CZ20023234A3

CZ20023234A3 - Léčivo proti diabetu

Info

Publication number: CZ20023234A3
Application number: CZ20023234A
Authority: CZ
Inventors: Hans-Ulrich Demuth; Konrad Glund
Original assignee: Probiodrug Ag
Priority date: 2000-03-31
Filing date: 2001-04-02
Publication date: 2003-01-15
Also published as: HU229042B1; ES2320630T5; EP1283735B2; US20010051646A1; US20020198242A1; BR0109553A; HUP0204459A2; WO2001072290A3; ES2320630T3; US20030008905A1; ZA200206460B; EP2055302A1; ATE419036T1; EP1283735A2; RU2261096C2; CA2400226C; DE60137216D1; AU2001254763A1; HUP0204459A3; CN1420797A

Description

-Spécob zlopčcni óignallzácě~’úSLiůvků slinivky břišní -diabetes mclliLus a 'přeVěhCé dlabe Les mellitusOblast techniky

Předkládaný vynález popisuje způsob terapie zvířat, včetně lidí, která zvyšuje relativní výkonnost produkce inzulínu endogenními pankreatickými β-buňkami prostřednictvím diferenciace pankreatických epitelových buněk na β-buňky produkující inzulín.

Dosavadní stav techniky

Pankreas obsahuje dvě glandulární tkáně, z nichž jedna je souborem buněk, které vytvářejí exokrinní funkci pankreatu, kde tyto exokrinní buňky syntetizují a uvolňují trávící enzymy do střeva; a druhá tkáň vytváří endokrinní funkci pankreatu a tyto buňky syntetizují a uvolňují hormony do cirkulace.

Zásadní význam pro endokrinní funkci pankreatu mají β-buňky. Tyto buňky syntetizují a secernují hormon inzulín. Hormon inzulín má zásadní úlohu v udržování normálních fyziologických koncentrací glukosy. Existují molekuly, které jsou efektory endokrinních buněk pankreatu. Inkretiny jsou příkladem takových molekul. Inkretiny potencují glukosou indukovanou sekreci inzulinu z pankreatu.

Bylo prokázáno, že inkretiny, jako je glukagon-like peptid-1 (7-36) amid (GLP- 1; nebo ještěrčí analog exendin4) a žaludeční inhibiční polypeptid (GIP), jsou inzulinotropní, t.j., jejich přítomnost nebo stabilizace může udržovat akutní kontrolu glykemie prostřednictvím jejich stimulačních účinků na sekreci inzulinu (Demuth, H.U., et al., DE 196 16 486:1-6, 1996; Pauly, R.P. et al., Regul. Pept. 64 • · • · · « ·

·· ·· ·· (1-3): 148, 1996, kde informace v těchto článcích jsou zde zahrnuty jako odkazy ve své úplnosti). Dále bylo prokázáno, že GLP-1 způsobuje - jako růstový hormon pro ostrůvky pankreatu stimulací proliferace β-buněk - zvýšení počtu buněk a navozuje diferenciaci nediferencovaných pankreatických buněk ve specializované buňky Langerhansových ostrůvků. Takové buňky vykazují lepší sekreci inzulínu a glukagonu (Yaekura, K. et al., v: VIP, PACAP, and Related Peptides, W.G. Forssmann a S.I. Said (ed.), New York: New York Academy of Sciences, 1998, str. 445-450; Buteau, J. et al., Diabetologia 42(7): 856-864, 1999, jejichž obsah je zde zahrnut jako odkaz ve své úplnosti).

Již dříve bylo navrženo použít exogenní bioaktivní GLP-1 nebo jeho analogy buď pro stimulaci regenerace buněk ostrůvků in vivo, nebo pro získání pankreatických buněk od pacientů s diabetes mellitus, a také ex vivo ošetření takových buněk v tkáňové kultuře za použití biologicky aktivního GLP-1. Předpokládalo se, že toto ex vivo ošetření usnadní regeneraci a/nebo diferenciaci buněk ostrůvků, které budou moci potom syntetizovat a secernovat inzulín nebo glukagon (Zhou, J. et al., Diabetes, 48(12):2358-2366, 1999; Xu, G. et al.,

Diabetes, 48(12):2270-2276, 1999, jejichž obsah je zde zahrnut jako odkaz ve své úplnosti).

Nicméně takové terapeutické režimy vyžadují enterální nebo parenterální aplikaci biologicky aktivního GLP-1 pacientům, včetně možného chirurgického zákroku. Jedním z cílů je obejít potřebu chirurgického zákroku, enterální nebo parenterální aplikace biologicky aktivního GLP-1.

• · · · · ·

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká nového způsobu, ve kterém redukce aktivity enzymu dipeptidyl-peptidasy (DP IV nebo CD 26) nebo enzymové aktivity podobné DP IV v krvi savce indukovaná efektory enzymu má za kauzální následek redukci degradace gastrointestinálního polypeptidu glukagon-like peptidu amidu-1 7-36 (GLP-1₇..₃₆) (nebo strukturně podobných funkčních analogů tohoto peptidu, jako je GLP-I7-37/ nebo zkrácené, ale biologicky aktivní fragmenty GLP-I7-36) působením DP IV a enzymů podobných DP IV. Taková léčba způsobí redukci nebo oddálení snížení koncentrace funkčně aktivních GLP-1 cirkulujících peptidových hormonů (včetně těch, které jsou odvozeny od GLP-1) nebo jejich analogů.

V důsledku výsledné lepší stability endogenních GLP-1 cirkulujících peptidů (včetně těch, které jsou odvozeny od GLP-1) způsobené inhibici aktivity DP IV je aktivita GLP-1 prodloužena, což vede k tomu, že funkčně aktivní GLP-1 cirkulující peptidové hormony (včetně těch, které jsou odvozeny od GLP-1) usnadňují stimulaci pankreatických buněk podobnou stimulaci růstovými hormony takovým způsobem, že tyto buňky proliferuji ve funkčně aktivní buňky Langerhansových ostrůvků. Navíc mohou být nesensitivní pankreatické buňky nebo narušené pankreatické buňky transformovány na funkčně aktivní buňky, když jsou vystaveny působení GLP-1.

Předpokládalo se, že transformace nesensitivních pankreatických buněk nebo narušených pankreatických buněk na funkčně aktivní buňky Langerhansových ostrůvků povede k zvýšení sekrece inzulínu a ke zvýšení koncentrace inzulínu v plasmě. Překvapivě však v pokusech na zdravých lidských dobrovolnících a na obézních diabetických Zucker krysách se po

léčbě inhibitorem DP IV isoleucyl-thiazolidinhemifumarátem (P32/98) koncentrace inzulinu snížily (viz příklad 1, resp.

