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CN1589150A - 从牝马尿中获得雌激素的方法 - Google Patents

从牝马尿中获得雌激素的方法 Download PDF

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CN1589150A CNA028229231A CN02822923A CN1589150A CN 1589150 A CN1589150 A CN 1589150A CN A028229231 A CNA028229231 A CN A028229231A CN 02822923 A CN02822923 A CN 02822923A CN 1589150 A CN1589150 A CN 1589150A
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Abstract

本发明涉及从妊娠牝马尿(PMU)中获得结合型雌激素的天然混合物的提取物的方法。根据本发明所获得的提取物符合涉及结合型雌激素相关的药物规格，和将游离型雌激素的含量减少到最低程度，甚至是当使用老化的和/或于较高温度储存或运输的妊娠牝马尿的时候。从PMU中获得含有结合型雌激素混合物的提取物可以通过在半极性吸附树脂上的固相提取来进行。

Description

从牝马尿中获得雌激素的方法
                          说明书
本发明涉及从妊娠牝马尿中获得结合型雌激素的天然混合物。
雌激素在医学中用于激素替代治疗。尤其是将雌激素混合物用于治疗和预防妇女在自然绝经或人为绝经后出现的更年期症状。已经证明，天然结合型雌激素混合物，例如存在于妊娠牝马尿液中的，对此特别有效且具有良好的耐受性。
溶解在妊娠牝马尿液(＝pregnant mares urine，以下简称为“PMU”)中的固体含量可以通常在较大的范围内变动，一般为每升40-90克干物质。PUM的固体含量中，除尿素和其它常见的尿容物之外，酚类成份含量大约为干物质的2-5重量％。这些酚类成份中有甲酚和以HPMF著称的二氢-3，4-双[(3-羟基苯基)甲基]-2(3H)-呋喃酮。它们可以以游离或结合的形式存在。PMU中含有雌激素的天然混合物，很大程度上以结合的形式例如作为硫酸半酯-钠盐(以下简称为“硫酸盐”)存在。结合型雌激素的含量(以雌激素硫酸盐计算)为干物质的0.3-1重量％。
从WO 98/08526中已知一种合适的方法，采用该方法可在半极性(特别是非离子型半极性)聚合物吸附树脂上进行的固相提取，从而可以获得一种混合物，该混合物酚类尿容物贫乏的，甚至没有甲酚和HPMF的，实际上完全含有PMU的天然雌激素成份的混合物。该提取物适合作为用于生产含有天然结合型雌激素混合物作为活性物质成份的药物的原料。
然而为了可以在药物中用作为活性物质成份，所获得的结合型雌激素的天然混合物必须符合一定的药物规格，例如符合在USP(美国药典)或欧洲药典中规定的标准。此外，以干物质计的游离型雌激素的含量不应超过一定的极限值。通常根据WO 98/08526的方法从PMU获得的结合型雌激素混合物符合所提出的药物规格要求。
可是结果表明，当使用“老化的”尿例如经较长时间和/或可能于较高温度储存或运输的PMU来获得结合型雌激素的天然混合物时，常常不能遵守所要求的药物规格例如前述的游离型雌激素的最大可耐受含量的极限值。PMU的老化可能归咎于以下原因，即依照储存和/或运输条件，结合型雌激素的含量会随着时间或者于较高的温度而减少，同时不希望的游离型雌激素的含量则由此增加。因此，相对于新鲜的尿的雌激素的天然混合物的原始组成会在老化的尿中发生不利的变化。对于用WO 98/08526的方法获得的天然结合型雌激素混合物，在老化的最初产品的可能发生变化的组成方面常常存在有这样的危险，即该获得的提取物不再能够遵守所要求的药物规格，特别是不能够再遵守游离型雌激素的最大可耐受含量。从而下面的情况是特别不利的，即从老化的PMU获得的并含有本身宝贵的结合型雌激素混合物的活性物质提取物的材料不能再用于生产药物制剂，而因此必须将其废弃。由于昂贵的和只在确定的妊娠期能够进行的PMU的收集以及与之相联系的在运输储存实践中的边界条件，并且从经济的观点来看，损失宝贵的天然药物活性物质是非常不能令人满意的。
因此，本发明的任务在于开发出一种在技术和经济上理想的方法用于从PMU中获得酚类尿容物贫乏的结合型雌激素的天然混合物，在该方法中也是可以使用老化的PMU作为最初产品，即经较长的时间和/或于较高的温度储存或运输的PMU，在这种PMU中可能具有增加的游离型雌激素的比例，但是可以确保没有废品，以及特别是在该方法中从PMU中获得的结合型雌激素的天然混合物具有良好的活性物质含量，并且在特别是还考虑到游离型雌激素的最大可耐受含量的情形下符合所要求的药物规格。
