CN106074600A - 自血浆中分离出的用于增强记忆力的混合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种自血浆中分离出的用于增强记忆力的混合物及其制备方法和应用。该混合物包括多种蛋白质和多种小分子，所述混合物的SDS‑PAGE变性胶电泳包括至少30个条带，其中在分子量大于48kD的条带中包括明显可见的7个条带，所述7个条带的分子量从小到大依次是56kD，68kD，77kD，115kD，175kD，250kD和289kD。该混合物的制备方法依次包括血浆收集、密度梯度离心、透析、一次浓缩、去高峰度蛋白、阴离子交换以及二次浓缩步骤。本发明制备的该混合物不仅可以起到增强记忆力的作用，还可以用于预防、改善和治疗阿尔兹海默症。
Description
技术领域
本发明涉及一种血浆分离物，具体地，涉及一种自血浆中分离出的用于增强记忆力的混合物及其制备方法和应用，该混合物可用于预防、改善和治疗阿尔兹海默症，并具有增强记忆力的作用。
背景技术
阿尔兹海默综合症又叫阿尔兹海默症，其特点是病人的记忆和认知能力逐渐丧失。病人在确诊后3到9年内死亡，占临床死亡病例的50％到56％。该病病因目前的认识是大脑内积累的异常折叠的beta-淀粉样蛋白和Tau蛋白导致了阿尔兹海默症。
阿尔兹海默症目前市场上的药物主要是西药，其特征是必须长期坚持服用，然而却疗效微小，只能缓解部分症状，不能控制病情的发展。长期服用的另外一个缺陷是药物副作用大，同时病人产生药物依赖性。为此市场上急需疗效更好，副作用性更低的药物。
目前的最新研究表明：给年老老鼠持续注射年轻老鼠的血浆能提升年老老鼠的认知水平(Villeda S.A.Young blood reverses age-related impairments in cognitivefunction and synaptic plasticity in mice.Nature Medicine 2014；20:659-663)。为此，血浆中可能含有某些物质能有效的提升阿尔兹海默症患者的认知水平。但是，这些物质的具体组分、以及分离获取方法还未见报道。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种自血浆中分离出的用于增强记忆力的混合物。
本发明的目的之二在于提供上述混合物的制备方法。
本发明的目的之三在于提供上述混合物的应用。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种自血浆中分离出的用于增强记忆力的混合物，所述混合物包括多种蛋白质和多种小分子，所述混合物的SDS-PAGE变性胶电泳包括至少30个条带，其中在分子量大于48kD的条带中包括：分子量从小到大依次是56kD，68kD，77kD，115kD，175kD，250kD和289kD的条带。
在上述混合物中，作为一种优选实施方式，所述混合物的FPLC鉴定具有4个峰，对应的蛋白大小分别是：250kD，120kD，100kD和80kD。
在上述混合物中，作为一种优选实施方式，通过蛋白质谱分析，所述混合物至少含有30个蛋白，包括白蛋白，球蛋白，角蛋白，纤维蛋白原和转运蛋白；通过小分子质谱分析，所述混合物还至少含有20个小分子。
在上述混合物中，作为一种优选实施方式，通过蛋白质谱分析，所述混合物所含蛋白如下：
在上述混合物中，作为一种优选实施方式，通过小分子质谱分析，所述混合物所含的小分子如下：
在上述混合物中，作为一种优选实施方式，所述血浆来源于哺乳动物；优选地，所述血浆来源于人。
上述自血浆中分离出的用于增强记忆力的混合物的制备方法，作为一种优选实施方式，所述制备方法依次包括：血浆收集步骤、密度梯度离心步骤、透析步骤、一次浓缩步骤、去高峰度蛋白步骤、阴离子交换步骤以及二次浓缩步骤。
在上述制备方法中，作为一种优选实施方式，在所述血浆收集步骤中，利用抗凝管收集血液，再通过离心收集上清液，得到血浆；优选地，所述离心转速为500-1500g，离心时间为10-30分钟。
在上述制备方法中，作为一种优选实施方式，在所述密度梯度离心步骤中，将所述血浆收集步骤得到的血浆与Percoll溶液、Forcol溶液或蔗糖溶液混合，建立密度梯度并离心，之后将离心管中最上层红色部分去掉，得到密度梯度离心后产物，其中所述离心的条件为：转速为10000-30000g，时间为2-20h；优选地，所述Percoll溶液、Forcol溶液或蔗糖溶液的浓度为40-60％，所述Percoll溶液、Forcol溶液或蔗糖溶液与所述血浆的体积比为(10-15):(1-3)。
在上述制备方法中，作为一种优选实施方式，在所述透析步骤中，将所述密度梯度离心后的产物放入透析袋或管中进行透析，透析后收集透析袋或管中的产物，作为透析产物；其中所述透析时使用的透析缓冲液为Tris-盐酸缓冲液，磷酸缓冲液或HBS缓冲液；优选地，所述Tris-盐酸缓冲液的浓度为0.2-200mM、pH值为7.0-9.2，所述磷酸缓冲液的浓度为1.0-500mM、pH值为6.0-9.2，所述HBS缓冲液的浓度为0.5-500mM、pH值为6.4-8.4；更优选地，所述透析缓冲液为1mM、pH值为8的Tris盐酸缓冲液；透析时间为20-72h，透析体积比是1:100-1:10000。
在上述制备方法中，作为一种优选实施方式，在所述一次浓缩步骤中，将所述透析产物进行浓缩，得到一次浓缩后产物，其中浓缩前体积是浓缩后体积的10倍以上；优选地，所述浓缩是采用浓缩管离心的方式进行的，所述浓缩管允许1.5-2.5KD的物质通过，所述离心时转速为2000-4000g。
在上述制备方法中，作为一种优选实施方式，在所述去高峰度蛋白步骤中，采用去高峰度蛋白试剂盒将一次浓缩后产物中的高峰度蛋白去掉，得到去高峰度蛋白产物；优选地，所述去高峰度蛋白试剂盒中的洗脱缓冲液对去高峰度蛋白柱子上的一次浓缩后产物进行洗脱时得到的洗脱液，为所述去高峰度蛋白产物；优选地，去掉的所述高峰度蛋白的含量是5mg/ml。
在上述制备方法中，作为一种优选实施方式，在所述阴离子交换步骤中，将所述去高峰度蛋白产物加到阴离子交换柱中，用含有20-500mM氯化钠的Tris-盐酸缓冲液进行梯度洗脱，当洗脱体积为15-35ml时开始收集洗脱液，当洗脱体积为40-85ml时停止收集洗脱液，收集得到的洗脱液为阴离子交换后产物；优选地，所述Tris-盐酸缓冲液的浓度为0.2-200mM、pH值为7.0-9.2。
在上述制备方法中，作为一种优选实施方式，在所述二次浓缩步骤中，将所述阴离子交换后产物进行浓缩，得到二次浓缩后产物即所述混合物，其中浓缩前体积是浓缩后体积的10倍以上；优选地，所属浓缩是采用浓缩管离心的方式进行的，所述浓缩管允许1.5-2.5KD的物质通过，所述离心时转速为2000-4000g。
