CN108587918A - 一种基于兼养微藻油脂积累的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于兼养微藻油脂积累的方法，属于生物柴油技术领域。本发明所述方法为：以葡萄糖为碳源的BG‑11基础培养基兼养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期收集藻细胞；将废醪液稀释后作为单针藻的基本培养基，然后向基础培养基中加入MgSO4·7H2O；调整PH值至6.8‑7.1，配制成培养基；将所得培养基进行高压高温灭菌，接入产油单针藻，藻细胞浓度为0.9‑1g/L，然后加入用无水乙醇溶解褪黑素母液，培养基中褪黑素的最终浓度为10‑1mol/L‑10‑4mol/L，并将藻液置于强光照下培养；将培养到稳定期的微藻富集，提取油脂，制备得到生物柴油。本发明简单易行、能大幅降低生产成本，并显著增加油脂产量，从而大大提高了微藻生产生物柴油的效率。
Description
技术领域
本发明属于生物柴油技术领域，具体涉及一种利用兼养BG-11培养基培养微藻，之后利用糖蜜酒精废醪液自养诱导微藻油脂积累的方法。
背景技术
生物柴油俗称阳光燃料是一种长链脂肪酸单烷基酯，是以植物油脂、动物油脂、各种废弃油脂及微生物油脂等为原料，与短链醇(如甲醇、乙醇) 经过转酯反应制备获取的一种可代替石化柴油的含氧再生性清洁燃料。与常规柴油相比，它具有环保、可再生、易降解、燃烧后污染物排放低、温室气体排放低等特点。
近年来，微藻作为生产生物柴油的原料备受关注。微藻的生长模式主要有自养、异养和兼养。现在微藻主要采用光自养培养。但光自养培养模式具有使藻细胞生长周期过长、产率低、易染菌且采收成本高等特点。而兼养条件下因为有光照和有机碳源，可以大量的积累生物量，缩短藻细胞生长周期。但是兼养生物量产率和优质产率较低，因此兼养一般不适于积累油脂。
单针藻属于一种单细胞绿色微藻，它在胁迫条件下，比如高温、强光照、氮饥饿等，能够大量的积累油脂。糖蜜酒精废醪液对水环境会造成严重危害，但同时废液中含有大量农作物所需的营养物质，所以它又是一种宝贵的资源。据分析，废醪液中含有机物6%-8% 、P2O50.02%-0.04% 、K2O 0.6%- 1.2% 、总氮0.3%- 0.5%。而云南省甘蔗糖厂年产废醪液156万t，相当于含有机物约10.9t；P2O5约474t；K2O 约1.4t；总氮约6243t。如何对酒精废醪液进行经济且有效的治理，至今仍是糖厂污染治理的一个难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于兼养微藻油脂积累的方法，该方法为两阶段培养过程，具体为利用兼养BG-11培养基培养微藻，之后利用糖蜜酒精废醪液自养培养微藻油脂积累的方法；以诱导为主，促进微藻油脂含量和生物量的增加，该方法过程简单，生产成本低，具体包括以下步骤：
（1）以葡萄糖为碳源的BG-11基础培养基兼养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期收集藻细胞。
（2）制备诱导的培养基：将废醪液稀释后作为单针藻的基本培养基，然后向基础培养基中加入MgSO4·7H2O；调整PH值至6.8-7.1，配制成培养基。
（3）产油微藻培养：将步骤（2）所得培养基进行高压高温灭菌，接入步骤（1）中的产油单针藻，藻细胞浓度为0.9-1g/L，然后加入用无水乙醇溶解的褪黑素母液，培养基中褪黑素的最终浓度为10-1mol/L -10-4mol/L，并将藻液置于强光照下培养。
（4）制备生物柴油：将培养到稳定期的微藻富集，提取油脂，制备得到生物柴油。
优选的，本发明步骤（1）中基础培养基中葡萄糖的加入量为9-11g/L，培养单针藻的温度为23-26℃。
优选的，本发明步骤（1）中废醪液稀释3000-3200倍。
