CN1780850A - 凝集素在促进糖蛋白和抗原分子的低聚反应中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及凝集素或凝集素样分子在促进糖蛋白或含有糖蛋白的免疫学和/或生物学活性的复合物的低聚反应中的应用。更具体地，本发明提供了包含凝集素分子和免疫学和/或生物学活性分子的分子复合物的组合物。还提供了制备这样的分子复合物的方法，使用包含这样的分子复合物的组合物预防和治疗疾病、特别是癌症和传染病，以及在受试者中引起免疫反应的方法。

Description

凝集素在促进糖蛋白和抗原分子的低聚反应中的用途

本申请要求享有2003年2月28日提交的美国临时申请序号60/450,721的利益，其在这里整体引作参考。

1.导言

本发明涉及生物治疗、免疫治疗和应激蛋白介导的免疫调制领域。更具体地，本发明涉及使用含有与免疫学和/或生物学活性分子结合的凝集素或凝集素样分子的分子复合物来增强免疫学和/或生物学活性分子在预防或治疗疾病(特别是预防或治疗癌症或传染病)中的预防和/或治疗作用的组合物和方法。

2.发明背景

这里对参考文献的引用和讨论不应当理解为对其构成本发明的现有技术的承认。

2.1免疫反应和抗原呈递

生物的免疫系统以2种反应与病原体或其它有害物反应——体液反应和细胞介导的反应(见Alberts，B.等，1994，Molecular Biology ofthe Cell，1195-96)。当静息B细胞被抗原激活以增殖和成熟成能分泌抗体的细胞时，它们会生成和分泌具有独特的抗原结合位点的抗体。该分泌抗体的反应称作体液反应。另一方面，T细胞的各种反应统一称作细胞介导的免疫反应。有两大类T细胞——细胞毒性T细胞和辅助性T细胞。细胞毒性T细胞直接杀死感染了病毒的细胞或一些其它的胞内微生物。相反地，辅助性T细胞辅助刺激其它细胞的反应：它们帮助活化例如巨噬细胞、树突细胞和B细胞(见Alberts，B.等，同上，1228)。细胞毒性T细胞和辅助性T细胞都能识别靶细胞内的外来蛋白抗原降解生成的肽片段形式的抗原，因此二者都依赖于主要组织相容性复合体(MHC)分子，后者能结合这些肽片段，将它们带至细胞表面，并将它们呈递给T细胞。MHC分子一般大量存在于呈递抗原细胞(APC)。

呈递抗原细胞(APC)，例如巨噬细胞和树突细胞，是先天的和适应性的免疫反应的关键组分。抗原一般在其他细胞，即APC的表面上“呈递”给T细胞或B细胞。APC可以捕获淋巴-和血液-携带的抗原，并且在内在化和降解后，将结合到主要组织相容性复合体(MHC)的细胞表面分子上的抗原性肽片段呈递给T细胞。APC然后可以活化T细胞(细胞介导的反应)，进行克隆扩充，且它们的子细胞可以发育成细胞毒性T细胞或辅助性T细胞，后者又用相同的MHC-结合抗原活化B细胞(体液反应)，以进行克隆扩充和生产特异性的抗体(见Alberts，B.等，同上，1238-45)。

已经识别出了两类抗原加工机制。第一类涉及：APC通过胞吞作用摄入蛋白，小泡内的抗原片段化，与II类MHC分子的结合和在细胞表面上的表达。能表达CD4的辅助性T细胞可以识别出该复合物。另一类用于在细胞内合成的且可能参与细胞质中的蛋白片段化的蛋白，例如病毒抗原。以该方式生成的肽会与I类MHC分子结合，并被能表达CD8的细胞毒性T细胞识别(见Alberts，B.等，同上。1233-34)。

T细胞的刺激涉及T细胞和APC两者表达的许多附属分子。共同刺激分子是那些能促进T细胞的生长和活化的附属分子。刺激后，共同刺激分子会诱导细胞因子的释放，例如白细胞介素1(IL-1)或白细胞介素2(IL-2)、干扰素等，后者能促进T细胞的生长和表面受体的表达(见Paul，1989，Fundamental Immunology，109-10)。

通常，APC是静止的，且需要活化才能发挥作用。能活化APC的信号的鉴定是一个至关重要的且未解决的问题(见Banchereau，等，1998，Nature，392：245-252；Medzhitov，等，1998，Curr Opin Immunol.，10：12-15)。

2.2热激蛋白

热激蛋白(HSP)也称作应激蛋白，起初将其鉴定为由热激引起的细胞合成的蛋白。已知了约十个家族的HSP，且每个家族由1-5个密切相关的蛋白组成。Srivastava，2002，Annu.Rev.Immunol.20：395-425。随后发现其它的应激刺激也能诱导这些家族中的许多成员，所述刺激包括营养丧失、代谢破坏、氧自由基和胞内病原体的感染(见Welch，May 1993，Scientific American，56-64；Young，1990，Annu.Rev.Immunol.，8：401-420；Craig，1993，Science，260：1902-1903；Gething等，1992，Nature，355：33-45；和Lindquist等，1988，Annu.Rev.Genetics，22：631-677)。

热激蛋白能在所有形式的生命的所有细胞中和许多胞内位置中表达，即它们能在原核生物的细胞溶胶和真核生物的细胞溶胶、核、内质网(ER)、线粒体和叶绿体中表达。Srivastava，2002，Annu.Rev.Immunol.20：395-425。HSP也构成一个细胞内最丰富的蛋白组。它们在正常的非热激条件下大量表达，且热激或其它形式的应激会将它们的表达有力地诱导到更高的水平。

热激蛋白属于现有的最高度保守的蛋白。例如，DnaK，来自大肠杆菌(E.coli)的Hsp70与来自脱皮(excoriate)的Hsp70蛋白具有约50％的氨基酸序列同一性(Bardwell等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.，81：848-852)。Hsp60和Hsp90家族也表现出类似的高水平的家族内保守性(Hickey等，1989，Mol.Cell.Biol.，9：2615-2626；Jindal，1989，Mol.Cell.Biol.，9：2279-2283)。另外，已经发现Hsp60、Hsp70和Hsp90家族由与应激蛋白在序列上相关的蛋白组成，例如，具有超过35％的氨基酸同一性，但是应激不改变其表达水平。

对热激和其它生理应激的细胞反应的研究表明，HSP具有下述功能：例如蛋白的折叠和解折叠，蛋白的降解，多亚基复合物的装配，耐热性，突变的表达的缓冲等。Srivastava，2002，Annu.Rev.Immunol.20：395-425。HSP能实现不同种类的陪伴功能。例如，位于细胞质、核、线粒体或内质网中的Hsp70家族的成员(Lindquist等，1988，Ann.Rev.Genetics，22：631-677)会参与抗原向免疫系统的细胞的呈递，且也参与正常细胞中的蛋白的转移、折叠和装配。HSP能结合蛋白或肽，并在存在腺苷三磷酸(ATP)或低pH的情况下释放结合的蛋白或肽。

2.3HSP-肽复合物的免疫原性

Srivastava等证实了对甲基胆蒽诱导的近交小鼠的肉瘤的免疫反应(1988，Immunol.Today，9：78-83)。在这些研究中，发现负责这些肿瘤的各个不同的免疫原性的分子是96kDa糖蛋白(gp96)和84-86kDa胞内蛋白(Srivastava等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：3407-3411；Ullrich等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：3121-3125)。用从特定的肿瘤分离出的gp96或p84/86免疫小鼠，能赋予小鼠对该特定肿瘤的免疫，但是对抗原性不同的肿瘤则不能。对能编码gp96和p84/86的基因的分离和表征，揭示了它们之间的显著同源性，并显示了gp96和p84/86分别是相同的热激蛋白的内质网的和胞质的对应物(Srivastava等，1988，Immunogenetics，28：205-207；Srivastava等，1991，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，167：109-123)。而且，显示了Hsp70能引起对其所分离自的肿瘤的免疫性，但是对抗原性不同的肿瘤则不能。但是，发现缺少肽的Hsp70会失去其免疫原性活性(Udono和Srivastava，1993，J.Exp.Med.，178：1391-1396)。这些发现表明，热激蛋白本身不是免疫原性的，但是能形成具有抗原性肽的非共价复合物，且该复合物可以引起对抗原性肽的特异性免疫(Srivastava，1993，Adv.Cancer Res.，62：153-177；Udono等，1994，J.Immunol.，152：5398-5403；Suto等，1995，Science，269：1585-1588)。

热激蛋白gp96陪伴着许多种类的肽，这依赖于gp96的分离来源(关于综述，见Srivastava等，1998，Immunity，8：657-665)。肿瘤衍生的gp96携带着肿瘤抗原性的肽(Ishii等，1999，J Immunology，162：1303-1309)；来自感染了病毒的细胞的gp96制剂携带着病毒表位(Suto和Srivastava，1995，Science，269：1585-1588；Nieland等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：1800-1805)，且来自转染了模型抗原(例如卵清蛋白或β-半乳糖苷酶)的gp96制剂与对应的表位结合(Arnold等，1995，J Exp.Med.，182：885-889；Breloer等，1998，Eur.J；Immunol.，28：1016-1021)。gp96与肽的结合在体内发生(Menoret和Srivastava，1999，Biochem.Biophys.Research Commun.，262：813-818)。无论是分离自细胞的(Tamura等，1997，Science，278：117-120)还是在体外重构的(Blachere等，1997，J.Exp.Med.，186：1183-1406)Gp96-肽复合物，都是优秀的免疫原，且已经广泛地用于引起对gp96-陪伴的抗原性肽特异性的CD8+T细胞反应。

gp96-肽复合物引起免疫反应的能力依赖于肽向呈递抗原细胞的MHC I类分子的转移(Suto和Srivastava，1995，同上)。由内质网(ER)中的gp96陪伴的内源合成的抗原可以体内引发抗原特异性的CD8+T细胞(或MHC I-限制的CTL)；CD8+T细胞的这种引发需要巨嗜细胞。尽管外源性抗原一般经过MHC II-呈递途径、并引起CD4+反应，但外源诱导的gp96-肽复合物可以引起CD8+T细胞反应。Suto和Srivastava，1995，同上；Blachere等，1997，J.Exp.Med.，186：1315-22。

考虑到免疫所需的极小量的gp96-陪伴的抗原性肽(Blachere等，1997，同上)和gp96-肽复合物对功能性呈递抗原细胞(APC)的免疫原性的严格依赖性(Udono等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91：3077-3081)，已经猜想APC具有gp96的受体(Srivastava等，1994，Immunogenetics，39：93-98)。当显示α2巨球蛋白(α2M)受体CD91能结合gp96和α2M，以及CD91的抗体完全抑制APC对gp96-陪伴的肽的重新呈递(representation)时该猜想得到了确认。Binder等，2000，Nat.Immunol.1(2)：151-55；Srivastava，2002，Annu.Rev.Immunol.20：395-425。后来，证实了CD91不仅对gp96，而且对hsp90、hsp70和肌钙网蛋白也起受体的作用。Basu等，2001，Immunity 14(3)：301-13。

已经证实，除了MHC I分子的重新呈递外，APC的MHC II分子也能重新呈递HSP-陪伴的肽。Srivastava，2002，Annu.Rev.Immunol.20：395-425。MHC II分子的重新呈递也通过CD91受体产生。因而，已经表明，HSP-肽复合物一旦通过CD91摄入，就可以进入数个交通和加工途径中的一个或多个。Srivastava，同上。

HSP还已经涉入先天免疫。将APC暴露于gp96(或其它的HSP)，会使APC分泌低水平的TNFα，无论gp96分子是否与抗原性肽结合。Suto和Srivastava，1995，Science 269：1585-88。后来发现，HSP(例如gp96，hsp90，hsp 70和hsp60)与APC的相互作用可以导致一系列的与先天免疫有关的事件，例如巨噬细胞分泌炎性细胞因子TNFα，IL-Iβ，IL-12和GM-CSF；巨噬细胞分泌趋化因子，例如MCP-1，MIP-2和RANTES；可诱导的氧化氮合酶的诱导和巨嗜细胞和DC生成氧化氮；DC的成熟，如通过CD11 c+细胞上的MHC II、B7-2和CD40分子的增强表达所测量的；大量DC(推测是朗格汉斯细胞)从gp96的注射位点向引流淋巴结的迁移；和NFκB向巨噬细胞和DC的核中的转移。Srivastava，2002，Annu.Rev.Immunol.20：395-425。几乎没有证据表明CD91是参与这些现象的受体，且已经暗示有其它的受体参与。Ohashi等，2000，J Immunol.164(2)：558-61；Panjwani等，2000，Cell Stress Chaperones 5：391；Srivastava，2002，Annu.Rev.Immunol.20：395-425。

从癌细胞中纯化出的HSP和肽的非共价复合物可以用于治疗和预防癌症，且已经记载在1996年4月11的PCT公开号WO 96/10411和1997年3月20日的WO 97/10001(分别是1998年4月12日授权的美国专利号5,750,119和1998年11月17日授权的美国专利号5,837,251，它们中的每一篇都在这里整体引作参考)中。已经记载了应激蛋白-抗原复合物的分离和纯化，例如，从病原体感染的细胞中的分离和纯化，并用于治疗和预防病原体(例如病毒和其它胞内病原体，包括细菌、原生动物、真菌和寄生物)造成的感染(见，例如，1995年9月21日的PCT公开号WO 95/24923)。还可以通过应激蛋白和抗原性肽的体外复合，制备免疫原性的应激蛋白-抗原复合物，且这样的复合物在治疗和预防癌症和传染病中的应用已经记载在1997年3月20日的PCT公开号WO 97/10000(2000年2月29日授权的美国专利号6,030,618)中。应激蛋白-抗原复合物在体外敏化用于过继免疫治疗的呈递抗原细胞中的应用记载在1997年3月20日的PCT公开号WO97/10002(也见1999年11月16日授权的美国专利号5,985,270)中。

对可以增强HSP-介导的肽的抗原呈递的免疫原性的特异性的分子或方法的鉴别和表征，可以提供有用的用于引起HSP和HSP-肽复合物的特异性免疫和开发新的诊断和治疗方法的试剂和技术。

2.4.凝集素

凝集素是一组在植物、动物、真菌、藻类和细菌中发现的蛋白，其共有结合特异性的碳水化合物基团的性质(见Sharon等，1972，Science，177：949)。它们是一组结构上不同的蛋白，且它们唯一的共同特征是特异性地且可逆地结合碳水化合物和通过在细胞表面上的寡糖基之间形成交联来凝集细胞的能力。Sharon，1993，Trends BiochemSci 18(6)：221-6。凝集素广泛地用于诊断和实验目的，例如鉴别细胞培养物中的突变细胞，通过触发红细胞的凝集来测定血型，或细胞膜表面的成像。凝集素也用于蛋白纯化，因为它们能特异性地且可逆地结合碳水化合物。

有些凝集素可以一起归入不同的家族，例如结构上相似的豆类或谷类的那些，或者含有同源的碳水化合物识别结构域的c-型(Ca²⁺-依赖性的)动物凝集素。Sharon，同上。豆类凝集素在它们的一级、二级和三级结构上惊人地相似。Srinivas等，2001，Biochim.Biophy.Acta1527：102-111。关于迄今已知的所有豆类凝集素，三级结构由2个反平行的β折叠、1个6-链的平“后”β折叠和1个7-链的弯曲的“前”β折叠组成。Srinivas等，同上。这些折叠依次连接，形成所谓的“jellyroll”基序。尽管它们在一级、二级和三级结构水平上相似，但豆类凝集素的二聚/四聚体集聚在它们的四级结合和单体组织的模式上表现出显著差异。Srinivas等，同上。

来自刀豆的伴刀豆球蛋白A(Con A)是已知其结构的豆类家族的第一种凝集素。Con A由237个氨基酸组成，且具有2个金属结合位点。Becker等，1975，J.Biol.Chem.250：1513。在pH 4.5-5.6，Con A以单一的二聚体存在。McKenzie等，1972，Biochim.Biophys.Acta，263：283。在pH 7以上，它主要是四聚体。Wang等，1975，J.Biol.Chem.250：1490。Con A能与非还原的D-葡萄糖和D-甘露糖反应。Smith等，1967，Arch.Biochem.Biophys.，121：88。在这样的反应中，α-甲基-D-吡喃型葡糖苷可以作为竞争性抑制剂起作用。Smith等，同上。

3.发明概述

本发明提供了含有一种或多种分子复合物的组合物，其中每种分子复合物包含凝集素和免疫学和/或生物学活性的糖蛋白(包括糖肽和糖多肽)。在一个实施方案中，分子复合物包含凝集素和免疫学和/或生物学活性的非抗原分子糖蛋白。如本文所使用的，术语“抗原分子”是指能表现出一个或多个抗原决定簇(需要在受试者中针对其发生免疫反应，例如为了治疗目的)的分子。在5.2部分给出了抗原分子的非限制性实例。在另一个实施方案中，分子复合物包含凝集素和免疫学和/或生物学活性的抗原分子糖蛋白。在另一个实施方案中，分子复合物包含凝集素、免疫学和/或生物学活性的非抗原分子糖蛋白和抗原分子，所述抗原分子可以是或不是糖蛋白。在一个优选的实施方案中，免疫学和/或生物学活性的分子是治疗剂。还提供了制备这样的组合物的方法和使用该组合物预防或治疗疾病(例如，癌症、传染病、贫血、生长激素缺乏病、酶缺乏病、免疫抑制状况)和在需要的受试者中刺激免疫反应的方法。不受任何理论的限制，本发明部分地基于申请人的发现，即凝集素能促进糖蛋白(包括糖肽和糖多肽)或免疫学和/或生物学活性的包含一种或多种糖蛋白的复合物的低聚反应，且该低聚的复合物与未低聚的分子相比表现出增强的生物活性(体外和体内)。

在一个实施方案中，本发明提供了一种或多种非共价的分子复合物或包含一种或多种非共价的分子复合物的组合物，其中每种分子复合物包含与免疫学和/或生物学活性的糖蛋白结合的凝集素，且其中组合物中的凝集素的量相对于糖蛋白的量是相同的，或超过1fg、100fg、500fg、1pg、100pg、500pg、1ng、2ng、5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg糖蛋白。在一个具体的实施方案中，组合物中的凝集素的量相对于糖蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、50ng-250ng或100ng-500ng凝集素/μg糖蛋白。在另一个实施方案中，凝集素相对于糖蛋白是摩尔过量的。在一个实施方案中，糖蛋白是抗原分子。在一个具体的实施方案中，本发明的分子复合物包含凝集素、抗原分子糖蛋白和另一个分子，例如热激蛋白(“HSP”)，其可以是或不是糖基化的。在另一个实施方案中，糖蛋白不是抗原分子。在一个具体的实施方案中，糖蛋白是糖基化的热激蛋白。在另一个实施方案中，本发明的分子复合物包含凝集素、非抗原分子糖蛋白和抗原分子(其可以是或不是糖蛋白)。在一个具体的实施方案中，抗原分子是能表现出对一类癌症的抗原或传染病因子的抗原的抗原性的蛋白(包括肽和多肽)。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种或多种分子复合物或包含一种或多种分子复合物的组合物，每种复合物包含热激蛋白、抗原分子和凝集素，其中热激蛋白和/或抗原分子是糖基化的，且其中复合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是相同的，或超过5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg热激蛋白。优选地，复合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、100ng-250ng或150ng-200ng凝集素/μg热激蛋白。在一些实施方案中，复合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是相同的，或小于5ng/μg热激蛋白。优选地，组合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是0.1ng-5ng、0.2ng-4ng、0.3ng-3ng、0.5ng-2ng或0.1ng-1ng凝集素/μg热激蛋白。

在另一个实施方案中，本发明还提供了一种包含药学上可接受的载体和一种或多种分子复合物的药物组合物，其中每种分子复合物包含凝集素和免疫学和/或生物学活性的糖蛋白，且其中所述的糖蛋白能在存在凝集素的情况下在所述的复合物中形成低聚物。在一个实施方案中，糖蛋白是抗原分子。在一个具体的实施方案中，本发明的分子复合物包含凝集素、抗原分子糖蛋白和另一个分子，例如热激蛋白(“HSP”)，其可以是或不是糖基化的。在另一个实施方案中，糖蛋白不是抗原分子。在一个具体的实施方案中，糖蛋白是糖基化的热激蛋白。在另一个实施方案中，本发明的分子复合物包含凝集素、非抗原分子糖蛋白和抗原分子(其可以是或不是糖蛋白)。在一个优选的实施方案中，抗原分子是能表现出对一类癌症的抗原或传染病因子的抗原的抗原性的蛋白(包括肽和多肽)。在一些实施方案中，糖蛋白是热激蛋白，且组合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是相同的，或超过5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg糖蛋白。优选地，组合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、50ng-250ng或100ng-500ng凝集素/μg HSP。在一些实施方案中，组合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是相同的，或小于5ng/μg HSP。优选地，组合物中的凝集素的量相对于HSP的量是0.1ng-5ng、0.1ng-4ng、0.1ng-3ng、0.1ng-2ng、0.1ng-1ng、0.5ng-5ng、0.5ng-3ng或1ng-4ng凝集素/μg糖蛋白。在一些实施方案中，糖蛋白不是热激蛋白，且组合物中的凝集素的量相对于糖蛋白的量是相同的，或超过1fg、100fg、500fg、1pg、100pg、500pg、1ng、2ng、5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg糖蛋白。

在一些实施方案中，本发明的分子复合物包含与复合到抗原分子(例如，抗原蛋白(包括抗原肽和多肽))上的糖基化的热激蛋白结合的凝集素。有些热激蛋白是天然糖基化的，包括但不限于gp96、GRP170、肌钙网蛋白和Bip(GRP78)。通过添加一个或多个在包含热激蛋白的天然氨基酸序列中不存在的糖基化位点，然后添加碳水化合物基团，或通过将HSP工程改造成含有能结合Con A的肽序列(见Scott等，PNAS(1992)89：5398-5402)，或使用本领域已知的偶联化学将HSP共价附着到Con A上，也可以将非天然糖基化的热激蛋白转化成糖蛋白。在一些其它的实施方案中，分子复合物包含凝集素，所述凝集素与免疫学和/或生物学活性的非热激蛋白的糖蛋白结合。在另一些其它的实施方案中，分子复合物包含凝集素，所述凝集素与复合到热激蛋白(其可以是或不是糖基化的)上的免疫学和/或生物学活性的糖蛋白结合。在一些实施方案中，本发明的分子复合物是非共价复合物。在一些实施方案中，本发明的分子复合物是共价复合物。

在一个优选的实施方案中，本发明的分子复合物中的凝集素是能结合甘露糖的凝集素。在一个具体的实施方案中，本发明的分子复合物中的凝集素是伴刀豆球蛋白A(Con A)。在一个优选的实施方案中，本发明的分子复合物中的热激蛋白是gp96。在一个具体的实施方案中，本发明的分子复合物是纯化的。

本发明还提供了制备本发明的分子复合物的方法。在一些实施方案中，在纯化糖蛋白或糖蛋白与其它分子(例如，糖基化的与抗原分子结合的HSP)的复合物之后添加凝集素，以促进糖蛋白的低聚反应。在一些实施方案中，在纯化糖蛋白或糖蛋白与其它分子(例如，糖基化的含有抗原分子的HSP)的复合物的过程中添加凝集素，以促进糖蛋白的低聚反应。在一个实施方案中，本发明提供了制备一种或多种非共价复合物的方法，其中每种复合物包含热激蛋白、抗原分子和凝集素，且其中所述的热激蛋白是糖基化的，所述的方法包括下述步骤：(a)使所述的凝集素结合到所述的热激蛋白；和(b)使所述的热激蛋白与抗原分子复合。在另一个实施方案中，本发明提供了制备一种或多种非共价复合物的方法，其中每种复合物包含热激蛋白、抗原分子和凝集素，且其中所述的热激蛋白和/或抗原分子是糖基化的，所述的方法包括使凝集素结合一种或多种复合物，每种复合物包含热激蛋白和抗原分子，其中所述的凝集素未结合到固相上。在一个具体的实施方案中，该方法包括在使复合物结合凝集素之前，通过基于凝集素的亲和层析分离热激蛋白和抗原分子的复合物。在另一个具体的实施方案中，该方法包括在使复合物结合凝集素之前，通过基于非凝集素的蛋白纯化方法(例如基于抗体的亲和层析)分离所述的热激蛋白和抗原分子的复合物。本发明还提供了通过所述方法制备的组合物。

本发明还提供了预防或治疗疾病(例如，癌症、传染病、贫血、生长激素缺乏、酶缺乏病、免疫抑制状况等)的方法，包括给需要的受试者施用预防或治疗有效量的包含一种或多种非共价复合物的组合物，其中每种复合物包含与免疫学和/或生物学活性的糖蛋白结合的凝集素。在一个实施方案中，糖蛋白是抗原分子。在一个具体的实施方案中，复合物包含凝集素、抗原分子糖蛋白和另一个分子，例如热激蛋白(“HSP”)，其可以是或不是糖基化的。在另一个实施方案中，糖蛋白不是抗原分子。在一个具体的实施方案中，糖蛋白是糖基化的热激蛋白。在另一个实施方案中，本发明的分子复合物包含凝集素、非抗原分子糖蛋白和抗原分子(其可以是或不是糖蛋白)。在一个具体的实施方案中，抗原分子是能表现出对一类癌症的抗原或传染病因子的抗原的抗原性的蛋白(包括肽和多肽)。该组合物还可以包含药学上可接受的载体。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了预防或治疗疾病(例如，癌症、传染病、贫血、生长激素缺乏、酶缺乏病、免疫抑制状况等)的方法，包括给需要的受试者施用预防或治疗有效量的包含一种或多种非共价复合物的组合物，其中每种复合物包含凝集素、热激蛋白和抗原分子，其中所述的热激蛋白和/或抗原分子是糖基化的，且其中组合物中凝集素的量相对于HSP的量是相同的，或超过5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg热激蛋白。优选地，组合物中凝集素的量相对于Hsp的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、50ng-250ng或100ng-500ng凝集素/μg热激蛋白。在一些实施方案中，组合物中的凝集素的量相对于Hsp的量是相同的，或小于5ng/μg热激蛋白。优选地，组合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是0.1ng-5ng、0.1ng-4ng、0.1ng-3ng、0.1ng-2ng、0.1ng-1ng、0.5ng-5ng、0.5ng-3ng或1ng-4ng凝集素/μg热激蛋白。该组合物还可以包含药学上可接受的载体。在一个具体的实施方案中，抗原分子是能表现出对一类癌症的抗原或传染病因子的抗原的抗原性的蛋白。

在一个优选的实施方案中，分子复合物的免疫学和/或生物学活性的糖蛋白，例如与能表现出对一类癌症的抗原或传染病因子的抗原的抗原性的肽相复合的热激蛋白，是受试者自体的；也就是说，它是从受试者自身的细胞分离出的(例如，当需要治疗癌症时，从患者的肿瘤活组织检查中制备)。或者，分子复合物可以对于本发明的分子复合物的组合物的施用受试者是异源的。或者，分子复合物是体外制备的，例如，从能重组表达热激蛋白的培养细胞中制备。

在一些实施方案中，本发明涉及预防和治疗原发性和转移性的肿瘤病的方法和组合物。除了癌症治疗外，本发明的组合物可以用于预防多种癌症，例如，在由于家族史而易患病的受试者中，或在由于环境因素而具有更高的癌症风险的受试者中。

在一些实施方案中，本发明提供了预防或治疗疾病(例如，癌症、传染病、贫血、生长激素缺乏、酶缺乏病、免疫抑制状况等)的方法，包括给需要的受试者施用预防或治疗有效量的包含一种或多种本发明的分子复合物的组合物，并组合施用一种或多种本发明的分子复合物之外的预防或治疗剂。在一个实施方案中，本发明提供了预防或治疗疾病(例如，癌症、传染病、贫血、生长激素缺乏、酶缺乏病、免疫抑制状况等)的方法，包括给需要的受试者施用预防或治疗有效量的包含一种或多种本发明的分子复合物的组合物，和一种或多种免疫反应增强剂或生物反应调节剂，包括但不限于细胞因子、各种配体的激动剂或拮抗剂、受体和信号转导分子、免疫刺激核酸和佐剂。根据本发明的该方面，本发明的组合物与这些免疫反应增强剂或生物反应调节剂中的一种或多种在联合疗法中一起使用。在另一个实施方案中，为了治疗癌症，本发明的组合物与放疗或一种或多种化疗剂组合施用。在另一个实施方案中，为了治疗或预防传染病，本发明的组合物与抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗寄生物剂组合施用。

本发明还提供了向受试者的所需位点或所需细胞类型中递送一种或多种糖蛋白或一种或多种包含糖蛋白的复合物的方法，所述的方法包括给受试者施用一种或多种分子复合物，其中每种分子复合物包含所述的糖蛋白和凝集素。在一个具体的实施方案中，糖蛋白是抗原分子。

本发明还提供了包含多个容器的试剂盒，每个容器包含的药物制剂或组合物含有足以满足一次预防或治疗施用的剂量的本发明的分子复合物。本发明还提供了包含一个装有免疫学和/或生物学活性的糖蛋白或其复合物的容器和一个装有凝集素的容器的试剂盒。在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，其包含：(a)第一容器，其装有包含大量非共价复合物的组合物，每种复合物包含热激蛋白和抗原分子，其中热激蛋白和/或抗原分子是糖基化的；和(b)装有纯化的凝集素的第二容器。任选地，试剂盒中可以包括关于根据本发明的方法配制低聚的复合物的说明书。

本发明还提供了具体的治疗方案和药物组合物。

4.附图简述

图1.人gp96-肽复合物批次中的始终如一升高水平的Con A。制备了来自4个独立的人肾肿瘤样品的组织匀浆物(A至D)，并通过ConA柱层析进行处理。分离Con A洗脱物，一半材料备用。剩余的样品缓冲液更换为PBS(PD-10柱)，然后经分离DEAE柱进一步纯化2种样品，生成2种匀浆物匹配的终产物——1种在Con A和DEAE柱之间没有缓冲液更换(无Bx)，1种在两柱之间有缓冲液更换步骤(Bx)。然后用检测Con A的灵敏ELISA来确定这些独立的gp96-肽复合物样品中的Con A浓度。使用包含缓冲液更换步骤的方法从普通匀浆物中纯化出的gp96具有比对应的在省略缓冲液更换步骤时生成的匀浆物匹配的gp96样品更高水平的Con A。

图2.Con A存在于低聚化的分子复合物中。制备了来自化学诱导的鼠纤维肉瘤(Meth A)组织的普通匀浆物，并通过Con A柱层析进行处理。分离Con A洗脱物，一半材料备用。剩余的样品缓冲液更换为PBS，然后经分离DEAE柱进一步纯化2种样品，生成2种匀浆物匹配的终产物——1种在Con A和DEAE柱之间没有缓冲液更换(无Bx)，1种有缓冲液更换步骤(Bx)。在Superdex 200柱(分别为上、中、下)上通过SEC一起分级分离2种样品和游离Con A(5μg、50μg/mL)的样品。通过SDS-PAGE分析收集的级分的gp96(级分1至8；插图)，并通过针对Con A的直接ELISA评价单独级分的Con A含量(级分1至14；覆盖图)。在无Bx-gp96的制剂中只有少量Con A，但是显示级分1至5中的用Bx生产的gp96具有Con A。游离Con A洗脱得更晚，表明Bx-gp96样品中的Con A不是游离的，而是与更高分子量的物质结合的。

图3.Con A介导gp96的洗脱位置的移动。制备了来自Meth A-诱导的鼠纤维肉瘤组织的普通匀浆物，并使用包含Con A和DEAE柱层析的方法进行处理。将最终的纯化的gp96制剂分成2份。向一半材料中加入外源的Con A至终浓度为50μg/mL，向另一半中只加入缓冲液作为对照，将2份样品均在37℃温育2小时，然后通过SEC(Superdex 200)分级分离。通过SDS-PAGE、和gp96-和Con A-特异性的ELISA分析各级分。没有缓冲液更换步骤生产的材料的分析数据如左图所示；添加了Con A的在右边。在左图中，gp96的峰在级分5中，且通过特异性的ELISA检测到的con A水平较低。在右图(添加了con A)中，如通过SDS-PAGE(插图；峰级分3(箭标)和5)和gp96 ELISA(级分3和5)以及集中在级分3的Con A的不同峰所证实的，gp96的2个峰都是明显的。Con A介导了gp96的洗脱位置的移动。

图4.人gp96样品中的Con A的含量与体外效力相关联。如上所述从4个独立的人肾肿瘤样品(A至D)制备了gp96样品(见图1)，生成了4对差别仅仅在于包括或省略了Con A和DEAE柱之间的缓冲液更换步骤的样品。使用CD71系统测定了所有8个样品的Con A含量(图A；也见图1)和体外抗原重新呈递(图B)。在每种情况下，与从匹配肿瘤匀浆物生成并通过省略了缓冲液更换步骤的步骤制备的样品相比，通过包含缓冲液更换步骤(且含有升高水平的con A)的方法制备的材料具有更高的体外重新呈递活性。

图5.在鼠CT26系统中，Con A与体外效力相关联。如上关于源自人肿瘤的样品所述(见图1)，从2个独立的鼠CT26肿瘤样品(制剂A和B)，制备了gp96样品。使用CT26系统测定了所有4个样品的Con A含量(图A)和体外抗原重新呈递(图B)。在每种情况下，与从匹配肿瘤匀浆物生成并通过省略了缓冲液更换步骤的步骤制备的样品相比，通过包含缓冲液更换步骤(且含有增加量的Con A)的方法制备的材料具有更高的体外重新呈递活性。

图6.Con A与体外Meth A重新呈递测定和体内鼠Meth A肿瘤保护模型中的效力相关联。从普通的肿瘤匀浆物(上面图1所述)制备了2份分开的Meth A gp96制剂，生成一对差别仅仅在于包括或缺少Con A和DEAE柱之间的缓冲液更换步骤的样品。通过Con A ELISA测定这些样品的Con A含量(图A)、在Meth A重新呈递测定中的体外活性(图B)和以10μg剂量在meth A肿瘤保护测定中的体内活性(图C)。与通过缺少缓冲液更换步骤的方法制备的样品相比，通过包含Con A和DEAE柱之间的缓冲液更换步骤的方法制备的Meth A gp96具有升高的Con A含量、更高的体外抗原重新呈递和更高的体内肿瘤保护活性。

图7.外源的Con A会增加CD71体外重新呈递测定中的gp96活性。匀浆人肝组织，并离心，生成11K上清液，分成3等份样品，并通过不同的方法进行处理。2个批次进行Con A柱层析处理，分离ConA洗脱物，一半材料备用。剩余的样品缓冲液更换为PBS，然后经分离DEAE柱进一步纯化2种样品，生成2种匀浆物匹配的终产物——1种在Con A和DEAE柱之间没有缓冲液更换(无Bx-样品A)，1种在两柱之间有缓冲液更换步骤(Bx-样品B)。如(Arnold-Schild等，Cancer Research，2000，60(15)：4175-4178)所述，使用gp96-特异性的scFv柱从剩余的11K上清液中纯化gp96，浓缩洗脱物，生成样品D。通过Con A特异性的ELISA分析所有样品的Con A浓度和在与μg/mL的蛋白浓度时CD71系统中的体外抗原重新呈递。关于匹配的样品对，通过包含缓冲液更换步骤的方法生产的材料(样品#1；Con A含量7.5ng/μg总蛋白)比通过省略了缓冲液更换步骤的方法生产的材料(样品A；con A含量0.43ng/μg总蛋白)更具有体外活性。通过没有使用Con A柱纯化步骤的一步方法生产的材料(scFv gp96；0ng/μg)具有类似于样品A的低体外活性。向样品A和C中添加外源的Con A至与在样品B中相同的水平(7.5ng con A/μg总蛋白)，会将特异性的体外抗原重新呈递活性增加到与样品B中相似的水平。该Con A水平对T细胞自身无影响。

图8.低聚物种类是甲基α-D-吡喃型甘露糖苷(α-MM)灵敏的。通过包括Con A和DEAE层析(没有缓冲液更换)的标准纯化方法纯化了meth A gp96样品，使用superose 6柱(Pharmacia)、通过分析型SEC分析了蛋白，其表明蛋白制剂主要含有二聚体的gp96(gp96 T＝0)。向该gp96样品(浓度500μg/ml)的等分试样中加入Con A(最终50μg/mL)，在室温温育样品，每小时一次取样(T＝1至T＝5)，并进行SEC分析。还进行了只包含Con A的样品。con A的加入介导了gp96二聚体峰的洗脱位置的移动，其在第一时间点后仅仅有轻微变化。gp96自身在该时间段内不能改变(gp96 T＝5)。在最后的时间点后，取出最后5小时样品的2份独立的等分试样，加入等体积的PBS或含有10％α-MM的PBS。然后通过SEC重新分析每份样品。加入了PBS的样品没有明显变化(未显示)。α-MM的添加离解了高分子量复合物(gp96+con A T＝5+αMM)，产生与原始的gp96样品(gp96T＝0或T＝5)类似的SEC图。

