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CN1555393A - 角蛋白基产品及其生产方法 - Google Patents

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CN1555393A
CN1555393A CNA028180313A CN02818031A CN1555393A CN 1555393 A CN1555393 A CN 1555393A CN A028180313 A CNA028180313 A CN A028180313A CN 02818031 A CN02818031 A CN 02818031A CN 1555393 A CN1555393 A CN 1555393A
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CNA028180313A
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�˵á����˻���ķ
彼得·马塞尔·马里亚姆·施罗伊恩
±��ٶ�
拉杜尔夫·奥贝蒂尔
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Stichting Nederlands Instituut Voor Zuivelonderzoek (Nizo)
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Stichting Nederlands Instituut Voor Zuivelonderzoek (Nizo)
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Abstract

本发明涉及从含角蛋白的原料，如家禽羽毛溶解角蛋白的方法。可以在碱性条件下使用硫化物溶解该角蛋白。在该方法中，例如通过烷基化而部分修饰溶解的角蛋白的半胱氨酸残基。选择溶解和部分修饰的条件，使得该角蛋白也被部分水解。该部分修饰且部分水解的角蛋白可以用作稳定的分散体，例如通过浇铸而用以生产膜和涂层。

Description

角蛋白基产品及其生产方法
技术领域
本发明涉及源于角蛋白的新产品。具体地说，本发明涉及源于天然存在的角蛋白和角蛋白纤维来源，如家禽羽毛的产品。本发明还涉及制备这些角蛋白源产品的方法以及这些角蛋白源产品的用途。
背景技术
羽毛是家禽工业的重要废产物，每年全世界约产生4百万吨。尽管其少量用于例如服装、保温材料和寝具，以及较大量用于制造用以生产动物饲料的羽毛粉，但是对于如此大量的羽毛而言，目前的(在经济上有利益的)应用不足。出于环境原因，燃烧或掩埋羽毛并不总是实用的选择；这些量的废羽毛给诸如家禽工业的工业带来了困难的处理问题。
因此，本发明的一般目的是提供一系列在经济上可行的废羽毛的用途，并且提供将废羽毛用于这种用途的方法。
羽毛主要由称作角蛋白的纤维状蛋白质材料组成。角蛋白是分子量约为10kDa的水不溶性且耐蛋白酶的蛋白质。如图1所示，图1中以(A)表示的每个角蛋白分子由形成晶质β-折叠的中央部(β)和两个分别以(N)和(C)表示的随机排列链端组成。在羽毛中，多个角蛋白的中央部(β)连接形成直径约30埃的所谓的微原纤维(B)。链端(C)和(N)含有二硫键连接的二聚氨基酸(胱氨酸)形式的链间和链内交联(C)，并且形成微原纤维被包埋其中的无定形基质。羽毛中蛋白质的二硫键(C)和分子团体使之不溶并且耐受大多数蛋白水解酶。
已经有很多涉及角蛋白、角蛋白水解产物和源于角蛋白的产品，以及它们的制备及用途的现有技术。尤其是化妆品和纺织工业对用以设计和修饰头发和羊毛的角蛋白源产品感兴趣。含有水解角蛋白的洗发剂和指甲油就是利用角蛋白的现有技术配方的实例。即使这些应用有很多，但它们基本上是主要使用水解角蛋白作为组分之一的产品配方。这些产品具有低附加价值并且只有有限的用途。
从本发明的发明人之一的该领域综述论文(P.Schrooyen：“Feather keratins：modification and film formation”，1999，ThesisUniversity of Twente，Enschede，The Netherlands)清楚地看出，使用角蛋白作为膜或涂层中的聚合物的现有技术少得多。一般而言，根据这些文献中所描述的方法，将不溶性角蛋白从它们的天然源提取出并且，例如在含水介质中溶解。通常，这种提取/溶解至少涉及二硫键(C)的断裂，这破坏微原纤维(B)，产生分离的角蛋白分子(A)。取决于所使用的条件，该提取/溶解还可能涉及角蛋白分子(A)自身的水解/降解，即形成角蛋白分子(A)的氨基酸之间的肽键的裂解。已经报道通过下列方法实现二硫键的断裂：用有机过酸氧化二硫键形成磺酸基；二硫键亚硫酸盐解形成S-磺酸盐基；或者用诸如2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)或二硫赤藓糖醇的硫醇化合物还原二硫键；或者用诸如硫化钠溶液的碱金属硫化物处理。一般而言，现有技术方法的目的是提供在含水介质中可溶的角蛋白源产品，例如角蛋白或角蛋白水解产物的溶液。为此目的，现有技术描述了对断裂的二硫键进行修饰，从而避免该键的重新形成，和/或使用特定的添加剂以使角蛋白保留在溶液中或者来稳定角蛋白溶液，如碱金属氢氧化物、脲、盐酸胍、2-巯基乙醇或巯基乙酸盐。
