CZ104298A3 - Samovolné předčasné vysemenění - Google Patents

Description

Samovolné předčasné vysemeněni

Oblast techniky

Vynález popisuje sekvence DNA, které obsahují fragmenty nukleové kyseliny kódující proteiny selektivní pro zónu samovolného otevření, zvláště hydrolázy buněčné stěny, jako jsou polygalakturonázy. Dále vynález popisuje regulační oblasti odpovídajících rostlinných genů a jejich použití při modifikaci vlastností samovolného otevřeni u rostlin, zvláště pak vlastnosti samovolného otevření lusku u Brassica napus.

Dosavadní stav techniky

Ztráta výtěžku způsobená padáním semen ze zralých plodů a lusků, což se také nazývá samovolné otevírání plodů nebo vysypání plodů, stejně jako průvodní nárůst divokého růstu v následující sklizňové sezóně jsou univerzálním problémem u plodin, které produkují suché samovolně pukající plody. Mezi ekonomicky důležité plodiny, kterých se tento problém týká, patří řepka olejná: při nepříznivém počasí může dojít až k 50% ztrátě potencionálního výtěžku.

Suché samovolně se otevírající plody, které se také nazývají lusky, se mohou vyvíjet z jednotlivých pestíků (jako jsou lusky u mnoha Fabaceae') nebo z více než jednoho peští ku (jak je tomu u šešulí u mnoha Brassicaceae). V případě šešulí lusk obsahuje dva pestíky, které jsou spojeny hranami. Sutura mezi hranami tvoří silné žebro, které se nazývá replum. Jak plod dozraje od replumu se progresivně oddělují dvě víčka, což eventuálně vede k vysypání semen, která jsou přichycena na replum.

Zkoumání ultrastruktur ukázalo, že vysypání lusků je spojeno s přesnou degradací materiálu buněčné stěny v místě, kde dochází k separaci víčka (to je sutura). Degradace buněčné stěny a ztráta buněčné koheze před samovolným otevřením plodu se převážně přisuzuje rozpouštěni střední lamely buněčné stěny. Tato střední lamela se nachází mezi primárními buněnčými stěnami a je pojivém, které drží dohromady jednotlivé buňky, přičemž tvoří tkáň. Oddělení buněk se předchází ethylénovým přechodem, který časově koreluje s tkáňově specifickým růstem aktivity hydrolytického enzymu celulázy (beta-1,4-glukanáza), k čemuž dochází specificky ve vrstvě buněk podél sutury. Tato vrstva se nazývá zóna samovolného otevření. Na rozdíl od této skutečnosti aktivita enzymu degradujícího buněčnou stěnu polygalakturonáza nevykazuje žádnou korelaci ani časovou ani prostorovou se samovolným otevřením lusku (Meakin and Roberts (1990), J. Exp. Bot. 41; 1003). Samovolné otevření plodu v časné fázi vývoje je charakteristické pro zamoření lusků pakomárem Dasineura brassicae. Při té příležitosti se pozoroval lokalizovaný narůst aktivity enzymů polygalakturonázy a celulázy. Zjistilo se však, že regulace vysypání semen indukované pakomárem a spojené s dozráváním se liší (Meakin and Roberts (1991), Annals of Botany 67: 193).

Na první pohled se zdá, že proces samovolného otevření plodu má řadu podobných rysů s oddělením, kdy rostliny ztrácí orgány, jako jsou listy, květy a plody. Pozorovalo se, že ethylen indukuje nebo zrychluje oddělení, zatímco auxin inhibuje nebo zpožďuje oddělení orgánů. Rozhodující krok při oddělení orgánů je vysoce koordinovaná exprese, syntéza a sekrece hydrolytických enzymů buněčné stěny v diskrétní vrstvě buněk. Tato vrstva se nazývá zóna oddělení. Celulázy (beta-1,4-glikanázy) tvoří jednu třídu takových hydroláz buněčné stěny. Celulázová aktivita se určila v různých tkáních zahrnujíc zónu oddělení listů, plodů, dozrávajícího plodu, stárnoucích děloh a čnělek a prašníků (Kemmerer and

Tucker (1994), Plant Physiol. 104: 557 a reference uvedené v této publikaci). Polygalakturonázy, které se podílí na • · • · · · · · · · ··· • · ·· · · · * ···· · ·· ···· ··· ······· ·· »· ·· ·· odděleni zejména plodů, tvoři druhou třídu hydroláz. U těchto enzymů se určily charakteristické izoformy (Bonghi et al. (1992), Plant Mol. Biol. 20: 839; Taylor et al. (1990) Planta 183: 133).

Kadkol et al.,((1986), Aust. J. Biol. 34:79) popisuje zvýšenou rezistenci vůči vysemenění u australské řepky. Odlišnosti v procesu dozrávání lusků se pozorovalo u mutantů řepky vyrostlých z ozářených semen (Luczkiewicz (1987), Proč. 7^th Int. Rapessed Congress 2: 463). Může se však usuzovat, že tradiční meotdy šlechtění nejsou úspěšné při zavádění rezistence vůči vysemenění do kultivarů řepky bez interference požadovaných rysů, jako jsou časné tvoření květů, zralost a rezistence vůči toxemii (Prakash and Chopra (1990), Genetical Research 56:1).

Navzdory ekonomickému přínosu je známo velmi málo o molekulárním přístupu a změnách v expresi genů, ke kterým dochází během samovolného otevírání lusku řepky olej né. Do současnosti se popsaly dva druhy mRNA, které jsou specifické pro lusky, jejichž exprese časově a prostorově koreluje s vývojem lusků. Avšak funkce kódovaných proteinů není známa (Coupe et al. (1993), Plant Mol.Biol. 23: 1223; Coupe et la.

(1994), Plant Mol. Biol. 24: 223). PCT publikace WO94/23043 v obecné rovině popisuje přístup regulece oddělování rostlinných orgánů a samovolného otevírání plodů.

Vynález poskytuje geny rostlin, které jsou selektivní pro zónu samovolného otevírání plodů.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje geny selektivní pro zónu samovolného otevírání (DZ) u rostlin, cDNA připravenou z mRNA, která je kódovaná uvedenými geny, a promotory takových genů. Vynález zvláště popisuje cDNA SEQ ID N0:l a promotor genu, který kóduje mRNA, kde cDNA této mRNA má v podstatě nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:1. V preferovaném provedení vynálezu se popisuje promotor, který je obsažený v 5'-regulační oblasti sekvence SEQ ID NO: 13 s počátkem v poloze 1 a končící v poloze 2 328.

Vynález popisuje DZ selektivní chimérické geny, které se mohou používat při transformaci rostlin za účelem získání transgenní rostliny, která vykazuje modifikované vlastnosti samovolného otevírání plodů, zvláště pak vykazuj e modifikované vlastnosti samovolného otevíráni lusků ve srovnání s rostlinami, které neobsahují DZ-selektivní chimérický gen, což je způsobeno expresí DZ-selektivního chimérického genu v transgenní

Vynález dále popisuje rostlinu, která obsahuje nejméně jeden DZ-selektivni chimérický gen začleněný do genomu jádra svých buněk, kde uvedený DZ-selektivní chimérický gen obsahuje následující operabilně spojené fragmenty DNA:

a) transkribovanou oblast DNA kódující:

1) RNA, která, v případě, že vzniká v buňkách určité rostlinné DZ, v takových buňkách brání, inhibuje nebo redukuje expresi rostlinného endogenního genu, upřednostňuje se endogenní DZ-selektivni gen, kódující hydrolázu buněčné stěny, zvláště pak endo-polygalakturonázu (endo-PG) nebo

2) protein nebo polypeptid, který, v případě, že vzniká v buňkách určité rostlinné DZ, zabijí nebo ničí tyto buňky nebo interferuje s jejich normálním metabolizmem, fyziologií nebo vývojem, ···· · · · · · · · • · ····· · · · · • · · · · · · · ···· · • · · · · · · · · ······· · · · · · · ··

b) promotor exprimujici v rostlině, který řídi expresi transkribované oblasti DNA přinejmenším v buňkách zóny samovolného otevření, umožnil, že jestliže přepisovaná oblast DNA kóduje protein nebo polypeptid nebo kóduje antisense RNA nebo ribozom směrovaný do sense RNA, kódovanou endogenním rostlinným genem, pak je exprimován v rostlinách v jiných buňkách než jsou ty z DZ; v rostlinách exprimujici promotor je DZselektivni promotor, to je promotor, který řídí expresi transkribované oblasti selektivně v buňkách zóny samovolného otevření.

Transkribované oblast DNA s výhodou kóduje protein nebo polypeptid, který je pro buňky, v nichž vzniká, toxický, např. barnáza; protein nebo polypeptid, který v buňkách, v nichž vzniká, zvyšuje hladinu auxinů nebo jeho analogů, např. indol-3-acetamidová hydroláza a/nebo tryptofanová monooxygenáza; protein nebo polypeptid, který v buňkách, v nichž vzniká, zvyšuje citlivost na auxin, např. produkt genu rolB; nebo protein nebo polypeptid, který v buňkách, v nichž vzniká, snižuje citlivost na ethylen, např. mutantní portein ETR-1 nebo jiný receptorový protein pro ethylen.

V jiném preferovaném provedení vynálezu transkribované DNA kóduje RNA, jako je antisense RNA nebo ribozom, jejichž část je komplementární s mRNA kódovanou genem, který je přirozeně exprimovaný v DZ, přednostně jde o DZ-selektivní gen.

Termín samovolné otevření znamená proces, kde rostlinný orgán nebo struktura, jako je prašník nebo plod, se po dozrání otevírá podél jisté linie nebo v určitém směru, což vede k vysypání obsahu zmíněného orgánu nebo struktury. V některých svých aspektech proces samovolného otevírání je ·«·* ··· · · · · • · ····· · · · · • · · · · · · · ···· « • · ···· ··· ······· ·· ·· · · · · reminiscence procesu oddělení, kde část nebo orgán rostliny, jako je list, květ nebo plod, se oddělí od zbytku rostliny.

Termín lusk znamená suchý samovolně otevřený plod, který obsahuje jeden, dva nebo více peštíků. V případě řepky olejně je lusk šešule s dvěma víčky, kde víčka jsou zobrazeny podélnou dorzální a ventrální suturou, která obsahuje samovolně se otevírající zóny.

Termín samovolně se otevírající lusk znamená proces, kde plod, zvláště lusk, se otevírá podél diskrétní vrstvy buněk, což eventuálně vede k separaci víček a k následnému vysypání semen, které byly obsaženy uvnitř plodu, zvláště lusku. Samovolně se otevírající lusk se vyskytuje u rozličných rostlin, které tvoří suché plody, jako je většina rostlin rodu Cruciferae.

Termín zóna samovolného otevření (DZ) v nejobecnějším smyslu zahrnuje tkáně v zóně, podél které se rostlinný orgán nebo struktura otevírají během procesu samovolného otevírání. DZ je obvykle makroskopicky rozeznatelná tím, že v orgánu je přítomna jasná sutura. V přesném smyslu DZ může zahrnovat oblast, kterou tvoří do tloušťky pouze 1 až 3 parenchymální buňky. U lusku tato oblast obvykle obsahuje velice hustě uspořádané buňky a sousedí s okrajem vaskulární tkáně replumu, který ji separuje od hran víčka. DZ podle vynálezu může také obsahovat buněčnou vrstvu, která obklopuje tuto oblast. DZ se rozprostírá od lokulu lusku do epidermální sutury.

Termín promotor znamená DNA, která je rozeznávána a vázána (přímo nebo nepřímo) během iniciace transkripce RNApolymerázou závislou na DNA. Promotor zahrnuje počáteční místo transkripce a vazebná místa pro transkripci iniciačních faktorů a RNA polymerázu a může zahrnovat řadu jiných míst (např. zesilovače), kam se mohou vázat proteiny regulující gen.

• ·

Termín promotor exprimující v rostlinách znamená promotor, který je schopný řídit transkripci v rostlinné buňce. Sem patří libovolný promotor rostlinného původu, ale také libovolný promotor, který není rostlinného původu a který je schopný řídit transkripci v rostlinné buňce, to jsou jisté promotory virového nebo bakteriálního původu, jako jsou promotory CaMV 35S nebo T-DNA.

Termín regulační oblast znamená libovolnou DNA, která je zahrnuta do řízení transkripce a kontroly (to je regulace) časování a úrovně transkripce danné sekvence DNA, jako je DNA klódující protein nebo polypeptid. Například 5'-regulační oblast (nebo oblast promotoru) je sekvence DNA, která se nachází upstream (to je na 5'-konci) kódující sekvence a která obsahuje promotor a 5'-nepřekládanou vedoucí sekvenci. 3'-regulační oblast je sekvence DNA, která se nachází downstream (to je na 3'-konci) kódující sekvence a která obsahuje vhodný transkripčni terminační (a/nebo regulační) signály, které zahrnují jeden nebo více polyadenylačních signálů.

Termín hydroláza buněčné stěny znamená enzym, který se podílí na degradaci materiálu buněčné stěny, například během procesu samovolného otevírání. Příklady takových enzymů zahrnují, ale nejsou na ně omezeny polygalakturonáza, celuláza (beta-1,4-glukanáza) , beta-galaktozidáza, proteázy hydrolyzující proteiny buněčné stěny a podobně.

Termín gen znamená libovolný fragment DNA obsahující oblast DNA (transkribovanou oblast DNA), která se v buňce přepisuje na molekulu RNA (např. mRNA). Tento proces řídí vhodné regulační oblasti, např. promotor exprimující v rostlinách. Gen pak může obsahovat několik operabilně spojených fragmentů DNA, jako je promotor, 5'-nepřekládáná vedoucí sekvence, kódující oblast a 3'-nepřekládanou oblast, která obsahuje polyadenylační místo. Endogenní rostlinný gen • ·

je gen, který se přirozeně nachází v rostlinných druzích. Chimérický gen je libovolný gen, který se normálně nenachází v rostlinných druzích nebo v jiném případě jde o libovolný gen, ve kterém promotor není spojen s částí nebo celou přepisovanou oblstí DNA nebo s nejméně jednou jinou regulační oblastí genu.

