CN1867349A

CN1867349A - 治疗泌尿生殖病症的组合物和方法

Info

Publication number: CN1867349A
Application number: CNA2004800298848A
Authority: CN
Inventors: A·P·卡塔尼亚; J·M·利普顿
Original assignee: Zengen Inc
Current assignee: Zengen Inc
Priority date: 2003-09-08
Filing date: 2004-09-08
Publication date: 2006-11-22
Also published as: US7402559B2; US20050037032A1; CR8341A; EP1667703A4; ECSP066494A; EP1667703A2; AU2004272049A1; CA2542303A1; ZA200602144B; WO2005025503A2; JP2007505045A; WO2005025503A3

Abstract

本发明涉及用于治疗泌尿生殖病症的组合物和方法。披露的一个实施方案是用于治疗泌尿生殖病症的药物组合物，其中，所述组合物包含KPV聚体，第一种防腐剂，溶剂，碱化剂，丙烯酸型聚合物，第二种防腐剂和胶凝剂。披露了本发明的另一个实施方案，其中，所述组合物包含CKPV(SEQ ID NO：5)二聚体，API，Carbopol，NF，对羟基苯甲酸丙酯，NF；对羟基苯甲酸甲酯，NF；丙二醇，USP；依地酸(EDTA)，USP；2M氢氧化钠溶液(NaOH)；和无菌注射用水，USP。还披露了使用所披露的组合物的方法和适应症。

Description

治疗泌尿生殖病症的组合物和方法

对相关申请的交叉参考

本申请是申请日为2000年3月23日的美国专利申请流水号09/535,066的部分继续申请，后者要求申请日为1999年3月24日的美国临时申请流水号60/126,233的优先权。本申请还是申请日为2003年5月21日的美国专利申请流水号10/442,683的部分继续申请，后者要求申请日为2002年5月21日的美国临时申请流水号60/382,887的优先权，以上所有申请都以全文形式收作本文参考，包括附图，如同在本文充分说明那样。

发明的技术领域

本发明涉及泌尿生殖病症的领域。

发明背景

泌尿生殖病症或疾病普遍影响男性和女性。这些病症包括泌尿系统和生殖系统的感染和/或炎症。例如，根据National Institute ofChild Health and Human Development(NICHD)的说法，″大部分女性在她们的一生中患有至少一种形式的阴道炎″。Vaginitis，NationalInstitute of Child Health and Human Development-PublicationsOn-line，www.nichd.nih.giv/publications/pubs/vagl.htm。产生阴道炎的原因有细菌，真菌或病毒感染，以及与该区域接触的霜剂，喷雾剂或甚至是衣物中的化学物质产生的刺激。Id.对于患有细菌和真菌感染的女性来说，这些感染因子通常源自直肠区域，并且通过会阴迁移到达阴道或尿道。

一种常见类型的阴道炎是念珠菌病或酵母感染，最常见的是由白色念珠菌引起的。念珠菌是个体存在于皮肤，口腔和胃肠道中的正常微生物菌群的一部分。Robbins Pathologic Basis of Disease 5^th ed.，Saunders Co.，Philadelphia(1994)p.354。它们还少量生存在女性阴道中。它们在诸如阴道或口腔的温暖潮湿的表面上生长得最好。它们通常是非致病性的，但是当它们的环境发生改变时，如对女性更年期、怀孕期间的激素改变作出反应，或者对应激作出反应，它们可能过度生长，从而导致酵母感染。这些变化还可能出现在免疫抑制的或受损的个体中，如接受化疗，服用免疫抑制剂，或罹患AIDS的人。

目前对念珠菌病的治疗包括非处方药物，含有诸如硝酸布康唑(Femstat)，克霉唑(Gyne-Lotrimin等)，咪康唑(Monistat等)，和噻康唑(Vagistat)的活性成分。这些药物在阴道中局部使用，并且能破坏念珠菌的细胞壁。其他类似的治疗包括含有同一家族的活性成分的处方药，如氟康唑(Diflucan)，特康唑(Terazol)，和酮康唑(Nizoral)。

尽管阴道炎通常与念珠菌相关，根据NICHD的报导，细菌性阴道病实际上是生殖年龄女性中最常见的阴道感染。Vaginitis，同上。细菌在阴道中的过度生长引起的细菌性阴道病非常像念珠菌，不过，用于其治疗的药物是不同的。

另一方面，男性也可能在他们的阴茎上受到念珠菌感染，包括龟头和包皮。龟头包皮炎-一种龟头和包皮的非特异性感染-是由多种生物引起的，包括诸如念珠菌的真菌和诸如葡萄球菌的化脓菌。Robbins Pathologic Basis of Disease 5^th ed.，Saunders Co.，Philadelphia(1994)，p.1008。

葡萄球菌是通常存在于皮肤和身体其他粘膜的革兰氏阳性细菌。特别是金黄色葡萄球菌是毒性病原体，它能导致多种病症和疾病，来自皮肤病损，心内膜炎，呼吸道感染，食物中毒和中毒性休克综合征。对于使用高吸收性棉塞的女性，已知金黄色葡萄球菌可在阴道中定殖，并且分泌毒素，被称作中毒性休克综合征毒素(TSST-1)。根据食品和药物管理署的报导，迄今报导的大约1/2的中毒性休克综合征病例与在月经期间使用棉塞相关，并且通常出现在年轻的女性中。Tamponand Asbestos，Dioxin，& Toxic Shock Syndrome，FDA Center forDevices and Radiological Health(July 23，1999)，www.fda.gov/cdrh/ocd/tampon sabs.html。

金黄色葡萄球菌感染通常是用甲氧西林治疗的。尽管它是非常有效的，某些金黄色葡萄球菌菌株业已产生了对甲氧西林的耐药性，并且只有少数的抗生素能够成功地治疗甲氧西林-耐药的金黄色葡萄球菌(MRSA)感染。常用于治疗MRSA的抗生素之一是万古霉素。不过，业已鉴定出一株金黄色葡萄球菌对万古霉素的敏感性下降(VISA)。Khurshid，M.A.，等，Staphylococcus aureus with ReducedSusceptibility to Vancomycin--Illinois，1999，Morbidity andMortality Weekly Report，48(51)：1165-1167(2000)，www.cdc.gov/epo/mmwr/preview/mmwrhtml/mm4851a1.htm。抗生素耐药细菌菌株的出现业已产生了对于对抗细菌感染的备选途径的需求。

除了真菌和细菌感染之外，病毒性阴道炎也是常见的。这些感染最常见的是通过性交传播的。病毒性阴道炎包括由单纯疱疹病毒(HSV)或人乳头瘤病毒(HPV)引起的感染。例如，HSV病毒能在生殖器区域复制，这里是病毒的进入部位，并且还能感染支配生殖器的神经元。为了逃避身体的免疫系统，HSV病毒能够保持潜伏在这些神经元中，并且会对环境条件起反应而被再次激活，所述环境条件如应激，免疫抑制，辐射，或病毒感染。目前对HSV的治疗包括诸如无环鸟苷，泛昔洛韦，或伐昔洛韦的药物。

对于泌尿系统来说，根据美国医学协会的报导，泌尿道感染(UTI)是促使人就诊的最常见的疾病之一。Women′s Health，Urinary TractInfections：A Patient′s Guide to Treatment，AMA Health Insight，On-Line Health Information for Everyone，www.ama-assn.org/insight/h_focus/wom_hlth/uti/uti.Htm。这些感染最常见的是由大肠杆菌引起的，不过，也可能涉及诸如念珠菌和葡萄球菌的生物。Id.这些感染可始于尿道，并且上行到膀胱，引起膀胱炎。最终，它可能甚至通过输尿管上行到肾脏而导致肾盂肾炎。男性和女性的泌尿系统都可能受到这些微生物的感染。

由于泌尿生殖病症并不局限于单一的原因，现行的治疗需要不同的药物治疗具体的致病原因。首先必须鉴定这些致病原因。鉴定需要时间，并且更重要的是需要对女性进行妇科检查，以便确定特定感染因子或其缺乏。

随着抗生素和其他药物的使用增加，诸如甲氧西林-耐药的金黄色葡萄球菌的微生物正越来越多地产生对现有药物的耐药性。因此，一直需要新型药物，这种药物能对抗广谱的感染因子。业已发现，包含赖氨酸-脯氨酸-缬氨酸的二聚体以及本文所披露的其他基于α-MSH的肽能有效治疗泌尿生殖病症。

发明概述

本发明涉及用于治疗泌尿生殖病症的系统。本发明的一个方面涉及治疗，包括将具有包括KPV(SEQ ID NO：1)，MEHFRWG(SEQ ID NO：2)，HFRWGKPV(SEQ ID NO：3)，VPKC(SEQ ID NO：5)-s-s CKPV(SEQ ID NO：5)或SYSMEHFRWGKPV(SEQ ID NO：4)的氨基酸序列的一种或多种多肽用于治疗泌尿生殖病症。VPKC-s-s-CKPV是″KPV二聚体″的一个例子，其中二硫键存在于每一个单体的N-末端半胱氨酸之间。在本说明书中，以下″CKPV二聚体″将是用于识别这种形式的KPV二聚体的术语，即，通过二硫键连接的两个CKPV单体，即，VPKC(SEQ ID NO：5)-s-s-CKPV(SEQ ID NO：5)。预计其他KPV二聚体也可用于本文所披露的组合物中。

