CN1234740A - 由牝马尿获取雌激素的方法 - Google Patents

Abstract

本文说明了通过于RP－硅胶上固相萃取来自妊娠牝马尿中的结合雌激素混合物,获取一种含有来自牝马尿的天然结合雌激素混合物的提取液的方法。

Description

由牝马尿获取雌激素的方法

本发明涉及由妊娠牝马的尿液中获取一种天然结合雌激素混合物的方法。

雌激素在医学上用于激素替代疗法中。雌激素混合物尤其应用于治疗和预防妇女在自然的或人工的绝经期后出现的更年期病症。例如存在于妊娠牝马尿液中的、天然结合雌激素混合物对此具有特别好的疗效和良好的耐受性。

溶解于妊娠牝马尿液(=妊娠牝马(mare)尿液，以下简称为“PMU”)中的固态物质含量自然可以变动于很大的范围内，一般来说在40-90g干物质/升的范围内。除尿素和其它常见的尿内含物质以外，在PMU的固态物质中所含有的酚类成份的量约为干物质的2-5重量％。在这些酚类成份中有甲酚和称为HPMF的二氢-3,4-双[(3-羟基苯基)甲基]-2(3H)-呋喃酮。它们可以以游离的或结合的形式存在。在PMU中含有一种天然的雌激素混合物，它基本上是以结合的形式存在，例如作为硫酸单酯-钠盐(以下简称为“硫酸盐”)。结合雌激素的含量(以雌激素硫酸盐计算)可以为干物质的0.3-1重量％。

通常用不可与水混溶或者仅可少量与水混合的极性有机溶剂，例如醋酸乙酯、正-丁醇或环己醇，经过萃取由PMU获得含有结合雌激素的提取物。但在这种液-液萃取过程中会出现诸多问题，譬如大量泡沫形成、沉淀形成、乳液形成和相分离差。一般来说需要进行多个萃取步骤，从而丧失大量雌激素而仅仅获得部分雌激素。

如果意欲处理少量尿液和浆液用以气相色谱分离法分析测定雌激素，Heikkinnen等(临床化学(Clin.Chem.)27/7,(1981),1186-1189)和Shackleton等(临床化学学报(Clinica Chimica Acta)107,(1980),231-243)建议：借助于柱，该柱含有包含十八烷基硅烷残基并且经过硅烷化的硅胶(Sep-Pak^R C₁₈-柱，制造者：Waters Ass.Inc.Milford,MA，美国)，固相萃取雌激素。在此过程中雌激素用甲醇由柱中洗脱。但是没有说明在含有雌激素的洗脱液中所含有的其它物质。

本发明目的是，研究出一种由PMU获得天然结合雌激素混合物的工业方法，同时又能避免迄今常用的液-液萃取方法中的已知缺点，该方法能提供一种贫化了酚类尿内含物质、并且基本上不含HPMF的产物。

现已发现一种方法，应用该方法可以在用疏水硅胶进行固相萃取的过程中获得一种贫化了酚类尿内含物质、并且基本上不含HPMF的、但却几乎完全保留了PMU天然雌激素含量的混合物，它可以用来作为起始物质，用于制备含有PMU来源的天然结合雌激素混合物作为活性物质的药物。

获得贫化了酚类尿内含物质的、PMU来源的天然结合雌激素混合物的本发明方法具备如下特点：a)  将一种尿液，它为不含有粘液物质和固态物质的尿、该尿的一种浓

缩液或者一种通过超滤该尿而获得的浓缩尿滞留液，用能够将pH

值调节为至少12的足够量的水溶性碱处理，接着通过添加足够量

的酸水溶液，将用碱处理过的尿液的pH值调节至5-8.5的范围内，b)  将用碱处理过的、pH值调节至5-8.5的范围内的尿液，与为了吸

附尿液中所含有的结合雌激素混合物所必需的足够量的疏水硅胶

接触，然后将负载有结合雌激素混合物的疏水硅胶由剩余的尿液中

分离，c)  将负载有结合雌激素混合物的疏水硅胶，用pH值已调节至5-7的、

尤其为pH5的含水缓冲液洗涤，d)  将洗涤过的疏水硅胶与为了解吸已经吸附于其上的结合雌激素混

合物所需要的足够量的洗脱液接触，该洗脱液为一种由水和可与水

混溶的有机溶剂所组成的混合液，所述有机溶剂选自可与水混溶的

醚、低级链烷醇和低级脂族酮，然后将含有天然结合雌激素混合物

的洗脱液由疏水硅胶中分离和任选浓缩。

在本发明方法中可以应用PMU本身、由此通过浓缩所获得的浓缩液或者由此通过膜过滤所获得的滞留液。将所收集的尿液首先按照本身已知的方法去除粘液物质和固态物质。较为合适的是使固态物质和粘液物质沉积，然后按照本身已知的分离方法，例如倾析法、分离法和/或过滤法将它们分离。因此例如可以将PMU引入通过本身已知的分离装置例如分离器、过滤装置或者沉降器。作为分离装置可以应用例如砂床、或者商用的分离器，例如喷嘴式分离器或者室分离器。需要时还可以应用微滤装置或超滤装置，在应用这些装置的同时还可以达到过滤后的PMU基本上无菌无病毒。