一种药物组合物，包含上述混合物和药学上可接受的载体；优选地，所述药学上可接受的载体为：药学上可接受的缓冲液、蛋白质、明胶、单糖、多糖、氨基酸、螯合剂、糖醇、聚乙二醇、以及表面活性剂中的一种或多种。更加优选地，所述药物组合物包括如下组分：1倍体积的上述混合物，9倍体积的8.5wt％NaCl或1.5M、pH7.0的PBS；进一步地，所述药物组合物中还包括白蛋白、葡萄糖以及谷氨酰胺，其中，所述白蛋白在所述药物组合物中的质量体积百分比为2％，所述葡萄糖在所述药物组合物中的质量体积百分比为1％，所述谷氨酰胺在所述药物组合物中的质量体积百分比为3％。
一种缓释制剂，包含上述混合物或者上述药物组合物、以及药学上可接受的生物相容物质；优选地，所述缓释制剂的剂型为脂质体、微球、水凝胶、微型渗透泵或微胶囊。
上述混合物、上述药物组合物以及上述缓释制剂在预防、改善或/和治疗记忆力减退类疾病的药物中的应用，优选地，所述记忆力减退类疾病为阿尔兹海默症。
上述混合物、上述药物组合物以及上述缓释制剂在增强记忆力药物中的应用。
包含上述混合物、上述药物组合物或者上述缓释制剂的试剂盒。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明制备的该血浆组分可以用于预防、改善和治疗阿尔兹海默症，该血浆组分经验证可以延缓阿尔兹海默症的疾病进程并有可能逆转阿尔兹海默症的病理性严重程度，此外其还可以起到增强记忆力的作用。
2、本发明提供的从血浆中分离出的混合物可以比血浆和目前药物更有效的提升阿尔兹海默症患者的认知水平。与此同时，长期服用这种血浆组分可以大大降低长期服用西药带来的副作用和药物依赖。
附图说明
图1：鸡尾酒组分Ⅰ(即本发明的从血浆中分离出的混合物)制备阴离子柱层析结果。小鼠血浆经过密度梯度离心、透析、浓缩和去高峰度蛋白后，进行阴离子柱层析。使用阴离子柱SourceQ吸附蛋白，再用含500mM氯化钠的Tris缓冲液进行梯度洗脱，得到洗脱曲线。当洗脱体积为35毫升时开始收集洗脱液，当洗脱体积为45毫升时停止收集洗脱液。收集的洗脱液经过浓缩后即为鸡尾酒组分Ⅰ。
图2：鸡尾酒组分ⅠSDS-变性胶电泳鉴定结果。泳道M：蛋白分子量标准；泳道1-3：鸡尾酒组分。
图3：鸡尾酒组分ⅠFPLC鉴定结果。鸡尾酒组分制备好后，其蛋白组分用FPLC检测，蛋白峰为紫外280nm处的吸光度。
图4：鸡尾酒组分Ⅰ促进原代海马细胞增值的活性图。往原代海马细胞的培养基里分别加入鸡尾酒组分Ⅰ，其他血浆组分A和B，以及未处理的血浆，作为实验组。对照组海马细胞只加DMEM培养基。一天后在显微镜下对海马细胞进行计数，计算实验组细胞数目占对照组细胞数目的比例。
图5：鸡尾酒组分Ⅰ促进原代海马细胞之间突触形成的活性图。往原代海马细胞的培养基里分别加入鸡尾酒组分Ⅰ，其他血浆组分A和B，以及未处理的血浆，作为实验组。对照组海马细胞只加DMEM培养基。一天后在显微镜下对突触数目进行计数，计算实验组突触数目占对照组突触数目的比例。
图6：鸡尾酒组分Ⅰ提升阿尔兹海默症小鼠的记忆力动物模型数据图。将鸡尾酒组分Ⅰ系统地注射到阿尔兹海默症小鼠模型中。通过水迷宫实验，评价给药对阿尔兹海默症小鼠记忆力的提升作用。
图7：不同处理后的原代海马细胞图。往原代海马细胞的培养基里分别加入鸡尾酒组分Ⅰ，其他血浆组分A和B，以及未处理的血浆，作为实验组。对照组海马细胞只加DMEM培养基。一天后在显微镜下对海马细胞进行成像。图中(a),(b),(c),(d),(e)分别是鸡尾酒组分Ⅰ、其他血浆组分A、B、未处理的血浆、DMEM培养基(即对照组)处理后的原代海马细胞。
具体实施方式
为了更好地对本发明的技术特征和效果进行说明，下面采用具体实施方式对本发明进行详细说明，但本发明并不限于此。
本发明提供的一种从血浆中分离出的混合物，所述混合物包括多种蛋白质和多种小分子，所述混合物的SDS-PAGE变性胶电泳包括至少30个条带，其中在分子量大于48kD的条带中包括明显可见的7个条带，所述7个条带的分子量从小到大依次是56kD，68kD，77kD，115kD，175kD，250kD和289kD。
所述混合物的FPLC鉴定具有4个明显峰。所述混合物的制备过程包括如下步骤：透析、一次浓缩、去高峰度蛋白、阴离子交换、二次浓缩。经过以上步骤制备的混合物经过FPLC纯化鉴定具有4个明显的峰(详见图3)，即横坐标在8-18之间的4个峰，从左到右4个明显的峰对应的蛋白大小分别是：250kD，120kD，100kD和80kD。
通过蛋白质谱分析，所述混合物至少含有30个蛋白，包括白蛋白，球蛋白，角蛋白，纤维蛋白原和转运蛋白；通过小分子质谱分析，所述混合物还至少含有20个小分子。
具体地，通过蛋白质谱(比如MS/MS)分析鉴定，所述混合物所含蛋白如下表1。
表1蛋白质谱(比如MS/MS)分析鉴定混合物所含蛋白结果
通过小分子质谱分析(比如UPLC-MS/MS)鉴定，所述混合物所含的小分子如下表2。
表2 MS2确认混合物中存在的小分子
所述血浆来源于哺乳动物，比如人、鼠等；优选地，所述血浆来源于人。
一种上述从血浆中分离出的混合物的制备方法，该混合物是通过对血浆进行一系列处理后获得的，处理步骤依次包括血浆收集、密度梯度离心、透析、一次浓缩、去高峰度蛋白、阴离子交换以及二次浓缩步骤。具体如下：
本发明中使用的各种培养基和常用试剂均采用常规方法配制，实施例中涉及的分子生物学操作如未注明具体试验条件和方法，请参照SambrookJ等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)或相应产品的说明书。
在所述血浆收集步骤中，利用抗凝管收集血液，通过离心收取上清，从而获得血浆；优选地，所述离心的转速为500-1500g(比如510g、600g、700g、800g、900g、1000g、1100g、1200g、1300g、1400g、1480g)，离心时间为10-30分钟(比如12min、15min、20min、25min、28min)。
在所述密度梯度离心步骤中，将所述血浆收集步骤得到的血浆与Percoll溶液或Ficoll溶液或蔗糖溶液混合建立密度梯度并离心，之后将离心管中最上层红色部分去掉，得到密度梯度离心后产物，其中所述离心的条件为：转速为10000-30000g(比如10010g、10500g、11000g、12000g、13000g、14000g、15000g、16000g、17000g、18000g、19000g、20000g、21000g、22000g、23000g、24000g、25000g、26000g、27000g、29000g)，离心时间为2-20h(比如3min、5min、10min、15min、18min)；优选地，所述Percoll溶液或Ficoll溶液或蔗糖溶液的浓度为40-60％(比如41％、45％、50％、52％、55％、58％)，所述Percoll溶液或Ficoll溶液或蔗糖溶液与所述血浆的体积比为(10-15):(1-3)(比如10.5:1、12:1、13:1、14:1、14.8:1、10.5:2、12:2、13:2、14:2、14.8:2、10.5:3、12:3、13:3、14:3、14.8:3)。通过密度梯度离心可以去除血浆中少量的具有较强的毒性的红色色素小分子。
