CN111172108A - 一种组织液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于生物医学实验领域，提供了一种组织液的制备方法，其包括如下步骤：步骤一、收集健康人或实验动物的血液；步骤二、将所述血液进行抗凝或者非抗凝处理，离心得到血浆或血清；步骤三、将所述血清或者血浆加到超滤管的过滤器中，将过滤器嵌入嵌套管中，进行离心操作，收集嵌套管内的液体，得到预处理液；步骤四、用柠檬酸钠缓冲液调整所述预处理液的pH值至7.1～7.3，得初步的组织液；步骤五、将所述初步的组织液用0.22微米的微孔滤膜进行过滤除菌，获得所述组织液。该方法获得的组织液组分与真实组织液接近，能够满足生物医学实验需求，安全性好。
Description
技术领域
本发明属于生物医学实验领域，尤其涉及一种组织液的制备方法。
背景技术
组织液是存在于细胞之间的液体，也被称之为组织间隙液。组织液大量存在于动植物体内，是普通细胞直接生活的液体环境，可与细胞进行物质交换。细胞浸润在组织液中，可与组织液进行物质交换，是普通细胞进行代谢的必要条件。此外，组织液还可对细胞产生缓冲和保护作用。
在动物体内，组织液从毛细血管动脉端渗入到组织间隙内的一部分液体，与组织细胞进行物质交换后，再经毛细血管静脉端或毛细淋巴管回流入血液或淋巴。绝大部分组织液呈凝胶状态，不能自由流动，不会因重力作用流到身体的低垂部位；将注射针头插入组织间隙，也不能抽出组织液。因此，组织液很难在生理条件下直接获得，其组成成分也未完全确定。组织液是血浆在毛细血管动脉端滤过管壁而生成的，在毛细血管静脉端，大部分又透过管壁吸收回血液。在正常情况下，组织液由毛细血管的动脉端不断产生，同时一部分组织液又经毛细血管静脉端返回毛细血管内，另一部分组织液则经淋巴管回流入血液循环。组织液是血浆滤过毛细血管壁而形成的。因此，普遍认为组织液与血液中的液体组分具有相近的组成。血浆的化学成分中，水分占90～92％，溶质以血浆蛋白为主。血浆的各种化学成分常在一定范围内不断地变动，其中以葡萄糖、蛋白质、脂肪和激素等的浓度最易受营养状况和机体活动情况的影响，而无机盐浓度的变动范围较小。
组织液的获取对于研究组织液的组成成分以及进一步的生物医学应用具有重要意义。组织液与血液的主要成分差异在于血细胞和血浆蛋白：组织液中几乎不含有血细胞，并且血浆蛋白含量也比较少。血浆中主要的血浆蛋白成分包括：约58％的白蛋白，分子量为67kD；约38％的球蛋白，分子量为150-196kD；以及少量的纤维蛋白原分子量约为340kD，还有其他一些微量蛋白，比如调节蛋白和凝血因子等。以往获取组织液模拟液是通过不同组分进行配置，另一个通过一些特殊装置从机体组织中抽取。前者与真实组织液成分相差较大，而后者得到的组织液体积比较有限，且价格昂贵。
发明内容
本发明旨在解决现有组织模拟液成分和真实组织液区别大，以及从机体组织中抽取组织液量有限的问题，提供一种更接近组织液的制备方法，获得的组织液更接近真实组织液。
为解决上述技术问题，本发明是这样实现的，一种组织液的制备方法，其包括如下步骤：
步骤一、收集健康人或实验动物的血液；
步骤二、将所述血液进行抗凝或者非抗凝处理，离心得到血浆或血清；
步骤三、将所述血清或者血浆加到超滤管的过滤器中，将过滤器嵌入嵌套管中，进行离心操作，收集嵌套管内的液体，得到预处理液；
步骤四、用柠檬酸钠缓冲液调整所述预处理液的pH值至7.1～7.3，得初步的组织液；
步骤五、将所述初步的组织液用0.22微米的微孔滤膜进行过滤除菌，获得所述组织液。
本发明与现有技术相比，工艺简单，条件温和，产品中的氨基酸、多肽、脂质以及糖类等生物活性成分含量高，活性高，安全性好，产品生产成本低，组分与真实组织液接近，能够满足生物医学实验需求。
附图说明
图1是本发明实施例提供的组织液的制备流程图。
图2是本发明实施例1获得的组织液与血浆和血清中蛋白的浓度图。
图3是本发明实施例1获得的组织液与血浆和血清中内毒素的含量图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
为实现本发明的目的，本发明实施例提供一种组织液的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、收集健康人或实验动物的血液；
步骤二、将所述血液进行抗凝或者非抗凝处理，离心得到血浆或血清；
步骤三、将所述血清或者血浆加到超滤管的过滤器中，将过滤器嵌入嵌套管中，进行离心操作，收集嵌套管内的液体，得到预处理液；
步骤四、用柠檬酸钠缓冲液调整所述预处理液的pH值至7.1～7.3，得初步的组织液；
步骤五、将所述初步的组织液用0.22微米的微孔滤膜进行过滤除菌，获得所述组织液。
具体地，收集健康人或者实验动物的血液的过程保持无菌，避免污染。
步骤二中，优选地，将离心前将抗凝或者非抗凝处理的血液室温下放置1.5～5小时，进一步优选室温下放置3小时。离心的转速为1500～5000转/分钟，进一步优选为3000转/分钟；离心的时间为3～10分钟，进一步优选为5分钟。
