CN1569031A

CN1569031A - 病毒灭活/超滤膜分段筛分法制备的血浆组分系列制剂

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Publication number: CN1569031A
Application number: CNA2004100130849A
Authority: CN
Inventors: 巫山
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-04-26
Filing date: 2004-04-26
Publication date: 2005-01-26

Abstract

病毒灭活/超滤膜分段筛分法制备的血浆组分系列制剂，涉及一种有关人类疾病防治用的病毒灭活/超滤膜分段筛分法制备的血浆组分系列制剂。具体过程为：原料血浆，或先进行澄清过滤和纳米膜去除病毒过滤，或加外源性保护剂进行病毒热灭活，然后再用超滤膜分段筛分分离获得各系列组分，经超滤透析和超滤浓缩及除菌过滤，获得血浆组分系列制剂。本发明用原料血浆是在内、外源双重保护剂作用下，故能经受更高强度的病毒灭活处理，获得无传染疾病危险、绝对安全、性能好、疗效佳的制剂。本发明能使血浆中约两百种蛋白质和非蛋白质组分，得到充分、完全、合理地综合利用，制备出均能静脉注射用的组分制剂。本发明投资少、见效快、成本低、效率高。

Description

病毒灭活/超滤膜分段筛分法制备的血浆组分系列制剂

技术领域本发明涉及一种有关人类疾病防治用的病毒灭活/超滤膜分段筛分法制备的血浆组分系列制剂。

背景技术血浆是全血去除(分离)血细胞后获得的无细胞成分的浅黄色胶体溶液。血浆可分为单人份血浆和多人份大混合血浆。单人份血浆是从单个献血员血液中分离获得的血浆，是属血液成分制品之一，用于成分输血。大混合血浆是众多献血员的血浆，是血浆组分制剂的原料，用于制备血浆组分制剂。

用现有技术制备的血浆蛋白制品，常称为血液制品，或血浆制品、血浆制剂、血浆衍生物。血浆蛋白制品是由健康人的血浆、免疫人血浆、免疫动物血浆或血清，或用生物技术产生的蛋白质为原料制备的用于防治人类有关疾病的生物制品类药品，如人血白蛋白、人免疫球蛋白(IgG)、人血或DNA重组的凝血因子以及各种特异性免疫球蛋白等。

传统血浆蛋白制品的制备方法有低温乙醇分段沉淀法、盐析法、层析法、PEG法等，均采用的是化学方法，是依据血浆中各种蛋白质的理化性质的不同，加入化学试剂与之发生反应，对理化性质不同的各种蛋白质进行分段沉淀/溶解，或吸附/洗脱等分离、收集方法，分别获得含某一种蛋白质组分，且并同时含大量杂质，如乙醇等化学试剂、蛋白质变性、裂解产物和被激活产物等成分的混合溶液体系。它们必需再行透析、精制、浓缩等一系列去除杂质成分的精制纯化过程所得的产品，才能达到现有技术常规血液制品质量要求。传统血浆蛋白制品，或称传统血浆蛋白组分制剂，只含单一蛋白质成分。

现有技术制备的血浆蛋白制品及其制备方法存在的主要问题：

1、血浆组分有蛋白质和非蛋白质组分共约两百种，该法只能制造白蛋白、免疫球蛋白制品，以及少量的凝血因子和某些微量蛋白制品等，其它蛋白质和非蛋白质组分都被废弃了；

2、依每升血浆总重量1000克计、可溶性总固体量为80-90克计、总蛋白为55克计，按该法只能提取其中的蛋白约33克/升血浆，而其中血浆总重量的96.7％、血浆总固体量的60％、血浆总蛋白的40％，都被废弃了；

3、在制备过程中，必需加入乙醇等各种化学试剂，以及乙醇浓度，盐离子浓度，氢离子浓度(PH值)，蛋白质浓度，温度五变因素的调变，使血浆蛋白质经反复凝聚、沉淀、溶解，还要加入助滤剂，并反复离心过滤或压滤，这样，不可避免地会出现大量杂质，及对血浆蛋白质的损伤作用，而影响制品质量；