不同浓度的Percoll溶液的配制方法：先用9(体积)份Percoll原液(Pharmacia公司产品)与1(体积)份8.5wt％NaCl或1.5M PBS混合达到生理性渗透压，此时得到的为100％Percoll溶液，然后用生理溶液(0.85wt％NaCl或0.15M PBS)稀释100％Percoll溶液到所需浓度。
不同浓度的Ficoll溶液的配制方法：先用9(体积)份Ficoll原液(Pharmacia公司产品)与1(体积)份8.5wt％NaCl或1.5M PBS混合达到生理性渗透压，此时得到的为100％Ficoll溶液，然后用生理溶液(0.85wt％NaCl或0.15M PBS)稀释100％Ficoll溶液到所需浓度。
不同浓度的蔗糖溶液的配制方法：在室温将蔗糖固块(Pharmacia公司产品)加入至8.5wt％NaCl或1.5M PBS溶液中至饱和，边加边搅拌。饱和蔗糖溶液浓度为2.3M，即为100％蔗糖溶液。然后用生理溶液(0.85wt％NaCl或0.15M PBS)稀释100％蔗糖溶液到所需浓度。
在所述透析步骤中，将所述密度梯度离心后产物放入透析袋或管中进行透析，透析后收集透析袋或管中的产物，作为透析产物，用于之后的一次浓缩步骤，其中所述透析时使用的透析缓冲液为0.2-200mM、pH7.0-9.2的Tris-盐酸缓冲液(比如：0.3mM、pH7.0的Tris-盐酸缓冲液，1mM、pH7.0的Tris-盐酸缓冲液，20mM、pH7.0的Tris-盐酸缓冲液，50mM、pH7.0的Tris-盐酸缓冲液，100mM、pH7.0的Tris-盐酸缓冲液，150mM、pH7.0的Tris-盐酸缓冲液，180mM、pH7.0的Tris-盐酸缓冲液，195mM、pH7.0的Tris-盐酸缓冲液，0.3mM、pH8.0的Tris-盐酸缓冲液，1mM、pH8.0的Tris-盐酸缓冲液，30mM、pH8.0的Tris-盐酸缓冲液，60mM、pH8.0的Tris-盐酸缓冲液，90mM、pH8.0的Tris-盐酸缓冲液，150mM、pH8.0的Tris-盐酸缓冲液，180mM、pH8.0的Tris-盐酸缓冲液，195mM、pH8.0的Tris-盐酸缓冲液，0.3mM、pH9.0的Tris-盐酸缓冲液，1mM、pH9.0的Tris-盐酸缓冲液，30mM、pH9.0的Tris-盐酸缓冲液，60mM、pH9.0的Tris-盐酸缓冲液，90mM、pH9.0的Tris-盐酸缓冲液，150mM、pH9.0的Tris-盐酸缓冲液，180mM、pH9.0的Tris-盐酸缓冲液，195mM、pH9.0的Tris-盐酸缓冲液，)，1.0-500mM、pH6.0-9.2的磷酸缓冲液(比如：1.5mM、pH6.5的磷酸缓冲液，30mM、pH6.5的磷酸缓冲液，90mM、pH6.5的磷酸缓冲液，160mM、pH6.5的磷酸缓冲液，200mM、pH6.5的磷酸缓冲液，300mM、pH6.5的磷酸缓冲液，400mM、pH6.5的磷酸缓冲液，460mM、pH6.5的磷酸缓冲液，490mM、pH6.5的磷酸缓冲液，1.5mM、pH7.5的磷酸缓冲液，30mM、pH7.5的磷酸缓冲液，90mM、pH7.5的磷酸缓冲液，160mM、pH7.5的磷酸缓冲液，200mM、pH7.5的磷酸缓冲液，300mM、pH7.5的磷酸缓冲液，400mM、pH7.5的磷酸缓冲液，460mM、pH7.5的磷酸缓冲液，490mM、pH7.5的磷酸缓冲液，1.5mM、pH8.5的磷酸缓冲液，30mM、pH8.5的磷酸缓冲液，90mM、pH8.5的磷酸缓冲液，160mM、pH8.5的磷酸缓冲液，200mM、pH8.5的磷酸缓冲液，300mM、pH8.5的磷酸缓冲液，400mM、pH8.5的磷酸缓冲液，460mM、pH8.5的磷酸缓冲液，490mM、pH8.5的磷酸缓冲液，1.5mM、pH9.0的磷酸缓冲液，30mM、pH9.0的磷酸缓冲液，90mM、pH9.0的磷酸缓冲液，160mM、pH9.0的磷酸缓冲液，200mM、pH9.0的磷酸缓冲液，300mM、pH9.0的磷酸缓冲液，400mM、pH9.0的磷酸缓冲液，460mM、pH9.0的磷酸缓冲液，490mM、pH9.0的磷酸缓冲液)或0.5-500mM、pH6.4-8.4HBS的缓冲液(比如：1mM、pH6.5HBS的缓冲液，50mM、pH6.5HBS的缓冲液，100mM、pH6.5HBS的缓冲液，150mM、pH6.5HBS的缓冲液，200mM、pH6.5HBS的缓冲液，250mM、pH6.5HBS的缓冲液，300mM、pH6.5HBS的缓冲液，350mM、pH6.5HBS的缓冲液，450mM、pH6.5HBS的缓冲液，495mM、pH6.5HBS的缓冲液，1mM、pH7.5HBS的缓冲液，50mM、pH7.5HBS的缓冲液，100mM、pH7.5HBS的缓冲液，150mM、pH7.5HBS的缓冲液，200mM、pH7.5HBS的缓冲液，250mM、pH7.5HBS的缓冲液，300mM、pH7.5HBS的缓冲液，350mM、pH7.5HBS的缓冲液，450mM、pH7.5HBS的缓冲液，495mM、pH7.5HBS的缓冲液，150mM、pH8.2HBS的缓冲液，200mM、pH8.2HBS的缓冲液，250mM、pH8.2HBS的缓冲液，300mM、pH8.2HBS的缓冲液，350mM、pH8.2HBS的缓冲液，450mM、pH8.2HBS的缓冲液，495mM、pH8.2HBS的缓冲液)；所述透析袋或管的孔径为0.2-0.3nm；优选地，所述透析缓冲液为1mM、pH＝8的Tris盐酸缓冲液；更优选地，所述透析的时间为20-72h(比如21h、25h、30h、35h、40h、45h、55h、65h、71h)，透析体积比(即透析袋中物质与处于透析袋外部的透析缓冲液的体积比)是1:100-1:10000(比如1:150、1:500、1:1000、1:1500、1:2500、1:3500、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、1:9500)。通过透析步骤，可以去除上一步密度梯度离心中的介质即蔗糖、Percoll或Ficoll，以防止该介质对下游产品制备产生不良影响。