例如，US-A-3464825描述了使用碱金属硫化物溶液，如Na2S溶液从羽毛提取角蛋白的方法。然后用诸如Na2SO3的碱金属亚硫酸盐处理这样获得的角蛋白溶液，之后对蛋白质进行酸沉淀。然后在碱水溶液中溶解该沉淀的角蛋白，随后用水溶性氧化剂，例如过氧化氢、高碘酸钠、亚氯酸钠或诸如过乙酸或过甲酸的有机过酸进行氧化，相信它们将胱氨酸/半胱氨酸残基氧化成磺基丙氨酸基。但是，这样获得的角蛋白是基本上完全修饰的，即所有自由胱氨酸/半胱氨酸残基均被氧化成磺基丙氨酸基。结果是，该完全修饰的角蛋白通常是水溶性的，因此不太适于提供水不溶性的膜，例如在涂层中应用和其它本文下述的应用。另外，FR2522657描述了基本上完全的修饰，例如角蛋白的至少70％的自由-SH基的修饰。
相反，US-A-3642498描述了使用硫化钠溶解角蛋白的方法，其中胱氨酸/半胱氨酸基基本上保持未被修饰。然后使用碱金属硫化物溶液来提取角蛋白，用碱金属亚硫酸盐溶液处理，接着进行酸沉淀。描述所得蛋白质产品在水-醇混合物中可分散，并且可以用于制备膜和涂层。US-A-3642498还描述了用以提取并溶解羽毛角蛋白的另一方法，包括用巯基乙醇-醇-水混合物处理；或者用含碱金属氢氧化物的碱性巯基乙醇-醇-水混合物处理。但是，根据US-A-3642498，胱氨酸/半胱氨酸残基基本上保持未被修饰。具有基本上未被修饰的胱氨酸/半胱氨酸残基的溶解的角蛋白的主要缺点是它们不能产生具有所需机械性质的角蛋白基产品，特别是膜和涂层。具体地说，这些膜是脆性的。
至此提到的大多数现有技术回溯至二十世纪六十年代末期和二十世纪七十年代早期。然而，在自此的三十年中，这些文献没有导致本文所公开的角蛋白基产品的任何广泛用途。这可能是因为所描述的产品和方法在经济上是不可行的，尽管它们采用废羽毛作为原料，和/或因为所获得的角蛋白产品没有表现出实际的(商业)用途所需的性质。
这些问题中的一些在本发明的发明人之一的论文(P.Schrooyen；“Feather keratins：modification and film formation”，1999，ThesisUniversity of Twente，Enschede，The Netherlands)中提出，该论文描述了在浓脲水溶液中并在2-巯基乙醇的存在下通过使用一碘乙酰胺、一碘乙酸或一溴琥珀酸部分修饰(即烷基化)完整羽毛角蛋白而获得的角蛋白源产品。以残留自由-SH基的量来计算，将角蛋白修饰至25-87％的修饰度。这种部分修饰提供基本上完整(即未水解)的部分修饰的角蛋白的稳定分散体，它能够用于浇铸具有所需热和机械性质的坚固膜。但是，用于部分修饰的基本上完整的角蛋白的提取和溶解需要使用高浓度的化学药品，如脲和2-巯基乙醇。在试验规模使用这些化学药品是可接受的。但是，它们的大规模使用在经济上是不可行的，因为使用这些化学药品是昂贵的，同时从与使用这些化学药品相关的环境和职业危险来看，需要昂贵的预防措施。
因此，仍然需要在经济上可行的方法来加工诸如羽毛的含角蛋白的(废)材料，该方法可以用来提供一系列具有实际/商业应用可接受的性质的角蛋白基产品，特别是膜和涂层。
发明内容
现已发现可以通过一种方法获得改善的角蛋白基产品，该方法涉及通常通过水解进行的角蛋白分子的部分降解和自由-SH基，即得自二硫键(C)的裂解的自由-SH基的部分修饰的组合。具体地说，本发明提供这种部分降解且部分修饰的产品，该产品在水中可分散，并且可以在一系列应用中使用，包括但不限于在下文中讨论的应用。这些水分散性的部分降解且部分修饰的角蛋白基产品在本领域中还没有被描述过。
因此，在第一方面，本发明涉及生产部分修饰且部分降解的角蛋白的方法。该方法包括以下步骤：(a)在碱性pH下，在水溶液中，使用还原剂从含角蛋白纤维的原料溶解角蛋白；及(b)部分修饰该溶解的角蛋白的-SH基。优选地，步骤(a)和/或(b)的条件使得该溶解的角蛋白被部分水解或部分降解至下文进一步说明的程度。任选地，可以使用另外的步骤(c)来将角蛋白水解至所需的程度。
对于含角蛋白纤维的原料，可以使用角蛋白纤维的任何适当来源。具体地说，可以使用角蛋白纤维的天然来源，例如毛发、羽毛、蹄、指甲、角等。优选地，使用至少含有β-角蛋白的角蛋白纤维源。羽毛是尤其优选的原料，特别是鸡、火鸡、鸭、鹅或其它家禽的羽毛，例如从家禽工业作为废产物获得的。这些角蛋白纤维源可能含有少量的其它蛋白质和/或诸如脂肪或血的其它成分，例如通常小于总重量(基于干羽毛)的5％的量。一般而言，它们的存在是容许的，否则，可以在溶解步骤(a)之前将一些或所有这些非角蛋白成分除去。含角蛋白纤维的原料优选接受一种或多种预处理，例如清洗、洗涤、分选、脱脂、切割、磨粉、研磨、干燥或它们的任何组合。这种预处理可以方便原料的处理，它可以改善诸如角蛋白的溶解的进一步加工步骤的效率，和/或它可以改善最终角蛋白基产品的质量。或者，可以使用已经预处理的含角蛋白的原料，如羽毛粉；以及已经分离的角蛋白或角蛋白纤维(但是出于经济原因这通常不太优选)。在溶解步骤a)中直接使用角蛋白或角蛋白纤维的天然来源，例如羽毛，而没有进一步的预处理也包括在本发明的范围内。
用于在碱性pH下溶解的还原剂可以选自硫化物、硫醇、硼氢化物和膦，或它们的组合。优选的硫化物是碱金属硫化物，如硫化钠。在更低的碱性pH下，例如在低于10、9.5或9.0的pH下，硫化铵也可以用作溶解的还原剂，其使用能在终产品中避免盐残留。优选的硫醇是二硫苏糖醇、2-巯基乙醇和巯基乙酸盐，并且优选的膦是三正丁基膦。