优选地，所述血清加入抗凝剂，所述抗凝处理为分离血浆时加入抗凝剂，所述抗凝剂为肝素、乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸钠、草酸钠中的至少一种，进一步，优选为肝素或EDTA。具体地，1mL血液加入0.8mg EDTA，1mL血液加入0.1mg肝素。
步骤三中，所选用的超滤管截留分子量为5～100kD，进一步优选10～50kD，离心转速为10000～14000转/分钟，进一步优选为12000转/分钟，离心时间为10～20分钟，进一步优选15分钟。
步骤四中，所述柠檬酸钠缓冲溶液的pH为4.0～6.0。
本发明组织液的制备方法工艺简单，如图1组织液的制备流程图所示，条件温和，同时，生产成本低，组分与真实组织液接近，保持了组织液中大部分氨基酸、多肽、糖分以及脂质等组分，能够满足生物医学实验需求，安全性好。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
实施例1
1、收集健康人的血液
利用带有EDTA抗凝剂的血液抗凝管收集健康人群4mL新鲜血液，血液收集过程保持无菌操作。
2、血浆的分离
将收集到的抗凝血离心，转速3000转每分钟，离心5分钟，离心完毕后，用移液枪将上清收集，得到血浆。
3、血浆蛋白的分离
将血浆加入到30kD分子量的超滤管中，将超滤管嵌套进入嵌套管中，进行高速离心，转速12000转每分钟，离心10分钟。离心结束后，将嵌套管中的液体收集，得到初步的组织液。
4、调节pH值
利用pH计对初步获取的组织液进行pH值检测，向其中添加适量的柠檬酸盐缓冲液，将pH值调整到7.2。
5、过滤除菌
将组织液利用0.22微米的滤器进行过滤，初步组织液通过0.22微米的滤膜达到除菌的目的，收集滤过液得到最终的组织液产品。
实施例2
1、收集健康人的血液
利用普通的血液收集管收集健康人群4mL新鲜血液，血液收集过程保持无菌操作。
2、血清的分离
将收集到血液室温静置3小时后，进行离心，转速3000转每分钟，离心5分钟，离心完毕后，用移液枪将上清收集，得到血清。
3、血浆蛋白的分离
将血清加入到30kD分子量的超滤管中，将超滤管嵌套进入嵌套管中，进行高速离心，转速12000转每分钟，离心10分钟。离心结束后，将嵌套管中的液体收集，得到初步的组织液。
4、调节pH值
利用pH计对初步获取的组织液进行pH值检测，向其中添加适量的柠檬酸盐缓冲液，将pH值调整到7.2。
5、过滤除菌
将组织液利用0.22微米的滤器进行过滤，初步组织液通过0.22微米的滤膜达到除菌的目的，收集滤过液得到最终的组织液产品。
实施例3
1、收集实验用SD大鼠的血液
将带有EDTA抗凝剂的血液抗凝管针头的一段插入SD大鼠腹主动脉，收集4mL新鲜血液，血液收集过程保持无菌操作。
2、血浆的分离
将收集到的抗凝血离心，转速3000转每分钟，离心5分钟，离心完毕后，用移液枪将上清收集，得到血浆。
3、血浆蛋白的分离
将血浆加入到30kD分子量的超滤管中，将超滤管嵌套进入嵌套管中，进行高速离心，转速12000转每分钟，离心10分钟。离心结束后，将嵌套管中的液体收集，得到初步的组织液。
4、调节pH值
利用pH计对初步获取的组织液进行pH值检测，向其中添加适量的柠檬酸盐缓冲液，将pH值调整到7.2。
5、过滤除菌
将组织液利用0.22微米的滤器进行过滤，初步组织液通过0.22微米的滤膜达到除菌的目的，收集滤过液得到最终的组织液产品。
利用BCA试剂盒对实施例1中收集到组织液进行蛋白定量，具体操作流程如下：将白蛋白标准品做系列稀释，分别得到如下9个不同浓度的标准品：2000μg/mL，1500μg/mL，1000μg/mL，500μg/mL，250μg/mL，125μg/mL，62.5μg/mL，31.25μg/mL，0μg/mL。取白蛋白标准品和待测样品各25μL到96孔板孔内，往每孔中加入200μL的BCA工作液，盖上96孔板盖子。将96孔板37℃放置30分钟，用酶标仪测562nm处的光吸收值。结果如图2所示，实施例1获得的组织液中白蛋白浓度已经降低到5mg/mL以下，说明利用该方法制得的组织液中大分子量的蛋白质已经部分除去，具有和真实组织液相近的成分特征。
利用鲎试剂盒对实施例1中制备的组织液进行内毒素含量检测，具体包括以下操作流程：1、配置内毒素标准溶液，包括10EU/mL，1EU/mL，0.1EU/mL以及0.01EU/mL，并设置细菌内毒素检查用水为阴性对照；2、按标示量加细菌内毒素检查用水于显色基质中，轻轻摇晃溶解显色基质，再将溶解的显色基质全部加入到鲎试剂中，轻轻摇晃使鲎试剂完全溶解；3、取除热原微板，在各孔中分别加入100μL细菌内毒素检查用水、内毒素标准溶液、组织液以及血浆；4、将微板放置于37℃孵育120分钟，然后用酶标仪测定405nm处的吸光度值。结果表明利用该方法制得的组织液与原始血清或血浆中内毒素含量类似，均低于生物制品检测上线要求，该方法制得的组织液符合生物制品要求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种组织液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、收集健康人或实验动物的血液；
步骤二、将所述血液进行抗凝或者非抗凝处理，离心得到血浆或血清；
步骤三、将所述血清或者血浆加到超滤管的过滤器中，将过滤器嵌入嵌套管中，进行离心操作，收集嵌套管内的液体，得到预处理液；
