CZ25697A3 - Novel compounds - Google Patents
Novel compounds Download PDFInfo
- Publication number
- CZ25697A3 CZ25697A3 CZ97256A CZ25697A CZ25697A3 CZ 25697 A3 CZ25697 A3 CZ 25697A3 CZ 97256 A CZ97256 A CZ 97256A CZ 25697 A CZ25697 A CZ 25697A CZ 25697 A3 CZ25697 A3 CZ 25697A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- compound
- dna
- igg4
- seq
- host cell
- Prior art date
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims description 44
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 52
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 87
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 29
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 21
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 11
- 230000002411 adverse Effects 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 102
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 102
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 101
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 64
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 27
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 21
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 21
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 13
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 244000309466 calf Species 0.000 description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 10
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 10
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 9
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 9
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 6
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 6
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 6
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 6
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 5
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M rubidium chloride Chemical compound [Cl-].[Rb+] FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AGJBKFAPBKOEGA-UHFFFAOYSA-M 2-methoxyethylmercury(1+);acetate Chemical compound COCC[Hg]OC(C)=O AGJBKFAPBKOEGA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 3
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 3
- 102000010787 Interleukin-4 Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010038486 Interleukin-4 Receptors Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 3
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 3
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 3
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 3
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000006872 enzymatic polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- 150000002614 leucines Chemical class 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 229940102127 rubidium chloride Drugs 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100268670 Caenorhabditis elegans acc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010010744 Conjunctivitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241001200922 Gagata Species 0.000 description 1
- NJCALAAIGREHDR-WDCWCFNPSA-N Glu-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NJCALAAIGREHDR-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100232919 Homo sapiens IL4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001076430 Homo sapiens Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000297179 Syringa vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000002205 allergic conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 208000024998 atopic conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960005150 glycerol Drugs 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 102000019207 human interleukin-13 Human genes 0.000 description 1
- 210000000962 igg plasma cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 229940099607 manganese chloride Drugs 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000008024 pharmaceutical diluent Substances 0.000 description 1
- AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N phosphite(3-) Chemical class [O-]P([O-])[O-] AQSJGOWTSHOLKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229960004109 potassium acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000759 toxicological effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5406—IL-4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Tento vynález se týká antagonistů lidského interleukinu 4 (IL4) a/nebo lidského interleukinu 13 (IL13) pro ošetřování stavů vyplývajících z nežádoucího účinku IL4 a/nebo IL13, stejně jako určitých alergických chorob zprostředkovaných IgE, autoimunitních stavů zprostředkovaných T buňkami a nepřiměřené imunitní odezvy na infekční přípravky.
Dosavadní stav techniky
Interleukiny jsou vylučovány jako peptidové mediátory imunitní odezvy. Každý ze známých interleukinů má řadu účinků na vývoj, aktivaci, proliferaci a diferenciaci buněk imunitního systému. IL4 má fyziologickou úlohu v takových funkcích, ale může také přispívat k patogenezi choroby. IL4 je obzvláště spojen s cestou B vývoje lymfocytu, která vede k vytváření IgE protilátek, které jsou charakteristickým znakem alergických chorob, jako je zevní astma, rinitida, alergická konjunktivitida, atopická dermatitida a anafylaxie. IL4 může také působit jako obecný růstový a diferenciační faktor pro T lymfocyty, které mohou přispívat k poškození tkáně za určitých autoimunitních stavů, jako je diabetes závislý na inzulínu, rozptýlená skleróza a reumatoidní artritida a odhojení štěpu. IL4 může také potlačovat vytváření odezvy zprostředkované buňkami, vyžadované pro potlačování infekční choroby. Proto se může očekávat antagonizmus účinku IL4 na T nebo B lymfocyty, který má příznivé účinky na takové choroby. Nedávno byl identifikován
IL13, který je podobný v mnoha biologických vlastnostech IL4 [A. Minty a kol., Nátuře, 362, 248-250 (1993)], včetně určitých aspektů struktury a/nebo funkce receptoru [G. Aversa a kol., J. Exp. Med., 178, 2213-2218 (1993)].
Lidský IL4 sestává z jediného polypeptidového řetězce ze 129 aminokyselin se 2 možnými N-glykosylačními místy a 6 cysteiny zahrnutými do 3 disulfidových můstků [Η. V. Le a kol., J. Biol. Chem., 263, 10817-10823 (1988)]. Aminokyselinová sekvence IL4 a umístění těchto disulfidových můstků je známo [C. Carr a kol., Biochemistry, 30., 1515-1523 (1991)].
HIS-LYS-CYS-ASP-ILE-TKR-LEU-GLN-GLU-ILE-ILE-LYS-THR-LEU-ASN20 30 SER-LEU-THR-GLU-GLN-LYS-THR-LEU-CYS-THR-GLU-LEU-THR-VAL-THR40
ASP-ILE-PHE-ALA-ALA-SER-LYS-ASN-THR-THR-GLU-LYS-GLU-THR-PHE50 S0
CYS-ARG-ALA-ALA-THR-VAL-LEU-ARG-GLN-PHE-TYR-SER-HIS-HIS-GLU70
LYS-ASP-THR-ARG-CYS-LEU-GLY-ALA-THR-ALA-GLN-GLN-PHE-HIS-ARG80 90 his-lys-gln-leu-ile-arg-phe-leu-lys-arg-leu-asp-arg-asn-leu100
TRP-GLY-LEU-ALA-GLY-LEU-ASN-SER-CYS-PRO-VAL-LYS-GLU-ALA-ASN110 120 GLN-SER-THR-LEU-GLU-ASN-PHE-LEU-GLU-ARG-LEU-LYS-THR-ILE-MET129
ARG-GLU-LYS-TYR-SER-LYS-CYS-SER-SER
Disulfidové můstky jsou mezi zbytky 3 a 127, 24 a 65 a dále 46 a 99. Molekulová hmotnost IL4 se mění podle rozsahu glykosylace od 15 kDa (neglykosylováno) do 60 kDa nebo více (hyperglykosylovaný IL4).
DNA sekvenci pro lidský IL4 také popsal T. Yokota a kol. v P. N. A. S., 83, 5894-5898 (1986).
W093/10235 popisuje určité mutanty IL4, které jsou IL4 antagonisty nebo částečnými antagonisty.
EP-A-0 464 533 uvádí fúzované proteiny, zahrnující různé části konstantní oblasti imunoglobulínových molekul dohromady s jiným lidským proteinem nebo jeho částí.
Podstata vynálezu
Tento vynález skýtá rozpustný protein, který má IL4 a/nebo IL13 antagonistickou nebo částečnou antagonistickou aktivitu, a který zahrnuje IL4 mutantu nebo variantu fúzovanou k alespoň jedné lidské imunoglobulínové konstantní doméně nebo jejímu fragmentu.
Výraz mutanta nebo varianta zahrnuje libovolnou molekulu, jako je komolý nebo jiný derivát IL4 proteinu, který si uchovává schopnost antagonizovat IL4 a/nebo IL13 po vnitřním podání člověkovi. Takové jiné deriváty se mohou připravit adicí, delecí, substitucí nebo přesmykem aminokyselin nebo jejich chemických modifikací.
DNA polymery, které kódují mutanty nebo varianty IL4, se mohou připravit obvyklými způsoby do místa zaměřenou mutagenezí cDNA, která kóduje pro IL4, jako popsal G. Winter a kol. v Nátuře 299, 756-758 (1982) nebo Zoller a Smith v Nucl. Acids Res.,10, 6487-6500 (1982), nebo deleční mutagenezí, jak popsal Chán a Smith v Nucl. Acids Res., 12, 2407-2419 (1984) nebo G. Winter a kol. v Biochem. Soc.
Trans., 12., 224-225 (1984), nebo reakcí polymerázového řetězce, jak popsal Mikaelian a Sergeant v Nucleic Acids Research, 20 . 376 (1992).
Pokud se zde používá výrazu má IL4 a/nebo IL13 antagonistickou nebo částečnou antagonistickou aktivitu, tento výraz znamená, že při testu popsaném Spitsem a kol. v J. Immunology, 139, 1142 (1987) se proliferace T buněk stimulovaná IL4 inhibuje způsobem závislým na dávce.
Vhodné IL4 mutanty jsou uvedeny ve WO93/10235, kde alespoň jedna aminokyselina, která se přirozeně vyskytuje v divokým typu IL4 v libovolné poloze 120 až 128 včetně, je nahrazena rozdílnou přirozenou aminokyselinou. Obzvláště tyrosin, přirozeně se vyskytující v poloze 124, může být nahrazen rozdílnou přirozenou aminokyselinou, jako je glycin nebo výhodněji kyselina asparagová.
Imunoglobulín může být z jakékoli podskupiny (IgG,
IgM, IgA, IgE), ale jde výhodně o IgG, jako je IgGl, IgG3 nebo IgG4. Tato konstantní doména nebo tyto konstantní domény nebo její fragment či jejich fragmenty mohou být odvozeny od těžkého nebo lehkého řetězce nebo od obou takových řetězců. Vynález zahrnuje mutace v imunoglobulinové složce, které eliminují nežádoucí vlastnosti přirozeně se vyskytujícího imunoglobulinu, jako je vázání Fc receptoru a/nebo zavedení požadovaných vlastností, jako je stabilita. Například S. Angal, D. J. King, M. W. Bodmer, A. Turner, A. D. G. Lawson, G. Robens, B. Pedley a R. Adair v Molecular Immunology, sv.
30, str. 105 až 108 (1993) popisují IgG4 molekulu, kde zbytek 241 (Kabatovo číslování) se změní ze šeřinu na prolin. Tato změna zvyšuje poloviční dobu existence IgG4 molekuly v seru. S. M. Canfield a S. L. Morrison v Journal of Experimental Medicine, sv. 173, str. 1483 až 1491, popisují změnu zbytku 248 (Kabatovo číslování) z leucinu na glutamát v IgG3 a z glutamátu na leucin v myším IgG2b. Substituce leucinu za glutamát v dříve jmenovaném případě snižuje afinitu imunoglobulínové molekuly týkající se Fct RI receptorů a substituce leucinu za glutamát v pozdějším případě zvyšuje afinitu.
EP 0 307 434 uvádí různé mutace včetně mutací L až E na zbytku 248 (Kabatovo číslování) v IgG.
Konstantní doména nebo domény nebo její či jejich fragment jsou výhodně celé nebo podstatné části konstantní oblasti těžkého řetězce lidského IgG, výhodněji IgG4.
Z jednoho hlediska IgG složka sestává z CH2 nebo CHg domén a pantová oblast IgGl zahrnuje cysteinové zbytky přispívající k středně těžkému řetězci disulfidové vazby, například zbytky 11 a 14 IgGl pantové oblasti [B. Frangione a C. Milstein, Nátuře, sv. 216, str. 939 až 941 (1967)]. Výhodně IgGl složka sestává z aminokyselin odpovídajících zbytkům 1 až 4 a 6 až 15 pantu, 1 až 110 CH2 a 1 až 107 CHg IgGl, které popsal J. Ellison, B. Berson a L. E. Hood v Nucleic Acids Research, sv. 110, str. 4071 až 4079 (1982). Zbytek 5 pantu je změněn z cysteinu v publikované IgGl sekvenci na alanin změnou TGT na GCC v nukleotidové sekvenci. Z jiného hlediska IgG složka je odvozena od IgG4, který zahrnuje CH2 a CH3 domény a pantovou oblast, zahrnující cysteinové zbytky přispívající k středně těžkému řetězci disulfidové vazby, například zbytky 8 a 11 IgG4 pantové oblasti [J. R. Piek a C. Milstein,
Nátuře, sv. 216, str. 941 až 942 (1967)]. Výhodně IgG4 složka sestává z aminokyselin odpovídajících zbytkům l až 12 pantu, až až 110 CH2 a 1 až 107 CH3 IgG4, jak popsal J. Ellison,
J. Buxbaum a L. Hood v DNA, sv. 1, str. 1 až 18 (1981).
V jednom příkladu vhodná mutace v IgG4, zbytek 10 pantu (zbytek 241, Kabatovo číslování), se mění ze šeřinu (S) v divokém typu na prolin (P) a zbytek 5 CH2 (zbytek 248, Kabatovo číslování) se mění z leucinu (L) v divokém typu na glutamát (E).
Fúze IL4 mutanty nebo varianty k Ig konstantní doméně nebo fragmentu se dosahuje C-koncovou skupinou jedné složky k N-koncové skupině jiné složky. Výhodně IL4 mutanta nebo varianta je fúzována přes svou C-koncovou skupinu k N-koncové skupině Ig konstantní domény nebo fragmentu.
Z výhodného hlediska sekvence aminokyseliny fúzovaného proteinu podle tohoto vynálezu je představována SEQ ID č. 4, SEQ ID č. 7 nebo SEQ ID č. 10.
Z dalšího hlediska tento vynález poskytuje sloučeninu podle tohoto vynálezu, kde způsob její přípravy zahrnuje exprimování DNA kódující tuto sloučeninu v rekombinantní hostitelově buňce a získání produktu.
DNA polymer zahrnující nukleotidovou sekvenci, který kóduje sloučeninu, také tvoří část tohoto vynálezu.
Při výhodném znaku DNA polymer zahrnuje dále uvedenou sekvenci nebo sestává ze sekvence SEQ ID č. 3, SEQ ID č. 6 nebo SEQ ID č. 9.
Způsob podle tohoto vynálezu může zahrnovat obvyklý rekombinantní technický postup, jako popisuje Maniatis a kol. v Molecular Cloning - A Laboratory Manual Cold Spring Harbor (1982) a DNA Cloning, sv. I, II a III (D. M. Glover, vyd.,
IRL Press Ltd).
Způsob může obzvláště zahrnovat stupně, které spočívají v tom, že
i) připraví se replikovatelný expresní vektor, který je schopen v hostitelově buňce exprimovat DNA polymer sestávající z nukleotidové sekvence, která kóduje tuto sloučeninu, ii) hostitelova buňka se transformuje tímto vektorem, iii) transformovaná hostitelova buňka se kultivuje za podmínek, které dovolují expresi tohoto DNA polymeru, k produkci uvedené sloučeniny a iv) získá se tato sloučenina.
Vynález také poskytuje způsob přípravy DNA polymeru kondenzací vhodných mono-, di- nebo oligomerních nukleotidových skupin.
Příprava se může provádět chemicky, enzymaticky nebo kombinací obou metod, in vitro nebo in vivo, jak je vhodné. Tak DNA polymer se může připravit enzymatickou ligací vhodných DNA fragmentů obvyklými způsoby, jako popsal D. M. Roberts a kol. v Biochemistry, 24, 5090-5098 (1985).
DNA fragmenty se mohou dostat štěpením DNA obsahující požadované sekvence nukleotidů vhodnými restrikčními enzymy, chemickou syntézou, enzymatickou polymerací na DNA nebo RNA maticích nebo kombinací těchto způsobů.
Štěpení s restrikčními enzymy se může provádět ve vhodném pufru za teploty od 20 do 70 °C, obvykle v objemu 50 μΐ nebo méně s 0,1 až 10 μg DNA.
Enzymatická polymerace DNA se může provádět in vitro za použití DNA polymerázy, jako je DNA polymeráza I (Kelenowův fragment) ve vhodném pufru, který obsahuje podle potřeby nukleosid trifosfáty dATP, dCTP, dGTP a dTTP, za teploty od 10 do 37 °C, obvykle v objemu 50 μΐ nebo méně.
Enzymatická ligace DNA fragmentů se může provádět za použití DNA ligázy, jako je T4 DNA ligáza, ve vhodném pufru za teploty od 4 °C do teploty místnosti, obvykle v objemu 50 μΐ nebo méně.
Chemická syntéza DNA polymeru nebo fragmentů se může provádět za použití chemických postupů běžných pro fosfotriestery, fosfity nebo fosforamidity, při využití technického postupu na tuhé fázi, jako je popsán v Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual (vyd. H. G. Gassen a A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982), nebo v jiných vědeckých publikacích, jako je například M. J. Gait, H. W. D. Matthes, M. Singh, B. S. Sproat a R. C. Titmas, Nucleic Acids Research, 10, 6243 (1982),
B. S. Sproat a W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 24, 5771 (1983), M. D. Matteucci a Μ. H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 21, 719 (1980), M. D. Matteucci a Μ. H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 103. 3185 (1983),
S. P. Adams a kol., Journal of the American Chemical Society, 105, 661 (1983), N. D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus a H. Koester, Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984) a H. W. D. Matthes a kol., EMBO Journal, 3., 801 (1984). Výhodně se používá automatizovaný DNA syntetizér.