Termín exprese genu je proces, kde oblast DNA řízená regulačními oblastmi, zvláště promotorem, se přepisuje na RNA, která je biologicky aktivní, to znamená, že je schopna být přeložena do biologicky aktivního polypeptidu nebo proteinu. Říká se, že gen kóduje RNA, když konečný produkt exprese genu je biologicky aktivní RNA, jako je antisense RNA nebo ribozym. Říká se, že gen kóduje protein, když konečný produkt exprese genu je biologicky aktivní protein nebo polypeptid.

Fenotypický účinek exprese genu se vztahuje na biochemické, fyziologické a/nebo vývojové účinky produkce RNA nebo proteinu, který je kódován genem, na rostlinné buňky (nebo rostliny), ve kterých je produkován. Fenotypické účinky exprese genu se mohou redukovat nebo se jim může předcházet redukcí nebo prevencí produkce kódované RNA nebo proteinu nebo se může jinak interferovat biologická aktivita takové RNA nebo proteinu.

Jak se zde určilo, vždy když je ve specifickacích uvedeno, že cDNA takové mRNA obsahuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:X pak RNA má stejnou nukleotidovou sekvenci jako je ta reprezentována v SEQ ID NO: X, mimo té, kde U-zbytky (v sekvenci RNA) jsou nahrazeny T-zbytky ( v sekvenci DNA).

Podle vynálezu jsou určeny DZ-selektivní cDNA a její odpovídající fragmenty rostlinné genomové DNA jako následuj ící:

1) konstruovala se knihovna cDNA začínající od mRNA izolované z DZ tkáně; knihovna cDNA se podrobila • · • ·

odlišnému testování za účelem určení mRNA, která je selektivně přítomna v tkáni určité DZ, když se srovnává s jinými rostlinnými tkaáněmi, které zahrnují, ale nejsou omezeny na stěny lusku, replum, listy, stonek, kořeny, reproduktivní orgány a podobně. V jiném případěknihovna cDNA se testuje oligonukleotidy, které jsou dedukovány z identifikované aminokyselinové sekvence izolovaného proteinu, jako je například hydroláza buněčné stěny, která je selektivně přítomna v DZ. Dále je možné použít stejné nukleotidy při nested-PCR a použít amplifikované fragment(y) jako sondy k testování knihovny. DZ-selektivní knihovna cDNA se může zkonstruovat z řady mRNA, které vznikly v různých fázích vývoje DZ;

2) charakterizuje se a izoluje se cDNA kódující DZselektivní mRNA nebo protein;

3) tato cDNA se použije jako sonda pro identifikaci a izolaci oblasti v rostlinném genomu, zahrnující nukleotidovou sekvenci kódující DZ-selektivní mRNA nebo protein. V jiném případě genomová DNA se může izolovat za využití inverzní PCR, přičemž se použijí oligonukleotidy dedukované ze sekvence cDNA a

4) volitelně se zkonstruovaly RNA sondy odpovídají cDNA, které se a užívaly při běžné RNA-RNA in šitu hybridizační analýze (např. De Block et al. (1993), Anal. Biochem. 215: 86) různých rostlinných tkání, které zahrnují určitou DZ, za účelem potvrdit selektivní přítomnost mRNA produkované předpokládaným DZ-selektivním endogenním rostlinným genem v uvedené DZ .

Termín selektivní pro zónu samovolného otevření znamená s ohledem na expresi DNA v souladu s vynálezem vysoce

specifickou, přednostně jedinečnou, expresi DNA v buňkách jedné určité DZ, zvláště DZ lusku nebo omezené skupiny DZ.

DZ-selektivní gen je endogenní gen rostliny, který uje selektivně exprimován v buňkách jistých DZ, zvláště v buňkách DZ lusku. Pro izolaci DZ-selektivních genů se mohou použít všechny rostliny, které mají DZ, která je středem zájmu. Pro izolaci DZ-selektivních genů je možné použít rostliny rodiny Criciferae, které zahrnují, ale nejsou na ně omezeny Arabidopsis thaliana, Brassica campestris, Brassica juncea a zvláště Brassica napus; rostliny rodiny Leguminosae, které zahrnují, ale nejsou na ně omezeny Glycine max, Phaseolus vulgaris a podobně. mRNA (nebo cDNA z ní získaná) přepsaná z takového genu je DZ-selektivní mRNA (nebo cDNA). Promotor, který řídí a reguluje transkripci takové mRNA je zmnován jako DZ-selektivní promotor. DZ-selektivní promotor se může například použít pro expresi cytotoxického genu (např. genu barnázy) v rostlině tak, že normální růst a vývoj a agronomické charakteristiky (např. výtěžek semen) rostliny je negativně ovlivněn expresí cytotoxického genu v jiných buňkách, než jsou DZ buňky, přednostně v buňkách jiných než jsou buňky DZ lusku.

Po té, co se získal DZ-selektivní gen (to je fragment genomové DNA, kódující DZ-selektivní mRNA, ze které lze připravit DZ-selektivni cDNA), se určila promotorové oblast obsahující DZ-selektivní promotor, jako oblast upstream (to je na 5^Z-konci) od kodonu kódujícího první aminokyselinu proteinu kódovaného mRNA. Preferuje se, že taková promotorové oblast se nachází nejméně okolo 400 až 500bp, přednostně nejméně okolo 1 OOObp, zvláště nejméně okolo 1 500 až 2 OOObp upstream od počátečního kodonu. Preferuje se, aby taková promotorové oblast nezasahovala více jak okolo 3 000 až 5 OOObp upstream počátečního kodonu. Aktuální DZ-selektivní promotor je oblast genomové DNA nacházející se upstream (to

je na 5'-konci) oblasti kódující DZ-selektivní mRNA. Chimérický gen obsahuje DZ-selektivní promotor operabilně spojený s kódující oblastí genu gus (Jefferson et al. (1986), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 8447) bude v transgennich rostlinách selektivně produkovat detekovatelnou betaglukuronidázovou aktivitu (kódovanou genem gus) v buňkách určité DZ, což se testovalo běžnýmy metodami in sítu (De Block and Dubrouwer (1992), The Plant Journal 2: 261; De Block and Debrouwer (1993), Planta 189: 218).

Preferované DZ-selektivní geny, ze kterých lze získat DZ-selektivní promotory jsou geny, přednostně geny z Brassica napus, které kódují DZ-selektivní mRNA, z níž se připravuje cDNA obsahující sekvenci odpovídající sekvenci oligonukleotidů PG1 (SEQ ID NO:2) mezi pozicemi nukleotidů 11 a 27 a/nebo sekvenci oligonukleotidů PG3 (SEQ ID NO:4) mezi pozicemi nukleotidu 11 a 27 (začíná v pozici 11 a končí v pozici 27); a/nebo obsahuje sekvenci komplementární k oligonukleotidů PG2 (SEQ ID NO:3) mezi oligonukleotidovými pozicemi 11 a 25 a/nebo sekvenci oligonukleotidů PG5 (SEQ ID NO: 5) mezi pozicemi nukleotidů 11 a 27. Taková DZ-selektivní cDNA s výhodou obsahuje dříve uvedené sekvence oligonukleotidů PG1 a PG3 a PG2 a PG5 nebo kóduje protein kódovaný oblastí SEQ ID NO:1 mezi pozicemi nukleotidů 95 a 1 393.

Zvláště preferovaným DZ-selektivním genem je gen z Brassica napus, který kóduje DZ-selektivní mRNA, z níž se dá připravit cDNA obsahující sekvenci SEQ ID NO:1 nejméně mezi nukleotidy 10 a 1600. Jiným preferovaným DZ-selektivním genem je gen z Brassica napus, který kóduje DZ-selektivní mRNA, z níž se dá připravit cDNA, která obsahuje sekvenci SEQ ID NO: 10 .

Preferovaný promotor podle vynálezu je promotor, který je obsažen v 5'-regulační oblasti genomového klonu

odpovídajícího cDNA SEQ ID NO: 1, např. 5'-regulační oblast se sekvencí SEQ ID NO: 13 začínající v pozici 1 a končící v pozici 2 328. Více preferovanou promotorovou oblastí je fragment DNA obsahující sekvenci SEQ ID NO: 13 začínající kdekoli mezi restrikčním místem Sphl (pozice 246 až 251) a restrikčním místem HindlI (pozice 1 836 až 1 841), zvláště mezi restikčními místy Sphl a BamHI (pozice 1 051 až 1 056) a končící v pozici 2 328 (právě před translačním počátečním kodónem ATG). Taková promotorové oblast obsahuje DZselektivní promotor podle vynálezu a 5' nepřekládanou vedoucí oblast a používá se ke konstrukci DZ-selektivních chimérických genů. S ohledem na tuto skutečnost více preferovanou promotorovou oblastí je fragment DNA (zde je uvedený jako PDZ) se sekvencí SEQ ID NO: 13 mezi pozicemi 251 (restrikční místo Sphl) a 2 328.

Menší fragmenty DNA se mohou použít jako promotorové oblasti podle vynálezu a předpokládá se, že upstream od iniciačního kodonu translace se může použít libovolný fragment DNA SEQ ID NO: 13, který obsahuje nejméně okolo 490 párů baží, přednostně okolo 661 párů baží a nejvýhodnější je okolo 1326 párů baží. Zvláště preferované menší fragmenty, které se mohu použít jako promotorové oblasti podle vynálezu, mají sekvenci DNA zahrnující sekvenci SEQ ID NO:13 mezi nukleotidy 1 002 a 2 328.

Předpokládá se, že SZ-specifita promotoru 5'regulační oblasti sekvence SEQ ID NO: 13 se může podstatně vylepšit inkluzí nukleotidové sekvence SEQ ID NO: 13 mezi nukleotidy 1 002 a 1 674. Proto se preferují promotory obsahující tuto sekvenci.

V jiném případě se mohou zkonstruovat umělé promotory, které obsahují tyto vnitřní části promotoru 5'regulační oblasti SEQ ID NO:13, které určují DZ-selektivitu tohoto promotoru. Tyto umělé promotory mohou obsahovat promotor • · · • · ···· · · · »·*···· ·· ·· ·· ·· jádra nebo oblast TATA boxu jiného promotoru schopného exprese v rostlinách, jako je oblast TATA boxu CaMV 35S jak se popisuje v publikaci WO 93/19188. Vhodné promotorové fragmenty nebo umělé promotory se mohou určit například jejich vhodnou fúzí s reportním genem (jako je gen gus) a detekcí exprese reportního genu ve vhodné tkáni (tkáních) a ve vhodném stádiu vývoje. Je známo, že takové menší promotory a/nebo umělé promotory obsahují tyto vnitřní části 5'regulačních oblastí SEQ ID NO:13, které určují DZselektivitu, mohou poskytnout lepší selektivitu transkripce v DZ-specifických buňkách a/nebo zesílit úroveň transkripce transkribovaných oblastí DZ-selektivních chimérických genů podle vynálezu.

Vedle aktuálního promotoru 5'regulační oblast DZselektivního genu podle vynálezu také obsahuje fragment DNA kódující 5'nepřekládanou vedoucí sekvenci (5'UTL) RNA lokalizovanou mezi počátečním místem transkripce a počátečním místem translace. Předpokládá se, že 5'transkripční počáteční místo je lokalizováno mezi pozicemi 2 219 a 2 227 (v sekvenci SEQ ID NO: 13), výsledkem je 5'UTL v délce okolo 102 až 110 nukleotidů. Dále se předpokládá, že tato oblast se může nahradit jinou 5'UTL, jako je 5^ZUTL jiného v rostlinách exprimujícího genu, aniž dojde k podstatnému ovlivnění specificty promotoru.

Jiné podle vynálezu použitelné DZ-selektivní geny nebo cDNA jsou ty izolované z jiných zdrojů, např. jiné kultivary B. napus nebo dokonce jiné rostlinné druhy například použitím cDNA sekvence SEQ ID NO: 1 (nebo SEQ ID NO: 10). Tyto fragmenty se používají jako sondy pro testování genomových knihoven za přísných hybridizačních podmínek, přičemž se používají běžné metody, jak se popisuje v publikaci Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approuch (1985), IRL Press Ltd UK (Eds. B.D. Hames and S.J. Higgins) . Gen použitelný podle vynálezu je pak libovolný gen charakterizovaný kódováním mRNA, z níž se mohou připravit různé cDNA, které obsahují kódující oblast s nukleotidovou sekvencí, jenž je v podstatě podobná sekvenci kódující oblast klonu cDNA se sekvencí SEQ ID NO: 1, a kóduje protein s polygalakturonázovou aktivitou. Také se mohou určit promotory a promotorové oblasti, například takových variant cDNA, které jsou v podstatě podobné promotorové oblasti nebo promotoru se sekvencí obsaženou v sekvenci SEQ ID NO: 13.

S ohledem na nukleotidové sekvence (DNA nebo RNA), jako jsou sekvence cDNA nebo sekvence regulačních oblastí genu, termín v podstatě podobné znamená, že když se srovnají dvě sekvence pak procento shodnosti sekvence- to je počet pozic s identickými nukleotidy děleno počtem nukleotidů v kratší ze sekvencí -je vyšší než 80%, přednostně vyšší než 90%, zvláště s ohledem na regulační oblasti. Srovnáni dvou nukleotidových sekvencí se provedlo pomocí algoritmu Wilbura a Lipmanna (Wilbur and Lipmann (1983), Proč. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 80: 726) za použití velikosti okna 20 nukleotidů, délce slova 4 nukleotidy a velikosti mezery (gap penalty) 4.

Dvě podstatně podobné varianty cDNA budou typicky kódovat proteiny, které se v podstatě podobají. Například varianta cDNA sekvence SEQ ID NO: 1 bude typicky kódovat protein s aminokyselinovou sekvencí, která je v podastatě podobná aminokyselinové sekvenci proteinu kódovaného cDNA se sekvencí SEQ ID NO: 1. S ohledem na aminokyselinové sekvence termín podstatně podobný znamená že, když se srovnají dvě relevantní sekvence pak procento shodnosti sekvence- to je počet pozic s identickými aminokyselinovými zbytky děleno počtem zbytků v kratší ze sekvencí -je vyšší než 80%, přednostně vyšší než 90%. Srovnání dvou aminokyselinových sekvencí se provedlo pomocí algoritmu Wilbura a Lipmanna (Wilbur and Lipmann (1983), Proč. Nat.

