hz), 3,56 (1H, d, 11Hz), 3,70 (1H, d, 11Hz), 4,10 (2H, m), 4,24 (1H, s), 4,45 (1H, d, 12 Hz), 4,53-4,67 (4H, m), 6,52 (1H, s), 7,3 (10H, m), 7,53 (2H, m), 7,62 (1H, m), 8,03 (2H, d, 7,6 Hz), 8,66 (1H, s), 8,78 (1H, s), 9,00 (1H, brs).

FAB-MAS (mNBA): 578 (M+H)⁺

Příklad 11 2'-O,4'-C-ethylen-6-A-benzoyladenosin (příklad sloučeniny č. 1-178)

K roztoku sloučeniny získané v příkladu 10 (116 mg, 0,20 mmol) v bezvodém methylenchloridu (5 ml) při teplotě -78 °C se přidal pomalu po kapkách 1M roztok chloridu boritého (1,5 ml, 1,5 mmol) v dichlormethanu a směs se míchala při teplotě -78 °C po dobu 3 hodiny. K reakční směsi se přidal 1M roztok chloridu boritého (1,5 ml, 1,5 mmol) v dichlormethanu a směs se míchala po dobu 2 hodin. Směs se pomalu zahřívala na teplotu místnosti a rychle se ochladila na teplotu -78 °C a pak se přidal do směsi methanol (5 ml). Reakční směs se pomalu zahřívala na teplotě místnosti a zakoncentroval se ve vakuu. Zbytek se čistil chromatografícky na koloně se silikagelem (jako eluent se používá směs dichlormethammethanol - 9:1). Vzniká bílý prášek (49 mg, 0,17 mmol, výtěžek je 84 %).

’Η-NMR (400 MHz, CD₃OD): 1,45 (1H, dd, 4,3 a 13 Hz), 2,12 (1H, m), 3,72 (1H, d, 12Hz), 3,79 (1H, d, 12Hz), 4,04 (1H, dd, 7,3 a 12 Hz), 4,15 (1H, dt, 4,3 a 9,4 Hz), 4,36 (1H, d, 3,2Hz), 4,43 (1H, d, 3,2 Hz), 6,57 (1H, s), 7,57 (2H, m), 7,66 (1H, m), 8,09 (2H, d, 8,0 Hz), 8,72 (1H, s), 8,85 (1H, s).

FAB-MAS (mNBA): 398 (M+H)⁺

Příklad 12 2'-O,4'-ethylenadenosin (příklad sloučeniny č. 1-7)

Roztok sloučeniny získané v příkladu 11 (14 mg, 0,035 mmol) vmethanolu saturovaném amoniakem (1 ml) se nechal stát přes noc. Směs se zakoncentrovala a zbytek se čistil chromatograficky na koloně se silikagelem (jako eluant se použila směs dichlormethammethanol) za vzniku bílého prášku (10 mg, 0,034 mmol, výtěžek je 98 %).

‘H-NMR (400 MHz, CD₃OD): 1,32 (dd, 4 a 13 Hz), 2,04 (1H, dt, 7,4 a 12 Hz), 3,53 (1H, dd, 5 a

Hz), 3,61 (1H, dd, 5,2 a 12 Hz), 3,90 (1H, dd, 7,4 a 12 Hz), 3,97 (1H, dt, 4 a 12 Hz), 4,15 (1H, d, 3,1 Hz), 5,27 (1H, t, 5,2 Hz), 5,39 (1H, d, 3,1 Hz), 6,33 (1H, s), 7,29 (2H, s), 7,66 (1H, m), 8,14 (1H, s), 8,42 (1H, s).

FAB-MAS (mNBA): 294 (M+H)⁺

UV (Xmax): 260 (pH7), 260(pHl), 258 (pH13)

-50CZ 296576 B6

Příklad 13 5 '-C>-dimethoxytrityl-2'-(9,4'-C-ethylen-6-/V-benzoyladenosin (příklad sloučeniny číslo 1-31)

Roztok sloučeniny získaný v příkladu 11 (14 mg, 0,035 mmol) vbezvodém pyridinu se azeotropicky refluxoval za účelem odstranit vodu. Produkt se rozpustil v nevodném pyridinu (1 ml) za atmosféry dusíku a k roztoku se přidal 4,4'-dimethoxytritylchlorid (2,59 g, 7,65 mmol). Směs se míchala při teplotě 40 °C po dobu 5 hodin. Do reakční směsi se přidalo malé množství methanolu a pak se rozpouštědlo odpařilo ve vakuu. Zbytek se rozdělil mezi vodu a chloroform a organická vrstva se promyla saturovaným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a saturovaným vodným roztokem chloridu sodného a koncentroval se ve vakuu. Zbytek se čistil chromatografícky na koloně se silikagelem (jako eluent se použila směs dichlormethammethanol = 100:5) za vzniku sloučeniny uvedené v názvu (18 mg, 0,026 mmol, výtěžek je 73 %) ve formě bezbarvé amorfní pevné látky.

'H-NMR (400 MHZ, CDC1₃): 1,63 (1H, m), 2,14 (1H, 7,5, 12 a 13 Hz), 3,37 (1H, d, 11Hz), 3,41 (1H, d, 11 Hz), 3,79 (6H, s), 4,10 (2H, m), 4,48 (1H, d, 3,3 Hz), 4,59 (1H, d, 3,3 Hz), 6,54 (1H, s), 6,58 (4H, m), 7,2-7,6 (12H, m), 8,02 (2H, m), 8,45 (1H, s), 8,82 (1H, s), 9,02 (1H, brs). FAB-MAS (mNBA): 700 (M+H)⁺

Příklad 14 5 '-<9-dimethoxytrityl-2 '-<9,4'-C-ethylen-6-A-benzoyladenosin-3 '-O-(2-kyano ethyl-7V,A-diizopropyl)fosforamidit (příklad sloučeniny c. 1-186)

Roztok sloučeniny získané v příkladu 13 (16 mg, 0,023 mmol) vbezvodém pyridinu se azeotropicky refluxovalo za účelem odstranit vodu. Produkt se rozpustil za podmínek atmosféry dusíku v bezvodém dichlormethanu (0,5 ml). K roztoku se přidal tetrazol-Λζ A-diizopropylaminová sůl (10 mg) a pak se po kapkách do ledové lázně přidal 2-kyanoethyl-A,A, V(V-tetraizopropylchlorfosforamidit (přibližně 20 μΐ). Směs se míchala při teplotě místnosti přes noc. Reakční směs se promyla saturovaným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a saturovaným vodným roztokem chloridu sodného a zakoncentrovala se ve vakuu. Zbytek se čistil chromatografícky na koloně se silikagelem (jako eluent se používá směs dichlormethamethylacetát = 2:1), za účelem získání sloučeniny uvedené v názvu (20 mg, 0,022 mmol, výtěžek je 97 %), ve formě bílé pevné látky.

‘H-NMR (400 MHz, CDC1₃): 1,0-1,2 (12H, m), 1,54 (1H, m), 2,15 (1H, m), 2,33 (2H, m), 3,3-3,6 (6H, m), 3,8 (6H, s), 4,08 (2H, m), 4,65 (1H, m), 4,75 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,84 (4H, m), 7,2-7,6 (12H, m), 8,01 (2H, m), 8,53 (1H, s), 8,83 (1H, s), 9,01 (1H, brs).

FAB-MAS (mNBA): 900 (M+H)⁺

Příklad 15 3',5'-di-C>-benzyl-2'-C>,4'-C-ethylenuridin (příklad sloučeniny č. 2-10)

Vodný roztok IN hydroxidu sodného (2 ml) se přidal k roztoku sloučeniny získané v příkladu 13 (194 mg, 0,292 mmol) v pyridinu (3 ml) při teplotě 0 °C a směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 30 minut. Reakční směs se neutralizovala IN kyselinou chlorovodíkovou a extrahovala se ethylacetátem (10 ml). Organická vrstva se promyla saturovaným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a saturovaným vodným roztokem chloridu sodného, sušil se na bezvodém síranu hořečnatém a pak se koncentroval ve vakuu. Zbytek se čistil chromatografícky na koloně se silikagelem (jako eluát se prožila směs dichlormethammethanol = 100:3) za vzniku bezbarvého oleje (105 mg, 0,233 mmol, výtěžek je 80 %).

-51 CZ 296576 B6 ’Η-NMR (400 MHz, CDC1₃): 1,36 (1H, m), 2,29 (1H, m), 3,63 (1H, d, 11 Hz), 3,74 (1H, d, 11 Hz), 3,87 (1H, d, 2,9 Hz), 4,03 (2H, m), 4,29 (1H, d, 2,9 Hz), 4,49 (1H, d, 12 Hz), 4,50 (1H, d, 11Hz), 4,53 (1H, d, 1 Hz), 5,20 (1H, dd, 2 a 8 Hz), 6,04 (1H, s), 7,2-7,4 (10H, m), 8,13 (1H, d, 8,2 Hz), 8,57 (1H, brs).

FAB-MAS (mNBA): 451 (M+H)⁺

Příklad 16 2'-O,4'-ethylenuridin (příklad sloučeniny č. 2-1)

Roztok sloučeniny získané v příkladu 15 (100 mg, 0,222 mmol) vmethanolu (4 ml) se míchal v atmosféře vodíku za atmosférického tlaku v přítomnosti hydrogenačního katalyzátoru po dobu 5 hodin. Reakční směs se filtrovala za účelem odstranění katalyzátoru a filtrát se koncentroval ve vakuu. Zbytek se čistil chromatografií na koloně se silikagelem (jako eluent se použila směs dichlormethammethanol = 10:1) za účelem získat bezbarvý olej (v množství 45 mg, 0,167 mmol a výtěžek je 75 %).