现在发现了一种方法，采用这种方法可以令人惊异的简单方式也从老化的PMU(即特别是从游离型雌激素的比例可能增加了的PMU)中也能获得结合型雌激素混合物，此处获得的结合型雌激素混合物具有高的产品质量，并且一定符合药物规格的要求，特别是还考虑到游离型雌激素的最大可耐受含量。
根据本发明的方法以WO 98/08526中所描述的方法为出发点，该方法用于从PMU中获得酚类尿容物贫乏的结合型雌激素的天然混合物。据此本发明涉及一种方法用于从妊娠牝马尿中获得酚类尿容物贫乏的结合型雌激素的天然混合物，在该方法中
a)视情况去除黏液物质和固体物质、该尿液的经浓缩的浓缩物或者通过该尿液的膜过滤而获得的经浓缩的尿滞留物，与足够用于吸附尿液中含有的结合型雌激素混合物的数量的半极性聚合物吸附树脂进行接触，然后将上载了结合型雌激素混合物的半极性聚合物吸附树脂与剩余的尿液分离开；
b)用调整pH范围至至少12.0特别是12.5-14.0的洗涤水洗涤上载了结合型雌激素混合物的半极性聚合物吸附树脂；
c)将经洗涤的吸附树脂与足够用于解吸在其上面吸附的结合型雌激素混合物的数量的洗脱液进行接触，该洗脱液为可与水混合的有机溶剂选自可与水混合的醚、低级烷醇和低级脂族酮，或者为由可与水混合的有机溶剂和可能调整至碱性的水所组成的混合物，然后将含有天然结合型雌激素混合物的洗脱物与吸附树脂分离，如果可能并进行浓缩；此处根据本发明的方法与现有技术水平的方法相比，其特征在于，
在处理步骤b)和c)之间进行中间洗涤，在该洗涤中用水洗涤上载了结合型雌激素混合物的半极性吸附树脂。
加样的准备、本身已知的处理步骤a)、b)和c)以及处理步骤c)中所获得的含有天然结合型雌激素混合物的洗脱物的使用大体上在国际专利申请WO 98/08526中已经进行了描述，因此专业人员可以从该出版的专利申请中来熟悉它们。出于公开的目的，WO 98/08526的内容也是本申请的主题。在本申请的实施例部分总结了对于一般性处理方式的进一步细节和可使用的材料。例如，根据WO 98/08526可以使用半极性(特别是非离子型半极性)吸附树脂。此外，根据本发明的方法也可以令人惊异地将根据本发明的中间洗涤步骤一起来使用于其他可能的吸附树脂，而不会影响到产品质量或者应当遵守的药物规格。在本发明的范围内可以使用的吸附树脂将在下文描述中进行更详细的解释。
根据本发明，将处理步骤a)中上载了结合型雌激素混合物的半极性吸附树脂在紧随处理步骤b)之后的中间洗涤步骤用水进行洗涤。洗涤水的数量可以如此进行选择，即在紧接着的处理步骤c)中所获得的洗脱物含有结合型雌激素混合物，其符合游离型雌激素最高含量的要求从而可以用于药物的活性物质成份。经证实，每1个柱床体积的吸附树脂使用2-8个优选地为3-5个柱床体积的洗涤水是适当的。此处合适的是将洗涤水以这样的流速引导通过含有吸附树脂的反应器，即每小时每1个体积份的吸附树脂通过3-10个优选地为5-7个体积份的洗涤水。
必须作为特别惊异的事进行说明的是，正如根据本发明所确定的，即使应用老化的PMU用水进行被认为是简单的且于处理步骤b)与c)之间施行的对于吸附树脂的洗涤，也能使获得的作为活性物质提取物的天然结合型雌激素混合物的药物规格达到最佳化。特别地，非常令人惊异的是，能够如此确定地降低主要在老化的PMU中可能含有的增加了的游离型雌激素比例，从而可以在处理步骤c)中获得天然结合型雌激素混合物作为洗脱物，该混合物符合药物规格的高要求，例如根据USP或欧洲药典所制订的要求，特别是也可以从老化的PMU中获得含有天然结合型雌激素混合物并在质量与数量上都具有高数值的活性物质提取物。该活性物质提取物可遵守游离型雌激素最大可耐受的最高含量，而确保不受PMU的年龄和来源的影响，因此证明其可作为用于生产药物的有利或者宝贵的最初产品。由此，也可以在复杂的条件下避免对于宝贵的药物原料造成不希望的和经济上不利的损失，例如此处来自天然结合型雌激素的混合物。
以下特点经证实是根据本发明的方法的进一步优点，即在处理步骤c)中获得的洗脱物与现有技术水平相比较具有以干物质计的增加了的总激素含量。由此可获得例如在活性物质含量方面明显改善的高质量产品。
在根据本发明的方法有利的实施方案中，于室温以下的温度特别是0℃-10℃的温度进行中间洗涤，因为事实表明通过附加的中间洗涤步骤可能减少特定的激素或活性物质的损失。通常将环境温度看作是室温，例如位于20℃-30℃的温度。非常合适的是该方法于实际上0℃或者接近0℃的温度来实施。因此，推荐在实践中于比0℃稍高的温度进行操作，并采取相应的措施以便设法遵守上述的温度范围。为此可以采用本身常用的措施用于降低温度，例如使用冷却的反应器、冷却的材料和/或冷却的原材料如PMU。从实践角度来看，可以将0℃至大约5℃，特别是0℃至大约3℃的温度看作是0℃或者接近0℃的温度。