2). Nicméně výsledná regenerace Langerhansových ostrůvků mění účinnost endogenního inzulinu a jiných hormonů ostrůvků, jako je glukagon, takovým způsobem, že dojde ke stimulaci metabolismu karbohydrátů u léčeného savce. V důsledku toho koncentrace glukosy v krvi klesá pod koncentraci charakteristickou pro hyperglykemii, jak je dokumentováno v příkladech 1 a 2. Mechanismus spouštějící tyto účinky dosud není podrobně znám. Nicméně takto vzniklá regenerace buněk ostrůvků dále zlepšuje anomálie v metabolismu, včetně glukosurie, hyperlipidemie a těžkých metabolických acidos a diabetes mellitus, tím, že zabraňuje těmto následkům nebo jezmírňuje.

Oproti dalším navrhovaným metodám, známým v oboru, jako je transplantace pankreatických buněk nebo tkáně nebo ex vivo léčba pankreatických buněk GLP-1 nebo exendinem-4, po které následuje reimplantace ošetřených buněk, nevyžaduje předkládaný vynález nákladné a komplikované chirurgické zákroky a poskytuje orální terapii. Předkládaný vynález představuje nový přístup pro snížení zvýšené koncentrace glukosy v krvi. Je komerčně použitelný a vhodný pro použití v terapeutickém režimu, zejména lidských onemocnění, z nichž mnohá jsou způsobena dlouhodobými zvýšenými koncentracemi glukosy v krvi.

Přehled obrázků na výkresech

Vynález je dokreslen na následujících výkresech, kde:

Obr. 1 je grafické znázornění závislosti cirkulujícího biologicky aktivního GLP-1 na čase u člověka (n=36) v závislosti na orálně aplikovaném přípravku inhibitoru DP IVu

P32/98;

Obr. 2 je graf znázorňující závislost AUC cirkulujícího biologicky aktivního GLP-1 u lidí (n=36) na orálně aplikovaném přípravku inhibitoru DP IV P32/98;

Obr. 3 je grafické znázornění ukazující zlepšení ranní koncentrace glukosy (MBG) po subchronické monoterapeutické aplikaci 8,7 mg/kg/d P32/98 obézním, diabetickým fa/fa krysám;

Obr. 4a je grafické znázornění ukazující zlepšení kontroly glukosy při léčbě inhibitorem DP IV po 16 dnech léčby obézních diabetických krys;

Obr. 4b je grafické znázornění ukazující snížení sekrece inzulínu při léčbě inhibitorem DP IV po 16 dnech léčby obézních diabetických krys;

Obr. 5a je grafické znázornění ukazující koncentrace glukosy v krvi v závislosti na čase při udržování lepší glykemie po 21 dnech subchronické terapie obézních, diabetických fa/fa krys přípravkem DP IV-inhibitoru p32/98; a

Obr. 5b je grafické znázornění ukazující plasmatické koncentrace inzulínu v závislosti na čase při udržování lepší glykemie po 21 dnech subchronické terapie obézních, diabetických fa/fa krys přípravkem DP IV-inhibitoru p32/98.

Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález se týká nového způsobu diferenciace a/nebo rekonstituce pankreatických buněk. Výsledná regenerace ·· ·· • · » · · · · ·

Langerhansových buněk pozitivně ovlivní syntézu a uvolňování endogenního inzulinu a jiných hormonů ostrůvků, jako je glukagon, takovým způsobem, že dojde ke stimulaci metabolismu karbohydrátů.

Glukosou-indukovaná sekrece inzulinu je modifikovaná mnoha hormony a neurotransmitery. Zejména významné jsou dva hormony, glukagon-like peptid-1 (GLP1) a žaludeční inhibiční peptid (GIP), které jsou oba inzulinotropními činidly. Inzulinotropní činidla mohou stimulovat nebo způsobovat stimulaci syntézy nebo exprese hormonu inzulinu.

GLP-1 je účinným střevním inzulinotropním činidlem, které zvyšuje sekreci inzulinu a akutně snižuje koncentrace glukosy, včetně koncentrací pozorovaných při diabetů I a II typu. GLP-1 je tvořen alternativním tkáňově-specifickým štěpením v L buňkách střeva, α-buňkách endokrinního pankreatu a v neuronech v mozku. GIP se syntetizuje a uvolňuje z duodena a proximálního jejuna po požití potravy. Jeho uvolňování závisí na mnoha faktorech, včetně obsahu stravy a aktuálního zdravotního stavu. Byl původně objeven a pojmenován pro své inhibiční účinky na žaludeční kyselinu. Nicméně při podrobnějším zkoumání tohoto hormonu byly objeveny jeho významnější fyziologické role. Konkrétně je GIP inzulinotropní činidlo se stimulačním účinkem na syntézu a uvolňování inzulinu.

DP IV je enzym, který je exopeptidasou, která selektivně štěpí peptidy za předposledním N-terminálním prolinem a alaninem. Endogenními substráty tohoto enzymu jsou mimo jiné inkretiny, jako jsou inzulinotropní polypeptidy závislé na glukose, například GIP a GLP-1. Za přítomnosti DP IV jsou tyto hormony enzymaticky redukovány na inaktivní formy. Inaktivní ·· ··

forma GIP a GLP nemůže indukovat sekreci inzulínu, takže dojde ke zvýšení plasmatických koncentrací glukosy, zejména při hyperglykemickém stavu. Zvýšené koncentrace glukosy v krvi mohou být asociovány s mnoha různými patologiemi, včetně diabetes mellitus (typu 1 a 2) a komplikací doprovázejících diabetes mellitus.

Také bylo objeveno, že DP IV má úlohu v T-buněčné imunitní reakci, například při transplantacích. Bylo prokázáno, že inhibice DP IV prodlužuje životnost srdečních allotransplantátů. Dále inhibice DP IV přispívá k supresi revmatoidní artritidy. DP IV se také přisuzuje role při penetraci HIV do T-lymfocytů (T-pomocných lymfocytů).

Byla vyvinuta činidla, jako jsou Ν-(Ν'-substituovaný glycyl)—2-kyanpyrrolidiny, L-threo-isoleucylthiazolidin (P32/98), L-allo-isoleucylthiazolidin, L-threoisoleucylpyrrolidin a L-allo-isoleucylpyrrolidin, inhibují enzymatickou aktivitu DP IV, a tato činidla jsou popsána v US 6 001 155, WO 99/61431, WO 99/67278, WO 99/67279, DE 19834591, WO 97/40832, DE 19616486C2, WO 98/19998, WO 00/07617, WO 99/38501 a WO 99/46272, které jsou zde zahrnuty jako odkazy ve své úplnosti. Cílem těchto činidel je inhibovat DP IV a tím snižovat koncentraci glukosy v krvi pro účinnou léčbu hyperglykemie a onemocnění spojených se zvýšením koncentrace glukosy v krvi. Jejich vynálezci překvapivě zjistili, že tato činidla mohou být výhodně použita pro zcela jiný terapeutický účel, než byl původně znám odborníkům.