···· ··· · · · · • · ····· ···· • · ·· ·· · · ···· · ·· · · · · ··· ··· ···· ·· ·· ·· ··

Acad. Sci. U.S.A. 80: 726) za použiti velikosti okna 20 aminokyselin, délce slova 2 aminokyseliny a velikosti mezery (gap penalty) 4. Počítačová analýza a interpretace sekvenčních dat zahrnující porovnání sekvenci, jak se popisuje shora, se může provést běžným postupem za použití programů Intelligenetics™ Suitě (Intelligenetics lne., CA).

Podle vynálezu DZ-selektivní cDNA a genomové DNA stejně jako regulační oblasti získané z genomové DNA se používají pro modifikaci vlastností samovolného otevírání u rostlin, zvláště vlastností samovolného otevírání lusku u Brassica napus.

Pak podle vynálezu vzniká rekombinantní DNA, která obsahuje nejméně jeden chimérický DZ-selektivní gen obsahující v rostlinách exprimující promotor a transkribovanou oblast DNA, kdy jedna nebo obě části jsou odvozeny od DZ-selektivního genu podle vynálezu.

Exprese DZ-selektivního chimérického genu v transgenních rostlinách bude vykazovat fenotypické účinky pouze v buňkách v DZ. Pak exprese DZ-selektivního genu může selektivně předcházet, potlačit, inhibovat nebo redukovat fenotypické účinky exprese endogenních rostlinných genů v jisté zóně samovolného otevírání (jako je DZ lusku), dále může selektivně zabít nebo porušit buňky v DZ nebo může interferovat s normálním metabolizmem buněk v DZ, což vede ke zpoždění nebo k prevenci samovolného otevírání, zvláště k samovolnému otevírání lusku. Podle vynálezu rostlinná buňka je (jako je DZ buňka) usmrcena nebo porušena, jestliže všechny biochemické a/nebo fyziologické procesy buňky jsou zastaveny nebo v jiném případě, jestliže všechny biochemické a/nebo fyziologické procesy buňky se změní, aby účinně redukovaly extracelulární produkci nejméně jednoho enzymu, který se podílí na degradaci stěn rostlinných buněk, zvláště enzym degradující pektin, jako je polygalakturonáza, ·· ·· • · · · · · · ··

přednostně nejméně o 30%, zvláště nejméně o 75%, zejména pak nejméně o 90%.

Podle vynálezu dochází k prevenci, supresi, inhibici nebo redukci fenotypických účinků exprese endogenního genu v rostlinné buňce, jestliže se redukuje množství mRNA a/nebo proteinu produkovaného buňkou expresi endogenního genu, přednostně nejméně o 30%, zvláště pak nejméně o 75%, preferuje se nejméně o 90%.

Rostliny, u kterých se samovolné otevírání zpožďuje o různou dobu nebo dochází prevenci tohoto procesu, vznikají transformací rostliny rekombinantní DNA, která obsahuje nejméně jeden DZ-selektivní chimérický gen podle vynálezu, jehož exprese podle vynálezu vede k produkci RNA nebo proteinu nebo polypeptidu, který do určitého stupně interferuje s normálními funkcemi buněk zóny samovolného otevírání. Například redukcí fenotypických účinků exprese jednoho nebo více endogenních genů, které kódují enzymy hydrolyzující buněnčnou stěnu nebo usmrcením buněk DZ. Zpoždění samovolného otevírání, zvláště samovolného otevírání plodů, kdy se může předejít nebo redukovat ztráta semen, se může uplatnit u těch rostlin , které jsou náchylné ke ztrátě semen před dozráním (to je před sklizní).

V preferovaném provedení vynálezu DZ-selektivní chimérický gen obsahuje transkribovanou oblast DNA, která se přepisuje na RNA, jejíž produkce v buňkách v DZ redukuje, inhibuje nebo předchází expresi endogenního genu, přednostně genu kódujícího hydrolázu buněčné stěny, zvláště endopolygalakturonázu v buňkách v DZ. Redukce exprese endogenního genu se může prokázat redukcí mRNA v cytoplazmě, která je normálně produkovaná endogenním genem. Endogenní gen izolovaný z rostliny je označen jako sense gen, který kóduje sense mRNA (nebo sense pre-mRNA, to je nezpracovanou mRNA, která může zahrnovat intronové oblasti).

Preferuje se, že endogenní sense gen kóduje enzym, který se podílí na hydrolýze buněnčné stěny, přednostně enzym degradující pektin, jako je pektinová esteráza, pektinová methylesteráza, pektinová lyáza, pektátová lyáza, polygalakturonáza a podobně a zvláště endo-PG. Věří se, že enzymy degradující pektin, zvláště endo-polygalakturonázy, mají důležitou úlohu při degradaci materiálu střední lamely stěn roslinných buněk a v procesu samovolného otevírání a že selektivní inhibice produkce takových enzymů v zóně samovolného otevírání nebo v oblasti obklopující DZ (např. expresí antisense RNA k mRNA kódující endo-PG) v průměru prodlužuje vysypání lusku nejméně o jeden den, přednostně o 2 až 5 dnů.

Ačkoli sense gen může kódovat libovolnou hydrolázu buněčné stěny, která je vylučována buňkami v DZ během procesu samovolného otevírání a která se podílí na degradaci materiálu buněčné stěny v jisté zóně samovolného otevírání, jako je například celuláza, glukanáza nebo betagalaktozidáza, preferuje se , že sense gen je nedogenní DZselektivní gen.

Podle vynálezu DZ-selektivní chimérický gen kóduje antisense RNA, která je komplementární přinejmenším k části sense mRNA nebo sense pre-mRNA. Říká se, že taková antisense RNA je směrována na sense RNA (nebo sense pre-mRNA). V tomto ohledu kódovaná antisense RNA obsahuje oblast, která je komplementární k části sense mRNA nebo sense pre-mRNA, přednostně ji natahuje nejméně o 50 baží, přednostně nejméně mezi 100 a 1 000 baží. Horní omezení délky oblasti antisense RNA , která je komplementární k sense RNA, je samozřejmě plná délka sense pre-mRNA nebo lná délka sense mRNA (která může nebo nemusí být upravena z sense pre-mRNA). Avšak antisense RNA může být komplementární k libovolné části sekevnce sense pre-mRNA a/nebo zpracované sense mRNA: může být komplementární k sekvenci proximální k 5konci nebo k místu čepičky, dále k části nebo k celé 5'nepřeložené oblasti, k oblasti intronu nebo exonu (nebo k oblasti přemosťující exon nebo intron) sense pre-mRNA, dále k oblasti přemosťující nekódující a kódující oblast, k celé nebo k části kódující oblasti zahrnující 3'konec kódující oblasti a/nebo k celé nebo k části 3'nepřekládané oblasti. V případě sense genu je člen rodiny genů, preferuje se, že antisense RNA kódovaná DZselektivním chimérickým genem podle vynálezu obsahuje sekvenci, která je komplementární s oblastí sense RNA, například DZ-selektivní sense RNA, kterou tvoří nejméně 50 nukleotidů a která má procento sekevnčí identiry menší než 50%; přednostně méně než 30%, s libovolnou oblastí s 50 nukleotidy libovolné sense RNA kódované libovolným jiným členem rodiny genů.

Přepsaná oblast DNA v DZ-selektivním chimérickém genu podle vynálezu může také kódovat specifický RNA enzym nebo tzv. ribozym (např. publikace WO89/05852), který je schopný vysoce specifického štěpení sense mRNA nebo sense pre-mRNA. Říká se, že takový ribozym je směrován na sense RNA (nebo sense pre-mRNA).

Exprese endogenního genu, který v rostlině produkuje sense mRNA, může také být inhibován nebo potlačen DZselektivním chimérickým genem, který kóduje část nebo celou, přednostně celou, takovou sense RNA (Jorgensen et al. (1992), AgBiotech News Info 4: 265N).

Sense RNA, ke které jsou směrovány antisense RNA nebo ribozym kódovaný DZ-selektivním chimérickým genem podle vynálezu, je přednostně mRNA, kde (dvouřetězcová) cDNA takové mRNA obsahuje nukleotidovou skevenci SEQ ID NO:1 (nebo SEQ ID NO: 10) nebo její varianty. Preferovaná oblast cDNA odpovídající sense RNA, ke které jsou směrovány antisense RNA nebo ribozym kódovaný DZ-selektivním chimérickým genem podle • * · · · · · ·«·· • · · · ··· · · · · • · ·· ·· · · *··· · ·· · · · · ··· ·····«· ·· ·· ·· ·· vynálezu, obsahuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:1 s počátkem kdekoli mezi nukleotidem 890 a 950 a končící kdekoli mezi nukleotidem 1560 a 1620, jako je např. nukleotidová sekvence mezi nukleotidy 952 a 1607. Jiná preferovaná oblast cDNA odpovídající sense RNA, ke které jsou směrovány antisense RNA nebo ribozym kódovaný DZ-selektivním chimérickým genem podle vynálezu, obsahuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 1 začínající kdekoli mezi nukleotidem 1280 a 1340 a končící kdekoli mezi nukleotidy 1560 a 1620, jako je nukleotidová sekvence mezi nukleotidy 1269 a 1607.

DZ-selektivní chimérický gen kódující antisense RNA nebo ribozym, jak se popisuje zhora, je přednostně řízen DZselektivním promotorem. Zvláště použitelnými DZ-selektivními promotory jsou promotory z DZ-selektivních genů, které jsou zhora popsány, zvláště zvláště promotor, který je obsažen v 5'regulační oblasti sekvence SEQ ID NO: 13 mezi pozicí 1 a 2328. Avšak jestliže DZ-selektivni gen kóduje antisense RNA a/nebo ribozym, který je směrován k sense RNA produkované endogenním selektivním genem, přednostně genem kódující endopolygalakturonázu, není nutné , aby promotor DZ-selektivního chimérického genu byl DZ-selektibvním promotorem. Nicméně v takovém případě promotor DZ-selektivního genu by měl řídit expresi nejméně v buňkách ve DZ. Protože sense RNA se produkuje selektivně v buňkách v DZ, produkce antisense RNA nebo ribozymu kódovaného DZ-selektivním genem v jiných buňkách než jsou buňky v DZ, nebude mít zmiňovaný fenotypický účinek v uvedených buňkách. Příklady promotorů, které řídí expresi přinejmenším v buňkách v DZ jsou konstitutivní v rostlinách exprimující promotory, jako je promotor (P35S) transkriptu 35S květákového mozajkového viru (CaMV) (Guiley et al. (1982), Cell 30: 763) nebo promotor (Pnos) genu nopalinové syntetázy z Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al. (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1: 561).

V jiném preferovaném provedení vynálezu DZ-selektivní chimérický gen kóduje mRNA, která, když je produkována v rostlinných buňkách, je přeložena na protein nebo polypeptid, který interferuje s metabolizmem a/nebo fyziologií rostlinných buněk. Ve většině případů se produkce takového proteinu nebo polypeptidu nevyžaduje v jiných buňkách, než jsou buňky v DZ a s ohledem na tuto skutečnost se prferuje, že takové chimérické geny obsahují DZ-selektivní promotor. Zvláště použitelné Dz-selektivní promotory jsou opět promotory z DZ-selektivních genů popisovaných shora.

Podle vynálezu DZ-selektivní chimérický gen obsahuje přepisovanou oblast DNA kódující protein, jehož aktivita v buňce způsobí nárůst aktivity auxinů nebo jeho analogů. Takové proteiny se mohou například podílet na biosyntéze auxinů, jako je tryptofanová monooxygenáza a/nebo indol-3acetamidová hydroláza, kódovaná genem 1 T-DNA z Agrobacterium tumefaciens (iaaM) a/nebo genem 2 (iaaH) (Gielen et al. (1984), The EMBO J. 3: 835) nebo možná amidohydroláza, kódovaná genem ILR1 z Arabidopsis thaliana, který uvolňuje aktivní indol-3-octovou kyselinu (IAA) z IAA-konjugátů (Bartel and Fink (1995), Science 268: 1745). Vzhledem k pozorovanému poklesu množství IAA před samovolným otevřením lusku (příklad 1) se uvažuje, že produkce takového auxinu zvyšující proteiny selektivně v buňkách v DZ rostlin nepovede k usmrcení buněk, ale spíše povede

Tato skutečnost které je způsobeno nadměrnou produkcí IAA, k udržení a/nebo k obnovení hladiny IAA.

zpožďuje počátek samovolného otevření prostřednictvím opožděné inhibice pomocí produkce IAA a/nebo pomocí aktivity enzymu hydrolyzující buněčnou stěnu, který normálně vzniká v buňkách v DZ.

V jiném případě přepisovaná oblast DNA DZ-selktivního chimérického genu podle vynálezu může obsahovat otevřený čtecí rámec genu rolB z Agrobacterium rhizogenes (Furner et φ

φ φ φ φ φ φ φ

·· *φ

ΦΦΦ· φ φ· φ * φφ φ φ φφ • ΦΦΦ • φ • φ · φ al. , (1986), Nátuře 319: 422). Exprese takového DZselektivního chimérického genu v rostlině povede ke zvýšení citlivosti rostlinných buněk na auxin, prostřednictvím produkce produktu genu rolB v buňkách v DZ lusku, přičemž se bere v úvahu normální pokles koncentrace IAA v DZ, dříve než dojde vysypání lusku.