图9.低Con A：gp96化学计量会介导gp96洗脱位置的SEC灵敏性移动。通过包含Con A和DEAE层析的标准纯化方法纯化了人肾肿瘤gp96，使用superose 6柱(Pharmacia)，通过分析型SEC分析了蛋白。向gp96(180μg/mL)中加入Con A至终浓度为0.005-50μg/mL，在室温温育样品1小时，并进行SEC分析。约1 Con A：10gp96的化学计量能产生gp96洗脱位置的SEC灵敏性移动。

图10.甲基α-D-吡喃型甘露糖苷的加入会造成CT26体外抗原重新呈递活性的浓度依赖性的降低。在稀释(1∶5)进含有RAW264.7 APC细胞和AH1特异性的T-细胞的微量滴定板孔之前，在存在50、100或400mM α-MM的情况下，将CT26-衍生的gp96的样品(通过Bx方法制备)和阳性对照9聚体肽(SPSYVYHQF)温育30分钟。将样品温育过夜，通过INF-γ特异性的ELISA分析得到的上清液。α-MM造成了CT26抗原重新呈递的剂量依赖性的降低，且对阳性对照9聚体肽的T细胞识别没有影响。

图11.在纯化Hsp-肽的过程中加入Con A造成了HSPPC-96的肿瘤排斥活性的可滴定的增加。

图12.Con A增加了gp96的肿瘤排斥活性。(A)在纯化Hsp-肽的过程中加入Con A。(B)将Con A加入终产物。

图13.Con A增加了通过免疫亲和柱纯化的HSPPC-96的肿瘤排斥活性。

5.发明详述

本发明涉及使用凝集素来促进糖蛋白或包含糖蛋白的免疫学和/或生物学活性的复合物的低聚反应。优选地，糖蛋白的生物学活性对其施用受试者是治疗性的。具体地，本发明提供了一种或多种分子复合物或包含一种或多种分子复合物的组合物，其中每种分子复合物包含凝集素和免疫学活性的(即免疫原的)和/或生物学活性的糖蛋白(包括糖肽和糖多肽)。如本领域的技术人员能够明白的，当在复合物的上下文中使用时(即作为复合物的组分)，“一种”凝集素、“一种”糖蛋白或“一种”任何其它分子分别是指“至少一种”凝集素、“至少一种”糖蛋白或“至少一种”任何其它分子，除非另有特别说明。在一些实施方案中，本发明的分子复合物是非共价的分子复合物。在一些实施方案中，本发明的分子复合物是共价复合物。还提供了制备分子复合物的方法和使用分子复合物或包含这样的分子复合物的组合物来预防和治疗各种疾病(例如，癌症、传染病、贫血、生长激素缺乏、酶缺乏病、免疫抑制状况等)和在有需要的受试者中诱发免疫反应的方法。本发明可以用于多种情形，包括但不限于需要调节免疫治疗剂和/或生物学活性的分子的生物学效力的情形；需要通过特异性的和/或替代性的受体或非受体介导的事件来改善疫苗向呈递抗原细胞中的送递的情形；需要改善免疫治疗剂和/或生物学活性部分向目标靶的送递的情形；需要改善免疫治疗部分的佐剂能力；或者需要捕获第二种免疫治疗剂/免疫活性部分，并通过特异性的受体-介导的摄入，将它们送递进呈递抗原细胞中的情形。

如本文所使用的，除非另有说明，当以单数形式使用术语“分子”、“复合物”、“分子复合物”、“糖蛋白”、“糖肽”、“热激蛋白”、“糖基化的热激蛋白”和“凝集素”时，也包括多个分子，且可以指大量优选的分子。

如本文所使用的，除非另有说明，术语“糖蛋白”是指包含蛋白和一种或多种碳水化合物部分的分子。糖蛋白可以是天然存在的糖蛋白，或通过合成糖基化方法形成，即在该方法中将碳水化合物连接到蛋白分子上。糖蛋白可以是糖肽或糖多肽。天然存在的糖蛋白的非限制性实例包括但不限于人生长激素、红细胞生成素(EPO)、抗体、组织纤溶酶原激活物(tPA)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和葡糖脑苷脂酶(来自Genzyme的Cerezyme^TM)。在一个优选的实施方案中，糖蛋白是热激蛋白。在另一个优选的实施方案中，糖蛋白是免疫活性的热激蛋白。如本文所使用的，“免疫活性的热激蛋白”是指能调节(优选地增强)免疫反应(优选针对热激蛋白所复合的抗原分子的免疫反应)的热激蛋白。如本文所使用的，术语“抗原分子”是指表现出一种或多种抗原决定簇(在受试者中需要针对它的免疫反应，例如为了治疗目的)的分子。抗原分子的非限制性实例如5.2部分所述。在一个优选的实施方案中，糖蛋白是糖基化的热激蛋白，包括但不限于gp96、GRP170、肌钙网蛋白和Bip(GRP78)。优选地，糖基化的热激蛋白是gp96。在某些实施方案中，糖蛋白还可以是抗原分子，其可以是天然存在的糖蛋白或工程改造成糖蛋白的抗原分子。抗原分子的非限制性实例如5.2部分所述。在某些实施方案中，本发明的分子复合物包含凝集素和未变性的糖蛋白。

通过添加一种或多种在天然氨基酸序列中不存在的糖基化位点，并在可以对蛋白进行糖基化的宿主细胞中重组表达蛋白，可以将蛋白(包括肽和多肽)遗传地工程改造成糖蛋白。蛋白的糖基化一般是N-连接的或O-连接的。术语“N-连接的”是指碳水化合物部分向天冬酰胺残基的侧链的附着。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是脯氨酸之外的任意氨基酸，是碳水化合物部分向天冬酰胺侧链酶促附着的识别序列。因而，这些三肽序列中的任一个在多肽中的存在，都会产生潜在的糖基化位点。术语“O-连接的糖基化”是指诸如N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖的糖中的一个向羟基氨基酸的附着，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸也可以使用。

可以通过多种方法实现糖基化位点的添加。例如，可以改变目标蛋白或肽的氨基酸序列，从而使其含有一种或多种上述的三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)。还可以通过向天然序列添加一种或多种丝氨酸或苏氨酸残基或用其取代，来进行改变(对于O-连接的糖基化位点)。通过DNA水平的变化，特别是通过在预选的碱基处突变能编码目标蛋白的DNA，从而使产生的密码子会翻译成需要的氨基酸，可以任选地改变氨基酸序列。可以进行DNA突变，例如使用美国专利号5,364,934所述的方法。

增加蛋白(包括肽和多肽)上的碳水化合物部分的数目的另一种方法是向蛋白化学或酶促地偶联糖苷。依赖于使用的偶联模式，糖可以附着到(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离的羧基，(c)游离的巯基，例如半胱氨酸的那些，(d)游离的羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些，(e)芳族残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。可以使用本领域已知的任何方法，例如国际公开号WO 87/05330和Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981)中所述的方法。一旦将一种或多种碳水化合物添加到蛋白上，凝集素就可以通过结合到碳水化合物单元上而与蛋白形成复合物。

在本发明的一些实施方案中，糖蛋白表现出对一类癌症的抗原或传染病因子的抗原的抗原性。在本发明的一些其它的实施方案中，糖蛋白未表现出对一类癌症的抗原或传染病因子的抗原的抗原性。在一些实施方案中，糖蛋白是热激蛋白，且热激蛋白陪伴(体内)或复合的蛋白表现出对一类癌症的抗原或传染病因子的抗原的抗原性。

如本文所使用的，术语“抗原性”是指分子结合抗体或MHC分子的能力。如本文所使用的，“一类癌症”是指起源组织的细胞类型，例如，乳房、肺、卵巢。在一个实施方案中，抗原分子表现出对传染因子的抗原的抗原性。在另一个实施方案中，抗原分子表现出对在癌细胞中相对于其在所述的细胞类型的非癌细胞中的表达而言超表达的抗原的抗原性。在另一个实施方案中，抗原分子是肿瘤特异性的抗原或肿瘤-相关抗原。在另一个实施方案中，分子复合物是纯化的。在另一个实施方案中，纯化的分子复合物包含与热激蛋白和传染因子的抗原分子或在癌细胞中相对于其在所述细胞类型的非癌细胞中的表达而言超表达的抗原结合的凝集素。

本领域已知了许多凝集素。术语“凝集素”是指共有结合特异性的碳水化合物基团的性质的蛋白组。可以从天然来源纯化凝集素，例如从植物、动物、真菌、藻类和细菌，或者可以化学合成它。在某些实施方案中，凝集素通过本领域已知的任意方法彼此交联，以形成用于本发明的二聚体或低聚物。在一个优选的实施方案中，凝集素分子是能结合甘露糖的凝集素，其可以是、但不限于表1所列的那些。凝集素可以商业上从许多商业供应商获得，例如Sigma(见Sigma的网站sigmaaldrich.com/Brands/Sigma/Enzyme_Explorer_Home/Lectin_for_life_Science.html)。在一个优选的实施方案中，凝集素是伴刀豆球蛋白A(Con A)。

表1.凝集素的实例

产品编号：	凝集素：	分子量(kDa)：	亚基：	特异性血型：	特异性糖：	促有丝分裂活性：
							L 5640	双孢蘑茹	58.5	-	-	β-gal(1-＞3)galNAc
L 4141	欧洲鳗	40	2	H	α-L-Fuc
							L 0881	落花生	120	4	T	β-gal(1-＞3)galNAc
L 7759	缀合物
							L 6135	缀合物
L 7381	缀合物
							L 3766	缀合物
L 6646	缀合物
							L 3515	木波罗	42	4	T	α-gal-＞OMe	(+)
L 4650	缀合物
							L 5147	缀合物

西非单叶豆
							L 2380	BS-I	114	4	A，B	α-gal，α-galNAc
L 3759	缀合物
							L 9381	缀合物
L 5264	缀合物
							L 1509	BS-I-A4	114	4	A	α-galNAc
L 0890	缀合物
							L 3019	BS-I-B4	114	4	B	α-gal
L 5391	缀合物
							L 2140	缀合物
L 2895	缀合物
							L 6013	紫羊蹄甲	195	4	-	β-gal(1-＞3)galNAc	(+)
L 9637	树锦鸡儿	60；120(c)	2；4	-	galNAc
							L 3141	鹰嘴豆	44	2	-	胎球蛋白
L 2638	刺松藻	60	4	-	galNAc
							L 7275	伴豆力球蛋白A	102	4	-	α-man，α-glc	(+)
L 6397	缀合物
							C 2272	缀合物
C 7642	缀合物
							C 6904	缀合物
C 9017	缀合物
							L 5021	缀合物
L 3642	缀合物
							C 7898	缀合物
L 3885	琥珀酰伴豆力球蛋白A	51	2	-	α-man，α-glc	(+)(d)
							L 9385	缀合物
L 2766	曼陀罗	86	2(α&β)a	-	(glcNAc)2
							L 2785	双花扁豆	140	4	A1	α-galNAc
L 1287	缀合物
							L 6533	缀合物
L 9142	缀合物
							L 9658	缀合物
L 9894	缀合物
							L 2142	龙芽菜	60	2	-	β-gal(1-＞4)glcNAc	(+)
L 5390	鸡冠刺桐	56.8	2(α&β)a	-	β-gal(1-＞4)glcNAc
							L 7400	欧洲卫矛	166	4(α&β)a	B，H	α-gal(1-＞3)gal	(+)
L 8725	雪花莲	52	4	(h)	非还原的D-man
							L 8775	缀合物

L 1395	大豆	110	4	-	galNAc	(+)(b)
							L 2650	缀合物
L 4511	缀合物
							L 1105	缀合物
L 6635	庭园大蜗牛	79	-	A	galNAc
							L 8764	缀合物
L 3382	罗马蜗牛	79	6	A	galNAc
							L 6387	缀合物
L 6512	缀合物
							L 1034	缀合物
L 1261	缀合物
							L 9267	兵豆	49	2	-	α-man	(+)
L 4143	缀合物
							L 9262	缀合物
L 0511	缀合物
							L 2263	美州鲎	400	18	-	NeuNAc
L 2886	番茄	71	-	-	(glcNAc)3	(+)(e)
							L 0651	缀合物
L 0401	缀合物
							L 8025	朝鲜槐	130	2(α&β)	O	唾液酸	(+)
L 6141	柘橙	40-43	2(α&β)a	-	α-gal，α-galNAc
							L 4401	缀合物
L 2013	缀合物
							L 5650	黄水仙	26	2	(h)	α-D-man
L 3138	多花菜豆	112	4	-	-
							L 4389	缀合物
菜豆
							L 8629	PHA-E	128	4	-	寡糖	(+)
L 6139	缀合物
							L 2769	PHA-L	126	4	-	寡糖	(+)
L 8754	PHA-P
							L 2646	PHA-M
L 9379	美国商陆	32f	-	-	(glcNAc)3	(+)
							L 2882	缀合物
L 5380	豌豆	49	4(α&β)a	-	α-man	(+)
							L 0770	缀合物
L 9895	铜绿假单胞菌(PA-I)	13-13.7	-	-	gal
							L 2138	四棱豆	35	1	-	galNAc，gal

L 3139	缀合物
							L 3014	缀合物
L 3264	缀合物
							蓖麻
L 7886	凝集素，RCA120	120	4	-	β-gal
							L 2390	缀合物
L 2758	缀合物
							L 9514	蓖麻毒蛋白，A链
L 4022	蓖麻毒蛋白，A链去糖基化的
							L 9639	蓖麻毒蛋白，B链
L 6890	西洋接骨木
							L 4266	马铃薯
L 9254	翅荚豌豆	120(A)，58(B)，117(C)	4；2；4	H	α-L-fuc
							L 5759	缀合物
L 3134	缀合物
							L 5644	缀合物
L 9640	普通小麦	36	2	-	(glcNAc)2，NeuNAc	(+)
							L 3892	缀合物
L 0390	缀合物
							L 5142	缀合物
L 4895	缀合物
							L 9884	缀合物
L 1894	缀合物
							L 1882	缀合物
荆豆
							L 5505	UEA I	68	-	H	α-L-fuc
L 8146	缀合物
							L 8262	缀合物
L 9006	缀合物
							L 4889	缀合物
L 6263	蚕豆	50	4(α&β)a	-	man，glc	(+)
							L 4011	柔毛野豌豆	139	4a	A1+Tn	galNAc
L 9388	缀合物
							L 7513	同工凝集素B4	143	4	Tn	galNAc
L 7888	缀合物
							L 2662	白果槲寄生	115g	4(α&β)a	-	β-gal
	多花紫藤	68	2	-	galNAc
							L 1516	缀合物
L 2016	还原的	34	1	-	galNAc

L 1766

缀合物

本发明提供了包含凝集素和糖蛋白(其可以是或不是抗原分子)的分子复合物和包含凝集素、糖蛋白以及非糖蛋白的分子(例如，抗原分子)的分子复合物。本发明的每种分子复合物可以包含一种或多种糖蛋白分子、一种或多种凝集素分子和一种或多种抗原分子(如果在复合物中存在的话)。优选地，复合物包含超过一种能在有凝集素存在时形成低聚物的糖蛋白分子。当分子复合物包含超过一种糖蛋白时，糖蛋白不需要是均质的，即群体中的一些糖蛋白是抗原分子，而一些糖蛋白不是抗原分子。本发明的分子复合物的组分的化学计量可以通过比例(g)∶(l)∶(a)予以表达，其中(g)、(l)和(a)可以是任意的整数，且(g)是复合物中的糖蛋白分子(其可以是或不是抗原分子)的数目，(l)是复合物中的凝集素分子的数目，且(a)是复合物中的其它分子(例如，非糖蛋白的抗原分子)的数目。在复合物中，当没有其它分子(例如，非糖蛋白的抗原分子)时，a＝0。例如，分子复合物可以包含一种糖蛋白(其可以是或不是抗原分子)和一种凝集素。在另一个实例中，分子复合物可以包含一种凝集素、两种热激蛋白和两种抗原分子。本发明还包括更多的组合。在一个优选的实施方案中，l大于g，即分子复合物中的凝集素的数目大于分子复合物中的糖蛋白的数目。在一些实施方案中，糖蛋白和凝集素的摩尔比是3∶1、2∶1或1∶1。在一个优选的实施方案中，凝集素是四聚体形式的Con A，且对于每个四聚体Con A分子，附着有3个、2个或1个糖蛋白。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了复合物的均质群体，其中所有复合物的(g)∶(l)∶(a)化学计量比都是相同的或大致相同的。在另一个实施方案中，本发明提供了复合物的群体，其中复合物表现出超过一种(g)∶(l)∶(a)比例，或者该比例对于群体中的所有复合物都是未知的，即本发明的分子复合物的组分的化学计量可以在群体的分子复合物中有所变化。在本发明的实施方案中，当尚未确定复合物或复合物群体的化学计量比时，在大多数情况下可以使用每种组分的质量比来表征复合物或复合物群体。例如，可以通过凝集素和糖蛋白(包括热激蛋白)的相对量来表征复合物群体，从而与其它群体区别开。下文的5.4部分中提供了这样的复合物和测定质量比的方法的实例。在一些实施方案中，优选包含热激蛋白、凝集素和抗原分子的复合物，其中凝集素相对于热激蛋白的量为大于或等于5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg热激蛋白。在其它的实施方案中，优选包含热激蛋白、凝集素和抗原分子的复合物，其中凝集素相对于热激蛋白的量为小于或等于5ng、4ng、3ng、2ng或1ng。

在一个优选的实施方案中，分子复合物包含凝集素、糖基化的热激蛋白和能表现出对一类癌症的抗原或传染病因子的抗原的抗原性的蛋白。在另一个优选的实施方案中，分子复合物包含凝集素和免疫学和/或生物学活性的糖蛋白，其中所述的免疫学和/或生物学活性的糖蛋白可以是、但不限于人生长激素、红细胞生成素(EPO)、抗体治疗剂、组织纤溶酶原激活物(tPA)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和Cerezyme^TM(Genzyme)。在另一个优选的实施方案中，分子复合物包含凝集素和免疫学和/或生物学活性的糖蛋白，其中所述的免疫学和/或生物学活性的糖蛋白是抗原分子。

在一些实施方案中，本发明提供了一种或多种分子复合物，每种复合物包含凝集素和免疫学和/或生物学活性的糖蛋白，其中凝集素与糖蛋白形成低聚物，且其中复合物中的凝集素的量相对于糖蛋白的量是相同的，或超过1fg、100fg、500fg、1pg、100pg、500pg、1ng、2ng、5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg糖蛋白。优选地，复合物中的凝集素的量相对于糖蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、100ng-250ng或150ng-200ng凝集素/μg糖蛋白。在一些实施方案中，复合物中的凝集素的量相对于糖蛋白的量是相同的，或小于5ng/μg糖蛋白。优选地，复合物中的凝集素的量相对于糖蛋白的量为0.1ng-5ng、0.2ng-4ng、0.3ng-3ng、0.5ng-2ng或0.1ng-1ng凝集素/μg糖蛋白。分子复合物还可以包含一种或多种其它的能表现出对一类癌症的抗原或传染病因子的抗原的抗原性的分子，优选蛋白(包括肽和多肽)。在一些实施方案中，糖蛋白是热激蛋白。在一些实施方案中，糖蛋白不是热激蛋白。在一些实施方案中，糖蛋白是抗原分子。在一些实施方案中，糖蛋白不是抗原分子。

本发明还提供了一种或多种分子复合物，每种复合物包含热激蛋白、抗原分子和凝集素，其中复合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是相同的，或超过5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg热激蛋白。优选地，复合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、100ng-250ng或150ng-200ng凝集素/μg热激蛋白。在一些实施方案中，复合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是相同的，或小于5ng/μg热激蛋白。优选地，复合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是0.1ng-5ng、0.2ng-4ng、0.3ng-3ng、0.5ng-2ng或0.1ng-1ng凝集素/μg热激蛋白。

在一些实施方案中，本发明提供了一种包含一种或多种分子复合物和药学上可接受的载体的药物组合物，其中每种分子复合物是包含凝集素和免疫学的和/或生物学活性的糖蛋白的非共价复合物。在一些实施方案中，糖蛋白是热激蛋白，且复合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是相同的，或超过5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg热激蛋白。优选地，复合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、100ng-250ng或150ng-200ng凝集素/μg热激蛋白。在一些实施方案中，复合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是相同的，或小于5ng/μg热激蛋白。优选地，复合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是0.1ng-5ng、0.2ng-4ng、0.3ng-3ng、0.5ng-2ng或0.1ng-1ng凝集素/μg热激蛋白。分子复合物还可以包含一种或多种分子，优选能表现出对一类癌症的抗原或传染病因子的抗原的抗原性的蛋白。

在一些实施方案中，本发明提供了分子复合物的纯化的群体，其中每种复合物包含免疫学和/或生物学活性的糖蛋白和凝集素。在一些实施方案中，糖蛋白是热激蛋白，且群体中凝集素的量相对于热激蛋白的量是相同的，或超过5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg热激蛋白。优选地，群体中凝集素的量相对于热激蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、100ng-250ng或150ng-200ng凝集素/μg热激蛋白。在一些实施方案中，群体中凝集素的量相对于热激蛋白的量是相同的，或小于5ng/μg热激蛋白。优选地，群体中凝集素的量相对于热激蛋白的量是0.1ng-5ng、0.2ng-4ng、0.3ng-3ng、0.5ng-2ng或0.1ng-1ng凝集素/μg热激蛋白。分子复合物还可以包含一种或多种能表现出对一类癌症的抗原或传染病因子的抗原的抗原性的分子，例如蛋白(包括肽和多肽)。在一个实施方案中，群体的分子复合物包含相同的抗原分子。在另一个实施方案中，群体的分子复合物包含不同的抗原分子。本发明还提供了包含与从重组细胞中纯化出的复合物结合的凝集素的分子复合物的纯化群体，其中每种复合物包含与能表现出对一类癌症的抗原或传染病因子的抗原的抗原性的蛋白结合的糖蛋白。

本发明还提供了制备组合物的方法，其优选地对疾病(例如，对一类癌症或传染病因子)是免疫原性的，所述方法包括添加凝集素分子来促进分子复合物的低聚反应的步骤，其中所述的分子复合物通过本申请的5.1-5.4部分所述的方法或本领域已知的方法制备。在一个实施方案中，低聚化的分子复合物包含凝集素和免疫学和/或生物学活性的糖蛋白(其可以是或不是抗原分子)。在另一个实施方案中，低聚化的分子复合物包含凝集素、糖蛋白和抗原分子，其中所述的抗原分子表现出对一类癌症的抗原或传染病因子的抗原的抗原性。在另一个实施方案中，低聚化的分子复合物包含凝集素、热激蛋白和免疫学和/或生物学活性的糖蛋白。在另一个实施方案中，分子复合物包含凝集素、糖基化的热激蛋白和抗原分子，且其中所述的抗原分子表现出对一类癌症的抗原或传染病因子的抗原的抗原性。本发明还提供了通过所述方法制备的组合物。

在一个实施方案中，制备免疫学和/或生物学活性的糖蛋白或包含免疫学和/或生物学活性的与一种或多种非凝集素的其它分子结合的糖蛋白的复合物的步骤不包括凝集素的应用，例如结合到固相上的凝集素，其一般用在柱层析中。将凝集素添加到免疫学和/或生物学活性的糖蛋白制剂或复合物制剂中，以促进糖蛋白的低聚反应。在另一个实施方案中，添加凝集素是制备免疫学和/或生物学活性的糖蛋白(或与一种或多种非凝集素的其它分子结合的糖蛋白)的一个步骤或步骤的一部分，其中添加的凝集素的量足以促进制剂的低聚反应，并生成最终的产品。在一些实施方案中，分子复合物包含热激蛋白和凝集素，且添加凝集素从而使终产品中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是相同的，或超过5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg热激蛋白。优选地，终产品中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、100ng-250ng或150ng-200ng凝集素/μg热激蛋白。在一些实施方案中，添加的凝集素的量足以促进制剂的低聚反应和生成终产品，其中终产品中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是相同的，或小于5ng/μg热激蛋白。优选地，终产品中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是0.1ng-5ng、0.2ng-4ng、0.3ng-3ng、0.5ng-2ng或0.1ng-1ng凝集素/μg热激蛋白。在一个优选的实施方案中，凝集素是Con A。

在一个优选的实施方案中，所述的糖蛋白是糖基化的热激蛋白(Hsp)，包括天然存在的糖基化的热激蛋白(例如，gp96，GRP170，肌钙网蛋白，Bip(GRP78)或其组合)和非天然地糖基化的热激蛋白，后者通过添加一种或多种在编码热激蛋白的天然序列中不存在的糖基化位点、随后添加碳水化合物基团来转化成糖蛋白。免疫学和/或生物学活性的复合物还可以包含能表现出对一类癌症的抗原或传染病因子的抗原的抗原性的分子。在其中抗原分子是体内复合到Hsp上的蛋白的实施方案中，可以从细胞中分离出复合物(见5.1部分)。或者，可以从Hsp和抗原分子的纯化制剂体外生产出Hsp-抗原复合物(见5.3部分)。在该实施方案中，癌症或传染因子的抗原可以通过从天然来源纯化、通过化学合成或重组地得到。凝集素可以通过体外方法(例如5.1至5.4部分所述的那些)与体内和体外生成的Hsp-抗原复合物形成低聚物。在一个优选的实施方案中，所述的凝集素是能结合甘露糖的凝集素分子。更优选地，能结合甘露糖的凝集素分子是伴刀豆球蛋白A(Con A)。

本发明的组合物和方法可以用于多种情形。例如，本发明的组合物可以用于增强分子复合物的免疫原性和/或在治疗或预防疾病(例如，癌症、传染病、贫血、生长激素缺乏、酶缺乏病或免疫抑制状况)的受试者中引起免疫反应。如本文所使用的，术语“受试者”是指患有该病或易患该病的动物，优选哺乳动物，更优选人。

根据本发明，给受试者施用低聚化的免疫学和/或生物学活性的复合物会在受试者中引起、刺激、调制(包括增强和下调)和/或维持免疫反应和/或生物学活性，特别是针对对目标抗原来源特异性的抗原蛋白。低聚化的复合物可以作为一剂或多剂进行施用。预防或治疗剂量可以随不同的受试者和不同的治疗或预防用途而变化。

在一个实施方案中，本发明提供了通过亚免疫性量的疫苗组合物诱导免疫反应的方法，其中低聚反应会通过适量的疫苗组合物(其在未低聚地使用时不足以诱导免疫反应)来促进免疫反应的诱导。

本发明还可以用于通过添加凝集素形成低聚物来增加免疫治疗性部分和/或生物学活性部分的生物学活性。如本文所使用的，术语“免疫治疗性部分”是指其是免疫治疗复合物的一部分的分子。如本文所使用的，术语“低聚物”是指2个或多个单元的复合物(例如，包含一种凝集素分子和一种HSP分子的复合物，或包含一种凝集素分子和两种HSP分子的复合物，等)。在一个实施方案中，本发明的低聚物是包含免疫治疗性部分和/或生物学活性部分和凝集素的二聚体。在另一个实施方案中，免疫治疗性部分和/或生物学活性部分形成更高级的种类，即具有超过2个亚基的低聚物。根据本发明，免疫治疗性部分和/或生物学活性部分的低聚会增加其生物学活性。在一个优选的实施方案中，本发明的低聚物包含凝集素分子和gp96。

本发明还可以用于通过受体介导的事件来增加疫苗向呈递抗原细胞(APC)中的摄入。不受任何理论的限制，通过受体介导的事件来增加疫苗向APC中的摄入的一种可能的解释是，与非低聚化的复合物(其中仅仅一个亚基与受体相互作用)相比，免疫学和/或生物学活性的复合物中的低聚物的多个亚基会增加与呈递抗原细胞上的受体的相互作用。在一个具体的实施方案中，受体是CD91。

本发明还可以用于通过非-受体介导的事件来增加疫苗向呈递抗原细胞中的摄入。一些免疫学和/或生物学活性的包含糖蛋白的复合物不通过受体-介导的事件来起作用。而且，即使当免疫学和/或生物学活性的复合物通过受体-介导的事件发挥它的一些功能时，它仍然可以通过非-受体介导的事件来发挥相同的或一些其它的功能。例如，呈递抗原细胞可以通过非-受体介导的事件摄入与抗原性肽结合的热激蛋白，所述事件包括但不限于胞饮作用、吞噬作用和与细胞表面组分的非-特异性相互作用和随后Hsp-肽复合物插入和/或跨细胞膜的移位。根据本发明，低聚反应将增加这种摄入。生物学活性部分的低聚反应也会增强它们向靶位点的递送。

在一个具体的实施方案中，本发明提供了向受试者的免疫系统递送抗原分子的方法，包括施用包含凝集素和所述的抗原分子的分子复合物，其中抗原分子是天然存在的糖蛋白或已经工程改造成糖蛋白的蛋白。

本发明还可以用于改善免疫治疗性部分的佐剂能力。如本文所使用的，术语“佐剂能力”是指非抗原物质与抗原一起增强免疫反应的能力，其通过例如诱导炎性反应实现，这导致免疫活性的细胞(例如能形成抗体的细胞和T淋巴细胞)的局部流入。具有佐剂能力的免疫治疗性部分在治疗上用于制备疫苗，因为它们能增强生成针对小量抗原的抗体，并延长抗体生成的时间段和/或细胞免疫反应的水平(例如，T淋巴细胞)。不受任何理论的限制，免疫治疗性部分和/或生物学活性部分的低聚反应会提高它们的佐剂能力。如本文所使用的，免疫治疗性部分和/或生物学活性部分是指糖蛋白(包括天然存在的糖蛋白和化学合成的糖蛋白)。在一个优选的实施方案中，糖蛋白是糖基化的热激蛋白，包括但不限于gp96，GRP170，肌钙网蛋白，Bip(GRP78)或其组合。

本发明还可以用于改善免疫治疗性部分和/或生物学活性部分的递送。不受任何理论的限制，免疫治疗性部分和/或生物学活性部分的低聚反应可以使复合物能开发替代性的和更有效的进入靶位点(例如，器官例如肾、肺、肝、心；组织；或细胞，例如呈递抗原细胞、红细胞(“RBC”)、巨噬细胞、淋巴细胞或参与特定的信号转导途径的细胞)的途径。

本发明还提供了在受试者中捕获第二种免疫治疗性部分并通过受体介导的摄入将所述的部分递送进呈递抗原细胞的方法，包括给受试者施用分子复合物的组合物，其中所述的分子复合物包含在有凝集素分子存在的情况下与第二种糖蛋白低聚化的第一种糖蛋白，组合物中的凝集素的量相对于糖蛋白的量是相同的，或超过5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg糖蛋白。优选地，组合物中的凝集素的量相对于糖蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、100ng-250ng或150ng-200ng凝集素/μg糖蛋白。在一些实施方案中，组合物中的凝集素的量相对于糖蛋白的量是相同的，或低于5ng/μg糖蛋白。优选地，组合物中的凝集素的量相对于糖蛋白的量是0.1ng-5ng、0.2ng-4ng、0.3ng-3ng、0.5ng-2ng或0.1ng-1ng凝集素/μg糖蛋白。分子复合物还可以包含一种或多种能表现出对一类癌症的抗原或传染病因子的抗原的抗原性的分子，优选肽。在一个实施方案中，第二种糖蛋白与第一种糖蛋白不同。在另一个实施方案中，第一种糖蛋白可以被呈递抗原细胞摄入，且第二种糖蛋白一般不会被呈递抗原细胞或前述的其它靶细胞摄入，而第一种糖蛋白与第二种糖蛋白的低聚反应使第二种糖蛋白能被呈递抗原细胞摄入。

在一个具体的实施方案中，第一种糖蛋白是糖基化的热激蛋白中的成员，而第二种糖蛋白选自相同的组但是是不同的成员。在另一个实施方案中，第一种糖蛋白是糖基化的热激蛋白的成员，而第二种糖蛋白不是热激蛋白。在另一个实施方案中，第一种糖蛋白不是热激蛋白，而第二种糖蛋白是热激蛋白。在另一个实施方案中，第一种和第二种糖蛋白都是热激蛋白。在一个优选的实施方案中，第一种糖蛋白还与能表现出对一类癌症的抗原或传染病因子的抗原的抗原性的抗原分子结合。在另一个优选的实施方案中，第二种糖蛋白还与能表现出对一类癌症的抗原或传染病因子的抗原的抗原性的抗原分子结合。

本发明还提供了治疗或预防疾病(例如，癌症、传染病、贫血、免疫抑制状况、酶缺乏或激素缺乏)的方法，包括给需要的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的组合物。在一个实施方案中，组合物包含纯化的含有热激蛋白、抗原分子和凝集素分子的非共价复合物，其中热激蛋白和/或抗原分子是糖基化的，其中抗原分子表现出对所述类型癌症的抗原或所述传染病因子的抗原的抗原性，且其中组合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是相同的，或超过5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg热激蛋白。优选地，组合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、100ng-250ng或150ng-200ng凝集素/μg热激蛋白。在一些实施方案中，组合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是相同的，或小于5ng/μg热激蛋白。优选地，组合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是0.1ng-5ng、0.2ng-4ng、0.3ng-3ng、0.5ng-2ng或0.1ng-1ng凝集素/μg热激蛋白。

在另一个实施方案中，组合物是包含分子复合物和药学上可接受的载体的药物组合物，其中分子复合物包含热激蛋白、抗原分子和凝集素分子，其中热激蛋白和/或抗原分子是糖基化的，其中抗原分子表现出对所述类型癌症的抗原或所述传染病因子的抗原的抗原性，且其中组合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是相同的，或超过5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg热激蛋白。优选地，组合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、100ng-250ng或150ng-200ng凝集素/μg热激蛋白。在一些实施方案中，组合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是相同的，或小于5ng/μg热激蛋白。优选地，组合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是0.1ng-5ng、0.2ng-4ng、0.3ng-3ng、0.5ng-2ng或0.1ng-1ng凝集素/μg热激蛋白。

在另一个实施方案中，本发明还提供了治疗或预防疾病(例如，癌症、传染病、贫血、免疫抑制状况、酶缺乏或激素缺乏)的方法，包括给需要的受试者施用(a)糖蛋白(例如，糖基化的Hsp)、凝集素和第一种抗原分子的一种或多种分子复合物，其中第一种抗原分子表现出对一类癌症的抗原或传染病因子的抗原的抗原性，且其中抗原分子可以是或不是糖基化的，且其中复合物中凝集素的量相对于糖蛋白的量是相同的，或超过5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg糖蛋白。优选地，复合物中凝集素的量相对于糖蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、100ng-250ng或150ng-200ng凝集素/μg糖蛋白。在一些实施方案中，复合物中凝集素的量相对于糖蛋白的量是相同的，或小于5ng/μg糖蛋白。优选地，复合物中凝集素的量相对于糖蛋白的量是0.1ng-5ng、0.2ng-4ng、0.3ng-3ng、0.5ng-2ng或0.1ng-1ng凝集素/μg糖蛋白；和(b)在施用分子复合物之前、同时或之后，给受试者施用包含呈递抗原细胞的组合物，所述呈递抗原细胞是用敏化量的与凝集素分子和第二种抗原分子结合的第二种糖蛋白分子复合物体外敏化的，其中所述的第二种抗原分子表现出对所述类型的癌症的第二种抗原或所述传染病因子的第二种抗原的抗原性。APC可以选自本领域已知的那些呈递抗原细胞，包括但不限于巨噬细胞、树突细胞、B淋巴细胞和其组合，且优选巨噬细胞。在一个实施方案中，第一种分子复合物与用于敏化APC的第二种分子复合物相同。在另一个实施方案中，第一种分子复合物与用于敏化APC的第二种分子复合物不同。在一个特定的实施方案中，其中APC和本发明的组合物同时施用，APC和本发明的组合物可以存在于相同的组合物(包含APC和分子复合物)或不同的组合物中。根据本发明的过继免疫治疗(使用敏化的APC)使得能通过与低聚化的分子复合物一起温育来活化免疫呈递抗原细胞。优选地，在体内使用细胞之前，完成对肿瘤或传染因子的反应性的体外测量。该体外增强后，进行克隆选择和/或扩充，且向患者施用构成有用的治疗/预防方案。在一个优选的实施方案中，糖蛋白是糖基化的热激蛋白。

在一个优选的实施方案中，分子复合物的免疫学和/或生物学活性部分，例如复合到能表现出对一类癌症的抗原或传染病因子的抗原的抗原性的蛋白的热激蛋白，是受试者自体的；也就是说，它是从受试者自身分离出的(例如，当需要治疗癌症时，从患者的肿瘤活组织检查中制备)。或者，分子复合物可以对于本发明分子复合物的组合物的施用受试者是异源的。可以体外制备分子复合物，例如，从能重组表达热激蛋白的培养细胞中制备。热激蛋白可以是天然地糖基化的热激蛋白(例如，gp96，GRP170，肌钙网蛋白，Bip(GRP78)，或其组合)、转化成糖蛋白的非天然地糖基化的热激蛋白或其组合。

