CN1654040A

CN1654040A - 苦荬菜属医药新用途及其药物中间体的制备方法

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Publication number: CN1654040A
Application number: CN 200410021125
Authority: CN
Inventors: 徐绥绪; 宋少江; 封锡志; 曹颖林; 路金才; 徐琲琲; 邹大光; 张国刚; 陈兆国; 张梅
Original assignee: Wei Zhenlin
Current assignee: Wei Zhenlin
Priority date: 2004-02-09
Filing date: 2004-02-09
Publication date: 2005-08-17
Anticipated expiration: 2024-02-09
Also published as: CN100462081C

Abstract

苦荬菜属医药新用途及其药物中间体的制备方法属医药卫生领域。本发明解决现有未发现苦荬菜属治疗心脑血管和白血病的新用途及其制备方法。苦荬菜属医药新用途的要点在于植物提取物，含倍半萜内酯及酚性物(含黄酮)，具有对循环系统增加冠脉流量、改善心肌循环、抑制血小板聚集作用、明显增加纤维蛋白的溶解酶的活性、抗脑梗塞等作用。其制备方法的要点在于中间体的制备采用水或醇类提取，通过大孔树脂和聚酰胺串联柱色谱方法制备，其中间体的总黄酮、总内酯的加和含量在60－95％。

Description

苦荬菜属医药新用途及其药物中间体的制备方法

技术领域：

本发明的技术领域属医药卫生领域。

背景技术：

菊科(Compositae)苦荬菜属(Ixeris genus)植物，全世界共有50余种，我国就有20余种，盛产于我国北方；东北、华北和内蒙古等地。具有清热解毒、消炎、止痛之功效。

苦荬菜属植物(例如抱茎苦荬菜Ixeris sonchifolia(Bge.)Hance；别名为苦碟子、满天星、秋抱茎苦荬菜Ixeris sonchifolia(Bge.)Hance Var.Serotina(Maxin.)Kitag，为抱茎苦荬菜的变种、苦荬菜Ixeris denticulate(Houtt.)Stebb、山苦荬菜Ixeris chinensis(Thunb.)Nakai，别名小苦卖菜、活血草等)，在我国有悠久的药用历史，应用于治疗阑尾炎、肠炎、头痛、牙痛等，主要药理作用有抗肿瘤、抗炎、镇痛、镇静及心血管方面的活性；分述如下：①抗肿瘤作用：苦荬菜属中很多植物具有抗肿瘤的作用。Ixerislaciniata在民间作为抗肿瘤草药使用，毕志明等人对它的化学成分和药理活性的研究结果表明，化合物11β，13-dihydrolactucin acetate有较强的细胞毒活性。抱茎苦荬菜的甲醇提取物对Ehrlich carcinoma癌细胞株有抑制活性。韩国学者发现Ixeris dentata的甲醇提取物对MG63人骨肉瘤细胞株有较强的抑制活性。②对心血管系统的药理作用：冯玉书等人证明，抱茎苦荬菜的提取物具有增加冠脉流量，增加心肌营养性血流量，降低心肌耗氧量，改善心肌循环等作用；对血液系统能显著抑制血小板聚集功能，明显增加纤溶酶的活性，而这些作用是防治血栓闭塞性疾病的基础。抱茎苦荬菜的提取物无论在有氧、不同程度缺氧以及无氧条件下，均能使心肌乳酸含量减少，这将减轻或防止心肌细胞酸中毒，有利于心肌细胞功能的恢复，这是抱茎苦荬菜用于治疗心肌梗塞的又一主要原因。③镇痛作用：药理实验表明，给雄性小鼠腹腔注射苦碟子注射液后，用热板法测定痛阈提高百分率，给药组动物痛阈比对照组有显著提高，表明苦碟子注射液具有镇痛作用④镇静作用：实验证明，苦碟子注射液具有明显镇静作用，可使小鼠自主活动显著减少，并能与催眠药戊巴比妥钠产生协同作用，但对中枢兴奋剂五甲烯四氮唑和苯甲酸钠咖啡因未见有明显的对抗作用。⑤降胆固醇作用：韩国学者发现苦荬菜(Ixeris dentata)的氯仿提取物具有显著的降低胆固醇水平的作用。对其进行进一步的研究后发现活性成分为三萜及甾醇的混合物：α-香树脂醇，β-香树脂醇，羽扇豆醇，伪蒲公英甾醇，蒲公英甾醇，β-谷甾醇，豆甾醇等。⑥抗诱变作用：韩国学者把苦荬菜(Ixerisdentata)用甲醇提取后，分别用环己烷，氯仿，乙酸乙酯，正丁醇依次萃取，然后将萃取各层与含水层一起进行抗黄曲霉毒素B(aflatoxin B)所致的诱变实验。筛选结果发现，氯仿层的活性最强，抑制率为74％。

自20世纪80年代以来，各国学者对苦荬菜属植物的化学成分进行了一系列的研究，发现主要有倍半萜内酯类、三萜类及黄酮类、香豆素、甾醇、木脂素、维生素、氨基酸和糖类等200余种化学成分。

其中开发成新药近有抱茎苦卖菜，文献报道该植物提取物对循环系统具有增加冠脉流量、改善心肌循环等作用；对血液系统能显著抑制血小板聚集作用，明显增加纤维蛋白溶解酶的活性，经多年研究已于20世纪80年代末开发成新药“碟脉灵注射剂”由于临床应用多年，疗效确切，于2002年12月1日升为国家标准，改名为“苦碟子注射液”(Kudiezi Zhusheye)批准文号为《WS-10354(ZD-0354)-2002》标准中发布其功能主治为活血止痛、清热祛瘀。用于瘀血闭阻的胸痹、证见、胸闷、心痛、口苦、舌暗红或存瘀斑等。适用于冠心病、心绞痛见上述病状者，亦可用脑梗塞者。标准中规定的中间体制法为经典的“石硫法”

另外三种药用植物仅有原植物药用报道和民间应用记载及其化学成分的分离鉴定等报道。总之，至今未发现苦荬菜属(除抱茎苦荬菜外)对治疗心脑血管病和白血病的的用途。

发明内容：

本发明解决现有未发现苦荬菜属治疗心脑血管和白血病的新用途及其制备方法。

医药新用途：

1.白血病细胞K₅₆₂的活性：

从苦荬菜属山苦荬[Ixeris chinensis(Thunb)Nakai]中分离得到木犀草素-7-O-龙胆二糖苷(Luteolin-7-O-gentiobiside)(I)芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(apigenin-7-O-D-glucuronopyranoside)(II)和木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(luteolin-7-O-glucuronopyranoside)(III)对人白血病细胞K₅₆₂由较强的抑制作用，K₅₆₂细胞用含5％小牛胎血清pMRI1640作基质培养而获得，利用MTT法，测定以上三种化合物，结果如下表。

表2苦荬菜属中有效成分的抗白血病细胞K₅₆₂的活性

Sample	Con.c/mM	OD(±s)	(nhibitory Ratel％)	P
Sample	Con.c/mM	OD(±s)	(nhibitory Ratel％)	P	Control(I)(II)(III)	盐水0.0850.1700.3400.0560.1120.2240.0410.0820.164	2.983±0.191.764±0.281.465±0.241.266±0.261.258±0.420.662±0.080.452±0.122.287±0.081.772±0.291.240±0.12	37.341.355.756.877.584.528.140.058.4	＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

2.苦荬菜属植物提取物的心血管作用

(1)苦碟子提取物静脉给药抗心肌缺氧作用的研究

将72只受试小鼠随机分成6组，每组12只雌雄各半，将受试小鼠用乌拉坦(1.2g/kg)腹腔注射麻醉、固定、颈前部手术暴露并游离气管，用MS·302多媒体化生物信号记录分析系统经针型电极与小鼠四肢相连，采集标II导联心电图，尾静脉穿刺注射给药，第1组对照组注射生理盐水，第2、3、4组为苦碟子提取物高中低剂量组，给药剂量分别为40mg/kg，20mg/kg，10mg/kg，第5组为苦碟子提取物灌胃给药组，剂量为20mg/kg，于夹闭气管前30分钟灌胃给药。第6组为碟脉灵注射液静脉注射组，给药剂量为1.625mg/kg，各组给药容积均为0.2ml/10g，给药速度为0.02ml/s于试验前用0.9％NaCl配制成所需浓度。受试小鼠给药后放入含有碱石灰的广口瓶中，用凡士林将瓶口密封，记录小鼠的死亡时间(min)。试验资料显著性测定用成对资料的t-test处理，试验结果如表3所示，在所选择剂量范围内，苦碟子提取物静脉注射给药和口服给药均明显延长小鼠存活时间，与对照组比较有显著和非常显著差异。

表3苦碟子提取物静脉注射对小白鼠存活时间(min)的影响( X±SD)

组别	剂量(mg/kg)	动物数(只)	死亡时间(min)
组别	剂量(mg/kg)	动物数(只)	死亡时间(min)	对照组苦碟子提取物iv苦碟子提取物iv苦碟子提取物iv苦碟子提取物ig苦碟子提取物iv	0.9％NaCl(0.2ml/kg)402010201.625	101010101010	35.3±4.0846.62±9.65^*45.9±11.1^44.12±9.30^44.0±9.80^45.0±10.26^*

各给药组与对照组比较^*P＜0.05 ^**P＜0.01

(2)苦碟子提取物抗心肌缺血作用的研究

①对麻醉犬急性心肌缺血的影响：

取30只杂种犬，体重在11.0-13.0公斤，每组5只雌雄兼用，随机分6组，分别为0.9％NaCl对照组，苦碟子提取物静脉给药高中低3个剂量组，剂量分别为8.8mg/kg、4.4mg/kg、2.2mg/kg和4.4mg/kg经十二指肠给药组及碟脉灵注射液0.33mg/kg静脉给药组。各给药组均于给药前用0.9％NaCl配制所需浓度药液。

受试动物在戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉麻醉下，先剖开一侧股静脉备给药用，再行气管插管，人工呼吸、呼吸频率为30次/分，呼吸时比为1.5∶1，潮气量为300ml。动物在右侧卧位人工呼吸下，于左侧第4-5胁间开胸，在距迷走神经2cm处，沿迷走神经剪开心包壁层做悬床(缝于胸壁)暴露心脏，在冠状动脉左前降支近1/2处，从冠状动脉下引线备结扎用。将心外膜电极缝于心外膜上，经波段开关连于EK10型单道自动心电图机上，记录心外膜电图^[5]，计算30个导联ST移位的总和(∑-ST)及ST移位超过1mV的导联数(N-ST)以结扎后15分钟时为给药前值。各组犬从股静脉分别滴入相应剂量的受试药物，给药容积为3ml/kg。给药速度为2ml/分。同时记录给药后30、60、120、180分钟心外膜电图，计算∑ST，N-ST及其变化率；于冠状动脉结扎前，结扎后60分，120分和180分别从股静脉采血化验肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)活力。给药后3小时，取下心脏称重后剪除心房及右室称左室重、冰冻30-40分钟，于冠脉结扎点下、与冠状沟平行将心室肌切成等厚的5片，将5片心室肌置于37℃1％N-BT染液中、振摇染色15分钟取出，梗死区染成浅红色，非梗死区为暗红色，计算梗死区占缺血心室、心脏重量的百分比。

试验结果表明苦碟子提取物静脉给药对冠状动脉结扎犬心肌缺血有明显改善作用，表现为：1.各给药组给药后心外膜电图ST段位移总和(∑ST)及ST移位超过1mV导联数(N-ST)的变化率与对照组各对应时间点上述两指标变化率之间有非常显著或显著差异，(详见表4、5)。2.各给药组于结扎冠状动脉后给药的不同时间点CK、LDH变化率与对照组相应各点CK、LDH变化率之间亦有非常显著或显著差异(详见表6、7)。3.心肌梗死范围的定量组织学测定结果表明：各给药组梗死心肌重量/心室重量百分比、梗死心肌重量/全心重量百分比明显低于对照组，其间有非常显著或显著差异(详见表8)

表4苦碟子提取物静脉注射给药对麻醉开胸犬结扎冠脉后心外膜电图S-T段总和(∑ST)影响(mv， X±SD，n＝6)

组别	剂量mg/kg 统计指标	给药前	给药后
		给药前	给药后	60 120 180
		对照组苦碟子提取物静滴苦碟子提取物静滴苦碟子提取物静滴苦碟子提取物经十二指肠给药苦碟子提取物静滴	0.9％NS1.0ml/kg 变化率(％)8.8变化率(％)4.4变化率(％)2.2变化率(％)4.4变化率(％)0.33变化率(％)	60 120 180	41.24±11.7244.97±24.6242.67±28.5837.14±7.9043.08±26.7443.90±29.68	47.08±14.23 49.90±15.05 48.25±14.6213.83±5.76 20.83±8.63 16.83±8.4539.50±18.89 28.99±13.43 28.60±03.18-10.05±5.90^ -33.97±9.37^ -34.79±8.95^39.11±26.38 36.97±22.90 36.22±22.07-8.91±5.43^ -11.64±3.51^ -13.14±4.18^35.29±7.37 34.30±7.23 34.64±7.03-4.89±0.91^ -7.60±1.21^ -6.57±3.08^41.29±25.46 45.67±26.97 44.17±25.58-3.69±4.12^ 7.84±9.80 4.68±9.6139.00±23.56 33.60±16.25 35.56±17.26-8.62±5.26^ -17.14±12.21^ -12.27±14.12^**

各给药组与生理盐水对照组同时间点给药前后变化率比较变化率＝(给药后值-给药前值/给药前值×100％)比^*P＜0.05 ^**P＜0.01

表5苦碟子提取物静脉注射给药对麻醉开胸犬结扎冠脉后心外膜电图N-ST(mv X±SD)的影响

组别	剂量mg/kg	统计指标	给药前	给药后
				给药后	60 120 180
				对照组苦碟子提取物静滴苦碟子提取物静滴苦碟子提取物静滴苦碟子提取物经十二指肠给药碟脉灵注射液静滴	60 120 180	0.9％NaCl1.0ml/kg8.84.42.24.40.33	X±SD％X±SD％X±SD％X±SD％X±SD％X±SD	17.2±3.918.2±4.017.0±7.016.2±5.316.0±5.114.0±7.4	19.2±5.510.0±11.016.6±4.5-9.1±9.6^16.0±8.3-9.5±17.414.4±5.0-11.2±9.1^16.0±4.41.3±6.813.4±7.1-4.1±4.6^*	20.6±5.6 19.6±5.018.51±12.0 13.4±12.59.4±6.9 9.6±6.0-51.6±31.5^ -49.5±25.9^13.4±8.9 13.4±9.3-27.4±19.6^ -28.1±22.1^14.4±5.6 14.0±5.3-11.9±9.7^ -14.5±7.2^16.8±4.6 16.8±4.66.5±8.2 6.5±8.212.0±5.2 12.4±5.1-11.1±8.6^** -7.7±13.5^*

表6苦碟子提取物静脉给药对犬血清肌酸酶CK的影响

组别剂量	统计指标	药前	药后(min)
			药后(min)		60	180
			对照组 0.9％NaCl10ml/kg苦碟子提取物静滴 8.8苦碟子提取物静滴 4.4苦碟子提取物静滴 2.2苦碟子提取物经 4.4十二指肠给药碟脉灵注 0.33射液静滴	X±SD变化率(％)X±SD变化率(％)X±SD变化率(％)X±SD变化率(％)X±SD变化率(％)X±SD变化率(％)	60	180	811.8±6.7.6966.0±73.9745.8±91.1699.4±100.5748.2±88.7741.8±74.6	1442.2±84.377.9±4.51306.2±63.435.5±5.7^*1238.4±88.266.9±8.7^1221.2±117.875.6±9.21254.8±99.568.4±8.71268.4±109.871.3±8.1	2732.4±160.7237.1±9.62403.2±298.6148.0±13.4^*1608.6±115.7117.6±24.82019.6±272.9189.3±10.4^2201.0±343.8193.1±14.1^2104.0±215.2183.7±11.6^*

与对照细比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

表7苦碟子提取物静脉给药对结扎冠状动脉犬乳酸脱氧酶的影响

组别剂量	统计指标	药前	药后(min)
			药后(min)		60	180
			对照组 0.9％NaCl1ml/kg注射用碟脉通静滴 8.8注射用碟脉通静滴 4.4注射用碟脉通静滴 2.2注射用碟脉通经 4.4	X±SD变化率(％)X±SD变化率(％)X±SD变化率(％)X±SD变化率(％)X±SD	60	180	122.2±30.2135.6±7.6120.2±23.4109.8±23.9127.6±18.5	171.2±323.242.9±18.7167.0±20.122.8±8.5^*150.4±28.025.4±8.2153.8±19.742.9±16.8158.8±22.3	296.8±37.4150.9±44.8291.8±27.2114.8±9.1244.6±18.0108.7±38.2246.0±14.5132.6±50.8276.4±21.6

十二指肠给药碟脉灵注 0.33射液静滴

变化率(％)X±SD变化率(％)

110.0±33.6

24.6±2.2131.1±35.919.6±10.6^*

118.4±21.2267.1±29.8156.3±70.9

与对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

表8苦碟子提取物静脉注射给药对结扎冠状动脉犬心肌梗死面积( X±SD n＝5)的影响

组别	剂量/(mg/kg)	梗死心肌重/室重(％)	梗死心肌重/全心重(％)
组别	剂量/(mg/kg)	梗死心肌重/室重(％)	梗死心肌重/全心重(％)	对照组苦碟子提取物静滴苦碟子提取物静滴苦碟子提取物静滴苦碟子提取物经十二指肠给药碟脉灵注射液静滴	0.9％NaCl1.0mg/kg8.84.42.24.40.33	30.61±4.6515.36±2.96^19.41±3.85^22.97±4.10^25.76±3.2220.75±1.99^*	18.99±3.008.71±2.10^11.72±1.79^13.39±2.36^16.33±3.1711.62±1.86^*

与对照组比较，^*P＜0.05 ^**P＜0.01

②对异丙肾上腺素诱发的大鼠急性心肌缺血的影响将60只大鼠随机分组每组10只，分别为模型对照组；秋抱茎苦荬菜提取物静注给药高中低剂量组给药剂量分别为30mg/kg、15mg/kg、7.5mg/kg；15mg/kg灌胃给药组；阳性对照组为碟脉灵注射液剂量为mg/kg，对照组静注0.9％NaCl。受试药物及对照组均用0.9％NaCl配制成所需浓度，给药容积为10ml/kg，注射速度为2ml/min。

受试动物用乌拉坦腹腔注射麻醉(1.2g/kg)，呈仰卧位固定、用针型电极与光电6511型心电图机相连记录标II导联与V₁导联。按上述剂量静脉给药后即皮下注射异丙肾上腺素，剂量为2mg/kg。观察给药后第5′、10′、20′、30′心电图中ST段偏移基线的高度。以均值做为衡量心肌损伤程度的观察指标，进行统计与显著性测定。

结果表明，静脉注射秋抱茎苦荬菜提取物对异丙肾上腺素皮下注射引起心肌代谢加强导致心肌缺血ST段的偏移有明显缓解作用。详见表9。

表9秋抱茎苦荬菜提取物静脉注射对异丙肾上腺素诱发心肌缺血的影响( X±SD，n＝10)

组别	剂量(mg/kg)	标II导联∑S-T总偏移值mv
组别	剂量(mg/kg)	标II导联∑S-T总偏移值mv	对照组秋抱茎苦荬菜提取物iv秋抱茎苦荬菜提取物iv秋抱茎苦荬菜提取物iv秋抱茎苦荬菜提取物ig碟脉灵注射液	0.9％NaCl5.0mg/kg30157.5150.33	0.73±0.150.38±0.24^0.48±0.24^0.51±0.24^0.44±0.13^0.46±0.23^*

各给药组与对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

3.苦卖菜属植物单体化合物的细胞毒活性我们对从苦卖菜属植物中分离得到的22个化合物进行了细胞毒活性的测试，并对构效关系进行了初步探讨。

实验材料及细胞培养

A375(人黑色素瘤细胞)，L929(小鼠肺上皮细胞)，HeLa(人宫颈癌细胞)均来源于美国ATCC(American Tissue Culture Collection)，均用RPMI-1640培养液培养，加入10％的胎牛血清，1％的抗生素(10,100U/ml青霉素和10,000μg/ml链霉素)，2mM谷氨酰胺，置于4％CO₂孵箱内培养。样品：从苦卖菜属植物中提取分离的各个单体化合物：抱茎苦荬菜内酯A(sonchifolactone A)(1)，抱茎苦荬菜内酯B(sonchifolactone B)(2)，抱茎苦荬菜内酯C(sonchifolactone C)(3)，抱茎苦荬菜内酯D(sonchifolactone D)(4)，抱茎苦荬菜木脂素A(sonchifolignan A)(5)，抱茎苦荬菜木脂素B(sonchifolignan B)(6)，抱茎苦荬菜素(sonchifolinin)(7)，木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷乙酯(luteolin-7-O-β-D-glucuronopyranoside ethyl ester)(8)，蒲公英烷-20-烯-3β，16α-二羟基-3-乙酯(taraxastane-20-ene-3β，16α-dihydroxy-3-acetate)(9)，苦荬菜皂苷A(ixeris saponin A)(10)，苦荬菜皂苷B(ixeris saponin B)(11)，苦荬菜皂苷C(ixeris saponin C)(12)，苦荬菜皂苷D(ixeris saponin D)(13)，木犀草素(luteolin)(14)，木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(luteolin-7-O-β-D-glucopyranoside)(15)，木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(luteolin-7-O-β-D-glucuronopyranoside)(16)，木犀草素-7-O-龙胆二糖苷(luteolin-7-O-gentiobiside)(18)，芹菜素(apigenin)(20)，芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷(apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside)(21)，芹菜素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(apigenin-7-O-β-D-glucuronopyranoside)(22)，5，7-二羟基-4’-甲氧基黄酮-7-O-芦丁糖苷(5，7-dihydroxy-4’-methoxy-flavone-7-O-rutinoside)(24)，齐墩果酸(oleanlic acid)(25)，蒲公英甾醇乙酸酯(taraxasterylacetate)(26)。

依次配制浓度为：1μg/ml，5μg/ml，20μg/ml，50μg/ml，100μg/ml。噻唑蓝(MTT)：北京宝泰克公司；RPMI-1640：Gibco公司，美国；胎牛血清(FBS)：大连生物试剂厂；青、链霉素：华北制药股份公司；胰蛋白酶：北方同正公司；谷氨酰胺：北京宝泰克公司。

对22种单体化合物进行了抗肿瘤活性体外筛选，结果见表10。

从表中可以看出，苦卖菜属植物中的各类化合物中，倍半萜内酯类(如化合物2)和三萜皂苷类化合物(如化合物11)有较明显的体外抗肿瘤活性，而黄酮类、木脂素类和三萜皂苷元基本没有抗肿瘤活性。

在倍半萜内酯类化合物中，化合物2的活性最强(IC₅₀ 11.0μg/ml左右)，对化合物1，2，3，4的结构进行比较，推测化合物2是由于其苷元结构中存在α-甲烯基-γ-内酯的结构而活性较强。当双键被还原后，活性大为降低，IC₅₀值降低为30-40μg/ml(如化合物1，3)。

在三萜皂苷类化合物中，化合物11和12的活性明显比10和13强。分析它们的结构时发现，很可能是11和12的结构中在C-28位成酯苷而导致了活性比C-28为游离羟基的皂苷10和13强。

在黄酮类化合物中，除了木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(15)呈中等的细胞毒性外，其它的化合物包括苷元、单糖苷、二糖苷均没有活性。化合物7表现出显著的细胞毒性，因此，我们利用荧光染色法进行了进一步的研究。结果发现化合物7能够诱导HeLa细胞凋亡。DAPI是一种荧光染料，它能与细胞DNA特异性的结合，并在一定波长的紫外光的激发下发出绿色荧光。将经化合物7处理的HeLa细胞进行DAPI染色后，发现HeLa细胞皱缩，细胞核变形，染色质凝集，呈典型的凋亡特征；而阴性对照组的细胞生长状况良好。

Table 10 Cytotoxic Activity of Natural Products against Tumor Cell Lines in vitro(IC₅₀，μ

g/ml)

Compound	A375	L929	HeLa
Compound	A375	L929	HeLa	12345678910111213141516182021242526CPM	34.8±11.213.2±1.628.2±11.538.5±13.2＞100＞1005.2±0.1＞100＞10043.28.8±2.632.3±14.8＞100＞10036.7±9.2＞100＞100＞100＞100＞100＞100＞1001.10±0.2	35.2±8.810.5±2.232.8±8.431.9±8.4＞100＞1004.1±2.2--＞10012.1±4.545.2±5.3＞100＞10055.2±25.7＞100＞100＞100＞100＞100＞100＞1000.85±0.4	------4.6±0.4--＞100----42.6±13.7-------0.46±0.2

倍半萜内酯和酚性化合物中的新化合物

表1 Constituents isolated from Ixeris genus

苦卖菜属提取制备中间体的工艺方法

A、药材浸泡及煎煮

(A)将苦卖菜属原料(药材)切段，按原料与自来水的重量分数比为1∶9～15向原料中加入自来水，常温浸泡1～3小时，然后将两者的混合物加热至70℃～100℃，保温1～3小时之后，滤渣取液。

(B)按所述苦卖菜属原料与自来水的重量分数比为1∶6～10向A步(A)滤出的渣中加入自来水，并将两者混合物加热至70℃～100℃，保温1～2.5小时之后，滤渣取液。

(C)按所述苦卖菜属原料与自来水的重量分数比为1∶6～8向A步(B)滤出的渣中加入自来水，并将两者混合物加热至70℃～100℃，保温1～1.5小时后，滤渣取液。

(D)或者采用50～95％乙醇和甲醇提取液，回收醇至无醇味或10％含醇量以下。

B、液体浓缩

将分别通过所述各A步(A)、(B)、(C)、(D)制取的液体混合一起后减压浓缩，直至其重量与所述原料重量之比为1∶1～5为止。

C、吸附、洗脱

使浓缩后的液体通过经活化处理后的大孔树脂柱，使液体中的总黄酮被树脂柱吸附，并弃去流出液，再按原料重量的1∶1～3的蒸馏水冲洗树脂柱，弃去流出液。继用浓度为10～60％的乙醇清洗树脂柱，并收集洗脱液。将此洗脱液通过已处理好的聚酰胺柱，并用原料量1～2倍的80％乙醇洗脱，收集流出液和洗脱液。

D、去杂

将C中收集的洗脱液，用浓度为95％的乙醇加入其中，直至洗脱液的乙醇浓度为80％，然后，使该混合液通过澄渣板过滤，去杂并收集滤液。

E、成品回收、干燥

回收工序D制得滤液中的乙醇，余留物质干燥后，即可得到制备中间体的成品。

本发明实现后与已有技术相比具有以下优点：

1.成本低

2.杂质含量低

3.工艺稳定，易于操作，易于实现

4.生产过程对环境无污染

中间体制备实施例

实施例1(原料为抱茎苦卖菜)

A、浸泡及煎煮

(A)取切段的苦碟子全草10Kg加入容器中，再向容器中加入自来水150升，常温浸泡2小时，然后，将两者的混合物加热至100℃，保温2小时。

(B)向A步(A)滤出的渣中加入自来水100升，并将两者混合

物加热至95℃，保温1小时之后，滤渣取液。

(C)向A步(B)滤出的渣中加入自来水80升，并将两者混合物

加热至95℃，保温1小时之后，滤渣取液。

B、液体浓缩

将分别通过上述各步(A)、(B)、(C)制取的液体，混合一起后，减压浓缩，直至其浓缩至20升为止。

C、吸附、洗脱

使浓缩后的液体通过经活化处理后的大孔树脂柱，使液体中的总黄酮被树脂柱吸附，并弃去流出液，再用0.5升蒸馏水冲洗树脂柱，弃去流出液，继用浓度60％的乙醇清洗树脂柱，并收集洗脱液。将此洗脱液通过已处理好的聚酰胺柱，并用原料量2倍的80％乙醇洗脱，收集流出液和洗脱液。

D、去杂

将C中收集的洗脱液，用浓度为95％的乙醇加入其中，直至洗脱液的乙醇浓度为80％，然后使该混合液通过澄渣板过滤，去杂并收集滤液。

E、成品回收、干燥

回收工序D制得滤液中的乙醇，余留物质干燥后，即可得到制备中间体。

实施例2(原料为秋抱茎苦荬菜)

A、浸泡及煎煮

(A)取切段的秋抱茎苦荬菜全草10Kg加入容器中，再向容器中加入自来水120升，常温浸泡2小时，然后，将两者的混合物加热至100℃，保温2小时。

(B)向A步(A)滤出的渣中加入自来水100升，并将两者混合

物加热至90℃，保温1.5小时之后，滤渣取液。

(C)向A步(B)滤出的渣中加入自来水80升，并将两者混合物

加热至85℃，保温1小时之后，滤渣取液。

B、液体浓缩

C、吸附、洗脱

使浓缩后的液体通过经活化处理后的大孔树脂柱，使液体中的总黄酮被树脂柱吸附，并弃去流出液，再用0.5升蒸馏水冲洗树脂柱，弃去流出液，继用浓度50％的乙醇清洗树脂柱，并收集洗脱液。将此洗脱液通过已处理好的聚酰胺柱，并用原料量2倍的70％乙醇洗脱，收集流出液和洗脱液。

D、去杂

E、成品回收、干燥

实施例3(原料为苦荬菜)

A、浸泡及煎煮

(A)取切段的苦荬菜全草10Kg加入容器中，再向容器中加入自来水150升，常温浸泡2小时，然后，将两者的混合物加热至95℃，保温1.5小时。

(B)向A步(A)滤出的渣中加入自来水100升，并将两者混合

物加热至90℃，保温2小时之后，滤渣取液。

(C)向A步(B)滤出的渣中加入自来水60升，并将两者混合物

加热至80℃，保温1.5小时之后，滤渣取液。

B、液体浓缩

C、吸附、洗脱

使浓缩后的液体通过经活化处理后的大孔树脂柱，使液体中的总黄酮被树脂柱吸附，并弃去流出液，再用0.5升蒸馏水冲洗树脂柱，弃去流出液，继用浓度55％的乙醇清洗树脂柱，并收集洗脱液。

D、去杂

E、成品回收、干燥

实施例4(原料为山苦荬菜)

A、浸泡及煎煮

(A)取切段的山苦荬菜全草10Kg加入容器中，再向容器中加入自来水100升，常温浸泡2.5小时，然后，将两者的混合物加热至100℃，保温2小时。

(B)向A步(A)滤出的渣中加入自来水100升，并将两者混合

物加热至95℃，保温2小时之后，滤渣取液。

(C)向A步(B)滤出的渣中加入自来水60升，并将两者混合物

加热至80℃，保温1.5小时之后，滤渣取液。

B、液体浓缩

C、吸附、洗脱

使浓缩后的液体通过经活化处理后的大孔树脂柱，使液体中的总黄酮被树脂柱吸附，并弃去流出液，再用0.5升蒸馏水冲洗树脂柱，弃去流出液，继用浓度50％的乙醇清洗树脂柱，并收集洗脱液。

D、去杂

E、成品回收、干燥回收工序D制得滤液中的乙醇，余留物质干燥后，即可得到制备中间体。

本发明药物的剂型：

1.注射用苦碟子(冻干)

抱茎苦荬菜提取物中间体50～200g

(相当总黄酮、总内酯总含量标示量90～110％)

甘露醇适量作支持剂

制成冻干粉针剂1000支

制法：在无菌条件下(或超净化工作台内操作)将处方量提取物和支持剂，加注射用水，加热溶解，加注射用活性炭，加热过滤，-40℃分装1000支，冷冻后，升温，冻干为止。

性状：本品为灰黄白色无定形粉末或疏松固体状物，味苦涩，有一定引湿性。

功能与主治：活血止痛、清热祛瘀，用于冠心病、心绞痛证见胸闷、心痛、口苦、舌暗红活存瘀斑等，亦可用与脑梗塞者。

2.抱茎苦荬菜输液剂

抱茎苦荬菜提取物中间体50～200g

(相当标示量的90～110％)

葡萄糖等赋形剂适量

制成PVP塑胶袋或输液瓶1000支

制法：将出方量中间体和附形剂、溶剂、加注射用水、加热溶解、加注射用活性炭、加热、滤过、分装即得。

性状：本品为浅黄淡色澄明液体，味苦涩。

功能与主治同实施例1。

3.抗脑塞片

苦荬菜提取的中间体80～400g

(含内酯、酚性物含量占50％以上)

赋形剂是量(乳糖、淀粉)

制成1000片

制法：将处方量中间体(提取物)与赋形剂混匀，湿法或一步制粒，若湿法制粒在60～80℃干燥，将颗粒整粒后加适量润滑剂压制成1000片，色衣或薄膜色衣即得。

性状：剥去糖衣或薄膜后为棕黄色粉末，味苦，涩。功能与主治：同实例1、2。另外可适用于慢性阑尾炎的消炎、止痛。

4.白血平胶囊剂

山苦荬提取的中间体80～400g

(含内酯总黄酮在50％以上，为标示量90～110％)

赋形剂适量

制成1000粒

制法：将处方量中间体混匀获制成颗粒，装入胶囊中即得。

性状：本品内容物为黄褐色无定形或疏松固体颗粒状物，味苦涩，有引湿性。功能与主治：清热、解毒、消肿止痛、散瘀。用于冠心病、心绞痛和脑梗塞证见胸闷、手肢麻木及白血病的辅助治疗等。

5.心脑舒平和剂(口服液)

秋抱茎苦荬菜提取的中间体80～400g

赋形剂(蜂蜜、乳糖等)适量

制成1000支

制法：将处方量中间体和赋形剂，加适量水，加热溶解，加入单糖浆和蜂蜜、苯甲酸等防腐剂，再加水适量，滤过分装至10000ml，冷藏，滤过，分装于10ml安瓶中或50ml安瓶中，以100℃无菌30分钟即得。

功能与主治：同实施例1

6.苦碟子颗粒剂(无糖型)

抱茎苦荬菜提取的中间体80～400g

(含内酯与总黄酮量在50％以上，标示量的90～110％)

赋形剂适量

制成1000袋

制法：将处方量提取物的中间体与赋形剂混匀，湿法制粒或一步制粒，若湿法制粒时于60～80℃干燥，将干颗粒进行整粒处理后，分装于1000袋即得。

性状：本品为黄浅棕白色疏松状颗粒味苦、涩。

功能与主治：同实施例1。

含量测定方法和指标

(1)以苦卖菜属中指标性成分腺苷及木犀草素7-O-糖苷为对照品，建立了植物提取物的薄层色谱鉴别方法。

(2)采用HPLC法对本属药材提取物中间体的有效成份抱茎苦荬菜内酯A进行含量测定，并以比色法测定了制剂的总黄酮含量，中间体中有效成分加和含量80％以上可测，提取物中间体抱茎苦荬菜内酯A的含量不得少于1％。

(3)以木犀草素7-O-糖苷为参照物，制定了药材、中间体的指纹图谱。所制定的质量标准保证了药品质量的可控性和重现性。

Claims

1.苦荬菜属医药新用途，其特征在于植物提取物，含倍半萜内酯及酚性物(含黄酮)，具有对循环系统增加冠脉流量、改善心肌循环、抑制血小板聚集作用、明显增加纤维蛋白的溶解酶的活性、抗脑梗塞等作用。

2.苦荬菜属中的九种新化合物的结构如下：

3.苦荬菜属药物中间体的制备方法，其特征在于中间体的制备采用水或醇类提取，通过大孔树脂和聚酰胺串联柱色谱方法制备。

4.根据权利要求2所述的苦荬菜属药物中间体的制备方法，其特征在于：

A、药材浸泡及煎煮

B、液体浓缩

C、吸附、洗脱使浓缩后的液体通过经活化处理后的大孔树脂柱，使液体中的总黄酮被树脂柱吸附，并弃去流出液，再按原料重量的1∶1～3的蒸馏水冲洗树脂柱，弃去流出液。继用浓度为10～60％的乙醇清洗树脂柱，并收集洗脱液。将此洗脱液通过已处理好的聚酰胺柱，并用原料量1～2倍的80％乙醇洗脱，收集流出液和洗脱液。

D、去杂