步骤四、用柠檬酸钠缓冲液调整所述预处理液的pH值至7.1～7.3，得初步的组织液；
步骤五、将所述初步的组织液用0.22微米的微孔滤膜进行过滤除菌，获得所述组织液。
2.如权利要求1所述的组织液的制备方法，其特征在于，所述抗凝处理的抗凝剂为肝素、乙二胺四乙酸、柠檬酸钠、草酸钠中的至少一种。
3.如权利要求1或2所述的组织液的制备方法，其特征在于，所述抗凝处理的抗凝剂为肝素或乙二胺四乙酸。
4.如权利要求1所述的组织液的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，离心转速为1500～5000转/分钟，离心时间为3～10分钟。
5.如权利要求1所述的组织液的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，离心前将抗凝或者非抗凝处理的血液室温下放置1.5～5小时。
6.如权利要求1所述的组织液的制备方法，其特征在于，所述超滤管截留分子量为5～100kD。
7.如权利要求1或6所述的组织液的制备方法，其特征在于，所述超滤管截留分子量为10～50kD。
8.如权利要求1所述的组织液的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述离心转速为10000～14000转/分钟。
9.如权利要求1所述的组织液的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述离心时间为10～20分钟。
10.如权利要求1所述的组织液的制备方法，其特征在于，所述柠檬酸钠缓冲溶液的pH为4.0～6.0。
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|---|---|---|---|
| CN201911173446.3A CN111172108A (zh) | 2019-11-26 | 2019-11-26 | 一种组织液的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111172108A true CN111172108A (zh) | 2020-05-19 |
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ID=70650046
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911173446.3A Pending CN111172108A (zh) | 2019-11-26 | 2019-11-26 | 一种组织液的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111172108A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113828426A (zh) * | 2021-09-07 | 2021-12-24 | 康膝生物医疗(深圳)有限公司 | 从血液中提取富血小板血浆的方法及装置 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4156681A (en) * | 1974-03-28 | 1979-05-29 | Plasmesco Ag | Process for isolating albumin from blood |
| CN1569031A (zh) * | 2004-04-26 | 2005-01-26 | 巫山 | 病毒灭活/超滤膜分段筛分法制备的血浆组分系列制剂 |
| CN102599332A (zh) * | 2012-03-09 | 2012-07-25 | 上海杰隆生物制品股份有限公司 | 一种利用禽血生产低灰分禽血浆蛋白粉的方法 |
| US20130236984A1 (en) * | 2007-08-08 | 2013-09-12 | School Juridical Person Kitasato Institute | Method for concentration of low-molecular-weight proteins and peptides in body fluid sample |
| CN107136296A (zh) * | 2017-06-02 | 2017-09-08 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 高凝胶性血浆蛋白粉及其制备方法 |
| CN108813090A (zh) * | 2018-06-06 | 2018-11-16 | 江苏省农业科学院 | 家禽血浆蛋白的制备方法 |
-
2019
- 2019-11-26 CN CN201911173446.3A patent/CN111172108A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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