可以用于与糖蛋白复合以形成特定的复合物的外源抗原和其片段和衍生物可以选自本领域已知的那些，以及通过本领域已知的标准免疫测定、借助于结合抗体或MHC分子(抗原性)或产生免疫反应(免疫原性)的能力能容易地鉴别出的那些。外源抗原的非限制性实例包括但不限于癌症特异性的抗原、癌症相关抗原、由感染了病原体或转染了能编码肿瘤特异性抗原的基因的细胞系或受试者表达的抗原，肿瘤相关抗原或病原体因子的抗原。糖蛋白和抗原分子的特异性复合物可以从患者的癌症或癌前期组织、或从癌细胞系中分离，或者可以体外生产(如在其中外源抗原用作抗原分子的实施方案中所必需的)。

本发明还提供了包含多个容器的试剂盒，每个容器装有包含一剂足以进行一次免疫原性施用的本发明的分子复合物的药物制剂或组合物。本发明还提供了包含装有免疫活性的糖蛋白或其复合物的容器和装有凝集素的容器的试剂盒。任选地，试剂盒中可以包括根据本发明的方法制备低聚复合物的说明书。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及预防和治疗原发性和转移性的肿瘤性疾病的方法和组合物。

本发明的治疗方案和药物组合物可以与另一种治疗方法或预防方法一起使用，例如其它的免疫反应增强剂或生物反应调节剂，包括但不限于细胞因子、各种配体的激动剂或拮抗剂、受体和信号转导分子、免疫刺激核酸和佐剂。根据本发明的这一方面，本发明的组合物在组合疗法中与这些免疫反应增强剂或生物反应调节剂中的一种或多种一起施用。在另一个实施方案中，本发明的组合物与用于治疗癌症的放疗或一种或多种化疗剂一起施用。

除了癌症治疗外，本发明的组合物可以用于预防多种癌症，例如，在由于家族史而易患病的受试者中或在由于环境因素而具有更高的癌症风险的受试者中。

本发明提供了具体的治疗方案、药物组合物和试剂盒。

5.1.热激蛋白制备

在本发明的一些实施方案中，分子复合物包含与复合到抗原分子(例如，一种或多种能表现出对一类癌症的抗原或传染病因子的抗原的抗原性的蛋白(包括肽和多肽))上的糖基化的热激蛋白结合的凝集素。在一些其它的实施方案中，分子复合物包含与糖基化的热激蛋白结合的凝集素。可以独立制备热激蛋白或Hsp-抗原分子复合物，且作为附加步骤添加凝集素来促进Hsp或Hsp-抗原分子复合物的低聚反应。

热激蛋白(Hsp)在本文中可互换地称作应激蛋白，且可以选自能满足下述标准的任何细胞蛋白：当细胞暴露于应激刺激时，该蛋白的胞内浓度会增加；它能结合其它蛋白；在有腺苷三磷酸(ATP)或低pH(例如，pH 1，2，3，4，5或6)存在时，它能释放结合的蛋白；且该蛋白表现出与具有上述性质中的任一项的任意细胞蛋白至少35％的同源性。热激蛋白的非限制性实例记载在Srivastava，Nature Reviews(Immunology)2：185-194(2002)中，其完整内容在这里引作参考。在一些实施方案中，仅仅使用天然糖基化的热激蛋白，其包括但不限于gp96、肌钙网蛋白、GRP 170、Bip(GRP78)或其非共价的或共价的复合物。在本发明的一些实施方案中，通过添加一种或多种在热激蛋白的天然序列中不存在的糖基化位点并随后添加碳水化合物，将热激蛋白转化成糖基化的热激蛋白。

根据本文所述的方法，在本发明的组合物中采用的每种特异性的Hsp-抗原复合物(Hsp-蛋白复合物)优选地纯化成60-100％的总mg蛋白，或至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的总mg蛋白。在另一个实施方案中，每种特异性的Hsp-抗原分子复合物纯化成表观均质的，如通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳所测定的。

在一个优选的实施方案中，从由癌症患者得到的肿瘤细胞，在手术后纯化和制备了Hsp(例如，hsp70，hsp90和gp96)和蛋白的非共价复合物，以用作本发明的组合物中的特异性的复合物。

根据本文所述的方法，内源地复合到Hsp或MHC抗原上的免疫原性的或抗原性的蛋白(包括肽和多肽)可以用作特异性的抗原分子。例如，可以制备这样的蛋白，其能刺激针对不同的肿瘤抗原(例如，酪氨酸酶，gp100，melan-A，gp75，粘蛋白，等)和病毒蛋白的细胞毒性T细胞反应，所述病毒蛋白包括但不限于I型免疫缺陷病毒(HIV-I)、II型人免疫缺陷病毒(HIV-II)、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流感、水痘、腺病毒、I型单纯疱疹病毒(HSV-I)、II型单纯疱疹病毒(HSV-II)、牛疫、鼻病毒、艾可病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒、巨细胞病毒、echinovirus、虫媒病毒、huntavirus、柯萨奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒和脊髓灰质炎病毒的蛋白。在抗原分子是体内地复合到Hsp上的蛋白的实施方案中，可以从细胞分离出复合物。或者，可以从Hsp和抗原分子的每种纯化的制剂体外生产复合物。在一些实施方案中，抗原分子是外源的抗原和其片段和衍生物。

在希望通过体外复合到Hsp上来使用抗原分子的实施方案中，可以在有ATP或低pH(pH 1，2，3，4，5或6)存在的情况下，从内源的Hsp-蛋白复合物中纯化用于这种用途的Hsp。还可以化学合成或重组生产Hsp。在本文中所述的方法可以用于从任何真核细胞(例如，感染了预定的胞内病原体的组织、分离的细胞或无限增殖化真核生物细胞系、肿瘤细胞或肿瘤细胞系)中分离特异性的Hsp-蛋白复合物或Hsp自身。

5.1.1 Hsp 70或Hsp70-蛋白复合物的制备和纯化

以前已经记载了Hsp70-蛋白复合物的纯化，见，例如，Udono等，1993，J.Exp.Med.178：1391-1396。下面通过实例但非限制性方式描述了可以使用的方法。

首先，将肿瘤细胞悬浮到3体积由30mM碳酸氢钠pH7.5，1mMPMSF组成的1X裂解缓冲液中。然后，在冰上超声处理沉淀，直到通过显微镜检测确定裂解了超过99％细胞。作为超声处理的替代方案，可以在Dounce匀浆器中匀浆细胞，通过机械剪切来裂解细胞，直到裂解了超过95％细胞。

然后在1,000g离心裂解物10分钟，去除未破碎的细胞、核和其它的细胞碎片。在100,000g离心得到的上清液90分钟，收获上清液，然后与用含有2mM Ca²⁺和2mM Mg²⁺的磷酸缓冲盐水(PBS)平衡的Con A琼脂糖凝胶混合。当通过机械剪切裂解细胞时，在与Con A琼脂糖凝胶混合之前，用等体积的2X裂解缓冲液稀释上清液。然后让上清液在4℃结合ConA琼脂糖凝胶2-3小时。收获不能结合的物质，并对10mM Tris-醋酸盐pH7.5、0.1mM EDTA、10mM NaCl、1mMPMSF透析36小时(3次，100体积/次)。然后在17,000rpm(Sorvall SS34转子)离心透析物20分钟。然后，收获得到的上清液，并应用到在20mMTris-醋酸盐pH 7.5、20mM NaCl、0.1mM EDTA和15mM 2-巯基乙醇中平衡的Mono Q FPLC柱上。然后用20mM-500mM NaCl梯度展开该柱，然后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分级分离洗脱的级分，并使用合适的抗-HSP70抗体(例如来自克隆N27F3-4，来自StressGen)通过免疫印迹进行表征。

收集与抗-HSP70的抗体强烈免疫反应性的级分，并用硫酸铵沉淀HSP70-蛋白复合物；更具体地用50％-70％硫酸铵的分流(cut)。然后在17,000rpm(SS34 Sorvall转子)离心收获得到的沉淀，并用70％硫酸铵洗涤。然后溶解洗涤的沉淀，并通过在SephadexR G25柱(Pharmacia)上进行凝胶过滤，除去任何残余的硫酸铵。如果需要，可以如上所述通过Mono Q FPLC柱纯化这样得到的HSP70制剂。

使用该方法，可以将Hsp70-蛋白复合物纯化成表观均质的。一般地，可以从1g细胞/组织中纯化出1mg Hsp70-蛋白复合物。

改进的纯化HSP70的方法包括：使细胞蛋白与固定在固体基质上的ATP或ATP的不可水解的类似物接触，从而使裂解物中的HSP70可以结合到ATP或不可水解的ATP类似物上，开洗脱结合的HSP70。优选的方法使用具有固定到固体基质上的ATP(例如，ATP-琼脂糖)的柱层析。得到的HSP70制剂的纯度更高，且没有污染蛋白。HSP70得率也明显增加了约超过10倍。

或者，可以用具有ADP的不可水解的类似物(代替ATP)的层析来纯化HSP70-蛋白复合物。见Peng等，Journal of ImmunologicalMethods 204：13-21(1997)，其完整内容在本文中引作参考。通过实例但非限制性的方式，可以如下所述通过ATP-琼脂糖层析纯化无蛋白的HSP70：在低渗缓冲液中使Meth A肉瘤细胞(5亿细胞)匀浆化，并在4℃、100,000g离心裂解物90分钟。将上清液应用到ATP-琼脂糖柱上。在缓冲液中洗涤该柱，并用5柱体积的3mM ATP洗脱。HSP70洗脱物在洗脱的全部15个级分的级分2至10中。通过SDS-PAGE分析洗脱的级分。使用该方法，可以将HSP70纯化成表观均质的。

或者，使用本领域已知的免疫亲和纯化方法，可以纯化Hsp70或Hsp70-蛋白。例如，可以使用Hsp70-特异性的scFv柱。(见Arnold-Schild等，Cancer Research，2000，60(15)：4175-4178，其在本文中整体引作参考。尽管Arnold-Schild描述了gp96-特异性的scFv柱，但通过等同的方法可以生产出Hsp70-特异性的scFv柱)。通过实例但非限制性的方式，可以如下进行使用Hsp70-特异性的scFv柱的纯化：将scFv抗-Hsp70偶联到CNBr-活化的琼脂糖凝胶上。将含有Hsp70或Hsp70-蛋白复合物的样品应用到scFv抗-Hsp70柱上。用PBS充分洗涤后，可以用PBS、1.3M NaCl或10mM磷酸钠(pH 7.2)洗脱Hsp70或Hsp70-蛋白。

在有ATP或低pH存在的情况下，可以从hsp70-蛋白复合物分离蛋白。这2种方法可以用于从hsp70-蛋白复合物洗脱蛋白。第一种方法包括在有ATP存在的情况下温育hsp70-蛋白复合物制剂。另一种方法包括在低pH缓冲液(例如，pH是1，2，3，4，5或6)中温育hsp70-蛋白复合物制剂。这些方法和本领域已知的任何其它方法都可以用于从Hsp-蛋白复合物分离HSP和蛋白。

5.1.2 Hsp90或Hsp90-蛋白复合物的制备和纯化

通过实例和非限制性的方式予以陈述的、可以使用的方法如下：

首先，将人或哺乳动物细胞悬浮到3体积由5mM磷酸钠缓冲液(pH 7)、150mM NaCl、2mM CaCl₂、2mM MgCl₂和1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)组成的1X裂解缓冲液中。然后，在冰上超声处理沉淀，直到通过显微镜检测确定裂解了超过99％细胞。作为超声处理的替代方案，通过机械剪切来裂解细胞，且在该方法中，一般将细胞重新悬浮到30mM碳酸氢钠(pH 7.5)、1mM PMSF中，在冰上温育20分钟，然后在Dounce匀浆器中匀浆，直到裂解了超过95％细胞。

然后在1,000g离心裂解物10分钟，去除未破碎的细胞、核和其它的细胞碎片。在100,000g离心得到的上清液90分钟，收获上清液，然后与用含有2mM Ca²⁺和2mM Mg²⁺的PBS平衡的Con A琼脂糖凝胶(Sepharose^TM)混合。当通过机械剪切裂解细胞时，在与Con A琼脂糖凝胶混合之前，用等体积的2X裂解缓冲液稀释上清液。然后让上清液在4℃结合Con A琼脂糖凝胶2-3小时。收获不能结合的材料，并对20mM磷酸钠(pH 7.4)、1mM EDTA、250mM NaCl、1mMPMSF透析36小时(3次，100体积/次)。然后在17,000rpm(Sorvall SS34转子)离心透析物20分钟。然后，收获得到的上清液，并应用到用透析缓冲液平衡的Mono Q FPLC^TM离子交换层析柱(Pharmacia)上。然后用200mM至600mM NaCl盐梯度洗脱蛋白。

通过SDS-PAGE分级分离洗脱的级分，并使用抗-hsp90抗体例如3G3(Affinity Bioreagents)，通过免疫印迹鉴别出含有hsp90-蛋白复合物的级分。使用该方法，可以将Hsp90-蛋白复合物纯化成表观均质的。一般地，可以从1g细胞/组织中纯化出150-200μg  hsp90-蛋白复合物。

或者，使用本领域已知的任何免疫亲和纯化方法，可以纯化Hsp90或Hsp90-蛋白。例如，可以使用Hsp90-特异性的scFv柱。(见Arnold-Schild，其在本文中整体引作参考。尽管Arnold-Schild描述了gp96-特异性的scFv柱，但通过等同的方法可以生产出Hsp90-特异性的scFv柱)。通过实例但非限制性的方式，可以如下进行使用Hsp90-特异性的scFv柱的纯化：将scFv抗-Hsp90偶联到CNBr-活化的琼脂糖凝胶上。将含有Hsp90或Hsp90-蛋白复合物的样品应用到scFv抗-Hsp70柱上。用PBS充分洗涤后，可以用PBS、1.3M NaCl或10mM磷酸钠(pH 7.2)洗脱Hsp90或Hsp90-蛋白。

在有ATP或低pH存在的情况下，可以从hsp90-蛋白复合物分离蛋白。这2种方法可以用于从hsp90-蛋白复合物洗脱蛋白。第一种方法包括在有ATP存在的情况下温育hsp90-蛋白复合物制剂。另一种方法包括在低pH缓冲液(例如，pH是1，2，3，4，5或6)中温育hsp90-蛋白复合物制剂。这些方法和本领域已知的任何其它方法都可以用于从Hsp-蛋白复合物分离HSP和蛋白。

5.1.3 Gp96或Gp96-蛋白复合物的制备和纯化

通过实例和非限制性的方式予以陈述的、可以使用的方法如下：

将人或哺乳动物细胞的沉淀重新悬浮到3体积由30mM碳酸氢钠缓冲液(pH 7.5)和1mM PMSF组成的缓冲液中，并使细胞在冰上膨胀20分钟。然后在冰上、在Dounce匀浆器(匀浆器的合适间隙(clearance)随每种细胞类型而异)中匀浆细胞沉淀，直到裂解了超过95％细胞。

在1,000g离心裂解物10分钟，去除未破碎的细胞、核和其它的细胞碎片。然后在100,000g离心来自该离心步骤的上清液90分钟。可以从100,000沉淀或从上清液中纯化gp96-蛋白复合物。

当从上清液中纯化时，用等体积的2X裂解缓冲液稀释上清液，并将上清液在4℃与用含有2mM Ca²⁺和2mM Mg²⁺的PBS平衡的ConA琼脂糖凝胶混合2-3小时。然后将浆装入柱中，用1X裂解缓冲液洗涤直到OD₂₈₀下降到基线。然后，用1/3柱床体积的溶解在含有2mMCa²⁺和2mM Mg²⁺的PBS中的10％α-甲基甘露糖苷(α-MM)洗涤柱，用一片石蜡膜密封柱，并在37℃温育15分钟。然后将柱冷至室温，并从柱底部去除石蜡膜。将5柱体积的α-MM缓冲液应用到柱上，并通过SDS-PAGE分析洗脱物。一般地，得到的材料是约60-95％纯的，但是这依赖于细胞类型和使用的组织与裂解缓冲液的比率。然后将样品应用到用含有5mM磷酸钠(pH 7)的缓冲液平衡的Mono Q FPLC^TM离子交换层析柱(Pharmacia)上。然后用0-1M NaCl梯度从柱上洗脱蛋白，且gp96级分在400mM和550mM NaCl之间洗脱。

但是，该方法可以通过2个单独使用或组合使用的附加步骤予以修饰，以始终如一地生产表观均质的gp96-蛋白复合物。一个任选的步骤包括在Con A纯化步骤之前的硫酸铵沉淀，而另一个任选的步骤包括在Con A纯化步骤以后的DEAE-琼脂糖凝胶纯化、并代替Mono QFPLC^TM步骤。

在第一种任选的步骤中，以实例方式描述如下：通过添加硫酸铵，使从100,000g离心步骤得到的上清液产生50％硫酸铵的终浓度。在轻轻搅拌置于一盘冰水中的烧杯中的溶液的同时，缓慢地加入硫酸铵。将溶液在4℃搅拌约1/2至12小时，并在6,000rpm(Sorvall SS34转子)离心得到的溶液。获取从该步骤得到的上清液，通过加入硫酸铵溶液调成70％硫酸铵的饱和度，并在6,000rpm(Sorvall SS34转子)离心。收获从该步骤得到的沉淀，悬浮到含有70％硫酸铵的PBS中，以冲洗沉淀。在6,000rpm(Sorvall SS34转子)离心该混合物，并将沉淀溶解到含有2mM Ca²⁺和Mg²⁺的PBS中。通过在15,000rpm(SorvallSS34转子)的简短离心去除未溶解的物质。然后，将溶液与Con A琼脂糖凝胶混合，方法如前所述。

在第二种任选的步骤中，以实例方式描述如下：汇集从Con A柱洗脱的含有gp96的级分，并通过透析或优选通过在交联葡聚糖凝胶G25柱上进行缓冲液更换而将缓冲液更换为5mM磷酸钠缓冲液(pH7)，300mM NaCl。缓冲液更换后，将溶液与预先用5mM磷酸钠缓冲液(pH 7)、300mM NaCl平衡的DEAE-琼脂糖凝胶混合。将蛋白溶液和珠轻轻混合1小时，倒入柱中。然后，用5mM磷酸钠缓冲液(pH 7)、300mM NaCl洗涤柱，直到在280nm的吸光度下降至基线。然后，用5体积的5mM磷酸钠缓冲液(pH 7)、700mM NaCl从柱上洗脱结合的蛋白。汇集含有蛋白的级分，用5mM磷酸钠缓冲液(pH 7)稀释，以将盐浓度降低至175mM。然后将得到的材料任选地应用到用5mM磷酸钠缓冲液(pH 7)平衡的Mono Q FPLC^TM离子交换层析柱(Pharmacia)上，然后用0-1M NaCl梯度从柱上洗脱结合在Mono QFPLC^TM离子交换层析柱(Pharmacia)上的蛋白。gp96级分在400mM和550mM NaCl之间洗脱。

但是，本领域的技术人员能够通过常规实验估计出将第二种任选的步骤整合进纯化方案中的益处。另外，也可以明白，添加每种任选步骤的益处依赖于原材料的来源。

当从100,000g沉淀中分离gp96级分时，将沉淀悬浮到5体积含有1％脱氧胆酸钠或1％辛基吡喃型葡糖苷(但是没有Mg²⁺和Ca²⁺)的PBS中，并在冰上温育1小时。在20,000g离心悬浮液30分钟，对几次PBS变化(也没有Mg²⁺和Ca²⁺)透析得到的上清液，以去除去污剂。在100,000g离心透析物90分钟，收获上清液，向上清液中分别加入钙和镁至终浓度2mM。然后通过未修饰的或修饰的方法纯化样品，以从100,000g上清液中分离gp96-蛋白复合物，见上。

使用该方法，可以将gp96-蛋白复合物纯化成表观均质的。从1g细胞/组织中可以分离出约10-20μg gp96。

或者，使用本领域已知的任意的免疫亲和纯化方法，可以纯化gp96或gp96-蛋白。例如，可以使用Hsp96-特异性的scFv柱。(见Arnold-Schild，Cancer Research，2000，60(15)：4175-4178，其在本文中整体引作参考。)

在有ATP或低pH(例如，pH 1，2，3，4，5或6)存在的情况下，可以从gp96-蛋白复合物中分离蛋白。这2种方法可以用于从gp96-蛋白复合物洗脱蛋白。第一种方法包括在有ATP存在的情况下温育gp96-蛋白复合物制剂。另一种方法包括在低pH缓冲液中温育gp96-蛋白复合物制剂。这些方法和本领域已知的任何其它方法都可以用于从Hsp-蛋白复合物分离HSP和蛋白。

5.1.4 Hsp110-蛋白复合物的制备和纯化

Wang等，2001，J.Immunol.166(l)：490-7描述的、可以使用的方法通过实例和非限制性的方式描述如下：

通过Dounce匀浆，将细胞或组织(例如，肿瘤细胞组织)的沉淀(40-60ml)在5体积低渗缓冲液(30mN碳酸氢钠，pH7.2和蛋白酶抑制剂)中匀浆。在4,500xg离心裂解物，然后在100,000xg离心2小时。如果细胞或组织是肝来源的，则将得到的上清液首先应用到蓝色琼脂糖凝胶柱(Pharmacia)上，以去除白蛋白。否则，将得到的上清液应用到预先用结合缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.5；100mMNaCl；ImM MgCl₂；1mM CaCl₂；1mM MnCl₂和15mM 2-ME)平衡的Con A-琼脂糖凝胶柱(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上。用含有15％α-D-o-甲基甘露糖苷(Sigma，St.Louis，MO)的结合缓冲液洗脱结合的蛋白。

首先对20mM Tris-HCl，pH 7.5、100mM NaCl和15mM 2-ME的溶液透析未结合Con A-琼脂糖凝胶的材料，然后应用到DEAE-琼脂糖凝胶柱上，并通过100至500mM NaCl的盐梯度洗脱。收集含有hsp110的级分，透析，并装载到用20mM Tris-HCl，pH 7.5、200mMNaCl和15mM 2-ME平衡的Mono Q(Pharmacia)10/10柱上。用200-500mM NaCl梯度洗脱结合的蛋白。通过SDS-PAGE、随后用Hsp110的Ab进行免疫印迹分析级分，如Wang等，1999，J.Immunol.162：3378所述。通过Centriplus(Amicon，Beverly，MA)浓缩含有Hsp110的汇集的级分，并应用到Superose 12柱(Pharmacia)上。用0.2ml/分钟流速的40mM Tris-HCl，pH 8.0、150mM NaCl和15mM 2-ME洗脱蛋白。

或者，使用本领域已知的任何免疫亲和纯化方法，可以纯化Hsp110或Hsp 110-蛋白。例如，可以使用Hsp110-特异性的scFv柱。(见Arnold-Schild等，Cancer Research，2000，60(15)：4175-4178，其在本文中整体引作参考。尽管Arnold-Schild描述了gp96-特异性的scFv柱，但通过等同的方法可以生产出Hsp110-特异性的scFv柱)。通过实例但非限制性的方式，可以如下进行使用Hsp 110-特异性的scFv柱的纯化：将scFv抗-Hsp110偶联到CNBr-活化的琼脂糖凝胶。将含有Hsp 110或Hsp 110-蛋白复合物的样品应用到scFv抗-Hsp110柱上。用PBS充分洗涤后，可以用PBS、1.3M NaCl或10mM磷酸钠(pH 7.2)洗脱Hsp110或Hsp110-蛋白。

5.1.5 Grp170-蛋白复合物的制备和纯化

Wang等，2001，J.Immunol.166(l)：490-7描述的、可以使用的方法通过实例和非限制性的方法描述如下：

通过Dounce匀浆，将细胞或组织(例如，肿瘤细胞组织)的沉淀(40-60ml)在5体积低渗缓冲液(30mN碳酸氢钠，pH7.2和蛋白酶抑制剂)中匀浆。在4,500xg离心裂解物，然后在100,000xg离心2小时。如果细胞或组织是肝来源的，则将得到的上清液首先应用到蓝色琼脂糖凝胶柱(Pharmacia)上，以去除白蛋白。否则，将得到的上清液应用到预先用结合缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.5；100mMNaCl；1mM MgCl₂；1mM CaCl₂；1mM MnCl₂和15mM 2-ME)平衡的Con A-琼脂糖凝胶柱(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上。用含有15％α-D-o-甲基甘露糖苷(Sigma，St.Louis，MO)的结合缓冲液洗脱结合的蛋白。

首先对20mM Tris-HCl，pH 7.5和150mM NaCl透析结合了ConA-琼脂糖凝胶的材料，然后应用到Mono Q柱上，并通过150至400mMNaCl梯度洗脱。浓缩汇集的级分，并应用到Superose 12柱(Pharmacia)上。收集含有均质的grp170的级分。

或者，使用本领域已知的任何免疫亲和纯化方法，可以纯化GRP170或GRP170-蛋白。例如，可以使用GRP170-特异性的scFv柱。(见Arnold-Schild等，Cancer Research，2000，60(15)：4175-4178，其在本文中整体引作参考。尽管Arnold-Schild描述了gp96-特异性的scFv柱，但通过等同的方法可以生产出Hsp170-特异性的scFv柱)。通过实例但非限制性的方式，可以如下进行使用Hsp170-特异性的scFv柱的纯化：将scFv抗-Hsp170偶联到CNBr-活化的琼脂糖凝胶。将含有Hsp170或Hsp170-蛋白复合物的样品应用到scFv抗-Hsp170柱上。用PBS充分洗涤后，可以用PBS、1.3M NaCl或10mM磷酸钠(pH7.2)洗脱Hsp170或Hsp170-蛋白。

5.1.6 Hsp的重组表达

本领域已知的方法可以用于重组地生产Hsp。可以将能编码热激蛋白的核酸序列插入表达载体中，以在宿主细胞中繁殖和表达。

如本文所使用的，表达构建体是指能编码HSP的核苷酸序列，其可操作地结合到一个或多个能使HSP在合适的宿主细胞中表达的调控区。“可操作地结合”是指一种结合，其中调控区和要表达的HSP序列连接、并以允许进行转录和最终的翻译的方式排列。

表达载体可以提供转录HSP所必需的调控区。如果要表达缺少其同源起始密码子的HSP基因序列，则还可以提供翻译起始密码子(ATG)。在相容的宿主-构建体系统中，细胞转录因子(例如RNA聚合酶)会结合到表达构建体的调控区上，以影响宿主生物中的修饰的HSP序列的转录。基因表达所需的调控区的精确性质会随宿主细胞的不同而变化。通常，需要启动子，它能结合RNA聚合酶和促进可操作地连接的核酸序列的转录。这样的调控区可以包括那些涉及转录和翻译起始的5′非-编码序列，例如TATA框、加帽序列、CAAT序列等。编码序列3’的非编码区可以含有转录终止调控序列，例如终止子和多腺苷酸化位点。

为了使具有调控功能的DNA序列(例如启动子)附着到HSP基因序列上、或将HSP基因序列插入载体的克隆位点，可以通过本领域熟知的技术将能提供合适的相容的限制位点的接头或连接物连接到cDNA的末端(Wu等，1987，Methods in Enzymol，152：343-349)。用限制酶切割后进行修饰，以通过向后消化或在连接前填充单链DNA末端来产生平端。或者，通过使用含有所需的限制酶切位点的引物的PCR扩增DNA，可以将所需的限制酶切位点导入DNA片段中。

可以将包含可操作地结合到调控区上的HSP序列的表达构建体直接导入合适的宿主细胞中，以表达和生产Hsp-肽复合物，而无需进一步克隆。见，例如，美国专利号5,580,859。表达构建体还可以含有能促进HSP序列向宿主细胞的基因组中整合的DNA序列，例如通过同源重组。在该情况中，不必使用包含适用于合适的宿主细胞的复制起点的表达载体，以在宿主细胞中扩增和表达HSP。

可以使用多种表达载体，包括但不限于质粒、粘粒、噬菌体、噬菌粒或修饰的病毒。一般地，这样的表达载体包含载体在合适的宿主细胞中增殖的功能性复制起点、一个或多个用于插入HSP基因序列的限制性内切核酸酶位点和一个或多个选择标记。表达载体必须与相容的宿主细胞一起使用，后者可以源自原核生物或真核生物，包括但不限于细菌、酵母、昆虫、哺乳动物和人。

通过添加一种或多种在天然序列中不存在的糖基化位点，也可以改变热激蛋白的编码序列。多肽的糖基化一般是N-连接的或O-连接的。术语“N-连接的”是指碳水化合物部分向天冬酰胺残基侧链的附着。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是脯氨酸以外的任意氨基酸)是碳水化合物部分向天冬酰胺侧链的酶促附着的识别序列。因而，在多肽中存在这些三肽序列中的任一种，都可以产生潜在的糖基化位点。术语“O-连接的糖基化”是指诸如N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖的糖中的一种向羟基氨基酸的附着，最常见丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。

可以通过多种方法实现糖基化位点的添加。例如，可以通过DNA水平的变化进行改变，特别是通过在预选碱基处突变能编码目标蛋白或肽的DNA，从而使产生的密码子能翻译成所需的氨基酸。可以进行DNA突变，例如使用美国专利号5,364,934所述的方法。

为了长期、高得率地生产适当加工过的Hsp或Hsp-蛋白复合物，优选在哺乳动物细胞中的稳定表达。使用含有选择标记的载体，可以对能稳定表达HSP或Hsp-蛋白复合物的细胞系进行工程改造。通过实例但非限制性的方式，在导入表达构建体后，可以使工程改造的细胞在滋养培养基中生长1-2天，然后转换到选择培养基。表达构建体中的选择标记会赋予对选择的抗性，并最佳地使细胞将表达构建体稳定地整合进它们的染色体中，并在培养基中生长并扩充为细胞系。这样的细胞可以培养较长的时间段，同时连续表达HSP。

可以在标准的温度、培养时间、光密度和培养基组成条件下培养重组细胞。但是，重组细胞的生长条件可以与HSP和抗原蛋白的表达条件不同。修改的培养条件和培养基还可以用于提高Hsp的生产。例如，可以将含有具有其同源启动子的HSP的重组细胞暴露于热或其它环境应激或化学应激。本领域已知的任何技术都可以用于建立生产HSP或HSP-蛋白复合物的最佳条件。

5.1.7 肽合成

通过重组技术生产Hsp的替代方案是肽合成。例如，通过使用肽合成仪，可以合成完整的Hsp或与Hsp的一部分相对应的肽。可以使用常规的肽合成或本领域熟知的其它合成方案。

使用与Merrifield，1963，J.Am.Chem.Soc.，85：2149所述的方法类似的方法，可以通过固相肽合成方法合成具有HSP的氨基酸序列或其一部分的肽。在合成过程中，将具有保护侧链的N-α-保护的氨基酸逐步添加到生长的通过其C-末端连接且连接到不溶的聚合物支持体(即聚苯乙烯珠)上的多肽链上。通过将N-α-脱保护的氨基酸的氨基连接到已经通过与试剂(例如二环己基碳二亚胺)反应活化的N-α-保护的氨基酸的α-羧基上，合成了肽。游离氨基与活化的羧基的附着，导致了肽键的形成。最常用的N-α-保护基包括酸不稳定的Boc和碱不稳定的Fmoc。本领域熟知合适的化学物质、树脂、保护基、保护的氨基酸和试剂的详细内容，所以在本文不再详细讨论(见，Atherton，等，1989，Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach，IRL Press，和Bodanszky，1993，Peptide Chemistry，A Practical Textbook，第2版，Springer-Verlag)。

在合成过程中，还可以添加一种或多种在天然序列中不存在的糖基化位点。例如，可以改变目标蛋白或肽的氨基酸序列，从而使其含有一种或多种5.1.6部分所述的三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)。还可以通过向天然序列添加一种或多种丝氨酸或苏氨酸残基或用其取代，来进行改变(对于O-连接的糖基化位点)。

使用常规方法，例如使用凝胶渗透、分配和/或离子交换层析的制备型HPLC，可以纯化得到的Hsp。本领域熟知合适的基质和缓冲液的选择，所以在本文不再详细讨论。

5.2.抗原分子

下面的小部分综述了可以用作本发明的分子复合物的抗原/免疫原组分的蛋白(包括肽和多肽)和如何鉴别这样的蛋白，例如，在重组表达用于HSP和抗原分子的体外复合的肽中的应用。但是，在本发明的实践中，例如，当从癌细胞或从感染了病原体的组织中直接纯化HSP/肽复合物时，不需要知道分子复合物的抗原分子的特性。

使用本领域已知的方法，可以鉴别出抗原分子的抗原表位。如本文所使用的，“表位”是指能结合或预计能结合受试者的抗体或主要组织相容性(MHC)分子的抗原肽的区域。优选地，在与MHC分子结合后，表位会体内地刺激对该抗原肽的免疫反应。本发明的肽含有预计能结合选定的MHC分子和诱导免疫反应的表位。本发明的抗原肽表位包含参与结合MHC等位基因编码的蛋白的保守残基。预测能结合MHC I类分子的抗原肽表位一般是8-10个残基，而预测能结合MHC II类分子的抗原肽表位一般是10-20个残基。

预测能结合本发明的抗原性肽的特异性的人MHC等位基因的非限制性实例包括下述的人白细胞抗原(HLA)分子：HLA-A1，HLA-A201，HLA-A203，HLA-A3，HLA-A2402，HLA-A26，HLA-B702，HLA-B8，HLA-B1510，HLA-B2705，HLA-B2709，HLA-B4402和HLA-B5101(Rammen see，等，Immunogenetics 41，178-228，1995)。可以用多种不同的方式测量结合MHC分子的能力，例如通过抑制抗原呈递(Sette，等，J.Immunol.141：3893，1991)、体外装配测定(Townsend，等，Cell62：285，1990)和使用突变细胞的基于FACS的测定，例如RMA.S(Melief，等，Eur.J.Immunol.21：2963，1991)。

在一些实施方案中，抗原分子是糖蛋白，且在有凝集素存在时形成低聚物。在其它的实施方案中，抗原分子不是糖蛋白(但是复合物的不同成员是糖蛋白)。在一些实施方案中，从细胞裂解物中分离抗原分子。在一些实施方案中，抗原分子是合成的。在一些实施方案中，将抗原分子工程改造成糖蛋白，例如，通过添加一种或多种在抗原分子的天然序列中不存在的糖基化位点，随后添加碳水化合物。见，例如，Scott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5398-5402(1992)。

5.2.1 抗原/免疫原组分的分离

已经发现，在有ATP或低pH存在的情况下，可以从Hsp复合物洗脱抗原蛋白(包括肽和多肽)和/或组分。这些实验条件可以用于从可能含有潜在有用的抗原决定簇的细胞分离蛋白和/或抗原组分。一旦分离，则使用常规的氨基酸测序方法，可以测定每种抗原蛋白的氨基酸序列。然后可以通过化学合成或重组方法生产这样的抗原分子，纯化，并体外复合到Hsp上，以形成本发明的Hsp复合物。

类似地，已经发现，使用本领域熟知的技术，可以从MHC-蛋白复合物洗脱潜在免疫原性的蛋白(Falk，K.等，1990Nature 348：248-251；Elliott，T.等，1990，Nature 348：195-197；Falk，K.等，1991，Nature 351：290-296)。

因而，可以从内源的Hsp-蛋白复合物或内源的MHC-蛋白复合物分离出潜在免疫原性的或抗原性的蛋白，随后通过体外复合到糖蛋白(例如，糖基化的热激蛋白)来形成本发明的分子复合物，用作抗原分子。下文描述了本领域已知的从这些复合物分离肽和/或抗原组分的示例性的方法。

5.2.2 来自Hsp-肽复合物的肽

可以用2种方法来从Hsp-肽复合物洗脱肽。

一种方法包括，在有ATP存在的情况下，温育Hsp-肽复合物。另一种方法包括，在低pH缓冲液中温育复合物。

简而言之，通过Centricon 10装置(Millipore)离心目标复合物，以获取与复合物松散结合的任何小分子量的物质。通过SDS-PAGE，可以获取和分析大分子量的级分，而可以通过如下所述的HPLC分析小分子量。在ATP温育方案中，将大分子量级分中的应激蛋白-肽复合物与10mM ATP在室温温育30分钟。在低pH(例如，pH 1、2、3、4、5或6)方案中，向应激蛋白-肽复合物中加入醋酸或三氟醋酸(TFA)，至终浓度为10％(体积/体积)，且在室温或在沸水浴中或二者之间的任意温度温育混合物10分钟(见，Van Bleek，等，1990，Nature 348：213-216；和Li，等，1993，EMBO Journal 12：3143-3151)。

如前所述，通过Centricon 10装置离心得到的样品。回收大和小分子量的级分。与ATP或低pH(例如，pH 1、2、3、4、5或6)一起再次温育剩余的大分子量应激蛋白-肽复合物，以获取任何剩余肽。