DNA polymer se výhodně připravuje ligací dvou nebo více DNA molekul, které dohromady zahrnují DNA sekvenci kódující sloučeninu. Zvláštní způsob podle tohoto vynálezu zahrnuje ligaci první DNA molekuly, kódující uvedenou IL4 mutantu nebo variantu, a druhé DNA molekuly, kódující uvedenou imunoglobulínovou doménu nebo její fragment.
DNA molekuly se mohou získat štěpení vhodnými restrikčními enzymy vektorů, které nesou požadované kódující sekvence, nebo použitím reakční technologie založené na polymerázovém řetězci.
Přesná struktura DNA molekul a způsob, kterým se získají, závisí na struktuře požadovaného produktu. Návrh vhodné strategie pro konstrukci DNA molekuly kódující pro sloučeninu je běžnou věcí pro odborně vzdělaného pracovníka v oboru.
Exprimování DNA polymeru kódujícího sloučeninu v rekombinantní hostitelově buňce se může provádět pomocí replikovatelného expresního vektoru, který je schopen v hostitelově buňce exprimovat DNA polymer. Expresní vektor je nový a také tvoří část tohoto vynálezu.
Replikovatelný expresní vektor se může připravit podle tohoto vynálezu štěpením vektoru kompatibilního s hostitelovou buňkou, aby se dostal lineární DNA segment, který má neporušený replikon, a kombinací tohoto lineárního segmentu s alespoň jednou DNA molekulou, dohromady s uvedeným lineárním segmentem, kóduje sloučeninu za podmínek ligace.
Ligace lineárního segmentu a více než jedné DNA molekuly se může provádět současně nebo postupně, jak je požadováno.
Tak DNA polymer může být získán nebo vytvořen během konstrukce vektoru, jak je potřebné.
Volba vektoru bude z části určena hostitelovou buňkou, která může být prokaryotická, jako je E. coli, nebo eukaryotická, jako je C127, myší myelom, vaječník čínského křečka nebo Hela buňky, houby, například vláknité houby nebo nebuněčné kvasinky nebo buňky hmyzu, jako je Drosophila. Hostitelova buňka může být také z transgenního zvířete. Mezi vhodné vektory se zahrnují plasmidy, bakteriofágy, kosmidy a rekombinantní viry. odvozená například od bacilovirů, vakcín nebo Semliki Forest viru.
Příprava replikovatelného expresního vektoru se může provádět obvykle s vhodnými enzymy pro restrikci, polymerací a ligaci DNA, způsoby, které popsal například Maniatis a kol., citováno výše. Polymerace a ligace se mohou provádět jak je svrchu uvedeno pro přípravu DNA polymeru. Štěpení . restrikčních enzymu se může dosahovat ve vhodném pufru za teploty od 20 do 70 °C, obvykle v objemu 50 μΐ nebo méně, s 0,1 až 10 μg DNA.
Rekombinantní hostitelova buňka se podle tohoto vynálezu připravuje transformací hostitelovy buňky replikovatelným expresním vektorem podle vynálezu za transformačních podmínek. Vhodné transformační podmínky jsou běžné a popsal je například Maniatis a kol., citováno výše, nebo DNA Cloning, sv. II, vyd. D. M. Glover, IRL Press Ltd. (1985) .
Volba transformačních podmínek je určena hostitelovou buňkou. Tak bakterie jako host, například jako je E. coli, se může zpracovat s roztokem chloridu vápenatého [Cohen a kol., Proč. Nat. Acad. Sci.,69, 2110 (1973)] nebo s roztokem směsi chloridu rubidného, chloridu manganatého, octanu draselného a glycerolu a potom s kyselinou 3-(N-morfolino)propansulfonovou, chloridem rubidným a glycerolem. Buňky savců v kultuře se mohou trasformovat společným srážením vápníkem z vektoru DNA v buňkách.
Vynález je také rozšířen na hostitelovu buňku transformovanou replikovatelným expresním vektorem podle tohoto vynálezu.
Kultivace transformované hostitelovy buňky za podmínek dovolujících expresi DNA polymeru se provádí běžným způsobem, jak popisuje například Maniatis a kol., DNA Cloning, citováno výše. Tak buňka se výhodně dodává s živnou látkou a kultivuje za teploty pod 45 °C.
Produkt exprese se dostává obvyklými způsoby podle hostitelovy buňky. Když je hostitelovou buňkou bakterie, jako je E. coli, může být lyofilizována fyzikálně, chemicky nebo enzymaticky a proteinový produkt se izoluje z výsledného lyzátu. Pokud produkt má být segregován z buňky bakterie, může se dostávat z periplasmového prostoru nebo živného prostředí. Jestliže hostitelovou buňkou je savec, produkt se může běžně izolovat z živného prostředí.
DNA polymer se může sestavit do vektorů určených pro izolaci stabilních transformovaných savčích buněčných linií exprimujících produkt. Například hovězí papilimavirusové vektory nebo amplifikované (rozšířené) vektory buněk vaječníku čínského křečka [DNA Cloning, sv. II, vyd. D. M. Glover, IRL Press (1985), R. J. Kaufman a kol., Molecular a Cellular Biology, 5, 1750-1759 (1985), G. N. Pavlakis a D.
H. Hamer, Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 80 , 397-401 (1983) a D. V. Goeddel a kol., evropská patentová přihláška č. 0 093 619 (1983)].
Sloučeniny podle tohoto vynálezu mají IL4 a/nebo IL13 antagonistickou aktivitu, a proto mají potenciální použití při ošetřování stavů vyplývajících z nežádoucího účinku IL4 a/nebo IL13, jako jsou alergické choroby zprostředkované IgE, stavy autoimunity zprostředkované T buňkami nebo chronické mikrobiální infekce.
Tento vynález proto dále poskytuje farmaceutický prostředek, který obsahuje sloučeninu podle tohoto vynálezu a farmaceuticky přijatelnou nosnou látku.
Při použití se sloučenina obvykle bude využívat ve formě farmaceutického prostředku, společně s farmaceutickou nosnou látkou, ředidlem a/nebo pomocnou látkou, které jsou vhodné pro člověka, třebaže přesná forma prostředku bude záviset na způsobu podání. Sloučenina může být například použita ve formě aerosolu nebo rozstřikovaného roztoku pro inhalaci nebo sterilních roztoků pro parenterálnímu podání.
Dávková rozmezí pro podání sloučenin podle tohoto vynálezu jsou taková, že vedou k dosažení požadovaného účinku na stav zprostředkovaný IL4 a/nebo IL13, například kdy stavy zprostředkované IgE protilátkou se snižují nebo se zastavuje nebo obrací postup autoimunitních chorob. Dávka se bude obvykle měnit s věkem, rozsahem nebo závažností stavu léčení a kontraindikacemi, pokud se nějaké vyskytují. Jednotková dávka se může měnit do méně než 1 mg do 300 mg, ale obvykle bude v oblasti do 1 do 20 mg na dávku, v jedné nebo několika dávkách, jaké jedné až šesti dávkách za den, takže denní dávka je v rozmezí od 0,02 do 40 mg/kg.
Prostředky vhodné pro injekce mohou být ve formě roztoků, suspenzí nebo emulzí, nebo suchých prášků, které se rozpouštějí nebo suspendují ve vhodném vehikulu před použitím.
Kapalné formy jednotkové dávky se připravují za použití sloučeniny a sterilního pomocného prostředku, který neobsahuje pyrogenní látky. Sloučenina v závislosti na vehikulu a použité koncentraci, se může bud rozpustit nebo suspendovat ve vehikulu. Roztoky se mohou použít pro všechny formy parenterálního podání a obzvláště se používají pro intravenózní infekce. Při přípravě roztoků se sloučenina může rozpustit ve vehikulu, roztok se upraví, aby byl isotonický, pokud je zapotřebí, přidáním chloridu sodného a sterilizuje se filtrací přes sterilní filtr za použití aseptického technického postupu před naplněním do vhodných sterilních lékovek nebo ampulí a jejich neprodyšným uzavřením. Podle jiného provedení, pokud je stabilita roztoku přiměřená, roztok v uzavřených zásobnicích se může sterilizovat autoklávováním. Výhodně se ve vehukulu mohou rozpustit přísady, jako jsou pufrující, solubilizační, stabilizační, konzervační nebo baktericidní, suspendační nebo emulzifikační přípravky a/nebo lokální anestetické přípravky.
Suché prášky, které se rozpouštějí nebo suspendují ve vhodném vehikulu před použitím, se mohou připravit naplněním předem sterilizované léčivé látky a jiných složek do sterilního zásobníku, za použití aseptických technických podmínek ve sterilním prostoru. Podle dalšího provedení se léčivo a jiné složky mohou rozpustit ve vodném prostředí, vzniklý roztok se sterilizuje filtrací a rozdělí do vhodných zásobníků za použití aseptického technického postupu ve sterilní prostoru. Produkt se potom suší vymražováním a zásobníky se neprodyšně uzavřou za aseptických podmínek.
Parenterální suspenze, vhodné pro intramuskulární, subkutánní nebo intradermální injekci, se připravují v podstatě stejným způsobem, jako je uveden výše, s tím rozdílem, že se sterilní sloučenina suspenduje ve sterilním vehikulu, na místo toho, aby se rozpustila, a sterilizace nemusí být doprovázena filtrací. Sloučenina se může izolovat ve sterilním stavu nebo alternativně se může sterilizovat po izolaci, například ozařováním τ paprsky. Výhodně se do prostředku zahrnuje suspendační přípravek, například polyvinylpyrrolidon, aby se usnadnilo rovnoměrné rozdělení sloučeniny.
Prostředky vhodné k podávání respiračním traktem zahrnují aerosoly, roztoky umožňující rozprášení nebo mikrojemné prášky pro insuflaci. V posledně uvedeném případě je výhodná velkost částic menší než 50 μπι, obzvláště menší než 10 μιη. Takové prostředky se mohou připravovat obvyklým způsobem a používají se ve spojení s obvyklým zařízením pro podávání.
Z dalšího hlediska se vynález týká způsobu ošetřování stavů vyplývajících z nežádoucích účinků IL4 a/nebo IL13, který spočívá v tom, že se poškozenému podává účinné množství sloučeniny podle tohoto vynálezu.
Vynález se dále týká sloučeniny podle tohoto vynálezu k použití jako aktivní terapeutická látka, obzvláště pro ošetřování stavů vyplývajících z nežádoucích účinků IL4 a/nebo IL 13.
Vynález také poskytuje použití sloučeniny podle tohoto vynálezu při přípravě léčiva pro ošetřování stavů vyplývajících z nežádoucích účinků IL4 a/nebo IL 13.
Neočekávané toxikologické účinky se nepředpokládají, pokud se sloučeniny podle tohoto vynálezu podávají v souladu s tímto vynálezem.
Příklady provedení vynálezu
Dále zařazené příklad ilustrují tento vynález.
Příklad 1
IL4.Y124D/IgGl fúzovaný protein
Popisuje se konstrukce IL4.Y124D/IgGl chimérní cDNA, exprese odpovídajícího proteinu v expresním systému savce a jeho aktivita.
1. Konstrukce DNA kódující pro fúzovaný protein
a) Konstrukce IL4.Y124D kódující oblasti
Varianta lidského IL4 genu, kterou popsal N. Kruše, H. P. Tony a W. Sebald ve EMBO Journal, 11, 3237 (1992), ve které zbytek 124 v proteinu je pozměněn z tyrosinu v divokém typu na kyselinu asparagovou, se připraví PCR mutagenezí lidské IL4 cDNA (lze zakoupit od British Biotechnology). IL4.Y124D cDNA se inzeruje do expresního vektoru pTR3l2, za použití míst HindlII a BglII [M. J. Browne, J. E. Carey,
C. G. Chapman, A. W. R. Tyrrell, C. Entwisle, G. Μ. P. Lawrence, B. Reavy, I. Dodd, A. Esmail a J. H. Robinson, Journal of Biological Chemistry, 263, 1599 (1988)], za vzniku plasmidu pDB906.
K rozšíření IL4.Y124D molekuly a připojení obvyklých restrikčních míst na každém konci pro subklonování se provede PCR reakce za použití 20 ng pDB906 plasmidu jako substrátu. PCR priméry jsou určeny k zavedení restrikčních enzymových míst, lemovaných 10 až 15 páry bází nukleotidů k zakotvení primérů na každém konci. Sekvence primérů se uvádějí dále:
1) 5' CGA ACC ACT GAA TTC CGC ATT GCA GAG ATA 3' (zahrnuje EcoRI restrikční místo, GAATTC)
2) 5' CAC AAA GAT CCT TAG GTA CCG CTC GAA CAC TIT GA 3 ' (zahrnuje KpnI restrikční místo, GGTACC)
Priméry se použijí v konečné koncentraci 5 ng/μΐ a přidává se dNTP do konečné koncentrace 0,2 mM v celkovém reakčním objemu 100 μΐ. Provede se 31 cyklus PCR. Cykly sestávají z denaturačního stupně za teploty 94 °C v trvání 1 minuty, anelačního stupně za teploty 50 °C během 1 minuty a 30 sekund a elongačního stupně za teploty 72 °C po dobu 1 minuty a 30 sekund. Cyklus jedné denaturace se prodlouží na 5 minut a konečný cyklus elongace se prodlouží na 7 minut.
Při PCR reakci se použije 2,5 jednotek enzymu Taq polymerázy od firmy Advanced Biotechnologies. Připraví se PCR produkt 587 bp. Ten se vyčistí za použití soupravy Promega Magie PCR Cleanup a potom štěpení s EcoRI a KpnI v reakčním pufru 4 (všechny restrikční enzymy se dostanou od firmy GibcoBRL.), k vytvoření kohezních konců. Po uplynutí 4 hodin a 30 minut za teploty 37 °C se reakční směs zahřívá na teplotu 70 °C po dobu 10 minut a potom se sráží ethanolem. Analýza výsledné DNA agarózovou gelovou elektroforézou ukazuje přítomnost tří pásů, přibližně 570 bp, 463 bp a 100 bp. 570 bp fragment představuje plnou délku IL4.Y124D varianty IL4 a je přítomen, protože štěpení je neúplné. Dva menší fragmenty se připraví v důsledku přítomnosti EcoRI místa v IL4.Y124D cDNA. 570 bp pás se čistí postupem Geneclean™ a liguje v BluescriptKS1™, který se připraví štěpením s EcoRI a s KpnI a posléze s Geneclean™. Tak se vytvoří BluescriptKS+/IL4.Y124D rekombinant. Větší množství tohoto rekombinantu DNA se připraví použitím způsobu Magie Maxiprep. IL4.Y124D inzert se excizuje z Bluescript rekombinantu za použití Smál a KpnI. 20 μg rekombinantu DNA se inkubuje s 25 jednotkami Smál v reakčním pufru 4 za teploty 30 °C přes noc. Potom se přidá 25 jednotek KpnI ke štěpení a vše se inkubuje za teploty 37 °C po dobu 5 hodin. Výsledný fragment o přibližně 580 bp se čistí pomocí Geneclean™, k vytvoření IL4.Y124D/SmaI/KpnI fragmentu.
b) Konstrukce IgGl kódující oblasti
COSFcLink vektor (tabulka 1) obsahuje lidskou IgGl cDNA kódující aminokyseliny 1-4 a 6-15 pantu, 1-110 CH2 a 1-108 CH3, jak popsal J. Ellison, B. Berson a L. E. Hood v Nucleic Acids Research, sv. 10, str. 4071 až 4079 (1982). Zbytek 5 pantu se změní z cysteinu v publikované IgGl sekvenci na alanin změnou TGT na GCC v nukleové sekvenci.
Tato látka se klonuje z lidské leukemické ARH-77 buňky IgG plazmy (American Type Tisue Collection), za použití RT-PCR a plně se sekvencuje, k potvrzení identity s publikovanou sekvencí (zveřejněná patentová přihláška W092/00985).
