CN111297849A - 用于治疗喉癌的药物组合物、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗癌药物技术领域，具体而言，涉及用于治疗喉癌的药物组合物、其制备方法及其应用。药物组合物的活性成分包括穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、扁柏双黄酮、竹柏双黄酮A、7‑去甲基银杏双黄酮和7,4',7”,4”'‑四甲氧基穗花杉双黄酮。该药物组合物对于治疗喉癌有良好的效果。

Description

用于治疗喉癌的药物组合物、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及抗癌药物技术领域，具体而言，涉及用于治疗喉癌的药物组合物、其制备方法及其应用。

背景技术

传统中医药是我国宝贵的文化遗产，为人类健康事业做出了巨大贡献。我国拥有丰富的中草药资源和几千年利用天然药物防病治病的临床经验，但是对于有些天然药物的药理作用或者其应用仍有可探索的空间。例如，江南卷柏别名“石柏”、“岩柏草”、“黄疸卷柏”等，来源为卷柏科植物江南卷柏(Selaginella moellendorfii Hieron)的全草。植物形态多年生常绿草本，具有强大的生物活性。江南卷柏主要分布于长江以南各地、北至陕西南部，生于林下或溪边。江南卷柏，有作为民间草药使用的记载，能清热利尿，活血消肿。用于急性传染性肝炎、胸胁腰部挫伤、全身浮肿、血小板减少。而现有技术中对江南卷柏的药理作用报道不多，特别是关于其双黄酮富集物的相关研究较少。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供用于治疗喉癌的药物组合物、其制备方法及其应用。本发明提供一种药物组合物其能够用于治疗喉癌。

本发明是这样实现的：

第一方面，实施例提供一种用于治疗喉癌的药物组合物，所述药物组合物的活性成分包括穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、扁柏双黄酮、竹柏双黄酮A、7-去甲基银杏双黄酮和7,4',7”,4”'-四甲氧基穗花杉双黄酮。

在可选的实施方式中，所述活性成分包括双黄酮富集物；

优选地，所述活性成分包括江南卷柏双黄酮富集物，所述江南卷柏双黄酮富集物包括穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、扁柏双黄酮、竹柏双黄酮A、7-去甲基银杏双黄酮和7,4',7”,4”'-四甲氧基穗花杉双黄酮。

在可选的实施方式中，所述穗花杉双黄酮、所述银杏双黄酮、所述扁柏双黄酮、所述竹柏双黄酮A、7-去甲基银杏双黄酮和所述7,4',7”,4”'-四甲氧基穗花杉双黄酮的质量比为42～76：5～15：3～9：1～7：6～17：1～7；优选为52.7:7.8:4.7:2.3：8.2:2.5。

第二方面，实施例提供如前述实施方式任一项所述的用于治疗喉癌的药物组合物的制备方法，包括对原料进行提取得到含有穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、扁柏双黄酮、竹柏双黄酮A、7-去甲基银杏双黄酮和7,4',7”,4”'-四甲氧基穗花杉双黄酮的所述药物组合物；

优选地，对江南卷柏进行提取得到含有所述活性成分的所述药物组合物；

优选地，提取包括：将所述江南卷柏与醇溶剂混合浸泡形成粗提物；而后再依次利用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇对所述粗提物进行萃取，并分别收集对应的萃取液；

接着，对乙酸乙酯萃取液进行纯化形成江南卷柏双黄酮富集物，所述江南卷柏双黄酮富集物包括穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、扁柏双黄酮、竹柏双黄酮A、7-去甲基银杏双黄酮和7,4',7”,4”'-四甲氧基穗花杉双黄酮；