Podle vynálezu DZ-selektivní chimérický gen obsahuje přepisovanou oblast DNA kódující protein, jehož aktivita povede ke zvýšení citlivosti rostlinných buněk na ethylen. Pomocí mutační analýzy se identifikovalo několik genů, které se podílejí na průběhu signální transdukce ethylenu v rostlinách (např. ETR1, ETR2, EIN4, ERS, CTR1, EIN2,EIN3, EIN5, EIN6, HLS1, EIR1, AUX1, EIN7). U mnoha z nich se klonoval odpovídající gen (Chang (1996), TIBS 21: 129, Bleecker and Schaller (1996), Plant Physiol. 11: 653). Uvažuje se, že ETR1, ETR2, EIN4, ERS kódují receptory pro ethylen, zatímce zbytek genů se podílí na průběhu signální transdukce ethylenu downstream od receptorů (Ecker (1995), Science 268: 667). Receptory pro ethylen, které se sekvenovaly, vykazují homologii s doménou odpovědného regulačního komponentu a/nebo s doménou kinázy histidinového proteinu senzorového komponentu, který se nazývá bakteriální dvoukomponentové regulátory a dělí se do dvou tříd podle přítomnosti nebo absence domény nesoucí homologii. Třída I receptorů ethylenu zahrnuje obě homologní domény senzoru a obdržitele a jejími příklady jsou ETR1 (Arabidopsis) a eTAEl (rajče) . Třída II receptorů ethylenu obsahuje pouze doménu homologní s doménou histidin proteinové kinázy senzorového komponentu a jsou zastoupeny např. ERS (Arabidopsis) a NR (rajče) . Rceptory kódované mutantními alelami identifikovaných genů propůjčují dominantní necitlivost na ethylen (Chang et al. (1996), citace uvedena shora); Blecker and Schaller (1996) citace uvedena shora). Proto příklad DZ99 ·· • · « · » · ·· * ···· ·· ·» • · · • · ··· « « « ·· • ·9 ·99 selektivního chimérického genu, který obsahuje přepisovanou oblast DNA kódující protein, jehož aktivita vede k poklesu citlivosti rostlinných buněk na ethylen, jeden z těch, které obsahují otevřený čtecí rámec dominantní, na ethylen necitlivé, mutantní alely genu ETR1 z Arabidopsis thaliana, jako je ETR1-1 (Chang et al. (1993), Science 262: 539). Rostlina, ve které je takový DZ-selektivní chimérický gen exprimován, produkuje selektivně v buňkách v DZ mutantní receptor na ethylen (protein ETR1-1) a tyto buňky se proto stávají necitlivé na fytohormon ethylenu a metabolicky nereagují na změny v koncentraci hormonu. Uvažuje se, že v jiném případě přepisovaná oblast DNA obsahuje otevřený čtecí rámec dominantní, na ethylen necitlivé, mutantní alely libovolného ethylenových receptorů třídy I, které lze použít se stejným účinkem. V jiném příkladu takového DZ-selektivního chimérického genu, který propůjčuje rostlinným buňkám necitlivost na ethylen se může za stejným účelem použít přepisovaná oblast DNA obsahující obsahuje otevřený čtecí rámec dominantní, na ethylen necitlivé, mutantní alely libovolného ethylenových receptorů třídy II, jako je gen ERS z Arabidopsis thaliana, (Hua et al. (1995), Science 269: 1712) nebo gen NR z rajčete (Wilkinson et al (1995), Science 270:1807).

Dále se předpokládá, že zbytek produktů kódovanými geny, které se podílí na průběhu signální transdukce ethylenu, působí down stream od receptorů. V případě CTR1, EIN2 a EIN3 se geny klonovaly (Ecker (1995), Science 268: 667). Modulace exprese pozdních genů v DZ např. pomocí antisense RNA nebo RNA ribozymu, přepisovanou za řízení DZ-specifickho promotoru, který je cílen na zmíněné geny, bude také ovlivňovat citlivost na ethylen.

Podle vynálezu DZ-selektivní chimérický gen obsahuje přepisovanou oblast DNA kódující protein nebo polypeptid , který, pokud je produkovaný v buňkách, jako jsou buňky v Dz lusku, tyto buňky usmrtínebo přinejmenším podstatně interferuje s jejich metabolizmem, funkcemi nebo vývojem.

Příklady takových přepisovaných oblastí DNA jsou ty, co obsahují sekvence DNA kódující ribonukleázy, jako je RNáza TI

• 9 ··	··	··	··	··
·· · ·	• ·	•	• ·	•	•
• ·	• ·	···	• ·	··
• ·	• · ·	• ·	• ···	•	•
• ·	• ·	• ·	•	•	9
··· ····	··	··	·*	··

a zvláště barnáza (Hartley (1988), J. Mol. Biol. 202: cytotoxiny, jako jsou A-doména toxinu difterie al (1983), Proč. Nati.

hpseudomonas. Může se kóduj ících zahrnují, proteázy, fosfolipáza A2, proteiny s ale jako

Acad. Sci. USA 80: 6853) použít několik jiných cytotoxickými vlastnostmi, omezeny na sekvence DNA papain, glukanázy, lipázy

913) ;

(Greenland et nebo exotoxin sekvencí DNA

Příklady kóduj ící jako je nej sou jsou lipidové peroxidázy. Methylázy jako je Dam methyláza z E.coli, Dnázy jako je endonukleáza EcoRI, inhibitory buněčné stěny rostlin a podobně.

Podle vynálezu DZ-selektivní chimérický gen obsahuje přepisovanou oblast DNA kódující protein nebo polypeptid, který může být vylučován z rostlinných buněk a inhibovat přinejmenším aktivitu nejméně jedné endo-polygalakturonázy, která je produkována v DZ (jako je DZ lusku), zvláště endo-PG kódivané cDNA se sekvencí SEQ ID NO:1.

U DZ-selektivního chimérického genu podle vynálezu se preferuje, aby nepřekládaná oblast kódované RNA byla spojena s promotorem, jako je DZ-selektivní promotor chimérického genu. Avšak 5'nepřekládaná oblast může také pocházet z jiného exprimovatelného genu. Preferuje se, že DZ-selektivní chimérický gen podle vynálezu obsahuje kompletní 5'regulační oblast (přičemž zahrnuje 5'nepřekládanou oblast) DZselektivního genu. Zvláště vhodnou 5'regulační oblastí je oblast SEQ ID NO:13 umístěná bezprostředně upstream pozice 1 329, přednostně oblast zahrnující nejméně 490bp, výhodněji oblast zasahující do prvního restrikčního místa Sphl upstream pozice 2 329.

DZ-selektivní chimérické geny podle vynálezu s výhodou obsahují 3'nepřekládané oblasti, které řídí polyadenylaci mRNA a terminaci transkripce v rostlinných buňkách. Tyto signály lze získat z rostlinných genů, jako jsou polygalakturonázové geny, nebo se mohou získat z genů jiných než rostlinných. Příklady cizorodé 3'terminace transkripce a polyadenylačních signálů jsou ty pocházející z genu oktopinové syntetázy (De Greve et al. (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1: 499), z genu nopalinové syntetázy (Depicker et al. (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1: 561) nebo z genu 7 T-DNA (Velten and Schell (1985), Nucl. Acids Res. 13: 6998) a podobně.

Upřednostňuje se, aby rekombinantní DNA obsahující DZselektivní chimérický gen také obsahovala chimérický značící gen. Chimérický značící gen může obsahovat značící DNA, která je řízena a operabilně spojena jejím 5' koncem s promotorem exprimujícím v rostlinách, upřednostňuje se konstitutivní promotor, jako je promotor CaMV 35S nebo světlem indukovatelný promotor, jako je promotor genu kódujícího malou podjednotku Rubisco; a operabilně spojen jejím 3'koncem k vhodnému terminačnímu signálu transkripce a k polyadenylačnimu signálu. Značící DNA přednostně kóduje RNA, protein nebo polypeptid, který když je exprimován v buňkách rostlin umožňuje jenoduchou separaci takových buněk od buněk, ve kterých taková DNA není exprimována. Volba značící DNA není kritická a může se vybrat libovolná vhodná značící DNA. Například značící DNA může kódovat protein, který poskytuje transformovaným buňkám odlišitelnou barvu, další značící DNA je gen Al (Meyer et al. (1987), Nátuře 330: 677), který poskytuje transformované rostlinné buňce rezistenci na herbicid, jako je gen bar, kódující rezistenci na fosfinotricin (EP 0,242,246) nebo může poskytovat transformované buňce rezistenci na antibiotika, jako je gen aac(6') kódující rezistenci na gentamycin (W094/01560).

DZ-selektivní promotory podle vynálezu mají vysoce specifickou aktivitu nebo účinek, co se týče řízení genové exprese v buňkách z DZ. Avšak charakteristiky (např. tkáňová specifita) promotoru, který je obsažený v chimérickém genu, se mohou v některých rostlinách transformovaných chimérickým genem trochu modifikovat. To může být ovlivněno účinky pozice, jako výsledku náhodné integrace do genomu rostliny.

Proto se může v buňkách některých rostlin, které nepocházejí z DZ a jsou transformovány DZ-selektivním chimérickým genem podle vynálezu, pozorovat slabá exprese chimérického genu. Pak rostlinný genom může také být transformován druhým chimérickým genem, který obsahuje druhou přepsanou oblast DNA, která je řízena druhým v rostlinách exprimujícím promotorem a která kóduje RNA protein nebo polypeptid, jenž je schopen předcházet, působit proti aktivitě produktu genu inhibovat nebo

DZ-selektivního chimérického genu.

Jestliže DZ-selektivni chimérický gen kóduje barnázu, preferuje se, aby druhý chimérický gen kódoval barstar, což je inhibitor barnázy (Hartley (1988), J.

Mol. Biol. 202: 913). Jiné použitelné proteiny kódované druhými chimérickými geny jsou protilátky nebo fragmenty protilátek, přednostně jednořetězcové protilátky, které jsou schopny se specificky vázat na protein kódovaný DZselektivnim chimérickým genem, přičemž ten je biologicky deaktivován.

Druhý promotor je schopný řídit expresi druhé přepisované oblasti DNA přinejmenším v buňkách rostlin, které nepochází z DZ tak, aby předcházeli, inhibovaly nebo působily proti DZ-selektivnímu chimérickému genu v uvedených buňkách transformovaných rostlin. Příklady použitelných druhých promotorů jsou CaMV minimální 35S promotor (Benfey and Chua • · ·· ···· · · · ··· ···· ·· ·· ·· ·· (1990), Science 25: 959) nebo promotor genu nopalinové syntetázy T-DNA Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al. (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1: 561). Další použitelné promotory jsou ty, které pocházejí z genů známých tím, že nejsou aktivní v DZ, jako jsou geny z Brassica napus kódující mRNA, z kterých se dá připravit cDNA obsahující sekvenci SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 nebo SEQ ID NO: 11.

U rostlin se druhý chimérický gen s výhodou nachází na stejném genovém lokusu jako DZ-selektivní chimérický gen, čímž je zajištěna jejich společná segregace. Ta se může zajistit kombinací obou chimérických genů na jednoduché transformující DNA, jako je vektor nebo část stejné T-DNA. Avšak v některých případech není společná segregace vždy požadována. Proto obě konstrukce se mohou vyskytovat na oddělených transformujících DNA tak, že transformace může vést k integraci dvou konstrukcí do různých pozic rostlinného genomu.

V dalším provedení podle vynálezu se může získat rostlina s modifikovanými vlastnostmi samovolného otevření transformací buňky známým způsobem, což vede ke stabilní inkorporaci DZ-selektivního chimérického genu podle vynálezu do jaderného genomu.

Rekombinantní DNA obsahující DZ-selektivní chimérický gen může být stabilně začleněna do jaderného genomu buňky rostliny, zvláště rostliny, která je náchylná pro transformaci zprostředkovanou Agrobacterium. Transfer genu může probíhat pomocí vektoru, kterým je omezený Ti-plazmid obsahující DZ-selektivní chimérický gen podle vynálezu a který je nesen Agrobacterium. Tato transformace se může provést postupem popsaným například v publikaci EP 0,116,718. Vektorové systémy Ti-plazmidu obsahují DZ-selektivní chimérický gen umístěný mezi hraničními sekvencemi T-DNA nebo přinejmenším k levé z pravé hranice T-DNA. V jiném případě ···· ··· ···· • · · · ··· · «·· • · · · · · · · ···· · • · · · ♦ · · * · ······· ·· ·· ·· ·· libovolný jiný typ vektoru se může použít pro transformaci rostlinné buňky aplikujíc metody jako je přímý přenos genu (jak se popisuje například v publikaci EP 0,233,247), transformace zprostředkovaná pilem (jak se popisuje například v publikaci EP 0,270,356, Wo85/01856 a US 4,684,611), transformace zprostředkovaná rostlinným RNA virem (jak se popisuje například v publikaci EP 0,067,553 a US 4,407,956), transformace zprostředkovaná lipozomy (jak se popisuje například v publikaci US 4,536,475) a podobně.

Jiné způsoby jako jsou bombardování mikroprojektily, jak se popisuje například v publikacích Fromm et al (1990), Bio/Tecnology 8: 833) a Gordon-Kamm et al. (1990), The Plant Cell 2: 603) jsou také vhodné pro toto použití.

Buňky jednoděložních rostlin, jako jsou hlavně obilniny, mohou být také transformovány použitím poškozené nebo enzymaticky degradované intaktní tkáně, která je schopna tvořit kompaktní embryogenní kalus nebo z nich získaný embryogenní kalus, jak se popisuje v publikaci WO92/09696. Výsledná transformovaná rostlinná buňka se pak může běžným způsobem použít k regeneraci transformované rostliny.

Získaná transformovaná rostlina se může použít k běžnému šlechtění za účelem produkce více transformovaných rostlin se stejnými charakteristikami nebo pro zavedení DZ-selektivního chimérického genu podle vynálezu do jiných variant stejných nebo příbuzných rostlinných druhů. Semena získaná z transformovaných rostlin obsahují DZ-selektivní chimérický gen podle vynálezu, který se vyskytuje jako stabilní genomový inzert.

Následující příklady popisují izolaci a charakterizaci DZ-selektivního genu z Brassica napus, identifikaci DZselektivního promotoru a použití takového promotoru pro identifikaci vlastností samovolného otevírání plodů u rostlin. Jestliže není v příkladech uvedeno jinak, všechny • · · · • · postupy rekombinace DNA se provádějí podle standardních protokolů, jak se popisuje v publikaci Sambrook et al. (1989) Molecular clonning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY a v dílech 1 a 2 publikace Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Standardní materiály a metody pro molekulární manipulace rostlin se popisuje R.D.D.Croy v publikaci Plant Molecular Biology Labfax (1993) vydané nakladatelstvím BIOS Scientific Publications Ltd. (UK) a Blackwell Scientific Publications, UK.