优选地选择溶解的条件，即含角蛋白纤维的原料、还原剂和缓冲剂的浓度，以及pH、温度和溶解时间，从而获得溶解的角蛋白的满意的收率，优选含角蛋白纤维的原料中的至少10、20、30、40、50或60％的角蛋白被溶解。进一步优选地选择溶解条件，从而使溶解的角蛋白被部分水解或部分降解至下文进一步说明的程度。
优选地，每升(含水)溶解介质溶解至少10克含角蛋白纤维的原料，并且每升(含水)溶解介质优选溶解不超过100克含角蛋白纤维的原料。通常每升(含水)溶解介质溶解20-60克含角蛋白纤维的原料。
(含水)溶解介质中的还原剂，例如碱金属硫化物或硫化铵的浓度优选在0.05M至1.0M之间。或者，使用2-巯基乙醇和氢氧化钠的组合：以0.1M至1.5M浓度的2-巯基乙醇和0.1-1.0N的氢氧化钠组合使用。
溶解角蛋白的pH是碱性的，即高于pH7.0。但是优选地，溶解在至少pH8.0、8.5、9.0、9.5的碱性pH下进行，但是更优选pH至少为或高于pH10.0、10.5、11.0、11.5、12.0或12.5，因为在至少为或高于pH10.0的pH下，硫化物的解离平衡向S2-移动，S2-是比HS-更强的还原剂。优选pH不高于13.5。
角蛋白溶解的温度优选至少为20℃。但是，优选使用更高的温度来溶解，如优选至少为30、40、50、60、70或80℃的温度，但优选不高于100℃。
首先选择角蛋白溶解步骤的时间，从而在给定的溶解条件下获得溶解的角蛋白的所需水解程度。通常溶解将花费10分钟至24小时。可以为溶解收率而进一步优化角蛋白溶解的时间。因此，为了获得至少所需的角蛋白水解程度和优选地获得溶解的角蛋白的最高收率，技术人员将以经验为依据优化角蛋白溶解的整套条件。
除了角蛋白的溶解外，本发明的方法进一步包括部分修饰角蛋白中存在的-SH基的步骤。通常，这些-SH基将是来自角蛋白分子中的分子内和分子间二硫键(C)的裂解的自由-SH基，裂解可以在来自含角蛋白纤维的原料的角蛋白的还原条件下在溶解期间发生。因此，一般而言，自由的-SH基将是半胱氨酸残基。自由-SH基的部分修饰通常涉及-SH基化学转化为另一种基团，例如包括但不限于一种或多种下文所述的官能团的官能团。修饰的一个目的是其阻止修饰的-SH基在溶解的角蛋白分子之间(重新)形成分子内和分子间二硫键，从而避免或者至少降低不溶性角蛋白聚集体的形成。另一方面，-SH基的部分修饰意味着残留的自由半胱氨酸残基可以进一步反应，例如(重新)形成二硫键，用以交联和/或聚合，这些反应可以用来赋予终产品所需的性质，如机械强度和/或耐化学或物理影响。与基本上完全修饰相比，部分修饰的一些进一步的优点包括这样获得的角蛋白(更)适于提供水不溶性膜，例如用于涂层应用和用于下文所述的其它应用。相比而言，完全修饰的角蛋白，如在上述US-A-3464825中所述的那些，通常是水溶性的。溶解的角蛋白的自由-SH基的部分修饰可以以本领域公知的许多方式来实现，这主要取决于所用的官能团。通过非限制性实施例，一些适当的官能团和用于部分转化自由-SH基的条件将在下文中描述。
在本发明的方法中，溶解的角蛋白的部分修饰优选使得该溶解的角蛋白中的全部自由-SH基的至少10％，优选至少20％，更优选至少30％，并且最优选至少40％被修饰，并且同时使得该溶解的角蛋白中的少于全部自由-SH基的70％，优选不超过65％，更优选不超过60％，并且最优选不超过57％被修饰。最优选该溶解的角蛋白中的全部自由-SH基的修饰度约为50％，即在44-56％之间。该角蛋白中的其余-SH基将不被修饰，因此仍原样存在于所得的部分修饰的产品中，或者以重新形成的二硫键存在(认为这等价于两个自由的-SH基，例如对于如下所述为了计算修饰度而言)。
修饰度可以通过适当选择修饰反应的条件来控制，包括但不限于所用的官能化试剂、反应时间、温度、pH、所用的溶剂、各反应物的浓度以及角蛋白材料的浓度。可以想象产生具有所需修饰度的终产品的具体条件的选择可能需要一些初步实验和/或某种程度的反复试验。但是，基于本文的公开，这将在技术人员容易达到的范围内，并且因此被认为包括在本发明的范围内。
修饰以本领域公知的方式进行，该方式取决于用来修饰-SH基的一种或多种基团，以及这种修饰是否与任何进一步的加工步骤，例如溶解组合。适当的条件可能包括水或含水介质的使用，官能化试剂的浓度为0.01M至1M，pH为7.0-10.0，温度为4℃至20℃，时间为10分钟至24小时，溶解的角蛋白的浓度为每100毫升含水解介质2克至10克。在约50％的修饰度下，用一氯乙酸修饰的条件是，例如，在8.5-9.5的pH下，在10-20℃的温度下，用0.5-5克一氯乙酸，在1升体积中将10-30克溶解的角蛋白保温30-90分钟。
修饰度可以通过比较修饰后残留的自由-SH基的量(包括存在的二硫键的量)和修饰前的自由-SH基(包括二硫键)的量来确定，其中角蛋白制剂中自由-SH基/二硫键的量可以使用适当的测定法来确定，如Schrooyen等描述的DTNB/NTSB测定法(Joumal of Agricultural andFood Chemistry；2000；48(9)；4326-4334)。或者，也可以比较修饰后残留的自由-SH基/二硫键的量和角蛋白中-SH基/二硫键的量的理论值。天然角蛋白中-SH基/二硫键的理论量(以存在的胱氨酸/半胱氨酸残基的量计)约为每克角蛋白700微摩尔半胱氨酸基(胱氨酸基的量为该量的一半)。