’Η-NMR (400 MHz, CD₃OD): 1,35 (1H, dd, 4 a 13 Hz), 2,13 (1H, ddd, 7,11 a 13 Hz), 3,66 (1H, d, 12 Hz), 3,73 (1H, d, 12 Hz), 3,91-4,08 (2H, m), 4,01 (1H, d, 3,2 Hz), 4,12 (1H, d, 3,2 Hz),5,66 (1H, d, 8,2 Hz), 6,00 (1H, s), 8,37 (1H, d, 8,2 Hz).

FAB-MAS (mNBA): 271 (M+H)⁺

Příklad 17 5'-0-dimethoxytrityl-2'-0,4'-C-ethylenuridm (příklad sloučeniny č. 2-15)

Roztok sloučeniny získané v příkladu 16 (28 mg, 0,104 mmol) vbezvodém pyridinu se azeotropicky refluxoval za účelem odstranit vodu. Produkt se rozpustil v bezvodém pyridinu (3 ml) v atmosféře dusíku a do roztoku se přidal 4,4'-dimethoxytritylchlorid (50 mg, 0,15 mmol). Směs se míchala při teplotě místnosti přes noc. Do reakční směsi se přidalo malé množství methanolu a z reakční směsi se rozpouštědlo odpařilo ve vakuu. Zbytek se rozdělil mezi vodu a chloroform a organická vrstva se promyla saturovaným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a saturovaným vodným roztokem chloridu sodného ve vakuu. Zbytek se čistil chromatografícky na kloně se silikagelem (jako eluent se použila směs dichlormethan:methanol=100:3), přičemž se získala sloučenina uvedená v názvu (25 mg, 0,044 mmol, výtěžek je 42 %) ve formě bezbarvého oleje.

’Η-NMR (400 MHz, CD₃OD): 1,35 (1H, dd, 3 a 14 Hz), 2,03 (1H, ddd, 8, 11 a 14 Hz), 2,46 (1H, d, 8Hz), 3,36 (1H, d, 11 Hz), 3,41 (1H, d, 11 Hz), 3,80 (3H, s), 3,81 (3H, s), 3,97 (2H, m), 4,21 (1), 4,33 (1H, brm), 5,31 (1H, m), 6,10 (1H, s), 6,86 (4H, m), 7,2-7,5 (9H, m), 8,27 (1H, d,

8,2 Hz), 8,43 (1H, brs).

FAB-MAS (mNBA): 573 (M+H)⁺

Příklad 18 5'-O-dimethoxytrityl-2'-(9,4'-C-ethylenuridin-3'-(?-(2-kyanoethyl-A,7V-diizopropyl)fosforamidit (příklad sloučeniny č. 2-233)

Roztok sloučeniny získané v příkladu 17 (6 mg, 0,0105 mmol) vbezvodém pyridinu se azeotropicky refluxoval za účelem odstranit vodu. Produkt se rozpustil v bezvodém pyridinu v atmosféře dusíku a do roztoku se přidal dichlormethan (0,5 ml). K roztoku se přidal tetranol-A(7Vdiizopropylaminová sůl (3 mg) a pak se po kapkách do ledové lázně přidal 2-kyanoethyl-A,N,

ΝζΝ-tetraizopropylchlorfosforamidit (přibližně 5 μΐ). Směs se míchala při teplotě místnosti přes noc. Reakční směs se promyla saturovaným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a

-52CZ 296576 B6 saturovaným vodným roztokem chloridu sodného a zakoncentrovala se ve vakuu. Zbytek se čistil chromatograficky na koloně se silikagelem (jako eluent se používá směs dichlormethamethylacetát = 2:1), za účelem získání sloučeniny uvedené v názvu (8 mg) ve formě pevné látky.

'H-NMR (400 MHz, CDC1₃): 1,1-1,2 (13H, m), 2,09 (1H, m), 2,4 (2H, m), 3,3-3,6 (6H, m), 3,81 (6H, s), 3,94 (2H, m), 4,47 (1H, m), 5,18 (1H, d, 8,2 Hz), 6,08 (1H, s), 6,86 (4H, m), 7,2-7,4 (9H, m), 8,31 (1H, d, 8,2 Hz).

FAB-MAS (mNBA): 773 (M+H)⁺

Příklad 19 3 ',5 '-di-(9-benzyl-2'-(?,4'-C-ethylen-4-A-benzoyl-5-methylcytidin (příklad sloučeniny č. 2-46)

K roztoku sloučeniny získané v příkladu 14 (310 mg, 0,396 mmol) v pyridinu (5 ml) při teplotě 0 °C se přidal IN vodný roztok hydroxidu sodného (5 ml) a směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 20 minut. Reakční směs se neutralizovala přidáváním po kapkách 20% kyseliny octové a extrahovala se dichlormethanem. Dichlormethanová vrstva se promyla saturovaným vodným roztokem chloridu sodného a koncentrovala se ve vakuu. Zbytek se čistil chromatograficky na koloně se silikagelem (jako eluent se použila směs dichlormethan : methanol = 100:2) a získala se sloučenina uvedená v názvu (190 mg, 0,334 mmol, výtěžek je 84 %).

Ή-NMR (400 MHz, CDC1₃): 1,37 (1H, m), 1,58 (3H, s), 2,30 (1H, dt, 10 a 13 Hz), 3,64 (1H, d,

Hz), 3,79 (1H, d, 11 Hz), 3,95 (1H, d, 3,0 Hz), 4,04 (2H, dd, 2,3 a 10 Hz), 4,37 (1H, d, 3,0 Hz), 4,50 (1H, d, 12 Hz), 4,56 (1H, d, 11 Hz), 4,61 (1H, d, 11 Hz), 4,76 (1H, d, 12 Hz), 6,11 (1H, s), 7,2-7,5 (13H, m), 8,09 (1H, s), 8,29 (2H, m)

FAB-MAS (mNBA): 568 (M+H)⁺

Příklad 20 2'-O,4'-C-ethylen-4-/V-benzoyl-5-methylcytidin (příklad sloučeniny č. 2-226)

K roztoku sloučeniny získané v příkladu 19 (120 mg, 0,211 mmol) vbezvodém dichlormethanu (5 ml) při teplotě -78 °C se přidal po kapkách 1 M roztok chloridu boritého (1,6 ml) a směs se míchala při teplotě -78 °C po dobu 4 hodin. Ke směsi se po kapkách pomalu přidával methanol (1 ml) a směs se míchala po dobu 10 minut. pH reakce se upravilo na hodnotu 7 až 8 přidáváním saturovaného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Reakční směs se zahřívala na teplotu místnosti a koncentrovala se ve vakuu. Zbytek se čistil chromatograficky na koloně se silikagelem (jako eluent se použije směs dichlormethan : methanol = 100 : 6) za vzniku sloučeniny uvedené v názvu (29 mg, 0,075 mmol, výtěžek je 36 %) ve formě pevné látky.

'H-NMR (400 MHz, d-DMSO: 1,24 (1H, m), 2,01 (3H, m), 2,0 (1H, m), 3,54 (1H, dd, 5,4 a

Hz), 3,64 (1H, dd, 5,4 a 12 Hz), 3,88 (3H, m), 4,10 (1H, m), 5,36 (1H, d, 5,4 Hz), 5,49 (1H, t, 5,0 Hz), 5,95 (1H, s), 7,4-7,6 (3H, m), 8,21 (2H, m), 8,49 (1H, s), 13,17 (1H, brs). FAB-MAS (mNBA): 388 (M+H)⁺

Příklad 21 5 '-O-dimethoxytrityl-2 '-(?,4'-C-ethylen-4-7V-benzoyl-5-methylcytidin (příklad sloučeniny č. 2-51)

Roztok sloučeniny získané v příkladu 20 (44 mg, 0,114 mmol) v nevodném pyridinu se azeotropicky refluxoval za účelem odstranění vody. Produkt se rozpustil v bezvodém pyridinu (1 ml) za atmosféry dusíku a k roztoku se přidal 4,4'-dimethoxytritylchlorid (60 mg, 0,177 mmol). Směs se míchala při teplotě místnosti přes noc. Do reakční směsi se přidalo malé množství methanolu a pak se rozpouštědlo odpařilo ve vakuu. Zbytek se rozdělil mezi vodu a chloroform a organická vrstva se promyla saturovaným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a saturovaným

-53CZ 296576 B6 vodným roztokem chloridu sodného a koncentrovala se ve vakuu. Zbytek se čistil chromatograficky na koloně se silikagelem (jako eluent se použila směs dichlormethammethanol = 100:4), za vzniku sloučeniny uvedené v názvu (73 mg, 0,106 mmol, výtěžek je 93 %) ve formě bezbarvé amorfní pevné látky.

‘H-NMR (400 MHz, CDClj): 1,46 (1H, m), 1,49 (3Η, s), 2,06 (1H, m), 2,59 (1H, d, 8,6 Hz), 3,36 (1H, d, 11 Hz), 3,39 (1H, d, 11Hz), 3,80 (3H, s), 3,81 (3H, s), 3,99 (2H, m), 4,30 (1H, d, 3,3 Hz), 4,39 (1H, m), 6,12 (1H, s), 6,85 (4H, m), 7,2 - 7,5 (12H, m), 8,03 (1H, s), 8,28 (2H, s). FAB-MAS (mNBA): 573 (M+H)⁺

Příklad 22 5 '-O-dimethoxytrityl-2'-(9,4'-C-ethylen-4-A-benzoyl-5-methylcytidin-3'-0-(2kyanoethyl-A(A-diizopropyl)fosforamidit (příklad sloučeniny č. 2-236)

Roztok sloučeniny získané v příkladu 21 (35 mg, 0,0507 mmol) v bezvodém pyridinu se azeotropicky refluxovalo za účelem odstranit vodu. Produkt se rozpustil za podmínek atmosféry dusíku v bezvodém dichlormethanu (1 ml). K roztoku se přidala tetrazol-A,7V-diizopropylaminová sůl (17 mg) a pak se po kapkách do ledové lázně přidal 2-kyanoethyl-N,N, Ν',Ν'-tetraizopropylchlorfosforamidit (přibližně 32 μΐ, 0,1 mmol). Směs se míchala při teplotě místnosti přes noc. Reakční směs se promyla saturovaným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a saturovaným vodným roztokem chloridu sodného a zakoncentrovala se ve vakuu. Zbytek se čistil chromatografícky na koloně se silikagelem (jako eluent se používá směs dichlormethan:ethylacetát = 2:1), za účelem získání sloučeniny uvedené v názvu (40 mg, 0,0445 mmol, výtěžek je 89 %), ve formě bílé pevné látky.