Dále popisu a v	následuje seznam sekvencí, které se vyskytují v příkladech vynálezu.
SEQ	ID	NO:	1:	DZ-selektivní cDNA kódující endopolygalakturonázu z Brassica napus
SEQ	ID	NO:	2 :	oligonukleotid PG1
SEQ	ID	NO:	3 :	oligonukleotid PG2
SEQ	ID	NO:	4 :	oligonukleotid PG3
SEQ	ID	NO:	5:	oligonukleotid PG5
SEQ	ID	NO:	6 :	fragment PCR BPG32-26
SEQ	ID	NO:	7 :	fragment PCR KPG32-8
SEQ	ID	NO:	8:	fragment PCR LPG12-16
SEQ	ID	NO:	9:	fragment PCR LPG32-24
SEQ	ID	NO:	10 :	fragment PCR LPG32-25
SEQ	ID	NO:	11 :	fragment PCR LPG32-32
SEQ	ID	NO:	12 :	T-DNA z pGSV5
SEQ	ID	NO:	13 :	sekvence genomového klonu obsahujícího oblast

DZ-selektivniho promotoru, který řídí expresi endopolygalakturonázového genu Brassica napus.

Λ • · • · ·· · · ·· · · · · · ·· · · · · ··· • ·· ···· ·· ·· ·· ··

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Charakterizace samovolného otevírání lusku během vývoje lusku

Profily endogenních fytohormonů během vývoje

Rostliny Brassica napus cv Fido se pěstují v nevytápěném skleníku. Dvanáct dní po vyklíčení rostlin se přenesly do kompostu o objemu 1 OOOcm³, kde se nechaly dále růst. Lusky se sklízely v týdenních intervalech po dobu dvou až osmi týdnů po anthezi. Lusky se vzaly ze základny posledního z prvních tří úžlabních hroznů. U lusků se oddělily zóna samovolného otevření, stěna lusku a semena.

Vzorky se drtily ve třecí misce tloučkem a extrahovaly se po dobu 16 hodin při teplotě -20°C v celkovém objemu 80% metanolu. Čištění a analýza fytohormonů se provedla podobně jak se popisuje v publikacích Bialek and Cohen (1989), Plant Physiol. 90: 398; Prinsen et al. (1991), A Laboratory Guide for Cellular and Molecular Plant Biology. Ed. Negrutiu and Gharti-Chhetri. Birkhauser Verlag, Basel/Boston/Berlin pp. 175-185, pp. 323-324; Chauvaux et al. (1993), J. Chromatogr.

A 657: 337) .

U různých částí lusků (stěna lusku, zóna samovolného otevírání a semena) se testovaly koncentrace prekurzoru ethylenu 1-aminocyklopropan-l-karboxylové kyselina (ACC) a její konjugáty, stejně jako přítomnost indol-3-octové kyseliny (IAA) a jejích konjugátů.

Nejvyšší koncentrace ethylenu (Meakin and Roberts (1990), J. Exp. Bot. 41: 1003) se pozorovala bezprostředně před vysemeněním lusku; tento pík koreluje s pozorovaným koncentračním pikem volné ACC. Zvláště v zóně samovolného otevřeni se před počátkem samovolného otevření pozoroval pokles koncentrace IAA (volné I konjugované formy). Tento • ·

pokles koncentrace IAA specificky koreluje s nárůstem celulázové aktivity v zóně samovolného otevření.

Při dalších experimentech se produkce ethylenu inhibovala aplikací aminoethoxyvinylglycinu (AVG) na lusky, což je konkurenční inhibitor enzymu ACC-syntetázy. AVG se aplikovala 28 dní po anthezi v koncentraci 500mg/ml. Toto ošetření vedlo k 40 až 50 % redukci produkce ethylenuv celém lusku a bylo doprovázeno oddálením stárnutí stěny lusku o 4 dny. Pokles koncentrací endogenní ACC v zóně samovolného otevření a u semen ošetřených lusků koreluje s redukci produkce ethylenu. V jiných analyzovaných tkáních (stěna lusku, septum a zóna mezi zónou samovolného otevření a stěnou lusku) se takový nárůst koncentrace ACC nebo syntézy neprojevil. V tomto experimentu se také pozoroval pokles obsahu endogenní IAA v zóně samovolného otevření, který předchází otevření lusku v obouch rostlinách, jak kontrolních tak i ošetřených AVG.

Při testování úlohy auxinu při vysemenění lusku se pro úpravu koncentrace auxinu použil syntetický auxin 4chlorofenoxyoctová kyselina (4CPA). 35 dnů po anthesi se aplikoval 4CPA ve formě spreje v koncentraci 150 mg/1 za účelem uměle udržet vysokou koncentraci auxinu po celou dobu testu. Výsledkem je rozdílná retardace ve vysemenění lusku (tabulka č. 1) stejně jako opožděné stárnutí stěny lusku o přibližně dva týdny. Nepozoroval se žádný účinek na koncentraci endogenního fytohormonu. Aktivita beta-glukanázy se však v zóně samovolného otevření rapidně snížila. Tyto výsledky jasně indikují inhibiční účinek auxinu na produkci a/nebo aktivitu beta-glukanázy.

Pokles koncentrace auxinu je hlavní impuls pro vysemenění lusku.

• · ·· · · · · · · · · · ·· · · · · ··· ··» ···· φφ *φ ·»

Tabulka 1: Impuls (10-3 Ν) potřebný k inicici a propagaci otevření lusku měřený testem ohýbáni podle Cantilevera (Kadkol et al (1986), Aust. J. Bot. 34: 595) u plodů (8% vlhkost) řepky olejně cv Fido. Testované rostliny buď zůstaly neošetřené nebo se postříkaly AVG za účelem redukce koncentrace ethylenu nebo se použil spray 4CPA pro prevenci poklesu koncentrace auxinu. (SED: Standardní odchylka rozdílů; df: stupeň volnosti)

	neošetřené	AVG	4CPA	SED (27df)
pro iniciaci praskliny	143,6	170,8	194,9	14,4
pro propagaci praskliny	167,1	171,4	222,6	17,21

Demonstrace aktivity enzymu degradujícího polygalakturonát v zóně samovolného otevření lusku.

Lusky řepky olejně cv Fido se sklízely v 6,5 týdnu od antheze, odtržením pestíků a semen a z tkání obklopující zónu samovolného otevření se připravily surové extrakty. Tyto tkáně zahrnuji replum s vaskulárními svazky a tenkou membránou oddělující dva lokuly šešule. Extrakty se v podstatě testovaly s ohledem na jejich působení na polymerní substráty (uronové kyseliny) použitím testů se snížením molekulové váhy, který se zakládá na gelové chromatografií substrátu, který se inkubuje s vařeným a aktivním enzymem. Test zvláště detekuje enzymy s endogenní aktivitou, jako je odstranění jednoduchých monosacharidů což pouze velmi pomalu mění rozdělení molekulové hmotnosti polymerního substrátu.

• ····

Analýza uroních kyselin proběhla v podstatě jak se popisuje v publikaci Blumenkrantz and Asboe-Hansen (1973), Anal.

Biochem. 54: 484.

ukázat přítomnost smyslu.

DZ z lusků aktivity, které pektových polymérů

Tento test se zde použil pouze za účelem enzymové aktivity v přísně kvalitativním řepky olejně obsahuje všechny enzymové jsou nutné pro úplnou depolymerizaci nízkého stupně methylace. Zjistilo se, že jeden komponent směsi enzymů specificky působí na polygalakturonátové polymery. Dále se ukázalo, že ze známých roštlíných enzymů pouze endo-polygalakturonáza je zodpovědná za pokles molekulové váhy používaného polygalakturonátu.

Lze říci, že endo-polygalakturonáza má důležitou úlohu při rozsáhlé degradaci materiálu střední lamely, která se pozorovala během samovolného otevíráni lusků.

Anatomické pozorování během proceso samovolného otevírání

Detailní zkoumání struktury tkání lusku poskytlo hlubší pohled na anatomické změny spojené s biochemickými postupy, které probíhají v zóně samovolného otevření. Elektronovou mikroskopií se pozorovalo, že degradaci parenchymatických buněk umístěných v zóně samovolného otevření, v mezokarpu, septumu a v zóně abcize semen bezprostředně předchází rychlá dehydratace stěny lusku. Počáteční rozklad se projevil boptnáním buněčných stěn. Následné oddělení buněk se ukázalo pouze v zóně samovolného otevírání a pozorovalo se, že probíhá podél linie střední lamely, je následována disperzí mikrofibril buněčné stěny. U všech buněk zóny samovolného otevírání se pozorovalo oddělení, zatímco dvě víčka lusku zůstala přichycena pouze vaskulárními řetězci, které procházejí zónou samovolného otevření. Analýza za použití elektronové mikroskopie vykazuje velmi dramatickou degradaci střední lamely během otevření lusku, zatímco primární buněčná

stěna zůstává v podstatě neporušena, není zeslabena ani nezměkla. Tato pozorováni ukazují, že libovolný proces v primární buněčné stěně je přístup k degradaci střední lamely.

Kompletní rozpuštění střední lamely v buňkách v zóně samovolného otevírání indikuje přítomnost enzymů degradujících pektin, jako je endoPG. Zatímco takové enzymy degradují nabité části pektinů střední lamely, jiné polysacharidové hydrolázy, které vykazují afinitu k neutrálním polymérům, se účastní kompletní depolymerizace střední lamely.

Beta-galaktanáza a beta-glukanáza se čistily až do dosažení homegenity. Podrobné zkoumání substrátové specifity indikovalo, že tyto enzymy působí zeslabení primární buněčné stěny v zóně samovolného otevření.

Příklad 2: Izolace DZ-selektivního klonu cDNA endopolygalakturonázy z Brassica napus.

Připravila se poly-A+ mRNA zóny samovolného otevření lusku Brassica napus cv Topaz. Dvacet gramů tkáně (listy, zóny samovolného otevření, stěny lusků, kořeny nebo stonky) se umístilo do kapalného dusíku a homogenizovalo se po dobu 30 sekund ve Waringově mixéru se 100 ml extrakčního pufru (4M guanidin thiokyanát, 25mM citrát sodný, pH 7,o, 0,5% sarkosyl, O,1M 2-merkaptoetanol). Homogenát se přenesl do nových zkumavek a přidala se 1/10 objemu 2M acetátu sodného, pH4,0 a 1 objem TE saturovaného fenol/chloroformem. Roztok se promíchal, zchladil se na ledu po dobu 15 minut a centrifugoval se při 10 OOOxg po dobu 15 minut při teplotě 4°C. Supernatant se znovu extrahoval fenol/chloroformem, jak se popisuje zhora. Za účelem další extrakce supernatantu se přidal stejný objem izopropanolu a RNA se vysrážela při inkubaci přes noc při teplotě -20°C. Po centrifugaci při 10 OOOx g po dobu 15 min, se pelet RNA rozpustil ve 2 ml denaturačního pufru. Pak se přidalo čtrnáct mililitrů 4M LiCl a roztok se udržoval v ledové lázni přes noc. Pelet RNA se získal centrifugací při 10 OOOxg po dobu 15 minut, promýval se 80% etanolem, sušil se a rozpustil se v lml vody. Poly-A+ RNA se izolovala oligo-d(T) sefarózové koloně podle návodu výrobce (Boehringer, Mannheim).

Náhodná syntéza prvního řetězce cDNA nebo jeho syntéza za účasti oligo-d(T) primerů proběhla za použití M-MLV reverzní transkriptázy a 6pg celkové poly-A+ RNA, která se připravila shora popsaným způsobem za podmínek, které doporučuje výrobce (Life Technologies/BRL). První řetězec cDNA se použil jako templátová DNA pro další PCR reakce.

Čtyři degenerované primery se vytvořily na základě konzervativních oblastí podle publikovaných dat aminokyselinových sekvencí polygalakturonáz (PG) z rajčat (DellaPenna et al. (1986), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 6420; Grierson et al. (1986), Nucl. Acids Res. 14: 8595), kukuřice (Niogret et al. (1991), Plant Mol. Biol. 17: 1155), avokádo a oenotera (Brown and Crouch (1990), The Plant Cell 2: 263). Sekvence čtyř používaných primerů (PG1, PG2, PG3 a PG5) jsou popsány v SEQ ID NO S 2-5. Místo restrikčního enzymu EcoRI se začlenilo na 5-konec dvou upstream primerů PG1 a PG3 a místo BamHI se zavedlo na 5-konec dvou downstream primerů PG2 a PG5.

Všechny reakce PCR měly následující konečné složení: 50mM KC1, lOmM Tris-HCl, pH8,3, l,5mM MgCl a 0,001% (váha/objem)želatiny, lOOpmol degenerovaných primerů a 1U Taq DNA poymerázy v reakci o objemu 50μ1.

Po počáteční denaturaci templátové DNA při teplotě 95°C po dobu 3 minut v lxPCR pufru, se reakce iniciovala přidáním 1U Taq DNA polymerázy v lxPCR pufru (PCR s horkým startem) za následujících podmínek: lminuta při teplotě 95°C, 1 minuta při teplotě 45°C a 1 minuta při teplotě 72°C po 35 cyklů, pak následuji 3 minuty při teplotě 72 °C. Při hnízdovém PCR2 s horkým startem jedna z reakcí se použila jako templát pro novou reakci PCR. Produkty PCR se extrahovaly chloroformem a srážely se etanolem, rozpustily se v TE a štěpily se restrikčními enzymy BamHI a EcoRI. Štěpené produkty PCR se izolovaly z agarózy tající při nízkých teplotách a klonovaly se do vektoru pGEM-7z, který byl štěpen BamHI a EcoRI. Způsobem terminace dideoxy řetězce Sequenase verze 2.0 (Pharmacia) se získaly sekvence DNA PCR fragmentů.

Použitím kombinace primerů PG1/PG5 se získal nejdelší fragment PCR. Hnízdová PCR s horkým startem proběhla za použití kombinace primerů PG3/PG2, PG1/PG2 nebo PG3/PG5 a malého množství obsahu PCR reakce s primery PG1/PG5, který se použil jako templát. Sekvenováním PCR produktů se určilo sedm vysoce divergentních klonů příbuzných s PG, což ukazuje na přítomnost nejméně sedmi různých PG izoforem. Z jedné tkáně se získaly pouze tři formy, jmenovitě Ipg32-25 (SEQ ID No 10) ze zón samovolného otevírání, kpg32-8 (SEQ ID No 7) ze stěn lusků a bpg32-26 (SEQ ID No 6) z listů. Lpg32-32 (SEQ ID No 11), Ipg 32-24 (SEQ ID No 9) se nachází pouze ve dvouch tkáních lusků, zatímco Ipgl2-16 (SEQ ID No 8) se získala ze tří analyzovaných tkání. Je nutné poznamenat, že Ipg35-8 (obsahující sekvenci DNA SEQ ID No 1 z polohy 884 do polohy 1 245) je typ, který se určil pouze v zóně samovolného otevírání, v případě, kdy se použila kombinace primerů PG3/PG5 v reakci hnízdového PCR.

