CZ20032414A3

CZ20032414A3 - Deriváry 3-(4-aminopyrrol-2-ylmethyliden-2-indolinonu jako inhibitory proteinkinázy

Info

Publication number: CZ20032414A3
Application number: CZ20032414A
Authority: CZ
Inventors: Huiping Guan; Congxin Liang; Li Sun; Peng Cho Tang; Chung Chen Wei; Michael A. Mauragis; Tomas Vojkovsky; Oingwu Jin; Paul Matthew Herrington
Original assignee: Sugen, Inc; Pharmacia & Upjohn Company
Priority date: 2001-02-15
Filing date: 2002-02-15
Publication date: 2004-04-14
Also published as: YU71703A; ZA200405615B; US20030092917A1; TWI324155B; US20070027149A1; HRP20030657B1; IL157418A; EA200300793A1; KR20030078921A; AR042586A1; NZ527572A; US7256189B2; SK11332003A3; RS51026B; IS6913A; CN100338059C; MXPA03007367A; NO20033608D0; WO2002066463A1; BG108098A

Description

Deriváty 3-(4-aminopyrrol-2-ylmethyliden)-2-indolinonu jako inhibitory proteinkinázy

Prioritní přihlášky

Tato přihláška prohlašuje prioritu předběžné přihlášky 60/312,361 registrované dne 15. srpna 2001 a předběžné přihlášky 60/268,683 registrované dne 15. února 2001, jejichž obsah se zde ve své úplnosti zahrnuje jako odkaz.

Oblast techniky

Předložený vynález se týká určitých derivátů 3-(4-aminopyrrol-2-ylmethyliden)-2-indolinonu, které modulují aktivitu proteinkináz („PK). Sloučeniny tohoto vynálezu jsou proto užitečné při léčení poruch vztahujících se k abnormální PK aktivitě. Patentují se také farmaceutické směsi zahrnující tyto sloučeniny, způsoby léčení nemocí využívající farmaceutické přípravky obsahující tyto sloučeniny a způsoby jejich přípravy.

Dosavadní stav techniky

Proteinkinázy jsou enzymy, které katalyzují fosforylaci hydroxylových skupin tyrosinových, serinových a threoninových zbytků proteinů. Následky této zdánlivě prosté aktivity jsou ohromující: růst buněk, diferenciace a proliferace, tj. prakticky všechny aspekty života buňky tím či oním způsobem závisejí na PK aktivitě. Kromě toho abnormální aktivita se uvedla do souvislosti s velkým množstvím poruch, rozprostírajících se od relativně život neohrožujících onemocnění, například psoriázy, po smrtelná nemoci, například glioblastom (rakovina mozku).

Proteinkinázy lze výhodně rozdělit na dvě třídy, proteintyrosinkinázy (PTK) a serotin-threoninkinázy (STK).

Jedním z primárních aspektů PTK aktivity je jejich zapojení s receptory faktoru růstu. Receptory faktoru růstu jsou proteiny buněčného povrchu. Když se navážou na ligand růstového faktoru, konvertují se receptory růstového faktoru na aktivní formu, která působí s proteiny na vnitřním povrchu membrány buňky. Vede to k fosforylaci na tyrosinovém zbytku receptoru a jiných proteinů a k tvorbě komplexů uvnitř buňky s rozličnými signálními molekulami cytoplasmy, které zase ovlivňují početné buněčné odezvy, například dělení buněk (proliferace), diferenciaci buněk, růst buněk, expresi metabolických účinků do extracelulárního mikroklimatu atd. Pro více vyčerpávající diskusi viz práci Schlessinger a Ullrich, Neuron, 1992, 9, 303-391, která se zahrnuje jako odkaz, včetně jakýchkoli obrázků, jako kdyby se vysvětlovaly zde.

Receptory růstového faktoru s PTK aktivitou jsou známé jako receptory tyrosinkináz („RTK). Zahrnují velikou skupinu transmembránových receptorů s rozličnou biologickou aktivitou. V současnosti se identifikovalo přinejmenším devatenáct (19) rozdílných podskupin RTK. Jejich příkladem je podskupina označovaná jako „HER RTK, která zahrnuje EGFR (epitělový receptor růstového faktoru), HER2, HER3 a HER4. Tyto RTK sestávají z extracelulární glykosylováné domény, která váže ligand, transmembránové domény a intracelulární cytoplasmaťické katalytické domény, která může fosforylovat tyrosinové zbytky proteinů.

Jiná podskupina RTK sestává z receptoru insulinu (IR) , receptoru růstového faktoru I podobného inzulínu (IGF-1R) a receptoru vztahujícímu se k inzulínu (IRR). IR a IGF-1R interagují s inzulínem, IGF-I a IGF-II, aby vytvořily

heterotetramer dvou zcela extracelulárních \glykosylovaných a subjednotek a dvou β subjednotek, které překračují buněčnou membránu a které obsahují doménu tyrosinkinázy.

třetí podskupině RTK se mluví jako o skupině receptorů růstového faktoru odvozeného z krevních destiček („PDGFR) , která zahrnuje PDGFRoí, ΡϋΰΓΡβ, CSFIR, c-kit a c-fms. Tyto receptory sestávají z glykosylovaných extracelulárních domén složených z rozličného počtu smyček podobných imunoglobulinu a intracelulární domény, ve které doména tyrosinkinázy je přerušena nesouvisejícími sekvencemi aminokyselin.

Další skupina, která je díky své podobnosti s podskupinou PDGFR někdy řazena k této podskupině, je podskupina receptorů fetální játrové kinázy („flk). 0 této'skupině se má za to, že je tvořena do kinázy vloženou receptorovou doménou fetální játrové kinázy-1 (KDR/FLK-1, VEGF-R2), flk-lR, flk-4 a fms podobné tyrosinkinázy 1 (flt-1)'.

Dalším členem skupiny receptorů růstového faktoru tyrosinkinázy je podskupina receptorů fibroblastového růstového faktoru („FGF). Tato skupina sestává ze čtyř receptorů, FGFR1-4 a sedmi ligand, FGF1-7. I když dosud nejsou zcela definovány, zdá se, že receptory sestávají z glykosylované extracelulární domény obsahující proměnlivý počet smyček podobných imunoglobulinu a intracelulární domény, ve které je sekvence tyrosinkinázy přerušena oblastmi nesouvisejících sekvencí aminokyselin.

Ještě dalším členem skupiny receptorů růstového faktoru tyrosinkinázy je podskupina receptorů vaskulárního endotelového růstového faktoru („VEGF). VEGF je dimerický glykoprotein podobný PDGF, ale má odlišné biologické funkce a cílenou buněčnou specificitu ^: in vivo. 0 VEGF se má ·· · · · · · · · · • · · ·· · · ·· ····· ·· · · · · ·· ··· ·· v současnosti zvláště za to, že hraje podstatnou roli při vaskulogenezi a angiogenezi.

Úplnější seznam známých RTK podskupin se popisuje v Plowman a spol. : DN&P, 1994, 7 (6), 334-339, v práci, která se zahrnuje jako odkaz, včetně jakýchkoli obrázků, jako kdyby se vysvětlovaly zde.

Navíc k RTK existují zcela intracelulární RTK nazývané „nereceptorové tyrosinkinázy nebo „celulární tyrosinkinázy. Zde se bude používat toto posledně uvedené označení, ve zkratce „CTK. CTK neobsahují extracelulární a transmembránové domény. V současnosti se identifikovalo více než 24 CTK v 11 podskupinách (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes, Fps, Fak, Jak a Ack). Podskupina Src se dosud jeví jako největší skupina CTK a zahrnuje Src, Yes, Fyn, Lyn, Lek, Blk, Hek, Fgr a Yrk. Pro podrobnější diskusi odkazujeme na práci: Bolen, Oncogene, 1993, 8, 2025-2031, která se zahrnuje jako odkaz, včetně jakýchkoli obrázků, jako kdyby sé vysvětlovaly zde.

Serin/threotinkinázy, STK, jako kinázy CTK, jsou převážně intracelulární, ačkoli existuje několik málo receptorových kináz typu STK.. STK jsou nejčastější cytosolické kinázy; tj. kinázy, které vykonávají svoji funkci v té části cytoplazmy, která je jiná než cytoplazmatické órganely a cytoskeleton. Cytosol je oblast uvnitř buňky, kde dochází k většině buněčné intermediární metabolické a biosyntétické aktivitě; např. právě v cytosolu se proteiny syntetizují na ribozomech.

U všech RTK, CTK' a STK se prokázala účast ve velkém množství patogenních stavů, příznačně včetně rakoviny. Další patogenní stavy, které se spojují s RTK zahrnují, aniž by se tím omezovaly, psoriázu, cirhózu jater, diabetes, angiogenezy, restenózu, oční nemoci, revmatoidní artritidu a jiná zánětlivá • · · • ·

onemocnění, imunologické poruchy, například aterosklerózu a rozličné poruchy ledvin.

Z hlediska rakoviny se rozvinuly dvě hlavní hypotézy pro vysvětlení nepřiměřeného bujení buněk, které pohání rozvoj nádoru vztahujícího se k funkcím, o kterých se ví, že se regulují PK. Znamená to, že se má za to, že růst maligní buňky je výsledkem zhroucení mechanismu, který řídí buněčné dělení a/nebo diferenciaci. Prokázalo se, že proteinové produkty řady protoonkogenů se zapojují do signálních transdukčních cest, které regulují růst a diferenciaci buněk. Tyto proteinové produkty protoonkogenů zahrnují výše diskutované extracelulární růstové faktory, transmembránóvé růstové faktory PTK receptorů (RTK), cytoplazmatické PTK (ČTK) a cytosolické STK.

10709, Kim a spol. (Jelínek a spoi.:

Z hlediska zřejmé spojitosti mezi buněčnými aktivitami vztahujícími se k PK a širokou rozmanitostí poruch v lidském organismu nepřekvapuje,' že ohromné úsilí se vynakládá na pokusy směřující k poznání způsobů, jak modulovat PK aktivitu. Část tohoto úsilí se zaměřuje ha přístupy napodobující biologické systémy použitím velkých molekul modelujících ty molekuly, které se účastní ve skutečných buněčných procesech (např. mutantní ligandy (U.S' přihláška č. 4,966,849), rozpustné receptory a protilátky (přihláška č. WO 94/10202, Kandall and Thomas: Proč. Naťl Acad. Sci., 1994, 90, 10.705Nature, 1993, 362, 841-844), ligandy RNA

Biochemistry, 33, 10450-10456, Takano a spol.: Mol. Bio. Cell, 1993, 4, 358A, Kinsella a spol.: Exp. Cell Res., 1992, 199, 56-62, Wríght a spol.: J. Cellular

Phys., 152, 448-457) a inhibitory tyrosinkinázy (WO 94/03427,

WO 92/21660, WO 91/15495, WO 94/14808, U.S. patent č. 5,330,992, Mariani a spol.: Proč. &m. Ássoc. Cancer Res., 1994, 35, 2268).

• ·

Navíc k výše uvedenému se uskutečnily pokusy zaměřené na poznání malých molekul, které působí jako inhibitory PK. Jako inhibitory tyrosinkinázy byly například popsány bismonocyklické, bicyklické a heterocyklické arylové sloučeniny (PCT WO 92/20642), deriváty vinylen-azaindolu (PCT WO 94/14808) a l-cyklopropyl-4-pyridylchinolony (U.S. patent č. 5,330,992). Jako prospěšné při léčení rakoviny byly popsány PTK inhibitory zahrnující styrylové sloučeniny (U.S. patent č. 5,217,999), pyridylové sloučeniny substituované styrylem (U.S. patent č. 5,302,606), deriváty chinazolinu (EP přihláška č. 0 566 266 AI), selenindoly a selenidy (PCT WO 94/03427), tricyklické polyhydroxylové sloučeniny (PCT WO 92/21660) a sloučeniny kyseliny benzylfosfonové (PCT WO 91/15495).

Podstata vynálezu

Shrnutí vynálezu

Předmětem předloženého vynálezu jsou určité deriváty 3-(4amidopyrrol-2-ylmethyliden)-2-indolinonu, které vykazují schopnost modulovat PK a jsou proto prospěšné při léčení poruch spojených s abnormální aktivitou PK.

Předmětem jednoho provedení tohoto vynálezu je sloučenina

O) kde

R¹ se vybere ze skupiny sestávající z vodíku, skupiny • · · • ·· ·« halo, alkyl, haloalkoxy, cykloalkyl, heteroalicyklické, hydroxy, alkoxy, -C(O)R⁸, -NR⁹R¹⁰ a -C (0) NR¹²R¹³,

R² se vybere ze skupiny sestávající z vodíku, skupiny halo, alkyl, trihalomethyl, hydroxy, alkoxy, kyano, -NR⁹R¹⁰, -NR⁹C(O)R¹⁰, -C(0)R⁸, -S(O)2NR⁹R¹⁰ a -SO2R¹⁴ (kde R¹⁴ je alkyl, aryl, aralkyl, heteroaryl a heteroaralkyl),

R³, R⁴ a R⁵ jsou nezávisle vodík nebo alkyl,

Z je aryl, heteroaryl, heterocyklus nebo -NR¹⁵R¹⁶, kde R¹⁵ a R¹⁶ jsou nezávisle vodík nebo alkyl/ nebo R¹⁵ a R¹⁶ společně s atomem dusíku, ke kterému se připojují, tvoří heterocykloaminovou skupinu,

R⁶ se vybere ze skupiny sestávající z vodíku nebo alkylu,

R⁷ se vybere ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, arylu, heteroaryíu a -C(O)R¹⁷,

R⁸ se vybere ze skupiny sestávající ze skupiny hydroxy, alkoxy a aryloxy,

R⁹ a	R¹⁰ se	nezávisle vyberou	ze	skupiny	sestávající
z vodíku,	alkylu,	kyanoalkylu,	cykloalkylu,	arylu a
heteroaryíu	nebo
se R⁹	a R¹⁰	spojí, aby vytvořily	heterocykloaminovou
skupinu,
R¹² a	R¹³ se	nezávisle vyberou	ze	skupiny	sestávaj ící

z vodíku, alkylu, hydroxyalkylu a arylu; nebo R¹² a R¹³ společně s atomem dusíku, ke kterému se připojují, tvoří heterocykloaminovou skupiny,

R¹⁷ se vybere ze skupiny sestávající z hydroxylu, alkylu, cykloalkylu, arylu a heteroaryíu, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl,

Předmětem dalšího provedení vynálezu je sloučenina vzorce (I) , kde • ·

R¹ se vybere ze skupiny sestávající z vodíku, skupiny halo, alkyl, cykloalkyl, heteroalicyklycké, hydroxy, alkoxy, -C(O)R⁸, -NR⁹R¹⁰ a -C (O)NR¹²R¹³,

R² se vybere ze skupiny sestávající z vodíku, skupiny halo, alkyl, trihalomethyl, hydroxy, alkoxy, kyano, -NR⁹R¹⁰, -NR⁹C(O)R¹⁰, -C(O)R⁸, -S(O)2NR⁹R¹⁰ a -SO2R¹⁴ (kde R¹⁴ je alkyl, aryl, aralkyl, heteroaryl a heteroaralkyl) ,

R³, R⁴ a R⁵ jsou nezávisle vodík nebo alkyl,

Z je aryl, heteroaryl, heterocyklus nebo NR¹⁵R¹⁶, kde R¹⁵ a R¹⁶ jsou nezávisle vodík nebo alkyl; nebo R¹⁵ a R¹⁶ společně s atomem dusíku, ke kterému se připojují, tvoří heterocykloaminovou skupinu,

R⁶ se vybere ze skupiny sestávající z vodíku nebo alkylu,

R⁷ se vybere ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, arylu, heteroarylu a -C(O)R¹⁷,

R⁸ se vybere ze skupiny sestávající ze skupiny hydroxy, alkoxy a aryloxy,

R⁹ a R¹⁰ se nezávisle vyberou ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, kyanoalkylu, cykloalkylu, arylu a heteroarylu nebo se R⁹ a R¹⁰ spojí, aby vytvořily heterocyklickou skupinu,

R¹² a R¹³ se nezávisle vyberou ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu a arylu nebo R¹² a R¹³ společně s atomem dusíku, ke kterému se připojují, tvoří heterocyklickou skupinu,

R¹⁷ se vybere ze skupiny sestávající z hydroxylu, alkylu, cykloalkylu, arylu a heteroarylu, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

Předmětem dalšího provedení vynálezu je sloučenina vzorce (Ia) :

·· ·· ·· · ·* · ···· · · ·· · · · ·· · 9 9 9 9 9 9 9

9 9 99 9 9 99 9 9999

9 9 9 9 9 9 9 9

kde

R¹, R³, R⁴ a R⁵ jsou vodík,

R² je fluor a je umístěn v pozici 5 kruhu indolinonu,

Z je morfolin-4-yl,

R⁶ a R⁷ jsou methyl.

Stereochemická konfigurace na uhlíku *C je výhodně (S) .

Předmětem dalšího provedení vynálezu je sloučenina vzorce (II):

kde

R je vodík nebo alkyl,

R¹ se vybere ze skupiny sestávající z vodíku, skupiny halo, alkyl, haloalkoxy, cykloalkyl, heteroalicyklické, hydroxy, alkoxy, -C(O)R⁸, -NR⁹R¹⁰ a -C (0) NR¹²R¹³,

R² se vybere ze skupiny sestávající z vodíku, skupiny halo, alkyl, trihalomethyl, hydroxy, alkoxy, kyano, -NR⁹R¹⁰, -NR⁹C(O)R¹⁰, -C(O)R⁸, -S(O)2NR⁹R¹⁰ a -SO2R¹⁴ (kde R¹⁴ je alkyl, • · • · · · · · ♦··· • · · ·· · · · · · · · · * • « · · · · ··· »· ···· ·· ·*· ·· * aryl, aralkyl, heteroaryl a heteroaralkyl),

R³, R⁴ a R⁵ jsou nezávisle vodík nebo alkyl,

Z je aryl, heteroaryl, hyterocyklus nebo -NR¹⁵R¹⁶, kde R¹⁵ a R¹⁶ jsou nezávisle vodík nebo alkyl; nebo R¹⁵ a R¹⁶ společně s atomem dusíku, ke kterému se připojují, tvoří heterocykloaminovou skupinu,

R⁶ se vybere ze skupiny sestávající z vodíku nebo alkylu,

R⁸ se vybere ze skupiny sestávající ze skupiny hydroxy, alkoxy a aryloxy,

R⁹ a	R¹⁰ se	nezávisle vyberou ze skupiny	sestavaj ící
z vodíku,	alkylu,	kyanoalkylu, cykloalkylu,	arylu a
heteroarylu	nebo
se R⁹	a R¹⁰	spojí, aby vytvořily heterpcykloaminovou
skupinu,
R¹² a	R¹³ se	nezávisle vyberou ze skupiny	sestávající

z vodíku, alkylu, hydroxyalkylu a arylu; nebo R¹² a R¹³ společně s atomem dusíku, ke kterému se připojují, tvoří heterocykloaminovou skupinu,

Předmětem dalšího provedení vynálezu je farmaceutický přípravek obsahující sloučeninu nebo sůl sloučeniny vzorců (I), (Ia) nebo (II) a farmaceuticky přijatelný nosič nebo pomocnou látku. .

Předmětem dalšího provedení vynálezu je způsob modulace katalytické aktivity proteinkinázy zahrnující uvedení do • 9 *· 99 • ·· 9 ·· 9*9 • »99»

9 9 9 ···· • · · · ••9 9 kontaktu proteinkinázy se sloučeninou nebo solí sloučeniny vzorce (I) , (Ia) nebo (II). Pro tento způsob může být proteinkinázou receptorová tyrosinkináza, nereceptorová tyrosinkináza a serin-threoninkináza.

Předmětem dalšího provedení vynálezu je způsob léčení nebo prevence poruchy vztahující se k proteinkináze v organismu zahrnující podávání terapeuticky účinného množství farmaceutického přípravku obsahujícího sloučeninu nebo sůl (Ia) nebo (II) a farmaceuticky pomocnou způsob sloučeniny vzorce přijatelný nosič Proteinkinázou pro tyrosinkináza, threoninkináza (I) , nebo tento látku muže do být organismu, receptorová a serinnereceptorová tyrosinkináza Poruchou vztahující se k proteinkináze může být porucha související s EGFR, porucha související s PDGFR, porucha související s IGFR a porucha související s flk. Poruchou vztahující se k proteinkináze může být také karcinom skvamózních buněk, astrocytom, Kaposiho sarkom, glioblastom, rakovina plic, rakovina močového měchýře, rakovina hlavy a krku, melanom, rakovina vaječníků, rakovina prostaty, rakovina prsníku, malobuněčný plícní karcinom, gliom, kolorektální karcinom, genitourinální rakovina a rakovina gastrointestinálního traktu. Poruchou související s proteinkinázou může být navíc diabetes, porucha autoimunitního systému, hyperproliferační porucha, restenóza, fibróza, psoriáza, nemoc von Heppel-Lindaua, osteoartritida, revmatoidní artritida, angiogeneze, zánětlivé poruchy, imunologické poruchy a kardiovaskulární poruchy. Tyto způsoby lze použít pro léčení lidí.

Předmětem dalšího provedení tohoto vynálezu jsou způsoby přípravy sloučenin vzorce (1) .

Předmětem tohoto vynálezu je nakonec také identifikace • · chemické sloučeniny, která moduluje katalytickou aktivitu proteinkinázy uvedením do kontaktu buněk exprimujících proteinkinázu se sloučeninou nebo solí sloučeniny předloženého vynálezu a potom monitorování buněk z hlediska účinku.

Podrobný popis vynálezu

Definice

Následující výrazy, které se používají v specifikaci a patentových nárocích, mají níže diskutované významy, pokud se neuvede jinak.

Výraz „alkyl se vztahuje k nasycené alifatické uhlovodíkové skupině zahrnující nerozvětvené a rozvětvené řetězce s jedním až dvaceti atomy uhlíku (uvede-li se zde kdekoli číselný rozsah, například „1-20, znamená to, že v tomto případě může alkylová skupina obsahovat jeden atom uhlíku, dva atomy uhlíku, tři atomy uhlíku atd., až do obsahu dvaceti atomů uhlíku). Výhodnější jsou středně velké alkyly s jedním až deseti atomy uhlíku, například methyl, ethyl, propyl, 2-propyl, n-butyl, isobutyl, terc-butyl, pentyl a podobně. Nejvýhodnější jsou nižší alkyly s jedním až čtyřmi atomy uhlíku, například methyl, ethyl, propyl, 2-propyl, nbutyl, isobutyl nebo teřc-butyl a podobně. Alkyly mohou nést substituent nebo být bez něho, a když mají substituent, potom je výhodnou skupinou nebo skupinami substituentů skupina halo, hydroxy, nižší alkoxy, aryl, aryloxy, heteroaryl, heteroalicyklická, -C(O)R⁸, -NR⁹R¹⁰ a -C(O)NR⁹R¹⁰.

Výraz „cykloalkyl se vztahuje . ke tří až osmičlennému monocyklickému 'kruhu složenému výlučně z atomů uhlíku, pětičlennému a šestičlennému nebo šestičlennému a šestičlennému kondenzovanému bicyklickému nebo multicyklickému • · • · • · · ·· · · („kondenzovaný kruh sousedící pár atomů kde jeden nebo více kruhu složenému výlučně z atomů uhlíku znamená, že každý kruh v systému sdílí uhlíku s každým dalším kruhem v systému), kruhů může obsahovat jednu nebo více dvojných vazeb, ale žádný z kruhů nemá úplný konjugovaný systém π elektronů. Aniž by došlo k omezení, jsou příklady cykloalkylových skupin cyklopropan, cyklobutan, cyklopentan, cyklopenten, cyklohexan, cyklohexadien, adamantan, cykloheptan, cykloheptatrien a podobně. Cykloalkylová skupina může mít substituent nebo být bez něho. Když se substituuje, skupinou nebo skupinami substituentů jsou výhodně jeden nebo více, výhodněji jeden nebo dva substituenty, nezávislé vybrané ' ze skupiny sestávající z nižšího alkylu, trihaloalkylu, skupiny halo, hydroxy, nižší alkoxylové skupiny, arylové skupiny volitelně substituované jednou nebo více, výhodně jednou nebo dvěma vzájemně nezávislými skupinami halo, hydroxy, nižšími alkylovými nebo nižšími alkoxylovými skupinami, aryloxy skupinou volitelně substituovanou jedním nebo více, výhodně jednou nebo dvěma vzájemně nezávislými skupinami halo, hydroxy, nižšími alkylovými nebo nižšími alkoxylovými skupinami, šestičlennou heteroarylovou skupinou, která má od jednoho do tří atomů dusíku v kruhu, jejíž uhlíkové atomy v kruhu jsou volitelně substituované jednou nebo více, výhodně jednou nebo dvěma vzájemně nezávislými skupinami halo, hydroxy, nižšími alkylovými nebo nižšími alkoxylovými skupinami, pětičlennou heteroarylovou skupinou, která má od jednoho do tří heteroatomů vybraných ze skupiny sestávající z dusíku, kyslíku a síry, jejíž uhlíkové a dusíkové atomy v kruhu jsou volitelně substituované jednou nebo více, výhodně jednou nebo dvěma vzájemně nezávislými skupinami halo, hydroxy, nižšími alkylovými nebo nižšími alkoxylovými skupinami, pěti' nebo šestičlennou heteroalicyklickou skupinu, která má od jednoho do tří heteroatomů vybraných ze skupiny sestávající z dusíku, kyslíku a siry, jejíž uhlíkové a

dusíkové (jsou-li přítomné) atomy ve skupině jsou volitelně substituované jednou nebo více, výhodně jednou nebo dvěma vzájemně nezávislými skupinami halo, hydroxy, nižšími alkylovými nebo nižšími alkoxylovými skupinami, merkapto (nižší alkyl)thio skupinou, skupinou arylthio volitelně substituovanou jednou nebo více, výhodně jednou nebo dvěma vzájemně nezávislými skupinami halo, hydroxy, nižšími alkylovými nebo nižšími alkoxylovými skupinami, skupinou kyano, acyl, thioacyl, O-kabamyl, N-karba-myl, O-thiokarbamyl, N-thiokarbamyl, C-amido, N-amido, nitro, N-sulfonamido, Ssulfonamido, R⁹S(O)-, R⁹S(O)₂-, -C(O)OR⁹, R⁹C(O)O- a -NR⁹R¹⁰, kde R⁹ a R¹⁰ se definují výše.

Výraz „alkenyl, jak se zde definuje, se vztahuje k alkylové skupině obsahující alespoň dva atomy uhlíku a alespoň jednu dvojnou vazbu mezi dvěma atomy uhlíku. Reprezentativní příklady zahrnují, ale nejsou omezeny na ethenyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-/ 2-, nebo 3-butenyl a podobně.

Výraz „alkynyl, jak se zde . definuje, se vztahuje k alkylové skupině obsahující alespoň dva atomy uhlíku a alespoň jednu trojnou vazbu mezi dvěma atomy uhlíku. Reprezentativní příklady zahrnují, ale nejsou omezeny na ethynyl, 1-propynyl, 2-propynyl, 1-, 2-, nebo 3-butynyl a podobně.

Výraz „aryl se vztahuje k monocyklickým nebo polycyklickým kondenzovaným kruhovým systémům (tj . kruhům, které sdílejí sousedící pár atomů uhlíku) vytvořených výlučně šesti až dvanácti atomy uhlíku, které mají úplný konjugovaný systém π elektronů. Příklady arylových skupin jsou, aniž by se tím omezovaly, fenyl, naftyl a antryl. Arylová skupina může být substituována nebo nesubstituována. Když je substituována, je substituční skupinou nebo skupinami výhodně jedna nebo více, výhodněji jedna, dvě nebo tři a ještě výhodněji, jedna nebo dvě skupiny, které se nezávisle vyberou ze skupiny sestávající z nižšího alkylu, trihaloalkylu, skupiny halo, hydroxy, nižší alkoxy, merkapto (nižší alkyl)thio, kyano, acyl, thioacyl, 0karbamyl, N-karbamyl, O-thiokarbamyl, N-thiokarbamyl, C-amido, N-amido, nitro, N-sulfonamido, S-sulfonamido, R⁹S(O)-, R⁹S(O)₂, -C(O)OR⁹, R⁹C(O)O- a -NR⁹R¹⁰, kde R⁹ a R¹⁰ se definují výše.

Výhodně se arylová skupina volitelně substituje jedním nebo dvěma substituenty nezávisle vybranými ze skupiny halo, nižší alkyl, trihaloalkyl, hydroxy, merkapto, kyano, N-amido, mono nebo dialkylamino, karboxy nebo N-sulfonamido.

Výraz „heteroaryl se vztahuje k monocyklické nebo kondenzované (tj. kruhům, které sdílejí sousedící pár atomů) cyklické skupině s pěti až dvanácti atomy v kruhu obsahujícími jeden, dva, tři nebo čtyři heteroatomy vybrané z N, 0 nebo S, zbytek atomů tvoří atomy C a navíc tato cyklická skupina má úplný konjugovaný systém π elektronů. Příklady heteroarylových skupin jsou, aniž by se tím omezovaly/' pyrrol, furan, thiofen, imidazol, oxazol, thiazol, pyrazol, pyridin, pyrimidin, chinolin, isochinolin, purin, tetrazol, triazin a karbazol. Heteroarylová skupina může být substituována nebo nesubstituována. Když se substituuje, je substituční skupinou nebo skupinami výhodně jedna nebo více, výhodněji jedna, dvě nebo tři a ještě výhodněji jedna nebo dvě skupiny, které se nezávisle vyberou ze skupiny sestávající z nižšího alkylu^ trihaloalkylu, skupiny halo, hydroxy, nižší alkoxy, merkapto (nižší alkyl)thio, kyano, acyl, thioacyl, O-karbamyl, Nkarbamyl, O-thiokarbamyl, N-thiokarbamyl, C-amido, N-amido, nitro, N-sulfonamido, S-sulfonamido, R⁹S(O)-, R⁹S(O)₂-,

-C(O)OR⁹, R⁹C(O)O- a -NR⁹R¹⁰, kde R⁹ a R¹⁰ se definují výše. Výhodně se heteroarylová skupina volitelně substituuje jedním nebo dvěma substituenty nezávisle vybranými ze skupiny halo, • · A

AAAA «·· ·· · ·_* • · AAAA AA AAA · · nižší alkyl, trihaloalkyl, hydroxy, merkapto, kyano, N-amido, mono nebo dialkylamino, karboxy nebo N-sulfonamido.

Výraz „heteroalicyklický se vztahuje k monocyklické nebo kondenzované kruhové skupině, která má v kruhu nebo kruzích pět až devět atomů, z nichž jeden nebo dva atomy kruhu jsou heteroatomy vybrané z N, O nebo S(0)_n (kde n je celé číslo od nuly do dvou) a zbývající atomy jsou C. Kruhy mohou mít také jednu nebo více dvojných vazeb. Žádný kruh však nemá úplný konjugovaný systém π elektronů. Příklady nesubstituovaných heteroalicyklických skupin jsou, aniž by se tím omezovaly, pyrrolidino, piperidino, piperazino, morfolino, thiomorfolino, homopiperazino a podobně. Heteroalicyklický kruh může být substituovaný nebo nesubstituovaný. Když je substituovaný, je substituční skupinou nebo skupinami výhodně jedna nebo více, výhodněji jedna, dvě nebo tři a ještě výhodněji jedna nebo dvě skupiny, které se nezávisle vyberou ze skupiny sestávající z nižšího alkylu, trihaloalkylu, skupiny halo, hydroxy, nižší alkoxy, merkapto (nižší alkyl)thio, kyano, acyl, thioacyl, 0karbamyl, N-karbamyl, O-thiokarbamyl, N-thiokarbamyl, C-amido, N-amido, nitro, N-sulfonamido, S-sulfonamido, R⁹S(O)-, R⁹S(O)₂-, -C(O)OR⁹, R⁹C(O)O- a -NR⁹R¹⁰, kde R⁹ a R¹⁰ se definují výše. Výhodně' je heteroalicyklická skupina volitelně substituována jedním nebo dvěma .substituenty nezávisle vybranými ze skupiny halo, nižší alkyl, trihaloalkyl, hydroxy, merkapto, kyano, N-amido, mono nebo dialkylamino, karboxy nebo N-sulfonamido.

Výraz „heterocyklus značí nasycenou cyklickou skupinu tří až osmi atomů v kruhu, z nichž jeden nebo dva atomy kruhu jsou heteroatomy vybrané z N, 0 nebo S(0)_n (kde n je celé číslo od nuly do dvou) a zbývající atomy jsou C, kde jeden nebo dva atomy uhlíku lze volitelně nahradit karbonylovou skupinou. Heterocyklický kruh lze volitelně substituovat nezávisle • · jedním, dvěma nebo třemi substituenty vybranými z nižšího alkylu, volitelně substituovaným jedním nebo dvěma substituenty nezávisle vybranými z karboxylové nebo esterové skupiny, haloalkylu, kyanoalkylu, skupiny halo, nitro, kyano, hydroxy, alkoxy, amino, monoalkylamino, dialkylamino, aralkyl, heteroaralkyl a -COR (kde R je alkyl). Výraz heterocyklyl konkrétněji zahrnuje, ale není omezený na tetrahydropyranyl, 2,2-dimethyl-l,3-dioxolan, piperidino, N-methylpiperidin-3-yl, piperazino, N-methylpyrrolidin-3-yl, pyrrolidino, morfolino, thiomorfolino, thiomorfolino-l-oxid, thiomorfolino-1,1-dioxid, 4-ethyloxykarbonylpiperazino, 3-oxopiperazino, 2-imidazolidon, 2-pyrrolidinon, 2-oxohomopiperazino, tetrahydropyrimidin-2-on a jejich deriváty. Výhodně je heterocyklická skupina volitelně substituovaná jedním nebo dvěma substituenty nezávisle vybranými ze skupiny halo, nižší alkyl, nižší alkyl substituovaný skupinou karboxy, esterovou, hydroxy nebo mono či dialkylamino.

Výraz „heterocykloamino znamená nasycenou cyklickou skupinu tří až osmi atomů v kruhuý z nichž alespoň jeden z atomů v kruhu je dusík a volitelně jeden nebo dva další atomy kruhu jsou heteroatomy vybrané z N, O nebo S(O)_n (kde n je celé číslo od nuly do dvou) a zbývající atomy jsou C, kde jeden nebo dva atomy uhlíku lze volitelně nahradit karbonylovou skupinou. Heterocykloaminový kruh lze volitelně substituovat nezávisle jedním, dvěma nebo třemi substituenty vybranými z nižšího alkylu, volitelně substituovaným jedním nebo dvěma substituenty nezávisle vybranými z karboxylové nebo esterové skupiny, haloalkylu, kyanoalkylu, skupiny halo, nitro, kyano, hydroxy, alkoxy, amino, monoalkylamino, dialkylamino, aralkyl, heteroaralkyl a -COR (kde R je alkyl). Výraz heterocykloamino konkrétněji zahrnuje, ale není omezený na piperidin-l-yl, piperazin-l-yl, pyrrolidin-l-yl, morfolin4-yl, thiomorfolin-4-yl, thiomorfolino-l-oxid, thiomorfolino18 • · · • ···

1,1-dioxid, 4-ethyloxykarbonylpiperazin-l-yl, 3-oxopiperazin1-yl, 2-imidazolidon-l-yl, 2-pyrrolidinon-l-yl, 2-oxohomopiperazino, tetrahydropyrimidin-2-on a jejich deriváty. Výhodně je heterocykloamino skupina volitelně substituovaná jedním nebo dvěma substituenty nezávisle vybranými ze skupiny halo, nižší alkyl, nižší alkyl substituovaný skupinou karboxy nebo esterovou, skupinou hydroxy nebo mono či dialkylamino. Skupina heterocykloamino je podskupinou výše definované heterocyklické skupiny.

Výraz „hydroxy se vztahuje k -OH skupině.

Výraz „alkoxy se vztahuje jak ke skupině -O-(alkyl), tak ke skupině -O- (nesubstituovaný cykloalkyl). Reprezentativní příklady zahrnují, ale neomezují se na skupiny, jako jsou např. methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, cyklopropyloxy, cyklobutyloxy, cyklopentyloxy, cyklohexyloxy a podobně.

Výraz „haloalkoxy se vztahuje ke skupině -0-(haloalkyl). Reprezentativní příklady zahrnují, ale neomezují se na např. trifluormethoxy, tribrommethoxy apod.

Výraz „aryloxy, jak se zde definuje, se vztahuje jak ke skupině -0-aryl, tak ke skupině -O-heteroaryl. Reprezentativní příklady zahrnují, ale neomezují se na fenoxy, pyridyloxy, furanyloxy, thienyloxy, pyrimidinyloxy, prazinyloxy apod. a jejich deriváty.

Výraz „merkapto se vztahuje ke skupině -SH.

Výraz „alkylthio se vztahuje jak ke skupině -S-(alkyl), tak ke skupině -S-(nesubstituovaný cykloalkyl). Reprezentativní příklady zahrnují, ale neomezují se na např. methylthio, ethylthio, propylthio, butylthio, cyklopropylthio,

• · · • · · · « · · ··· · • · · • * v cyklobutylthio, cyklopentylthio, cyklohexylthio apod.

Výraz „arylthio, jak se zde definuje, se vztahuje jak ke skupině -S-aryl, tak ke skupině -S-heteroaryl. Reprezentativní příklady zahrnují, ale neomezují se na fenylthio, pyridylthio, furanylthio, thienylthio, pyrimidinylthio apod. a jejich deriváty.

Výraz „acyl se vztahuje k -C(O)-R skupině, kde R se vybere ze skupiny sestávající z vodíku, nižšího alkylu, trihalomethylu, nesubstituovaného cykloalkylu, arylu volitelně substituovaného jedním nebo více, výhodněji jedním, dvěma nebo třemi substituenty vybranými ze skupiny sestávající z nižšího alkylu, trihalomethylu, nižší skupiny alkoxy, skupiny halo a skupiny -NR⁹R¹⁰, heteroarylu (vázaného přes atom uhlíku v kruhu) volitelně substituovaný jedním nebo více, výhodněji jedním, dvěma nebo třemi substituenty vybranými ze skupiny sestávající z nižšího alkylu, trihaloalkylu, nižšího alkoxylu, skupiny halo a skupiny -NR⁹R¹⁰, heteroalicyklické skupiny (vázané přes atom uhlíku v kruhu) volitelně substituované jedním nebo více, výhodněji jedním, dvěma nebo třemi substituenty vybranými ze skupiny sestávající z nižšího alkylu, trihaloalkylu, nižšího alkoxylu, skupiny halo a skupiny -NR⁹R¹⁰. Reprezentativní acylové skupiny zahrnují, ale neomezují se na acetyl, trifluoracetyl, benzoyl apod.

Výraz „aldehyd se vztahuje k acylové skupině, ve které R je vodík.

Výraz „thioacyl se vztahuje ke skupině -C(S)-R, s R jak se zde definuje.

Výraz „ester se vztahuje ke skupině -C(O)O-R, s R jak se zde definuje s tím, že R nemůže být vodík.

• · · • ··· ·

Výraz „acetylová skupina se vztahuje ke skupině -C(O)CH3.

Výraz „halo se vztahuje k fluoru, chloru, bromu nebo jodu, výhodně k fluoru nebo chloru.

Výraz „trihalomethyl se vztahuje ke skupině -CX₃, kde X je skupina halo, jak se definuje výše.

Výraz „trihalomethansulfonyl se vztahuje ke skupiny X₃CS(=O)₂-, kde X je stejné, jak se definuje výše.

Výraz „kyano se vztahuje ke skupině -C=N.

Výraz „S-sulfonamido se vztahuje ke skupině -S (O) ₂NR⁹R¹⁰, kde R⁹ a R¹⁰ jsou stejné, jak se zde definují.

Výraz „N-sulfonamido se vztahuje ke skupině -NR⁹S (O) ₂R¹⁰, kde R⁹ a R¹⁰ jsou stejné, jak se zde definují.

Výraz „O-karbamyl se vztahuje ke skupině -OC (O) NR¹²R¹³, kde R¹² a R¹³ jsou stejné, jak se zde definují.

Výraz „N-karbamyl se vztahuje ke skupině R⁹OC (O) NR¹⁰-, kde R⁹ a R¹⁰ jsou stejné, jak se zde definují.

Výraz „O-thiokarbamyl se vztahuje k skupině -OC (S) NR¹²R¹³, kde R¹² a R¹³ jsou stejné, jak se zde definují.

Výraz „N-thiokarbamyl se vztahuje ke skupině R⁹OC (S) NR¹⁰-, kde R⁹ a R¹⁰ jsou stejné, jak se zde definují.

Výraz „amino se vztahuje ke skupině -NR⁹R¹⁰, kde R⁹ a R¹⁰jsou oba vodík.

Výraz „C-amido se vztahuje ke skupině -C(O)NR⁹R¹⁰, kde R⁹a R¹⁰ jsou stejné, jak se zde definují.

Výraz „N-amido se vztahuje ke skupině R⁹C(O)NR¹⁰-, kde R⁹a R¹⁰ jsou stejné, jak se zde definují.

Výraz „nitro se vztahuje ke skupině -N0₂.

Výraz „haloalkyl znamená alkyl, výhodně nižší alkyl, jak se definuje výše, který je substituovaný jedním nebo více stejnými nebo odlišnými halo atomy, např. -CH₂C1, -CF₃, -CH₂CF₃, -CH₂CC1₃ apod.

Výraz „hyroxyalkyl znamená alkyl, výhodně nižší alkyl, jak se definuje výše, který je substituovaný jednou, dvěma nebo třemi hydroxy skupinami, např. hydroxymethyl, 1 nebo 2~ hydroxyethyl, 1,2-, 1,3- nebo 2,3-dihydroxypropyl apod.

Výraz „aralkyl znamená alkyl, výhodně nižší alkyl, jak se definuje výše, který je substituovaný nějakou arylovou skupinou, jak se definuje výše, např. -CH₂-fenyl, -(CH₂)₂fenyl, - (CH₂) ₃-fenyl, CH₃CH (CH₃) CH₂-fenyl apod. a jejich deriváty.

Výraz „heteroaralkylová skupina znamená alkyl, výhodně nižší alkyl, jak se definuje výše, který je substituovaný heteroarylovou skupinou, např. CH₂-pyridyl, -(CH₂)₃pyrimidinyl, -(CH₂) ₃-imidazolyl apod. a jejich deriváty.

Výraz „monoalkylamino znamená, skupinu -NHR, kde R je alkyl nebo nesubstituovaná cykloalkylová skupina, jak se definuje výše, např. methylamino, (1-methylethyl)amino, cyklohexylamino apod.

Výraz „dialkylamino znamená skupinu -NRR, kde každé R je nezávisle alkyl nebo nesubstituovaná cykloalkylová skupina, jak se definuje výše, např. dimethylamino, diethylamino, (1methylethyl)-ethylamino, cyklohexylmethylamino, cyklopentylmethylamino apod.

Výrazy „volitelný nebo „volitelně znamenají, že následně popsaná událost nebo okolnost může nebo nemusí nastat a že popis zahrnuje situace, kdy událost nebo okolnost nastane a situace, ve kterých nenastane. Například slovní spojení „heterocyklická skupina volitelně substituovaná alkylovou skupinou znamená, že alkyl může, ale nemusí být přítomen a popis zahrnuje situace, při kterých je heterocyklická skupina substituována alkylovou skupinou a situace, při kterých není heterocyklická skupina substituována alkylovou skupinou.