泌尿生殖病症可以包括感染，炎症或这两种情况。在本发明的一个优选实施方案中，泌尿生殖病症包括阴道，外阴，泌尿道，阴茎，和/或直肠感染和/或炎症。在本发明的另一个优选实施方案中，所述一种或多种多肽溶解在载体中。在本发明的另一个优选实施方案中，所述一种或多种多肽与棉塞结合，用于预防中毒性休克综合征。在另一个优选实施方案中，所述一种或多种多肽与避孕用具结合，用于预防性传播疾病或感染。在另一个优选实施方案中，所述一种或多种多肽与用于插入阴道或直肠的栓剂结合。在本发明的另一个优选实施方案中，所述一种或多种多肽溶解在液体载体中，用于冲洗阴道。

在本发明的一个方面，披露了用于治疗泌尿生殖病症的药物组合物，它包含KPV二聚体，防腐剂，溶剂，碱化剂，丙烯酸型(acrylicacid based)聚合物，和胶凝剂。

在本发明的另一方面，用于治疗泌尿生殖病症的药物组合物包含丙烯酸型聚合物，例如，Carbopol，National Formulary(以下称之为NF)；对羟基苯甲酸丙酯，NF；对羟基苯甲酸甲酯，NF；丙二醇，美国药典(以下称之为USP)；依地酸(以下称之为EDTA)，USP；CKPV二聚体(它还可以通过商标″CZEN002TM″识别)，活性药用成分(以下称之为API)；2M氢氧化钠溶液(以下称之为NaOH)；和无菌注射用水，USP。预计还可以对所列举的某些成分进行改变，替代或取消。

附图的简要说明

图1显示α-MSH肽对金黄色葡萄球菌生长的抑制作用。

图2显示α-MSH肽对尿激酶诱导的金黄色葡萄球菌生长的作用。

图3显示α-MSH肽对白色念珠菌生长的抑制作用。

图4比较了α-MSH肽与氟康唑的抗真菌活性。

图5A-5D显示α-MSH肽对白色念珠菌芽管形成的抑制作用。

图6显示α-MSH肽针对白色念珠菌的增强了的嗜中性粒细胞杀伤作用。

图7，8，和9显示α-MSH肽抑制白色念珠菌生长的机制。

图10-13显示α-MSH肽对在慢性感染的细胞中病毒复制和表达的抑制作用。

图14显示α-MSH肽抑制病毒复制、表达和再激活的机制。

图15显示α-MSH肽对在急性感染的细胞中病毒复制和表达的抑制作用。

图16显示KPV二聚体的一种化学结构的示意图。

图17显示在用于治疗白色念珠菌时，在相同摩尔浓度下，KPV二聚体(CKPV二聚体)的效果是KPV单体的两倍以上。

图18显示在治疗克鲁斯氏念珠菌时，在相同摩尔浓度下，KPV二聚体(CKPV二聚体)的效果是KPV单体的两倍以上。

图19显示在治疗光滑念珠菌时，在相同摩尔浓度下，KPV二聚体(CKPV二聚体)的效果是KPV单体的两倍以上。

优选实施方案的详细说明

下面所引用的参考文献收作本文参考，如同在本文中充分说明那样。本发明涉及利用α-促黑素细胞激素(″α-MSH″)肽及其二聚体治疗泌尿生殖病症的组合物和方法。α-MSH是通过对较大的前体分子propiomelanocortin进行翻译后加工产生的古老的十三个氨基酸的肽(SEQ ID NO：4)。它与促肾上腺皮质激素(″ACTH″)共享1-13氨基酸序列，后者同样来自propiomelanocortin。

已知α-MSH是由很多细胞类型分泌的，包括垂体细胞，单核细胞，黑素细胞，和角质形成细胞。它可见于大鼠皮肤中，人类表皮中，或完整的和切除垂体的小鼠的胃肠道粘膜屏障中。例如，参见Eberle，A.N.，The Melanotrophins，Karger，Basel，Switzerland(1998)；Lipton，J.M.等，Anti-inflammatory Influence of theNeuro immunomodulator α-MSH，Immunol.Today 18，140-145(1997)；Thody，A.J.等，MSH Pept ides are Pre sent in Mamma lian Skin，Peptides 4，813-815(1983)；Fox，J.A.等，Immunoreactiveα-Melanocyte Stimulating Hormone，Its Distribution in theGastrointestinal Tract of Intact and Hypophysectomized Rats，Life.Sci.18，2127-2132(1981)。

已知α-MSH肽具有有效的解热抗炎特性，同时它们具有极低的毒性。在体外，它们能够减少宿主细胞促炎介质的产生，并且还可以减轻炎症动物模型中局部和全身反应的产生。例如，″核心″α-MSH序列(4-10)(SEQ ID NO：2)，具有学习和记忆行为效果，但是少有解热抗炎活性。相比之下，对于解热抗炎活性的活性信使序列存在于α-MSH的C-末端氨基酸序列，即，赖氨酸-脯氨酸-缬氨酸(″Lys-Pro-Val″或″KPV″)(SEQ ID NO：1)。这种三肽具有与母体分子类似的体外和体内活性。α-MSH肽的抗炎活性披露于以下两份被收作本文参考的专利中：美国专利号5,028,592，于1991年7月2日授予Lipton，J.M.，标题为解热抗炎Lys Pro Val组合物及其使用方法；于1992年10月20日授予Lipton，J.M.的美国专利号5,157,023，标题为解热抗炎Lys Pro Val组合物及其使用方法；还可参见Catania，A.等，α-Melanocyte Stimulating Hormone in theModulation of Host Reactions，Endocr.Rev.14，564-576(1993)；Lipton，J.M.等，Anti-inflammatory Influence of theNeuroimmunomodulator α-MSH，Immunol.Today 18，140-145(1997)；Rajora，N.等，α-MSH Production Receptors and Influence onNeopterin，in a Human Monocyte/macrophage Cell Line，J.Leukoc.Biol.59，248-253(1996)；Star，R.A.等，Evidence of AutocrineModulation of Macrophage Nitric Oxide Synthase by α-MSH，Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)92，8015-8020(1995)；Lipton，J.M.等，Anti-inflammatory Effects of the Neuropeptide α-MSH in AcuteChronic and Systemic inflammation，Ann.N.Y.Acad.Sci.741，137-148(1994)；Fajora，N.等，α-MSH Modulates Local andCirculating Tumor Necrosis Factor α in Experimental BrainInflammation，J.Neuroosci，17，2181-2186(1995)；Richards，D.B.等，Effect ofα-MSH(11-13)(lysine-proline-valine)on Feverin the Rabbit，Peptides 5，815-817(1984)；Hiltz，M.E.等，Anti-inflammatory Activity of a COOH-terminal Fragment of theNeuropeptide α-MSH，FASEB J.3，2282-2284(1989)。

除了它的抗炎解热功能之外，本发明的一个方面涉及α-MSH肽的抗微生物或抗感染活性。正如下面所披露的，α-MSH肽具有显著的抗感染应用，包括例如用于减弱微生物的存活力，减少酵母的萌发，杀伤微生物而又不减弱人类嗜中性粒细胞对微生物的杀伤作用，用于治疗与微生物感染相关的炎症而又不减弱微生物杀伤作用，增加cAMP在微生物体内的积累，并且抑制病毒病原体的复制和表达。

在本发明的优选实施方案中，所述抗微生物或抗感染活性尤其是与C-末端氨基酸序列-KPV(SEQ ID NO：1)相关。这种三肽以及它的二聚体和其他α-MSH肽在非常宽的浓度范围内都是有效的，包括通常存在于人血浆中的皮摩尔浓度。纳摩尔和微摩尔浓度能产生更有效的浓度。

正如在背景部分所讨论的，泌尿生殖病症并不局限于一种原因，多种生物和感染因子，从细菌和真菌到病毒，单独或组合，能导致多种病症，包括阴道炎，外阴炎，尿道炎，龟头包皮炎，念珠菌病，性传播疾病，和中毒性休克综合征。为了治疗这些病症，可以通过本领域公知的方法将α-MSH肽局部应用到感染和/或炎症的部位。例如，可将α-MSH肽溶解在溶液中，如磷酸盐缓冲盐水，透明质酸盐，甲基纤维素，羧甲基纤维素，或乙醇。常见的载体，如软膏，霜剂，凝胶，可溶解的药丸，气溶胶喷雾剂，栓剂，用于冲洗的液体溶液或棉塞的吸收材料可以携带α-MSH肽作为活性成分，用于治疗泌尿生殖病症。这些载体可以通过应用器(applicator)应用到感染或炎症的部位，如注射器或注射器样装置，绷带，导管，具有柱塞的管子，抹刀或其他类型的扁平表面涂敷器，避孕套，海绵，隔膜，棉塞应用器或手指。