Mezi onemocnění, pro která je charakteristická hyperglykemie, patří například diabetes mellitus typu I a II. Diabetes může být obecně charakterizován jako nedostatek výdeje hormonu β-buňkami pankreatu. Normálně tyto buňky • · »· · · « ♦ · • · • · syntetizují a secernují hormon inzulín. Při diabetů typu I je tato insuficience způsobena destrukcí β-buněk autoimunitním procesem. Diabetes II. typu je primárně způsoben kombinací deficience β-buněk a periferní resistence na inzulín. U pacientů s diabetem je počet β-buněk redukován, takže se nejedná pouze o poruchu schopnosti β-buněk syntetizovat a uvolňovat fyziologický inzulín, ale též o problém kritické hmoty pankreatických buněk produkujících inzulín. Je známo, že při diabetů dochází ke ztrátě β-buněk. Při ztrátě těchto buněk dochází k poruše endokrinní funkce pankreatu, například v produkci inzulínu. Při nižším výdeji inzulínu se mohou zvýraznit patologické procesy způsobené hyperglykemií.

GLP-1 působí jako růstový hormon ostrůvků tím, že stimuluje proliferaci β buněk, zvýšení hmoty buněk a podporuje diferenciaci nediferencovaných pankreatických buněk na specializované buňky Langerhansových ostrůvků. Takovéto pankreatické buňky vystavené působení GLP-1 vykazují lepší sekreci inzulínu a glukagonu (Yaekura, K. et al., v: VIP, PACAP, and Related Peptides, W.G. Forssmann a S.I. Said (ed.), New York: New York Academy of Sciences, 1998, str. 445-450; Buteau, J. et al., Diabetologia 42(7): 856-864, 1999). Předkladatelé vynálezu objevili, že je žádoucí zvýšit poločas GLP-1, což usnadní rekonstituci β-buněk pankreatu.

Předkladatelé vynálezu také objevili způsob, kterým může být snížen katabolismus GLP1, což usnadní rekonstituci β-buněk pankreatu.

Způsob podle předkládaného vynálezu pro léčbu hyperglykemie u savce, včetně, avšak nikoli výlučně, lidí, zahrnuje potenciaci přítomnosti GLP-1 inhibici aktivit DP IV nebo příbuzných enzymů, za použití inhibitoru enzymu. Ve

• · většině případů může být výhodné orální podání inhibitoru DP IV. Nicméně vynález předpokládá jiné způsoby podání. Inhibici aktivity DP IV enzymu se významně prodlouží poločas aktivní formy GLP-1 a udržuje se za fyziologických podmínek.

Prodloužená přítomnost aktivního GLP-1, zejména v pankreatické tkáni, usnadní diferenciaci pankreatických epiteliálních buněk na pankreatické efektorové buňky, jako jsou β-buňky produkující inzulín. Prodloužení aktivní přítomnosti GLP-1 v pankreatické tkáni navíc usnadní regeneraci těch β-buněk, které jsou již přítomné, ale potřebují reparaci. Překvapivě je tento efekt pozorovatelný pouze po opakovaných dávkách (viz příklad 2). Protože se po ukončení medikace obnoví metabolický stav před léčbou, je zapotřebí subchronické nebo chronické podávání DP IV efektoru pro udržení zlepšené glykemie. Tyto reparované buňky produkující inzulín mohou potom účinně přispívat ke korekci a udržování normálních fyziologických hladin glykemie.

V předkládaném vynálezu se endogenní GLP-1 syntetizuje a uvolňuje normálním fyziologickým způsobem. Příjem potravy může stimulovat uvolnění GLP-1. Alternativně může být pro stimulaci uvolňování endogenního GLP-1 podávána orálně ve formě farmaceuticky přijatelného nosiče glukosa nebo její analog (například ve formě sacharidové pilulky). Taková glukosa může být podávána před podáním inhibitoru DP IV, současně s ním nebo po něm.

Předkládaný vynález také poskytuje farmaceutické prostředky. Takové prostředky obsahují terapeuticky (nebo profylakticky) účinné množství inhibitoru (a/nebo sacharidové tablety pro podání současně s inhibitorem DP IV) a farmaceuticky přijatelný nosič nebo přísadu. Nosič a prostředek jsou produkovány za standardních laboratorních podmínek a jsou sterilní. Prostředek je vyroben pro určitý • ·

způsob podání v souladu s běžnou praxí.

Mezi vhodné farmaceuticky přijatelné nosiče patří například voda, roztoky solí (například NaCl), alkoholy, arabská klovatina, rostlinné oleje, benzylalkoholy, polyethylenglykoly, želatina, karbohydráty, jako je laktosa, amylosa nebo škrob, magnesium-stearát, talek, viskózní parafin, aromatické oleje, estery mastných kyselin, hydroxymethylcelulosa, polyvinylpyrrolidon atd. Farmaceutické přípravky mohou být sterilizovány a podle potřeby mohou být smíšeny s pomocnými činidly, jako jsou například kluzná činidla, konzervační činidla, stabilizační činidla, smáčivá činidla, emulgační činidla, soli ovlivňující osmotický tlak, pufry, barviva, chuťová korigens a/nebo aromatické substance a podobně, které nereagují nežádoucím způsobem s aktivními sloučeninami, ale které zlepšují stabilitu, zpracovatelnost a/nebo estetický vzhled.

Prostředky mohou, pokud je to vhodné, také obsahovat malá množství smáčivých nebo emulgačních činidel nebo činidel pro pufrování pH. Kromě toho může být prostředek ve formě kapalného roztoku, emulze, tablety, pilulky, kapsle, prostředku s řízeným uvolňováním nebo prášku. Dále může být prostředek ve formě čípku, ve kterém jsou použity tradiční pojivá a nosiče, jako jsou triglyceridy. Orální prostředky mohou obsahovat standardní nosiče, jako jsou farmaceutické přípravky manitolu, laktosy, škrobu, magnesium-stearátu, polyvinylpyrolidonu, sacharinu sodného, celulosy, uhličitanu horečnatého a podobně.

Dále mohou být prostředky připraveny za použití standardních metod pro intravenosní podání člověku. Obvykle jsou prostředky pro intravenosní podání sterilní isotonické • 4 44 > 4 4

4 4 4 4 ·

vodné pufrované roztoky. Pokud je to nutné, obsahují prostředky solubilizační činidla a lokální anestetika pro zmírnění bolesti v místě injekce. Obecně jsou složky dodány buď samostatně, nebo dohromady ve formě dávkové jednotky, například ve formě suchého lyofilizovaného prášku nebo ve formě koncentrátu v hermeticky uzavřeném zásobníku, jako je ampule nebo sáček, na kterém je vyznačeno množství aktivní sloučeniny. Má-li být prostředek podán infusí, může být uložen v infusním vaku obsahujícím sterilní farmaceutickou vodu, salinický roztok nebo dextrosu/vodu. Má-li být prostředek podán injekčně, může obsahovat ampuli sterilní vody pro injekce nebo fyziologického roztoku, aby mohly být složky smíšeny bezprostředně před podáním.