为了将在中间洗涤期间可能的激素损失尽可能控制在低水平，根据本发明的这种变化形式，将在中间洗涤步骤中和/或也在处理步骤b)中使用的调整至碱性的洗涤水预冷却至室温以下的温度特别是0℃-10℃的温度。进一步合适的或者优选的温度范围是如上指出的0℃至大约5℃的温度，特别是0℃至大约3℃的温度。于0℃或者接近0℃的温度来操作是优选的，即优选地将在中间洗涤步骤中和/或也在处理步骤b)中使用的调整至碱性的洗涤水预冷却至比0℃稍高的温度。通过在步骤b)中使用冷却的并调整至碱性的洗涤水，可实现这样的特性，即预冷却吸附树脂或者保持已经进行的吸附树脂的冷却，从而例如在对于中间洗涤使用冷却的洗涤水时可避免其发生不希望的再次升温。因此，中间洗涤步骤和前述的处理步骤b)这两者优选地于同一温度范围施行，例如于室温以下的温度，特别是于0℃-10℃的温度，或者优选地如于上面给出的温度范围。
在前述的本发明的变化形式中于室温以下的温度施行该方法，在该变化形式中可值得希望的是，以预冷却的方式来应用所有使用的装置，如用于接受半极性吸附树脂的反应器或者已经含有半极性吸附树脂的反应器和/或应用所使用的PMU，这是相应地预冷却至室温以下的温度，特别是预冷却至0℃-10℃的温度，或者预冷却至上面给出的优选的温度范围。
聚合物吸附树脂适于作为根据本发明的方法的吸附剂。特别地，优选的吸附树脂为半极性(特别是非离子型半极性)聚合物吸附树脂。在根据本发明的方法中可用作为吸附剂的半极性聚合物吸附树脂优选地为多孔的有机非离子型聚合物，其不同于非极性疏水型聚合物吸附树脂而具有中等极性(＝例如树脂活性表面的偶极矩在1.0-3.0德拜的范围内，特别是1.5-2.0德拜)和稍微亲水的结构，例如聚羧酸酯树脂。合适的是使用大孔型半极性树脂，其优选地具有大网状结构，以及具有在50-150埃优选为70-100埃的范围内的平均孔径大小和在300-900m2/g优选为400-500m2/g的范围内的比表面。经证实特别合适的是大孔型交联脂族聚羧酸酯树脂，特别是交联聚丙烯酸酯树脂如Rohm & Haas公司的Amberlite XAD-7R，其是非离子型半极性吸附树脂。
除了所述优选的吸附剂之外也可以使用其他的吸附树脂。非极性的、半极性的以及极性的吸附树脂适合作为在此所述的吸附树脂。在此首先依据各自的吸附器容量来确定可抽吸至吸附器之上的尿的量。可使用的吸附树脂的实例为商业上惯用的型号如聚合物Amberlite吸附剂，其具有苯乙烯二乙烯基苯主链(例如型号XAD-1180、XAD-2、XAD-4、XAD-16)、具有丙烯酸酯主链(例如XAD-7)或者具有含有氮和氧的高极性主链(如XAD-12)。其他的吸附树脂为Dowex-树脂(苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物)，例如Dowex 112、Dowex Optipore、Dowex Optipore V 493；Lewatite(交联聚苯乙烯)，例如Lewatit OC 1064、Lewatit OC 1066或LewatitOC 1163；聚胺阴离子交换树脂如Dowex-树脂。有利的吸附树脂特别地为XAD-7、XAD-16(型号HP)、XAD118和Dowex Optipore(优选地为Dowex Optipore V 493)，以及Lewatit OC 1064、OC 1066和OC 1163。
正如以上详细描述的，根据本发明的方法相对于现有技术具有一系列优点和改善。如此，使本发明也能使用可能增加游离型雌激素的比例的老化的PMU，而不会危机到所遵守的药物规格。根据本发明的方法还具有经济上的优点，因为明显减少了在不能遵守制药学规格(例如不可接受的游离型雌激素的含量)的情况下损失高价值的活性物质的危险。根据本发明的方法提供了质量上经改善的活性物质成份，其具有基于干物质含量提高的激素含量。该活性物质成份特别适合于制备含有天然雌激素的混合物作为活性物质的药物。
以下实施例应能进一步描述本发明，而并非限制本发明的范围。
                       实施例
在下面的实施例中给出了用于从PMU中获得活性物质提取物的一般性操作规程，该提取物含有在PMU中含有的结合型雌激素的天然混合物，并大大地减少了酚类尿内容物。经证明，根据本发明也从游离型雌激素的比例可能增加了的老化的PMU中可以获得具有高活性物质含量的优质提取物。
WO 98/08526的方法