Konstrukce COSFc začne s pUC18 vektorem obsahujícím lidský IgGl cDNA popsaný výše (pUC18-Fc), který se štěpí s KpnI a SacII a podrobí deleci CH3, pant a část CH2. Oblast delece se nahradí PCR rozšířeným fragmentem, který obsahuje oblast pant-CH2. Používá se těchto PCR primérů:
5' TCG AGC TCG GTA CCG AGC CCA AAT CGG CCG ACA AAA CTC ACA C 3 ' a
5' GTA CTG CTC CTC CCG CGG CTT TGT CTT G 3'
DNA fragment obsahující oblast pant-CH2 se rozšíří z pUC18-Fc, štěpí s KpnI a SacII, čistí na gelu a klonuje v KpnI/SacII štěpeném pUC18-Fc vektoru. Cys, který je umístěn v poloze 230 [Kabatovo číslování, Kabat a kol., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. vyd., US Department of Health a Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)] IgGl těžkého řetězce, se změní na Ala přes TGT k GCC substituci v nukleotidové sekvenci. Změněná DNA sekvence v jednom z PCR primérů zahrnuje jedinečné místo KpnI na 5' konci pantu. Tento výsledný plasmid se označuje pUC18Fcmod a spojení a PCR rozšířená oblast se sekvencují pro ověření.
Celý pant-CH2-CH3 inzert v pUC18-Fcmod se odstraní v jediném DNA fragmentu s KpnI a Xbal, čistí na gelu a liguje do SFcRlCos4 řezu s KpnI a Xbal k vytvoření COSFc.
SFcRlCos4 je odvozen od pST4DHFR [K. Deen, J. S. McDougal, R. Inacker, G. Folena-Wasserman, J. Arthos, J.
Rosenberg, P. J. Maddon, R. Axel a R. W. Sweet, Nátuře, 331, 82 (1988)] a obsahuje rozpustný typ Fc receptorů (SFcRl) inzerovaný mezi promotor cytomegaloviru (CMV) a polyadenylač ní oblasti hovězího růstového hormonu (BGH) a také obsahuje dihydrofolát reduktázu (DHFR) cDNA inzerovanou mezi β-globinový promotor a SV40 prolyadenylační oblasti, SV40 původu z replikace a gen resistentní k ampicilinu pro růst bakterií. Řezem vektoru s KpnI a Xbal se odstraní sFcRl kódující oblast, takže COSFc vektor obsahuje pant-CH2~CH3 oblast inzerovanou mezi CMV promotor a BGH polyA oblast.
COSFcLink vektor se připraví z COSFc inzerováním oligonukleotidového spojovníku v jedinečném EcoRI místě vektoru, který znovu vytvoří toho EcoRI místo a také zavede BstEII, Pstl a EcoRV klonující místa. Používají se tyto oligonukleotidy:
5' AAT TCG GTT ACC TGC AGA TAT CAA GCT 3'
3' GCC AAT GGA CGT CTA TAG TTC GAT TAA 5'
Spojení se sekvencuje k ověření orientace vektoru. Velikost konečného vektoru odpovídá 6,37 bp.
c) Konstrukce DNA kódující pro fúzovaný protein
K inzerování IL4.Y124D cDNA se COSFcLink vektor připraví štěpením s EcoRV a KpnI takto: 5 μΐ DNA se inkubuje s 15 jednotkami EcoRV v react 2 za teploty 37 °C po dobu 5 hodin a potom se provede srážení ethanolem. Výsledná DNA se štěpí s KpnI v react 4 za teploty 37 °C po dobu 3 hodin a potom se provede vysrážení ethanolem. IL4.Y124D/SmaI/KpnI a COSFcLink/EcoRV/KpnI fragmenty se ligují dohromady za vzniku plasmidu pDB951, který kóduje IL4.Y124D/IgGl fúzovaný protein. Ligace se dosahuje za použití soupravy Amersham DNA Ligation (kódové označení produktu RPN 1507) a reakční směs se inkubuje za teploty 16 °C přes noc. Produkty ligační reakce se transformují do Promega JM109 kompetičních buněk (vysoká účinnost) a umístí do na agar Luria Broth, který obsahuje 50 μg/ml ampicilinu. Transformanty se kultivují v Luria Broth, s obsahem 50 μg/ml ampicilinu, a DNA připraví za použití Promega Magie Minipreps. Produkce IL4.Y124D/COSFcLink rekombinantní DNA se ověří restrikčním štěpením a DNA sekvencováním. Úplná sekvence IL4.Y124D a spojení s COSFcLink DNA se potvrdí DNA sekvencováním (tabulka 2). Kódující sekvence rekombinantní IL4.Y124D/IgGl DNA je uvedena v tabulce 3 a sekvence aminokyseliny fúzovaného proteinu je znázorněna v tabulce 4.
IL4.Y124D/COSFcLink rekombinantní DNA se připraví a čistí za použití gradientu chloridu česného a DNA se použije k dočasně transfekovaným HeLa buňkám.
2. Exprese fúzovaného proteinu
HeLa buňky rostou v MEMa prostředí (Gibco) s 10% fetálním telecím šerem a 1% glutaminem. Pro test se naočkuje 1 x 106 HeLa buněk v 15 ml prostředí RPMI-1640 s 10 % neonatálního telecího sera a 1 % glutaminu (očkovací prostředí) do baňky o objemu 75 ml čtyři dny před transfekcí. V den před transfekcí se do každé baňky přidá dalších 12,5 ml očkovacího prostředí. V den transfekce se prostředí změní na 15 ml transfekčního prostředí (MEM prostředí s Earleovými solemi, s obsahem 10 % neonatálního telecího sera a 1 % neesenciálních aminokyselin) v čase nula. V čase +3 hodiny se k buňkám přidá 25 μg příslušné DNA v 0,125 M chloridu vápenatého a 1 x HBS (HEPES pufrovaný fyziologický roztok). V čase +7 hodin se buňky podrobí glycerolovému šoku (15 % objem/objem) a potom ponechají inkubovat přes noc v 12,5 ml očkovacího prostředí, které obsahuje 5 mM butyrátu sodného. Následujícího dne se buňky promyjí PBS (Dulbeccoův fosfátem pufrovaný fyziologický roztok) a přidá se 12,5 ml sklizňového prostředí (harvest medium, RPMI-1640 s 2 a 7,5 % zásobního roztoku hydrogenuhličitanu sodného). Po dalších 24 hodinách inkubace se supernatanty odstraní, odstředí při frekvenci otáček 1000 za minutu během 5 minut, k odstranění zbytků buněk, a skladují buď za teploty 4 °C nebo za teploty -20 °C.
3. Biologická aktivita
Pro testování supernatantu na IL4 antagonistickou aktivitu se použije způsobu, který popsal Spits a kol. v J. Immunology, 139, 1142 (1987), kdy se lymfocyty lidské periferní krve inkubují po dobu 3 dnů s fytohemaglutinem,
T buněčným mitogenem, k regulaci IL4 receptoru. Výsledné balastní buňky se potom stimulují další tři dny s IL4. Proliferace se měří inkorporací 3H thymidinu.
IL4.Y124D/IgGl chiméra inhibuje inkorporací 3H thymidinu lymfocyty lidské periferní krve, stimulovanými 133 pM IL4 v dávce závislé na způsobu.
Příklad 2
IL4.Y124D/IgG4 fúzovaný protein
1. Konstrukce DNA kódující pro fúzovaný protein
PCR slouží k rozšíření IL4.Y124D kódující oblasti a zavedení tiché nukleotidové substituce na 3' konci, co vede k vytvoření Xhol místa. Jako substrát pro PC4R reakci se použije 20 ng linearizovaného pDB951 plasmidu (příklad l.l(c)). Používají se tyto oligonukleotidové priméry:
1) 5' CAC AAG TGC GAT ATC ACC TTA CAG GAG ATC 3' (zahrnuje EcoRV restrikční místo, GATATC)
2) 5' CTC GGT ACC GCT CGA GCA CTT TGA GTC TTT 3' (zahrnuje Xhol restrikční místo, CTCGAG).
Druhá PCR reakce slouží k rozšíření pant-CH2~CH3 fragmentu lidského IgG4 těžkého řetězce. Substrátem pro tento případ je syntetická lidská IgG4 cDNA s těžkým řetězcem, které sekvence je popsána v tabulce 5, a která je založena na Genbank sekvenci GB:HUMIGCD2 [J. Ellison, J. Buxbaum a L. E. Hood, DNA, 1, 11-18 (1981)]. S publikovanou nukleotidovou sekvencí se provede řada tichých substitucí. Gen se sestaví kombinováním dvou 0,5 kb syntetických DNA fragmentů. Každý 0,5 kb fragment se připraví anelováním řad překrývajících se oligonukleotidů a potom se vnese do mezer pomocí PCR. Dva 0,5 kb fragmenty se spojí v SacII místě a inzerují do pCR2 vektoru. 1,0 kb Apal-BglII fragment obsahující celou konstantní oblast se izoluje a liguje do expresního vektoru, pCD, který obsahuje lidskou IL4 specifickou variabilní oblast. Tento konstrukt se použije jako PCR substrát k rozšíření pant-CH2-CH3 oblasti IgG4.
Použité oligonukleotidové priméry pro rozšíření IgG4 pant-CH2-CH3 oblasti jsou tyto:
1) 5' GGT GGA CAA CTC GAG CGA GTC CAA ATA TGG 3' (zahrnuje Xhol restrikční místo, CTCGAG)
2) 5' TTA CGT AGA TCT AGA CTA CAC TCA TTT ACC 3’ (zahrnuje Xbal restrikční místo, TCTAGA).
Podmínky pro obě PCR reakce jsou popsány pro derivát pDB951. Uvedeno v krátkosti, použije se priméru v koncentraci 5 ng/μΐ a dNTP při konečné koncentraci 0,2 mM v celkovém reakčním objemu 100 μΐ. Použijí se 2,5 jednotky enzymu Taq polymeráza od firmy Advanced Biotechnologies a provede se 31 cyklus PCR. Cykly sestávají z denaturačního stupně za teploty 94 °C v trvání 1 minuty, anelačního stupně za teploty 50 °C během 1 minuty a 30 sekund a elongačního stupně za teploty 72 °C po dobu 1 minuty a 30 sekund. Cyklus jedné denaturace se prodlouží na 5 minut a konečný cyklus elongace se prodlouží na 7 minut.
Dostanou se PCR produkty o přibližně 700 bp (pant-CH2-CH33 IgG4) a 400 bp (IL4.Y124D) a čistí se za použití soupravy Promega Magie PCR Cleanup. Čištěný PCR reakčni produkt se potom štěpí s dále uvedenými enzymy k vytvoření kohezních konců: Xhol a Xbal pro IgG4 a EcoRV a Xhol pro IL4-Y124D. Štěpené látky se inkubují za teploty 37 °C po dobu 3 hodin a potom se provede vysrážení ethanolem. Výsledná DNA se analyzuje gelovou elektroforézou a poskytne velikosti přibližně 690 bp (pant-CH2-CH3 IgG4) a 370 bp (IL4.Y124D).
Připraví se vektor, do kterého se ligují pant-CH2-CH3 IgG4 a IL4.Y124D PCR fragmenty štěpením pDB951 (IL4.Y124D v COSFcLink) s EcoRV a Xbal, k odstranění většiny IL4.Y124D/IgGl fúzované molekuly. Pouze zbývající část je přibližně 75 bp na 5' konci IL4, který není přítomen v IL4.Y124D EcoRV/Xhol fragmentu produkovaném rozšířením PCR.
μ9 pDB951 DNA se štěpí v celkovém objemu 30 μΐ za použití react 2 pufru (GibcoBRL). Výsledný 5,8 kb DNA fragment se čisti za použiti postupu Geneaclean .
Tři popsané fragmenty (IL4.Y124D EcoRV/Xhol, pant-CH2-CH3 IgG4 Xhol/Xbal a 5,8 kb fragment získaný z EcoRV/Xbal štěpením pDB951) se ligují dohromady za vzniku plasmidu pDB952, který kóduje IL4.Y124D/IgG4 fúzovaný protein. Ligace se provádí za použití DNA ligační soupravy od firmy Amersham (kód produktu RPN 1507) a reakční směs se inkubuje za teploty 16 °C přes noc. Produkty ligační reakce se transformují do Promega JM109 kompetičních buněk (vysoká účinnost) a umístí na agaru Luria Broth, který obsahuje 50 μg/ml ampicilinu. Transformanty se kultivují v Luria Broth (obsahujícím 50 μΐ/mg ampicilinu) a DNA připraví za použití Promega Magie Minipreps. Produkce IL4.Y124D/IgG4 rekombinantní DNA se ověří restrikční štěpením a úplné IL4.Y124D a pant-CH2-CH3 oblasti se ověří DNA sekvencováním. Tabulka popisuje sekvenci kódující oblasti pouze IL4.Y124D/IgG4 fúzované molekuly a tabulka 7 obsahuje sekvenci aminokyseliny fúzovaného proteinu. IL4.Y124D/IgG4 rekombinantní DNA se připraví a čistí za použití gradientu chloridu česného. DNA se použije k dočasné transfekováným HeLa buňkám.
2. Exprese fúzovaného proteinu
HeLa buňky rostou v MEMa prostředí (Gibco) s 10% fetálním telecím šerem a 1% glutaminem. Pro test se vloží 1 x 106 HeLa buněk v 15 ml prostředí RPMI-1640 s 10 % neonatálního telecího sera a 1 % glutaminu (očkovací prostředí) do baňky o objemu 75 ml čtyři dny před transfekcí. V den před transfekcí se do každé baňky přidá dalších 12,5 ml očkovacího prostředí. V den transfekce se prostředí změní na 15 ml transfekčního prostředí (MEM prostředí s Earleovými solemi, s obsahem 10 % neonatálního telecího sera a 1 % neesenciálních aminokyselin) v čase nula V čase +3 hodiny se k buňkám přidá 25 ug příslušné DNA v 0,125 M chloridu vápenatého a 1 x HBS (HEPES pufrovaný fyziologický roztok). V čase +7 hodin se buňky podrobí glycerolovému šoku (15 % objem/objem) a potom nechají inkubovat přes noc v 12,5 ml očkovacího prostředí, které obsahuje 5 mM butyrátu sodného. Následujícího dne se buňky promyjí PBS (Dulbeccoův fosfátem pufrovaný fyziologický roztok) a přidá se 12,5 ml sklizňového prostředí (harvest medium, RPMI-1640 se 2 a 7,5 % zásobního roztoku hydrogenuhličitanu sodného). Po dalších 24 hodinách inkubace se supernatanty odstraní, odstředí při frekvenci otáček 1000 za minutu během 5 minut, k odstranění zbytků buněk, a skladují buď za teploty 4 °C nebo za teploty -20 °C.
3. Biologická aktivita
Pro testování supernatantu na IL4 antagonistickou aktivitu se použije způsobu, který popsal Spits a kol. v J. Immunology, 139. 1142 (1987), kdy se lymfocyty lidské periferní krve inkubují po dobu 3 dnů s fytohemaglutinem,
T buněčným mitogenem, k regulaci IL4 receptorů. Výsledné balastní buňky se potom stimulují další tři dny s IL4. Proliferace se měn inkorporaci H thymidinu.
IL4.Y124D/IgGl chiméra inhibuje inkorporaci 3H thymidinu lymfocyty lidské periferní krve stimulovanými 133 pM IL4 v dávce závislé na způsobu.
Příklad 3
IL4.Y124D/IgG4 PE fúzovaný protein
1. Konstrukce DNA kódující pro fúzovaný protein
PCR slouží k rozšíření IL4.Y124D kódující oblasti a zavedení tiché nukleotidové substituce na 3' konci, co vede k vytvoření Xhol místa, jak je popsáno v příkladu 2.
Druhá PCR reakce se provádí k rozšíření pant-CH2~CH3 fragmentu PE varianty lidského IgG4 těžkého řetězce. V IgG4 PE je zbytek 10 pantu (zbytek 241, Kabatovo číslování) změněn ze šeřinu (S) v divokém typu na prolin (P) a zbytek CH2 (zbytek 248, Kabatovo číslování) je změněn z leucinu (L) v divokém typu na glutamát (E). S. Angal, D. J. King, M. W. Bodmer, A. Turner, A. D. G. Lawson, G. Roberts, B. Pedley a R. Adair v Molecular Immunology, sv. 30, str. 105 až 108 (1993) popisují IgG4 molekulu, kde zbytek 241 (Kabatovo číslování) je změněn z šeřinu na prolin. Tato změna zvyšuje poloviční dobu existence IgG4 molekul v seru.