Výrazy „2-indolinon, „indolin-2-on a „2-oxindol se zde používají vzájemně zaměnitelně ve vztahu k molekule, která má chemickou strukturu:

H

Výraz „pyrrol se vztahuje k molekule, která má chemickou strukturu:

H

Sloučeniny, které mají stejný molekulový vzorec, ale liší se povahou nebo posloupností vazeb svých atomů nebo uspořádáním svým atomů v prostoru se označují jako „isomery. Isomery, které se odlišují uspořádáním svých atomů v prostoru *· > 4 4 · ř 4 · ► 4 4 * · •· 4444

4 4 · 4 ·444 se označují jako „stereoisomery. Stereoisomery, které nejsou k sobě zrcadlovými obrazy, se označují jako „diastereomery a ty, které nejsou superponovatelnými vzájemnými zrcadlovými obrazy se nazývají „enantiomery. Když má sloučenina centrum asymetrie, například, které se váže ke čtyřem odlišným skupinám, je možný pár enantiomerů. Enantiomer lze charakterizovat pomocí absolutní konfigurace jeho asymetrického centra a popisuje se R- a S-sekvenčními pravidly Cahna a Prologa nebo způsobem, kterým molekula otáčí rovinu polarizovaného světla a označuje levotočivé (tj. jako (+) nebo sloučenina může existovat buď jako individuální enantiomer nebo jako jejich směs. Směs obsahující stejné podíly enantiomerů se nazývá „racemická směs.

se jako pravotočivé a (-)-isomery). Chirální

Sloučeniny tohoto vynálezu mohou mít jedno nebo více asymetrických center. Takové sloučeniny lze proto vyrábět jako jednotlivé (R}~ nebo (S)-stereoisomery nebo jako jejich směsi. Například atom uhlíku, který ve sloučenině vzorce (I) nese hydroxylovou skupinu v -CONHCHR³-CR⁴ (OH) CR⁵Z, je asymetrickým centrem a proto sloučenina vzorce (I) může existovat jako (H)~ nebo (Sj -stereoisomer. Pokud není naznačeno jinak, popis nebo jméno konkrétní sloučeniny v popisu a v patentových nárocích se myslí tak, aby zahrnovaly individuální enantiomery a jejich směsy, racemické nebo jiné. Způsoby stanovení stereochemie a dělení stereoisomerů jsou v technice dobře známé (viz diskusi v kapitole 4 knihy „Advanced Organic Chemistry, 4. vydání J. Marche, John Wiley and Sons, New York, 1992).

Sloučeniny vzorce (I) mohou vykazovat jev tautomerie a strukturní isomerie. Například sloučeniny, které se zde popisují, mohou mít E nebo Z konfiguraci na dvojné vazbě připojující podíl 2-indolinonu k podílu pyrrolu nebo mohou být směsí E a Z. Tento vynález zahrnuje jakoukoli tautomerní nebo ·♦ ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ♦··· ·· · ·· · • · ·· · · · • · · ♦ · · · • · · · · ♦ · ··· • · · · · · • · ··· ·· · 24 strukturně isomerní formu a jejich směsi, která má schopnost modulovat RTK, CTK a/nebo STK aktivitu, a není omezena na jakoukoli tautomerní nebo strukturně isomerní formu.

Výraz „farmaceutický přípravek se vztahuje ke směsi jedné nebo více zde popisovaných sloučenin nebo jejich fyziologicky a farmaceuticky přijatelných solí nebo prolátek s dalšími chemickými složkami, například fyziologicky a farmaceuticky přijatelnými nosiči a pomocnými látkami. Smyslem farmaceutického přípravku je usnadnit ' podávání sloučeniny do organismu.

Sloučenina vzorce (I) může také působit jako prolátka. Výraz „prolátka se vztahuje k činidlu, které se přemění na mateřské léčivo in vivo. Prolátky jsou často prospěšné, protože v některých situacích je lže snadněji podávat než mateřské léčivo. Při orálním podání mohou mít například vhodnou biologickou dostupnost, zatímco mateřské léčivo nikoli. Prolátka může mít také 'lepší rozpustnost ve farmaceutických přípravcích ve srovnání s mateřským léčivem. Jako příklad, který nemá být omezující, by mohla posloužit sloučenina předloženého vynálezu, která se podává jako ester („prolátka), pro usnadnění přenosu přes buněčnou membránu, kde rozpustnost ve vodě poškozuje ínobilitu, ale potom se metabolicky hydrolyzuje na karboxylovou kyselinu, aktivní složku, která jakmile je uvnitř buňky, tak je rozpustnost ve vodě prospěšná.

Dalším příkladem prolátky by mohl být krátký polypeptid, neomezující příklad kterého je polypeptid s dvěma až deseti aminokyselinami, který se prostřednictvím aminoskupiny váže na karboxylovou skupinu sloučeniny tohoto vynálezu, přičemž se polypeptid hydrolyzuje nebo metabolizuje in vivo za uvolnění aktivní molekuly. Prolátky sloučeniny vzorce (I) spadají do • 9

9 9 9

9 9 9 9

9 9 9

9999

9

9 9

9 9 9

9 9999

9 9

9·9 99 · rámce tohoto vynálezu.

Předpokládá se navíc, že by se sloučenina vzorce (I) pomocí enzymů metabolizovala v těle organismu, jakým je lidská bytost, za vytvoření metabolitu, který může modulovat aktivitu proteinkináz. Takové metabolity spadají do rámce předloženého vynálezu.

Výraz „fyziologicky či farmaceuticky přijatelný nosič, jak se zde užívá, se vztahuje k nosiči nebo ředidlu, které nezpůsobuje významné podráždění organismu a neruší biologickou aktivitu a vlastnosti podávané sloučeniny.

Výraz „farmaceuticky přijatelná pomocná látka se vztahuje k inertní látce, která se přidává do farmaceutického přípravku, aby se dále usnadnilo podávání sloučeniny. Příklady pomocných látek, které nejsou omezující, zahrnují uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, rozličné cukry a druhy škrobu, deriváty celulózy, želatinu, rostlinné oleje a polyethylenglykoly.

Výraz „farmaceuticky přijatelná sůl, jak se zde užívá, se vztahuje k těm solím, které zachovávají biologickou účinnost a vlastnosti mateřské sloučeniny. Takové soli zahrnují:

1) kyselé adiční soli, které se získávají reakcí volné báze mateřské sloučeniny s anorganickými kyselinami, například kyselinou chlorovodíkovou, kyselinou bromovodíkovou, kyselinou dusičnou, kyselinou fosforečnou, kyselinou sírovou, kyselinou chloristou a podobně, nebo s organickými kyselinami, například kyselinou octovou, kyselinou šťavelovou, kyselinou (£>) nebo (i) jablečnou, kyselinou maleinovou, kyselinou methansulfonovou, kyselinou ethansulfonovou, kyselinou p-toluensulfonovou, kyselinou salicylovou, kyselinou vinnou, kyselinou citrónovou, kyselinou sukcinovou nebo kyselinou malonovou a

444 • · ···· podobně, výhodně s kyselinou chlorovodíkovou nebo (L) jablečnou,

2) soli, které se vytvářejí v případě, kdy kyselý proton přítomný v mateřské sloučenině se buď nahradí kovovým iontem, např. iontem alkalického kovu, iontem kovu alkalické zeminy nebo iontem hliníku, nebo se koordinuje s organickou bází, například ethanolaminem, diethanolaminem, triethanolaminem, trimethylaminem, V-methylglukaminem a podobně.

Zkratka	„PK	se vztahuje k	receptorové protein-
tyrosinkináze	(RTK)	, nereceptorové	nebo	„celulární
tyrosinkináze	(CTK) a	serin-threoninkináze (STK).
Výraz „	způsob	se vztahuje k	metodám,	prostředkům,

technikám a postupům pro naplnění daného úkolu zahrnující, ale nikoli omezený na metody, prostředky, techniky a postupy buď známé praktikům v chemické, farmaceutické, biologické, biochemické a lékařské technice nebo si je uvedení odborníci v technice snadno vyvinou ze známých metod, prostředků, technik a postupů.

Výraz „modulace nebo „modulování se vztahuje ke změně katalytické aktivity enzymů RTK, CTK a STK. Modulování se zvláště vztahuje k aktivaci katalytické aktivity enzymů RTK, CTK a STK, výhodně k aktivaci nebo inhibici katalytické aktivity enzymů RTK, CTK a STK v závislosti na koncentraci sloučeniny nebo soli, které je RTK, CTK nebo STK vystaveno, nebo výhodněji k inhibici katalytické aktivity enzymů RTK, CTK a STK.

Výraz „katalytická aktivita se vztahuje k rychlosti fosforylace tyrosinu pod přímým či nepřímým vlivem enzymů RTK a/nebo CTK nebo k rychlosti fosforylace šeřinu a threoninu pod přímým či nepřímým vlivem enzymů STK.

9*

999« • 9 999«

Výraz „uvedení do kontaktu se vztahuje ke spojení sloučeniny tohoto vynálezu a cílové PK tak, že sloučenina může ovlivnit katalytickou aktivitu PK, buď přímo, tj. interakcí se samotnou kinázou, nebo nepřímo, tj. interakcí s další molekulou, na které závisí katalytická aktivita kinázy. Takové „uvedení do kontaktu lze provést „in vitro, tj. v testovací zkumavce, petriho misce nebo podobně. Uvedení do kontaktu v testovací zkumavce může zahrnovat pouze sloučeninu a PK, o který je zájem, nebo může zahrnovat celé buňky. Buňky lze také udržovat nebo nechat růst v nádobě pro buněčné kultury a uvést do kontaktu se sloučeninou v tomto prostředí. Schopnost konkrétní sloučeniny ovlivnit poruchu související s PK, tj. níže definované IC50 sloučeniny, lze v tomto kontextu stanovit před použitím sloučenin in vivo ve složitějších živých organismech. Pro buňky mimo organismus existují odborníkům dobře známé rozmanité způsoby uvedení PK do kontaktu se sloučeninami zahrnující, ale nikoli omezené na prime mikroinjekce do buňky a početné techniky transmembránového nosíce.

Výraz „in vitro se vztahuje k postupům prováděným v umělém prostředí, jako je např. zkumavka nebo kulturní médium, aniž by se omezovaly jenom na ně.

Výraz „in vivo se vztahuje k postupům prováděným uvnitř živého organismu, jako je např. myš, krysa nebo králík, aniž by se omezovaly jenom na ně.

Výrazy „porucha související s PK „porucha řízená PK a „abnormální aktivita PK se všechny vztahují ke stavu, který charakterizuje nepatřičná, tj. nižší nebo obvykleji vyšší katalytická aktivita PK, kde konkrétní PK může být některá RTK, CTK nebo STK. Nepatřičná katalytická aktivita se může objevit jako výsledek (1) exprese PK v buňkách, které normálně

• · · • · · • · · · ♦ · · ··· • · · neexprimují PK, (2) zvýšenou expresí PK vedoucí k nežádoucí buněčné proliferaci, diferenciaci a/nebo růstu nebo (3) snížení exprese PK vedoucí k nežádoucímu snížení buněčné proliferace, diferenciace a/nebo růstu. Nadměrná aktivita PK se vztahuje buď k zesílení genu kódujícího konkrétní PK nebo k produkci úrovně PK aktivity, která může být v korelaci s poruchou buněčné proliferace, diferenciace a/nebo růstu (to znamená, že jak se úroveň PK zvyšuje, zvyšují se potíže jednoho nebo více symptomů buněčné poruchy). Snížená aktivita je pochopitelně obrácená, v níž se potíže jednoho nebo více symptomů buněčné poruchy zvyšují, jak se snižuje úroveň PK aktivity.

Výrazy „léčit, „léčba, „léčení se vztahují ke způsobu zmírnění nebo odstranění buněčné poruchy zprostředkované PK a/nebo průvodních symptomů. Se zvláštním zřetelem na rakovinu, tyto výrazy prostě znamenají, že očekávaná délka života jedince postihnutého rakovinou se prodlouží nebo že jeden nebo více symptomů nemoci se sníží.

Výraz „organismus se vztahuje na jakoukoliv živou entitu zahrnující alespoň jednu buňku. Živý organismus může být tak jednoduchý jako například jedna eukaryontní buňka nebo tak komplexní jako savec, včetně lidské bytosti.

Výraz „terapeuticky účinné množství se vztahuje k takovému podávanému množství sloučeniny, které ulehčí do určité míry od jednoho nebo více symptomů léčené poruchy. S odkazem na léčení rakoviny se terapeuticky účinné množství vztahuje k takovému množství, které má účinek na (1) snížení velikosti nádoru, (2) inhibici (tj . určité zpomalení, výhodně zastavení) nádorových metastází ·« ·

	29	w· ·· · t « · · · · • · · · · • · · · · • · · · · «· ···· · ·	• ·· · ·· · · · • · ♦ · • · · · ·· < · · ··· ··
(3)	určitou inhibici (tj. určité zastavení) růstu nádoru a/nebo	zpomalení,	výhodně
(4)	určité ulehčení (nebo výhodně odstranění) nebo více symptomů spojených s rakovinou.	j ednoho

Výraz „monitorování znamená sledování nebo detekci účinku po uvedení do kontaktu sloučeniny s buňkou exprimující konkrétní PK. Sledovaným nebo detekovaným účinkem může být změna fenotypu buňky, změna katalytické aktivity PK nebo změna v interakci PK s přirozeným vazebným partnerem. Techniky pro sledování nebo detekci takových účinků jsou v technice dobře známé.

V konečném aspektu tohoto vynálezu se výše uvedený účinek vybere ze změny nebo absence změny ve fenotypu buňky, ze změny nebo absence změny v katalytické aktivitě příslušné proteinkinázy nebo ze změny či absence změny v interakci příslušné proteinkinázy s přirozeným vazebným partnerem.

Výraz „fenotyp buňku se vztahuje k vnějšímu vzhledu buňky nebo tkáně nebo k biologické funkci buňky nebo tkáně. Příklady fenotypu buňky, které nemají omezovat, jsou velikost buňky, růst buňky, proliferace buňky, diferenciace buňky, přežívání buňky, apoptóza a přijímání a využívání živin. Takové charakteristiky fenotypů jsou měřitelné dobře známými způsoby v technice.

Výraz „přirozený vazebný partner se vztahuje k polypeptidů, který se váže na konkrétní PK v buňce. Přirození vazební partneři mohou hrát^; roli při šíření signálu v signálním transdukčním procesu zprostředkovaném PK. Změna v interakci PK s přirozeným vazebným partnerem se může sama projevovat jako zvýšení nebo snížení koncentrace komplexu PK/přirozený vazebný partner a ve výsledku v pozorovatelné • · « · · * · · · • · · • · · ·

změně schopnosti PK zprostředkovávat transdukci signálu.

Reprezentativní sloučeniny předloženého vynálezu se představují v níže uvedené tabulce la.

Tabulka la

Sl. č.	Struktura	Název	MS m/z
1	0 NxP H	(3 -diethylamino-2-hydroxypropyl)amid kyseliny 5-(5-fluor-2-oxo-l,2dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl- l//-pyrrol-3 -karboxylové	427 [M+l]
2	0 ÍQŮPO VyV H	(2-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl)amid kyseliny 5-[5-fluor-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3 Z)-ylidenmethyl] 2,4-dimethyl- l/Z-pyrrol-3 karboxylové	441 [M-l]
3	0 ^HaC AA-hr ° H	(2-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl)amid kyseliny 2,4-dimethyl-5-[2oxo-1,2-dihydro-indol-(3 Z)ylidenmethyl]-1 //-pyrrol-3 karboxylové	423 [M-l]
4	0 TcP H	(2-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl)amid kyseliny 5-[5-chlor-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]2,4-dimethyl- l/Z-pyrrol-3 karboxylové	457 [M-l]
5	0 J>^HCH ΪΗ U H AJA/ ° H	(2-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl)amid kyseliny 5-[5-brom-2-oxo-l,2dihydřo-indol-(3Z)-ylidenmethyl] 2,4-dimethyl- l/Z-pyrrol-3 karboxylové	501 [M-l] 503 [M-l]

• 4 • · · · · · ···· • · · · * · · · · ····· • · · * · · ··· ·· ···· «» ·<· ·· 9

6	O ACAch°^h ν=ν αΡ Η	(2-hydroxy-3 -[ 1,2,3 ]triazol-1 -ylpropyl)-amid kyseliny 2,4-dimethyl5 -[2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl]- l/f-pyrrol-3 karboxylové	405 [M-l]
7	0 ^Η3θ ^τ-τΑν/Υ^Ν^ ν=ν ^υΜ3 ΥΥ<ο^Η Η	(2-hydroxy-3 -[1,2,3 ] triazol-1 -ylpropyl)-amid kyseliny 5-[5-fluor-2oxo-1,2-dihydro-indol-(3 Z)- ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-\Hpyrrol-3 -karboxylové	423 [M-l]
8	0 ^H3^C >--ΑνΎΎ ύ 2n^c_H0H Ν=Ν /Γ^ΙΨ ^ϋΜ* ρχΡ Η	(2-hydroxy-3 -[ 1,2,3 ]triazol-1 -ylpropyl)-amid kyseliny 5-[5-chlor-2oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)- ylidenmethyl]-2,4-dimethyl- IHpyrrol-3 -karboxylové	439 [M-l]
9	Ppo ^Brsy*^ÍS'y^>Y₌ Η Η	(2-hydroxy-3-[ 1,2,3]triazol-l -ylpropyl)-amid kyseliny 5-[5-brom-2oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)- ylidenmethyl]-2,4-dimethyl- 1Hpyrrol-3 -karboxylové	483 [M-l] 485 [M-l]
10	0 00=°” Η	5 - {(Z)-[4-(3 -chlorfenyl)-2-oxo-1,2dihydro-3Z7-indol-3 -yliden]methyl} JV-(2-hydroxy-3 -pyrrolidin-1 ylpropyl)-2,4-dimethyl- l//-pyrrol-3 karboxamid
11	^ΛτΑργρ ° Ac. Α^Η °^Η ^αΡιΡ Η	(3Z)-3-{ [4-({ [3-(diethylamino)-2hydroxypropyl] amino} karbonyl)- 5 methyl-3 -fenyl- l/7-pyrrol-2yl]methylen} -2-oxo-Ň-fenyl-2,3 dihydro- 17?-indol-5 -karboxamid
12	„ Υ?Τ< ^Χη\|\|Γρ=^ο ρΑν^ζ Η	(3Z)-3- {[4-( {[3 -(diethylamino)-2hydroxypropyl] amino} karbonyl)-5 methyl-3 -fenyl-1 //-pyrrol-2yl]methylen} -P-methyl-2-oxo-2,3 dihydro- l/í-indol-5 -karboxamid

• 9

9 9 9 9 9 ·· 9 9 9

9999 99

13		ύ H	N ° aX N t=0	(3 Z)-3 - {[4 - ({[ 3 -(diethylamino)-2hydroxypropyl] amino} karbonyl)-5 methyl-3-fenyl- l//-pyrrol-2yl]methylen)-aV-(2-hydroxyethyl)-2-oxo2,3-dihydro-l//-indol-5-karboxamid
14	Fx	XX	0	TV- [3 -(diethylamino)-2-hydroxypropyl] -
		u	Wxcc	4-(4-fluorfenyl)-2-methyl-5- {(Z)[5-
	0		(morfolin-4-ylkarbonyl)-2-oxo-1,2-
			dihydro-3//-indol-3 -yliden]methyl )-1//-
	íYg	H	H =0	pyrrol-3 -karboxamid
15	F^		O	(3Z)-3 - {[4-({ [3-(diethylamino)-2-
		Ljl	^bnx	hydroxypropyljamino} karbonyl)-3 -(4-
	π		fluorfenyl)-5 -methyl- l//-pyrrol-2-
	^^Ν'τ^ίίίΧιΓ ^H UL		x^z	yljmethylen) -TV-isopropyl-2-oxo-2,3 -
	H	H =0	dihydro- l/í-indol-5 -karboxamid
16	F		0	(32)-3 - {[4-( {[3 -(diethylamino)-2-
			yhwc	hydroxypropyl] amino } karbonyl)-3 -(2,4-
			difluorfenyl)-5-methyl-l//-pyrrol-2-
	^h		X^z H =0	yl]methylen) -2-oxo-JV-fenyl-2,3 -
	0 H	dihydro-l//-indol-5 -karboxamid
17	F		0	(3Z)-3- {[4-({ [3-(diethylamino)-2-
			Wx<	hydroxypropyljamino } karbonyl)- 3 -(2,4-
	π		difluorfenyl)-5-methyl-l//-pyrrol-2-
			H =0	yljmethylen}-7V-(2-hydroxyethyl)-2-oxo-
	“/Áx ^H	0 H	2,3 -dihydro- l//-indol-5 -karboxamid
18			0 N II	(32)-3-{ [3-(4-kyanofenyl)-4-({ [3-
	o		ίχχηχ	(diethylamino)-2- hydroxypropyl] amino} karbonyl)- 5-
			H —-ΓΊ	methyl-l//-pyrrol-2-yl]methylen}-aV,7V-
		X\	dimethyl-2-oxo-2,3-dihydro-l//-indol-5-
	¹ k-	1/ H	—·υ	karboxamid
19	X	XX	0	4-(4-kyanofenyl)-7V-[3-(diethylamino)-2-
		U		hydroxypropyl] -2-methyl- 5-{(Z)-[5-
	π		(morfolin-4-ylkarbonyl)-2-oxo-1,2-
			”^N^Z H =0	dihydro-3//-indol-3 -ylidenjmethyl} - IH-
	0¾	H	pyrrol-3-karboxamid

•9 · · ·· · ··· • · · 9 9 ·«· · ·« *· · 9 · · · · · · • · · ·· 9 · ·· · «· · · • · · ··· · · a ·· ··«· ·· ··· ·» «

20	Ck r\	Or H	o ΙίΤΎΟ O^H OH ^N^z H	(3Z)-3 - {[3 -(4-chlorfenyl)-4-({ [3 (diethylamino)-2- hydroxypropyl] amino } karbonyl)-5 methyl- l/7-pyrrol-2-yl]methylen} -2oxo-jV-fenyl-2,3-dihydro-177-indol-5karboxamid
uu	o
21		Ck	O	0	(3Z)-3-{[3-(4-chlorfenyl)-4-({[3-
	o		k	Τηχ	(diethylamino)-2- hydroxypropyljamino } karbonyl)-5 -
	-A_nA		N^z	methyl- 17Z-pyrrol-2-yl]methylen} -N-
			H	isopropyl-2-oxo-2,3 -dihydro- 177-indol-
	H	U	/ ⁰H		5-karboxamid
22			0 κ	Λ	5 ’[(Z)-(5 -fluor-2-oxo-1,2-dihydro-3 Hindol-3-yliden)methyl]-jV-[2-hydroxy-3-
			Yy	(2//-tetrazol-2-yl)propyl]-2,4-dimethyll#-pyrrol-3 -karboxamid
	R		H
	ΎΊ		=0
		H
23			9 „JÁ	5-[(Z)-(5-chlor-2-oxo-1,2-dihydro-3//-
			Jo —^·Ν^ΖH		indol-3 -yliden)methyl]-Y-[2-hydroxy-3 (277-tetrazol-2-yl)propyl]-2,4-dimethyll/7-pyrrol-3-karboxamid
	Ck
			<=o
		V/ H
24			0 .N.	;V-[2-hydroxy-3 -(2/7-tetrazol-2-
				O¹ OH	yl)propyll-2,4-dimethyl-5- {(Z)-[2-oxo-
	fV^F		JO H	5-(trifluormethoxy)-1,2-dihydro-3//indol-3 -yliden] methyl} - l/Z-pyrrol-3 -
			karboxamid
		ϊΏ	>=0
		^N^z H
25			0 Ti '^^SN^/	V> H Ai i ⁷	5-[(Z)-(5-fluor-2-oxo-1,2-dihydro-377indol-3-yliden)methyl]-jV-[2-hydroxy-3(1/7-tetrazol-1 -yl)propyl]-2,4-dimethyl-
		Z	J¹ OH	1 ZZ-pyrrol-3 -karb oxamid
	^Frk	H =0
		-N^Z H

• · · · ·

9 9 · »· c·«· ι

26	H	5-[(Z)-(5-chlor-2-oxo-1,2-dihydr 0-377indol-3 -yliden)methyl] -N- [2-hydr oxy-3 (177-tetrazol-1 -yl)propyl]-2,4-dimethyll/Z-pyrrol-3 -karboxamid
27	V O> H	7V-[2-hydroxy-3-(177-tetrazol-1 yl)propyl]-2,4-dimethyl-5-{(Z)-[2-oxo5-(trifluormethoxy)-1,2-dihydro-377indol-3 -ylidenjmethyl) - 177-pyrrol-3 karboxamid
28	H	N- {3-[(2/?,6₁V)-2,6-dimethylmorfolin-4yl]-2-hydroxypropyl}-5-[(Z)-(5-fluor-2oxo-1,2-dihydro-377-indol-3 yliden)methyl]-2,4-dimethyl-177-pyrrol3-karboxamid
29	0 ^ClxV^r-\ ^H * k^J-Lisr^⁰ H	5-[(Z)-(5-chlor-2-oxo-1,2-dihydro-377indol-3 -yliden)methyl]-7V- { 3 - [(27?, 65)2,6-dimethylmorfolin-4-ylJ-2hydroxypropyl }-2,4-dimethyl-177pyrrol-3 -karboxamid
30		TV-{3-[(27?,65)-2,6-dimethylmorfolin-4yi]-2-hydroxypropyl}-2,4-dimethyl-5{(Z)-[2-oxo-5-(trifluormethoxy)-1,2dihydro-377-indol-3-yliden]methy])-177pyrrol-3 -karboxamid
31	_f jÁtA H O k^J-L-N^⁰ H	5-[(Z)-(5-fluor-2-oxo-1,2-dihydro-377indol-3-yliden)methyl]-TV-[(27?)-2hydroxy-3 -(3 -methyl-2,5dioxoimidazolidin-1 -yl)propyl]-2,4dimethyl- 177-pyrrol-3 -karboxamid
32	k^krí ° H	5-[(Z)-(5 -chlor-2-oxo-1, 2-dihydro-377indol-3 -yliden)methyl] -7V-[(27?)-2hydroxy-3-(3 -methyl-2,5 dioxoimidazolidin-1 -yl)propyl]-2,4dimethyl-1 77-pyrrol-3 -karboxamid

• 9 • · · · · · *· · · · • · · · · · ···» • · * · * O · · · · Α· · · • · · ··· « · · ·» ···· *· ·«· ·« «

33	0 ο Η	TV-[(27?)-2-hydroxy-3-(3 -methyl-2,5dioxoimidazolidin-1 -yl)propyl]-2,4dimethyl-5 - {(Z)-[2-oxo-5 (trifluormethoxy)-1,2-dihydro-3/7-indol3 -yliden] methyl} -1 //-pyrrol-3 karboxamid
34	Η	5 - [(2)-(5 -fluor-2-oxo-1,2-dihydro-3TYindol-3 -yliden)methyl] -TV- [(25)-2hydroxy-3-(3-methyl-2,5dioxoimidazolidin-1 -yl)propyl]-2,4dimethyl- l/7-pyrrol-3 -karboxamid
35	° Η	TV-[(25)-2-hydroxy-3 -(3 -methyl-2,5 dioxoimidazolidin-l-yl)propyl]-2,4dimethyl-5-{(Z)-[2-oxo-5(trifluormethoxy)-1,2-dihydro-37/-indol3 -yliden] methyl} - lTT-pyrrol-3 karboxamid
36	YYVo Η	5-[(2)-(5-chlor-2-oxo-l,2-dihydro-3T7indol-3 -yliden)methyl] -TV- [(20)-2 hydroxy-3 -(3 -methyl-2,5 dioxoimidazolidin-1 -yl)propyl]-2,4dimethyl- l/V-pyrrol-3 -karboxamid
37	0 αΡ Η	TV- [3 -(1,1 -dioxidothiomorfolin-4-yl)-2hydroxypropyl]-2,4-dimethyl-5-[(Z)-(2oxo-1,2-dihydro-377-indol-3 yliden]methyl]- l/7-pyrrol-3 -karboxamid
38	pPxr ΌΡ Η	TV-[3-(1,1 -dioxidothiomorfolin-4-yl)-2hydroxypropyl]-5-[(2)-(5-fluor-2-oxo1,2-dihydro-377-indol-3 -yliden]methyl] 2,4-dimethyl- l//-pyrrol-3 -karboxamid
39	ύΡΡ” ΎχΡ Η	5-[(Z)-(5-chlor-2-oxo-1,2-dihydro-3Z7indol-3 -yliden] methyl] -TV- [3-(1,1dioxidothiomorfolin-4-yl)-2- hydroxypropyl]-2,4-dimethyl-l/7-pyrrol- 3-karboxamid

• · · « « · • · · ·· ··« ·

40	Η	Χχχ Η 0 D	5-[(2)-(5-brom-2-oxo-1,2-dihydro-377indol-3 -yliden]methyl]-77- [3-(1,1dioxidothiomorfolin-4-yl)-2- hydroxypropyl]-2,4-dimethyl-l/7-pyrrol- 3-karboxamid
41	’Ό	X Η	Χηο	5-[(Z)-(5-fluor-2-oxo-1,2-dihydro-3/7indol-3 -yliden)methyl] -N-[(2S)-2hydroxy-3 -morfolin-4-ylpropyl] -2,4dimethyl-1 //-pyrrol-3 -karboxamid (442,49)
42	'X	X Η	XÁXi	5-[(Z)-(5 -fluor-2-oxo-1,2-dihydro-37/indol-3-yliden)methyl]-/V-[(2A)-2hydroxy-3-morfolin-4-ylpropyl]-2,4dimethyl- l/7-pyrrol-3 -karboxamid (442,49)
43	°Χ	X Η	ΧΧχι .=^η	5-[(Z)-(5-chlor-2-oxo-1,2-dihydro-3/7indol-3 -yliden)methyl] -N- [(2/?)-2hydroxy-3-morfolin-4-ylpropyl]-2,4dimethyl- l/T-pyrrol-3 -karboxamid (458,95)
44	θχ Ό	Η	0 ΐΧτο Η -0	5-[(Z)-(5-chlor-2-oxo-1,2-dihydro-37/indol-3 -yliden)methyl] -N- [(2S)-2hydroxy-3-morfolin-4-ylpropyl]-2,4dimethyl- l/Z-pyrrol-3 -karboxamid (458,95)
47	X	X Η	=0	[2-hydroxy-3 -([1,2,3 ]triazolo [4,5- Z>]pyridin-3 -yloxy)-propyl]-amid kyseliny 5-(5-(Z)-fluor-2-oxo-l,2dihydro-indol-3-ylÍdenmethyl)-2,4dimethyl- l/7-pyrrol-3 -karboxylové
48	^C’c	V Η	0 11 Λ=ν Χ-χχ =0	: [2-hydroxy-3 -([1,2,3 ]triazolo [4,5. 7>]pyridin-3-yloxy)-propyl]-amid kyseliny 5-(5-(2)-chlor-2-oxo-l,2dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl- lZ/-pyrrol-3 -karboxylové

·· · • »·

49		=0	u	[2-hydroxy-3 -([1,2,3 jtriazolo [4,5b]pyridin-3 -yloxy)-propyl]-amid kyseliny 2,4-(Z)-dimethyl-5-(2-oxo-5trifluormethoxy-1,2-dihydro-indol-3 ylidenmethyl)-1 JY-pyrrol-3 -karboxylové
	H
50			0	O' 1,	[2-hydroxy-3 -(3 -oxy-benzotriazol-1 -yl)-
			χΑ	/U*	propyl]-amid kyseliny 5-(5-(Z)-fluor-2oxo-1,2-dihydro-indol-3 -ylidenmethyl)-
			Tli	2,4-dimethyl- 177-pyrrol-3 -karboxylové
			=O
		H
51			0	σ 1 .	[2-hydroxy-3 -(3 -oxy-benzotriazol-1 -yl)-
			II . . M	prppyl]-amid kyseliny 5-(5-(2)-chlor-2-
				cx	oxo-1,2-dihydro-indol-3 -ylidenmethyl)-
		r?	L Ί	2,4-dimethyl- l/Z-pyrrol-3 -karboxylové
	Vl	rS	=0	V
	o	H
52			0	o-	[2-hydroxy-3 -(3 -oxy-benzotriazol-1 -yl)-
			a .. m	propylj-amid kyseliny 2,4-(Z)-dimethyl-
		r?		O	5-(2-oxo-5-trifluormethoxy-1,2-dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-1 //-pyrrol-3 -
		X		karboxylové
	u	L-N^ H	=0

Další reprezentativní sloučeniny předloženého vynálezu se představují v níže uvedené tabulce lb.

·· »···

Tabulka lb

Sl. č.	Struktura	Název
IN				0	(3-diethylamino-2-hydroxypropyl)amid kyseliny 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-
		H	7/ W H A..	dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-
			ΚΎ	UÍ1 \	dimethyl- l/ř-pyrrol-3-karboxylové
	E O		H
		ip	>=0
		H
2N			0	(2-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl)-
		H	JO	JTQ	amid kyseliny 5 - [5 -fluor-2-oxo-1,2dihydro-indol-(3 )-ylidenmethyl] -2,4dimethyl- l//-pyrrol-3 -karboxylové
	E	j0	H =0
		H
3N			0		(2-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl)-
		H	FK -N	»TO	amid kyseliny 2,4-dimethyl-5-[2-oxol,2-dihydro-indol-(3)-ylidenmethyl]l#-pyrrol-3 -karboxylové
	Π	¹	H =0
		H
4N			0	(2-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl)-
			FK ^^X'N^/	κκκ	amid kyseliny 5-[5-chlor-2-oxo-l,2dihydro-indol-(3Ž)-ylidenmethyl]-2,4-
			O¹ ÓH 1^6	dimethyl- l/Z-pyrrol-3 -karboxylové
	Υϊ		H =0
		H
5N			0	(2-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl)-
		H	jo	™o	amid kyseliny 5-[5-brom-2-oxo-l,2dihydro-indol-ylidenmethyl]-2,4dimethyl- l/í-pyrrol-3 -karboxylové
	Byx	ÍT>	H =0
		H
6N			0		^; (2-hydroxy-3-[ 1,2,3 Jtriazol-1 -ylpropyl)-amid kyseliny 2,4-dimethyl-5-
		H	ΓΚ	-^H ÓH O	[2-oxo-1,2-dihydro-indolylidenmethyl] -1 TT-pyrrol-3 -
			H		karboxylové

	1		0
		H

7N	’Ό	0	(2-hydroxy-3 -[ 1,2,3 Jtriazol-1 -ylpropyl)-amid kyseliny 5-[5-fluor-2oxo-1,2-dihydro-indol-ylidenmethylJ2,4-dimethyl-l/7-pyrrol-3-karboxylové
H H	Ϊ1 ^N^z H -0	TK Y ^XN -^H OH W
8N			0	X OH N=N	(2-hydroxy-3 -[ 1,2,3 Jtriazol-1 -ylpropyl)-amid kyseliny 5-[5-chlor-2-
		H	jr€	oxo-1,2-dihydro-indol-ylidenmethylJ2,4-dimethyl- l/7-pyrrol-3 -karboxylové
	Ck		H
		ry	=0
		H
9N			0	H k , ,/	(2-hydroxy-3 -[ 1,2,3 Jtriazol-1 -ylpropyl)-amid kyseliny 5-[5-brom-2-
		H	xí	oxo-1,2-dihydro-indol-ylidenmethyl J -
			X OH N=N	2,4-dimethyl- l/f-pyrrol-3 -karboxylové
			H
	Ir^ i		=0
		H
11N				0	3 - {[4-({ [3 -(diethylamino)-2-
			\jL	yXXC	bydroxypropyl]amino}karbonyl)-5-
	aj		\JT	methyl-3 -fenyl- l/ř-pyrrol-2yl Jmethylen } -2-oxo-Ň-fenyl-2,3 -
	fjr	// N A ^H	dihydro- lZ/-indol-5-karboxamid
	H	/=0
			H		i
12N			\	0	3-{ [4-({ [3-(diethylamino)-2-
		\	J?		hydroxypropyljamino} karbonyl)- 5 -
	0	H	jr§	kc	methyl-3 -fenyl-l//-pyrrol-2yljmethylen} -7V’-methyl-2-oxo-2,3 -
				dihydro- l//-indol-5 -karboxamid
			H
	H	1 '	*=0
		H
13N			/⁼⁼⁼⁼\	0	(3Z)-3 - {[4-( {[3 -(diethylamino)-2-
			\ /)	hydroxypropyljamino} karbonyl)-5-
	0		OÝYsX	methyl-3 -fenyl- 177-pyrrol-2yl]methylen}-jV-(2-hydroxyethyl)-2-
	^HQ—J			'N H	oxo-2,3-dihydro-177-indol-5karboxamid
	H	I	>=o
			-N H

♦ · · *« ·« «»

14Ν	F /\ 0	N-[3 -(diethylamino)-2-hydroxypropyl] 4-(4-fluorfenyl)-2-methyl-5- {[5(morfolin-4-ylkarbonyl)-2-oxo-1,2dihydro-3TV-indol-3 -yliden] methyl} l/Z-pyrrol-3 -karboxamid
cÁ:	w H	ji ^N^Z H =O	A íA_
15Ν		F v	o		3-{ [4-({ [3-(diethylamino)-2- hydroxypropyl] amino} karbonyl)-3 -(4-
		/ I	ccc	fluorfenyl)-5-methyl- l/T-pyrrol-2-
	o	Ί	/tQ	yl]methylen} -TV-isopropyl-2-oxo-2,3 -
		11 VS-	dihydro- l/Z-indol-5-karboxamid
	Ά'Υύΐ ^H u	H	H =O
16Ν			F Qj	)	3-{[4-({[3-(diethylamino)-2- hydroxypropyl] amino} karbonyl)-3 -
		Pz		(2,4-difluorfenyl)-5 -methyl- 1/Z-pyrrol-
		H	ko FV ' H )<=O	»xc	2-yl]methylen } -2-oxo-TV-fenyl-2,3 -
	GUU ^H k	H	-~ⁿ OH ^x—	dihydro- l/Z-indol-5-karboxamid
17Ν			F		3-{[4-({[3-(diethylamino)-2-
			0	0	hydroxypropyl] amino} karbonyl)-3 (2,4-difluorfenyl)-5-methyl- 1/Z-pyrrol-
	0	F-		iccc	2-yl]methylen}-Á-(2-hydroxyethyl)-2oxo-2,3 -dihydro-1 T/-indol-5 -
	^ho^x_nA/ ^H c	F	Z H / °		karboxamid
18Ν	1			3 - {[3 -(4-kyanofenyl)-4-( {[3 -
		7==⁷	\ 0		(diethylamino)-2-
		v H	CA jy	ccc	hydroxypropyl]amino} karbonyl)-5methyl- l/Z-pyrrol-2-yl]methylen} -TV,TV-
	0	dimethyl-2-oxo-2,3 -dihydro-1 //-indol-
			H =0		5-karboxamid

	ΑΛ	H
19Ν		V			4-(4-kyanofenyl)-TV- [3 -(diethylamino)-
			A o		2-hydroxypropyl]-2-methyl-5 - {[5 -
		v	Jj	:CCC	(morfolin-4-ylkarbonyl)-2-oxo-1,2-
	o	H	jrl	dihydro-3//-indol-3 -yliden] methyl} l/Z-pyrrol-3 -karboxamid
	cC	H	H =o

4 ···· ·· ·»«·

20N	οα Η	0	CI Μ Ο L / ⁰ Η	0 Ν^ζ Η	3-{[3-(4-chlorfenyl)-4-({ [3(diethylamino)-2- hydroxypropyl]amino}karbonyl)- 5methyl- l//-pyrrol-2-yl]methylen} -2oxo-JV-fenyl-2,3-dihydro-l/Z-indol-5karboxamid
21N			Cl		3 - {[3 -(4-chlorfenyl)-4-( { [3 -
				>=?\	0	(diethylamino)-2-
				\ //	IJ . . _	hydroxypropyl] amino} karbonyl)-5-
		0			methyl- l//-pyrrol-2-yl]methylen} -Nisopropyl-2-oxo-2,3-dihydro-l/f-indol-
	Λ		/7 Ν -Λ ^Η		5-karboxamid
		Η	Η	/=0
				Η
22N				0	Λ 'N^^N-N	5-[(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-3Hindol-3 -yliden)methyl] -7V-[2-hydroxy-
			Η	jTÍ	3-(2#-tetrazol-2-yl)propyl]-2,4dimethyl- l//-pyrrol-3 -karboxamid
	F_x			Η
		ι I		=0
			s\r Η
23N				0	Λ	5-[(5-chlor-2-oxo-l,2-dihydro-3ZZ- indol-3-yliden)methyl]-7V-[2-hydroxy-
			Η	jrC	3 -(2//-tetrazol-2-yl)propyl]-2,4dimethyl- lZf-pyrrol-3 -karboxamid
	CL			Η
				>==0
			W Η
24N				0 Ν_χ	ŤV-[2-hydroxy-3 -(2//-tetrazol-2-
						yl)propyll-2,4-dimethyl-5-{ [2-OXO-5-
	Ρ	Ρ	Η	' Η \—ΓΛ	(trifluormethoxy)-1,2-dihydro-377-
			indol-3 -yliden]methyl} - l//-pyrrol-3 -
	Γ	3γ^Χ			karboxamid
		V	Η	Χ=_=(^
25N				0	•Λ Η 6η	5-[(5-fluor-2-oxo-1,2-dihydro-377indol-3 -yliden)methyl]-7V- [2-hydroxy-
			Η	,'fC-	3 -(1/7-tetrazol-1 -yl)propyl] -2,4dimethyl- l//-pyrrol-3 -karb oxamid
	Κ			^_Ν/ Η

				=0
			hr Η

• 9 9

99 9 9

26Ν	Cl· ^χ	H G H	9 .ji.	5 -[(5 -chlor-2-oxo-1,2-dihy dro-3//indol-3-yliden)methyl]-/V-[2-hydroxy3-(l//-tetrazol-l-yl)propyl]-2,4dimethyl- l//-pyrrol-3-karboxamid
H =0	IX
27Ν	_Fy	H	T Xff H	I Λ TXT	A/-[2-hydroxy-3 -(1/ř-tetrazol-1 yl)propyl] -2,4-dimethyl-5 - {[2-oxo-5 (trifluormethoxy)-1,2-dihydro-3//indol-3 -yliden]methyl} -1 //-pyrrol-3 -
			karboxamid
		Γ	>=o
		T-N^z H
28Ν			0	íxqt	N- {3 - [2,6-dimethylmorfolin-4-yl]-2hydroxypropyl}-5-[(5-fluor-2-oxo-l,2-
		H	O- 'Xr	dihydro-3//-indol-3 -yliden)methyl] -
			2,4-dimethyl-l //-pyrrol-3 -karboxamid
	F. χ-^ Ti		H =0	T
	TT	H
29Ν			0	5-[(5-chlor-2-oxo-l,2-dihydro-3//-
				:«xnr	indol-3-yliden)methyl]-/V-{3-[2,6-
		H	jo H =0	dimethylmorfolin-4-yl]-2hydroxypropyl }-2,4-dimethyl- 1H-
	cl ~ Ί	\| \	I	pyrrol-3 -karboxamid
	V	1 / H
30Ν			0	A^L{3-[2,6-dimethylmorfolin-4-yl]-2-
				ΚΠ	hydroxypropyl} -2,4-dimethyl-5- {[2-
	R F	H	jo	oxo-5-(trifluormethoxy)-1,2-dihydro-
	fT		3 //-indol-3 -yliden]methyl} -1 //-pyrrol-
	F Á		H	1	3-karboxamid
		Íl>	=0
					- J
34Ν			0	0	5-[(5 -fluor-2-oxo-1,2-dihydro-3//-
			U	JI	indol-3 -yliden)methyl] -N- [2-hydroxy-
		H	oj	ϊφ-	3 -(3 -methyl-2,5-dioxoimidazolidin-1 yl)propyl]-2,4-dimethyl-1 //-pyrrol-3 -
			N H	ď	karboxamid
	Tjt		=0
	TT	H

·· ·*·· ·· * 9 · • ··· • *

35N	^F\z^F Fdf	0 a ..	•fr	N- [2-hydroxy-3 -(3 -methyl-2,5 dioxoimidazolidin-1 -yl)propyl] -2,4dimethyl-5-{ (Z)-[2-oxo-5(trifluormethoxy)-1,2-dihy dro-3/7indol-3 -ylidenjmethyl} - l//-pyrrol-3 karboxamid
H X-N^/ H	Jry H >=0	NsK Y^xX OH
36N			0		0	5-[(5-chIor-2-oxo-l,2-dihydro-3/Z-
			11^		X	indol-3-yliden)methyl]-jV-[2-hydroxy-
		H	JpC	»x;	X	3 -(3 -methyl-2,5 -dioxoimidazolidin-1 yl)propyl]-2,4-dimethyl- 1//-pyrrol-3 -
	CL		^ř#^N^/ H	<4		karboxamid

			=0
		H
37N			0			AL [3 -(1,1 -dioxidothiomorfolin-4-yl)-2-
			Ř z	K /\ . .X*****		hydroxypropyl]-2,4-dimethyl-5-[(2-
	H	vÍL	X/V	Xo	oxo-1,2-dihydro-3//-indol-3 -
		ÓH Y	<	ylidenjmethyl] - l/Z-pyrrol-3 -
			IN H		II 0	karboxamid
		/=0
	Y/M H
38N			0 JI ^XN^Z		γ	AL[3-(1,1 -dioxidothiomorfolin-4-yl)-2hydroxypropyl] -5 - [(5 -fluor-2-oxo-1,2-
		H	XT	Ko	dihydro-3//-indol-3 -ylidenjmethyl] -
			ÓH	T	2,4-dimethyl- l//-pyrrol-3 -karboxamid
	ΌΧ H	H 0		0
39N			0	XX	Y	5- [(5-chlor-2-oxo-1,2-dihy dro-3/Zindol-3-yliden]methylJ-A^r-[3-( 1,1-
		H	FVh ^N^z	Lo	dioxidothiomorfolin-4-yl)-2-
			ÓH	X	hydroxypropyl]-2,4-dimethyl- 1H-
	^Cl>^v		H		0	pyrrol-3 -karboxamid
	11		=0
		H
40N			0	Xt	γ	5- [(5 -brom-2-oxo-1,2-dihydro-3 Hindol-3 -yliden]methyl]-A^r-[3 -(1,1-
		H	Γ^Η ^XN^Z	X	dioxidothiomorfolin-4-yl)-2hydroxypropyl]-2,4-dimethyl-1H-
			H		0	pyrrol-3-karboxamid
	[ T		0
	XX-	H

·· ··

• · * ♦ · · ♦· ···· • · · • · ♦ · • · ·· · « · ♦ ·· ·

47N		O	0 1 ...	/M Y	[2-hydroxy-3 -([ 1,2,3 Jtriazolo [4,5- Z>]pyridin-3-yloxy)-propyl]-amid kyseliny 5 -(5 -fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyllZ/-pyrrol-3-karboxylové
H Ti H	Xy H =0	3v Y ^XP H Óh
48N				0	Y ÓH		[2-hydroxy-3 -([1,2,3 ]triazolo [4,5ólpyridin-3 -yloxy)-propyll-amid
			H	xí H	%X	kyseliny 5-(5-chlor-2-oxo-1,2-dihydro-
				í«	indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-
	CL					l/Z-pyrrol-3 -karboxylové
		v	<bf H	=0
49N				0		[2-hydroxy-3 -([ 1,2,3 ]triazolo [4,5-
					J¹ ÓH	b]pyridin-3 -yloxy)-propyl]-amid
	F_x	.F	H		XJ	kyseliny 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-5trifluormethoxy-1,2-dihydro-indol-3 -
	F			H		ylidenmethyl)- l//-pyrrol-3 -
			Γ)	=0			karboxylové
			H
50N				0		0’	[2-hydroxy-3 -(3 -oxy-benzotriazol-1 -
					yl)-propyl]-amid kyseliny 5-(5-fluor-2-
			H	xv	n?	\Λ	oxo-1,2-dihydro-indól-3ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l/7-pyrrol-
	F_x			^N^z H =0		u	3-karboxylové
			ΊΨ H
51N				0		0' I	[2-hydroxy-3 -(3 -oxy-benzotriazol-1 -
					/M⁺	yl)-propyl]-amid kyseliny 5-(5-chlor-2-
			H	A	'N^V^ř H ÓH		oxo-1,2-dihydro-indol-3ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-17/-pyrrol-
	CL					o o	3-karboxylové
	Π		H =0
			-s/ H
52N				O	0’	[2-hydroxy-3 -(3 -oxy-benzotriazol-1 -
			H	o	-Y Óh	ťi	yl)-propyl]-amid kyseliny 2,4dimethyl-5 -(2-oxo-5 -trifluormethoxy-
	F		rň	l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-l/7-
	F	Υγ⁷	V H	H =0			pyrrol-3 -karboxylové

• A AAA'

Další reprezentativní sloučeniny předloženého vynálezu se představují v níže uvedené tabulce lc.