对于根据本发明的方法，同样可以使用如根据WO 98/08526使用这样的PMU、即通过浓缩而获得的浓缩物或者由此通过膜过滤而获得的滞留物。收集得到的尿首先以本身已知的方式从黏液物质和固体物质中释放出来。合适的是让固体物质和黏液物质沉积，然后采用本身已知的分离方法来分离它们，例如倾析、离析和/或过滤。因此PMU例如可以导入到本身已知的分离装置如离析器、过滤器或者沉淀器之上。例如砂床可作为分离装置，或者可以使用商购常见的离析器如喷嘴离析器或室式离析器。如果希望也可以使用微过滤装置或者超过滤装置，在使用这些装置的同时可以将经过滤的PMU进一步地去除病菌和病毒。
视需要可以在尿中添加防腐剂、杀微生物剂、杀菌剂和/或驱蠕虫剂。
如果应当使用经浓缩得到的PMU滞留物来代替PMU，可以通过本身已知的膜过滤从PMU中获得这些滞留物。滞留物的固体物质含量和其组成可以依据所使用的PMU和用于膜过滤的膜如其孔径以及过滤的条件而变化。例如可以在使用纳米过滤膜的时候对于PMU滞留物中的雌激素成份进行几乎无损失的浓缩，同时去除直至50重量％的低分子量的PMU内容物。对于根据本发明的方法可使用PMU滞留物，该PMU滞留物浓缩至了大约1∶10的比例例如大约1∶7的比例，因此其体积可缩减至最初PMU体积的大约1/10例如大约1/7。
在处理步骤a)中可使用的半极性聚合物吸附树脂为多孔的有机非离子型聚合物，其不同于非极性疏水型聚合物吸附树脂而具有中等极性(＝例如树脂活性表面的偶极矩在1.0-3.0德拜的范围内，特别是1.5-2.0德拜)和稍微亲水的结构，例如聚羧酸酯树脂。合适的是使用大孔型半极性树脂，其优选地具有大网状结构，以及具有在50-150埃，优选为70-100埃的范围内的平均孔径，和在300-900m2/g，优选为400-500m2/g的范围内的比表面。经证实特别合适的是大孔型交联脂族聚羧酸酯树脂，特别是交联聚丙烯酸酯树脂如Rohm & Haas公司的Amberlite XAD-7R。
结合型雌激素在半极性吸附树脂上的吸附可以根据WO 98/08526，也如根据本发明的方法，通过将PMU或者其滞留物与吸附树脂接触来进行，这即是将尿液导入含有吸附树脂的反应器中，并使尿液在其中与吸附树脂保持接触对于吸附雌激素成份足够的时间。在结合型雌激素成功吸附于半极性吸附树脂上之后，可以本身已知的方式将上载了结合型雌激素混合物的吸附树脂与剩余的尿液分离开。合适的是可以将尿液以这种流速引导通过含有吸附树脂的柱，即使得接触时间足够用于雌激素成份的吸附。例如这样的流速是合适的，即该流速相当于每小时每1个体积份的吸附树脂流过3-10个优选地为5-7个体积份的PMU。尿液通过反应器的流速可以合适地通过对于微小的超压或负压进行操作来控制。所用半极性吸附树脂的数量可以根据所使用的吸附树脂的特性和尿液中固体物质的含量而变化。当使用PMU时，例如可以将1个体积份的吸附树脂如交联脂族聚羧酸酯吸附树脂用直至80个体积份的预先处理的PMU进行上载，而不会在流出的尿液中发现有显著数量的雌激素。当使用PMU浓缩物或者PMU滞留物时，吸附树脂的上载容量自然应当按浓缩的比例而减少。因此，例如1个体积份的交联脂族聚羧酸酯吸附树脂可以用数量相当于20-80个优选的为30-50个体积份的PMU的尿液来上载。
上载了结合型雌激素混合物的半极性吸附树脂在处理步骤b)中用洗涤水进行洗涤，该洗涤水已调整至至少12.0的pH范围之内，特别是12.5-14的pH范围，优选的是大约12.5-13.5的pH范围。可以使用在尿液中可溶的惰性碱性物质的水溶液作为洗涤水，该碱性物质足够强从而达到至少12.5的pH值。作为对于半极性聚合物吸附树脂惰性的且水溶的碱性物质，水溶性无机碱优选地是合适的，如碱金属氢氧化物或者碱土金属氢氧化物，特别是氢氧化钠。该洗涤水合适地只含有大约这一数量的碱性物质，即该数量对于达到所希望的PH值优选的为pH13是足够的。洗涤水的数量可以如此进行选择，即其足够用于尽可能地去除酚类尿容物，而与此同时不会洗去值得注意的量的结合型雌激素。经证实，例如每1个柱床体积的吸附树脂使用2-10个特别是4-6个柱床体积的洗涤液是适当的。在此合适的是将洗涤水以这样的流速引导通过含有吸附树脂的反应器，即每小时每1个体积份的吸附树脂通过3-10个优选地为5-7个体积份的洗涤水。