IgG4 PE varianta se vytvoří za použití PCR mutageneze na syntetickém lidském IgG4 těžkém řetězci cDNA, popsaném v tabulce 5 a potom se liguje do pCD expresního vektoru. Jde o plasmid, který se používá jako substrát pro PCR reakci rozšiřující pant-CH2~CH3 fragment IgG4 PE. Sekvence IgG4 PE varianty je popsána v tabulce 8. Zbytky IgG4 nukleotidové sekvence, které jsou změněny k přípravě PE varianty, jsou tyto (vztaženo k tabulce 8):
zbytek 322 se mění na C v PE variantě z T v divokém typu, zbytek 333 se mění na G v PE variantě z A v divokém typu a zbytek 343-344 se mění na GA v PE variantě z CT v divokém typu.
Pro rozšíření IgG4 PE varianty pant-CH2~CH3 oblasti se použijí oligonukleotidové priméry, jako jsou popsány pro derivát pDB952.
Dostanou se PCR produkty o přibližně 700 bp (pant-CH2-CH3 IgG4 PE mutantu) a 400 bp (IL4.Y124D) a čistí se za použití soupravy Promega Magie PCR Cleanup. Vyčištěný PCR reakční produkt se potom štěpí dále uvedenými enzymy k vytvoření kohezních konců: Xhol a Xbal pro IgG4 PE a EcoRV a Xhol pro IL4.Y124D. Rozštěpené látky se inkubují za teploty 37 °C po dobu 3 hodin a potom se provede vysráží ethanolem. Výsledné DNA mají velikost přibližně 690 bp (pant-CH2-CH3 IgG4 PE) a 370 bp (IL4.Y124D).
K získání větších množství IgG4 PE varianty, pant-CH2-CH3 fragmentu a IL4.Y124D fragmentu se vyčištěné +TM a štěpené PCR produkty liguji do BluescriptKS , který je připraven štěpením bud s Xhol a Xbal pro pant-CH2-CH3 IgG4 PE fragmentu nebo EcoRV a Xhol pro IL4.Y124D fragment a potom pomocí GenecleanTN. Tak se vytvoří BluescriptKS4™/ /pant-CH2~CH3 IgG4 PE rekombinat a BluescriptKS+™/IL4.Y124D rekombinat. Větší množství těchto DNA se produkuje za použití metody Promega Magie Maxiprep. IgG4 PE pant-CH2~CH3 fragment se excituje z Bluescript rekombinantu za použití
Xhol a Xbal. Výsledný fragment o přibližně 690 bp se čistí TM
Geneclean , k vytvořeni velikého množství IgG4 PE pant-CH2-CH3 Xhol/Xbal fragmentu. IL4.Y124D fragment se excituje z Bluescript rekombinantu za použití EcoRV a Xhol a výsledný fragment o přibližně 370 bp se čistí pomocí
TM
Geneclean .
Připraví se vektor, ve kterém se liguje pant-CH2-CH3 IgG4 PE fragment a IL4.Y124D fragment štěpením pDB951 s EcoRV a Xbal, jak je popsáno pro derivát pDB952.
Tři popsané fragmenty (IL4.Y124D EcoRV/Xhol, pant-CH2-CH3 IgG4 PE varianta Xhol/Xbal a 5,8 kb fragment získávaný z EcoRV/Xbal štěpení pDB951) se ligují dohromady za vzniku plasmidu pDB953, za použití DNA ligační soupravy od firmy Amersham (kód produktu RPN 1507) a reakční směs se inkubuje za teploty 16 °C přes noc. Produkty ligační reakce se transformují do Promega JM109 kompetenčních buněk (vysoká účinnost) a umístí na agar Luria Broth, který obsahuje 50 μg/ml ampicilinu. Transformanty se kultivují v Luria Broth (obsahujícím 50 μΐ/mg ampicilinu) a DNA připravené za použití Promega Magie Minipreps. Produkce IL4.Y124D/IgG4 variantní rekombinantní DNA se ověří restrikčním štěpením a úplné IL4.Y124D a pant-CH2-CH3 variantové oblasti se ověří DNA sekvencováním. Tabulka 9 popisuje sekvenci kódující oblasti pouze IL4.Y124D/IgG4 PE fúzované molekuly a tabulka 10 obsahuje sekvenci aminokyseliny fúzovaného proteinu.
IL4.Y124D/IgG4 rekombinantní DNA se připraví a čistí za použití gradientu chloridu česného a DNA použije k dočasně transfekováným HeLa buňkám.
2. Exprese fúzovaného proteinu
HeLa buňky rostou v MEMa prostředí (Gibco) s 10% fetálním telecím šerem a 1% glutaminem. Pro test se naočkuje 1 x 106 HeLa buněk v 15 ml prostředí RPMI-1640 s 10 % neonatálního telecího sera a 1 % glutaminu (očkovací prostředí) do baňky o objemu 75 ml čtyři dny před transfekcí. V den před transfekcí se do každé baňky přidá dalších 12,5 ml očkovacího prostředí. V den transfekce se prostředí změní na 15 ml transfekčního prostředí (MEM prostředí s Earleovými solemi, s obsahem 10 % neonatálního telecího sera a 1 % neesenciálních aminokyselin) v čase nula V čase +3 hodiny se k buňkám přidá 25 μ9 příslušné DNA v 0,125 M chloridu vápenatého a 1 x HBS (HEPES pufrovaný fyziologický roztok). V čase +7 hodin se buňky podrobí glycerolovému šoku (15 % objem/objem) a potom nechají inkubovat přes noc v 12,5 ml očkovacího prostředí, které obsahuje 5 mM butyrátu sodného. Následujícího dne se buňky promyjí PBS (Dulbeccoův fosfátem pufrovaný fyziologický roztok) a přidá se 12,5 ml sklizňového prostředí (harvest medium, RPMI-1640 se 2 a 7,5 % zásobního roztoku hydrogenuhličitanu sodného). Po dalších 24 hodinách inkubace se supernatanty odstraní, odstředí při frekvenci otáček 1000 za minutu během 5 minut, k odstranění zbytků buněk, a skladují buď za teploty 4 °C nebo za teploty -20 °C.
3. Biologická aktivita
Pro testování supernatantu na IL4 antagonistickou aktivitu se použije způsobu, který popsal Spits a kol. v J. Immunology, 139, 1142 (1987), kdy se lymfocyty lidské periferní krve inkubují po dobu 3 dnů s fytohemaglutinem,
T buněčným mitogenem, k regulaci IL4 receptoru. Výsledné balastní buňky se potom stimulují další tři dny s IL4. Proliferace se měří inkorporaci H thymidinu.
IL4.Y124D/IgG4 PE chiméra inhibuje inkorporaci 3H thymidinu lymfocyty lidské periferní krve, stimulovanými 133 pM IL4 v dávce závislé na způsobu.
Příklad 4
Expresní vektor savce obsahující DNA kódující pro IL4.Y124D/ /IgG4 PE
1. Konstrukce DNA pCDN vektor (N. Aiyar, E. Baker, H.-L. Wu, P. Nambi,
R. M. Edwards, J. J. Trill, C. Ellis a D. Bergsma, Molecular and Cellular Biochemistry, 131, 75-86 (1994) obsahuje CMV promotor, polylinkerovou klonující oblast a BGH polyadenylační oblast. Tento vektor také obsahuje bakteriální gen neomycin fosfotransferázy (NEO) inzerovaný mezi β-globinový promotor a SV40 polyadenylačm oblast pro Geneticiniil selekci, DHFR selekční kazetu inzerovanou mezi β-globinový promotor a BGH polyadenylační oblast pro rozšíření methotrexátu (MTX), amplicilinový resistenční gen pro růst bakterií, a SV40 pocházející z replikace.
K inzerci IL4.Y124D/IgG4 PE cDNA se pCDN vektor připraví štěpením s Ndel a BstXl takto: 15 μg DNA se inkubuje se 30 jednotkami BstXl v react 2 (Gibco-BRL) za teploty 55 °C po dobu l hodiny a potom se provede srážení ethanolem. Výsledná DNA se štěpí Ndel v react 2 za teploty 37 °C po dobu 1 hodiny a provede vysrážení ethanolem. IL4.Y124D/IgG4 PE fragment se připraví z pDB953 (příklad 3.1) štěpením s BstXl a Ndel takto: 15 ug DNA se inkubuje se 30 jednotkami BstXl v react 2 za teploty 55 °C po dobu 1 hodiny a provede se vysrážení ethanolem. Výsledná DNA se štěpí Ndel v react 2 za teploty 37 °C po dobu 1 hodiny a provede se vysrážení ethanolem.
IL4.Y124D/IgG4 PE Ndel/BstXl a pCDN Ndel/BstXl fragmenty se ligují dohromady za vzniku plasmidu pCDN-IL4.Y124D/IgG4 PE. Ligace se dosahuje za použití 2 jednotek T4 DNA Ligase (Gibco BRL) s T4 DNA ligázovým pufrem. Reakční směs se inkubuje za teploty 16 °C přes noc. Produkty ligační reakce se transformují v Gibco-BRL DH5a kompetenčních buňkách (subklonující účinek) a umístí na agaru Luria Broth, který obsahuje 75 μg/ml ampicilinu. Transformanty se kultivují v Luria Broth (obsahujícím 50 μΐ/mg ampicilinu) a DNA se připraví alkalickou lýzou. Produkce p-CDN-IL4.Y124D/ /IgG4 PE DNA se potvrdí restrikčními štěpeními. Úplná sekvence rekombinantní IL4.Y124D/IgG4 PE DNA se potvrdí sekvencováním. pCDN-IL4.Y124D/IgG4 PE rekombinantní DNA se připraví a čistí za použití kolony Qiagen a DNA se použije k dočasnému infikování COS buněk a elektroporaci do CHO buněk, k vytvoření stabilních klonů.
2. Exprese fúzovaného proteinu
a) Dočasná exprese v COS
COS-1 buňky rostou v DMEM prostředí s 10% fetálním telecím šerem. Pro transfekci se buňky naočkují 2 x 10 buněk do misky pro kultivaci tkáně o průměru 35 mm 24 hodin předem. Roztok obsahující 1 μg DNA ve 100 μΐ DMEM zbaveného sera se přidá k roztoku, který obsahuje 6 μΐ reakčního přípravku LIPOFECTAMINE (Gibco-BRL) ve 100 μΐ DMEM bez sera, vše se opatrně rozvíří a inkubuje za teploty místnosti po dobu 45 minut. Buňky se jednou promyjí DMEM zbaveným sera. 0,8 ml DMEM zbaveného sera se přidá k opatrně míchanému roztoku DNA-LIPOFECTAMINE a zředěným roztokem se převrství buňky. Buňky se inkubují za teploty 37 °C po dobu 5 hodin a potom se k nim přidá 1 ml DMEM, s obsahem 20 % fetálního hovězího sera. Buňky se testují o 48 až 72 hodiny později ke stanovení úrovní exprese.
b) Elektropolace v CHO buňkách
CHO buňky, ACC-098 [suspenze buněčné linie odvozené od CHO DG-44, G. Urlaub, E. Kas, A. M. Carothers a L. A. Chasin, Cell, 33, 405-412, (1983)] se nechá růst v růstového prostředí prostém sera, které je popsáno ve W092/05246. 15 μ9 PCDN-IL4.Y124D/IgG4 PE plasmidu se štěpí za použití 30 jednotek Notl za teploty 37 °C po dobu 3 hodin k linearizaci plasmidu a potom se provede vysrážení ethanolem. Výsledná DNA se znovu suspenduje v 50 μΐ 1 x TE (10 mM Tris, hodnota pH 8,0, 1 mM EDTA). DNA se elektroporuje do 1 x 107 ACC-098 buněk, za použití pulzátorové soupravy Bio Rad Gene Pulser při napětí 380 V a elektrické kapacitě 25 μFd. Buňky se znovu suspendují v růstovém prostředí při 2,5 x 104 buňkách na mililitr a 200 μΐ buněčné suspenze se umístí do každé jamky na desce s 96 jamkami. O 48 hodin později se prostředí prudce vnese do růstového prostředí, které obsahuje 400 μg/ml G418 (Geneticin). Za 21 den po selekci se upraví prostředí z kolonie, která vznikla, a podrobí se ELISA testu. Nejvyšší exprimované kolonie se přenesou na desku s 24 jamkami, aby se dosáhlo jejich zvětšení.