Tabulka lc

Sl. č.	Struktura	Název
45N	^FTX^^W° H	(2-hydroxy-3-mórfolin-4-yl-propyl)methyl-amid kyseliny 5-[5-fluor-2oxo-1,2-dihydro-indol-3 ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-l//-pyrrol3-karboxylové
45 S	_p víůCO τχΡ H	((5j-2-hydroxy-3 -morfolin-4-ylpropyl)-methyl-amid kyseliny 5-((2)-5fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3 ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l//-pyrrol3-karboxylové
46S	0 _F Oď° H	((/?)-2-hydroxy-3-morfolin-4-ylpropyl)-methyl-amid kyseliny 5-((2)-5fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3 ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-l/7-pyrrol3-karboxylové

Sloučeniny uvedené v tabulkách la^ až lc slouží pouze jako příklad a nezamýšlí se tak, aby rozsah tohoto vynálezu jakýmkoli způsobem omezovaly.

Výhodná provedení vynálezu

Zatímco se nej širší definice uvádí v kapitole Shrnutí vynálezu, určité sloučeniny vzorce (I) jsou výhodné a uvádějí se níže.

1. Výhodnými skupinami sloučenin vzorce (I) jsou ty, ve kterých:

9 • 9 9 9 9 9 9999 • · · 99 9 9 99 9999

9 9 999 999 • 9 9999 9· «· «· «

R⁶ se vybere ze skupiny sestávající z vodíku a alkylu, výhodně z vodíku, methylu, ethylu, isopropylu, terc-butylu, isobutylu nebo n-butylu, výhodněji z vodíku nebo methylu, a

R⁷ se vybere ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, arylu, heteroarylu a -C(O)R¹⁷, kde R¹⁷ je hydroxyl, alkyl, cykloalkyl, aryl nebo heteroaryl a R⁷ je výhodněji vodík, methyl, ethyl, isopropyl, η-, iso- nebo terc-butyl, fenyl, benzoyl, acetyl nebo kaboxyl, a ještě výhodněji methyl, vodík nebo fenyl.

2. Dalšími výhodnými skupinami sloučenin vzorce (I) jsou ty, ve kterých:

R⁶ se vybere ze skupiny sestávající z vodíku a alkylu, výhodně z vodíku, methylu, ethylu, isopropylu, terc-butylu, isobutylu nebo n-butylu, výhodněji z vodíku nebo methylu, nejvýhodněji z methylu,

R⁷ se vybere ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, arylu, heteroarylu a -C(O)R¹⁷, kde R¹⁷ je hydroxyl, alkyl nebo aryl a R⁷ je výhodněji vodík, methyl, ethyl, isopropyl, η-, iso- nebo terc-butyl, fenyl, benzoyl, acetyl nebo kaboxyl, a ještě výhodněji methyl, vodík nebo fenyl,

R³, R⁴ a R⁵ jsou vodík a

Z je aryl.

3. Dalšími výhodnými skupinami sloučenin vzorce (I) jsou ty, ve kterých:

R⁷ se vybere ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, arylu, heteroarylu a -C(O)R¹⁷, kde R¹⁷ je hydroxyl, alkyl nebo aryl a R⁷ je výhodněji vodík, methyl, ethyl, isopropyl, η-, iso- nebo *· ·· • 9 ♦ • · • · · ·· * 9 9 » 9 9 9 • 9 99 9

9 9 ·

terc-butyl, fenyl, benzoyl, acetyl nebo kaboxyl, a ještě výhodněji methyl, vodík nebo fenyl, nejvýhodněji methyl,

R³, R⁴ a R^s jsou vodík a

Z je heteroaryl, výhodně triazinyl, tetrazolyl, imidazolyl, pyridyl, pirimidinyl nebo pyrazinyl.

4. Dalšími výhodnými skupinami sloučenin vzorce (I) jsou ty, ve kterých:

R⁶ se vybere ze skupiny sestávající z vodíku a alkylu, výhodně z vodíku, methylu, ethylu, isopropylu, terc-butylu, isobutylu nebo n-butylu, výhodněji z vodíku nebo methylu, nej výhodněji z methylu,

R³, R⁴ a R⁵ jsou vodík a

Z je heterocyklus.

5. Dalšími výhodnými skupinami sloučenin vzorce (I) jsou ty, ve kterých:

R⁷ se vybere ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, arylu, heteroarylu a -C(O)R¹⁷, kde R¹⁷ je hydroxyl, alkyl nebo aryl a R⁷ je výhodněji vodík, methyl, ethyl,isopropyl, η-, iso- nebo terc-butyl, fenyl, benzoyl, acetyl nebo kaboxyl, a ještě výhodněji methyl, vodík nebo fenyl, nejvýhodněji methyl,

R³, R⁴ a R⁵ jsou vodík a • 9 *

Z je -NR¹⁵R¹⁶, kde R¹⁵ a R¹⁶ se spojují, aby vytvořily skupinu heterocykloaminovou, výhodně piperidin-l-yl, N-methylpiperidin-l-yl, piperazin-l-yl, N-methylpyrrolidin-l-yl, pyrrolidin-l-yl, morfolin-l-yl, thiomorfolin-4-yl, thiomorfolino-1oxid, thiomorfolino-1,1-dioxid, 4-ethyloxykarbonylmethylpiperazin-l-yl, 3-oxopiperazin-l-yl, imidazolidin-l-yl-2-on, pyrrolidin-l-yl-2-on, 2-oxohomopiperazin-l-yl nebo tetrahydropyrimidin-l-yl-2-on, výhodněji morfolin-4-yl.

6. Dalšími výhodnými skupinami sloučenin vzorce (I) jsou ty, ve kterých:

R^{7 * * * *} se vybere ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, arylu, heteroarylu a -C(O)R¹⁷, kde R¹⁷ je hydroxyl, alkyl nebo aryl a R⁷ je výhodněji vodík, methyl, ethyl, isopropyl, η-, iso- nebo terc-butyl, fenyl, benzoyl, acetyl nebo kaboxyl, a ještě výhodněji methyl, vodík nebo fenyl,

R³, R⁴ a R^s jsou vodík a

Z je -NR^1SR¹⁶, kde R¹⁵ a R¹⁶ jsou alkyl, výhodně diethylamino, dimethylamino nebo ethylamino.

7. V rámci výše uvedených výhodných a výhodnějších skupin 1.

až 6. jsou dokonce ještě výhodnější skupiny sloučenin, ve kterých: . .

R¹ je vodík, alkyl, -C (0) NR¹²R¹³, nesubstituovaný cykloalkyl, výhodně vodík, 3,4-dimethoxyfenylaminokarbonyl, 4-methoxy-3chlorfenylaminokarbonyl, dokonce ještě výhodněji vodík nebo methyl, nejvýhodněji vodík a

R² je vodík, skupina kyano, halo, nižší alkoxylová nebo skupina ·· *· · nebo alkyl a vodík, chlor.

·* ·· • · · · • · · • · · * · · ·· ·«··

-S (O) ₂NR⁹R¹⁰, kde R⁹ je vodík a R¹⁰ je vodík, aryl je v poloze 5 oxindolového kruhu, R² je výhodně brom, fluor, methoxy, ethoxy, fenyl, dimethylaminosulfonyl, 3chlorfenylaminosulfonyl, karboxyl, methoxyl, aminosulfonyl, methylaminosulfonyl, fenylaminosulfonyl, pyridin-3-yl-aminosulfonyl, dimethylaminosulfonyl, isopropylaminosulfonyl, výhodněji vodík, fluor nebo brom. Nejvýhodnější R² je fluor a je umístěn v pozici 5 na kruhu indolinonu.

Ve výše uvedených výhodných, výhodnějších a ještě výhodnějších sloučeninách je stereochemie na uhlíkovém atomu nesoucím hydroxylovou skupinu v řetězci -CONHCH (R³) *CR⁴ (OH) CR⁵Z a naznačená buď RS, R nebo S, výhodněji S.

Využitelnost

Proteinkinázy, jejichž katalytická aktivita se moduluje sloučeninami tohoto vynálezu, zahrnují protein-tyrosinkinázy, které mohou být dvojího typu, receptorové tyrosinkinázy (RTK), celulární tyrosinkinázy (CTK) a serin-threoninkinázy (STK). Transdukce signálu zprostředkovaná RTK se iniciuje extracelulámí interakcí se specifickým růstovým faktorem (ligandem), po které následuje receptorová dimerizace, přechodná stimulace skutečné aktivity protein-tyrosinkinázy a fosforylace. Vytváří se tím vazebná místa pro molekuly intracelulární transdukce signálu a vedou k vytvoření komplexů se spektrem cytoplasmických signálních molekul, které napomáhají správné buněčné odezvě (např. buněčnému dělení, metabolickým účinkům na extracelulámí mikroprostředí atd.). Viz Schlessinger a Ullrich: Neuron, 1992, 9, 303-391.

Prokázalo se, že místa fosforylace tyrosinu na receptorech růstového faktoru účinkují jako místa s vysokou vazebnou afinitou pro SH2 (src homologie) domény signálních molekul.

··· . í :·::·· ........... ,.·

Fantl a spol.: Cell, 1992, 69, 413-423, Songyang a spol.: Mol. Cell. Biol. 1994, 14, 2777-2785, Songyang a spol.: Cell, 1993, 72, 767-787 a Koch a spol.: Science, 1991, 252, 668-678.

Identifikovalo se několik intracelulárních substrátových proteinů, které jsou spojené s enzymy RTK. Lze je rozdělit do dvou hlavních skupin: (1) substráty, které mají katalytickou doménu a (2) substráty, které postrádají takovou doménu, ale které slouží jako adaptéry a spojují se s katalyticky aktivními molekulami. Sangyang a spol.: Cell, 1993, 72, 767778. Specifičnost interakce mezi receptory a SH2 doménami jejich substrátů je určena zbytky aminokyselin bezprostředně obklopující fosforylovaný zbytek tyrosinu. Rozdíly ve vazebných afinitách mezi SH2 doménami a sekvencemi aminokyselin obklopujícími fosfotyrosinové zbytky na konkrétních receptorech jsou konsistentní s pozorovanými rozdíly v jejich profilech substrátové fosforylace. Songyang a spol.: Cell, 1993, 72, 767-778. Tato pozorování naznačují, že funkce každé RTK není určena pouze charakterem její exprese a dostupností ligandu, ale také polem „downstream signálních transdukčních cest, které se aktivují konkrétním receptorem. Fosforylace je takto důležitým regulačním krokem, který určuje selektivitu signálních cest, které. se rekrutují pomocí specifických receptorů růstového faktoru a stejně tak receptorů faktoru diferenciace.

Enzymy STK, které jsou v první řadě cytosolické, ovlivňují vnitřní biochemii buňky, často jako sestupná odezva na PTK událost. STK se zahrnují do signálního procesu, který iniciuje syntézy DNA a následnou mitózu vedoucí k buněčné proliferaci.

Výsledkem PK signální transdukce je mezi jinými odezvami buněčná proliferace, diferenciace, růst a metabolismus. Abnormální buněčná proliferace může způsobit širokou škálu • · · · · · ········ • · · ·♦· · · · • · ·· ·· ·· ··· ·· · poruch a nemocí, včetně rozvoje neoplasmatu, například karcinomu, sarkomu, glioblastomu a hemangiomu, poruch jako jsou leukémie, psoriáza, arterioskleróza, artritida a diabetická retinopatie a jiné poruchy vztahující se k neřízené agiogenezi a/nebo vaskulogenezi.

Přesné porozumění mechanismu, kterým sloučeniny tohoto vynálezu inhibují PK enzymy, se z hlediska praktikování předloženého vynálezu nevyžaduje. I když se tímto nevážeme na žádný konkrétní mechanismus nebo teorii, domníváme se však, že tyto sloučeniny jsou v interakci s aminokyselinami katalytické oblasti PK. Typickou strukturou PK jsou dva laloky, kde se ATP zřejmě vážou do mezery mezi dvěma laloky v oblasti, kde jsou zakonzervovány aminokyseliny mezi enzymy PK. 0 inhibitorech PK se má za to, že se vážou pomocí nekovalentních interakcí, například jako vodíkové můstky, van der Waalsovy síly a iontové interakce ve stejné obecné oblasti, ve které se výše zmíněné ATP vážou na enzymy PK. Specifičtěji se má za to, že 2-indolinonová složka sloučenin tohoto vynálezu se váže v obecném prostoru normálně obsazeném adeninovým kruhem ATP. Specifičnost konkrétní molekuly pro konkrétní PK se může projevit jako výsledek dalších interakcí mezi rozličnými substituenty na 2-indolinonovém jádře a aminokyšilínovými doménami specifickými pro konkrétní enzymy PK. Odlišné indolinonové substituenty tím mohou přispívat k přednostním vazbám na konkrétní enzymy PK. Schopnost vybrat sloučeniny aktivní pro různá vazebná místa ATP (nebo jiných nukleotidů) činí sloučeniny tohoto vynálezu prospěšné pro zasažení jakéhokoli proteinu s takovými místy. Zde patentované sloučeniny jsou tudíž užitečné při zkouškách in vitro takových proteinů, jakož i vykazováním terapeutického účinku in vivo prostřednictvím interakce s takovými proteiny.

Sloučeniny předloženého vynálezu navíc poskytují terapeutický přístup k léčení mnoha druhů pevných nádorů včetně, ale neomezujíce se na karcinomy, sarkomy, včetně Kaposiho sarkomu, erytroblastomu, glioblastomu, meningiomu, astrocytomu, melanomu a myoblastomu. Léčení nebo prevence nepevných rakovinných nádorů, jako například leukémie, se také uvažují v rámci tohoto vynálezu. Indikace mohou zahrnovat, ale nejsou omezeny na rakoviny mozku, močového měchýře, vaječníků, trávící soustavy, pankreatu, tlustého střeva, krve, plic a kostí.

Aniž by se omezovaly jen na ně, dalšími příklady typů poruch vztahujících se k nesprávné aktivitě PK, při kterých mohou být zde popisované sloučeniny prospěšné z hlediska prevence, léčení a studia, jsou buněčné proliferativní poruchy, fibrózní a metabolické poruchy.

Buněčné proliferativní poruchy, kterým lze předcházet a které lze léčit nebo dále studovat pomocí předloženého vynálezu, zahrnují rakovinu, proliferativní poruchy krevních cév a proliferativní poruchy mezangiálních buněk.

Proliferativní poruchy krevních cév se vztahují k poruchám souvisejícím s abnormální vaskulogenezí (tvorbou krevní cévy) a angiogenezí (šíření krevních cév). Zatímco vaskulogeneze a angiogeheze hrají důležitou roli v řadě normálních fyziologických procesů, například při vývoji embrya, při tvorbě korpus luteum (žlutého tělíska), při hojení poranění a při regeneraci orgánu, hrají také ústřední roli při rozvoji rakoviny, kde dávají vznik novým kapilárám potřebným pro udržení nádoru při životě. Další příklady proliferativní poruchy krevních cév zahrnují artritidu, kde nové kapiláry krevních cév pronikají do kloubu a rozrušují chrupavku, a oční nemoci, jako je diabetická retinopatie, kde nové kapiláry v sítnici pronikají do sklivce, mokvají a způsobují slepotu.

U dvou strukturně souvisejících RTK se identifikovala vazba VEGF s vysokou afinitou: receptor tyrosinu 1 (flt-1) podobný fms (Shibuya a spol.: Oncogene, 1990, 5, 519-524; De

Vries a spol.: Science, 1992, 255, 989-991) a receptor KDR/FLK-1, také známý jako VEGF-R2. 0 vaskulárním endotelovém růstovém faktoru (VEGF) bylo uvedeno, že je specifickým mitogenem endotelové buňky, který podporuje aktivitu růstu endotelové buňky in vitro (Ferrara a Henzel: Biochem. Biophys. Res. Comm., 1989, 161, 851-858; Vaisman a spol.: J. Biol.

Chem., 1990, 265, 19461-19566). Informace zveřejněné v U.S.

žádostech pořadové č. 08/193,829, 08/038,596 a 07/975,750 rozhodně naznačují, že VEGF nenese odpovědnost pouze za proliferaci endotelové buňky, ale je také nejdůležitějším regulátorem normální a patologické ángiogeneze. Obecně viz Klagsburn a Soker: Current Biology, 1993, 3 (10), 699-702;

Houck a spol.: J. Biol. Chem., 1992, 267, 26031-26037.

Normální vaskulogeneze a angiogeňeze hrají důležité role v řadě fyziologických procesů, například při vývoji embrya, při hojení poranění, při regeneraci orgánu a ženských reprodukčních procesech, například vývoj folikula v žlutém tělísku během ovulace a růstu placenty po otěhotnění (Folkman a Shing: J. Biological Chem., 1992, 267 (16), 10931-34).

Neřízená vaskulogeneze a/nebo ángiogeneze jsou spojeny s nemocemi, jako je diabetes a stejně tak maligní pevný nádor, který pro svůj růst spoléhá na vaskularizaci (Klagsburn a Soker: Current Biology, 1993, 3 (10), 699-702); Folkham: J.

Nati. Cancer Inst., 1991, 82, 4-6; Weidner a spol.: New Engl.

J. Med., 1991, 324, 1-5).

Souhrnná úloha VEGF v proliferaci endotelové buňky a migrace během ángiogeneze a vaskulogeneze naznačuje důležitou úlohu pro receptor KDR/FLK-1 v těchto procesech. Nemoci, například diabetes melitus (Folkman v: XI^th Congress of

Thrombosis and Haemostasis, Verstraeta a spol. (editoři), Leuven University Press, Leuven 1998, str. 583-596) a artritidy, jakož i růst maligního nádoru mohou vznikat z neřízené angiogeneze (viz např. Folkman: N. Engl. J. Med., 1971, 285, 1182-1186) . Receptory, ke kterým se VEGF specifiky váže, jsou důležitým a silným terapeutickým cílem pro regulaci a modulaci vaskulogeneze a/nebo angiogeneze a rozličných vážných nemocí, ve kterých hraje roli abnormální buněčný růst způsobený těmito procesy (Plowman a spol.: DN&P, 1994, 7 (6), 334-339) . Specifická úloha receptorů KDR/FLK-1 v neovaskularizaci je konkrétněji činí vybraným cílem pro terapeutický přístup k léčení rakoviny a jiných nemocí, ve kterých hraje roli neřízená tvorba krevních cév.

Předmětem předloženého vynálezu jsou tudíž sloučeniny schopné regulovat a/nebo modulovat transdukční signál tyrosinkinázy včetně transdukce signálu receptorem KĎR/FLK-1, aby došlo k inhibici nebo podpoření angiogeneze a/nebo vaskulogeneze, tj. sloučeniny, které inhibují, brání nebo interferují s transdukovaným signálem pomocí KDR/FLK-1, když jsou aktivovány pomocí takových ligandů, jako jsou VEGF. Ačkoli se věří, že sloučeniny předloženého vynálezu působí na receptor nebo jinou složku podél cesty přenosu signálu tyrosinkinázou, mohou také přímo působit na nádorové buňky vzniklé z neřízené angiogeneze.

Ačkoli se nomenklatura lidských a myších protějšků generických receptorů „flk-I odlišuje, FLK-1 a jejich lidský protějšek, KDR, mají v rámci intracelulární domény homologii sekvence 93,4 %. Myší FLK-1 rovněž váže lidské VEGF se stejnou afinitou jako myší VEGF a v souladu s tím se aktivuje ligandem odvozeným z každého z těchto druhů (Millauer a spol.: Cell, 1993, 72, 835-846, Quinn a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 7533-7537) . FLK-1 se také spojuje s lidskými • · 4 • ·· I substráty RTK a následně se tyrosinově fosforyluje (např. PLC-γ nebo p85), když se společně exprimuje v 293 buňkách (lidské embryonální ledvinové fibroblasty).

myšího receptoru FLK-1 identifikují sloučeniny,

Modely, které se spoléhají na receptor FLK-1 jsou proto přímo aplikovatelné pro porozumění receptoru KDR. Použití je například ve způsobech, které které regulují myší cestu přenosu signálu, jsou přímo aplikovatelné pro identifikaci sloučenin, které lze použít pro regulaci lidské cesty přenosu signálu, tj . které regulují aktivitu vztahující se k receptoru KDR. Chemické sloučeniny identifikované jako inhibitory KDR/FLK-1 in vitro, lze tudíž potvrdit ve vhodných modelech in vivo. Jak myší tak krysí živočišné modely in vivo se ukázaly jako vysoce hodnotné pro určení klinického potenciálu činidel působících na cestu přenosu signálu indukovaného KDR/FLK-1.

Předmětem předloženého vynálezu je tudíž sloučenin, které regulují, modulují a/nebo vaskulogenezi a/nebo angiogenezi pomocí ovlivnění enzymové aktivity receptoru KDR/FLK-1. Předložený vynález tudíž poskytuje terapeutický přístup pro léčbu mnoha druhů pevných národů, včetně, ale neomezujíce se na glioblastom, melanom a Kaposiho sarkom a rakovinu vaječníků, plic, prsníku, prostaty, pankreatu, tlustého střeva a pokožky. Údaje navíc naznačují, že podávání sloučenin, které inhibují cesty přenosu signálu zprostředkovaného KDR/FLK-1, lze také použít při léčení hemangiomu, restěnózy a diabetické retinopatie.

poskytnutí inhibuj í

Předmětem vynálezu je dále inhibice vaskulogeneze a angiogeneze pomocí jiných cest zprostředkovaných receptory, včetně cest zahrnujících receptor flt-1.

Přenos signálu zprostředkovaný receptorem tyrosinkinázy se • · ·

iniciuje extracelulární interakcí se specifickým růstovým faktorem (ligandem), po níž následuje dimerizace receptoru, přechodná stimulace aktivity vnitřní protein-tyrosinkinázy a autofosforylace. Vytvoří se tím vazebná místa pro intracelulární molekuly přenosu signálu, což vede k vytvoření komplexů se spektrem cytoplasmatických signálních molekul, které usnadňují příslušnou buněčnou odezvu, např. buněčné dělení a metabolické účinky na extracelulární mikroprostředí (viz Schlessinger a Ullrich: Neuron, 1992, 9, 1-20) .

1993, 90, spol.: Mol.

Blízká homologie intracelulárních oblastí KDR/FLK-1 s oblastmi receptoru PDGF-β (50,3 % homologie) a/nebo souvisejícího receptoru flt-1 svědčí o indukci překrývajících se cest přenosu signálu. Například pro receptor PDGF-β, člen skupiny src (Twamley a spol.: Proč. Nati. Acad. Sel. USA, fosfatidylinositol-3'-kinázu (Hu a 1992, (12), 981-990), fosfolipázu cy (Kashishian a Cooper, Mol. Cell. Biol., 1993, (4), 49-51), protein aktivující ras-GTP-ázu (Kashishian a spol.: EMBO J., 1992, 11, 1373-1382), PTP-ID/syp (Kazlauskas a spol.: Proč.

7696-7700), Cell. Biol.,

Nati. Acad. Sel. USA, 1993, 90 (10), 6939-6943), Grb2 (Arvidsson a spol.: Mol. Cell. Biol., 1994, 14, 6715-6726) a adaptérové molekuly Shc a Nck (Nishimura a spol.: Mol. Cell. Biol., 1993, 13, 6889-6896) se ukázalo, že se vážou na oblasti zahrnující odlišná místa autofosforylace. Obecně viz ClaessonWelsh: Prog. Growth Factor Res., 1994, 5, 37-54. Je proto pravděpodobné, že cesty přenosu signálu aktivované pomocí KDR/FLK-1 zahrnují cestu ras (Rozakis a spol.: Nátuře, 1992, 360, 689-692), PI-3'-kinázu a cesty zprostředkované src a plcy. Každá z těchto cest může hrát kritickou roli při angiogenickém a/nebo vaskulogenickém účinku KDR/FLK-1 v endotelových buňkách. Předmětem dalšího aspektu tohoto vynálezu je v důsledku toho použití zde popisovaných organických sloučenin na modulaci takové angiogeneze a vaskulogeneze, jako jsou • 9 « · ·· · 9 procesy řízené těmito cestami.

Opačně, poruchy vztahující se k úbytku, smršťování nebo uzavírání krevních cév, například restenóza, se také postihují a mohou se léčit nebo se jim může předcházet způsoby tohoto vynálezu.

Fibrózní poruchy se vztahují k abnormální tvorbě extracelulárních matrixů. Příklady fibrózních poruch zahrnují jaterní cirhózu a proliferativní poruchy buněčného přenosu signálu. Jaterní cirhózu charakterizuje zmnožení složek extracelulárního matrixu, jehož výsledkem je tvorba jaterních jizev. Zmnožení extracelulárního matrixu s výsledkem jaterních jizev může být také způsobeno virovou infekcí, například hepatitidou. Zdá se, že lipocyty hrají hlavní roli při jaterní cirhóze. Jiné fibrózní poruchy, které se postihují, zahrnují aterosklerózu.

Poruchy způsobené proliferací mezangiálních buněk vznikají abnormálním bujením mezangiálních buněk. Mezenagiální proliferativní poruchy zahrnují rozličné poruchy lidských ledvin, například glomerulonefritidu, diabetickou nefropatii a maligní nefrosklerózu, jakož i poruchy, jako jsou syndromy trombotické mikroagiopatie, odmítnutí transplantátu a glomerulopatie. Do udržování proliferace mezangiálních buněk jsou zapleteny RTK PDGFR (Floege a spol.: Kidney International, 1993, 43, 47S-54S).

Mnohé druhy rakoviny představují buněčné proliferativní poruchy a jak se uvedlo výše, enzymy PK souvisejí s buněčnými proliferativními poruchami. Není tudíž překvapivé, že enzymy PK, například členové skupiny RTK souvisejí s rozvojem rakoviny. Některé z těchto receptorů, 'jako EGFR (Tuzí a spol.: Br. J. Cancer, 1991, 63, 227-233; Torp a spol.: APMIS, 1992, • · • ·

999 9 9 · 9 · 9

9· 9999 ·· 9 99 99 9

100, 713-719), HER2/neu (Slamon a spol.: Science, 1989, 244, 707-712) a PDGF-R (Kumabe a spol.: Oncogene, 1992, 7, 627-633) mají nadměrnou expresi v mnoha nádorech a/nebo jsou trvale aktivovány autokrinními smyčkami. V nejběžnějších a nej těžších případech rakoviny byly skutečně nadměrné exprese těchto receptorů (Akbasak a Suner-Akbasak a spol.: J. Neurol. Sci., 1992, 111, 119-133, Dickson a spol.: Cancer Treatment Res.,

1992, 61, 249-273, Korc a spol.: J. Clin. Invest., 1992, 90,

1352-1360) a autokrinní smyčky (Lee a Donoghue: J. Cell. Biol., 1992, 118, 1057-1070, Korc a spol.: J. Clin. Invest.,

1992, 90, 1352-1360 a Akbasak a Suner-Akbasak a spol.: J.

Neurol. Sci., 1992, 111, 119-133) prokázány. Například EGFR byl spojen se skvamózními buňkami karcinomu, astrocytomu, glioblastomu, rakovinou hlavy a krku, rakovinou plic a rakoviny močového měchýře. HER2 byl spojen s rakovinou prsníku, vaječníků, žaludku, plic, pankreatu a močového měchýře. PDGFR byl spojen s glioblastomem a melanomem, jakož i s rakovinou plic, vaječníků a prostaty. RTK c-met byl také spojen s maligními nádorovými formacemi. Například c-met byl spojen, mezi jinými druhy rakoviny, s rakovinou tlustého střeva a konečníku, s karcinomy a lymfomy štítné žlázy, pankreatu, žaludku a hepatobuněčnými karcinomy a lymfomy. Navíc se c-met spojuje s leukémií. Nadměrná exprese genu c-met se také zaznamenala u pacientů s Hodgkinsovou nemocí a Burkittsovou nemocí.

IGF-IR se navíc k prokázané účasti při podpoře výživy a v diabetů typu II spojuje s několika typy rakoviny. Například u IGF-I se prokázala účast jako autokrinního stimulátoru růstu pro několik typů nádorů, např. buněk karcinomu lidské rakoviny prsníku (Arteaga a spol.: J. Clin. Invest., 1989, 84, 14181423) a malobuněčných plicních nádorů (Macauley a spol.: Cancer Res., 1990, 50, 2511-2517). Zatímco se IGF-I integrálně účastní na normálním růstu a diferenciaci nervového systému, • · ukázal se navíc jako autokrinní stimulátor lidských gliomů (Sandberg-Nordqvist a spol.: Cancer Res., 1993, 53, 24752478) . Důležitost IGF-IR a jeho ligandů při bujení buněk je dále podpořen skutečností, že růst mnoha buněčných typů v kultuře (fibroblasty, epitelové buňky, buňky hladkého svalstva, T-lymfocyty, myeloické buňky, chondrocyty a osteoblasty (kmenové buňky kostní dřeně)) se stimuluje, aby rostly, pomocí IGF-I (Goldring a Goldring: Eukaryotic Gene Expression, 1991, 1, 301-326). Baserga a Coppola připomínají, že IGF-IR hraje ústřední úlohu v mechanismu transformace a jako takový by mohl být výhodným cílem pro terapeutické intervence pro široké spektrum lidských malignací (Baserga: Cancer Res., 1995, 55, 249-252, Baserga: Cell, 1994, 79, 927930, Coppola a spol.: Mol. Cell. Biol., 1994, 14, 4588-4595).

U enzymů STK se prokázala účast v mnoha typech rakoviny, včetně obzvláště rakoviny prsníku (Cance a spol.: Int. J. Cancer, 1993, 54, 571-577).

Spojení mezi abnormální aktivitou PK a nemocí se neomezuje na rakovinu. Enzymy RTK se například spojují s nemocemi jako je psoriáza, diabetes melitus, endometrióza, angiogenze, rozvoj ateromatůs palque, Alzheimerova choroba, restenóza, onemocnění von Hippel-Lindaua, epidermální hyperproliferace, neurodegenerativní nemoci, skvrnitá degenerace související se stářím a hemangiomy. EGFR se například uváděl při hojení korneálního a dermálního zranění. Poruchy v inzulinu-R a IGFIR se uvádějí u typu II diabetes melitus. Úplnější korelace mezi specifickými enzymy RTK a jejich terapeutickými indikacemi se uvádějí v Plowman a spol.: DN&P, 1994, 7, 337339.

Jak bylo uvedeno výše nejen enzymy RTK, ale CTK zahrnující, nikoli však omezené na spc, abl, fps, yes, fyn, lyn, lek, blk, hek, fgr a yrk (přehledně uvedené v práci Bolen a spol.: FASEB J. 1992, 6, 3403-3409) se účastní proliferativní a metabolické cesty transdukce signálu a dá se tudíž od nich očekávat, a bylo prokázané, že se účastní mnoha poruch zprostředkovaných PTK, na které se předložený vynález zaměřuje. Mutovaný src (v-src) se například prokázal jako onkoprotein (pp60^v_src) u kuřat. Navíc jeho buněčný homolog, proto-onkogen pp60^o-src přenáší onkogenické signály mnoha receptoru. Nadměrná exprese EGFR nebo HER2/neu v nádorech vede k základní aktivaci pp60^c_src, která je charakteristická pro maligní buňky, ale nedochází k ní u normálních buněk. Nedostatečná exprese c-src na druhé straně vykazuje u myší osteopetrotické fenotypy, což naznačuje klíčovou účast c-src v osteoklastické funkci a možného zapojení v odpovídajících poruchách.

Podobně se prokázala účast Zap70 při signalizací T-buněk, která se možná vztahuje k autoimunitním poruchám.

Enzymy STK se spojují se záněty, autoimunitními chorobami, imunitními odezvami a poruchami z hyperproliferace jako jsou restenóza, fibróza, psoriáza, osteoartritida a revmatoidni artritida.

Prokázala se účast enzymů PK při implantaci embrya. Sloučeniny tohoto vynálezu mohou tudíž poskytovat účinný způsob ochrany takové implantace embrya a být proto prospěšné jako činidla řídící narození. Další poruchy, které lze léčit nebo kterým lze předcházet použitím sloučenin tohoto vynálezu jsou imunologické poruchy, například autoimunitní poruchy, AIDS a kardiovaskulární poruchy, jako je ateroskleróza.

Konečně se jak o enzymech RTK, tak CTK v poslední době předpokládá, že se podílejí na hyperimunitních poruchách.

• ·

• ·** · · · · • · · · · · · · ···· • · · * · · · ·*·· ·* ··· ·· ·

Sloučeniny a předložené údaje nejsou sestaveny tak, aby jakýmkoli způsobem omezovaly rámec tohoto vynálezu.

Podávání a farmaceutický přípravek

Sloučeninu předloženého vynálezu nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl lze podávat lidskému pacientovi jako takovou, nebo ji lze podávat ve farmaceutických přípravcích, ve kterých se výše uvedená látka smíchá s vhodnými nosiči nebo pomocnými látkami. Techniky pro přípravu a podávání léků lze nalézt v „Remington's Pharmacological Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA., poslední vydání.

Výrazy „podávat nebo „podávání, jak se zde používají, se vztahují k dodání sloučeniny vzorce (I) nebo její farmaceuticky přijatelné soli nebo farmaceutického přípravku obsahujícího sloučeninu vzorce (I) nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl tohoto vynálezu do organismu za účelem prevence či léčení poruchy vztahující se k PK.

Vhodné cesty podávání mohou zahrnovat, aniž by se tím omezovaly, podávání orální, rektální, transmukosální nebo intestinální nebo transmuskulární, subkutánní, intramedulární, intratekální, přímé intraventrikulární, intravenózní, intravitreální, intraperitoneální, intranasální nebo intraokulární injekce. Výhodnými cestami podávání jsou cesty orální nebo parenterální.

Alternativně lze sloučeninu podávat spíše lokálně než systémově, například injekcí sloučeniny přímo do pevného nádoru, často jako depotní nebo trvale se uvolňující přípravek.

Navíc se léčivá látka může podávat jako cílený systém • · • · · · • * · • « · • · · ·· ···» uvolňující léčivou látku, například v liposomu pokrytém protilátkou specifickou pro nádor. Liposomy budou cílené a selektivně přitaženy nádorem.

Farmaceutické přípravky předloženého vynálezu lze vyrábět postupy dobře známými v technice, například pomocí obvyklého míšení, rozpouštění, granulace, přípravy dražé, rozmělňování na prášek, emulzifikace, opouzdřováním, vytvářením komplexu a lyofilizací.

Farmaceutické přípravky pro použití v souladu s předloženým vynálezem lze připravovat obvyklým způsobem s použitím jednoho nebo více fyziologicky přijatelných nosičů zahrnujících přídavné a pomocné látky, které usnadňují zpracování aktivních sloučenin do přípravků, které lze farmaceuticky použít. Vlastní přípravek závisí na zvolené cestě podávání.

Sloučeniny vynálezu určené pro injekční podávání lze připravovat ve vodných roztocích, výhodně ve fyziologicky slučitelných pufrech, např. v Hanksově roztoku, Ringerově roztoku nebo fyziologickém solném pufru. Pro transmukosální podávání se v přípravku používají penetranty vhodné k průchodu barierou, kterou je nutno překonat. Takové penetranty jsou v technice dobře známé.

Pro orální podávání lze sloučeniny připravovat spojením aktivních sloučenin s farmaceuticky přijatelnými nosiči, které jsou v technice dobře známé. Nosiče umožňují, aby se sloučeniny vynálezu převedly do formy tablet, pilulek, pastilek, dražé, tobolek, kapalin, gelů, sirupů, kaší, suspenzí apod. pro orální přijetí pacientem. Farmaceutické přípravky pro orální použití lze vyrobit s použitím pevných pomocných látek, volitelně rozemletím výsledné směsi a úpravou • 9

99 9 99 9

999 9 9 99 9*9 • 9 9 9 9 9999 • 99·· 9999 9999

999 999 999

9999 99 999 99 9 směsi do granul a pokud je žádoucí po přidání dalších vhodných přídavných látek pro získání základů tablet nebo dražé. Prospěšnými pomocnými látkami jsou zejména plniva, například cukry, včetně laktózy, sacharózy, mannitolu nebo sorbitolu, přípravky celulózy, takové jako například kukuřičný škrob, pšeniční škrob, rýžový škrob a bramborový škrob a další látky, například želatina, tragantová pryskyřice, methylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, natriumkarboxylmethylcelulóza a/nebo polyvinylpyrrolidon (PVP). Je-li žádoucí, přidávají se desintegrační činidla, například síťovaný polyvinylpyrrolidon, agar nebo kyselina alginová. Lze také použít soli, jako například alginát sodný.

Základy dražé jsou opatřené vhodnými potahy. Pro tento účel lze použít koncentrované roztoky cukru, které mohou volitelně obsahovat arabskou gumu, mastek, polyvinylpyrrolidon, karbopolový gel, polyethylenglykol a/nebo oxid titaničitý, lakové roztoky a vhodná organická rozpouštědla nebo směsi rozpouštědel. K tabletám nebo dražé lze přidávat barviva a pigmenty pro identifikaci nebo charakterizaci rozličných kombinací dávek aktivní sloučeniny.

Farmaceutické přípravky, které lze používat orálně zahrnují vytlačované tobolky vyrobené ze želatiny, jakož i měkké ražené tobolky vyrobené ze želatiny a plastifikátoru, takového, jakým je glycerol nebo sorbitol. Vytlačované tobolky mohou obsahovat aktivní ingredienty v přimíšenině s plnivem, například laktózou, pojivém, například škrobem a/nebo mazivem, například mastek nebo stearát hořečnatý a volitelně se stabilizátory. V měkkých tobolkách lze aktivní sloučeniny rozpustit nebo suspendovat ve vhodných kapalinách, například v mastných olejích, tekutém parafinu nebo kapalných polyethylenglykolech. K těmto přípravkům lze také přidávat stabilizátory.

• · • ·

4 4 4

4 4 4 4

4 4 ·

4444 ··

Farmaceutické přípravky, které lze také použít, zahrnují tvrdé želatinové tobolky. Jako neomezující příklad může být léková forma tobolky s aktivní sloučeninou v množství 50 a 200 mg. Dvě dávky s odlišným množstvím se připravují ze stejných granulí naplněním do tvrdých želatinových tobolek s odlišnou velikostí, velikost 3 pro tobolky s 50 mg aktivní složky a velikost 0 pro tobolky s 200 mg. Složení přípravku může být například takové, jak se uvádí v tabulce 2.

Tabulka 2

Složka jméno/kvalita	Koncentrace v granulátu (hmotnostní %)	Množství v 50 mg tobolce (mg)	Množství v 200 mg tobolce (mg)
Aktivní sloučenina NF	65,0	50,0	200,0
Mannitol NF	23,5	18,1	72,4
Natriumkroskarmelóza NF	6,0	4,6	18,4
PovidonK30NF	5,0	3,8	15,2
Stearát hořečnatý NF	0,5	0,38	1,52
Tobolka, švédská žlutá NF		velikost 3	velikost 0

Tobolky mohou být baleny do lahviček z hnědého skla nebo plastu, aby se aktivní sloučenina chránila před světlem. Obaly obsahující tobolky s přípravkem aktivní sloučeniny se musí skladovat při řízené teplotě místnosti (15-30 °C) .

Pro podávání prostřednictvím inhalace se sloučeniny pro použití podle předloženého vynálezu bez obtíží dopravují ve formě aerosolového spreje s použitím tlakových nádobek nebo jako rozprašovače a vhodnou pohonnou látku, kterou může být například, aniž by tím docházelo k omezování, dichlordifluormethan, trichlorfluormethan, dichlortetrafluorethan nebo oxid uhličitý. V případě tlakového aerosolu lze dávkovou jednotku řídit pomocí ventilu, který propustí potřebné množství. Kapsle a náboje, například želatina pro použití v inhalátoru nebo insulflatoru, lze připravovat s obsahem práškové směsi sloučeniny a vhodného práškového základu, například laktózy nebo škrobu.

«· ·· *· · ·· · • ·· · · · · · · * · • · · ··· · · · · • · · » · · · · · · ···· • · · ·«· ··· ·· »· »· ·· ··· »· ·

Sloučeniny lze také připravovat pro parenterální podávání, např. pomocí jednorázové injekce nebo kontinuální infuze. Přípravky pro injekce mohou být připraveny v jednotkové dávkové formě, např. v ampulích nebo v multidávkových obalech s přídavkem konzervační látky. Přípravky mohou mít takové formy, jako jsou suspenze, roztoky nebo emulze v olej ovitých nebo vodných médiích a mohou obsahovat pomocné látky, jako jsou suspenzační, stabilizační a/nebo dispergační činidla.

Farmaceutické přípravky pro parenterální podávání zahrnují vodné roztoky ve vodě rozpustných forem, například sůl aktivní sloučeniny, což nemá vyjadřovat nějaké omezení.. Suspenze aktivních sloučenin lze navíc připravovat v lipofilním médiu. Vhodnými lipofilními médií jsou mastné oleje, například sezamový olej, syntetické estery mastných kyselin, například ethyloleát, triglyceridy nebo látky typu liposomů. Suspenze vodných injekcí mohou obsahovat substance, které zvyšují viskozitu suspenze, například natriumkarboxymethylcelulózu, sorbitol nebo děxtran. Volitelně mohou suspense také obsahovat vhodné stabilizátory a/nebo činidla pro zvýšení rozpustnosti sloučenin, aby se umožnila příprava vysoce koncentrovaných roztoků.