汇集得到的小分子量级分，通过蒸发浓缩，并溶解到0.1％ TFA中。然后通过反相高压液相层析(HPLC)，使用例如用0.1％ TFA平衡的VYDAC C18反相柱，分级分离溶解的材料。然后通过用溶于0.1％ TFA中的0-80％乙腈线性梯度展开柱，以约0.8ml/分钟的流速洗脱结合的材料。可以通过OD210监控肽的洗脱，并收集含有肽的级分。

5.2.3 来自MHC-肽复合物的肽

本领域熟知从MHC分子分离潜在免疫原性的肽，所以在本文不再详细讨论(见，Falk等，1990，Nature 348：248-251；Rotzsche等，1990，Nature 348：252-254；Elliott等，1990，Nature 348：191-197；Falk等，1991，Nature 351：290-296；Demotz等，1989，Nature 343：682-684；Rotzsche等，1990，Science 249：283-287)，其公开内容在这里引作参考。

简而言之，可以通过常规的免疫亲和方法分离MHC-肽复合物。然后可以通过在有约0.1％ TFA(溶于乙腈中)存在的情况下温育复合物，从MHC-肽复合物洗脱肽。如前所述，可以通过反相HPLC分离和纯化洗脱的肽。

通过本领域熟知的人工的或自动的氨基酸测序技术，可以测定洗脱的肽的氨基酸序列。一旦已经确定了潜在保护肽的氨基酸序列，则可使用常规的肽合成或本领域熟知的其它方法，合成任意所需量的肽。

使用与Merrifield，1963，J.Am.Chem.Soc.，85：2149所述的方法类似的方法，可以通过固相肽合成方法合成具有与上面分离的肽相同的氨基酸序列的肽。在合成过程中，将具有保护侧链的N-α-保护的氨基酸逐步添加到生长的通过其C-末端连接且连接到不溶的聚合物支持体(即聚苯乙烯珠)上的多肽链上。通过将N-α-脱保护的氨基酸的氨基连接到已经通过与试剂(例如二环己基碳二亚胺)反应活化的N-α-保护的氨基酸的α-羧基上，合成了肽。游离氨基与活化的羧基的附着，导致了肽键的形成。最常用的N-α-保护基包括酸不稳定的Boc和碱不稳定的Fmoc。

简而言之，首先将C-末端N-α-保护的氨基酸附着到聚苯乙烯珠上。然后去除N-α-保护基。将脱保护的α-氨基偶联到下一个N-α-保护的氨基酸的活化的α-羧基上。重复该过程，直到合成了所需的肽。然后从不溶的聚合物支持体上切割下得到的肽，并脱保护氨基酸侧链。通过缩合保护的肽片段，可以衍生出更长的肽。本领域熟知合适的化学物质、树脂、保护基、保护的氨基酸和试剂的详细内容，所以在本文不再详细讨论(见，Atherton，等，1989，Solid Phase PeptideSynthesis：A Practical Approach，IRL Press，和Bodanszky，1993，Peptide Chemistry，A Practical Textbook，第2版，Springer-Verlag)。

使用常规方法，例如使用凝胶渗透、分配和/或离子交换层析的制备型HPLC，可以纯化得到的肽。本领域熟知合适的基质和缓冲液的选择，所以在本文不再详细讨论。

5.2.4 外源的抗原分子

可以从本领域已知的或通过免疫测定确定能结合抗体或MHC分子(抗原性)或产生免疫反应(免疫原性)的分子中，选择能表现出病原体的已知抗原的抗原性、或癌症类型的肿瘤-特异性的或肿瘤-相关的抗原(例如抗原或其抗原部分)的抗原性的分子用作抗原分子，以复合糖蛋白和/或凝集素。为了通过检测与抗体的结合来确定免疫原性或抗原性，可以使用本领域已知的多种免疫测定，包括但不限于竞争性的和非-竞争性的使用下述技术的测定系统，例如放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫放射分析、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、体内免疫测定(使用例如胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白印迹、免疫沉淀反应、凝集测定(例如，凝胶凝集测定、血凝测定)、补体结合测定、免疫荧光测定、A蛋白测定和免疫电泳测定等。在一个实施方案中，通过检测第一抗体上的标记来检测抗体结合。在另一个实施方案中，通过检测第二抗体或试剂与第一抗体的结合来检测第一抗体。在其它的实施方案中，标记了第二抗体。预期可以使用本领域已知的多种检测免疫测定中的结合的方法。在检测免疫原性的一个实施方案中，可以通过标准方法来测定T细胞介导的反应，例如，体外细胞毒性测定或体内迟发型超敏反应测定。

还可以通过多种标准鉴别出用作抗原分子的潜在有用的抗原或其衍生物，例如抗原在中和病原体的感染性中的参与(其中需要治疗或预防这样的病原体的感染)(Norrby，1985，Summary，in Vaccines 85，Lerner，等(eds.)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York，pp.388-389)、特异性的类型或组、患者抗血清或免疫细胞的识别和/或对抗原特异性的抗血清或免疫细胞的保护作用的证实。另外，当需要治疗或预防病原体造成的疾病时，及时地或在相同病原体的不同分离物中，抗原的编码的表位应当优选地表现出较小程度的或没有抗原性差异。

优选地，当需要治疗或预防癌症时，使用肿瘤-特异性的抗原(即在肿瘤细胞中表达)或肿瘤相关抗原(即在肿瘤细胞中相对超表达)或其片段或衍生物。例如，这样的肿瘤特异性的或肿瘤相关的抗原包括但不限于KS 1/4全癌抗原(pan-carcinoma antigen)(Perez和Walker，1990，J.Immunol.142：3662-3667；Bumal，1988，Hybridoma 7(4)：407-415)；卵巢癌抗原(CA125)(Yu，等，1991，Cancer Res.51(2)：468-475)；前列腺酸式磷酸盐(Tailer，等，1990，Nucl.Acids Res.18(16)：4928)；前列腺特异性的抗原(Henttu和Vihko，1989，Biochem.Biophys.Res.Comm.160(2)：903-910；Israeli，等，1993，Cancer Res.53：227-230)；黑素瘤相关的抗原p97(Estin，等，1989，J.Natl.Cancer Inst.81(6)：445-446)；黑素瘤抗原gp75(Vijayasardahl，等，1990，J.Exp.Med.171(4)：1375-1380)；大分子量黑素瘤抗原(Natali，等，1987，Cancer 59：55-63)和前列腺特异性的膜抗原。可以复合到糖蛋白上的其它外源抗原包括在癌细胞中高频率地突变的部分或蛋白，例如癌基因(例如，ras，特别是具有仅仅发生在4个氨基酸残基(12，13，59或61)处的活化突变的ras突变体(Gedde-Dahl等，1994，Eur.J.Immunol.24(2)：410-414))和肿瘤抑制基因(例如，p53，已经为其鉴别出了多种能刺激细胞毒性T细胞反应的突变体或多态的p53肽抗原(Gnjatic等，1995，Eur.J.Immunol.25(6)：1638-1642)。

在一个具体的实施方案中，选择了对肿瘤特异性的抗原或其片段或衍生物来复合HSP，以形成用于进行低聚反应，然后施用给患有肿瘤的患者的HSP-抗原复合物。

优选地，当需要治疗或预防病毒病时，使用包含已知病毒的表位的分子。例如，这样的抗原表位可以从下述病毒制备，包括但不限于甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流感、水痘、腺病毒、I型单纯疱疹病毒(HSV-I)、II型单纯疱疹病毒(HSV-II)、牛疫、鼻病毒、艾可病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒、巨细胞病毒、echinovirus，虫媒病毒、huntavirus，柯萨奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、I型人免疫缺陷病毒(HIV-I)和II型人免疫缺陷病毒(HIV-II)。优选地，当需要治疗或预防细菌感染时，使用包含已知细菌的表位的分子。例如，可以从下述细菌制备这样的抗原表位，包括但不限于分枝杆菌立克次氏体、支原体、奈瑟氏球菌和军团菌。

优选地，当需要治疗或预防原生动物感染时，使用包含已知原生动物的表位的分子。例如，这样的抗原表位可以从下述原生动物制备，包括但不限于利什曼原虫、kokzidioa和锥虫。

优选地，当需要治疗或预防寄生物感染时，使用包含已知寄生物的表位的分子。例如，这样的抗原表位可以从下述寄生物制备，包括但不限于衣原体和立克次氏体。

5.3.Hsp/抗原分子复合物的体外生产

在一个实施方案中，其中没有使用体内内源结合的Hsp和抗原分子的特异性的复合物，体外地生产了Hsp与抗原分子的复合物。如本领域的技术人员能够明白的，可以用多种纯化的天然的或体外重组的应激蛋白重构通过前述方法分离的或化学合成或重组生产的抗原分子，以生成免疫原的非共价的应激蛋白-抗原分子复合物。或者，为了用于本发明的免疫治疗性的或预防性的疫苗，可以将外源的抗原或其抗原性的或免疫原性的片段或衍生物复合到应激蛋白上。下面讨论了一个优选的、示例性的体外复合应激蛋白和抗原分子的方法。

在复合之前，用ATP或低pH(例如，pH为1、2、3、4、5或6)预处理Hsp，以获取可能与目标Hsp结合的任何肽。当使用ATP方法时，如Levy，等，1991，Cell 67：265-274所述，通过加入apyranase来去除制剂中多余的ATP。当使用低pH方法时，通过加入pH修饰试剂，将缓冲液重新调至中性pH。

混合抗原分子(1μg)和预处理的Hsp(9μg)，得到约5抗原分子：1应激蛋白摩尔比。然后，在合适的结合缓冲液(例如含有20mM磷酸钠，pH 7.2，350mM NaCl，3mM MgCl₂和1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的缓冲液)中，将混合物在4至45℃温育15分钟至3小时。通过Centricon 10装置(Millipore)离心制剂，以去除任何未结合的肽。通过SDS-PAGE，可以测定肽与应激蛋白的结合。这是体外复合从由内源的hsp-肽复合物解离出的肽的MHC-肽复合物分离出的肽的优选方法。

在本发明的一个替代实施方案中，优选地为了生产hsp70与外源的抗原分子(例如蛋白)的复合物，将5-10μg纯化的Hsp与100微升体积的溶于20mM磷酸钠缓冲液pH 7.5，0.5M NaCl，3mM MgCl₂和1mM ADP中的等摩尔量的抗原分子在37℃温育1小时。在磷酸缓冲盐水中，将温育混合物再稀释至1ml。

在本发明的一个替代实施方案中，优选地为了生产gp96或hsp90与肽的复合物，将5-10μg纯化的gp96或hsp90与溶于合适的缓冲液(例如含有20mM磷酸钠缓冲液pH 7.5，0.5M NaCl，3nM MgCl₂的缓冲液)中的等摩尔量或过量的抗原肽在37-65℃温育5-20分钟。将该温育混合物冷却至室温，且如果需要，通过Centricon 10装置(Millipore)离心一次或多次，以去除任何未结合的肽。

复合后，使用例如下述的混合淋巴细胞靶细胞测定(MLTC)，可以任选地体外测定免疫原性的应激蛋白-抗原分子复合物。一旦已经分离了免疫原性的复合物，可以使用下面讨论的优选的施用方法和赋形剂，任选地在动物模型中进一步表征它们。

作为Hsp和抗原分子的非共价复合物的替代方案，可以在根据本发明的方法施用之前，将抗原分子共价地附着到Hsp上。在如5.1.1.至5.1.4部分所述的从细胞或组织中纯化后，优选地交联Hsp-抗原分子复合物。在一个实施方案中，将Hsp化学交联地共价偶联到抗原分子上。化学交联方法是本领域熟知的。例如，在一个优选的实施方案中，可以使用戊二醛交联。戊二醛交联已经用于形成肽和hsp的共价复合物(见Barrios等，1992，Eur.J.Immunol.22：1365-1372)。优选地，在有0.002％戊二醛存在的情况下，将1-2mg Hsp-抗原分子复合物交联2小时。通过对磷酸缓冲盐水(PBS)透析过夜，去除戊二醛(Lussow等，1991，Eur.J.Immunol.21：2297-2302)。

在另一个实施方案中，Hsp和特异性的抗原通过紫外光(UV)交联进行交联。

在另一个实施方案中，生产了由热激蛋白序列和抗原肽序列组成的重组融合蛋白。为了生产这样的重组融合蛋白，使用本领域已知的重组方法，例如在上面的5.1.6.部分所述的那些，使用与编码抗原的序列相融合的能编码热激蛋白的核酸序列，构建了表达载体。然后表达和分离了Hsp-抗原肽融合体。这样的融合蛋白可以用于引起免疫反应(Suzue等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：13146-51)。通过特别设计分子的抗原肽部分，这样的融合蛋白可以用于引起针对癌症或传染病的免疫反应和用于免疫治疗。

5.4.生物学活性复合物的低聚反应

根据本发明，凝集素或凝集素样分子会与免疫学和/或生物学活性的糖蛋白形成分子复合物。在一些实施方案中，糖蛋白是热激蛋白。在一些实施方案中，糖蛋白不是热激蛋白。在一些实施方案中，糖蛋白是抗原分子。在一些实施方案中，糖蛋白不是抗原分子。在某些实施方案中，分子复合物还可以包含一种或多种非糖蛋白的部分。在一个具体的实施方案中，分子复合物还包含抗原性部分。在一个具体的实施方案中，分子复合物包含与糖蛋白和热激蛋白结合的凝集素分子。在另一个实施方案中，分子复合物包含与糖蛋白、热激蛋白和抗原分子结合的凝集素。在另一个具体的实施方案中，分子复合物包含与糖基化的热激蛋白和抗原分子结合的凝集素分子，其中所述的糖基化的热激蛋白可以是天然存在的热激蛋白(例如，gp96，GRP170，肌钙网蛋白和Bip(GRP78))或非天然存在的热激蛋白，后者通过添加一种或多种在包含热激蛋白的天然氨基酸序列中不存在的糖基化位点、随后添加碳水化合物基团来转化成糖蛋白。糖蛋白(例如，热激蛋白)和抗原分子的复合物可以是非共价的或共价的。优选地，凝集素非共价地结合一种或多种糖蛋白或糖蛋白(例如，热激蛋白)和一种或多种其它部分(例如，抗原分子)的复合物。在一个优选的实施方案中，凝集素分子是能结合甘露糖的凝集素分子，包括但不限于表1中所列的那些。更优选地，能结合甘露糖的凝集素分子是伴刀豆球蛋白A(ConA)。

在一个优选的实施方案中，分子复合物中的凝集素的数目大于分子复合物中的糖蛋白的数目。在一些实施方案中，糖蛋白和凝集素之间的摩尔比是3∶1、2∶1或1∶1。在一个优选的实施方案中，凝集素是四聚体形式的Con A，且对于每个四聚体Con A分子，附着了3个、2个或1个糖蛋白。

可以通过不同的方法制备本发明的分子复合物。在某些实施方案中，体内形成分子复合物，并从细胞中分离出分子复合物。在某些实施方案中，从一种或多种分子复合物的组分的纯化的制剂体外生产分子复合物。在本发明的分子复合物制剂中使用的技术依赖于复合物的性质。制备本发明的分子复合物的组分的非限制性实例在上文5.1.-5.3.部分给出。还可以采用蛋白纯化领域熟知的其它技术，它们包括但不限于吸附分离，例如，层析、离子交换、无机吸附剂、疏水吸附剂、固定金属亲和层析、免疫吸附剂、染料配体层析、从离子交换剂和其它的吸附剂的亲和洗脱；凝胶过滤；电泳方法；液相分配和超滤。见Scopes，1994，PROTEIN PURIFICATION，PRINCIPLES ANDPRACTICE，第3版，Springer，其完整内容在本文中引作参考。

可以在制备分子复合物的各个阶段加入凝集素，例如，在用于纯化免疫学和/或生物学活性部分(例如，Hsp-蛋白复合物)的各层析步骤之前或之后。可以以各种形式加入凝集素，例如粉末或液体溶液。可以组合使用不同的凝集素，以制备本发明的低聚物。在加入本发明的分子制剂之前，还可以使用本领域熟知的方法交联凝集素，以促进低聚反应。在一些实施方案中，添加凝集素是纯化分子复合物中的一个步骤。在一些实施方案中，首先制备了分子复合物的其它组分，并向终产物中加入凝集素，以促进分子复合物的低聚反应。在一个优选的实施方案中，本发明的分子复合物包含热激蛋白、抗原分子和凝集素，其中添加的凝集素的量足以促进制剂的低聚反应和生成终产品，其中终产品中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是相同的，或超过5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg热激蛋白。优选地，终产品中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、100ng-250ng或150ng-200ng凝集素/μg热激蛋白。在一些实施方案中，添加的凝集素的量足以促进制剂的低聚反应和生成终产品，其中终产品中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是相同的，或小于5ng/μg热激蛋白。优选地，终产品中的凝集素的量相对于热激蛋白的量是0.1ng-5ng、0.2ng-4ng、0.3ng-3ng、0.5ng-2ng或0.1ng-1ng凝集素/μg糖蛋白。

本领域已知的任何实验都可以用于验证分子复合物的低聚反应。例如，可以使用SEC作图(profiling)，其中低聚化的分子复合物在尺寸排阻柱纯化时洗脱在与未低聚化的分子复合物不同的级分中(例如，见第7部分)。

本领域已知的任何测定都可以用于验证凝集素分子在低聚物中的存在，包括但不限于任何基于免疫的方法，例如ELISA、放射免疫测定、“夹心”免疫测定、免疫放射分析、免疫扩散测定、免疫荧光测定和免疫电泳测定等，所有的这些测定都是本领域熟知的，在这里不再详细描述(关于Con A特异性的ELISA的实例，见第6部分)。

通过本领域已知的任何测定，可以证实分子复合物的低聚与其体内和体外活性的关联，包括但不限于能检测本发明的分子复合物的生物学活性和/或免疫原性的那些测定(例如但不限于下面的5.5部分所述的那些)，能检测本发明的分子复合物的体外活性的测定(例如但不限于重新呈递测定，例如，CD71体外重新呈递测定、Meth A体外重新呈递测定和CT26体外抗原重新呈递测定，见下面的实施例部分)和能使用动物模型检测本发明的分子复合物的体内活性的测定(例如，体内Meth A肿瘤抑制测定，见下面的实施例部分)。在一个优选的实施方案中，使用了重新呈递测定或肿瘤抑制测定。

5.5.分子复合物的免疫原性的测定

任选地，可以使用本领域已知的任何方法测定本发明的分子复合物的免疫原性。通过实例但非限制性的方式，可以使用下述方法之一。

5.5.1 MLTC测定

简而言之，使用任意的方便的施用途径，给小鼠注射一定量的本发明的分子复合物。作为阴性对照，给其它的小鼠注射例如不包含低聚化的糖蛋白的分子复合物。已知含有特异性的抗原的细胞(例如感染了传染病因子的肿瘤细胞或细胞)可以作为测定的阳性对照。给小鼠注射2次，间隔7-10天。最后一次免疫后10天，取出脾，释放淋巴细胞。随后可以通过加入死亡的表达目标抗原的细胞，体外地重新刺激释放出的淋巴细胞。

例如，可以在3ml含有10％胎牛血清的RPMI培养基中，用4×10⁴丝裂霉素C处理的或γ-辐射的(5-10,000拉德)含有目标抗原的细胞(或转染了适当基因的细胞，视情况而定)刺激8×10⁶免疫脾细胞。在某些情况中，可以在培养基中包含33％二次混合的淋巴细胞培养物上清液，作为T细胞生长因子来源(见，Glasebrook，等，1980，J Exp.Med.151：876)。为了检测免疫后原发的细胞毒性T细胞反应，可以无刺激地培养脾细胞。在有些实验中，还可以用抗原性不同的细胞重新刺激免疫的小鼠的脾细胞，以测定细胞毒性T细胞反应的特异性。

6天后，在4小时⁵¹Cr-释放测定中检测培养物的细胞毒性(见，Palladino，等，1987，Cancer Res.47：5074-5079和Blachere，等，1993，J.Immunotherapy 14：352-356)。在该测定中，向靶细胞悬浮液中添加混合的淋巴细胞培养物，以产生不同的效应物：靶(E∶T)比(通常是1∶1至40∶1)。通过在37℃、在含有20mCi⁵¹Cr/ml的培养基中温育1×10⁶靶细胞1小时，预标记靶细胞。标记后，洗涤细胞3次。每个测定点(E∶T比)进行一式三份，并整合适当的对照以测量自发的⁵¹Cr释放(测定中未加入淋巴细胞)和100％释放(用去污剂裂解的细胞)。温育细胞混合物4小时后，通过在200g离心5分钟，沉淀细胞。通过γ计数器测量释放到上清液中的⁵¹Cr的量。将(实验样品中的cpm-自发释放的cpm)/(总去污剂释放的cpm-自发释放的cpm)测量为百分比细胞毒性。

为了阻断MHC I类级联，向实验样品中加入从K-44杂交瘤细胞(抗-MHC I类杂交瘤)衍生出的浓缩杂交瘤上清液，至终浓度为12.5％。

5.5.2 CD4⁺T细胞增殖测定

从脾、新鲜血液或CSF得到了原代T细胞，并使用基本上如Kruse和Sebald，1992，EMBO J.11：3237-3244所述的FICOLL-PAQUEPLUS(Pharmacia，Upsalla，瑞典)通过离心进行纯化。将外周血单核细胞与能表达抗原分子的细胞的裂解物一起温育7-10天。在测定之前的24至48小时，可以任选地向培养物中加入呈递抗原细胞，以在裂解物中加工和呈递抗原。然后离心收获细胞，在RPMI 1640培养基(GibcoBRL，Gaithersburg、Md.)中洗涤。在37℃，将5×10⁴活化的T细胞/孔(PHA-胚细胞)置于在96孔平板中的含有10％胎牛血清、10mM HEPES.pH 7.5、2mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素G和100μg/ml硫酸链霉素的RPMI 1640培养基中72小时，用1μCi ³H-胸苷(DuPont NEN，Boston，Mass.)/孔脉冲6小时，收获，并在TOPCOUNT闪烁计数器(Packard Instrument Co.，Meriden，Conn.)中测量放射性。

5.5.3 抗体反应测定

在本发明的某些实施方案中，通过测量施用复合物生成的抗体，可以测定包含低聚化的糖蛋白的本发明的分子复合物的免疫原性。在该实施方案的一个模式中，用50μl/孔的0.75μg/ml纯化的非复合形式的用于分子复合物(例如Aβ42)中的抗原肽的PBS溶液在4℃涂覆微量滴定板(96-孔Immuno Plate II，Nunc)16小时，并在20℃涂覆1小时。排空孔，用200μl PBS-T-BSA(含有0.05％(v/v)TWEEN 20和1％(w/v)牛血清白蛋白的PBS)/孔在20℃封闭1小时，然后用PBS-T洗涤3次。将50μl/孔的来自已经接受了本发明的分子复合物的动物(例如模型小鼠或人患者)的血浆或CSF在20℃应用1小时，然后用PBS-T洗涤平板3次。然后适当地在20℃与50μl/孔的山羊抗-小鼠或抗-人免疫球蛋白温育1小时后，后两者与在PBS-T-BSA中以1∶1,500稀释的辣根过氧化物酶(Amersham)和(如上所述3次另外的PBS-T洗涤后)50μl对苯二胺(OPD)-H₂O₂底物溶液缀合，量热地测量抗-肽抗体的活性。5分钟后，用150μl 2M H₂SO₄终止反应，用Kontron SLT-210光度计(SLT Lab-instr.，Zurich，瑞士)在492nm(参考620nm)测定吸光度。

5.5.4 细胞因子检测测定

通过检测和定量特定细胞因子的水平，可以测量CD4⁺T细胞对本发明的HSP-复合物的增殖反应。在一个实施方案中，例如，使用IFN-γ检测测定来测试本发明的复合物的免疫原性，可以测量胞内细胞因子。在该方法的一个实例中，用特定肿瘤的肽抗原或传染病因子的肽抗原刺激了来自用凝集素-HSP-肽复合物处理的受试者的外周血单核细胞。然后用流式细胞仪可检测的T细胞-特异性标记的抗体(例如FITC-缀合的抗-CD8和PerCP-标记的抗-CD4抗体)对细胞染色。洗涤后，固定细胞，渗化，并与染料标记的可与人IFN-γ反应的抗体(PE-抗-IFN-γ)反应。使用标准技术，通过流式细胞仪分析样品。

或者，可以用滤器免疫实验，即酶联免疫斑点测定(ELISPOT)来检测T细胞周围的特异性的细胞因子。在一个实施方案中，例如，用纯化的细胞因子-特异性的第一抗体(即抗-IFN-γ)涂覆硝酸纤维素衬垫的微量滴定板，并封闭该板，以避免其它蛋白的非特异性的结合造成的背景。从用凝集素-HSP-肽复合物处理的受试者得到了含有能分泌细胞因子的细胞的单核血细胞的样品，将该样品稀释到微量滴定板的孔上。加入标记的(例如，生物素-标记的)第二抗-细胞因子抗体。然后可以检测抗体细胞因子复合物，即通过酶缀合的链霉抗生物素蛋白-能分泌细胞因子的细胞在可视的、显微镜的或电子检测方法中会显示为“斑点”。

5.5.5 四聚体测定

在另一个实施方案中，可以用“四聚体染色”测定(Altman等，1996，Science 274：94-96)来鉴别抗原-特异性的T-细胞。例如，在一个实施方案中，使含有特异性的肽抗原(例如肿瘤-特异性的抗原)的MHC分子多聚化，以生成可溶的肽四聚体，并标记，例如通过复合链霉抗生物素蛋白。然后将MHC-肽抗原复合物与从大量用凝集素-HSP-复合物处理的受试者得到的T细胞混合。然后用生物素对能表达目标抗原(即肿瘤-特异性的抗原)的T细胞进行染色。

5.6.与过继免疫治疗的组合

过继免疫治疗是指治疗癌症或传染病的治疗方法，其中给宿主施用免疫细胞，其目的是使该细胞直接或间接介导对肿瘤细胞和/或抗原组分的特异性免疫或肿瘤的退化或传染病的治疗，这视情况而定(见1999年11月16日授权的美国专利号5,985,270，其在这里整体引作参考)。作为任选的步骤，根据本文所述的方法，用本发明的分子复合物敏化APC，并用于过继免疫治疗中。

在一个实施方案中，用凝集素结合的与根据本文所述的方法制备的抗原蛋白复合的HSP敏化在过继免疫治疗中使用的呈递抗原细胞(APC)。通过将凝集素-Hsp复合到源自能表达造成传染病的因子的抗原决定簇的抗原性细胞或病毒颗粒中的至少50％不同蛋白或至少100不同蛋白的抗原蛋白上，可以生成复合物。通过(a)用蛋白酶消化源自所述癌症类型的细胞的蛋白制剂，或者使其与ATP、盐酸胍和/或酸接触，以生成大量抗原性肽，和(b)使该大量抗原性肽复合到凝集素-Hsp上，也可以生产复合物。

在另一个实施方案中，施用体外复合的通过本发明的方法制备的抗原性肽、HSP和凝集素的疗法可以与使用通过本领域已知的任何方法(见例如，美国专利号5,985,270)制备出的HSP-抗原肽复合物敏化的APC的过继免疫治疗组合，其中抗原性肽能表现出所需的抗原性(例如，癌症类型或病原体的)。敏化的APC可以单独施用，与体外复合的蛋白、HSP和凝集素组合施用，或在施用复合的蛋白、HSP和凝集素之前或之后施用。更具体地，敏化的APC在预防和治疗癌症方面的应用还可以包括给受试者施用对所述的治疗或预防有效量的包含凝集素和复合到抗原蛋白上的热激蛋白的复合物，其中所述的复合物如上所述制备。类似地，敏化的APC在治疗或预防传染病类型方面的应用还可以包括给受试者施用对所述的治疗或预防有效量的包含凝集素结合的热激蛋白和抗原蛋白的复合物。

而且，可以改变体外生产的本发明的分子复合物的施用模式，包括但不限于例如，皮下地、静脉内地或肌内地，尽管优选皮内地。在另一个具体的实施方案中，施用由根据本发明制备的复合物敏化的呈递抗原细胞的过继免疫治疗可以与施用与通过本领域已知的任何方法(见例如，美国专利号5,750,119；5,837,251；5,961,979；5,935,576,PCT公开号WO 94/14976或WO 99/50303)制备的HSP-抗原分子复合物结合的凝集素的疗法组合，其中抗原分子表现出所需的抗原性(例如，癌症类型或病原体的)。

5.6.1 得到巨噬细胞和呈递抗原细胞

优选地通过体外生产，如Inaba，K.，等，1992，J.Exp.Med.，176：1693-1702所述，从来自人外周血或骨髓的干细胞和祖先细胞得到了抗原-呈递细胞，包括但不限于巨噬细胞、树突细胞和B-细胞。

通过本领域已知的各种方法中的任一种，可以得到APC。在优选的方面，使用了从人血细胞得到的人巨噬细胞。通过实例但非限制性的方式，可以如下得到巨噬细胞：

通过Ficoll-Hypaque梯度离心，从患者(优选要治疗的患者)的外周血分离出了单核细胞，并接种到用患者自己的血清或其它AB+人血清预涂覆的组织培养皿中。将细胞在37℃温育1小时，然后通过移液操作取出非贴壁的细胞。向皿中剩余的贴壁细胞中加入在磷酸缓冲盐水中的冷的(4℃)1mM EDTA，并将皿置于室温中15分钟。收获细胞，用RPMI缓冲液洗涤，并悬浮到RPMI缓冲液中。通过在37℃与巨噬细胞-集落刺激因子(M-CSF)一起温育，可以得到增加数目的巨噬细胞；如Inaba，K.，等，1992，J.Exp.Med.，176：1693-1702所详细描述的，通过与粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)一起温育，可以得到增加数目的树突细胞。

5.6.2 用本发明的分子复合物敏化巨噬细胞和呈递抗原细胞

用本发明的分子复合物敏化了APC，优选地通过与复合物一起体外温育细胞实现。通过在37℃与复合物体外温育15分钟至24小时，用包含与凝集素和抗原分子结合的糖蛋白/糖肽的复合物敏化了APC。通过实例但非限制性的方式，可以使5×10⁴巨噬细胞在1ml简单RPMI培养基中，与所需浓度(从150μg/ml开始，向下滴定)的Hsp一起在37℃温育15分钟至24小时。洗涤细胞3次，并重新悬浮到优选无菌的适用于给患者注射的方便浓度(例如，1×10⁷/ml)的生理介质中。优选地，给其注射敏化的APC的患者是从其原始分离APC的患者(自体的实施方案)。

任选地，通过它们刺激CTL释放肿瘤坏死因子的能力和它们作为这样的CTL的靶的能力，可以监控敏化的APC刺激例如抗原-特异性的I类-限制的细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)的能力。

5.6.3 敏化的APC的重新灌注

通过常规的临床方法，将分子复合物-敏化的APC全身地、优选静脉内地重新灌注进患者中。将这些活化的细胞优选地通过全身施用重新灌注到自体患者中。依赖于患者的状况，患者一般接受约10⁶至约10¹²敏化的巨噬细胞。在一些方案中，患者可以任选地另外接受合适剂量的生物学反应调节剂，包括但不限于细胞因子IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、TNF或其它的细胞因子生长因子。

5.7.被动免疫疗法

本发明的组合物还可以用于针对癌症和传染病的被动免疫疗法。被动免疫是宿主通过施用预先形成的针对异源生物的抗体获得的短期保护。例如，包含从感染了传染性生物的细胞得到的、且与凝集素分子低聚化的Hsp-肽复合物的本发明的组合物可以用于引起受试者中的免疫反应，从该受试者取出的血清还可以用于治疗或预防该传染性生物在另一个受试者中造成的疾病。

5.8.疾病的预防和治疗

本发明还提供了预防或治疗疾病(例如，癌症、传染病、贫血、生长激素缺乏、酶缺乏病、免疫抑制状况等)的方法，包括给需要的受试者施用预防或治疗有效量的包含一种或多种分子复合物的组合物，其中每种复合物包含与免疫学和/或生物学活性的糖蛋白结合的凝集素。在一个实施方案中，糖蛋白是抗原分子。在一个具体的实施方案中，复合物包含凝集素、抗原分子糖蛋白和其它分子，例如热激蛋白，其可以是或不是糖基化的。在另一个实施方案中，糖蛋白不是抗原分子。在一个具体的实施方案中，糖蛋白是糖基化的热激蛋白。在另一个实施方案中，本发明的分子复合物包含凝集素、非抗原分子糖蛋白和抗原分子(其可以是或不是糖蛋白)。在一个具体的实施方案中，抗原分子是能表现出对一类癌症的抗原或传染病因子的抗原性的蛋白(包括肽和多肽)。组合物还可以包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，受试者是动物。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是家畜，例如马、鸡、羊或猪。在一些实施方案中，受试者是宠物，例如鸟、狗或猫。在一个优选的实施方案中，受试者是人。

在一个实施方案中，“治疗”是指疾病或其至少一项可辨别的症状的改善。在另一个实施方案中，“治疗”是指至少一项可测量的与疾病有关的、受试者未必可辨别的身体参数的改善。在另一个实施方案中，“治疗”是指身体地(例如，可辨别的症状的稳定)、生理地(例如，身体参数的稳定)或二者兼有地抑制疾病的进展。在另一个实施方案中，“治疗”是指延迟疾病或紊乱的发作。

在某些实施方案中，将本发明的组合物施用给受试者作为对疾病的预防措施。如本文所使用的，“预防”是指减小患特定疾病(例如癌症或传染病)的风险。在该实施方案的一个模式中，将本发明的组合物施用给具有癌症的遗传性素因的受试者作为预防措施。在该实施方案的另一个模式中，将本发明的组合物施用给面临暴露于致癌剂(包括但不限于化学物质和/或辐射)的受试者或面临暴露于传染病因子的受试者作为预防措施。

例如，在某些实施方案中，施用本发明的组合物，会使癌细胞或传染因子的生长相对于不存在所述的组合物时的生长被抑制或减少至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％或至少10％。

通过本发明的方法制备的组合物包含与糖蛋白、优选热激蛋白结合的凝集素的复合物。组合物还可以包含大量抗原性肽(其可以是或不是糖蛋白)。本发明的组合物可以用于在肿瘤位点诱导炎性反应，且可以在治疗的癌症患者中最终造成肿瘤负荷量的衰退。本发明的组合物可以增强受试者的免疫活性，并引起针对传染因子的特异性免疫和针对肿瘤前细胞和赘生性细胞的特异性免疫。本发明的组合物还可以用于预防传染病的发作和进展，并抑制肿瘤细胞的生长和进展。

联合疗法是指本发明的分子复合物与其它用药程式在预防和治疗疾病(例如，癌症、传染病、贫血、生长激素缺乏、酶缺乏病、免疫抑制状况)中的应用。施用本发明的复合物可以增强预防剂或治疗剂(例如抗癌剂或抗传染剂)的作用，反之亦然。优选地，该其它形式的用药程式是基于非凝集素-HSP的用药程式，即该用药程式不包含HSP或凝集素作为组分。该方法通常称作联合疗法、辅助疗法或结合疗法(这些术语在本文中可互换地使用)。通过联合疗法，可以观察到加和的效力或加和的治疗效果。还可以预期治疗功效大于加和功效的协同结果。使用联合疗法，还可以提供比单独施用治疗用药程式或凝集素-HSP复合物更好的治疗特征。加和的或协同的作用可以允许调节一种或两种用药程式的剂量和/或施用频率，以减小或避免有害的或负面的作用。

根据本发明，本发明的分子复合物可以单独使用，或者与许多不同类型的治疗用药程式组合使用。一些这样的用药程式对于特定类型的癌症或传染病是特别有用的，且在5.8.1和5.8.2部分予以讨论。许多其它的用药程式对免疫系统的功能有作用，并且通常可以应用于肿瘤病和传染病。

在一个实施方案中，本发明的分子复合物与一种或多种生物反应调节剂组合使用，以治疗癌症或传染病。一组生物反应调节剂是细胞因子。在一个这样的实施方案中，将细胞因子施用给接受本发明的分子复合物的受试者。在另一个这样的实施方案中，将分子复合物施用给接受化疗剂和细胞因子的组合的受试者。在各种实施方案中，可以使用一种或多种细胞因子，且它们选自IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IFNα，IFNβ，IFNγ，TNFα，TNFβ，G-CSF，GM-CSF，TGF-β，IL-15，IL-18，GM-CSF，INF-γ，INF-α，SLC，内皮单核细胞活化蛋白-2(EMAP2)，MIP-3α，MIP-3β或MHC基因，例如HLA-B7。另外，其它示例性的细胞因子包括TNF家族的其它成员，包括但不限于与TNF-α有关的诱导细胞凋亡的配体(TRAIL)，与TNF-α有关的活化诱导的细胞因子(TRANCE)，与TNF-α有关的细胞凋亡弱诱导物(TWEAK)，CD40配体(CD40L)，淋巴毒素α(LT-α)，淋巴毒素β(LT-β)，OX40配体(OX40L)，Fas配体(FasL)，CD27配体(CD27L)，CD30配体(CD30L)，41BB配体(41BBL)，APRIL，LIGHT，TL1，TNFSF16，TNFSF17和AITR-L，或其功能部分。见，例如，Kwon等，1999，Curr.Opin.Immunol.11：340-345关于TNF家族的综述。优选地，在治疗用药程式之前施用分子复合物。在一个具体的实施方案中，将本发明的复合物施用给接受环磷酰胺和IL-12的组合的受试者，以治疗癌症。