Tabulka 1: DNA sekvence COSFcLink vektoru, 6367 bp
SEQ ID č. 1
GACGTCGACGGATCGGGAGATCGGGGA7CGATCCGTCGACGTACGACTAGTTATTAATAG 6 0
TAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTT ACAT AACTT 120
ACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATG 180
ACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTAT 240
TTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCT 300
ATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGG 360
GACTTTCCTACTTGGCAGTAC ATCT ACGTATTAGTCATCGCT ATTACCATGGTGATGCGG 420
TTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTC 480
CACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAA 540
TGTCGT AAC AACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGT AGGCGTGTACGGTGGGAGGTC 600
TATATAAGCAGAGCTGGGTACGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCGAATTCGG 660
TTACCTGCAGATATCAAGCTAATTCGGTACCGAGCCCAAATCGGCCGACAAAACTCACAC 720
ATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCC 780
AAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGA 840
CGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTC AACTGGT ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA 900
T AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGT 960
CCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCpAA 1020 C AAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA 1080
ACC ACAGGTGT ACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCT 1140 GACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGG 1200
GCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTT 12 60' CCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATG 1320
CTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCC 1380 GGGTAAATGAGTGTAGTCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCA 1440
GCCÁTCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCAC 1500
TGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTAT 15 60 TCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCA 1620
TGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAACCAGCTGGGGCTCGAGGGGGGATCTCCCGATC 1680
CCCAGCTTTGCTTCTCAATTTCTTATTTGCATAATGAGAAAAAAAGGAAAATTAATTTTA 1740
ACACCAATTCAGTAGTTGATTGAGCAAATGCGTTGCCAAAAAGGATGCTTTAGAGACAGT 1800
GTTCTCTGCACAGATAAGGACAAACATTATTCAGAGGGAGTACCCAGAGCTGAGACTCCT 18 60 AAGCCAGTGAGTGGCACAGCATTCTAGGGAGAAATATGCTTGTCATCACCGAAGCCTGAT 1920
TCCGTAGAGCCACACCTTGGTAAGGGCCAATCTGCTCACACAGGATAGAGAGGGCAGGAG 1980
CC AGGGCAGAGCATATAAGGTGAGGTAGGATCAGTTGCTCCTCACATTTGCTTCTGACAT 2040
AGTTGTGTTGGGAGCTTGGATAGCTTGGACAGCTCAGGGCTGCGATTTCGCGCCAAACTT 2100
GACGGCAATCCT AGCGTGAAGGCTGGTAGGATTTT ATCCCCGCTGCC ATCATGGTTCGAC 2160
CATTGAACTGCATCGTCGCCGTGTCCCAAAATATGGGGATTGGCAAGAACGGAGACCTAC 2220
CCTGGCCTCCGCTCAGGAACGAGTTCAAGTACTTCCAAAGAATGACCACAACCTCTTCAG 2280
TGGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAGGAAAACCTGGTTCTCCATTCCTGAGA 2340
AGAATCGACCTTTAAAGGACAGAATTAATATAGTTCTCAGTAGAGAACTCAAAGAACCAC 2400
CACGAGGAGCTCATTTTCTTGCCAAAAGTTTGGATGATGCCTTAAGACTTATTGAACAAC 2460
CGGAATTGGCAAGTAAAGTAGACATGGTTTGGATAGTCGGAGGCAGTTCTGTTTACCAGG 2520
AAGCCATGAATCAACCAGGCCACCTTAGACTCTTTGTGACAAGGATCATGCAGGAATTTG 2580
AAAGTGACACGTTTTTCCCAGAAATTGATTTGGGGAAATATAAACTTCTCCCAGAATACC 2640
CAGGCGTCCTCTCTGAGGTCCAGGAGGAAAAAGGCATCAAGTATAAGTTTGAAGTCTACG 2700
AGAAGAAAGACTAACAGGAAGATGCTTTCAAGTTCTCTGCTCCCCTCCTAAAGCTATGCA 2760
TTTTTATAAGACCATGCTAGCTTGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAA 2820
AGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGT 2880
TTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCAACGATAGCTTATCTGTGGGC 2940
GATGCCAAGCACCTGGATGCTGTTGGTTTCCTGCTACTGATTTAGAAGCCATTTGCCCCC 3000
7GAG7GGGGC77GGGAGCACTAAC777C7CT77CAAAGGAAGCAA7GCAGAAAGAAAAGC 3060 A7ACAAAG7A7AAGC7GCCA7G7AA7AA7GGAAGAAGA7AAGGTTG7A7GAA7TAGATT7 3120 ACA7AC77C7GAA77GAAAC7AAACACC777AAA77C77AAA7A7A7AACACA777CA7A 3180 7GAAAG7A7777ACA7AAG7AAC7CAGA7ACA7AGAAAACAAAGC7AATGA7AGG7G7CC 3240 C7AAAAG77CA777A77AA77C7ACAAA7GA7GAGC7GGCCA7CAAAA77CCAGC7CAAT 3300 TC77CAACGAA77AGAAAGAGCAA7C7GCAAAC7CA7C7GGAA7AACAAAAAACC7AGGA 3360 7AGCAAAAACTCT7C7CAAGGA7AAAAGAACC7C7GG7GGAA7CACCA7GCC7GACCTAA 3420 AGC7G7AC7ACAGAGCAA77G7GA7AAAAAC7GCA7GG7AC7GA7ATAGAAACGGACAAG 3480 7AGACCAA7GGAA7AGAACCCACACACC7A7GG7CAC77GA7C77CAACAAGAGAGC7AA 3540 AACCA7CCAC7GGAAAAAAGACAGCA7777CAACAAA7GG7GC7GGC ACAAC7GG7GG77 3600
A7CA7GGAGAAGAA7G7GAAT7GA7CCAT7CCAATCTCCT7G7AC7AAGG7CAAATCTAA 3660 G7GGA7CAAGGAAC7CCACA7AAAACCAGAGACAC7GAAAC7TA7AGAGGAGAAAG7GGG 3720 GAAAAGCC7CGAAGA7A7GGGCACAGGGGAAAAA77CC7GAA7AGAACAGCAATGGCTTG 3780 TGC7G7AAGA7CGAGAA77GACAAA7GGGACC7CA7GAAAC7CCAAAGCTA7CGGA7CAA 3840 TTCC7CCAAAAAAGCC7CC7CAC7AC77C7GGAA7AGC7CAGAGGCCGAGGCGGCC7CGG 3900 CC7C7GCA7AAATAAAAAAAA77 AG7CAGCCA7GCA7GGGGCGGAGAA7GGGCGGAAC7G 3960
GGCGGAG77AGGGGGGGGA7GGGCGGAG77AGGGGCGGGAC7A7GG77GC7GAC7AA77G 4020 AGA7GCA7GC777GCA7AC77C7GCCTGC7GGGGAGCC7GGGGACT77CCACACC7GG77 4080 GC7GAC7AA77GAGA7GCA7GC777GCA7AC77C7GCC7GC7GGGGAGCC7GGGGACT77 4140 CCACACCC7AACTGACACACA77CCACAGAA77AA77CCCGA7CCCG7CGACCTCGAGAG 4200 CTTGGCGTAATCATGGTCA7AGCTGTT7CCTGTG7GAAAT7G77A7CCGCTCACAA77CC 4260 ACACAACA7ACGAGCCGGAAGCA7AAAG7G7AAAGCC7GGGGTGCC7AATGAG7GAGC0^ 4320 AC7CACA77AA77GCG77GCGC7CAC7GCCCGC777CCAG7CGGGAAACC7G7CGTGCCA 4380 GC7GCA7TAA7GAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGG777GCG7A77GGGCGC7CT7C 4440 CGC77CC7CGC7CAC7GACTCGC7GCGC7CGG7CG77CGGC7GCG6CGAGCGG7A7CAGC 4500' 7CAC7CAAAGGCGG7AATACGG77 A7CCAC AGAA7CAGGGGA7AACGCAGGAAAGAACA7 4560
G7GAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCG7AAAAAGGCCGCG77GC7GGCG77TT7 4620 CCA7AGGC7CCGCCCCCC7GACGAGCA7CACAAAAA7CGACGC7CAAG7CAGAGG7GGCG 4680 AAACCCGACAGGAC7A7AAAGA7ACCAGGCG777CCCCC7GGAAGC7CCCTCG7GCGC7C 4740 7CC7G77CCGACCCTGCCGC77ACCGGA7ACC7G7CCGCC777C7CCCTTCGGGAAGCG7 4800 GGCGC777C7CAA7GC7CACGCTGTAGG7A7CTCAG7TCGG7G7AGG7CG77CGC7CCAA 4860 GC7GGGC7G7G7GCACGAACCCČCCG77CAGCCCGACCGC7GCGCCTTATCCGG7AACTA 4920 TCG7C77GAG7CCAACCCGG7 AAGACACG ACTT A7CGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAA 4980
CAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAA 5040 CTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTT 5100 CGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTT 5160 TTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGAT 5220 CTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCAT 5280 GAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTT AAATC 5340
AATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGC 5400 ACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTA 54 60 GATAACTACGAT ACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGA 5520 CCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCG 5580 CAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGC 5640 TAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCAT 5700 CGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAG 5760 GCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGAT 5820 CGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAA 5880 TTCTCTT ACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAA 5940
GTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGA 6000 TAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGC7CATCAT7GGAAAACGTTCTTCGGG 6060 GCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGC 6120 ACCC AACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGG 6180
AAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACT 6240
CTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACAT
ATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCČCGAAAAGT
GCCACCT
Tabulka 2: DNA sekvence kódované Y124D/IgGl fúzované v COSFcLink vektoru, 6926 bp
SEQ ID č. 2
GACGTCGACGGATCGGGAGATCGGGGATCGATCCGTCGACGTACGACTAGTTATTAATAG
TAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTT acggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatg
ACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTAT
TTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCT
ATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGG
GACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGG
TTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTC
CACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAA
TGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTC
TATATAAGCAGAGCTGGGTACGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCGAATTCGG
TTACCTGCAGATGGGCTGCAGGAATTCCGCATTGCAGAGATAATTGTATTTAAGTGCCTA
GCTCGATACAATAAACGCCATTTGACCATTCACCACATTGGTGTGCACCTCCAAGCTTAC
CTGCCATGGGTCTCACCTCCCAACTGCTTCCCCCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATGTGCCG
GCAACTTTGTCCACGGACACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAACTTTGA
ACAGCCTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTG
CCTCCAAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGT
TCTACAGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACA
GGCACAAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGG
GCTTGAATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAA
GGCTAAAGACGATCATGAGAGAGAAAGACTCAAAGTGTTCGAGCGGTACCGAGCCCAAAT
CGGCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGT
CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGG
TCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG
TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA
CGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT
ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAG
CCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGA
CCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCG
TGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGG
ACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGC
AGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA
AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGTAGTCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGA
CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCC
TGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTC
TGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATT
GGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAACCAGCTGGGGCTC
GAGGGGGGATCTCCCGATCCCCAGCTTTGCTTCTCAATTTCTTATTTGCATAATGAGAAA
AAAAGGAAAATTAATTTTAACACCAATTCAGTAGTTGATTGAGCAAATGCGTTGCCAAAA
AGGATGCTTTAGAGACAGTGTTCTCTGCACAGATAAGGACAAACATTATTCAGAGGGAGT •ACCCAGAGCTGAGACTCCTAAGCCAGTGAGTGGCACAGCATTCTAGGGAGAAATATGCTT
GTCATCACCGAAGCCTGATTCCGTAGAGCCACACCTTGGTAAGGGCCAATCTGCTCACAC
6300
6360
6367 molekuly
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
2460
2520
AGGATAGAGAGGGCAGGAGCCAGGGCAGAGCATATAAQGTGAGGTAGGATCAGTTGCTCC 2580 TCACATTTGCTTCTGACATAGTTGTGTTGGGAGCTTGGATAGCTTGGACAGCTCAGGGCT 2640 GCGATTTCGCGCCAAACTTGACGGCAATCCTAGCGTGAAGGCTGGTAGGATTTTATCCCC 2700 GCTGCCATCATGGTTCGACCATTGAACTGCATCGTCGCCGTGTCCCAAAATATGGGGATT 2760 GGC AAGAACGGAGACCT ACCCTGGCCTCCGCTC AGGAACGAGTTCAAGT ACTTCCAAAGA 2820 ATGACCACAACCTCTTCAGTGGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAGGAAAACC 2880 TGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGACAGAATTAATATAGTTCTCAGT 2940 AGAGAACTCAAAGAACCACCACGAGGAGCTCATTTTCTTGCCAAAAGTTTGGATGATGCC 3000 TTAAGACTTATTGAACAACCGGAATTGGCAAGTAAAGTAGACATGGTTTGGATAG7CGGA 3060 GGCAGTTCTGTTTACCAGGAAGCCATGAATCAACCAGGCCACCTTAGACTCTTTGTGACA 3120 AGGATCATGCAGGAATTTGAAAGTGACACGTTTTTCCCAGAAATTGATTTGGGGAAATAT 3180 AAACTTCTCCCAGAATACCCAGGCGTCCTCTCTGAGGTCCAGGAGGAAAAAGGCATCAAG 3240 TATAAGTTTGAAGTCTACGAGAAGAAAGACTAACAGGAAGATGCTTTCAÁGTTCTCTGCT 3300 CCCCTCCTAAAGCTATGCATTTTTATAAGACCATGCTAGCTTGAACTTGTTTATTGCAGC 3360 TT ATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTC 3420 ACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCAA 3480 CGATAGCTTATCTGTGGGCGATGCCAAGCACCTGGATGCTGTTGGTTTCCTGCTACTGAT 3540 TTAGAAGCCATTTGCCCCCTGAGTGGGGCTTGGGAGCACTAACTTTCTCTTTCAAAGGAA 3600 GCAATGCAGAAAGAAAAGCATACAAAGT AT AAGCTGCCATGTAATAATGGAAGAAGATAA 3660 GGTTGTATGAATTAGATTTACATACTTCTGAATTGAAACTAAACACCTTTAAATTCTTAA 3720 ATATATAACACATTTCATATGAAAGTATTTTACATAAGTAACTCAGATACATAGAAAkCA 3780 AAGCT AATGATAGGTGTCCCTAAAAGTTCATTTATTAATTCTACAAATGATGAGCTGGCC 3840 ATCAAAATTCCAGCTCAATTCTTCAACGAATTAGAAAGAGCAA^CTGCAAACTCATCTGG 3900 AATAACAAAAAACCTAGGATAGCAAAAACTCTTCTCAAGGATAAAAGAACCTCTGGTGGA 3960 ATCACCATGCCTGACCTAAAGCTGTACTACAGAGCAATTGTGATAAAAACTGCATGGTAC 4020 TGATATAGAAACGGACAAGTAGACCAATGGAATAGAACCCACACACCTATGGTCACTTGA 4080 TCTTCAACAAGAGAGCTAAAACCATCCACTGGAAAAAAGACAGCATTTTCAACAAATGGT 4140 GCTGGCACAACTGGTGGTTATCATGGAGAAGAATGTGAATTGATCCATTCCAATCTCCTT 4200 GTACTAAGGTCAAATCTAAGTGGATCAAGGAACTCCACATAAAACCAGAGACACTGAAAC 4260 TTATAGAGGAGAAAGTGGGGAAAAGCCTCGAAGATATGGGCACAGGGGAAAAATTCCTGA 4320 ATAGAACAGCAATGGCTTGTGCTGTAAGATCGAGAATTGACAAATGGGACCTCATGAAAC 4380 TCCAAAGCTATCGGATCAATTCCTCCAAAAAAGCCTCCTCACTACTTCTGGAATAGCTCA 44 4 0 GAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCTGCATAAAT AAAAAAAATT AGTCAGCCATGCATGGGG 4500 CGGAGAATGGGCGGAACTGGGCGGAGTTAGGGGCGGGATGGGCGGAGTTAGGGGCGGGAC 4560 TATGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGG 4620 GGACTTTCCACACCTGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGC 4680 TGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCCT AACTGACACACATTCCACAGAATTAATTCCCG 4740 ATCCCGTCGACCTCGAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATT 4800 GTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGG 4860 GTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGT 4920 CGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTT 4980 TGCGT ATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGC 5040 TGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGG 5100 ATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGG 5160 CCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGAC 5220 GCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTG 5280 GAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCT 5340 TTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGG 5400 TGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCT 5460 GCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCAC 5520 TGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGT 5580 TCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTC 5640 TGCTGAAGCCAGTT ACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCA 5700 CCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGAT 5760
CTCAAG AAGATCCTTTGATCTTTTCT ACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCAC 5820 GTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCT-TCACCTAGATCCT TTTAAATT 5880 AAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACC 5940 AATGCTT AATC AGTGAGGCACCTATCTC AGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTG 6000 CCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTG 60 60 CTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGC 6120 CAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTA 6180 TTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTG 6240 TTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCT 6300 CCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCC ATGTTGTGCAAAAAAGCGGTT A 63 60 GCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGG 6420 TTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGA 6480 CTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTT 6540 GCCCGGCGTCAATACGGGAT AAT ACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCA 6600 TTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTT 6660 CGATGTAACCCACTCGTGC ACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTT 6720 CTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGA 6780 AATGTTGAATACTCAT ACTCTTCCTTTTTCAATATT ATTGAAGC ATTTATCAGGGTT ATT 6840 GTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGC 6900 GCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCT 692 6 Tabulka 3: DNA sekvence kódující oblasti IL4.Y124D/IgGl fúzované molekuly, 1164 bp
SEQ ID Č. 3
ATGGGTCTCACCTCCCAACTGCTTCCCCCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATGTGCCGGCAAC 6 o
TTTGTCCACGGACACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAACTTTGAACAGC 120
CTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCC 180
AAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTAC 240
AGCCACCATGAGAAGGACACTGGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACAGGCAC 300
AAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTG 3 60 AATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTA 420
AAGACGATCÁTGAGAGAGAAAGACTCAAAGTGTTCGAGCGGTACCGAGCCCAAATCGGCC 4 80 GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTC 540
TTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACA 600
TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTT CAACTGGT ACGTGG AC 660
GGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTAC 720
CGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAG 780
TGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA 840
GGGC AGCCCCGAG AACCAC AGGTGT ACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTG ACCAAG 900
AACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG 960
TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCC 1020
GACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGG 1080
AACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT ACACGCAGAAGAGC 1140
CTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA 1164
Tabulka 4: Sekvence kódovaného IL4.Y124D/IgGl fúzovaného proteinu, 387 aa
SEQ ID č. 4
MGLTSQLLPP LFFLLACAGN FVHGHKCDIT LQEIIKTLNS LTEQKTLCTE 51 LTVTDIFAAS KNTTEKETFC RAATVLRQFY SHHEKDTRCL GATAQQFHRH
101 KQLIRFLKRL DRNLWGLAGL NSCPVKEANQ S7LENFLERL K7IMREKDSK 151 CSSG7EPKSA DK7H7CPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT 201 CWVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH 251 QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSRDELTK 301 NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL 351 TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK*
Tabulka 5: DNA sekvence syntetické IgG4 cDNA, 1006 bp
SEQ ID č. 5
GCTTCCACCAAGGGCCC ATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAG 6 0
AGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCG 120
TGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA 180
GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACC 240
TACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCC 300
AAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAATTTCTGGGGGGACCATCAGTC 3 60 TTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACG 420
TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGAT 480 ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgYac 540
CG7GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAG 600
TGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCATCGATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA 660
GGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAG 720
AACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAG 780
TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCC 840
GACGGATCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGG 900
AATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGC 960
CTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGAGTGTAGTCTAGATCTACGTATG 1006
Tabulka 6: DNA sekvence kódující oblasti IL4.Y124D/IgG4 fúzované molekuly, 1149 bp
SEQ ID č. 6
ATGGGTCTCACCTCCCAACTGCTTCCCCCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATGTGCCGGC AAC 6 0
TTTGTCCACGGACACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAACTTTGAACAGC 120
CTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCC 180
AAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTAC 240
AGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCC ACAGGCAC 300
AAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTG 3 60 AATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTA 420
AAGACGATCATGAGAGAGAAAGACTCAAAGTGCTCGAGCGAGTCCAAATATGGTCCCCCA 480
TGCCCATCATGCCCAGCACCTGAATTTCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCA 540
AAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGAC 600
GTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCAT 660
AATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGC AGTTCAACAGC ACGTACCGTGTGGTCAGCGTC 720
C7CACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC 780
AAAGGCCTCCCGTCATCGATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAG 840
CC ACAGGTGT AC ACCCTGCCCCCATCCCAGG AGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG 900
ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG 960
CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTC 1020
CTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGC 1080
TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTG 1140
GGTAAATGA 1149
Tabulka 7: Sekvence kódovaného IL4.Y124D/IgG4 fúzovaného proteinu, 382 aa
SEQ ID č. 7
MGLTSQLLPP LFFLLACAGN FVHGHKCDIT LQEIIKTLNS LTEQKTLCTc.