Aktivní ingredient může mít alternativně formu prášku pro smíšení před použitím s vhodným médiem, např. sterilní vobou bez pyrogenu.

Sloučeniny lze také připravovat jako rektální přípravky, například čípky nebo zadržované klystýry s použitím například obvyklých čípkových základů, jako jsou kakaové máslo nebo glyceridy.

K výše popsaným přípravkům se navíc také řadí způsob přípravy sloučenin jako depotních přípravků. Takové dlouho • 9

AA · • A

AAA A A A A A • A A AA « působící přípravky lze podávat pomocí implantace (například subkutánně nebo intramuskulárně) nebo pomocí intramuskulární injekce. Sloučeninu tohoto vynálezu lze připravovat pro tuto cestu podávání s vhodnou polymerní nebo hydrofobní látkou (například v emulzi s farmaceuticky přijatelným olejem), s iontovýměnnou pryskyřicí nebo jako šetrně rozpustný derivát, například šetrně rozpustnou sůl, aniž by se jednalo o omezující příklad.

Neomezujícím příkladem farmaceutického nosiče pro hydrofobní sloučeniny vynálezu je systém dalšího rozpouštědla zahrnující benzylalkohol, nepolární povrchově aktivní látku, s vodou mísitelný organický polymer a takovou vodnou fází, jakou je systém VPD s dalším rozpouštědlem. VPD je 3 % roztok benzylalkoholu, 8 % nepolární povrchově aktivní látky polysorbat 80 a 65 % polyethylenglykolu 300, přičemž uvedená procenta vyjadřují hmotnost složky vztaženou na jednotku objemu absolutního ethanolu. Systém VPD s dalším rozpouštědlem (VPD:D5W) sestává z VPD zředěného v poměru 1:1 s 5 % roztokem dextrózy ve vodě. Tento systém s dalším rozpouštědlem dobře rozpouští hydrofobní sloučeniny a sám má nízkou toxicitu při systematickém podávání. Přirozeně se ponechává značná volnost pro změny proporcí v takovém systému s dalším rozpouštědlem, aniž by se porušily jeho rozpustnostní a toxické charakteristiky. Navíc se může měnit totožnost složek systému s dalším rozpouštědlem: například se může použít jiná nepolární povrchově aktivní látka s nízkou toxicitou místo polysorbatu 80, může se měnit velikost frakce polyethylenglykolu, jiné biokompatibilní polymery mohou nahradit polyethylenglykol, např. polyvinylpyrrolidon a dextrózu lze nahradit jinými cukry nebo polysacharidy.

Pro hydrofobní farmaceutické sloučeniny lze alternativně využít další dopravovací systémy. Dobře známými příklady • · ·· ·« • w · · • c · • · r • · · ·· ···· ·· ·· dopravovacích médií jsou liposomy a emulze nebo nosiče hydrofobních léčivých látek. Navíc lze také použít další určitá organická rozpouštědla, například dimethylsulfoxid, ačkoli často za cenu vyšší toxicity.

Sloučeniny lze navíc dopravovat s použitím systému s kontinuálním uvolňováním, takovým jako jsou polopropustné matrice pevných hydrofobních polymerů obsahující terapeutické činidlo. Vžily se rozličné materiály s kontinuálním uvolňováním a odborníci v technice jsou s nimi dobře seznámeni. Kapsle s kontinuálním uvolňováním mohou v závislosti na své chemické povaze uvolňovat sloučeniny po několik týdnů až více než sto dní. V závislosti na chemické povaze a biologické stabilitě terapeutických reagens lze využít další strategie pro stabilizaci proteinu.

Farmaceutické přípravky vynálezu mohou také zahrnovat vhodné nosiče nebo pomocné látky v pevné nebo gelové fázi. Příklady takových nosičů nebo pomocných látek zahrnují, ale nejsou omezeny ha uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, rozličné cukry, škroby, deriváty celulózy, želatinu a polymery, například polyethylenglykoly,

Mnohé sloučeniny tohoto vynálezu modulující PK lze poskytovat jako fyziologicky přijatelné soli, ve kterých patentovaná sloučenina může tvořit negativně nebo pozitivně nabité částice. Příklady sloučenin, ve kterých sloučenina vytváří pozitivně nabitý podíl zahrnuje, aniž by tím omezoval, kvartérní ammoniové soli (které se zde definují na jiném místě), například hydrochlorid, sulfát, karbonát, laktát, tartarát, malát, maleát, sukcinát, kde dusíkový atom kvartérní ammoniové skupiny je dusík vybrané sloučeniny tohoto vynálezu, který reaguje s příslušnou kyselinou. Soli, ve kterých sloučenina tohoto vynálezu vytváří negativně nabitou částici c · · · · · · · • · ··· · · · · · · · · * ·· ····· ·· · · · ··· ···· ·· ··· ·· · zahrnuje, bez omezování, sodné, draselné, vápenaté a horečnaté soli vytvořené reakcí kyselé karboxylové skupiny ve sloučenině s příslušnou bází (např. hyroxidem sodným (NaOH), hydroxidem draselným (KOH), hydroxidem vápenatým (Ca(OH)₂) atd.).

Farmaceutické přípravky vhodné pro použití v předloženém vynálezu zahrnují přípravky, ve kterých jsou aktivní složky obsažené v množství dostatečném k dosažení zamýšleného účelu, např. modulace PK aktivity nebo léčení či prevenci poruchy vztahující se k PK.

Terapeuticky účinné množství konkrétněji znamená množství sloučeniny, které účinně předchází, zmírňuje nebo zlepšuje příznaky nemoci nebo prodlužuje život subjektu, který se léčí.

Stanovení terapeuticky účinného množství spadá dosti dobře do schopností odborníků v technice, zvláště ve světle zde poskytovaného detailního popisu.

Pro jakoukoli sloučeninu použitou způsoby podle tohoto vynálezu lze terapeutické množství nejprve určit ze zkoušek na buněčných kulturách. Potom lze vyvinout dávku pro použití ve zvířecích modelech tak, aby se dosáhlo cirkulující koncentrace v oblasti, která zahrnuje ICso, jak se stanovilo v buněčné kultuře (tj. koncentrace testované sloučeniny, kterou se dosahuje polovina maximální inhibice PK aktivity). Takovou informaci lze potom použít pro přesnější určení prospěšných dávek u lidí.

Toxicitu a terapeutickou účinnost zde popisovaných sloučenin lze určit standardními farmaceutickými postupy v buněčných kulturách nebo na experimentálních zvířatech, například pomocí stanovení IC50 a LD50 (obě tyto veličiny se zde diskutují na jiném místě), pro předmětnou sloučeninu. Údaje • * • · • · · · · získané z těchto zkoušek na buněčných kulturách a studiích na zvířatech lze použít pro vyvinutí oblasti dávkování pro použití u lidí. Dávka se může měnit v závislosti na použité lékové formě a na použité cestě podávání. Přesný přípravek, cesta podávání a dávka mohou být voleny jednotlivým lékařem, který má přehled o stavu pacienta. (Viz např. Fingl a spol.: v „The Pharmacological Basis of Therapeutics, kap. 1. str. 1, 1975).

Množství dávky a interval dávkování lze nastavit individuálně, aby se zajistily v plasmě hladiny aktivních složek, které postačují pro udržení modulačních účinků na kinázu. Tyto hladiny v plasmě se označují jako minimální účinná koncentrace (MEC - minimal effective concentration). Hodnoty MEC se budou měnit pro každou sloučeninu, ale lze je určit z údajů in vitro, například podle zde opisovaných zkoušek lze zjistit potřebnou koncentraci pro dosažení 50-90 % inhibíce kinázy. Dávky potřebné pro dosažení MEC budou záviset na individuální charakteristice a cestě podávání. Pro stanovení koncentrací v plasmě lze použít analýzy HPLC nebo bioanalýzy.

Interval dávkování lze také stanovit použitím MEC hodnoty. Sloučeniny by se měly dávkovat s použitím režimu, který udržuje hladiny v plasmě nad hodnotou MEC po 10-90 % času, výhodně mezi 30-90 % času a nejvýhodněji mezi 50-90 % času.

V současné době se terapeuticky účinná množství sloučenin vzorce I, Ia nebo II mohou pohybovat přibližně od 25 mg/m² do 1500 mg/m² na den; výhodně asi 3 mg/m²/den. Ještě výhodněji 50 mg/m²/den až do 400 mg/m²/den.

V případech lokálního podávání nebo selektivní absorpce, se nemusí účinné lokální koncentrace léčivé látky vztahovat ke koncentraci v plasmě a lze použít jiné známé postupy · ·· ·· · ·· · • ·· 9 9 ··· · · 9 • · · · 9 · · · · 9 • 9 9999 9999 999 « · · · · 9 9 9 · ···· 99 9 · 9 99 9 v technice pro stanovení správné velikosti dávky a intervalu dávkování.

Množství podávané lékové formy bude samozřejmě záviset na subjektu, který se má léčit, na kritičnosti postižení, způsobu podávání, úsudku lékaře, který lék předepisuje atd.

Podle přání lze léky předkládat v obalu nebo automatickém zařízení, například v soupravě schválené FDA (Food and Drug Administration - Úřad pro kontrolu potravin a léčiv Spojených států amerických), které mohou obsahovat jednu nebo více forem dávkových jednotek obsahujících aktivní složku. Obalem může být například kovová nebo plastiková fólie, jako je například bublinkové balení. Balení nebo automatické zařízení může obsahovat doprovodní instrukce pro podávání. Balení nebo automatické zařízení může také obsahovat doprovodné upozornění přibalené k zásobníkům ve formě předepsané vládním úřadem, který kontroluje výrobu, použití nebo prodej léků. Tyto poznámky odrážejí souhlas příslušného úřadu, který se týká lékové formy a podávání v lidské nebo veterinární medicíně. Takovým upozorněním může být například etiketa schválená FDA pro předepisování léků nebo schválení použitého produktu. Lékové formy obsahující sloučeninu vynálezu zapracovanou do slučitelného farmaceutického nosiče lze také připravit, umístnit do vhodného zásobníku a označit pro léčbu indikovaného stavu. Vhodné stavy vyznačené na etiketě mohou zahrnovat léčbu nádoru, inhibici angioneneze, léčbu fibrózy, diabetů apod.

Sloučeniny předloženého vynálezu lze podávat s CMC suspenzí jako vehikulem. V níže uvedené tabulce 3 je příklad CMC suspenze.

• 4 • 4 • · • 4 • 4 ·

4444

Tabulka 3

Složka	Koncentrace v % (hm./objem)
API	*
Natriumkarboxymethylcelulóza, USP (střední kvalita)	0,5
Chlorid sodný, USP/NF	0,9
Polysorbát 80, NF	0/4
Benzylalkohol, NF	0, 8
Deionizovaná voda	Doplnit na celkový objem 100 mL

* závisí na požadované koncentraci (datumu).

Protokol pro přípravu 1 litru CMC suspenzního vehikula je následující. Vypočtou se příslušná množství pomocných látek potřebných pro přípravu vehikula s použitím tabulky, která ukazuje složení přípravku vehikula a velikost dávky. Zváží se vhodný prázdný obal, například čistá skleněná láhev se širokým hrdlem nebo polyethylenová láhev. Do láhve se odměří asi 600 mL vody. Naváží se natriumkarboxymethylcelulóza (5 g) a přenese se do láhve. Směs se míchá laboratorním magnetickým nebo vrtulovým míchadlem, až se dosáhne homogenního roztoku (asi 2-3 hodiny) . Naváží se NaCl a přidá se do láhve. Míchání pokračuje až do rozpuštění soli (asi 10 minut). Přidá se polysorbát 80. Směs se míchá až do homogenního roztoku (asi 20 minut). Přidá se benzylalkohol. Míchá se do dosažení homogenního roztoku (asi 10 minut). Přidá se zbylá voda, aby se dosáhlo hmotnosti roztoku pro požadovanou velikost dávky buď podle hmotnosti nebo objemu (1010 g nebo 1000 mL, hustota při 22 °C je 1,01 g/mL). Skladování při 2-8 °C (v ledničce).

Přípravek suspenze lze připravit následovně. API se rozmělní s použitím třecí misky a paličky, aby se získal • · β» ·· · ··· • ·· · · · · · · ·· «· * · « · ··»· • · · ·· · · · · · ···· • · · «·· · · · ·· ···· ·< «·· ·· » prášek s homogenním vzhledem s malou velikostí částic (neměly by být přítomné větší kousky a částice - ideálně by měl procházet standardním US sítem >80, tj. velikost <180 pm) . Naváží se vypočtené množství API do láhve. Do láhve se přidá asi 90 % celkového požadovaného množství (CMS suspenzačního vehikula). Sloučeniny se suspendují ve vehikulu s použitím laboratorního míchadla s vrtulkou nebo jejím ekvivalentem. Míchání se provádí při 50 otáčkách za minutu po dobu 30 minut nebo dokud není léčivá látka dobře suspendována. Přidá se přípravek vehikula (vytvořený ve vodě) do hodnoty „gs (quality sufficient - postačující kvality), aby příslušná hmotnost odpovídala velikosti dávky. Směs se míchá při 50 otáčkách za minutu dalších 30 minut. Poměrné části suspenze se okamžitě přenesou do jantarově zbarvených skleněných nebo polypropylenových lahviček. Lahvičky se musí chránit před světlem. Skladují se při 2-8 °C (v ledničce, nesmějí se zmrazit).

gemcitabin (používaný improsulfan karboquon, melaminy,

Jednou stránkou tohoto vynálezu je také to, že zde popisovanou sloučeninu, její sůl nebo prolátku, lze spojovat s jinými chemoterapeutickými činidly pro léčení výše diskutovaných nemocí nebo poruch. Například by se mohla sloučenina, její sůl nebo prolátka tohoto vynálezu spojit s alkylačními činidly, například fluoruracilem (5-FU) samotným nebo v další kombinaci s leukovorinem; nebo s dalšími alkylačními činidly, jakou jsou, aniž by se tím omezovaly, jiné analogy pyrimidinu, například UFT, capecitabin, a cytarabin, alkylsulfonáty, např. busulfan pro léčbu chronické granulocytické a piposulfan; aziridiny, např. meturedepa a uredepa; ethyleniminy např. altretamin, triethylenmelamin, leukémie), benzodepa, a methyltriethylenfosforamid, triethylenthiofosforamid a trimethylolmeiamin; deriváty hořčičného dusíku, např. chlorambucil (používaný při ♦ ♦ · »··· léčbě chronické lymfocytické leukémie, primární enémie makroglobulinu a jiného lymfomu než Hodgkinsova), cyklofosfamid (používaný pro léčení Hodgkinsovy nemoci, hromadného myelomu, neuroblastomu, rakoviny prsníku, plic, Wilmova nádoru a rhabdomyosarkomu), ifosfamid, novembrichin, prednimustin a uráčil mustard (používaný při léčení primární trombocytózy, jiného lymfomu než Hodgkinsova, Hodgkinsovy nemoci a rakoviny vaječníku); a triaziny, například dakarbazin (používaný pro léčení sarkomu měkké tkáně).

vaj ečníků, estramustin,

Sloučeninu, sůl nebo prolátku tohoto vynálezu lze také použít ve spojení s dalšími antimetabolitovými chemoterapeutickými činidly, jakou jsou například, bez omezování na ně, analogy kyseliny listové, například metotrexát (používaný při léčení akutní lymfocytické leukémie, choriokarcinomu, rakoviny prsníku mycosis fungiodes, rakoviny hlavy a krku a osteogenického sarkomu) a pteropterin; a purinové analogy, například merkaptopurin a tioguanin, které nalézají použití při léčení akutní granuloctické, akutní lymfocytické a chronické granulocytické leukémie.

Zamýšlí se, aby sloučenina, sůl nebo prolátka tohoto vynálezu mohla být také použita ve spojení s chemoterapeutickými činidly na bázi přírodních produktů, aniž by se tím omezovaly, tak například s alkaloidy Vinca rosea, například vinblastin (používaný při léčení rakoviny prsu a varlat), vinkristin a vindesin; epipodofylotoxiny, například etoposid a teniposid, které se oba používají k léčení rakoviny varlat a Kaposiho sarkomu; antibiotická chemoterapeutická činidla, napříkad daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, mitomycin (používané pro léčení rakoviny žaludku, děložního hrdla, tlustého střeva, prsu, močového měchýře a pankreatu), daktinomycin, temozolomid, plicamycin, bleomycin (používané při léčbě rakoviny kůže, jícnu a pohlavně močového traktu); a enzymatická chemoterapeutická činidla, například Lasparagináza.

Kromě výše uvedených případů se sloučenina, sůl a prolátka tohoto vynálezu může také používat ve spojení s koordinačními komplex platiny (cisplatina atd.), substituovanými deriváty močoviny, například hydroxymočovina; deriváty methylhydrazinu, např. prokarbazin; činidly potlačující adrenokortikoidy, např. mitotan, aminoglutethimid; a s hormony a antagonistý hormonů, například adrenokortikosteriody (např. prednison), progestiny (např. hydroxyprogesteron-kaproát); estrogeny (např. diethylstilbesterol); antiestrogeny, například tamoxifen; androgeny, např. testosteron-propionát; a inhibitory aromatáz, například anastrozol.

Konečně se také zamýšlí, že kombinace sloučeniny tohoto vynálezu bude účinná ve spojení s mitoxantronem (mitozantronem), paklitaxelem, inhibitory cyklooxygenázy-2, které jsou známé v technice, zejména Celebrex® Paracoxib®, Vioxx®, Abbottův Cox-189 patentovaný v PCT publikaci č. WO 99/11605, inhibitory topoisomerázy, například Camptosar®, antagonista receptorů Her-2, například Herceptin®, endostatin, Gleevac®, antagonista ImClone VEGF receptorů IMC C225® pro léčení pevných rakovinných nádorů nebo leukémií, aniž by se omezovaly tak takových, jako je myelogenní leukémie (nelymfocytická).

Obecný postup syntézy

Následovnou obecnou metodologii lze uplatnit při přípravě sloučenin tohoto vynálezu:

Vhodně substituovaný 2-oxindol (1 ekvivalent), vhodně • · · · · · • * * « · · ·» · · · • » β · · · · · · · • · · · · 9 · · · · ·· · · • · · · * · ··· • · «··· ·· ·· · ·· « substituovaný 3-karboxy-5-formylpyrrol (1,2 ekvivalentu) a zásada (0,1 ekvivalentu) se smíchají v rozpouštědle (1-2 mL/mmol 2-oxindolu) a směs se potom zahřívá od asi 2 do asi 12 hodin. Po ochlazení se vytvořená sraženina filtruje, promyje chladným ethanolem nebo etherem a vysuší ve vakuu za poskytnutí odpovídající 5- (2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)ylidenmethyl)-líf-pyrrol-3-karboxylové kyseliny. Pokud se nevytvoří sraženina, reakční směs se zahustí a zbytek se trituruje směsí dichlormethanu s etherem, výsledná pevná látka se shromáždí filtrací a potom se suší. Produkt se může volitelně dále čistit pomocí chromatografie.

Zásadou může být organická nebo anorganická báze. Pokud se použije organická báze, jedná se výhodně o dusíkovou bázi. Příklady organické dusíkové báze zahrnují, ale neomezují se na diisopropylamin, trimethylamin, triethylamin, anilin, pyridin,

1,8-diazabicyklo[5.4.1]undec-7-en, pyrrolidin a piperidin.

Příklady anorganických bází jsou, aniž by se tím omezovaly, amoniak, hydroxidy alkalických kovů nebo alkalických zemin, fosfáty, karbonáty, bikarbonáty, bisulfáty a amidy. Alkalické kovy zahrnují lithium, sodík a draslík, zatímco alkalické zeminy zahrnují vápník, hořčík a barium.

Když je rozpouštědlem protické rozpouštědlo, například voda nebo alkohol, je bází v součastném výhodném provedení tohoto vynálezu anorganická báze alkalického kovu nebo alkalické zeminy, výhodně hydroxid _; alkalického kovu nebo alkalické zeminy;

Pro zamýšlenou reakci bude odborníkům v technice zřejmé, jak ze známých obecných principů organické syntézy, tak ze zde uvedeného popisu, která báze by byla nejvhodnější.

·· · · · A AAAA • A AAAA A A A A AAA A·· AAA AAA

AA A«AA AA AAA AA A

Rozpouštědlo, ve kterém se reakce provádí, může být protické nebo aprotické, výhodně je to protické rozpouštědlo. „Protické rozpouštědlo je rozpouštědlo, ve kterém se vodíkový atom nebo vodíkové atomy kovalentně vážou k atomům kyslíku nebo dusíku, což činí atomy vodíku znatelně kyselými a tudíž schopnými „se sdílet s rozpuštěnou látkou prostřednictvím vodíkových můstků. Příklady protických rozpouštědel zahrnují vodu nebo alkoholy, aniž by se omezovaly jenom na ně.

„Aprotické rozpouštědlo může být polární nebo nepolární, ale v obou případech neobsahuje kyselé vodíkové atomy, a proto není schopné vytvářet vodíkové vazby s rozpuštěnou látkou. Příklady nepolárních rozpouštědel, aniž by se omezovaly jenom na ně, jsou pentan, hexan, benzen, toluen, methylenchlorid a tetrachlormethan. Příklady polární aprotických rozpouštědel jsou chloroform, tetrahydrofuran, dimethylsulfoxid a dimethylformamid.

V současném výhodném provedení tohoto vynálezu je rozpouštědlem protické rozpouštědlo, výhodně voda nebo alkohol, například ethanol.

Reakce se provádí při teplotě vyšší než laboratorní teplota. Obecně je teplota od asi 30 °C do asi 150 °C, výhodně od asi 80 °C do asi 100 °C, nej výhodněji od asi 60 °C do asi 85 °C, což je přibližně bod varu ethanolu. Slovíčkem „asi se míní, že teplota se pohybuje v intervalu 10 °C kolem uvedené teploty, výhodněji v intervalu 5 °C kolem uvedené teploty a nej výhodněji v intervalu 2 °C kolem uvedené teploty. Tak například výrazem „asi 75 °C se míní 75 °C ± 10 °C, výhodně 75 °C ± 5 °C a nej výhodně ji 75 °C ± 2 °C.

Výchozí látky 2-oxinoly a 3-karboxy-5-formylpyrroly lze snadno syntetizovat s použitím technik dobře známých v chemické technice a použitím snadno dostupných výchozích materiálů.

Kondenzace 5-(2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z) -ylidenmethyl)lH-pyrrol-3-karboxylové kyseliny s aminem vzorce ZCH(R⁵)CR⁴ (OH)-CHR³NH2 v organickém rozpouštědle, například dimethylformamid, tetrahydrofuran a podobně a v přítomnosti vhodného kondenzačního činidla, například dicyklohexylkarbodiimid, DEAD, EDC a HOBt potom poskytuje sloučeninu vzorce (I) . Aminy vzorce ZCH (R⁵) -CR⁴ (OH) -CHR³NH2 jsou komerčně dostupné nebo je lze připravit způsoby v technice dobře známými. Některé z těchto postupů se zde uvádějí níže.

Odborníci v technice ocení, že jsou přístupné další syntetické cesty pro vytvoření sloučenin tohoto vynálezu a že níže uvedené se nabízejí jako příklad a nikoli jako omezení vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Následující přípravy a příklady se poskytují odborníkům v technice, aby jasněji porozuměli předloženému vynálezu a umožnily jim jeho praktické provedení. Neměly by se brát jako omezení rámce vynálezu, ale pouze jako jeho ilustrace a reprezentativní příklady.

Příklady syntéz

Příklad 1

Syntéza 5-[5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]2,4-dimethyl-l#-pyrrol-3-karboxylové kyseliny

Krok 1

Dimethylformamid (25 mL, 3 ekv.) se za míchání chladil

v lázni s ledem. K němu se přidal POC1₃ (1,1 ekv., 10,8 mL) . Po třiceti minutách se k reakční směsi přidal roztok 3,5dimethyl-4-ethylesteru pyrrolu (17,7 g, 105,8 mmol) v DMF (2M, 40 mL) a míchání pokračovalo. Po dvou hodinách se reakční směs zředila vodou (250 mL) a alkalizovala se na pH = 11 pomocí IN vodného roztoku NaOH. Bílá pevná látka se odstranila filtrací, propláchla se vodou a potom hexany a sušila se za poskytnutí ethylesteru kyseliny 5-formyl-2, 4-dimethyl-líf-pyrrol-3karboxylové (19,75 g, 95 %) jako světlohnědé pevné látky.

²Η NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 12,11 (br s, 1H, NH) , 9,59 (s, 1H, CHO), 4,17 (q, J = 6,7 Hz, 2H, OCH₂GH₃) , 2,44 (s, 3H, CH₃) , 2,40 (s, 3H, CH₃), 1,26 (d, J= 6,7 Hz, 3H, OCH₂CH₃) .

Krok 2

Ethylester kyseliny 5-formyl-2, 4-dimethyl-lH-pyrrol-3karboxylové (2 g, 10 mmol) se přidal k roztohu hydroxidu draselného (3 g, 53 mmol) rozpuštěného v methanolu (3 mL) a vodě (10 mL) . Směs se zahřívala k varu po 3 hodiny, ochladila se na laboratorní teplotu a okyselila se 6N kyselinou chlorovodíkovou na pH = 3. Pevná látka se shromáždila filtrací, promyla se vodou a sušila ve vakuové sušárně přes noc za poskytnutí 5-formyl-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (1,6 g, 93 %) .

^XH NMR (360 MHz, DMS0-d₆) δ 12,09 (s, br, 2H, NH a COOH) , 9,59 (s, 1H, CHO), 2,44 (s, 3H,. CH₃) , 2,40 (s, 3H, CH₃) .

Krok 3

V 50 mL hydrátu hydrazinu se rozpustil 5-fluorisatin (8,2 g, 49,7 mmol) a zahříval se k varu jednu hodinu. Reakční směs se potom nalila do ledové vody. Sraženina se potom filtrovala, promyla vodou a sušila ve vakuové sušárně za poskytnutí 5fluor-2-oxindolu (7,5 g) .

Krok 4 • 9

9

9· 99··

Reakční směs 5-fluor-2-oxindolu (100 mg, 0,66 mmol), 5formyl-2,4-dimethyl-lJí-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (133 mg, 0,79 mmol) a 10 kapek piperidinu v ethanolu (3 mL) se míchala při 60 °C přes noc a filtrovala. Pevná látka se promyla IN vodným roztokem chlorovodíku, vodou a sušila se za poskytnutí 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2, 4-dimethyl-líř-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (201 mg, kvantitativní výtěžek) jako žluté pevné látky. MS m/z (relativní intenzita, %) 299 ( [M-l]⁺·, 100) .

Příklad 2

Syntéza (3-diethylamino-2-hydroxy-propyl) -amidu kyseliny 5-(5fluor-2-oxo-l, 2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl) -2,4-dimethyl-lířpyrrol-3-karboxylové

Krok 1

K 2-chlormethyloxiranu (95 g, 1,03 mol) se při 30 °C přidala směs vody (3,08 g, 0,17 mol) a diethylaminu (106,2 mL, 1,03 mol). Reakční směs se potom šest hodin míchala při 28-35 °C a ochladila se na 20-25 °C za poskytnutí l-chlor-3diethylamino-propan-2-olu.

Krok 2

K roztok hydroxidu sodného (47,9 g, 1,2 mol) v 78 mL vody se přidal l-chlor-3-díethylamino-propan-2-ol. Výsledný roztok se jednu hodinu míchal při 20-25 °C, zředil se 178 mL vody a dvakrát se extrahoval etherem. Spojené etherové roztoky se sušily pevným hydroxidem draselným a odpařily se za poskytnutí 135 g surového produktu, který se čistil frakční destilací za poskytnutí glycidyldiethylaminu (98 g, 76 %) jako oleje.

Krok 3

K ledově chladnému 25 % (podle hmotnosti) roztoku hydroxidu amonného (25 mL, 159 mmol) se po kapkách během

9 ·· 9 9 9 999

99 9 9 9 9 9 9 99 • 9 9 «9 9 9999

9999 9«99 9999

999 999 999

9999 <9 999 99 9 deseti minut přidal glycidildiethylamin (3,2 g, 24,8 mmol). Reakční směs se jednu hodinu míchala při 0-5 °C a potom čtrnáct hodin při laboratorní teplotě. Výsledná reakční směs se odpařila a destilovala (84-90 °C, při 500-600 mtorr (1 mtorr = 0,133 Pa)) za výtěžku l-amino-3-diethylamino-propan-2-olu (3,3 g, 92 %) . MS m/z 147 ([M+l]⁺’) .

Krok 4

K roztoku 5-formyl-2, 4-dimethyl-lJ/-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (100 mg, 0,43 mmol), EDC (122,7 mg, 0,64 mmol) a HOBt (86,5 mg, 0,64 mmol) v 1,0 mL DMF se přidal l-amino-3diethylamino-propan-2-ol (93,2 mg, 0,64 mmol). Výsledný reakční roztok se přes noc míchal při laboratorní teplotě a odpařil se. Zbytek se suspendoval v 10 mL vody a filtroval. Pevná látka se promyla nasyceným roztokem kyselého uhličitanu sodného a vodou a sušila se přes noc při vysokém vakuu v sušárně za poskytnutí surového produktu, který se čistil kolonovou chromatografií s elučním činidlem 6 % methanolu v dichlormethanu obsahujícím triethylamin (2 kapky na 100 mL 6 % methanolu v dichlormethanu) za poskytnutí (3-diethylamino-2hydroxy-propyl)-amidu kyseliny 5-(5-fluor-2-oxo-l, 2-dihydroindol-3-ylidenmethyl) -2,4-dimethyl-líř-pyrrol-3-karboxylové (62 mg, 34 %) jako žluté pevné látky.

^ΧΗ NMR (400 MHz, DMSO-dg) δ 13,70 (s, 1H, NH-1'), 10,90 (s, 1H, NH-1), 7,76 (dd, J = 2,38, 9, 33 Hz, 1H, H-4j, 7,72 (s, 1H, vinyl-H), 7,60 (m, br., 1H, CONHCH_ZCH(OH) -CH₂N(C₂H₅) ₂-4') , 6,93 (dt, J= 2, 38, 8,99 Hz, 1H, H-5), 6,85 (dd, J= 4,55, 8,99 Hz,

1H, H-6), 3,83 (m, br, 1H, OH), 3,33 (m, 4H) , 2,67 (m, br,

5H) , 2,46 (s, 3H, CH₃), 2,44 (s, 3H, CH₃) , 1,04 (m, br, 6H,

CH₃x2) . MS m/z (relativní intenzita, %). 427 ([M+l]⁺', 100).

Příklad 3

Syntéza (2-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl)-amidu kyseliny 5[5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(32)-ylidenmethyl]-2,4• · ·· ·· · ·· · • ·· · * · · · 9 9 9 • · · · · · 9 9 9 9 • · · ♦ · · · ·· 9 99 · • · · ··· 9 9 9 dimethyl-líf-pyrrol-3-karboxylové

Krok 1

Směs morfolinu (2,6 mL, 30 mmol) a epichlorhydrinu (2,35 mL, 30 mmol) v ethanolu (50 mL) se míchala při 70 °C přes noc. Po odstranění rozpouštědla se zbytek zředil methylenchloridem (50 mL). Čirá pevná vysrážená látka se shromáždila vakuovou filtrací za poskytnutí l-chlor-3-morfolin-4-yl-propan-2-olu (2,0 g, 37 %) .

^ΧΗ NMR (DMSO-cfe) δ 3,49 (t, J = 4,8 Hz, 2H) , 3,60 (t, J = 4, 6 Hz, 2H) , 3,75 (m, 4H, 2xCH₂) , 4,20 (dd, J = 5,2, 12 Hz, 2H) , 4,54 (m, 2H), 4,62 (m, 1H, OH), 6,64 (d, J = 6,4 Hz, 1H, OH). MS m/z 180,2 (M+l).

Krok 2

Při laboratorní teplotě reagoval l-chlor-3-morfolin-4-ylpropan-2-ol (2,0 g, 11 mmol) s roztokem NH₃ v methanolu (25 hmot. %, 20 mL) . Reakční směsí se probublával dusík, aby se odstranil amoniak. Odpaření rozpouštědla poskytlo hydrochloridovou sůl l-amino-3-morfolin-4-yl-propan-2-olu (2,0 g, 91 %) .

^XH NMR (DMSO-d_ff) δ 2,30 (d,	J =	6, 0	Hz,	2H) ,	2,36 (m, 4H,
NCH₂), 2,65 (dd, J= 8,4, 12,8	Hz,	1H) ,	2,91	(dd,	J = 3,6, 12, 8
Hz, 1H) , 3,52 (m, 4H, OCH₂) ,	3, 87	(m,	1H,	CH) ,	5,32 (s, 1H,

OH), 8,02 (brs., 3H, NH₃ ⁺) . MS m/z 161,1 (M+l).

Krok 3

Kyselina 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-líí-pyrrol-3-karboxylová (120 mg, 0,4 mmol) kondenzovala s l-amino-3-morfolin-4-yl-propan-2-olem (74 mg, 0,48 mmol) za vysrážení (2^hydroxy-3-morfolin-4-ylpropyl)-amidu kyseliny 5-[5-fluor-2-oxo-l, 2-dihydro-indol(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové (65 mg, 36 %) . Mateřský louh se odpařil do sucha a zbytek se ·· ·· ·· · ·· » • · · · · · · · · * · • · · ··· · · · * ·· · · · · ········ • · · ··· · · · ·· ···· ·· ··· ·· · čistil rychlou chromatografií za poskytnutí dalšího výtěžku titulní sloučeniny (70 mg, 39 %) .

X NMR (DMSO-d_ř) δ 2,28 (m,	1H) ,	2,32	(m,	1H) ,	2, 40	(m,	4H) ,
2,40, 2, 42 (2xs, 6H, 2xCH₃) ,	3,15	(s,	1H) ,	3,31	(m,	1H) ,	3,55
(m, 4H) , 3,78 (m, 1H) , 4,73	(brs,	1H,	OH) ,	6, 82	(dd,	J =	4,5,
8,4 Hz, 1H) , 6, 90 (td, ²J =	2,8,	³J =	10, 0	Hz,	1H) ,	7,53	(m,

1H), 7,70 (s, 1H) , 7,74 (dd, J = 2,0, 9,6 Hz, 1H) (aromatický a vinylový) , 10,87 (s, 1H, CONH) , 13,66 (s, 1H, NH) . LC-MS (m/z) 441,4 (M-l) .

Syntéza 2-hydroxy-7-oxa-4-azoniaspiro[3.5]nonan-chloridu

Do tříhrdlé baňky s kulatým dnem o objemu 1 L, vybavené termočlánkem, přívodem dusíku a 250 mL nálevku, se navážil mořfolin (91,5 g, 91,5 mL, 1,05 mol, 1,0 ekv.) a odměřilo 100 mL ethanolu. Roztok se rychle míchal zatímco se nálevkou přidával epichlorhydrin (100 g, 84,5 mL, 1,08 mol, 1,03 ekv.) v průběhu více než asi 30 minut. Teplota se monitorovala a když teplota baňky dosáhla 27 °C, reakční směs se chladila v lázni ledu s vodou. Čirý roztok se míchal 18 hodin. Reakční směs se analyzovala plynovou chromatografií (5 kapek reakční směsi se zředilo 1 mL ethanolu a dávkovalo se do 15 m DB-5 kapilární GC kolony za těchto podmínek: teplota dávkovače 250 °C, teplota detektoru 250 °C, počáteční teplota v kolonovém prostoru 28 °C se zvyšovala rychlosti 10 °C za minutu až do teploty 250 °C) . Reakce se ukončila, když v reakční směsi zbylo méně než 3 % morfolinu. Reakční směs se zahustila na rotačním s plným vakuem, až nedocházelo ke Výsledný olej se skladoval při odpařóváku při 50 °C kondenzaci destilátu.

laboratorní teplotě po dobu 24-48 hodin nebo až se • 4 • 4 4 * • · 4 4 4 4 44 4 4 4

9 4 44 4 4444 • · 4 44 4 4 44 4 44 44 • 44 444 444

4444 44 444 44 4 nepozorovala další tvorba krystalů (zárodečná zrnka urychlují postup). Kaše se zředila 250 mL acetonu a filtrovala se. Pevná látka se sušila ve vakuové sušárně při 60 °C po dobu 18-24 hodin. Tento postup poskytl 84 g krystalického produktu. Pro zvýšení výtěžku by se mohl mateční louh zahustit a krystalizační proces zopakovat.

^ΧΗ NMR (400 MHz, DMSO-cfe) δ 6,55 (d, 1H) , 4,64 (m, 1H) , 4,53 (m, 2H), 4,18 (m, 2H) , 3,74 (m, 4H) , 3,60 (m, 2H) , 3,48 (m, 2H) . ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-cfe) δ 70, 9, 61,39, 61,04, 60,25, 58,54, 57,80.

Syntéza l-amino-3- (4-morfolinyl)-2-propanolu (racemického)

Do jednohrdlové baňky s kulatým dnem o objemu 3 L, vybavené magnetickým míchadlem, se navážil 2-hydroxy-7-oxa-ⁱ-4azoniaspiro[3.5]nonan-chlorid (150 g, 835 mmol) a přidal se 23 % (hm.) bezvodý amoniak v methanolu (2120 mL). Baňka se uzavřela a výsledný čirý roztok se 18 hodin míchal při 20-23 °C. Plynová chromatografie za výše uvedených podmínek ukázala, že nezbyla žádná výchozí látka. Zátka se odstranila a amoniak se nechal vybublat z roztoku během 30 minut. Baňka se potom přenesla na rotační odpařovák a reakční směs se zahustila na bílou pevnou látku s lázní nastavenou na teplotu 45 °C a při plném vakuu.

^ΤΗ NMR (400 MHz, DMSO-d_s) δ 3,57 (dd, 2H) , 3,3-3,5 (m, 6H) ,

2,59 (m, 2H), 2,2-2,4 (m, 6H) . ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-cfe) δ

70, 8, 67, 1, 60, 1, 53, 8, 48, 1.

Sledováním postupu, který se popisuje výše v příkladu 3, ale nahrazením 2-(RS)-l-amino-3-morfolin-4-yl-propan-2-olu s ·· ·· • ·

2- (S)-l-amino-3-morfolin-4-yl-propan-2-olem, který se připravil podle níže uvedeného popisu, se získala žádaná sloučenina (2-(S)-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl)-amid kyseliny 5-[5fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2, 4-dimethyllíř-pyrrol-3-karboxylové.

Syntéza l-amino-3-(4-morfolinyl)-2-propanolu (neracemického)

OH ₊ KOtBu CCi NH, r KL

THF

I KOtBu

MeOH un

-CC

Do tříhrdlové baňky s kulatým dnem o obsahu 1 L, vybavené mechanickým míchadlem, termočlánkem a nálevkou se odměřil morfolin (91,5 g, 91,5 mL, 1,05 mol, 1,0 ekv.) a 45 mL tercbutanolu. Roztok se rychle míchal, zatímco se nálevkou přidával R-epichlorhydrin (100 g, 84,5 mL, 1,08 mol, 1,03 ekv.) v průběhu více než asi 30 minut. Teplota se monitorovala a když teplota baňky dosáhla 27 °C, reakční směs se chladila v lázni ledu s vodou. Čirý roztok se míchal 18 hodin. Reakční směs se analyzovala plynovou chromatografií (5 kapek reakční směsi se zředilo 1 mL ethanolu a dávkovalo se do 15 m DB-5 kapilární GC kolony za těchto podmínek: teplota dávkovače 250 °C, teplota detektoru 250 °C, počáteční teplota v kolonovém prostoru 28 °C se zvyšovala rychlostí 10 °C za minutu až do teploty 250 °C) . Reakce se ukončila, když v reakční směsi zbylo méně než 3 % morfolinu. Roztok se ochladil na 10 °C a po kapkách se přidal roztok 20 hmot. % kalium-terc-butoxidu v THF (576 g) při udržování teploty pod 15 °C. Výsledná bílá kaše se dvě hodiny míchala při 10-15 °C a kontrolovala se plynovou chromatografií za použití výše uvedených podmínek. Nezaznamenal se žádný chlorhydrin.

rotačním odpařováku s použitím 50 °C

Výsledná směs se zředila vodou (500' mL) a methylenchloridem. Fáze se oddělily a vodná fáze se promyla methylenchloridem

Směs se zahustila na lázně a plného vakua.

« · · ···· • · · ·· · • · · • · · · (500 mL). Spojené organické vrstvy se sušily nad síranem sodným a zahustily se na čirý bezbarvý olej. Získalo se 145 g, 97 % výtěžek epoxidu.

³H NMR (400 MHz, DMSO-cfe) δ 3,3 (dd, 4H) , 3,1 (m, 1H) , 2,6 (dd, 1H) , 2,5 (dd, 1H), 2,4 (m, 4H) , 2,2 (dd, 2H) . ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-cfe) δ 65,4, 60, 1, 53, 1, 48,9, 43, 4.

Výše připravený surový epoxid se vložil do kulaté baňky s jedním hrdlem o objemu 3 L s magnetickým míchadlem. Přidal se bezvodý amoniak v methanolu (24 hmot. %, 2,5 L), baňka se uzavřela a směs se 24 hodin míchala při laboratorní teplotě. Plynová chromatografie za výše uvedených podmínek ukázala, že nezbyla žádná výchozí látka. Zátka se: odstranila a amoniak se nechal vybublat z roztoku během 30 minut. Baňka se potom přenesla na rotační odpařovák a reakční směs se zahustila na čirý bezbarvý olej s lázní nastavenou na teplotu 45 °C a při plném vakuu. Získalo se 124 g produktu.

³H NMR (400 MHz, DMSO-cfe;) δ 3,57 (dd, 2H) , 3,3-3,5 (m, 6H) ,

2,59 (m, 2H), 2,2-2,4 (m, 6H) . ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-cfe) δ

70, 8, 67, 1, 60, 1, 53,8, 48,1.

Syntéza l-amino-3-(4-morfolinyl)-2-(S) -propanolu

Do tříhrdlové baňky s kulatým dnem o obsahu 1 L, vybavené mechanickým míchadlem, termočlánkem a nálevkou se odměřil morfolin (91,5 g, 91,5 mL, 1,05 mol, 1,0 ekv.) a 200 mL methanolu. Roztok se rychle míchal-, zatímco se nálevkou přidával R-epichlorhydrin (100 g, 84,5 mL, 1,08 mol, 1,03 ekv.) v průběhu více než asi 30 minut. Teplota se monitorovala a když teplota baňky dosáhla 27 °C, reakční směs se chladila v lázni ledu s vodou. Čirý roztok se míchal 18 hodin. Reakční směs se analyzovala plynovou chromatografií (5 kapek reakční směsi se zředilo 1 mL ethanolu a dávkovalo se do 15 m DB-5 kapilární GC kolony za těchto podmínek: teplota dávkovače 250 • · · · 9 9 99 9 9 9 • · · · 9 9 9 9 9 9

9 9 99 9 9 99 9 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 999 99 9 °C, teplota detektoru 250 °C, počáteční teplota v kolonovém prostoru 28 °C se zvyšovala rychlostí 10 °C za minutu až do teploty 250 °C) . Reakce se ukončila, když v reakční směsi zbylo méně než 3 % morfolinu. Roztok se ochladil na 10 °C a po kapkách se přidal roztok 25 hmot. % natriummetoxidu v methanolu (233 g, 1,08 mol, 247 mL) ) při udržování teploty pod 15 °C. Výsledná bílá kaše se dvě hodiny míchala při 10-15 °C a kontrolovala se plynovou chromatografií za použití výše uvedených podmínek. Žádný chlorhydrin se nezaznamenal. Směs se zahustila na rotačním odpařováku s použitím 50 °C lázně a plného vakuu. Výsledná směs se zředila vodou (500 mL) a methylenchloridem. Fáze se oddělily a vodná fáze se promyla methylenchloridem (500 mL). Spojené organické vrstvy se sušily nad síranem sodným a zahustily se na čirý bezbarvý olej. Získalo se 145 g, 97 % výtěžek 1,2-epoxy-3-morfolin-4ylpropanu.