紧接着在处理步骤c)中，将经洗涤的上载了结合型雌激素混合物的吸附树脂用足够用于洗脱结合型雌激素混合物的数量的洗脱液进行处理，从而获得含有PMU中结合型雌激素的天然混合物的洗脱物。根据本发明而使用的洗脱液为可与水混合的有机溶剂选自可与水混合的醚、低级烷醇和低级脂族酮，或者为由这些可与水混合的溶剂和可能的调整至碱性的水所组成的混合物。可与水混合的环状醚如四氢呋喃或二噁烷适合作为洗脱液的醚成份，但可与水混合的开链醚如乙二醇二甲醚(＝Monoglyme)、二乙二醇二甲醚(＝Diglyme)或乙氧乙氧基乙醇(＝卡必醇)也是合适的。可与水混合的具有1-4个优选的为1-3个碳原子的烷基醇适合作为低级烷醇，特别是乙醇或异丙醇。可与水混合的具有3-5个碳原子的酮适合作为低级脂族酮，特别是丙酮。经证实，其中的有机溶剂为乙醇的洗脱液是特别有利的。合适的是使用由前述的可与水混合的有机溶剂和可能调整至碱性的水所组成的混合物作为洗脱液。这种含水洗脱剂的pH值位于pH13以内的中性至碱性范围之内，并可以有利地总计为大约10-12。可选择在所使用的pH范围之内稳定的溶剂作为含水洗脱液中的溶剂成份。在具有大约10-12的pH值的含水碱性洗脱液中，低级烷醇适合作为溶剂成份，优选的为乙醇。所希望的含水洗脱剂的pH值可通过添加相应数量的水溶的惰性碱性物质来调节，优选的为无机碱，例如碱金属氢氧化物或者碱土金属氢氧化物，特别是氢氧化钠。在含水的洗脱液中，可与水混合的有机溶剂和水的体积比可以位于40∶60-20∶80的范围之内，优选的为大约30∶70。所使用的洗脱剂的数量总计可为每1个柱床体积的吸附树脂使用大约3-10个特别是大约4-6个柱床体积的洗脱剂。合适地可将洗脱液以这样的流速引导通过含有上载了雌激素混合物的吸附树脂的反应器，即可以获得能够完全洗脱下结合型雌激素混合物的接触时间。当使用体积比为30∶70的乙醇与水的混合物时，例如合适的流速为每小时每1个体积份的吸附树脂通过3-10个优选地为5-7个体积份的洗涤液。这一洗涤过程合适地于室温至大约60℃的温度范围之内进行，优选地于大约40-50℃。如果希望可以通过在稍微升高的压力下例如在直至0.2巴的超压下进行操作来调节流速，并在多个级分中接收洗脱物。各个洗脱级分中的结合型雌激素以及酚类尿容物如甲酚和HPMF的含量可以本身已知的方式通过高效液相色谱法(＝high performance liquid chromatography，缩写为“HPLC”)来测定。
在进行洗脱时，首先获得浅色至无色的且实际上无雌激素的初级分，其数量一般相当于大约1个柱床体积。结合型雌激素的主要数量例如存在于最初PMU中的结合型雌激素的80-99％位于随后的深黄色至深褐色的主洗脱级分之中，其数量一般为2-4个柱床体积。在随后的后级分中，一般只含有微量的结合型雌激素。如果获得这样的后级分，即该级分中结合型雌激素的含量仍高于重量10重量％(基于干物质)和含有低于0.6重量％(基于干物质)的甲酚与HPMF，则可以将该级分与富含雌激素的主洗脱物合并以便进一步处理。
实施例1(对比实施例)：
a)PMU的雌激素成份在半极性聚丙烯酸酯吸附树脂上的吸附
在高220mm、直径40mm的柱中装填入300ml于水中泡涨的半极性聚丙烯酸酯吸附树脂(＝Rohm & Haas公司的Amberlite XAD-7，粒度为0.3-1.2mm，偶极矩为1.8德拜，平均孔径为80埃，比表面在干燥时为大约450m2/g)。将10.5L(＝35个柱床体积)通过超滤装置而过滤的PMU(通过HPLC测定的雌激素硫酸盐和甲酚的含量见下面的实施例表)于室温以平均每分钟24ml(＝每小时4.8个柱床体积)的流速引导通过柱。PMU的雌激素成份完全吸附在经如此上载的半极性吸附树脂柱上。流出的尿液通过HPLC对于其中的结合型雌激素含量(折算为雌激素硫酸盐)进行检测从而证实其实际上不含雌激素。将流出液丢弃。
b)洗涤经上载的吸附树脂柱
将经上载的吸附树脂柱用1.5L pH值为13的氢氧化钠水溶液进行洗涤。为此，该碱性洗涤水以平均每分钟24.6ml(＝每小时4.9个柱床体积)的流速引导通过柱。流出的洗涤液通过HPLC对于其中的雌激素硫酸盐和甲酚的含量进行检测。该检测表明，在洗涤阶段期间洗涤下的雌激素低于柱上所给出的雌激素总量的5％。
c)结合型雌激素从经洗涤的吸附树脂柱上的解吸
将1.5L洗脱液(乙醇/水30∶70)以每分钟25ml(＝每小时5.0个柱床体积)的流速引导通过于实施例表中指定的洗脱温度预热的柱。以5个级分接收流出的洗脱物。这些级分总计各为300ml(＝1个柱床体积)，并通过HPLC对于其中的雌激素硫酸盐和甲酚的含量进行检测。
第一个级分只含有微量的雌激素硫酸盐。该洗脱物显现为无色至浅黄色。在随后的级分2至4中含有柱上所吸附的结合型雌激素总量的大约80-98％。所述洗脱物在此具有浓厚的深褐色色调。最后的级分仍只含有微量的雌激素硫酸盐，可以看到颜色强度也明显地减退了。
对于含有主要数量的结合型雌激素的级分，在下面的表中给出了各个以重量％表示的TS含量以及通过HPLC测定的雌激素硫酸盐和甲酚的含量。这些级分为适合于医用的进一步处理的提取物。
d)吸附树脂柱的再生
为了再生，将柱首先用600ml含有50％乙醇的乙醇/水混合物进行洗涤，然后用600ml含有70％乙醇的乙醇/水混合物洗涤，紧接着用600ml10％柠檬酸钠水溶液洗涤，最后用600ml蒸馏水洗涤。全部的再生过程于45℃的温度进行。柱可以多次例如直至40次进行上载和重新再生。