优选的，本发明步骤（2）中MgSO4·7H2O的加入量为283-293mg/L。
优选的，本发明步骤（3）中培养条件为：光照培养温度为23-26℃，光照强度为2500-4000lux，摇床转速为130-160r/min。
优选的，本发明步骤（4）制备生物柴油的具体步骤为：将培养液离心富集，离心条件为3400-3600r/min离心8-10min，并以蒸馏水反复洗涤2-3次后冻干，冻干藻粉中添加石英砂研磨20-30min，然后用氯仿与甲醇体积比为2:1的氯仿-甲醇的混合溶液进行油脂提取，重复提取3-4次后收集有机相进行浓缩，提取得到的油脂加入硫酸-甲醇溶液进行甲酯化制备得到生物柴油，其中硫酸与甲醇体积比为3:97。
本发明的有益效果是：
（1）本发明能节省碳源和氮源，提高了糖的利用率和转化率，降低了生产成本；废醪液实现零排放，有利于保护环境；将环境污染的处理和微藻的培养结合在一起，变废为宝。
（2）结果表明：利用光自养添加诱导子诱导兼养后的藻细胞积累油脂，发现添加外源褪黑素可有效促进异养微藻细胞中油脂的积累；通过此两阶段培养微藻的方法，既实现了微藻的快速高密度生长，又实现了微藻的高品质培养；当褪黑素浓度为10-3μmol/L时，藻细胞中油脂含量比对照组提高了26%，达到了54.85%；生物量提高了17%，达到了1.04g/L。
（3）本发明中产油微藻在兼养的BG-11培养基里面能够大量的积累生物量。之后能很好地在废醪液培养基中生长，不但解决了环境污染问题，而且将污染物转化为可再生的生物能源。用废醪液作为基本培养基培养微藻积累油脂为企业带来经济效益，完全可做到“变废为宝”，有着良好的废物利用前景。微藻在废醪液中不但能很好地生长，而且还能促进产油微藻油脂含量的增加；可能存在的作用机制是，废醪液里边的氮源、碳源能被微藻很好地吸收并利用，废醪液里边也可能存在促进微藻生长的作用因子。
附图说明
图1为实施例1中褪黑素含量不同的情况下微藻细胞中油脂的积累量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。
实施例1
一种基于兼养微藻油脂积累的方法，具体包括以下步骤：
（1）以葡萄糖为碳源的BG-11基础培养基兼养培养产油微藻Monoraphidiumsp. FXY-10，待单针藻生长至对数生长期后期收集藻细胞；葡萄糖的加入量为9g/L，培养单针藻的温度为26℃。
（2）制备诱导的培养基：将废醪液稀释3200倍后作为单针藻的基本培养基，然后向基础培养基中加入MgSO4·7H2O，加入量为287.8mg/L；调整PH值至6.8-7.1，配制成培养基。
（3）产油微藻培养：将步骤（2）所得培养基进行高压高温灭菌，接入步骤（1）中的产油单针藻，藻细胞浓度为0.9g/L，然后加入用无水乙醇溶解的褪黑素母液，培养基中褪黑素的最终浓度为10-3μmol/L，并将藻液置于强光照下培养；培养条件为：光照培养温度为25℃，光照强度为3500lux，摇床转速为150r/min。
（4）制备生物柴油：将培养到稳定期的微藻富集，将培养液离心富集，离心条件为3500r/min离心10min，并以蒸馏水反复洗涤2-3次后冻干，冻干藻粉中添加石英砂研磨20min，然后用氯仿与甲醇体积比为2:1的氯仿-甲醇的混合溶液进行油脂提取，重复提取3-4次后收集有机相进行浓缩，提取得到的油脂加入硫酸-甲醇溶液进行甲酯化制备得到生物柴油，其中硫酸与甲醇体积比为3:97。
控制其他条件不变，使培养基中褪黑素的最终浓度为0μmol/L、10-1μmol/L、10-2μmol/L、10-3μmol/L、10-4μmol/L。
结果分析：褪黑素含量不同的情况下微藻细胞中油脂的积累量如图1所示，由图可以看出，添加外源褪黑素可有效促进异养微藻细胞中油脂的积累；通过两阶段培养微藻的方法，既实现了微藻的快速高密度生长，又实现了微藻的高品质培养；当褪黑素浓度为10-3μmol/L时，藻细胞中油脂含量比对照组提高了26%，达到了54.85%；生物量提高了35%，达到了1.22g/L。