'H-NMR (400 MHz, CDC1₃): 1,1-1,2 (12H, m), 1,36 (3H, s), 1,37 (1H, m), 2,10 (1H, m), 2,36 (2H, m), 3,3-3,6 (6H, m), 3,81 (6H, m), 3,98 (2H, m), 4,42 (1H, m), 4,49 (1H, m), 6,11 (1H, s), 6,88 (4H, m), 7,2-7,5 (12H, m), 8,14 (1H, s), 8,28 (2H, m).

FAB-MAS (mNBA): 890 (M+H)⁺

Příklad 23 2'-O-4'-C-ethylen-5-methylcytidin (příklad sloučeniny č. 2-226)

Roztok sloučeniny získané v příkladu 20 (11,6 mg, 0,030 mmol) v methanolu saturovaném amoniakem (2 ml) se nechal stát přes noc. Směs se zakoncentrovala a získalo se pevná bílá látka (8,5 mg, 0,030 mmol).

‘H-NMR (400 MHz, d-DMSO): 1,20 (1H, m), 1,82 (3H, s), 1,97 (1H, m), 3,49 (1H, dd, 5 a 12 Hz), 3,58 (1H, dd, 5 a 12 Hz), 3,85 (2H, m), 5,23 (1H, d, 5 Hz), 5,32 (1H, t, 5 Hz), 5,84 (1H, s), 6,7 (1H, brs), 7,2 (1H, brs), 8,08 (1H, s).

FAB-MAS (mNBA): 284 (M+H)⁺

UV (Zmax): 279 (pH7), 289 (pHl), 279(pH13)

Příklad 24 3',5 -di-(9-benzyl-2'-O,4'-C-ethylen-2-jV-izobutyrylguanosin (příklad sloučeniny č. 1-24)

K roztoku sloučeniny získané v příkladu 15 (přibližně 200 mg) v pyridinu (2 ml) se přidal IN vodný roztok hydroxidu sodného (2 ml) a směs se míchala při teplotě místnosti po dobu minut. Reakční směs se neutralizovala IN kyselinou chlorovodíkovou a extrahovala se ethylacetátem. Organická vrstva se promyla saturovaným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a saturovaným vodným roztokem chloridu sodného, sušila se na bezvodém síranu hořečna-54CZ 296576 B6 tém a pak se koncentrovala ve vakuu. Zbytek se čistil chromatograficky na koloně se silikagelem (jako eluent se použila směs dichlormethan : methanol = 50:1) a získala se bezbarvá amorfní pevná látka (20 mg, 0,36 mmol, výtěžek je 6 %, dva kroky).

'H-NMR (400 MHz, CDC1₃): 1,27 (3Η, s), 1,29 (3Η, s), 1,43 (1H, dd, 3 a 13 Hz), 2,28 (1H, m),

2,59 (1H, kvi, 6,9 Hz), 3,54 (1H, d, 11 Hz), 3,68 (1H, d, 11 Hz), 4,03 (2H, m), 4,15 (1H, d, 3,0 Hz), 4,31 (1H, d, 3,0 Hz), 4,45 (1H, d, 12), 4,56 (1H, d, 12 Hz), 4,61 (1H, d, 12 Hz), 4,63 (1H, d, 12 Hz), 6,18 (1H, s), 7,2-7,4 (10H, m), 8,19 (1H, s), 11,93 (1H, brs).

FAB-MAS (mNBA): 560 (M+H)⁺

Příklad 25 2'-(9,4'-C-ethylen-2-A-izobutyrylguanosin (příklad sloučeniny č. 1-177)

Roztok sloučeniny získané v příkladu 24 (10 mg, 0,018 mmol) v methanolu (2 ml) se míchal v atmosféře vodíku za atmosférického tlaku v přítomnosti hydrogenačního katalyzátoru po dobu 5 hodin. Reakční směs se filtrovala za účelem odstranění katalyzátoru a filtrát se koncentroval ve vakuu. Zbytek se čistil chromatografií na koloně se silikagelem (jako eluent se použila směs dichlormethan/methanol = 10:2) za účelem získání bezbarvého oleje (v množství 5 mg, 0,013 mmol a výtěžek je 72 %).

'H-NMR (400 MHz, CD₃OD): 1,21 (3Η, s), 1,22 (3Η, s), 1,41 (1H, dd, 4 a 13 Hz), 2,18 (1H, m), 2,69 (1H, kvi, 6,9 Hz), 3,69 (1H, d, 12 Hz), 3,76 (1H, d, 12 Hz), 4,0 (2Η, m), 4,26 (1H, d,

3,2 Hz), 4,30 (1Η, d, 3,2 Hz), 6,30 (1H, s), 8,40 (1H, s).

FAB-MAS (mNBA): 380 (M+H)⁺

Příklad 26 5'-<9-dimethoxytrityl-2'-(9,4'-C-ethylen-2-N-izobutyrylguanosin (příklad sloučeniny č. 1-35)

Roztok sloučeniny získané v příkladu 25 (5 mg, 0,13 mmol) vbezvodém pyridinu se azeotropicky refluxoval za účelem odstranění vody. Produkt se rozpustil v bezvodém pyridinu (1 ml) za atmosféry dusíku a 4,4'-dimethoxytritylchloridu (14 mg, 0,04 mmol) a přidal se k roztoku. Směs se míchala při teplotě 40 °C po dobu 3 hodiny. Do reakční směsi se přidalo malé množství methanolu a pak se rozpouštědlo odpařilo ve vakuu. Zbytek se čistil chromatograficky na koloně se silikagelem (jako eluent se použila směs dichlormethanmethanol - 100:6) za vzniku sloučeniny uvedené v názvu (4 mg, 0,0059 mmol, výtěžek je 45 %) ve formě bezbarvé pevné látky.

'H-NMR (400 MHz, CDC1₃): 1,26 (3H, d, 1,4 Hz), 1,28 (3H, d, 1,4 Hz), 1,66 (1H, m), 2,15 (1H, m), 2,59 (1H, kvi, 6,9 Hz), 3,65 (1H, m), 3,78 (1H, m), 4,06 (2H, m), 4,35 (1H, m), 4,38 (1H, d,

3,2 Hz), 6,23 (1H, s), 6,8 (4H, m), 7,2-7,5 (9H, m), 8,1 (1H, s), 8,19 (1H, brs).

FAB-MAS (mNBA): 682 (M+H)⁺

Příklad 27 5 '-O-dimethoxytrityl-2'-(?,4'-C-ethylen-2-A-izobutyrylguanosin-3'-0-(2kyanoethyl-A,A-diizopropyl)fosforarnidit (příklad sloučeniny č. 1-185)

Roztok sloučeniny získané v příkladu 26 (4 mg, 0,0058 mmol) vbezvodém pyridinu se azeotropicky refluxoval za účelem odstranit vodu. Produkt se rozpustil za podmínek atmosféry dusíku vbezvodém dichlormethanu (0,5 ml). K roztoku se přidala tetrazol-A,A-diizopropylaminová sůl (5 mg) a pak se po kapkách do ledové lázně přidal 2-kyanoethyl-N,N, Ν',Ν'-tetraizopropylchlorfosforamidit (9 μΐ, 0,03 mmol). Směs se míchala při teplotě místnosti po dobu jedné hodiny. Reakční směs se promyla saturovaným vodným roztokem hydrogenuhličitanu

-55CZ 296576 B6 sodného a saturovaným vodným roztokem chloridu sodného a zakoncentrovala se ve vakuu.

Zbytek se čistil chromatograficky na koloně se silikagelem (jako eluent se používá směs dichlormethamethylacetát = 2:1), za účelem získání sloučeniny uvedené v názvu (4 mg) ve formě bílé pevné látky.

‘H-NMR (400 MHz, CDC1₃): 1,1-1,4 (19H, m), 2,1 (1H, m), 2,4 (2H, m), 2,6 (1H, m), 3,3-3,6 (6H, m), 3,8 (6H, ms), 4,0-4,6 (4H, m), 6,2 (1H, s), 6,8 (4H, m), 7,2-7,5 (9H, m), 8,1 (1H, s).

Příklad 28 2'-O,4'-ethylenguanosin (příklad sloučeniny č. 1-5)

Roztok sloučeniny získané v příkladu 25 (0,5 mg) v methanolu saturovaném v amoniaku (0,5 ml) se nechal stát při teplotě 60 °C po dobu 5 hodin. Směs se zakoncentrovala a vytvořil se bílý prášek (0,4 mg).