LTVTDIFAAS KNTTEKETFC RAATVLRQFY SHHEKDTRCL GATAQQFHRH 101 KQLIRFLKR.L DRNLWGLAGL NSCPVKEANQ STLENFLERL KTIMREKDSK 151 CSSESKYGPP CPSCPAPEFL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCWVD 201 VSQEDPEVQF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRWSV LTVLHQDWLN 251 GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL 301 TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS
351 RWQEGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSL GK*
Tabulka 8: DNA sekvence IgG4 PE varianty, 984 bp SEQ ID č. 8
GCTAGT ACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAG 6 0 AGCACgGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTG^CG 12 0 TGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA 180 GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACC 240 TACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCC 300 AAATATGGTCCCCCATGCCCAcCATGCCCAGCgCCTGAaTTtgaGGGGGGACCATCAGTC 3 δ 0 TTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACG 420 TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCC AGTTCAACTGGTACGTGGAT 480 GGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTAC 540 CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAG 600 TGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCaTCgATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA 660 GGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAG 72 0 AACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAG 780 TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCC 84 0 GACGGaTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGG 900 AATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGC 960 CTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA 984
Tabulka 9: DNA sekvence kódující oblasti IL4.Y124D/lgG4 PE fúzované molekuly, 1149 bp
SEQ ID č. 9
ATGGGTCTC ACCTCCCAACTGCTTCCCCCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATGTGCCGGCAAC 6 0 TTTGTCCACGGACACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAACTTTGAACAGC 120 CTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCC 180 AAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTAC 240 AGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACAGGCAC 300 AAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTG 3 60 AATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTA 420 AAGACGATCATGAGAGAGAAAGACTCAAAGTGCTCGAGCGAGTCCAAATATGGTCCCCCA 480 TGCCCACCATGCCCAGCgCCTGAATTTGAGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCA 540 AAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGAC 600 GTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGT ACGTGGATGGCGTGGAGGTGCAT 660 AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGT ACCGTGTGGTCAGCGTC 720
CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC 780 AAAGGCCTCCCGTCaTCgATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAG 840 CCACAGGTGTACACCC7GCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG 900 ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG 960 CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGaTCCTTCTTC 1020 CTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGC 1080 TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTG 1140 GGTAAATGA 1149
Tabulka 10: Sekvence kódované IL4.Y124D/IgG4 PE varianty fúzovaného proteinu, 382 aa
SEQ ID č. 10
MGLTSQLLPP LFFLLACAGN FVHGHKCDIT LQEIIKTLNS LTEQKTLCTE 51 LTVTDIFAAS KNTTEKETFC RAATVLRQFY SHHEKDTRCL GATAQQFHRH 101 KQLIRFLKRL DRNLWGLAGL NSCPVKEANQ STLENFLERL KTIMREKDSK 151 CSSESKYGPP CPPCPAPEFE GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD 201 VSQEDPEVQF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRWSV LTVLHQDWLN 251 GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL 301 TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LY^RLTVDKS
351 RWQEGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSL GK* <— JO £> C35
O “ > o <3 o
OKY toc?
o czx r—“
O ř\S o<
IL4 a/nebo IL13 i ..
u t
Claims (19)
- PATENTOVÉ NÁR1. Rozpustný protein, projevující antagonistickou nebo částečnou antagonistickou aktivitu, vyznačující se tím, že zahrnuje IL4 mutantu nebo variantu fúzovanou k alespoň jedné lidské imunoglobulínové konstantní doméně nebo jejímu fragmentu.
- 2. Sloučenina podle nároku 1, kde alespoň jedna aminokyselina, která se přirozeně vyskytuje v divokým typu IL4 v libovolné poloze 120 až 128 včetně, je nahrazena rozdílnou přirozenou aminokyselinou.
- 3. Sloučenina podle nároku 2, kde tyrosin, přirozeně se vyskytující v poloze 124, je nahrazen rozdílnou přirozenou aminokyselinou.
- 4. Sloučenina podle nároku 3, kde tyrosin, přirozeně se vyskytující v poloze 124, je nahrazen kyselinou asparagovou.
- 5. Sloučenina podle některého z předcházejících nároků, kde imunoglobulín je z podskupiny IgG.
- 6. Sloučenina podle nároku 5, kde konstantní doména nebo domény nebo její či jejich fragment jsou celé nebo podstatnou částí konstantní oblasti těžkého řetězce lidského IgG.
- 7. Sloučenina podle nároku 5, kde konstantní doména nebo domény nebo její či jejich fragment jsou celé nebo podstatnou částí konstantní oblasti těžkého řetězce lidskéhoIgG4.
- 8. Sloučenina podle nároku 1, která obsahuje sekvenci aminokyseliny představovanou SEQ ID č. 4, SEQ ID č. 7 nebo SEQ ID č. 10.
- 9. Způsob přípravy sloučeniny podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že zahrnuje exprimování DNA kódující tuto sloučeninu v rekombinantní hostitelově buňce a získání produktu.
- 10. Způsob podle nároku 9,vyznačující se tím, žei) připraví se replikovatelný expresní vektor, který je schopen v hostitelově buňce exprimovat DNA polymer sestávající z nukleotidové sekvence, která kóduje tuto sloučeninu, ii) hostitelova buňka se transformuje tímto vektorem, iii) transformovaná hostitelova buňka se kultivuje za podmínek, které dovolují expresi tohoto DNA polymeru, k produkci uvedené sloučeniny a iv) získá se tato sloučenina.
- 11. DNA polymer, vyznačující se tím, že obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje sloučeninu podle některého z nároků 1 až 8.
- 12. DNA polymer podle nároku 11, vyznačuj ící se t i m, že zahrnuje nebo sestává ze sekvence SEQ ID č.3, SEQ ID č. 6 nebo SEQ ID č. 9.
- 13. Replikovatelný expresní vektor, vyznačující se tím, že zahrnuje DNA polymer podle nároku ll.
- 14. Hostitelova buňka, vyznačující se tím, že je transformována replikovatelným expresním vektorem podle nároku 13.
- 15. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje sloučeninu podle některého z nároků 1 až 8 a farmaceuticky přijatelnou nosnou látku.
- 16. Způsob ošetřování stavů vyplývajících z nežádoucích účinků IL4 a/nebo IL13, vyznačující se tím, že se poškozenému podává účinné množství sloučeniny podle nároku 1.
- 17. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 8, k použití pro terapeutické účely.
- 18. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 8, k použití pro ošetřování stavů vyplývajících z nežádoucích účinků IL4 a/nebo IL13.
- 19. Použití sloučeniny podle některého z nároků 1 až 8, k přípravě léčiva pro ošetřování stavů vyplývajících z nežádoucích účinků IL4 a/nebo IL13.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9415379A GB9415379D0 (en) | 1994-07-29 | 1994-07-29 | Novel compounds |
| US46829795A | 1995-06-06 | 1995-06-06 | |
| PCT/EP1995/003036 WO1996004388A1 (en) | 1994-07-29 | 1995-07-28 | Novel compounds |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ25697A3 true CZ25697A3 (en) | 1997-09-17 |
Family
ID=26305369
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ97256A CZ25697A3 (en) | 1994-07-29 | 1995-07-28 | Novel compounds |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0770135A1 (cs) |
| JP (1) | JPH10503371A (cs) |
| CN (1) | CN1117155C (cs) |
| AU (1) | AU3382595A (cs) |
| BR (1) | BR9508469A (cs) |
| CA (1) | CA2196200A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ25697A3 (cs) |
| HU (1) | HUT76369A (cs) |
| MX (1) | MX9700764A (cs) |
| NO (1) | NO970374L (cs) |
| NZ (1) | NZ292124A (cs) |
| PL (1) | PL182665B1 (cs) |
| WO (1) | WO1996004388A1 (cs) |
Families Citing this family (225)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6471956B1 (en) | 1994-08-17 | 2002-10-29 | The Rockefeller University | Ob polypeptides, modified forms and compositions thereto |
| US6001968A (en) | 1994-08-17 | 1999-12-14 | The Rockefeller University | OB polypeptides, modified forms and compositions |
| US6429290B1 (en) | 1994-08-17 | 2002-08-06 | The Rockefeller University | OB polypeptides, modified forms and derivatives |
| US6350730B1 (en) | 1994-08-17 | 2002-02-26 | The Rockefeller University | OB polypeptides and modified forms as modulators of body weight |
| US7597886B2 (en) | 1994-11-07 | 2009-10-06 | Human Genome Sciences, Inc. | Tumor necrosis factor-gamma |
| US7429646B1 (en) | 1995-06-05 | 2008-09-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies to human tumor necrosis factor receptor-like 2 |
| US6936439B2 (en) | 1995-11-22 | 2005-08-30 | Amgen Inc. | OB fusion protein compositions and methods |
| US20030040467A1 (en) | 1998-06-15 | 2003-02-27 | Mary Ann Pelleymounter | Ig/ob fusions and uses thereof. |
| US7888466B2 (en) | 1996-01-11 | 2011-02-15 | Human Genome Sciences, Inc. | Human G-protein chemokine receptor HSATU68 |
| US6664227B1 (en) * | 1996-03-01 | 2003-12-16 | Genetics Institute, Llc | Treatment of fibrosis by antagonism of IL-13 and IL-13 receptor chains |
| EP0812913A3 (en) * | 1996-06-12 | 1999-08-04 | Smithkline Beecham Corporation | HR-1 receptor, a receptor of the cytokine receptors family |
| US5986059A (en) | 1996-06-14 | 1999-11-16 | Bayer Corporation | T-cell selective interleukin-4 agonists |
| US6335426B1 (en) | 1996-06-14 | 2002-01-01 | Bayer Corporation | T-cell selective interleukin-4 agonists |
| US6028176A (en) | 1996-07-19 | 2000-02-22 | Bayer Corporation | High-affinity interleukin-4 muteins |
| US6287801B1 (en) * | 1996-07-22 | 2001-09-11 | Smithkline Beecham Corporation | Nucleic acids encoding the G-protein coupled receptor HNFDS78 |
| EA004790B1 (ru) * | 1996-12-20 | 2004-08-26 | Амген Инк. | Композиции на основе слитого белка ов и способы их применения |
| US6100387A (en) * | 1997-02-28 | 2000-08-08 | Genetics Institute, Inc. | Chimeric polypeptides containing chemokine domains |
| US6852508B1 (en) | 1997-02-28 | 2005-02-08 | Genetics Institute, Llc | Chemokine with amino-terminal modifications |
| DK1037927T3 (da) | 1997-12-08 | 2004-09-06 | Emd Lexigen Res Ct Corp | Heterodimere fusionsproteiner, der er nyttige til målrettet immunterapi og generel immunstimulering |
| US7198789B2 (en) | 1998-03-17 | 2007-04-03 | Genetics Institute, Llc | Methods and compositions for modulating interleukin-21 receptor activity |
| US6057128A (en) | 1998-03-17 | 2000-05-02 | Genetics Institute, Inc. | MU-1, member of the cytokine receptor family |
| EP1093457B8 (en) | 1998-03-19 | 2011-02-02 | Human Genome Sciences, Inc. | Cytokine receptor common gamma chain like |
| WO2000050620A2 (en) | 1999-02-26 | 2000-08-31 | Human Genome Sciences, Inc. | Human endokine alpha and methods of use |
| US20010021380A1 (en) * | 1999-04-19 | 2001-09-13 | Pluenneke John D. | Soluble tumor necrosis factor receptor treatment of medical disorders |
| US7067110B1 (en) | 1999-07-21 | 2006-06-27 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| PL202058B1 (pl) | 1999-08-09 | 2009-05-29 | Merck Patent Gmbh | Wielofunkcyjne białko fuzyjne cytokin i przeciwciała |
| JP2003514552A (ja) | 1999-11-12 | 2003-04-22 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | 改善された性質を有するエリトロポエチンの形態 |
| DE60122286T2 (de) | 2000-02-11 | 2007-08-02 | Merck Patent Gmbh | Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen |
| US20030031675A1 (en) | 2000-06-06 | 2003-02-13 | Mikesell Glen E. | B7-related nucleic acids and polypeptides useful for immunomodulation |
| EP2431054A3 (en) | 2000-06-15 | 2013-03-06 | Human Genome Sciences, Inc. | Human tumor necrosis factor delta and epsilon |
| KR20060088905A (ko) | 2000-06-16 | 2006-08-07 | 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 | 면역특이적으로 ＢＬｙＳ에 결합하는 항체 |
| ES2288967T3 (es) | 2000-06-29 | 2008-02-01 | Merck Patent Gmbh | Reforzamiento de las respuestas inmunes mediadas por la proteina de fusion anticuerpo-citoquina por medio del tratamiento combinado por agentes que mejoran la incorporacion de inmunocitoquina. |
| TWI327600B (en) | 2000-11-28 | 2010-07-21 | Medimmune Llc | Methods of administering/dosing anti-rsv antibodies for prophylaxis and treatment |
| EP1355919B1 (en) | 2000-12-12 | 2010-11-24 | MedImmune, LLC | Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof |
| EP1683865A3 (en) | 2001-02-02 | 2006-10-25 | Eli Lilly & Company | Mammalian proteins and in particular CD200 |
| US7094892B2 (en) * | 2001-02-22 | 2006-08-22 | The Research Foundation Of State University Of New York | Nucleic acids encoding opiate receptors |
| GB0105360D0 (en) * | 2001-03-03 | 2001-04-18 | Glaxo Group Ltd | Chimaeric immunogens |
| BR0207854A (pt) | 2001-03-07 | 2004-08-24 | Merck Patent Gmbh | Tecnologia de expressão para proteìnas contendo uma porção de anticorpo de isotipo hìbrido |
| WO2002079415A2 (en) | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
| DK1385864T3 (da) | 2001-04-13 | 2010-08-16 | Human Genome Sciences Inc | Anti-VEGF-2-antistoffer |
| HUP0400284A3 (en) | 2001-05-03 | 2012-09-28 | Merck Patent Gmbh | Recombinant tumor specific antibody and use thereof |
| US7064189B2 (en) | 2001-05-25 | 2006-06-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors |
| US6867189B2 (en) | 2001-07-26 | 2005-03-15 | Genset S.A. | Use of adipsin/complement factor D in the treatment of metabolic related disorders |
| PL206975B1 (pl) | 2001-12-04 | 2010-10-29 | Merck Patent Gmbh | Immunocytokiny o modulowanej selektywności oraz ich zastosowanie |
| US7371383B2 (en) | 2002-04-12 | 2008-05-13 | Medimmune, Inc. | Recombinant anti-interleukin-9 antibodies |
| AU2003276832A1 (en) | 2002-05-10 | 2004-02-25 | Medimmune, Llc | EphA2 AGONISTIC MONOCLONAL ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF |
| US7132100B2 (en) | 2002-06-14 | 2006-11-07 | Medimmune, Inc. | Stabilized liquid anti-RSV antibody formulations |
| US7425618B2 (en) | 2002-06-14 | 2008-09-16 | Medimmune, Inc. | Stabilized anti-respiratory syncytial virus (RSV) antibody formulations |
| ES2381617T5 (es) | 2002-08-14 | 2016-02-24 | Macrogenics, Inc. | Anticuerpos específicos frente a FcgammaRIIB y sus procedimientos de uso |
| RU2366664C2 (ru) | 2002-12-17 | 2009-09-10 | Мерк Патент Гмбх | Гуманизированное антитело (н14.18) на основании антитела 14.18 мыши, связывающееся с gd2, и его слияние с il-2 |
| EP1594525A1 (en) * | 2003-01-18 | 2005-11-16 | Children's Hospital Medical Center | Regulation of allergen induced gene |
| AU2004206250B8 (en) | 2003-01-21 | 2009-09-17 | Bristol-Myers Squibb Company | Polynucleotide encoding a novel acyl coenzyme a, monoacylglycerol acyltransferase-3 (MGAT3), and uses thereof |
| EP1444989A1 (en) | 2003-02-07 | 2004-08-11 | Giorgio Dr. Stassi | Sensitizing cells for apoptosis by selectively blocking cytokines |
| CA2516455C (en) | 2003-02-20 | 2012-05-01 | Seattle Genetics, Inc. | Anti-cd70 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of cancer and immune disorders |
| CN102040662A (zh) | 2003-03-14 | 2011-05-04 | 惠氏有限责任公司 | 抗人il-21受体的抗体及其应用 |
| WO2004091510A2 (en) | 2003-04-11 | 2004-10-28 | Medimmune, Inc. | Recombinant il-9 antibodies and uses thereof |
| US20070253966A1 (en) * | 2003-06-12 | 2007-11-01 | Eli Lilly And Company | Fusion Proteins |
| ATE525395T1 (de) * | 2003-06-12 | 2011-10-15 | Lilly Co Eli | Fusions proteine von glp-1-analoga |
| WO2005042743A2 (en) | 2003-08-18 | 2005-05-12 | Medimmune, Inc. | Humanization of antibodies |
| US7371381B2 (en) | 2003-12-12 | 2008-05-13 | Amgen Inc. | Anti-galanin antibodies and uses thereof |
| BRPI0418286A (pt) | 2003-12-30 | 2007-05-02 | Merck Patent Gmbh | proteìnas de fusão de il-7 |
| CA2551916C (en) | 2003-12-31 | 2014-04-29 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung | Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics |
| EP1702069A2 (en) | 2004-01-05 | 2006-09-20 | EMD Lexigen Research Center Corp. | Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin |
| WO2005097184A2 (en) | 2004-03-26 | 2005-10-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies against nogo receptor |
| DK1751184T3 (da) | 2004-05-13 | 2009-11-23 | Lilly Co Eli | FGF-21 fusionsproteiner |
| AR049390A1 (es) | 2004-06-09 | 2006-07-26 | Wyeth Corp | Anticuerpos contra la interleuquina-13 humana y usos de los mismos |
| US7501121B2 (en) | 2004-06-17 | 2009-03-10 | Wyeth | IL-13 binding agents |
| CA2580921C (en) | 2004-09-21 | 2016-04-12 | Medimmune, Inc. | Antibodies against and methods for producing vaccines for respiratory syncytial virus |
| US7635754B2 (en) * | 2004-09-22 | 2009-12-22 | Aerovance, Inc. | Interleukin-9 and interleukin-4 chimeric antagonist muteins and methods of using same |
| EP1809326A4 (en) | 2004-10-27 | 2009-11-04 | Medimmune Inc | MODULATION OF ANTIBODY SPECIFICITY BY MEASURING ADAPTATION OF ITS AFFINITY TO AN APPARENT ANTIGEN |
| EP1824886B1 (en) | 2004-11-17 | 2010-12-22 | Amgen Inc. | Fully human monoclonal antibodies to il-13 |
| RU2437893C2 (ru) | 2004-12-09 | 2011-12-27 | Мерк Патент Гмбх | Варианты il-7 со сниженной иммуногенностью |
| ATE435235T1 (de) * | 2004-12-22 | 2009-07-15 | Lilly Co Eli | Formulierungen glp-1-analoger fusionsproteine |
| WO2006102095A2 (en) | 2005-03-18 | 2006-09-28 | Medimmune, Inc. | Framework-shuffling of antibodies |
| EP2511299A1 (en) | 2005-04-19 | 2012-10-17 | Seattle Genetics, Inc. | Humanized anti-CD70 binding agents and uses thereof |
| ES2561628T3 (es) | 2005-05-06 | 2016-02-29 | Zymogenetics, Inc. | Anticuerpos monoclonales IL-31 y métodos de uso |
| US20070110757A1 (en) | 2005-06-23 | 2007-05-17 | Ziping Wei | Antibody formulations having optimized aggregation and fragmentation profiles |
| US7482124B2 (en) | 2005-07-08 | 2009-01-27 | Bristol-Myers Squibb Company | Method of identifying a PPARgamma-agonist compound having a decreased likelihood of inducing dose-dependent peripheral edema |
| EA014900B1 (ru) | 2005-11-07 | 2011-02-28 | Зе Скрипс Ресеч Инститьют | Композиции и способы контроля специфичности передачи сигналов, опосредуемой тканевым фактором |
| US8592149B2 (en) | 2006-04-27 | 2013-11-26 | Pikamab, Inc. | Methods and compositions for antibody therapy |
| RU2009101783A (ru) | 2006-06-21 | 2010-07-27 | Апогеникс Гмбх (De) | Дифференциальная экспрессия цитокинов il-4 и/или il-10 в злокачественной опухоли человека |
| EP2505209A1 (en) | 2006-06-26 | 2012-10-03 | MacroGenics, Inc. | Fcgamma-RIIB-specific antibodies and methods of the use thereof |
| US7572618B2 (en) | 2006-06-30 | 2009-08-11 | Bristol-Myers Squibb Company | Polynucleotides encoding novel PCSK9 variants |
| EP2064243A2 (en) | 2006-08-28 | 2009-06-03 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Antagonistic human light-specific human monoclonal antibodies |
| EP2594586B1 (en) | 2006-09-01 | 2014-08-27 | ZymoGenetics, Inc. | IL-31 monoclonal antibodies and methods of use |
| EP2407548A1 (en) | 2006-10-16 | 2012-01-18 | MedImmune, LLC | Molecules with reduced half-lives, compositions and uses thereof |
| PT2099823E (pt) | 2006-12-01 | 2014-12-22 | Seattle Genetics Inc | Agentes de ligação ao alvo variantes e suas utilizações |
| CA2682170A1 (en) | 2007-03-30 | 2008-10-09 | Medimmune, Llc | Antibodies with decreased deamidation profiles |
| JP5791895B2 (ja) | 2007-05-04 | 2015-10-07 | テクノファージ， インベスティガサン エ デセンボルビメント エム ビオテクノロジア，エスエー | 遺伝子操作されたウサギ抗体可変ドメイン及びその使用 |
| CA2685222C (en) | 2007-05-14 | 2017-12-19 | Medimmune, Llc | Methods of reducing eosinophil levels |
| PL2796466T3 (pl) | 2007-12-07 | 2018-04-30 | Zymogenetics, Inc. | Humanizowane cząsteczki przeciwciała swoiste dla il-31 |
| BRPI0907046A2 (pt) | 2008-01-18 | 2015-07-28 | Medimmune Llc | Anticorpo de cisteína engenheirada, ácido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, conjugado de anticorpo, composição farmacêutica, métodos de detecção de câncer, doenças ou distúrbios autoimunes, inflamatórios ou infecciosos em um indivíduo e de inibição de proliferação de uma célula alvo |
| EP2282773B2 (en) | 2008-05-02 | 2025-03-05 | Seagen Inc. | Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation |
| KR101030978B1 (ko) * | 2008-07-10 | 2011-04-28 | (주) 에이프로젠 | 동물세포용 재조합 발현벡터 |
| ES2643411T3 (es) | 2008-08-05 | 2017-11-22 | Novartis Ag | Composiciones y métodos para anticuerpos dirigidos a la proteína del complemento C5 |
| US8852608B2 (en) | 2009-02-02 | 2014-10-07 | Medimmune, Llc | Antibodies against and methods for producing vaccines for respiratory syncytial virus |
| WO2010093993A2 (en) | 2009-02-12 | 2010-08-19 | Human Genome Sciences, Inc. | Use of b lymphocyte stimulator protein antagonists to promote transplantation tolerance |
| EA201171259A1 (ru) | 2009-04-22 | 2012-05-30 | Мерк Патент Гмбх | Антительные гибридные белки с модифицированными сайтами связывания fcrn |
| US20120134984A1 (en) | 2009-06-01 | 2012-05-31 | Olga Lubman | Molecules with extended half-lives and uses thereof |
| AU2010270979B2 (en) | 2009-06-22 | 2015-04-23 | Medimmune, Llc | Engineered Fc regions for site-specific conjugation |
| SMT201700293T1 (it) | 2009-07-20 | 2017-07-18 | Bristol Myers Squibb Co | Combinazione di un anticorpo anti-ctla-4 con etoposide per il trattamento sinergico di malattie proliferative |
| DK2464657T3 (en) | 2009-08-10 | 2015-06-29 | Morphosys Ag | New screening strategies for the identification of antibodies or fragments thereof which bind an antigen with enzymatic activity |
| JP5883384B2 (ja) | 2009-08-13 | 2016-03-15 | ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー | 免疫機能を調節する方法 |
| BR112012003064B8 (pt) | 2009-08-13 | 2021-05-25 | Crucell Holland Bv | anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, combinação que os compreende, método de detecção de infecção por rsv, moléculas de ácido nucléico, e método de produção de um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo |
| WO2011035205A2 (en) | 2009-09-18 | 2011-03-24 | Calmune Corporation | Antibodies against candida, collections thereof and methods of use |
| CA2798390A1 (en) | 2010-05-06 | 2011-11-10 | Novartis Ag | Compositions and methods of use for therapeutic low density lipoprotein - related protein 6 (lrp6) multivalent antibodies |
| EP2566892B1 (en) | 2010-05-06 | 2017-12-20 | Novartis AG | Compositions and methods of use for therapeutic low density lipoprotein-related protein 6 (lrp6) antibodies |
| CN103140237A (zh) | 2010-07-09 | 2013-06-05 | 比奥根艾迪克依蒙菲利亚公司 | 因子ix多肽及其使用方法 |
| US9139642B2 (en) | 2010-07-09 | 2015-09-22 | Crucell Holland B.V. | Anti-human respiratory syncytial virus (RSV) antibodies and methods of use |
| WO2012019061A2 (en) | 2010-08-05 | 2012-02-09 | Stem Centrx, Inc. | Novel effectors and methods of use |
| PL2606070T3 (pl) | 2010-08-20 | 2017-06-30 | Novartis Ag | Przeciwciała dla receptora epidermalnego czynnika wzrostu 3 (her3) |
| SG10201506782XA (en) | 2010-08-27 | 2015-10-29 | Stem Centrx Inc | Notum protein modulators and methods of use |
| JP6327855B2 (ja) | 2010-09-03 | 2018-05-23 | アッヴィ・ステムセントルクス・エル・エル・シー | 新規モジュレータ及びその使用法 |
| AU2011325833C1 (en) | 2010-11-05 | 2017-07-13 | Zymeworks Bc Inc. | Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain |
| WO2012069466A1 (en) | 2010-11-24 | 2012-05-31 | Novartis Ag | Multispecific molecules |
| CA2820885A1 (en) | 2010-12-08 | 2012-09-07 | Stem Centrx, Inc. | Novel modulators and methods of use |
| US9540443B2 (en) | 2011-01-26 | 2017-01-10 | Kolltan Pharmaceuticals, Inc. | Anti-kit antibodies |
| SA112330278B1 (ar) | 2011-02-18 | 2015-10-09 | ستيم سينتركس، انك. | مواد ضابطة جديدة وطرق للاستخدام |
| WO2012170742A2 (en) | 2011-06-07 | 2012-12-13 | University Of Hawaii | Treatment and prevention of cancer with hmgb1 antagonists |
| WO2012170740A2 (en) | 2011-06-07 | 2012-12-13 | University Of Hawaii | Biomarker of asbestos exposure and mesothelioma |
| WO2012172495A1 (en) | 2011-06-14 | 2012-12-20 | Novartis Ag | Compositions and methods for antibodies targeting tem8 |
| US20130058947A1 (en) | 2011-09-02 | 2013-03-07 | Stem Centrx, Inc | Novel Modulators and Methods of Use |
| US20150044208A1 (en) | 2011-09-23 | 2015-02-12 | Technophage, Investigaçäo E Desenvolvimento Em Biotecnologia, Sa | Modified Albumin-Binding Domains and Uses Thereof to Improve Pharmacokinetics |
| WO2013067060A1 (en) | 2011-11-01 | 2013-05-10 | Bionomics, Inc. | Anti-gpr49 antibodies |
| WO2013067055A1 (en) | 2011-11-01 | 2013-05-10 | Bionomics, Inc. | Methods of blocking cancer stem cell growth |
| US9221906B2 (en) | 2011-11-01 | 2015-12-29 | Bionomics Inc. | Methods of inhibiting solid tumor growth by administering GPR49 antibodies |
| AU2012332590B2 (en) | 2011-11-01 | 2016-10-20 | Bionomics, Inc. | Anti-GPR49 antibodies |
| AU2012332021B8 (en) | 2011-11-04 | 2017-10-12 | Zymeworks Bc Inc. | Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain |
| EP3252075A1 (en) | 2011-11-04 | 2017-12-06 | Novartis AG | Low density lipoprotein-related protein 6 (lrp6) - half life extender constructs |
| US9453073B2 (en) | 2011-12-02 | 2016-09-27 | Eli Lilly And Company | Anti-glucagon antibodies and uses thereof |
| SG11201402783YA (en) | 2011-12-05 | 2014-06-27 | Novartis Ag | Antibodies for epidermal growth factor receptor 3 (her3) |
| BR112014013568A2 (pt) | 2011-12-05 | 2017-06-13 | Novartis Ag | anticorpos para o receptor do fator de crescimento epidermal 3 (her3) direcionados para o domínio ii do her3 |
| SG10201703249PA (en) | 2011-12-21 | 2017-05-30 | Novartis Ag | Compositions and methods for antibodies targeting factor p |
| CA2859755C (en) | 2011-12-23 | 2021-04-20 | Pfizer Inc. | Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor |
| PH12020500604A1 (en) | 2012-02-24 | 2023-06-14 | Abbvie Stemcentrx Llc | Anti sez6 antibodies and methods of use |
| JP6089047B2 (ja) | 2012-02-24 | 2017-03-01 | アッヴィ・ステムセントルクス・エル・エル・シー | Ｄｌｌ３モジュレーター及び使用方法 |
| WO2013166594A1 (en) | 2012-05-10 | 2013-11-14 | Zymeworks Inc. | Heteromultimer constructs of immunoglobulin heavy chains with mutations in the fc domain |
| TWI596113B (zh) | 2012-07-25 | 2017-08-21 | 塞爾德克斯醫療公司 | 抗ｋｉｔ抗體及其用途 |
| WO2014059028A1 (en) | 2012-10-09 | 2014-04-17 | Igenica, Inc. | Anti-c16orf54 antibodies and methods of use thereof |
| WO2014084859A1 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-05 | Novartis Ag | Molecules and methods for modulating tmem16a activities |
| AU2013355414B2 (en) | 2012-12-05 | 2017-02-02 | Novartis Ag | Compositions and methods for antibodies targeting EPO |
| KR20150095684A (ko) | 2012-12-18 | 2015-08-21 | 노파르티스 아게 | 히알루로난에 결합하는 펩티드 태그를 이용하는 조성물 및 방법 |
| SMT201900339T1 (it) | 2013-02-22 | 2019-07-11 | Medimmune Ltd | Coniugati anticorpo anti-dll3/pbd e loro usi |
| US20160067337A1 (en) | 2013-03-14 | 2016-03-10 | Bristol-Myers Squibb Company | Combination of dr5 agonist and anti-pd-1 antagonist and methods of use |
| EP3611189A1 (en) | 2013-03-14 | 2020-02-19 | Novartis AG | Antibodies against notch 3 |