实施例2
一种基于兼养微藻油脂积累的方法，具体包括以下步骤：
（1）以葡萄糖为碳源的BG-11基础培养基兼养培养产油微藻Monoraphidiumsp. FXY-10，待单针藻生长至对数生长期后期收集藻细胞；葡萄糖的加入量为11g/L，培养单针藻的温度为23℃。
（2）制备诱导的培养基：将废醪液稀释3250倍后作为单针藻的基本培养基，然后向基础培养基中加入MgSO4·7H2O，加入量为293mg/L；调整PH值至6.8-7.1，配制成培养基。
（3）产油微藻培养：将步骤（2）所得培养基进行高压高温灭菌，接入步骤（1）中的产油单针藻，藻细胞浓度为1g/L，然后加入用无水乙醇溶解的褪黑素母液，培养基中褪黑素的最终浓度为10-4μmol/L，并将藻液置于强光照下培养；培养条件为：光照培养温度为26℃，光照强度为4000lux，摇床转速为160r/min。
（4）制备生物柴油：将培养到稳定期的微藻富集，将培养液离心富集，离心条件为3600r/min离心8min，并以蒸馏水反复洗涤2-3次后冻干，冻干藻粉中添加石英砂研磨20-30min，然后用氯仿与甲醇体积比为2:1的氯仿-甲醇的混合溶液进行油脂提取，重复提取3-4次后收集有机相进行浓缩，提取得到的油脂加入硫酸-甲醇溶液进行甲酯化制备得到生物柴油，其中硫酸与甲醇体积比为3:97；本实施例中藻细胞中油脂含量比对照组提高了22%，达到51.15%；生物量提高了25%，达到了1.12g/L。
Claims (6)
1.一种基于兼养微藻油脂积累的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以葡萄糖为碳源的BG-11基础培养基兼养培养单针藻，待单针藻生长至对数生长期后期收集藻细胞；
（2）制备诱导的培养基：将废醪液稀释后作为单针藻的基本培养基，然后向基础培养基中加入MgSO4·7H2O；调整PH值至6.8-7.1，配制成培养基；
（3）产油微藻培养：将步骤（2）所得培养基进行高压高温灭菌，接入步骤（1）中的产油单针藻，藻细胞浓度为0.9-1g/L，然后加入用无水乙醇溶解的褪黑素母液，培养基中褪黑素的最终浓度为10-1mol/L -10-4mol/L，并将藻液置于强光照下培养；
（4）制备生物柴油：将培养到稳定期的微藻富集，提取油脂，制备得到生物柴油。
2.根据权利要求1所述基于兼养微藻油脂积累的方法，其特征在于：步骤（1）中基础培养基中葡萄糖的加入量为9-11g/L，培养单针藻的温度为23-26℃。
3.根据权利要求1所述基于兼养微藻油脂积累的方法，其特征在于：步骤（1）中废醪液稀释3000-3200倍。
4.根据权利要求1所述基于兼养微藻油脂积累的方法，其特征在于：步骤（2）中MgSO4·7H2O的加入量为283-293mg/L。
5.根据权利要求1所述基于兼养微藻油脂积累的方法，其特征在于：步骤（3）中培养条件为：光照培养温度为23-26℃，光照强度为2500-4000lux，摇床转速为130-160r/min。
6.根据权利要求1所述基于兼养微藻油脂积累的方法，其特征在于：步骤（4）制备生物柴油的具体步骤为：将培养液离心富集，离心条件为3400-3600r/min离心8-10min，并以蒸馏水反复洗涤2-3次后冻干，冻干藻粉中添加石英砂研磨20-30min，然后用氯仿与甲醇体积比为2:1的氯仿-甲醇的混合溶液进行油脂提取，重复提取3-4次后收集有机相进行浓缩，提取得到的油脂加入硫酸-甲醇溶液进行甲酯化制备得到生物柴油，其中硫酸与甲醇体积比为3:97。
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