在另一个实施方案中，将本发明的分子复合物与一种或多种生物反应调节剂组合使用，所述调节剂是免疫系统的各种配体、受体和信号转导分子的激动剂或拮抗剂。例如，生物反应调节剂包括但不限于Toll样受体(TLR-2，TLR-7，TLR-8和TLR-9)的激动剂；LPS；41BB，OX40，ICOS和CD40的激动剂；和Fas配体、PD1和CTLA-4的拮抗剂。这些激动剂和拮抗剂可以是抗体、抗体片段、肽、拟肽(peptidomimetic)化合物和多糖。

在另一个实施方案中，将本发明的分子复合物与一种或多种生物反应调节剂组合使用，后者是免疫刺激性的核酸。这样的核酸(其中的许多是包含未甲基化的CpG基序的寡核苷酸)是促脊椎动物淋巴细胞有丝分裂的，且已知其能增强免疫反应。见Woolridge等，1997，Blood 89：2994-2998。这样的寡核苷酸记载在国际专利公开号WO01/22972、WO 01/51083、WO 98/40100和WO 99/61056中，其中的每篇都在这里整体引入，和美国专利号6,207,646、6,194,388、6,218,371、6,239,116、6,429,199和6,406,705，其中的每篇都在这里整体引入。Kandimalla等已经在Bioorganic & Medicinal Chemistry 9：807-813(2001)中描述了其它种类的免疫刺激性的寡核苷酸，例如含有YpG-和CpR-基序的硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸，其在这里整体引作参考。还包括免疫刺激性的寡核苷酸，其缺少CpG二核苷酸，后者当通过粘膜途径(包括低剂量施用)或通过肠胃外的途径以高剂量施用时会增强抗体反应，经常与CpG核酸的程度一样，但是该反应是Th2-偏向的(IgG1＞＞IgG2a)。见美国专利公开号20010044416 A1，其在这里整体引作参考。按照前述专利和文献，可以进行测定免疫刺激性的寡核苷酸的活性的方法。而且，可以在磷酸酯主链、糖、核碱基(nucleobase)和核苷酸间连接的范围内修饰免疫刺激性的寡核苷酸，以调控活性。这样的修饰是本领域的技术人员已知的。

在另一个实施方案中，本发明的分子复合物与一种或多种佐剂组合使用。在一个具体的实施方案中，本发明的分子复合物与皂苷(例如，QS-21)和/或免疫刺激性的寡核苷酸(例如，包含至少1个CpG二核苷酸的寡核苷酸)组合使用。可以分开施用佐剂，或者在与本发明的复合物混合在一起的组合物中施用。全身佐剂是可以肠胃外地递送的佐剂。全身佐剂包括能产生贮存(depot)效果的佐剂、能刺激免疫系统的佐剂和能实现二者的佐剂。如本文所使用的，能产生贮存效果的佐剂是能使抗原在体内缓慢释放、从而延长免疫细胞向抗原的暴露时间的佐剂。这类佐剂包括但不限于明矾(例如，氢氧化铝、磷酸铝)；或基于乳状液的制剂，包括矿物油、非矿物油、油包水包油乳状液、水包油的乳状液，例如Seppic ISA系列的Montanide佐剂(例如，Montanide ISA 720，AirLiquide，Paris，法国)；MF-59(用Span 85和Tween 80稳定化的水包角鲨烯的乳状液；Chiron Corporation，Emeryville，Calif.；和PROVAX(含有稳定化去污剂和胶束形成剂的水包油乳状液；IDEC，Pharmaceuticals Corporation，San Diego，Calif.)。

其它佐剂会刺激免疫系统，例如使免疫细胞生产和分泌细胞因子或IgG。这类佐剂包括但不限于免疫刺激性的核酸，例如CpG寡核苷酸；从皂树(Q.saponaria)的树皮纯化出的皂苷，例如QS21；聚[二(羧基苯氧基)膦腈(poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene)(PCPP聚合物；Virus Research Institute，美国)；脂多糖(LPS)的衍生物，例如单磷酰脂质A(MPL；Ribi ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，Mont.)，胞壁酰二肽(MDP；Ribi)和苏氨酰-胞壁酰二肽(t-MDP；Ribi)；OM-174(与脂质A有关的葡糖胺二糖；OM Pharma SA，Meyrin，瑞士)；氨烷基氨基葡糖苷磷酸盐(AGPs，Corixa Corporation)和利什曼原虫属(Leishmania)延伸因子(纯化的利什曼原虫属蛋白；CorixaCorporation，Seattle，Wash.)。

其它的全身佐剂是能生成贮存效果和刺激免疫系统的佐剂。这些化合物是具有上面鉴别出的全身佐剂的2种功能的那些化合物。这类佐剂包括但不限于ISCOM(免疫刺激复合物，其含有混合的皂苷、脂质，并形成具有能容纳抗原的孔的病毒大小的颗粒；CSL，Melbourne，澳大利亚)；SB-AS2(SmithKline Beecham佐剂系统#2，它是含有MPL和QS21的水包油乳状液：SmithKline Beecham Biologicals[SBB]，Rixensart，比利时)；SB-AS4(SmithKline Beecham佐剂系统#4，它含有明矾和MPL；SBB，比利时)；能形成胶束的非离子性的嵌段共聚物，例如CRL 1005(它们含有通过聚氧乙烯链在侧面连接的疏水聚氧丙烯的线性链；Vaxcel，Inc.，Norcross，Ga.)；和Syntex佐剂制剂(SAF，含有Tween 80和非离子性的嵌段共聚物的水包油乳状液；SyntexChemicals，Inc.，Boulder，Colo.)。

根据本发明有用的粘膜佐剂是当与本发明的复合物一起施用给粘膜表面时能在受试者中诱导粘膜免疫反应的佐剂。粘膜佐剂包括但不限于CpG核酸(例如PCT公布的专利申请WO 99/61056)，细菌毒素：例如，霍乱毒素(CT)，CT衍生物，包括但不限于CT B亚基(CTB)(Wu等，1998，Tochikubo等，1998)；CTD53(Val至Asp)(Fontana等，1995)；CTK97(Val至Lys)(Fontana等，1995)；CTK104(Tyr至Lys)(Fontana等，1995)；CTD53/K63(Val至Asp，Ser至Lys)(Fontana等，1995)；CTH54(Arg至His)(Fontana等，1995)；CTN107(His至Asn)(Fontana等，1995)；CTE114(Ser至Glu)(Fontana等，1995)；CTE112K(Glu至Lys)(Yamamoto等，1997a)；CTS61F(Ser至Phe)(Yamamoto等，1997a，1997b)；CTS106(Pro至Lys)(Douce等，1997，Fontana等，1995)；和CTK63(Ser至Lys)(Douce等，1997，Fontana等，1995)，密闭小带毒素，zot，大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)，LT衍生物包括但不限于LT B亚基(LTB)(Verweij等，1998)；LT7K(Arg至Lys)(Komase等，1998，Douce等，1995)；LT61F(Ser至Phe)(Komase等，1998)；LT112K(Glu至Lys)(Komase等，1998)；LT118E(Gly至Glu)(Komase等，1998)；LT146E(Arg至Glu)(Komase等，1998)；LT192G(Arg至Gly)(Komase等，1998)；LTK63(Ser至Lys)(Marchetti等，1998，Douce等，1997，1998，Di Tommaso等，1996)；和LTR72(Ala至Arg)(Giuliani等，1998)，百日咳毒素，PT.(Lycke等，1992，Spangler BD，1992，Freytag和Clemments，1999，Roberts等，1995，Wilson等，1995)包括PT-9K/129G(Roberts等，1995，Cropley等，1995)；毒素衍生物(见下文)(Holmgren等，1993，Verweij等，1998，Rappuoli等，1995，Freytag和Clements，1999)；脂质A衍生物(例如，单磷酰脂质A，MPL)(Sasaki等，1998，Vancott等，1998；胞壁酰二肽(MDP)衍生物(Fukushima等，1996，Ogawa等，1989，Michalek等，1983，Morisaki等，1983)；细菌外膜蛋白(例如，布氏疏螺旋体(Borreliaburgdotferi)的外表面蛋白A(OspA)脂蛋白、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的外膜蛋白)(Marinaro等，1999，Van de Verg等，1996)；水包油的乳状液(例如，MF59)(Barchfield等，1999，Verschoor等，1999，O′Hagan，1998)；铝盐(Isaka等，1998，1999)；和皂苷(例如，QS21)Aquila Biopharmaceuticals，Inc.，Worster，Me.)(Sasaki等，1998，MacNeal等，1998)，ISCOM，MF-59(用Span 85和Tween 80稳定化的水包角鲨烯的乳状液；Chiron Corporation，Emeryville，Calif.)；the Seppic ISA系列的Montanide佐剂(例如，Montanide ISA 720；AirLiquide，Paris，法国)；PROVAX(含有稳定化去污剂和胶束形成剂的水包油乳状液；IDEC PharmaceuticalsCorporation，San Diego，Calif.)；Syntext佐剂制剂(SAF；SyntexChemicals，Inc.，Boulder，Colo.)；聚[二(羧基苯氧基)膦腈(PCPP聚合物；Virus Research Institute，美国)和利什曼原虫属延伸因子(CorixaCorporation，Seattle，Wash.)。

5.8.1 靶癌症

单独或与敏化的APC一起施用本发明的组合物，会刺激宿主受试者的免疫活性，并引起针对肿瘤前细胞和/或赘生性细胞的特异性免疫。如本文所使用的，“肿瘤前”细胞是指处于从正常形式向肿瘤形式的过渡中的细胞。逐渐得到分子生物学研究支持的形态学证据表明，肿瘤形成前通过多个步骤进行。非赘生性细胞生长通常由增生、化生或最独特的发育异常组成(关于这样的异常生长状况的综述，见Robbins和Angell，1976，Basic Pathology，2d Ed.，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，pp.68-79)。增生是有控制的细胞增殖的形式，涉及组织或器官中的细胞数目的增加，而不显著改变结构或功能。例如，子宫内膜增生经常先于子宫内膜癌。化生是有控制的细胞生长的形式，其中一种类型的成年或完全分化的细胞取代另一种类型的成年细胞。化生可以发生在上皮组织或结缔组织的细胞中。非典型的化生涉及稍微混乱的化生上皮。发育异常经常是癌症的预兆，且主要见于上皮；它是非赘生性细胞生长的最混乱的形式，涉及个体细胞均匀性和细胞的结构取向的损失。发育异常的细胞经常具有异常大的、深度染色的核，并表现出多型现象。当存在慢性刺激或炎症时，发育异常会特征地发生，且常见于子宫颈、呼吸道、口腔和胆囊。尽管肿瘤前的病变可能发展成瘤形成，但它们也可以保持稳定较长的时间段，甚至可以退化，特别是如果去除了刺激剂或如果病变被宿主的免疫攻击征服时。可以用本发明的组合物治疗的癌症还包括但不限于人肉瘤和癌。人肉瘤和癌还是对低聚化的糖蛋白复合物敏化的APC的过继免疫治疗起反应的。

在一个实施方案中，联合疗法除了包括施用本发明的分子复合物以外，还包括辅助使用一种或多种能辅助预防或治疗癌症的用药程式，该用药程式包括但不限于化疗剂、免疫治疗剂、抗血管发生剂、细胞因子、激素、抗体、多核苷酸、辐射和光动力学的治疗剂。在具体的实施方案中，联合疗法可以用于预防癌症的复发、抑制转移或抑制癌症或转移的生长和/或扩散。

通过本发明的方法可以治疗或预防的癌症类型包括但不限于人肉瘤和癌，例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、子宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤；白血病，例如、急性淋巴细胞性白血病和急性髓细胞性白血病(原粒细胞的、早幼粒细胞的、骨髓单核细胞的、单核细胞的和红白血病)；慢性白血病(慢性髓细胞性(粒细胞的)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)；和真性红细胞增多、淋巴瘤(何杰金病和非何杰金病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和重链病。

在另一个实施方案中，癌症患者由于在施用本发明的分子复合物或施用凝集素-Hsp敏化的APC之前已经进行了抗癌治疗(例如，化疗辐射)而被免疫抑制。

本发明提供的免疫疗法能理想地用于癌症患者具有多种原因。首先，具有麻醉的手术会导致免疫抑制。利用手术前阶段的适当的免疫疗法，可以预防或逆转该免疫抑制。这会导致更少的感染并发症，并促进伤口愈合。其次，手术后的肿瘤体积是最小的，在该情况下免疫疗法最可能是有效的。第三个原因是如下可能性，即肿瘤细胞在手术时会流入循环中，在此时应用有效的免疫疗法可以消除这些细胞。

本发明的预防和治疗方法指向在手术前、手术时或手术后增强癌症患者的免疫活性，以及诱导对癌细胞的肿瘤-特异性的免疫，其目的是抑制癌症，且最终的临床目的是完全的癌退化和根除。本发明的方法还可以用于面临特定种类癌症的高风险的个体，例如，由于家族史或环境危险因素所导致的。

在一些实施方案中，除了本发明的分子复合物外，还给需要治疗或预防癌症的受试者施用一种或多种抗癌剂。抗癌剂是指能辅助治疗肿瘤或癌症的任何分子或化合物。在本发明的方法中可以使用的抗癌剂的实例包括但不限于：异噁唑醋酸；阿柔比星；盐酸阿可达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白细胞介素；六甲密胺；丙氨肽霉素；阿美坦醌；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；氨茴霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素(asperlin)；阿托胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐替派；比卡鲁胺；盐酸必桑郡；二甲磺酸双奈法德(bisnafide dimesylate)；比折来新(bizelesin)；硫酸博来霉素；白瑞夸尔钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C；卡普睾酮；卡拉酰胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡米诺霉素；卡折来新(carzelesin)；西地芬戈(cedefingol)；苯丁酸氮芥；西罗里霉素；顺铂；克拉利平；甲磺酸克雷斯托；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D；盐酸柔红霉素；脱氧氮杂胞苷；右奥马铂(dexormaplatin)；地扎胍宁(dezaguanine)；甲磺酸地扎胍宁；地吖醌；多西他赛；阿霉素；盐酸阿霉素；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸甲雄烷酮；偶氮霉素；依达曲沙；盐酸艾佛鸟氨酸；elsamitrucin；恩络铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表阿霉素；厄布洛唑(erbulozole)；盐酸去羟阿霉素；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；艾托卜宁；盐酸法罗唑啉；法扎拉滨(fazarabine)；维甲酰酚胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他宾；磷喹酮(fosquidone)；佛司曲辛钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸去甲柔毛霉素；异环磷酰胺；依莫佛新；白细胞介素II(包括重组的白细胞介素II，或rIL2)，干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-Ia；干扰素γ-Ib；异丙铂；盐酸伊立替康；生长妥林；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；洛莫氮芥；盐酸洛索蒽醌(loxoxantrone hydrochloride)；马丙考；美登素；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮；美法仑；美洛格端；巯嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶；四甲尿烷亚胺；米汀多酰胺；mitocarcin；丝裂红素；丝林霉素；丝裂马菌素；丝裂霉素；丝裂帕菌素；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；洛可达唑；诺加拉霉素；奥马铂(ormaplatin)；奥昔舒仑；紫杉醇；培加帕酶；培利霉素(peliomycin)；戊氮芥；硫酸培来霉素；哌磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸必散特隆；普卡霉素；普洛美坦(plomestane)；卟吩姆钠；泊非罗霉素；松龙苯芥；盐酸丙卡巴肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；吡鲁米特；沙芬戈(safingol)；盐酸沙芬戈；司莫司汀；双曲秦；斯帕磷酸钠；司帕素霉素；盐酸锗螺胺；螺旋氮芥；顺螺铂；链黑霉素；链脲霉素；磺氯苯脲(sulofenur)；他利霉素；tecogalan sodium；喃氟啶；盐酸替洛蒽醌(teloxantronehydrochloride)；替莫泊芬(temoporfin)；替尼泊苷；台罗西隆；睾内酯；硫唑鸟嘌呤；硫鸟嘌呤；噻替哌；噻唑呋林；替拉扎明；柠檬酸托瑞米芬；醋酸7-甲诺酮；磷酸曲西瑞宾；曲麦克特；三甲曲沙葡糖醛酯；曲普瑞林；盐酸九布洛唑；尿嘧啶氮芥；乌瑞替哌；伐普肽(vapreotide)；维替泊芬(verteporfin)；硫酸长春碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定(vinepidine sulfate)；硫酸长春甘酯；硫酸长春素；长春瑞宾；硫酸异长春碱；硫酸长春氮芥；伏罗唑；折尼拉汀；新制癌菌素；盐酸佐柔比星。

可以使用的其它抗癌药包括但不限于：20-表-1，25二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙(abiraterone)；阿柔比星；酰基富烯(acylfulvene)；adecypenol；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲密胺；安巴司丁；amidox；氨磷丁；氨基乙酰丙酸；氨柔比星(amrubicin)；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗-背部化形态发生蛋白-1；抗雄激素物质，前列腺癌；抗雌激素；抗瘤酮；反义寡核苷酸；氨基乙酸艾菲地可宁；细胞凋亡基因调节剂；细胞凋亡调节剂；脱嘌呤核酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；asulacrine；阿他美坦；阿曲氮芥；axinastatin 1；axinastatin 2；axinastatin 3；阿扎西隆；azatoxin；重氮酪氨酸(azatyrosine)；浆果赤霉素III衍生物；balanol；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；benzochlorins；苯甲酰十字孢碱；β内酰胺衍生物；beta-alethine；亚阿克拉霉素B；白桦酯酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；必桑郡；双吖丙啶基精胺；双奈法德；bistratene A；比折来新；breflate；溴匹立明；布朵替坦；丁硫氨酸亚砜胺(buthionine sulfoximine)；钙泊三醇；calphostin C；喜树碱衍生物；canarypox IL-2；卡培他滨；氨甲酰-氨基-三唑；羧基氨基三唑；CaRest M3；CARN 700；软骨衍生的抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；澳粟精胺；杀菌肽B；西曲瑞克；chlorlns；氨磺酰氯喹噁啉；西卡前列素；顺式卟啉；克拉利平；氯米芬类似物；克霉唑；collismycin A；collismycin B；风车子素A4；风车子素类似物；conagenin；crambescidin 816；克雷斯托；隐藻素8(cryptophycin8)；隐藻素A衍生物；库拉素A(curacin A)；环戊蒽醌(cyclopentanthraquinones)；cycloplatam；cypemycin；阿糖胞苷酯；溶细胞因子；磷酸己烷雌酚；达昔单抗(dacliximab)；脱氧氮杂胞苷；脱氢代代宁B；地洛瑞林(deslorelin)；地塞米松；右异环磷酰胺(dexifosfamide)；右雷佐生；右维拉帕米(dexverapamil)；地吖醌；代代宁B；didox；diethylnorspermine；二氢-5-氮胞苷；二氢紫杉醇，9-；dioxamycin；联苯螺旋氮芥；多西他赛；二十二烷醇；多拉司琼；脱氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；duocarmycin SA；依布硒；依考莫司汀(ecomustine)；依地福新(edelfosine)；依决洛单抗(edrecolomab)；艾佛鸟氨酸；榄烯；乙嘧替氟(emitefur)；表阿霉素；依立雄胺；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法罗唑啉；法扎拉滨；维甲酰酚胺；非格司亭；非那雄胺；flavopiridol；氟噻司汀；fluasterone；氟达拉滨；fluorodaunorunicin hydrochloride；伏芬尼美司；福美坦；佛司曲辛；福泰氮芥；gadolinium texaphyrin；硝酸镓；加洛他滨(galocitabine)；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；hepsulfam；heregulin；六亚甲基二乙酰胺；金丝桃素；伊本膦酸；去甲柔毛霉素；艾多昔芬；伊决孟酮(idramantone)；伊莫福新；伊洛马司他(ilomastat)；咪唑吖啶酮(imidazoacridones)；咪喹莫特；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白细胞介素；碘苄胍；碘阿霉素；甘薯黑疤霉醇，4-；伊罗普拉(iroplact)；伊索拉定；isobengazole；isohomohalicondrin B；伊他司琼(itasetron)；jasplakinolide；kahalalide F；三醋酸片螺素(lamellarin)-N；缓释兰乐肽；leinamycin；来格司亭；硫酸香菇多糖；leptolstatin；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林+雌激素+孕酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；线性多胺类似物；亲脂的二糖肽；亲脂的铂化合物；lissoclinamide 7；洛巴铂；蚯蚓氨酸(lombricine)；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛伐他汀；洛唑利宾；勒托替康(lurtotecan)；lutetium texaphyrin；lysofylline；裂解肽；美坦生；mannostatin A；马马司他；马丙考；脉丝平；基质分解素(matrilysin)抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美洛格瑞；美巴龙(merbarone)；meterelin；甲硫氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；米非司酮；米替福星；米英司定；错配的双链RNA；丙米腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；胺硝萘酞胺；mitotoxin成纤维细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀(mofarotene)；重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；单克隆抗体，人绒毛膜促性腺激素；单磷酰脂质A+分枝杆菌细胞壁sk；蒙匹胺醇；多重抗药性基因抑制剂；基于多重肿瘤抑制剂1的疗法；芥子抗癌剂；印度洋海绵(mycaperoxide)B；分枝杆菌细胞壁提取物；myriaporone；N-acetyldinaline；N-取代的苯甲酰胺；萘法瑞林；nagrestip；纳洛酮+喷他佐辛；napavin；naphterpin；纳妥格拉斯丁；奈达铂；奈莫柔比星(nemorubicin)；奈立膦酸(neridronic acid)；中性内肽酶；尼鲁米特；nisamycin；氧化氮调节剂；硝基氮抗氧化剂；nitrullyn；O6-苄基鸟嘌呤；善得定；okicenone；寡核苷酸；奥那司酮；奥丹西隆；奥丹西隆；oracin；经口的细胞因子诱导剂；奥马铂；奥沙西罗(osaterone)；奥沙利铂；oxaunomycin；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；palauamine；棕榈酰根霉素；帕米膦酸；人参三醇；巴洛米芬；三羟水杨胺；泊泽尼普定；培加帕酶；peldesine；木聚硫钠；喷司他丁；pentrozole；全氟溴烷(perflubron)；哌磷酰胺；紫苏子醇；phenazinomycin；乙酸苯酯；磷酸酶抑制剂；溶链菌；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克辛；placetin A；placetin B；纤溶酶原激活物抑制剂；铂复合物；铂化合物；铂-三胺复合物；卟吩姆钠；泊非罗霉素；泼尼松；丙基双吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；基于A蛋白的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂，微观藻类的；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；紫红素；9-甲氧基吡唑啉吖啶(pyrazoloacridine)；吡多酸化的血红蛋白聚氧乙烯缀合物；raf拮抗剂；雷替曲塞；拉莫西隆；ras法尼基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；脱甲基化的雷替尼卜定；羟乙膦酸铼Re 186；根霉素；核酶；RII retinamide；吡鲁米特；rohitukine；磷壁酰基二肽；罗喹美克；rubiginone B1；ruboxyl；沙芬戈；saintopin；SarCNU；sarcophytol A；重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；Sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老衍生的抑制剂1；有义寡核苷酸；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；西索菲兰；索布佐山；硼卡钠(sodium borocaptate)；苯乙酸钠；solverol；生长调节素结合蛋白；索纳明(sonermin)；斯帕磷酸；spicamycin D；螺旋氮芥；斯耐潘定；spongistatin 1；角鲨胺(squalamine)；干细胞抑制剂；干细胞分裂抑制剂；stipiamide；溶基质素抑制剂；sulfinosine；强效的血管活性的肠肽拮抗剂；suradista；苏拉明；苦马豆素(swainsonine)；合成的糖胺聚糖；他莫司汀(tallimustine)；他莫昔芬甲碘化物；牛磺莫司汀；他佐罗汀；tecogalansodium；喃氟啶；tellurapyrylium；端粒末端转移酶抑制剂；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷；tetrachlorodeeaoxide；tetrazomine；thaliblastine；thiocoraline；血小板生成素；血小板生成素模拟物；胸腺法新；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南(thymotrinan)；促甲状腺素素；tin ethyl etiopurpurin；替拉扎明；二氯环戊二烯钛；topsentin；托瑞米芬；全能干细胞因子；翻译抑制剂；维A酸；三乙酰基尿苷；曲西瑞宾；曲麦克特；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲(turosteride)；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂；UBC抑制剂；乌苯美司；尿殖窦-衍生的生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；variolin B；载体系统，红细胞基因疗法；维拉雷琐(velaresol)；vermine；verdins；维替泊芬；长春烯碱；vinxaltine；vitaxin；伏罗唑；扎诺特隆(zanoterone)；折尼拉汀；亚苄维(zilascorb)和净司他丁替马拉美。

抗癌剂可以是化疗剂，其包括但不限于下述的化合物：细胞毒性的抗生素、抗代谢物、抗有丝分裂剂、烷化剂、铂化合物、砷化合物、DNA拓扑异构酶抑制剂、紫杉烷、核苷类似物、植物生物碱和毒素；和其合成的衍生物。表2列出了所述组中的示例性的化合物：

表2

烷化剂
		氮芥：	环磷酰胺
	异环磷酰胺
			三芥环磷酰胺
	苯丁酸氮芥
		亚硝基脲：	卡莫司汀(BCNU)
	洛莫氮芥(CCNU)
		烷基磺酸盐：	白消安
	曲奥舒凡
		三氮烯：	达卡巴嗪
含铂的化合物：	顺铂
			卡铂
	Aroplatin
			奥沙利铂
植物生物碱
		长春花生物碱：	长春新碱
	长春碱
			长春地辛
	长春烯碱
		Taxoids：	紫杉醇
	多西他赛
DNA拓扑异构酶抑制剂
		Epipodophyllins：	依托泊苷
	替尼泊苷
			拓朴替康
	9-氨基喜树碱
			喜树碱
	克雷斯托
		丝裂霉素：	丝裂霉素C

		抗-叶酸盐：
DHFR抑制剂：	甲氨蝶呤
			曲麦克特
IMP脱氢酶抑制剂：	霉酚酸
			噻唑呋林
	三氮唑核苷
			EICAR
核糖核苷还原酶抑制剂：	羟基脲
			去铁胺
嘧啶类似物：
		尿嘧啶类似物：	5-氟尿嘧啶
	氟尿苷
			脱氧氟尿苷
	雷替曲塞(Ratitrexed)
		胞嘧啶类似物：	阿糖胞苷(ara C)
	胞嘧啶阿拉伯糖苷
			氟达拉滨
嘌呤类似物：	巯嘌呤
			硫鸟嘌呤
DNA抗代谢物：	3-HP
			2′-脱氧-5-氟尿苷
	5-HP
			α-TGDR
	氨基乙酸艾菲地可宁
			ara-C
	5-氮杂-2′-脱氧胞苷
			β-TGDR环胞苷胍唑
	inosine glycodialdehyde

	macebecin II
			吡唑啉咪唑(pyrazoloimidazole)
抗有丝分裂剂：	Allocolchicine
			Halichondrin B
	秋水仙碱
			秋水仙碱衍生物
	dolstatin 10
			美登素
	根霉素
			硫代秋水仙碱
	三苯甲基半胱氨酸
		其它：
异戊二烯化抑制剂：
		多巴胺能神经毒素：	1-甲基-4-苯基吡啶鎓离子
细胞周期抑制剂：	十字孢碱
		放线菌素：	放线菌素D
	更生霉素
		博来霉素：	博来霉素A2
	博来霉素B2
			培来霉素
蒽环霉素：	柔红霉素
			阿霉素(羟基柔红霉素)
	去甲柔毛霉素
			表阿霉素
	吡柔比星
			佐柔比星
	米托蒽醌
		MDR抑制剂：	维拉帕米
Ca2+ATP酶抑制剂：	毒胡萝卜素

本发明还预期含有一种或多种化疗剂(例如，FLAG、CHOP)的组合物。FLAG包括氟达拉滨、胞嘧啶阿拉伯糖苷(Ara-C)和G-CSF。CHOP包括环磷酰胺、长春新碱、阿霉素和泼尼松。前面的表中的每一种都是说明性的，无意进行限制。

在一个实施方案中，可以用包含本发明的复合物的药物组合物与5-氟尿嘧啶、顺铂、多西他赛、阿霉素、Herceptin、吉西他滨、IL-2、紫杉醇和/或VP-16(依托泊苷)一起组合治疗乳腺癌。

在另一个实施方案中，可以用包含本发明的复合物的药物组合物与紫杉醇、多西他赛、米托蒽醌和/或雄激素受体拮抗剂(例如，氟他胺)一起组合治疗前列腺癌。

在另一个实施方案中，可以用包含本发明的复合物的药物组合物与氟达拉滨、胞嘧啶阿拉伯糖苷、gemtuzumab(MYLOTARG)、柔红霉素、甲氨蝶呤、长春新碱、6-巯嘌呤、去甲柔毛霉素、米托蒽醌、依托泊苷、天冬酰胺酶、泼尼松和/或环磷酰胺一起组合治疗白血病。作为另一个实例，可以用包含本发明的复合物的药物组合物与地塞米松一起组合治疗骨髓瘤。

在另一个实施方案中，可以用包含本发明的复合物的药物组合物与达卡巴嗪一起组合治疗黑素瘤。

在另一个实施方案中，可以用包含本发明的复合物的药物组合物与伊立替康一起组合治疗结肠直肠癌。

在另一个实施方案中，可以用包含本发明的复合物的药物组合物与紫杉醇、多西他赛、依托泊苷和/或顺铂一起组合治疗肺癌。

在另一个实施方案中，可以用包含本发明的复合物的药物组合物与环磷酰胺、CHOP、依托泊苷、博来霉素、米托蒽醌和/或顺铂一起组合治疗非何杰金淋巴瘤。

在另一个实施方案中，可以用包含本发明的复合物的药物组合物与顺铂一起组合治疗胃癌。

在另一个实施方案中，可以用包含本发明的复合物的药物组合物与吉西他滨一起组合治疗胰腺癌。

根据本发明，本发明的复合物可以在抗癌剂之前、之后或与之同时施用，以预防或治疗癌症。依赖于癌症的类型、受试者的历史和状况、选择的抗癌剂，可以使本发明的复合物的应用与化疗的剂量和时间选择相协调。

可以将本发明的复合物的应用加入化疗方案中。在一个实施方案中，化疗剂是剂量范围为100至1000mg/m²/周期的吉西他滨。在一个实施方案中，化疗剂是剂量范围为200至4000mg/m²/周期的达卡巴嗪。在一个优选的实施方案中，达卡巴嗪的剂量范围为700至1000mg/m²/周期。在另一个实施方案中，化疗剂是剂量范围为25至50mg/m²/周期的氟达拉滨。在另一个实施方案中，化疗剂是剂量范围为200至2000mg/m²/周期的胞嘧啶阿拉伯糖苷(Ara-C)。在另一个实施方案中，化疗剂是剂量范围为1.5至7.5mg/kg/周期的多西他赛。在另一个实施方案中，化疗剂是剂量范围为5至15mg/kg/周期的紫杉醇。在另一个实施方案中，化疗剂是剂量范围为5至20mg/kg/周期的顺铂。在另一个实施方案中，化疗剂是剂量范围为5至20mg/kg/周期的5-氟尿嘧啶。在另一个实施方案中，化疗剂是剂量范围为2至8mg/kg/周期的阿霉素。在另一个实施方案中，化疗剂是剂量范围为40至160mg/kg/周期的表鬼臼毒素。在另一个实施方案中，化疗剂是剂量范围为50至200mg/kg/周期的环磷酰胺。在另一个实施方案中，化疗剂是剂量范围为50至75、75至100、100至125或125至150mg/m²/周期的伊立替康。在另一个实施方案中，化疗剂是剂量范围为3.7至5.4、5.5至7.4、7.5至11或11至18.5mg/m²/周期的长春碱。在另一个实施方案中，化疗剂是剂量范围为0.7至1.4或1.5至2mg/m²/周期的长春新碱。在另一个实施方案中，化疗剂是剂量范围为3.3至5、5至10、10至100或100至1000mg/m²/周期的甲氨蝶呤。

在一个优选的实施方案中，本发明还包括，当作为联合疗法方案的一部分施用时，低剂量的化疗剂的应用。例如，本发明的复合物的起始治疗会增加肿瘤对随后的一定剂量的化疗剂攻击的敏感性，所述剂量接近或低于在没有本发明的复合物时施用化疗剂的剂量低限。

在一个实施方案中，给癌症患者施用本发明的复合物和低剂量(例如，6-60mg/m²/天或更少)的多西他赛。在另一个实施方案中，给癌症患者施用本发明的复合物和低剂量(例如，10-135mg/m²/天或更少)的紫杉醇。在另一个实施方案中，给癌症患者施用本发明的复合物和低剂量(例如，2.5-25mg/m²/天或更少)的氟达拉滨。在另一个实施方案中，给癌症患者施用本发明的复合物和低剂量(例如，0.5-1.5g/m²/天或更少)的胞嘧啶阿拉伯糖苷(Ara-C)。

在另一个实施方案中，化疗剂是剂量范围为10-100mg/m²/周期的吉西他滨。在另一个实施方案中，化疗剂是剂量范围为5-10、10-20、20-40或40-75mg/m²/周期的顺铂，例如，PLATINOL或PLATINOL-AQ(Bristol Myers)。在另一个实施方案中，给卵巢癌患者施用剂量范围为7.5-75mg/m²/周期的顺铂。在另一个实施方案中，给膀胱癌患者施用剂量范围为5-50mg/m²/周期的顺铂。在另一个实施方案中，化疗剂是剂量范围为2-4、4-8、8-16、16-35或35-75mg/m²/周期的卡铂，例如，PARAPLATIN(Bristol Myers)。在另一个实施方案中，给卵巢癌患者施用剂量范围为7.5-75mg/m²/周期的卡铂。在另一个实施方案中，给膀胱癌患者施用剂量范围为5-50mg/m²/周期的卡铂。在另一个实施方案中，给睾丸癌患者施用剂量范围为2-20mg/m²/周期的卡铂。在另一个实施方案中，化疗剂是剂量范围为6-10、10-30或30-60mg/m²/周期的多西他赛，例如，TAXOTERE(Rhone PoulencRorer)。在另一个实施方案中，化疗剂是剂量范围为10-20、20-40、40-70或70-135mg/kg/周期的紫杉醇，例如，TAXOL(Bristol MyersSquibb)。在另一个实施方案中，化疗剂是剂量范围为0.5-5mg/kg/周期的5-氟尿嘧啶。在另一个实施方案中，化疗剂是剂量范围为2-4、4-8、8-15、15-30或30-60mg/kg/周期的阿霉素，例如，ADRIAMYCIN(Pharmacia & Upjohn)、DOXIL(Alza)、RUBEX(Bristol Myers Squibb)。