需要时可以向尿液内添加贮藏剂、杀(霉)菌剂、杀(细)菌剂和/或驱虫剂。

如果替代PMU应用浓缩的PMU-滞留液，可以由PMU通过本身已知的膜过滤方法获得之。由于所应用的PMU的不同、膜过滤中所应用的膜例如其孔径的不同、以及过滤条件的不同，因此滞留液中固态物质的含量及其组成成份也可以有所不同。例如在应用毫微过滤膜时，可以在PMU-滞留液中近乎毫无损失地获得雌激素浓缩液，同时又能去除高达50重量％的低分子量PMU-内含物。在本发明方法中所应用的PMU-滞留液可以浓缩至约1∶10的比例，例如约1∶7，并且因此其体积可以浓缩至约原PMU-体积的1/10，例如约1/7。

在方法步骤a)中，向尿液内添加了足够量的水溶性碱，以调节pH值为至少12，尤其是13-14。作为水溶性碱合适的有无机或有机的、溶解于尿液中的惰性碱，其碱性强度足以使pH值至少达到12。这样合适的有碱金属-或碱土金属氢氧化物，尤其是氢氧化钠，或者合适的还有有机碱，如季低级烷基氢氧化铵。优选添加水溶液形式的、碱含量为至少20重量％，优选为40-60重量％的碱。较为合适的尤其是45-55％浓度的氢氧化钠溶液。在这个碱性预处理过程中，尿液的pH值被调节为至少12，例如12-14的范围内，优选约13，并且保持该碱性pH值的时间一般约1/2至2小时，以足以使尿液中所含有的内酯类分解。所选择的处理条件必须使结合雌激素在此过程中不受到攻击。因此优选在室温下，在限制碱的添加量至达到所希望的pH值在12-14范围内为准的条件下，进行该处理过程。根据所应用的PMU的成份不同，为达到pH值在12-14范围内所需碱的量也有所不同。在应用50％氢氧化钠溶液时，基于10升PMU，一般来说约100-700ml 50％氢氧化钠溶液的量就已足够。接着通过添加酸水溶液，调节pH值至5-8.5范围内，优选7-8.5，尤其是8-8.5。作为酸合适的有可溶解于尿液中的惰性有机或无机酸，例如盐酸、硫酸、磷酸或低级羧酸如醋酸。较为合适的例如有浓盐酸水溶液。根据所应用的PMU成份不同和为了碱性调节所应用的碱量的不同，达到上述pH值范围所需要的酸量也有所不同。在应用浓盐酸的情况下，一般来说相对于1升PMU添加约25-100g浓盐酸溶液即可达到所需要的pH值。

在方法步骤b)中可应用的疏水硅胶为本身已知的反相硅胶(=反相硅胶，简称为“RP-硅胶”)，它为一种化学改性硅胶，携带有疏水性功能基团或配体。合适的有例如硅烷化的RP-硅胶，它们所含有的疏水性功能基团为正-十八烷基二甲基甲硅烷基氧基-、正-辛基二甲基甲硅烷基氧基-、或二甲基羟基甲硅烷基氧基-残基。合适的例如有平均颗粒大小在15-500μm范围内的硅烷化的硅胶，尤其合适的是平均颗粒大小在0.05-0.3mm范围内的、含有二甲基羟基甲硅烷基氧基-残基的硅胶，例如Merck公司的“硅胶60/二甲基硅烷衍生物”。