FAB-MAS (mNBA): 310 (M+H)⁺ UV (/.max): 255 (pH7), 256(pHl), 258-266 (pH13)

Příklad 29 Syntéza oligonukleotidového derivátu

Syntéza oligonukleotidového derivátu se provádí za použití mechanického syntetizéru nukleových kyselin (ABI model392 DNA/RNA syntetizér: produkt firmy Perkin-Elmer Corp.) z rozmezí 1,0 mikromolů. Rozpouštědla, činidla a koncentrace fosforamiditu v každém cyklu syntézy je stejná, jako při syntéze přirozených oligonukleotidů. Rozpouštědla, činidla a fosforamidity přirozeného typu nukleotidů jsou produkty firmy PE Biosystems. Každá sekvence upraveného oligonukleotidového derivátu se syntetizovala opakováním kondenzace sloučeniny získané v příkladu 9 nebo amidity obsahující čtyři druhy bází nukleové kyseliny vhodné pro syntézu nukleotidů s 5'-hydroxythymidinem produkovaným deprotekcí skupiny DMTr 5'-O-DTMrthymidinu (1,0 mikromolů) za použití kyseliny trichloroctové, 3'-hydroxyskupiny thymidinu, která je zachycena na nosiči CGP. Cyklus syntézy je následující:

1) detritylace směsí kyselina trichloroctová/dichlormethan, 35 vteřin

2) spojovací fosforamiditu (přibližně 20 ekv.), tetrazol/acetonitril, 25 vteřin nebo 10 minut

3) vyplňování mezer za použití směsi 1-methylimidazol/tetrahydrofuran, anhydrid kyseliny octové/pyridin/tetrahydrofuran, 15 vteřin

4) oxidace za použití směsi jód/voda/pyridin/tetrahydrofuran, 15 vteřin

Když se použije ve shora uvedeném kroku 2)d cyklu sloučenina získaná v příkladu 9, reakční čas je 10 minut, a když se použijí fosforamidity, reakční čas je 25 vteřin.

Po syntéze požadované sekvence oligonukleotidového derivátu se odstranila skupina 5'-DTMr. Nosič obsahující požadovaný produkt se odstranil koncentrovaným vodným roztokem amoniaku za účelem odstranit oligomér z nosiče a tak se odstranila ochrana z kyanoethylové skupiny, která je chráněna fosforovou skupinou. Z oligoméru se odstranila ochranná aminoskupina v adeninu, guaninu a v cytosinu. Oligonukleotidový derivát se čistil HPLC s reverzní fází (HPLC: LC-PV: produkt firmy Shimazu Corp., kolona: Wakopak WS-DNA: produkt Wako Pure Chemical Industry, Ltd.) za účelem získání požadovaného oligonukleotidu.

Na základě této syntetické metody se získala následující oligonukleotidová sekvence (oligonukleotid je zde označen jako „oligonukleotid 1“) (koncentrace je 0,23 pmol, výtěžek je 23 %).

-56CZ 296576 B6

Příkladem sekvence č. 2 uvedené v seznamu sekvencí je sekvence 5gcgttttttgct-3', kde cukerná část thymidinů v bázích č. 4 až 8 je 2'-O,4'-C-ethylen.

Připomínky v příkladu 1

3.5- di-0-benzyl-4-třifluormethansulfonyloxymethyl-l,2-C>-izopropyliden-a-D-erythropentofuranóza

K roztoku 3,5-di-(9-benzyl-4-trifluormethansulfonyloxymethyl-1,2-(9-izo-propyliden-a-Derythropentofuranózy (2000mg, 5,0mmol) vbezvodém dichlormethanu (50ml) a trifluorsulfonovém anhydridu (1010 mg, 6,0 mmol) v atmosféře dusíku při teplotě -78 °C a přidal bezvodý pyridin (0,60 ml, 7,5 mmol) a směs se míchala po dobu 40 minut. Reakční směs se částečně rozdělila mezi methylenchlorid a saturovaný vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (přibližně 100 ml). Organická vrstva se promyla saturovaným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (přibližně 100 ml) a saturovaným vodným roztokem chloridu sodného (přibližně 100 ml), sušila se za použití bezvodého síranu hořečnatého a pak se koncentrovala ve vakuu za vzniku bílého prášku (2520 mg, 4,73 mmol, výtěžek je 95 %), který se použije v další reakci, aniž dojde k dalšímu čištění.

’Η-NMR (400 MHz, CDC1₃): 1,34 (3H, s), 1,63 (3Η, s), 3,48 (1H, d, 10 Hz), 3,53 (1H, d, 10 Hz), 4,21 (1H, d, 5,0 Hz), 4,5 (4H, m), 4,74 (1H, d, 12 Hz), 4,80 (1H, d, 12 Hz), 5,01 (1H, d, 12 Hz), 5,73 (1H, d, 4,6 Hz), 7,3(10H, m).

Odkaz k příkladu 2

3.5- di-0-benzyl-4-kyanomethyk-l,2-C>-izopropyliden-a-D-erythropentofuranóza

Sloučenina získaná v příkladu 1 (2 520 mg, 4,73 mmol) se rozpustila v dimethylsulfoxidu (50 ml) při teplotě 90 °C. K roztoku se přidal kyanid sodný (463 mg, 9,46 mmol) při teplotě místnosti a směs se míchala při teplotě 50 °C po dobu 3 hodin. Reakční směs se rozdělila mezi vodu (přibližně 100 ml) a ethylacetát (přibližně 100 ml). Organická vrstva se promyla saturovaným vodným roztokem chloridu sodného (přibližně 100 ml), sušila se pomocí bezvodého síranu hořečnatého a koncentrovala se ve vakuu. Zbytek se čistil chromatografícký na silikagelu (za použití směsi hexan : ethylacetát = 4:1) za vzniku bezvodého oleje (1 590 mg, 3,89 mmol, výtěžek je 82 %).

’Η-NMR (400 MHz, CDC1₃): 1,34 (3H, s), 1,62 (3H, s), 2,88 (1H, d, 17 Hz), 3,15 (1H, d, 17 Hz), 3,50 (1H, d, 10 Hz), 3,58 (1H, d, 10 Hz), 4,08 (1H, d, 5,1 Hz), 4,52 (1H, d, 12 Hz), 4,56 (1H, d, 12Hz), 4,57 (1H, m), 4,58 (1H, d, 12 Hz), 4,76 (1H, d, 12 Hz), 5,73 (1H, d, 3,7 Hz), 7,3 (10H, m).

Odkaz k příkladu 3

3.5- di-O-benzyl-4- formylmethyl-l,2-č?-izopropyliden-a-erythropentorfuranóza

K roztoku sloučeniny získané v příkladu 2 (610 mg, 1,49 mmol) v dichlormethanu (10 ml) v atmosféře dusíku při teplotě -78 °C se přidal po kapkách 1,5M toluenový roztok hydridu izobutylhlinitého a směs se míchala po dobu 1 hodiny při teplotě -78 °C a pak se zahřála na teplotu místnosti. K reakční směsi se přidal methanol (5 ml) a saturovaný vodný roztok chloridu amonného (přibližně 20 ml) a tato směs se míchala po dobu 30 minut. Reakční směs se extrahovala ethylacetátem (přibližně 30 ml). Organická vrstva se promyla ethylacetátem (přibližně 30 ml). Organická vrstva se promyla saturovaným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (přibližně 30 ml) a saturovaným vodným roztokem chloridu sodného (přibližně 30 ml), sušila se pomocí bezvodého síranu hořečnatého a pak se koncentrovala ve vakuu za vzniku produktu, který se použil v další reakci bez dalšího čištění.

-57CZ 296576 B6

Odkaz k příkladu 4

3.5- di-O-benzyl-4-hydroxyethyl-1,2-O-izopropyl iden-a-D-erythropentofuranóza

K roztoku sloučeniny získané v příkladu 3 (154 mg,0,377 mmol) v ethanolu (5 ml) se přidal NaBH₄ (7,6 mg, 0,2 mmol) a směs se míchala při teplotě místnosti po dobu jedné hodiny. Reakční směs se rozdělila mezi ethylacetát (přibližně 10 ml) a vodu (přibližně 10 ml) a organická vrstva se promyla saturovaným vodným roztokem chloridu sodného (přibližně 10 ml), sušila se za použití vodného síranu hořečnatého a koncentrovala se ve vakuu. Zbytek se čistil chromatografícky na silikagelu (za použití směsi hexan : ethylacetát = 2:1) za vzniku bezbarvého oleje (117 mg, 0,284 mmol, 75 %).

Odkaz k příkladu 5

3.5- di-O-benzyl—l-formyl-l,2-(?-izopropyliden-a-D-erythropentofuranóza

K methylenchloridu (200 ml) chlazenému při teplotě -78 °C se přidal oxalylchlorid (6,02 ml, 69,0 mmol). K tomuto roztoku se po kapkách přidal roztok dimethylsulfoxidu (7,87 ml, 110 mmol) vbezvodém methylenchloridu (100 ml). Po zamíchání po dobu 20 minut se ktéto směsi přidal roztok 3,5-di-O-benzyl-l,2-O-izopropyliden-a-D-erythropentofuranózy (9210mg, 23,02mmol) vbezvodém dichlormethanu (100ml) a směs se míchala po dobu 30 minut. K reakční směsi se přidal triethylamin (28 ml, 200 mmol) a pomalu se zahříval na teplotu místnosti. Reakční směs se rozdělila mezi dichlormethan a vodu (přibližně 300 ml). Organická vrstva se promyla vodou (přibližně 300 ml) a saturovaným vodným roztokem chloridu sodného (přibližně 300 ml), sušila se pomocí bezvodého síranu hořečnatého a pak se koncentrovala ve vakuu. Zbytek se čistil chromatografícky na silikagelu (za použití směsi hexan : ethylacetát = 5:1) za vzniku bezbarvého oleje (8 310 mg, 20,88 mmol, výtěžek je 91 %).

'H-NMR (400 MHz, CDC1₃): 1,35 (3H, s), 1,60 (3H, s), 3,68 (1H, d, 11 Hz), 4,37 (1H, d, 4,4 Hz), 4,46 (1H, d, 12Hz), 4,52 (1H, d, 12 Hz), 4,59 (1H, d, 12 Hz), 4,59 (1H, dd, 3,4, 4,4 Hz), 4,71 (1H, d, 12 Hz), 5,84 (1H, d, 3,4 Hz), 7,3 (lOh, m), 9,91 (1H, s).

FABMS (mNBA): 397 (M-H)⁺, 421 (M+Na)⁺ [a]_D+27,4° (0,51, methanol).