实施例2(根据本发明的方法)：
再次施行实施例1，但其具有根据本发明的于处理步骤b)和c)之间的中间洗涤步骤。
中间洗涤步骤
将经上载的吸附树脂柱用900ml水进行洗涤。为此将中性的洗涤水以平均每分钟25.0ml(＝每小时5.0个柱床体积)的流速引导通过柱。
流出的洗涤液通过HPLC对于其中的雌激素硫酸盐和甲酚的含量进行检测。该检测表明，在该洗涤阶段期间洗涤下的雌激素只占柱上所给出的雌激素总量的很少部分(最多只是大约百分之几)。但在施行根据本发明的方法时，游离型雌激素的比例也根据本发明而减少了(见实施例4)。
表I：对照实施例1和根据本发明的实施例2的结果
    实施例编号     1     2
处理步骤a)：
最初PMU雌酮        mg/L马烯雌酮    mg/L甲酚        mg/L 86.457.01191.1 92.357.0877.6
处理步骤b)：
洗涤水＝NaOH水溶液  pH13     pH13
中间洗涤步骤：
洗涤水＝水洗涤级分1：雌酮        mg/L马烯雌酮    mg/L甲酚        mg/L洗涤级分2：雌酮        mg/L马烯雌酮    mg/L甲酚        mg/L洗涤级分3：雌酮        mg/L马烯雌酮    mg/L甲酚        mg/L 对比：未施行中间洗涤步骤 0.020.918.0125.00.00.0290.6138.031.5
处理步骤c)：
洗脱液     乙醇/水30∶70     乙醇/水30∶70
洗脱温度     45℃     45℃
洗脱级分1：重量％，TS雌酮        mg/L(重量％，TS)马烯雌酮    mg/L(重量％，TS)洗脱级分2：重量％，TS雌酮        mg/L(重量％，TS)马烯雌酮    mg/L(重量％，TS)洗脱级分3：重量％，TS雌酮        mg/L(重量％，TS)马烯雌      mg/L(重量％，TS)洗脱级分4：重量％，TS雌酮       mg/L(重量％，TS)马烯雌酮   mg/L(重量％，TS) 4.30.0     (0.00)24.8    (0.06)1.92788.6  (14.68)1528.0  (8.04)0.2193.2   (9.66)99.8    (4.99)0.17.1     (0.71)9.3     (0.93) 0.2342.7   (17.14)182.6   (9.13)0.92053.5  (22.81)1120.1  (12.45)0.238.9    (1.95)19.8    (0.99)0.10.0     (0.00)0.0     (0.00)
实施例3(具有冷却步骤的根据本发明的方法)：
在中性洗涤期间激素损失的减少
如在实施例1和2中进行操作，但要在冷却条件下。冷却是为了在中间洗涤期间尽量减少激素损失。中间洗涤不是于室温而是用冰水来施行，这样可以将激素的损失减少直至大约50％左右，特别是当在处理过程中温度为实际的0℃或者接近0℃时。在此推荐不只提供冰水，而更确切地说是将整个柱冷却至0℃，这是因为冰水会由于以室温存在的柱内含物而相对快速地变暖。
实施试验
对于中间洗涤所需的0℃的柱温度可通过在先进行的碱性洗涤的冷却而实现，即碱性洗涤已经于0℃进行。当碱性洗涤的时候，提供5个柱床体积的0℃的洗涤液在此足够用于将柱内含物从室温冷却至0℃。然后，紧接着的中间洗涤就可以于0℃进行。除了尽量减少激素损失外，也一起检测在碱性洗涤期间对于甲酚的分离可能出现的温度影响。
为了直接的对比可进行两个实验。
实施例3a：
于室温进行碱性洗涤和中间洗涤。
实施例3b：
于0℃进行碱性洗涤和中间洗涤。
所有的其他步骤以如上面对于WO 98/08526中描述的方法而规定的或者在实施例1和2中规定的标准方法来施行。
试验结果
表III给出了试验参数以及于室温和于0℃的温度的试验结果。
试验结果使得可以清晰地看出
a)将温度降低至0℃不会影响碱性洗涤即甲酚的去除。甲酚的分离定量地进行。表III作了概括。
b)降低温度可将在中间洗涤期间的激素损失减少大约50％左右。表III作了概括。
表II：激素损失和通过干0℃施行中间洗涤而尽量减少其损失
实施例编号     3a     3b
    室温(T＝大约25℃)     冰水(T＝大约0℃)
雌酮     2.7重量％     1.8重量％
马烯雌酮     3.4重量％     1.4重量％
因此，在碱性洗涤期间给予温度调至大约0℃的氢氧化钠溶液提供了一种简单的可能性，即通过同样地于大约0℃进行操作来减少中间洗涤步骤中的激素损失而不会影响甲酚的分离。