Konečně, prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny v neutrální formě nebo ve formě soli. Mezi farmaceuticky přijatelné soli patří soli tvořené s volnými aminoskupinami, jako jsou soli odvozené od kyseliny chlorovodíkové, fosforečné, octové, vinné, šťavelové atd., a soli sodíku, draslíku, amoniaku, vápníku, hydroxidů železa, isopropylaminu, triethylaminu, 2-ethylaminoethanolu, histidinu, prokainu, a jiné soli dobře známé v oboru.

Množství prostředku podle předkládaného vynálezu, které bude účinné v léčbě konkrétního onemocnění nebo stavu, bude záviset na typu onemocnění nebo stavu, a může být určeno standardními klinickými technikami. Dále mohou být pro stanovení optimálních dávek použity testy in vitro a/nebo in vivo. Přesná dávka použitá v prostředku také závisí na způsobu podání a na závažnosti onemocnění nebo stavu. Dávka by měla být určena ošetřujícím lékařem pro každého pacienta.

Odborníkům v oboru bude jasné, že existují různé varianty • 999 9 « « 9 9

popsaných provedení, včetně různých inhibitorů DP IV a alternativních terapeutických kombinací. Tyto varianty spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Následující příklady neomezují rozsah předkládaného vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

DP IV-inhibitor P32/98 je aktivně transportován prostřednictvím PepTl intestinálního peptidového transportéru. Rychlý a aktivní transport P32/98 přes sliznici střeva je odpovědný za rychlý nástup účinku. T_max je určující pro účinné působení na dipetidylpeptidasu IV (DP IV). Orální podání P32/98 vede k maximální cílové inhibici 15 až 20 min, resp. 30 až 40 min po požití u krys, resp. lidí. Proto by měl být DP IV-inhibitor podán 10 až 20 minut před požitím glukosy nebo potravy.

V první studii na člověku s P32/98 se zkoumaly farmakodynamické parametry, jako je koncentrace inzulínu a GLP-1 v plasmě a koncentrace glukosy v krvi na 36 zdravých dobrovolnících mužského pohlaví. Orálně byl P32/98 podán v následujících koncentracích: 7,5 mg, 15 mg, 30 mg, 60 mg,

120 mg a 240 mg. Výsledky uvedených farmakodynamických testů jsou uvedeny v následující tabulce 1.

zdravých dobrovolníků mužského pohlaví bylo rozděleno do 3 skupin po 12 jedincích. V každé skupině bylo 9 jedincům podáno aktivní činidlo P32/98 a 3 bylo podáno placebo.

Jedincům, kterým byla podána aktivní substance, byly podány dvě dávky, v různou dobu a různém množství. Dávky P32/98 podávané ve skupinách byly následující: skupina I - 7,5 mg a ··.φ φφ • Φ ··

• Φ ·· • φ φ φ · ♦ φφφ φ φφφ φφ φφφφ mg; skupina II - 15 mg a 120 mg; a skupina III - 30 mg a 240 mg. Jedincům v placebo skupinách bylo podáno placebo v obou dávkách.

Vyšetření jedinců před testem bylo provedeno během 3-14 dnů před jejich zařazením do studie. Druhá část studie se sestávala z experimentální fáze a zahrnovala 6 jednotlivých dávek se zvyšující se koncentrací P32/98 (periody 1 až 6; tabulka 2) a byla uzavřena konečným vyšetřením. Každý jedinec se účastnil pre-testovací a experimentální fáze, které byly odděleny alespoň 5 dny. Vyšetření po testu bylo provedeno do 7 dnů po poslední dávce testovaného léku. Postupy v 6 periodách byly stejné, s výjimkou testované dávky.

Metody

Orální glukosový toleranční test (OGTT) : Jedinci se nechali lačnit alespoň 12 hodin a 3 dny před každým OGTT měli dietu bohatou na karbohydráty. Při každém glukosovém tolerančním testu se jedincům podalo 300 ml roztoku mono/disacharidů ekvivalentních 75 g glukosy (Dextro® O.G.T., Boehringer Mannheim, FRG). Vzorky krve (1,2 ml do zkumavky s fluoridem sodným) se odebraly bezprostředně před podáním glukosy a za 30, 60, 90 a 120 minut potom. Jakákoliv koncentrace glukosy vyšší než 126 mg/dl (7,0 mmol/1) v minutách 0 a 120 se považovala za patologickou glukosovou toleranci.

Prodloužený OGTT se provedl v den 1 každé dávkovači periody. Jedincům se podalo 300 ml roztoku mono/disacharidů ekvivalentních 75 g glukosy. Vzorky krve (1,2 ml) se odebíraly v následujících intervalech: 1) 5 minut před požitím glukosy; za 5, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150 a 180 minut po požití glukosy; 3) za 4, 12, 24 a 48 hodin po požití glukosy. Byla • ·

9 9

9» 9· 9 * • 9

9 provedena další hodnocení farmakodynamiky, která jsou dobře známá v oboru.

Insulin: 4,7 ml krve se odebralo do 4,9 ml EDTA-zkumavek. Vzorky se odstředily (1500 g, 10 min.) a uskladnily se při -70 °C do laboratorní analýzy.

Glukosa: 1,2 ml krve se odebralo do 1,2 ml zkumavek s fluoridem sodným. Vzorky plasmy se odstředily (1500 g, 10 min.) a uskladnily se při -70 °C do laboratorní analýzy.

GLP-1: 2,7 ml krve se odebralo do EDTA zkumavek a ty se umístily na led nebo se do lednice a do zkumavek se přidal inhibitor dipeptidyl peptidasy IV. Inhibitor se připravil napřed. Krev se odebrala do zkumavek a ihned se odstředila při lOOOg během 10 min v chlazené odstředivce nebo se krev vnesla na led a odstředila se během 1 hodiny a rozdělila se do stejných podílů. Krev se uskladnila ve vhodných podílech při —70°C (aby se zabránilo opakovanému mrazení/tání) do laboratorní analýzy.

Výsledky

Koncentrace aktivního GLP-1: Byl zjištěn efekt P32/98 ve srovnání s placebem, který by závislý na dávce. Celkové jednotlivé koncentrace byly v rozmezí mezi 2 a 68 pmol/1. Průměry pro skupiny před aplikací byly 3,77 - 2,62 pmol/1 a 6,67 ± 9,43 pmol/1 a zvýšily se na 4,22 a 7,66 pmol/1 po podání placeba, ale na 11,6 pmol/1 (15 mg) a 15,99 pmol/1 (240 mg P32/98) po podání inhibitoru. Když je relativní průměrné zvýšení počítáno z absolutních koncentrací, tak se koncentrace aktivního GLP-1 zvýšily přibližně o 200-300% po placebu, ale o přibližně 300-400% po podání P32/98. Absolutní zvýšení to· ···· • tototo toto • to toto • · to·· · ··· · to v mediánech po 15-240 mg P32/98 bylo 2-3-krát vyšší při srovnání placeba a 7,5-mg dávky (viz tabulka 1) a ukazuje na závislost na dávce. Zvýšení nad hodnoty před aplikací se objevilo za přibližně 3-4 hodiny po dávce P32/98.