在另一个实施方案中，本发明的复合物与一种或多种免疫治疗剂(例如抗体和疫苗)组合施用。在一个优选的实施方案中，抗体具有对癌症的体内治疗和/或预防用途。在一些实施方案中，抗体可以用于治疗和/或预防传染病。治疗和预防性抗体的实例包括但不限于：MDX-010(Medarex，NJ)，它是目前在临床上用于治疗前列腺癌的人源化的抗-CTLA-4抗体；SYNAGIS(MedImmune，MD)，它是用于治疗RSV感染的患者的人源化的抗-呼吸道合胞病毒(RSV)单克隆抗体；HERCEPTIN(Trastuzumab)(Genentech，CA)，它是用于治疗转移性乳腺癌患者的人源化的抗-HER2单克隆抗体。其它的实例是人源化的抗-CD18F(ab′)2(Genentech)；CDP860，它是人源化的抗-CD18F(ab′)2(Celltech，英国)；PR0542，它是与CD4融合的抗-HIV gp120抗体(Progenics/Genzyme Transgenics)；Ostavir，它是人抗乙型肝炎病毒抗体(Protein Design Lab/Novartis)；PROTOVIR^TM，它是人源化的抗-CMV IgG1抗体(Protein Design Lab/Novartis)；MAK-195(SEGARD)，它是鼠抗-TNF-αF(ab′)2(Knoll Pharma/BASF)；IC14，它是抗-CD14抗体(ICOS Pharm)；人源化的抗-VEGF IgG1抗体(Genentech)；OVAREX^TM，它是鼠抗-CA 125抗体(Altarex)；PANOREX^TM，它是鼠抗-17-IA细胞表面抗原IgG2a抗体(GlaxoWellcome/Centocor)；BEC2，它是鼠抗-独特型(GD3表位)IgG抗体(ImClone System)；IMC-C225，它是嵌合的抗-EGFR IgG抗体(ImClone System)；VITAXIN^TM，它是人源化的抗-αV β3整联蛋白抗体(Applied Molecular Evolution/MedImmune)；Campath 1H/LDP-03，它是人源化的抗CD52 IgG1抗体(Leukosite)；Smart M195，它是人源化的抗-CD33 IgG 抗体(Protein Design Lab/Kanebo)；RITUXAN^TM，它是嵌合的抗-CD20 IgG1抗体(IDEC Pharm/Genentech，Roche/Zettyaku)；LYMPHOCIDE^TM，它是人源化的抗-CD22 IgG抗体(Immunomedics)；Smart ID 10，它是人源化的抗-HLA抗体(ProteinDesign Lab)；ONCOLYM^TM(Lym-1)是放射性标记的鼠抗-HLADIAGNOSTIC REAGENT抗体(Techniclone)；ABX-IL8是人抗-IL8抗体(Abgenix)；抗-CD11a是人源化的IgG1抗体(Genentech/Xoma)；ICM3是人源化的抗-ICAM3抗体(ICOS Pharm)；IDEC-114是灵长类化的抗-CD80抗体(IDEC Pharm/Mitsubishi)；ZEVALIN^TM是放射性标记的鼠抗-CD20抗体(IDEC/Schering AG)；IDEC-131是人源化的抗-CD40L抗体(IDEC/Eisai)；IDEC-151是灵长类化的抗-CD4抗体(IDEC)；IDEC-152是灵长类化的抗-CD23抗体(IDEC/Seikagaku)；SMART抗-CD3是人源化的抗-CD3 IgG(Protein Design Lab)；5Gl.1是人源化的抗-补体因子5(C5)抗体(Alexion Pharm)；D2E7是人源化的抗-TNF-α抗体(CAT/BASF)；CDP870是人源化的抗-TNF-α Fab片段(Celltech)；IDEC-151是灵长类化的抗-CD4 IgG1抗体(IDECPharm/SmithKline Beecham)；MDX-CD4是人抗-CD4 IgG抗体(Medarex/Eisai/Genmab)；CDP571是人源化的抗-TNF-αIgG4抗体(Celltech)；LDP-02是人源化的抗-α4β7抗体(LeukoSite/Genentech)；OrthoClone OKT4A是人源化的抗-CD4 IgG抗体(Ortho Biotech)；ANTOVA^TM是人源化的抗-CD40L IgG抗体(Biogen)；ANTEGREN^TM是人源化的抗-VLA-4 IgG抗体(Elan)；MDX-33是人抗-CD64(FcγR)抗体(Medarex/Centeon)；SCH55700是人源化的抗-IL-5 IgG4抗体(Celltech/Schering)；SB-240563和SB-240683分别是人源化的抗-IL-5和IL-4抗体(SmithKline Beecham)；rhuMab-E25是人源化的抗-IgEIgG1抗体(Genentech/Norvartis/Tanox Biosystems)；ABX-CBL是鼠抗CD-147 IgM抗体(Abgenix)；BTI-322是大鼠抗-CD2 IgG抗体(MedImmune/Bio Transplant)；Orthoclone/OKT3是鼠抗-CD3 IgG2a抗体(ortho Biotech)；SIMULECT^TM是嵌合的抗-CD25 IgG1抗体(Novartis Pharm)；LDP-01是人源化的抗-β2-整联蛋白IgG抗体(LeukoSite)；抗-LFA-1是鼠抗CD 18 F(ab′)2(Pasteur-Merieux/Immunotech)；CAT-152是人抗-TGF-β2抗体(Cambridge AbTech)；Corsevin M是嵌合的抗-因子VII抗体(Centocor)。根据本领域的技术人员已知的任何方案，包括免疫反应性试剂的供应商推荐的方案，可以施用上述的免疫反应性试剂以及任何其它的免疫反应性试剂。在一个优选的实施方案中，本发明的分子复合物与抗-CTLA4抗体或抗-41BB抗体组合施用。

在另一个实施方案中，本发明的复合物与一种或多种抗血管发生剂组合施用，后者包括但不限于angiostatin，沙立度胺，三环域(kringle)5，血管内皮抑素(endostatin)，Serpin(丝氨酸蛋白酶抑制剂)抗-凝血酶，纤连蛋白的29kDa N-末端和40kDa C-末端蛋白水解片段，促乳素的16kDa蛋白水解片段，血小板因子-4的7.8kDa蛋白水解片段，与血小板因子-4的片段对应的13个氨基酸的肽(Maione等，1990，Cancer Res.51：2077-2083)，与胶原I的片段对应的14个氨基酸的肽(Tolma等，1993，J.Cell Biol.122：497-511)，与血小板反应蛋白I的片段对应的19个氨基酸的肽(Tolsma等，1993，J.Cell Biol.122：497-511)，与SPARC的片段对应的20个氨基酸的肽(Sage等，1995，J.Cell.Biochem.57：1329-1334)，或其任意片段、家族成员或变体，包括其药学上可接受的盐。

还已经描述了能抑制血管发生、且与层粘连蛋白、纤连蛋白、前胶原和EGF的片段相对应的其它肽(见，例如，Cao，1998，Prog MolSubcell Biol.20：161-176)。已经证实，能阻断某些结合RGD蛋白(即具有肽基序Arg-Gly-Asp)的整联蛋白的单克隆抗体和环五肽具有抗血管形成的活性(Brooks等，1994，Science 264：569-571；Hammes等，1996，Nature Medicine 2：529-533)。而且，通过受体拮抗剂抑制尿激酶纤溶酶原激活物受体可以抑制血管发生、肿瘤生长和转移(Min等，1996，Cancer Res.56：2428-33；Crowley等，1993，Proc Natl Acad Sci.90：5021-25)。本发明还预期将这样的抗血管发生剂与复合物组合使用。

在另一个实施方案中，本发明的复合物与激素治疗结合使用。激素治疗性治疗剂包含激素激动剂、激素拮抗剂(例如，氟他胺、比卡鲁胺、他莫昔芬、雷洛昔芬、醋酸亮丙瑞林(LUPRON)、LH-RH拮抗剂)、激素生物合成和加工的抑制剂和类固醇(例如，地塞米松、类视黄醇、deltoids、倍他米松、皮质醇、可的松、泼尼松、去氢睾酮、糖皮质激素、盐皮质激素、雌激素、睾酮、孕酮)、维生素A衍生物(例如，全反视黄酸(ATRA))；维生素D3类似物；抗孕激素(例如，米非司酮、奥那司酮)和抗雄激素物质(例如，环丙孕酮)。

在另一个实施方案中，本发明的复合物在癌症的治疗中与基因治疗方案结合使用。在一个实施方案中，将使用能分泌白细胞介素-2的重组细胞的基因治疗与本发明的复合物组合使用，以预防或治疗癌症，特别是乳腺癌(见，例如，Deshmukh等，2001，J Neurosurg.94：287-92)。在其它实施方案中，使用多核苷酸化合物进行基因治疗，例如但不限于反义多核苷酸、核酶、RNA干扰分子、三螺旋多核苷酸等，其中这样的化合物的核苷酸序列与肿瘤或癌症的起始、发展和/或病理学的相关基因的DNA和/或RNA的核苷酸序列有关。例如，许多是癌基因、生长因子基因、生长因子受体基因、细胞周期基因、DNA修复基因，且是本领域熟知的。

在另一个实施方案中，本发明的复合物与辐射治疗方案结合施用。关于辐射治疗，辐射可以是γ射线或X-射线。该方法包括包含辐射治疗的癌症治疗，例如外射束辐射治疗、放射同位素(I-125，钯，铱)的间质植入，例如锶-89，胸辐射治疗，腹膜内的P-32辐射治疗，和/或全腹部的和骨盆的辐射治疗。关于辐射治疗的一般综述，见Hellman，第16章：Principles of Cancer Management：Radiation Therapy，第6版，2001，DeVita等，编，J.B.Lippencott Company，Philadelphia。在优选的实施方案中，辐射治疗是作为外射束辐射或远距离治疗来施用的，其中辐射是从远处源发出。在各种优选的实施方案中，辐射治疗是作为内部治疗或近距离放射疗法施用的，其中放射活性源置于体内临近癌细胞或肿瘤块处。还包括组合使用本发明的复合物和包含施用感光剂的光动力学疗法，所述感光剂例如血卟啉及其衍生物，Vertoporfin(BPD-MA)，酞菁，感光剂Pc4，脱甲氧-竹红菌甲素A和2BA-2-DMHA。

在各种实施方案中，给癌症患者组合施用本发明的复合物和至少一种化疗剂较短的治疗周期，以治疗癌症。使用化疗剂进行治疗的持续时间可以根据使用的具体癌症治疗剂而变化。本发明还预期不连续的施用或以分成数次部分施用的每日剂量施用。普通技术人员能够明白具体的癌症治疗剂的适当治疗时间，且本发明预期连续评价每种癌症治疗剂的最佳治疗方案。本发明预期至少一个周期，优选超过一个周期，在该过程中施用单一治疗剂或系列治疗剂。普通技术人员能够明白一个周期的适当时段，例如周期的总个数和周期之间的间隔。

在另一个实施方案中，将本发明的复合物与能改善癌症症状(例如但不限于疼痛)和本发明的复合物产生的副作用(例如但不限于流感样症状、发烧等)的化合物组合使用。因此，可以与本发明的复合物组合或混合使用已知能减少疼痛、流感样症状和发烧的许多化合物。这样的化合物包括镇痛药(例如，醋氨酚)，减充血剂(例如，伪麻黄碱)，抗组胺(例如，扑尔敏)和镇咳剂(例如，美沙芬)。

5.8.2  靶传染病

本发明的方法可以治疗或预防的传染病是传染因子造成的，包括但不限于病毒、细菌、真菌、原生动物、蠕虫和寄生物。本发明不限于治疗或预防胞内病原体造成的传染病。文献中已经广泛地描述了许多医学上有关的微生物，例如，见C.G.A Thomas，MedicalMicrobiology，Bailliere Tindall，Great Britain 1983，其完整内容在这里引作参考。

联合疗法除了包括施用本发明的复合物以外，还包括使用一种或多种能辅助预防或治疗传染病的用药程式，该用药程式包括但不限于抗生素、抗病毒剂、抗原生动物的化合物、抗真菌的化合物和驱虫剂。可以用于治疗或预防传染病的其它治疗用药程式包括如上所述的免疫治疗剂、多核苷酸、抗体、细胞因子和激素。

人和非-人脊椎动物的传染性病毒包括逆转录病毒、RNA病毒和DNA病毒。已经在人类中发现的病毒的实例包括但不限于：反录病毒科(Retroviridae)(例如人免疫缺陷病毒、例如HIV-1(也称作HTLV-III，LAV或HTLV-III/LAV，或HIV-III；和其它分离物，例如HIV-LP；小RNA病毒科(Picornaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、艾可病毒)；嵌杯状病毒科(Calciviridae)(例如能造成胃肠炎的毒株)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviridae)(例如登革病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(Coronaviridae)(例如冠状病毒)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如水泡性口炎病毒、狂犬病病毒)；纤状病毒科(Filoviridae)(例如欧鲍拉病毒)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如汉坦病毒、bunga virus、白蛉病毒和内罗病毒)；砂粒病毒科(Arena viridae)(出血热病毒)；呼肠病毒科(Reoviridae)(例如呼肠弧病毒、环状病毒和轮状病毒)；双RNA病毒科(Birnaviridae)；嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(Parvovirida)(细小病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(Herpesviridae)(单纯疱疹病毒(HSV)1和2，水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)，疱疹病毒；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(Irodoviridae)(例如非洲猪瘟病毒)；和未分类的病毒(例如海绵状脑病的病原体，丁型肝炎因子(认为是乙肝病毒的缺陷型伴随体)，非甲型肝炎和非乙型肝炎的因子(1类＝内部传递；2类＝肠胃外传递(即丙型肝炎)；诺沃克和相关病毒和星状病毒)。

预期的逆转录病毒包括简单的逆转录病毒和复合的逆转录病毒。简单的逆转录病毒包括B-型逆转录病毒、C-型逆转录病毒和D-型逆转录病毒亚群。B-型逆转录病毒的实例是小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)。C-型逆转录病毒包括C-型A组(包括劳斯肉瘤病毒(RSV)，禽类白血病病毒(ALV)和禽类成髓细胞瘤病毒(AMV))和C-型B组(包括鼠白血病病毒(MLV)，猫白血病病毒(FeLV)，鼠肉瘤病毒(MSV)，长臂猿白血病病毒(GALV)，脾脏坏死病毒(SNV)，网状内皮组织增殖病毒(RV)和猿猴肉瘤病毒(SSV))亚群。D-型逆转录病毒包括Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)和猿猴逆转录病毒1型(SRV-1)。复合的逆转录病毒包括慢病毒、T-细胞白血病病毒和泡沫病毒亚群。慢病毒包括HIV-1，但是也包括HIV-2，SIV，绵羊髓鞘脱落病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)和马传染性贫血病毒(EIAV)。T-细胞白血病病毒包括HTLV-1，HTLV-II，猿猴T-细胞白血病病毒(STLV)和牛白血病病毒(BLV)。泡沫病毒包括人泡沫病毒(HFV)，猿猴泡沫病毒(SFV)和牛泡沫病毒(BFV)。

是脊椎动物抗原的RNA病毒的实例包括但不限于：呼肠病毒科的成员，包括正呼肠病毒属(Orthoreovirus)(哺乳动物和禽逆转录病毒的多种血清型)，环状病毒属(Orbivirus)(蓝舌病病毒、Eugenangee病毒、Kemerovo病毒、非洲马瘟病毒和科罗拉蜱传热病毒)，轮状病毒属(Rotavirus)(人轮状病毒、内布拉斯加小牛腹泻病毒(Nebraska calf diarrhea virus)、鼠轮状病毒、猿猴轮状病毒、牛或绵羊轮状病毒、禽轮状病毒)；小RNA病毒科，包括肠道病毒属(Enterovirus)(脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒A和B，人类肠道致细胞病变的孤儿病毒、甲型肝炎病毒、猿猴肠道病毒、鼠脑脊髓炎(ME)病毒、Poliovirus muris，牛肠道病毒、猪肠道病毒、心病毒属(Cardiovirus)(脑心肌炎病毒(EMC)，门戈病毒(Mengovirus))，鼻病毒属(Rhinovirus)(包括至少113个亚型的人鼻病毒；其它鼻病毒)，Apthovirus属(口蹄疫(FMDV)；嵌杯状病毒科，包括猪水疱疹病毒、圣米格尔海狮病毒、猫小RNA病毒和诺沃克病毒；披膜病毒科，包括α病毒属(Alphavirus)(东部马脑炎病毒、塞姆利基森林病毒、新培斯病毒、基孔贡亚病毒、奥尼永尼永病毒、罗斯河病毒(Ross rivervirus)、委内瑞拉马脑炎病毒、西部马脑炎病毒)，黄病毒属(Flavirus)(蚊传播的黄热病毒、登革病毒、日本脑炎病毒、圣路易脑炎病毒、墨累山谷脑炎病毒、西尼罗病毒、昆津病毒(Kunjin virus)、中欧蜱传播的病毒、远东蜱传播的病毒、贾萨努尔森林病毒、跳跃病病毒(Louping III virus)、玻瓦散病毒、鄂木斯克出血热病毒)，风疹病毒属(风疹病毒)，瘟病毒属(Pestivirus)(粘膜病病毒、猪瘟病毒、边界病病毒)；布尼病毒科，包括布尼病毒属(Bunyavirus)(布尼亚病毒和相关病毒、加州脑炎组病毒)，白蛉病毒属(Phlebovirus)(白蛉热西西里病毒(Sandfly fever Sicilian virus)、雷付脱谷热病毒)，内罗病毒属(Nairovirus)(克里米亚-刚果出血热病毒、内罗皮绵羊病病毒)和乌库病毒属(Uukuvirus)(吴孔尼米蜱传病毒和有关病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒属(Influenza virus)(A型流感病毒，许多人亚型)；猪流感病毒和禽和马流感病毒；B型流感(许多人亚型)和C型流感(可能的独立的属)；副粘病毒科，包括副粘病毒属(Paramyxovirus)(副流感病毒1型，仙台病毒、致血细胞吸附病毒、副流感病毒2至5型，新城疫病毒、腮腺炎病毒)，麻疹病毒属(Morbillivirus)(麻疹病毒、亚急性硬化性全脑炎病毒(subacutesclerosing panencephalitis virus)、犬瘟病毒、牛瘟病毒)，肺病毒属(Pneumovirus)(呼吸道合胞病毒(RSV)，牛呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒)；森林病毒、新培斯病毒、基孔贡亚病毒、奥尼永尼永病毒、罗斯河病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西部马脑炎病毒)，黄病毒属(蚊传播的黄热病毒、登革病毒、日本脑炎病毒、圣路易脑炎病毒、墨累山谷脑炎病毒、西尼罗病毒、昆津病毒、中欧蜱传播的病毒、远东蜱传播的病毒、贾萨努尔森林病毒、跳跃病病毒、玻瓦散病毒、鄂木斯克出血热病毒)，风疹病毒属(风疹病毒)，瘟病毒属(粘膜病病毒、猪瘟病毒、边界病病毒)；布尼病毒科，包括布尼病毒属(布尼亚病毒和相关病毒、加州脑炎组病毒)，白蛉病毒属(白蛉热西西里病毒、雷付脱谷热病毒)，内罗病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒、内罗皮绵羊病病毒)和乌库病毒属(吴孔尼米蜱传病毒和有关病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒属(A型流感病毒，许多人亚型)；猪流感病毒和禽和马流感病毒；B型流感(许多人亚型)和C型流感(可能的独立的属)；副粘病毒科，包括副粘病毒属(副流感病毒1型，仙台病毒、致血细胞吸附病毒、副流感病毒2至5型，新城疫病毒、腮腺炎病毒)，麻疹病毒属(麻疹病毒、亚急性硬化性全脑炎病毒、犬瘟病毒、牛瘟病毒)，肺病毒属(呼吸道合胞病毒(RSV)，牛呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒)；弹状病毒科，包括水泡病毒属(Vesiculovirus)(VSV)，ChanBipura病毒、Flanders-Hart公园病毒)，狂犬病病毒属(Lyssavirus)(狂犬病病毒)，鱼弹状病毒，和两种可能的弹状病毒(马堡病毒和欧鲍拉病毒)；沙粒病毒科，包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCM)，塔卡里伯病毒群(Tacaribe virus complex)和拉萨病毒；冠状病毒科，包括传染性支气管炎病毒(IBV)，小鼠肝炎病毒，人肠冠状病毒和猫传染性腹膜炎(猫冠状病毒)。

是脊椎动物的抗原的DNA病毒的实例包括但不限于：痘病毒科，包括正痘病毒属(Orthopoxvirus)(大天花、类天花、猴痘痘苗，牛痘，水牛痘，兔痘，脱脚病)，野兔痘病毒属(Leporipoxvirus)(粘液瘤，纤维瘤)，禽痘病毒属(Avipoxvirus)(禽痘，其它的禽痘病毒)，山羊痘病毒属(Capripoxvirus)(绵羊痘，山羊痘)，猪痘病毒属(Suipoxvirus)(猪痘)，副痘病毒属(Parapoxvirus)(触染性脓疱性皮炎病毒、假牛痘，牛丘疹性口炎病毒)；虹彩病毒科(非洲猪瘟病毒、蛙病毒2和3型，鱼淋巴囊肿病病毒)；疱疹病毒科，包括α-疱疹病毒(单纯疱疹1和2型，水痘带状疱疹，马流产病毒、马疱疹病毒2和3型，假狂犬病病毒、传染性牛角膜结膜炎病毒、传染性牛鼻气管炎病毒、猫鼻气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒)，β-疱疹病毒(人巨细胞病毒和猪、猴和啮齿类的巨细胞病毒)；γ-疱疹病毒(EB病毒(EBV)，马立克氏病病毒、松鼠猴疱疹，蛛猴疱疹病毒，sylvilagus疱疹病毒，豚鼠疱疹病毒、Lucke肿瘤病毒)；腺病毒科，包括哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)(人亚群A，B，C，D，E和未分组的；猿猴腺病毒(至少23个血清型)，犬传染性肝炎和牛、猪、绵羊、蛙和许多其它物种的腺病毒、禽腺病毒属(Aviadenovirus)(禽腺病毒)；和不可培养的腺病毒；乳多空病毒科，包括乳头瘤病毒属(Papillomavirus)(人乳头瘤病毒、牛乳头瘤病毒、兔乳头瘤病毒，和各种其它物种的致病性乳头瘤病毒)，多瘤病毒属(Polyomavirus)(多瘤病毒、猿空泡因子(SV-40)，兔空泡因子(RKV)，K病毒、BK病毒、JC病毒，和其它灵长类多瘤病毒，例如嗜淋巴性乳头瘤病毒)；细小病毒科，包括腺伴随病毒属(Adeno-associated virus)、细小病毒属(Parvovirus))(猫泛白细胞减少症病毒、牛细小病毒、犬细小病毒、水貂阿留申病病毒，等)。最后，DNA病毒可以包括未归入上述科的病毒，例如Kuru病和Creutzfeldt-Jacob病病毒和慢性传染性神经病因子。

可以与本发明的复合物组合使用的抗病毒化合物的许多实例是本领域已知的，并且包括但不限于：利福平，核苷逆转录酶抑制剂(例如，AZT，ddI，ddC，3TC，d4T)，非-核苷逆转录酶抑制剂(例如，依非韦伦，奈韦拉平)，蛋白酶抑制剂(例如，aprenavir，吲哚那韦，利托那韦和沙喹那韦)，碘苷，西多福韦，无环鸟苷，丙氧鸟苷，扎那米韦，金刚烷胺和帕利珠单抗(Palivizumab)。抗病毒剂的其它实例包括但不限于乙酰吗喃；无环鸟苷；无环鸟苷钠；阿德福韦；阿洛夫定(Alovudine)；阿韦舒托(Alvircept Sudotox)；盐酸金刚烷胺；珠囊壳素；阿立酮(Arildone)；甲磺酸阿的维定；阿夫立定；西多福韦；西潘茶碱(Cipamfylline)；盐酸阿糖胞苷；甲磺酸地拉韦定；地昔洛韦；地达诺新；二噁沙利；依度尿苷；氨韦拉登；韦罗肟；泛昔洛韦；盐酸抑感灵；非西他滨；非阿尿苷；膦利酯；膦甲酸钠；膦乙酸钠；丙氧鸟苷；丙氧鸟苷钠；碘苷；凯托沙；拉米夫定；洛布卡韦；盐酸甲氧苯异喹；甲吲噻腙；奈韦拉平；喷昔洛维；吡罗达韦(Pirodavir)；三氮唑核苷；盐酸金刚乙胺；甲磺酸沙喹那韦；盐酸索金刚胺；索利夫定；匐枝青霉素；司他夫定；盐酸泰洛伦；三氟尿苷；盐酸伐昔洛韦；阿糖腺苷；磷酸阿糖腺苷；阿糖腺苷磷酸钠；韦罗肟；扎西胞苷；齐多夫定；净韦肟(Zinviroxime)。

本发明的方法可以治疗或预防的细菌感染或疾病是由以下细菌造成的，包括但不限于在其生活周期中具有胞内阶段的细菌，例如分枝杆菌(例如，结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis)，牛分枝杆菌(M.bovis)，鸟分枝杆菌(M.avium)，麻风分枝杆菌(M.leprae)或非洲分枝杆菌(M.africanum))、立克次氏体、支原体、衣原体和军团菌。预期的细菌感染的其它实例包括但不限于革兰氏阳性杆菌(例如，李斯忒氏菌属(Listeria)，芽孢杆菌属(Bacillus)例如炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)，丹毒丝菌属(Erysipelothrix)物种)，革兰氏阴性杆菌(例如，巴尔通氏体属(Bartonella)，布鲁氏菌属(Brucella)，弯曲杆菌属(Campylobacter)，肠杆菌属(Enterobacter)，埃希氏菌属(Eschericha)，弗朗西丝氏菌属(Francisella)，嗜血菌属(Hemophillus)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，摩根氏菌属(Morganella)，变形菌属(Proteus)，普罗威登斯菌属(Providencia)，假单胞菌属(Pseudomonas)，沙门氏菌属(Salmonella)，沙雷氏菌属(Serratia))，志贺氏菌属(Shigella)，弧菌属(Vibrio)和耶尔森氏菌属(Yersinia)物种)，螺旋体细菌(例如，疏螺旋体属(Borrelia)物种，包括会造成Lyme病的布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi))，厌氧细菌(例如，放线菌属(Actinomyces)和梭菌属(Clostridium)物种)，革兰氏阳性的和阴性的球菌，肠球菌属(Enterococcus)物种，链球菌属(Streptococcus)物种，肺炎球菌属(Pneumococcus)物种，葡萄球菌属(Staphylococcus)物种，奈瑟氏球菌属(Neisseria)物种造成的感染。传染性细菌的具体实例包括但不限于：幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)，布氏疏螺旋体，侵肺军团菌(Legionella pneumophilia)，结核分枝杆菌，鸟分枝杆菌，胞内分枝杆菌(M.intracellulare)，堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)，戈登分枝杆菌(M.gordonae)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)，单核细胞增生李斯忒氏菌(Listeriamonocytogenes)，酿脓链球菌(Streptococcus pyogene)(A组链球菌)，无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组链球菌)，绿色链球菌(Streptococcus viridans)，粪链球菌(Streptococcus faecalis)，牛链球菌(Streptococcus bovis)，肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)，流感嗜血菌(Haemophilus infiuenzae)，Bacillusantracis，corynebacterium Biphtheriae，猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)，产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringers)，破伤风梭菌(Clostridium tetani)，产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)，多杀巴斯德氏菌(Pasturella multocida)，具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)，念珠状链杆菌(Streptobacillusmoniliformis)，彻白密螺旋体(Treponema pallidium)，极细密螺旋体(Treponema pertenue)，钩端螺旋体属(Leptospira)，立克次氏体属(Rickettsia)和衣氏放线菌(Actinomyces israelli)。

可以与本发明的复合物组合使用的抗菌剂或抗生素包括但不限于：氨基糖苷抗生素类(例如，安普霉素，阿贝卡星，默诺霉素，丁胺菌素，地贝卡星，新霉素，十一烯酸新霉素，奈替米星，巴龙霉素，核糖霉素，西索米星和大观霉素)，酰胺醇(amphenicol)抗生素类(例如，叠氮氯霉素，氯霉素，氟砜尼可(florfenicol)和甲砜霉素)，安沙霉素抗生素类(例如，利福米特和利福平)，碳头孢烯类(carbacephems)(例如，氯拉卡比)，碳青霉烯类(例如，比阿培南和亚胺培南)，头孢菌素类(例如，头孢克洛，头孢羟氨苄，头孢孟多，头孢曲秦，头孢吡酮，头孢唑兰(cefozopran)，头孢咪唑，头孢匹胺和头孢匹罗)，头霉素类(例如，头孢拉宗，头孢美唑和头孢米诺)，单菌霉素类(例如，氨曲南，卡芦莫南和泰格莫南)，氧头孢烯类(oxacephems)(例如，氟氧头孢和拉氧头孢)，青霉素类(例如，美西林，匹美西林，阿莫西林，巴氨西林，苄青霉酸，苄青霉素钠，依匹西林，芬贝西林，氟氯青霉素，醋甲西林，喷沙西林，苯明青霉素O(penicillin o-benethamine)，青霉素O，青霉素V，苄星青霉素V，海巴明青霉素V，青哌四环素，和phencihicillin potassium)，林可胺类(lincosamides)(例如，克林霉素，和林可霉素)，大环内酯类(例如，阿奇霉素，卡波霉素，克拉霉素，地红霉素，红霉素和红霉素阿西曲酯)，安福霉素，杆菌肽，卷曲霉素，多粘菌素E，持久杀霉素，恩威霉素，四环素类(例如，阿匹四环素，金霉素，氯莫环素和地美环素)，2，4-二氨基嘧啶(例如，溴莫普林)，硝基呋喃类(例如，呋喃它酮和氯化呋噻咪唑)，喹诺酮类和其类似物(例如，西诺沙星，环丙沙星，克林沙星，氟甲喹和grepagloxacin)，磺胺类(例如，乙酰基磺胺甲氧吡嗪，苄磺胺，苯丙磺胺二磺酸钠，酞磺醋胺，偶氮磺胺和磺胺西汀)，砜类(例如，百里砜，葡萄糖氨苯砜钠和苯丙砜)，环丝氨酸，莫匹罗星和抗结核菌素。

抗菌剂的其它实例包括但不限于醋氨苯砜；磺胺苯砜钠；Alamecin；己联双辛胍；美西林；匹美西林；阿米环素；氨氟沙星；甲磺酸氨氟沙星；阿米卡星；硫酸阿米卡星；对氨水杨酸；对氨基水杨酸钠；阿莫西林；安福霉素；氨苄青霉素；氨苄青霉素钠；阿帕西林钠；安普霉素；门冬托星(Aspartocin)；硫酸阿司米星；卑霉素；阿佛帕星；阿奇霉素；阿洛西林；阿洛西林钠；盐酸巴氨西林；杆菌肽；杆菌肽亚甲基双水杨酸酯；杆菌肽锌；默诺霉素；苯酰胺水杨酸钙；红霉素B；硫酸倍他霉素；比阿培南；皮尼拉霉素；盐酸苯柳胺酯；Bispyrithione Magsulfex；氨羟丁卡钠霉素；硫酸丁胺菌素；硫酸卷曲霉素；卡巴多司；羧苄基青霉素双钠盐；茚满酯羧苄青霉素钠；羧苄苯青霉素钠；羧苄青霉素钾；卡芦莫南钠；头孢克洛；头孢羟氨苄；头孢孟多；头孢孟多酯钠；头孢孟多钠；头孢哌罗；头孢曲秦；头孢氟唑钠；头孢唑啉；头孢唑啉钠；头孢拉宗；头孢地尼；头孢吡肟；盐酸头孢吡肟；头孢替考；头孢克肟；盐酸头孢甲肟；头孢美唑；头孢美唑钠；头孢尼西单钠；头孢尼西钠；头孢哌酮钠；头孢雷特；头孢氨噻肟钠；头孢替坦；头孢替坦二钠；盐酸头孢替安；头孢西丁；头孢西丁钠；头孢咪唑；头孢咪唑钠；头孢匹胺；头孢匹胺钠；硫酸头孢匹罗；头孢泊肟酯；头孢丙烯；头孢沙定；头孢磺啶钠；头孢他啶；头孢布坦；头孢唑肟钠；头孢曲松钠；头孢氨呋肟；头孢呋辛酯；头孢呋辛Pivoxetil；头孢呋辛钠；头孢乙氰钠；头孢氨苄；盐酸头孢氨苄；头孢格来星；头孢噻啶；头孢噻吩钠；头孢吡硫钠；环己烯胺头孢菌素；盐酸四环林；乙酰氯霉素；氯霉素；棕榈酸氯霉素；泛酸氯霉素复合物；琥珀酸钠氯霉素；氯己定Phosphanilate；氯二甲酚；金霉素硫酸氢盐；盐酸金霉素；西诺沙星；环丙沙星；盐酸环丙沙星；西罗里霉素；克拉霉素；盐酸克林沙星；克林霉素；盐酸克林霉素；盐酸氯林可霉素棕榈酸酯；磷酸克林霉素；氯法齐明；苄星邻氯青霉素；氯唑西林钠；氯羟喹；多粘菌素E甲磺酸钠；硫酸多粘菌素E；库马霉素；库马霉素钠；氨环己青霉素；环丝氨酸；达福普汀；氨苯砜；达帕托霉素；地美环素；盐酸地美环素；去甲环素；地奴真菌素；双氨藜芦啶；双氯西林；双氯西林钠；硫酸双氢链霉素；Bipyrithione；地红霉素；多西环素；多西环素钙；多西环素Fosfatex；盐酸多西环素；氧呋喹酸钠；依诺沙星；依匹西林；盐酸差向四环素；红霉素；红霉素阿西曲酯；依托红霉素；琥乙红霉素；葡庚糖酸红霉素；乳糖酸红霉素；红霉素丙酸酯；红霉素硬脂酸酯；盐酸乙胺丁醇；乙硫异烟胺；氟罗沙星；氟氯青霉素；氟氘丙氨酸；氟甲喹；磷霉素；磷霉素氨基丁三醇；呋莫克西林；氯化呋噻咪唑；酒石酸呋噻咪唑；夫西地酸钠；夫西地酸；硫酸庆大霉素；格洛莫南(gloximonam)；短杆菌肽；卤普罗近；海他西林；海他西林钾；海克西定；依巴氟沙星；亚胺培南；异康唑；异帕米星；异烟肼；交沙霉素；卡那霉素硫酸盐；吉他霉素；左旋呋喃它酮；苯氧丙基青霉素钾；来西索霉素；林可霉素；盐酸林可霉素；洛美沙星；盐酸洛美沙星；甲磺酸洛美沙星；氯拉卡比；磺胺米隆；甲基氯环素；磺基水杨酸甲基氯环素；巨霉素磷酸钾；美喹多司；美罗培南；美他环素；盐酸美他环素；乌洛托品；马尿酸乌洛托品；孟德立酸乌洛托品；甲氧苯青霉素钠；美替普林；盐酸甲硝唑；磷酸甲硝唑；美洛西林；美洛西林钠；米诺环素；盐酸米诺环素；盐酸米林可霉素；莫能星；莫能星钠；萘夫西林钠；萘啶酸钠；萘啶酸；那他霉素；妥布霉素；棕榈酸新霉素；硫酸新霉素；十一烯酸新霉素；硫酸奈替米星；中性霉素；硝呋拉定；硝呋氨氧腙；硝呋拉太；硝呋氮酮；硝呋羟乙咪酮；硝呋甲咪酮；硝呋吡醇；硝呋喹胺醇；硝呋噻唑；硝基四环素；呋喃妥因；硝米特；诺氟沙星；新生霉素钠；氧氟沙星；奥美普林；苯唑西林钠；肟莫南(oximonam)；肟莫南钠；奥索利酸；土霉素；土霉素钙；盐酸土霉素；泡迪霉素；对氯酚；帕罗霉素；培氟沙星；甲磺酸培氟沙星；醋甲西林；苄星青霉素G；青霉素G钾；普鲁卡因青霉素G；青霉素G钠；青霉素V；苄星青霉素V；海巴明青霉素V；青霉素V钾；戊胺唑酮钠；苯基氨基水杨酸盐；哌拉西林钠；吡苄西林钠；磺苯吡酮青霉素钠；盐酸皮里霉素；盐酸匹氨青霉素；双羟萘酸匹氨青霉素；丙苯酸匹氨青霉素；硫酸多粘菌素B；泊非罗霉素；普匹卡星(propikacin)；吡嗪酰胺；吡硫锌；醋酸喹地卡明；奎奴普丁；消旋甲砜霉素；雷冒拉宁；雷尼霉素；雷洛霉素；瑞波罗霉素；利福布丁；利福美坦(rifametane)；利福克昔(rifamexil)；利福米特；利福平；利福喷丁；利福昔明；氢吡四环素；硝酸氢吡四环素；蔷薇霉素；丁酸蔷薇霉素；丙酸蔷薇霉素；蔷薇霉素磷酸钠；硬脂酸蔷薇霉素；罗索沙星；罗沙胂；罗红霉素；去甲去氧四环素；山费培南(sanfetrinem)钠；酚醚青霉素；沙匹西林；Scopafingin；西索米星；硫酸西索米星；司帕沙星；盐酸大观霉素；螺旋霉素；盐酸司他霉素；斯堡霉素；硫酸链霉素；链霉素异烟肼；磺胺苯；磺胺苯酰；磺胺醋酰；磺胺醋酰钠；磺胺西汀；磺胺哒嗪；磺胺哒嗪钠；磺胺多辛；磺胺林；磺胺甲基嘧啶；磺胺对甲氧嘧啶；磺胺二甲嘧啶；磺胺甲二唑；磺胺甲噁唑；磺胺间甲氧嘧啶；磺胺二甲噁唑；对氨基苯磺酸锌；磺胺硝苯；柳氮磺吡啶；磺胺异噻唑；磺胺噻唑；磺胺吡唑；磺胺异噁唑；磺胺乙酰异噁唑；磺胺异噁唑二醇胺；磺粘霉素；硫培南(sulopenem)；舒他西林；森西林钠；氨苄青霉素酞酯盐酸盐；替考拉宁；盐酸替马氟沙星；替莫西林；四环素；盐酸四环素；四环素磷酸复盐；四氧普林；甲砜霉素；Thiphencillin钾；羧噻吩青霉素甲苯酯钠；替卡西林二钠；替卡西林单钠；替克拉酮；氯化乔多；妥布霉素；硫酸妥布霉素；托氟沙星；甲氧苄啶；硫酸甲氧苄啶；三磺嘧啶；醋竹桃霉素；硫酸托哌霉素；短杆菌素；万古霉素；盐酸万古霉素；维吉霉素；佐尔博霉素。