\H NMR (400MHz, DMSO-cfe) δ 3,3 (dd, 4H) , 3,1 (m, 1H) , 2,6 (dd, 1H) , 2,5 (dd, 1H) , 2,4 (m, 4H) , 2,2 (dd, 2H) . ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-cfe) δ 65, 4, 60, 1, 53, 1, 48, 9, 43,4.

Výše připravený surový 1,2-epoxy-3-morfolin-4-ylpropan se vložil do kulaté baňky s jedním hrdlem o objemu 3 L s magnetickým míchadlem. Přidal se bezvodý amoniak v methanolu (24 hmot. %, 2,5 L) , baňka se uzavřela a směs se 24 hodin míchala při laboratorní teplotě. Plynová chromatógrafie za výše uvedených podmínek ukázala, že nezbyla žádná výchozí látka. Zátka se odstranila a amoniak se nechal vybublat z roztoku během 30 minut. Baňka se potom přenesla na rotační odpařovák a reakční směs se zahustila na čirý bezbarvý olej s lázní nastavenou na teplotu 45 °C a při plném vakuu. Získalo se 124 g l-amino-3-(4-morfolinyl)-2-(S)-propanolu.

^rH NMR (400 MHz, DMSO-cfe) δ 3,57 (dd, 2H) , 3,3-3,5 (m, 6H) ,

2,59 (m, 2H) , 2,2-2,4 (m, 6H) . ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-cfe) δ

70, 8, 67, 1, 60, 1, 53, 8, 48, 1.

• · ·♦ ·· • · · · • · · • · » « · · ·· ···· ♦ · · • · · • · · · • · · ···· • · · ·« ·

5-fluoroxindol Et,N, THF

Η,Ν'Ύ'-Ν

Smíchaly se amid imidazolu (7,0 g, 32,3 mmol), amin (15,0 g, 64,6 mmol), 5-fluoroxindol (4,93 g, 32,6 mmol), triethylamin (9,79 g, 96,9 mmol) a THF (88 mL) a zahřály se na 60 °C. Vytvořil se hnědý roztok. Po 24 hodinovém míchání při 60 °C se žlutá kaše ochladila na laboratorní teplotu a filtrovala. Filtrační koláč se promyl 80 mL THF a sušil přes noc při 50 °C za vakuu. Získala se hnědá pevná látka (23,2 g). Z pevné látky a 350 mL vody se vytvořila kaše a míchala se pět hodin při laboratorní teplotě a filtrovala se. Filtrační koláč se promyl 100 mL vody a sušil se přes noc při 50 °C ve vakuu. Získalo se 8,31 g s chemickým výtěžkem 56 %.

Do baňky s objemem 250 mL vybavená teploměrem, chladičem, magnetickým míchadlem a přívodem dusíku se navážilo 4,92 g 5flouroxindolu, 7,0 g amidu imidazolu, 15,5 g (R)-l-amino-3-(4morfolinyl)-2-propanolu, 9,78 g triethylaminu a 88 mL tetrahydrofuranu. Směs se zahřívala na 60 °C 16,5 hodiny. Reakční směs se potom ochladila na laboratorní teplotu, a filtrovala.

Získaná pevná látka se potom postupně třikrát rozmíchala v acetonitrilu v množství 11 mL/g, sušila ve vakuu za výtěžku 3,6 g (25,25 %). [HPLC, Hypersil BDS, C-18, 5μ, (6:4), acetonitril:0,1M chlorid amonný, PHA-571437 = 4,05 min.] ^XH NMR (DMSO) δ 10,86 (bs, 1H) , 7,75 (d, 1H) , 7,70 (s, 1H) , 7,50 (m, 1H), 6,88 (m, 2H) , 4,72 (bs, 1H) , 3,78(bs, 1H) , 3,56 (m, 4H) , 3,32 (m, 6H), 3,15 (m, 1H), 2,43 (bm, 8H) .

Příklad 4

Syntéza (2-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl)-amidu kyseliny 2,4dimethyl-5-[2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-yliden-methyl]-1Hpyrrol-3-karboxylové

Titulní sloučenina, (2-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl)amid kyseliny 2,4-dimethyl-5-[2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3B)ylidenmethyl]-l/í-pyrrol-3-karboxylové, se vysrážela kondenzací kyseliny 5-[2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-líí-pyrrol-3-karboxylové (113 mg, 0,4 mmol) s l-amino-3morfolin-4-yl-propan-2-olem (74 mg, 0,48 mmol) za výtěžku 77 mg (4 5,3 %) .

^XH NMR (DMSO-cfe) δ 2,27 (m, 1H), 2,32 (m, 1H) , 2,40 (m, 4H) , 2,40, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH₃) , 3,15 (s, 1H) , 3,32 (m, 1H) , 3,55

(m,	4H) ,	3,77	(m, 1H), 4,74 (d, J = 4,8 Hz, 1H, OH), 6,86 (d,
J =	7,6	Hz, 1H) , 6,96 (t, J = 7,2 Hz, 1H) , 7,10 (t, J = 7,6
Hz,	1H),	7, 49	(t, J= 5,6 Hz, 1H), 7,61 (s, 1H) , 7,77 (d, J =
8,0	Hz,	1H)	(aromatický a vinylový), 10,88 (s, 1H, CONH),

13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 425,4 (M+l).

Příklad 5

Syntéza (2-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl)-amidu kyseliny 5[5-chlor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové

Titulní sloučenina, (2-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl)• · · · · · • · amid kyseliny 5-[5-chlor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl] -2, 4-dimethyl-líř-pyrrol-3-karboxylové, se vysrážela kondenzací kyseliny 5-[5-chlor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3ylidenmethyl]-2, 4-dimethyl-líř-pyrrol-3-karboxylové (126 mg, 0,4 mmol) s l-amino-3-morfolin-4-yl-propan-2-olem (74 mg, 0,48

mmol) za výtěžku 107 mg (58 %) .
^XH NMR (DMSO-cfe)	δ 2,29 (m, 1H) , 2,33 (m, 1H) ,	2, 39	(m,	4H) ,
2,40, 2,42 (2xs,	6H, 2xCH₃) , 3,15 (s, 1H) , 3,37	(m,	1H) ,	3,55
(m, 4H) , 3,77 (m	, 1H) , 4,74 (d, J = 4,8 Hz, 1H,	OH) ,	6, 85	(d,

J= 8,4 Hz, 1H) , 7,11 (dd, J= 2,0, 8,0 Hz, 1H) , 7,53 (t, J = 5,6 Hz, 1H) , 7,75 (s, 1H) , 7,97 (d, J = 2,0 Hz, 1H) (aromatický a vinylový) , 10,99 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH) . LC-MS (m/z) 457,4 (M-l).

Stereoisomery R a S lze připravit následovně.

Smíchaly se a zahřály na 60 °C amid imidazolu (7,0 g, 32,3 mmol), amin (15,5 g, 96,9 mmol), 5-chloroxindol (5,48 g, 32,6 mmol), triethylamin (14 mL) a THF (88 mL) . Vytvořil se červený roztok. Po 16-ti hodinovém míchání při 60 °C se žlutá kaše ochladila na laboratorní teplotu a filtrovala. Filtrační koláč se dvakrát promyl 50 mL THF a sušil přes noc při 50 °C za vakua. Získalo se 4,36 g, což představuje 29 % chemického výtěžku.

• ·

Smíchaly se a zahřály na 60 °C amid imidazolu (6,8 g, 31,3 mmol) , amin (10,0 g, 62,5 mmol) , 5-chloroxindol (5,3 g, 31,6 mmol) a THF (100 mL) . Vytvořil se červený roztok. Po 68 hodinovém míchání při 60 °C se přidal triethylamin (14 mL) a směs se míchala pět hodin při 60 °C. Reakce kompletně neproběhla. Přidalo se 4,6 g aminového postranního řetězce a směs se míchala 20 hodin při 60 °C. Žlutá kaše se ochladila na laboratorní teplotu a filtrovala. Filtrační koláč se dvakrát promyl 50 mL THF a sušil přes noc při 50 °C za vakua. Získalo se 5,48 g, což představuje 38 % chemického výtěžku.

Příklad 6

Syntéza (2-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl) -amidu kyseliny 5[5-brom-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z) -ylidenmethyl]-2,4dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové

Titulní sloučenina, (2-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl)amid kyseliny 5- [5-brom-2-oxo-l, 2-dihydro-indol- (3Z) -ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-líř-pyrrol-3-karboxylové, se vysrážela kondenzací kyseliny 5-[5-brom-2-oxo-l, 2-dihydro-indol-3ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-líf-pyrrol-3-karboxylové (72,2 mg, 0,2 mmol) s l-amino-3-morfolin-4-yl-propan-2-olem (38 mg, 0,24 mmol) za výtěžku 55 mg (55 %).

^XH NMR (DMSO-cřg) δ 2,27 (m, 1H) , 2,32 (m, 1H) ,	2,39	(m,	4H) ,
2,41, 2,42 (2xs, 6H,	2xCH₃), 3,	13 (s, 1H), 3,35	(m,	1H) ,	3,55
(m, 4H) , 3,77 (m, 1H)	, 4,74 (d,	J = 4,4 Hz, 1H,	OH) ,	6, 80	(d,
J = 8,4 Hz, 1H) , 7, 24	(dd, J -	2,0, 8,0 Hz, 1H)	, 7,51 (t,	J =
5,6 Hz, 1H) , 7,76	(s, 1H),	8,09 (d, J =	2,0	Hz,	1H)

• · (aromatický a vinylový), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H,

NH). LC-MS (m/z) 503,4 (M-l).

Příklad 7

Syntéza (2-hydroxy-3-[1,2,3]triazol-l-yl-propyl)-amidu kyseliny 2,4-dimethyl-5-[2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl] -líf-pyrrol-3-karboxylové

Krok 1

Směs 3-[1,2,3]triazolu (2,0 g, 29 mmol), epichlorhydrinu (3,4 mL, 43,5 mmol) a N, N-diisopropyl-ethylaminu (2, 6 mL, 15 mmol) v ethanolu (50 mL) se míchala při laboratorní teplotě přes noc. Po odstranění rozpouštědel se zbytek čistil rychlou chromatografií (CH2CI2/CH3OH = 100/1-100/2-100/4) za poskytnutí l-chlor-3-[1,2,3]triazol-2-ylpropan-2-olu (2,1 g, 45 %), ^XH NMR (CDCI3) δ 3,52 (m, 2H, OH a CH₂) , 3,60 (dd, J = 5,2, 11,2 Hz, 1H) , 4,36 (m, 1H, CH) , 4,68 (m, 2H) , 7,67 (s, 2H) ; MS (m/z) 162,1 (M+l);

a l-chlor-3-[1,2,3]triazol-l-ylpropan-2-olu (2,3 g, 49 %), ^ΧΗ NMR (CDCI3) δ 3,56 (s, 1H) , 3,57 (s, 1H), 4,35 (m, 1H) , 4,53 (dd, J = 7,2, 14 Hz, 1H) , 4,67 (dd, 3,8, 14 Hz, 1H) , 7,67 (s, 1H) , 7,71 (s, 1H) ; MS (m/z) 162,1 (M+l).

Krok 2

V hermeticky uzavřené tlakové nádobě reagoval přes noc při 60 °C l-chlor-3-[1,2,3]triazol-l-ylpropan-2-ol (2,3 g, 13 mmol) s NH3 v metanolu (25 hmotn. %, 20 mL) . Po ochlazení na laboratorní teplotu se reakční směsí probublával dusík, aby se odstranil amoniak. Odpaření rozpouštědla poskytlo hydrochloridovou sůl l-amino-3-[1,2,3]triazol-l-ylpropan-2-olu (2,57 g, 100 %) .

^ΧΗ NMR (DMSO-dř)	δ 2, 68 (dd, J = 8,8, 12,8	Hz,	1H) ,	2,97 (dd, J
= 3,6, 12,8 Hz,	1H), 4,15 (m, 1H) , 4,44	(dd,	J =	6,4, 14 Hz,
1H), 4,57 (dd,	J = 4,6, 14 Hz, 1H) , 5,95	(d,	J =	5,2 Hz, 1H,

OH), 7,77 (s, 1H), 8,01 (brs., 3H, NH₃ ⁺) , 8,12 (s, 1H) . MS (m/z) 143,1 (M+l) .

Krok 3

Titulní sloučenina, (2-hydroxy-3-[1,2, 3]triazol-l-ylpropyl)-amid kyseliny 2,4-dimethyl-5-[2-oxo-l,2-dihydro-indol(3Z)-ylidenmethyl]-líř-pyrrol-3-karboxylové, se vysrážela kondenzací kyseliny 5-(2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové (113 mg, 0,4 mmol) s 1amino-3-[1,2,3]triazol-l-yl-propan-2-olem (85 mg, 0,48 mmol) za výtěžku 70 mg (41 %).

^ΧΗ NMR (DMSO-dX δ 2, 45, 2, 48 (2xs, 6H, 2xCH₃) , 3,35 (m, 2H) ,

4, 02	(m, 1H) , 4,32 (dd, J = 7,6,	14	Hz, 1H) , 4,53	(dd,	J =
3,4,	14 Hz, 1H) , 5,43 (d, J = 5,6	Hz,	1H, OH), 6,91	(d,	J =
7,6	Hz, 1H) , 7, 01 (t, J = 7,6 Hz,	1H.)	, 7,15 (t, J =	8, 0	Hz,
1H),	7,66 (s, 1H) , 7,12 (t, J =	5, 6	Hz, 1H), 7,74	(s,	1H) ,

7, 77 (d, J = 7,6 Hz, 1H) , 8,11 (s, 1H) , 10,93 (s, 1H, CONH) ,

13,68 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 405,4 (M-l).

Příklad 8

Syntéza (2-hydroxy-3-[1,2,3]triazol-l-yl-propyl)-amidu kyseliny 5-[5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl] -2, 4-dimethyl-lJ7-pyrrol-3-karboxylové

Titulní sloučenina, (2-hydroxy-3-[1,2, 3]triazol-l-ylpropyl)-amid kyseliny 5-[5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol- (3Z) yliden-methyl]-2,4-dimethyl-l£T-pyrroÍ-3-karboxylové, se vysrážela kondenzací kyseliny 5-[5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-17í-pyrrol-3-karboxylové (120 mg, 0,4 mmol) s l-amino-3-[1,2,3]triazol-l-yl-propan-2-olem (85

mg, 0,48 mmol) za výtěžku	100	mg (62	%) ·.
^ΤΗ NMR (DMSO-dg) δ 2,42,	2,44	(2xs,	6H, 2xCH₃) ,	3, 27	(m,	2H) ,
3,98 (m, 1H) , 4,27 (dd,	J =	7, 6,	14 Hz, 1H) ,	4,50	(dd,	J =
3,4, 13,6 Hz, 1H), 5,38 (d, J	= 5,6	Hz, 1H, OH) ,	6, 82	(dd,	J =

4,4, 8,4 Hz, 1H) , 6,91 (td, ²J = 2,4, ³J = 9,0 Hz, 1H) , 7,70 (m, 3H) , 7,75 (dd, J= 2,4, 9,2 Hz, 1H) , 8,11 (s, 1H) , 10,93 (s, 1H, CONH), 13,73 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 423,4 (M-l).

Příklad 9

Syntéza (2-hydroxy-3-[1,2,3]triazol-l-yl-propyl)-amidu kyseliny 5-[5-chlor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(32)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové

Titulní sloučenina, (2-hydroxy-3-[1,2, 3]triazol-l-ylpropyl)-amid kyseliny 5-[5-chlor-2-oxo-l, 2-dihydro-indol-(32) yliden-methyl]-2, 4-dimethyl-lí/-pyrrol-3-karboxylové, se vysrážela kondenzací kyseliny 5-[5-chlor-2-oxo-l, 2-dihydro-indol-3ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové (126,6 mg, 0,4 mmol) s l-amino-3-[1,2,3]triazol-l-yl-propan-2-olem (85 mg, 0,48 mmol) za výtěžku 48 mg (27 %).

^ΧΗ	NMR (DMSO-dg) δ 2, 42, 2, 44 (2xs, 6H, 2:	xCH₃) ,	3,27	(m,	2H) ,
3,	99	(m, 1H) , 4,28 (dd, J = 7,8, 14 Hz,	1H) ,	4,51	(dd,	J =
3,	2/	14 Hz, 1H), 5,39 (d, J =6,0 Hz, 1H,	OH),	6, 85	(dd,	J =
8,	4	Hz, 1H) , 7,12 (dd, J = 2,0, 8,2 Hz,	1H) ,	7, 70	(m,	2H) ,
7<	74	(s, 1H) , 7,97 (d, J= 2,0, Hz, 1H) ,	8, 07	(s, 1H),	10, 99

(s, 1H, CONH), 13,65 (s, 1H, NH) . LC-MS (m/z) 439, 4 (M-l).

Příklad 10

Syntéza (2-hydroxy-3-[1,2,3]triazol-l-yl-propyl)-amidu kyseliny 5-[5-brom-2-oxo-l,2-dihydro-indol-(32)-ylidenmethyl] -2, 4-dimethyl-líf-pyrrol-3-karboxylové

Titulní sloučenina, (2-hydroxy-3-[1,2, 3]triazol-l-ylpropyl)-amid kyseliny 5-[5-brom-2-oxo-l, 2-dihydro-indol-(32)yliden-methyl]-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové, se vysrážela kondenzací kyseliny 5-[5-brom-2-oxo-l, 2-dihydro-indol-3ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové (144,4 mg, 0,4 mmol) s l-amino-3-[1,2,3]triazol-l-yl-propan-2-olem (85 • · ·· · ··· 9 9 9 9 • 9 9 99 9 · 99 9999 • 99 9 · · 999 • 9 9999 99 999 »9 9 mg, 0,48 mmol) za výtěžku 130 mg (67 %) .

^XH	NMR (DMSO-ck)	δ 2,41, 2,	44 (2xs, 6H, 2xCH₃) ,	3, 27	(m, 2H) ,
3,	99 (m, 1H) , 4	,28 (dd, J	= 7,6, 14 Hz, 1H) ,	4,50	(dd, J -
3,	6, 14 Hz, 1H)	, 5,40 (d,	J =5, 6 Hz, 1H, OH) ,	6, 81	(dd, J =
8,	4 Hz, 1H), 7,	24 (dd, J	= 2,0, 8,0 Hz, 1H) ,	7, 70	(m, 2H) ,
7,	77 (s, 1H), 8,	07 (s, 1H),	8,10 (d, J = 1,6 Hz	, , 1H) ,	11,0 (s,
1H	, CONH), 13,64	(s, 1H, NH)	. LC-MS (m/z) 485,4	(M-l).

Syntézy kyselin 5-[5-brom-2-oxo-l, 2-dihydro-indol-3ylidenmethyl] -2,4-dimethyl-líf-pyrrol-3-karboxylové, 5- [5chlor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl]-2, 4-dimethyl-lHpyrrol-3-karboxylové a 5-[2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl]-2, 4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové se popisují v souběžně podané přihlášce žadatele k předložené přihlášce ze 14. února 2001, jejíž název je „Pyrrole Substituted 2Indolinone — Protein Kinase Inhibitors, pořadové číslo 09/783,264, popis které se zde v plném rozsahu zahrnuje do tohoto vynálezu.

Příklad 11

Syntéza l-amino-3- (1,1-dioxo—X⁶-thiomorfolin-4-yl) -propan-2-olu

K roztoku thiomorfolinu (5,0 g, 48,7 mmol) v HOCH₃ (200 mL) se přidal roztok oxonu (36,0 g, 58,5 mmol) v H₂O (100 mL) . Směs se intenzivně míchala 48 hodin· při 40 °C a potom se ochladila na 0 °C. Po kapkách se přidal vodný roztok NaOH, aby se pH nastavilo na hodnotu 12. Pevná látka se filtrovala, promyla HOCH₃ (3 x 40 mL). Spojené kapalné podíly se zahustily a čistily rychlou chromatografií na silikagelu (CHCl₃/CH₃OH/NH₃.H₂O=3/l/0,1-2/1/0,1) za poskytnutí 1, 1-dioxidu thiomorfolinu (6,2 g) v 93 % výtěžku.

^XH NMR (DMSO-cfe) δ 2,97 (m, 4H) , 3,07 (m, 4H) , 3,42 (brs, 1H) . MS (m/z) 136 (M+l).

Směs 1,1-dioxidu thiomorfolinu (2,5 g, 18,5 mmol) a (R)-(-)epichlorhydrinu (1,55 mL, 20 mmol) ve směsi rozpouštědel éthanol (50 mL) a voda (5 mL) se 24 hodin míchala při 25 °C. Po odstranění rozpouštědla se zbytek čistil rychlou chromatografií za poskytnutí (R)-l-chlor-3-(1,1-dioxo—λ⁶thiomorfolin-4-yl)-propan-2-olu (4,0 g, 96 %) .

^XH NMR (DMSO-de) δ	2,50 (m,	2H) , 2,94	(m,	4H) , 3,05	(m, 4H) ,
3,54	(dd,	J = 5,8,	11,2 Hz,	1H), 3,63	(dd,	J = 4,4,	11,2 Hz,
1H),	3, 78	(m, 1H,	CH), 5,10	(d, J = 5,	2 Hz,	1H, OH) .	MS (m/z)

228,2 (M+l).

(R) -l-chlor-3- (1,1-dioxo—λ⁶-thiomorfolin-4-yl) -propan-2-ol (2,27 g, 10 mmol) reagoval 12 hodin při teplotě 50 °C s roztokem NH₃ v methanolu (25 hm. %, 20 mL) . Po odpaření rozpouštědel se zbytek zpracoval anionovou iontovýměnnou pryskyřicí (AGlx8, OH forma) ve vodě za poskytnutí surového (S) -l-amino-3- (1,1-dioxo—λ⁶-thiomorfolin-4-yl) -propan-2-olu (2,0 g) . Uvedená sloučenina obsahovala asi 30 % svého diméru, od kterého se dosti obtížně čistila kolonovou chromatografií. MS (m/z) 209,2 (M+l). Kondenzací (S)-l-amino-3-(1,1-dioxo—λ⁶thiomorfolin-4-yl)-propan-2-ol s oxindoly se získaly požadované indolinony (výtěžek 50-80 % po čistění).

[3- (1,1-dioxo—X⁶-thiomorfolin-4-yl) -2-hydroxy-propyl] -amid kyseliny (R) -5-(2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl-lJí-pyrrol-3-karboxylové • 4 • 4 44 > 44 4

44 4 4 444 4 44

4 4 44 4 4 4 4 4

4 4 44 4 4 44 44444

444 444 444

^ΧΗ NMR (DMSO-cfc) δ 2,39, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH₃) , 2,49 (m, 1H) ,

2,56 (m, 1H) , 2,97 (m, 4H) , 3,07 (m, 4H) , 3,16 (m, 1H) , 3,34 (m, 1H) , 3,74 (m, 1H) , 4,83 (d, J= 4,8 Hz, 1H, OH), 6,86 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 6,97 (t, J =7,4 Hz, 1H) , 7,11 (t, J= 7,5 Hz, 1H) , 7,50 (t, J = 5,6 Hz, 1H) , 7,61 (s, 1H) , 7,76 (d, 7,6

Hz, 1H) (aromatický a vinylový), 10,88 (s, 1H, CONH) , 13,62 (S, 1H, NH). LC-MS (m/z) 473,4 (M+l).

[3- (1,1-dioxo—X⁶-thiomorfolin-4-yl) -2-hydroxy-propyl] -amid kyseliny (R) -5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-lR-pyrrol-3-karboxylové

O

H ^τΗ NMR (DMSO-cfe) δ 2, 40, 2, 42 (2XS, 6H, 2xCH₃) , 2,47 (m, 1H) ,

2,54	(m,	1H) , 2,97 (m,	4H) , 3,06 (m, 4H) , 3,17	(m, 1H) , 3,30
(m,	1H),	3,74 (m, 1H),	4, 83 (d, J = 4,4 Hz, 1H) ,	6,82 (t, J =
4,0	Hz,	1H) , 6,91 (td,	²J = 2,8, ³J = 9,0 Hz, 1H) ,	7,53 (t, J =
5, 8	Hz,	1H), 7,70 (s,	1H) , 7,75 (dd, J = 2,4,	9,2 Hz, 1H) ,

10,88 (s, 1H), 13,67 (s, 1H). LC-MS (m/z) 491,4 (M+l).

[3- (1,1-dioxo—X⁶-thiomorfolin-4-yl) -2-hydroxy-propyl] -amid kyseliny (R) -5-(5-chlor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-yliden• · ··

9 9

99 9 9 methyl) -2, 4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové

2,53 (m, 1H) , 2,96 (m, 4H) , 3,06 (m, 4H) , 3,17 (m, 1H) , 3,33 (m, 1H) , 3,75 (m, 1H) , 4,83 (d, J= 4,4 Hz, 1H, OH), 6,85 (t, J= 8,4 Hz, 1H), 7,11 (dd, <7= 2,2, 8,2 Hz, 1H) , 7,53 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 7,75 (s, 1H) , 7,97 (d, J = 2,0 Hz, 1H) , 10,98 (s, 1H), 13,62 (s, 1H). LC-MS (m/z) 507,2 (M+l).

[3- (1,1-dioxo—X⁶-thiomorfolin-4-yl) -2-hydroxy-propyl] -amid kyseliny (H) -5-(5-brom-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové

^ςΗ NMR (DMSO-dó) δ 2,41, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH₃) , 2,47 (m,	1H) ,
2,54 (m, 1Ή), 2,97 (m, 4H) , 3,06 (m, 4H) , 3,18 (m, 1H) ,	3, 30
(m, 1H) , 3,74 (m, 1H) , 4,83 (d, J= 4,8 Hz, 1H) , 6,81 (d,	J =
8,4 HZ, 1H) , 7,24 (dd, J = 1,8, 8,2 Hz, 1H) , 7,53 (t, J =	5, 8
Hz, 1H) , 7,76 (s, 1H), 8,09 (d, J='2,0 Hz, 1H) , 10,98	(s,
1H), 13,62 (s, 1H). LC-MS (m/z) 553,6 (M+l).

·· ·· • · · • ····

Příklad 12

Syntéza (S)- nebo (R)-l-methylamino-3-morfolin-4-yl-propan-2-

(S)(/?)Směs morfolinu (1,74 mL, 20 mmol) a (R)-epichlorhydrinu (1,56 mL, 20 mmol) v ethanolu (10 mL) se míchala 48 hodin při laboratorní teplotě. Po odstranění rozpouštědla reagoval zbytek 14 hodin při laboratorní teplotě s roztokem CH₃NH₂ ve vodě (40 hmot. %, 20 mL) . Odstranění rozpouštědel poskytlo surový (S)-l-methylamino-3-morfolin-4-yl-propan-2-ol, který lze čistit vakuovou destilací nebo na chromatografické koloně (2,4 g, 70 %) . (R)-l-methylamino-3-morfolin-4-yl-propan-2-ol se vyrobil z (Sj-epichlorhydrinu s 76 % výtěžkem.

^ΧΗ NMR (CDCls) δ 2,33 (dd, J= 3,6, 12, 4 Hz, 1H), 2,42 (m, 1H) ,

2,44	(dd,	J =	2,8, 9,8 Hz, 2H) , 2,45 (s,	3H), 2,53	(dd,	J =
7,6,	11, 8	Hz,	1H) , 2,62 (m, 2H) , 2,65 (dd,	J = 3,6,	12,0	Hz,
1H) ,	3,71	(m,	. 4H) , 3,85 (m, 1H) . ¹³C NMR (CDC1₃)	δ 67	,06,
65,58, 62,	80,	55, 87, 53, 94, 36,72, MS (m/z)	175 (M+l).

Kondenzace (S)-l-methylamino-3-morfolin-4-yl-propan-2-olu s 5-fluoroxindolem poskytuje (2-hydroxy-3-morfolin-4-ylpropyl)-methylamid kyseliny (R)-5-(5-fluor-2-oxo-l, 2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové

	*· ·· ·· • · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · ·· ·· ·· ·· 99	• ·· • « · ···	·♦ · • · · • · · · • · ··· • · · »· *
^XH NMR (DMSO-cfe) δ 2,0	(s, 3H) , 2,15 (m, 1H) , 2,25	(m,	6H),
2,28 (m, 2H) , 2,42 (s,	1H) , 2,95 (s, 1H) , 3,0 (s,	3H) ,	3, 25
(m, 2H) , 3,57 (m, 2H) ,	3,97 a 3,68 (2xbrs, 1H) , 4,	80 a	4,74
(2xbrs, 1H) , 6,82 (dd,	J = 4,0, 8,0 Hz, 1H) , 6, 90	(td,	²J =
2,3, ³J = 8,7 Hz, 1H) ,	7,67 (s, 1H) , 7,71 (dd, J = 2,	2, 9,	0 Hz,
1H), 10,86 (s, 1H), 13,	57 (s, 1H). LC-MS (m/z) 457,2	(M+l)

(R)-l-methylamino-3-morfolin-4-yl-propan-2-ol poskytuje (2-hydroxy-3-morfolin-4-yl-propyl)-methylamid kyseliny (Sj-5(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2, 4-dimethyllH-pyrrol-3-karboxylové

^XH NMR (DMSO-cfe) δ 2,0 (m, 3H) , 2,10 (m, 1H) , 2,22 (m, 6H) ,

2,25 (m, 2H) , 2,38 (m, 1H) , 2,90 (s, 1H) , 2,96 (s, 3H) , 3,27 (m, 2H), 3,52 (m, 2H), 3,93 a 3,64 (2xbrs, 1H), 4,75 a 4,70 (2xbrs, 1H), 6,77 (dd, J = 4,6, 8,2 Hz, 1H) , 6,85 (td, ²J =

2,5, ³J = 8,8 Hz, 1H) , 7,62 (s, 1H), 7,67 (dd, J=2,0, 9,6 Hz, 1H), 10,81 (s, 1H), 13,52 (s, 1H). LC-MS (m/z) 457,2 (M+l).

Příklad 13

Příprava aminového postranního řetězce 3- (ΙΗ-tetrazol-l-yl) -2-hydroxy-l-chlorpropanu a 3-(2H-tetrazol-l-yl)-2-hydroxy-l-chlorpropanu

Směs 6, 905 g tetrazolu (100 mmol) a 1,75 mL diisopropylethylaminu (10 mmol) a 11,73 mL epichlorhydrinu (150 mmol) v bezvodém acetonitrilu (30 mL) se míchala 4 hodiny při 60 °C. Získaný roztok se odpařil, sušil ve vysokém vakuu a čistil na

100 ·· ·« ·» • · · · · · • · · · · • » · t · · • · · · · *· ·<··» «·

9

9 9

9 9 9

9 9999

9 9

9 koloně se silikagelem s elucí chloroform-methanol 100:8, První frakce poskytla čistý 3-(2íf-tetrazol-l-yl)-2-hydroxy-lchlorpropan, 6,215 g (bezbarvý olej, 38 % výtěžek), výtěžkem druhé frakce bylo 9,208 g čistého 3- (líf-tetrazol-l-yl) -2hydroxy-l-chlorpropanu (lepkavá guma, 57 % výtěžek).

3- (líf-tetrazol-l-yl) -2-hydroxy-l-aminopropan

Směs 9,110 g 3-(líf-tetrazol-l-yl)-2-hydroxy-l-chlorpropanu, 15 g uhličitanu draselného a 130 mL nasyceného roztoku methanolického amoniaku se míchala 21 hodin, potom filtrovala a odpařila. Zbytek se čistil na silikagelové koloně pomocí eluce chloroform-methanol-vodný roztok amoniaku 80:35:4. Výtěžek 7,326 g bílé lepkavé gumy (91,5 %).

3- (2íf-tetrazol-l-yl) -2-hydroxy-l-aminopropan

Směs 6,105 g 3- (2íf-tetrazol-l-yl) -2-hydroxy-l-chlorpropanu, 10 g uhličitanu draselného a 95 mL nasyceného roztoku methanolického amoniaku se míchala 21 hodin, potom filtrovala a odpařila. Zbytek se čistil na silikagelové koloně pomocí eluce chloroform-methanol-vodný roztok amoniaku 60:25:2. Výtěžek 3,726 g bílé, krystalické, pevné látky (69,5 % teoretických).

3-[(2R, 6S)-2,6-dimethylmorfolin-4-yl]-2-hydroxy-l-aminopropan

Do ledově vychlazeného roztoku cis-2, 6-dimethylmorfolinu (4,607 g, 40 mmol) v trifluorethanolu (5 mL) se přidalo 4,7 mL epichlorhydrinu (60 mmol). Roztok se míchal jednu hodinu při 0-5 °C, chladící lázeň se odstranila a míchání pokračovalo při laboratorní teplotě pět hodin. Směs se odpařila ve vysokém vakuu, získaný olejovitý zbytek se rozpustil v bezvodém ethanolu (50 mL) , roztok se ochladil v lázni s ledem, přidal ·· · ·· · • ·· · · · • * · · · · • · ·· ····· • · · · · ·· · · · · · ·

101 se ve dvou dávkách pevný natrium-methoxid (2,27 g) a směs se dvě hodiny míchala při 0-5 °C. Potom se reakční směs filtrovala, soli se promyly ethanolem (30 mL) a spojené filtráty se přidaly do ledem chlazeného koncentrovaného vodného roztoku amoniaku (200 mL) . Směs se 12 hodin míchala při laboratorní teplotě a potom se odpařila ve vysokém vakuu. Zbytek se čistil na koloně se silikagelem s elucí směsí chloroform-methanol-7M roztok amoniaku v methanolu 80:15:3. Výtěžek 5,75 g bílé, krystalické, hygroskopické látky (76,3 % teoretických).

(2S)-3-(3-methyl-2,5-dioxoimidazolidín-l-yl)-2-hydroxy-lchlorpropan a (2S)-3-(3-methyl-2,5-dioxoimidazolidin-l-yl)-2hydroxy-l-aminopropan

Při 60 °C se po dobu 20 hodin míchala směs 3, 423 g 3methyl-2,5-dioxoimidazolidinu a 3,60 mL R-epichlorhydrinu (-) (99 % e.e.) a 0,30 mL Bartoňovy báze (1,5 mmol) v bezvodém acetonitrilu. Získaný roztok se odpařil ve vysokém vakuu a čistil se na silikagelové koloně elucí směsí chloroformmethanol (gradient od 5 do 20 % methanolu), aby se získalo 5,527 g chlorované sloučeniny jako bílé, amorfní, pevné látky (90 % výtěžek). Chlorid se převedl na amin následovně. Získaný hydroxy-chlorový meziprodukt se rozpustil v methanolickém amoniaku (nasycený amoniakovým plynem), přidal se uhličitan draselný a směs se míchala v uzavřené nádobě dva a půl dne. Reakční směs se filtrovala a filtrát se odpařil. Zbytek se čistil na silikagelové koloně s elucí směsí chloroformmethanol-koncentrovaný vodný roztok amoniaku 80:15:1,5.

Příklad 14

5-[(Z)-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)methyl]-Μι 2-hydroxy-3- (2H-tetrazol-2-yl) propyl] -2,4-dimethyl-lH-pyrrol3-karboxamid (sloučenina 22) (obecný postup) • ·

9999

102

Do kaše 105 mg (0,25 mmol) l-oxy-7-azabenztriazol-esteru kyseliny 5- [ (Z) - (5-fluor-2-oxo-l, 2-dihydro-37í-indol-3yliden)methyl]-2,4-dimethyl-177-pyrrol-3-karboxylové [připraveného pomocí aktivace (3Z)-3-({3,3-dimethyl-4-karboxy-17fpyrrol-2-yl[methylen)-5-fluor-l,3-dihydro-2H-indol-2-onu (480 mg, 1,6 mmol) s činidlem HATU (570 mg, 1,5 mmol) v přítomnosti Hunigovy báze (3,0 mmol, 0, 525 mL) v DMF (5 mL) a izolovaného v čisté formě pomocí srážení s chloroformem (5 mL) a sušeného ve vysokém vakuu s 92 % výtěžkem (579 mg) ] v bezvodém dimethylacetamidu (1,5 mL) se přidalo 72 mg 3-(277-tetrazol-2yl)-2-hydroxy-l-aminopropanu. Směs se míchala 30 minut a odpařila ve vysokém vakuu. Zbytek se suspendoval ve směsi methanol-diethylamin 20:1 (3 mL), ponechal se jednu hodinu krystalizovat v ledničce (5 °C) , filtroval se, sraženina se promyla ledově chladným methanolem a sušila ve vysokém vakuu. Vytěžilo se 106 mg oranžové, krystalické, pevné látky.

Příklad 15

5- [ (Z) - (5-chlor-2-oxo-l, 2-dihydro-377-indol-3-yliden) methyl] -N[2-hydroxy-3- (27f-tetrazol-2-yl) propyl] -2, 4-dimethyl-ltf-pyrrol3-karboxamid (sloučenina 23) (obecný postup)

Do kaše 109 mg (0,25 mmol) l-oxy-7-azabenztriazol-esteru kyseliny 5-[ (Z) - (5-chlor-2-oxo-l, 2-dihydro-37f-indol-3yliden)methyl]-2,4-dimethyl-17í-pyrrol-3-karboxylové [připraveného pomocí aktivace (3Z)-3-( [3, 3-dimethyl-4-karboxy-177pyrrol-2-yl]methylen) -5-chlor-l, 3-dihydro-277-indol-2-onu (1,520 g, 4,8 mmol) s činidlem HATU (1,768 g, 4,65 mmol) v přítomnosti Hunigovy báze (9,0 mmol, 1,58 mL) v DMF (20 mL) a izolovaného v čisté formě pomocí srážení s chloroformem (20 mL) a sušeného ve vysokém vakuu s 94 % výtěžkem (1, 907 g) ] v bezvodém dimethylacetamidu (1,5 mL) se přidalo 72 mg 3-(277tetrazol-2-yl)-2-hydroxy-l-aminopropanu. Směs se míchala 30 minut a odpařila ve vysokém vakuu. Zbytek se suspendoval ve

103 směsi methanol-diethylamin 20:1 (3 mL) , nechal se jednu hodinu krystalizovat v ledničce (5 °C) , filtroval se, sraženina se promyla ledově chladným methanolem a sušila ve vysokém vakuu. Vytěžilo se 109 mg oranžové, krystalické, pevné látky.

Příklad 16

N- [2-hydroxy-3- (2íf-tetrazol-2-yl)propyl] -2, 4-dimethyl-5- [(2)[2-OXO-5-(trifluormethoxy)-1,2-dihydro-3tf-indol-3yliden]methyl]-lfí-pyrrol-3-karboxamid (sloučenina 24) (obecný postup)

Do kaše 121,5 mg (0,25 mmol) l-oxy-7-azabenztriazol-esteru kyseliny 5-[(2)-(5-trifluormethoxy-2-oxo-l, 2-dihydro-3H-indol3-yliden)methyl] -2,4-dimethyl-líř-pyrrol-3-karboxylové [připraveného pomocí aktivace (32) -3- ({3, 3-dimethyl-4-karboxy-l.fipyrrol-2-yl}methylen)-5-trifluormethoxy-l, 3-dihydro-2H-indol2-onu (1,768 g, 4,8 mmol) s činidlem HATU (1,758 g, 4,65 mmol) v přítomnosti Hunigovy báze (9,0 mmol, 1,58 mL) v DMF (25 mL) a izolovaného v čisté formě odpařením a vysrážením s bezvodým acetonitrilem a sušeného ve vysokém vakuu s 85,5 % výtěžkem (1,929 g) ] v bezvodém dimethylacetamidu (1,5 mL) se přidalo 72 mg 3-(2H-tetrazol-2-yl)-2-hydroxy-l-aminopropanu. Směs se míchala 30 minut a odpařila ve vysokém vakuu. Zbytek se suspendoval ve směsi methanol-diethylamin 20:1 (3 mL), nechal se jednu hodinu krystalizovat v ledničce (5 °C), filtroval se, sraženina se promyla ledově chladným methanolem a sušila ve vysokém vakuu. Vytěžilo se 113 mg oranžové, krystalické, pevné látky.

Příklad 17

5-[(2)-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-3tf-indol-3-yliden)methyl]-N[2-hydroxy-3- (líf-tetrazol-2-yl)propyl] -2, 4-dimethyl-líf-pyrrol3-karboxamid (sloučenina 25)

104

Φ · · ··· ···· • · β · · φ · · · ····· ··· · · · ··· •· ···· ·· ··· ·· ·

Tato sloučenina se připravila podle postupu v příkladu 14 ze 72 mg odpovídajícího aminu. Výtěžek 113 mg oranžové, krystalické, pevné látky.

Příklad 18

5- [ (Z) - (5-chlor-2-oxo-l, 2-dihydro-37í-indol-3-yliden) methyl] -V[2-hydroxy-3- (lH-tetrazol-2-yl) propyl] -2, 4-dimethyl-líf-pyrrol3-karboxamid (sloučenina 26)

Tato sloučenina se připravila podle postupu v příkladu 15 ze 72 mg odpovídajícího aminu. Výtěžek 122 mg oranžové, krystalické, pevné látky.

Příklad 19

N- [2-hydroxy-3- (líf-tetrazol-l-yl)propyl] -2, 4-dimethyl-5- [ (Z) [2-oxo-5- (trifluormethoxy) -1,2-dihydro-3íf-indol-3yliden] methyl ]-líř-pyrrol-3-karboxamid (sloučenina 27)

Tato sloučenina se připravila podle postupu v příkladu 16 ze 72 mg odpovídajícího aminu. Výtěžek 118 mg oranžové, krystalické, pevné látky.

Příklad 20

W-[3-[(2R, 6S)-2,6-dimethylmorfolin-4-yl]-2-hydroxypropyl]-5[ (Z) - (5-fluor-2-oxo-l, 2-dihydro-3íf-indol-3-yliden) methyl] 2,4-dimethyl-líí-pyrrol-3-karboxamid (sloučenina 28)

Tato sloučenina se připravila podle postupu v příkladu 14 z 95 mg odpovídajícího aminu. Výtěžek 99 mg oranžové, krystalické, pevné látky.

Příklad 21

5- [ (Z} - (5-chlor-2-oxo-l, 2-dihydro-3fl^r-indol-3-yliden) methyl] N-[3-[(2R,6S)-2,6-dimethylmorfolin-4-yl]-2-hydroxypropyl]105

2, 4-dimethyl-líí-pyrrol-3-karboxamid (sloučenina 29)

Tato sloučenina se připravila podle postupu v příkladu 15 z 95 mg odpovídajícího aminu. Výtěžek 101 mg oranžové, krystalické, pevné látky.

Příklad 22

N-[3-[(2R,6S)-2,6-dimethylmorfolin-4-yl]-2-hydroxypropyl]2, 4-dimethyl-5- [(2)- [2-oxo-5- (trifluormethoxy) -1,2-dihydro-3JTindol-3-yliden] methyl]-lH-pyrrol-3-karboxamid (sloučenina 30)

Tato sloučenina se připravila podle postupu v příkladu 16 z 95 mg odpovídajícího aminu. Výtěžek 89 mg oranžové, krystalické, pevné látky.

Příklad 23

5- [ (2) - (5—fluor-2-oxo-l, 2-dihydro-3íí-indol-3-yliden) methyl] -N[(2S)-2-hydroxy-3-(3-methyl-2,5-dioxoimidazolidin-lyl)propyl]-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxamid (sloučenina 34)

Tato sloučenina se připravila podle postupu v příkladu 14 z 95 mg odpovídajícího aminu. Výtěžek 109 mg oranžové, krystalické, pevné látky.

Příklad 24

5- [ (2) - (5-chlor-2-oxo-l, 2-dihydro-3JT-indol-3-yliden)methyl] -N[(2S)-2-hydroxy-3-(3-methyl-2,5-dioxoimidazolidin-lyl) propyl]-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxamid (sloučenina 36)

Tato sloučenina se připravila podle postupu v příkladu 15 z 95 mg odpovídajícího aminu. Výtěžek 107 mg oranžové, krystalické, pevné látky.

106

Příklad 25

N-[(2S)-2-hydroxy-3-(3-methyl-2,5-dioxoimidazolidin-lyl)propyl]-2,4-dimethyl-5-{ (Z) -[2-oxo-5-(trifluormethoxy)-1,2dihydro-3íf-indol-3-yliden] methyl }-lH-pyrrol-3-karboxamid (sloučenina 35)

Tato sloučenina se připravila podle postupu v příkladu 16 z 95 mg odpovídajícího aminu. Výtěžek 123 mg oranžové, krystalické, pevné látky.

Příklad 26

5-[(Z) -(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)methyl]-W[(2R)-2-hydroxy-3-(3-methyl-2,5-dioxoimidazolidin-lyl)propyl]-2,4-dimethyl-17í-pyrrol-3-karboxamid (sloučenina 31)

Tato sloučenina se připravila podle postupu v příkladu 14 z 95 mg odpovídajícího aminu. Výtěžek 110 mg oranžové, krystalické, pevné látky.