更具体地讲，本发明的一个优选实施方案是将α-MSH肽溶解在液体型载体中。然后将这种携带有溶剂化的α-MSH肽的载体储存在加压的罐中。在通过排泄阀或其他机制从加压罐中释放所述载体时，形成了气溶胶泡沫，并被捕获到注射器或注射器型装置中。然后将所述注射器部分插入阴道，并且将它的内容物输送到阴道中。所述注射器或注射器装置以及它的开口还可以塑造成不同的大小、形状、和长度，以便适合插入不同的泌尿生殖区域，如尿道，并且还可用于直肠。

本发明的另一个优选实施方案是含有载体的栓剂。这种载体如凝胶或甘油在室温下是固体或半固体的，但是在插入阴道或直肠时在体温下会熔化。当载体熔化时，携带有溶剂化的α-MSH肽的这种载体被输送到泌尿生殖病症的部位。

将α-MSH肽输送到泌尿生殖区外部区域如外阴或阴茎的龟头和阴茎包皮可以通过局部涂敷霜剂，软膏，凝胶，喷雾剂，泡沫或香膏而实现，上述制剂的组成为本领域所熟知。

在本发明的另一方面，可以在生产过程中用α-MSH肽处理棉塞。α-MSH在棉塞中的存在能够抑制诸如金黄色葡萄球菌的微生物的生长，这种微生物能够分泌中毒性休克综合征毒素(TSST-1)。生产棉塞的方法为本领域所熟知。用α-MSH肽或它的衍生物处理棉塞的吸收材料可以通过首先将所述吸收材料浸泡在α-MSH肽的溶液中实现。然后可以让所述吸收材料干燥。另外，α-MSH还能够以干粉形式撒在棉塞的吸收材料上。

在本发明的另一方面，还可以通过使用避孕工具将α-MSH肽输送到感染部位，如避孕套，隔膜，海绵，或其他用于防止怀孕或性传播疾病的屏障型机械装置。α-MSH肽可以溶解在避孕套中所用的润滑剂中，溶解在与隔膜一起使用的凝胶或泡沫中，或溶解在与避孕套，隔膜，或海绵联合使用的任何其他杀精子的溶液中。

在本发明的另一方面，可以将α-MSH肽溶解在液体中，用于冲洗。所述液体可以通过冲洗输送入阴道，用于治疗感染和/或炎症。

在本发明的另一方面，用于治疗泌尿生殖病症的药物组合物包含CKPV二聚体(SEQ ID NO：5)，防腐剂，溶剂，碱化剂，Carbopol，和胶凝剂。所述组合物还可以包含螯合剂。可以对这些成分进行改变，替代或取消。CKPV二聚体(SEQ ID NO：5)比其他可以使用的α-MSH肽更优选，因为业已证实它在治疗阴道炎方面更有效。参见下面的实施例XII。

在本发明的另一方面，披露了用于治疗泌尿生殖病症的药物组合物，其中，所述组合物包含丙烯酸型聚合物，例如，Carbopol，NF；对羟基苯甲酸丙酯，NF；对羟基苯甲酸甲酯，NF；丙二醇，USP；EDTA，USP；CKPV(SEQ ID NO：5)，API；2M NaOH；和无菌注射用水，USP。下面披露了本发明的至少一个实施方案，呈现为0.1％CKPV二聚体(SEQ ID NO：5)批次的组合物，重大约4Kg。本发明的各成分的预计百分比范围是对本发明的不同的大小数量披露的。

一种类型的丙烯酸型聚合物是Carbopol。Carbopol是高分子量交联的丙烯酸型聚合物的注册商标，可以从Noveon Pharmaceuticals.获得，www.pharma.noveonic.com/products/carbopol.asp。用在所披露组合物中的Carbopol的用量为至少大约60-100g或占所述组合物的至少大约1.5-2.5％。Carbopol的优选用量为至少大约80g或占所述组合物的至少大约2％。本领域技术人员将明白，可以将其他已知的胶凝剂用于补充或替代Carbopol，只要它们能有效形成凝胶就行。

对羟基苯甲酸丙酯或4-羟基苯甲酸丙酯是众所周知的防腐剂。参见，The Merck Index p.1350，12th Ed.(Merck ResearchLaboratories，1996)。用在所披露的组合物中的对羟基苯甲酸丙酯的用量范围是至少大约1-3g或占所述组合物的0.025-0.075％。对羟基苯甲酸丙酯的优选用量为至少大约2g或占所述组合物的至少大约0.05％。

对羟基苯甲酸甲酯或4-羟基苯甲酸甲酯是众所周知的防腐剂。参见，The Merck Index p.1041，12^th Ed.(Merck Research Laboratories，1996)。用在所披露的组合物中的对羟基苯甲酸甲酯的用量为至少大约4-8g或占所述组合物的至少大约0.1-0.2％。对羟基苯甲酸甲酯的优选用量为至少大约6g或占所述组合物的至少大约0.15％。

所述防腐剂还可选自下列一组：苯氧乙醇，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丁酯，对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯甲酸丙酯和山梨酸钾及其组合。

丙二醇或1，2-丙二醇是众所周知的溶剂，在很多化学领域具有多种用途。参见，The Merck Index p.1348，12th Ed.(Merck ResearchLaboratories，1996)。用在所披露的组合物中的丙二醇的用量为至少大约200-600g或占所述组合物的至少大约5-15％。丙二醇的优选用量为至少大约400g或占所述组合物的至少大约10％。

所述溶剂还可选自下列一组：乙醇，苯酚，丙酮，甘油和异丙醇及其组合。

EDTA或N，N′-1，2-乙烷二基双[N-(羧甲基)甘氨酸]，是众所周知的螯合剂。参见，The Merck Index p.593，12th Ed.(MerckResearch Laboratories，1996)。用在所披露组合物中的EDTA的用量为至少大约2-6g或占所述组合物的至少大约0.05-0.15％。EDTA的优选用量为至少大约4g或占所述组合物的至少大约0.1％。

所述螯合剂还可选自下列一组：辅酶Q10，锌，L-半胱氨酸，L-甲硫氨酸，L-赖氨酸，谷胱甘肽和EDTA及其组合。

CKPV(SEQ ID NO：5)二聚体是可用于本发明的一种形式的二聚体。用在所披露组合物中的CKPV(SEQ ID NO：5)的用量为至少大约2-6g或占所述组合物的0.05-0.15％。CKPV二聚体(SEQ ID NO：5)的优选用量为至少大约4g或占所述组合物的0.1％。

2M NaOH溶液是众所周知的被用作碱化剂的腐蚀剂。参见，TheMerck Index，p.1477-8，12^th Ed.(Merck Research Laboratories，1996)。用于所披露组合物中的2M NaOH的用量足以将所述组合物调整到4.0±0.1的优选的pH。

所述碱化剂还可选自下列一组：N-(2-羟基乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(以下称之为HEPES)，2M NaOH，2-(N-吗啉代)乙磺酸(以下称之为MES水合物)，3-(N-吗啉代)丙磺酸(以下称之为MOPS)，N-三[羟基甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(以下称之为TAPS)，双(2-羟基乙基)氨基-三(羟基甲基)甲烷，(以下称之为Bis-Tris)或其组合。

无菌注射用水是普遍公知的并且在将粉末或其他固体吸收到凝胶中时常用的胶凝剂。用在所披露组合物中的无菌注射用水的用量足够并多至至少大约3500-3550g或占所述组合物的至少大约87-89％。

其他胶凝剂还可选自下列一组：水，无菌水，蒸馏水，无菌盐水及其组合。

4Kg 0.1％ CKPV(SEQ ID NO：5)二聚体凝胶批次的组合物优选包括：

Carbopol，NF	80.0g
Carbopol，NF	80.0g	对羟基苯甲酸丙酯，NF	2.0g
对羟基苯甲酸甲酯，NF	6.0g	对羟基苯甲酸丙酯，NF	2.0g
对羟基苯甲酸甲酯，NF	6.0g	丙二醇，USP	400.0g
EDTA，USP	4.0g	丙二醇，USP	400.0g
EDTA，USP	4.0g	CKPV(SEQ ID NO：5)二聚体，API	4.0g
2M NaOH溶液	用量足以将pH调整到4.0±0.1	CKPV(SEQ ID NO：5)二聚体，API	4.0g
2M NaOH溶液	用量足以将pH调整到4.0±0.1	无菌注射用水，USP	3504g

正如上文和下文所披露的，在用作治疗剂时，CKPV(SEQ ID NO：5)二聚体的有效量范围为皮摩尔到纳摩尔浓度。微摩尔浓度是更为有效的。本文所披露的药物组合物的剂量范围为50-150μg/ml。本文所披露的药物组合物的优选剂量为100μg/ml。