Koncentrace insulinu vykazovaly celkové individuální rozpětí hodnot mezi 3,40 a 155,1 μΐυ/ml. Průměrné (±SD) koncentrace před dávkou byly mezi 7,96 ± 1,92 μΐϋ/ml (30 mg) a 11,93 ± 2,91 μΐυ/ml (60 mg P32/98). Po požití 75 g glukosy za 10 min. po podání P32/98/placeba se průměrné koncentrace inzulínu zvýšily o 30,12 μΐυ/ml (120 mg P32/98) na 56,92 μΐυ/ml (30-mg skupina) během 40-55 min. Nebyl jasný rozdíl mezi placebem a P32/98 a opět nebyla patrná závislost P32/98 na dávce. Zajímavé je, že absolutní zvýšení koncentrace inzulínu bylo nejnižší při dvou nejvyšších dávkách P32/98 (viz tabulka 1). Koncentrace inzulínu byly zvýšeny po dobu 3-4 hodin ve všech skupinách včetně placeba.

Koncentrace glukosy byly mezi 2,47 a 11,7 mmol/1 na lačno, během OGGT nebo po jídle u všech testovaných jedinců. Průměrné koncentrace před dávkami byly mezi 4,55 ± 0,41 (15 mg) a '4,83 ± 0,30 mmol/1 (7,5 mg P32/98) s minimálními variacemi. Průměrné maximální koncentrace byly dosaženy během 40-55 minut po podání, tj. během 30-45 minut po podání 75 g glukosy.

Absolutní průměrné koncentrace byly nejvyšší ve dvou placebových a 7,5 mg P32/98 skupinách. Nejnižší absolutní koncentrace byly získány od skupiny s 15 mg, 60 mg a 240 mg. Příslušné průměrné změny byly v rozmezí od 3,44 do 4,21 mmol/1, resp. 1,71 až 3,41 mmol/1, a odpovídaly dobře mediánům uvedeným v tabulce 1. Ačkoliv nebyla pozorována perfektní závislost na dávce, ukazují tyto výsledky snižující se koncentraci glukosy se zvyšujícími se dávkami P32/98 (15-240 mg) ve srovnání s placebem.

♦ · · · *

4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 9 4

4 144 4 14 ·

4 4 4 4 4 «· Φ · 4444 • · « • φ · • 1 » • « · ·· ··

Tabulka 1: Maximální změny ve farmakodynamických parametrech (0-12 hodin, mediány)

	Placebo (1-3)	7.5mg P32/98	15mg P32/98	30mg P32/98	Placebo (4-6)	60mg P32/98	120mg P32/98	240mg P32/98
GLP-1,; aktivn	3.90	4.10	10.00	10.60	5.30	12.20	11.10	14.50
[pmol/1]	0:25h	l:10h	0:25h	0:40h	0:40	0:25h	0:25h	0:25h
insulin	46.29	41.86	29.67	59.84	42.90	43.35	28.63	33.36
[μΤυ/ml]	O:55h	0:55h	0:55h	0:40h	0:40h	0:40h	0:40h	0:40h
glukosa.	3.43	4.66	2.43	3.38	5.33	2.92	2.39	1.73
[mmol/1]	0:55h	0:55h	0:55h	0:40h	0:55h	0:40h	0:40h	0:40h

Tabulka 2: Korigované Cmax a AUC pro koncentrace glukosy 0-3 hodiny po OGTT

	AUC₀_>i80min [mmol*min/l]	C_B1I [mmol]
	průměr ±SD hodnoceni	95%-CI	¹prům6r±SD	hodnocení	95%-CI
: Periody 1-3
Placebo	223.9 ±143.3			4.16 ±1.10
7.5mg P32/98	299.7 ±111.4	75.8	-48.1- 199.7	4.94 ±1.58	0.78	-0.40- 1.96
15mgP32/98	130.9 ±125.2	-93.0	-216.9- 30.9	2.92 ±1.10	-1.24*	-2.43--0.06
30mg P32/98	116.1 ±134.0	-107.7	-231.6- 16.2	3.26 ±1.07	-0.90	-2.08 - 0.28
Periody 4-6
Placebo	252.9 ±103.3			4.91 ±1.14
60mg P32/98	151.8 ± 99.2	-101.1	-204.8- 2.6	3.50 ±1.66	-1.41*	-2.66--0.17
120mgP32/98	126.7 ±147.3	-126-1*	-229.8- -22.4	3.09 ±1.47	-1.82**	-3.07--0.58
240mgP32/98	24.7 ± 66.6	-228.2***	-331.8--124-5	1.99 ±0.69	-2.92***	-4.16--1.68

¹ Výsledky z ANOVA srovnání versus placebo * p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001

4*00 *« 0« ·· 0* 00 ·« 0 0 0 t » 0 · · • · 0 0 0 0 0 · · · • · > ň 0 · 004 ♦ · · · • 000 ·0 fe 040

0 0 00 «0 »0 0*40

Průměrné píkové koncentrace glukosy korigované k základní hodnotě (C_max) přesahovaly 4,0 mmol/1 ve dvou placebových a 7,5 mg pouze ve dvou P32/98 skupinách. Tyto hodnoty byly také pod 3,0 mmol/1 v 15 mg a 240 mg P32/98 skupině. Rozdíl ve srovnání s placebem byl statisticky významný pro 15 mg, 60 mg, 120 mg a 240 mg P32/98, ale ne pro 7,5 mg a 30 mg skupiny. Průměrné hodnoty AUC korigované k základní hodnotě byly >200 mmol*min/l po placebu a 7,5 mg P32/98, ale jasně pod 200 mmol*min/l po dávce 15 mg a 240 mg P32/98. Redukce systémové expozice glukose z OGTT byla statisticky významná pro dávky 15 mg, 60 mg, 120 mg a 240 mg P32/98, ale ne pro dávky 7,5 mg a 30 mg (viz tabulka 2). Hodnocení hodnoty korigovaných k základní hodnotě bylo velmi podobné hodnocení získaného z nekorigovaných dat. Tak data ukazují jasně nižší expozici glukose po OGTT u zdravých jedinců léčených P32/98, což se blíží, ale ne zcela přesně odpovídá závislosti na dávce.