可以用任何所需的适于-SH基的官能化和/或角蛋白的官能化的官能团修饰-SH基；或者用两种或多种这些基团的适当组合修饰-SH基。所选择的具体官能团和它们各自的量通常将取决于终产品的所需性质。
因此，本发明的角蛋白可以具有一个或多个带负电的官能团、一个或多个带正电的官能团，和/或一个或多个中性官能团，或者它们的适当组合。在这方面，本领域技术人员将清楚带“正”和/或“负”电荷的基团可以分别与适当的反荷离子，即阴离子(基团)或阳离子(基团)缔合。还将清楚由本文所述的带“正”或“负”电荷的官能团所带的实际电荷还可能取决于角蛋白存在/维持的条件，如pH、溶剂等。但是，一般而言，在6.0-8.0范围内的pH下，带“正”电荷的基团将具有净正电荷，带“负”电荷的基团将具有净负电荷，而“中性”基团将具有基本上为零的净电荷。
优选地，使用至少含有允许该有机化合物与-SH基反应的基团或残基的一种或多种饱和或不饱和有机化合物来引入所描述的官能团。这些可以包括但不限于适当的离去基团，如卤素(氯、溴或碘)、环氧化物-或缩水甘油基，或诸如(甲基)丙烯酰基、乙烯基的不饱和基团；而其它适当的基团对于本领域技术人员而言将是清楚的。除了可以与自由-SH基反应的基团外，这些有机化合物还可以含有一种或多种可以提供负电荷的其它基团，如-COOH基；或者可以提供正电荷的基团，如季铵基，包括但不限于烷基化的氨基。因此，举例来说，可以用带负电的基团，例如可以使用如下物质引入的基团来修饰角蛋白：
—卤代酸，如氯乙酸、碘乙酸和溴乙酸；
—过氧化物，如过氧化氢或有机过氧化物，包括但不限于用来形成磺酸盐基的过甲酸或过乙酸；
—含有带负电荷的基团的不饱和有机化合物，如含有-COOH基的乙烯基化合物；
—缩水甘油基化合物；
或者它们的任何适当组合。
通常，用这些带负电的基团部分修饰部分水解的角蛋白将增强角蛋白的可分散性。
举例来说，可以使用下列物质引入带正电的官能团：
—卤代有机胺，如卤代烷基胺；
—带胺基的缩水甘油基化合物，如缩水甘油基三甲基氯化铵；
或者它们的适当组合。
举例来说，可以使用下列物质引入中性官能团：
—卤代有机化合物，如卤代烷和卤代醚、酯或酰胺；
—缩水甘油基化合物，如烷基缩水甘油基化合物；
—乙烯基化合物，如烷基乙烯基化合物；
或者它们的适当组合。
其它适当的官能化化合物，举例来说，在FR 2 522 657中有描述。还可以使用诸如亚硫酸钠或偏亚硫酸氢钠的亚硫酸盐修饰角蛋白，形成S-磺酸盐基，或者使用其它无机化合物修饰角蛋白。
可以例如通过向溶解混合物中添加官能化试剂而方便地将修饰步骤与溶解步骤组合。在溶解和修饰后，角蛋白源产品可能已经适于其设计的最终用途，并且因此，举例来说，可以被销售或者就这样提供给最终消费者。
在本发明的方法中，溶解和/或修饰的条件优选使溶解的角蛋白被部分水解或部分降解。部分水解，也称作部分“降解”，通常包括形成角蛋白分子的氨基酸之间(部分)肽键的裂解。部分水解可以在溶解和/或修饰期间实现。但是，如果溶解和/或修饰不产生溶解的角蛋白的所需程度的部分水解，可以通过本领域任何公知的方式实现进一步的水解或降解，所述方式包括，例如化学水解、物理水解和/或酶水解。
溶解的角蛋白的水解程度使从溶解且部分水解的角蛋白生产的角蛋白基产品具有所需的物理和化学性质。例如，从溶解且部分水解的角蛋白生产的膜或涂层优选具有高于15MPa，更优选高于16、17、18或20MPa的拉伸强度。该膜还优选具有至少100Mpa，更优选高于150、200、250或300Mpa的E-模量。该膜还优选具有至少10％，更优选高于20、30、40或50％的断裂伸长率。可以产生具有这些物理化学性质的角蛋白基产品的溶解的角蛋白的水解程度可以通过在本发明的方法中所得的溶解且部分水解的角蛋白的分子量分布来定义。因此，该溶解且部分水解的角蛋白的分子量分布可以定义如下：
—该溶解且部分水解的角蛋白基本上具有1至10.4kDa之间的分子量，特别是3至10.4kDa之间，其中基本上被理解成意指在该部分水解的角蛋白部分中存在的所有角蛋白分子的至少50％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少99％具有所示范围内的分子量；
—优选地，至少1％的该溶解的角蛋白具有小于10kDa的分子量。另外，优选至少50％的该溶解的角蛋白具有大于5kDa的分子量。更优选地，至少3、5、7、10或15％的该溶解的角蛋白具有小于10kDa的分子量，其中至少60、70、80、90或95％的该溶解的角蛋白具有大于5kDa的分子量；和/或
—该溶解且部分水解的角蛋白优选具有基本上与如下获得的溶解的角蛋白的分子量分布相同的分子量分布：在40-80℃的温度下，将40克清洁且干燥的家禽羽毛在pH为pH10.0至pH13.5之间的1升0.05-0.5M硫化钠水溶液中溶解30-90分钟。然后，优选通过过滤分离该溶解的角蛋白和未溶解的原料。更优选地，该分子量分布基本上与如下获得的角蛋白的分子量分布相同：在55-65℃的温度下，将40克清洁且干燥的家禽羽毛在pH为pH11.0至pH13.0之间的1升0.075-0.15M硫化钠水溶液中溶解45-75分钟。最优选地，该分子量分布基本上与如下获得的角蛋白的分子量分布相同：在60℃的温度下，将40克清洁且干燥的家禽羽毛在pH12.5的1升0.1M硫化钠水溶液中溶解45-75分钟。