4、在制备时加入乙醇形成的蛋白质沉淀颗粒及加入的助滤剂等，均是带负电荷的激活剂，对FXIII有极强的激活作用，最终产生PKA，可引起不良临床反应；

5、制备时必需加入乙醇，使血浆蛋白分子脱水、凝聚、沉淀，沉淀颗粒就是蛋白质分子的聚合体，未彻底解聚的蛋白质聚合体(多聚体)，有抗补体活性作用(ACA)，可引起不良临床反应；

6、只有高纯度的白蛋白(纯度96％)和高纯的免疫球蛋白(IgG)(纯度95％)，才能进行静脉注射。

现有《一种冻干人血浆病毒灭活方法》(专利申请号02103960)，它包含有以下步骤：将冰冻血浆置于融浆罐中，融浆，融浆置于灭活病毒罐中，加磷酸三丁酯和曲拉通，搅拌、升温，移入杯式离心机中，加植物油萃取灭活剂，进行离心分离，将分离后的水相血浆经含有C18树脂层析柱制得不含磷酸三丁酯和曲拉通-100的血浆，将血浆经超滤膜进行浓缩后经孔径为0.2微米的膜过滤除菌后进行分装，将分装的血浆置于冻干机内进行真空低温升华，干燥密封后在沸水浴中进行干热灭活制得粉状成品血浆。其血浆制品病毒灭活更彻底，使用更安全，且具有保存和运输更方便的优点。

发明内容本发明的目的是针对现有技术制备的血浆制品所存在的问题，旨在提供一种无任何病毒活性、无任何微生物活性、无传染疾病危险的绝对安全的、性能更好、功能更全、疗效更佳、质量稳定，均可静脉注射的病毒灭活/超滤膜分段筛分法制备的血浆组分系列制剂。

本发明目的的实现方式为，病毒灭活/超滤膜分段筛分法制备的血浆组分系列制剂，其过程如下：

原料血浆，用微孔膜逐级澄清过滤和纳米膜去除病毒过滤，经60-10KD超滤膜筛分过滤，获得的超过滤液，或再重复前述的除病毒过滤和超滤膜筛分过滤，而获得的反复超过滤滤液，经除菌过滤，即为小分子组分制剂；获得的超滤截留液，或用原料血浆，加入外源性保护剂进行热灭活，经澄清过滤和纳米膜去除病毒过滤，获得灭活材料。灭活材料(不经超滤膜过滤)，即为全血浆组分或组合类组分；灭活材料，经不同孔径的超滤膜分段筛分分离，获得系列组分；全血浆组分和系列组分，经超滤透析和超滤浓缩，获得符合标准要求的各系列组分，再经除菌过滤，即为血浆组分系列制剂。

外源性保护剂包括有辛酸钠、辛酸钠/乙酰色氨酸钠、山梨醇、甘露醇、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖，其加量为：辛酸钠0.12-0.20mM/克蛋白或辛酸钠/乙酰色氨酸钠各0.06～0.10mM/克蛋白，山梨醇或甘露醇、木糖醇20～120克/升血浆，和/或麦芽糖和/或葡萄糖、蔗糖30～150克/升血浆。

本发明有以下优点：

1)能将血浆中的约两百种蛋白质和非蛋白质组分，筛分分离制备出相应的组分制剂，使血浆能获得充分、合理、全面的综合利用；

2)原料血浆可用ACD抗凝剂抗凝的血浆，具有更好的保护血浆的作用，有利于并有助于保存、保持系列制剂的天然性、稳定性和疗效性；

3)本发明采用的是物理热灭活法，灭活停止后不存留任何残留物；

4)保留原料血浆自身固有的内在天然保护剂(白蛋白)，可充分发挥血浆内大量白蛋白(占血浆总蛋白的50％以上)的自身天然保护剂作用，在此基础上，外加多项外源性保护剂，在内、外源双重保护剂的共同保护、协同保护、互相保护、连环保护作用下进行灭活处理，血浆组分能经受更强烈更深度的病毒灭活/去除处理而不发生凝聚、凝固、裂解、变性，可更好更有效保证血浆成分的天然性、生理活性和疗效性，能获得无传染疾病危险的绝对安全的、性能更好、功能更全、疗效更佳的，无任何病毒活性和无任何微生物活性的系列制剂；