Závěr

Výsledky tohoto testu vedou k následujícím farmakodynamickým závěrům:

Aktivní GLP-1 se zvyšuje o přibližně 300-400% po léčbě P32/98 10 min. před OGTT, ale žádné efekty odlišné od placeba nebyly pozorovány pro dávku 7,5 mg (viz obr. 1 a 2). Koncentrace insulinu se snižovaly při dávkách 120-240 mg po stimulaci 75 g glukosy. Během OGTT na zdravých jedincích se koncentrace glukosy významně méně zvyšovaly po léčbě P32/98 (15-240 mg) ve srovnání s placebem a tento efekt souvisel s dávkou P32/98.

• · · · · · · ·· · ·· ··· · ····> · · • 9 ·· ·· ·· ·· ····

Příklad 2

U obézních Zucker krys podporuje P32/98 nejprve sekreci inzulínu. Nicméně, při subchronické léčbě P32/98 redukuje celkovou denní sekreci inzulínu. Ve srovnání s kontrolním glibenklamidem, který zvyšuje výdej inzulínu o 27%, P32/98 způsobuje ekonomizaci inzulínu tím, že ve srovnání s kontrolou šetří 45%.

Byl provede test toho, zda je P32/98 kandidátem na ovlivnění glukosové tolerance in vivo tím, že zvyšuje cirkulační poločasy incretinů GIP a GLP- 1. Byly provedeny srovnávací testy s glibenklamidem (Maninil® Berlin-Chemie, Berlin, Germany) jako referenční substancí. Glibenklamid je jedním z nejúčinnějšleh léků pro snížení glukosy v krvi při diabetů II. typu a je jedním z nejvíce předepisovaných sulfonylmočovinových léků.

Samci Zucker fa/fa krys, které mají abnormality v glukosovém metabolismu a jsou zavedeným zvířecím modelem pro diabetes II typu, byly zkoumáni následujícím způsobem:

P32/98 a glibenklamid byly aplikovány jednou denně před podáním potravy po dobu 21 dnů. Monitorovanými parametry byly ranní koncentrace glukosy v krvi a plasmatické koncentrace inzulínu. V profilu den/noc byly glykemie a inzulinemie monitorovány od dne 16 do dne 17. OGTT byl proveden v den 21 pro sledování kinetik koncentrace glukosy v krvi a plasmatické koncentrace inzulínu za účelem hodnocení změn v glukosové toleranci. Glibenklamid (DAB 1996; R01 1150/33372) byl darován Berlin-Chemie (Berlin, Germany). Samci Zucker (fa/fa) krys s tělesnou hmotností 300 g byly zakoupeni od Charles River (Sulzfeld, Germany).

00 00 00

Metody

Chov krys: Zvířata byla chována v samostatných boxech za běžných podmínek s kontrolovanou teplotou (22±2 °C) s 12/12 hodinovým cyklem světlo/tma (světlo v 06:00). Standardní pelety (ssniff®, Soest, Germany) a vodovodní voda okyselená HCl byly podávány ad libitum.

Katetrizace karotické arterie: Po 1 týdnu adaptace se krysám implantovaly do karotické arterie katetry, což bylo provedeno v celkové anestesii (injekce 0,25 mi/kg i.p. Rompun® [2%], Bayer, Germany) a 0,5 ml/kg i.p. Velonarkon® (Arzneimittelwerk Dresden, Germany). Zvířata se nechala 1 týden zotavovat. Katetry se proplachovaly heparinem-salinickým roztokem (100 IU/ml) třikrát týdně.

Opakované dávkování: 30 samců non-diabetických Wistar a 30 samců diabetických Zucker krys se randomizovalo do RP (Referenční Produkt: glibenklamid)-, TP- (Testovaný Produkt: P32/98) a CO- (kontrolní) skupin (N=10 na skupinu). Potom se non-diabetické Wistar krysy léčily orálně jednou denně RP (5 mg/kg tělesné hmotnosti) nebo TP (21,61 mg/kg tělesné hmotnosti) a diabetické Zucker krysy se léčily orálně jednou denně RP (1 mg/kg tělesné hmotnosti) nebo TP (21,61 mg/kg tělesné hmotnosti) po dobu 21 dnů v 05.00 hod. (před pravidelným podáním potravy ve fázi tmy). Kontrolám se podal orálně 1% roztok celulosy (5 ml/kg). Vzorky krve se odebíraly každé ráno v 7,30 z oasní žíly pro měření glukosy v krvi a plasmatického inzulínu. Poslední vzorky krve z této části programu se odebraly v 07.30 15. den pro měření glukosy v krvi a plasmatického inzulínu. Orální terapie lékem pokračovala po dobu 1 týdne, zaznamenávání denního/nočního profilu glukosy v krvi (At = 3 h) a plasmatického inzulínu (At = 3-6 h) při výše • 0 uvedené terapii se provádělo od dne 16 (od 17.00) do dne 17 (do 14.00) .

OGTT: Konečný OGTT byl proveden v den 21 s odběrem krve z ocasní žíly. Vzorky krve z ocasní žíly se odebíraly v —12 h (noc před dnem 21), v 0 minutě (bezprostředně před zahájením OGTT), v 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100 a 120 minutě. Vzorky krve se odebíraly do 20 μΐ skleněných kapilár pro měření glukosy a do Eppendorfových zkumavek (100 μΐ). Zkumavky byly okamžitě odstředěny a plasmatická frakce byla uskladněna při -20 °C pro analýzu inzulínu.

Koncentrace glukosy v krvi: Hladiny glukosy byly měřeny za použití glukosa-oxidasy (Super G GlukosemePgerát; Dr. Muller Gerátebau, Freital, Germany).

Plasmatická koncentrace inzulínu: Koncentrace insulinu se testovaly RIA metodou (LINCO Research, lne. St. Charles, Mo., USA) .

Výsledky

Denní/noční profil glykemie (viz obr. 4A): Průměrná koncentrace glukosy v krvi v CO-skupině v den 16 byla 7,78 ± 0,83 mmol/1 před aplikací léku v 17.00. Po orální aplikaci placeba a požití potravy ve fázi noci se glykemie zvýšila na maximální hodnoty 12,18±1,34 mmol/1 v 21.00 hod. Potom se glykemie pomalu snižovala na nejnižší hodnoty 7,27±0,61 mmol/1 v 11.00 hod., a potom se zvýšila na 8,90±0,92 mmol/1 v 14.00 hod. další den. V RP-skupině byl pozorován podobný profil glykemie. Nicméně, ze srovnatelných průměrných hodnot 7,96±1,13 mmol/1 v 17.00 hod. pro kontrolní zvířata zde došlo ke většímu zvýšení na 14,8011,46 mmol/1 (21.00 hod.) a potom • · · · • · ♦ · » ···· ·« · ·· · · · 4 ····· · 4 * · · · ·· · ·«· ·· ·· ·» ·· ·· ··· · ke snížení na 7,66±1,22 mmol/1 (11.00 hod.), resp. k mírnému snížení na 7, 34±0,77 mmol/1 v 14.00 další den. V TP-skupině měly Zucker krysy normální průměrné koncentrace glukosy 5,25+0,16 mmol/1 v 17.00 hod. a jednotlivé hodnoty byly v rozmezí od 4,34 do 6,07 mmol/1. Glykemie vykazovala zvýšení o přibližně 3 mmol/1 až 8,34±0,47 mmol/1 v 21.00 hod. Po tomto zvýšení následovalo trvalé snížení na bazální hodnoty, které byly dosaženy v 08.00 hod. (5,64±0,23) a a které se udržely do 11.00 hod. (5,33±0,14 mmol/1), resp. 14.00 hod. další den (5,5 l±0,19 mmol/1).