以下实施例证实了α-MSH肽对抗感染的能力和应用。在本说明书中使用但没有明确说明的微生物学，分子生物学和细胞培养方法业已在科学文献中有充分的报导。这些方法属于本领域技术人员的技能范围。

在以下实施例中使用的肽包括：CKPV(SEQ ID NO：5)的二聚体，α-MSH(1-13)(SEQ ID NO：4)，(4-10)(SEQ ID No：2)，(6-13)(SEQ ID NO：3)，和(11-13)(SEQ ID NO：1)，它们都是N-乙酰化的和C-酰胺化的，以及ACTH(1-39)(SEQ ID NO：9)和(18-39)(SEQ ID NO：10)(CLIP)。这些肽是通过固相肽合成制备的，并且通过反相高效液相层析纯化。图16显示一种KPV二聚体，即，CKPV二聚体(SEQ ID NO：5)的一种化学结构的示意图。二聚体可以通过在上述任何多肽的N-末端添加半胱氨酸，并且让两个多肽的半胱氨酸形成二硫键而形成。可以用这种方法形成同二聚体和异二聚体。

当两个KPV肽的N-末端通过接头连接时可以形成KPV二聚体。VPKC(SEQ ID NO：5)-s-s CKPV(SEQ ID NO：5)是通过在KPV肽的N-末端添加半胱氨酸并且让两个CKPV肽的半胱氨酸形成二硫键(-s-s-)而形成的KPV二聚体的例子。换句话说，VPKC(SEQ ID NO：5)-s-s CKPV(SEQ ID NO：5)是当两个KPV(SEQ ID NO：1)肽通过-Cys-s-s-Cys-接头连接时形成的。所述接头可以是任何种类的化学键，它能将两个KPV肽的N-末端连接在一起。优选所述接头是-Cys-s-s-Cys-，-DCys-s-s-Cys-，-Pen-s-s-Cys-，-Pen-s-s-DCys-，-DPen-s-s-Cys-，-DPen-s-s-DCys-，-DPen-s-s-DPen-，-Pen-s-s-Pen-，-hCys-s-s-Cys-，-hCys-s-s-DCys-，-hCys-s-s-hCys-，-DhCys-s-s-DhCys-，-DhCys-s-s-hCys-，-hCys-s-s-Pen-，-hCys-s-s-DPen-，或-DhCys-s-s-DPen-。

更优选的是，所述接头是-Cys-Cys-。术语″Pen″表示青霉胺。术语″Cys″表示半胱氨酸。术语″hCys″表示高半胱氨酸。前缀″D″表示右旋形式的氨基酸。因此，优选的是，KPV二聚体是VPK-Cys(SEQ ID NO：5)-s-s-Cys-KPV(SEQ ID NO：5)，VPK-DCys(SEQ ID NO：6)-s-s-Cys-KPV(SEQ ID NO：5)，VPK-Pen-s-s-Cys-KPV(SEQ ID NO：5)，VPK-Pen-s-s-DCys-KPV(SEQ ID NO：6)，VPK-DPen-s-s-Cys-KPV(SEQID NO：5)，VPK-DPen-s-s-DCys-KPV(SEQ ID NO：6)，VPK-DPen-s-s-DPen-KPV，VPK-Pen-s-s-Pen-KPV，VPK-hCys(SEQ IDNO：7)-s-s-Cys-KPV(SEQ ID NO：5)，VPK-hCys(SEQ ID NO：7)-s-s-DCys-KPV(SEQ ID NO：6)，VPK-hCys(SEQ ID NO：7)-s-s-hCys-KPV(SEQ ID NO：7)，VPK-DhCys(SEQ ID NO：8)-s-s-DhCys-KPV(SEQID NO：8)，VPK-DhCys(SEQ ID NO：8)-s-s-hCys-KPV(SEQ ID NO：7)，VPK-hCys(SEQ ID NO：7)-s-s-Pen-KPV，VPK-hCys(SEQ ID NO：7)-s-s-DPen-KPV，或VPK-DhCys(SEQ ID NO：8)-s-s-DPen-KPV。更优选的是，所述KPV二聚体是CKPV(SEQ ID NO：5)二聚体，即，VPK-Cys(SEQ ID NO：5)-s-s-Cys-KPV(SEQ ID NO：5)。

尽管本文所披露的特定的氨基酸序列是有效的，对于熟悉本领域的人员来说显而易见的是，在所述氨基酸序列中可以进行氨基酸置换或者缺失，而又不改变所述肽的有效性。因此，本说明书预计不同的KPV二聚体。另外，已知α-MSH序列的稳定能够大大提高所述肽的活性，并且用D-氨基酸形式置换L-形式可以改善或减弱肽的有效性。例如，α-MSH的稳定的类似物[Nle⁴，D-Phe⁷α-MSH]，已知它具有对黑素细胞和黑素瘤细胞的显著的生物学活性，它在退热方面的效力比母体肽高出大约十倍。Holdeman，M.和Lipton，J.M.，AntipyreticActivity of a Potent α-MSH Analog，Peptides 6，273-5(1985)。另外，在C-末端α-MSH(11-13)序列上添加氨基酸能够减弱或增强退热效力(Deeter，L.B.；Martin，L.W.；Lipton，J.M.，AntipyreticProperties of Centrally Administered α-MSH Fragments in theRabbit，Peptides 9，1285-8(1989)。添加甘氨酸以形成10-13序列略微减弱效力；9-13序列几乎缺乏活性，而8-13序列的效力大于11-13序列的效力。已知Ac-[D-K¹¹]α-MSH 11-13-NH₂具有与L-形式的三肽α-MSH 11-13相同的总体效力。Hiltz，M.E.；Catania，A.；Lipton，J.M.，Anti-inflammatory Activity of α-MSH(11-13)Analogs：Influences of Alterations in Stereochemistry，Peptides12，767-71(1991)。

在13位置换为D-形式的缬氨酸或者在11位置换为D-形式的赖氨酸加上13位的D-形式的缬氨酸使得抗炎活性比L-形式的三肽更大。因此，使用D-形式形成的二聚体可能是另一种有效的KPV二聚体。这些例子表明，肽的氨基酸特征的改变可影响肽的活性或者具有很少的影响，取决于操作的性质。还认为生物学功能等同物可以通过置换具有类似亲水性(hydropathic)值的氨基酸来获得。因此，例如，异亮氨酸和亮氨酸的亲水性指数分别为+4.5和+3.8，它们可以置换亲水性指数为+4.2的缬氨酸，并且仍然能获得具有类似生物学活性的蛋白。另外，在所述标度的另一端，赖氨酸(-3.9)可以置换精氨酸(-4.5)，如此等等。一般而言，认为当氨基酸的亲水性评分在替代的氨基酸的大约+/-1亲水性指数单位内时这种氨基酸就可以被成功地置换。生物学功能等同物的抗微生物特性可以通过它们对细菌或真菌的菌落形成单位的抑制作用，或者通过它们对HIV表达或转录的抑制作用来测定，正如在本发明说明书实施例中披露的。

使用单向方差分析和学生t检验分析在下面的实施例中所披露的统计学显著性。大于0.05的概率值被认为是显著的。

实施例I

本实施例说明了α-MSH肽对金黄色葡萄球菌的抗微生物特性。

金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)的培养物是从Department ofMicrobiology，Ospedale Maggiore di Milano的收藏物中获得的。金黄色葡萄球菌(1×10⁶/ml，存在于Hank′s平衡盐溶液中)在37℃下在存在或不存在浓度为10^-15-10^-4M的α-MSH(1-13)(SEQ ID NO：4)，α-MSH(11-13)(SEQ ID NO：1)，或CKPV(SEQ ID NO：5)二聚体的条件下培养两小时。然后在冷蒸馏水中洗涤细胞，并且用HBSS稀释到浓度为100个生物/ml。将一毫升的等份样品分配到血琼脂平板上，并且在37℃下培养24小时。根据形成的菌落评估微生物的存活力。在另一组实验中，在37℃下，在振荡的水浴中与所述肽一起用500单位的尿激酶(金黄色葡萄球菌生长促进剂)培养所述细菌(10⁵/100ml)四小时。

图1显示α-MSH(1-13)(SEQ 1D NO：4)，α-MSH(11-13)(SEQID NO：1)，和CKPV(SEQ ID NO：5)二聚体都能抑制金黄色葡萄球菌菌落形成。这种抑制作用跨越大范围的浓度，并且当肽的浓度为10^-12-10^-4M时抑制作用是显著的(p＞0.01)。图2显示α-MSH(1-13)(SEQ ID NO：4)和α-MSH(11-13)(SEQ ID NO：1)在10^-6M的浓度下能显著地对抗抵消尿激酶的生长促进作用。因此，α-MSH肽能够抑制金黄色葡萄球菌的生长，后者是一种已知能导致与使用棉塞相关的中毒性休克综合征，阴道炎，UTI，尿道炎，和龟头包皮炎的致病因子。