按照本发明可以通过将任选浓缩的PMU或者其滞留液与疏水硅胶接触，以进行结合雌激素吸附至疏水硅胶上的吸附过程，其中将在方法步骤a)中预处理过的尿液加至含有硅胶的反应器中，使在其中与硅胶接触，并且保持足够长的时间以使吸附雌激素。在完成结合雌激素吸附于疏水硅胶上的吸附过程后，可以按照本身已知的方式，将负载有结合雌激素混合物的硅胶由剩余的尿液中分离出来。合适的是将尿液通过含有硅胶的柱，其流通速度应使有足够长的接触时间以吸附雌激素。例如合适的流通速度相当于5-20体积份PMU/1体积份硅胶/小时。优选在室温下进行吸附作用。合适的是通过在稍稍的过压下或者在低压下操作，以调节控制尿液通过反应器的流速。根据所应用硅胶的种类不同，和方法步骤a)中预处理过的尿液内固态物质含量的不同，所应用的疏水硅胶的量也可以不同。在应用预处理过的PMU时，例如可以用至多80体积份预处理过的PMU来负载1体积份疏水硅胶，而能使在流出的尿液中检测不到雌激素。在应用预处理过的PMU-浓缩液或PMU-滞留液时，疏水硅胶的负载容量减少程度与它们浓缩程度一致。例如可以用相当于30-80，优选40-50体积份PMU的尿液来负载1体积份疏水硅胶。

在方法步骤c)中，将负载有结合雌激素混合物的疏水硅胶用一种pH值已调节至5-7范围的，优选约为5的含水缓冲液洗涤。作为洗涤液优选应用pH值调节约至5的含水的乙酸/乙酸盐-缓冲液。尤其合适的是0.1-1摩尔浓度，优选0.1-0.2摩尔浓度的乙酸/乙酸盐-缓冲液。洗涤液的量的选择应能足以基本上洗除酚类尿内含物，但是又没有明显量的结合雌激素被同时洗除。较为合适的是例如每床体积疏水硅胶应用8-15，尤其是9-10床体积洗涤液。在此较为合适的是，以5-20体积份洗涤液/1体积份硅胶/小时的流速，使洗涤液通过含有疏水硅胶的反应器。

接着在方法步骤d)中，将洗涤过的、负载有结合雌激素混合物的疏水硅胶，用洗脱结合雌激素混合物所需足够量的洗脱液处理，这样可获得含有PMU天然结合雌激素混合物的洗脱液。本发明所应用的洗脱液为一种由水和可与水混溶的醚、低级链烷醇和/或低级脂族酮所组成的混合液。作为洗脱液的醚成份，合适的有可与水混溶的环醚如四氢呋喃或二噁烷，合适的还有可与水混溶的开链醚例如乙二醇二甲醚(=单甘醇二甲醚)、二甘醇二甲醚(=二甘醇二甲醚)或者乙氧基乙氧基乙醇(=二甘醇一乙醚)。作为低级链烷醇，合适的有可与水混溶的、带有1-4个，优选1-3个碳原子的烷基醇，尤其是乙醇或异丙醇。作为低级脂族酮，合适的有可与水混溶的、带有3-5个碳原子的酮尤其是丙酮。尤其合适的是，洗脱液中的有机溶剂为乙醇。洗脱液中可与水混溶的有机溶剂与水的体积比可以在40∶60至20∶80的范围内，优选约30∶70。所应用的洗脱液量可以约为3-5床体积洗脱液每床体积疏水硅胶。较为合适的是，洗脱液通过含有负载疏水硅胶的反应器的流速应使有足够的接触时间使结合雌激素混合物完全洗脱。在应用体积比为30∶70的四氢呋喃和/或乙醇与水的混合液时，合适的流速例如是5-20体积份洗脱液/1体积份硅胶/小时。较为合适的是，通过在稍加提高的压力下，例如在高至0.2巴的过压下操作以调节流速，并且以多个馏分形式接收洗脱液。各个洗脱馏分中结合雌激素和酚类尿内含物如甲酚和HPMF的含量可以按照本身已知的方式，通过高效液相色谱分离法(=高效液相色谱分离法，简称为“HPLC”)测定。

在洗脱过程中，首先获得的是浅色甚至无色的、基本上不含雌激素的前馏分，其量一般约相当于一个床体积。大部分量的结合雌激素，例如在80-99％之间的起始-PMU中存在的结合雌激素量，存在于后面的暗黄棕色主馏分中，其量一般约为1-2床体积。在后面的后续馏分中一般只含有微量结合雌激素。如果得到的后续馏分还含有基于干物质超过10重量％的结合雌激素和低于0.6重量％的甲酚和HPMF，可以将它们与富含雌激素的主馏分合并后用于进一步处理中。