本发明的方法可以治疗或预防的真菌病包括但不限于曲霉病，隐球菌病(crytococcosis)，孢子丝菌病，球孢子菌病，副球孢子菌病，组织胞浆菌病，芽生菌病，接合菌病和念珠菌病。

可以与本发明的复合物组合使用的抗真菌化合物包括但不限于：多烯类(例如，两性霉素b，克念菌素，美帕曲星，那他霉素和制霉菌素)，烯丙胺(例如，布替萘芬和萘替芬)，咪唑(例如，联苯苄唑，布康唑，氯登妥因，氟曲马唑，异康唑，酮康唑和兰诺康唑)，硫代氨基甲酸酯(例如，托西拉酯，托林达酯和托萘酯)，三唑(例如，氟康唑，伊曲康唑，沙泊那唑和特康唑)，溴柳氯苯胺，丁氯柳胺，丙酸钙，氯苯甘醚，环己吡酮乙醇胺，重氮丝氨酸，灰黄霉素，寡霉素，十一烯酸新霉素，吡咯尼林，西卡宁，杀结核菌素和绿胶霉素。抗真菌化合物的其它实例包括但不限于吖啶琐辛(Aerisorcin)；安布替星；两性霉素B；阿查那唑；重氮丝氨酸；巴西芬净(Basifungin)；联苯苄唑；盐酸苯柳胺酯；Bispyrithione Magsulfex；硝酸布康唑；十一烯酸钙；克念菌素；卡宝品红；氯登妥因；环己吡酮乙醇胺；环吡酮胺；西洛芬净(Cilofungin)；顺科拉唑；克霉唑(Clotrimazole)；铜迈克星；地奴真菌素；Bipyrithione；杜康唑；益康唑；硝酸益康唑；恩康唑；硝酸萘唑酸酯；硝酸芬康唑；菲律平；氟康唑；氟胞嘧啶；真菌霉素；灰黄霉素；哈霉素；异康唑；伊曲康唑；卡内霉素；酮康唑；洛蒙霉素；利地霉素；美帕曲星；咪康唑；硝酸咪康唑；莫能星；莫能星钠；盐酸萘替芬；十一烯酸新霉素；硝呋拉太；硝呋美隆；硝拉明；制霉菌素；辛酸；硝酸奥可拉唑；硝酸奥昔康唑；盐酸澳克付精；盐酸帕康唑；拟念珠菌素；碘化钾；丙氯醇；吡硫锌；吡咯尼林；芦他霉素；血根氯铵(Sanguinarium Chloride)；沙泊那唑；吸水真菌素；二硫化硒；西奈芬近；硝酸硫康唑；特比萘芬；特康唑；双硫胺甲酰；替克拉酮；噻康唑；托西拉酯；托林达酯；托萘酯；三醋酸甘油酯；Triafuigin；十一烯酸；Viridoflilvin；十一烯酸锌和盐酸泽罗拉唑。

本发明的方法可以治疗或预防的寄生物病包括但不限于阿米巴病，疟疾，利什曼病，球虫，贾第虫病，隐孢子虫病，弓形体病和锥虫病。还包括各种蠕虫的感染，例如但不限于蛔虫病，钩虫病，鞭虫病，类圆线虫病，弓蛔虫病，旋毛虫病，盘尾丝虫病，丝虫病和恶丝虫病。还包括各种吸虫的感染，例如但不限于血吸虫病，肺吸虫病和支睾吸虫病。根据它们是胞内的还是胞外的，可以对能造成这些病的寄生物进行分类。如本文所使用的，“胞内寄生物”是指其整个生活周期都是胞内的寄生物。人胞内寄生物的实例包括利什曼原虫属物种、疟原虫属(Plasmodium)物种、克鲁氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、冈氏弓形虫(Toxoplasma gondii)、巴贝西虫属(Babesia)物种和旋毛线虫(Trichinella spiralis)。如本文所使用的，“胞外寄生物”是指其整个生活周期都是胞外的寄生物。能感染人类的胞外寄生物包括痢疾内变形虫(Entamoeba histolytica)，表吮贾第虫(Giardia lamblia)，比氏肠胞虫(Enterocytozoon bieneusi)，纳氏虫属(Naegleria)和棘变形虫属(Acanthamoeba)以及大多数蠕虫。另一类寄生物定义为主要是胞外的，但是在它们的生活周期的关键阶段是专性胞内存在的。这样的寄生物在本文中称作“专性胞内寄生物”。这些寄生物可能在它们生命的大部分或仅仅在它们生命的小部分中存在于胞外环境，但是它们在它们的生活周期中都具有至少一个专性胞内阶段。该后一类寄生物包括罗得西亚锥虫(Trypanosoma rhodesiense)和冈比亚锥虫(Trypanosoma gambiense)，等孢球虫属(Isospora)物种，隐孢子虫属(Cryptosporidium)物种，艾美球虫属(Eimeria)物种，新孢子虫属(Neospora)物种，肉孢子虫属(Sarcocystis)物种和血吸虫属(Schistosoma)物种。

可以与本发明的复合物组合使用治疗寄生物病的抗原生动物的化合物的许多实例是本领域已知的，包括但不限于：奎宁，氯喹，甲氟喹，氯胍，乙胺嘧啶，班硝唑，糠酸二氯尼特，替硝唑，两性霉素，葡酸锑钠，曲莫沙唑和依西酸喷他脒。可以与本发明的复合物组合使用治疗寄生物病的抗寄生物药是本领域已知的，包括但不限于：甲苯咪唑，左旋咪唑，氯硝柳胺，吡喹酮，丙硫咪唑，伊维菌素，枸橼酸乙胺嗪和噻苯达唑。抗寄生物化合物的其它实例包括但不限于醋氨苯砜；盐酸阿莫地喹；胺喹甲酯；阿替夫林(Arteflene)；氯喹；盐酸氯喹；磷酸氯喹；双羟萘酸环氯胍；磷酸恩哌罗林(Enpiroline Phosphate)；盐酸卤泛群；硫酸羟氯喹；盐酸甲氟喹；环己辛萘酮；盐酸米林可霉素；磷酸伯氨喹；乙胺嘧啶；硫酸奎宁和替布喹(Tebuquine)。

在较低优选的实施方案中，本发明的复合物可以与基于非-HSP和非-α2M的疫苗组合物组合使用。这样的人用疫苗的实例记载在TheJordan Report 2000，Accelerated Development of Vaccines，NationalInstitute of Health，其在这里整体引作参考。许多用于治疗非-人脊椎动物的疫苗记载在Bennett，K.Compendium of Veterinary Products，第3版.North American Compendiums，Inc.，1995，其在这里整体引作参考。

5.8.3 靶向其它疾病

除了癌症和传染病以外，本发明的方法也可以治疗或预防其它疾病，包括但不限于贫血、生长激素缺乏、酶缺乏病和免疫抑制状况。

贫血可能由多种原因造成，例如，它可能由铁缺乏、叶酸缺乏、慢性病(例如，慢性感染或炎症、癌症、肝病、慢性肾衰竭)、化疗等造成。

生长激素由人的垂体前叶腺分泌。成年期的生长激素缺乏会造成轻微的至中度的肥胖、无力和降低的心输出量。可以通过重组的DNA技术合成人生长激素。用人生长激素可以治疗患有垂体功能减退和严重生长激素缺乏的患者。

有许多不同种类的酶缺乏病。非限制性实例是Debrancher酶缺乏(也称作Cori氏病或Forbes氏病)、糖原贮积病(例如，糖原脱支酶缺乏)，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏、半乳糖神经酰胺酶缺乏(Krabbe病)等。

不受任何理论的限制，本发明的分子复合物或包含本发明的分子复合物的药物组合物在治疗或预防疾病例如贫血、生长激素缺乏和酶缺乏病方面的治疗或预防作用的一种可能的解释是，与未低聚化的糖蛋白相比，对这样的疾病具有治疗或预防作用的免疫学和/或生物学活性的糖蛋白的低聚可以提高糖蛋白的治疗或预防作用。例如，低聚化的糖蛋白可以更容易地定位到所需的位点或所需的细胞类型，例如，通过使复合物中的凝集素结合到细胞表面糖蛋白受体上。因此，凝集素优选地在复合物中摩尔过量。或者，通过受体介导的事件或非-受体介导的事件，低聚化的糖蛋白可以被其靶细胞更容易地摄入。

可以根据本发明使用本领域已知的用于治疗或预防疾病(例如但不限于贫血、激素缺乏或酶缺乏)的激素和酶。天然产生的糖蛋白的激素和酶(例如，红细胞生成素)可以在有凝集素存在的情况下形成低聚物，并根据本发明使用。可以将非天然产生的糖蛋白的激素和酶工程改造成添加一种或多种碳水化合物基团，并根据本发明使用。在一个实施方案中，本发明提供了治疗贫血的方法，包括给需要的受试者施用包含一种或多种分子复合物的组合物，其中每种复合物包含凝集素和红细胞生成素(EPO)。优选地，受试者是人，且施用的EPO是人EPO。EPO是主要由肾小管周围毛细血管内皮细胞生产的糖蛋白激素，并负责调节红细胞的生产。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗酶缺乏病的方法，包括施用包含凝集素和葡糖脑苷脂酶的组合物。优选地，要治疗的酶缺乏病是Gaucher病。

免疫抑制状况可能由多种原因造成，包括但不限于癌症(例如，胸腺瘤，何杰金病)，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，结节病和化疗。可以根据本发明使用已知能刺激免疫系统的蛋白来治疗或预防免疫抑制状况。在一个实施方案中，本发明提供了治疗或预防免疫抑制状况的方法，包括给需要的受试者施用包含一种或多种分子复合物的组合物，其中每种复合物包含凝集素和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗或预防免疫抑制状况的方法，包括给需要的受试者施用包含一种或多种分子复合物的组合物，其中每种复合物包含凝集素和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。

5.8.4 自体的实施方案

HSP的特异性的免疫原性不是源自HSP本身，而是源自结合到它们上的抗原蛋白。在本发明的一个优选实施方案中，用作癌症疫苗的本发明的组合物中的复合物是自体的复合物，由此避开了癌症免疫疗法的2个最难以处理的障碍。第一个是人癌症(类似于实验动物的癌症)存在抗原性差异的可能性。为了避开该障碍，在本发明的一个优选实施方案中，将凝集素-HSP复合到抗原蛋白上，并用复合物治疗蛋白所来源的相同受试者的癌症。其次，癌症免疫疗法的大多数现有方案集中在确定癌细胞系的CTL-识别表位。该方法需要获得细胞系和针对癌症的CTL。这些试剂对于绝大多数人癌症是不可得到的。在本发明的一个指向使用自体抗原蛋白的实施方案中，癌症免疫疗法不再依赖于获得细胞系或CTL，也不需要定义癌细胞的抗原表位。这些优点使得结合到自体抗原蛋白上的凝集素-HSP的复合物成为有吸引力的癌症免疫原。

在一些实施方案中，可以从来自与要施用复合物的受试者异源的受试者的相同类型癌症的癌组织制备治疗性或预防性的复合物中的抗原蛋白。

5.9.药物制剂和施用方法

可以将本发明分子复合物和药物组合物以治疗有效剂量施用给患者，以治疗或改善疾病或紊乱(例如，癌症、传染病、贫血、免疫抑制状况、酶缺乏或激素缺乏)。治疗有效剂量是指足以改善这样的紊乱的症状的复合物的量。当组合使用另一种治疗用药程式时，复合物的有效剂量可以是不同的。本领域已知治疗用药程式(例如化疗剂、辐射治疗和生物/免疫治疗剂，例如细胞因子)的适当的和推荐的剂量、制剂和施用途径(例如，如Physicians′Desk Reference(第56版，2002，第57版，2003和第58版，2004)等文献所述)，或者可以根据生产商的说明书或指导使用。

5.9.1 有效剂量

通过细胞培养物或实验动物中的标准药物方法，可以确定本发明的分子复合物的毒性和治疗功效，例如，为了确定LD₅₀(对50％群体致死的剂量)和ED₅₀(在50％群体中治疗上有效的剂量)。毒性和治疗作用之间的剂量比是治疗指数，可以将其表达为比率LD₅₀/ED₅₀。优选能表现出较大治疗指数的复合物。尽管可以使用会表现出毒副作用的复合物，但应当小心地设计将这样的复合物靶向到效应组织位点处的递送系统，以使对未感染的细胞的潜在损害最小化，并由此减少副作用。

在一个实施方案中，可以在制定人用剂量范围时使用从细胞培养测定和动物实验得到的数据。复合物的剂量优选地在包含ED₅₀且具有较低或没有毒性的循环浓度范围内。依赖于采用的剂型和使用的施用途径，可以在该范围内改变剂量。对于在本发明的方法中使用的任何复合物，可以初步从细胞培养测定估计治疗有效剂量。可以在动物模型中确定剂量，以达到包含在细胞培养物中确定的IC50(即达到半数最大抑制症状的实验化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。可以使用这样的信息来更精确地确定在人类中的有用剂量。可以测量血浆水平，例如，通过高效液相层析。

在另一个实施方案中，对于人患者，包含施用给受试者的凝集素和Hsp96-抗原分子复合物的本发明的分子复合物的量是在约1ng至约600μg的范围内。优选的人剂量与在25g小鼠中使用的相同，即在约1-10ng、约20ng、约30ng、约40ng、约50ng、约70ng、约100ng、约200ng、约300ng、约400ng、约500ng、约600ng、约700ng、约800ng、约900ng、约1μg、约10μg，约25μg、约50μg、约100μg、约200μg、约300μg、约400μg、约500μg或约600μg的范围内。包含与任何其它HSP复合物结合的凝集素的本发明的分子复合物在人患者中的剂量范围为约5-5,000μg，优选的剂量为100μg。这些剂量优选皮内地、皮下地、肌内地、静脉内地或腹膜内地施用。这些剂量可以一次或重复施用，例如每日一次、每隔一天一次、每周一次、每两周一次或每月一次。优选地，每周施用一次复合物，持续约4-6周，优选地在每次施用时改变施用模式或位点。因而，通过实例且非限制性的方式，第一次注射可以在左臂皮下施用，第二次在右臂施用，第三次在左腹施用，第四次在右腹施用，第五次在左股施用，第六次在右股施用，等。在间隔一次或多次注射后，可以重复相同的位点。另外，可以进行分离注射(split injection)。因而，例如，可以将半剂施用在一个位点，另一半在同一天施用在另一个位点。或者，依次改变施用模式，例如，依次皮内地、肌内地、皮下地、静脉内地或腹膜内地每周一次进行注射。优选地，每周一次的剂量持续施用4周。4-6周后，优选地以2周的间隔进行其它注射，持续1个或几个月，或者直到用完复合物。依赖于患者的临床发展和对免疫疗法的反应性，可以修改后面的注射的速率。在一个优选的实例中，进行皮内施用，依次改变每次的施用位点。

因此，本发明提供了预防和治疗受试者的癌症或传染病的方法，包括施用能刺激宿主个体的免疫活性和引起针对肿瘤前细胞和/或赘生性细胞或感染细胞的特异性免疫的组合物。

在一个具体的实施方案中，在联合治疗过程中，以次最优量施用本发明的分子复合物(例如，包含凝集素和HSP的分子复合物)，例如，当在没有通过本领域已知的方法确定的治疗用药程式的情况下施用时，该量不会表现出可检测到的治疗益处。在这样的方法中，给接受治疗用药程式的受试者施用这样次最优量的本发明的分子复合物会总体上改善治疗的有效性。在另一个具体的实施方案中，在联合治疗过程中，以次最优量施用不包含包含本发明的分子复合物的治疗用药程式。在这样的方法中，给接受本发明的分子复合物的受试者施用这样次优量的治疗用药程式会总体上改善治疗的有效性。

在一个实施方案中，以不会导致肿瘤退化或癌症缓解的量，或者以当在没有另一种治疗用药程式的情况下施用所述的分子复合物时，癌细胞没有显著减少或已经增加的量，施用一种或多种本发明的分子复合物。在另一个实施方案中，给接受治疗用药程式的受试者施用次最优量的本发明的分子复合物，由此改善治疗的总体有效性。这些用本发明的分子复合物治疗的受试者是接受化疗或放疗的那些。通过适当的动物实验，可以确定次最优量。通过动物实验的外推法，可以确定在人类中的这样的次最优量。

在一个实施方案中，一种或多种本发明的分子复合物包含与糖蛋白和抗原分子结合的凝集素，其中糖蛋白不是热激蛋白。例如，本发明的分子复合物可以包含红细胞生成素(EPO)。当将EPO用作单一药物时，常用的起始剂量是25-30单位/kg注射物，每周2次或3次。(平均5000-6000单位/周)。有些患者可以每周一次或者甚至每两周一次进行皮下注射。静脉内的EPO需要至少每周2或3次。其它的剂量方案可以在Physician′s Desk References(第56版，2002，第57版，2003和第58版，2004)中找到。

在另一个实施方案中，本发明的分子复合物可以包含组织纤溶酶原激活物(tPA)，例如阿替普酶(Activase^，Genentech)。阿替普酶是纯化的527个氨基酸的糖蛋白。阿替普酶用于控制和治疗急性心肌梗死(AMI)、急性缺血性发作和肺栓塞。静脉内施用Activase。为了控制和治疗AMI，有两种剂量方案：加速输注和3-小时输注。在加速输注中，对于重量超过67kg的患者，施用100mg，其中静脉内快速输注15mg，随后经30分钟输注50mg，然后经60分钟输注35mg。对于体重小于或等于67kg的患者，推荐剂量的施用方法是，静脉内快速输注15mg，随后经30分钟输注0.75mg/kg且不超过50mg，然后经60分钟输注0.5mg/kg且不超过35mg。在3-小时输注中，推荐剂量是100mg，其在第1小时施用60mg，经第2小时施用20mg，经第3小时施用20mg。在Physician′s Desk Reference(第56版，2002，第57版，2003和第58版，2004)中还可以发现阿替普酶在治疗其它病时的剂量方案，其在这里引作参考。

在另一个实施方案中，本发明的分子复合物可以包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，例如Leukine^(Berlex)。可以使用Leukine^，例如，在诱导化疗后用于急性骨髓性白血病，在移植自体的外周血祖先细胞后用于动员，在自体骨髓移植后用于骨髓重建，在异源骨髓移植后用于骨髓重建，和用于骨髓移植失败或移入延迟。对于不同病的剂量方案可以改变。在一个实例中，当在外周血祖细胞移植后使用Leukine^时，推荐剂量是250mcg/m²/天，经24小时静脉内(IV)施用，或每日一次皮下(SC)施用，其在祖先细胞融合后马上开始，持续到达到连续3天的ANC＞1500细胞/mm³。在Physician′sDesk Reference(第56版，2002，第57版，2003和第58版，2004)中可以发现其它的剂量方案。

在另一个实施方案中，本发明的分子复合物可以包含粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，例如Neupogen^。可以使用Neupogen^，例如，用于接受骨髓抑制化疗的癌症患者，用于接受诱导或强力化疗的急性髓性白血病患者，用于接受骨髓移植的癌症患者，用于经历外周血祖先细胞收集和治疗的患者，和用于严重慢性嗜中性白细胞减少症的患者。剂量方案在不同的疾病中有所区别。在一个实例中，可以给接受骨髓移植的癌症患者施用10mcg/kg/天，作为静脉内输注4或24小时，或作为连续的24-小时皮下输注。在Physician′s Desk Reference(第56版，2002，第57版，2003和第58版，2004)中可以发现其它的方案。

在另一个实施方案中，本发明的分子复合物可以包含酶，例如葡糖脑苷脂酶(Genzyme的Cerezyme^)，其用于酶缺乏病例如Gaucher病。Cerezyme^是通过静脉内输注1-2小时来施用。剂量应当针对每位患者而异。初始剂量范围为2.5U/kg体重、每周3次至60U/kg每2周一次。在Physician′s Desk Reference(第56版，2002，第57版，2003和第58版，2004)中可以发现其它的方案。

在各种实施方案中，与根据本发明的凝集素的低聚可以降低所述药物的有效剂量，例如，降低1，5，10，20，50，100倍或更多。当药物剂量不是按照重量单位给出时，根据生产商的说明书或本领域已知的任何方法，可以将其转化成重量单位，然后可以相应地计算出分子复合物中对应的凝集素的量。

5.9.2 治疗方案

对于上述的用于治疗或预防病(例如，癌症、传染病、贫血、免疫抑制状况、酶缺乏或激素缺乏)的任意联合疗法，本发明的复合物可以在施用基于非-凝集素-糖蛋白的用药程式之前、同时或之后施用。基于非-凝集素-糖蛋白的用药程式可以是上述的用于治疗或预防癌症或传染病的任何一种用药程式(或对于治疗或预防目标疾病所需的任意其它治疗用药程式)。

在一个实施方案中，本发明的复合物基本上与其它用药程式同时施用给受试者。该方法前提是，2次施用是在彼此相距小于1分钟至约5分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时或最多12小时的时间段内进行的，例如在同一医生巡视时。

在另一个实施方案中，本发明的复合物和用药程式精确地同时施用。在另一个实施方案中，本发明的复合物和用药程式依次在一定时间间隔内施用，使得本发明的复合物和用药程式可以一起作用，以提供比单独施用它们时更大的益处。在另一个实施方案中，本发明的复合物和用药程式是在足够接近的时间内施用的，以提供所需的治疗性或预防性的结果。每一种可以同时或分开地以任何适当的形式和任何合适的途径施用。在一个实施方案中，本发明的复合物和用药程式是通过不同的施用途径施用的。在一个替代实施方案中，每种通过相同的施用途径施用。可以在相同或不同的位点施用本发明的复合物，例如臂和腿。当同时施用时，本发明的复合物和用药程式可以是或不是混合地或通过相同的施用途径在相同施用位点施用的。

在一个优选的实施方案中，根据5.9.1部分所述的方案施用本发明的复合物。在各种实施方案中，本发明的复合物和另一种用药程式是在相隔小于1小时、在相隔约1小时、在相隔1小时至2小时、在相隔2小时至3小时、在相隔3小时至4小时、在相隔4小时至5小时、在相隔5小时至6小时、在相隔6小时至7小时、在相隔7小时至8小时、在相隔8小时至9小时、在相隔9小时至10小时、在相隔10小时至11小时、在相隔11小时至12小时、在相隔不超过24小时或不超过48小时时施用。在其它的实施方案中，本发明的复合物和另一种用药程式是在相隔2至4天、在相隔4至6天、在相隔1周、在相隔1至2周、在相隔2至4周、在相隔1个月、在相隔1至2个月或2个或更多个月时施用。在优选的实施方案中，本发明的复合物和另一种用药程式是在二者仍然是有活性的时间段内施用的。通过确定每种施用的组分的半衰期，本领域的技术人员能够确定这样的时间段。

在一个实施方案中，本发明的复合物和另一种用药程式是在同一次患者巡视时施用。在一个具体的优选实施方案中，在施用另一种用药程式之前施用本发明的复合物。在一个替代的具体实施方案中，在施用另一种用药程式之后施用本发明的复合物。

在某些实施方案中，给受试者周期性地施用本发明的复合物和一种或多种其它用药程式。周期性治疗包括施用本发明的复合物一段时间，然后施用另一种用药程式一段时间，并重复该顺序施用。周期性治疗可以减少发生对一种或多种疗法的抗性，避免或减少一种疗法的副作用，和/或改善治疗的功效。在这样的实施方案中，本发明预期交替施用本发明的复合物，随后在4至6天后、优选2至4天后、更优选1至2天后施用另一种用药程式，其中这样的循环可以根据需要重复多次。在某些实施方案中，在小于3周、每2周一次、每10天一次或每周一次的周期内交替施用本发明的复合物和一种或多种其它用药程式。在一个具体的实施方案中，在施用另一种用药程式后的1小时至24小时的时间段内，给受试者施用本发明的复合物。如果使用了缓释或连续释放类型的用药程式递送系统，则该时间段可以再延长几天或更久。

5.9.3 制剂和用途

使用一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂，可以以常规方式配制出用于根据本发明的用途的药物组合物。

因此，可以配制出用于通过吸入或吹入(通过嘴或鼻子)、经口地、经口腔地、肠胃外地、皮内地、粘膜地、皮下地、静脉内地、直肠地或经皮地施用的复合物和它们的生理上可接受的盐和溶剂化物。

为了经口施用，药物组合物可以采取下述形式，例如，片剂或胶囊，其通过常规方式与药学上可接受的赋形剂例如粘合剂(例如，预凝胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充物(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠)一起制备。通过本领域熟知的方法，可以对片剂涂覆。经口施用的液体制剂可以采取下列形式，例如，溶液、糖浆或悬浮液，或者将它们制成可以在使用前与水或其它合适载体构建的干产品。这样的液体制剂可以通过常规方式与药学上可接受的添加剂例如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化的食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性载体(例如，杏仁油、油脂、乙醇或分级分离的植物油)；和防腐剂(例如，甲基或丙基对羟基苯甲酸盐或山梨酸)一起制备。根据需要，制剂还可以含有缓冲盐、调味剂、着色剂和增甜剂。

可以将经口施用的制剂合适地配制成能控释活性复合物。

为了经口腔施用，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或糖锭的形式。

为了吸入施用，以应用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体)的压缩包或雾化器呈递的气溶胶喷雾形式，方便地递送用于本发明的用途的复合物。在压缩的气溶胶情形下，通过提供一个递送计量的量的阀门，可以确定剂量单位。胶囊和药筒(例如，用于吸入器或吹入器的明胶的)可以配制成含有复合物和合适的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。

可以将复合物配制成肠胃外注射施用的形式，例如，单次快速静脉注射或连续输注。注射制剂可以制成添加有防腐剂的单位剂量形式，例如，在安瓿或多剂量容器中。组合物可以采用在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳状液的形式，且可以含有配制剂(formulatoryagent)，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是用于在使用前与合适的载体(例如，无菌的无致热原的水)配制的粉末形式。

还可以将复合物配制成直肠组合物例如栓剂或保留灌肠剂，例如，含有常规的栓剂基质，例如可可油或其它甘油酯。

除了前述的制剂外，还可以将复合物配制成贮存制剂(depotpreparation)。这样的长效制剂可以通过植入(例如皮下地或肌内地)或通过肌内注射来施用。因而，例如，可以用合适的聚合的或疏水的材料(例如作为在可接受的油中的乳状液)或离子交换树脂配制复合物，或制成难溶的衍生物，例如难溶的盐。

如果需要，可以将组合物置于包或分配装置中，所述装置可以含有一个或多个含有活性成分的单位剂量形式。该包可以例如包含金属或塑料箔，例如泡形包装(blister pack)。该包或分配装置可以伴有施用说明书。

还包括佐剂与本发明的复合物的组合或混合使用。预期的佐剂包括但不限于无机盐佐剂或无机盐凝胶佐剂、颗粒佐剂、微粒佐剂、粘膜佐剂和免疫刺激性佐剂，例如在5.8部分所述的那些。佐剂可以作为与本发明的复合物的混合物施用给受试者，或与在5.9.2部分所述的复合物组合使用。

还预期腺苷二磷酸(ADP)与本发明的复合物(优选gp96复合物)的组合或混合使用。

5.9.4 试剂盒

本发明还提供了用于实现本发明的治疗方案的试剂盒。这样的试剂盒包含装在一个或多个容器中的治疗或预防有效量的药学上可接受形式的本发明的分子复合物。本发明的试剂盒的瓶中的分子复合物可以是药学上可接受的溶液的形式，例如与无菌盐水、葡萄糖溶液、或缓冲液或其它药学上可接受的无菌流体组合。或者，可以冻干或干燥复合物；在该情况下，试剂盒还任选地包含装在容器中的药学上可接受的溶液(例如，盐水、葡萄糖溶液等)、优选无菌的，以重配复合物，形成注射用的溶液。

在另一个实施方案中，本发明的试剂盒还包含用于注射复合物的针或注射器，优选包装在无菌形式中，和/或包装的酒精垫。任选地包括关于医生或患者施用本发明的分子复合物的说明书。

在一些实施方案中，本发明提供了包含多个容器的试剂盒，每个容器包含药物制剂或组合物，其含有足以实现一次治疗性或预防性施用剂量的本发明的分子复合物。本发明还提供了包含一个装有免疫学和/或生物学活性的糖蛋白或其复合物的容器和一个装有凝集素的容器的试剂盒。任选地，试剂盒中可以包括关于根据本发明的方法配制低聚复合物的说明书。

在一个具体的实施方案中，试剂盒包含装有纯化的分子复合物的第一个容器和装有不同治疗用药程式的第二个容器，当在施用第一个容器中的分子复合物之前、同时或之后施用时，所述治疗用药程式的量能有效地将总体治疗有效性提高到超过单独施用每种组分时的有效性，或者能有效地降低治疗的副作用(例如，与单独使用每种组分时观察到的副作用相比)。在一个优选的具体实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，其在第一个容器中装有包含从哺乳动物癌组织得到的且在有ConA存在的情况下低聚化的大量非共价肽复合物的纯化的本发明的分子复合物，在第二个容器中装有包含纯化的癌症化疗剂的组合物，且在第三个容器中装有包含纯化的细胞因子的组合物。

5.10.监控治疗过程中的效果

通过本领域的技术人员已知的任意方法，可以监控本发明的分子复合物的治疗效果。例如，症状和/或实验室结果的改善或恶化、成像技术或各种生化测定的变坏都可以用于监控治疗效果。

通过本领域的技术人员已知的任意方法，可以监控本发明的分子复合物对肿瘤病的发展和进展的治疗效果，所述方法包括但不限于检测：a)迟发型超敏反应，作为对细胞免疫的估计；b)溶细胞的T-淋巴细胞的体外活性；c)肿瘤特异性抗原例如癌胚抗原(CEA)的水平；d)使用诸如计算层析X射线照相术(CT)扫描的技术，检测肿瘤的形态学变化；e)高危受试者中特定癌症风险的推定生物标记的水平的变化，和f)使用声波图检测肿瘤形态学的变化。

5.10.1 迟发型超敏反应皮肤实验

迟发型超敏反应皮肤实验在总体免疫活性和对抗原的细胞免疫中具有重要价值。将不能与一组普通皮肤抗原反应称作无反应性(Sato，T.，等，1995，Clin.Immunol.Pathol.，74：35-43)。

皮肤实验的适当技术要求，抗原应当无菌、避光地储藏在4℃，在使用前迅速重配。用25-或27-规格的针确保皮内、而不是皮下地施用抗原。在皮内施用抗原后的24和48小时，用标尺测量红斑和硬结的最大尺寸。通过使用更高浓度的抗原，或在模糊情形下通过中间实验的重复实验，确认了对任何特定抗原或抗原组的活动减退。

5.10.2 细胞毒性T细胞的体外活化

使用在3ml含有10％胎牛血清的RPMI培养基中的4×10⁴丝裂霉素C处理的肿瘤细胞，重新刺激通过Ficoll-Hypaque离心梯度技术分离出的8×10⁶外周血衍生的T淋巴细胞。在一些实验中，将33％二次混合的淋巴细胞培养物上清液或IL-2包含在培养基中，作为T细胞生长因子源。

为了测量免疫后的细胞毒性T-淋巴细胞的原发反应，在没有刺激物肿瘤细胞的情况下培养T细胞。在其它的实验中，用抗原性不同的细胞重新刺激T细胞。6天后，在4小时⁵¹Cr-释放测定中测试培养物的细胞毒性。靶的自发的⁵¹Cr-释放应当达到小于20％的水平。对于抗-MHC I类阻断活性，以12.5％的终浓度向实验物中加入10倍浓缩的W6/32杂交瘤上清液(Heike M.，等，J.Immunotherapy，15：165-174)。

5.10.3 肿瘤特异性抗原的水平

尽管不太可能检测所有肿瘤上的独特肿瘤抗原，但许多肿瘤表现出了能将它们与正常细胞区别开的抗原。单克隆抗体试剂已经允许分离和生化地表征抗原，且已经非常重要地在诊断上用于区别转化的和未转化的细胞和定义转化细胞的细胞谱系。最好地表征的人肿瘤相关抗原是瘤胚抗原。这些抗原在胚胎发生的过程中表达，但是在正常的成体组织中不存在或非常难以检测到。原型抗原是癌胚抗原(CEA)，它是在胎儿肠和人结肠癌细胞中发现的糖蛋白，但是在正常的成体结肠细胞中不存在。由于CEA源自结肠癌细胞、且在血清中发现，所以最初认为该抗原在血清中的存在可以用于筛选结肠癌患者。但是，其它肿瘤(例如胰腺癌或乳腺癌)的患者的CEA血清水平的也有所升高。因此，监控经历治疗的癌症患者中的CEA水平的降低和升高，在预测肿瘤发展和对治疗的反应方面具有经证实的作用。

几种其它的瘤胚抗原已经用于诊断和监控人肿瘤，例如已经在肝和生殖细胞肿瘤患者的血清中发现了甲胎蛋白(一般由胎儿肝和卵黄囊细胞分泌的α-球蛋白)，且可以用作疾病状态的标记物。

5.10.4 计算层析X射线照相术(CT)扫描

CT仍是确定癌症的精确病期的选择技术。已经证实了CT比检测转移的任何其它成像技术更灵敏和更有特异性。

5.10.5 推定的生物标记物的测量

测量特定癌症的推定的生物标记物的水平，以监控本发明的分子复合物的效果。例如，在处于高前列腺癌风险的受试者中，通过Brawer，M.K.，等，1992，J.Urol.，147：841-845和Catalona，W.J.，等，1993，JAMA，270：948-958所述的方法，测量了血清前列腺-特异性的抗原(PSA)；或者在处于结肠直肠癌风险的受试者中，如上面5.10.3部分所述测量了CEA；在处于高乳腺癌风险的受试者中，通过Schneider，J.等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：3047-3051所述的方法，测量了雌二醇的16-羟基化。

5.10.6 声波图

声波图仍是确定癌症的精确病期的替代选择技术。

6.实施例1：人GP96-肽复合物批次中持续升高水平的CON A

制备了来自4个独立的人肾肿瘤样品的组织匀浆物(A至D)，并通过Con A柱层析进行处理。分离Con A洗脱物，一半材料备用。剩余的样品缓冲液更换为PBS(PD-10柱)，然后经分离DEAE柱进一步纯化2种样品，生成2种匀浆物匹配的终产物——1种在Con A和DEAE柱之间没有缓冲液更换(无Bx)，1种在两柱之间有缓冲液更换步骤(Bx)。然后用检测Con A的灵敏ELISA来确定这些分离的gp96-肽样品中的Con A浓度。

伴刀豆球蛋白A特异性的ELISA：

材料：伴刀豆球蛋白A购自Sigma，目录号C7275。捕获抗体：小鼠抗Con A目录号MAB 158 Maine Biotechnology，第一抗体：兔抗Con A目录号C7401 Sigma；检测抗体：山羊抗兔IgG-HRP目录号111-035-144 Jackson ImmunoResearch.0.1M NaHCO₃ pH 9.6。洗涤缓冲液PBST PBS+0.05％ Tween 20。封闭缓冲液：在洗涤缓冲液(PBST)中的2％脱脂奶粉。甲基α-D-吡喃型甘露糖苷(α-MM)，USB目录号19115。样品稀释剂：PBS+1％ BSA和10％ MMP。TMB Microwell基质，目录号50-76-05 KPL。停止溶液，目录号50-85-05 KPL。

方法：用2μg/mL溶于0.1M NaHCO₃ pH 9.6中的小鼠抗-Con A涂覆平板，并在4℃温育过夜。洗涤平板(PBS-Tween)，随后在37℃封闭(1％ BSA/PBS)1小时，然后洗涤。在样品稀释剂中制备样品和标准品，以100μl/孔一式两份地应用到孔中，温育(37℃，1小时)，并洗涤平板。加入溶于1％BSA+10％ α-MM中的兔抗-Con A，在37℃温育平板1小时，然后洗涤。加入在封闭缓冲液中的1∶5000的检测抗体山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶，在室温(RT)温育平板0.5小时，然后洗涤。然后向每个孔中加入TMB基质，温育平板(室温，10分钟)，加入停止溶液，并在450nm读平板。