实施例II

本实施例说明了α-MSH肽对白色念珠菌的抗真菌特性。

白色念珠菌的临床分离株是从Department of Microbiology，Ospedale Maggiore di Milano的收藏物中获得的。将白色念珠菌的培养物保持在沙氏琼脂斜面上，并且定期转移到沙氏琼脂平板上，并且在28℃下培养48小时。为了制备稳定生长期酵母，从琼脂平板上取菌落，转移到30ml沙氏-葡萄糖肉汤中，并且在32℃下培养72小时。以1000xg的速度离心细胞十分钟，并且用蒸馏水洗涤沉淀两次。对细胞进行计数，并且悬浮在Hank′s平衡盐溶液(″HBSS″)中，达到理想的浓度。通过排出0.01％亚甲蓝测定的存活力保持大于98％。

在HBSS中1×10⁶/ml的浓度下，在37℃下，在有或没有浓度为10^-15-10^-4M的α-MSH(1-13)(SEQ ID NO：4)，α-MSH(11-13)(SEQID NO：1)，或CKPV(SEQ ID NO：5)二聚体的条件下培养所述真菌两小时。然后用冷的蒸馏水洗涤细胞，并且用HBSS稀释到浓度为100生物/ml。然后将一毫升等份样品分配到血琼脂平板上，并且在37℃下培养48小时。根据形成的菌落数评估所述生物的存活力。

图3表明α-MSH(1-13)(SEQ ID NO：4)，α-MSH(11-13)(SEQID NO：1)，和CKPV(SEQ ID NO：5)二聚体在10^-12-10^-4M的浓度下能够大大减弱白色念珠菌形成菌落的能力(p＜0.01与对照比较)。因此，这证实了α-MSH肽能够抑制白色念珠菌生长，后者是已知能导致念珠菌病，阴道炎，尿道炎，和龟头包皮炎的致病因子。

实施例III

本实施例比较了α-MSH肽与氟康唑——一种确定的抗真菌剂的抗感染活性。

使用与实施例II相同的方法，测定了浓度为10^-6-10^-4M的α-MSH(1-13)(SEQ ID NO：4)，(4-10)(SEQ ID NO：2)，(6-13)(SEQ ID NO：3)，(11-13)(SEQ ID NO：1)，ACTH(1-39)(SEQID NO：9)，(18-39)(SEQ ID NO：10)，和氟康唑对抗白色念珠菌的作用。图4表明与氟康唑相比，α-MSH(11-13)(SEQ ID NO：1)，(6-13)(SEQ ID NO：3)，和(1-13)(SEQ ID NO：4)对白色念珠菌最有效。它们的抑制活性与相同摩尔浓度的氟康唑类似。相比之下，″核心″α-MSH序列(4-10)(SEQ ID NO：2)，其具有行为效果但是具有很小的抗炎活性，能导致对菌落形成单位(CFU)的大约50％抑制。尽管这种抑制作用是实质性的(p＜0.01与对照比较)，但是其效力显著低于具有KPV信号序列的α-MSH片段，即α-MSH(6-13)(SEQ ID NO：3)和(11-13)(SEQ ID NO：1)(p＜0.01)，或母体分子α-MSH(1-13)(SEQ ID NO：4)(p＜0.05)。图4还表明了ACTH(1-39)(SEQ ID NO：9)和ACTH片段(18-39)(SEQ IDNO：10)不能减低白色念珠菌存活力。即使在10^-4M的更高浓度下(在附图中没有示出)，ACTH肽同样是无效的。

因此，本实施例证实了α-MSH肽在抑制念珠菌生长方面与氟康唑一样有效。

实施例IV

本实施例说明了α-MSH肽能够抑制白色念珠菌的萌发或芽管形成。芽管形成是白色念珠菌感染的致病机理的重要部分。这种发病机理涉及与宿主上皮和内皮细胞的粘附，以及从椭圆形芽生孢子向各种丝状形式的形态学转变，例如，芽管，假菌丝，和菌丝。Gow，N.A.，Germ Tube Growth of Candida albicans，Curr.Topics Med.Myco.8，43-55(1997)。

用蒸馏水洗涤来自稳定期培养物的白色念珠菌两次，并且悬浮在HBSS中，使最终浓度为2×10⁶/ml。通过向在37℃下连续振荡培养45分钟的酵母中添加10％灭活马血清(GIBCO/BRL，Paisley，GreatBritain)诱导菌丝生长。然后通过用HBSS洗涤细胞两次除去马血清，并且在37℃下，在存在浓度为10^-6M的α-MSH(1-13)(SEQ ID NO：4)，(6-13)(SEQ ID NO：3)，或(11-13)(SEQ ID NO：1)的条件下连续振荡继续培养60分钟。在光学显微镜下借助于血球计数器估算丝状细胞的百分比。实验重复进行一式三份，评分至少200个细胞。利用连接在Axioskop Zeiss显微镜上的MC100照相机拍摄显微照片。

图5A-5D显示白色念珠菌与α-MSH(1-13)(SEQ ID NO：4)或(11-13)(SEQ ID NO：1)的共同培养抑制了由马血清诱导的芽管形成。α-MSH(1-13)(SEQ ID NO：4)导致丝状细胞数量减少28-32％，而α-MSH(11-13)(SEQ ID NO：1)导致减少54-58％。尽管在附图中没有示出，α-MSH(6-13)(SEQ ID NO：3)同样可将丝状细胞的数量减少大约50％。因此，这证实了α-MSH肽能够通过抑制芽管形成而抑制一种模式的念珠菌致病机理。

实施例V

对病原体的杀伤作用减弱是在感染期间用皮质类固醇和其他非甾体抗炎药物治疗的可怕后果。Stevens，D.L.，Could NonsteroidalAnti-inflammatory Drugs(NSAIDs)Enhance Progression ofBacterial Infections to Toxic Shock Syndrome？Clin.Infect.Dis.21，977-80(1997)；Capsoni，F.等，Effect of Corticosteroidson Neutrophil Function：Inhibition of Antibody-dependentCell-Mediated Cytotoxicity(ADCC)，J.Immunopharmacol.5，217-30(1983)。该实施例说明了α-MSH肽能抑制感染因子的生长，而不有损人类嗜中性粒细胞对抗这些感染的能力。本实施例还证实了α-MSH肽能够实际上增强嗜中性粒细胞杀伤所述感染因子的能力。

用肝素对来自健康志愿者的静脉血(20ml)进行抗凝处理。然后通过葡聚糖沉降和使用Ficoll-Hypaque(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri，USA)离心来分离嗜中性粒细胞。通过低渗休克裂解红血球，所得到的嗜中性粒细胞占细胞悬液的至少97％。通过台盼蓝排出估算的细胞存活力超过98％。将嗜中性粒细胞重悬在HBSS中，用于实验。

用人AB血清在振荡的水浴中在37℃下对白色念珠菌(1×10⁶)进行调理30分钟。然后将它们与嗜中性粒细胞在仅存在培养基或培养基与浓度为10^-15-10^-4M的α-MSH(1-13)(SEQ ID NO：4)或α-MSH(11-13)(SEQ ID NO：1)的条件下，在振荡的水浴中，在37℃下培养2小时。在培养之后，将培养试管放置在冰上以阻止生长，并且通过在4℃下以1000-xg的速度离心洗涤胞外生物两次。将2.5％的脱氧胆酸钠溶液添加到悬浮液中，并且振荡所述试管5分钟。然后添加冷的蒸馏水，以获得10⁶个细胞/ml的悬浮液。用HBSS进行两次1/100系列稀释，以获得100个细胞/ml的最终悬浮液。然后将一毫升等份样品分配到血琼脂平板上，并且在37℃下培养48小时。在培养阶段结束时计数菌落形成单位，实验进行一式三份，并且使用来自五名不同供体的血液重复进行。

图6显示在以10^-12-10^-4M的浓度施用时，α-MSH(1-13)(SEQ IDNO：4)和(11-13)(SEQ ID NO：1)实际上增强了嗜中性粒细胞对白色念珠菌的杀伤作用(p＜0.01)。这表明了，这种增强了的杀伤作用出现在很宽的浓度范围内，包括皮摩尔浓度，它类似于在人血浆中发现的α-MSH的浓度。

因此，本实施例证实了α-MSH肽能够同时对抗感染和炎症，它还可应用于念珠菌病，阴道炎，尿道炎，龟头包皮炎，或痔疮。

本实施例表明了α-MSH肽发挥总的抗微生物特性尤其是抗真菌特性的细胞机制。

在有或没有10^-6M的α-MSH(1-13)(SEQ ID NO：4)，(11-13)(SEQ ID NO：1)，或毛喉素(一种已知能增加胞内cAMP的物质)的条件下，在37℃下连续振荡培养用甲苯/乙醇透化的白色念珠菌(10⁶/ml)。三分钟之后，通过添加冰冷的乙醇终止该反应。按照生产商的说明，在通过液相方法萃取之后，使用商业化的酶免疫测定试剂盒(Amersham，United Kindom)一式两份地测定cAMP水平。在相关实验中，还将白色念珠菌暴露于浓度为25，50，和100×10^-5M的二脱氧腺苷(ddAdo，Sigma)(腺苷环化酶的有力抑制剂)两小时，并且再接触α-MSH肽两小时。毛喉素和ddAdo对白色念珠菌形成菌落的能力的影响是按照实施例II所披露的方法测定的。