在所述一次浓缩步骤中，将所述透析步骤得到的产物进行浓缩，得到一次浓缩后产物，其中浓缩前体积是浓缩后体积的至少10倍(比如：15倍、30倍、40倍、50倍、70倍、90倍、100倍)；所述浓缩的具体方法包括滤膜浓缩和浓缩管浓缩。优选地，所述浓缩是采用浓缩管离心的方式进行的，所述浓缩管允许1.5-2.5KD(比如1.6KD、1.8KD、1.9KD、2.0KD、2.2KD、2.4KD)的物质通过，所述离心时转速为2000-4000g(比如2100g、2300g、2500g、3000g、3200g、3500g、3800g)。该步骤的目的是让血浆组分体积变小，从而更高效的实现下一步中高峰度蛋白的去除。
在所述去高峰度蛋白步骤中，采用去高峰度蛋白试剂盒将一次浓缩后产物中的高峰度蛋白去掉，从而得到去高峰度蛋白产物；优选地，所述去高峰度蛋白试剂盒中的洗脱缓冲液对去高峰度蛋白柱子上的一次浓缩后产物进行第一次洗脱时得到的洗脱液，即为所述去高峰度蛋白产物。该步骤的目的是去掉血浆中含量是5mg/ml的高峰度蛋白，以防止血浆中的有效组分无法发挥功效。
在所述阴离子交换步骤中，将所述去高峰度蛋白产物加到阴离子交换柱中，用含有氯化钠(20-500mM)的Tris盐酸缓冲液(0.2-200mM，pH7.0-9.2)进行梯度洗脱，当洗脱体积为15-35ml时(比如16ml、20ml、25ml、30ml、34ml)开始收集洗脱液，当洗脱体积为40-85ml时(比如57ml、60ml、65ml、75ml、83ml)停止收集洗脱液，收集得到的洗脱液即为阴离子交换后产物。其中，含有氯化钠(20-500mM)的Tris盐酸缓冲液(0.2-200mM，pH7.0-9.2)可以是：含有25mM氯化钠的1mM、pH7.2的Tris盐酸缓冲液，含有25mM氯化钠的1mM、pH8.2的Tris盐酸缓冲液，含有25mM氯化钠的1mM、pH9.0的Tris盐酸缓冲液，含有100mM氯化钠的1mM、pH7.2的Tris盐酸缓冲液，含有100mM氯化钠的1mM、pH8.2的Tris盐酸缓冲液，含有100mM氯化钠的1mM、pH9.0的Tris盐酸缓冲液，含有200mM氯化钠的1mM、pH7.2的Tris盐酸缓冲液，含有200mM氯化钠的1mM、pH8.2的Tris盐酸缓冲液，含有200mM氯化钠的1mM、pH9.0的Tris盐酸缓冲液，含有400mM氯化钠的1mM、pH7.2的Tris盐酸缓冲液，含有400mM氯化钠的1mM、pH8.2的Tris盐酸缓冲液，含有400mM氯化钠的1mM、pH9.0的Tris盐酸缓冲液，含有490mM氯化钠的1mM、pH7.2的Tris盐酸缓冲液，含有490mM氯化钠的1mM、pH8.2的Tris盐酸缓冲液，含有490mM氯化钠的1mM、pH9.0的Tris盐酸缓冲液，含有30mM氯化钠的100mM、pH7.2的Tris盐酸缓冲液，含有150mM氯化钠的100mM、pH7.2的Tris盐酸缓冲液，含有400mM氯化钠的100mM、pH7.2的Tris盐酸缓冲液，含有480mM氯化钠的100mM、pH7.2的Tris盐酸缓冲液，含有30mM氯化钠的190mM、pH7.2的Tris盐酸缓冲液，含有150mM氯化钠的190mM、pH7.2的Tris盐酸缓冲液，含有400mM氯化钠的190mM、pH8.2的Tris盐酸缓冲液，含有480mM氯化钠的190mM、pH9.0的Tris盐酸缓冲液。该步骤的目的是去除血浆组分中带负电荷的成分，以防止这些成分对疾病的毒害作用，带负电荷成分的存在几乎会导致血浆组分没有疗效。收集洗脱体积为上述范围内的洗脱液可以获得疗效显著的血浆成分。
在所述二次浓缩步骤中，将所述阴离子交换后产物进行浓缩，得到二次浓缩后产物即所述混合物，其中浓缩前体积是浓缩后体积的至少10倍(比如：15倍、30倍、40倍、50倍、70倍、90倍、100倍)；所述二次浓缩的具体方法包括滤膜浓缩和浓缩管浓缩。优选地，所述浓缩是采用浓缩管离心的方式进行的，所述浓缩管允许1.5-2.5KD(比如1.6KD、1.8KD、1.9KD、2.0KD、2.2KD、2.4KD)的物质通过，所述离心时转速为2000-4000g(比如2100g、2300g、2500g、3000g、3200g、3500g、3800g)。二次浓缩的目的是提高鸡尾酒组分的浓度和粘度，从而提高单位成分的疗效。
一种药物组合物，包含上述混合物和药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可以为：药学上可接受的各种常用缓冲液(比如磷酸盐、柠檬酸盐以及其他有机酸缓冲液)、蛋白质(如白蛋白和免疫球蛋白，其可大大提升产品的稳定性)、明胶、单糖、多糖、氨基酸、螯合剂(如EDTA)、糖醇(如甘露醇)、聚乙二醇、以及表面活性剂如TWEEN和PLURONICS中的一种或多种。
优选地，所述药物组合物包括如下组分：1倍体积的上述混合物(即二次浓缩后产物)，9倍体积的8.5wt％NaCl或1.5M PBS(pH7.0)。更优选地，所述药物组合物中还包括白蛋白、葡萄糖以及谷氨酰胺，其中，所述白蛋白在所述药物组合物中的质量体积百分比为2％(w/v)，所述葡萄糖在所述药物组合物中的质量体积百分比为1％(w/v)，所述谷氨酰胺在所述药物组合物中的质量体积百分比为3％(w/v)。
所述药物组合物的剂型可以是：溶液剂、注射剂、静脉注射乳剂、糖浆剂、胶浆剂、混悬剂、微球剂、微囊、片剂、散剂、颗粒、丸剂、冻干粉、气雾剂、喷雾剂。
所述药物组合物可以按照如下方式给药：静脉滴注、静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、肝动脉注射、皮下包埋、鼻粘膜给药和口服。给药剂量是0.01-1ml/kg(比如：0.02ml/kg、0.05ml/kg、0.1ml/kg、0.4ml/kg、0.6ml/kg、0.8ml/kg、0.9ml/kg)。
一种缓释制剂，包含：上述混合物或者上述药物组合物、以及药学上可接受的生物相容物质；优选地，所述缓释制剂的剂型为脂质体、微球、水凝胶、微型渗透泵或微胶囊。
上述混合物、上述药物组合物和/或上述缓释制剂在预防、改善或/和治疗记忆力减退类疾病的药物中的应用；优选地，所述记忆力减退类疾病是阿尔兹海默症。
上述混合物、上述药物组合物和/或上述缓释制剂在增强记忆力药物中的应用。
一种包含上述混合物、上述药物组合物和/或上述缓释制剂的试剂盒。所述试剂盒中还可以含有阴性对照或阳性对照等。
下面通过实施例对本发明混合物的制备、鉴定和应用进行说明。以下实施例中使用的原代海马细胞是按照如下参考文献培养的：Guo,W.,Y.Ji,et al.(2014)."Neuronalactivity alters BDNF-TrkB signaling kinetics and downstream functions."J CellSci 127(Pt 10):2249-2260。
实施例1：混合物的制备
(1)从成年小鼠采血，收集血浆