—该溶解且部分水解的角蛋白优选具有这样的分子量，其使该溶解的角蛋白的1％(w/v)溶液在25℃下具有1mPa·s至100mPa·s，优选1mPa·s至100mPa·s之间的粘度。举例来说，可以在乌伯娄德粘度计中测量粘度。
—该溶解且部分水解的角蛋白优选具有这样的分子量分布，其使该溶解的角蛋白在水中的可分散性为1％至50％，优选为10％至30％。本文中角蛋白的可分散性定义为，角蛋白能够形成在制备24小时内几乎没有或没有沉淀的稳定分散体。
可以通过适当地选择水解反应的条件来控制水解程度，所述条件包括但不限于所用的反应物(如用于化学降解)、所用的力/设备(如用于物理降解)、所用的酶(如用于酶降解)、水解时间、温度、pH、所用的溶剂、各反应物的浓度、角蛋白材料的浓度、提供角蛋白材料的方式(如在本文下述的适当预处理之后)、所用的任何搅拌或振荡，和/或水解是否在溶解、修饰期间进行和/或单独进行。可以想象，选择提供所需水解程度并且因而与部分修饰和任何进一步加工结合而产生具有诸如下述性质的所需性质的终产品可能需要一些初步实验和/或某种程度的反复试验。但是基于本文的公开，这将在本领域技术人员容易达到的范围内，并且因此应认为其涵盖于本发明的范围内。
另外-或任选地-可以以几种方式确定水解程度，包括例如通过例如尺寸排阻色谱法分析水解部分的分子量或其分布；测定制剂的粘度；测定制剂的可分散性；测定蛋白端基量；或者它们与其他适当技术的任意组合。
取决于所使用的条件，作为部分水解的结果，可能直接获得分子量基本上在上述范围内的部分水解的角蛋白的部分或制剂。但是，以下内容也在本发明的范围内：为了获得这样的部分或制剂，例如，作为水解和/或修饰后的任何进一步加工的部分，可以从该水解的部分或制剂中除去仍存在的一定量的-达到约基本上全部的-更高分子量成分(如任何残余且未溶解的原料)和/或一定量的-达到约基本上全部的-在水解反应期间形成的更低分子量的降解产物。
另外，根据本发明，该溶解的角蛋白可能形成，例如分子量在上述范围之上的聚集体。这种聚集以及所得的聚集体都在本发明的范围内，只要形成这些聚集体的角蛋白源分子具有基本上在所述范围内的分子量。
此外，该角蛋白源产品可能发生一定程度的聚合(例如在部分水解、部分修饰和/或进一步加工之后)，其中又可能形成分子量在上述范围之上的产品。这种聚合以及所获得的聚合产物也在本发明的范围内，同样条件是结合形成这些聚合结构的角蛋白源分子的分子量基本上在上述范围内。
与现有技术中基本上完整的角蛋白相比，本发明的部分水解/修饰的角蛋白可以有利地用于特别是那些需要角蛋白具有更疏水特性和/或更低表面张力的应用。当将本发明的部分水解的角蛋白应用于膜或涂层时，这可能是有利的。与基本上完整的角蛋白相比，本发明的部分水解的角蛋白还具有改善的粘着性。这些粘着性可以，例如有利地用于将纸粘到玻璃上，如可以用于将标签固定到(啤酒)瓶上。与现有技术中的基本上完整的角蛋白相比，本发明的部分水解的角蛋白具有改善的乳化性质，因为该部分水解的角蛋白是更加两亲的。使用部分水解且部分修饰的角蛋白的进一步的益处在于部分水解的蛋白的潜在增加的抗菌作用。这由乳清蛋白乳铁蛋白的水解产物，lactoferricin表现出。通过部分修饰，仍可以通过二硫键形成将具有增加的抗菌作用的角蛋白肽引入机械强度良好的膜中，产生新一代抗菌涂层。
在本发明的另一任选的方面，溶解且部分水解的角蛋白可以接受进一步的加工步骤，例如可以包括：
—进一步的纯化，例如从所得角蛋白产品中除去不需要的组分和/或物质。举例来说，它们可以包括残留的角蛋白原料、更高分子量的角蛋白组分、更低分子量的角蛋白组分、反应物和/或来自任何加工步骤的副产物，和/或其它杂质或不需要的组分。用以除去这些组分或物质的适当技术包括例如洗涤、沉淀、渗析、过滤和离心；
—角蛋白源产品，和/或其任何特定部分的分离。举例来说，这可以使用诸如沉淀、膜分离、色谱技术和溶剂萃取来实现；
—干燥，包括例如冷冻干燥、喷雾干燥、多级干燥和使用滚筒干燥；
—在所需溶剂或溶剂混合物中分散；
—聚集或者甚至聚合；
或者它们的任何适当组合。
另外，根据所设计的用途，该角蛋白产品可以与一种或多种其它物质、添加剂、组分等组合或混合。它们的一些非限制性实例包括颜料、盐、抗菌剂、洗涤剂和增塑剂。
将清楚，这种进一步的加工和/或其它组分的添加也可以由最终用户进行；并且这也涵盖在本发明的范围内。
本发明的另一方面涉及包含由或可由上述本发明的方法所获得的角蛋白的组合物。这些组合物中的角蛋白的特征在于(a)其-SH基被部分修饰，优选该角蛋白的至少10％且不超过70％的-SH基被修饰；和(b)其被部分水解，使得该组合物中的角蛋白具有文本上述的分子量分布。
在另一方面，本发明公开了包含角蛋白的组合物，该组合物可由(或由)至少包括下列步骤的方法获得：(a)在40-80℃的温度下，将来自含角蛋白纤维的原料的角蛋白在pH为pH10.0至pH13.5的0.05-0.5M硫化钠水溶液中溶解30-90分钟；和(b)修饰该溶解的角蛋白的10-70％的-SH基，优选通过烷基化进行修饰。
一般而言，本发明的产品可以描述为角蛋白的(例如角蛋白基或角蛋白源)产品或制剂或组合物，其中部分水解且部分修饰的角蛋白分子形成主要组分，例如占该产品、制剂或组合物的总组分的至少50重量％，优选至少80、90、95或99重量％。优选该部分水解且部分修饰的角蛋白分子形成该产品、制剂或组合物的总蛋白的至少50重量％，优选至少80、90、95或99重量％。因此，不排除本发明的蛋白质产品可能含有一些其它组分，如其它蛋白质或蛋白质成分(例如水解和/或修饰的蛋白质)、未水解的角蛋白、(更)低分子量的水解产物，以及非蛋白组分，如表面活性剂、盐和/或诸如灰尘的杂质。但是，它们仅以少量存在，例如少于50重量％，优选少于20重量％，更优选少于10重量％，更优选少于5重量％。