按照前面所叙述的方法由硅胶中分离出来的主要洗脱液，含有PMU天然结合雌激素混合物，此外还有很少量的原本在PMU中存在的酚类尿内含物质。这种洗脱液可以作为起始物质用于制备含有天然结合雌激素混合物的药物。需要时可以按照本身已知的方式，将此洗脱液进一步浓缩，以便获得基本上不含有机溶剂的、适合于盖伦氏制药进一步处理的浓缩液。需要时还可以通过喷雾干燥法制备不含洗脱液的固态物质混合物。如果应用天然结合雌激素混合物制备固态药物，则较为合适的是，在浓缩或者喷雾干燥前，即已向含有结合雌激素的洗脱液中混合添加固态载体物质，以此方式可以获得含有结合雌激素和载体物质的固态混合物。含有该雌激素混合物的洗脱液、以及由此制备的浓缩液或者喷雾干燥的固态产物，可以按照已知的方式制备成固态的或液态的盖伦氏制剂，例如片剂、糖衣丸剂、胶囊或乳液剂。可以按照本身已知的方法，应用常见的固态或液态载体物质例如淀粉、纤维素、乳糖、或滑石粉、或者液态石蜡，和/或应用常见的制药学佐剂，例如片剂崩解剂、增溶剂或贮藏剂，制备这些盖伦氏制剂。可以将含有结合雌激素的产物与制药学载体物质或佐剂一起，按照本身已知的方式混合，然后将混合物转化成合适的剂型。

以下实施例可以进一步说明本发明，但并非仅限于此。

实施例1-5

由PMU获得基本上贫化了酚类尿内含物质的、含有PMU中所含有的天然结合雌激素混合物的提取物的一般操作程序。A)  PMU的预处理

将10l通过5cm高的砂床或者通过一个微滤装置过滤后的

PMU(干物质含量(=TS)以及通过HPLC所测定的雌酮硫酸盐、甲

酚和HPMF的含量，参见以下实施例表)，在剧烈搅拌下通过添加

50％氢氧化钠水溶液(20℃下密度为1.52g/ml)调节至pH13(所添

加的NaOH溶液量参见实施例表)，然后在室温下搅拌1小时。接

着通过添加浓盐酸水溶液(约35％)将碱性尿液调节至pH8-8.5。B)  PMU的雌激素成份吸附于RP-硅胶

用100g(约等于约193ml的体积=1床体积)RP-硅胶(Merck公司的

“硅胶60/二甲基硅烷衍生物”，订货号：7719，颗粒大小63-200μm)