Příklad 27

5- [ (Z) - (5-chlor-2-oxo-l, 2-dihydro-3íí-indol-3-yliden) methyl] -N[(2R)-2-hydroxy-3-(3-methyl-2,5-dioxoimidazolidin-lyl)propyl]-2, 4-dimethyl-lfr-pyrrol-3-karboxamid (sloučenina 32)

Tato sloučenina se připravila podle postupu v příkladu 15 z 95 mg odpovídajícího aminu. Výtěžek 103 mg oranžové, krystalické, pevné látky.

Příklad 28

N-[(2R)-2-hydroxy-3-(3-methyl-2,5-dioxoimidazolidin-lyl)propyl]-2,4-dimethyl-5-{(Z)-[2-oxo-5-(trifluormethoxy) -1,2dihydro-3íř-ihdol-3-yliden]methyl} -líf-pyrrol-3-karboxamid (sloučenina 33)

107

9 9 9 · · 9 ·» 9 • · · « 9 ··· 9 9 9 · 9 «« 9 999· « 9 9 · · · · · * 99«··

9 9 999 99«

9« 9999 9« «99 99 ·

Tato sloučenina se připravila podle postupu v přikladu 16 z 95 mg odpovídajícího aminu. Výtěžek 120 mg oranžové, krystalické, pevné látky.

Příklad 29

Ethylester kyseliny 5-formyl-2-methyl-4-fenyl-lH-pyrrol-3karboxylové

V ledové lázni se za míchání chladil DMF (4 mL, 3 ekv.). Přidal se k němu POCI3 (1,1 ekv. 1,8 mL) . Po 30 minutách se přidal roztok 3,5-dimethyl-4-ethylesteru pyrrolu (4 g, 17,4 mmol) v DMF (2M, 9,mL) a míchání pokračovalo. Po deseti minutách se reakční směs proměnila na pevnou látku. Ta se rozpustila v 5 mL DMF a zahřála se na 90 °C na olejové lázni. Po jedné hodině se reakční směs ochladila na laboratorní teplotu a zředila se vodou (100 mL) a alkalizovala se IN NaOH na pH = 11. Produkt se extrahoval do methylenchloridu (3 x 200 mL) a organické vrstvy se promyly solankou (200 mL), sušily se (MgSO₄) a zahustily za poskytnutí 4,3 g (95 %) ethylesteru kyseliny 5-formyl-2-methyl-4-fenyl-lff-pyrrol-3-karboxylové jako hnědé, pevné látky.

^ΧΗ NMR (360 MHz, DMS0-d₆) δ 12,5 (br s, 1H, NH) , 9,11 (s, 1H, CHO), 7,35 (s, 5H, ArH), 3,98 (q, J = 6,8 a 7,2 Hz, 2H, OCH2CH3) , 2,48 (s, 3H, CH₃), 0,98 (t, J = 7 Hz, 3H, OCH₂CH₃) .

Kyselina 5-formyl-2-methyl-4-fenyl-lH-pyrrol-3-karboxylové

108

Ethylester kyseliny 5-formyl-2-methyl-4-f enyl-lif-pyrrol-3karboxylové se za míchání rozpustil ve vodě (100 mL) a methanolu (45 mL) . Přidal se KOH (2 ekv., 1,9 g) a směs se zahřívala na 100 °C. Po 2,5 hodině se směs ochladila na laboratorní teplotu, zbylý ester se odstranil extrakcí do ethyl-acetátu (200 mL) a směs se sušila a zahustila. Vodná vrstva se okyselila na pH = 3 s použitím 2N HC1. Bílá, pevná látka se odstranila filtrací a propláchla se vodou. Pevná látka se opět zahustila z toluenu, triturovala se hexany a sušila za poskytnutí 2 g (52 %) našedlé pevné látky.

^XH NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 12,46 (br s, 1H, CO₂H) , 11,95 (s,

1H, NH) , 9,08 (s, 1H, CHO), 7,36 (s, 5H, ArH), 2,49 (s, 3H, CH₃) . MS m/z (relativní intenzita %, ion) nalezena 229 (100, M⁺) ; vypočtena 229,2.

(3-diethylamino-2-hydroxy-propyl)-amid kyseliny 5-formyl-2methyl-4-fenyl-líř-pyrrol-3-karboxylové

Směs karboxylové kyseliny 5-formyl-2-methyl-4-f enyl-líf-pyrrol-3(1,0 g, 4,36 mmol), l-amino-3-diethylamino-2propanolu (950 mg, 6,54 mmol), DDC (900 mg, 4,36 mmol) a HOBt (884 mg, 6,54 mmol) v chloroformu (60 mL) se 12 hodin míchala

109

při laboratorní teplotě. Reakční směs se nalila do nasyceného roztoku kyselého uhličitanu sodného (60 mL) a přidal se k ní IN NaOH (8 mL) . Směs se potom extrahovala EtOAc (3 x 100 mL) , promyla vodou a solankou a zahustila za poskytnutí 400 mg (3diethylamino-2-hydroxy-propyl)-amidu kyseliny 5-formyl-2m.ethyl-4-fenyl-líf-pyrrol-3-karboxylové.

Příklad 30

Postup syntézy sloučenin 11 - 21

Připravil se 0,36 M roztok každého oxindolu v DMSO, jakož i 0,576 M roztok každého aldehydu. 300 pL příslušného oxindolu se smísilo s 300 pL příslušného aldehydu v přítomnosti 200 pL DMSO. Potom se přidalo 40 mg diethylentriaminové vychytávací pryskyřice. Směs se umístnila do Robbinsova bloku, který se neprodyšně uzavřel a vložil do sušárny při teplotě 60 °C, kde se protřepával 18 hodin.

Po 18 hodinách se Robbinsův blok vytáhl ze sušárny. Horní uzávěr bloku se odstranil a ke směsi se přidalo 800 pL DMSO. Potom se blok znovu neprodyšně uzavřel a opět se umístnil do sušárny při teplotě 60 °C, kde se nechal nepřetržitě rotovat jednu hodinu.

Po završení jedné hodiny se Robbinsův blok vyndal ze sušárny a nechal se ochladit. Spodní uzávěr Robbinsova bloku se opatrně odstranil a celý blok se umístnil do filtračního zařízení, které umožňuje, aby se nově syntetizované sloučeniny odfiltrovala od pryskyřice.

Příklad 31

3- [líf— (7-azabenztriazolyl) -oxy]-2-hydroxy-l-aminopropan

Při 60 °C se směs 4, 083 g l-hydroxy-7-azabenztriazolu (30 • · « · · · · ··· · ·· • · · · · · · · · · • · · ·· · · · < · ♦··· ··· ··· · · · «· ···· ·· ··· ·· ·

110 mmol) a 0,53 mL diisopropylaminu (3 mmol) a 4,70 mL epichlorhydrinu v bezvodém chloroformu míchala dvě hodiny. Reakční směs se nalila na silikagelovou kolonu a eluovala se směsí chloroform-methanol 100:3. Získaný hydroxy-chlorový meziprodukt (4,83 g, světle žlutý olej, 70 % výtěžek) se rozpustil v methanolickém amoniaku (100 mL, nasycený plynným amoniakem), přidalo se 8,3 g uhličitanu draselného a směs se míchala v uzavřené nádobě dva a půl dne. Reakční směs se filtrovala a filtrát se odpařil. Zbytek se čistil na silikagelové koloně ve směsi chloroform-methanol-koncentrovaný vodný roztok amoniaku 80:15:1,5 s výtěžkem 2,793 g bílé, krystalické, pevné látky (63 % teoretických z chloridu).

3- [ 177- (benztriazolyl) -oxy] -2-hydroxy-l-chlorpropan a 3-[ 177-(benztriazolyl-3-N-oxido) ]-2-hydroxy-l-chlorpropan

Při 55 °C se směs 12,162 g hydroxyazabenztriazolu (90 mmol), 1,59 mL diisopropylaminu (9 mmol) a 14,1 mL epichlorhydrinu (180 mmol) v bezvodém chloroformu míchala dvě hodiny. Reakční směs se odpařila, zbytek se sušil ve vysokém vakuu a potom čistil na silikagelové koloně s elucí směsí chloroform-methanol 100:5. První frakce poskytly 3—[177— (benztriazolyl)-oxy]-2-hydroxy-l-chlorpropan, 10,570 g (světle žlutý med; 51,5 % výtěžek) a následující frakce 3-[177(benztriazolyl-3-N-oxido)]-2-hydroxy-l-chlorpropan, 9,990 g (bílá, krystalická, pevná látka, 48,5 % výtěžek).

3- [ 177- (benztriazolyl-3-N-oxido) ]-2-hydroxy-l-aminopropan

Sloučenina se připravila aminolýzou 3-[177-(benztriazolyl3-N-oxido)]-2-hydroxy-l-chlorpropanu anlogicky k syntéze 3[177- (7-azabenztriazolyl) -oxy] -2-hydroxy-l-aminopropanu.

111 • 9 9 9 · 9 9 9 · ·· • 9 9 9 9 9 >··· • 9 9 · 9 9 · ·9 99999

999 ··· 9 · 9

9999 99 999 ·· ·

Příklad 32

5- [ (Z) - (5-fluor-2-oxo-l, 2-dihydro-3íí-indol-3-yliden) methyl] N- [2-hydroxy-3-(3H- [1,2,3]triazolo[4,5-b]pyridin-3yloxy) propyl] -2, 4-dimethyl-líí-pyrrol-3-karboxamid (obecný postup)

Ke kaši 105 mg (0,25 mmol) l-oxy-7-azabenztriazol-esteru kyseliny 5- [ (Z) - (5-fluor-2-oxo-l, 2-dihydro-3íř-indol-3yliden) methyl] -2, 4-dimethyl-líf-pyrrol-3-karboxylové [připraveného pomocí aktivace (3Z)-3-([3,3-dimethyl-4-karboxy-lHpyrrol-2-yl]methylen) -5-fluor-l, 3-dihydro-2íf-indol-2-onu (480 mg, 1,6 mmol) s činidlem HATU (570 mg,_: 1,5 mmol) v přítomnosti Hunigovy báze (3,0 mmol, 0,525 mL) v DMF (5 mL) a izolovaného v čisté formě srážením s chloroformem (5 mL) a sušeného ve vysokém vakuu s 92 % výtěžkem (579 mg) ] v bezvodém dimethylacetamidu (1,5 mL) se přidalo 105 mg 3-[líř-(7-azabenztriazolyl)-oxy]-2-hydroxy-l-aminopropanu. Směs se míchala 30 minut a odpařila ve vysokém vakuu. Zbytek se suspendoval ve směsi methanol-diethylamin 20:1 (3 mL), nechal se jednu hodinu krystalizovat v ledničce (5 °C), filtroval se, sraženina se promyla ledově chladným methanolem a sušila ve vysokém vakuu. Vytěžilo se 121 mg oranžové, krystalické, pevné látky.

Příklad 33

5- [ (Z) - (5-chlor-2-oxo-l, 2-dihydro-3H-indol-3-yliden) methyl] N-[2-hydroxy-3-(3H- [1,2,3]triazolo[4,5-b]pyridin-3yloxy)propyl]-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxamid (obecný postup)

Ke kaši 109 mg (0,25 mmol) l-oxy-7-azabenztriazol-esteru kyseliny 5-[ (Z) - (5-chlor-2-oxo-l, 2-dihydro-3H-indol-3yliden) methyl] -2, 4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové [připraveného pomocí aktivace (3Z)-3-( [3,3-dimethyl-4-karboxy-lífpyrrol-Z-yl]methylen) -^5-chlor-l, 3-dihydro-2H-indol-2-onu

112

(1,520 g, 4,8 mmol) s činidlem HATU (1, 768 g, 4,65 mmol) v přítomnosti Hunigovy báze (9,0 mmol, 1,58 mL) v DMF (20 mL) a izolovaného v čisté formě srážením s chloroformem (20 mL) a sušeného ve vysokém vakuu s 94 % výtěžkem (1,907 g) ] v bezvodém dimethylacetamidu (1,5 mL) se přidalo 105 mg 3-[lH(7-azabenztriazolyl)-oxy]-2-hydroxy-l-aminopropanu. Směs se míchala 30 minut a odpařila ve vysokém vakuu. Zbytek se suspendoval ve směsi methanol-diethylamin 20:1 (3 mL), nechal se jednu hodinu krystalizovat v ledničce (5 °C), filtroval se, sraženina se promyla ledově chladným methanolem a sušila ve vysokém vakuu. Vytěžilo se 130 mg oranžové, krystalické, pevné látky.

Příklad 34

5-[(Z)-(5-trifluormethoxy-2-oxo-l,2-dihydro-3H-indol-3yliden)methyl)]-N- [2-hydroxy-3-(3H-[1,2,3] triazolo[4,5b]pyridin-3-yloxy)propyl] -2, 4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxamid (obecný postup)

Ke kaši 121,5 mg (0,25 mmol) l-oxy-7-azabenztriazol-esteru kyseliny 5-[ (Z) - (5-trifluormethoxy-2-oxo-l, 2-dihydro-377-indol3-yliden) methyl] -2, 4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové [připraveného pomocí aktivace (3Z)-3-([3, 3-dimethyl-4-karboxy-lífpyrrol-2-yl]methylen)-5-trifluormethoxy-l, 3-dihydro-2H-indol2-onu (1,768 g, 4,8 mmol) s činidlem HATU (1,768 g, 4,65 mmol) v přítomnosti Hunigovy báze (9,0 mmol/ 1,58 mL) v DMF (25 mL) a izolovaného v čisté formě odpařením a srážením s bezvodým acetonitrilem a sušeného ve vysokém vakuu s 85,5 % výtěžkem (1, 929 g) ] v bezvodém dimethylacetamidu (1,5 mL) se přidalo 105 mg 3-[1H-(7-azabenztriazolyl)-oxy]-2-hydroxy-l-aminopropanu. Směs se míchala 30’ minut a odpařila ve vysokém vakuu. Zbytek se suspendoval ve směsi methanol-diethylamin 20:1 (3 mL) , nechal se jednu hodinu krystalizovat v ledničce (5 °C) , filtroval se, sraženina se promyla ledově chladným methanolem

113 a sušila ve vysokém vakuu, krystalické, pevné látky.

Vytěžilo se

142 mg oranžové,

Příklad 35

5-[(Z)- (5-fluor-2-oxo-l, 2-dihydro-3íř-indol-3-yliden) methyl] -N[2-hydroxy-3-(3-oxido-lH-l,2,3-benzotriazo-l-yl)propyl]-2,4dimethyl-líf-pyrrol-3-karboxamid

Tato sloučenina se připravila podle postupu v příkladu 32 ze 105 mg odpovídajícího aminu. Výtěžek 120 mg oranžové, krystalické, pevné látky.

Příklad 36

5- [ (Z) - (5-chlor-2-oxo-l, 2-dihydro-3íf-indol-3-yliden) methyl] -N[2-hydroxy-3- (3-oxido-líf-l, 2, 3-benzotriazo-l-yl) propyl] -2, 4dimethyl-líf-pyrrol-3-karboxamid

Tato sloučenina se připravila podle postupu v příkladu 33 ze 105 mg odpovídajícího aminu. Výtěžek 127 mg oranžové, krystalické, pevné látky.

Příklad 37

N- [2-hydroxy-3- (3-oxido-líf-l, 2,3-benzotriazo-l-yl) propyl] -2, 4dimethyl-5-[(2)-[2-oxo-5-(trifluormethoxy)-1,2-dihydro-3ííindol-3-yliden]methyl]-líf-pyrrol-3-karboxamid

Tato sloučenina se připravila podle postupu v příkladu 34 ze 105 mg odpovídajícího aminu. Výtěžek 141 mg oranžové, krystalické, pevné látky.

114

Biologické příklady

Následující zkoušky se využily k tomu, aby se nalezly ty sloučeniny, které vykazují optimální stupeň požadované aktivity.

A. Postupy zkoušek

Následující zkoušky lze použít pro stanovení hladiny aktivity a účinku rozličných sloučenin předloženého vynálezu na jeden nebo více enzymů PK. Podobné zkoušky lze navrhnout podél stejných linií pro jakoukoli PK s použitím technik dobře známých v technice.

Několik zde popisovaných zkoušek se provádělo zkouškou ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Sandwich Assay) (Voliér a spol.: „Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, 1980, Manual of Clinical Immunology, 2. vydání, Rose and Friedman, Tím. Soc. of Microbiology, Washington, D.C., str. >359-371). Obecný postup je následující: sloučenina se zavede do buněk exprimujících testovanou kinázu, buď přirozeně nebo rekombinantně, na vybraný časový úsek, po kterém se, pokud je testovanou kinázou receptor, přidá ligand, o kterém je známo, že aktivuje receptor. Provede se lýze buněk a lyzát se převede do jamek destičky ELISA předem smočených specifickou protilátkou rozpoznávající substrát enzymatické fosforylační reakce. Nesubstrátové složky buněčného lyzátu se vymyjí a množství fosforylace na substrátu se deteguje protilátkou specificky rozpoznávající fosfotyrosin ve srovnání s kontrolními buňkami, které nebyly v kontaktu s testovanou sloučeninou.

Níže se uvádějí v současnosti výhodné protokoly pro provedení experimentů ELISA pro specifické PK. Přizpůsobení těchto protokolů pro stanovení aktivity sloučenin vůči jiným

115 ·· *·

• f ····

RTK, jakož i vůči CTK a STK, však velmi dobře zapadá do rámce znalostí odborníků v technice. Jiné zde popisované zkoušky měří množství DNA vytvořené jako odezva na aktivaci testované kinázy, které je obecnou mírou proliferativní odezvy. Obecný postup této zkoušky je následující: sloučenina se dopraví do buněk exprimujících testovanou kinázu, buď přirozeně nebo rekombinantně, na vybraný časový úsek, po kterém se, pokud je testovanou kinázou receptor, přidá ligand, o kterém je známo, že aktivuje receptor. Po inkubaci, která trvá přinejmenším přes noc, se přidá reagent značkující DNA, například 5bromdeoxyuridin (BrdU) nebo H³-thymidin. Množství značené DNA se deteguje buď pomocí protilátky proti BrdU nebo měřením radioaktivity a porovnává se s kontrolními buňkami, které nebyly v kontaktu se sloučeninou.

GST-FLK-1 bioanalýza

Tato zkouška analyzuje aktivitu tyrosinkinázy GST-FLK-1 na póly(glu,tyr)-peptidech.

Materiály a reagencie:

1. Corning destičky ELISA s 96 jamkami (Corning, katalogové č. 5805-96).

2. Lyofilizát poly(glu, tyr) 4:1 (Sigma, katal. č. P0275).

3. Příprava zkušebních destiček smočených póly(glu, tyr) : smočí se 2 pg/důlek póly (glu, tyr) (pEY) ve 100 pL PBS, 2 hodiny se ponechá při laboratorní teplotě nebo při 4 °C přes noc. Destičky se přikryjí, aby se zabránilo odpařování.

4. PBS pufr: pro přípravu 1 L se smíchá 0,2 g KH₂PO₄, 1,15 g Na₂HPO4, 0,2 g KCl a 8 g NaCl v asi 900 mL destilované vody. Když se všechny reagencie rozpustí, nastaví se pH na hodnotu 7,2 pomocí HC1. Roztok se doplní na 1 L destilovanou vodou.

·· ·· ·· · ·· · • · · · · · ·· * · · • · · · · · · < · · • · ♦ · · · · * < · ···· *»»* ·>·« *··* ··· ·· ♦

116

5. PBST pufr: do 1 L PBS pufru se přidá 1 mL TWEEN-20.

6. TBB - blokovací pufr: pro přípravu 1 L se smíchá 1,21 g TRIS, 8,77 g NaCl, 1 mL TWEEN-20 v asi 900 mL destilované vody. Pomocí HC1 se nastaví pH na hodnotu 7,2. Přidá se 10 g BSA a míchá se až se rozpustí. Celkový objem se upraví na 1 L pomocí destilované vody. Filtruje se pro odstranění pevných částic.

7. 1 % BSA v PBS: pro přípravu roztoku na jedno použití se přidá 10 g BSA do asi 990 mL PBS pufru, míchá se do rozpuštění. Celkový objem se nastaví na 1 L pomocí PBS pufru, filtruje se pro odstranění pevných částic.

8. 50 mM Hepes, pH 7,5.

9. GST-Flklcd vyčištěný ze sf9 transformace rekombinantního bakuloviru (SUGEN, lne.).

10. 4 %'DMSO v destilované vodě.

11. 10 mM ATP v destilované vodě.

12. 40 mM MnCl₂.

13. Pufr na ředění kinázy (KDB) : smíchá se 10 mL Hepes (pH 7,5), 1 mL 5 M NaCl, 40 pL 100 mM vanadičnanu sodného a 0,4 mL 5 % BSA v destilované vodě s 88,56 mL destilované vody.

14. NUNC polypropylenové destičky s 96 jamkami s dnem ve tvaru V, Applied Scientific, katalogové č. AS-72092.

15. EDTA: smíchá se 14,12 g ethylendiamintetraoctové kyseliny (EDTA) s asi 70 mL destilované vody. Přidává se 10 N NaOH dokud se EDTA nerozpustí. Hodnota pH se nastaví na 8,0. Celkový objem se upraví na 100 mL destilovanou vodou.

16. 1° ředící pufr pro protilátku: smíchá se 10 mL 5 % BSA v PBS pufru s 89,5 mL TBST.

17. Anti-fosfot.yrosinová monoklonální protilátka navázaná na křenovou peroxidázu (PY99 HRP, Santa Cruz Biotech).

18. Kyselina 2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonová (ABTS, Moss, kat. č. ABST).

• · ···· • * · · ···· · * • · ···· ·· • · ···· ···· ··· ··· ·· ·» ···· ·· ··· ··

117

19. 10 % SDS.

Postup:

1. Corning destičky ELISA s 96 jamkami se smočí 2 pg polyEY peptidu v sterilním PBS, jak se popisuje v kroku 3 odstavce „Materiály a reagencie.

2. Nenavázaná kapalina se z jamek odstraní otočením destičky. Jamky se jednou promyjí TBST. Poklepáním destičky na buničinu se odstraní přebytek kapaliny.

3. Do každé jamky se přidá 100 pL 1 % BSA v PBS. Inkubuje se jednu hodinu za třepání při laboratorní teplotě.

4. Zopakuje se krok 2.

5. Jamky se smočí 50 mM HEPES (pH 7,5) (150 pL/jamku).

6. Testovaná sloučenina se zředí destilovanou vodou/4 % DMSO na čtyřnásobek požadované konečné koncentrace zkoušky v 96 jamkové polypropylenové destičce.

7. Přidá se 25 pL zředěné testované sloučeniny na ELISA destičku. Do kontrolních jamek se pipetuje 25 pL destilované vody/4 % DMSO.

8. Do každého jamky se přidá 25 pL 40 mM MnCl₂ se 4 x ATP (2 pM) .

9. Do jamek s negativní kontrolou se přidá 25 pL 0,5 M EDTA.

10. Pomocí KDB se zředí GST-FLK1 na koncentraci 0,005 pg (5 ng)/jamku.

11. Do každé jamky se přidá 50 pL zředěného enzymu.

12. Destička se při laboratorní teplotě 15 minut inkubuje za protřepávání.

13. Reakce se zastaví přídavkem 50 pL 250 mM EDTA (pH 8,0).

14. Destička se třikrát promyje TBST a jejím poklepáním na buničinu se odstraní přebytečná kapalina.

15. Do každé jamky se přidá 100 pL anti-fosfotyrosin HRP konjugátu, zředění 1:5000 v ředícím pufru pro protilátku. Inkubuje se 90 minut při laboratorní teplotě

118 • · • · ·

za protřepávání.

16. Stejné promytí jako v kroku 14.

17. Do každé jamky se přidá 100 pL roztoku ABTS.

18. Za protřepávání se inkubuje od 10 do 15 minut. Jakékoli bublinky se odstraní.

19. Reakce se zastaví přídavkem 20 pL 10 % SDS do každé jamky.

20. Odečtou se výsledky na spektrofotometru Dynatech MR7000 ELISA s filtrem pro test při 410 nm a referenčním filtrem při 630 nm.

Pyk2 bioanalýza

Tato zkouška se používá k měření kinázové aktivity pyk2 (FL.pyk2-HA) s úplnou délkou značený HA epitopem in vitro v analýze ELISA.

Materiály a reagencie:

1. Corning destičky ELISA s 96 jamkami.

2. 12CA5 monoklonální protilátka anti-HA, (SUGEN lne.).

3. PBS fosfátem pufrovaný fyziologický roztok Dulbecco (Gibco, kat. č. 450-1300EB).

4. TBST pufr: pro přípravu 1 L se smíchá 8,766 g NaCl,

	6, 057 g TRIS a 1 mL 0,1 %	Triton	X-100 v asi	900 mL
	destilované vody. Hodnota pH	se nastaví na 7,2	a obj em
	se upraví na 1 L.
5.	Blokovací pufr: pro přípravu	1 L se	smíchá 100	g 10 %
	BSA, 12,1 g 100 mM TRIS, 58,	44 g 1	M NaCl a 10	mL 1 %
	TWEEN-20.
6.	FL.pyk2-HA z buněčných lyzátů	sf9 (SUGEN, lne.).
7.	4 % DMSO v MilliQue H₂0.
8.	10 mM ATP v destilované vodě.
9.	1 M MnCl₂.
10.	1 M MgCl₂.

· • 4 4 · · ··· 4 4 4 ·· 4 4 4 · 4 4 » 4

4 4 44 · 4 44 4444

444 444 444

4444 44 444 44 4

119

11. 1 M dithiothreitol (DTT).

12. 10X kinázový pufr fosforylace: smíchá se 5 mL 1 M Hepes (pH 7,5), 0,2 mL 1 M MnCl₂, 1 mL 1 M MgCl₂, 1,0 mL 10 % Triton X-100 v 2,8 mL destilované vody. Těsně před použitím se přidá 0,1 mL DTT.

13. NUNC polypropylenové destičky s 96 jamkami s dnem ve tvaru V.

14. 500 mM EDTA v destilované vodě.

15. Ředící pufr pro protilátku: pro přípravu 100 mL se smíchá 1 mL 5 % BSA/PBS a 1 mL 10 % Tween-20 v 88 mL TBS.

16. HRP-konjugovaný anti-Ptyr (PY99), Santa Cruz Biotech, kat. č. SC-7020.

17. ABTS, Moss, kat. č. ABST-2000.

18. 10 % SDS.

Postup:

1. Corning destičky ELISA s 96 jamkami se smočí 0,5 pg na jamku 12CA5 anti-HA protilátkou ve 100 pL PBS. Destičky se skladují při 4 °C přes noc.

2. Nenavázaná protilátka HA se z jamek odstraní otočením destičky. Destička se promyje destilovanou vodou.

Poklepáním destičky na buničinu se odstraní přebytek kapaliny.

3. Do každé jamky se přidá 150 pL blokovacího pufru. Inkubuje se třicet minut za třepání při laboratorní teplotě.

4. Čtyřikrát se destička promyje TBS-T.

5. Lyzát se zředí v PBS (1,5 pg lyzátu/100 pL PBS).

6. Do každé jamky se přidá 100 pL zředěného lyzátu. Protřepává se jednu hodinu při laboratorní teplotě.

7. Stejné promývání jako v kroku 4.

8. Na ELISA destičku obsahující zachycený pyk2-HA se přidá 50 pL 2X kinázového pufru.

120

9. Do každé jamky se přidá 25 pL 400 mM testované sloučeniny v 4 % DMSO. Do kontrolních jamek se pipetuje samotný 4 % DMSO.

10. Do jamek negativní kontroly se přidá 25 pL 0,5 M EDTA.

11. Do všech jamek se přidá 25 pL 20 pM ATP. Inkubuje se za protřepávání 10 minut.

12. Reakce se zastaví přídavkem 25 pL 500 mM EDTA (pH 8,0) do každé jamky.

13. Stejné promývání jako v kroku 4.

14. Do každé jamky se přidá 100 pL anti-Ptyr HRP konjugátu zředěného 1:6000 v ředícím pufru pro protilátku. Inkubuje se jednu hodinu při laboratorní teplotě za protřepávání.

15. Destička se třikrát promyje TBST a jedenkrát PBS.

16. Do každé jamky se přidá 100 pL roztoku ABST.

17. Pokud je potřebné, zastaví se vyvíjecí reakce přídavkem 20 pL 10 % SDS do každé jamky.

18. Odečtou se výsledky na destičce na spektrofotometru ELISA s filtrem pro test při 410 nm a referenčním filtrem při 630 nm.

PGFRl bioanalýza

Tato zkouška se používá k měření kinázové aktivity FGF1-R in vitro v analýze ELISA.

Materiály a reagencie:

1. Costar destičky ELISA s 96 jamkami (Corning, katalogové č. 3369).

2. Póly(Glu-Tyr) (Sigma, kat. č. PO275).

3. PBS (Gibco, kat. č. 450-1300EB).

4. 50 mM pufrovací roztok Hepes.

5. Blokovací pufr: (5 % BSA/PBS).

6. Čištěný GST-PGFR1 (SUGEN, lne.).

121

7. Ředící pufr pro kinázu: smíchá se 500 pL Hepes (GIBCO) , 20 pL 5 % BSA/PBS, 10 pL 100 mM vanadičnanu sodného a 50 pL 5 M NaCl.

8. 10 mM ATP.

9. ATP/MnCl₂ fosforylační směs: smíchá se 20 pL ATP, 400 pL 1 M MnCl₂ a 9,56 mL destilovaná vody.

10. NUNC polypropylenové destičky s 96 jamkami s dnem ve tvaru V, (Applied Scientific, katalogové č. AS-72092).

11. 0,5 M EDTA.

12. 0,05 % TBST: přidá se 500 pL TWEENu do jednoho litru TBS.

13. Králičí polyklonální anti-fosfotyrosinové sérum (SUGEN, lne.) .

14. Kozí anti-králičí IgG poroxidázový konjugát (Biosource, katal. č. ALI0404).

15. Roztok ABTS.

16. Roztok ABTS/H₂O₂.

Postup:

1. Costar destičky ELISA s 96 jamkami se smočí 1 pg na jamku Póly(Glu, Tyr) ve 100 pL PBS. Destičky se skladují při 4 °C přes noc.

2. Jednou se destičky promyjí PBS.

3. Do každé jamky se přidá 150 pL blokovacího pufru 5 % BSA/PBS. Inkubuje se jednu hodinu za třepání při laboratorní teplotě.

4. Destičky se dvakrát promyjí PBS, potom jednou 50 mM Hepes. Poklepáním destičky na buničinu se odstraní přebytek kapaliny a bublinky.

5. Na destičku se přidá 25 pL 0,4mM testované sloučeniny v 4 % DMSO nebo samotný DMSO (kontrolní jamky).

6. Čištěný GST-FGFR1 se zředí v ředícím pufru pro kinázu (5 ng kinázy/50 pL KDB/jamka).

7. Do každé jamky se přidá 50 pL zředěné kinázy.

122

8.

9.

Zahájí se reakce kinázy přídavkem 25 pL/jamku čerstvě připraveného ATP/Mn⁺⁺ (0,4 mL 1 M MnCl₂, 40 pL 10 mM ATP, 9,56 mL destilované vody, čerstvě připravený).

Jedná se o. rychlou reakci kinázy a musí se zastavit 25 pL 0,5 M EDTA způsobem podobným k přidání ATP.

Destička se čtyřikrát promyje čerstvým TBST.

Připraví se ředící pufr pro protilátku: pro přípravu 50 mL se smíchá 5 mL 5 % BSA, 250 pL 5 % mléka a 50 pL 100 mM vanadičnanu sodného a doplní se na celkový objem pomocí 0,5 % TBST.

Pipetuje se 100 pL anti-fosfotyrosinu (zředěného 1:10.000 v ABD) na jamku. Inkubuje se za třepání jednu hodinu při laboratorní teplotě.

Stejné promývání jako v kroku 10.

Přidá se 100 pL kozího anti-králičího IgG poroxidázového konjugátu od firmy Biosource (zředěného 1:6000 v ADB) na jamku. Inkubuje se jednu hodinu^při laboratorní teplotě za protřepávání.

Destička se promyje jako v kroku 10 a potom s PBS, aby se odstranily bublinky a přebytek TWEENu.

Do každé jamky se přidá 100 pL roztoku ABST/H₂O₂.

Inkubuje se za protřepávání 10 až 20 minut. Jakékoli bublinky se odstraní.

Odečtou se výsledky na spektrofotometru ELISA Dynatech MR7000; filtr pro test při 410 nm, referenční filtr při 630 nm.

EGFR bioanalýza

Materiály a reagencie:

1. Corning destičky ELISA s 96 jamkami.

123

2. SUM01 monoklonální anti-EGFR protilátka (SUGEN, lne.).

3. PBS.

4. TBST pufr.

5. Blokovací pufr: pro přípravu 100 mL se smíchá 5,0 g Carnation Instant Non-fat Milk® se 100 mL PBS.

6. A431 buněčný lyzát (SUGEN, lne.).

7. TBS pufr.

8. TBS + 10 % DMSO: pro přípravu 1 litru se smíchá 1,514 g TRIS, 2,192 g NaCl a 25 mL DMSO a doplní se na celkový objem 1 L destilovanou vodou.

9. ATP (Adenosin-5'-trifosfát, z koňského svalu, Sigma, kat. č. A-5394), 1, 0 mM roztok v destilované vodě. Tato reagencie by se měla připravit bezprostředně před použitím a udržovat se na ledu.

10. 1,0 mM MnCl₂.

11. ATP/MnCl₂ fosforylační směs: pro přípravu 10 mL se smíchá 300 pL 1 mM ATP, 500 pL MnCl₂ a 9,2 mL destilované vody. Připraví se těsně před použitím a udržuje se na ledu.

12. NUNC polypropylenové destičky s 96 jamkami s dnem ve tvaru V.

13. EDTA.

14. Králičí polyklonální anti-fosfotyrosinové sérum (SUGEN, lne.).

15. Kozí anti-králičí IgG peroxidázový konjugát (Biosource, katal. č. ALI0404).

. ABTS.

17. 30 % peroxid vodíku.

18. ABTS/H₂O₂.'

19. 0,2 M HC1.

Postup:

1. Corning destičky ELISA s 96 jamkami se smočí 0,5 pg SUMO1 v 100 pL PBS na jamku a skladují se při 4 °C přes

124

2. Z jamek se odstraní nenavázaný SUMO1 prostřednictvím otočení destičky, aby se odstranila kapalina. Destička se jedenkrát promyje destilovanou vodou. Poklepáním destičky na buničinu se odstraní přebytek kapaliny.

3. Do každé jamky se přidá 150 pL blokovacího pufru. Inkubuje se 30 minut za protřepávání při laboratorní teplotě.

4. Destičky se třikrát promyjí deionizovanou vodou, potom jednou TBST. Poklepáním destičky na buničinu se odstraní přebytek kapaliny a bublinky.

5. Lyzát se zředí v PBS (7 pg lyzátu/100 pL PBS).

6. Do každé jamky se přidá 100 pL zředěného lyzátu. Protřepává se při laboratorní teplotě jednu hodinu.

7. Promytí destiček, jak se popisuje ve výše uvedeném kroku

4.

8. Přidá se 120 pL TBS na ELISA destičku obsahující zachycený EGFR.

9. Testovaná sloučenina se zředí v TBS v poměru 1:10.

10. Přidá se po 13,5 pL zředěné testované sloučeniny na ELISA destičku. Do kontrolních jamek se přidá 13,5 pL TBS v 10 % DMSO.

11. Inkubuje se 30 minut za protřepávání při laboratorní teplotě.

12. Přidá se 15 pL fosforylační směsi do všech jamek s výjimkou jamky negativní kontroly. Konečný objem v jamce by měl být 150 pL s konečnou koncentrací 3 pM ATP/5 mM MnCl₂ v každé jamce. Inkubuje se 5 minut za protřepávání.

13. Reakce se zastaví přidáním 16,5 pL roztoku EDTA za protřepávání. Protřepává se další minutu.

14. Čtyřikrát se promyje deionizovanou vodou a dvakrát TBST.

15. Pipetuje se 100 pL anti-fosfotyrosinu (zředěného 1:3000 v TBST) na jamku. Inkubuje se 30-45 minut za třepání při laboratorní teplotě.

125

16. Promývání jako ve výše uvedeném kroku 4.

17. Do každé jamky se přidá 100 pL kozího anti-králičího IgG poroxidázového konjugátu od firmy Biosource (zředěného 1:2000 v TBST). Inkubuje se 30 minut při laboratorní teplotě za protřepávání.

18. Promývání jako ve výše uvedeném kroku 4.

19. Do každé jamky se přidá 100 pL roztoku ABST/H₂O₂.

20. Inkubuje se 5 až 10 minut za protřepávání. Odstraní se jakékoli bublinky.

21. Je-li nutné, zastaví se reakce přídavkem 100 pL 0,2 M HCl na jamku.

22. Odečtou se výsledky na spektrofotometru ELISA Dynatech MR7000; filtr pro test při 410 nm, referenční filtr při 630 nm.

PDGFR bioanalýza

Materiály a reagencie:

1. Corning destičky ELISA s 96 jamkami.

2. 28D4C10 monoklonální anti-PDGFR protilátka (SUGEN, lne.).

3. PBS.

4. TBST pufr.

5. Blokovací pufr (stejný jako při EGFR bioanalýze) .

6. PDGFR-β exprimující NIH 3T3 buněčný lyzát (SUGEN, lne.).

7. TBS pufr.

8. TBS + 10 % DMSO.

9. ATP.

10. MnCl₂.

11. Kinázová pufrovací fosforylační směs: pro přípravu 10 mL se smíchá 250 pL 1 M TRIS, 200 pL 5 M NaCl, 100 pL 1 M

126 • · · · · · · · · · · · · • · · · · · · · · ·· ···· ·· ··· ·· ·

MnCl₂ a 50 pL 100 mM Triton X-100 s dostatečným množství destilované vody, aby byl celkový objem 10 mL.

12. NUNC polypropylenové destičky s 96 jamkami s dnem ve tvaru V.

13. EDTA.

14. Králičí polyklonální anti-fosfotyrosinové sérum (SUGEN, lne.).

15. Kozí anti-králičí IgG poroxidázový konjugát (Biosource, katal. č. ALI0404).

16. ABTS.

17. 30 % roztok peroxidu vodíku.

18. ABTS/H₂O₂.

19. 0,2 M HC1.

Postup:

1. Corning destičky ELISA s 96 jamkami se smočí 0,5 pg 28D4C10 v 100 pL PBS na jamku a skladují se přes noc při 4 °C.

2. Odstraní se nenavázaný 28D4C10 z jamek prostřednictvím otočení destičky, aby se odstranila kapalina. Destička se jedenkrát promyje destilovanou vodou. Poklepáním destičky na buničinu se odstraní přebytek kapaliny.

3. Do každé jamky se přidá 150 pL blokovacího pufru. Inkubuje se 30 minut při laboratorní teplotě za protřepávání.

5. Lyzát se zředí v HNTG (10 pg lyzátu/100 pL HNTG).

7. Promytí destiček, jak se popisuje ve výše uvedeném kroku 4.

8. Přidá se 80 pL pracovní kinázové pufrovací směsi na

127 • · · · · · · · · • · · · · · » · 9 9999

9 9 9 9 9 9 9

9999 99 999 99 9

ELISA destičku obsahující zachycený PDGFR.

9. Testovaná sloučenina se zředí v TBS v poměru 1:10 na 96 jamkových polypropylenových destičkách.

10. Na destičku ELISA se přidá po 10 pL zředěné testované sloučeniny. Do kontrolních jamek se přidá 10 pL TBS + 10 % DMSO. Inkubuje se 30 minut při laboratorní teplotě za protřepávání.

11. Přidá se 10 pL ATP přímo do všech jamek s výjimkou jamek negativní kontroly (konečný objem v jamce by měl být asi 100 pL s konečnou koncentrací 20 pM ATP v každé jamce) . Inkubuje se 30 minut za protřepávání.

12. Reakce se zastaví přidáním 10 pL roztoku EDTA do každé j amky.

13. Čtyřikrát se promyje deionizovanou vodou a dvakrát TBST.

14. Pipetuje se 100 pL anti-fosfotyrosinu (zředěného 1:3000 v TBST) na jamku. Inkubuje se 30-45 minut při laboratorní teplotě za třepání.

15. Promývání jako v kroku 4.

16. Do každé jamky se přidá 100 pL kozího anti-králičího IgG poroxidázového konjugátu od firmy Biosource (zředěného 1:2000 v TBST). Inkubuje se 30 minut při laboratorní teplotě za protřepávání.

17. Promývání jako v kroku 4.

18. Do každé jamky se přidá 100 pL roztoku ABST/H2O2.

19. Inkubuje se 10 až 30 minut za protřepávání. Odstraní se jakékoli bublinky.

20. Je-li nutné, zastaví se reakce přídavkem 100 pL 0,2 M HC1 do každé jamky.

21. Odečtou se výsledky na spektrofotometru ELISA Dynatech MR7000; filtr pro test při 410 nm, referenční filtr při 630 nm.

128

Zkouška celulární kinázy HER-2

Tato zkouška se používá k měření kinázové aktivity HER-2 v celých buňkách ve formátu ELISA.

Materiály a reagencie:

1. DMEM (GIBCO, kat. č. 11965-092).

2. Fetální hovězí sérum (FBS, GIBCO, kat. č. 16000-044), inaktivované teplem na vodní lázni po dobu 30 minut při teplotě 56 °C.

3. Trypsin (GIBCO, kat. č. 25200-056).

4. L-glutamin (GIBCO, kat. č. 25030-081).

5. HEPES (GIBCO, kat. č. 15630-080).

6. Růstové médium: smíchá se 500 mL DMEM, 55 mL tepelně inaktivovaného FBS, 10 mL HEPES a 5,5 mL L-glutaminu.

7. Hladové médiu: smíchá se 500 mL DMEM, 2,5 mL tepelně inaktivovaného FBS, 10 mL HEPES a 5,5 mL L-glutaminu.

8. PBS.

9. 96-jamkové mikrotitrační destičky tkáňové kultury s plochým dnem (Corning, katal. č. 25860).

10. Misky na tkáňovou kulturu s průměrem 15 cm (Corning, katal. č. Ó8757148).

11. Corning destičky ELISA s 96 jamkami.

12. NUNC polypropylenové destičky s 96 jamkami s dnem ve tvaru V.

13. Přenášecí náboje Costar pro Transtar 96 (Costar, katal. č. 7610)

14. SUMO 1: monoklonální anti-EGFR protilátka (SUGEN, lne.).

15. TBST pufr.

16. Blokovací pufr: 5 % Carnation Instant Milk® v PBS.

17. EGF ligand: EGF-201, Shinko American, Japonsko. Prášek se suspenduje ve 100 pL 10 mM HČ1. Přidá se 100 pL 10 mM NaOH. Přidá se 8 00 pL PBS, přenese se do Eppendorfovy zkumavky a skladuje se při -20 °C dokud není připraven

129 • · · ··· · · · · • · · · · · · · · ····· ··· · · · ··· ·· ···· ·· ··· ·· · k použití.

18. HNTG pufr pro lýzu. Pro zásobní roztok 5X HNTG se smíchá 23, 83 g HEPES, 43, 83 g NaCl, 500 mL glycerolu a 100 mL Triton X-100 a dostatečné množství destilované vody, aby byl celkový objem 1 L.

Pro IX HNTG* se smíchají 2 mL HNTG, 100 pL 0,1 M Na₃VO₄, 250 pL 0,2 M Na₄P₂O₇ a 100 pL EDTA.

19. EDTA.

20. Na₃VO₄. Pro přípravu zásobního roztoku se smíchá 1,84 g Na₃VO₄ s 90 mL destilované vody. Nastaví se pH na hodnotu 10. Vaří se v mikrovlnné peci jednu minutu (roztok se vyčeří). Ochladí se na laboratorní teplotu. Nastaví se pH na hodnotu 10. Opakuje se cyklus ohřívání/chlazení tak dlouho, až hodnota pH zůstane na deseti.

21. 200 mM Na₄P₂O₇.

22. Králičí polyklonální antisérum specifické pro fosfotyrosin (protilátka anti-Ptyr, SUGEN, lne.).

23. Afinitně čištěné antisérum, kozí anti-králičí IgG poroxidázový konjugát (Biosource, katal. č. ALI0404) .

24. Roztok ABTS.

25. 30 % roztok peroxidu vodíku.