优选地，醇溶剂为一元醇，优选为乙醇；

优选地，形成所述江南卷柏双黄酮富集物包括利用树脂对所述乙酸乙酯萃取液内的成分进行吸附，而后再进行梯度洗脱，并收集洗脱液形成所述江南卷柏双黄酮富集物；

优选地，梯度洗脱包括利用不同质量浓度的水-醇溶剂进行洗脱。

第三方面，实施例提供如前述实施方式任一项所述的用于治疗喉癌的药物组合物在制备用于治疗喉癌的药物中的应用；

优选地，所述药物组合物为诱导喉癌细胞凋亡的药物；

优选地，所述药物组合物为抑制细胞迁移能力的药物。

在可选的实施方式中，所述药物组合物为通过影响线粒体凋亡信号转导通路，而后诱导喉癌细胞凋亡的药物；

优选地，所述药物组合物为通过下调Bcl-2蛋白的表达水平和/或上调Bax蛋白的表达水平，而后影响所述线粒体凋亡信号转导通路的药物；

或者，所述药物组合物为通过上调Caspase-3和Caspase-9的表达水平来影响所述线粒体凋亡信号转导通路的药物。

在可选的实施方式中，所述药物组合物为通过影响JAK-STAT信号通路来诱导所述喉癌细胞凋亡的药物；

优选地，所述药物组合物为通过下调STAT3蛋白的磷酸化水平，继而影响所述JAK-STAT信号通路的药物。

在可选的实施方式中，所述药物组合物为通过影响Akt/NF-κB信号通路来诱导所述喉癌细胞凋亡的药物；

优选地，所述药物组合物为通过下调Akt蛋白的磷酸化水平和NF-κB蛋白来影响所述Akt/NF-κB信号通路的药物。

第四方面，实施例提供如前述实施方式任一项所述的用于治疗喉癌的药物组合物在制备抑制以下(1)-(3)至少一种通路的调节药物中的应用；

(1)活化线粒体凋亡信号转导通路；

(2)抑制JAK-STAT信号通路；

(3)抑制Akt/NF-κB信号通路。

第五方面，实施例提供如前述实施方式任一项所述的用于治疗喉癌的药物组合物在制备实现(a)-(c)至少情况的调节药物中的应用；

(a)上调(4)-(6)至少一种蛋白的表达水平，其中(4)为Bax蛋白，(5)为Caspase-3以及(6)为Caspase-9蛋白；

(b)下调(7)-(8)至少一种蛋白的表达水平，其中，(7)为NF-κB蛋白以及(8)为Bcl-2蛋白；

(c)下调(9)-(10)至少一种蛋白的磷酸化水平，其中，(9)为STAT3蛋白以及(10)为Akt蛋白。

本发明具有以下有益效果：本发明通过采用含有穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、扁柏双黄酮、竹柏双黄酮A、7-去甲基银杏双黄酮和7,4',7”,4”'-四甲氧基穗花杉双黄酮的活性成分能够诱导诱导癌细胞凋亡，继而对于喉癌有良好的治疗效果，可以用于制备抗喉癌药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例提供的江南卷柏双黄酮富集物的提取的流程示意图。

图2为本发明实验例1提供的检测结果图。

图3为本发明实验例2提供的检测结果图；其中，A和C表示两种喉癌细胞系分别用SM-BFRE(0、5、10和20μg/mL)处理后的0、12和24小时的显微照片，并用Image J软件计算伤口愈合试验中的相对伤口表面积，B和D表示通过western blot法检测MMP-9蛋白的表达，并通过Image Lab软件计蛋白相对表达量。

图4为本发明实验例3提供的检测结果图；其中，A和C表示两种喉癌细胞系经SM-BFRE(0、10、30和50μg/mL)处理24h后的形态变化，B和D表示用SM-BFRE(0、10、30和50μg/mL)处理24小时并在荧光显微镜下观察用Hoechst 3328染色的两种喉癌细胞系的变化。

图5本发明实验例4提供的检测结果图；其中，A和C表示Hep-2和TU212细胞用SM-BFRE(0、10、30和50μg/mL)处理24小时，用Annexin V-FITC和PI染色细胞，并通过流式细胞仪检测细胞凋亡的比例，B和D表示通过流式细胞仪检测后，在荧光显微镜下观察用SM-BFRE(0和50μg/mL)处理后的喉癌细胞的凋亡情况。

图6本发明实验例5提供的检测结果图；其中，A和B表示通过Western blot法检测两种喉癌细胞系用SM-BFRE(0、10、30和50μg/mL)处理24h后的Bcl-2/Bax，cleavedcaspase-9，caspase-3和PARP的蛋白相对表达量。

图7本发明实验例6提供的检测结果图；其中，A和B表示用SM-BFRE(0、45和90mg/kg/天)治疗Hep-2的荷瘤小鼠4周后将肿瘤取出并拍照，C表示在实验期间，每4天用游标卡尺测量移植的肿瘤的体积，当实验结束时，将肿瘤取出并称重，D和E表示制备肿瘤切片，进行TUNEL和IHC染色，并计算凋亡细胞的比例，F表示从移植的肿瘤组织中提取蛋白质，并通过Western blot检测Bcl-2/Bax，cleaved caspase-9，caspase-3和PARP的相对表达。

图8本发明实验例7提供的检测结果图；其中，A和B表示用SM-BFRE(0、10、30和50μg/mL)处理24h后用Western blot检测两种喉癌细胞系中p-STAT3(Tyr705)的相对表达，C表示从移植的肿瘤组织中提取蛋白质，并通过Western blot检测p-STAT3(Tyr705)的相对表达。

图9本发明实验例8提供的检测结果图；其中，A和B表示用SM-BFRE(0、10、30和50μg/mL)处理24h后用Western blot检测两种喉癌细胞系中p-Akt(Ser473)和NF-κB的相对表达，C表示从移植的肿瘤组织中提取蛋白质，并通过Western blot检测p-Akt(Ser473)和NF-κB的相对表达。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

首先，本发明实施例提供一种用于治疗喉癌的药物组合物，药物组合物的活性成分包括穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、扁柏双黄酮、竹柏双黄酮A、7-去甲基银杏双黄酮和7,4',7”,4”'-四甲氧基穗花杉双黄酮。通过上述几种物质的作用能够有效诱导喉癌细胞凋亡，继而治疗喉癌。

具体地，穗花杉双黄酮(化合物1)、银杏双黄酮(化合物2)、竹柏双黄酮A(化合物4)、7-去甲基银杏双黄酮(化合物5)和7,4',7”,4”'-四甲氧基穗花杉双黄酮(化合物6)的结构式为：

其中，扁柏双黄酮(化合物3)的结构式为：

具体地，穗花杉双黄酮、所述银杏双黄酮、所述扁柏双黄酮、所述竹柏双黄酮A、7-去甲基银杏双黄酮和所述7,4',7”,4”'-四甲氧基穗花杉双黄酮的质量比为42～76：5～15：3～9：1～7：6～17：1～7；优选为52.7:7.8:4.7:2.3：8.2:2.5。