Odkaz k příkladu 6

3.5- di-(2-benzyl-4-vinyl-l,2-0-izopropyliden-oc-D-erythropentofuranóza

K roztoku sloučeniny získané v odkazem kpříkladu 5 (8 310 mg, 20,88 mmol) vbezvodém tetrahydrofuranu (300 ml) v atmosféře dusíku při teplotě 0 °C se přidal, 0,5M toluenový roztok činidla Tebbe (44 ml, 22 mmol) a smě se míchala. Pak se pomalu přidával 0,lN vodný roztok hydroxidu sodného (20 ml). Směs se filtrovala přes celit za účelem odstranit sraženinu a sraženina se promyla diethyletherem (přibližně 100 ml). Organická vrstva se sušila za použití bezvodého síranu hořečnatého a koncentrovala se ve vakuu. Zbytek se čistil chromatografícky na silikagelu (za použití směsi hexan : ethylacetát = 8 : 1 až 5 : 1) za vzniku bezbarvého oleje (5600 mg, 14,14 mmol, výtěžek je 68%).

'H-NMR (400 MHz, CDC1₃): 1,28 (3H, s), 1,52 (3H, s), 3,31 (1H, d, 11 Hz), 3,34 (1H, d, 11 Hz), 4,25 (1H, d, 4,9 Hz), 4,40 (1H, d, 12 Hz), 4,52 (1H, d, 12 Hz), 4,57 (1H, dd, 3,9, 4,9 Hz), 4,59 (1H, d, 12 Hz), 4,76 (1H, d, 12 Hz), 5,25 (1H, dd, 1,8, 11Hz), 5,52 (1H, dd, 1,8, 18 Hz), 5,76 (1H, d, 3,9 Hz), 6,20 (1H, dd, 11, 8 Hz), 7,3 (10H, m).

FABMS (mNBA): 419 (M+Na)⁺.

Odkaz k příkladu 7

3.5- di-č?-benzyl-4-hydroxyethyl-l,2-0-izopropyliden-a-D-erythropentofuranóza

-58CZ 296576 B6

K roztoku sloučeniny získané v odkazech k příkladu 6 (5 500 mg, 13,89 mmol) vbezvodém tetrahydrofuranu (200 ml) v atmosféře dusíku se přidal po kapkách 0,5M roztok tetrahydrofuranu 9-BBN (9-borabicyklo[3,3,l]nonan) (80 ml, 40 mmol) a směs se míchala při teplotě místnosti přes noc. Do reakční směsi se přidávala voda do té doby než se zastavil vývoj plynu. Pak se přidal 3N vodný roztok hydroxidu sodného (30 ml) a pak se pomalu přidával 30% vodný roztok hydrogenperoxidu při teplotě, která se udržovala mezi hodnotou 30 a 50 °C. Směs se míchala při teplotě 30 minut a dělila mezi saturovaný vodný roztok chloridu sodného (přibližně 200 ml) a ethylacetát (200 ml). Organická vrstva se promyla neutrálním pufrovaným roztokem kyseliny fosforečné (přibližně 200 ml) a saturovaným vodným roztokem chloridu sodného (přibližně 200 ml) a sušila se pomocí bezvodého síranu hořečnatého a pak se koncentrovala ve vakuu. Zbytek se čistil chromatograficky na silikagelu (za použití směsi hexan . ethylacetát = 2 : 1 až 1 : 1) za vzniku bezbarvého oleje (5 370 mg, 12,97 mmol, výtěžek je 93 %).

‘H-NMR (400 Mhz, CDC1₃): 1,33 (3H, s), 1,66 (3H, s), 1,78 (1H, ddd, 4,0, 8,5, 15 Hz), 2,51 (1H, ddd, 3,4, 6,4, 15 Hz), 3,54 (1H, d, 10 Hz), 3,80 (2H, m), 4,13 (1H, d, 5,3 Hz), 4,43 (1H, d, 12 Hz), 4,52 (1H, d, 12 Hz), 4,55 (1H, d, 12 Hz), 4,65 (1H, dd, 4,0, 5,3 Hz), 4,77 (1H, d, 12 Hz), 5,77 (1H, d, 4,0 Hz), 7,3 (10H, m).

FABMS (mNBA): 415 (M+Na)⁺, [a]_D+57,4° (0,91, methanol).

Odkaz k příkladu 8

3,5-di-C*-benzyM—(p-toluensulfonyloxyethyl)-l,2-O-izopropyliden-a-D-erythropentofuranóza

K roztoku sloučenin získané v odkazu k příkladu 4, který se azeotropicky refluxoval s toluenem (1035 mg, 2,5 mmol) vbezvodém dichlormethanu (35 ml) v atmosféře dusíku při teplotě 0 °C se přidal triethylamin (1,8 ml, 13 mmol), dimethylaminopyridin (30 mg, 0,25 mmol) a />-toluensulfonylchlorid (858 mg, 4,5 mmol) a směs se míchala při teplotě místnosti přes noc. Reakční směs se dělila mezi dichlormethan a saturovaný vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (přibližně 100 ml). Organická vrstva se promyje saturovaným vodným roztok hydrogenuhličitanu sodného (přibližně 100 ml) a saturovaného vodného roztoku chloridu sodného (přibližně 100 ml) a sušila se za pomoci bezvodého síranu hořečnatého a pak se koncentrovala ve vakuu. Zbytek se čistil chromatografícky na silikagelu (za použití směsi hexan : ethylacetát = 3 : 1) za vzniku bezbarvého oleje (1 340 mg, 2,60 mmol, výtěžek je 94 %).

'H-NMR (400 MHz, CDC1₃): 1,33 (3H, s), 1,49 (3H, s), 1,99 (1H, dt, 7,6 a 15 Hz), 2,47 (3H, s),

2,60 (1H, ddd, 5,7, 7,6, 15 Hz), 3,28 (1H, d, 10 Hz), 3,45 (1H, d, 10 Hz), 4,11 (1H, d, 5,3 Hz), 4, 32 (2H, m), 4,42 (1H, d, 12 Hz), 4,50 (1H, d, 12 Hz), 4,54 (1H, d, 12 Hz), 4,62 (1H, dd, 4,0,

5,2 Hz), 4,76 (1H, d, 12 Hz), 5,74 (1H, d, 4,0 Hz), 7,3 (12H, m), 7,78 (2H, d, 8,3 Hz).

FABMS (mNBA): 569 (M+H)⁺.

Odkaz k příkladu 9 l,2-di-0-acetyl-3,5-di-0-benzyl-4-(p-toluensulfonyloxyethyl)-a-D-erythropentofuranóza

K roztoku sloučeniny získané v odkazu k příkladu 8 (1 340 mg, 2,36 mmol) v kyselině octové (15 ml) se přidal kyselý anhydrid (1,88 ml, 20 mmol) a koncentrovaná kyselina sírová (0,01 ml). Směs se míchala při teplotě místnosti po dobu jedné hodiny. Reakční směs nalila do vody (60 ml) v ledové lázni a míchala se po dobu 30 minut a pak se dělila mezi saturovaný vodný roztok chloridu sodného (přibližně 100 ml) a ethylacetát (přibližně 100 ml). Organická vrstva se promyla neutrálním pufrovacím roztokem kyseliny fosforečné, saturovaným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a saturovaným vodným roztokem chloridu sodného a sušila se za použití bezvodého síranu hořečnatého a pak se koncentrovala. Zbytek se čistil chromatografícky na silikagelu (za použití směsi hexan : ethylacetát = 2:1) za vzniku bezbarvého oleje (1 290 mg, 2,11 mmol, výtěžek je 89%, poměr α : β je 1 : 5).

-59CZ 296576 B6 'H-NMR (400 MHz, CDC1₃): (derivát β) 1,86 (3H, s), 2,05 (3H, s), 2,08 (1H, m), 2,18 (1H, m),

2,42 (3H, s), 3,30 (1H, d, 10 Hz), 3,30 (1H, d, 10 Hz), 4,23 (1H, d, 5,1 Hz), 4,24 (2H, m), 4,42 (2H, s), 4,45 (1H, d, 12Hz), 4,55 (1H, d, 12 Hz), 5,28 (1H, d, 5,1 Hz), 6,01 (1H, s), 7,3 (12 H, m),

7,73 (2H, d, 8,3 Hz).

FAB-MAS (mNBA): 613 (M+H)⁺.

Odkaz k příkladu 10 2'-0-acetyl-3',5'-di-0-benzy>4'-_jp-toluensulfonyloxyethyl-5-methyluridin

Trimethylsilyllovaný thymin (500 mg, přibližně 2 mmol), který se připravil způsobem popsaným v publikaci H. Vorbrggen, K. Krolikiewicz and B. Bennua, Chem. Ber., 114, 1234-1255 (1981)) se přidal do roztoku sloučeniny získané v odkazu příkladu 9 (650 mg, 1,06 mmol) vbezvodém

1,2-dichlorethanu (15 ml) při teplotě místnosti v atmosféře dusíku. Ke směsi se po kapkách přidal trimethylsilyltrifluormethansulfonát (0,36 ml, 2 mmol) a smě se míchala při teplotě 50 °C po dobu 1 hodiny. Saturovaný vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného se filtroval přes celit. K filtrátu se přidal dichlormethan (50 ml). Organická vrstva se promyla saturovaným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (přibližně 50 ml) a sušila se za použití síranu hořečnatého a koncentrovala se ve vakuu. Zbytek se čistil chromatografícky na silikagelu (použila se směs hexan : ethylacetát = 1 : 2) za vzniku bezbarvé amorfní pevné látky (432 mg, 0,64 mmol, výtěžek je 60 %).