5)没有经乙醇等化学试剂处理，没有出现蛋白质凝聚、沉淀、溶解、激活，无需加助滤剂，不需离心沉淀或压滤，故没有由此产生的杂质，因此制成的制剂没有ACA、PKA等引起的不良临床反应；

6)没有经任何相态(固、液)变化，直接由膜过滤技术筛分分离获得的制剂，可更好、更完善、更有效的、更全面保护血浆组分(蛋白组分和非蛋白组分)的天然性、生理性、纯净性和安全性，获得性能更好、能长期保存的、疗效更佳的系列制剂产品；

7)系列制剂是应用膜孔径大小不同的超滤膜进行分段筛分，以获得分子量不同的血浆组分系列制剂，制备方法是属物理过滤筛分法，简单方便、快速可靠、没有相态(固相、液相)变化造成对蛋白质性能的损伤和对制剂质量的影响；

8)可直接制备出系列组分制剂，如健康人血浆和免疫人血浆系列组分制剂中的高分子量组分制剂、大分子量组分制剂、中分子量组分制剂、小分子量组分制剂、组合组分制剂、全血浆组分制剂，以及免疫动物血清免疫蛋白制品原料组分和生物技术产生的目的蛋白制品原料组分等，制剂均是静脉注射剂，具有速效、高效、持久疗效作用；

9)制备出的原料组分，体积小，便于保存，并能长期保存，有助于进一步加工、纯化制备出高质量、纯度高的制剂；

10)本发明系列制剂，是用膜过滤筛分分离技术获得，如同普通血液中心和单采血浆站能分离的血液成分分离方法一样的简单方便，无需深低温车间和相关的复杂设备，投资少、见效快、成本低、效率高、生产周期短，可更大规模的投料生产，且劳动强度小，有利于生产环境改善，有利于环保；

11)制备工艺符合血液制剂生产的现代化、规模化、自动化生产要求，符合血浆制剂生产的GMP质量管理要求。

附图说明附图为本发明工艺流程图

具体实施方式参照附图，本发明的实施过程是，取原料血浆，用膜孔径不同(如10-5-1-0.45-0.22μM)的一组微孔膜进行逐级澄清过滤和纳米膜(如BMM35μM)去除病毒过滤，经60-10KD超滤膜筛分过滤，获得超过滤液或反复超过滤滤液和超滤截留液。其中超过滤液或反复超过滤滤液，经除菌过滤，即为小分子组分制剂；其中截留液，或直接用原料血浆，加外源性保护剂后，在60℃±20℃进行5-15小时以上的湿热灭活，或经冻干成粉后，在80℃±20℃进行50-100小时以上的干热灭活，再经微孔膜逐级澄清过滤和纳米膜去除病毒过滤，获无病毒活性材料(称灭活材料)，不经超滤膜筛分者，即为全血浆组分；灭活材料经截留分子量不同的超滤膜分段筛分分离，获得各系列组分。全血浆组分和各系列组分，再用透析用超滤膜进行超滤透析和超滤浓缩及用0.20-0.22μm微孔膜进行除菌过滤，获得无任何微生物活性、无热原质、适宜于人体静脉输注用的血浆组分系列制剂，制剂可以是液体剂型或冻干剂型。

原料血浆包括用ACD抗凝剂抗凝的健康人血浆、免疫人血浆、免疫动物血清或血浆、生物技术产生的目的蛋白溶液。

超滤膜分段筛分分离法获得的各种血浆组分系列制剂，举例如下：

一、健康人血浆天然组分系列制剂：

不经超滤膜筛分的灭活材料即为全血浆组分制剂

1、用截留分子量160～300KD的超滤膜对健康人血浆、免疫人血浆灭活材料进行筛分分离，获得高分子组分制剂和大、中、小分子组合组分制剂或材料，具体如下：

①获得的截留浓缩液，称健康人血浆高分子组分制剂，或称凝血因子(FI、FVIII)制剂，主要组分为分子量大于160～300KD的FI、FVIII，主要用于治疗甲型血友病和纤维蛋白原缺乏所致的凝血障碍。