Denní-noční profil inzulinemie: (viz obr. 4B): CO- a RPZucker krysy byly silně hyperinzulinemické. Insulin vykazoval variabilitu v průměrných hodnotách v 17.00 hod. v CO-skupině (47,0±8,7 ng/ml), 20.00 hod. (45,5±7,7 ng/ml), 05.00 hod. (54,2±5,7 ng/ml) a 14.00 hod. další den (61,0±10,2 ng/ml; NS), což nemělo žádnou souvislost s koncentrací glukosy v krvi.

V RP-skupině ve fázi tmy od 18.00 hod. do 06.00 hod. bylo pozorováno signifikantní zvýšení hodnoty plasmatické koncentrace inzulínu s maximem v 5.00 hod. Tento parametr se zvýšil ze silně hyperinzulinemické hodnoty 50,0±8,2 ng/ml (17.00 hod.) přes 57,3±8,2 ng/ml (20.00 hod.) na 76,3±8,6 ng/ml (05.00 hod.; p< 0,01 vs. počáteční hodnota), a potom následovalo snížení na 58,3±7,3 ng/ml (14.00 hod. další den).

V této RP-skupině byl inzulin silně fázově posunut ve srovnání s výkyvy glukosy v krvi. V TP-skupině byly Zucker krysy také hyperinzulinemické. Plasmatický inzulin v 17.00 hod. byl signifikantně nižší než v RP (p<0,05 vs. RP). Paralelně se zvýšením glukosy v krvi bylo pozorováno (Obr. IV/3 A) zvýšení plasmatického inzulínu v 20.00 hod. (41,9±8,5 ng/ml).

Maximální hodnota inzulinu byla naměřena v 05.00 hod.

(57,1+8,6 ng/ml; p<0,01 vs. počáteční hodnoty). Koncentrace plasmatického inzulínu se potom snižovala a dosáhla bazální koncentrace (24,313,7 ng/ml) v přibližně 14.00 hod. dalšího dne, což byla koncentrace významně nižší než v CO nebo RP skupinách (p<0,01 vs. CO nebo TP).

OGTT po 21 denní léčbě, křivky koncentrace glukosy v krvi (viz. obr. 5A): Při poslední aplikaci léku v 17.00 hod. a lačnění přes noc v den 21 došlo k signifikantnímu snížení glykemie v CO-skupině z 8,6811,26 mmol/1 (17.00 hod.) na 5,0810,24 mmol/1 (p<O,O5), v RP skupině z 8,81+1,21 mmol/1 na 4,91±0,37 mmol/1 (p<0,01) a v TP-skupině z 5,75+0,23 mmol/1 na 4,88±0,13 mmol/1 (p<0,01). Proto se orálně podala glukosa za účelem dosažení srovnatelné ranní (7,30 hod.) bazální koncentrace glukosy ve všech třech pokusných skupinách.

V CO-skupině se glykemie zvýšila po orální aplikaci glukosy na píkové hodnoty 14,64+1,42 mmol/1 během 40 min. Později došlo na konci testu k mírnému, signifikantnímu snížení na 9,75+0,46 mmol/1 (120 min.). V RP-skupině bylo pozorováno prudké zvýšen koncentrace glukosy v krvi na hodnoty 16,33+0,98 a 16,24±l,09 mmol/1 v 50 min., resp. 80 min. Vysoké koncentrace glukosy se udržovaly do konce testu ve 120 min. (100 min: 15,13±0,76 mmol/1, 120 min: 14,8 l±0,66 mmol/1; NS od předešlé píkové hodnoty). V TP-skupině byla křivka glukosy v krvi podobná jako v CO-skupině. Glykemie se zvýšila na 14,54±0,65 mmol/1 v 50 min. a snížila se signifikantně na 10,67±0,62 mmol/1 (120 min.; NS od CO).

Plocha pod glukosovou křivkou (G-AUC0-120 min) v CO- a TPskupinách byla 823+41 a 895+50 mmol.min/1, v příslušném pořadí (NS). V RP-skupině byl tento parametr 1096176 mmol.min/1 a tato hodnota byla signifikantně vyšší než v CO(p<0,01) nebo TP-skupinách (p<0,05).

OGTT po 21 denní léčbě, plasmatický inzulín (viz obr. 5B):

• · • 9 «9 9 9 9 9 9 · * *

9 9 9999 99 9

999 « 99999 9 9

Hladovění přes noc vedlo u Zucker krys ke snížení koncentrace plasmatického inzulínu u CO-zvířat (14,6±3,7 ng/ml), v RP skupině na 11,8±1,5 ng/ml, a v TP-skupině na 9,3±1,5 ng/ml,--A^-přisJjlšiiónr-pUradí''.'· Rozdíly mezi experimentálními skupinami nebyly statisticky významné. Po glukosovém stimulu se plasmatický inzulín prakticky nezměnil v C0-, RP- a TP-skupinách. Mírně vyšší hodnoty byly pozorovány ve 120 min. pouze v CO-skupině, kde dosáhly 21,3±3,0 ng/ml, což bylo signifikantně více než v TP-skupině (p<0,05).

Hodnota I-AUC0-120 byla obecně nízká. V_JP-skupině byl tento parametr nižší než v CO- nebo RP-skupinách' (NS) .

Souhrn

Ranní koncentrace glukosy v krvi: Kontroly ošetřené placebem byly hyperglykemické (přibližně 7,5 mmol/1). Průměrné koncentrace se neměnily během testu. RP terapie zvyšovala glukosu v krvi o přibližně 1,5 mmol/1 během dvou dnů. Glykemie zůstavala vysoká. TP-medikace snižovala glukosu v krvi na normální hodnoty během 5 dnů. Koncentrace glukosy v krvi zůstávala normální až do konce testu.

Plasmatický inzulín: Kontrolní Zucker krysy byly hyperinzulinemické a vykazovaly určité zvýšení inzulínu během 14 denního pozorování. Zucker krysy léčené RP vykazovaly zvýšení inzulínu na signifikantně vyšší koncentrace než kontrolní zvířata. Aplikace TP mírně snížila koncentraci inzulínu na 14 dnů ve srovnání s kontrolními zvířaty.