‘H-NMR (400 MHz, CDC1₃): 1,52 (3H, d, 0,9 Hz), 1,94 (1H, dt, 7,5 a 15 Hz), 2,06 (3H, s), 2,23 (1H, dt, 6,0 a 15 Hz), 2,42 (3H, s), 3,38 (1H, d, 10 Hz), 3,67 (1H, d, 10 Hz), 4,17 (2H, m), 4,36 (1H, d, 6,0 Hz), 4,41 (1H, d, 12 Hz), 4,44 (1H, d, 12 Hz), 4,48 (1H, d, 12 Hz), 4,58 (1H, d, 12 Hz), 5,39 (1H, dd, 5,1 a 6,0 Hz), 6,04 (1H, d, 5,1 Hz), 7,3 (12 H, m), 7,73 (2H, dt, 1,8 a 8,3 Hz), 8,18 (1H, s).

FAB-MAS (mNBA): 679 (M+H)⁺.

Odkaz k příkladu 11 2'-(9-acetyl-3',5'-di-<9-benzyl-4'-/>-toluensulfonyloxyethyl-4-7V-benzoylcytidin

Trimethylsilylovaný benzoylcytosin (300 mg, přibližně 1,0 mmol), který se připravil způsobem popsaným v publikaci H. Vorbrgeen, K. Krolikiewicz and B. Bennua, Chem. Ber., 114, 1234-1255 (1981) se přidal k roztoku sloučeniny získaní v odkazu příkladu 9 (383 mg, 0,626 mmol) vbezvodém 1,2-dichlorethanu (4 ml). Trimethylsilyltrifluormethansulfonát (0,18 ml, 0,995 mmol) při teplotě 0 °C se přidal do směsi a směs se míchala při teplotě 50 °C po dobu 1 hodiny. Do směsi se přidal saturovaný vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (přibližně 10 ml) a methylenchlorid (přibližně 20 ml) a směs se míchala. Výsledná bílá sraženina se odfiltrovala za použití celitu. Organická vrstva filtrátu se promyla saturovaným vodným roztokem chloridu sodného (přibližně 20 ml) a sušila se za použití bezvodého síranu hořečnatého a koncentrovala se ve vakuu za vniku bezbarvé amorfní pevné látky (397 mg, výtěžek je 83 %).

‘H-NMR (400 MHz, CDC1₃): 8,70 (1H, br), 8,18 (1H, d, 7,4 Hz), 7,87 (2H, d, 7,5 Hz), 7,72 (2H, d, 8,3 Hz), 7,61-7,57 (1H, m), 7,51-7,48 (2H, m), 7,43-7,21 (13 H, m), 6,02 (1H, d, 2,9 Hz), 5,40 (1H, dd, 5,8, 2,9 Hz), 4,57 (1H, d, 11 Hz), 4,39 (1H, d, 11 Hz), 4,32^1,28 (3H, m), 4,19—4,16 (2H, m), 3,69 (1H, d 11 Hz), 3,31 (1H, d, 11 Hz), 2,40 (3H, s), 2,30-2,23 (1H, m), 2,06 (3H, s), 1,95-1,89 (1H, m).

FAB-MAS (mNBA): 769 (M+H)⁺

Odkaz k příkladu 12 2'-0-acetyl-3'-5'-di-(9-benzyl-4'-p-toluensulfonyloxyethyl-6-7V-benzoyladenosin

-60CZ 296576 B6

Trimethylsilylovaný benzoyladenosin (500 mg, přibližně 2 mmol), který se připravil způsobem popsaným v publikaci H. Vorbrggen, K. Krolikiewicz and B. Bennua, Chem. Ber., 114, 1234-1255 (1981)) se přidal do roztoku sloučeniny získané v odkazu příkladu 9 (600 mg, 0,98 mmol) vbezvodém 1,2-dichlorethanu (15 ml) při teplotě místnosti v atmosféře dusíku. Ke směsi se po kapkách přidal trimethylasilyltrifluormethansulfonát (0,36 ml, 2 mmol) a směs se míchala při teplotě 50 °C po dobu 4 hodiny. Do reakční směsi se přidal saturovaný vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného a dichlormethan (50 ml). Reakční směs se rozdělila do těchto dvou vrstev. Organická vrstva se promyla saturovaným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (přibližně 50 ml) a saturovaným vodným roztokem chloridu sodného (přibližně 50 ml) a sušila se za použití síranu hořečnatého a koncentrovala se ve vakuu. Zbytek se čistil chromatograficky na silikagelu (použila se směs dichlormethan : methanol = 50 : 1) za vzniku bezbarvé amorfní pevné látky (405 mg, 0,51 mmol, výtěžek je 52%).

'H-NMR (400 MHz, CDC1₃): 2,0 (1H, m), 2,06 (3H, s), 2,32 (1H, dt, 6,0 a 15 Hz), 2,40 (3H, s), 3,36 (1H, d, 10 Hz), 3,58 (1H, d, 10 Hz), 4,22 (2H, m), 4,39 (1H, d, 12 Hz), 4,45 (1H, d, 12 Hz), 4,47 )1H, d, 12 Hz), 4,59 (1H, d, 12 Hz), 4,62 (1H, d, 5,6 Hz), 5,94 (1H, dd, 4,5 a 5,6 Hz), 5,94 (1H, dd, 4,5 a 5,6 Hz), 6,21 (1H, d, 4,5 Hz), 7,2-7,3 (12H, m), 7,54 (2H, m), 7,62 (1H, dt, 1,2 a

6,2 Hz), 7,72 (2H, d, 8,3 Hz), 8,02 (2H, m), 8,21 (1H, s), 8,75 (1H, s), 8,97 (1H, brs). FAB-MAS (mNBA): 792 (M+H)⁺.

Odkaz k příkladu 13 '-O-acetyl-3' ,5 '-di-(9-benzyl-4'-p-toluensulfonyloxyethyluridin

Trimethylsilylovaný uráčil (200 mg, přibližně 0,8 mmol), který se připravil způsobem popsaným v publikaci H. Vorbrggen, K. Krolikiewicz and B. Bennua, Chem. Bern. 114, 1234-1255 (1981)) se připravil do roztoku sloučeniny získané v odkazu příkladu 9 (200 mg, 0,327 mmol) v bezvodé,

1,2-dichlorethanu (8 ml) při teplotě místnosti v atmosféře dusíku. Ke směsi se po kapkách přidal trimethylsilyltrifluormethansulfonát (0,145 ml, 0,8 mmol) a směs se míchala při teplotě 70 °C po dobu 1 hodiny. Do reakční směsi se přidal saturovaný vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (10 ml) a směs se filtrovala za použití celitu. K filtrátu se přidal dichlormethan (přibližně 10 ml). Organická vrstva se promyla saturovaným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a saturovaným vodným roztokem chloridu sodného a sušila se za použití bezvodého síranu hořečnatého a koncentrovala se ve vakuu. Zbytek se čistil chromatograficky na silikagelu (použila se směs dichlormethan : methanol = 100 : 2) za vzniku bezbarvého oleje (199 mg, 0,299 mmol, výtěžek je 92 %).

'H-NMR (400 MHz, CDC1₃): 1,94 (1H, dt, 7,4 a 15 Hz), 2,07 (3H, s), 2,23 (1H, dt, 5,9 a 15 Hz), 2,43 (3H, s), 3,36 (1H, d, 10 Hz), 3,65 (1H, d, 10 Hz), 4,17 (2H, dd, 6 a 7 Hz), 4,31 (1H, d, 5,9 Hz), 4,38 (1H, d, 11 Hz), 4,39 (1H, d, 11 Hz), 4,40 (1H, d, 11 Hz), 4,58 (1H, d, 11 Hz), 5,29 (1H, dd, 2,4 a 8,2 Hz), 5,33 (1H, dd, 4,5 a 6 Hz), 6,00 (1H, d, 4,5 Hz), 7,2-7,4 (12H, m),

7,61 (1H, d, 8,2 Hz), 7,74 (1H, d, 8,3 Hz), 8,14 (1H, brs).

FAB-MAS (mNBA): 665 (M+H)⁺.

Odkaz k příkladu 14 2'-O-acetyl-3',5'-di-C-benzyl-4'-p-toluensulfonyloxyethyl-4-V-benzoyl-5-methylcytidin

Trimethylsilylovaný uráčil (200 mg, přibližně 0,8 mmol), který se připravil způsobem popsaným v publikaci H. Vorbrggen, K. Krolikiewicz and B. Bennua, Chem. Ber., 114, 1234-1255 (1981)) se přidal do roztoku sloučeniny získané v odkazu příkladu 9 (400 mg, 0,653 mmol) v bezvodém

1,2-dichlorethanu (6 ml). Ke směsi se po kapkách přidal trimethylasilyltrifluormethansulfonát (0,180 μΐ, 1,0 mmol) při teplotě 0 °C a směs se míchala při teplotě 50 °C po dobu 1 hodiny. Reakční směs se zahřála na teplotu místnosti. Do reakční směsi se přidal saturovaný vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (přibližně 5 ml) a methylenchlorid (přibližně 10 ml) a směs se zamíchala. Dále se směs filtrovala za použití celitu, aby se odstranila bílá sraženina. Organická

-61 CZ 296576 B6 vrstva filtrátu se promyla saturovaným vodným roztokem chloridu sodného a sušila se za použití bezvodého síranu hořečnatého a koncentrovala se ve vakuu za vzniku bezbarvé amorfní pevné látky (320 mg, 0,409 mmol, výtěžek je 63 %).

‘H-NMR (400 MHz, CDC1₃): 1,68 (3H, s), 1,95 (1H, dt, 7,3 a 15 Hz), 2,07 (3H, s), 2,25 (1H, dt, 6 a 15 Hz), 2,43 (3H, s), 3,40 (1H, d, 10 Hz), 3,71 (1H, d, 10 Hz), 4,18 (2H, m), 4,37 (1H, d, 5,8 Hz), 4,42 (1Hz, d, 12 Hz), 4,46 (1H, d, 12 Hz), 4,51 (1H, d, 12 Hz), 4,61 (1H, d, 12 Hz), 5,42 (1H, dd, 4,9 a 5,8 Hz), 6,07 (1H, d, 4,9 Hz), 7,2-7,6 (17H, m), 7,74 (2H, d, 8,3 Hz), 8,28 (2H, d, 7,0 Hz).