在中间洗涤期间降低温度至大约0℃使得能够尽量减少激素损失，即可以将通过附加的中间洗涤步骤而无法避免的激素损失减少直至大约50％左右。
如果在中间洗涤之前实施的碱性洗涤同样于大约0℃进行，那么在中间洗涤期间的柱温度调节可以简单的方式来达到。降低温度不会对于在碱性洗涤中发生的甲酚的分离产生负面影响。
表III：于室温和在冷却条件下施行根据本发明的方法
    实施例编号     3a     3b
    室温(T＝大约25℃)     冰水(T＝大约0℃)
处理步骤a)：
最初PMU雌酮        mg/L马烯雌酮    mg/L甲酚        mg/L 64.957.9329.0 65.457.6333.0
处理步骤b)：
洗涤水＝NaOH水溶液     pH13     pH13
洗涤级分1：雌酮       mg/L马烯雌酮   mg/L甲酚       mg/L洗涤级分2：雌酮       mg/L马烯雌酮   mg/L甲酚       mg/L洗涤级分3：雌酮       mg/L马烯雌酮   mg/L甲酚       mg/L洗涤级分4： 4.40.055.128.831.56942.50.011.52215.2 1.71.651.627.924.87011.00.018.32774.0
雌酮        mg/L马烯雌酮    mg/L甲酚        mg/L洗涤级分5：雌酮        mg/L马烯雌酮    mg/L甲酚        mg/L     0.00.0280.60.00.076.6     0.63.2268.60.00.044.1
洗涤级分1-5的激素损失雌酮马烯雌酮 1.5％2.1％ 1.3％2.4％
中间洗涤步骤：
洗涤水＝水洗涤级分1：雌酮        mg/L马烯雌酮    mg/L甲酚        mg/L洗涤级分2：雌酮        mg/L马烯雌酮    mg/L甲酚        mg/L洗涤级分3：雌酮        mg/L马烯雌酮    mg/L甲酚        mg/L 0.00.022.813.39.733.248.058.376.0 0.00.019.48.25.911.832.023.30.0
洗涤级分1-3的激素损失雌酮马烯雌酮 2.7％3.4％ 1.8％1.4％
处理步骤c)：
洗脱液         乙醇/水30∶70         乙醇/水30∶70
洗脱温度           45℃           45℃
洗脱级分1：重量％，TS雌酮        mg/L(重量％，TS)马烯雌酮    mg/L(重量％，TS)洗脱级分2：重量％，TS雌酮        mg/L(重量％，TS)马烯雌酮    mg/L(重量％，TS)洗脱级分3：重量％，TS雌酮        mg/L(重量％，TS)马烯雌酮    mg/L(重量％，TS)洗脱级分4：重量％，TS雌酮        mg/L(重量％，TS)马烯雌酮    mg/L(重量％，TS)甲酚        mg/L(重量％，TS)洗脱级分5：重量％，TS雌酮        mg/L(重量％，TS)马烯雌酮    mg/L(重量％，TS)洗脱级分6：雌酮        mg/L马烯雌酮    mg/L 0.276.0   |     (3.80)65.8   |     (3.29)1.01237.0       (12.37)1093.8       (10.94)0.4607.8        (15.20)524.7        (13.12)0.184.6         (8.46)58.2         (5.82)0.0          (0.00)0.121.1         (2.11)7.5          (0.75)9.00.0 0.258.0  |  (2.90)48.2  |  (2.41)0.91145.6   (12.73)1135.0   (12.61)0.5840.0    (16.80)748.4    (14.97)0.1144.6    (14.46)107.3    (10.74)0.0      (0.00)0.134.3     (3.43)17.9     (1.79)15.23.4
实施例4(游离激素含量的减少)：
依照上述实施例1-3中的处理方式可以研究出当使用根据本发明的方法时游离激素的含量是如何减少的。结果在下面的表IVa(无中间洗涤步骤的对照试验)和IVb(有中间洗涤步骤的根据本发明的试验)中进行了描述。
表IV：游离激素的最小化
表IVa：无中间洗涤步骤的对照试验
            浓缩物中游离型雌激素             浓缩物中以干物质含量