优选地，本发明的组合物中至少50、60、70、80或90％的角蛋白分子至少包含一个疏水部分或区，以及至少一个，且优选两个亲水部分或区，如下面进一步描述的。例如，这些角蛋白分子可以包含总共10-100个氨基酸残基，优选30-100个氨基酸残基；其中疏水部分或区包含20-40个氨基酸残基，其余氨基酸残基构成一个或多个亲水部分或区。在本发明优选的方面，该组合物中的角蛋白被水解至一定程度，使得所得部分水解的角蛋白分子(仍)含有至少一个疏水部分或区-例如衍生自原角蛋白分子的原中央部(β)-以及至少一个亲水部分或区，例如衍生自原链端(C)和/或(N)之一。可以认为这种部分水解的角蛋白分子具有“A-B”的示意结构，其中A代表通常为5-30个氨基酸残基的亲水部分或区；而B代表通常为5-40个氨基酸残基的疏水部分或区。更优选地，在本发明中，角蛋白被水解至一定程度，使得所得部分水解的角蛋白分子(仍)含有至少一个疏水部分或区-例如衍生自原角蛋白分子的原中央部(β)的疏水部分或区-亲水部分或区，例如衍生自原链端(C)的亲水部分或区和衍生自原链端(N)的亲水部分或区位于所述疏水部分或区的两侧。在该优选的方面，认为部分水解的角蛋白分子具有“A-B-A”的示意结构，其中A’代表亲水部分或区(例如如上定义的)，而B代表疏水部分或区(同样例如如上定义的)。
因为这种优选的结构A-B或者更优选的结构A-B-A，本发明的部分水解的角蛋白可以有利地用于制备或提供多相系统，如分散体、乳浊液、凝胶、胶束、微球以及层或分层结构(包括但不限于单层或双层)。另外，本发明的部分水解的角蛋白可以用作稳定剂、乳化剂或更通常地用于可以是含水或有机系统的这样的多相系统的配方试剂。本领域技术人员将清楚，本领域中描述的水溶性角蛋白或角蛋白制剂，包括但不限于(更)完全水解的制剂，通常将不适于这些应用。
根据本发明的组合物将通常是部分修饰且部分水解的角蛋白的水溶液或分散体的形式。这些溶液或分散体将优选含有每升至少10、20或40克角蛋白，优选每升不超过60、75或90克角蛋白。一般而言，这些溶液或分散体将含有每升约50克角蛋白。优选地，这些溶液或分散体在化学和物理意义上都是稳定的。因此，在化学意义上说，优选地在至少一天、一周或一个月的时间内没可感知的，即优选少于10、5、1％的角蛋白(进一步)降解、修饰和/或氧化发生。在物理意义上说，优选地在至少一天、一周或一个月的时间内没有可感知的，即优选少于10、5、1％的角蛋白沉积或沉淀发生。为了稳定本发明的溶液或分散体，可以应用本领域公知的添加剂。对于长期贮存或更方便的运输而言，本发明的组合物可以是固体形式，优选是分散性的无粉尘粉末或颗粒的形式。可以应用常用的干燥和/或粒化技术，包括使用添加剂来辅助固体形式的配方。
本发明的另一方面涉及使用本发明的部分修饰且部分水解的角蛋白作为角蛋白源来生产角蛋白基产品的方法。本发明的优选的角蛋白基产品通过浇铸本发明的角蛋白溶液或分散体来生产。
本发明的另一方面涉及从本发明的部分修饰且部分水解的角蛋白生产的角蛋白基产品。在优选的实施方案中，该角蛋白基产品是从本发明的角蛋白溶液或分散体浇铸的膜或涂层。优选地，该膜或涂层具有高于15MPa的拉伸强度。该膜或涂层优选具有高于100MPa的E模量，并优选具有大于10％的断裂伸长率。
本发明的部分修饰且部分水解的角蛋白可以用于本领域公知的角蛋白基产品的任何应用，包括例如那些在上文给出的现有技术中提到的应用。一般而言，在这些应用中，本发明的角蛋白源产品将提供有利的性质，包括但不限于诸如机械稳定性的改善的机械性质、改善的物理和化学稳定性、低水溶性和良好的成膜性。另外，因为本发明的角蛋白源产品是水分散性的，而不是水溶性的，所以还可以将其用于例如分散体、乳浊液、胶束、凝胶、微球或其它多相系统(的制备)中。因此，本发明的角蛋白的一些非限制性实例包括：
—用作或用于膜、涂层等，或者用于它们的制备；
—用作或用于(可生物降解的)包装材料，或者用于它们的生产；
—用作或用于诸如控释系统的配方；诸如除草剂、杀虫剂或其它抗微生物剂的农业化学药品；调味料；香料等；所述控释系统用于诸如药物的活性物质；
—用作或用于乳浊液、分散体或其它多相含水系统的配方；
—用作或用于填料、胶凝剂、粘合剂、填充剂、成粒剂、脱模剂、基质材料、乳化剂、稳定剂或其他配方试剂；
—用作抗氧化剂；
—用作抗微生物剂。
因此，举例来说，本发明的角蛋白通常可以用于食品或者食品技术领域；药物和兽医产品；化妆品；农业化学药品领域；粘合剂；油漆或其它涂料；包装材料；诸如洗涤剂的清洁试剂；农业。本发明的角蛋白的可以想象的一些具体用途包括但不限于：
—用作颗粒、粉末，如洗衣粉或其它洗涤剂的涂层或粘结剂；
—用于常规目的的粘合剂，用于工业及家庭使用；
—用于木材、纸张、纸板或模制纤维(moulded fibre)的粘结剂或粘合剂；
—在涂料-包括但不限于水致涂料系统-和/或墨水/墨汁系统中用作粘结剂；用于工业及家庭使用；
—用作抗氧化剂；
—用于封装和/或涂布技术；
—用作例如动物饲料和化妆品中的抗菌剂。
附图说明
图1：(A)角蛋白分子，(B)由聚合的角蛋白单元组成的微原纤维，和(C)微原纤维中分子内和分子间二硫键的图示。
图2：三种不同修饰的角蛋白制剂的摩尔质量对尺寸排阻色谱中洗脱体积的曲线。