Northernovou analýzou se zkoumala exprese PG-přibuzného PCR klonu Ipg35-8 v kořenech, stoncích, listech a hypokotylech a během vývoje lusku. Celková RNA jednotlivých tkáních se oddělila gelovou elektroforézou v 0,66 M formaldehyd/1% agaróza gelu (Sambrook et al. (1989), citace uvedena shora). RNA se přenesla na filtry Hybond-N a fixovala se tam UV-radiací. Filtry se pre-hybridizovaly po dobu 4 hodin v roztoku, který obsahuje 5x Denhardt, 25 mM Na2HPO4, 25 mM NaHP04, 0,1% pyrofosfát, 750mM NaCl, 5mM EDTA a 100 gg/ml DNA spermatu heringa denaturované při teplotě 68 °C. Produkty PCR se značily radioaktivně, denaturovaly se teplem a přímo se přidaly do pre-hybridizačního roztoku a hybridizovaly se po dobu 16 hodin při teplotě 68°C. Filtr se promýval podle publikace Sambrooka et al, (1989), citace uvedena shora, kdy konečné promytí se provedlo při teplotě 68°C v roztoku 0,2x SDS, 0,1% SDS. Filtry se podrobily autoradiografii při teplotě -80°C za použití zintenzivňující obrazovky.

V celkové RNA izolované z kořenů, listů a hypokotyl se neidentifikoval transkrypt, který by hybridizoval s klonem Ipg35-8. Avšak tento klon hybridizoval s transkriptem o velikosti 1,6 až 1,7 kb, který se exprimuje pouze v zóně samovolného otevírání během všech analyzovaných stádií a zjistilo se, že jeho množství se významně zvyšuje po pátém týdnu.

V inzertních vektorech Lambda ZAP®II (Stratagen) se zkonstruovala DZ selektivní cDNA knihovna za použití 5 gg poly-A+ RNA, která se izolovala v zóně samovolného otevírání 6 týdnů po antezi. Z agarozového gelu tajícího při nízké teplotě se izolovala cDNA o velikosti větší než 1 kbp a ligovala se do vektoru Lambda ZAP®II. Primární knihovna s inzertem cDNA o průměrné velikosti přibližně 1,5 kbp tvoří l,25xl0⁶ pfu. Testování knihovny se provedlo podle standardního postupu za přísných podmínek (Sambrook te al., (1989), citace uvedena shora).

cDNA se sekvenovaly za použití sequenázy verze 2.0 (Amersham). Sekvenční analýza proběhla se softwarem, který analyzuje GCG sekvenci verze 7 (Devereux et al (1984), Nucl. Acids Res. 12: 387).

• ·

Při testovaní 300 000 plak za použití PCR fragmentu Ipg35-8 jako próby vzniklo přibližně 200 pozitivních hybridizačních signálů. Pět silně hybridizujících plaků se čistilo až do dosažení homogenity. Inzert DNA se vystřihl z lambda vektoru. Analýza cDNA inzertů restrikčními enzymy ukázala, že cDNA inzerty tvoří přibližně 1 600 bp všech klonů cDNA mimo jednoho, který nese inzert pouze o velikosti 1 300 bp. Mapování čtyř největších cDNA inzertů (označených jako X,5,9 a 11) restrikčními enzymy ukazují malé odchylky.

Nejpozoruhodnější je přítomnost místa, který rozpoznává restrikční enzym Nsil, v cDNA klonech X a 11 a přítomnost místa HindlI v cDNA klonu 9. Naopak žádné z uvedených restrikčních míst není přítomno v cDNA klonu 5. Částečné sekvenování 5'a 3'konců cDNA vykazuje další odlišnosti sekvencí, které zahrnují malé delece/inzerce mezi různými klony cDNA. Tyto výsledky vykazují expresi různých, ale vysoce homologních genů kódujících PG v zóně samovolného otevírání. Tyto sekvenační data také ukazují, že všechny 4 větší inzerty cDNA obsahovaly celou kódující sekvenci proteinu PG.

Celá sekvence cDNA klonu X a dedukovaná aminokyselinová sekvence jeho největšího otevřeného čtecího rámce je popsaná v SEQ ID č. 1. Otevřený čtecí rámec kóduje protein o velikosti 433 aminokyselin, jehož odhadnutá molekulová váha je 46,6kD a který vykazuje podstatnou podobnost se známými endopolygalakturonázami. Podobně jako jiné hydrolázy buněčné stěny také předpokládaná DZ-selektivní endo-PG se v počátku produkuje jako prekurzor, který obsahuje N-terminální signální peptid, jenž se ko-translačně odštěpuje. Místo štěpení se nejpravděpodobněji nachází mezi 23 a 24 aminokyselinou a vzniká tak zralý protein, jehož molekulová váha se odhaduje na 44,2 kD.

·< »· ·· ···· · · · · · · · • · «··♦· · · · · • · ·· · · · · · · · · · ·· ···· ··· ··· ···· ·· ·· ·♦ ·· ³⁸

Northenová analýza, kdy se jako sonda použije klon X, potvrzuje a rozšiřuje dříve získaný patern exprese. Celková RNA se připravila z různých tkání lusků (zóna samovolného otevření, stěny lusku, semena a septum) v pěti časových bodech (2,3,5,7 a 9 týdnů po antezi-WAA). Gelovou elektroforézou se oddělilo 5[ig celkové RNA a hybridizovalo se s radioznačenou cDNA se sekvencí uvedenou v SEQ ID No 1 za přísných podmínek, které jsou shora popsány. Autoradiogram vznikl po celonoční expozici. Při 2 WAA nevznikl žádný signál, při 3 WAA se pozoroval slabý signál. Na základě densitometrického měření úroveň exprese v časovém bodě 5 WAA dosáhla okolo hodnoty 3,5x množství změřeného v bodě 3 WAA; v bodě 7 WAA byla 7x množství naměřeného v bodě 3WAA; a v bodě 9 WAA to bylo 12x množství naměřené v bodě 3 WAA. Ve stěnách lusků nebo v semenech se nedetekoval žádný signál. Slabá exprese (srovnatelná s hodnotou v bodě 3 WAA u DZ) se naměřila v septumu v bodě 9 WAA.

RNA používaná v tomto experimentu se extrahovala z tkání rostlin, jejichž vývoj trval okolo 9 týdnů.

Příklad 3: Izolace DZ-selektivního promotoru z genomového klonu B. napus, který odpovídá cDNA klonu Ipg35-

8.

Testovala se komerčně dostupná genomová knihovna lambda EMBL3 Brassica napus cv. Bridger (Clontech Laboratories, lne.) v kmeni NM538 Escherichia coli. Po přenesení na membránu Hybond-N se cDNA Ipg35-8 radioaktivně značila za použití náhodného navázání primerů a filtry se hybridizovaly za přísných podmínek v roztoku, který obsahuje 5xSSPE, 5x Denhardt, 0,5% SDS, 50 gg/ml DNA heringa (lxSSPE: 0,18M NaCl, 10 mM fosforečnan sodný, pH7,7, lmM EDTA), filtry se dále promývaly za přísných podmínek (konečné promytí: teplota 68°C, 0,lxSSPE, 0,1% SDS). Testovalo se přibližně 600 000 plaků a izolovalo se dvanáct hybridizujících plaků. Dva hybridizující plaky, lambda 2 a 11, se testovaly dvakrát. Následující druhé testování fágových lyzátu se provedlo pro lambda 2 a 11 v E.coli NM538, klony rostly bez přítomnosti maltózy. DNA z lambda 2 a lambda 11 se štěpila enzymem Sáli, provedla se gelová elektroforéza a DNA se přenesla na nylonovou membránu Hybond-N. Hybridizací se značenou cDNA klonu Ipg35-8 vznikly pro oba klony identické hybridizační paterny. Z lambda 11 se izoloval silně hybridizující Sáli fragment o velikosti 6,3 kb a začlenil se do plazmidů pUC18, vznikl klon 6,3Sal. Za účelem potvrdit, že 6,3Sal fragment koresponduje s Ipg35-8 se vytvořil sekvenční primer, který umožňuje určit část DNA kódující dvě aminokyseliny, jenž se nacházejí v Ipg35-8. Dideoxy sekvenování podle Sangerovy metody potvrzuje, že izolovaný genomový klon 6,3Sal je v tomto ohledu stejný jako cDNA Ipg35-8. Restrikčni mapování tohoto klonu ukázalo, že uvedený klon zabírá celý otevřený čtecí rámec Ipg35-8 a obsahuje více jak přibližně 100 až 200 bp downstream sekvence a přibližně 3,5 kb upstream sekvence. Určila se sekvence DNA tohoto úseku o velikosti 2,3 kb (zahrnující promotor, 5'nepřekládanou oblast a prvních 24 nukleotidů otevřeného čtecího rámce) a je uvedená jako SEQ ID No. 13.

Na základě skutečnosti, že z různých B. napus kultivarů (cv. Topaz a cv. Bridger) se izolovala cDNA klonu (SEQ ID No 1) a genomového klonu (SEQ ID No 13), se překvapivě zjistilo, že porovnání obouch sekvencí ukazuje, že přečnívající fragment vykazuje 100% sekvenční identitu.

Počáteční místo transkripce DZ selektivního genu, který odpovídá genu obsaženému v klonu 6,3Sal, se orčilo použitím obecně známých metod jako je nanalýza prodlužováním primerů (Sambrook et al (1989) Molecular Clonning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ·· ·· ·· ·· • * 9 9 9 9

9999 9 9 9 9

99 99 9 9 9 · 9 9 9 9 9

99 99 99

• *

NY) nebo RACE-PCR (Innis et al (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academie Press lne.) Uvažuje se, že 5'UTL se nachází mezi pozicemi 2 219 a 2 227 Sekvence SEQ ID No 13 .

Za použití dobře zavedené metody místně řízené mutageneze (Ausubel et al. (1994), citace uvedená shora) se sekvence DNA modifikovala a vzniklo jediné místo pro restrikční enzym (např. Ncol), které se nachází okolo iniciačního translačního kodónu ATG kódující sekvence. Pak následuje přímá fúze oblasti promotoru DZ-selektivního genu se sekvencí DNA a vznikl DZ-selektivní chimérický gen podle vynálezu. Za použití jediného restrikčního místa, které se nachází mezi 500 až 2 000 bp upstream (to je na 5') a jediného restrikčního místa, které obklopuje translační iniciační kodón ATG, se izoloval dobře definovaný fragment DNA, který se v podstatě používá jako promotorové kazeta PZD, která řídí DZ selektivní expresi v rostlinách.

Například SphI-NcoI fragment (okolo 2,08 kb), který je schopný řídit DZ-selektivní expresi v rostlinnách, se používá v podstatě jako promotorové kazeta PDZ1.

Zkonstruoval se DZ-selektivní chimérický gen (PDZ nebo PDZl-gus-3nos), který obsahuej následující operabilně spojené DNA fragmenty:

PDZ nebo PDZ1: 5'regulační oblast obsahující DZselektivní promotor, gus: fragment DNA kódující beta-glukuronidázu (Jefferson et al (1986) Proč. Nati. Acad. Sci USA 83: 8447).

3'nos: 3'nepřekládaný konec obsahující polyadenylační místo genu syntetázy nopalinu (3'nos) (Depicker et al. (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1: 561).

• *4 ·* ·· ·· • · · · 9 · 9 ···· » · · 4 ··· · ♦ ·♦ φ Φ · · · · · · ·*· · « ·· ···· · · · a·· ··*· ·· ·· ·* ··

Druhá promotorové kazeta, která je schopna řídit DZselektivní expresi v rostlinnách, se získala použitím dobře zavedené metody místně mutace k modofikaci sekvence DNA za účelem bezprostředně upstream vytvořit jediné restrikční místo translačního iniciačního kodónu kódující sekvence. Pro tyto účely se manipulovala Smál místo, ležící bezprostředně upstream ATG-kodónu změnou A-nukleotidů

SEQ ID No 13 v pozicích 2327 a 2328 na G-nukleotidy. Fragment SphI-Smal o velikosti 2,1 kb, zde se nazývá promotorové kazeta PDZ2, se fúzoval v Smál místě upstream GUS kódující sekvence do plazmidů pBHOl (Clontech Laboratories, lne CA,

USA), což vede ke vzniku plazmidů (2.Iguspgem7), který nese konstrukci chimérického genu PDZ3-gus-3'nos.

Zkonstruoval se chimérický selekční markrový gen PSSUbar-3'ocs (De Almeide et al. (1989), Mol. Gen. Genet.

218:78). Tato konstrukce obsahuje následující operabilně spojené fragmenty DNA:

PSSU: promotorové oblast genu kódujícího podjednotku IA ribuloze-1,5-bifosfátová karboxylázy Arabidopsis thaliana (Krebbers te al. (1988), Plant Mol. Biol.

11: 745), bar: oblast genu bar kódující fosfinotricinacetylovou transferázu (Thompson et al. (1987), The EMBO J.

6:2519) ,

3'ocs: 3'nepřekládaný konec obsahující polyadenylační místo genu oktopinové syntetázy (De Greve et al. (1983), J. Mol. Appl. Genet. 1: 499).

V jiném případě se zkonstruoval PSSU-bar-3'g7, který obsahuje identické fragmenty jako předcházející chimérický selekční markrový gen, mimo skutečnosti, že 3'ocs se nahradil 3'nepřekládaným koncem, který obsahuje polyadenylační místo • ·* ·· ·· ·· ·· ···< ··· · · » · • · · · ··· · · ·· • ·«····· ··· · · ·· ···· ··· ··· ···· ·· ·· ·· ··

T-DNA genu 7 (3^zg7; Velten and Schell (1985), Nucl. Acids

Research, 13, 6981).