26. ABTS/H₂O₂.

27. 0,2 M HCl.

Postup:

1. Corning destičky ELISA s 96 jamkami se smočí 1 pg SUMO1 na jamku v PBS, 100 pL konečného objemu/jamku. Skladují se při 4 °C přes noc.

2. V den použití se odstraní smáčecí pufr a destička se třikrát promyje destilovanou vodou a jednou pufrem TBST. Každé promývání v této zkoušce by se mělo provádět tímto způsobem, pokud není uvedeno něco jiného.

3. Do každé jamky se přidá 100 pL blokovacího pufru. Destička se inkubuje 30 minut při laboratorní teplotě za

130 protřepávání.

4. Pro tuto zkoušku se použije buněčná linie EGFr/HER-2 chiméra/3T3-C7.

5. Vyberou se misky, na kterých je 80-90 % shluků. Buňky se shromáždí pomocí trypsinizace a odstředí se při 1000 otáčkách za minutu při laboratorní teplotě v průběhu 5 minut.

6. Buňky se opět resuspendují v hladovém médiu a spočítají se trypanovou modří. Požaduje se životnost nad 90 %.

Buňky se vysadí v hladovém médiu s hustotou 2500 buněk na jamku, 90 pL na jamku v mikrotitrační destičce s 96 jamkami. Vysázené buňky se inkubují přes noc při teplotě 37 °C v atmosféře s obsahem 5 % C0₂.

7. Zkouška se zahájí dva dny po vysazení.

8. Testované sloučeniny se rozpustí v 4 % DMSO. Vzorky se potom dále ředí hladovým DMEM přímo na destičkách. Toto zředění bude typicky 1:10 nebo vyšší. Všechny jamky se potom převedou na destičku s buňkami při dalším ředění v poměru 1:10 (10 pL vzorku a media do 90 pL hladového média. Konečná koncentrace DMSO by měla být 1 % nebo nižší. Lze také použít standardní ředící řadu.

9. Inkubuje se 2 hodiny při teplotě 37 °C v atmosféře s obsahem 5 % C0₂.

10. Připraví se EGF ligand pomocí naředění zásobního EGF (16,5 pM) v teplém DMEM na 150 nM.

11. Připraví se čerstvý HNTG*, aby stačil na přidání 100 pL do každé jamky; umístní se na led.

12. Po dvouhodinové inkubaci s testovanou sloučeninou se k buňkám přidá připravený EGF ligand v množství 50 pL na jamku, aby konečná koncentrace byla 50 nM. Do jamek s pozitivní kontrolou se přidá stejné množství EGF. Do jamek s negativní kontrolou se nepřidá EGF. Inkubuje se 10 minut při 37 °C.

13. Odstraní se testovaná sloučenina, EGF a DMEM. Buňky se • ·

131 • · • · « • »· · jednou promyjí PBS.

14. Převede se HNTG* k buňkám, 100 pL na jamku. Na pět minut se uloží na led. V mezičase se odstraní blokovací pufr z destičky ELISA a destička se promyje.

15. Buňky se seškrábou z destičky pomocí mikropipetoru a buněčný materiál se homogenizuje opakovaným nasáváním a vypouštěním HNTG* pufru pro lýzu. Lyzát se převede do smočené, blokované a promyté ELISA destičky. Nebo se použije přenosný náboj Costar pro převedení lyzátu na destičku.

16. Inkubuje se jednu hodinu při laboratorní teplotě za protřepávání.

17. Lyzát se odstraní a destička se promyje. Čerstvě zředěná protilátka anti-Ptyr (zředěná v poměru 1:3000 v TBST) se převede na ELISA destičku, 100 pL na jamku.

18. Inkubuje se třicet minut při laboratorní teplotě za protřepávání.

19. Ostraní se protilátka anti-Ptyr a destička se promyje. Převede se čerstvě zředěná protilátka BIOSOURCE na destičku ELISA (zředěná v poměru 1:8000 v TBST, 100 pL na jamku).

20. Inkubuje se třicet minut při laboratorní teplotě za protřepávání.

21. Odstraní se protilátka BIOSOURCE a destička se promyje. Převede se čerstvě připravený roztok ABST/H2O2 na ELISA destičku, 100 pL na jamku.

22. Inkubuje se 5 až 10 minut za protřepávání. Odstraní se jakékoli bublinky.

23. Reakce se zastaví přídavkem 100 pL 0,2 M HC1 do každé j amky.

24. Odečtou se výsledky na spektrofotometru ELISA Dynatech MR7000; filtr pro test při 410 nm, referenční filtr při 630 nm.

132 ·« ·· ·· • · · · · · • · « · » · · » · · • · · · · • * 9 9 99 9 9 «» ·

9 9 9 9

99 9 9 9 ·

Zkouška cdk2/cyklin A

Tato zkouška se používá k měření serin/threonin kinázové aktivity lidské cdk2/cyklin A in vitro v zkoušce „Scintillation Proximity Assay (SPA).

Materiály a reagencie:

1.

2.

3.

.

5.

6.

7.

8.

9.

Polyethylen-tereftalátové destičky (flexi) Wallac s 96 jamkami (Wallac, katal. č. 1450-401).

Amersham Redivue [γ³³Ρ] ATP (Amersham, katal. č. AH9968) . Streptavidinem smočené polyvinyltoluenové SPA nosiče firmy Amersham (Amersham, katal. č. RPNQ0007). Nosiče by se měly rekonstituovat v PBS bez hořčíku nebo vápníku, při koncentraci 20 mg/mL.

Aktivovaný enzymový komplex cdk2/cyklin A čištěný z Sf9 buněk (SUGEN, lne.).

Biotinylovaný peptidový substrát (Debtid). Peptid biotin-X-PKTPKKAKKL se rozpustí v destilované vodě při koncentraci 5 mg/mL.

Směs peptid/ATP: pro přípravu 10 mL se smíchá 9,979 mL destilované vody, 0,00125 „chladného ATP, 0,010 mL Debtidu a 0,010 mL γ³³Ρ ATP. Konečná koncentrace bude v každé jamce 0,5 pM „chladného ATP, 0,1 pg Debtidu a 0,2 pCi γ³³Ρ ATP.

Kinázový pufr: pro přípravu 10 mL se smíchá 8,85 mL destilované vody, 0, 625 mL TRIS (pH 7,4), 0,25 mL 1 M MgCl₂, 0,25 mL 10 % NP40 a 0,025 mL 1 M DTT, přidaný čerstvě právě před použitím.

mM ATP v destilované vodě.

M TRIS, pH nastaveno HC1 na hodnotu 7,4.

M MgCl₂.

M DTT.

PBS (Gibco, katal. č. 14190-144).

133 ·· ·· ·· • 9 · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · ·· ···· ·· ·· · • · • · · • ···· • · · ·« ·

13. 0,5 M EDTA.

14. Zastavovací roztok: pro přípravu 10 mL se smíchá 9,25 mL PBS, 0,005 mL 100 mM ATP, 0,1 mL 0,5 M EDTA, 0,1 mL 10 % Triton X-100 a 1,25 mL SPA nosiče 20 mg/mL.

Postup:

1. Připraví se roztoky testovaných sloučenin v 5 % DMSO pětkrát koncentrovanější než je požadovaná konečná

koncentrace.	Do každé jamky se přidá	10	pL. V j amkách
pro negativní	kontrolu se použije 10	pL	samotného 5 %
DMSO.
2. 5 pL roztoku	cdk2/cyklin A se zředí	2,1	mL kinázového

pufru s dvojnásobnou koncentrací,

3. Do každé jamky se přidá 20 pL enzymu.

4. Do jamek pro negativní kontrolu se přidá 10 pL 0,5 M EDTA.

5. Pro zahájení reakce kinázy se do každé jamky přidá 20 pL směsi peptid/ATP. Inkubuje se jednu hodinu bez protřepávání.

6. Do každé jamky se přidá 200 pL zastavovacího roztoku.

7. Počká se nejméně 10 minut.

8. Destička se odstředí při asi 2300 otáčkách za minutu po dobu 3-5 minut.

9. Na destičce se odečtu hodnoty s použitím Trilux nebo podobného analyzátoru.

Zkouška met transfosforylace

Tato zkouška se používá k měření hladin fosfotyrosinu na substrátu póly(glutamová kyselina : tyrosin (4:1)), jako prostředek pro identifikaci agonistů/antagonistů met transfosforylace substrátu.

Materiály a reagencie:

134

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8. 9.

Corning destičky ELISA s 96 jamkami (Corning, katal. č. 25805-96.

Poly(glu, tyr) 4:1, Sigma, katal. č. P 0275.

PBS, Gibco, katal. č. 450-1300EB.

mM HEPES.

Blokovací pufr: rozpustí se 25 g hovězího sérového albuminu, Sigma, katal. č. A-7888, v 500 mL PBS, filtruje se přes filtr 4 pm.

Čištěný GST fúzní protein obsahující Met kinázovou doménu, Sugen, lne.

TBST pufr.

% vodný (MilliQue H₂O) DMSO.

mM vodný (destilovaná voda) adenosin-5'-trifosfát, Sigma, katal. č. A-5394.

2X ředící pufr kinázy: pro přípravu 100 mL se smíchá 10 mL 1 M HEPES s pH 7,5 s 0,4 mL 5 Š BSA/PBS, 0,2 mL 0,1 M vanadičnanu sodného a 1 mL 5 M chloridu sodného v 8 8,4 mL destilované vody.

4X ATP reakční směs: pro přípravu 10 mL se smíchá 0,4 mL 1 M chloridu manganatého a 0,02 mL 0,1 M ATP v 9,56 mL

destilované vody.

4X směs negativních kontrol: pro přípravu 10 mL se

smíchá 0,4 mL 1 M chloridu manganatého v 9,6 mL

destilované vody.

NUNC polypropylenové destičky s 96 jamkami s dnem ve

tvaru V, Applied Scientific, katal. č. S-72092.

500 mM EDTA.

Ředící pufr protilátky: pro přípravu 100 mL se smíchá 10 mL 5 % BSA/PBS, 0,5 mL 5 % Carnation Instant Milk® v PBS a 0,1 mL 0,1 M vanadičnanu sodného v 88,4 mL TBST.

Králičí polyklonální anti-fosfotyrosinová protilátka, Sugen, lne.

Kozí anti-králičí křenovou peroxidázou konjugovaná protilátka, Biosource, lne.

135

18. Roztok ABTS: pro přípravu 1 L se smíchá 19,21 g kyseliny citrónové, 35, 49 g Na₂HPO₄ a 500 mg ABTS s dostatečným množstvím destilované vody do 1 L.

19. ABTS/H₂O₂: smíchá se 15 mL roztoku ABST s 2 pL H₂O₂ pět minut před použitím.

20. 0,2 M HC1.

Postup:

1. Destičky ELISA se smočí 2 pg Póly(glu-tyr) ve 100 pL PBS a skladují se přes noc při 4 °C.

2. Destička se blokuje 150 pL 5 % BSA/PBS po dobu 60 minut.

3. Destička se dvakrát promyje PBS, jednou 50 mM Hepes pufrem s pH 7,4.

4. Do každé jamky se přidá 50 pL zředěné kinázy. (Čištěná kináza se zředí ředícím pufrem pro kinázu. Konečná koncentrace by měla být 10 ng/jamku).

5. Přidá se 25 pL testované sloučeniny (v 4 % DMSO) nebo samotný DMSO (4 % v destilované vodě) do kontrolních jamek.

6. Směs kináza/sloučenina se inkubuje 15 minut.

7. Přidá se 25 pL 40 mM MnCl₂ do jamek negativní kontroly.

8. Do všech ostatních jamek (s výjimkou jamek negativní kontroly) se přidá 25 pL směsi ATP/MnCl₂. Inkubuje se 5 minut.

9. Přidá se 25 pL 500 mM EDTA pro zastavení reakce.

10. Destička se třikrát promyje TBST.

11. Do každé jamky se přidá 100 pL králičí polyklonální anti-Ptyr zředěný 1:10.000 v ředícím pufru pro protilátku. Inkubuje se jednu hodinu při laboratorní teplotě za protřepávání.

12. Destička se třikrát promyje TBST.

13. V ředícím- pufru pro protilátku se zředí anti-králičí protilátka konjugovaná HRP od firmy Biosource v poměru 1:6000. Přidá se 100 pL na jamku a inkubuje se jednu

136 • · · · • · · · • · · « · · · • · e · · · hodinu při laboratorní teplotě za protřepávání.

14. Destička se jednou promyje PBS.

15. Do každé jamky se přidá 100 pL roztoku ABST/H₂O₂.

16. Pokud je nutné, zastaví se rozvoj reakce přídavkem 100 pL 0,2 M HC1 na jamku.

17. Odečtou se výsledky na spektrofotometru ELISA Dynatech MR7000 s filtrem pro test při 410 nm a referenčním filtrem při 630 nm.

Zkouška transfosforylace IGF-1

Tato zkouška se používá k měření hladin fosfotyrosinu v substrátu póly(glutamová kyselina : tyrosin (4:1)) pro identifikaci agonistů/antagonistů gst-IGF-1 transfosforylace substrátu.

Materiály a reagencie:

1. Corning destičky ELISA s 96 jamkami.

2.	Póly(glu-tyr) (4:1), Sigma, katal. č. P	0275.
3.	PBS, Gibco, katal. č. 450-1300EB.
4.	50 mM HEPES.
5.	TBB blokovací pufr: pro přípravu 1 L	se smíchá 100 g
	BSA, 12,1 g TRIS (pH 7,5), 58,44 g chloridu sodného a 10
	mL 1 % TWEEN-20.
6.	Čištěný GST fuzní protein obsahující	IGF-1 kinázovou

doménu (Sugen, lne).

7. TBST pufr: pro přípravu 1 L se smíchá 6, 057 g TRIS, 8,766 g chloridu sodného a 0,5 mL TWEEN-20 s dostatečným množstvím destilované vody, aby byl celkový objem 1 L.

8. 4 % DMSO v Milli-Q H₂O.

9. 10 mM ATP v destilované vodě.

10. 2X ředící pufr kinázy: pro přípravu 100 mL se smíchá 10 mL 1 M HEPES (pH 7,5), 0,4 mL 5 % BSA v destilované vodě, 0,2 mL 0,1 M vanadičnanu sodného a 1 mL 5 M

137 chloridu sodného s dostatečným množstvím destilované vody, aby byl celkový objem 100 mL.

11. 4X reakční směs ATP: pro přípravu 10 mL se smíchá 0,4 mL 1 M MnCl₂ a 0, 008 mL 0,01 M ATP s 9,56 mL destilované vody.

12. 4X směs negativních kontrol: smíchá se 0,4 mL 1 M chloridu manganatého v 9,60 mL destilované vody.

13. NUNC polypropylenové destičky s 96 jamkami s dnem ve tvaru V.

14. 500 mM EDTA v destilované vodě.

15. Ředící pufr protilátky: pro přípravu 100 mL se smíchá 10 mL 5 % BSA v PBS, 0,5 mL 5 % Carnation Instant Non-fat Milk® v PBS a 0,1 mL 0,1 M vanadičnanu sodného v 88,4 mL TBST.

16. Králičí polyklonální anti-fosfotyrosinová protilátka, Sugen, lne.

17. Kozí anti-králičí HRP konjugovaná protilátka, Biosource.

18. Roztok ABTS.

19. ABTS/H₂O₂: pět minut před použitím se smíchá 15 mL roztoku ABST s 2 pL H₂O₂.

20. 0,2 M HC1 v destilované vodě.

Postup:

1. Destička ELISA se smočí 2 pg/jamku Póly(glu-tyr) 4:1 (Sigma P0275) ve 100 pL PBS. Destička se skladuje přes noc při 4 °C.

2. Destička se jednou promyje PBS.

3. Do každé jamky se přidá 100 pL TBB blokovacího pufru. Destička se jednu hodinu inkubuje při laboratorní teplotě za protřepávání.

4. Destička se jednou promyje s PBS, potom dvakrát s 50 mM Hepes pufrem s pH 7,5.

5. Přidá se na destičku 25 pL roztoku testované sloučeniny v 4 % DMSO (získaného zředěním zásobního roztoku 10 mM • · · · · · · ··· • · · · · · · · · ·· ♦ · · ·· · ···· • · · · · · · · · ···· • · · · · · · · · «····· ·· ··· '· · ·

138 testované sloučeniny v 100 % DMSO destilovanou vodou).

6. Do všech jamek se přidá 10,0 ng gst-IGF-1 kinázy v 50 pL ředícího pufru pro kinázu.

7. Reakce kinázy se zahájí přídavkem 25 pL 4X reakční směsi ATP do všech testovaných jamek a jamek pozitivní kontroly. Do všech jamek negativní kontroly se přidá 25 pL 4X směsi negativní kontroly. Inkubuje se 10 minut při laboratorní teplotě za protřepávání.

8. Do všech jamek se přidá 25 pL 0,5 M EDTA (pH 8,0) .

9. Destička se čtyřikrát promyje TBST pufrem.

10. Do všech jamek se přidá králičí polyklonální antifosfotyrosinové antisérum zředěné 1:10.000 ve 100 pL ředícího pufru protilátky. Inkubuje se jednu hodinu při laboratorní teplotě za protřepávání.

11. Destička se promyje jako v kroku 9.

12. Do všech jamek se přidá 100 pL Biosource anti-králičí HRP při zředění 1:10.000 v ředícím pufru protilátky. Inkubuje se jednu hodinu při laboratorní teplotě za protřepávání.

13. Destička se promyje jako v kroku 9 a potom jednou s PBS, aby se snížil výskyt bublinek a přebytek Tweenu-20.

14. Do každé jamky se přidá 100 pL/jamku roztoku ABST/H2O2.

15. Po asi pěti minutách se odečtou výsledky na spektrofotometru ELISA s filtrem pro test při 410 nm a referenčním filtrem při 630 nm.

Zkouška inkorporace BrdU

Následující zkoušky používají buňky zmanipulované tak, aby exprimovaly vybraný receptor a potom hodnotí účinek testované sloučeniny na aktivitu ligandem indukované syntézy DNA pomocí stanovení inkorporace BrdU do DNA.

Následující materiály, reagencie a postupy jsou obecně • · • · · · · · · · · ·

A · · · · · » · · · ·· · • · · · · · ··· ·· ···· ·· ··· ·· ·

139 stejné, jako v následujících zkouškách inkorporace BrdU. Rozdíly ve specifických zkouškách se vyznačí.

Materiály a reagencie:

1. Vhodný ligand.

2. Vhodně naprojektované buňky.

3. Značkovací reagencie BrdU: 10 mM v PBS (pH 7,4) (Boehringer Mannheim, Německo).

4. FixDenat: fixační roztok (připravený k použití,

Boehringer Mannheim, Německo).

5. Anti-BrdU-POD: myší monoklonální protilátka konjugovaná s peroxidázou (Boehringer Mannheim, Německo).

6. Substrátový roztok TMB: tetramethylbenzidin (TMB,

Boehringer Mannheim, Německo).

7. Promývací roztok PBS: IX PBS, pH 7,4.

8. Albumin, hovězí (BSA), prášek frakce V (Sigma Chemical Co., USA).

Obecný postup:

1. Buňky se vysadí s hustotou 8000 buněk na jamku v 10 % CS, 2 mM Gin v DMEM na 96 jamkovou destičku. Buňky se inkubují přes noc při teplotě 37 °C v atmosféře s obsahem 5 % CO₂.

2. Po 24 hodinách se buňky promyjí s PBS a potom se nechají 24 hodin sérově strádat v médiu bez séra (0 % CS DMEM s 0,1 % BSA) .

3. Na třetí den se současně přidají k buňkám vhodný ligand a testovaná sloučenina. Do jamek negativní kontroly se přidá pouze DMEM bez séra s 0,1 % BSA; do jamek pozitivní kontroly se přidá pouze ligand bez testované sloučeniny. Testované sloučeniny se připraví v DMEM bez séra s ligandem na 96 jamkové destičce a sériově se ředí pro 7 testovaných koncentrací.

140

4. Po 18 hodinách aktivace ligandu se přidá zředěná značkovací reagencie BrdU (1:100 v DMEM, 0,1 % BSA) a buňky se 1,5 hodiny inkubují s BrdU (konečná koncentrace = 10 μΜ).

5. Médium se po inkubaci se značkovací reagencií odstraní tím, že se slije a poklepáním otočené destičky na buničinu. Přidá se roztok FixDenat (50 pL/jamku) a destičky se 45 minut inkubují při laboratorní teplotě na třepačce pro destičky.

6. Roztok FixDenat se dokonale odstraní tím, že se slije a poklepáním obrácené destičky na buničinu. Přidá se mléko (5 % dehydratovaného mléka v PBS, 200 pL/jamku) jako blokovací roztok a destička se 30 minut inkubuje při laboratorní teplotě na třepačce pro destičky.

7. Blokovací roztok se odstraní tím, že se slije a jamky se jednou propláchnou PBS. Přidá se (50 pL/jamku) roztoku anti-BrdU-POD (zředěný v poměru 1:200 v PBS, 1 % BSA) a destička se 90 minut inkubuje při laboratorní teplotě na třepačce. ^!

8. Konjugát protilátky se dokonale odstraní tím, že se slije a pětkrát promyje s PBS a destička se suší jejím otočením a poklepáním na buničinu.

9. Přidá se substrátový roztok TMB (100 pL/jamku) a 20 minut se inkubuje při laboratorní teplotě na třepačce pro destičky dokud vývoj barvy není dostatečný pro fotometrickě stanovení.

10. Absorbance vzorků se měří při 410 nm (v módu „duální vlnové délky s filtrem při 490 nm, jako referenční vlnovou délkou) na spektrofotometru Dynatech pro destičky ELISA.

Zkouška EGF indukované inkorporace BrdU

Materiály a reagencie: ' • · • · · · · · ··· ·· ···· ·· ··· ·· ·

141

1. Myší EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japonsko).

2. 3T3/EGFRc7.

Zkouška EGF indukovanou Her-2 řízenou inkorporací BrdU

Materiály a reagencie:

1. Myší EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japonsko).

2. 3T3/EGFr/Her2/EGFr (EGFr s Her-2 kinázovou doménou).

Zkouška EGF indukovanou Her-4 řízenou inkorporací BrdU

Materiály a reagencie:

1. Myší EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japonsko).

2. 3T3/EGFr/Her4/EGFr (EGFr s Her-4 kinázovou doménou).

Zkouška PDGF indukované inkorporace BrdU

Materiály a reagencie:

1. Lidský PDGF B/B (Boehringer Mannheim, Německo).

2. 3T3/EGFRC7.

Zkouška FGF indukované inkorporace BrdU

Materiály a reagencie:

1. Lidský FGF2/bFGF (Gibco BRL, USA).

2. 3T3c7/EGFr.

Zkouška IGF1 indukované inkorporace BrdU

Materiály a reagencie:

1. Lidský, rekombinantní G511 (Promega Corp., USA).

2. 3T3/IGFlr.

142 ·· ·· ·· • · · · · · • · · * · • · 9 · · · • · • · · • ·'· ·

Zkouška inzulínem indukované inkorporace BrdU

Materiály a reagencie:

1. Inzulín, krystalický, hovězí, zinek (13007, Gibco BRL, USA) .

2. 3T3/H25.

Zkouška HGF indukované inkorporace BrdU

Materiály a reagencie:

3. Rekombinantní lidský HGF (Kat. č. 249-HG, R&D Systems, lne., USA).

4. BxPC-3 buňky (ATCC CRL-1687).

Postup:

1. Buňky se vysadí s hustotou 9000 buněk na jamku v RPMI 10 % FBS na 96 jamkovou destičku. Buňky se inkubují přes noc při teplotě 37 °C v atmosféře s obsahem 5 % CO₂.

2. Po 24 hodinách se buňky promyjí s PBS a potom se nechají hodin sérově strádat v 100 pL média bez séra (RPMI s 0,1 % BSA) .

3. Na třetí den se k buňkám přidá 25 pL obsahujících ligand (připravený v koncentraci 1 pg/mL v RPMI s 0,1 % BSA; konečná koncentrace HGF je 200 ng/mL) a testovanou sloučeninu. Do jamek negativní kontroly se přidá pouze pL RPMI bez séra s 0,1 % BSA; do jamek pozitivní kontroly buněk se přidá ligand (HGF) bez testované sloučeniny. Testované sloučeniny se připraví v pětinásobku jejich konečné koncentrace v RPMI bez séra s ligandem v 96 jamkové destičce a sériově se ředí pro sedm testovaných koncentrací. Nejvyšší konečná koncentrace testované sloučeniny je typicky 100 pM a používá se ředění v poměru 1:3 (tj. konečná koncentrace

143 • ·· · 9 9 9 9 · · ·

9« 9 99 « 9999

9 9 99 9 9 «9 9 999

999 99« · · ·

9« «99« 99 999 «9 9 testované sloučeniny se pohybuje od 0,137 do 100 μΜ) .

4. Po 18 hodinách aktivace ligandu se přidá do každé jamky

12,5 pL zředěné značkovači reagencie BrdU (1:100 v RPMI, 0,1 % BSA) a buňky se jednu hodinu inkubuj i s BrdU (konečná koncentrace je 10 pM).

5. Stejné jako v obecném postupu.

6. Stejné jako v obecném postupu.

7. Blokovací roztok se odstraní tím, že se slije a jamky se jednou propláchnou PBS. Přidá se (100 pL/jamku) roztoku anti-BrdU-POD (zředěný v poměru 1:100 v PBS, 1 % BSA) a destička se 90 minut inkubuje při laboratorní teplotě na třepačce pro destičky.

8. Stejné jako v obecném postupu.

9. Stejné jako v obecném postupu.

10. Stejné jako v obecném postupu.

Zkouška HUV-EC-C

Tato zkouška se používá pro měření aktivity sloučeniny vůči PDGF-R, FGF-R, VEGF, aFGF nebo Flk-1/KDR, kteréžto všechny se přirozeně exprimují buňkami HUV-EC.

Den 0:

1. Buňky HUV-EC-C se promyjí a trypsinizují (lidské endotelové buňky z pupeční žíly, American Type Culture Collection, katal. č. 1730 CRL). Promyjí se dvakrát fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem Dulbecco (D-PBS, získaný od Gibco BRL, katal. č. 14190-029) v množství asi 1 mL/10 cm²nádoby tkáňové kultury. Trypsinizují se 0,05 % trypsin-EDTA v neenzymatickém buněčném disociačním roztoku (Sigma Chemical Company, katal. č. C-1544). Roztok trypsinu s koncentrací 0,05 % se připraví zředěním 0,25 % trypsinu/1 mM EDTA (Gibco, katal. č. 25200-049) v buněčném disociačním roztoku.

144 • 4 4 · · · · 4 · 4 4

4 4 4 · 4 4 4 4 4

4 4 44 4 4 44 444·

444 444 444

4444 44 444 44 4

Trypsinizuje se pět minut při teplotě 37 °C s asi 1 mL/23-30 cm² nádoby tkáňové kultury. Poté, co se buňky izolují z nádoby, přidá se stejný objem zkušebního média a převedou se do 50 mL sterilní centrifugační zkumavky (Fisher Scientific, katal. č. 05-539-6).

2. V 50 mL sterilní centrifugační zkumavce se buňky promyjí asi 35 mL zkušebního média tím, že se přidá zkušební médium, odstřeďují se 10 minut při asi 200 x g, odsaje se supernatant a resuspendují se 35 mL D-PBS. Promývání s D-PBS se zopakuje ještě dvakrát, buňky se resuspendují v asi 1 mL zkušebního média/15 cm² nádoby buňkové kultury. Zkušební médiu sestává z F12K média (Gibco BRL, katal. č. 21127-014) a 0,5 % teplem inaktivovaného fetálního hovězího séra. Buňky se spočítají pomocí Coulter Counter® (Coulter Electronics, lne.) a přidá se zkušební médium k buňkám, aby se získala koncentrace od 0,8 do 1,0 x 10⁵ buněk/mL.

3. Buňky se přidají na destičky s 96 jamkami s plochým dnem v množství 100 pL/jamku nebo 0,8-l,0xl0⁴ buněk/jamku a inkubují se asi 24 hodin při teplotě 37 °C v atmosféře s 5 % CO₂.

Den 1:

1. Připraví se dvojnásobné titry testované sloučeniny v oddělených 96 jamkových destičkách, obecně 50 pM a snižující se k 0 pM. Použije se stejné zkušební médium, jako se uvádí výše v den 0, krok 2. Titry se připraví přídavkem 90 pL/jamku testované sloučeniny při koncentraci 200 pM (proti konečně koncentraci čtyřikrát koncentrovanější) do horní jamky konkrétního sloupce destičky. Jelikož zásobní roztok testované sloučeniny má obvykle koncentraci 20 mM v DMSO, koncentrace léčivé látky 200 pM obsahuje 2 % DMSO.

145

·· · · · · · ···· • · · · · · • · · · · ·· a

Ředidlo pro vytvoření koncentrace 2 % DMSO ve zkušebním médiu (F12K + 0,5 % fetálního hovězího séra) se použije jako ředidlo pro titry testované sloučeniny, aby se testovaná sloučenina zředila, ale zachovala se konstantní koncentrace DMSO. Toto ředidlo se přidá do zbývajících jamek ve sloupci v množství 60 pL/jamku. Vezme se 60 pL ze 120 pL na 200 pM zředěné testované sloučeniny z vrchní jamky sloupce a smíchá se s 60 pL druhé jamky sloupce. Z této jamky se vezme 60 pL a smíchá se s 60 pL třetí jamky ve sloupci atd., dokud se dvojnásobné titry nedokončí. Když se smíchá předposlední jamka, vezme se 60 pL ze 120 pL v tomto důlku a vyhodí se. Poslední jamka se ponechá se 60 pL ředidla DMSO/médium jako kontrola, která neobsahuje testovanou sloučeninu. Vytvoří se 9 sloupců titrované testované sloučeniny, což je dostatek pro triplicitní jamky v nichž jsou: (1) VEGF (získaný od Pepro Tech lne., katal. č. 100-200), (2) růstový faktor endotelových buněk (ECGF) (také známý jako kyselý fibroblastový růstový faktor, nebo aFGF) (získaný od Boehringer Mannheim Biochemica, katal. č. 1439 600) nebo (3) lidský PDGF B/B (katal. č. 1276956, Boehringer Mannheim, Německo) a kontrola zkušebního média. ECGF se dodává jako přípravek s natrium-heparinem.

2. Převede se 50 pL/jamku zředěných roztoků testovaných sloučenin na 96 jamkovou zkušební destičku obsahující 0,8Ι,ΟχΙΟ⁴ buněk/100 pL/jamku buněk HUV-EC-C ze dne 0 a inkubuje se asi dvě hodiny při 37 °C v atmosféře s obsahem 5 % CO2.

3. Do každé z forem testované sloučeniny se přidá 50 pL/jamku 80 pg/mL VEGF, 20 ng/mL ECGF nebo kontroly média, a to trojmo. Podobně, jako u testovaných sloučenin, jsou koncentrace růstových faktorů čtyřikrát koncentrovanější než požadovaná konečná koncentrace. Použije se zkušební médium z dne 0, krok 2, pro přípravu koncentrací růstových faktorů. Inkubace probíhá asi 24 hodin při 37 °C v atmosféře s obsahem 5

146 • · · · · · ···· • · ···· · · · · ··· • · · · · · ··· ·· ···· ·· ··· ·· · % C0₂. Každá jamka bude obsahovat 50 pL ředění testované sloučeniny, 50 pL růstového faktoru nebo média a 100 pL buněk, což sečteno dává celkem 200 pL/jamku. Tím se čtyřnásobné koncentrace testované sloučeniny a růstových faktorů sníží na jednonásobné, jakmile se vše přidalo do jamek.

Den 2:

1. Přidá se ³H-thymidin (Amersham, katal. č. TRK-686) s 1 pCi/jamku (10 pL/jamku roztoku 100 pCi/mL připraveného v médiu RPMI + 10 % teplem inaktivovaného fetálniho hovězího séra) a inkubuje se asi 24 hodin při 37 °C v atmosféře s obsahem 5 % CO₂. RPMI se získalo od firmy Gibco BRL, katal. č. 11875-051.

Den 3:

1. Destičky se zmrazí přes noc na -20 °C.

Den 4:

Destičky se rozmrazí a sklidí pomocí sklízecího zařízení 96 jamkové destičky (Tomtec Harvester 96®) do filtrových podložek (Wallac, katal. č. 1205-401) a na kapalném scincilačním detektoru Wallac Betaplate™ se odečtou hodnoty.

Biologické testy, které byly nebo se mohou použít pro hodnocení sloučenin se detailně popisují níže. Sloučeniny 1-9 se testovaly a byly aktivní ve zkouškách flkGST, FGFR1 a PDGF,

Živočišné modely in vivo

Xenoimplantátové živočišné modely

Schopnost lidských nádorů růst, jako xenoimplantát v

147 beztymových myších (např. Balb/c, nu/nu) poskytuje prospěšný model . in vivo pro studium biologické odezvy na terapie lidských nádorů. Od první úspěšné xenotransplantace lidských nádorů do beztymových myší (Rygaard a Povlsen: Acta Pathol. Microbial. Scand., 1969, 77, 758-760), mnoho rozličných buněčných linií lidských nádorů (např. prsních žláz, plic, pohlavně močových orgánů, gastrointestinálního traktu, hlavy a krku, glioblastomu, kostí a maligních melanomů) se transplantovaly a úspěšně rostly v holých myších. Následující zkoušky lze použít pro stanovení hladiny aktivity, specificity a účinku na rozličné sloučeniny předloženého vynálezu. Pro hodnocení sloučenin jsou prospěšné tři obecné typy zkoušek: celulárně/katalytická, celulárně/biologická a in vivo. Předmětem zkoušek celulárně/katalytických je stanovení účinku sloučeniny na schopnost TK fosforylovat tyrosiny na známém substrátu v buňce. Předmětem zkoušek celulárně/biologických je stanovení účinku sloučeniny na biologickou odezvu stimulovanou TK v buňce. Předmětem zkoušek in vivo je stanovení účinku sloučeniny ve zvířecím modelu konkrétní poruchy, například rakoviny.

Vhodné buněčné linie pro subkutánní xenoimplantátové experimenty zahrnují C6 buňky (gliom, ATCC č. CCL 107), buňky A375 (melanom, ATCC č. CRL 1619), buňky A431 (epidermoidní karcinom, ATCC č. CRL 1555), buňky Calu 6 (plíce, ATCC č. HTB 56), buňky PC3 (prostata, ATCC č. CRL 1435), buňky SKOV3TP5 a fibroblasty NIH 3T3 geneticky projektované tak, aby měly nadměrnou expresi EGFR, PDGFR, IGF-1R nebo jakékoli jiné testovací kinázy. Následující protokol lze použít pro provedení xenoimplantátových experimentů:

Samičky beztymových myší (BALB/c, nu/nu) se získaly od Simonsen Laboratories (Gilroy, CA) . Všechna zvířata se držela v podmínkách čistého prostoru v mikroizolovaných klíckách

148

s Alpha-dri pelíškem. Dostávala sterilní žrádlo pro hlodavce a vodu ad libitum.

Buněčné linie se pěstovaly ve vhodném médiu (např. MEM, DMEM, Ham F10 nebo Ham F12 plus 5 % - 10 % fetálního hovězího séra (FBS) a 2 mM glutaminu (GLN) ) . Veškerá buněčná kulturní média, glutamin a fetální hovězí sérum se zakoupily od Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) pokud není specifikováno jinak. Všechny buňky se pěstovaly v atmosféře s 90-95 % vlhkostí s přítomností 5-10 % CO₂ při 37 °C. Ze všech buněčných linií se rutinně dvakrát týdně vytvářely subkultury a byly negativní pro mykoplasmu, jak se stanovilo způsobem Mycotect (Gibco) .

Buňky se sklízely na shlucích nebo v jejich blízkosti s 0,05 % trypsin-EDTA a peletují se při 450 x g po dobu 10 minut. Pelety se resuspendují v sterilním PBS nebo médiu (bez PBS) na konkrétní koncentraci a buňky se implantují do zadní slabiny myši (8-10 myší na skupinu, 2-10xl0⁶ buněk/zvíře). Růst nádoru se měří 3-6 týdnů s použitím kalipru. Objemy nádorů se vypočítají jako násobek délky, šířky a výšky, pokud se neuvádí jinak. Průměrné hodnoty se vypočítají použitím Studentova ttestu. Testované sloučeniny v 50 - 100 pL pomocné látky (DMSO nebo VPD:D5W) lze podávat jako IP injekce při různých koncentracích obecně počínaje dnem po implantaci.

Model tumorové invaze

Vyvinul se následující model tumorové invaze a lze jej použít pro hodnocení terapeutické hodnoty a účinnosti sloučenin, u kterých se identifikovalo, že selektivně inhibují KDR/FLK-1 receptor.

Postup:

149

* ♦ · • · · ·

Jako experimentální zvířata se použily 8 týdnů staré nahé myši (samice) (Simonsen lne.). Implantaci buněk tumoru lze provést odtahem s laminárním tokem. Pro narkózu se podává intraperitoneálně koktejl xylazin/ketamin (100 mg/kg ketaminu a 5 mg/kg xylazinu) . Střední čára řezu se vede tak, aby obnažila břišní dutinu (dlouhá přibližně 1,5 cm), aby se injektovalo 10⁷ nádorových buněk v objemu 100 pL média. Buňky se injektují buď do duodenálního laloku pankreatu nebo pod serózní blánu střeva. Pobřišnice a svaly se uzavřou nepřerušovaným hedvábným stehem 6-0 a kůže se uzavře svorkami na rány. Zvířata se denně pozorují.

Analýzy

Po 2-6 týdnech, v závislosti na celkovém pozorování zvířat, se myši obětují a lokální nádorové metastáze na rozličných orgánech (plících, játrech, mozku, žaludku, slezině, srdci, svalech) se odstraní a analyzují (měří se velikost nádoru, stupeň invaze, imunochemie, stanovení hybridizace in šitu, atd.)

Zkouška c-kit

Tato analýza slouží ke stanovení tyrosinové fosforylace ckit

Buňky MO7E (lidské akutní myeloidní leukémie) se nechají sérově strádat přes noc v 0,1 % séru. Buňky se před stimulací ligandu zpracují se sloučeninou (konkurenční k sérovému strádání). Buňky se 15 minut stimulují 250 ng/mL rh-SCF. Po stimulaci se provede lýze buněk a imunoprecipitace s protilátkou anti-c-kit. Fosfotyrosin a hladiny proteinu se stanoví pomocí western blot.

150 ·· ·· ·· • · · · · · • · ♦ · · • · * · · · • · · · · ·· ···· ·· ·· · ·· • · · • ···· • ·

MTT proliferačni zkouška

Buňky MO7E se nechají sérově strádat a předem se zpracují se sloučeninou, jak se popisuje pro fosforylační pokusy. Buňky se umístní v množství 4xl0⁴ buněk/jamku na 96 jamkovou destičku v 100 pL RPMI + 10 % séra. Přidá se rh-SCF (100 ng/mL) a destička se inkubuje 48 hodin. Po 48 hodinách se přidá 10 pL 5 mg/mL MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromidu) a nechá se inkubovat 4 hodiny. Přidá se kyselý isopropanol (100 pL 0,04 N HCl v isopropanolu) a změří se optická densita při vlnové délce 550 nm.

Zkouška apoptózy

Buňky M07E se inkubují +/- SCF a +/- sloučenina v 10 % FBS s rh-GM-CSF (10 ng/mL) a rh-IL-3 (10 ng/mL). Vzorky se analyzují po 24 a 48 hodinách. Pro měření aktivované caspase-3 se vzorky promyjí s PBS a permeabilizuji se ledově chladným 70 % ethanolem. Buňky se potom obarví PE konjugovanou polyklonální králičí anti-aktivní caspase-3 a analyzují se pomocí FACS. Pro měření rozštěpeného PARP se provede lýze vzorků a analyzují se pomocí western blot s protilátku antiPARP.

Doplňkové zkoušky

Další zkoušky, které lze použít pro hodnocení sloučenin tohoto vynálezu zahrnují, bez omezování, zkoušku bio-flk-1, zkoušku chimérického receptorů EGF receptor-HER2 v celých buňkách, zkoušku bio-src, zkoušku bio-lck a zkoušku měřící fosforylační funkci raf. Protokoly pro každou z těchto zkoušek lze nalézt v U. S. přihlášce pořadové č. 09/099,842, která se zde zahrnuje jako odkaz, včetně jakýchkoli obrázků.

151

•	99		*9	• 9		4	• 9		•
•		9	•	9	•	•	9	•	• ·
•		9	•	9 9	•	•	9 9	•	·· · ·
•		9	•	9	•	•	•	•	•
	99		• · · ·	99			• ·		•

Měření buněčné toxicity

Terapeutické sloučeniny by měly projevovat větší potenci při inhibici aktivity receptorové tyrosinkinázy, než v uplatnění cytotoxického účinku. Míru účinnosti a buněčné toxicity sloučeniny lze získat stanovením terapeutického indexu, t j . IC50/LD50. Dávka potřebná pro dosažení 50 % inhibice, IC50, se může měřit standardními technikami, jako jsou ty, které se popisují zde. Stejně tak LD50/ dávka, jejíž výsledkem je 50 % toxicita, se může také měřit standardními technikami (Mossman: J. Immunol. Methods, 1983, 65, 55-63) měřením uvolněného množství LDH (Korzeniewski a Callewaert: J. Immunol. Methods, 1983, 64, 313, Decker a Lohmann-Matthes: J.

Immunol. Methods, 1988, 115, 61) nebo měřením smrtící dávky v živočišných modelech. Výhodné jsou sloučeniny s vysokým terapeutickým indexem. Terapeutický index by měl být větší než 2, výhodně přinejmenším 10 a výhodněji nejméně 50.

Odborník v technice by měl snadno nahlédnout, že předložený vynález je dobře přizpůsobený svým cílům a dosahuje zmíněných cílů a výhod, jakož i těch, které jsou od něho neodmyslitelné. Molekulární komplexy a způsoby, postupy, léčení, molekuly, specifické sloučeniny, které se zde popisují, představují v současné době reprezentativní výběr výhodných provedení vynálezu, který slouží jak příkladný a nezamýšlí se jako omezení rámce vynálezu. Jejich změny a další použití, které napadnou odborníky v technice, a které jsou v duchu vynálezu, se definují rámcem patentových nároků.

Odborníci v technice snadno nahlédnou, že rozličné substituce a modifikace lze v zde popsaném vynálezu provádět, aniž by se odchýlili od rámce a ducha vynálezu.

Všechny patenty a publikace zmíněné v popisu odpovídají

152

úrovni odborníkům v technice, kterým je vynález určen. Všechny patenty a publikace se zde zahrnují jako odkaz ve stejném rozsahu, jakoby každá jednotlivá publikace byla specificky a jednotlivě označena, že se zahrnuje jako odkaz.

Vynález, který se zde ilustrativně popisuje, lze vhodně praktikovat bez jakéhokoli prvku nebo prvků, omezení nebo omezování, které se zde specificky nepopisují. V každém případě tudíž například kterýkoliv ze zde používaných výrazů „obsahující, „sestávající v podstatě z a „sestávající z lze nahradit kterýmkoli z jiných dvou výrazů. Pojmy a výrazy, které se používají, se používají jako pojmy a výrazy popisu a nikoli omezení a nezamýšlí se, že použití takových pojmů a výrazů vylučuje jakékoli ekvivalenty rysů, které se předvádějí a popisují nebo které jsou jejich částí, ale má se zato, že rozličné modifikace jsou možné v rámci patentových nároků vynálezu. Mělo by se tudíž rozumět, že ačkoli předložený vynález se popsal specificky pomocí výhodných provedení a volitelných význaků, modifikací a variací zde popsaného pojetí, pro které se mohou rozhodnout odborníci v technice a že takové modifikace a variace spadají do rámce tohoto vynálezu, jak se definuje v přiložených patentových nárocích.

Navíc, kde se význaky nebo aspekty vynálezu popisují v pojmech skupina Markush, odborníkům v technice bude zřejmé, že vynález je tímto také popisován v pojmech jakéhokoli jednotlivého člena nebo podskupiny členů skupiny Markush.' Popisuje-li se například X jako, že se vybere ze skupiny sestávající z bromu, chloru a jodu, se plně popisují nároky, že X je brom a nároky, že X je brom a chlor.