图7显示α-MSH(1-13)(SEQ ID NO：4)和(11-13)(SEQ IDNO：1)能提高白色念珠菌中的cAMP含量。这种cAMP的增加与由等摩尔量的毛喉素诱导的增加为相同的大小数量级。图8显示相对对照组而言，与α-MSH(1-13)(SEQ ID NO：4)和(11-13)(SEQ ID NO：1)一起，毛喉素也显著抑制了白色念珠菌生长(p＜0.01)。图9显示ddAdo具有逆转α-MSH(1-13)(SEQ ID NO：4)和(11-13)(SEQID NO：1)对白色念珠菌生长的作用的能力。

本实施例证实了α-MSH肽最有可能通过提高其cAMP含量继而抑制mRNA和蛋白合成来抑制白色念珠菌和其他微生物的生长。例如，参见Bhattacharya A.等，Effect of Cyclic AMP on RNA and ProteinSynthesis in Candida albicans，Biochem，Biophysics.Res.Commun.，77：1433-44(1977)。

实施例VII

本实施例说明了α-MSH肽抑制病毒在人细胞内复制的能力。更具体地讲，α-MSH能抑制HIV-1在慢性感染的人类单核细胞中的复制和表达。

慢性HIV-1感染的前单核细胞U1细胞系是单核细胞中潜伏的HIV感染的体外模型。所述细胞携带有两个完整的HIV原病毒拷贝，并且HIV的组成型表达是非常低的。不过，正如通过RNA转录、p24抗原或逆转录酶释放测定的，病毒复制可以通过不同的刺激激活，如TNF-α，IL-6，IL-10，PMA或细胞拥挤(crowding)。

为了测定α-MSH肽对HIV复制的影响，在完全培养基(补充了10mMHepe s的RPMI 1640)，2mM L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich)，10％热灭活的FCS(Hyclone Laboratories，Logan，UT，USA)，浓度为100单位/ml的青霉素和浓度为100μg/ml的链霉素(Gibco Laboratories，Grand Island，NY)中将所述细胞保持在对数生长期。首先进行预试验，以便确定最佳细胞密度，刺激浓度，和利用这些培养条件产生HIV-1 p24抗原的动力学。在使用之前，用HBSS洗涤细胞三次，以便除去细胞外病毒。然后将细胞平板接种在24-孔平底平板上，浓度为2×10⁵/ml(最终体积为1ml)，与单独的培养基或培养基加TNF-α(10ng/ml)(R & D Systems，Oxford，England，UK)，在有或没有浓度为10^-15-10^-4M的α-MSH(1-13)(SEQ ID NO：4)或(11-13)(SEQ ID NO：1)的条件下培养。

在进一步的试验中，将单独的浓度为10^-5M的α-MSH(11-13)(SEQID NO：1)添加到用TNF-α(10ng/ml)，IL-6(20ng/ml)，IL-10(20ng/ml)(R & D Systems，Oxford，England，UK)，PMA(1ng/ml)(Sigma-Aldrich)刺激过或者在拥挤条件下的U1细胞中。拥挤是通过以2×10⁵/ml的密度接种U1细胞，并且在37℃下在5％CO₂中将它们保持在培养物中7天不更换培养基而实现的。将用细胞因子或PMA激活的培养物仅保持48小时。然后通过离心除去上清液，并且使用通过商业渠道获得的ELISA试剂盒分析p24抗原，所述试剂盒购自Cellular Products，Inc.，Buffalo，NY，USA。还利用从Innovagen，Lund，Sweden购买的ELISA Retrosys RT测定试剂盒测定了逆转录酶释放。对于这些实验，α-MSH(11-13)(SEQ ID NO：1)的添加是在第一天进行的，并且每一种条件测试一式三份。

图10显示在宽浓度范围内α-MSH(1-13)(SEQ ID NO：4)和(11-13)(SEQ ID NO：1)显著抑制p24抗原从经TNF-α刺激的U1细胞中释放。对这两种肽来说最有效的浓度为10^-5M，分别导致52.7％和56.0％的抑制作用。图11显示α-MSH(11-13)(SEQ ID NO：1)还抑制由IL-6，IL-10，PMA以及在拥挤条件下诱导的p24抗原和逆转录酶从U1细胞中的释放。另外，图12显示α-MSH(11-13)(SEQ ID NO：1)还抑制剪接过的和未剪接过的HIV-1 RNA在PMA刺激过的U1细胞中的转录，这一结果是通过Northern印迹分析测定的。

因此，本实施例证实了α-MSH肽能够通过介导TNF-α，IL-6和IL-10途径抑制病毒基因的转录。

实施例VIII

本实施例进一步说明了α-MSH抑制病毒复制和激活的能力。更具体地讲，本实施例说明了在U1细胞中添加α-MSH中和抗体能显著增加p24-抗原释放。

U1细胞的培养与实施例VII中所披露的类似，使用用培养基以1：250稀释的亲和纯化的兔-抗-α-MSH抗体(Euro-Diagnostica，Malmo，Sweden)封阻由U1细胞产生的内源α-MSH。

对照抗体是相同稀释度的兔IgG。用抗-α-MSH或对照抗体处理过的细胞(2×10⁵/ml)与培养基或PMA(1ng/ml)一起培养。在37℃培养48小时之后，分离上清液，并且检测p24抗原释放。在使用按上述方法培养的U1细胞的拥挤实验中，在第一天添加抗-α-MSH抗体或对照IgG，并且在第七天收获上清液。

图13显示在静息的，PMA诱导的或拥挤的U1细胞中封阻α-MSH显著增加了p24抗原的释放。本实施例强烈暗示了病毒复制受α-MSH影响。

实施例IX

本实施例说明了α-MSH肽抑制病毒复制和表达的机制。更具体地讲，α-MSH肽抑制了TNF-α诱导的NF-κB激活和结合。

为了确定NF-κB活性水平，从20×10⁶个U1细胞(2×10⁵/ml，存在于完全培养基中)制备细胞核提取物，所述细胞使用TNF-α(20ng/ml)在有或没有10^-5M的α-MSH(11-13)(SEQ ID NO：1)的条件下刺激了四小时。

用冷PBS洗涤细胞一次，用缓冲液A(10mM Hepes pH7.9，1.5mM MgCl₂，10mM KCl，0.5mM PMSF和0.5mM DTT)洗涤两次，离心，并且在冰上在缓冲液A加上0.1％ NP-40中培养10分钟。然后，除去上清液，并且将细胞核沉淀物重新悬浮在15μl缓冲液C(20mM HepespH7.9，1.5mM MgCl₂，0.42M KCl，0.2mM EDTA，25％甘油，0.5mMPMSF，和0.5mM DTT)中，在冰上培养15分钟，混合，然后离心。用75μl改进的缓冲液D(20mM Hepes，pH7.9，0.05mM KCl，0.2mMEDTA，20％甘油，0.5mM PMSF，和0.5mM DTT)稀释上清液，并且在-80℃下保存。在室温下进行结合反应15分钟，使用10μg细胞核提取蛋白和0.5ng的³²P-标记的NF-κB(30,000cpm/μl)或AP1共有，在缓冲液A(12mM Tris-HCl pH7.8，60mM KCl，0.2mM EDTA，0.3mM DTT)，加10％甘油，2μg/ml牛血清白蛋白和1μg/ml单链DNA(Pharmacia Biotech)中。对于用于这些研究的NF-κB的寡核苷酸是：+gat cca agg gga ctt tcc gct ggg gac ttt cca tg(SEQ IDNO：11)，和-gat cca tgg aaa gtc ccc agc gga aag tcc cct tg(SEQ ID NO：12)。使每一寡核苷酸与它的互补链退火，并且用多核苷酸激酶以³²P-γ-ATP进行末端标记。为了确定特定条带，细胞核提取物首先与100倍过量的未标记探针温育5分钟，然后与标记过的探针温育。所述混合物然后在5％(30∶1)丙烯酰胺凝胶上在1x TBE缓冲液中电泳。干燥所述凝胶，并且进行放射自显影。

图14显示TNF-α大大增强了NF-κB结合活性，但是与10^-5M的α-MSH(11-13)(SEQ ID NO：1)共同培养显著减弱了NF-κB激活。不过，α-MSH(11-13)(SEQ ID NO：1)不改变静息细胞中的NF-κB激活。这表明α-MSH肽通过调控NF-κB结合抑制病毒复制和表达。