                   的含量                 计的结合型雌激素的总含量
                  (重量％)                          (重量％)
试验1               3.21                              3.2
试验2               3.67                              4.4
试验3               2.38                              9.2
试验4               4.14                              12.2
试验5               4.03                              9.9
表IVb：有中间洗涤步骤的试验(根据本发明)
              浓缩物中游离型雌激素               浓缩物中以干物质含量
                   的含量                     计的结合型雌激素的总含量
                  (重量％)                          (重量％)
试验6               0.0                              25.2
试验7               0.77                             17.2
试验8               0.35                             23.9
试验9               0.20                             29.3
试验10              0.0                              27.7

Claims (7)

1.从妊娠牝马尿中获得酚类尿容物贫乏的天然结合型雌激素混合物的方法，在该方法中
a)视情况去除黏液物质和固体物质、该尿液的经浓缩的浓缩物或者通过该尿液的膜过滤而获得的经浓缩的尿滞留物，与足够用于吸附尿液中含有的结合型雌激素混合物的数量的聚合物吸附树脂进行接触，然后将上载了结合型雌激素混合物的聚合物吸附树脂与剩余的尿液分离开；
b)用调整pH范围至至少12.0的洗涤水洗涤上载了结合型雌激素混合物的半极性聚合物吸附树脂；和
c)将经洗涤的吸附树脂与足够用于解吸在其上面吸附的结合型雌激素混合物的数量的洗脱液进行接触，该洗脱液为可与水混合的有机溶剂选自可与水混合的醚、低级烷醇和低级脂族酮，或者为由可与水混合的有机溶剂和可能调整至碱性的水所组成的混合物，然后将含有天然结合型雌激素混合物的洗脱物与吸附树脂分离，并视情况进行浓缩，其特征在于，
在处理步骤b)和c)之间进行中间洗涤，在该洗涤中用水洗涤上载了结合型雌激素混合物的聚合物吸附树脂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，中间洗涤步骤于室温以下的温度进行，特别是于0℃-10℃的温度，优选于比0℃稍高的温度下进行。
3.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，将用于中间洗涤步骤的洗涤水预冷却至室温以下的温度，特别是0℃-10℃的温度，优选比0℃稍高的温度。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将在处理步骤b)中所使用的调整至碱性的洗涤水预冷却至室温以下的温度，特别是0℃-10℃的温度，优选比0℃稍高的温度。
5.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，中间洗涤步骤和先施行的处理步骤b)于室温以下的温度进行，特别是0℃-10℃的温度，优选比0℃稍高的温度。
6.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，所使用的装置如用于装载聚合物吸附树脂的反应器或者已经含有聚合物吸附树脂的反应器和/或所使用的PMU，相应地预冷却至室温以下的温度进行使用，特别是预冷却至0℃-10℃的温度，优选预冷却至比0℃稍高的温度。
7.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，使用半极性吸附树脂作为聚合物吸附树脂，优选使用非离子型半极性吸附树脂。
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