将100只成年的C75BL/6品系的小鼠(该小鼠也可以使用其他品系实验动物代替，比如：BALB/cA品系的小鼠，DBA/2品系的小鼠，SD大鼠，Wistar大鼠)用20vol％的二氧化碳(即二氧化碳含量为20vol％的气体)麻醉，然后用采血针从小鼠眼部放血至采血管(采血管为抗凝管)内，边放血边摇晃采血管，防止血液凝固。将含有血液的采血管放入离心机，设定转速为1000g，离心30分钟。然后用移液器小心吸取上清，即为收集到的血浆。
(2)从小鼠血浆中分离出鸡尾酒组分即本发明的混合物
(a)密度梯度离心
首先将血浆进行密度梯度离心：往总体积为13毫升的离心管内加入12毫升浓度为50％的Percoll，然后再加入1毫升的小鼠血浆；将离心管放入超速离心机，设定转速为12000g，设定温度为4摄氏度，离心5个小时。密度梯度离心后，用移液器去除离心管中最上层红色部分，将离心管中剩余的血浆组分连同Percoll一起进行透析。
(b)透析
透析选用一般的透析袋，透析袋孔径约为0.25纳米。将密度梯度离心后获得的血浆组分连同Percoll一同加入到透析袋中，然后将透析袋放入1L的烧杯中，烧杯中透析袋外加入1L的1mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)，边搅拌边透析。透析温度为4℃，透析时间为24小时。透析结束后，将透析袋中的剩余的血浆组分作为透析产物，待进行一次浓缩。
(c)一次浓缩
将透析后的血浆组分加入到体积为2毫升的浓缩管中，浓缩管允许大小为2千道尔顿的物质通过。将浓缩管放入离心机中，设定转速为3000g，设定温度为4℃，启动离心机，开始浓缩，直到最终体积为500微升。之后，将剩余的透析后的血浆再次加入该离心管中以使血浆组分的体积达到2mL，以相同的参数进行离心，再次浓缩至最终体积为500微升。如此循环浓缩，直到将透析后的血浆组分最终浓缩到体积为500微升。将该500微升血浆组分作为一次浓缩产物，记为血浆组分A，待进行去高峰度蛋白处理。
(d)去高峰度蛋白
去高峰度蛋白采用BIO-RAD公司生产的型号为163-3006的去高峰度蛋白试剂盒，将浓缩后获得的500微升血浆加入到去高峰度蛋白的柱子中，然后将该柱子放到4℃的冰箱，放置5个小时。之后往柱子中加入2毫升的冲洗缓冲液，4摄氏度离心5分钟，离心转速为10000g。然后再往柱子中加入500微升的洗脱缓冲液，4℃放置30分钟，然后4℃离心5分钟，离心转速为10000g，之后洗脱下来的血浆组分即为去高峰度蛋白后的血浆组分，记为血浆组分B，将该血浆组分B待用阴离子交换柱进一步纯化。
(e)阴离子交换
将去除过高峰度蛋白后的500微升血浆组分加到阴离子交换柱Source Q中，用含有500mM氯化钠的Tris盐酸缓冲液(200mM,pH8.0)进行梯度洗脱，其中阴离子交换柱的填料为Q Sepharose(购自GE Healthcare)，平均粒度为3微米，阴离子交换柱体积为25毫升，洗脱速度为4ml/min，上样速度为3ml/ml。当洗脱体积为35毫升时开始收集洗脱液，当洗脱体积为45毫升时停止收集洗脱液；此部分洗脱液具有疗效活性。收集的洗脱液作为阴离子交换产物，待进行二次浓缩后。参见图1，其为阴离子柱层析结果，使用阴离子柱Source Q吸附蛋白，再用氯化钠梯度溶液洗脱，本图为洗脱曲线。
(f)二次浓缩
将阴离子交换后的血浆组分加入到体积为2毫升的浓缩管中，浓缩管允许大小为2千道尔顿的物质通过，将浓缩管放入离心机中，设定转速为3000g，设定温度为4℃，启动离心机，开始浓缩，直到最终体积为500微升。之后，将剩余的阴离子交换后的血浆再次加入该离心管中以使浓缩罐中溶液的体积为2毫升，以相同的参数进行离心，再次浓缩至最终体积为500微升。如此循环浓缩，直到将阴离子交换后的血浆组分最终浓缩到体积为500微升。该500微升的血浆组分，即为从小鼠血浆中分离得到的鸡尾酒组分，将其命名为鸡尾酒组分Ⅰ。
实施例2：实施例1制备的鸡尾酒组分ⅠSDS-PAGE变性胶电泳鉴定
从上述鸡尾酒组分里取出2微升，在紫外280nm下测定其吸光度，从而计算鸡尾酒组分的蛋白浓度。取一定体积的鸡尾酒组分，与1微升5×蛋白上样缓冲液(购自北京兰博利德生物技术有限公司，货号D621)混合，即为需要进行电泳的样品，该样品里面有10微克的蛋白质。将电泳样品升温至100℃，加热20分钟使蛋白质变性，然后立即将样品放到冰上，等待5分钟后开始跑SDS-PAGE变性还原胶(所述SDS变性还原胶的配制方法如下：30(w/v)％的丙烯酰胺Acr-Bis(购自GE Healthcare)取1.3ml、1.5M Tris-盐酸缓冲液(pH8.8，购自GEHealthcare)取1.3ml、10(w/v)％的SDS取0.05ml、10％(w/v)过硫酸铵(购自GEHealthcare)取0.05ml、TEMED(购自GE Healthcare)取0.003ml、以及水取2.3ml，共计5ml，混合后在室温即可凝固成胶)。跑胶时，每个泳道的蛋白上样量为10微克，设定跑胶电压为100V，开始跑胶，跑胶时间为1小时。跑完胶后，用考马斯亮蓝染色液(该染色液的制备方法为：将2.5g考马斯亮蓝R-250溶于500ml 95％乙醇溶液，加入100ml 85％的乙酸溶液，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定)对胶进行染色，可以发现鸡尾酒组分里至少含有10条肉眼可见多肽(图2)，其分子量分别为从小到大依次是31kD，56kD，68kD，77kD，115kD，128kD，165kD，175kD，250kD和289kD。其中在分子量大于48kD的条带中包括明显可见的7个条带，所述7个条带的分子量从小到大依次是56kD，68kD，77kD，115kD，175kD，250kD和289kD。
实施例3：实施例1制备的鸡尾酒组分ⅠFPLC鉴定
从鸡尾酒组分里取出2微升，在紫外280nm下测定其吸光度，从而计算鸡尾酒组分的蛋白浓度。先用20mM Tris-盐酸缓冲液(pH 8.0)平衡FPLC柱子(Superdex 200)，之后将一定体积的鸡尾酒组分注射到FPLC柱子中，注射的鸡尾酒组分含蛋白质300微克。然后让鸡尾酒组分以每分钟1毫升的速度流过FPLC柱子，发现鸡尾酒组分里含有明显可见的4个峰，参见图3，峰从左到右4个明显的峰(横坐标在8-18之间的4个峰)对应的蛋白大小分别是：250kD，120kD，100kD和80kD。
实施例4：实施例1制备的鸡尾酒组分Ⅰ蛋白质质谱鉴定