| CN103265637B (zh) * | 2013-06-04 | 2015-10-21 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 一种重组猪白细胞介素4-Fc融合蛋白及其编码基因和表达方法 |
| SG11201509982UA (cs) | 2013-06-06 | 2016-04-28 | Igenica Biotherapeutics Inc | |
| US9562101B2 (en) | 2013-06-21 | 2017-02-07 | Novartis Ag | Lectin-like oxidized LDL receptor 1 antibodies and methods of use |
| AR096601A1 (es) | 2013-06-21 | 2016-01-20 | Novartis Ag | Anticuerpos del receptor 1 de ldl oxidado similar a lectina y métodos de uso |
| EP3041507B1 (en) | 2013-08-26 | 2021-06-30 | BioNTech Research and Development, Inc. | Nucleic acids encoding human antibodies to sialyl-lewis a |
| JP2016538318A (ja) | 2013-08-28 | 2016-12-08 | ステムセントリックス， インコーポレイテッド | 新規ｓｅｚ６モジュレーターおよび使用方法 |
| EP3892294A1 (en) | 2013-08-28 | 2021-10-13 | AbbVie Stemcentrx LLC | Site-specific antibody conjugation methods and compositions |
| RU2016119491A (ru) | 2013-11-04 | 2017-12-11 | Пфайзер Инк. | Конъюгаты антитела к efna4 с лекарственным средством |
| SI3097122T1 (sl) | 2014-01-24 | 2020-07-31 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Protitelesa, ki se vežejo v domeni beta klotho 2, in metode za njihovo uporabo |
| BR112016018891A2 (pt) | 2014-02-21 | 2017-10-10 | Abbvie Stemcentrx Llc | anticorpos anti-dll3 e conjugados de fármacos para uso em melanoma |
| GB201403775D0 (en) | 2014-03-04 | 2014-04-16 | Kymab Ltd | Antibodies, uses & methods |
| MX2016012873A (es) | 2014-04-04 | 2017-03-07 | Bionomics Inc | Anticuerpos humanizados que se unen al receptor 5 acoplado a proteina g que contiene repeticion rica en leucina (lgr5). |
| WO2015175375A1 (en) | 2014-05-13 | 2015-11-19 | Short Jay M | Conditionally active biological proteins |
| CN106413750B (zh) | 2014-05-16 | 2022-04-29 | 免疫医疗有限责任公司 | 具有增强的治疗和诊断特性的带有改变的新生儿Fc受体结合的分子 |
| AU2015271685B2 (en) | 2014-06-04 | 2021-02-18 | Biontech Research And Development, Inc. | Human monoclonal antibodies to ganglioside GD2 |
| US20170291939A1 (en) | 2014-06-25 | 2017-10-12 | Novartis Ag | Antibodies specific for il-17a fused to hyaluronan binding peptide tags |
| EP3160991A2 (en) | 2014-06-25 | 2017-05-03 | Novartis AG | Compositions and methods for long acting proteins |
| US20170290876A1 (en) | 2014-06-25 | 2017-10-12 | Novartis Ag | Compositions and methods for long acting proteins |
| DK3177642T3 (da) | 2014-08-07 | 2022-02-21 | Novartis Ag | Angiopoietin-lignende 4-antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
| US9988443B2 (en) | 2014-08-07 | 2018-06-05 | Novartis Ag | Angiopoetin-like 4 (ANGPTL4) antibodies and methods of use |
| CA2959786A1 (en) | 2014-09-03 | 2016-03-10 | Bioatla, Llc | Discovering and producing conditionally active biologic proteins in the same eukaryotic cell production hosts |
| MA41044A (fr) | 2014-10-08 | 2017-08-15 | Novartis Ag | Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer |
| WO2016094837A2 (en) | 2014-12-11 | 2016-06-16 | Igenica Biotherapeutics, Inc. | Anti-c10orf54 antibodies and uses thereof |
| UY36449A (es) | 2014-12-19 | 2016-07-29 | Novartis Ag | Composiciones y métodos para anticuerpos dirigidos a bmp6 |
| SG11201705988UA (en) | 2015-02-24 | 2017-08-30 | Bioatla Llc | Conditionally active biological proteins |
| DE112016001013T5 (de) | 2015-03-03 | 2017-12-21 | Kymab Limited | Antikörper, verwendungen und verfahren |
| CA2982237A1 (en) | 2015-06-05 | 2016-12-08 | Novartis Ag | Antibodies targeting bone morphogenetic protein 9 (bmp9) and methods therefor |
| JOP20200312A1 (ar) | 2015-06-26 | 2017-06-16 | Novartis Ag | الأجسام المضادة للعامل xi وطرق الاستخدام |
| WO2017021893A1 (en) | 2015-08-03 | 2017-02-09 | Novartis Ag | Methods of treating fgf21-associated disorders |
| MX2018003038A (es) | 2015-09-09 | 2018-04-11 | Novartis Ag | Moleculas de union a linfopoyetina estromal timica (tslp) y metodos de uso de las moleculas. |
| MY186352A (en) | 2015-09-09 | 2021-07-15 | Novartis Ag | Thymic stromal lymphopoietin (tslp)-binding antibodies and methods of using the antibodies |
| WO2017058859A1 (en) | 2015-09-29 | 2017-04-06 | Celgene Corporation | Pd-1 binding proteins and methods of use thereof |
| JP7064769B2 (ja) | 2015-11-02 | 2022-05-11 | バイオアトラ、エルエルシー | 条件的活性型ポリペプチド |
| MA43372A (fr) | 2015-12-04 | 2018-10-10 | Novartis Ag | Compositions à greffe de cytokine-anticorps et procédés d'utilisation pour l'immunorégulation |
| AU2016370813A1 (en) | 2015-12-18 | 2018-06-28 | Novartis Ag | Antibodies targeting CD32b and methods of use thereof |
| ES2847155T3 (es) | 2016-01-21 | 2021-08-02 | Novartis Ag | Moléculas multiespecíficas que fijan como objetivo CLL-1 |
| US10745487B2 (en) | 2016-03-22 | 2020-08-18 | Bionomics Limited | Method of treating cancer by administering an anti-LGR5 monoclonal antibody |
| WO2017189724A1 (en) | 2016-04-27 | 2017-11-02 | Novartis Ag | Antibodies against growth differentiation factor 15 and uses thereof |
| TW201802121A (zh) | 2016-05-25 | 2018-01-16 | 諾華公司 | 抗因子XI/XIa抗體之逆轉結合劑及其用途 |
| KR102492057B1 (ko) | 2016-06-15 | 2023-01-26 | 노파르티스 아게 | 골 형태형성 단백질 6(ｂｍｐ6)의 억제제를 사용한 질병의 치료 방법 |
| CN109641968B (zh) | 2016-07-06 | 2023-10-20 | 百时美施贵宝公司 | Tim-4拮抗剂和pd-1拮抗剂的组合及其使用方法 |
| CN109952317A (zh) | 2016-09-19 | 2019-06-28 | 细胞基因公司 | 使用pd-1结合蛋白治疗免疫病症的方法 |
| JP2019534859A (ja) | 2016-09-19 | 2019-12-05 | セルジーン コーポレイション | Ｐｄ−１結合タンパク質を使用して白斑を治療する方法 |
| US11779604B2 (en) | 2016-11-03 | 2023-10-10 | Kymab Limited | Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses and methods |
| CN110325550B (zh) | 2016-12-23 | 2024-03-08 | 诺华股份有限公司 | 因子xi抗体和使用方法 |
| JP7110199B2 (ja) | 2016-12-23 | 2022-08-01 | ノバルティス アーゲー | 抗第ＸＩ／ＸＩａ因子抗体による処置法 |
| ES3035810T3 (en) | 2017-02-08 | 2025-09-09 | Novartis Ag | Fgf21 mimetic antibodies and uses thereof |
| MX2019014023A (es) | 2017-05-24 | 2020-02-17 | Novartis Ag | Proteinas de anticuerpo injertadas con citocina y metodos de uso en el tratamiento del cancer. |
| CN111107868A (zh) | 2017-05-24 | 2020-05-05 | 诺华股份有限公司 | 抗体细胞因子移植蛋白及使用方法 |
| JOP20190271A1 (ar) | 2017-05-24 | 2019-11-21 | Novartis Ag | بروتينات مطعّمة بسيتوكين- الجسم المضاد وطرق الاستخدام للاضطرابات المتعلقة بالمناعة |
| WO2018215937A1 (en) | 2017-05-24 | 2018-11-29 | Novartis Ag | Interleukin-7 antibody cytokine engrafted proteins and methods of use in the treatment of cancer |
| WO2018229715A1 (en) | 2017-06-16 | 2018-12-20 | Novartis Ag | Compositions comprising anti-cd32b antibodies and methods of use thereof |
| US11707522B2 (en) | 2017-10-13 | 2023-07-25 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Human antibodies to Tn antigen |
| US20210040205A1 (en) | 2017-10-25 | 2021-02-11 | Novartis Ag | Antibodies targeting cd32b and methods of use thereof |
| CN112004558A (zh) | 2018-04-12 | 2020-11-27 | 米迪亚制药有限责任公司 | Lgals3bp抗体-药物-偶联物及其用于癌症的治疗的用途 |
| TWI869346B (zh) | 2018-05-30 | 2025-01-11 | 瑞士商諾華公司 | Ｅｎｔｐｄ２抗體、組合療法、及使用該等抗體和組合療法之方法 |
| US11492409B2 (en) | 2018-06-01 | 2022-11-08 | Novartis Ag | Binding molecules against BCMA and uses thereof |
| MA53160A (fr) | 2018-07-20 | 2021-05-26 | Pf Medicament | Récepteur pour vista |
| AU2019349651B2 (en) | 2018-09-27 | 2023-12-07 | Celgene Corporation | SIRP alpha binding proteins and methods of use thereof |
| UY38407A (es) | 2018-10-15 | 2020-05-29 | Novartis Ag | Anticuerpos estabilizadores de trem2 |
| EP3947442A2 (en) | 2019-03-28 | 2022-02-09 | Danisco US Inc. | Engineered antibodies |
| EP3972993A1 (en) | 2019-05-21 | 2022-03-30 | Novartis AG | Variant cd58 domains and uses thereof |
| KR20250156861A (ko) | 2019-05-21 | 2025-11-03 | 노파르티스 아게 | Cd19 결합 분자 및 이의 용도 |
| TW202124446A (zh) | 2019-09-18 | 2021-07-01 | 瑞士商諾華公司 | 與ｅｎｔｐｄ２抗體之組合療法 |
| CN114502590A (zh) | 2019-09-18 | 2022-05-13 | 诺华股份有限公司 | Entpd2抗体、组合疗法、以及使用这些抗体和组合疗法的方法 |
| TWI877278B (zh) | 2019-12-30 | 2025-03-21 | 美商思進公司 | 以非海藻糖苷化抗－ｃｄ７０抗體治療癌症之方法 |
| WO2021202473A2 (en) | 2020-03-30 | 2021-10-07 | Danisco Us Inc | Engineered antibodies |
| EP4143224A1 (en) | 2020-05-01 | 2023-03-08 | Novartis AG | Immunoglobulin variants |
| EP4143236A1 (en) | 2020-05-01 | 2023-03-08 | Novartis AG | Engineered immunoglobulins |
| TW202212354A (zh) | 2020-08-03 | 2022-04-01 | 美商健生生物科技公司 | 用於病毒治療劑中之多向生物運輸的材料及方法 |
| EP4240491A1 (en) | 2020-11-06 | 2023-09-13 | Novartis AG | Cd19 binding molecules and uses thereof |
| WO2022147463A2 (en) | 2020-12-31 | 2022-07-07 | Alamar Biosciences, Inc. | Binder molecules with high affinity and/ or specificity and methods of making and use thereof |
| EP4362977A1 (en) | 2021-06-29 | 2024-05-08 | Seagen Inc. | Methods of treating cancer with a combination of a nonfucosylated anti-cd70 antibody and a cd47 antagonist |
| UY40097A (es) | 2022-01-07 | 2023-07-14 | Johnson & Johnson Entpr Innovation Inc | Materiales y métodos de proteínas de unión a il-1b |
| CA3255838A1 (en) | 2022-04-26 | 2023-11-02 | Novartis Ag | MULTISPECIFIC ANTIBODIES TARGETTING IL-13 AND IL-18 |
| JP2025525530A (ja) | 2022-07-15 | 2025-08-05 | ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド | 抗原結合可変領域の改善された生物工学による対合のための材料及び方法 |
| EP4554619A1 (en) | 2022-07-15 | 2025-05-21 | Danisco US Inc. | Methods for producing monoclonal antibodies |
| EP4612165A1 (en) * | 2022-11-02 | 2025-09-10 | Synerkine Pharma B.V. | Engineered immunocytokines, fusion polypeptides, and il10 polypeptides |
| WO2024130158A1 (en) | 2022-12-16 | 2024-06-20 | Modernatx, Inc. | Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding extended serum half-life interleukin-22 for the treatment of metabolic disease |
| WO2025104604A1 (en) | 2023-11-14 | 2025-05-22 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Anti-respiratory syncytial virus antibodies and uses thereof |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988007089A1 (en) * | 1987-03-18 | 1988-09-22 | Medical Research Council | Altered antibodies |
| KR900005995A (ko) * | 1988-10-31 | 1990-05-07 | 우메모또 요시마사 | 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법 |
| DE59109269D1 (de) * | 1990-06-28 | 2005-12-15 | Hoechst Ag | Fusionsproteine mit Immunglobulinanteilen, ihre Herstellung und Verwendung |
| DE4137333A1 (de) * | 1991-11-13 | 1993-05-19 | W Prof Dr Sebald | Therapeutische mittel, die antagonisten oder partielle agonisten des humanen interleukin 4 sind oder diese enthalten, hil-4-mutantenproteine sowie vefahren zu deren herstellung |
-
1995
- 1995-07-28 CN CN95195305A patent/CN1117155C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-07-28 MX MX9700764A patent/MX9700764A/es unknown
- 1995-07-28 CA CA002196200A patent/CA2196200A1/en not_active Abandoned
- 1995-07-28 CZ CZ97256A patent/CZ25697A3/cs unknown
- 1995-07-28 HU HU9700260A patent/HUT76369A/hu unknown
- 1995-07-28 NZ NZ292124A patent/NZ292124A/xx unknown
- 1995-07-28 WO PCT/EP1995/003036 patent/WO1996004388A1/en not_active Ceased
- 1995-07-28 JP JP8506192A patent/JPH10503371A/ja not_active Ceased
- 1995-07-28 EP EP95930435A patent/EP0770135A1/en not_active Withdrawn
- 1995-07-28 BR BR9508469A patent/BR9508469A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-07-28 AU AU33825/95A patent/AU3382595A/en not_active Abandoned
-
1997
- 1997-01-28 NO NO970374A patent/NO970374L/no not_active Application Discontinuation
- 1997-03-27 PL PL95318380A patent/PL182665B1/pl not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NZ292124A (en) | 1998-10-28 |
| PL182665B1 (pl) | 2002-02-28 |
| AU3382595A (en) | 1996-03-04 |
| BR9508469A (pt) | 1997-09-16 |
| PL318380A1 (en) | 1997-06-09 |
| MX9700764A (es) | 1997-05-31 |
| JPH10503371A (ja) | 1998-03-31 |
| CN1117155C (zh) | 2003-08-06 |
| NO970374D0 (no) | 1997-01-28 |
| CN1164872A (zh) | 1997-11-12 |
| EP0770135A1 (en) | 1997-05-02 |
| WO1996004388A1 (en) | 1996-02-15 |
| HUT76369A (en) | 1997-08-28 |
| CA2196200A1 (en) | 1996-02-15 |
| NO970374L (no) | 1997-02-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ25697A3 (en) | Novel compounds | |
| US5783181A (en) | Therapeutic uses of fusion proteins between mutant IL 4/IL13 antagonists and immunoglobulins | |
| CA2406807C (en) | Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia | |
| JP4288159B2 (ja) | 直列連鎖体を有する免疫接合体 | |
| AU2018260545B2 (en) | Multispecific molecules comprising a non-immunoglobulin heterodimerization domain and uses thereof | |
| EP1606318B1 (en) | Improved fc fusion proteins | |
| TWI784288B (zh) | Ｆｃ區之多肽及包含其之Ｆｃ融合蛋白 | |
| AU650893B2 (en) | O-glycosylated alpha-2 interferon | |
| US8268588B2 (en) | Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia | |
| AU657788B2 (en) | Chimaeric interleukin 5-receptor/immunoglobulin polypeptides | |
| US8871907B2 (en) | Glycosylated immunoglobulin and immunoadhesin comprising the same | |
| AU2002313952A1 (en) | Concatameric immunoadhesion | |
| JPH05507420A (ja) | 組換えヒト第８因子誘導体 | |
| WO1997000319A2 (en) | Chimeric leptin fused to immunoglobulin domain and use | |
| CA2295149A1 (en) | Fusion proteins with an immunoglobulin hinge region linker | |
| JPH11507843A (ja) | タンパク質の可溶性二価および多価ヘテロ二量体類縁体 | |
| AU2023200875A1 (en) | UTI fusion proteins | |
| US5998598A (en) | Immunoadhesins and methods of production and use thereof | |
| US7557084B2 (en) | IL-18 specific polypeptides and therapeutic uses thereof | |
| EP4306545A1 (en) | Fusion protein of tnfr2 and april baff receptor | |
| KR100418329B1 (ko) | 직렬 연쇄체를 갖는 면역접합체 | |
| AU1196402A (en) | Novel compounds | |
| AU2023327477A1 (en) | IL-15 MUTANT-FC/IL-15Rα SUBUNIT-FC HETERODIMER AND USE THEREOF | |
| AU2140699A (en) | Novel compounds | |
| WO2024253944A2 (en) | Interleukin-15 fusion protein and methods of use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |