CN1492878A - 免疫特异性结合BLyS的抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫特异性地结合BLyS的抗体及相关的分子。本发明还涉及检测或诊断与异常BLyS表达或不适当的BLyS功能相关的疾病或功能失调的方法和组合物,其包括免疫特异性地结合BLyS的抗体或其片段或变体或相关分子。本发明还涉及预防、治疗或改善与异常BLvS表达或不适当的BLyS功能相关的疾病或功能失调的方法或组合物,其包括给予动物有效量的免疫特异性地结合BLyS的一或多种抗体或其片段或变体或相关的分子。
Description
导言
本发明涉及免疫特异性结合BLyS的抗体和相关的分子。本发明还涉及检测,诊断或预测与异常BLyS或BLyS受体表达或不适当的BLyS或BLyS受体功能相关的疾病或功能失调的方法和组合物,包括免疫特异性结合BLyS的抗体或其片段或变体,或相关的分子。本发明还涉及预防,治疗或减轻与异常BLyS或BLyS受体表达或不适当的BLyS或BLyS受体功能相关的疾病或功能失调的方法和组合物,包括为动物优选人施用有效量的免疫特异性结合BLyS的一或多种抗体或其片段或变体或相关分子。
发明背景
B淋巴细胞刺激因子(BLyS)是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的一个成员,其在体内和体外均诱导B细胞增殖和分化(Moore等,科学285:260-263(1999))。通过其单核细胞特异性基因和蛋白质表达模式及其特异性受体分布和对B淋巴细胞的生物活性,可以将BLyS与其它B细胞生长和分化因子如IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-13,IL-15,CD40L,或CD27L(CD70)加以区分。BLyS表达在天然杀伤(NK)细胞,T细胞或B细胞中检测不到,而是限于源自骨髓的细胞。BLyS在静止的单核细胞中的表达受γ干扰素(IFN-γ)正调节。编码BLyS的基因已经染色体作图为13q34。
BLyS表示为是一个285个氨基酸的II型膜结合多肽和一个可溶的152个氨基酸的多肽(Moore等,1999如前)。所述膜结合形式的BLyS在第47-73位氨基酸残基之间具有一个推定的跨膜结构域。可溶形式的BLyS的NH2-末端在膜结合形式的BLyS的Ala124处起始。可溶的重组的BLyS已经示出诱导小鼠脾B细胞在体外增殖,及在这些细胞上结合细胞表面受体(Moore等,1999如前).将可溶形式的BLyS施用于小鼠已经示出导致CD45R暗,Ly6D亮(也称为ThB)B细胞的比例提高,血清IgM和IgA水平提高(Moore等,1999如前)。因此,BLyS在其受体分布和生物活性方面均表现B细胞向性。
基于其表达模式和生物活性,提示BLyS参与B细胞和单核细胞或其分化的子代之间的信号交换。BLyS受体和配体的限制性表达模式提示BLyS可以作为T细胞非依赖性应答的调节剂,以与T细胞依赖性抗原激活中CD40和CD40L相似方式进行。这样,可以发现免疫特异性结合BLyS的抗体和相关分子具有医学用途,例如治疗与自身免疫性,瘤形成,或免疫缺陷综合征相关的B细胞功能失调。
发明概述
本发明涵盖了免疫特异性结合BLyS多肽或多肽片段的抗体(包括包含或由其抗体片段或变体组成的分子)。特别地,本发明涵盖了免疫特异性结合以下多肽或多肽片段的抗体(包括包含或由其抗体片段或变体组成的分子),所述多肽或多肽片段是人BLyS(SEQ IDNO:3228和/或3229),或在人单核细胞上表达的BLyS;小鼠BLyS(SEQ ID NO:3230和/或3231)或在小鼠单核细胞上表达的BLyS;大鼠BLyS(可溶形式的SEQ ID NO:3232,3233,3234和/或3235,或膜结合形式,例如在大鼠单核细胞的表面上);或猴BLyS(例如猴BLyS多肽SEQ ID NO:3236和/或3237,可溶形式的BLyS,或在猴单核细胞上表达的BLyS),优选人BLyS。本发明还涵盖了在动物,优选哺乳动物,最优选人中,检测,诊断或预测与异常BLyS或BLyS受体表达或不适当的BLyS或BLyS受体功能相关的疾病或功能失调的方法和组合物,包括使用免疫特异性结合BLyS的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)。可以用本发明的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)检测,诊断或预测的疾病和功能失调包括但非限于免疫失调(例如狼疮,类风湿性关节炎,多发性硬化,重症肌无力,Hashimoto’s病,和免疫缺陷综合征),炎症(例如哮喘,过敏性疾病和类风湿性关节炎),感染性疾病(例如AIDS),和增殖性疾病(例如白血病,癌症和淋巴瘤)。本发明还涵盖了在动物体内,优选哺乳动物及更优选人体内,预防,治疗或减轻与异常BLyS或BLyS受体表达或不适当的BLyS或BLyS受体功能相关的疾病或功能失调的方法和组合物,包括为所述动物施用有效量的免疫特异性结合BLyS的一或多种抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)。可以通过施用有效量的本发明抗体预防,治疗或减轻的疾病和功能失调包括但非限于免疫失调(例如狼疮,类风湿性关节炎,多发性硬化,重症肌无力,Hashimoto’s病和免疫缺陷综合征),炎症(例如哮喘,过敏性疾病和类风湿性关节炎),感染性疾病(例如AIDS),和增殖性疾病(例如白血病,癌症和淋巴瘤)。
使用噬菌体展示方法,本发明人已经鉴别了免疫特异性结合BLyS的单链抗体分子(scFvs),包括免疫特异性结合可溶性BLyS的scFvs,免疫特异性结合膜结合形式BLyS的scFvs,和免疫特异性结合可溶形式及膜结合形式BLyS的scFvs。本发明还涵盖了免疫特异性结合可溶形式的BLyS,膜结合形式BLyS和/或可溶及膜结合形式BLyS的,包含或由这些scFvs的片段或变体组成的分子(例如包括具有表1所示任一氨基酸序列的VH结构域,VH CDR,VL结构域,或VL CDR),本发明还涵盖了编码这些scFvs的核酸分子。
特别地,本发明涉及的scFvs包含或由选自以下的一种氨基酸序列组成:SEQ ID NO:1-2128,优选SEQ ID NO:834-872,1570-1595,和1886-1908,及最优选SEQ ID NO:1-46,321-329,1563-1569,和1881-1885,如下表1所示。在特异的实施方案中,本发明涉及免疫特异性结合可溶形式BLyS的scFvs,所述scFvs包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:1563-1569,优选SEQ ID NO:1570-1595,及最优选SEQ ID NO:1563-1569组成,如下表1所示。在其它实施方案中,本发明还涉及免疫特异性结合膜结合形式BLyS的scFvs,所述scFvs包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:1881-2128,优选SEQ IDNO:1886-1908,及最优选SEQ ID NO:1881-1885组成,如下表1所示。本发明还涉及免疫特异性结合膜结合形式和可溶形式BLyS的scFvs,所述scFvs包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:1-1562,优选SEQ ID NO:834-872,及最优选SEQ ID NO:1-46,和321-329组成,如下表1所示。本发明还涵盖了免疫特异性结合可溶形式BLyS,膜结合形式BLyS,和/或可溶形式及膜结合形式BLyS的,包含或由这些scFvs的片段或变体(例如包括具有表1所示任一种氨基酸序列的VH结构域,VH CDR,VL结构域或VL CDR)组成的分子,本发明还涵盖了编码这些scFvs的核酸分子。
本发明提供了免疫特异性结合BLyS多肽或多肽片段的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子),所述抗体包含或由具有以下结构域的氨基酸序列的多肽组成:下表1所示任一种重链可变(VH)结构域,或下表1所示任一种轻链可变(VL)结构域。在一个优选的实施方案中,本发明的抗体包含或由具有包含于SEQ IDNO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908中的VH结构域的氨基酸序列的多肽组成,如下表1所示。在另一个优选的实施方案中,本发明的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)包含或由具有包含于SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908中的VL结构域的氨基酸序列的多肽组成,如下表1所示。本发明还涵盖了免疫特异性结合可溶形式BLyS,膜结合形式BLyS,和/或可溶形式及膜结合形式BLyS的,包含或由这些抗体的片段或变体(例如包括具有表1所示任一种氨基酸序列的VH结构域,VH CDR,VL结构域或VL CDR)组成的分子,本发明还涵盖了编码这些抗体的核酸分子。
本发明还提供了免疫特异性结合BLyS多肽或多肽片段的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子),所述抗体包含或由具有下表1所示任一种VH结构域的氨基酸序列和下表1所示任一种VL结构域的氨基酸序列的一种多肽组成。在一个优选的实施方案中,本发明的抗体包含或由具有表1所示同一scFv中包含的VH和VL结构域的氨基酸序列的多肽组成。在另一个优选的实施方案中,本发明的抗体包含或由一个VH结构域和一个VL结构域组成,所述VH结构域来自表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908的scFv,所述VL结构域来自表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908的scFv。在另一个优选的实施方案中,本发明的抗体包含或由来自表1所示的SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908的单一scFv的VH和VL结构域组成。本发明还涵盖了免疫特异性结合可溶形式BLyS,膜结合形式BLyS,和/或可溶形式及膜结合形式BLyS的,包含或由这些抗体的片段或变体(例如包括具有表1所示任一种氨基酸序列的VH结构域,VH CDR,VL结构域或VL CDR)组成的分子,本发明还涵盖了编码这些抗体的核酸分子。
本发明还提供了免疫特异性结合BLyS多肽或多肽片段的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子),所述抗体包含或由一种多肽组成,所述多肽具有表1所示任一种,两种,三种或多种VH互补决定区(CDR)(即VH CDR1,VH CDR2,或VH CDR3)的氨基酸序列,和/或表1所示任一种,两种,三种或多种VL CDR(即VL CDR1,VL CDR2,或VL CDR3)的氨基酸序列。在一个实施方案中,本发明的抗体包含或由一种多肽组成,所述多肽具有表1所示任一种VH CDR1和/或任一种VL CDR1的氨基酸序列。在另一个实施方案中,本发明的抗体包含或由一种多肽组成,所述多肽具有表1所示任一种VH CDR2和/或任一种VL CDR2的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中,本发明的抗体包含或由一种多肽组成,所述多肽具有表1所示任一种VH CDR3和/或任一种VL CDR3的氨基酸序列。本发明还涵盖了免疫特异性结合可溶形式BLyS,膜结合形式BLyS,和/或可溶形式及膜结合形式BLyS的,包含或由这些抗体的片段或变体(例如包括具有表1所示任一种氨基酸序列的VH结构域,VH CDR,VL结构域或VL CDR)组成的分子,本发明还涵盖了编码这些抗体的核酸分子。
在另一个实施方案中,本发明的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)免疫特异性结合BLyS多肽或多肽片段,并包含或由一种多肽组成,所述多肽具有表1所示任一种VH CDR1s的氨基酸序列,表1所示任一种VH CDR2s氨基酸序列,和/或表1所示任一种VH CDR3s的氨基酸序列。在另一个实施方案中,本发明的抗体包含或由一种多肽组成,所述多肽具有表1所示任一种VLCDR1s的氨基酸序列,表1所示任一种VL CDR2s氨基酸序列,和/或表1所示任一种VL CDR3s的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中,本发明的抗体包含或由对应于表1所示同一scFv的至少一个,两个,三个,四个,五个,六个或多个CDR组成,更优选地,其中VL结构域的CDR1,CDR2,和CDR3对应于同一scFv,或者其中VH结构域的CDR1,CDR2,和CDR3对应于同一scFv,及最优选其中所有6个CDR均对应于表1所示同一scFv。本发明还涵盖了免疫特异性结合可溶形式BLyS,膜结合形式BLyS,和/或可溶形式及膜结合形式BLyS的,包含或由这些抗体的片段或变体(例如包括具有表1所示任一种氨基酸序列的VH结构域,VH CDR,VL结构域或VL CDR)组成的分子,本发明还涵盖了编码这些抗体的核酸分子。
本发明还提供了抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子):免疫特异性结合可溶形式的BLyS(例如由SEQ ID NO:3228的134-285位氨基酸组成的多肽);免疫特异性结合膜结合形式BLyS(例如由SEQ ID NO:3228的1-285位氨基酸组成的多肽或在单核细胞表面表达的BLyS多肽);和/或免疫特异性结合可溶形式和膜结合形式BLyS。在一个优选的实施方案中,本发明的抗体免疫特异性结合可溶形式的BLyS,并包含或由对应于一或多个免疫特异性结合可溶形式BLyS的scFvs的VH结构域,VH CDR1,VH CDR2,VHCDR3,VL结构域,VL CDR1,VL CDR2,和/或VL CDR3组成。在另一个优选的实施方案中,本发明的抗体免疫特异性结合膜结合形式的BLyS,并包含或由对应于一或多个免疫特异性结合膜结合形式BLyS的scFvs的VH结构域,VH CDR1,VH CDR2,VH CDR3,VL结构域,VL CDR1,VL CDR2,和/或VL CDR3组成。在另一个优选的实施方案中,本发明的抗体免疫特异性结合可溶形式的和膜结合形式的BLyS,并包含或由对应于一或多个免疫特异性结合可溶形式的和膜结合形式BLyS的scFv的VH结构域,VH CDR1,VHCDR2,VH CDR3,VL结构域,VL CDR1,VL CDR2,和/或VLCDR3组成。在另一个优选的实施方案中,本发明的抗体包含或由对应于表1所示的同一scFv的一个VH结构域和一个VL结构域组成,所述抗体免疫特异性结合可溶形式的BLyS,膜结合形式BLyS,或可溶形式的和膜结合形式的BLyS。本发明还涵盖了编码这些抗体的核酸分子。本发明还涵盖了免疫特异性结合可溶形式BLyS,膜结合形式BLyS,和/或可溶形式及膜结合形式BLyS的,包含或由这些抗体的片段或变体(例如包括具有表1所示任一种氨基酸序列的VH结构域,VH CDR,VL结构域或VL CDR)组成的分子,本发明还涵盖了编码这些抗体的核酸分子。
在此所揭示的氨基酸序列的一个VH结构域可以与在此所揭示的一个氨基酸序列的一个VL结构域组合,或与其它VL结构域组合,以提供一个VH/VL对,表示抗体的抗原结合位点。相似地,在此所揭示氨基酸序列的VL结构域可以与在此所揭示的氨基酸序列的VH结构域或其它VH结构域组合。另外,在此所揭示的一或多个CDR可以来自一个VH或VL结构域,并掺入一个适当的框架中。如前所述。
本发明提供了包含或由所述VH结构域,VL结构域和/或CDR组成的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体(包括衍生物)组成的分子),所述抗体免疫特异性结合BLyS(例如可溶性BLyS和膜结合BLyS),并可以使用本领域已知的方法常规分析其与BLyS的免疫特异性结合,例如使用前述的免疫测定方法。本发明的抗体和抗体片段或变体(包括衍生物)包括例如一或多个氨基酸序列改变(添加,缺失,取代和/或插入一个氨基酸残基)。这些改变可以在一或多个框架区和/或一或多个CDR’s中进行。本发明的抗体(包括抗体片段,变体和衍生物)可以通过本领域已知方法常规产生。根据本发明,可以应用包含或由其序列在此特异性揭示的任何VH结构域,VH CDR,VL结构域和VL CDR的片段或变体组成的分子。本发明还涵盖了编码这些抗体和分子(包括片段,变体和衍生物)的核酸分子。
本发明还提供了抗体组(包括包含或由抗体片段或变体组成的分子),其中组成员对应于本发明的一个,两个,三个,四个,五个,十个,十五个,二十个或更多个不同的抗体(例如完全抗体,Fabs,F(ab′)2片段,Fd片段,二硫键连的Fvs(sdFvs),抗独特型(抗-Id)抗体,和scFvs)。本发明还提供了抗体的混合物,其中所述混合物对应于本发明的一个,两个,三个,四个,五个,十个,十五个,二十个或更多个不同的抗体(例如完全抗体,Fab,F(ab′)2片段,Fd片段,二硫键连的Fv(sdFv),抗独特型(抗-Id)抗体,和scFv)。本发明还提供了包含或由本发明的一个,两个,三个,四个,五个,十个,十五个,二十个或更多个抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)组成的组合物。本发明的组合物可以包含或由一或多个抗体或其片段或变体的一个,两个,三个,四个,五个,十个,十五个,二十个或更多个氨基酸序列组成。或者,本发明的组合物可以包含或由编码本发明一或多种抗体的核酸分子组成。
本发明还提供了融合蛋白,其包含本发明的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)和一种异源多肽(即与抗体或抗体结构域不相关的多肽)。本发明还涵盖了编码这些融合蛋白的核酸分子。本发明的组合物可以包含或由一种,两种,三种,四种,五种,十种,十五种,二十种或更多种本发明的融合蛋白。或者,本发明的组合物可以包含编码一种,两种,三种,四种,五种,十种,十五种,二十种或更多种本发明的融合蛋白的核酸分子组成。
本发明还制备了一种通常是分离的核酸分子,其编码本发明的抗体(包括如scFvs,其包含或由抗体片段或其变体组成)。本发明还提供了用本发明的核酸分子转化的宿主细胞及其子代。本发明还提供了一种生产本发明抗体(包括包含或由其抗体片段或变体组成的分子)的方法。本发明还提供了一种从核酸分子中表达本发明抗体(包括包含或由其抗体片段或变体组成的分子)的方法。本发明的这些及其它方面在下文中详细说明。
本发明还涵盖了对动物体内,优选哺乳动物体内,更优选人体内与异常BLyS或BLyS受体表达或不适当的BLyS或BLyS受体功能相关的疾病和功能失调进行检测,诊断和/或判断预后的方法和组合物,包括使用免疫特异性结合BLyS的抗体(包括包含或由其抗体片段或变体组成的分子)。可以用本发明的抗体进行检测,诊断和/或判断预后的疾病和功能失调包括但非限于免疫失调(例如狼疮,类风湿性关节炎,多发性硬化,重症肌无力,Hashimoto’s病,和免疫缺陷综合征),炎症(例如哮喘,过敏性疾病和类风湿性关节炎),感染性疾病(例如AIDS),和增殖性疾病(例如白血病,癌症和淋巴瘤)。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了对与高γ球蛋白血症(例如AIDS,自身免疫性疾病和一些免疫缺陷症)相关的疾病或功能失调进行检测,诊断和/或判断预后的方法和组合物。在另一个特异的实施方案中,本发明涵盖了对与低γ球蛋白血症(例如一种免疫缺陷症)相关的疾病或功能失调进行检测,诊断和/或判断预后的方法和组合物。
本发明还涵盖了在动物体内,优选哺乳动物体内,更优选人体内预防,治疗和减轻与异常BLyS或BLyS受体表达或不适当的BLyS或BLyS受体功能相关的疾病和功能失调的方法和组合物,包括为所述动物施用有效量的一或多种免疫特异性结合BLyS的抗体(包括包含或由其抗体片段或变体组成的分子)。通过施用本发明的一或多种抗体或分子可以预防,治疗和减轻的疾病和功能失调包括但非限于免疫失调(例如狼疮,类风湿性关节炎,多发性硬化,重症肌无力,Hashimoto’s病,和免疫缺陷综合征),炎症(例如哮喘,过敏性疾病和风湿性关节炎),感染性疾病(例如AIDS),和增殖性疾病(例如白血病,癌症和淋巴瘤)。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了预防,治疗或减轻与高γ球蛋白血症相关的疾病或功能失调(例如AIDS,自身免疫性疾病,和一些免疫缺陷综合征)的方法和组合物(例如拮抗性抗BLyS抗体)。在其它特异性实施方案中,本发明涵盖了预防,治疗或减轻与低γ球蛋白血症相关的疾病或功能失调(例如一种免疫缺陷综合征)的方法和组合物(例如兴奋性抗BLyS抗体)。
可以用本发明抗体检测,诊断,预测或监测的自身免疫功能失调,疾病或状态包括但非限于自身免疫性溶血性贫血,自身免疫性新生儿血小板减少症,特发性血小板减少性紫癜,自身免疫性中性粒细胞减少症,自身免疫性血细胞减少,溶血性贫血,抗磷脂综合征,皮炎,谷蛋白敏感性肠道病,变应性脑脊髓炎,心肌炎,复发性多软骨炎,风湿性心脏病,肾小球肾炎(例如IgA肾病),多发性硬化,神经炎,眼色素层眼炎,多发内分泌腺病,紫癜(例如Henloch-Scoenlein紫癜),Reiter’s病,Stiff-Man综合征,自身免疫性肺炎,心肌病,IgA肾小球肾炎,密集沉积疾病,风湿性心脏病格林-巴利综合征,胰岛素依赖性糖尿病,和自身免疫性眼炎,自身免疫性甲状腺炎,甲状腺功能低下(即Hashimoto′s甲状腺炎),系统性红斑狼疮,盘状狼疮,肺出血肾炎综合征,天疱疮,自身免疫性受体疾病例如(a)突眼性甲状腺肿,(b)重症肌无力和(c)胰岛素抗性,自身免疫性溶血性贫血,自身免疫性血小板减少性紫癜,类风湿性关节炎,抗胶原抗体schleroderma,混合性结缔组织病,多发性肌炎/皮肌炎,恶性贫血,特发性阿狄森氏病,不孕症,肾小球肾炎如原发性肾小球肾炎和IgA肾病,大疱性类天疱疮,干燥综合征,糖尿病,和肾上腺素抗性(包括哮喘或囊肿性纤维化的肾上腺素抗性),慢性活动性肝炎,原发性胆汁性肝硬化,其它内分泌腺病变,白癜风,血管炎,后-MI,心切开术综合征,风疹,特应性皮炎,哮喘,炎症性心肌病,和其它炎症,肉芽肿病,退化和萎缩)。
可以用本发明的抗体检测,诊断,预测或监测的免疫缺陷包括但非限于X连锁的重度联合免疫缺陷症(SCID),常染色体SCID,腺苷脱氨酶缺陷(ADA缺陷),X连锁的无丙种球蛋白血症(XLA),Bruton’s病,先天性无丙种球蛋白血症,X连锁的婴儿无丙种球蛋白血症,获得性无丙种球蛋白血症,成年起病的无丙种球蛋白血症,晚期发作的无丙种球蛋白血症,异常γ球蛋白血症,低γ球蛋白血症,幼儿暂时低γ球蛋白血症,非特异性低γ球蛋白血症,无丙种球蛋白血症,普通可变免疫缺陷(CVID)(获得性),Wiskott-Aldrich综合征(WAS),高IgM的X-连锁的免疫缺陷,高IgM的非X-连锁的免疫缺陷,选择性IgA缺陷,IgG亚类缺陷(伴或不伴IgA缺陷),Igs水平正常或提高的抗体免疫缺陷,具有胸腺瘤的免疫缺陷,Ig重链缺失,κ链缺损,B细胞淋巴增殖性失调(BLPD),选择性IgM免疫缺陷,隐性无丙种球蛋白血症(Swiss型),网状细胞发育不全,新生儿中性粒细胞减少,重度先天性白细胞减少,免疫缺陷性胸腺淋巴细胞减少—发育不全或发育异常,共济失调性毛细管扩张症,短肢矮小症,X连锁的淋巴细胞增殖性综合征(XLP),联合Igs免疫缺陷的胸腺发育异常综合征,嘌呤核苷磷酸化酶缺损(PNP),MHC II型缺损(裸淋巴细胞综合征)和重度联合免疫缺陷症。
定义
术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分,即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。因此,术语抗体不仅涵盖完整抗体分子,还包括所述抗体的片段以及所述抗体和抗体片段的变体(包括衍生物)。在本说明书中所述术语抗体分子例如包括但非限于单链Fv(scFv),Fab片段,Fab’片段,F(ab’)2,二硫键连接的Fv(sdFv),Fv,及包含或由VL或VH结构域组成的片段。术语“单链Fv”或“scFv”是指一种多肽,其包含与抗体VH结构域连接的抗体的VL结构域。免疫特异性结合BLyS的抗体可以与其它抗原发生交叉反应。优选地,免疫特异性结合BLyS的抗体与其它抗原不发生交叉反应。免疫特异性结合BLyS的抗体可以例如通过免疫测定或其它本领域技术人员已知的方法鉴别,例如通过以下实施例中所述免疫测定方法鉴别。
本发明的抗体包括但非限于单克隆,多特异性,人或嵌合抗体,单链抗体,Fab片段,F(ab′)片段,抗独特型(抗-Id)抗体(包括例如本发明抗体的抗-Id抗体),和上述任何抗体的表位结合片段。本发明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白的任何类型(例如IgG,IgE,IgM,IgD,IgA和IgY),类别(例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2)或亚类。
优选地,本发明的抗体包含或由具有表1所述任一氨基酸序列或其片段或变体的VH结构域,VH CDR,VL结构域,或VL CDR组成。
“结合可溶形式BLyS”的本发明抗体是这样的一个抗体,其结合152个氨基酸的可溶形式的BLyS蛋白(SEQ ID NO:3228的134-285位氨基酸)。在本发明的特异实施方案中,“结合可溶形式BLyS”的本发明抗体不与膜结合形式或膜缔合形式的BLyS结合。测定与可溶形式BLyS结合情况的分析包括但非限于受体结合抑制分析,或从溶液中捕获可溶BLyS的分析方法,见于实施例8和9所述。
“结合膜结合形式BLyS”的本发明抗体是这样的一个抗体,其结合膜缔合(未裂解的)BLyS蛋白。在本发明的特异实施方案中,“结合膜结合形式BLyS”的本发明抗体不与可溶形式的BlyS结合。在ELISA中与HIS标记的BLyS(如本文所述)的结合,是抗体结合膜结合形式BLyS的指征,但不能作为具有膜结合形式BLyS特异性的检验。可以作为抗体对膜结合形式BLyS具有特异性的检验包括但非限于如实施例2所述结合质膜表达BLyS。“结合可溶形式和膜结合形式BLyS”的本发明抗体是即结合膜结合形式的BLyS又结合可溶形式BLyS的抗体。
术语“变体”是指一种多肽,其与BLyS多肽,BLyS片段,抗BLyS抗体或其抗体片段具有相似或相同的功能,但非必需包含相似或相同的BLyS多肽,BLyS片段,抗BLyS抗体或其片段的氨基酸序列,或具有相似或相同的BLyS多肽,BLyS片段,抗BLyS抗体或其片段的结构。具有相似氨基酸序列的一种变体称为一种多肽,其至少符合以下一种多肽:(a)包含或由一种氨基酸序列组成的多肽,所述氨基酸序列与BLyS多肽,BLyS片段,抗BLyS抗体或其片段(包括具有表1所示任一种氨基酸序列的VH结构域,VHCDR,VL结构域,或VLCDR)的氨基酸序列具有至少30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%或至少99%相同性;(b)由一种核苷酸序列编码的含有至少5,10,15,20,25,30,40,50,60,70,80,90,100,125,或至少150个氨基酸残基的多肽,所述核苷酸序列的互补序列在严格杂交条件下与编码BLyS多肽(例如SEQ ID NO:3228),BLyS片段,抗BLyS抗体或其片段(包括具有表1所示任一种氨基酸序列的VH结构域,VHCDR,VL结构域,或VLCDR)的核苷酸序列杂交;(c)由一种核苷酸序列编码的多肽,所述核苷酸序列与编码BLyS多肽,BLyS片段,抗BLyS抗体或其片段(包括具有表1所示任一种氨基酸序列的VH结构域,VHCDR,VL结构域,或VLCDR)的核苷酸序列具有至少30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%或至少99%相同性。与BLyS多肽,BLyS片段,抗BLyS抗体或其片段具有相似结构的多肽是指这样的多肽,其与BLyS多肽,BLyS片段,抗BLyS抗体或其片段具有相似二级,三级或四级结构。多肽的结构可以通过本领域技术人员已知的方法确定,包括但非限于X光结晶法,核磁共振,和结晶电子显微镜方法。
为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的相同性百分率,将所述序列进行最佳序列对比(例如在第一个氨基酸或核酸序列中产生缺口,以与第二个氨基酸或核酸序列最佳对比)。然后对比在相应氨基酸位或核苷酸位的氨基酸残基或核苷酸。在第一个序列一个位置被第二个序列相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时,则所述分子在所述位置是相同的。两个序列之间相同性百分率是所述序列所呈现的相同位置数目的函数(即相同性%=相同重叠位置数/总位置数×100%)。在一个实施方案中,所述两个序列是等长的。
确定两个序列之间相同性百分率可以通过本领域技术人员已知的数学公式进行。对比两个序列的一个数学公式例如是Karlin和Altschul提出的公式(美国科学院院报87:2264-2268(1990)),之后Karlin和Altschul又加以修改(美国科学院院报90:5873-5877(1993))。在这个公式中加入了Altschul等(分子生物学杂志215:403-410(1990))所述的BLASTn和BLASTx程序。BLAST核苷酸研究可以用BLASTn程序进行,score=100,wordlength=12,以获得与本发明核酸分子相同的核苷酸序列。BLAST蛋白质研究可以用BLASTx程序进行,score=50,wordlength=3,以获得与本发明蛋白质分子相同的氨基酸序列。为获得缺口序列排列以进行对比,可以利用Altschul等(核酸研究25:3389-3402(1997))的Gapped BLAST进行。或者,可以使用PSI-BLAST进行重复研究,检测分子间的间隔关系(Id.)。当利用BLAST,Gapped BLAST,和PSI-BLAST程序时,可以使用各个程序的默认参数(例如BLASTx和BLASTn)。(见http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)
用于对比序列的另一个数学公式例如是Myers和Miller,CABIOS(1989)所述公式。在这个公式中加入了ALIGN程序(2.0版本),其是GCG序列对比软件包的一部分。本领域已知的其它序列对比公式包括Torellis和Robotti(计算机应用生物科学10:3-5(1994))所述的ADVANCE和ADAM;Pearson和Lipman(美国科学院院报85:2444-8(1988))所述的FASTA。在FASTA中,ktup是一个控制选项,其设定研究的灵敏性和速度。
术语“衍生物”是指一种变化的本发明多肽,其包含或由本发明的BLyS多肽,BLyS片段,或特异性结合BLyS的本发明抗体的氨基酸序列组成,其已经通过进行氨基酸残基取代,缺失或添加而改变。术语“衍生物”还指一种已经修改的BLyS多肽,BLyS多肽片段,免疫特异性结合BLyS的抗体,所述修改例如是将任何类型的分子共价附加于所述多肽。例如但非限于可以通过糖基化,乙酰化,PEG化(pegylation),磷酸化,酰胺化,通过已知保护/阻断基团衍生化,蛋白酶解,与细胞配体或其它蛋白质连接等。BLyS多肽,BLyS片段,或抗BLyS抗体的衍生物,可以使用本领域已知的方法通过化学修饰加以修改,包括但非限于特异性化学裂解,乙酰化,甲酰化,衣霉素的代谢合成等。另外,BLyS多肽,BLyS片段,或抗BLyS抗体的衍生物,可以含有一或多个非经典氨基酸。多肽衍生物具有与BLyS多肽,BLyS片段,或抗BLyS抗体相似或相同的功能。
术语“表位”是指在动物体优选哺乳动物体内具有抗原性或免疫原性活性的BLyS的一部分。具有免疫原性活性的表位是BLyS的一部分,其在动物体内激发抗体应答。具有抗原性活性的表位是BLyS的一部分,抗体与其免疫特异性结合,这可以通过本领域已知的方法测定,例如本文所述的免疫测定方法。抗原性表位非必需是免疫原性的。
术语“片段”是指一种多肽,其包含具有BLyS多肽或免疫特异性结合BLyS的抗BLyS抗体(包括如scFv’s分子,其包含或由抗体片段或其变体组成)的氨基酸序列的至少5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,60,70,80,90,100,125,150,175,200,250个氨基酸的氨基酸序列
术语“融合蛋白”是指一种多肽,其包含或由本发明抗BLyS抗体的氨基酸序列和一个异源多肽的氨基酸序列(即与抗体或抗体结构域不相关的一个多肽)组成。
术语“宿主细胞”是指用一种核酸分子转化的特殊细胞和这种细胞的子代或潜在子代。子代可以不同于用核酸分子转染的亲代细胞,这归因于在随后的生产中或核酸分子整合入所述宿主细胞基因组中发生的突变或环境影响。
附图简述
图1:三种scFvs,I006E07,I008D05和I016F04的ELISA结果,其免疫特异性结合U937膜,但不与TNF-α或BSA结合或发生交叉反应。
图2:三种scFvs,I006E07,I008D05和I016F04在受体抑制分析中的结果。
图3:两种scFvs(I022D01和I031F02)的ELISA结果,表明其能结合人BLyS及与小鼠BLyS交叉反应,但不与TNF配体家族的其它抗原结合或发生交叉反应。
图4:当用BLyS或TNF-α作为竞争剂时,三种scFvs(I031F09,I050A12,and I051C04)结合U937质膜的ELISA结果。
图5:scFv抗体I003C02的动力学分析。示出从3nM-825nM系列稀释的I003C02。使用BIAcore 2000和BIAevaluation 3.0软件产生缔合和解离曲线。
图6:两种scFv抗体(I007F11 and I050A07)的典型滴定曲线。未标记的BLyS竞争性结合其受体,IC50值为0.8nM。I007F11和I050A07的IC50值分别为7.9nM和17.1nM。以一式三份进行分析并示出标准误差柱。
图7:三种scFv克隆(I074B12,I075F12 and I075A02)的ELISA结果,所述克隆免疫特异性结合固定的BLyS,但不结合U937质膜,TNF-α或BSA。作为对照,识别TNF的噬菌体抗体也示于图7。
图8:两种scFv(I025B09和I026C04)在受体抑制分析中的结果。
图9:两种scFv克隆(I067F05和I078D02)的ELISA结果,表明其能结合固定的人BLyS及与固定的小鼠BLyS交叉反应,但不结合或与TNF配体家族的其它抗原交叉反应。
作为对照,识别TNF的噬菌体抗体也示于图7。
图10:scFv抗体I002A01的动力学分析。示出从3nM-1650nM系列稀释的I002A01。使用BIAcore 2000和BIAevaluation 3.0软件产生缔合和解离曲线。
图11:两种svFv(I0068C06和I074B12)的典型滴定曲线。未标记的BLyS竞争性结合其受体,IC50值为0.66nM。I0068C06和I074B12的IC50值分别为61nM和13nM。以一式三份进行分析并示出标准误差柱。
图12:三个克隆(I079C01,I081C10和I082A02)的ELISA结果,表明其能结合组氨酸标记的BLyS,U937质膜,但不结合固定的生物素化的BLyS。
图13:当用组氨酸标记的BLyS或生物素化的BLyS作为竞争剂式,三个scFvs(I079B04,I079F08,和I080B01)结合U9378质膜的ELISA结果。
图14:8个scFv的典型sensorgram的解离部分实例。包括不识别BLyS的抗TNF-α抗体作为对照。在举例的8个scFv中,鉴别I079F06以进一步研究,因为在其表面有相对大量的RU结合。
图15:scFv抗体I082C03产生的典型结合曲线实例。这个克隆的解离速率(off-rate)经计算为2×10-3s-1。I082C03的亲和性经计算为20nM,设想svFv活性为100%。
图16:当用组氨酸标记的BLyS作为竞争剂时,三个scFvs(I079B04,I079F08,和I080B01)结合P388质膜的ELISA结果。
发明详述
本发明涵盖了免疫特异性结合BLyS或BLyS片段或变体的抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)。特别地,本发明提供了抗体例如具有表1所示SEQ ID NO:1-2128的任一种氨基酸序列的单链Fvs(scFvs)。特别地,本发明涵盖了抗体,其免疫特异性结合一种多肽,多肽片段或变体,或人BLyS的表位(SEQ IDNO:3228和/或3229)或在人单核细胞上表达的BLyS;小鼠BLyS(SEQID NO:3230和/或3231)或在小鼠单核细胞上表达的BLyS;大鼠BLyS(可溶形式SEQ ID NO:3232,3233,3234和/或3235,或膜结合形式,例如在大鼠单核细胞表面上);或猴BLyS(例如猴BLyS多肽SEQ IDNO:3236和/或3237,可溶形式的猴BLyS,或在猴单核细胞上表达的BLyS)(通过本领域已知免疫测定方法测定以分析特异性抗体—抗原结合)。
SEQ ID NO:3228所示的多肽序列是通过对HNEDU15克隆的cDNA进行测序和翻译获得的,所述克隆于1996年10月22日保藏在美国典型培养物保藏中心,ATCC登记号为No.97768,保藏中心位于美国维吉尼亚州马纳萨斯镇大学道20110-2209号,邮编10801。所保藏的克隆包含于pBluescript SK(-)质粒中(Stratagene,La Jolla,CA)。ATCC保藏物是根据用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约进行保藏的。
SEQ ID NO:3229所示的多肽序列是通过对HDPMC52克隆的cDNA进行测序和翻译获得的,所述克隆于1998年12月10日保藏在美国典型培养物保藏中心,ATCC登记号为No.203518。所保藏的克隆包含于pBluescript SK(-)质粒中(Stratagene,La Jolla,CA)。ATCC保藏物是根据用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约进行保藏的。
本发明的抗体结合的BLyS多肽可以是单体或多聚体(即二聚体,三聚体,四聚体和更多聚体)。因此,本发明涉及结合本发明BLyS多肽的单体和多聚体的抗体,其制备,和包含其的组合物(优选药物组合物)。在特异的实施方案中,本发明的抗体结合BLyS单体,二聚体,三聚体或四聚体。在另外的实施方案中,本发明的抗体结合BLyS的至少二聚体,至少三聚体或至少四聚体。
本发明抗体结合的多聚体的BLyS可以是同源多聚体或异源多聚体。BLyS同源多聚体是指一种只含有BLyS多肽(包括BLyS多肽片段,其变体和融合蛋白)的多聚体。这些同源多聚体可以包含具有相同或不同氨基酸序列的BLyS多肽。在特异的实施方案中,本发明的抗体结合一种BLyS同源二聚体(例如含有具有相同或不同氨基酸序列的两个BLyS多肽),或一种BLyS同源三聚体(例如含有具有相同或不同氨基酸序列的三个BLyS多肽)。在一个优选的实施方案中,本发明的抗体结合BLyS的同源三聚体。在另外的实施方案中,本发明的抗体结合一种同源BLyS多聚体,其至少是同源二聚体,同源三聚体或同源四聚体。
异源多聚体BLyS是指一种除了本发明的BLyS多肽之外,还含有异源多肽的多聚体(即不同蛋白质的多肽)。在一个特异的实施方案中,本发明的抗体结合一种BLyS异源二聚体,一种异源三聚体或一种异源四聚体。在另外的实施方案中,本发明的抗体结合一种异源BLyS多聚体,其至少是异源二聚体,异源三聚体或异源四聚体。在高度优选的实施方案中,本发明抗体结合一种异源三聚体,其包含两种BLyS多肽和APRIL多肽(SEQ ID NO:3239;基因库登记号No.AF046888;PCT国际出版物W097/33902;实验医学杂志188(6):1185-1190)或其片段或变体。在其它高度优选的实施方案中,本发明的抗体结合一种异源三聚体,其包含一个BLyS多肽(包括片段或变体)和两个APRIL多肽(包括片段或变体)。在其它高度优选的实施方案中,本发明的抗体结合一种异源三聚体,其包含两种BLyS多肽(包括片段或变体)和一个APRIL多肽(包括片段或变体)。在另外的非独家的实施方案中,本发明抗体结合的异源多聚体含有CD40配体多肽序列,或其生物活性片段或变体。
在特别优选的实施方案中,本发明的抗体结合同源多聚体尤其同源三聚体的BLyS多肽,其中多聚体的各个蛋白质成分由成熟形式的BLyS多肽(例如SEQ ID NO:3228的134-285位氨基酸残基,或SEQ ID NO:3229的134-266位氨基酸残基)或其片段或变体组成。在其它特定的实施方案中,本发明的抗体结合异源多聚体尤其异源三聚体BLyS多肽,如含有两个BLyS多肽和一个APRIL多肽的异源三聚体,或含有一个BLyS多肽和两个APRIL多肽的异源三聚体,其中BLyS异源多聚体的各个蛋白质成分由BLyS(例如SEQ IDNO:3228的134-285位氨基酸残基,或SEQ ID NO:3229的-266位氨基酸残基)或其片段或变体的成熟胞外可溶部分,或者由APRIL(SEQ ID NO:3239的105-250位氨基酸残基)或其片段或变体的的成熟胞外可溶部分组成。
在特定的实施方案中,本发明的抗体结合BLyS单体蛋白的构象表位。在特异的实施方案中,本发明抗体结合BLyS多聚体尤其三聚体蛋白的构象表位。在其它实施方案中,本发明抗体结合起于具有异源多肽的BLyS邻近的构象表位,如当BLyS形成异源三聚体时(例如与APRIL多肽(例如SEQ ID NO:3239))可以存在,或在BLyS和一个异源多肽之间的融合蛋白中。
本发明抗体结合的BLyS多聚体可以是疏水,亲水,离子和/或共价缔合和/或可以是非直接连接的,例如通过形成脂质体连接。因此,在一个实施方案中,BLyS多聚体,例如特异二聚体或特异三聚体,是当本发明的多肽在溶液中彼此相接触时形成的。在另一个实施方案中,BLyS异源多聚体例如BLyS异源三聚体或BLyS异源四聚体,是当本发明的多肽与本发明多肽的抗体(包括本发明融合蛋白中异源多肽序列的抗体)在溶液中相接触时形成的。在其它实施方案中,BLyS多聚体是通过与和/或在本发明BLyS多肽之间共价缔合形成的。这种共价缔合可以包括所述多肽序列(例如SEQ IDNO:3228或SEQ ID NO:3229所示)中包含的一或多个氨基酸残基。在一个实例中,所述共价缔合是在位于所述多肽序列中的半胱氨酸残基之间进行交联,其在天然(即天然发生的)多肽中相互作用。在另一个实例中,共价缔合是化学或重组操纵的结果。或者,这种共价缔合可以包括BLyS融合蛋白中所述异源多肽中含有的一或多个氨基酸残基。在一个实施例中,共价缔合是在融合蛋白中的所述异源序列之间(见例如美国专利No.5,478,925所述)。在一个特异的实施例中,所述共价缔合在BLyS-Fc融合蛋白中包含的异源序列之间。在另一个特异的实施例中,本发明融合蛋白的共价缔合是在来自能形成共价缔合多聚体的另一个TNF家族配体/受体成员的异源多肽序列之间,例如骨原蛋白(见例如国际出版物WO 98/49305,其内容在此全部并入参考)。在另一个特异实施例中,本发明融合蛋白的共价缔合是在来自CD40L的异源多肽序列或其可溶片段之间。在另一个实施方案中,两个或BLyS多肽是通过合成接头(例如肽,碳水化合物或可溶聚合物接头)连接的。那些肽接头的实例见于美国专利No.5,073,627所述(在此并入参考)。包含由肽接头分离的多个BLyS多肽的蛋白质可以使用常规重组DNA方法产生。
在一个实施方案中,本发明抗体免疫特异性结合一种具有SEQID NO:3228氨基酸序列或由ATCC No.97768包含的cDNA克隆编码的BLyS多肽,或结合一种包含上述多肽一部分(即片段)的多肽。在另一个实施方案中,本发明提供了一种抗体,其结合具有SEQID NO:3229氨基酸序列或由ATCC No.203518包含的cDNA克隆编码的氨基酸的分离的BLyS多肽,或者一种结合包含上述多肽一部分(即片段)的多肽的抗体。
本发明的抗体免疫特异性结合包含或由SEQ ID NO:3228氨基酸序列组成的多肽,所述多肽由ATCC登记号No.97768的质粒中包含的cDNA编码,或由与所述保藏克隆中包含的核苷酸序列杂交(例如在严格杂交条件下)的核酸编码。本发明抗体还结合SEQ IDNO:3228氨基酸序列的片段,所述多肽由ATCC登记号No.97768的质粒中包含的cDNA编码,或由与所述保藏克隆中包含的核苷酸序列杂交(例如在严格杂交条件下)的核酸编码。
另外,本发明的抗体结合包含或由SEQ ID NO:3229氨基酸序列组成的多肽,所述多肽由ATCC登记号No.203518的质粒中包含的cDNA编码,或由与所述保藏克隆中包含的核苷酸序列杂交(例如在严格杂交条件下)的核酸编码。本发明抗体还结合SEQ ID NO:3229氨基酸序列的片段,所述多肽由ATCC登记号No.203518的质粒中包含的cDNA编码,或由与所述保藏克隆中包含的核苷酸序列杂交(例如在严格杂交条件下)的核酸编码。
另外,本发明抗体结合包含或由SEQ ID NO:3230-3237中包含的氨基酸序列组成的多肽或多肽片段。
在特异的实施方案中,本发明抗体免疫特异性结合多肽片段,所述片段包括包含或由SEQ ID NO:3228氨基酸序列组成的多肽,所述多肽由保藏的克隆中含有的cDNA编码,或由与保藏克隆中包含的核苷酸序列杂交(例如在严格杂交条件下)的核酸编码。蛋白质片段可以是“独立存在的”,或包含在较大的多肽内,所述较大多肽的片段形成一个部分或区域,最优选形成一个单一的连续区域。可与本发明抗体结合的多肽片段的代表性实例包括包含或由以下氨基酸残基组成的片段:SEQ ID NO:3228的1-50,51-100,101-150,151-200,201-250,和/或251-285氨基酸残基。另外,多肽片段的长度可以是至少10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,175或200个氨基酸。
在特异的实施方案中,本发明的抗体结合这样的多肽片段,其包含或由以下氨基酸残基组成:SEQ ID NO:3228的1-46,31-44,47-72,73-285,73-83,94-102,148-152,166-181,185-209,210-221,226-237,244-249,253-265,和/或277-285氨基酸残基。
本领域普通技术人员将意识到,定向于SEQ ID NO:3228的BLyS多肽区域的突变可以影响观测到的BLyS生物活性,所述区域涵盖了19个氨基酸残基插入体,这个插入体在SEQ ID NO:3229的BLyS多肽序列(即SEQ ID NO:3229的Val-142至Lys-160氨基酸残基)中未发现。更特异地,可以定向突变的BLyS多肽序列的部分非限制性及非独家的这种氨基酸残基包括以下SEQ ID NO:3228所示BLyS多肽序列的氨基酸残基:V-142;T-143;Q-144;D-145;C-146;L-147;Q-148;L-149;I-150;A-151;D-152;S-153;E-154;T-155;P-156;T-157;I-158;Q-159;和K-160。因此,在特异的实施方案中,本发明的抗体期望是结合SEQ ID NO:3228的V-142至K-160区域中有一或多个突变的BLyS多肽。
多肽片段可以是“独立存在的”或包含于较大多肽中,所述较大多肽的片段形成一个部分或区域,优选形成一个单一的连续区域。可以由本发明抗体结合的多肽片段的代表性实例例如包括包含或由以下氨基酸残基组成的片段:SEQ ID NO:3228所示氨基酸序列的1-15,16-30,31-46,47-55,56-72,73-104,105-163,163-188,186-210和210-284氨基酸。可以由本发明抗体结合的多肽片段的另外的代表性实例例如包括包含或由“大约”以下氨基酸残基组成的片段:SEQ IDNO:3229所示氨基酸序列的1-143,1-150,47-143,47-150,73-143,73-150,100-150,140-145,142-148,140-150,140-200,140-225,和140-266氨基酸。另外,可以由本发明抗体结合的多肽片段的长度可以是至少10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,175或200个氨基酸。在文中,“大约”是指在氨基或羧基端或这两端比所述范围可以多或少一些,几个,5,4,3,2或1个氨基酸残基。
另外一些优选的的实施方案涵盖了结合多肽片段的抗体,所述片段包含BLyS的推定的胞内结构域(例如SEQ ID NO:3228的1-46位氨基酸残基),BLyS的推定的跨膜结构域(例如SEQ ID NO:3228的47-72位氨基酸),BLyS的推定的胞外结构域(例如SEQ IDNO:3228的73-285位氨基酸),BLyS的成熟的可溶形式的胞外结构域(例如SEQ ID NO:3228的134-285位氨基酸残基),BLyS的推定的TNF保守结构域(例如SEQ ID NO:3228的191-284位氨基酸),和一种多肽,其包含或由融合于BLyS的推定的胞外结构域的推定的胞内结构域组成(SEQ ID NO:3228的1-46位氨基酸残基融合于73-285位氨基酸残基)。
另外一些优选的实施方案涵盖了结合多肽片段的抗体,所述片段包含BLyS的推定的胞内结构域(例如SEQ ID NO:3229的1-46位氨基酸残基),BLyS的推定的跨膜结构域(例如SEQ ID NO:3229的47-72位氨基酸),BLyS的推定的胞外结构域(例如SEQ IDNO:3229的73-266位氨基酸),BLyS的推定的TNF保守结构域(例如SEQ ID NO:3229的172-265位氨基酸),和一种多肽,其包含或由融合于BLyS的推定的胞外结构域的推定的胞内结构域组成(SEQ ID NO:3229的1-46位氨基酸残基融合于73-266位氨基酸残基)。
本发明的一些其它实施方案涵盖了结合多肽片段的抗体,所述多肽片段包含SEQ ID NO:3228和SEQ ID NO:3229所示BLyS多肽的推定的β片层折叠区。包含β片层折叠区的这些多肽片段包含SEQID NO:3228的以下氨基酸残基:Gln-144至Ala-151,Phe-172至Lys-173,Ala-177至Glu-179,Asn-183至Ile-185,Gly-191至Lys-204,His-210至Val-219,Leu-226至Pro-237,Asn-242至Ala-251,Gly-256至Ile-263和/或Val-276至Leu-284。在另一个非限制性实施方案中,包含BLyS的β片层折叠的这些多肽片段包含SEQ ID NO:3229的以下氨基酸残基:Phe-153至Lys-154,Ala-158至Glu-160,Asn-164至Ile-166,Gly-172至Lys-185,His-191至Val-200,Leu-207至Pro-218,Asn-223至Ala-232,Gly-237至Ile-244和/或Val-257至Leu-265。
可以由本发明抗体结合的一部分非限制性代表性的多肽包括包含本发明氨基酸序列组合的多肽,例如SEQ ID NO:3228的[Met-1至Lys-113]融合于[Leu-114至Thr-141]融合于[Val-142至Lys-160]融合于[Gly-161至Gln-198]融合于[Val-199至Ala-248]融合于[Gly-249至Leu-285];或者SEQ ID NO:3228的[Met-1至Lys-113]融合于[Val-142至Lys-160]融合于[Gly-161至Gln-198]融合于[Val-199至Ala-248]融合于[Gly-249至Leu-285];或者SEQ IDNO:3228的[Met-1至Lys-113]融合于[Leu-114至Thr-141]融合于[Val-142至Lys-160]融合于[Gly-161至Gln-198]融合于[Gly-249to Leu-285]。可以由本发明抗体结合的其它氨基酸序列组合可以包括不同于上述顺序的多肽片段(例如(SEQ ID NO:3228)的[Leu-114至Thr-141]融合于[Val-199至Ala-248]融合于[Gly-249至Leu-285]融合于[Val-142至Lys-160]。可以由本发明抗体结合的其它氨基酸序列组合还可以包括在此所述异源多肽片段和/或本发明其它多肽或多肽片段 (例如融合于一个FLAG标记的SEQ ID NO:3228的[Met-1至Lys-113]融合于[Leu-114 to Thr-141]融合于[Val-142至Lys-160]融合于[Gly-161至Gln-198]融合于[Gly-249至Leu-285];或者SEQID NO:3228的[Met-1至Lys-113]融合于SEQ ID NO:3228的[Leu-114至Thr-141]融合于SEQ ID NO:3229的[Glu-135至Asn-165]融合于SEQ ID NO:3228的[Val-142至Lys-160]融合于SEQ ID NO:3228的[Gly-161至Gln-198]融合于SEQ ID NO:3228的[Val-199至Ala-248]融合于SEQ ID NO:3228的[Gly-249至Leu-285])。
可以由本发明抗体结合的一部分非限制性代表性的多肽包括包含以下氨基酸序列组合的多肽:SEQ ID NO:3229的[Met-1至Lys-113]融合于[Leu-114至Thr-141]融合于[Gly-142至Gln-179]融合于[Val-180至Ala-229]融合于[Gly-230至Leu-266];或者SEQ IDNO:3229的[Met-1至Lys-113]融合于[Gly-142至Gln-179]融合于[Val-180至Ala-229]融合于[Gly-230至Leu-266];或者SEQ IDNO:3229的[Met-1至Lys-113]融合于[Leu-114至Thr-141]融合于[Gly-142至Gln-179]融合于[Gly-230至Leu-266]。可由本发明抗体结合的其它氨基酸序列组合包括与上述顺序不同的多肽片段(例如SEQ ID NO:3229的[Leu-114至Thr-141]融合于[Val-180至Ala-229]融合于[Gly-230至Leu-266]融合于[Gly-142至Gln-179])。可以由本发明抗体结合的其它氨基酸序列组合还可以包括在此所述的异源多肽片段和/或本发明其它多肽或多肽片段(例如SEQ ID NO:3229的[Met-1至Lys-113]融合于[Leu-114至Thr-141]融合于[Gly-142至Gln-179]融合于SEQ ID NO:3229的[Gly-230至Leu-266]融合于FLAG标记(SEQ ID NO:3238);或者SEQ ID NO:3229的[Met-1至Lys-113]融合于[Leu-114至Thr-141]融合于[Glu-135至Asn-165]融合于SEQ ID NO:3229的[Gly-142至Gin-179]融合于SEQ ID NO:3229的[Val-180至Ala-229]融合于SEQ ID NO:3229的[Gly-230 to Leu-266]。
本发明的其它实施方案涵盖了结合BLyS多肽片段的抗体,所述片段包含或由本发明多肽的功能区组成,如Garnier-Robsonα区,β区,转角区,和卷曲区,Chou-Fasmanα区,β区,转角区,和卷曲区,Kyte-Doolittle亲水区和疏水区,Eisenberg α和β两亲区,Karplus-Schulz柔性区,Emini表面形成区和高抗原指数的Jameson-Wolf区,如表9和10所示。在一个优选的实施方案中,本发明抗体结合的多肽片段是抗原性的(即含有连续四或多个抗原指数高于或等于1.5的氨基酸,这是使用Jameson-Wolf程序的默认参数确定的)完整(即全长)BLyS多肽(例如SEQ ID NO:3228和3229)。
代表SEQ ID NO:3228的BLyS多肽(表9)或SEQ ID NO:3229的BLyS多肽(表10)的结构或功能属性的数据,是使用DNA*STAR的各种模块和公式在默认参数下产生的。列I代表α螺旋区的Garnier-Robson分析结果;列II代表α螺旋区的Chou-Fasman分析结果;列III代表β片层区的Garnier Robson分析结果;列IV代表β片层区的Chou-Fasman分析结果;列V代表转角区的Garnier Robson分析结果;VI列代表转角区的Chou-Fasman分析结果;VII列代表卷曲区的Garnier Robson分析结果;列VIII代表Kyte-Doolittle亲水区;列IX代表Hopp-Woods疏水区;列X代表α两亲区的Eisenberg分析结果;列XI代表β两亲区的Eisenberg分析结果;列XII代表柔性区的Karplus-Schultz分析结果;列XIII代表Jameson-Wolf抗原指数记录;列XIV代表Emini表面概率区。
在一个优选的实施方案中,表9和10的列VIII,IX,XIII,和XIV所示数据,可以用于确定SEQ ID NO:3228的BLyS多肽(表9)或SEQ ID NO:3229的BLyS多肽(表10)的呈现高度抗原性潜力的区域。高抗原性区域是从列VIII,IX,XIII,和/或XIV所示数据中,通过选择代表多肽区域的数值确定的,所述多肽区域在一定环境中可能暴露于所述多肽表面,所述环境是在其中在免疫应答起始过程中可以发生抗原识别。
表9和10中所示的优选的区域包括但非限于通过分析SEQ IDNO:2所示氨基酸序列鉴别的上述类型区域。如表9和10所示,这种优选的区域包括Garnier-Robsono区,β区,转角区,和卷曲区,Chou-Fasmanα区,β区,转角区,Kyte-Doolittle亲水区,Eisenbergα和β两亲区,Karplus-Schulz柔性区,高抗原指数Jameson-Wolf区,和Emini表面形成区。优选地,本发明的抗体结合BLyS多肽或包含BLyS区域的BLyS多肽片段或变体,所述BLyS区域组合一些结构特点,如上述和表9和10所示的一些(例如1,2,3,或4)相同或不同的区域特点。
表9
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Met 1 A . . . . . . 0.73 -0.71 . . . 0.95 1.39
Asp 2 A . . . . T . 1.12 -0.66 * . . 1.15 1.56
Asp 3 A . . . . T . 1.62 -1.09 * . . 1.15 2.12
Ser 4 A . . . . T . 2.01 -1.51 . . . 1.15 4.19
Thr 5 A . . . . T . 2 40 -2.13 . . F 1.30 4.35
Glu 6 A A . . . . . 2.70 -1.73 * * F 0.90 4.51
Arg 7 A A . . . . . 2.81 -1.34 * * F 0.90 4.51
Glu 8 A A . . . . . 2.00 -1.73 * * F 0.90 6.12
Gln 9 A A . . . . . 1.99 -1.53 * * F 0.90 2.91
Ser 10 A . . B . . . 2.00 -1.04 * * F 0.90 2.15
Arg 11 A . . B . . . 1.33 -0.66 * * F 0.90 1.66
Leu 12 A . . B . . . 0.41 -0.09 * * F 0.45 0.51
Thr 13 A . . B . . . 0.46 0.20 * * F -0.15 0.32
Ser 14 A A . . . . . 0.50 -0.19 * * . 0.30 0.32
Cys 15 A A . . . . . 0.91 -0.19 * * . 0.30 0.78
Leu 16 A A . . . . . 0.80 -0.87 * * F 0.90 1.06
Lys 17 A A . . . . . 1.61 -1.36 . * F 0.90 1.37
Lys 18 A A . . . . . 1.32 -1.74 . * F 0.90 4.44
Arg 19 A A . . . . . 1.67 -1.70 . * F 0.90 5.33
Glu 20 A A . . . . . 1.52 -2.39 . * F 0.90 5.33
Glu 21 A A . . . . . 2.38 -1.70 . * F 0.90 2.20
Met 22 A A . . . . . 2.33 -1.70 . * F 0.90 2.24
Lys 23 A A . . . . . 1.62 -1.70 * * F 0.90 2.24
Leu 24 A A . . . . . 0.66 -1.13 * * F 0.75 0.69
Lys 25 A A . . . . . 0.36 -0.49 . * F 0.45 0.52
Glu 26 A A . B . . . -0.53 -0.71 * * . 0.60 0.35
Cys 27 A A . B . . . -0.74 -0.03 * * . 0.30 0.30
Val 28 A A . B . . . -1.00 -0.03 * * . 0.30 0.12
Ser 29 A A . B . . . -0.08 0.40 * * . -0.30 0.11
Ile 30 A . . B . . . -0.08 0.40 * * . -0.30 0.40
Leu 31 A . . B . . . -0.08 -0.17 * . . 0.45 1.08
Pro 32 . . . B . . C 0.29 -0.81 * . F 1.10 1.39
Arg 33 . . . . T . . 0.93 -0.81 . * F 1.50 2.66
Lys 34 . . . . T . . 0.93 -1.07 . . F 1.84 4.98
Glu 35 . . . . . . C 0.97 -1.37 * * F 1.98 4.32
Ser 36 . . . . . T C 1.89 -1.16 * * F 2.52 1.64
Pro 37 . . . . . T C 1.80 -1.16 * * F 2.86 1.60
Ser 38 . . . . T T . 1.39 -0.77 * . F 3.40 1.24
Val 39 A . . . . T . 1.39 -0.39 . * F 2.36 1.24
Arg 40 A . . . . . . 1.39 -0.77 * * F 2.46 1.60
Ser 41 A . . . . . . 1.34 -1.20 * * F 2.46 2.00
Ser 42 . . . . T T . 1.60 -1.16 . * F 3.06 2.67
Lys 43 . . . . T T . 1.09 -1.80 . * F 3.06 2.72
Asp 44 . . . . T T . 1.13 -1.11 * * F 3.40 1.67
Gly 45 A . . . . T . 0.43 -0.81 * * F 2.66 1.03
Lys 46 A A . . . . . 0.14 -0.70 . . F 1.77 0.52
Leu 47 A A . . . . . 0.13 -0.20 * . . 0.98 0.31
Leu 48 A A . . . . . -0.72 0.29 * . . 0.04 0.46
Ala 49 A A . . . . . -1.53 0.54 . * . -0.60 0.19
Ala 50 A A . . . . . -2.00 1.23 . . . -0.60 0.19
表9(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Thr 51 A A . . . . . -2.63 1.23 . . . -0.60 0.19
Leu 52 A A . . . . . -2.63 1.04 . . . -0.60 0.19
Leu 53 A A . . . . . -2.63 1.23 . . . -0.60 0.15
Leu 54 A A . . . . . -2.34 1.41 . . . -0.60 0.09
Ala 55 A A . . . . . -2.42 1.31 . . . -0.60 0.14
Leu 56 A A . . . . . -2.78 1.20 . . . -0.60 0.09
Leu 57 A . . . . T . -2.78 1.09 . . . -0.20 0.06
Ser 58 A . . . . T . -2.28 1.09 . . . -0.20 0.05
Cys 59 A . . . . T . -2.32 1.07 . . . -0.20 0.09
Cys 60 A . . . . T . -2.59 1.03 . . . -0.20 0.08
Leu 61 . . B B . . . -2.08 0.99 . . . -0.60 0.04
Thr 62 . . B B . . . -1.97 0.99 . . . -0.60 0.11
Val 63 . . B B . . . -1.91 1.20 . . . -0.60 0.17
Val 64 . . B B . . . -1.24 1.39 . . . -0.60 0.33
Ser 65 . . B B . . . -1.43 1.10 . . . -0.60 0.40
Phe 66 A . . B . . . -1.21 1.26 . . . -0.60 0.40
Tyr 67 A . . B . . . -1.49 1.11 . . . -0.60 0.54
Gln 68 A . . B . . . -1.44 0.97 . . . -0.60 0.41
Val 69 A . . B . . . -0.59 1.27 . . . -0.60 0.39
Ala 70 A . . B . . . -0.63 0.89 . . . -0.60 0.43
Ala 71 A . . B . . . 0.07 0.56 . * . -0.60 0.25
Leu 72 A . . . . T . -0.50 0.16 . * . 0.10 0.55
Gln 73 A . . . . T . -1.09 0.20 . . F 0.25 0.45
Gly 74 A . . . . T . -0.53 0.20 . . F 0.25 0.45
Asp 75 A . . . . T . -0.76 0.09 . * F 0.25 0.73
Leu 76 A A . . . . . -0.06 0.09 . * F -0.15 0.35
Ala 77 A A . . . . . 0.17 -0.31 . * . 0.30 0.69
Ser 78 A A . . . . . 0.17 -0.24 . * . 0.30 0.42
Leu 79 A A . . . . . -0.30 -0.24 . * . 0.30 0.88
Arg 80 A A . . . . . -0.30 -0.24 . * . 0.30 0.72
Ala 81 A A . . . . . 0.17 -0.34 . * . 0.30 0.93
Glu 82 A A . . . . . 0.72 -0.30 . * . 0.45 1.11
Leu 83 A A . . . . . 0.99 -0.49 . * . 0.30 0.77
Gln 84 A A . . . . . 1.21 0.01 . * . -0.15 1.04
Gly 85 A A . . . . . 1.10 0.01 * * . -0.30 0.61
His 86 A A . . . . . 1.73 0 01 * * . -0.15 1.27
His 87 A A . . . . . 0.92 -0.67 . * . 0.75 1.47
Ala 88 A A . . . . . 1.52 -0.39 . * . 0.45 1.22
Glu 89 A A . . . . . 0.93 -0.39 . . . 0.45 1.39
Lys 90 A A . . . . . 0.93 -0.39 * . F 0.60 1.03
Leu 91 A . . . . T . 0.38 -0.46 * . . 0.85 1.01
Pro 92 A . . . . T . 0.07 -0.46 . . . 0.70 0.59
Ala 93 A . . . . T . 0.07 -0.03 . . . 0.70 0.29
Gly 94 A . . . . T . -0.14 0.47 . . . -0.20 0.36
Ala 95 A . . . . . . -0.14 0.21 . * . -0.10 0.36
Gly 96 A . . . . . . 0.08 -0.21 . . F 0.65 0.71
Ala 97 A . . . . . . -0.06 -0.21 . . F 0.65 0.72
Pro 98 A . . . . . . -0.28 -0.21 . * F 0.65 0.71
Lys 99 A A . . . . . 0.07 -0.03 . . F 0.45 0.59
Ala 100 A A . . . . . 0.66 -0.46 . . F 0.60 1.01
表9(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Gly 101 A A . . . . . 0.41 -0.96 . . F 0.90 1.13
Leu 102 A A . . . . . 0.79 -0.89 . . F 0.75 0.57
Glu 103 A A . . . . . 0.41 -0.46 * . F 0.45 0.88
Glu 104 A A . . . . . -0.49 -0.46 * . F 0.45 0.89
Ala 105 A A . . . . . -0.21 -0.24 . . . 0.30 0.81
Pro 106 A A . . . . . -0.46 -0.44 . . . 0.30 0.67
Ala 107 A A . . . . . 0.01 0.06 . . . -0.30 0.39
Val 108 A A . . . . . -0.80 0.49 . * . -0.60 0.38
Thr 109 A A . . . . . -0.76 0.67 . * . -0.60 0.20
Ala 110 A A . . . . . -1.06 0.24 * * . -0.30 0.40
Gly 111 A A . . . . . -1.54 0.43 * * . -0.60 0.38
Leu 112 A A . . . . . -0.96 0.57 * * . -0.60 0.23
Lys 113 . A B . . . . -0.31 0.09 * * . -0.30 0.39
Ile 114 . A B . . . . -0.21 0.01 * . . -0.30 0.61
Phe 115 . A B . . . . -0.21 0.01 * . . 0.15 1.15
Glu 116 . A . . . . C -0.08 -0.17 * . F 1.25 0.58
Pro 117 . A . . . . C 0.39 0.26 * * F 1.10 1.28
Pro 118 . . . . . . C 0.34 -0.00 . . F 2.20 1.47
Ala 119 . . . . . T C 0.89 -0.79 . * F 3.00 1.47
Pro 120 . . . . . T C 1.59 -0.36 . * F 2.25 0.94
Gly 121 . . . . T T . 1.29 -0.39 . * F 2.15 0.98
Glu 122 . . . . T T . 1.20 -0.43 . . F 2.00 1.30
Gly 123 . . . . . . C 1.41 -0.54 . . F 1.60 1.12
Asn 124 . . . . . T C 2.00 -0.57 . . F 1.50 1.97
Ser 125 . . . . . T C 1.91 -0.60 . * F 1.50 1.82
Ser 126 . . . . . T C 2.37 -0.21 . * F 1.54 2.47
Gln 127 . . . . . T C 2.37 -0.64 . * F 2.18 3.01
Asn 128 . . . . . . C 2.76 -0.64 . . F 2.32 3.61
Ser 129 . . . . . T C 2.87 -1.03 . . F 2.86 5.39
Arg 130 . . . . T T . 2.58 -1.41 * . F 3.40 6.09
Asn 131 . . . . T T . 2.02 -1.31 * . F 3.06 3.83
Lys 132 . . . . T T . 2.02 -1.07 * . F 2.72 2.12
Arg 133 . . . . T . . 1.68 -1.06 * . F 2.18 1.88
Ala 134 . . . . . . C 1.77 -0.63 * . F 1.64 1.15
Val 135 . . . . . . C 1.66 -0.60 * . F 1.49 0.89
Gln 136 . . . . . . C 1.66 -0.60 * . F 1.83 0.79
GlV 137 . . . . . T C 1.30 -0.60 * . F 2.52 1.35
Pro 138 . . . . . T C 0.33 -0.61 * . F 2.86 2.63
Glu 139 . . . . T T . 0.61 -0.61 * . F 3.40 1.13
Glu 140 A . . . . T . 1.47 -0.53 * . F 2.66 1.64
Thr 141 A . . . . . . 1.47 -0.56 . . F 2.12 1.84
Val 142 A . . . . . . 1.14 -0.99 . . F 1.78 1.77
Thr 143 A . . . . T . 0.54 -0.41 . . F 1.19 0 55
Gln 144 A . . . . T . 0.54 0.27 * . F 0.25 0.31
Asp 145 A . . . . T . -0.27 0.19 * . F 0.25 0.73
Cys 146 A . . . . T . -0.84 0.23 * . . 0.10 0.42
Leu 147 A A . . . . . -0.58 0.43 * . . -0.60 0.17
Gln 148 A A . . . . . -0.27 0.53 * . . -0.60 0.10
Leu 149 A A . . . . . -0.57 0.53 * * . -0.30 0.32
Ile 150 A A . . . . . -0.57 0.34 * . . 0.30 0.52
表9(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Ala 151 . A . . . . C -0.21 -0.34 . * . 1.40 0.52
Asp 152 . . . . T T . 0.39 -0.26 . * F 2.45 0.91
Ser 153 . . . . . T C 0.08 -0.51 . . F 3.00 2.00
Glu 154 . . . . . T C -0.00 -0.71 . . F 2.70 2.86
Thr 155 . . . . . T C 0.89 -0.53 * . F 2.40 1.20
Pro 156 . . . B . . C 1.52 -0.13 * . F 1.56 1.55
Thr 157 . . . B T . . 1.18 -0.51 * . F 1.92 1.79
Ile 158 A . . B . . . 1.18 -0.09 . . F 1.08 1.23
Gln 159 . . . . T T . 0.93 -0.19 . . F 2.04 1.07
Lys 160 . . . . T T . 0.93 0.14 * . F 1.60 1.16
Gly 161 . . . . T T . 0.44 0.14 * . F 1.44 2.38
Ser 162 . . . . T T . -0.10 0.24 * . F 1.28 1.19
Tyr 163 . . . B T . . 0.58 0.49 * . . 0.12 0.44
Thr 164 . . B B . . . 0.29 0.91 * . . -0.44 0.69
Phe 165 . . B B . . . -0.57 1.40 * . . -0.60 0.54
Val 166 . . B B . . . -1.03 1.70 . . . -0.60 0.29
Pro 167 . . B B . . . -1.03 1.63 . . . -0.60 0.16
Trp 168 A . . B . . . -1.49 1.53 . * . -0.60 0.25
Leu 169 A . . B . . . -1.13 1.53 * . . -0.60 0.29
Leu 170 A . . B . . . -0.32 0.89 * . . -0.30 0.38
Ter 171 A . . . . . . 0.19 0.46 * . . 0.20 0.71
Phe 172 . . . . T . . 0.10 -0.03 * . . 1.80 0.85
Lys 173 . . . . T T . -0.20 -0.33 * . F 2.60 1.38
Arg 174 . . . . . T C -0.20 -0.51 . . F 3.00 1.04
Gly 175 . . . . . T C 0.61 -0.21 . . F 2.25 0.99
Ser 176 A . . . . T . 0.91 -1.00 * . F 2.05 0.86
Ala 177 A A . . . . . 1.66 -1.00 * . F 1.35 0.76
Leu 178 A A . . . . . 1.61 -1.00 . . F 1.20 1.54
Glu 179 A A . . . . . 1.50 -1.43 . . F 0.90 1.98
Glu 180 A A . . . . . 1.89 -1.41 * . F 0.90 3.16
Lys 181 A A . . . . . 1.30 -1.91 * . F 0.90 7.66
Glu 182 A A . . . . . 1.08 -1.91 . . F 0.90 3.10
Asn 183 A A . . . . . 1.03 -1.23 * * F 0.90 1.48
Lys 184 A A . . . . . 1.08 -0.59 * . F 0.75 0.55
Ile 185 A A . . . . . 1.08 -0.59 * * . 0.60 0.63
Leu 186 A A . . . . . 0.72 -0.59 * * . 0.60 0.68
Val 187 A A . . . . . 0.38 -0.50 . * . 0.30 0.49
Lys 188 A A . . . . . 0.13 -0.07 * * F 0.45 0.69
Glu 189 A . . . . T . -0.61 0.00 * * F 0.40 1.32
Thr 190 . . . . T T . -0.42 0.10 . * F 0.80 1.54
Gly 191 . . . . T T . -0.50 0.24 * . F 0.65 0.67
Tyr 192 . . . . T T . 0.11 0.93 * * . 0.20 0.27
Phe 193 . . B B . . . -0.28 1.69 . . . -0.60 0.29
Phe 194 . . B B . . . -0.28 1.63 . * . -0.60 0.29
Ile 195 . . B B . . . -0.82 1.60 . . . -0.60 0.32
Tyr 196 . . B B . . . -1.29 1.49 . . . -0.60 0.28
Gly 197 . . . B T . . -1.29 1.39 . . . -0.20 0.26
Gln 198 . . . B T . . -0.90 1.36 . . . -0.20 0.59
Val 199 . . . B . . C -0.20 1.16 . . . -0.40 0.54
Leu 200 . . . B . . C 0.73 0.40 . . . -0.10 0.92
表9(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Tyr 201 . . . . T T . 0.67 -0.03 . . . 1.25 1.06
Thr 202 . . . . T T . 0.77 0.06 . . F 0.80 2.06
Asp 203 . . . . T T . 0.18 0.17 . . F 0.80 3.91
Lys 204 A . . . . T . 0 43 -0.01 . . F 1.00 2.52
Thr 205 A A . . . . . 0.90 -0.16 . . F 0.60 1.73
Tyr 206 A A . . . . . 1.11 -0.21 . . . 0.45 1.03
Ala 207 A A . . . . . 0.61 0.29 . . . -0.30 0.70
Met 208 A A . . . . . -0.28 0.97 . . . -0.60 0.40
Gly 209 A A . B . . . -0.32 1.17 * . . -0.60 0.18
His 210 A A . B . . . 0.10 0.81 * . . -0.60 0.31
Leu 211 A A . B . . . 0.39 0.31 . . . -0.30 0.61
Ile 212 A A . B . . . 1.02 -0.30 . . . 0.45 1.22
Gln 213 A A . B . . . 0.77 -0.73 . * . 0.75 1.80
Arg 214 A A . B . . . 1.08 -0.59 . * F 0.90 1.62
Lys 215 A A . B . . . 0.26 -0.77 * * F 0.90 3.14
Lys 216 A A . B . . . 0.37 -0.81 . * F 0.90 1.35
Val 217 . A B B . . . 0.91 -0.43 * * . 0.30 0.60
His 218 . A B B . . . 0.91 -0.00 . * . 0.30 0.29
Val 219 . A B B . . . 0.80 -0.00 * * . 0.30 0.25
Phe 220 . . B B . . . -0.06 -0.00 * . . 0.30 0.57
Gly 221 A . . B . . . -0.40 0.04 . * . -0.30 0.35
Asp 222 A . . . . . . -0.36 -0.07 * . . 0.50 0.63
Glu 223 A . . . . . . -1.18 -0.03 * . . 0.50 0.60
Leu 224 A . . B . . . -0.63 -0.17 . . . 0.30 0.45
Ser 225 A . . B . . . -0.74 -0.11 . . . 0.30 0.39
Leu 226 A . . B . . . -1.10 0.57 . * . -0.60 0.18
Val 227 A . . B . . . -0.99 1.36 . * . -0.60 0.19
Thr 228 A . . B . . . -1.66 0.67 * * . -0.60 0.28
Leu 229 A . . B . . . -1.73 0.86 * . . -0.60 0.18
Phe 230 A . . B . . . -1.43 0.86 * . . -0.60 0.17
Arg 231 A . . B . . . -0.62 0.61 * . . -0.60 0.21
Cys 232 . . . B T . . -0.37 0.53 * . . -0.20 0.41
Ile 233 . . . B T . . -0.27 0.46 * . . -0.20 0.46
Gln 234 . . . B T . . 0.54 0.10 * . . 0.10 0.37
Asn 235 . . . B . . C 0.93 0.10 * . . 0.05 1.19
Met 236 . . . B . . C 0.01 0.01 * . F 0.20 2.44
Pro 237 . . . B . . C 0.47 0.01 * . F 0.44 1.16
Glu 238 . . . . T . . 1.36 0.04 * . F 1.08 1.12
Thr 239 . . . . . . C 1.36 0.04 * . F 1.12 1.82
Leu 240 . . . . . . C 1.06 -0.17 * . F 1.96 1.89
Pro 241 . . . . T . . 0.99 -0.21 . . F 2.40 1.46
Asn 242 . . . . T . . 0.96 0.36 . . F 1.41 0.54
Asn 243 . . . . T T . 0.66 0.63 . . F 1.22 1.03
Ser 244 . . . . T T . 0.38 0.33 . . F 1.13 0.89
Cys 245 . . . . T T . 0.84 0.40 . . . 0.74 0.56
Tyr 246 . . . . T T . 0.17 0 43 . . . 0.20 0.35
Ser 247 A . . . . . . -0.42 0.71 . . . -0.40 0.18
Ala 248 A A . . . . . -0.38 0.83 . . . -0.60 0.34
Gly 249 A A . . . . . -0.89 0.26 . . . -0.30 0.43
Ile 250 A A . . . . . -0.22 0.19 * . . -0.30 0.27
表9(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Ala 251 A A . . . . . 0.02 -0.20 * . . 0.30 0.46
Lys 252 A A . . . . . -0.02 -0.70 . . . 0.60 0.80
Leu 253 A A . . . . . 0.57 -0.70 . . F 0.90 1.13
Glu 254 A A . . . . . 0.91 -1.39 . . F 0.90 1.87
Glu 255 A A . . . . . 0.99 -1.89 . . F 0.90 1.62
Gly 256 A A . . . . . 1.58 -1.20 . * F 0.90 1.62
Asp 257 A A . . . . . 0.72 -1.49 . * F 0.90 1.62
Glu 258 A A . . . . . 0.94 -0.80 * * F 0.75 0.77
Leu 259 A A . . . . . 0.06 -0.30 * * . 0.30 0.79
Gln 260 A A . . . . . -0.16 -0.04 * . . 0.30 0.33
Leu 261 A A . . . . . 0.30 0.39 * . . -0.30 0.30
Ala 262 A A . . . . . 0.30 0.39 * . . -0.30 0.70
Ile 263 A A . . . . . 0.30 -0.30 . * . 0.30 0.70
Pro 264 A . . . . T . 0.52 -0.30 . * F 1.00 1.37
Arg 265 A . . . . T . 0.52 -0.49 . * F 1.00 1.37
Glu 266 A . . . . T . 0.44 -0.59 * * F 1.30 3.38
Asn 267 A . . . . T . 0.73 -0.59 * * F 1.30 1.53
Ala 268 A . . . . . . 0.81 -0.63 * * . 0.95 1.05
Gln 269 A . . . . . . 1.02 0.06 * * . -0.10 0.50
Ile 270 A . . . . . . 0.57 0.06 . * . 0.15 0.52
Ser 271 . . . . . . C 0.57 0.09 . * . 0.60 0.51
Leu 272 . . . . . . C -0.29 -0.41 . * F 1.60 0.49
Asp 273 . . . . T T . -0.01 -0.17 . * F 2.25 0.52
Gly 274 . . . . T T . -0.71 -0.37 . * F 2.50 0.56
Asp 275 . . . . T T . -0.52 0.03 . * F 1.65 0.59
Val 276 A . . . . T . -0.57 0.13 . * F 1.00 0.30
Thr 277 A . . B . . . -0.34 0.56 . * . -0.10 0.30
Phe 278 A . . B . . . -1.16 0.63 . * . -0.35 0.18
Phe 279 A . . B . . . -0.77 1.31 . * . -0.60 0.20
Gly 280 A A . . . . . -1.58 0.67 . * . -0.60 0.28
Ala 281 A A . . . . . -1.53 0.87 . * . -0.60 0.27
Leu 282 A A . . . . . -1.61 0.77 * . . -0.60 0.26
Lys 283 A A . . . . . -1.30 0.41 * . . -0.60 0.33
Leu 284 A A . . . . . -0.99 0.41 . . . -0.60 0.42
Leu 285 A A . . . . . -1.03 0.34 * . . -0.30 0.65
表10
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Met 1 A . . . . . . 0.73 -0.71 . . . 0.95 1.39
Asp 2 A . . . . T . 1.12 -0.66 * . . 1.15 1.56
Asp 3 A . . . . T . 1.62 -1.09 * . . 1.15 2.12
Ser 4 A . . . . T . 2.01 -1.51 . . . 1.15 4.19
Thr 5 A . . . . T . 2.40 -2.13 . . F 1.30 4.35
Glu 6 A A . . . . . 2.70 -1.73 * * F 0.90 4.51
Arg 7 A A . . . . . 2.81 -1.34 * * F 0.90 4.51
Glu 8 A A . . . . . 2.00 -1.73 * * F 0.90 6.12
Gln 9 A A . . . . . 1.99 -1.53 * * F 0.90 2.91
Ser 10 A . . B . . . 2.00 -1.04 * * F 0.90 2.15
Arg 11 A . . B . . . 1.33 -0.66 * * F 0.90 1.66
Leu 12 A . . B . . . 0.41 -0.09 * * F 0.45 0.51
Thr 13 A . . B . . . 0.46 0.20 * * F -0.15 0.32
Ser 14 A A . . . . . 0.50 -0.19 * * . 0.30 0.32
Cys 15 A A . . . . . 0.91 -0.19 * * . 0.30 0.78
Leu 16 A A . . . . . 0.80 -0.87 * * F 0.90 1.06
Lys 17 A A . . . . . 1.61 -1.36 . * F 0.90 1.37
Lys 18 A A . . . . . 1.32 -1.74 . * F 0.90 4.44
Arg 19 A A . . . . . 1.67 -1.70 . * F 0.90 5.33
Glu 20 A A . . . . . 1.52 -2.39 . * F 0.90 5.33