该活性物质包括双黄酮富集物，进一步地，活性成分包括江南卷柏双黄酮富集物，所述江南卷柏双黄酮富集物包括穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、扁柏双黄酮、竹柏双黄酮A、7-去甲基银杏双黄酮和7,4',7”,4”'-四甲氧基穗花杉双黄酮。

也就是说本申请的用于治疗喉癌的药物组合物包括江南卷柏双黄酮富集物，而该江南卷柏双黄酮富集物包含穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、扁柏双黄酮、竹柏双黄酮A、7-去甲基银杏双黄酮和7,4',7”,4”'-四甲氧基穗花杉双黄酮。当然也可以药物组合物包含其他对喉癌有治疗效果的其他成分，继而提升药物组合物的治疗效果，也可以包含其他活性成分，降低药物组合物的毒副作用或者提升其治疗效果，或者该药物组合物可以仅包含江南卷柏双黄酮富集物，也可以保证该药物组合物的治疗效果，或者该药物组合物还可以包括药学上可接受的载体或辅料，并将其制备为具有一定剂型的药剂。

需要说明的是，在本发明实施例中，术语“药学上可接受的”指当化合物给人类施用时该化合物是生理上可接受的，且不会发生胃肠道紊乱、头晕等过敏反应或者类似这些过敏反应的全身过敏反应。

在本发明实施例中，“药学上可接受的载体或辅料”包括但不限于：粘合剂(如微晶纤维素、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮)、填充剂(如淀粉、蔗糖、葡萄糖和无水乳酸)、崩解剂(如交联PVP、交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、和低取代羟丙基纤维素)、润滑剂(硬脂酸镁、硬脂酸铝、滑石、聚乙二醇、苯甲酸钠)、润湿剂(如甘油)、表面活性剂(如十六烷醇)以及吸收促进剂、矫味剂、甜味剂、稀释剂、包衣剂等。

同时，为了使该药物快速、连续并在很长一段时间里释放活性成分，本发明的药物组合物可以根据公开在那些本技术领域中的常规方法制造。本实施方式的药物的给药途径可以为口服、鼻吸入、或肠胃外给药。包含该组合物的制剂可以是片剂、软胶囊、硬胶囊、口服液、丸剂、栓剂、粉末、颗粒、乳剂、糖浆、气雾剂、灭菌注射剂、和灭菌粉等。

本发明实施例还提供一种上述用于治疗喉癌的药物组合物的制备方法，包括对江南卷柏进行提取得到含有所述活性成分的所述药物组合物。

进一步地，将所述江南卷柏与醇溶剂混合浸泡形成粗提物；而后再依次利用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇对所述粗提物进行萃取，并分别收集对应的萃取液。采用的醇溶剂为一元醇，优选为乙醇，最优为浓度为95％(体积分数)的乙醇。本发明实施例采用浸渍法进行提取，且利用95％的乙醇浸提4次，每次95％的乙醇的用量为2-3升，保证提取效果，同时，该方法操作简单。

接着，对乙酸乙酯萃取液进行纯化形成江南卷柏双黄酮富集物，所述江南卷柏双黄酮富集物包括穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、扁柏双黄酮、竹柏双黄酮A、7-去甲基银杏双黄酮和7,4',7”,4”'-四甲氧基穗花杉双黄酮。

进一步地，形成所述江南卷柏双黄酮富集物包括利用树脂，例如D101大孔树脂柱，对所述乙酸乙酯萃取液内的成分进行吸附，而后再进行梯度洗脱，并收集洗脱液形成所述江南卷柏双黄酮富集物；优选地，梯度洗脱包括利用不同质量浓度的水-醇溶剂进行洗脱；优选地，梯度洗脱包括依次利用10％、30％、50％、70％、80％和95％的水-乙醇混合溶液进行梯度洗脱。

并且对以上洗脱液进行高效液相(后文简称高液)分析，根据HPLC分析结果，将具有相同高液分析结果的洗脱液合并，同时，高液分析显示色谱峰一致的洗脱液合并，主要含有穗花杉双黄酮(化合物1，保留时间4.75分钟)、银杏双黄酮(化合物2，保留时间8.83分钟)、扁柏双黄酮(化合物3，保留时间10.08分钟)、竹柏双黄酮A(化合物4，保留时间13.81分钟)、7-去甲基银杏双黄酮(化合物5，保留时间13.81分钟)和7,4',7”,4”'-四甲氧基穗花杉双黄酮(化合物6，保留时间17.79分钟)6个化合物，即为纯化的江南卷柏双黄酮富集物，双黄酮含量以6个化合物的峰面积计算大于85％。

而后再利用色谱柱，例如Phenomenex Gemini C18 HPLC色谱柱，对江南卷柏双黄酮富集物进行分离，得到6个不同出峰的馏分。同时，将上述6个组分分别溶解在DMSO-d₆中以进行NMR测试，测试不仅仅确定化合物1-6确实存在于江南卷柏双黄酮富集物中，同时确定化合物1-6分别的含量，每克江南卷柏双黄酮富集物中含化合物1为400～620mg、化合物2为47～93mg、化合物3为34～62mg、化合物4为14～33mg、化合物5为63～104mg、化合物6为14～37mg。

进一步地，本发明实施例还提供一种上述用于治疗喉癌的药物组合物在制备用于治疗喉癌的药物中的应用；优选地，所述药物组合物为诱导喉癌细胞凋亡的药物；优选地，所述药物组合物为抑制细胞迁移能力的药物。