将鸡尾酒组分转移到FALCON管中，加入两倍体积的样品缓冲液(缓冲液的配方为：7.5M尿素UREA，1.5M硫脲THIOUREA，4(w/v)％3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐CHAPS，0.05(w/v)％十二烷基硫酸钠SDS，100mM二硫苏糖醇DDT，各组分前的所示浓度是其相应组分在缓冲液中的浓度)，并通过3kDa molecular weight cut-off spin columns(Pall GmbH,Austria)离心管离心浓缩。浓缩液用二硫苏糖醇进行还原反应，得到还原产物；其中，浓缩液与二硫苏糖醇的体积比为1：3，反应时间为15分钟，温度为室温。再将该还原产物与碘乙酰胺进行反应，得到烷基化产物；其中，该还原产物与碘乙酰胺的体积比1：1，反应时间为15分钟，温度为室温；随后用胰蛋白酶在37℃进行消化反应过夜，其中烷基化产物与胰蛋白酶的体积比1:1，得到消化后的肽段。胰蛋白酶消化所得肽段通过C18色谱柱纯化，得到样品。所得样品真空离心干燥并随后保存在-20℃冰箱中用于MS/MS分析。MS/MS分析具体如下：HPLC用的是Ultimate 3000系统，其中配备了PepMap100C-18trap column(300μm×5mm)和PepMap100C-18analytical column(75μm×250mm)两根柱子。质谱仪采用Amazon speed ETD,MS数据采集范围为400-1400m/z,MS/MS的肽段处理范围为100-2800m/z。随后，每个MS数据会自动搜索与其匹配的三个质量最好的CID MS/MS峰谱。喷嘴口电压设置为1400伏特。氮气保护的温度为150℃，流速为3升/分钟。MS的蛋白质识别和无标记定量(LFQ)数据分析采用开放源代码软件MaxQuant1.3.0.5。通过搜索SwissProt数据库(版本10/2003 20354项)对蛋白质进行鉴定，鉴定结果参见表1。
实施例5：实施例1制备的鸡尾酒组分Ⅰ小分子质谱鉴定
取200微升的鸡尾酒组分样本放入玻璃瓶内，将玻璃瓶插在冰内15分钟。再将玻璃瓶于通风橱内用1毫升注射器向其中加入800微升甲烷/二氯甲烷混合液(甲烷与二氯甲烷的体积比为2：1)。然后再将玻璃瓶插放回冰内，超声粉碎2分钟。粉碎结束后将玻璃瓶放在冰上静置20-30分钟，之后放在震荡仪上震荡混匀1分钟。然后放在冰箱内静置5分钟，看其分层后再放在震荡仪上震荡混匀，共重复3-5次。之后室温2000rpm离心20分钟，离心后会分三层，上层为代谢产物(用M标注)，中间为蛋白质，下层为脂类(用LP标注)，用250微升的注射器轻轻吸取玻璃瓶内的上层溶液至一个新的1.5毫升EP管内；用250ul的注射器吸取玻璃瓶内的下层溶液至另一个新的1.5毫升EP管内。将吸出的下层液体同时放在4℃离心机内13000rpm离心10分钟，吸取上清液至新的1.5毫升EP管内用UPLC-MS/MS高分辨液质联用分析仪对小分子代谢产物进行鉴定，Q Exactive Orbitrap质谱仪用于代谢产物的鉴定，其重要参数如下表3，鉴定结果参见表2。
表3 Q Exactive Orbitrap质谱仪鉴定参数
实施例6：实施例1制备的鸡尾酒组分Ⅰ体外促使原代海马细胞增值的活性
从鸡尾酒组分里取出2微升，在紫外280nm下测定其吸光度，从而计算鸡尾酒组分的蛋白浓度。用24孔板培养大鼠来源的原代海马细胞(本发明中使用的原代海马细胞的培养方法均参照以下文献中记载的方法：Guo,W.,Y.Ji,et al.(2014)."Neuronal activityalters BDNF-TrkB signaling kinetics and downstream functions."J Cell Sci 127(Pt 10):2249-2260.)，培养所用培养基为DMEM，培养条件为37℃，5vol％二氧化碳。等到细胞密度达到每孔4×105个细胞时，往培养基里加入鸡尾酒组分，每个孔中加入的鸡尾酒组分含蛋白1000微克，作为实验组1-鸡尾酒组分。同时实验组中还包括以下三组：即往不同孔的培养基里分别加入蛋白含量为1000微克的小鼠血浆(实施例1的第(1)步制备得到的)、蛋白含量为1000微克的血浆组分A(实施例1的第(2)步(c)中制备得到的)和蛋白含量为1000微克的血浆组分B(实施例1的第(2)步(d)中制备得到的)，分为命名为实验组2-小鼠血浆、实验组3-血浆组分A、实验组4-血浆组分B。同时设置对照组，在对照组中，等到细胞密度达到每孔4×105个细胞时，往孔的培养基中添加100微升的DMEM培养基。之后在原先的条件下继续培养细胞24小时，然后在光学显微镜下对实验组和对照组进行细胞计数，计算各实验组细胞数目占对照组细胞数目的比例。参见图4，可以发现相比血浆、血浆组分A和B而言，鸡尾酒组分可以明显促进原代海马细胞的增值，细胞数目占对照组细胞数目约为150％。
实施例7：实施例1制备的鸡尾酒组分Ⅰ体外促使原代海马细胞突触形成的活性
从鸡尾酒组分里取出2微升，在紫外280nm下测定其吸光度，从而计算鸡尾酒组分的蛋白浓度。用24孔板培养原代海马细胞，培养所用培养基为DMEM，培养条件为37℃，5vol％二氧化碳。等到细胞密度达到每孔4×105个细胞时，往培养基里加入鸡尾酒组分，每个孔中加入的鸡尾酒组分含蛋白1000微克，作为实验组1-鸡尾酒组分。同时实验组中还包括以下三组：即往不同孔的培养基里分别加入蛋白含量为1000微克的小鼠血浆(实施例1的第(1)步制备得到的)、蛋白含量为1000微克的血浆组分A(实施例1的第(2)步(c)中制备得到的)和蛋白含量为1000微克的血浆组分B(实施例1的第(2)(d)中步制备得到的)，分为命名为实验组2-小鼠血浆、实验组3-血浆组分A、实验组4-血浆组分B。同时设置对照组，在对照组中，等到细胞密度达到每孔4×105个细胞时，往孔的培养基中添加100微升的DMEM培养基。之后在原先的条件下继续培养细胞24小时，然后在光学显微镜下对各实验组和对照组进行突触计数，计算各实验组突触数目占对照组突触数目的比例。参见图5，可以发现相比血浆、血浆组分A和B而言，鸡尾酒组分可以明显促进原代海马细胞形成突触，突触数目占对照组突触数目约为210％。继续培养细胞24小时后在显微镜下对海马细胞进行成像，参见图7，从图7中可以看出：相比血浆、血浆组分A和B而言，鸡尾酒组分可以明显促进原代海马细胞的增值，突触形成数目占对照组细胞数目约为210％。
实施例8：实施例1制备的鸡尾酒组分Ⅰ有效提升阿尔兹海默症小鼠的记忆力
本实施例采用5XFAD阿尔兹海默症小鼠模型，订购于美国jackson laboratory,并按照动物实验标准进行繁殖和饲养。每一只实验模型小鼠都通过鼠尾进行基因鉴定，确保APP基因和PS1基因的稳定突变。鸡尾酒组分通过鼠尾静脉注射进小鼠体内，给药组保证30微克蛋白/次的给药剂量，在24天内每三天给药1次，共给药8次。水迷宫实验用于检测小鼠的学习能力和记忆力，无给药组为20只14周龄的5XFAD雄性小鼠，在行为学实验前24天接受了8次Saline(即生理盐水)注射，给药组为20只14周龄5XFAD雄性小鼠，在行为学实验前24天接受8次给药，阴性对照组为20只14周龄的c57BL/6雄鼠，同样接受Saline注射。