DZ-selektivní chimérický gen (PDZ2-gus-3'nos; klonovaný jako HindlII-Xhol fragment o velikosti 4,2 kb) a chiméricky markrový gen (PSSU-bar-3'g7) se zavedl do polylinkru, který se nachází mezi hraničními sekvencemi T-DNA vektoru pGSV5, přičemž vzniká plazmidový vektor pTCO155 nesoucí mezi hraničními repeticemi T-DNA konstrukce PDZ2-gus3' nos a pSsuAra-bar-3'g7 chimérického genu. pGSV5 se odvodil od plazmidu pGSC1700 (Cornelissen a Vandewiele (1989), Nucl. Acids Res. 17: 833), ale liší se tím, že neobsahuje gen betalaktamázi a že jeho T-DNA se charakterixuje sekvencí SEQ ID č. 12.

Příklad 4: Konstrukce chimérického genu nesoucího kódující oblast barnázi, kterou řídí endo-PG promotor.

Zkonstruoval se DZ-selektivní chimérický gen (PDZbarnáza-3'nos nebo PDZl-barnáza-3'nos nebo PDZ2-barnáza3'nos), který obsahuje následující operabilně spojené fragmenty DNA:

PDZ nebo PDZlnebo PDZ2: 5'regulační oblast popsanou v příkladu 3 obsahující DZ-selektivní promotor, barnáza: fragment DNA kódující barnázu z Bacíllus amYlollquefaciens (Hartley (1988), J. Mol. Biol. 202: 913) .

3^znos

Oba DZ-selektivní chimérický gen a PSSU-bar-3'g7 nebo PSSU-bar-3^zocs chimérický markrový gen se zavedly do polylinkru, který se nachází mezi hraničními sekvencemi T-DNA vektoru pGSV5 popsaného v příkladu 4.

PDZ2-barnáza-3'nos mezi T-DNA hraničními repeticemi se zkonstruoval nahrazením pTA29 promotoru upstream oblasti • · kódující barnázu v pTC099 promotorovou kazetou PDZ2. K tomuto konci se připojil SphI-Smal fragment o velikosti 2,1 kb (s tupým koncem) obsahující PDZ2. Jeho Smál restrikční místo se fúzovalao s tupým koncem Ncol restrikčního místa, přes které přesahuje ATG-kodón, který se manipuloval na 5'konci kódující sekvence, aby se dosáhlo dokonalé barnázy v pTCO99, přičemž vzniká plazmidový vektor pTPRl nesoucí PDZ2-barnáza-3nos chimérický gen mezi T-DNA hraničními repeticemi. Část T-DNA vektoru pTC099 se odvodila od pGSV5 inzercí EcoRI linkru (GGAATTCC) do Smál restrikčního místa polylinkru a BglI linker (GAGATCTG) do Ncol místa polylinkru , po čemž následuje zavedení chimérického genu pTA29-barnáza-3nos pTCO113 (WO96/26283) do EcoRI restrikčního místa polylinkru. Zavedení chimérického selekčního markrového genu pSSUAra-bar3'g7 do sekvence polylinkru pTPRl mezi T-DNA hraniční repetice vede ke vzniku pTPR3.

Zkonstruoval se další T-DNA vektor (pTPR2), kde DZselektivní chimérický gen popsaný výše v textu (PZD2-barnáza3'nos) je doprovázen BglII fragmentem pTCO113 (WO96/26283), který obsahuje oblast kódující barstar, řízenou promotorem nopalinové syntetázy (pnos-barstar-3'g7) začleněného do polylinkru pTPRl mezi T-DNA hraniční repetice. Zavedení chimérického selekčního markrového genu pSSUAra-bar-3'g7 do sekvence polylinkru pTPR2 mezi T-DNA hraniční repetice vede ke vzniku pTPR4.

Příklad 5: Konstrukce DZ-selektivního chimérického genu kódujícího produkt T-DNA genu 1 nebo produkt genu rolB.

Zkonstruoval se DZ-selektivní chimérický gen (PDZ-gl3'nos), který obsahuje následující operabilně spojené fragmenty DNA:

• · · · · · ··· • ·· ·· ···· · • · · · · · · ·· · · · · · ·

PDZ nebo PDZ1 nebo PDZ2: 5'regulační oblast podle příkladu 3; obsahující DZ-selektivní promotor, gl: fragment DNA kódující tryptofanovou 2- monooxygenázu z Agrobacterium tumefaciens (iaaM nebo produkt T-DNA genu 1) (Gielen et al. (1984) EMBO J.

3:835), získaný pomocí PCR za použití vhodně vytvořených primerů, které obsahují sekvence identické nebo komplementární se sekvencemi bezprostředně lemujícími gen 1.

3''nos

Zkonstruoval se druhý DZ-selektivní gen (PDZ-g2-3'nos), který obsahuje následující operabilně spojené fragmenty DNA:

PDZ nebo PDZ1 nebo PDZ2: 5'regulační oblast podle příkladu 3; obsahující DZ-selektivní promotor, g2: fragment DNA kódující indol-3-acetamidovou hydrolázu z Agrobacterium tumefaciens (iaaH nebo produkt T-DNA genu 2) (Gielen et al. (1984) EMBO J.

3:835), získaný pomocí PCR za použití vhodně vytvořených primerů, které obsahují sekvence identické nebo komplementární se sekvencemi bezprostředně lemujícími gen 1.

3'nos

Oba DZ-selektivní chimérický gen (buď samotný PDZ-gl3'nos nebo v kombinaci s PDZ-g2-3'nos) a PSSU-bar-3'ocs nebo PSSU-bar-3'g7 chimérický markrový gen se zavedly do polylinkru, který se nachází mezi hraničními sekvencemi T-DNA vektoru pGSV5 popsaného v příkladu 4.

Zkonstruoval se další DZ-selektivní chimérický gen (PDZrolB-3'nos) obsahující následující operabilně spojené fragmenty DNA:

PDZ: 5'regulační oblast podle příkladu 3; obsahující DZ-selektivní promotor, rolB: otevřený čtecí rámec genu rolB z Agrobacterium rhizogenes (Furner et al. (1986), Nátuře 319:422)

3nos

Oba DZ-selektivní chimérický gen a PSSU-bar-3ocs nebo PSSU-bar-3g7 chimérický markrový gen se zavedly do polylinkru, který se nachází mezi hraničními sekvencemi T-DNA vektoru pGSV5 popsaného v příkladu 4.

Příklad 6: Konstrukce DZ-selektivního chimérického genu kódujícího mutantní ETR1-1 etylenový receptor.

Zkonstruoval se DZ-selektivní chimérický gen (PDZ-etrl1-3'nos) obsahující následující operabilně spojené fragmenty DNA:

PDZ nebo PDZ1 nebo PDZ2: 5'regulační oblast podle příkladu 3; obsahující DZ-selektivní promotor, etrl-1: otevřený čtecí rámec dominantní na etylen necitlivé mutantní aley genu ETR z Arabidopsis thaliana (Chang et al. (1993), Science 262:239), který se izoloval jako fragment o velikosti 2,7 kb obsahující exony kódující sekvence oddělené 5 introny, které se získaly amplifikaci PCR za použití plazmidu nesoucího 7,3 kb genomový fragment EcoRI obsahující DNA mutantní alely etrl (Chang et al (1993), Science 262:539) a vhodně vytvořené primery.

3nos

Oba DZ-selektivní chimérický gen a PSSU-bar-3ocs nebo

PSSU-bar-3g7 chimérický markrový gen se zavedly do polylinkru, který se nachází mezi hraničními sekvencemi T-DNA vektoru pGSV5 popsaného v příkladu 4.

• · • · · ·· ···· ·· ······· ·· ·· ·· ··

Přiklad 7: Konstrukce DZ-selektivního chimérického genu kódujícího antisense RNA komplementární k mRNA, ze které se může připravit cDNA o sekvenci SEQ ID No 1.

Zkonstruoval se DZ-selektivní chimérický gen (PDZ-antiPG-l-3'nos) obsahující následující operabilně spojené fragmenty DNA:

PDZ nebo PDZ1 nebo PDZ2: 5'regulační oblast podle příkladu 3; obsahující DZ-selektivní promotor, anti-PG-1: fragment DNA kódující RNA, která je komplementární k RNA kódované oblastí o sekvenci SEQ ID No 1 mezi pozicemi nukleotidů 10 a 1600.

3'nos

Promotor CaMV35S 35S-antisense PG konstrukce obsahující sekvenci DNA komplementární k celé sekvenci uvedené v SEQ ID No 1 klonované mezi CaMV 35S promotor a polyadenylační signál (jak se popisuje níže v textu) se eliminoval štěpením s HincII a Xhol a nahradil se fragmentem obsahujícím PDZ2.

Oba DZ-selektivní chimérický gen a PSSU-bar-3'ocs nebo PSSU-bar-3g7 chimérický markrový gen se zavedly do polylinkru, který se nachází mezi hraničními sekvencemi T-DNA vektoru pGSV5 popsaného v příkladu 4.

Zkonstruoval se další DZ-selektivní chimérický gen (PDZanti-PG-2-3'nos) obsahující následující operabilně spojené fragmenty DNA:

PDZ nebo PDZ1 nebo PDZ2: 5' regulační oblast podle příkladu 3; obsahující DZ-selektivní promotor, anti-PG-2: fragment DNA kódující RNA, která je komplementární k RNA kódované oblastí o sekvenci SEQ ID No 1 mezi pozicemi nukleotidů 20 a 700.

3'nos • · ·

Oba DZ-selektivní chimérický gen a PSSU-bar-3'ocs nebo PSSU-bar-3'g7 chimérický markrový gen se zavedly do polylinkru, který se nachází mezi hraničními sekvencemi T-DNA vektoru pGSV5 popsaného v příkladu 4.

Zkonstruoval se další DZ-selektivní chimérický gen (PDZanti-PG-3-3'nos) obsahující následující operabilně spojené fragmenty DNA:

PDZ nebo PDZ1 nebo PDZ2: 5'regulační oblast podle příkladu 3; obsahující DZ-selektivní promotor, anti-PG-3: fragment DNA kódující RNA, která je komplementární k RNA kódované oblastí o sekvenci SEQ ID No 1 mezí pozicemi nukleotidů 800 a 1600.

3'nos

Oba DZ-selektivní chimérický gen a PSSU-bar-3'ocs nebo PSSU-bar-3'g7 chimérický markrový gen se zavedly do polylinkru, který se nachází mezi hraničními sekvencemi T-DNA vektoru pGSV5 popsaného v příkladu 4.

Vytvořily se další tři antisence konstrukce obsahující CaMV 35S promotor, sekvenci DNA komplementární k celé sekvenci uvedené v SEQ ID No 1 nebo sekvenci DNA komplementární k 679 bp 3'konce sekvence SEQ ID No 1 (A30) a polyadenylační signál. Vystřihla se cDNA z cDNA-knihovny klonu X jako fragment EcoRI-Xhol a zavedl se do pBluescript® (Stratagene, CA, USA). Z uvedeného plazmidu se izolovala cDNA v plné délce jako fragment BamHI-XhoI a začlenil se do vektoru pRTlOO štěpeného BamHI-XhoI (Topfer et al (1987) Nucleic Acids Research 15, 5890) mezi promotor CaMV35S a polyadenylační signál. Výsledný plazmid se štěpil BamHI a EcoRI a aplikoval se Klenow polymeráza a uzavřel se ligací.

Do Smal-Xhol štěpeného vektoru pRTlOO se mezi promotor CaMV35S a polyadenylační signál začlenil HaelII-XhoI fragment plazmidu Bluescript® s inzertem cDNA, který obsahuje 679 bp 3'konce sekvence SEQ ID No 1, přičemž vzniká plazmid A67.

Konstrukce A67 se štěpila restriktázami Xbal a Styl, aplikovala se Klenow polymaráza a uzavřela se ligaci, vznikl plazmid A30, který mezi promotorem CaMV35S a polyadenylačním signálem obsahuje sekvenci DNA komplementární s 336 bp 3''konce sekvence SEQ ID No 1. Chimérické geny se izolovaly jako fragmenty Pstl.

35S-antisense PG chimérický gen a PSSU-bar-3'ocs nebo PSSU-bar-3'g7 chimérický markrový gen se zavedly do polylinkru, který se nachází mezi hraničními sekvencemi T-DNA vektoru pGSV5 popsaného v příkladu 4.

Příklad 8: Transformace řepky olejně a charakterizace jejích transformantů

Transformace zprostředkovaná bakteriemi Agrobacterium

Izolovaly se explanty hypokotyl z Brassica napus, kultivovaly se a následně se transformovaly jako se popisuje v publikaci De Block et al (1989), Plant physiol. 91: 694 s následujícími změnami:

Explanty hypokotyl se prekultivují po dobu 3 dnů v médiu A2 (MS, 0,5g/l Mes (pH7,5), 1,2% glukóza, 0,5% agaróza, 1 mg/1 2,4-D, 0,25 mg/1 kyseliny naftalénoctové (NAA) a 1 mg/1 6-benzylaminopurin (BAP)).

Infekčním médiem A3 je MS, 0,5g/l Mes (pH5,7), 1,2% glukóza, 0,1 mg/1 kyseliny naftalénoctové (NAA) a 0,75 mg/1 6-benzylaminopurin (BAP) a 0,01 mg/1 kyseliny giberelové (GA3).

selekčním médiem A5 je MS, 0,5 g/1 Mes (pH5,7), 1,2%

glukóza,	40 mg/1 adenin	SO4,	0,5 g/1
polyvinylpyrrolidin	(PVP),	0,5%	agaróza,	0,1 mg/1
NAA,
0,75 mg/1	BAP, 0,01	mg/1 GA3,	. 250	mg/1 karbenicilin,
250 mg/1	triacilin,	0,5 mg/1	AgNO3

• ·

Regeneračním médiem A6 je MS, 0,5 mg/1 Mes (pH5,7),

2% sacharóza, 40mg/l adenin.SC>4, 0,5 g/1 PVP, 0,5% agaróza, 0,0025 mg/1 BAP a 250 mg/ triacilinu.

zdravé pupeny se přenesou do zakořeňovacího média, kterým je médium A8: 100 - 130 ml MS o poloviční koncentraci, 1% sacharóza (pH5,0), lmg/1 kyseliny izomáselné (IBA), 100 mg/1 triacilinu se přidalo do perlitu (konečné pH je 6,2) do nádoby o objemu 1 litr.