具体地，该药物组合物通过影响线粒体凋亡信号转导通路，而后诱导喉癌细胞凋亡，其中，bcl-2家族的表达和调控是影响线粒体细胞凋亡信号转导的关键因素之一，其主要作用位点在线粒体膜上。细胞受到死亡信号刺激后，bcl-2家族中的促凋亡蛋白在蛋白酶作用下发生构像变化，从细胞浆移位到细胞器膜上，尤其是线粒体外膜上，并与细胞器膜上和膜内的抗凋亡蛋白相互作用，使抗凋亡蛋白丧失对凋亡的抑制作用，引起细胞器功能丧失和各种促凋亡因子的释放，最终导致喉癌细胞凋亡。

Bcl-2和Bax分别是bcl-2家族中最有代表性的抑制凋亡和促进凋亡基因。在正常细胞中，Bcl-2通常表达阴性，而Bax表达阳性。但在如喉癌、肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、神经母细胞瘤、鼻咽癌、前列腺癌与膀胱癌等恶性肿瘤中，都观察到了Bcl-2的上调与Bax下调，并且细胞分化程度越低，这种趋势更加明显。

而发明人发现该药物组合物可以通过下调Bcl-2蛋白的表达水平和/或上调Bax蛋白的表达水平，而后影响所述线粒体凋亡信号转导通路，继而诱导喉癌细胞凋亡。

同时，Bcl-2/Bax比值的改变，最终导致caspase家族引起的细胞凋亡。caspase家族是一类能特异性识别天冬氨酸位点的半胱氨酸蛋白酶，参与细胞凋亡信号转导的多个过程。在线粒体细胞介导的凋亡通路中，Caspase家族参与凋亡信号的放大与凋亡效应，通过酶促级联反应的方式放大凋亡信号，并催化凋亡相关效应蛋白，最终导致细胞的凋亡。如在Bcl-2家族的调控下，线粒体释放凋亡活化因子1(Apaf1)，Apaf1结合细胞色素C(cytoC)、ATP，并经过自身构象变化及自身活化，使Apaf1 N端形成一种表面结构，可活化Caspase 8/9，再进一步活化Caspase 3/6/7，最终Caspase 3/6/7催化一系列凋亡相关底物，引起细胞凋亡。

发明人还发现，该药物组合物通过上调Caspase-3和Caspase-9的表达水平来影响所述线粒体凋亡信号转导通路，继而诱导喉癌细胞凋亡。

与此同时，发明人还发现，药物组合物为通过影响JAK-STAT信号通路来诱导所述喉癌细胞凋亡。

JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，其参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。其中，STAT3的活性在细胞恶变过程中起关键性作用。许多肿瘤来源细胞株都需要STAT蛋白(特别是STAT3)来保持转变后的表现型，这些肿瘤来源细胞株包括喉癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、神经母细胞瘤、鼻咽癌、前列腺癌或膀胱癌。

下面以喉癌为例，进行详细论述：

许多喉癌的危险因素都可以促进STAT3的活化。JAK-STAT信号通路的传递过程相对简单。信号传递过程如下：细胞因子与相应的受体结合后引起受体分子的二聚化，这使得与受体偶联的JAK激酶相互接近并通过交互的酪氨酸磷酸化作用而活化。JAK激活后催化受体上的酪氨酸残基发生磷酸化修饰，继而这些磷酸化的酪氨酸位点与周围的氨基酸序列形成“停泊位点”(docking site)，同时含有SH2结构域的STAT蛋白被招募到这个“停泊位点”。最后，激酶JAK催化结合在受体上的STAT蛋白发生磷酸化修饰，活化的STAT蛋白以二聚体的形式进入细胞核内与靶基因结合，调控基因的转录。STAT3在几乎所有头颈部肿瘤中都高度磷酸化。因此，STAT3被作为肝细胞肝癌治疗的一个非常重要的分子靶向目标。

发明人发现，该药物组合物通过下调STAT3蛋白的磷酸化水平，继而影响所述JAK-STAT信号通路，继而实现诱导喉癌细胞凋亡的目的。

进一步地，药物组合物通过影响Akt/NF-κB信号通路来诱导所述喉癌细胞凋亡，核因子κB(NF-κB)是密切相关的转录因子家族，是细胞中重要的核转录因子。它主要参与人体的炎症反应和免疫反应。然而，越来越多的报告表明，NF-κB调节基因的表达，这些基因在肿瘤的发生和发展中至关重要，包括细胞增殖，迁移和凋亡。通常认为，NF-κB以二聚体的形式以其非活性状态的抑制剂(IκBs)的形式存在于细胞质中。受刺激时，IκB蛋白通过磷酸化和泛素化降解，并且NF-κB二聚体被释放并最终转移到细胞核中，该细胞核与靶基因结合以促进其转录。研究表明，PI3K/Akt信号通路的激活也与NF-κB的激活有关。Akt具有两个磷酸化位点(Thr308和Ser473)，可通过双重磷酸化激活。Thr308位点的磷酸化会激活Akt部分，但整个Akt功能活性都需要Ser473的磷酸化。磷酸化的Akt(p-Akt Ser473)表达的减少是PI3K/Akt途径激活的关键指标。如前所述，NF-κB对细胞凋亡具有调节作用，通常认为NF-κB抑制细胞凋亡。