图3：未修饰的角蛋白在不同溶液中的溶解性：(1)水，(2)50mMTris-缓冲液pH8.0，(3)pH8.5的8M脲，及(4)每升补加2.5克二硫苏糖醇(DTT)的pH8.5的8M脲。
图4：50％修饰的角蛋白在不同溶液中的溶解性：(1)水，(2)50mM Tris-缓冲液pH8.0，(3)pH8.5的8M脲，及(4)每升补加2.5克二硫苏糖醇(DTT)的pH8.5的8M脲。
图5：90％修饰的角蛋白在不同溶液中的溶解性：(1)水，(2)50mM Tris-缓冲液pH8.0，(3)pH8.5的8M脲，及(4)每升补加2.5克二硫苏糖醇(DTT)的pH8.5的8M脲。
                           实施例
实施例1：部分降解和没有部分降解的部分修饰的分散性角蛋白的制 备
在一个比较实验中，使用Schrooyen等描述的程序(Journal ofAgricultural and Food Chemistry；2000；48(9)；4326-4334)。使用水和洗涤剂清洗家禽羽毛。将清洁且干燥的羽毛(40克)与1升2-巯基乙醇(125mM)、脲(8M)和EDTA(3mM)在Tris-缓冲液(0.2M，pH9.0)中的水溶液混合，并搅拌1小时。使用粗滤布和Whatman 54滤器(孔径10微米)分离未溶解的羽毛和溶解的角蛋白。过滤后，向滤液中加入2克一氯乙酸，并且将pH在9.0保持恒定。1小时后，对该水溶液进行渗析并冷冻干燥。基于100％角蛋白原料(羽毛的重量)，干角蛋白产品的收率是45％。该产品将被称作修饰的角蛋白-方法1。
在第二个实验中，使用改进的方法，方法2。与方法1相比，方法2在下列方面不同：
1)未使用脲；
2)pH更碱性(12.5而非9.0)；
3)使用更高的温度(60℃而非20℃)。
这些条件导致角蛋白蛋白质通过水解而部分降解。将清洁且干燥的羽毛(40克)与1升热的Na2S水溶液(0.1M，pH12.5，60℃)混合并搅拌1小时。使用粗滤布和Whatman 54滤器(孔径10微米)分离未溶解的羽毛和溶解的角蛋白。冷却至20℃后，向滤液中加入2克一氯乙酸并且将pH调节为9.0(基本上实现50％的-SH修饰，称作50％修饰的角蛋白)。1小时后，通过用盐酸(2N)将pH调节为4.2而沉淀角蛋白。通过在Sorvall离心机中以20000xg离心30分钟来分离沉淀。从上清液中取样并冷冻干燥用以进一步分析(进一步称为修饰的角蛋白上清液-方法2)。用乙酸(0.1N，pH4.2)洗涤角蛋白团粒，并随后节其重新悬浮于水中。使用NaOH(1N)将该重新悬浮的团粒的pH调节为7.0并且冷冻干燥这些混合物。基于100％角蛋白原料(羽毛的重量)，干角蛋白产品的收率是40％。该产品将被称作修饰的角蛋白-方法2。
修饰度.使用Schrooyen等描述的DTNB/NTSB测定法(Journal ofAgricultural and Food Chemistry；2000；48(9)；4326-4334)测量修饰度。对于修饰的角蛋白-方法1，54％的半胱氨酸残基得到修饰；对于修饰的角蛋白-方法2，57％的半胱氨酸残基得到修饰。
在图2中显示了修饰的角蛋白-方法1、修饰的角蛋白上清液-方法2和修饰的角蛋白-方法2的摩尔质量对洗脱体积(TSK G 3000+TSK Guard PWH柱+UV检测器)的曲线。洗脱液是脲(8M)和二硫苏糖醇(15mM)的水溶液。流速为0.7ml/min。在这些洗脱条件下，所有残留的二硫键均被还原，并且仅观察到角蛋白(≈10400g/mol)或降解产物(少于10400g/mol)。可以看出，修饰的角蛋白-方法1和修饰的角蛋白-方法2都具有相似的摩尔质量分布，尽管修饰的角蛋白-方法2含有比修饰的角蛋白-方法1更多的高和低摩尔质量产物。高摩尔质量产物可能是在高pH下能够发生的交联反应的产物，例如通过形成羊毛硫氨酸。低摩尔质量产物是降解的结果。这在修饰的角蛋白上清液-方法2中甚至能够更好地观察到，角蛋白上清液-方法2仍含有大量的低摩尔质量产品，主要在3000至10000g/mol之间。
因为方法1中使用的pH从没有高于9.0，所以不可能发生多肽链的降解，这由SEC-MALLS分析的使用得到证实。在方法2中，高温和强碱性pH引起角蛋白的部分降解。
实施例2：具有不同修饰度的部分降解的角蛋白的制备
使用水和洗涤剂清洗家禽羽毛。将清洁且干燥的羽毛(60克)与1.5升热的(NH4)2S水溶液(0.1M，pH12.5，60℃)混合并搅拌1小时。使用粗滤布和Whatman 54滤器(孔径10微米)分离未溶解的羽毛和溶解的角蛋白。基于100％角蛋白原料(羽毛)，滤液中的角蛋白收率是59.5％。冷却至20℃后，将滤液分成3份，每份500毫升：不向第一份中加入一氯乙酸，并且将pH调节为9.0(得到基本上未修饰的角蛋白，称作未修饰的角蛋白)，向第二份中加入1克一氯乙酸，并且将pH调节为9.0(得到基本上50％的SH修饰，称作50％修饰的角蛋白)，向第三份中加入5克一氯乙酸，并且将pH调节为9.0(得到基本上90％的SH修饰，称作90％修饰的角蛋白)。1小时后，通过使用盐酸(2N)将pH调节为4.2而沉淀角蛋白。在Sorvall离心机中以20000xg离心30分钟来分离沉淀。从上清液中取样用以进一步分析。用乙酸(0.1N，pH4.2)洗涤角蛋白团粒，并随后将其重新悬浮于水中。使用NaOH(1N)将该重新悬浮的团粒的pH调节为7.0，并且冷冻干燥这些混合物。基于100％角蛋白原料(羽毛的重量)，干角蛋白产品的收率对于未修饰的角蛋白是46.5％，对于50％修饰的角蛋白是48.9％，而对于90％修饰的角蛋白是20.8％。