病毒因子的复制通常取决于受感染细胞的激活状态，并且通常受到病毒和宿主因子之间的相互作用的调控。所述宿主因子可以包括TNF-α和其他细胞因子如白介素。与HIV-1感染和激活类似，单纯疱疹病毒也可以对宿主细胞因子作出反应而从潜伏状态被再次激活。例如，业已证实，TNF-α和IL-6，而不是IL-1和IL-3，能再次激活HSV感染。用抗IL-6的抗体中和IL-6显著抑制HSV再激活，而中和干扰素α和β则不能。例如，参见Baker，M.等，The Relationshipbetween Interleukin-6 and Herpes Simplex Virus Type-1：Implications for Behavior and Immunopathology，Brain Behav.Immun.13(3)：201-11(1999)；Noisakran S.等，Lymphocytes DelayKinetics of HSV-1 Reactivation from in vitro Explants of LatentInfected Trigeminal Ganglia，J.Neuroimmunol.95(1-2)：126-35(1999)；Walev，I.等，Enhancement by TNF-αof Reactivation andReplication of Latent Herpes Simplex Virus from TrigeminalGanglia of Mice，Arch Virol.140(6)：987-92(1995)；Domk-Optiz，I.等，Stimulation of Macrophages by Endotoxin Results in theReactivation of a Persistent Herpes Simplex Virus Infection，Scand J.Immunol.32(2)：69-75(1990)；Fauci，A.S.，HostFactors in the Pathoaenesis of HIV-induced Disease，Nature 384：529(1996)。

TNF-α或包括HSV在内的病毒感染可导致IκB的靶向破坏，继之激活NF-κB的核转运。核转运促进NF-κB与用于转录多种炎性剂包括TNF-α，IL-6，和其他细胞因子的DNA操纵基因结合。所述细胞因子的表达再次进一步重新激活了其他HSV感染的细胞，以产生HSV病毒。例如，参见Patel，A.等，Herpes Simplex Type 1 Induction ofPersistent NF-κB Nuclear Translocation Increases theEfficiency of Virus Replication，Virology 247(2)：212-22(1998)。

因此，通过阻断NF-κB结合，α-MSH肽抑制了能够再次激活HSV的更多炎性细胞因子的表达。本实施例和实施例VII-VIII证实了α-MSH肽通过抑制对身体细胞因子或其他病毒感染起反应的NF-κB结合而抑制病毒复制，表达和再激活。

实施例X

本实施例说明了α-MSH肽在急性感染的人类细胞中抑制病毒复制的能力。更具体地讲，α-MSH抑制了HIV-1在急性感染的人类外周血单核细胞(PBMC)中的复制和表达。

通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心从正常供体中分离PBMC。通过Percoll梯度分离法分离单核细胞，并且使其分化成巨噬细胞(MDM)，分化是在RPMI加上20％FCS的完全培养基中，使用24-孔组织培养平板以10⁶细胞/ml的密度培养七天进行的。用亲单核细胞的HIVBa-I株(1∶10)感染MDM过夜。未稀释的病毒母液含有10⁷感染单位/ml。24小时之后，洗涤MDM并且重悬在完全培养基中，每周更换三次，培养三周时间。

感染之后每周使用通过商业渠道获得的试剂盒-从Innovagen，Lund，Sweden购买的ELISA Retrosys RT assay测定逆转录酶释放。在HIV感染时添加10^-5M的α-MSH(11-13)(SEQ ID NO：1)，然后每天添加直到收获。

图15显示α-MSH显著抑制急性感染的MDM中的逆转录酶释放。这种抑制作用在第六天更显著，不过在第21天仍是统计学显著的。

因此，本实施例证实了在感染部位的病毒复制可以被α-MSH肽抑制。因此，一般的性病尤其是HIV的性传播可以通过将α-MSH肽结合在性接触期间使用的诸如避孕套，隔膜，或海绵等避孕用具上，和/或在性接触之后应用含有α-MSH肽的栓剂，霜剂，软膏，凝胶或气溶胶泡沫而得到抑制。

实施例XI

本实施例说明了α-MSH肽的生物学功能等同物。

尽管本文所披露的特定氨基酸序列是有效的，对本领域技术人员来说显而易见的是，可以对氨基酸进行置换或缺失而不改变所述肽的有效性。另外，已知稳定α-MSH序列能大大提高所述肽的活性，并且用D-氨基酸形式置换L-形式可以提高或降低所述肽的有效性。例如，已知对黑素细胞和黑素瘤细胞具有显著的生物学活性的α-MSH的稳定类似物[Nle4，D-Phe7]-α-MSH在退热方面的效力比母体肽高出大约十倍。另外，在α-MSH(11-13)(SEQ ID NO：1)序列的C-末端添加氨基酸能够减弱或增强退热效力。添加甘氨酸以形成10-13序列(SEQID NO：13)略微减弱效力；9-13序列(SEQ ID NO：14)几乎没有活性，而8-13序列(SEQ ID NO：15)的效力大于11-13序列(SEQID NO：1)的效力。已知Ac-[D-K11]-α-MSH 11-13-NH₂具有与L-形式的三肽α-MSH(11-13)(SEQ ID NO：1)相同的总效力。不过，某些参考文献业已证实了用D-脯氨酸置换三肽的12位使它失活。例如，参见Holdeman，M.等，Antipyretic Activity of a Potent α-MSHAnalog，Peptides 6，273-5(1985)。Deeter，L.B.等，AntipyreticProperties of Centrally Administered α-MSH Fragments in theRabbit，Peptides 9，1285-8(1989)。Hiltz，M.E.，Anti-inflammatory Activity of α-MSH(11-13)Analogs：Influences ofAlterations in Stereochemistry，Peptides 12，767-71(1991)。

还可以通过置换具有类似亲水性值的氨基酸获得生物学功能等同物。因此，例如，亲水性指数分别为+4.5和+3.8的异亮氨酸和亮氨酸可以置换亲水性指数为+4.2的缬氨酸，并且仍然获得具有类似生物学活性的蛋白，由此提供了多种类型KPV二聚体的可能性。或者，在标度的另一端，赖氨酸(-3.9)可以置换精氨酸(-4.5)，以此类推。一般认为当氨基酸的亲水性分值在替代氨基酸的大约+/-1个亲水性指数单位范围内时就能够成功地置换这种氨基酸。

实施例XII

白色念珠菌，光滑念珠菌和克鲁斯氏念珠菌(临床分离株)是从laboratory of Microbiology，Ospedale Maggiore di Milano的收藏物中获得的。每一种酵母菌株使用了六种不同的分离株。念珠菌细胞保持在沙氏琼脂斜面上，并且定期转移到沙氏琼脂平板上，并且在28℃下培养48小时。为了制备稳定生长期的酵母，从琼脂平板上取菌落，并且转移到5ml沙氏-葡萄糖肉汤中，并且在32℃下培养48小时。以1,000xg的速度离心细胞10分钟，并且用蒸馏水洗涤沉淀两次。对细胞进行计数并且悬浮在蒸馏水中，以获得10⁷酵母细胞/ml。通过排出0.01％亚甲蓝测定的存活力保持＞98％。

试管中装有念珠菌细胞，以1×10⁶存在于100μl蒸馏水中，向其中添加溶解在100μl蒸馏水中的CKPV二聚体10^-7-10^-4M或KPV 10^-4M(最终浓度)。对照试管接收100μl蒸馏水。所有测试都一式三份进行。在37℃下培养2小时之后，用蒸馏水稀释来自每一个小瓶的酵母悬浮液，以获得大约100个生物/ml。将来自每一个试管的一毫升等份样品分配到血琼脂平板上，并且在37℃下培养48小时以计数CFU。生物的存活力根据每一个平板中CFU的数目估算。只有对照平板中的CFU在80-120之间并且计数的变异性低于10％的实验被用于评估所述肽的效果。在对照平板中具有更少或更多数目菌落的实验被视为在技术上不合适的，并且从分析中排除。

结果如图17-19所示，并且示出了在上述条件下特定真菌所得到的CFU。所述附图包括在没有α-MSH肽(在图17-19中表示为″0″)，10^-4M的KPV[在图17-19中表示为″-4″]，10^-7M的CKPV(SEQ ID NO：5)二聚体[在图17-19中表示为″-7″]，10^-6M的CKPV二聚体[在图1-3中表示为″-6″]，10^-5M的CKPV(SEQ ID NO：5)二聚体[在图17-19中表示为″-5″]，和10^-4M的CKPV(SEQ ID NO：5)二聚体[在图17-19中表示为″-4″]存在的条件下得到的CFU。图17显示在相同的摩尔浓度下，CKPV(SEQ ID NO：5)二聚体在治疗比白色念珠菌方面的有效性是KPV单体的两倍以上。图18显示在相同摩尔浓度下，CKPV(SEQ ID NO：5)二聚体在治疗克鲁斯氏念珠菌方面的有效性是KPV单体的两倍以上。图19显示在相同摩尔浓度下，CKPV(SEQ IDNO：5)二聚体在治疗光滑念珠菌方面的有效性是KPV单体的两倍以上。

上述实施例I-XII证实了α-MSH肽的抗感染活性和用途。以上数据只是用作举例，而不是要将本发明局限于这些实施例。可以理解的是，对上述实施例进行改变不会偏离本发明构思。还应当理解的是，所述实施例可以单独或者彼此组合应用。

序列表

<110>ZENGEN，INC.