发明人发现，该药物组合物能够降低Akt蛋白的磷酸化水平以及NF-κB蛋白的表达，而后调控Akt/NF-κB信号通路，继而诱导喉癌细胞的凋亡。

也进一步说明，上述用于治疗喉癌的药物组合物可以应用于制备抑制以下(1)-(3)至少一种通路的调节药物中；(1)活化线粒体凋亡信号转导通路；(2)抑制JAK-STAT信号通路；(3)抑制Akt/NF-κB信号通路。

也进一步说明，上述用于治疗喉癌的药物组合物可以应用于制备实现(a)-(c)至少一种情况的调节药物中的应用；(a)上调(4)-(6)至少一种蛋白的表达水平，其中(4)为Bax蛋白，(5)为Caspase-3蛋白以及(6)为Caspase-9蛋白；(b)下调(7)-(8)至少一种蛋白的表达水平，其中，(7)为NF-κB蛋白以及(8)为Bcl-2蛋白；(c)下调(9)-(10)至少一种蛋白的磷酸化水平，其中，(9)为STAT3蛋白以及(10)为Akt蛋白。或该用于治疗喉癌的药物组合物可以应用于制备抑制喉癌细胞迁移能力的药物中的应用。

实施例1

本实施例提供一种药物组合物，其活性成分包括穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、扁柏双黄酮、竹柏双黄酮A、7-去甲基银杏双黄酮和7,4',7”,4”'-四甲氧基穗花杉双黄酮，且质量比为52.7:7.8:4.7:2.3：8.2:2.5。

本发明实施例还提供一种上述药物组合物的制备方法，包括：

参照图1所示的工艺流程对江南卷柏进行提取得到含有上述活性成分的药物组合物。

具体地，研磨江南卷柏的干燥全草(500g)，然后在室温下依次浸入95％EtOH四次(每次2.5L，3天)，浸提。减压蒸发溶剂，得到粗提取物(61.5g)。将粗提物浸膏以1:10加入水悬浮在水中，然后依次用等体积的石油醚(PE)，乙酸乙酯(EtOAc)和正丁醇(n-BuOH)分别萃取4次，合并相应的萃取液，浓缩干燥得到PE部位(4.3g)，EtOAc部位(9.4g)、n-BuOH部位(23.7g)和水部位。

将EtOAc部位(8g)进行D101大孔树脂柱色谱分离，依次用质量浓度为10％、30％、50％、70％、80％和95％的水-乙醇进行梯度洗脱，得到142种洗脱液。根据HPLC分析结果，将不同的洗脱液合并为七个组分(Frs.A-G)。其中，含有保留时间4.75分钟、8.83分钟、10.08分钟、13.81分钟、13.81分钟和17.79分钟色谱峰的洗脱液合并浓缩作为纯化的江南卷柏双黄酮富集物(编号为：SM-BFRE，3.5g)。

通过HPLC-PDA方法进行江南卷柏双黄酮富集物的化学分析。优化梯度洗脱以使用Phenomenex Gemini-NX C18 HPLC色谱柱(5μm，4.6×250mm)(乙腈在水中含0.1％甲酸)进行分析。梯度程序如下：0-13分钟，40-70％乙腈；13-13.05分钟，乙腈70-90％；13.05-20分钟，乙腈90-95％；20-25分钟，95％乙腈。分析的流速为1.0mL/min。将100mg SM-BFRE溶解在2.0mL甲醇中，并将溶液过滤。用Phenomenex Gemini C18 HPLC色谱柱(5μm，10×250mm)(含0.1％甲酸的乙腈在40％至60％的水中，从100％的SM-BFRE进行半制备HPLC，从60％进行16分钟)在接下来的0.05分钟内降至90％，在接下来的8.95分钟内从90％降至95％，并保持95％乙腈5分钟)，流速为4.0mL/min。手动收集了6个色谱峰的馏分，并重复进行20次注射，而后将6个馏分DMSO-d6中以进行测试NMR，确定6个馏分分别为化合物1(52.7mg)，2(7.8mg)，3(4.7mg)，4(2.3mg)，5(8.2mg)和6(2.5mg)。

实验例

下面结合药效试验对本发明实施例1中提供的江南卷柏双黄酮富集物进行药效评价。

样品：

待测品：实施例1提供的江南卷柏双黄酮富集物；

对比例1：实施例1提供的粗提物；

对比例2：实施例1提供的酸乙酯萃取液；

实验例一、检测待测品、对比例1和2对人喉癌细胞Hep-2和TU212与正常喉上皮细胞HBE细胞活力的影响以及IC₅₀值

取对数生长期Hep-2和TU212细胞株，调节细胞浓度为5×10⁴个/mL，每孔0.1mL接种至96孔培养板，继续培养24h后，每孔分别添加由含10％小牛血清DMEM液配制成的待测样品0.2mL，使样品浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL和100μg/mL继续培养12h、24h与48h；每个浓度一式3孔，同时设不加测试样品的实验对照和不加样品和细胞的空白对照孔。达到给药时间后每孔加入MTT 0.1mL继续孵育30min，到达孵育时间后吸弃培养液，每孔加入0.15mL DMSO，充分溶解细胞内生成的紫色甲臜结晶，于562nm下测定每孔吸光度A值。HBE细胞的培养与给药除给药时间为24h外，其余操作均相同。