修饰度.使用Schrooyen等描述的DTNB/NTSB测定法(Journal ofAgricultural and Food Chemistry；2000；48(9)；4326-4334)测量修饰度。对于未修饰的角蛋白1，0％的半胱氨酸残基得到修饰，对于50％修饰的角蛋白，53％的半胱氨酸残基得到修饰，对于90％修饰的角蛋白，89％的半胱氨酸残基得到修饰。
溶解性
将冷冻干燥的角蛋白产品在室温下悬浮(5％)于4种缓冲液中：
1.水
2.Tris-缓冲液(50mM)水溶液-pH8.0：碱性pH有助于悬浮角蛋白
3.脲(8M)-pH8.5：加入脲以防止非共价结合的角蛋白聚集
4.脲(8M)+2.5g/ltr二硫苏糖醇(DTT)-pH8.5：加入DTT以还原二硫键
未修饰的角蛋白在缓冲液4中完全可溶(图3)。它在其它缓冲液中形成白色凝胶。50％修饰的角蛋白在缓冲液3和4中可溶(图4)。它在其它缓冲液中形成白色凝胶。当将缓冲液2加热到40℃时，得到混浊的分散体。90％修饰的角蛋白在所有缓冲液中都可溶或可分散；缓冲液1和2有些混浊(图5)。
成膜
为了通过溶液浇铸产生膜，需要良好的水分散体或水溶液。从未修饰的角蛋白不可能产生膜。从50％修饰的角蛋白，将5％分散体与甘油混合(0.30g/g角蛋白)，并在培养皿中浇铸。干燥后，得到强硬的膜(拉伸强度15MPa)，它在室温下不溶于水。从90％修饰的角蛋白，相似的膜得到制备。该膜具有不良的机械性质(拉伸强度＜5MPa)并且是水溶性的。
粘着性
50％修饰的角蛋白具有良好的粘着性，并且尤其适于通常用于啤酒瓶的将纸粘到玻璃上。

Claims (18)

1、生产部分修饰且部分水解的角蛋白的方法，该方法包括以下步骤：(a)在碱性pH下，在水溶液中，使用还原剂从含角蛋白纤维的原料溶解角蛋白；及(b)部分修饰该溶解的角蛋白的-SH基，其特征在于作为步骤(a)和(b)，以及任选的另外水解步骤(c)的条件的结果，该溶解的角蛋白被部分水解，其中该溶解的角蛋白被部分水解，使得至少50％的溶解的角蛋白分子具有高于1kDa且低于10,4kDa的分子量。
2、根据权利要求1的方法，其中该溶解的角蛋白被部分水解，使得至少1％的溶解的角蛋白具有低于10kDa的分子量，并且至少50％的溶解的角蛋白具有高于5kDa的分子量。
3、根据权利要求1的方法，其中该溶解的角蛋白具有基本上与如下获得的角蛋白的分子量分布相同的分子量分布：在40-80℃的温度下，将40克清洁且干燥的家禽羽毛在pH为pH10.0至pH13.5之间的1升0.05-0.5M硫化钠水溶液中溶解30-90分钟。
4、根据前述权利要求之任一项的方法，其中该溶解的角蛋白的至少10％且不超过70％的-SH基被修饰。
5、根据权利要求5的方法，其中-SH基的修饰包括-SH基的烷基化。
6、根据前述权利要求之任一项的方法，其中该还原剂包括硫化物，优选是碱金属硫化物或硫化铵。
7、包含角蛋白的组合物，其中该角蛋白的特征在于：
a)该角蛋白的至少10％且不超过70％的-SH基被修饰；和
b)至少50％的溶解的角蛋白具有1-11kDa的分子量。
8、根据权利要求7的组合物，其中至少1％的角蛋白具有低于10kDa的分子量，并且至少50％的角蛋白具有高于5kDa的分子量。
9、根据权利要求8的组合物，其中该角蛋白具有基本上与如下获得的角蛋白的分子量分布相同的分子量分布：在40-80℃的温度下，将40克清洁且干燥的家禽羽毛在pH为pH10.0至pH13.5之间的1升0.05-0.5M硫化钠水溶液中溶解30-90分钟。
10、根据权利要求7-9之任一项的组合物，其中-SH基的修饰包括-SH基的烷基化。
11、包含角蛋白的组合物，其中该组合物可以在包括下列步骤的方法中获得：
(a)在40-80℃的温度下，将来自含角蛋白纤维的原料的角蛋白在pH为pH10.0至pH13.5之间的0.05-0.5M硫化钠水溶液中溶解30-90分钟；
(b)修饰溶解的角蛋白的10％至70％的-SH基，优选通过烷基化进行修饰。
12、根据权利要求7-11之任一项的组合物，其中该组合物是水溶液或分散体的形式。
13、根据权利要求7-11之任一项的组合物，其中该组合物是固体形式，优选是分散性的无粉尘粉末或颗粒。
14、生产角蛋白基产品的方法，该方法的特征在于将权利要求7-13之任一项的含角蛋白的组合物用作角蛋白源。
15、根据权利要求14的方法，其中通过浇铸权利要求7-13之任一项的角蛋白溶液或分散体而生产该角蛋白基产品。
16、根据权利要求15的方法，其中该角蛋白基产品是膜或涂层。
17、从权利要求7-13之任一项的含角蛋白的组合物生产的角蛋白基产品，该产品是膜或涂层，具有
a)高于15MPa的拉伸强度；
b)高于100MPa的E模量；和
c)高于10％的断裂伸长率。
18、权利要求7-13之任一项的角蛋白用于下列各项的用途：
-制备膜或涂层；
-制备可生物降解的包装材料；
-配方用于活性物质的控释系统；
-形成乳液、分散体或多相含水系统；
-作为或用于填料、胶凝剂、粘结剂、填充剂、成粒剂、脱模剂、基质材料、乳化剂或稳定剂；
-作为抗氧化剂；或者
-作为抗微生物剂。
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