OGTT po 21 denní léčbě, glukosa v krvi: Hladovění přes noc β» r * * · · · · « ··» · « · ·

Z Η ···· ·· φ «·· ·* ·· ·· ·· 9 · ·· snížilo koncentraci glukosy v krvi v testovaných skupinách na normální hodnoty. Zvířata léčená placebem vykazovala zvýšení glukosy v krvi na přibližně 9 mmol/1 během 40 min. po podání glukosy a mírné snížení potom. Zucker krysy léčené PP vykazovaly zvýšení glukosy v krvi na přibližně 11 mmol/1 a žádné snížení potom. Průměrná křivka glukosy v krvi u zvířat léčených TP se nelišila od kontrol. Léčba RP zvýšila G-AUC, léčba TP nezvýšila G-AUC ve srovnání s placebem.

OGTT po 21 denní léčbě, plasmatický inzulín: Kontrolní Zucker krysy měly nejvyšší inzulín na lačno ze tři testovaných skupin a tato hodnota byla přibližně 15 ng/ml. Po podání glukosy se inzulín významně zvýšil pouze na konci testu (120 min). Krysy léčené PP měly o něco nižší inzulín na lačno (přibližně 12,5 ng/ml) na začátku OGTT a došlo u nich k časnému zvýšení ve 40 minutě bez zvýšení na konci testu. Krysy léčené TP měly nejnižší inzulín na začátku OGTT (přibližně 9 ng/ml) a časně se ve 20 min. hodnota zvýšila současně se zvýšením koncentrace glukosy v krvi a tato koncentrace se snížila mezi 40 min. a 100 min. I-AUC byla o něco nižší u krys léčených TP.

Závěr

Inhibitor DP IV P32/98 (TP), podávaný jednou denně, normalizuje ranní koncentraci glukosy v krvi, snižuje hyperinzulinemii a udržuje denní-noční profil glukosy v krvi pod kritickou (pro diabetiky) hodnotou 8,3 mmol/1. Metabolický benefit se udržuje po omezenou dobu po ukončení podávání P32/98.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití alespoň jednoho inhibitoru aktivity enzymu DP IV pro výrobu léčiva pro zvýšení kapacity buněk vyrábějících inzulín u zvířete.
2. Použití podle nároku 1, kde uvedené zvýšení kapacity buněk produkujících inzulin zahrnuje zvýšení účinnosti produkce inzulínu endogenními buňkami produkujícími inzulin.
3. Použití podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kde uvedené zvýšení kapacity buněk produkujících inzulin zahrnuje vyvolání diferenciace buněk přítomných v pankreatu na buňky produkující inzulin.
4. Použití podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kde uvedený DP IV efektor je vybrán ze skupiny zahrnující N-(N'substituovaný glycyl)—2-kyanpyrrolidiny, N-aminoacylthiazolidiny, N-aminoacyl-pyrrolidiny: jako je L-threoisoleucyl-thiazolidin (P32/98), L-allo-isoleucyl-thiazolidin, L-threo-isoleucyl-pyrrolidin a L-allo-isoleucyl-pyrrolidin a jejich farmaceutické soli. .
5. Použití podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kde uvedený efektor zahrnuje substrát schopný vazby na uvedený DP IV, který soutěží o DP IV s přirozeně se vyskytujícími substráty.
6. Použití podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kde uvedený efektor zahrnuje inhibitor schopný inhibice uvedeného DP IV.
7. Použití podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kde

99 99 99 • *

99 99 9· uvedené podání zahrnuje orální podání.
8. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kde uvedené podání zahrnuje iv nebo im injekci.
9. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kde uvedené podání zahrnuje chronické orální podání.
10. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kde uvedené podání zahrnuje chronické iv nebo im injekce.
11. Použití podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, které dále zahrnuje podání glukosy nebo příjem potravy před, během nebo po podání uvedeného efektorů aktivity DP IV.
12. Použití podle nároku 11, kde uvedené podání uvedeného efektorů aktivity DP IV je provedeno před uvedeným podáním glukosy nebo příjmem potravy.
13. Použití terapeuticky účinné dávky alespoň jednoho efektorů aktivity DP IV enzymu podle kteréhokoliv z předcházejících nároků.
14. Způsob zvýšení kapacity buněk produkujících inzulín u zvířete vyznačující se tím, že zahrnuje podání terapeuticky účinné dávky alespoň jednoho efektorů aktivity DP IV enzymu uvedenému zvířeti.
15. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že uvedené zvýšení kapacity buněk produkujících inzulín zahrnuje zvýšení účinnosti produkce inzulínu endogenními buňkami produkujícími inzulín.

···· 94

99 4 4 99 · 9 _ν ·

999 9999 99 9

99 «·· 9 99999 9 9

Λ/γ 994999 9994

Z Z 49 «9 99 99 9* 9999
16. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 14 až 15, kde uvedené zvýšení kapacity buněk produkujících inzulín zahrnuje vyvolání diferenciace buněk přítomných v pankreatu na buňky produkující inzulín.
17. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 14 až 16 vyznačující se tím, že uvedený DP IV efektor je vybrán ze skupiny zahrnující Ν-(Ν'-substituovaný glycyl)—2kyanpyrrolidiny, N-aminoacyl- thiazolidiny, N-aminoacylpyrrolidiny: jako je L-threo-isoleucyl-thiazolidin (P32/98), L-allo-isoleucyl-thiazolidin, L-threo-isoleucyl-pyrrolidin a L-allo-isoleucyl-pyrrolidin a jejich farmaceutické soli.
18. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 14 až 17 vyznačující se tím, že uvedeným efektorem je substrát schopný vazby na uvedený DP IV, který soutěží o DP IV s přirozeně se vyskytujícími substráty.
19. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 14 až 18 vyznačující se tím, že uvedený efektor zahrnuje inhibitor inhibující uvedený DP IV.
20. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 14 až 19 vyznačující se tím, že uvedené podání zahrnuje orální podání.
21. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 14 až 19 vyznačující se tím, že uvedené podání zahrnuje iv nebo im injekci.
22. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 14 až 19 vyznačující se tím, že uvedené podání zahrnuje chronické orální podání.

··· · · · · tt· * ·· ··« · · · · · · v · • tttt · · · ··· • tttt ·· ·· ······
23. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 14 až 19 vyznačující se tím, že uvedené podání zahrnuje chronické iv nebo im injekce.
24. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 14 až 23 vyznačující se tím, že zahrnuje podání glukosy nebo příjem potravy před, během nebo po podání uvedeného efektoru aktivity DP IV.
25. Způsob podle nároku 24 vyznačující se tím, že uvedené podání uvedeného efektoru aktivity DP IV je provedeno před uvedeným podáním glukosy nebo příjmem potravy.