Další provedení vynálezu jsou v rámci následujících patentových nároků.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Součenina vzorce (I):

(I) vyznačující se tím, že

R¹ se vybere ze skupiny sestávající z vodíku, skupiny halo, alkyl, haloalkoxy, cykloalkyl, heteroalicyklické, hydroxy, alkoxy, -C(O)R⁸, -NR⁹R¹⁰ a -C (0) NR¹²R¹³,

R² se vybere ze skupiny sestávající z vodíku, skupiny halo, alkyl, trihalomethyl, hydroxy, alkoxy, kyano, -NR⁹R¹⁰, -NR⁹C(O)R¹⁰, -C(0)R⁸, -S(O)2NR⁹R¹⁰ a -SO2R¹⁴ (kde R¹⁴ je alkyl, aryl, aralkyl, heteroaryl a heteroaralkyl),

R³, R⁴ a R⁵ jsou nezávisle vodík nebo alkyl,

Z je aryl, heteroaryl, hyterocyklus nebo -NR¹⁵R^1S, kde R¹⁵ a R¹⁶ jsou nezávisle vodík nebo alkyl; nebo R¹⁵ a R¹⁶ společně s atomem dusíku, ke kterému . se připojují, tvoří heterocykloaminovou skupinu,

R⁶ se vybere ze skupiny sestávající z vodíku nebo alkylu,

R⁷ se vybere ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, arylu, heteroaryíu a -C(O)R¹⁷, jak se definuje níže,

R⁸ se vybere ze skupiny sestávající ze skupiny hydroxy, alkoxy a aryloxy,

R⁹ a R¹⁰ se nezávisle vyberou ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, kyanoalkylu, cykloalkylu, arylu a

154 • · · · · · · • · · · · ·« « · · i ♦ * · · · · I • · · · · • · ♦♦·· ·· β·· heteroarylu nebo se R⁹ a R¹⁰· spojí, aby vytvořily heterocykloaminovou skupinu,

R¹² a R¹³ se nezávisle vyberou ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, hydroxyalkylu a arylu; nebo R¹² a R¹³společně s atomem dusíku, ke kterému se připojují, tvoří heterocykloaminovou skupinu,

R¹⁷ se vybere ze skupiny sestávající z alkylu, cykloalkylu, arylu, hydroxylu a heteroarylu, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.
2. Sloučenina podle nároku 1 vyznačující se tím, že

R¹ se vybere ze skupiny sestávající z vodíku, skupiny halo, alkyl, cykloalkyl, heteroalicyklické, hydroxy, alkoxy, -C(O)R⁸, -NR⁹R¹⁰ a -C (O)NR¹²R¹³,

R² se vybere ze skupiny sestávající z vodíku, skupiny halo, alkyl, trihalomethyl, hydroxy, alkoxy, kyano, -NR⁹R¹⁰, -NR⁹C(O)R¹⁰, -C(O)R⁸, -S(O)2NR⁹R¹⁰ a -SO2R¹⁴ (kde R¹⁴ je alkyl, aryl, aralkyl, heteroaryl a heteroaralkyl),

R³, R⁴ a R⁵ jsou nezávisle vodík nebo alkyl,

Z je aryl, heteroaryl, hyterocyklus nebo -NR¹⁵R¹⁶, kde R¹⁵ a R¹⁶ jsou nezávisle vodík nebo alkyl; nebo R¹⁵ a R¹⁶ společně s atomem dusíku, ke kterému se připojují tvoří heterocykloaminovou skupinu,

R⁶ se vybere ze skupiny sestávající z vodíku nebo alkylu,

R⁷ se vybere ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, arylu, heteroarylu a -C(O)R¹⁷, jak Se definuje níže,

R⁸ se vybere ze skupiny sestávající ze skupiny hydroxy, alkoxy a aryloxy,

R⁹ a R¹⁰ se nezávisle vyberou ze skupiny sestávající • ♦ • · · · · · · · · · · ·» · · · · · · » · • · · · · · · · · * ···· ··· · · · · · · ·· ·>» · · ·♦ »·· <* *

155 z vodíku, alkylu, kyanoalkylu, cykloalkylu, arylu a heteroarylu nebo se R⁹ a R¹⁰ spojí, aby vytvořily heterocyklickou skupinu,

R¹² a R¹³ se nezávisle vyberou ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu a arylu nebo R¹² a R¹³ společně s atomem, dusíku, ke kterému se připojují, tvoří heterocyklickou skupinu,

R¹⁷ se vybere ze skupiny sestávající z alkylu, cykloalkylu, arylu hydroxylu a heteroarylu, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

3. Sloučenina nebo sůl podle nároku 1 vyznačující se tím, že se sloučenina vybere ze skupiny sestávající z:

Sl. č. Struktura Název IN R 0 ^H jr / ° H (3-diethylamino-2hydroxypropyl)-amid kyseliny 5-(5-fluor-2-oxo-l,2-dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-2,4dimethyl- l//-pyrrol-3 karboxylové 2N r u/uíO ^H jQ>=° H (2-hydroxy-3 -morfolin-4-ylpropyl)-amid kyseliny 5-[5fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol(3Z)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl- l/Z-pyrrol-3 karboxylové 3N Ι^ΪΓ yJ/xO η (2-hydroxy-3 -morfolin-4-ylpropyl)-amid kyseliny 2,4dimethyl-5-[2-oxo- 1,2-dihydro- indol-(3Z)-ylidenmethyl]- 1/fpyrrol-3 -karboxylové UL 2=0 H

156

4Ν Ck 0 (2-hydroxy-3 -morfolin-4-ylpropyl)-amid kyseliny 5-[5chlor-2-oxo- 1,2-dihydro-indol(3Z)-ylidenmethyl] -2,4dimethyl-1 //-pyrrol-3 karboxylové Ty ^N^z H =0 n?o H 5Ν 0 (2-hydroxy-3 -morfolin-4-yl- H M ^í*^^v'N^z »VG propyl)-amid kyseliny 5-[5brom-2-oxo-1,2-dihydro-indolylidenmethyl]-2,4-dimethyl- Br. H lZř-pyrrol-3 -karboxylové iO =0 H 6Ν 0 (2-hydroxy-3 -[ 1,2,3 Jtriazol-1 yl-propyl)-amid kyseliny 2,4- H Tv OH n=n dimethyl-5 - [2-oxo-1,2-dihydroindol-ylidenmethylj- 1/7-pyrrol- N H 3-karboxylové II =0 H 7Ν H 0 Ty •hKY^isrG -^H ok W (2-hydroxy-3-[ 1,2,3 Jtriazol-1 yl-propyl)-amid kyseliny 5-[5fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol- ylidenmethyl] -2,4-dimethyl- F. Ti \ H l/y-pyrrol-3 -karboxylové JLn' H >=0 8Ν H 0 Ty H ^χίΓ^Ά -^H ÓH N=n' (2-hydroxy-3 -[ 1,2,3 Jtriazol-1 yl-propyl)-amid kyseliny 5-[5chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol- ylidenmethyl] -2,4-dimethyl- Ck l/f-pyrrol-3 -karboxylové V >=0 H 9Ν H 0 Ty r^N^z H 'kkk'·) ~^H ÓH N=r/ (2-hydroxy-3 -[ 1,2,3 Jtriazol-1 yl-propyl)-amid kyseliny 5-[5brom-2-oxo-1,2-dihydro-indolylidenmethyl] -2,4-dimethyl- Br. l/Z-pyrrol-3 -karboxylové |T >=0 H

• · • Λ • ·

157 · · · · • ·« ·«··· <· ·

11Ν QU Η M\ o 3 - {[4-( {[3 -(diethylamino)-2hydroxypropyl] amino }karbonyl)- 5 -methyl-3 -fenyl- 1Hpyrrol-2-yl]methylen} -2-oxoÁ-fenyl-2,3-dihydro- 1/ř-indol5-karboxamid w \Jn FV M ^H Xv ⁰ H Sxc 12Ν M\ o 3 - {[4-( {[3 -(diethylamino)-2- \ // II hydroxypropyl] amino} karbo- 0 CM- «XC nyl)-5-methyl-3 -fenyl-\Hpyrrol-2-yl]methylen} -N- ζλ methyl-2-oxo-2,3 -dihydro- 1H- JZ H indol-5-karboxamid Η || /=0 Μ H 13Ν f~~\ 0 (3Z)-3- {[4-({ [3 -(diethylamino)- \ /) 2-hydroxy- 0 ΟνϊΧ propyl] amino} karbonyl)-5 methyl-3 -fenyl-177-pyrrol-2- ^H£W zr ^n· ^H Íl \ Λ yl]methylen}-7V-(2hydroxyethyl)-2-oxo-2,3 - H c. 1 M⁰ dihydro- l/7-indol-5 - H karboxamid 14Ν F. N-[3 -(diethylamino)-2- / \ 0 hydroxypropyl]-4-(4- \M H ví :«XC fluorfenyl)-2-methyl-5- {[5(morfolin-4-ylkarbonyl)-2-oxo- O II 1,2-dihydro-3/7-indol-3 - ^H yliden]methyl} - 12/-pyrrol-3 - O kj/ ° H karboxamid 15Ν F 3 - {[4-( { [3-(diethylamino)-2- / \ O hydroxypropyl]amino}karbo- y_/ I M nyl)-3 -(4-fluorfenyl)-5-methyl- X;X' lZ7-pyrrol-2-yl]methylen}-7V- o 7r^N^/ isopropyl-2-oxo-2,3 -dihydro- ^H U¹ M H \=° H 177-indol-5-karboxamid 16Ν F _F0í 3-{[4-({[3-(diethylamino)-2hydroxypropyl] amino }karbo- nyl)-3-(2,4-difluorfenyl)-5- xjy ΉΎΧΙ methyl-1 //-pyrrol-2- Cv j¹ OH ^x— yl] methylen } -2-oxo-jV-fenyl- M ^H 2,3 -dihydro- l//-indol-5 - H c I>° H karboxamid

158 • · • · · • II·· *

»«*

17N ^H k F .0 □ Src 3 - {[4-({ [3 -(diethylamino)-2hydroxypropyl]amino }karbonyl)-3 -(2,4-difluorfenyl)-5methyl- l//-pyrrol-2yljmethylen} -7V-(2hydroxyethyl)-2-oxo-2,3 dihydro-1 //-indol-5 karboxamid f' H H Jrj ' H )«=0 18N 1 3 - {[3 -(4-kyanofenyl)-4-( {[3 - \ O (diethylamino)-2-hydroxy- \ /7 II propyl] amino} karbonyl)-5- o H rv n?t methyl- l//-pyrrol-2yljmethylen} -jV,?/-dimethyl-2- H oxo-2,3 -dihydro-1 //-indol-5 - O H -O karboxamid 19N V 4-(4-kyanofenyl)-/V-[3- A θ (diethylamino)-2- v aac hydroxypropyl]-2-methyl-5- < XX. . y D H τί ^N^Z H {[5-(morfolin-4-ylkarbonyl)-2oxo-1,2-dihydro-3//-indol-3 yliden] methyl} - l/ř-pyrrol-3 - O \χ· Xx W H =O karboxamid 20N Cl 3 - {[3 -(4-chlorfenyl)-4-({ [3 - D (diethylamino)-2-hydroxy- 4 /? Sxc propyl] amino } karbonyl)-5- a. H O jK XV H methyl- l//-pyrrol-2yl]methylen} -2-oxo-/V-fenyl- 2,3 -dihydro- l//-indol-5- Ίι >=O karboxamid H 21N Cl \ o 3-{[3-(4-chlorfenyl)-4-({ [3(diethylamino)-2-hydroxy- V νΛ nx propyl] amino} karbonyl)-5 - 0 H jrc methyl- l//-pyrrol-2yl]methylen}-77-isopropyl-2- AJ H H oxo -2,3-dihydro-l//-indol-5- 1X1 =0 karboxamid M¹ H

« · · ·

159 • · * · · • «· · ·

22N R H <|/ H 0 U Xy ^N^Z H =0 Λ *Vs 5 - [(5 -fluor-2-oxo-1,2-dihydro3 //-indol-3 -yliden)methyl]-7V[2-hydroxy-3 -(2//-tetrazol-2yl)propyl]-2,4-dimethyl- IHpyrrol-3 -karboxamid 23N H 0 u Ty H Λ 5-[(5-chlor-2-oxo- 1,2-dihydro3Z/-indol-3 -yliden)methyl]-/V[2-hydroxy-3-(2//-tetrazol-2yl)propyl]-2,4-dimethyl- 1H- Cl pyrrol-3-karboxamid r> =0 Ύί H 24N C ί Λ A-[2-hydroxy-3-(2//-tetrazol-2yl)propyl]-2,4-dimethyl-5-{ [2- ,5/ H Ty (***Χκ|Χ oxo-5-(trifluormethoxy)-1,2dihydro-3//-indol-3 - Γ H ylidenjmethyl} - l/7-pyrrol-3 - AzíA' ΪΓ b <==0 karboxamid XiV H 25N H 0 Ty nV 5-[(5-fluor-2-oxo-1,2-dihy dro3/7-indol-3 -yliden)methyl] -N[2-hydroxy-3 -(l/f-tetrazol-1 yl)propyl]-2,4-dimethyl-1H- F_x H pyrrol-3 -karboxamid =0 H 26N 0 nV 5-[(5-chlor-2-oxo-1,2-dihydro- H Ty 3//-indol-3 -yliden)methyl] -N[2-hydroxy-3-(1 //-tetrazol-1 yl)propyl]-2,4-dimethyl-1H- C!_x N H pyrrol-3 -karboxamid t =0 -bT H 27N 0 κΧ N- [2-hydroxy-3 -(1//-tetrazol-1 - H Ty ΓίΡ yl)propyl]-2,4-dimethyl-5-{ [2oxo-5-(trifluormethoxy)-1,2dihydro-3//-indol-3- N H ylidenjmethyl} -1//-pyrrol-3 - Ύ T =0 karboxamid Ύν^ζ H

4 4 · · 4 »

160 • <4

28N Ό 0 TV-{3-[2,6-dimethylmorfolin-4yl] -2-hydroxypropyl} -5 - [(5 fluor-2-oxo-1 F-dihydro-STYindol-S-ylidenjmethylJ^Fdimethyl- l#-pyrrol-3 karboxamid H H jy ^N^z H =0 F OH O 29N 0 5-[(5-chlor-2-oxo-1,2-dihydro- W 37/-indol-3 -ylidenjmethyl]-TV- H jo H {3 -[2,6-dimethylmorfolin-4yl] -2-hydroxypropyl} -2,4- CL 1 dimethyl- I/Ť-pyrrol-3- ÍT =0 karboxamid II / H 30N O TV- { 3 -[2,6-dimethylmorfolin-4- jary yl]-2-hydroxypropyl} -2,4- F F 4 JK dimethyl-5- {[2-oxo-5- ,χ (trifluormethoxy)-1,2-dihydro- Γ H 1 3//-indol-3 -ylidenjmethyl} -1/7- ÍT ' *=0 pyrrol-3 -karboxamid Y^z 34N 0 0 li 5-[(5-fluor-2-oxo-1,2-dihydro- K k 1 Z\ Z\ . .z*x 3//-indol-3 -yliden)methyl]-/V- H fc YV [2-hydroxy-3 -(3 -methyl-2,5- dioxoimidazolidin-1 - F^ N H ď yl)propyl]-2,4-dimethyl- \H- =0 pyrrol-3 -karboxamid -N^? H 35N o 9 TV- [2-hydroxy-3 -(3 -methyl-2,5 - raV dioxoimidazolidin-1 - F H jK H yl)propyl]-2,4-dimethyl-5-{(Zj[2-oxo-5-(trifluormethoxy)-1,2- F ( “kz^ ď dihydro-3T7-indol-3 ylidenjmethyl} -1//-pyrrol-3 - >=0 O^z H karboxamid 36N 0 0 II 5-[(5-chlor-2-oxo-l,2-dihydro- zk 3 TV-indol-3 -ylidenjmethyl] -TV- H Fk «Xj_r [2-hydroxy-3 -(3 -methyl-2,5 dioxoimidazolidin-1 - ci_x N H ď yl)propyl]-2,4-dimethyl-\H- Ά =0 pyrrol-3 -karboxamid ή\γ H

• · • » ·♦ « « * « · * * «··· « · » · « · ·««· «> *--a «c» ··» ·· r>

161

37N 0 JI _{Λ Λ} /V-[3-(l, 1-dÍoxidothiomorfolin4-yl)-2-hydroxypropyl]-2,4dimethyl-5-[(2-oxo-1,2dihydro-3//-indol-3 yliden)methyl]-1//-pyrrol-3 karboxamid ι^Ίτ H H ζΥ” Óh/ H =0 Y° 0 38N 0 «Ό /V-[3-(l, 1-dioxidothiomorfolin4-yl)-2-hydroxypropyl]-5-[(5- H TÚ ^M^z L>0 fluor-2-oxo-1,2-dihydro-3//- indol-3 -yliden)methyl]-2,4- F_x H II 0 dimethyl-1//-pyrrol-3 - =0 karboxamid H 39N H 0 tv 5-[(5-chlor-2-oxo- 1,2-dihydro3//-indol-3 -yliden)methyl] -/V[3-(1,1 -dioxidothiomorfolin-4- y yl)-2-hydroxypropyl]-2,4- Ck VzíY'' H 0 dimethyl-1//-pyrrol-3 - Tf/ t=0 karboxamid H 40N hj 0 Jrí Xko 5-[(5-brom-2-oxo-1,2-dihydro3//-indol-3 -yliden)methyl] -N[3-(1,1 -dioxidothiomorfolin-4- OH k yl)-2-hydroxypropyl]-2,4- Br. H 0 dimethyl-1 //-pyrrol-3 - |T \ =0 karboxamid H 47N 0 M [2-hydroxy-3- 'νλχ Y óh ([l,2,3]triazolo[4,5-Z»]pyridin- H JT> H O 3-yloxy)-propyl]-amid kyseliny 5 -(5-fluor-2-oxo-1,2-dihydro- F_v indol-3 -ylidenmethyl)-2,4- |T \ fc=0 dimethyl-1 //-pyrrol-3 - H karboxylové 48N 0 M [2-hydroxy-3- .^H ÓH ([ 1,2,3]triazolo[4,5-Z»]pyridin- H jfl H O 3-yloxy)-propyl]-amid kyseliny 5-(5-chlor-2-oxo-1,2-dihydro- Ck indol-3 -ylidenmethyl)-2,4- 'v^ ÍT ^x >=0 dimethyl- l//-pyrrol-3 - l{ / /<N^Z H karboxylové

« *

4 9 9 4 9 «

9 9 9 9 4 9- 9 ♦ 4 9 • · 9

9 9 9 9

9 99994

99 9·«~· ·« «4-9 «» 4

162

49N fY 0 Ύ [2-hydroxy-3- ([l,2,3]triazolo[4,5-b]pyridin3-yloxy)-propyl]-amid kyseliny 2,4-dimethyl-5-(2-oxo-5trifluormethoxy-1,2-dihydroindol-3 -ylidenmethyl)- ΪΗpyrrol-3 -karboxylové H iu H JO H =0 Y¹ OH 50N 0 0- [2-hydroxy-3 -(3 -oxy- H=m benzotriazol-1 -yl)-propyl] - H ty n? rii amid kyseliny 5-(5-fluor-2oxo-1,2-dihydro-indol-3 - ^N^Z H =0 U¹ ylidenmethyl)-2,4-dimethyl- F_x l/7-pyrrol-3 -karboxylové -N H 51N 0 σ 1 [2-hydroxy-3 -(3 -oxy- benzotriazol-1 -yl)-propyl]- H ty ,^H OH rS amid kyseliny 5-(5-chlor-2oxo-1,2-dihydro-indol-3 - CL ^N^z kj ylidenmethyl)-2,4-dimethyl- Ύίι H =0 1 Zř-pyrrol-3 -karboxylové M -K H 52N O σ [2-hydroxy-3 -(3 -oxy- benzotriazol-1 -yl)-propyl] - F_s >F H Syyn Y OH Y) amid kyseliny 2,4-dimethyl-5(2-oxo-5-trifluormethoxy-1,2- A ^N^z H —O u dihydro-indol-3 -ylidenmethyl)- lí> l//-pyrrol-3 -karboxylové H

4. Sloučenina nebo sůl podle nároku 3 vyznačující se tím, že se 'sloučenina vybere ze skupiny sestávající z:

Sl. v c. Struktura Název 1S 0 YYů“· '-Ύ Οπ₃ H (3-diethylamino-2hydroxypropyl)-amid kyseliny 5 -(5 -fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3 -(32)-ylidenmethyl)-2,4dimethyl-1 ůT-pyrrol-3 karboxylové

•· ·· ·· « ·

9 · · * » · ♦ · « · ·

9 * · · · ♦ « · · » • « » · · » « · · · ·« · ·

Φ· ··<· «· ·<« «· 9163

2S 0 ^ΗΡ ΑΓΑ&Λ O> TXp H (2-hydroxy-3 -morfolin-4-ylpropyl)-amid kyseliny 5-[5fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol(3 Z)-ylidenmethyl] -2,4dimethyl- 177-pyrrol-3 karboxylové 3S 0 ^HaC AA P^tPcH°^H M> oP H (2-hydroxy-3 -morfolin-4-ylpropyl)-amid kyseliny 2,4dimethyl-5-[2-oxo-1,2-dihydro- indol-(3Z)-ylidenmethyl]-l/ípyrrol-3 -karboxylové 4S GpGG TtP H (2-hydroxy-3 -morfolin-4-ylpropyl)-amid kyseliny 5-[5chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol(3Z)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl- l/f-pyrrol-3karboxylové 5S GpGO “Op H (2-hydroxy-3-morfolin-4-ylpropyl)-amid kyseliny 5-[5brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol(32)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl- 177-pyrrol-3 karboxylové 6S 0 ^h3^C J/ ΡΡί,ΟΗ N=N //W ^CH3 oP H (2-hydroxy-3 -[ 1,2,3]triazol-1 yl-propyl)-amid kyseliny 2,4dimethyl-5-[2-oxo-1,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmethyl]- 1Hpyrrol-3 -karboxylové 7S 0 ^hp pta /P-P-CHp ”=* ^FYn=o^H H (2-hydroxy-3 -[ l,2,3]triazol-1 yl-propyl)-amid kyseliny 5-[5fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol(3Z)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl- 177-pyrrol-3 karboxylové

164

9» 9 ·♦ · • <9 <· · «φ

9 9 9 9 · · · • 9 9 · 99 9 99 99 • 9 99» » » *

8S X 0 ^HaC Yv AT ^4_k,X-CH^^H N=N z/π ^uri3 A H (2-hydroxy-3-[l,2,3]triazol-lyl-propyl)-amid kyseliny 5-[5chlor-2-oxo-l,2-dihydro-Índol(3Z)-ylidenmethyl]-2,4dimethyl- l/Z-pyrrol-3 karboxylové 9S 0 ^HaC γ-Α^ΛίΑ _/ΓΛ_Νζ^'ΟΗ₃θ^Η (2-hydroxy-3 -[ 1,2,3]triazol-1 yl-propyl)-amid kyseliny 5-[5brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol- (3Z)-ylidenmethyl]-2,4- ^Η dimethyl- l/Z-pyrrol-3 - ζ/θ Η karboxylové 11S A ů (3Z)-3 - {[4-({ [3 -(diethylamino)- cu χχχ //Ν^ζ 2-hydroxy- propyl]amino}karbonyl)-5methyl-3 -fenyl- l/Z-pyrrol-2- ^Η yl]methylen} -2-oxo-JV-fenyl- H Γ L/=o 2,3 -dihydro-1 ZZ-indol-5 - Η karboxamid 12S A ů (3Z)-3-{ [4-({ [3-(diethylamino)- ζΧ^ν^ζ 2-hydroxy- propyl]amino}karbonyl)-5- 0 methyl-3 -fenyl- l/Z-pyrrol-2- yl]methylen} -yV-methyl-2-oxo- ΊΓ?=ο 2,3-dihydro- 1/Z-indol-5 - ^H k Αν Η karboxamid 13S A ů (3Z)-3 - {[4-({ [3 -(diethylamino)- 0 Xxc /1 'Ίν 2-hydroxy- propyl]amino) karbonyl)-5methyl-3 -fenyl- l/Z-pyrrol-2- ΧΑ-Λ ^Η yl]methylen} -N-(2- H |Γ>ο hydroxyethyl)-2-oxo-2,3 - aJm/ dihydro-1 /Z-indol-5- Η karboxamid 14S Ύϊ ? Χχ< ΖΤ^Χ'Μ^/ N-[3 -(diethylamino)-2hydroxypropyl]-4-(4- 0 fluorfenyl)-2-methyl-5 - { (Z)- [5 (morfolin-4-ylkarbonyl)-2-oxo- r/frto^H 1,2-dihydro-3/Z-indol-3 yliden]methyl} - l/Z-pyrrol-3 - Ω > X S. Η karboxamid

165 * · ♦ »·«· 4 a *• · a a a a a a a aa a ·

15S 0 ^nA H ^Fn 0 (32)-3-( [4-({ [3-(diethylamino)2-hydroxy- propyl] amino} karbonyl)-3 -(4fluorfenyl)-5-methyl- 1Hpyrrol-2-yl]methylen) -N- isopropyl-2-oxo-2,3 -dihydrol/ř-indol-5-karboxamid u Fx ^VN^Z H =0 STC X H 16S F X' c ) (3Z)-3-{[4-({ [3-(diethylamino)- X ji_J. Yc 2-hydroxy- propyljamino } karbonyl)-3 -(2,4- cv H 0 difluorfenyl)-5-methyl- 1H- ΥΥ H pyrrol-2-yl]methylen} -2-oxo- =O jV-fenyl-2,3-dihydro- 1/7-indol- Xx- w H 5-karboxamid 17S O (32)-3 - {[4-({ [3 -(diethylamino)- 1 Y?c 2-hydroxy- O X, propyl] amino }karbonyl)-3 -(2,4difluorfenyl)-5 -methyl- ÍH- ^HCV\k, /\zz ' H pyrrol-2-ylJmethylen} -N-(2- ^VXN H /· Ό >=o hydroxyethyl)-2-oxo-2,3 - X H dihydro-1 //-indol-5 - karboxamid 18S Νγγ- _s c ) (3Z)-3 - {[3 -(4-kyanofenyl)-4- LJ 5ηχ ({[3 -(diethylamino)-2-hydroxy- Yx χχ propyl]amino}karbonyl)-5- O Χχ methyl- l/7-pyrrol-2- Ύ H yljmethylen} -/V,/V-dimethyl-2- O =0 oxo-2,3 -dihydro-1 //-indol-5 - Υχ H karboxamid 19S O 4-(4-kyanofenyl)-/V- [3 - rX] xc (diethylamino)-2- XX Γχ hydroxypropyl]-2-methyl-5 - 0 {(Z)-[5-(morfolin-4- \x<X\. H ylkarbonyl)-2-oxo-1,2-dihydro- O o =0 3/7-indol-3 -ylidenjmethyl} - ÍH- XX H pyrrol-3 -karboxamid 20S Cl X' 0 (3 2)-3 - {[3 -(4-chlorfenyl)-4- llx Y ({[3-(diethylamino)-2-hydroxy- Yíi 9 Xx jn '^N^/ H propyljamino} karbonyl)-5methyl- l//-pyrrol-2- H yljmethylen} -2-oxo-A^r-fenyl- i =0 2,3 -dihydro- l/7-indol-5 - H karboxamid

166 • · « · * ·

9 ♦ 99 9 · 9

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 99 9 9999 • * · 9 9 9

9 9 9 9 9 99 9

21S Ck ° ΜγμΧ< (32)-3-( [3-(4-chlorfenyl)-4({[3 -(ďiethylamino)-2-hydroxy- propyl] amino} karbonyl)-5 - o yý^xN^/ methyl-1 //-pyrrol-2- Λ ^H yl]methylen}-7V-isopropyl-2- H >=o óxo-2,3 -dihydro- l//-indol-5 - ^N⁷ H karboxamid 22S JLs/xĎ 5-[(2)-(5-fluor-2-oxo-l,2- dihydro-3//-indo 1-3 - z/ yliden)methyl] -N- [2-hydroxy3-(2//-tetrazol-2-yl)propyl]-2,4- E / dimethyl-1//-pyrrol-3 - =0 karboxamid Té H 23 S JLj6 5-[(Z)-(5 -chlor-2-oxo-1,2- dihydro-3//-indol-3 - yliden)methyl]-2V-[2-hydroxy- 3-(2//-tetrazol-2-yl)propyl]-2,4- Cl. ů dimethyl- l//-pyrrol-3 - ΪΙ ' fc=O karboxamid v Tn^/ H 24S Teď JV-[2-hydroxy-3 -(2//-tetrazol-2- yI)propyl]-2,4-dimethyl-5- _^FX^F ΤΟΤΓ /^XN^/ H ((2)-[2-oxo-5- (trifluormethoxy)-1,2-dihydro- r · 3//-indol-3 -yliden]methyl} -177- >=0 pyrrol-3 -karboxamid ^x X-N⁷ H 25S A Λ XÚOX T^Z H 5-[(2)-(5-fluor-2-oxo-1,2dihydro-3//-indol-3 yliden)methyl]-jV-[2-hydroxy3 -(l//-tetrazol-1 -yl)propyl]-2,4- E dimethyl- l//-pyrrol-3 - E\ =0 karboxamid H 26S ! Λ '^N^/ H 5-[(2)-(5-chlor-2-oxo-1,2dihydro-3//-indol-3 yliden)methyl]-2V-[2-hydroxy3-(l//-tetrazol-1 -yl)propyl]-2,4- CL dimethyl-l//-pyrrol-3 - =0 karboxamid k_N/ H

167 ·· ♦· · · « ·· ♦ · ♦ ♦· · · »

9* * · · * «··* ♦ » «>«· » » · * ···♦ ·* ···· ·· ·«· ·· ·

27S _Fy X _rXv«> P H jV-[2-hydroxy-3 -(177-tetrazol-1 yl)propyl]-2,4-dimethyl-5{(Z)-[2-oxo-5- (trifluormethoxy)-1,2-dihydro37/-indol-3 -ylidenjmethyl} -1/7pyrrol-3 -karboxamid 28S ý H >0 N-{3-[(2R,6S)-2,6dimethylmorfolin-4-yl]-2hydroxypropyl}-5-[(Z)-(5fluor-2-oxo-1,2-dihydro-3/7indol-3 -yliden)methyl]-2,4dimethyl- 177-pyrrol-3 karboxamid 29S X d H ΡΡ«ύ X ^v 5-[(Z)-(5-chlor-2-oxo-l,2dihydro-3/ř-indol-3 yli den) methyl]-?/- {3 -[(27?,65)2,6-dimethylmorfolin-4-yl] -2hydroxypropyl} -2,4-dimethyll/7-pyrrol-3 -karboxamid 30S fV^F Xj 0 χ=° 7V-{3-[(27?,65)-2,6dimethylmorfolin-4-yl]-2hydroxypropyl} -2,4-dimethyl5-{(Z)-[2-oxo-5(trifluormethoxy)-1,2-dihydro3/7-indol-3 -yliden]methyl} -1/7- pyrrol-3 -karboxamid 31S ^fyy XX N⁷ H 0 Ό jpn/p =0 5-[(Z)-(5-fluor-2-oxo-l,2dihydro-3/7-indol-3 yliden)methyl]-#-[(27?)-2hydroxy-3 -(3 -methyl-2,5 dioxoimidazolidin-1 -yl)propyl]2,4-dimethyl-l/7-pyrrol-3karboxamid 32S ^cVi J -N^Z H Xxp >=0 5-[(Z)-(5-chlor-2-oxo-l ,2dihydro-3Z7-indol-3 yliden)methyl]-jV-[(2/?)-2hydroxy-3 -(3 -methyl-2,5 dioxoimidazolidin-1 -yl)propyl] 2,4-dimethyl- l/7-pyrrol-3 karboxamid

168 • 9 • · 9 • 9994

33S 0 0 JJ p- TV-[(2T?)-2-hydroxy-3 -(3 methyl-2,5 -dioxoimidazolidinl-yl)propylJ-2,4-dimethyl-5{(Z)-[2-oxo-5- (trifluormethoxy)-1,2-dihydro3ZZ-indol-3 -ylidenjmethyl} -1/7pyrrol-3 -karboxamid Λ >=0 Y ' Óh x^N^z H 34S 0 0 5-[(Z)-(5-fluor-2-oxo-l,2- ll dihydro-3/7-indol-3 - Tt p- yliden)methyl]-T\7-[(25)-2hydroxy-3 -(3 -methyl-2,5 - F Z ^N^Z č r dioxoimidazolidin-1 -yl)propyl] - Λ 2,4-dimethyl- l/7-pyrrol-3 - -Z H -0 karboxamid 35S 0 0 Λ TV-[(25)-2-hydroxy-3 -(3 - ínc methyl-2,5 -dioxoimidazolidin- F_x .F xs r^N^z H 1_Γ 1 -yl)propyl]-2,4-dimethyl-5{(2)-[2-oxo-5- ΪΓ; 5 (trifluormethoxy)-1,2-dihydro3/7-indol-3 -ylidenjmethyl} -1/7- fc=o H pyrrol-3 -karboxamid 36S 0 0 5-[(2)-(5-chlor-2-oxo-l,2- J ,._.A dihydro-3/7-indol-3 - v d 1 iy N- yliden)methyl]-7V-[(25)-2- OH y—' hydroxy-3-(3 -methyl-2,5 - Ck Č 1 dioxoimidazolidin- l-yl)propylj- ΥΊ =0 2,4-dimethyl- l/7-pyrrol-3 - <n^Z H karboxamid 37S 0 TV-[3-(l, 1-dioxidothiomorfolin- ra x\ 4-yl)-2-hydroxypropyl J-2,4- rt ^N^z H dimethyl-5-[(Z)-(2-oxo-1,2dihydro-3/7-indol-3 yliden)methylj- l/7-pyrrol-3 - =0 karboxamid kJ¹ H 38S to γ TV- [3 -(1,1 -dioxidothiomorfolin4-yl)-2-hydroxypropyl J -5 - [(2)(5 -fluor-2-oxo-1,2-dihy dro-3/7indol-3 -yliden)methyl J -2,4- F^ _// ft dimethyl- l/7-pyrrol-3 - r iT =0 karboxamid ^X^ H

169 • · • · · • ·· ··

39S 0 5-((2)-(5 -chlor-2-oxo-1,2dihydro-37T-indol-3 yliden)methyl] -TV- [3 -(1,1 dioxidothiomorfolin-4-yl)-2hydroxypropyl]-2,4-dimethyl1 T7-pyrrol-3 -karboxamid iý^Q- H 0 =0 M- H 40S Br_x O í H H 0 =0 5-((2)-(5 -brom-2-oxo-1,2dihydro-3/T-indol-3 yliden)methyl]-TV-[3-(l, 1dioxidothiomorfolin-4-yl)-2hydroxypropyl]-2,4-dimethyl1 TT-pyrrol-3 -karboxamid 41S o H 5-[(2)-(5-fluor-2-oxo-l,2dihydro-377-indol-3 yliden)methyl] -N- [(25)-2hydroxy-3-morfolin-4ylpropyl]-2,4-dimethyl- \Hpyrrol-3 -karboxamid 42S F A- JQ K Jko H *=0 5-[(2)-(5-fluor-2-oxo-1,2dihydro-3T7-indol-3 yliden)methyl]-T\T-[(2T?)-2hydroxy-3 -morfolin-4ylpropyl]-2,4-dimethyl- 1Hpyrrol-3 -karboxamid 43 S Cl_x r d H ΫΤΟ -o 5-[(2)-(5-chlor-2-oxo-1,2dihydro-377-indol-3 yliden)methyl]-TV-[(2T?)-2hydroxy-3 -morfolin-4ylpropyl]-2,4-dimethyl- 1Hpyrrol-3 -karboxamid 44S ^Cl\ O H 0 ϊ^η?ο H =0 5-[(2)-(5-chlor-2-oxo-l,2dihydro-3//-indol-3 yliden)methyl] -N- [(20)-2hydroxy-3 -morfolin-4ylpropyl]-2,4-dimethyl- 1TTpyrrol-3 -karboxamid 47S Fs Ό H =0 [2-hydroxy-3- ([l,2,3]triazolo[4,5-Z>]pyridin-3yloxy)-propyll-amid kyseliny 5-(5-(Z)-fluor-2-oxo-1,2dihydro-indol-3 -ylidenmethyl)2,4-dimethyl- lTT-pyrrol-3 karboxylové

4·

170 • ·· · • ·· 4 4 · • 4 4 4 · 4 • 4 · · 4 ·· 44

48S X [2-hydroxy-3- ([l,2,3]triazolo[4,5-ř]pyridin-3yloxy)-propyl]-amid kyseliny 5-(5-(Z)-chlor-2-oxo-1,2dihydro-indol-3 -ylidenmethyl)2,4-dimethyl-1 //-pyrrol-3 karboxylové ú H H =0 ib y 49S ^F\x^F ^F A V Z SV H =0 Mi X [2-hydroxy-3- ([1,2,3 ]triazolo[4,5 -b]pyridin-3 yloxy)-propyl]-amid kyseliny 2,4-(Z)-dimethyl-5-(2-oxo-5trifluormethoxy-1,2-dihydroindol-3 -ylidenmethyl)- 1Hpyrrol-3 -karboxylové 50S Z H o =0 [2-hydroxy-3 -(3 -oxybenzotriazol-1 -yl)-propyl] -amid kyseliny 5-(5-(Z)-fluor-2-oxo- 1,2-dihydro-indol-3 ylidenmethyl)-2,4-dimethyll/7-pyrrol-3 -karboxylové 51S X H 0 X«x‘ H =O 4 U [2-hydroxy-3 -(3 -oxybenzotriazol-1 -yl)-propyl] -amid kyseliny 5-(5-(Z)-chlor-2-oxo- 1,2-dihydro-indol-3 ylidenmethyl)-2,4-dimethyll/Z-pyrrol-3 -karboxylové 52S Ό -N H 0 xín? —O O' X⁺ [2-hydroxy-3 -(3 -oxybenzotriazol-1 -yl)-propyl] -amid kyseliny 2,4-(Z)-dimethyl-5-(2oxo-5-trifluormethoxy-1,2dihydro-indol-3 -ylidenmethyl)l/Z-pyrrol-3 -karboxylové

• · · · · ·

171 • · · · • · ····

5. Sloučenina vzorce (Ia) :

vyznačující se tím, že R¹, R³, R⁴ a R⁵ jsou vodík,

R² je fluor a je umístěn v pozici 5 indolinonového kruhu, Z je morfolin-4-yl,

R⁶ a R⁷ jsou methyl a stereochemická konfigurace na uhlíku *C je (S).
6. Sloučenina vzorce (II):

vyznačující se tím, že

R je vodík nebo alkyl,

R¹ se vybere ze skupiny sestávajíc! z vodíku, skupiny halo, alkyl, haloalkoxy, cykloalkyl, heteroalicyklické, hydroxy, alkoxy, -C(O)R⁸, -NR⁹R¹⁰ a -C (0) NR¹²R¹³,

ΦΦ φφ ΦΦ Φ ΦΦ 9 • Φ Φ · * ΦΦΦ φ «φ φφ Φ Φ Φ · ΦΦΦΦ

Φφ φφφφ ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ • ΦΦ Φ « Φ ΦΦΦ

ΦΦ ΦΦΦΦ «Φ ΦΦΦ ΦΦ Φ

172

R² se vybere ze skupiny sestávající z vodíku, skupiny halo, alkyl, trihalomethyl, hydroxy, alkoxy, kyano, -NR⁹R¹⁰, -NR⁹C(O)R¹⁰, -C(O)R⁸, -S(O)2NR⁹R¹⁰ a -SO2R¹⁴ (kde R¹⁴ je alkyl, aryl, aralkyl, heteroaryl a heteroaralkyl),

R³, R⁴ a R⁵ jsou nezávisle vodík nebo alkyl,

Z je aryl, heteroaryl, hyterocyklus nebo -NR^1SR¹⁶, kde R¹⁵ a R¹⁶ jsou nezávisle vodík nebo alkyl; nebo R¹⁵ a R^ie společně s atomem dusíku, ke kterému se připojují, tvoří heterocykloaminovou skupinu,

R⁶ se vybere ze skupiny sestávající z vodíku nebo alkylu,

R⁷ se vybere ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, arylu, heteroarylu a -G(O)R¹⁷, jak se definuje níže,

R⁸ se vybere ze skupiny sestávající ze skupiny hydroxy, alkoxy a aryloxy,

R⁹ a R¹⁰ se nezávisle vyberou ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, kyanoalkylu, cykloalkylu, arylu a heteroarylu nebo se R⁹ a R¹⁰ spojí, aby vytvořily heterocykloaminovou skupinu,

R¹² a R¹³ se nezávisle vyberou ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, hydroxyalkylu a arylu; nebo R¹² a R¹³společně s atomem dusíku, ke kterému se připojují, tvoří heterocykloaminovou skupinu,

R¹⁷ se vybere ze skupiny sestávající z alkylu, cykloalkylu, arylu, hydroxylu a heteroarylu, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

Sloučenina nebo sůl podle nároku 6 vyznačující tím, že se sloučenina vybere ze skupiny sestávající z:
7.

··

173

Sl. č. Struktura Název 45N _F νςΜχι H (2-hydroxy-3 -morfolin-4-ylpropyl)-methylamid kyseliny 5[5-fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol3 -ylidenmethyl]-2,4-dimethyllZř-pyrrol-3 -karboxylové 45S _F aÁW H ((5)-2-hydroxy-3 -morfolin-4-ylpropyl)-methylamid kyseliny 5((Z)-5-fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-2,4dimethyl-177-pyrrol-3 karboxylové 46S AÁTO txP H ((7?)-2-hydroxy-3 -morfolin-4-ylpropyl)-methylamid kyseliny 5((Z)-5-fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3 -ylidenmethyl)-2,4dimethyl-177-pyrrol-3 karboxylové
8. Farmaceutický přípravek obsahující sloučeninu nebo sůl podle nároků 1, 2, 3, 4, 5, 6 nebo 7 a farmaceuticky přijatelný nosič nebo pomocnou látku.
9. Farmaceutický přípravek obsahující sloučeninu nebo sůl podle nároku 5 a farmaceuticky přijatelný nosič nebo pomocnou látku.
10. Způsob modulace katalytické aktivity proteinkinázy zahrnující uvedení do kontaktu zmíněné proteinkinázy se sloučeninou nebo solí podle kteréhokoli z nároků 1, 3 nebo

6.
11. Způsob podle nároků 10 vyznačující se tím, že zmíněná proteinkináza se vybere ze skupiny receptorové tyrosinkinázy, nereceptorové tyrosinkinázy a serinthreoninkinázy.

·« φ • * · « · · · • · ·· · · · » ·

174
12. Způsob léčení nebo prevence poruchy vztahující se k proteinkináze v organismu vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství farmaceutického přípravku obsahujícího sloučeninu nebo sůl podle kteréhokoli z nároků 1, 3 nebo 6 a farmaceuticky přijatelný nosič nebo pomocnou látku do zmíněného organismu.
13. Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že zmíněná porucha vztahující se k proteinkináze se vybere ze skupiny sestávající z poruchy vztahující se k receptorové tyrosinkináze, z poruchy vztahujícící se k nereceptorové tyrosinkináze a z poruchy vztahující se k serinthreoninkináze.
14. Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že zmíněná porucha vztahující se k proteinkináze se vybere ze skupiny sestávající z poruchy vztahující se k EGFR, z poruchy vztahující se k PDGFR, z poruchy vztahující se k IGFR a z poruchy vztahující se k flk.
15. Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že zmíněná porucha vztahující se k proteinkináze je rakovina, která se vybere ze skupiny sestávající z karcinomu skvamózní buňky, astrocytomu, Kaposiho sarkomu, glioblastomu, rakoviny plic, rakoviny močového měchýře, rakoviny hlavy a krku, melanomu, rakoviny vaječníků, rakoviny prostaty, rakoviny prsníku, malobuněčného plícního nádoru, gliomu, kolorektalní rakoviny, rakoviny močových a pohlavních orgánů a rakoviny gastrointestinálního traktu.
16. Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že zmíněná porucha vztahující se k proteinkináze se vybere ze skupiny sestávající z diabetů, autoimunitní poruchy, hyperproliferační poruchy, restenózy, fibrózy, psoriázy, nemoci von Heppel-Lindau, osteoartritidy, revmatoidní ·« ·· φ • φ · • · · · • · ···· • · ·

175 artritidy, angiogeneze, zánětlivé poruchy, imunologické poruchy a kardiovaskulární poruchy.
17. Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že zmíněnýn organizmem je člověk.