MS je médium podle Murashige a Skooga (Murashige a Skoog (1962), Physiol. Plant. 15: 473).

se

Explanty hypokotyl

Agrobacterium tumefaciens kmen pomocný odvodil bakteriemi

Genet.

Ti-plazmid, jakým od pMP90 (Koncz and 204:383), který bakteriálního infikovaly

C58ClRifR, který nese: pGV4000, který se (1986), Mol. Gen.

získal inzercí je

Schell se nesoucí genu chloramfenikol spojeným k 2,5 kb homologii s T-DNA vektoru pGSV5, do pMP90.

rezistenci na fragmentu, jenž má vektor T-DNA odvozený od pGSV5, který obsahuje mezi hranicemi T-DNA DZ-selektivni gen podle příkladu 3, 4, 5, 6 nebo 7 a chimérický markerový gen.

Vybraná linie těchto transformantů nesoucí jeden typ chimérických genů podle vynálezu se dále používá při křížových experimentech, jejichž výsledkem je nová linie obsahující kombinace chimérických genů podle vynálezu.

Charakterizace transformantů

Transformované buňky rostlin Brassica napus podle příkladu 8 obsahující ve svých jaderných genomech DZselektivni chimérický gen podle přikladu 3 se našly v různých • · ·· · · · · · · · ······· ·· ·· ·· ·· tkáních rostlin za použití běžných histochemických metod (DeBlock and Debrouwer (1992), The Plant Journal 2:261; De Block and Debrouwer (1993), Planta 189:218). V DZ vrstvě lusků se zjistila vysoká GUS aktivita, což naznačuje silné zabarvení, zatímco v ostatních tkáních lusku se nepozorovalo žádné pozadí značeni, což ukazuje na skutečnost, že promotor podle příkladu 3 selektivně řídí expresi v DZ lusku.

Transformované buňky rostlin Brassica napus podle příkladu 8 obsahující ve svých jaderných genomech DZselektivní chimérický gen podle příkladu 4,5,6 nebo 7 samotné nebo v kombinaci se charakterizují s ohledem na následující charakteristiky:

1) změny ve fyziologických procesech analyzováním snížení exprese produktů cíleného genu (jako jsou hydrolázy buněčné stěny) nebo snížení biochemických aktivit (Blumenkratz, citace uvedena shora), monitorováním heterogenní exprese genu (Sambrook et al., citace uvedená shora) nebo měřením endogenního množství IAA nebo IAA konjugátů během vývoje (příklad 1) ·

2) změny v anatomii DZ a DZ buněčných stěn během stárnutí pomocí světelné mikroskopie a elektornové mikroskopie; rozsah separece buněk po otevření lusku, přičemž se pomocí elektronové mikroskopie analyzují separované povrchy DZ (příklad 1)

3) změny mechanických vlastností DZ a odolnosti proti předčasnému vysypání semen analýzou odolnosti proti předčasnému vysypání semen u jednotlivých lusků. Tato anlýza se může provést pomocí nosníkového testu, jak se popisuje v Kadkol et al. (1986), Aust. J. Bot. 34: 595). Uzavřené lusky se umístí jako nosník do univerzálního testovacího přístroje, který obsahuje křížový paprsek, kterým hýbe poháněči zařízení, v • · · · · · · • · ·· ·· · · němž je umístěná buňka produkující konstantmí sílu za účelem vychýlení lusku. Zaznamenává se posunutí a síla nezbytná pro iniciaci a podporu otevírání lusku v zóně samovolného otevírání. V jiném případě první určení náchylnosti k předčasnému vysypání semen se provede s uchycenými luskami, které jsou vystaveny kontrolovatelným vibracím (simulují se naárazy). Vibrace zahrnují horizontální oscilace s pevnou amplitudou v nádobě s ocelovými kuličkami, aby se zvýšil přenos energie. Při jiném postupu se náchylnost na prasknutí určí měřením tření. V tomto případě se zaznamenává síla vznikající třením způsobené mezi klínem, který se tlačí podél DZ, a umožňuje srovnání DZ tkání ve vybraných extrémních příkladech odolnosti.

Nakonec jednotlivé vybrané linie jsou předmětem analýzy na poli. Tyto testy na poli jsou založeny na kultivaci jednotlivých linií (homozygotní z hlediska transgenů) ve dvouch oblastech ve třech replikách.

Analýza statisticky významných počtů lusků z různých transformovaných rostlin ukazuje nárůst odolnosti vůči předčasnému vysypání semen ve srovnání s netransformovanými kontrolními rostlinami.

Je zbytečné říkat, že použití DZ-selektivního promotoru a rekombinantních konstrukcí DNA podle vynálezu není limitováno transformací specifické rostliny podle vynálezu. Takový promotor a rekombinantní konstrukce DNA se mohou použít při transformaci libovolné plodiny, kde promotor může řídit expresi genu, přednostně, kde se taková exprese vyskytuje ve velké míře v rostlinných buňkách zóny samovolného otevření.

Také použiti DZ-selektivního promotoru podle vynálezu není limitováno na řízení určitých přepisovaných oblastí DNA podle vynálezu, ale může se používat k řízení exprese libovolného cizího genu nebo fragmentu DNA v rostlině.

Dále vynález se neomezuje na specifický DZ-selektivní promotor, který je popsán ve výše uvedených příkladech. Vynález spíše zdůrazňuje promotory, které jsou ekvivalentní s jedním z příkladů, jenž se může použít k řízení exprese strukturálního genu přinejmenším selektivně v rostlinných buňkách zóny samovolného otevírání. Sekvence DNA DZselektivního promotoru podle příkladů se může modifikovat záměnou některých nikleotidů a/nebo deleci nebo inzercí některých nukleotidů, což poskytuje takové modifikace, které nemění v podstatě časováni, úroveň a tkáňovou specifitu exprese řízené promotorem, jak se měří v transgenních rostlinách GUS testy. Tyto rostliny jsou transformovány chimérickým gus genem za řízení modifikovaného promotoru (příklad 3). Až 20% nukleotidů se může promotoru v promotoru změnit, aniž se ovlivní charakteristiky promotoru. Takové promotory se mohou izolovat hybridizací za standardních podmínek (Sambrook et al, citace uvedena shora) za použití vybraných fragmentů DNA sekvence SEQ ID No 13, jak se popisuje shora v textu.

• ··· ···· • · ···· · ··· • · · ·· · · · · · · ·

Claims (29)

PATENTOVÉ NÁROKY

1) RNA, která vzniká v buňkách určité DZ rostliny, brání, inhibuje nebo redukuje v uvedených buňkách DZ expresi endogenního genu rostlin, který kóduje hydrolázu buněčné stěny, zvláště endopolygalakturonázu, nebo

1. Rostlina obsahující nejméně jeden DZ-selektivní chimérický gen začleněný v jaderném genomu jejích buněk, vyznačující se tím, že uvedený DZ-selektivní chimérický gen obsahuje následující operabilně spojené fragmenty DNA:

a) přepisovaná oblast DNA kódující:

2. Rostlina podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že uvedená transkribovaná oblast DNA kóduje antisense RNA, která je směrován k sense RNA endogenního genu uvedené rostliny, který kóduje hydrolázu buněčné stěny.

2) protein nebo polypeptid, který, je-li produkován v uvedených buňkách DZ, usmrcuje nebo poškozuje buňky nebo interferuje s jejich normálním metabolizmem, fyziologií nebo vývojem,

b) promotor exprimovatelný v rostlině, který řídí expresi uvedené přepisované oblasti DNA nejméně v uvedených DZ buňkách, umožňuje, že transkribované oblast DNA kóduje protein nebo polypeptid nebo antisense RNA nebo ribozóm směrovaný k sense RNA, která je kódovaná endogenním genem, jenž je exprimovatelný v uvedené rostlině v buňkách jiných než jsou uvedené DZ buňky, pak uvedený promotor exprimovatelný v rostlině je DZ-selektivní promotor, který selektivně řídí expresi uvedené transkribované oblasti v uvedených DZ buňkách a uvedená rostlina je charakterizována modifikovanými vlastnostmi samovolného otevírání, upřednostňuje se zpožděné samovolné otevírání, ve srovnání s rostlinou, která neobsahuje uvedený DZ-selektivní chimérický gen.

3. Rostlina podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že uvedená transkribovaná oblast DNA kóduje ribozóm, který je směrován k sense RNA endogenního genu zmíněné rostliny, který kóduje hydrolázu buněčné stěny.

4. Rostlina podle nároku 2 nebo 3, vyznačuj ící se tím, že uvedený endogenní rostlinný gen je DZselektivní gen.

5. Rostlina podle libovolného z nároků 2 až 4, vyznačující se tím, že uvedený endogenní rostlinný gen kóduje mRNA kódující endo-polygalakturonázu.

6. Rostlina podle nároku 5, vyznačující se tím, že uvedená mRNA kódující uvedenou endopolygalakturonázu je mRNA, kde cDNA zmíněné mRNA obsahuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID No 1 nebo nukleotidovou sekvenci, která je jí v podstatě podobná.

7. Rostlina podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že uvedená transkribovaná oblast DNA kóduje ribonukleázu, jako je barnáza, nebo cytotoxin, jako je fragment A toxinu difterie.

8. Rostlina podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že uvedená transkribovaná oblast DNA kóduje protein, který, je-li produkován v buňce DZ, zvyšuje v uvedené buňce množství auxinů nebo jejich analogů nebo zvyšuje citlivost uvedené buňky na auxin nebo na jeho analogy.

9. Rostlina podle nároku 8, vyznačuj ící se tím, že uvedená transkribovaná oblast DNA kóduje protein vybraný ze skupiny, která zahrnuje tryptofanovou monooxygenázu, indol-3-acetamidovou hydrolázu a amidohydrolázu.

10. Rostlina podle nároku 8, vyznačuj ící se tím, že uvedená transkribovaná oblast DNA kóduje produkt genu rolB.

11. Rostlina podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že uvedená transkribovaná oblast DNA kóduje protein, který, je-li produkován v buňce DZ, snižuje citlivost uvedené buňky na etylen.

12. Rostlina podle nároku 11, vyznačuj ící se tím, že uvedená transkribovaná oblast DNA kóduje mutantní protein ETR1, který je citlivý na etylen, upřednostňuje se protein ETR1-1.

13. Rostlina podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedená transkribovaná oblast DNA kóduje protein, který je schopen inhibovat polygalakturonázu, upřednostňuje se endo-polygalakturonázu.

14. Rostlina podle libovolného z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, žeDZjeDZ lusku, upřednostňuje se druh Brassica, zvláště Brassica napus.

15. Rostlina podle libovolného z nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že promotor exprimovatelný v uvedené rostlině je DZ-selektivní promotor.

16. Rostlina podle nároku 15, vyznačuj ící se tím, že uvedený DZ-selektivní promotor pochází z genu kódujícího mRNA, kde cDNA uvedené mRNA zahrnuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID No 1 nebo nukleotidovou sekvenci, která je jí v podstatě podobná.

17. Rostlina podle nároku 16, vyznačuj ící se tím, že uvedený DZ-selektivní promotor je obsažený v 5'regulační oblasti s nukleotidovou sekvencí SEQ ID No 13 mezi pozicemi 1 a 2 328 nebo s nukleotidovou sekvencí, která jí je v podstatě podobná.

18. Rostlina podle libovolného z nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že uvedené DZ-selektivní chimérické geny obsahují promotorovou oblast zahrnující nejméně nukleotidovou sekvenci SEQ ID No 13 mezi pozicemi 1 839 a 2 328 nebo nukleotidovou sekvenci, která jí je v podstatě podobná.

19. Rostlina podle nároku 18, vyznačuj ící se tím, že uvedené DZ-selektivní chimérické geny obsahují promotorovou oblast obsahující nejméně nukleotidovou sekvenci SEQ ID No 13, která začíná mezi místy Sphl a BamHI a končí v pozici 2 328, nebo nukleotidovou sekvenci, jenž jí je v podstatě podobná.

20. Rostlina podle nároku 19, vyznačuj ící se tím, že uvedené DZ-selektivní chimérické geny obsahuji promotorovou oblast zahrnující nejméně nukleotidovou sekvenci SEQ ID No 13 mezi pozicemi 1 a 2 328 nebo nukleotidovou sekvenci, která jí je v podstatě podobná.

21. DNA kódující antisense mRNA obsahující oblast nejméně 50 nukleotidů, která je komplementární s oblastí mRNA, kde cDNA uvedené mRNA obsahuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID No 1 nebo nukleotidovou sekvenci, která jí je v podstatě podobná.

22. Promotor genu kódujícího mRNA, vyznačuj ící se tím, že obsahuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID No 1 nebo nukelotidovou sekvenci, která je jí v podstatě podobná.

23. DNA obsahující nejméně nukleotidovou sekvenci SEQ ID No 13 mezi pozicemi 1 839 a 2 328 nebo nukleotidovou sekvenci, která jí je v podstatě podobná.

24. DNA podle nároku 23 obsahující nejméně nukleotidovou sekvenci SEQ ID No 13 začínající mezi místy Sphl a BamHI a končící v pozici 2 328 nebo nukleotidovou sekvenci, která jí je v podstatě podobná.

25. DNA podle nároku 24 obsahující nejméně nukleotidovou sekvenci SEQ ID No 13 mezi pozicemi 1 a 2 328 nebo nukleotidovou sekvenci, která jí je v podstatě podobná.

26. DZ-selektivní chimérický gen podle libovolného z nároků 1 až 20.

• · ·

27. Rostlinná buňka nebo rostlinná buněčná kultura, vyznačující se tím, že je transformovaná DZselektivním chimérickým genem podle nároku 26.

28. Semena rostliny, vyznačující se tím, že obsahuje DZ-selektivní chimérický gen podle nároku 26.

29. Způsob produkce rostliny s modifikovanými vlastnostmi samovolného otevírání, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje:

a) transformaci jederného genomu buňky původní rostliny DZselektivním chimérickým genem podle nároku 26; a

b) regeneraci transformované rostliny z uvedené transformované buňky.