②获得的超滤液，称健康人血浆大、中、小分子组合组分制剂或材料，或称IgG/白蛋白/小分子组合组分制剂，主要组分为分子量小于160～300KD的IgG、白蛋白及小分子血浆组分(蛋白组分和非蛋白组分)。它可进一步筛分为相应组分制剂，也可作为含此三种组分的组合制剂。

2、用截留分子量70～150KD的超滤膜对大、中、小分子组合组分制剂或材料进行筛分分离，获得大分子组分制剂和中、小分子组合组分制剂或材料，具体为：

①获得的截留浓缩液，称健康人血浆大分子组分制剂，或称免疫球蛋白(IgG)制剂，主要成分为分子量156KD的IgG。它主要用于治疗免疫球蛋白缺乏病症，自身性免疫性疾病和感染性疾病。

②获得的超滤液，称健康人血浆中、小分子组分制剂或材料，或称白蛋白/小分子组合组分制剂，主要组分为分子量小于70～150KD的白蛋白及血浆小分子组分(小分子蛋白组分及非蛋白组分)。它可作进一步筛分分离为相应组分制剂，也可作为含此两种组分的组合制剂。

3、用截留分子量60-10KD的超滤膜对中、小分子组合组分制剂或材料进行筛分分离，获得中分子组分制剂和小分子组分制剂，具体有：

①获得的截留浓缩液，称健康人血浆中分子组分制剂，或称白蛋白制剂，主要成分为分子量66KD的白蛋白。它主要用于防治创伤性、出血性休克，严重烧伤及低蛋白血症等。

②获得的超滤液，包括原料血浆首先经逐级澄清过滤和纳米膜除病毒过滤后，直接用60-10KD超滤膜进行筛分分离获得的超滤液，称健康人血浆小分子组分制剂，或称生物反应调节剂/水盐平衡剂，主要成分为分子量小于10～60KD的血浆蛋白质组分和非蛋白质组分[糖类，脂类，无机盐、氨基酸、其他有机酸、维生素、微量元素、激素、细胞因子、水分]，是人体天然生理溶液。主要作生物反应调节剂和水盐平衡剂，有增强人体免疫功能和免疫调节作用，以及补充和调节人体水盐平衡和补充电解质等作用，可用于治疗肿瘤化疗、放疗及由各种原因所致的低白细胞等低血象症、肾性贫血，及作血液净化的交换液和水盐平衡的补液治疗等。

(二)免疫人血浆天然组分系列制剂：

同健康人血浆天然组分系列制剂的筛分方法和步骤，获得的系列组分与制剂也完全相对应。只是其中的IgG组分制剂是特异性免疫球蛋白(IgG)制剂，用于相应疾病的特异性被动免疫防治。

(三)免疫动物血清免疫球蛋白(制品)原料组分：

用截留分子量70～150KD和160～300KD的两种超滤膜，分别对灭活免疫动物血清材料进行筛分分离，获得分子量与相关动物的IgG分子量(约156KD)相近的组分，即为免疫动物血清免疫球蛋白制品的原料组分，供进一步精制纯化制备成相应制品。它为制备动物免疫球蛋白纯化制品，提供了经初步纯化的经病毒灭活的原料组分，更便于精制加工制造出相应免疫球蛋白制品，有助于提高相关产品的产量和质量。

(四)生物技术产生的目的蛋白(制品)原料组分：

依目的的蛋白质分子量的大小，选用截留分子量比目的蛋白分子量略大和略小的两种超滤膜，分别对灭活材料进行筛分分离，可获得目的蛋白组分，即为目的蛋白(制品)原料组分，为进一步纯化制备成相应目的蛋白制品，提供了经初步纯化的、经病毒灭活的原料组分，便于进一步精制纯化制备成相应的目的蛋白制品。