Hep-2、TU212与HBE细胞的生长抑制率＝[1-(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)]×100％。使用SPSS 19.0计算半数抑制浓度(IC₅₀)。

结果参见图2，本发明实施例1提供的江南卷柏双黄酮富集物在5-100μg/mL的浓度范围内，对喉癌细胞显示出较好的活力抑制，也显示出明显的量效、时效关系，但对正常喉上皮细胞HBE影响不大。与此相比，江南卷柏乙醇粗提物(SME)和乙酸乙酯部位(SMEA)对于两种喉癌细胞的抑制作用明显更弱。

实验例二、检测待测品对Hep-2和TU212细胞迁移能力的影响

取对数生长期的Hep-2和TU212细胞，以5×10⁴个/孔的浓度接种入6孔板，培养24h，吸弃培养液，加入不同浓度的江南卷柏双黄酮富集物(样品浓度分别为0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL)后，用200μL无菌移液器吸头刮擦板表面可形成伤口。在倒相显微镜下观察给药0h，12h和24h后的伤口面积。通过Image J软件计算伤口表面积的测量值。

基质金属蛋白酶(MMPs)在肿瘤细胞的转移和侵袭中起主要作用。其中，MMP-9在促进细胞迁移中起关键作用。因此，我们通过蛋白质印迹法(western blot)检测了两个喉癌细胞中MMP-9蛋白的表达。

结果见图3，与0h相比，在12h和24h后伤口明显愈合，即随着时间的流逝，伤口愈合得更多。同时，随着剂量的增加，SM-BFRE对两种喉癌细胞迁移的抑制作用也逐渐增加。WB实验的结果显示SM-BFRE剂量依赖的抑制MMP-9的表达。该结果表明本发明实施例1提供的江南卷柏双黄酮富集物对喉癌细胞的迁移具有显着的抑制作用。

实验例三、检测待测品对Hep-2和TU212细胞形态的影响

取对数生长期的Hep-2和TU212细胞，以5×10⁴个/孔的浓度接种入6孔板，培养24h，吸弃培养液，加入不同浓度的江南卷柏双黄酮富集物(样品浓度分别为0μg/mL、10μg/mL、30μg/mL和50μg/mL)，继续培养24h，显微镜明场观察细胞形态后，吸弃培养液，每孔加入固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)，固定后吸弃，加入PBS清洗两遍，每次3min，吸除液体，风干。加入Hoechst33258染色液覆盖所有细胞。采用荧光倒置显微镜观察细胞形态。

结果见图4，两个空白组的Hep-2细胞呈现良好的贴壁性，总数多、界限清楚、细胞分布均匀、细胞核形态正常、呈圆形或不规则椭圆形、核质分布均匀，细胞呈现均匀荧光。而经本发明实施例1的江南卷柏双黄酮富集物处理后，随剂量的增加出现不同程度的凋亡，Hep-2细胞的凋亡特征逐步明显。低剂量组(药物浓度为10μg/mL)细胞形态不统一，贴壁细胞数量减少，开始出现凋亡小体；中剂量组(30μg/mL)贴壁细胞数量进一步减少，出现少量的凋亡小体，细胞核可见致密的颗粒性荧光；高剂量组(药物浓度为50μg/mL)贴壁细胞数量明显减少，细胞核固缩，有较多的凋亡小体出现。TU212细胞的实验结果与Hep-2细胞相一致。

实验例四、检测待测品对Hep-2和TU212细胞凋亡数量的影响

细胞培养及给药方法见实验三。细胞给药培养24h后将细胞用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶消化，300g离心5min以收集悬浮的细胞，用冷PBS洗涤两次，加入400μL 1×Annexin V重悬细胞后，先加入5μL Annexin V-FITC染色液避光孵育15min，再加入5μL的PI染色液避光孵育5min，立即用流式细胞仪以及荧光显微镜观察。用FlowJo V10软件分析凋亡细胞的百分比。

结果见图5，在流式细胞仪检测的结果中，本发明实施例1提供的江南卷柏双黄酮富集物给药组(0μg/mL、10μg/mL、30μg/mL和50μg/mL)各剂量下，Hep-2细胞中Q1、Q2、Q3、Q4的百分比分别为15.47％，16.63％，39.00％和50.00％，而TU212细胞中分别为10.92％，17.56％，28.20％和51.60％，表明SM-BFRE剂量依赖性地诱导喉癌细胞凋亡。在荧光显微镜下，早期的凋亡细胞用Annexin V-FITC染色，使细胞膜呈现绿色荧光，在此基础上，晚期凋亡细胞用碘化丙啶(PI)染色，使细胞核呈现。结果表明，与0μg/mL相比，SM-BFRE的浓度为50μg/mL时，凋亡细胞的数量显着增加。

实验例五、检测待测品体外对Hep-2和TU212细胞线粒体凋亡信号转导通路相关蛋白表达的影响

细胞凋亡时，伴随一系列蛋白酶学的改变。Bcl-2家族与Caspase家族活性变化参与线粒体凋亡通路的启动与执行过程。Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9为关键的参与分子，对其进行检测可以反应药物是否诱导肝癌细胞通过线粒体途径凋亡。