结果：使用包含缓冲液更换步骤的方法从普通匀浆物中纯化出的gp96具有比对应的省略缓冲液更换步骤生成的匀浆物匹配的gp96样品更高水平的Con A(图1)。

7.实施例2：CON A存在于低聚化的分子复合物中

制备了来自化学诱导的鼠纤维肉瘤(Meth A)组织的普通匀浆物，并通过Con A柱层析进行处理。分离Con A洗脱物，一半材料备用。剩余的样品缓冲液更换为PBS，然后经分离DEAE柱进一步纯化2种样品，生成2种匀浆物匹配的终产物——1种在Con A和DEAE柱之间没有缓冲液更换(无Bx)，1种在有缓冲液更换步骤(Bx)。在Superdex200柱(分别为上、中、下)上通过SEC一起分级分离2种样品和游离Con A(5μg、50μg/mL)的样品。通过SDS-PAGE分析收集的级分的gp96(级分1至8；插图)，通过针对Con A的直接ELISA评价单独级分的Con A含量(级分1至14；覆盖图)(关于针对Con A的直接ELISA，见实施例1)。在无Bx-gp96的制剂中只有少量Con A，但是显示级分1至5中的用Bx生产的gp96具有Con A。游离Con A洗脱得更晚，表明Bx-gp96样品中的Con A不是游离的，而是与更高分子量的物质结合的。

为了证实gp96是与Con A低聚化的，制备了来自Meth A诱导的鼠纤维肉瘤组织的普通匀浆物，并通过包括Con A和DEAE柱层析的方法进行处理。将最终纯化的gp96制剂分成2份。向一半材料中加入外源的con A，至终浓度50μg/mL；向另一半中只加入缓冲液作为对照，将2份样品在37℃温育2小时，然后通过SEC(Superdex 200)分级分离。通过SDS-PAGE、gp96-和con A-特异性的ELISA分析各级分。没有缓冲液更换步骤时生产的材料的分析数据显示在左图中；其中加入了con A的图在右边。在左图中，gp96的峰在级分5中，且通过特异性的ELISA检测到的con A水平较低。在右图(加入了con A)中，如通过SDS-PAGE(插图；峰级分3(箭标)和5)和gp96 ELISA(级分3和5)以及集中在级分3中的Con A的不同峰所证实的，2个gp96峰都是明显的。Con A介导了gp96的洗脱位置的移动。

8.实施例3：低聚反应与体外和体内效力相关联

8.1.人gp96样品中的Con A含量与体外效力相关联

如上所述从4个独立的人肾肿瘤样品(A至D)制备了gp96样品(见图1)，生成了4对差别仅仅在于包括或省略了Con A和DEAE柱之间的缓冲液更换步骤的样品。使用CD71系统，测定所有8个样品的con A含量(图A；也见图1)和体外抗原重新呈递(图B)。在每种情况下，与从匹配肿瘤匀浆物生成并通过省略了缓冲液更换步骤的步骤制备的样品相比，通过包含缓冲液更换步骤(且含有高水平的Con A)的方法制备的材料具有更高的体外重新呈递活性。

CD71 体外重新呈递实验：

材料：在这些实验中使用呈递抗原细胞系RAW264.7(ATCC号TIB-71)。它是Abelson鼠白血病病毒转化的巨噬细胞细胞系，其源自BALB/c品系(H-2^d)。通过融合对人CD719聚体特异性的BALB/c T细胞和BWαβ^-胸腺瘤细胞，生成了T细胞杂交瘤。通过PEG，使T细胞与BWαβ^-细胞融合，并在HAT培养基中选择。然后通过抗原刺激后HT-2细胞的增殖，测量IL-2生产，筛选得到的T-T杂交瘤细胞的CD71 9聚体特异性。使用的培养基是RPMI 1640(Gibco-BRL)。使用缓冲液更换和无缓冲液更换的方法和如(Arnold-Schild等，同上)所述的scFv-柱方法，从人肾肿瘤纯化出了人gp96。将使用相同的纯化方法从CT26肿瘤纯化的鼠gp96-CT26作为实验样品，鼠CD719聚体肽(TYEALTQKV)作为阴性抗原对照。人CD71 9聚体(TYKELIERI)用作阳性抗原对照。

人肿瘤衍生的gp96的制备：从人肾肿瘤纯化了人衍生的gp96。简而言之，将肿瘤匀浆，并通过离心澄清。对无细胞的上清液进行50％硫酸铵沉淀。使用ConA和DEAE层析，进一步纯化得到的上清液。对蛋白进行过滤除菌(0.22μm)，等分试样，并储存在-80±20℃待用。

重新呈递实验：在96-孔平底平板中，将人CD71-特异性的T细胞杂交瘤(5×10⁴)与RAW264.7细胞(5×10⁴)共培养。一式三份地加入所需浓度的人gp96，从150μg/ml开始，并向下滴定。加入合适的阳性和阴性对照，并将培养基的体积调至终体积为200μl。除了含有T细胞杂交瘤和APC的实验平板外，加入只含有T细胞杂交瘤或APC的平板作为对照。通过轻打来轻微搅拌平板，然后置于37℃、5％ CO₂培养箱中20小时。温育后，在1000 RPM、4℃沉淀细胞5分钟。将上清液转移到96-孔圆底平板中，通过ELISA(R & D)测试IL-2生产。

8.2.鼠CT 26系统中的Con A含量与体内效力相关联

如上面关于人肿瘤衍生的样品所述(见图1)，从2个独立的鼠CT26肿瘤样品(制剂A和B)制备了gp96样品。使用CT26系统测定了所有4个样品的con A含量(图A)和体外抗原重新呈递(图B)。在每种情况下，与从匹配肿瘤匀浆物生成并通过省略了缓冲液更换步骤的步骤制备的样品相比，通过包含缓冲液更换步骤(且含有增加量的Con A)的方法制备的材料具有更高的体外重新呈递活性。

CT26 体外抗原重新呈递实验：

材料：在这些实验中使用呈递抗原细胞系RAW264.7(ATCC号TIB-71)。它是Abelson鼠白血病病毒转化的巨噬细胞细胞系，其源自BALB/c品系(H-2^d)。细胞毒性T淋巴细胞(CTL)：从University ofConnecticut Medical Center得到了对CT26肿瘤肽特异性的T细胞。这些T细胞是对AH1表位、氨基酸序列SPSYVYHQF特异性的。用AH1 9聚体肽加辐照的BALB/c脾细胞，每周一次重新刺激这些CTL。使用了AIM V(Gibco-BRL)组织培养基。它是无血清的不含蛋白酶的培养基。蛋白酶是不希望的，因为它们会将长肽消化为更小的尺寸，后者能表面装载到诱导独立于抗原重新呈递的CTL反应的MHC分子上。使用缓冲液更换和无缓冲液更换的方法，从小鼠肿瘤纯化出了CT26衍生的gp96。加入单独的AH1 19聚体(RVTYHSPSYVYHQFERRAK)以及源自正常小鼠器官的gp96作为阴性对照。将能表面装载和引发CTL识别的AH1 9聚体(SPSYVYHQF)用作阳性对照。另外的阳性对照包含与AH1 19聚体肽复合的小鼠衍生的gp96。

方法：

CT26衍生的gp96的制备：从实体瘤纯化出了CT26衍生的gp96。将小鼠肿瘤匀浆，并通过离心澄清。对无细胞的上清液进行50％硫酸铵沉淀。使用ConA和DEAE层析，进一步纯化得到的上清液。对蛋白进行过滤除菌(0.22μm)，等分试样，并储存在-80±20℃待用。

gp96-AH1 19聚体复合物(复合物阳性对照样品)的制备：将溶解在H₂O中的AH119聚体肽以50∶1摩尔比加入gp96中。在15ml锥形管中，依赖于要复合的蛋白的量，将样品简单地混合到约1-2ml的体积中，并在37℃放置0.5小时。温育后，使用30K MWCO Centricon自旋过滤器装置(Millipore)，用5ml PBS洗涤样品4次，并通过Bradford测定分析蛋白浓度。

AH1-9聚体(测定阳性对照样品)的制备：AH1 9聚体可以直接装载到MHC I分子上，因此用作阳性对照来直接刺激未经APC加工的T细胞。

阴性对照样品包括以相同的摩尔浓度溶解在PBS中的未复合的gp96或裸19聚体肽。

重新呈递测定：洗涤AH1肽-特异性的T细胞(刺激后8天)3次，以去除APC，并以2×10⁵细胞/ml重新悬浮到AIM V培养基中。将RAW264.7细胞用作APC，并在AIM V中以2×10⁵细胞/ml重新悬浮之前，在DMEM加10％ FCS中洗涤一次。在96-well圆底平板中，一式四份地加入CT26衍生的gp96样品，并进行2倍系列稀释(200μg/ml-6.25μg/ml)。加入适当的阳性和阴性对照，以及达到250μl终体积所需量的AIM V。在每个孔中，将1×10⁴ T细胞与等数目的APC共培养。将仅仅含有T细胞的平板用作对照。在37℃和5％ CO₂温育平板18小时。

温育后，在1000rpm、4℃沉淀细胞5分钟。将上清液转移到96-孔平底平板中进行ELISA，并储存在-20℃。通过ELISA(R & D Systems)测量IFN-γ水平。

8.3.Con A含量与在体外Meth A重新呈递测定和体内鼠Meth A肿瘤保护模型中的效力相关联

从普通肿瘤匀浆物(上述)制备了2份分开的Meth A gp96制剂，生成一对差别仅仅在于包括或缺少Con A和DEAE柱之间的缓冲液更换步骤的样品。通过Con A ELISA，测定了这些样品的Con A含量(图A)，在Meth A重新呈递测定中的体外活性(图B)和以10μg的剂量在meth A肿瘤保护测定中的体内活性(图C)。与通过缺少缓冲液更换步骤的方法制备的样品相比，通过包含Con A和DEAE柱之间的缓冲液更换步骤的方法制备的Meth A gp96具有更高的Con A含量、更高的体外抗原重新呈递和更高的体内肿瘤保护活性。

Meth A体外抗原重新呈递：

材料：辐照的BALB/c脾细胞用作呈递抗原细胞(APC)。使用了Meth A-特异性的CD4⁺T细胞克隆24D3。它们是MHCII分子I-Ed限制的，且是对包含在序列EYELRKHNFSDTG中的抗原肽特异性的。用在该测定中的培养基是RPMI 1640(Gibco-BRL)。使用缓冲液更换和无缓冲液更换的方法，从小鼠Meth A肿瘤纯化出了gp96。野生型的L11肽(EYELRKNNFSDTG)用作阴性对照，且突变型L11肽(EYELRKHNFSDTG)用作阳性对照。

方法：

Meth A衍生的gp96的制备：从实体瘤纯化出了Meth A衍生的gp96。将小鼠肿瘤匀浆，并通过离心澄清。对无细胞的上清液进行50％硫酸铵沉淀。使用ConA和DEAE层析，进一步纯化得到的上清液。对蛋白进行过滤除菌(0.22μm)，等分试样，并储存在-80±20℃待用。

重新呈递实验：在96孔平底平板中，以200μl的终体积，在有各种浓度的来自Meth A或其它来源的gp96存在的情况下(100、50、25、12.5、6.25μg/ml终浓度)，将2×10⁴ Meth A特异性的CD4+T细胞克隆(24D3)与5×10⁵辐照的BALB/c脾APC一起温育48-72小时。在重复的孔中加入野生型核糖体蛋白L11肽和突变的核糖体蛋白L11肽，并分别用作阴性对照或阳性对照。在37℃、5％ CO₂温育48-72小时后，取出100μl上清液，通过ELISA测量IL-5生产。

体内Meth A肿瘤抑制测定：

体内Meth A生长抑制测定：在第0天和第7天，用10或50μg gp96在胁腹皮内免疫BALB/c小鼠(n＝30/组)。在研究的第14天，用总体积为100μl的1×10⁵ Meth A细胞皮内攻击小鼠。在随后的4周中，监控生长的肿瘤。在研究的第41天，完成最后的肿瘤测量后，使所有的动物安乐死。将数据记录为在研究的第41天没有肿瘤的动物的百分比。对照组包括未免疫的(稀释剂-阴性对照)和用辐照的Meth A细胞免疫的(阳性对照)。

9.实施例4：外源的Con A会增加CD71体外重新呈递测定中的gp96活性

将人肝组织匀浆并离心，生成11K上清液，将其分成3等份样品，并通过不同的方法进行处理。

通过Con A柱层析处理2份样品(见5.13部分)，分离Con A洗脱物，一半材料备用。剩余的样品缓冲液更换为PBS(见5.13部分)，然后经分离DEAE柱纯化2种样品，生成2种匀浆物匹配的终产物一-1种在Con A和DEAE柱之间没有缓冲液更换(无Bx-样品A)，1种在两柱之间有缓冲液更换步骤(Bx-样品B)(图7)。

使用Arnold-Schild等，Cancer Research，2000，60(15)：4175-4178(在下文中称作“Arnold-Schild”，其在这里整体引作参考)所述的gp96-特异性的scFv柱，将剩余的11K上清液用于纯化gp96。纯化如下进行：将5mg scFv抗-gp96偶联到0.5mg CNBr-活化的琼脂糖凝胶(Pharmacia)上(关于scFv抗-gp96的生产，见Arnold-Schild，或者可以通过本领域熟知的任何方法制备)。将该11K上清液应用到scFv抗-gp96柱上。用PBS充分洗涤后，用PBS、1.3M NaCl、10mM醋酸钠(pH 7.2)洗脱gp96。

通过con A特异性的ELISA(将外源的con A(7.5ng con A/μg总蛋白)加入2种样品A和D中，直到与样品B中的水平相同)，分析所有样品的con A浓度，和在75μg/mL的蛋白浓度时CD71系统中的体外抗原重新呈递。关于匹配的样品对，通过包含缓冲液更换步骤的方法生产的材料(样品#1；con A含量7.5ng/μg总蛋白)比通过省略了缓冲液更换步骤的方法生产的材料(样品A；con A含量0.43ng/μg总蛋白)更具有体外活性(图7)。通过没有使用Con A柱纯化步骤的一步方法生产的材料(scFv gp96；0ng/μg)具有类似于样品A的低体外活性(图7)。向样品A和C中添加外源的Con A至与在样品B中相同的水平(7.5ng con A/μg总蛋白)，会将特异性的体外抗原重新呈递活性增加到与样品B中相似的水平(图7)。该Con A水平对T细胞自身无影响。

10.实施例5：低聚物种类是甲基α-D-吡喃型甘露糖苷(α-MM)灵敏的

通过包括Con A和DEAE层析的标准纯化方法，纯化了meth Agp96样品，并通过使用superose 6柱(Pharmacia)的分析型SEC分析了蛋白，其表明蛋白制剂主要含有二聚体的gp96(gp96 T＝0)。向该gp96样品(浓度500μg/ml)的等分试样中加入Con A(最终50μg/mL)，在室温温育样品，每小时一次取样(T＝1至T＝5)，并进行SEC分析。还进行了只含有con A的样品。con A的加入会介导gp96二聚体峰在洗脱位置中的移动，它在第一个时间点后仅仅有轻微变化。gp96自身在该时间段内不能改变(gp96 T＝5)。在最后的时间点后，取出最后5小时样品的2份独立的等分试样，加入等体积的PBS或含有10％ α-MM的PBS。然后通过SEC重新分析每份样品。其中加入了PBS的样品没有明显变化(未显示)。α-MM的加入离解了高分子量复合物(gp96+con A T＝5+α-MM)，产生与原始gp96样品(gp96 T＝0或T＝5)类似的SEC图。

11.实施例6：低Con A：gp96化学计量会介导gp96洗脱位置的SEC灵敏性移动

通过包含Con A和DEAE层析的标准纯化方法纯化了人肾肿瘤gp96，使用superose 6柱(Pharmacia)，通过分析型SEC分析了蛋白。向gp96(180μg/mL)中加入Con A至终浓度为0.005-50μg/mL，在室温温育样品1小时，并进行SEC分析。约1 Con A：10gp96的化学计量能产生gp96洗脱位置的SEC灵敏性移动。

12.实施例7：甲基α-D-吡喃型甘露糖苷的加入会造成CT26体外抗原重新呈递活性的浓度依赖性的降低

在稀释(1∶5)进含有RAW264.7 APC细胞和AH1特异性的T-细胞的微量滴定板孔之前，在存在50、100或400mM α-MM的情况下，将CT26-衍生的gp96的样品(通过Bx方法制备)和阳性对照9聚体肽(SPSYVYHQF)温育30分钟。将样品温育过夜，通过INF-γ特异性的ELISA分析得到的上清液。α-MM造成了CT26抗原重新呈递的剂量依赖性的降低，且对阳性对照9聚体肽的T细胞识别没有影响。该水平的α-MM没有影响APC或T细胞的生存力。

13.实施例8：Con A会增加HSPPC-96的肿瘤排斥活性

13.1.在纯化gp96的过程中加入的Con A会增加纯化的终产物的活性

通过在纯化过程中加入Con A，制备了在终产物中含有不同水平的Con A的Meth A衍生的gp96。通过Con A ELISA测定了所有样品的Con A含量(为每个样品测量的Con A浓度以ng Con A/μg为单位，显示在图中)和体内肿瘤排斥。图11显示了Meth A体内肿瘤排斥测定的结果。过程中(in process)加入Con A会造成HSPPC-96的肿瘤排斥活性的可滴定的增加。

方法：

Meth A衍生的gp96的制备和Con A的过程中添加：将Meth A肿瘤的样品匀浆(含有2mM MgCl₂和2mM AEBSF的30mM磷酸钠缓冲液pH 7.2)，通过离心澄清，加入固体硫酸铵至50％，再次离心样品，并将上清液直接应用到Con A柱上。在该阶段，将Con A洗脱物缓冲液更换为磷酸缓冲盐水(“PBS”)，并分成6等份样品。将一份样品通过装载到二乙氨乙基(“DEAE”)柱上，用10mM磷酸钠、260mM NaCl洗涤该样品，并用10mM磷酸钠、700mM NaCl洗脱(标准方法)，来对其立即进行处理。向剩余的5份中，加入外源的Con A(1-5的水平分别为3μg/ml，10μg/ml，30μg/ml，100μg/ml和300μg/ml)。然后如上所述，经DEAE柱纯化所有样品。随后将全部DEAE洗脱物缓冲液更换为9％蔗糖-磷酸钾缓冲液pH 7.4。

体内Meth A生长抑制测定：在第0天和第7天，用10μg gp96在胁腹皮内免疫BALB/c小鼠(n＝10/组)。在研究的第14天，用总体积为100μl的1×10⁵ Meth A细胞皮内攻击小鼠。在随后的4周中，监控生长的肿瘤。在研究的第41天，完成最后的肿瘤测量后，使所有的动物安乐死。将数据记录为在研究的第41天没有肿瘤的动物的百分比。对照组包括未免疫的(稀释剂-阴性对照)和用辐照的Meth A细胞免疫的(阳性对照)。

13.2.在纯化gp96的过程中或在纯化gp96后加入的Con A会增加纯化的终产物的活性

通过在纯化过程中(在30μg/ml和300μg/ml的水平)或在纯化后(在30μg/ml的水平)加入Con A，制备了在终产物中含有不同水平的Con A的Meth A衍生的gp96。通过Con A ELISA测定了所有样品的Con A含量(为每个样品测量的Con A浓度以ng Con A/μg为单位，显示在图中)和体内肿瘤排斥。图12(A)显示了过程中加入Con A的Meth A体内肿瘤排斥测定的结果，且图12(B)显示了向终产物中加入Con A的结果。过程中加入Con A或在纯化gp96后加入Con A会造成HSPPC-96的肿瘤排斥活性的增加。

方法：

Meth A衍生的gp96的制备和Con A的添加：将Meth A肿瘤的样品匀浆(含有2mM MgCl₂和2mM AEBSF的30mM磷酸钠缓冲液pH7.2)，通过离心澄清，加入固体硫酸铵至50％，再次离心样品，并将上清液直接应用到Con A柱上。在该阶段，将Con A洗脱物缓冲液更换为PBS，并分成3份样品。将一份样品通过DEAE柱立即处理，以得到gp96(标准方法)。向剩余的2份中，加入外源的Con A(分别为30和300μg/mL)，然后经DEAE柱纯化样品。随后对全部DEAE洗脱的样品进行最终的缓冲液更换，更换为9％蔗糖-磷酸钾缓冲液pH7.4。向一份通过标准方法纯化的gp96等分试样中加入ConA(30μg/mL)。分析样品的Con A含量和体内肿瘤排斥。当过程中加入(图12(A))或向最终纯化的gp96蛋白(图12(B))中加入时，Con A都会造成gp96的肿瘤排斥活性的增加。

体内Meth A生长抑制测定：在第0天和第7天，用10μg gp96在胁腹皮内免疫BALB/c小鼠(n＝10/组)。在研究的第14天，用总体积为100μl的1×10⁵ Meth A细胞皮内攻击小鼠。在随后的4周中，监控生长的肿瘤。在研究的第41天，完成最后的肿瘤测量后，使所有的动物安乐死。将数据记录为在研究的第41天没有肿瘤的动物的百分比。对照组包括未免疫的(稀释剂-阴性对照)和用辐照的Meth A细胞免疫的(阳性对照)。

在另一个实验中，使用抗-gp96 scFv免疫亲和柱，制备了Meth A衍生的gp96。将纯化的gp96缓冲液更换为PBS，并分成几等份。向一等份试样中加入Con A。通过Con A ELISA分析样品(为每个样品测量的Con A浓度以ng Con A/μg为单位，显示在图中)和体内肿瘤排斥。结果显示在图13中。在每种情况下，Con A的加入都会增加gp96的肿瘤排斥活性。

方法：

Meth A衍生的gp96的制备和Con A的添加：将Meth A肿瘤的样品匀浆(含有2mM MgCl₂和2mM AEBSF的30mM磷酸钠缓冲液pH7.2)，通过离心澄清，并过滤(0.45μM)。将得到的澄清匀浆物应用到1mL抗-gp96 scFv免疫亲和柱上。用10柱体积的PBS洗涤柱，随后用5柱体积的含有1.3M NaCl的PBS洗脱gp96。将柱洗脱物缓冲液更换为PBS。

体内Meth A生长抑制测定：在第0天和第7天，用0.3或3μg单独的gp96或与Con A组合在胁腹皮内免疫BALB/c小鼠(n＝10/组)。在研究的第14天，用总体积为100μl的1×10⁵ Meth A细胞皮内攻击小鼠。在随后的4周中，监控生长的肿瘤。在研究的第41天，完成最后的肿瘤测量后，使所有的动物安乐死。将数据记录为在研究的第41天没有肿瘤的动物的百分比。对照组包括未免疫的(稀释剂-阴性对照)和用辐照的Meth A细胞免疫的(阳性对照)。

14.实施例9：HSV-2感染的免疫疗法

通过本领域已知的许多方法，培养2型单纯疱疹病毒(“HSV-2”)，并分离病毒颗粒(见例如，Principles of Virology，Molecular Biology，Pathgenesis，and Control，Flint等，编，ASM Press，(2000))。通过几种普通方法中的一种，提取病毒颗粒，离心得到的样品并过滤，以得到富含病毒蛋白的级分。可以定量最初收集的可溶化的病毒蛋白，并加入化学计量过量的Con A(或其它凝集素)。或者，通过伴刀豆球蛋白A(或其它固定化的凝集素)柱上的层析，还可以进一步富集可溶的蛋白提取物中的病毒-特异性糖蛋白。使用凝集素-特异性的抑制剂(例如针对Con A的甲基α-吡喃型甘露糖苷)，可以从柱上特异性地洗脱下糖蛋白。使用许多缓冲液更换方法，可以去除抑制剂。然后可以定量富集的糖蛋白样品，并加入化学计量过量的Con A。或者，使用酶促的或化学的方法，可以进一步加工富集的糖蛋白样品，以生产糖蛋白的更小的肽片段。可以将这些更小的片段直接与化学计量过量的ConA(或其它凝集素)混合，或通过层析和从Con A柱(或其它固定化的凝集素柱)洗脱，进一步进行纯化。可以定量富集的糖肽级分，并加入化学计量过量的Con A(或其它凝集素)。使用预防(鼠HSV-2)或治疗(豚鼠HSV-2)模型，可以评价样品和适当对照物的生物学活性。

可以进行类似的方法，以生成用于评价癌症免疫疗法的实验材料。

等同方案和引用的文献

在本文中为所有目的引用的全部文献在这里都整体引作参考，其程度与为所有目的具体地和个别地整体引用单个的出版物或专利或专利申请作为参考相同。

如本领域的技术人员所明白的，可以对本发明进行许多修饰和变化，而不偏离其精神和范围。本文所述的具体实施方案仅仅是作为实例予以提供。

                             序列表

<110>Antigenics，Inc.

<120>凝集素在促进糖蛋白和抗原分子的低聚反应中的用途

<130>8449-330-228

<150>60/450,721

<151>2003-02-28

<160>6

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>鼠白血病病毒表位

<400>1

Ser Pro Ser Tyr Val Tyr His Gln Phe

1               5

<210>2

<211>9

<212>PRT

<213>小鼠(Mus Musculus)

<400>2

Thr Tyr Glu Ala Leu Thr Gln Lys Val

1               5

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

Thr Tyr Lys Glu Leu Ile Glu Arg Ile

1               5

<210>4

<211>19

<212>PRT

<213>鼠白血病病毒表位

<400>4

Arg Val Thr Tyr His Ser Pro Ser Tyr Val Tyr His Gln Phe Glu Arg

1               5                   10                  15

Arg Ala Lys

<210>5

<211>13

<212>PRT

<213>小鼠(Mus Musculus)

<400>5

Glu Tyr Glu Leu Arg Lys His Asn Phe Ser Asp Thr Gly

1               5                   10

<210>6

<211>13

<212>PRT

<213>小鼠(Mus Musculus)

<400>6

Glu Tyr Glu Leu Arg Lys Asn Asn Phe Ser Asp Thr Gly

1               5                   10

Claims (70)

1.一种或多种非共价复合物，每种复合物包含热激蛋白、抗原分子和凝集素，其中所述的热激蛋白和/或抗原分子是糖基化的，且其中所述的复合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量大于或等于40ng凝集素/μg热激蛋白。

2.如权利要求1的复合物，其中所述的复合物中的凝集素相对于热激蛋白的量是50ng凝集素/μg热激蛋白至1000ng凝集素/μg热激蛋白。

3.如权利要求1的复合物，其中所述的复合物中的凝集素相对于热激蛋白的量是100ng凝集素/μg热激蛋白至500ng凝集素/μg热激蛋白。

4.一种或多种非共价复合物，每种复合物包含热激蛋白、抗原分子和凝集素，其中所述的热激蛋白和/或抗原分子是糖基化的，且其中所述的复合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量小于或等于5ng凝集素/μg热激蛋白。

5.如权利要求4的复合物，其中所述的复合物中的凝集素相对于热激蛋白的量是0.1ng凝集素/μg热激蛋白至1ng凝集素/μg热激蛋白。

6.如权利要求4的复合物，其中所述的复合物中的凝集素相对于热激蛋白的量是0.5ng凝集素/μg热激蛋白至1ng凝集素/μg热激蛋白。

7.如权利要求1-6中的任一项的复合物，其中所述的凝集素是能结合甘露糖的凝集素。

8.如权利要求7的复合物，其中所述的能结合甘露糖的凝集素是伴刀豆球蛋白A(Con A)。

9.如权利要求1-6中的任一项的复合物，其中所述的热激蛋白是gp96。

10.如权利要求1-6中的任一项的复合物，其中非共价复合物是纯化的。

11.制备大量包含热激蛋白、抗原分子和凝集素的非共价复合物的方法，其中所述的热激蛋白是糖基化的，所述的方法包括下述步骤：a)使所述的凝集素结合到所述的热激蛋白上；和b)使所述的热激蛋白复合到抗原分于上。

12.制备大量包含热激蛋白、抗原分子和凝集素的非共价复合物的方法，其中所述的热激蛋白和/或抗原分子是糖基化的，所述的方法包括使凝集素结合到一种或多种复合物上，每种复合物包含热激蛋白和抗原分子，其中所述的凝集素未结合到固相上。

13.如权利要求12的方法，还包括：在使所述的复合物结合到凝集素上之前，通过基于凝集素的亲和层析分离所述的热激蛋白和抗原分子的复合物。

14.如权利要求12的方法，还包括：在使所述的复合物结合到所述的凝集素上之前，通过基于非-凝集素的层析分离所述的热激蛋白和抗原分子的复合物。

15.如权利要求14的方法，其中所述的基于非-凝集素的层析是基于抗体的亲和层析。

16.一种或多种分子复合物，其是权利要求11-14中的任一项的方法的产物，其中所述的组合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量大于或等于40ng凝集素/μg热激蛋白。

17.一种或多种分子复合物，其是权利要求11-15中的任一项的方法的产物，其中所述的组合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量小于或等于5ng凝集素/μg热激蛋白。

18.如权利要求11-15中的任一项的方法，其中所述的凝集素是能结合甘露糖的凝集素。

19.如权利要求18的方法，其中所述的能结合甘露糖的凝集素是伴刀豆球蛋白A(Con A)。

20.如权利要求11-15中的任一项的方法，其中所述的热激蛋白是gp96。

21.如权利要求12-15中的任一项的方法，其中所述的热激蛋白和抗原分子的复合物是从癌组织得到的。

22.纯化的权利要求16或17的分子复合物。

23.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和一种或多种热激蛋白、抗原分子和凝集素的复合物，其中所述的热激蛋白和/或抗原分子是糖基化的，且其中所述的组合物中的凝集素相对于热激蛋白的量大于40ng/μg热激蛋白。

24.如权利要求23的药物组合物，其中所述的组合物中的凝集素相对于热激蛋白的量是50ng凝集素/μg热激蛋白至1000ng凝集素/μg热激蛋白。

25.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和一种或多种热激蛋白、抗原分子和凝集素的复合物，其中所述的热激蛋白和/或抗原蛋白是糖基化的，且其中所述的组合物中的凝集素相对于热激蛋白的量小于5ng/μg热激蛋白。

26.如权利要求25的药物组合物，其中所述的组合物中的凝集素相对于热激蛋白的量是0.1ng凝集素/μg热激蛋白至1ng凝集素/μg热激蛋白

27.如权利要求23-26中的任一项的药物组合物，其中分子复合物以能有效地治疗或预防癌症或传染病的量存在。

28.如权利要求23-26中的任一项的药物组合物，其中所述的凝集素是能结合甘露糖的凝集素。

29.如权利要求28的药物组合物，其中所述的能结合甘露糖的凝集素是伴刀豆球蛋白A(Con A)。

30.如权利要求23-26中的任一项的药物组合物，其中所述的热激蛋白是gp96。

31.预防或治疗一类癌症或传染病的方法，包括给患有癌症或传染病的受试者施用治疗有效量的包含大量非共价复合物的组合物，每种复合物包含热激蛋白、能表现出对所述的癌症的抗原或所述的传染病因子的抗原的抗原性的抗原分子和凝集素，其中所述的热激蛋白和/或抗原分子是糖基化的，且其中所述的组合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量大于或等于40ng凝集素/μg热激蛋白。

32.如权利要求31的方法，其中所述的组合物中的凝集素相对于热激蛋白的量是50ng凝集素/μg热激蛋白至1000ng凝集素/μg热激蛋白。

33.预防或治疗一类癌症或传染病的方法，包括给患有癌症或传染病的受试者施用治疗有效量的包含大量非共价复合物的组合物，所述复合物包含热激蛋白、能表现出对所述的癌症的抗原或所述的传染病因子的抗原的抗原性的抗原分子和凝集素，其中所述的热激蛋白和/或抗原分子是糖基化的，且其中所述的组合物中的凝集素的量相对于热激蛋白的量小于或等于5ng凝集素/μg热激蛋白。

34.如权利要求33的方法，其中所述的组合物中的凝集素相对于热激蛋白的量是0.1ng凝集素/μg热激蛋白至1ng凝集素/μg热激蛋白。

35.预防或治疗一类癌症或传染病的方法，包括给患有癌症或传染病的受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和一种或多种热激蛋白、能表现出对所述的癌症的抗原或所述的传染病因子的抗原的抗原性的抗原分子和凝集素的复合物，其中所述的热激蛋白和/或抗原蛋白是糖基化的，且其中所述的组合物中的凝集素相对于热激蛋白的量大于或等于40ng/μg热激蛋白。

36.如权利要求35的方法，其中所述的组合物中的凝集素相对于热激蛋白的量是50ng凝集素/μg热激蛋白至1000ng凝集素/μg热激蛋白。

37.预防或治疗一类癌症或传染病的方法，包括给患有癌症或传染病的受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和一种或多种热激蛋白、能表现出对所述的癌症的抗原或所述的传染病因子的抗原的抗原性的抗原分子和凝集素的复合物，其中所述的热激蛋白和/或抗原蛋白是糖基化的，且其中所述的组合物中的凝集素相对于热激蛋白的量小于或等于5ng/μg热激蛋白。

38.如权利要求37的方法，其中所述的组合物中的凝集素相对于热激蛋白的量是0.1ng凝集素/μg热激蛋白至1ng凝集素/μg热激蛋白。

39.如权利要求31-38中的任一项的方法，其中所述的凝集素是能结合甘露糖的凝集素。

40.如权利要求39的方法，其中所述的能结合甘露糖的凝集素是伴刀豆球蛋白A(Con A)。

41.如权利要求31-38中的任一项的方法，其中所述的热激蛋白是gp96。

42.如权利要求31-38中的任一项的方法，其中所述的受试者是哺乳动物。

43.如权利要求42的方法，其中所述的哺乳动物是人。

44.如权利要求31-38中的任一项的方法，其中所述的热激蛋白和所述的抗原分子是从癌组织分离出的纯化的非共价复合物。

45.如权利要求31-38中的任一项的方法，其中分子复合物是纯化的。

46.试剂盒，其包含：(a)第一容器，其装有包含大量非共价复合物的组合物，每种复合物包含热激蛋白和抗原分子，其中热激蛋白和/或抗原分子是糖基化的；和(b)装有纯化的凝集素的第二容器。

47.如权利要求46的试剂盒，其中抗原分子表现出对一类癌症的抗原或传染病因子的抗原的抗原性。

48.如权利要求46的试剂盒，其中凝集素是能结合甘露糖的凝集素。

49.如权利要求48的试剂盒，其中能结合甘露糖的凝集素是伴刀豆球蛋白A(Con A)。

50.如权利要求46的试剂盒，其中热激蛋白是gp96。

51.一种或多种非共价复合物，每种复合物包含凝集素和生物学活性的糖蛋白，其中所述的复合物中的凝集素的量相对于糖蛋白的量大于或等于40ng凝集素/μg糖蛋白。

52.如权利要求51复合物，其中所述的复合物中的凝集素相对于糖蛋白的量是50ng凝集素/μg糖蛋白至1000ng凝集素/μg糖蛋白。

53.一种或多种非共价复合物，每种复合物包含凝集素和生物学活性的糖蛋白，其中所述的复合物中的凝集素的量相对于糖蛋白的量小于或等于5ng凝集素/μg糖蛋白。

54.如权利要求53复合物，其中所述的复合物中的凝集素相对于糖蛋白的量是0.1ng凝集素/μg糖蛋白至1ng凝集素/μg糖蛋白。

55.如权利要求51-54中的任一项的复合物，其中所述的糖蛋白是抗原分子，其能表现出对一种或多种需要在受试者中发生针对它们的免疫反应的抗原决定簇。

56.如权利要求51-54中的任一项的复合物，其中所述的凝集素是能结合甘露糖的凝集素。

57.如权利要求56复合物，其中所述的能结合甘露糖的凝集素是伴刀豆球蛋白A(Con A)。

58.如权利要求51-54中的任一项的复合物，其中非共价复合物是纯化的。

59.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和一种或多种权利要求51-54中的任一项的复合物。

60.如权利要求59的药物组合物，其中复合物以能有效地治疗或预防癌症、传染病、贫血、生长激素缺乏紊乱、酶缺乏紊乱或免疫抑制状况的量存在。

61.向受试者的所需位点或所需细胞类型中递送糖蛋白的方法，包括施用一种或多种分子复合物，其中每种复合物包含凝集素和糖蛋白，且其中所述的复合物中的凝集素的量相对于糖蛋白的量大于或等于40ng凝集素/μg糖蛋白。

62.向受试者的所需位点或所需细胞类型中递送糖蛋白的方法，包括施用一种或多种分子复合物，其中每种复合物包含凝集素和糖蛋白，且其中所述的复合物中的凝集素的量相对于糖蛋白的量小于或等于5ng凝集素/μg糖蛋白。

63.如权利要求61或62的方法，其中所述的糖蛋白是抗原分子，其能表现出对一种或多种需要在受试者中发生针对它们的免疫反应的抗原决定簇。

64.如权利要求61或62的方法，其中所述的凝集素是能结合甘露糖的凝集素。

65.如权利要求64的方法，其中所述的能结合甘露糖的凝集素是伴刀豆球蛋白A(Con A)。

66.如权利要求61或62的方法，其中分子复合物是纯化的。

67.如权利要求61或62的方法，其中受试者是人。

68.纯化的复合物，其包含凝集素和生物学活性的糖蛋白，前提条件是所述的糖蛋白不包括热激蛋白。

69.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求68的复合物和药学上可接受的载体，其中所述的生物学活性的糖蛋白是治疗剂。

70.向患者递送治疗剂的方法，包括给患者施用权利要求69的药物组合物。

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