上述(一)、(二)、(三)、(四)制得的制剂和/或材料，可以是液体剂型或是冻干剂型，同时也均是供进一步用其他方法纯化为高纯度制剂的原料组分。

Claims

1、病毒灭活/超滤膜分段筛分法制备的血浆组分系列制剂，其特征在于，其过程如下的制备方法及其制备的系列制剂和/或原料组分：

取原料血浆，经逐级澄清过滤、纳米膜除病毒过滤和60-10KD超滤膜筛分过滤，获得的超过滤液，或再重复前述的除病毒过滤和超滤膜筛分过滤，而获得的反复超过滤滤液，经除菌过滤，即为小分子组分制剂；

获得的超滤截留液，或取原料血浆，再经如下步骤：

1)加外原性保护剂，在60℃±20℃，进行5-15小时以上的湿热灭活，或经冻干后，在80℃±20℃进行50-100小时以上的干热灭活；

2)用膜孔径不同的一组微孔膜进行逐级澄清过滤和经纳米膜去除病毒过滤，获得经病毒灭活/去除的材料，称灭活材料；

3)灭活材料，不经超滤膜筛分即获得全血浆组分；灭活材料，经超滤膜分段筛分分离，获得各系列组分；

4)用透析用超滤膜进行超滤透析和超滤浓缩，以获得符合标准的系列组分制剂；

5)用0.20-0.22μm微孔膜进行除菌过滤，获得无任何微生物活性、无热原质的血浆组分系列制剂及原料组分，包括小分子、中分子、大分子、高分子、综合类、全血浆组分制剂及原料组分等的液体剂型和冻干剂型。

2、根据权利要求1所述的病毒灭活/超滤膜分段筛分法制备的血浆组分系列制剂，其特征在于原料血浆包括用ACD抗凝剂抗凝的健康人血浆、免疫人血浆、免疫动物血清或血浆、生物技术产生的目的蛋白溶液。

3、根据权利要求1、2所述的病毒灭活/超滤膜分段筛分法制备的血浆组分系列制剂，其特征在于用截留分子量160～300KD的超滤膜对健康人血浆、免疫人血浆相关灭活材料进行筛分分离，获得高分子组分制剂和大、中、小分子组合组分制剂或材料。

4、根据权利要求3所述的病毒灭活/超滤膜分段筛分法制备的血浆组分系列制剂，其特征在于用截留分子量70～150KD的超滤膜对大、中、小分子组合组分制剂或材料进行筛分分离，获得大分子组分制剂和中、小分子组合组分制剂或材料。

5、根据权利要求4所述的病毒灭活/超滤膜分段筛分法制备的血浆组分系列制剂，其特征在于用截留分子量60-10KD的超滤膜对中、小分子组合组分制剂或材料进行筛分分离，获得中分子组分制剂和小分子组分制剂。

6、根据权利要求1、2所述的病毒灭活/超滤膜分段筛分法制备的血浆组分系列制剂，其特征在于用截留分子量70～150KD和160～300KD的两种超滤膜，分别对灭活免疫动物血清材料进行筛分分离，获得分子量与相关动物的免疫球蛋(IgG)分子量(约156KD)相近的免疫球蛋白(IgG)组分。

7、根据权利要求1、2所述的病毒灭活/超滤膜分段筛分法制备的血浆组分系列制剂，其特征在于选用截留分子量比目的蛋白分子量略大和略小的两种超滤膜，分别对生物技术产生的目的蛋白组分相关材料进行筛分分离，获得目的蛋白组分。

8、根据权利要求1、2所述的病毒灭活/超滤膜分段筛分法制备的血浆组分系列制剂，其特征在于保全原料血浆中自身固有的天然白蛋白等组分的基础上，加外源性有关保护剂后进行相关灭活处理和超滤膜分段筛分分离，获得的各种血浆组分系列制剂，或/和供进一步用其他方法纯化为高纯度制剂的原料组分。