取对数生长期的Hep-2和TU212细胞，以1.37×10⁶个/皿的浓度接种在100mm×20mm细胞培养皿中，培养24h，加入不同浓度的江南卷柏双黄酮富集物(样品浓度分别为0μg/mL、10μg/mL、30μg/mL和50μg/mL)24h后，收集细胞液，PBS洗涤，加入细胞裂解液裂解，超声粉碎，沸水浴10min，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。制备浓缩胶和分离胶，采用12％SDS-PAGE凝胶电泳分离总蛋白，按照免疫印迹方法将胶内蛋白转移至PVDF膜上，用5％脱脂奶粉溶液封闭过夜后，分别加入一抗anti-Bax、anti-Bcl-2、anti-cleaved-Caspase-3、anti-cleaved-Caspase-9、anti-PARP、anti-β-actin孵育过夜，TBST洗涤三次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2h，TBST洗涤3次，后按照ECL的方法依次加入发光底物、曝光、显影及定影，采用Image软件分析条带。

结果见图6，Hep-2和TU212细胞内的一些重要蛋白的表达水平发生明显变化，随着江南卷柏双黄酮富集物给药浓度的增加，Bax、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9、cleaved-PARP表达水平上升，Bcl-2的表达水平下降，Bcl-2/Bax的比值明显降低。这一结果表明，本发明实施例1提供的江南卷柏双黄酮富集物是通过影响线粒体凋亡通路的相关蛋白表达，发挥抗喉癌的作用。

实验例六、检测待测品体外对动物体内线粒体凋亡信号转导通路相关蛋白表达的影响

将喉癌细胞Hep-2接种到裸鼠的右后方(BALB/c，SPF级，雌性，16-18g，4-5周龄)，浓度为1×10⁷/只。当肿瘤长到约100mm³时，将小鼠随机分为三组(每组五只小鼠)，并进行腹膜内注射(ip)江南卷柏双黄酮富集物(0、45和90mg/kg/day)28天，每四天测量一次肿瘤体积。28天后，取出移植的肿瘤进行评估。我们动物实验涉及的所有程序均符合中南民族大学(中国武汉)动物保护和使用委员会的要求。

结果见图7，根据图7中A-C可知，本发明实施例1提供的江南卷柏双黄酮富集物在裸鼠中剂量依赖性地抑制移植的肿瘤的增殖。根据图7中D-E可知，通过TUNEL和免疫组织化学染色(IHC)检查江南卷柏双黄酮富集物对体内细胞凋亡的作用。TUNEL和IHC将凋亡细胞的细胞核染成棕色，表明随着SM-BFRE剂量的增加，移植肿瘤中凋亡细胞的数量也逐渐增加。根据图7中F可知，WB实验进一步证实了江南卷柏双黄酮富集物在体内促进喉癌细胞凋亡的作用。发现随着SM-BFRE浓度的增加，Bcl-2/Bax的表达比例显着降低，而cleaved-Caspase-9，-3和PARP的表达逐渐增加，这与体外获得的结果一致。

实验例七、检测待测品对Hep-2和TU212细胞STAT3通路相关蛋白表达的影响

JAK/STAT信号转导通路，广泛参与细胞的增殖、分化、凋亡、免疫调节、炎症、肿瘤等多种生理、病理过程。组成型STAT3由磷酸化的STAT3二聚化形成，是STAT3的活化形式，其异常活化主要由其上游元件的异常活化和表达引起。多种酪氨酸激酶均可直接或间接的激活STAT3，通常认为Tyr705位点的STAT3磷酸化是激活STAT3信号通路的先决条件。STAT3Tyr705位点的磷酸化程度可以反应药物是否通过抑制JAK2/STAT3信号转导通路诱导喉癌细胞凋亡。

细胞操作与免疫印迹方法见实验五，其中一抗使用anti-STAT3、anti-pTyr705-STAT3与anti-β-actin。

结果见图8，Hep-2和TU212细胞内STAT3磷酸化水平都随着本发明实施例1提供的江南卷柏双黄酮富集物给药浓度的增加而降低，说明江南卷柏双黄酮富集物诱导喉癌细胞凋亡通过影响STAT3信号转导通路发挥作用。其中，图8中A和B均为体外实验，图8中C为体内实验的结果。

实验例八、检测待测品对Hep-2和TU212细胞Akt/NF-κB通路相关蛋白表达的影响

NF-κB主要参与人体的炎症反应和免疫反应。然而，越来越多的报告表明，NF-κB调节基因的表达，这些基因在肿瘤的发生和发展中至关重要，包括细胞增殖，迁移和凋亡。通常NF-κB以二聚体的形式存在于细胞质中，受到刺激后，二聚体被释放并最终转移到细胞核中，该细胞核与靶基因结合以促进其转录。研究表明，PI3K/Akt信号通路的激活也与NF-κB的激活有关，在Ser473位点的磷酸化Akt表达的减少是PI3K/Akt途径激活的关键指标。因此，Akt Ser473位点的磷酸化程度以及NF-κB的表达可以反应药物是否通过抑制Akt/NF-κB信号转导通路诱导喉癌细胞凋亡。

结果见图9，Hep-2和TU212细胞内Akt磷酸化水平和NF-κB的表达都随着江南卷柏双黄酮富集物给药浓度的增加而降低，说明江南卷柏双黄酮富集物诱导喉癌细胞凋亡通过影响Akt/NF-κB信号转导通路发挥作用，并且江南卷柏双黄酮富集物对NF-κB的抑制作用可能是通过抑制其上游Akt活化而造成的。其中，图9中A和B均为体外实验，图9中C为体内实验的结果。