FAB-MAS (mNBA): 782 (M+H)⁺.

Odkaz k příkladu 15

2'-(9-acetly-3' ,5 '-di-O-benzyl-4'-p-toluensulfonyloxyethyl-2-.V-izobutyrylguanosin

Trimethylsilylovaný izobutyrylguanosin (650 mg, přibližně 1,5 mmol), který se připravil způsobem popsaným v publikaci H. Horbrggen, K. Krolikiewicz and B. Bennua, Chem. Ber., 114, 1234-1255 (1981)) se přidal do roztoku sloučeniny získané v odkazu příkladu 9 (400 mg, 0,65 mmol) vbezvodém 1,2-dichlorethanu (10 ml) při teplotě místnosti v atmosféře dusíku. Ke směsi se po kapkách přidal trimethylasilyltrifluormethansulfonát (0,2 ml, 1,2 mmol) a směs se míchala při teplotě 50 °C po dobu 4 hodin. Do reakční směsi se přidal saturovaný vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (5 ml) a organická vrstva se promyla saturovaným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a saturovaným vodným roztokem chloridu sodného a sušila se za použití bezvodého síranu hořečnatého a koncentrovala se ve vakuu za vzniku produktu, který se použil v další reakci bez dalšího čistění.

Příklad testu 1

Test měření Tm

Roztok vzorku (1 ml), jehož konečná koncentrace NaCl je 100 mM, pufrovací roztok fosforečnanu sodného (pH 7,2) s koncentrací 10 mM, oligonukleotid (1) s koncentrací 4 μΜ a komplementární DNA (zde uvedená jako oligonukleotid (2)), která vykazuje sekvenci indikovanou svým komplementárním řetězcem (sekvence 5'-agcaaaaacgc-3' (sekvence č. 1 na seznamu sekvencí) nebo komplementární RNA (zde uvedená jako oligonukleotid (3)), která má sekvenci indikovanou sekvencí 5'-agcaaaaaacgc-3' (sekvence č. 1 uvedenou na seznamu sekvencí) s koncentrací 4 μΜ, se zahřál v lázni s vroucí vodou a pomalu se chladil na teplotu místnosti, což trvalo přibližně dvě hodiny. Vzorek se pak zahřál a měřilo se za použití spektrofotometru (UV-3100PC:produkt firmy Shimadzu Corp.). Vzorek se zahřál v cele (tloušťka cely je 1,0 cm, cylindrický plášťový typ) cirkulující vodou zahřívanou v inkubátoru (Haake FE2: produkt firmy EKO Corp.) a monitorovala se teplota za použití teploměru (SÁTO SK1250MC). Teplota se zvýšila z 20 na 95 °C a při každém zvýšení teploty o jeden °C se měřila absorbance ultrafialového záření při maximální absorpční vlnové délce 260 nm. Přirozeně se vyskytující DNA (zde uvedená jako oligonukleotid (4)), která má sekvenci indikovanou sekvencí 5'-gcgttttttgct-3' (sekvence č. 2 uvedená v seznamu sekvencí), jenž má stejnou sekvenci jako oligonukleotid (1) (sloučenina příkladu 29) se použila jako kontrola a provedl se stejný postup.

Teplota, při které změna na 1 °C dosáhne maxima, je teplota Tm (teplota denaturace) a při této teplotě se hodnotila schopnost oligonukleotidového analogu tvořit komplementární řetězec.

Výsledky měření hodnot Tm oligonukleotidu (4) (přirozeně se vyskytující DNA) a oligonukleotidu (1) (sloučenina z příkladu 29) je vztažena k oligonukleotidu (2) (komplementární DNA) a oligonukleotidu (3) (komplementární RNA).

-62CZ 296576 B6

Tabulka č. 3

Tm (^DC)
sloučenina	oligonukleotid (2)	oligonukleotid (3)
oligonukleotid (4)	48	44
oligonukleotid (1)	61	75

Z tabulky plyne, že oligonukleotidový analog podle vynálezu vykazuje překvapivě vyšší hodnotu Tm a překvapivě vyšší schopnost tvořit komplementární řetězec ve srovnání s přirozeně se vyskytující DNA.

Příklad testu 2

Měření rezistence vůči nukleázám

Exonukleáza a endonukleáza se smíchaly s pufrem s oligonukleotidem a směs se udržovala při teplotě 37 °C po dobu 15 minut. Roztok směsi se pak udržoval při teplotě 37 °C po předem určenou dobu. K části směsi se přidala kyselina ethylendiaminotetraoctová (EDTA) a směs se zahřála na teplotu 100 °C po dobu 2 minuty, přičemž se zastavila reakce. Množství zbývajícího oligonukleotidu se stanovilo HPLC s reverzními fázemi, měřily se změny množství oligonukleotidu závislé na čase v přítomnosti nukleázy.

Oligonukleotidové analogy podle vynálezu demonstrují překvapivou rezistenci vůči nukleázám.

Průmyslová využitelnost

Nový oligonukleotidový a nukleosidový analog podle vynálezu se může použít jako antigenní farmaceutický prostředek, který vykazují skvělou stabilitu. Dále se mohou požít jako detekční činidla (sondy) specifického genu, jako primery pro začátek amplifíkace nebo jako meziprodukty při jejich přípravě.

Seznam sekvencí <210> 1 <211> 12 <212> DNA <213 > umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Syntetizovaný oligonukleotid určený pro testování hodnoty Tm <400> 1 agcaaaaaac gc gcgtttttt ct <210> 2 <211> 12 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Syntetizovaný oligonukleotid určený pro testování hodnoty Tm <400> 2

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Nukleosidový analog obecného vzorce 1 kde symboly R¹ a R² jsou stejné nebo různé a reprezentují atom vodíku, hydroxylovou chránící skupinu, skupinu kyseliny fosforečné, chráněnou skupinu kyseliny fosforečné nebo -P(R³)R⁴, kde symboly R³ a R⁴ jsou stejné nebo různé a reprezentují hydroxylovou skupinu, chráněnou hydroxylovou skupinu, merkaptoskupinu, chráněnou merkaptoskupinu, aminoskupinu, alkoxyskupinu, která obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, alkylthioskupinu, která obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, kyanoalkoxyskupinu, která obsahuje 1 až 5 atomů uhlíku, nebo aminoskupinu substituovanou alkylovou skupinou, která obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku, symbol A reprezentuje alkandiylovou skupinu, která obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku a symbol B reprezentuje skupinu purin-9-yl, 2-oxopyrimidin-l-yl nebo substituovanou skupinou purin-9-yl nebo substituovanou skupinu 2-oxopyrimidin-l-yl mající alespoň jeden substituent vybraný ze skupiny a, která se skládá z hydroxylové skupiny, chráněné hydroxylové skupiny, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, merkaptoskupiny, chráněné merkaptoskupiny, alkylthioskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, aminoskupiny, chráněné aminoskupiny, aminoskupiny substituované alkylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku alkylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku a halogenovaného atomu, nebo jeho sůl.

2. Nukleosidový analog podle nároku 1 nebo jeho sůl, kde symbol R¹ je atom vodíku, alifatická acylová skupina, aromatická acylová skupina, methylová skupina substituovaná jednou až třemi arylovými skupinami, methylová skupina, substituovaná jednou až třemi arylovými skupinami, jejichž arylový kruh je substituován nižším arylem, nižší alkoxyskupinou, halogenem nebo kyanoskupinou nebo silylovou skupinou.

3. Nukleosidový analog podle nároku 1 nebo jeho sůl, kde symbol R¹ je atom vodíku, acetylová skupina, benzoylová skupina, benzylová skupina, p-methoxybenzylová skupina, dimethoxytritylová skupina, monomethoxytritylová skupina nebo íerc-butyldifenyl-silylová skupina.

4. Nukleosidový analog podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 nebo jeho sůl, kde symbol R² je atom vodíku, alifatická acylová skupina, aromatická acylová skupina, methylová skupina substituovaná jednou až třemi arylovými skupinami, methylová skupina substituovaná jednou až třemi arylovými skupinami, jejichž arylový kruh je substituován nižším alkylem, nižší alkoxyskupinou, halogenem nebo kyanoskupinou, silylovou skupinou, fosforamiditovou skupinou, fosfonylovou skupinou, skupinou kyseliny fosforečné nebo chráněnou skupinou kyseliny fosforečné. ⁵

5. Oligonukleotidový analog podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 nebo jeho sůl, kde symbol R²je atom vodíku, acetylová skupina, benzoylová skupina, benzylová skupina, p-methoxybenzylová skupina, fórc-butyldifenylsilylová skupina, -P(OC₂H₄CN)NCH(CH₃)₂),

-64CZ 296576 B6

-P(OCH₃)NCH(CH₃)₂), fosfonylová skupina nebo skupina kyseliny 2-chlorfenylfosforečné nebo

4-chlorfenylfosforečné.

6. Nukleosidový analog podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 nebo jeho sůl, kde symbol A je methylenová skupina.