水迷宫实验在上午8点到下午1点间进行。水迷宫空间记忆训练期为4天，每天4次，每次训练间隔时间为10分钟。在实验中，每四个小鼠被随机分为一个训练组。对于每个训练组，水迷宫的平台位置被随机分配，且在整个训练中保持不变。训练中，小鼠从任意位置释放入水迷宫中，并允许它在120秒中搜索隐藏的平台。如果小鼠没有在120秒内找到平台，它将被引导到平台。每次训练中找到平台所用的时间和所经过的距离被智能摄像头自动记录下来。水迷宫测试在最后一次训练48小时后进行，每只小鼠被释放入没有放置平台的水迷宫中，并允许其自由活动60秒。其游动路线被智能摄像头自动记录下来。测试期比训练期时间短一倍，以避免小鼠产生抑郁行为。小鼠在目标象限所花费的时间与其他三个象限所花费的时间被记录下来，用于对小鼠记忆力的评估。其结果参见图6，从图6中可以看出，给药组即注射鸡尾酒组分的小鼠目标象限所花费的时间与正常对照组基本相同，说明鸡尾酒组分对阿尔兹海默症小鼠记忆力有明显的提升作用。
实施例9鸡尾酒组分Ⅱ的制备
除步骤(2)-(e)不同于实施例1以外，其他制备步骤均与实施例1相同，在本实施例中，步骤(2)-(e)具体如下：
阴离子交换：
将去除过高峰度蛋白后的500微升血浆组分加到阴离子交换柱Source Q中，用含有200mM氯化钠的Tris盐酸缓冲液(100mM,pH8.0)进行梯度洗脱，其中阴离子交换柱的填料为Q Sepharose(购自GE Healthcare)，平均粒度为3微米，阴离子交换柱体积为25毫升，洗脱速度为4ml/min，上样速度为3ml/ml。当洗脱体积为20毫升时开始收集洗脱液，当洗脱体积为80毫升时停止收集洗脱液。收集的洗脱液作为阴离子交换产物，待进行二次浓缩后。
该实施例得到的鸡尾酒组分，命名为鸡尾酒组分Ⅱ。
实施例10鸡尾酒组分III的制备
除步骤(2)-(a)不同于实施例1以外，其他制备步骤均与实施例1相同，在本实施例中，步骤(2)-(a)具体如下：
密度梯度离心
首先将血浆进行密度梯度离心：往总体积为13毫升的离心管内加入10毫升浓度为40％的蔗糖，然后再加入3毫升的小鼠血浆；将离心管放入超速离心机，设定转速为30000g，设定温度为4摄氏度(℃)，离心20个小时。密度梯度离心后，用移液器去除离心管中最上层红色部分，将离心管中剩余的血浆组分连同蔗糖一起进行透析。
实施例11鸡尾酒组分IV的制备
除步骤(2)-(a)不同于实施例1以外，其他制备步骤均与实施例1相同，在本实施例中，步骤(2)-(a)具体如下：
密度梯度离心
首先将血浆进行密度梯度离心：往总体积为13毫升的离心管内加入11毫升浓度为60％的Ficoll，然后再加入2毫升的小鼠血浆；将离心管放入超速离心机，设定转速为15000g，设定温度为4摄氏度，离心10个小时。密度梯度离心后，用移液器去除离心管中最上层红色部分，将离心管中剩余的血浆组分连同Ficoll一起进行透析。
实施例12
按照实施例2-5的鉴定方法分别对鸡尾酒组分Ⅱ-IV进行鉴定，鸡尾酒组分Ⅱ-IV的SDS-PAGE蛋白电泳结果表明，鸡尾酒组分Ⅱ-IV里均含有分子量从小到大依次是31kD，56kD，68kD，77kD，115kD，128kD，165kD，175kD，250kD和289kD的10条肉眼可见多肽，且在分子量大于48kD的7个条带非常清晰，其分子量从小到大依次是56kD，68kD，77kD，115kD，175kD，250kD和289kD。FPLC鉴定结果表明，鸡尾酒组分Ⅱ-IV均有蛋白大小分别是250kD、120kD、100kD和80kD的峰。蛋白质质谱和小分子质谱鉴定结果表明，鸡尾酒组分Ⅱ-IV中均含有表1和表2所示的蛋白质和小分子。
实施例13
按照实施例6的方法分别检测鸡尾酒组分Ⅱ-IV体外促使原代海马细胞增值的活性。
检测结果表明，鸡尾酒组分Ⅱ-IV也可以明显促进原代海马细胞的增值，其中，鸡尾酒组分Ⅱ组的细胞数目是对照组细胞数目的5倍；鸡尾酒组分Ⅲ组的细胞数目是对照组细胞数目的6倍；鸡尾酒组分IV组的细胞数目是对照组细胞数目的5.5倍。
实施例14
按照实施例7的方法分别检测鸡尾酒组分II-IV体外促使原代海马细胞突触形成的活性。
检测结果表明，鸡尾酒组分II-IV也可以明显促进原代海马细胞的增值，其中鸡尾酒组分II组的突触形成数目是对照组细胞数目的7倍；鸡尾酒组分III组的突触形成数目是对照组细胞数目的6.5倍；鸡尾酒组分IV组的突触形成数目是对照组细胞数目的8倍。
Claims (21)
1.一种自血浆中分离出的用于增强记忆力的混合物，其特征在于，所述混合物包括多种蛋白质和多种小分子，所述混合物的SDS-PAGE变性胶电泳包括至少30个条带，其中在分子量大于48kD的条带中包括：分子量从小到大依次是56kD，68kD，77kD，115kD，175kD，250kD和289kD的条带。
2.根据权利要求1所述的自血浆中分离出的用于增强记忆力的混合物，其特征在于，所述混合物的FPLC鉴定具有4个峰，对应的蛋白大小分别是：250kD，120kD，100kD和80kD。
3.根据权利要求1所述的自血浆中分离出的用于增强记忆力的混合物，其特征在于，通过蛋白质谱分析，所述混合物至少含有30个蛋白，包括白蛋白，球蛋白，角蛋白，纤维蛋白原和转运蛋白；通过小分子质谱分析，所述混合物还至少含有20个小分子。
4.根据权利要求3所述的自血浆中分离出的用于增强记忆力的混合物，其特征在于，通过蛋白质谱分析，所述混合物所含蛋白如下：
5.根据权利要求3所述的自血浆中分离出的用于增强记忆力的混合物，其特征在于，
通过小分子质谱分析，所述混合物所含的小分子如下：
6.根据权利要求1所述的自血浆中分离出的用于增强记忆力的混合物，其特征在于，所述血浆来源于哺乳动物；优选地，所述血浆来源于人。
7.一种权利要求1-6任一所述自血浆中分离出的用于增强记忆力的混合物的制备方法，其特征在于，依次包括：血浆收集步骤、密度梯度离心步骤、透析步骤、一次浓缩步骤、去高峰度蛋白步骤、阴离子交换步骤以及二次浓缩步骤。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，
在所述血浆收集步骤中，利用抗凝管收集血液，再通过离心收集上清液，得到血浆；优选地，所述离心转速为500-1500g，离心时间为10-30分钟。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，