综上所述可知，本发明实施例1提供的江南卷柏双黄酮富集物在体外与体内抗癌活性研究中，显示出良好的效果。江南卷柏双黄酮富集物能有效的诱导喉癌细胞株凋亡，并且对正常喉上皮细胞影响较小。在对其促凋亡的机制研究发现江南卷柏双黄酮富集物可以增加Bax的表达水平，降低Bcl-2的水平，从而降低Bcl-2/Bax的比值，另上调cleaved-Caspase-9、cleaved-Caspase-3和cleaved-PARP的水平，而导致诱导细胞凋亡。也就证明了含有穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、扁柏双黄酮、竹柏双黄酮A、7-去甲基银杏双黄酮和7,4',7”,4”'-四甲氧基穗花杉双黄酮的药物组合物可以用于治疗喉癌，且治疗原理如上。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于治疗喉癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的活性成分包括穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、扁柏双黄酮、竹柏双黄酮A、7-去甲基银杏双黄酮和7,4',7”,4”'-四甲氧基穗花杉双黄酮。

2.根据权利要求1所述的用于治疗喉癌的药物组合物，其特征在于，所述活性成分包括双黄酮富集物；

优选地，所述活性成分包括江南卷柏双黄酮富集物，所述江南卷柏双黄酮富集物包括穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、扁柏双黄酮、竹柏双黄酮A、7-去甲基银杏双黄酮和7,4',7”,4”'-四甲氧基穗花杉双黄酮。

3.根据权利要求1所述的用于治疗喉癌的药物组合物，其特征在于，所述穗花杉双黄酮、所述银杏双黄酮、所述扁柏双黄酮、所述竹柏双黄酮A、7-去甲基银杏双黄酮和所述7,4',7”,4”'-四甲氧基穗花杉双黄酮的质量比为42～76：5～15：3～9：1～7：6～17：1～7；优选为52.7:7.8:4.7:2.3：8.2:2.5。

4.如权利要求1-3任一项所述的用于治疗喉癌的药物组合物的制备方法，其特征在于，包括对原料进行提取得到含有穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、扁柏双黄酮、竹柏双黄酮A、7-去甲基银杏双黄酮和7,4',7”,4”'-四甲氧基穗花杉双黄酮的所述药物组合物；

优选地，对江南卷柏进行提取得到含有所述活性成分的所述药物组合物；

优选地，提取包括：将所述江南卷柏与醇溶剂混合浸泡形成粗提物；而后再依次利用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇对所述粗提物进行萃取，并分别收集对应的萃取液；

接着，对乙酸乙酯萃取液进行纯化形成江南卷柏双黄酮富集物，所述江南卷柏双黄酮富集物包括穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、扁柏双黄酮、竹柏双黄酮A、7-去甲基银杏双黄酮和7,4',7”,4”'-四甲氧基穗花杉双黄酮；

优选地，醇溶剂为一元醇，优选为乙醇；

优选地，形成所述江南卷柏双黄酮富集物包括利用树脂对所述乙酸乙酯萃取液内的成分进行吸附，而后再进行梯度洗脱，并收集洗脱液形成所述江南卷柏双黄酮富集物；

优选地，梯度洗脱包括利用不同质量浓度的水-醇溶剂进行洗脱。

5.如权利要求1-3任一项所述的用于治疗喉癌的药物组合物在制备用于治疗喉癌的药物中的应用；

优选地，所述药物组合物为诱导喉癌细胞凋亡的药物；

优选地，所述药物组合物为抑制喉癌细胞迁移能力的药物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物组合物为通过影响线粒体凋亡信号转导通路，而后诱导喉癌细胞凋亡的药物；

优选地，所述药物组合物为通过下调Bcl-2蛋白的表达水平和/或上调Bax蛋白的表达水平，而后影响所述线粒体凋亡信号转导通路的药物；

或者，所述药物组合物为通过上调Caspase-3和Caspase-9的表达水平来影响所述线粒体凋亡信号转导通路的药物。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物组合物为通过影响JAK-STAT信号通路来诱导所述喉癌细胞凋亡的药物；

优选地，所述药物组合物为通过下调STAT3蛋白的磷酸化水平，继而影响所述JAK-STAT信号通路的药物。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物组合物为通过影响Akt/NF-κB信号通路来诱导所述喉癌细胞凋亡的药物；

优选地，所述药物组合物为通过下调Akt蛋白的磷酸化水平和NF-κB蛋白来影响所述Akt/NF-κB信号通路的药物。

9.如权利要求1-3任一项所述的用于治疗喉癌的药物组合物在制备调控以下(1)-(3)至少一种通路的药物中的应用；

(1)活化线粒体凋亡信号转导通路；

(2)抑制JAK-STAT信号通路；

(3)抑制Akt/NF-κB信号通路。

10.如权利要求1-3任一项所述的用于治疗喉癌的药物组合物在制备实现(a)-(c)至少一种情况的调节的药物中的应用；

(a)上调(4)-(6)至少一种蛋白的表达水平，其中(4)为Bax蛋白，(5)为Caspase-3蛋白以及(6)为Caspase-9蛋白；

(b)下调(7)-(8)至少一种蛋白的表达水平，其中，(7)为NF-κB蛋白以及(8)为Bcl-2蛋白；

(c)下调(9)-(10)至少一种蛋白的磷酸化水平，其中，(9)为STAT3蛋白以及(10)为Akt蛋白。

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