Catania，Anna P.

Lipton，James M.

<120>治疗泌尿生殖病症的组合物和方法

<130>54275.8005.WO01

<150>US 10/659,053

<151>2003-09-08

<150>US 09/535,066

<151>2000-03-23

<150>US 60/126,233

<151>1999-03-24

<150>US 10/442,683

<151>2003-05-21

<150>US 60/382,887

<151>2002-05-21

<160>15

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>3

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>具有抗炎、抗微生物、抗真菌和抗病毒特性的合成多肽

<400>1

Lys Pro Val

1

<210>2

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>具有抗炎、抗微生物、抗真菌和抗病毒特性的合成多肽

<400>2

Met Glu His Phe Arg Trp Gly

1 5

<210>3

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>具有抗炎、抗微生物、抗真菌和抗病毒特性的合成多肽

<400>3

His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val

1 5

<210>4

<211>13

<212>PRT

<213>智人

<220>

<223>具有抗炎、抗微生物、抗真菌和抗病毒特性的合成多肽/天然肽

<400>4

Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val

1 5 10

<210>5

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>具有抗炎、抗微生物、抗真菌和抗病毒特性的合成多肽

<400>5

Cys Lys Pro Val

1

<210>6

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>α-MSH的C-末端序列/Cys是DCys

<400>6

Trp Cys Lys Pro Val

1 5

<210>7

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>具有抗炎、抗微生物、抗真菌和抗病毒特性的合成多肽/Cys是hCys

<400>7

Arg Trp Cys Lys Pro Val

1 5

<210>8

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>具有抗炎、抗微生物、抗真菌和抗病毒特性的合成多肽/Cys是DhCys

<400>8

Cys Lys Pro Val

1

<210>9

<211>39

<212>PRT

<213>智人

<220>

<400>9

Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Lys Lys

1 5 10 15

Arg Arg Pro Val Lys Val Tyr Pro Ala Gly Glu Asp Asp Glu Ala Ser

20 25 30

Glu Ala Phe Pro Leu Glu Phe

35

<210>10

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>具有抗炎、抗微生物、抗真菌和抗病毒特性的合成多肽

<400>10

Arg Pro Val Lys Val Tyr Pro Ala Gly Glu Asp Asp Glu Ala Ser Glu

1 5 10 15

Ala Phe Pro Leu Glu Phe

20

<210>11

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>NF-kB的寡核苷酸探针

<400>11

gat cca agg gga ctt tcc gct ggg gac ttt cca tg 35

<210>12

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>NF-kB的寡核苷酸探针

<400>12

gat cca tgg aaa gtc ccc agc gga aac tcc cct tg 35

<210>13

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>具有抗炎、抗微生物、抗真菌和抗病毒特性的合成多肽

<400>13

Gly Lys Pro Val

1

<210>14

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>具有抗炎、抗微生物、抗真菌和抗病毒特性的合成多肽

<400>14

Trp Gly Lys Pro Val

1 5

<210>15

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>具有抗炎、抗微生物、抗真菌和抗病毒特性的合成多肽

<400>15

Arg Trp Gly Lys Pro Val

1 5

Claims

1.药物组合物，包含KPV二聚体，第一种防腐剂，溶剂，碱化剂，丙烯酸型聚合物，第二种防腐剂和胶凝剂。

2.如权利要求1的组合物，还包含螯合剂。

3.如权利要求1的组合物，其中，所述KPV二聚体是CKPV(SEQID NO：5)二聚体。

4.如权利要求1的组合物，其中，所述丙烯酸型聚合物是Carbopol。

5.如权利要求1的组合物，其中，所述第一种防腐剂选自下列一组：苯氧乙醇，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丁酯，对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯甲酸丙酯和山梨酸钾及其组合。

6.如权利要求1的组合物，其中，所述第二种防腐剂选自下列一组：苯氧乙醇，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丁酯，对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯甲酸丙酯和山梨酸钾及其组合。

7.如权利要求5的组合物，其中，所述第一种防腐剂是对羟基苯甲酸甲酯。

8.如权利要求6的组合物，其中，所述第二种防腐剂是对羟基苯甲酸丙酯。

9.如权利要求1的组合物，其中，所述溶剂选自下列一组：丙二醇，乙醇，苯酚，丙酮，甘油和异丙醇及其组合。

10.如权利要求9的组合物，其中，所述溶剂是丙二醇。

11.如权利要求2的组合物，其中，所述螯合剂选自下列一组：辅酶Q10，锌，L-半胱氨酸，L-甲硫氨酸，L-赖氨酸，谷胱甘肽和EDTA及其组合。

12.如权利要求11的组合物，其中，所述螯合剂是EDTA。

13.如权利要求1的组合物，其中，所述碱化剂选自下列一组：HEPES，2M NaOH，MES水合物，MOPS，TAPS和Bis-Tris及其组合。

14.如权利要求13的组合物，其中，所述碱化剂是NaOH。

15.如权利要求1的组合物，其中，所述胶凝剂选自下列一组：水，无菌水，蒸馏水，无菌盐水和无菌注射用水及其组合。

16.如权利要求15的组合物，其中，所述胶凝剂是无菌注射用水。

17.如权利要求3的组合物，其中，所述CKPV(SEQ ID NO：5)二聚体占所述组合物的至少大约0.05-0.15％。

18.如权利要求17的组合物，其中，所述CKPV(SEQ ID NO：5)二聚体占所述组合物的至少大约0.1％。

19.如权利要求4的组合物，其中，所述Carbopol占所述组合物的至少大约1.5-2.5％。

20.如权利要求19的组合物，其中，所述Carbopol占所述组合物的至少大约2％。

21.如权利要求7的组合物，其中，所述对羟基苯甲酸甲酯占所述组合物的至少大约0.1-0.2％。

22.如权利要求21的组合物，其中，所述对羟基苯甲酸甲酯占所述组合物的至少大约0.15％。

23.如权利要求8的组合物，其中，所述对羟基苯甲酸丙酯占所述组合物的至少大约0.025-0.075％。

24.如权利要求23的组合物，其中，所述对羟基苯甲酸丙酯占所述组合物的至少大约0.05％。

25.如权利要求10的组合物，其中，所述丙二醇占所述组合物的至少大约5-15％。

26.如权利要求25的组合物，其中，所述丙二醇占所述组合物的至少大约10％。

27.如权利要求12的组合物，其中，所述EDTA占所述组合物的至少大约0.05-0.15％。

28.如权利要求27的组合物，其中，所述EDTA占所述组合物的至少大约0.1％。

29.如权利要求14的组合物，其中，所述2M NaOH的用量足以将所述组合物的pH调整到4.0±0.1。

30.如权利要求15的组合物，其中，所述无菌注射用水的用量足以形成凝胶。

31.药物组合物，包含Carbopol，对羟基苯甲酸丙酯，对羟基苯甲酸甲酯，丙二醇，CKPV(SEQ ID NO：5)二聚体，2M NaOH和无菌注射用水。

32.如权利要求31的组合物，还包含EDTA。

33.如权利要求31的组合物，其中，所述CKPV(SEQ ID NO：5)二聚体占所述组合物的至少大约0.1％。

34.如权利要求31的组合物，其中，所述Carbopol占所述组合物的至少大约2％。

35.如权利要求31的组合物，其中，所述对羟基苯甲酸甲酯占所述组合物的至少大约0.15％。

36.如权利要求31的组合物，其中，所述对羟基苯甲酸丙酯占所述组合物的至少0.05％。

37.如权利要求31的组合物，其中，所述丙二醇占所述组合物的至少大约10％。

38.如权利要求32的组合物，其中，所述EDTA占所述组合物的至少大约0.1％。

39.如权利要求31的组合物，其中，所述2M NaOH的用量足以将所述组合物的pH调整到4.0±0.1。

40.如权利要求31的组合物，其中，所述无菌注射用水的用量足以形成凝胶。

41.药物组合物，包含2％的Carbopol，0.05％的对羟基苯甲酸丙酯，0.15％的对羟基苯甲酸甲酯，10％的丙二醇，0.1％的EDTA，用量足以将该组合物的pH调整到4.O±0.1的2M NaOH，0.1％的CKPV(SEQ ID NO：5)二聚体和用量足以形成凝胶的无菌注射用水。

42.用于治疗泌尿生殖病症的方法，包括使用药物组合物，该组合物包含至少大约2％的Carbopol，至少大约0.05％的对羟基苯甲酸丙酯，至少大约0.15％的对羟基苯甲酸甲酯，至少大约10％的丙二醇，至少大约0.1％的EDTA，用量足以将该组合物的pH调整到4.0±0.1的2M NaOH，至少大约0.1％的CKPV(SEQ ID NO：5)二聚体和用量足以形成凝胶的无菌注射用水。