在所述密度梯度离心步骤中，将所述血浆收集步骤得到的血浆与Percoll溶液、Forcol溶液或蔗糖溶液混合，建立密度梯度并离心，之后将离心管中最上层红色部分去掉，得到密度梯度离心后产物，其中所述离心的条件为：转速为10000-30000g，时间为2-20h；优选地，所述Percoll溶液、Forcol溶液或蔗糖溶液的浓度为40-60％，所述Percoll溶液、Forcol溶液或蔗糖溶液与所述血浆的体积比为(10-15):(1-3)。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，
在所述透析步骤中，将所述密度梯度离心后的产物放入透析袋或管中进行透析，透析后收集透析袋或管中的产物，作为透析产物；其中所述透析时使用的透析缓冲液为Tris-盐酸缓冲液，磷酸缓冲液或HBS缓冲液；优选地，所述Tris-盐酸缓冲液的浓度为0.2-200mM、pH值为7.0-9.2，所述磷酸缓冲液的浓度为1.0-500mM、pH值为6.0-9.2，所述HBS缓冲液的浓度为0.5-500mM、pH值为6.4-8.4；更优选地，所述透析缓冲液为1mM、pH值为8的Tris盐酸缓冲液；透析时间为20-72h，透析体积比是1:100-1:10000。
11.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，
在所述一次浓缩步骤中，将所述透析产物进行浓缩，得到一次浓缩后产物，其中浓缩前体积是浓缩后体积的10倍以上；优选地，所述浓缩是采用浓缩管离心的方式进行的，所述浓缩管允许1.5-2.5KD的物质通过，所述离心时转速为2000-4000g。
12.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，
在所述去高峰度蛋白步骤中，采用去高峰度蛋白试剂盒将一次浓缩后产物中的高峰度蛋白去掉，得到去高峰度蛋白产物；优选地，所述去高峰度蛋白试剂盒中的洗脱缓冲液对去高峰度蛋白柱子上的一次浓缩后产物进行洗脱时得到的洗脱液，为所述去高峰度蛋白产物；优选地，去掉的所述高峰度蛋白的含量是5mg/ml。
13.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，
在所述阴离子交换步骤中，将所述去高峰度蛋白产物加到阴离子交换柱中，用含有20-500mM氯化钠的Tris-盐酸缓冲液进行梯度洗脱，当洗脱体积为15-35ml时开始收集洗脱液，当洗脱体积为40-85ml时停止收集洗脱液，收集得到的洗脱液为阴离子交换后产物；优选地，所述Tris-盐酸缓冲液的浓度为0.2-200mM、pH值为7.0-9.2。
14.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在所述二次浓缩步骤中，将所述阴离子交换后产物进行浓缩，得到二次浓缩后产物即所述混合物，其中浓缩前体积是浓缩后体积的10倍以上；优选地，所属浓缩是采用浓缩管离心的方式进行的，所述浓缩管允许1.5-2.5KD的物质通过，所述离心时转速为2000-4000g。
15.一种药物组合物，包含权利要求1-6任一所述的混合物和药学上可接受的载体。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体为：药学上可接受的缓冲液、蛋白质、明胶、单糖、多糖、氨基酸、螯合剂、糖醇、聚乙二醇、以及表面活性剂中的一种或多种。
17.根据权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如下组分：1倍体积的权利要求1-5任一所述的混合物，9倍体积的8.5wt％NaCl或1.5M、pH7.0的PBS；优选地，所述药物组合物中还包括白蛋白、葡萄糖以及谷氨酰胺，其中，所述白蛋白在所述药物组合物中的质量体积百分比为2％，所述葡萄糖在所述药物组合物中的质量体积百分比为1％，所述谷氨酰胺在所述药物组合物中的质量体积百分比为3％。
18.一种缓释制剂，包含权利要求1-6任一所述的混合物或者权利要求15-17任一所述的药物组合物、以及药学上可接受的生物相容物质；优选地，所述缓释制剂的剂型为脂质体、微球、水凝胶、微型渗透泵或微胶囊。
19.权利要求1-6任一所述的混合物、权利要求15-17任一所述的药物组合物以及权利要求18所述缓释制剂在预防、改善或/和治疗记忆力减退类疾病的药物中的应用，优选地，所述记忆力减退类疾病为阿尔兹海默症。
20.权利要求1-6任一所述的混合物、权利要求15-17任一所述的药物组合物以及权利要求18所述缓释制剂在增强记忆力药物中的应用。
21.一种包含权利要求1-6任一所述的混合物、权利要求15-17任一所述的药物组合物或者权利要求18所述缓释制剂的试剂盒。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Li Lin Inventor after: Cui Wenhong Inventor before: Cui Wenhong |
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20180511 Address after: 100094 1, 115, 117, 123, 125 rooms, 1 building, 538 Yongfeng Tun, Haidian District, Beijing. Applicant after: Beijing HAOSI Biotechnology Co. Ltd. Address before: 100000 Beijing Haidian District Renji villa D502 Applicant before: Tian Ye |
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| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 102208 room 102-2, 1f, building 1, courtyard 7, kekekeyuan Road, Huilongguan town, Changping District, Beijing Patentee after: Beijing HAOSI Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 100094 1, 115, 117, 123, 125 rooms, 1 building, 538 Yongfeng Tun, Haidian District, Beijing. Patentee before: Beijing HAOSI Biotechnology Co.,Ltd. |
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| CP03 | Change of name, title or address |