填充50cm高、直径为5cm的柱。将柱首先用0.5l水，之后用0.25

l甲醇，然后再次用0.5l水洗涤。

将在A)中预处理过的尿液在0.2巴的过压下以60ml/分钟的流速通

过柱。PMU中的雌激素完全吸附于如此负载的RP-硅胶柱上。借

助于HPLC检测所流出的尿液中结合雌激素含量，实验证明，它几

乎不含有雌激素。摒弃流出液。C)  负载的RP-硅胶柱的洗涤

用2l(约等于10床体积)0.15摩尔浓度的醋酸/乙酸钠-缓冲液洗涤

负载的RP-硅胶柱。制备缓冲液的方法是，向0.15摩尔浓度醋酸水

溶液中添加固态乙酸钠(约107g)直至达到pH5。借助于HPLC测

定流出的洗涤液中雌酮硫酸盐、甲酚和HPMF的含量，其含有低

于5％起始-PMU中的雌激素含量。D)  由洗涤后的RP-硅胶柱中解吸结合雌激素，以及富含雌激素的洗脱

液馏分的分离

在0.2巴的过压下以约60ml/分钟的流速使1l洗脱液(水/溶剂-混合

液，组成成份参见以下实施例表)通过柱。将流出的洗脱液收集成

多个馏分(体积分别约为200ml约等于1床体积)。借助于HPLC检

测各个馏分中的雌酮硫酸盐、甲酚和HPMF的含量。收集第一馏

分，期间洗脱液为无色至淡黄色。该馏分的体积为150-200ml。

该馏分仅仅含有微量的雌激素硫酸盐。

一旦该洗脱液的颜色转为明显的暗黄色至棕色时，则收集约200ml

的第二馏分。

在该馏分中所含有的结合雌激素含量约为萃取柱上负载的结合雌

激素的总量的80-98％。剩余的馏分仅仅含有很少量的雌激素硫酸

盐。任选地在蒸馏去除溶剂后，可以将该剩余馏分再次送至方法步

骤B)。

以下实施例表中分别说明了含有大部分量结合雌激素的第2馏分中

以重量％表示的TS-含量、和通过HPLC测定的雌酮硫酸盐、甲酚

和HPMF的含量。该馏分为适合于进一步盖伦氏处理的提取液。E)  RP-硅胶柱的再生

为了再生，首先用2l水，之后用0.5l甲醇，然后再次用2l水洗

涤硅胶柱。之后该柱可以重新应用于方法中。该柱可以多次地，例

如至多10次地被再生和再应用。

实施例号	1	2	3
				起始-PMU重量％TS雌酮硫酸盐含量    mg(约等于重量％TS)甲酚含量          mg(约等于重量％TS)HPMF含量          mg(约等于重量％TS)	6.0860.0(0.14)10170.0(1.70)680.0(0.11)	7.31040(0.14)2220(0.30)840(0.12)	7.31090(0.15)2410(0.33)830(0.11)
预处理添加g50％NaOH(pH)添加g浓HCl(pH)	629(13)767(8.5)	250(13)284(8.5)	252(13)263(8.0)
				洗脱液	四氢呋喃/水30∶70	乙醇/水30∶70	异丙醇/水30∶70
洗脱液馏分2重量％TS雌酮硫酸盐含量    mg(约等于重量％TS)甲酚含量          mg(约等于重量％TS)HPMF含量          mg(约等于重量％TS)	3.1858.2(13.84)18.0(0.29)6.4(0.10)	1.8852(23.7)7.4(0.21)9.2(0.26)	894.2(21.3)10.9(0.26)10.7(0.25)

实施例号	4	5
			起始-PMU重量％TS雌酮硫酸盐含量    mg(约等于重量％TS)甲酚含量          mg(约等于重量％TS)HPMF含量          mg(约等于重量％TS)	7.71250(0.16)2940(0.38)890(0.12)	7.71250(0.16)2940(0.38)890(0.12)
预处理添加g50％NaOH(pH)添加g浓HCl(pH)	291(13)334(7.9)	305(13)347(8.0)
			洗脱液	单甘醇二甲醚/水30∶70	丙酮/水30∶70
洗脱液馏分2重量％TS雌酮硫酸盐含量    mg(约等于重量％Ts)甲酚含量          mg(约等于重量％TS)HPMF含量          mg(约等于重量％TS)	洗脱液馏分2和31045.1(19.97)33.7(0.46)7.3(0.14)	971.9(20.9)14.7(0.32)0  (0.0)

Claims (7)

1．获取贫化了酚类尿内含物质的、来自妊娠牝马的尿的天然结合雌激素混合物的方法，其特点是，a)将一种尿液，它为不含有粘液物质和固态物质的尿、该尿的一种浓缩液或者一种通过膜过滤该尿而获得的浓缩尿滞留液，用能够将pH值调节为至少12的足够量的水溶性碱处理，接着通过添加足够量的酸水溶液，将用碱处理过的尿液的pH值调节至5-8.5的范围内，b)将用碱处理过的、pH值调节至5-8.5的范围内的尿液，与为了吸附尿液中所含有的结合雌激素混合物所必需的足够量的疏水硅胶接触，然后将负载有结合雌激素混合物的疏水硅胶由剩余的尿液中分离，c)将负载有结合雌激素混合物的疏水硅胶，用pH值已调节至5-7的含水缓冲液洗涤，和d)将洗涤过的疏水硅胶与为了解吸已经吸附于其上的结合雌激素混合物所需要的足够量的洗脱液接触，该洗脱液为一种由水和可与水混溶的有机溶剂所组成的混合液，所述有机溶剂选自可与水混溶的醚、低级链烷醇和低级脂族酮，然后将含有天然结合雌激素混合物的洗脱液由疏水硅胶中分离和任选浓缩。

2．按照权利要求1的方法，其特点是，在方法步骤a)中将尿液与碱，优选与碱的水溶液混合，并且在足以使尿内含物中所含的内酯类分解的时间内保持其pH值至少为12。

3．按照上述权利要求之一的方法，其特点是，作为疏水硅胶，应用携带二甲基羟基甲硅烷基氧基残基的、硅烷化的硅胶。

4．按照上述权利要求之一的方法，其特点是，在方法步骤b)中，1体积份疏水硅胶用相当于30至80，优选40至50体积份尿的尿液负载。

5．按照上述权利要求之一的方法，其特点是，在方法步骤b)中，以相当于5-20体积份尿/1体积份疏水硅胶/小时的流速，使尿液通过含有疏水硅胶的反应器。

6．按照上述权利要求之一的方法，其特点是，在方法步骤c)中所应用的洗涤液为一种pH值调节至约为5的乙酸/乙酸盐-含水缓冲液。

7．按照上述权利要求之一的方法，其特点是，在方法步骤d)中所应用的洗脱液为，一种由水和一种可与水混溶的有机溶剂组成的混合液，有机溶剂与水的体积比在20∶80至40∶60的范围内，尤其是30∶70。