7. Nukleosidový analog podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 nebo jeho sůl, kde symbol B je 6-aminopurin-9-yl (to je adeninyl), 6-aminopurin-9-yl, jehož aminoskupina je chráněná, 2,6-di-aminopurin-9-yl, 2-amino-6-chlorpurin-9-yl, 2-amino-6-chlorpurin-9-yl, jehož aminoskupina je chráněná, 2-amino-6-fluorpurin-9-yl, 2-amino-6-fluorpurin-9-yl, jehož aminoskupina je chráněná, 2-amino-6-brompurin-9-yl, 2-amino-6-brompurin-9-yl, jehož aminoskupina je chráněná, 2-amino-6-hydroxypurin-9-yl (to je guaninyl), 2-amino-6-hydroxypurin9-yl, jehož aminoskupina a hydroxylová skupina jsou chráněné, 6-amino-2-methoxypurin-9-yl, 6-amino-2-chlorpurin-9-yl, 6-amino-2-fluor-purin-9-yl, 2,6-dimethoxypurin-9-yl, 2,6-dichlorpurin-9-yl, 6-merkaptopurin-9-yl, 2-oxo-4-aminopyrimidm-l-yl (to je cytosinyl), 2-oxo-4-aminopyrimidin-l-yl, jehož aminoskupina je chráněná, 2-oxo-4-amino-5fluorpyrimidin-l-yl, 2-oxo-4-amino-5-fluorpyrimidin-l-yl, jehož aminoskupina je chráněná, 4-amino-2-oxo-5-chlorpyrimidin-l-yl, 2-oxo-4-methoxypyrimidin-l-yl, 2-oxo-4-merkaptopyrimidin-l-yl, 2-oxo-4-hydroxypyrimidin-l-yl (to je uracinyl), 2-oxo-4-hydroxy-5methylpyrimidin-l-yl (to je thyminyl) nebo 4-amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-l-yl (to je methylcytosinyl) nebo 4-amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-l-yl, jehož aminoskupina je chráněná.

8. Nukleosidový analog podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 nebo jeho sůl, kde symbol B je 6-benzoylaminopurin-9-yl, adeninyl, 2-izobutyl-arylamino-6-hydroxypurin-9-yl, guaninyl, 2-oxo-4-benzoylamino-pyrimidin-l-yl, cytosinyl, 2-oxo-5-methyl-4-benzoylaminopyrimidin-l-yl, 5-methylcytosinyl, uracinyl nebo thyminyl.

9. Nukleosidový analog nebo jeho sůl vybraná z následující skupiny:

2'-O,4'-C-ethylenguanosin 2'-C>,4'-C-ethylenadenosin 3', 5 '-di-O-benzyl-2'-O,4'-C-ethylen-6W-benzoyladenosin 3',5'-di-(9-benzyl-2'-O,4'-C-ethylen-2-7V-izobutyrylguanosin 5'-<?-dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-6-N-benzoyladenosin 5'-(9-dimethoxytrityl-2'-Q4'-C~ethylen-2-7V-izobutyrylguanosin 2'-O,4'-C-ethylen-2-A^r-izobutyrylguanosin 2'-(?,4'-C-ethylen-6-A^z-benzoyladenosin 5'-O-dimethoxytrityl-2'--O,4'-C-ethylen-6-.ZV-benzoyladenosin-3'-O-(2-kyanoethyl-N,N-diizopropyl)fosforamidit 5'-<9-dimethoxytrityl~2'-O,4'-C-ethylen-2-A-osobutyrylguanosin-3'-C>-(2-kyanoethyl-A^/',A^Ldiizopropyl)fosforamidin 2'-(9,4'-C-ethylenuridin

2'-O,4'-C-ethylen-5-methyluridin 2'-(?,4'-C-ethylencitidin

2'-(9,4'-C-ethylen-5-methylcytidin 3',5'-di-O-benzyl-2'-<9,4'-C-ethylenuridin 5 '-O-dimethyoxytri tyl-2 '-O,4'-C-ethylenuridin 3 (5 '-di-O-benzyl-2'-ČM'-C-ethylen-5-methyluridin 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-5-methyluridin 3',5'-di-O-benzyl-2'-(9,4'-C-ethylen-4--JV-benzoylcytidin 5'~č?-dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-4-JV-benzoylcytidin 3\5'-di-O-benzyl-2'-(9,4'-C-ethylen-4-JV-benzoyl-5--methyluridin 5'-O-dimethoxytrityl-2'-C>,4'-C-ethylen-4-7V-benzoyl-5-methylcytidin

-65CZ 296576 B6

2'-O,4'-C-ethylen-4-N-benzoylcytidin

2'-O,4'-C-ethylen-4-A-benzoyl-5-methylcytidm

5'-(9--dimethoxytntyl-2'-O,4-C-ethylenundm-3'~-O-(2-kyanoethyl-V,/V-diizopropyl)fosforamidin

5'-<9-dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-5-methyluridin-3'-(9-(2-kyanoethyl-A,A^Ldiizopropyl)fosforamidit

5'-C>-dimethoxytrityl-2'-O,4'-C-ethylen-4-A-benzoylcytidin-3'-C>-(2-kyanoethyl-A(jV-diizopropyl)fosforamidit a

5'-C*-dimethoxytrityl-2-C>,4'-C-ethylen-5-methylurídin-3'-O-(2-kyanoethyl-jV,/V-diizopropyl)fosforamidit.

10. Oligonukleotidový analog, který vykazuje jednu nebo dvě nebo více struktur obecného vzorce 2:
(2), kde symbol A reprezentuje alkandiylovou skupinu, která má 1 až 4 atomy uhlíku a symbol B reprezentuje skupinu purin-9-yl, 2-oxopyrimidin-l-yl nebo substituovanou skupinu purin-9-yl nebo substituovanou skupinu 2-oxopyrimidin-l-yl mající alespoň jeden substituent vybraný ze skupiny a, která se skládá z hydroxylové skupiny, chráněné hydroxylové skupiny, alkoxyskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, merkaptoskupiny, chráněné merkaptoskupiny, alkylthioskupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, aminoskupiny, chráněné aminoskupiny, aminoskupiny substituované alkylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, alkylové skupina s 1 až 4 atomy uhlíku nebo halogenovaného atomu, nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.

11. Oligonukleotidový analog podle nároku 10 nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde symbol A je methylenová skupina.

12. Oligonukleotidový analog podle kteréhokoliv z nároků 10 a 11 nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde symbol B je 6-aminopurin-9-yl (to je adeninyl), 6-aminopurin-9-yl, jehož aminoskupina je chráněná, 2,6-diaminopurin-9-yl, 2-amino-6-chlorpurin-9-yl, 2-amino-6chlorpurin-9-yl, jehož aminoskupina je chráněná, 2-amino-6-fluorpurin-9-yl, 2-amino-6fluorpurin-9-yl, jehož aminoskupina je chráněná, 2-amino-6-brompurin-9-yl, 2-amino-6brompurin-9-yl, jehož aminoskupina je chráněná, 2-amino-6-hydroxypurin-9-yl (to je guaninyl), 2-amino-6-hydroxypurin-9-yl, jehož aminoskupina je chráněná, 2-amino-6hydroxypurin-9-yl, jehož aminoskupina a hydroxylová skupina jsou chráněné,6-amino-2methoxypurin-9-yl, 6-amino-2-chlorpurin-9-yl, 6-amino-2-fluorpurin-9-yl, 2,6-dimethoxypurin-9-yl, 2,6-dichlorpurin-9-yl, 6-merkaptopurin-9-yl, 2-oxo-4-aminopyrimidin-l-yl (to je cytosinyl), 2-oxo-4-aminopyrimidin-l-yl, jehož aminoskupinaje chráněná, 2-oxo-4-amino-5fluorpyrimidin-l-yl, 2-oxo-4-amino-5-fluorpyrirnidin-l-yl, jehož aminoskupina je chráněná, 4-amino-2-oxo-5-chlorpyrimidin-l-yl, 2-oxo-4-methoxypyrimidin-l-yl, 2-oxo-4—merkaptopyrimidin-l-yl, 2-oxo-4-hydroxypyrimidin-l-yl (to je uracinyl), 2-oxo-4-hydroxy-5-methylpyrimidin-l-yl (to je thyminyl) nebo 4-amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-l-yl (to je methylcytosinyl nebo 4-arnino-5-methyl-2-oxopyrimidin-l-yl, jehož aminoskupina je chráněná.

-66CZ 296576 B6

13. Oligonukleotidový analog podle kteréhokoliv z nároků 10 až 12 nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde symbol B je 6-benzoylaminopurin-9-yl, adeninyl, 2-izobutyrylamino-6-hydroxy-purin-9-yl, guaninyl, 2-oxo-Á—benzoylaminopyrimidin-l-yl, cytoxinyl, 2-oxo-5-methyl4-benzoylaminopyrimidin-l-yl, 5-methylcytosinyl, uracinyl nebo thyminyl.

14. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství farmaceuticky aktivní sloučeniny spolu s nosičem nebo ředidlem, kde uvedená farmakologicky aktivní sloučenina je oligonukleotidový analog podle kteréhokoliv z nároků 10 až 13 nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.

15. Sonda vhodná pro gen, vyznačující se tím, že obsahuje oligonukleotidový analog podle kteréhokoliv z nároků 10 až 13.

16. Primer vhodný pro začátek amplifíkace, vyznačující se tím, že obsahuje oligonukleotidový analog podle kteréhokoliv z nároků 10 až 13.

17. Použití oligonukleotidového analogu podle kteréhokoliv z nároků 10 až 13 nebo jeho farmaceuticky přijatelné sole pro výrobu léčiva vhodného pro prevenci nebo léčbu onemocnění, kterému je možné předcházet nebo ho léčit schopností uvedeného oligonukleotidového analogu vykazovat farmakologicky přijatelnou protismyslnou aktivitu v těle pacienta po jeho aplikaci.

18. Použití oligonukleotidového analogu podle kteréhokoliv z nároků 10 až 13 nebo jeho farmaceuticky přijatelné sole pro výrobu léčiva vhodného pro prevenci nebo léčbu onemocnění, kterému je možné předcházet nebo ho léčit schopností uvedeného oligonukleotidového analogu vykazovat farmakologicky použitelnou antigenní aktivitu v těle pacienta po jeho aplikaci.

19. Oligonukleotidový analog podle kteréhokoliv z nároků 10 až 13 nebo jeho farmakologicky přijatelná sůl pro použití jako léčivo.