Glu 21 A A . . . . . 2.38 -1.70 . * F 0.90 2.20
Met 22 A A . . . . . 2.33 -1.70 . * F 0.90 2.24
LVs 23 A A . . . . . 1.62 -1.70 * * F 0.90 2.24
Leu 24 A A . . . . . 0.66 -1.13 * * F 0.75 0.69
Lys 25 A A . . . . . 0.36 -0.49 . * F 0.45 0.52
Glu 26 A A . B . . . -0.53 -0.71 * * . 0.60 0.35
Cys 27 A A . B . . . -0.74 -0.03 * * . 0.30 0.30
Val 28 A A . B . . . -1.00 -0.03 * * . 0.30 0.12
Ser 29 A A . B . . . -0.08 0.40 * * . -0.30 0.11
Ile 30 A . . B . . . -0.08 0.40 * * . -0.30 0.40
Leu 31 A . . B . . . -0.08 -0.17 * . . 0.45 1.08
Pro 32 . . . B . . C 0.29 -0.81 * . F 1.10 1.39
Arg 33 . . . . T . . 0.93 -0.81 . * F 1.50 2.66
Lys 34 . . . . T . . 0.93 -1.07 . . F 1.84 4.98
Glu 35 . . . . . . C 0.97 -1.37 * * F 1.98 4.32
Ser 36 . . . . . T C 1.89 -1.16 * * F 2.52 1.64
Pro 37 . . . . . T C 1.80 -1.16 * * F 2.86 1.60
Ser 38 . . . . T T . 1.39 -0.77 * . F 3.40 1.24
Val 39 A . . . . T . 1.39 -0.39 . * F 2.36 1.24
Arg 40 A . . . . . . 1.39 -0.77 * * F 2.46 1.60
Ser 41 A . . . . . . 1.34 -1.20 * * F 2.46 2.00
Ser 42 . . . . T T . 1.60 -1.16 . * F 3.06 2.67
Lys 43 . . . . T T . 1.09 -1.80 * * F 3.06 2.72
Asp 44 . . . . T T . 1.13 -1.11 * * F 3.40 1.67
Gly 45 A . . . . T . 0.43 -0.81 * * F 2.66 1.03
Lys 46 A A . . . . . 0.14 -0.70 . . F 1.77 0.52
Leu 47 A A . . . . . 0.13 -0.20 * . . 0.98 0.31
Leu 48 A A . . . . . -0.72 0.29 * . . 0.04 0.46
Ala 49 A A . . . . . -1.53 0.54 . * . -0.60 0.19
Ala 50 A A . . . . . -2.00 1.23 . . . -0.60 0.19
表10(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Thr 51 A A . . . . . -2.63 1.23 . . . -0.60 0.19
Leu 52 A A . . . . . -2.63 1.04 . . . -0.60 0.19
Leu 53 A A . . . . . -2.63 1.23 . . . -0.60 0.15
Leu 54 A A . . . . . -2.34 1.41 . . . -0.60 0.09
Ala 55 A A . . . . . -2.42 1.31 . . . -0.60 0.14
Leu 56 A A . . . . . -2.78 1.20 . . . -0.60 0.09
Leu 57 A . . . . T . -2.78 1.09 . . . -0.20 0.06
Ser 58 A . . . . T . -2.28 1.09 . . . -0.20 0.05
Cys 59 A . . . . T . -2.32 1.07 . . . -0.20 0.09
Cys 60 A . . . . T . -2.59 1.03 . . . -0.20 0.08
Leu 61 . . B B . . . -2.08 0.99 . . . -0.60 0.04
Thr 62 . . B B . . . -1.97 0.99 . . . -0.60 0.11
Val 63 . . B B . . . -1.91 1.20 . . . -0.60 0.17
Val 64 . . B B . . . -1.24 1.39 . . . -0.60 0.33
Ser 65 . . B B . . . -1.43 1.10 . . . -0.60 0.40
Phe 66 A . . B . . . -1.21 1.26 . . . -0.60 0.40
Tyr 67 A . . B . . . -1.49 1.11 . . . -0.60 0.54
Gln 68 A . . B . . . -1.44 0.97 . . . -0.60 0.41
Val 69 A . . B . . . -0.59 1.27 . . . -0.60 0.39
Ala 70 A . . B . . . -0.63 0.89 . . . -0.60 0.43
Ala 71 A . . B . . . 0.07 0.56 . * . -0.60 0.25
Leu 72 A . . . . T . -0.50 0.16 . . . 0.10 0.55
Gln 73 A . . . . T . -1.09 0.20 . . F 0.25 0.45
Gly 74 A . . . . T . -0.53 0.20 . . F 0.25 0.45
Asp 75 A . . . . T . -0.76 0.09 . * F 0.25 0.73
Leu 76 A A . . . . . -0.06 0.09 . * F -0.15 0.35
Ala 77 A A . . . . . 0.17 -0.31 . * . 0.30 0.69
Ser 78 A A . . . . . 0.17 -0.24 . * . 0.30 0.42
Leu 79 A A . . . . . -0.30 -0.24 . * . 0.30 0.88
Arg 80 A A . . . . . -0.30 -0.24 . * . 0.30 0.72
Ala 81 A A . . . . . 0.17 -0.34 . * . 0.30 0.93
Glu 82 A A . . . . . 0.72 -0.30 . * . 0.45 1.11
Leu 83 A A . . . . . 0.99 -0.49 . * . 0.30 0.77
Gln 84 A A . . . . . 1.21 0.01 . * . -0.15 1.04
Gly 85 A A . . . . . 1.10 0.01 * * . -0.30 0.61
His 86 A A . . . . . 1.73 0.01 * * . -0.15 1.27
His 87 A A . . . . . 0.92 -0.67 . * . 0.75 1.47
Ala 88 A A . . . . . 1.52 -0.39 . * . 0.45 1.22
Glu 89 A A . . . . . 0.93 -0.39 . . . 0.45 1.39
Lys 90 A A . . . . . 0.93 -0.39 * . F 0.60 1.03
Leu 91 A . . . . T . 0.38 -0.46 * . . 0.85 1.01
Pro 92 A . . . . T . 0.07 -0.46 . . . 0.70 0.59
Ala 93 A . . . . T . 0.07 -0.03 . . . 0.70 0.29
Gly 94 A . . . . T . -0.14 0.47 . . . -0.20 0.36
Ala 95 A . . . . . . -0.14 0.21 . * . -0.10 0.36
Gly 96 A . . . . . . 0.08 -0.21 . . F 0.65 0.71
Ala 97 A . . . . . . -0.06 -0.21 . . F 0.65 0.72
Pro 98 A . . . . . . -0.28 -0.21 . * F 0.65 0.71
Lys 99 A A . . . . . 0.07 -0.03 . . F 0.45 0.59
Ala 100 A A . . . . . 0.66 -0.46 . . F 0.60 1.01
表10(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Gly 101 A A . . . . . 0.41 -0.96 . . F 0.90 1.13
Leu 102 A A . . . . . 0.79 -0.89 . . F 0.75 0.57
Glu 103 A A . . . . . 0.41 -0.46 * . F 0.45 0.88
Glu 104 A A . . . . . -0.49 -0.46 * . F 0.45 0.89
Ala 105 A A . . . . . -0.21 -0.24 . . . 0.30 0.81
Pro 106 A A . . . . . -0.46 -0.44 . . . 0.30 0.67
Ala 107 A A . . . . . 0.01 0.06 . . . -0.30 0.39
Val 108 A A . . . . . -0.80 0.49 * * . -0.60 0.38
Thr 109 A A . . . . . -0.76 0.67 . * . -0.60 0.20
Ala 110 A A . . . . . -1.06 0.24 * * . -0.30 0.40
Gly 111 A A . . . . . -1.54 0.43 * * . -0.60 0.38
Leu 112 A A . . . . . -0.96 0.57 * * . -0.60 0.23
Lys 113 . A B . . . . -0.31 0.09 * * . -0.30 0.39
Ile 114 . A B . . . . -0.21 0.01 * . . -0.30 0.61
Phe 115 . A B . . . . -0.21 0.01 * . . 0.15 1.15
Glu 116 . A . . . . C -0.08 -0.17 * . F 1.25 0.58
Pro 117 . A . . . . C 0.39 0.26 * * F 1.10 1.28
Pro 118 . . . . . . C 0.34 0.00 * . F 2.20 1.47
Ala 119 . . . . . T C 0.89 -0.79 . * F 3.00 1.47
Pro 120 . . . . . T C 1.59 -0.36 . * F 2.25 0.94
Gly 121 . . . . T T . 1.29 -0.39 . * F 2.15 0.98
Glu 122 . . . . T T . 1.20 -0.43 . . F 2.00 1.30
Gly 123 . . . . . . C 1.41 -0.54 . . F 1.60 1.12
Asn 124 . . . . . T C 2.00 -0.57 . . F 1.50 1.97
Ser 125 . . . . . T C 1.91 -0.60 . * F 1.50 1.82
Ser 126 . . . . . T C 2.37 -0.21 . * F 1.54 2.47
Gln 127 . . . . . T C 2.37 -0.64 . * F 2.18 3.01
Asn 128 . . . . . . C 2.76 -0.64 . . F 2.32 3.61
Ser 129 . . . . . T C 2.87 -1.03 . . F 2.86 5.39
Arg 130 . . . . T T . 2.58 -1.41 * . F 3.40 6.09
Asn 131 . . . . T T . 2.02 -1.31 * . F 3.06 3.83
Lys 132 . . . . T T . 2.02 -1.07 * . F 2.72 2.12
Arg 133 . . . . T . . 1.68 -1.06 * . F 2.18 1.88
Ala 134 . . . . . . C 1.77 -0.63 * . F 1.64 1.15
Val 135 . . . . . . C 1.66 -0.60 * . F 1.15 0.89
Gln 136 . . . . . . C 1.66 -0.60 * . F 1.49 0.79
Gly 137 . . . . . T C 1.30 -0.60 * . F 2.18 1.35
Pro 138 . . . . . T C 0.84 -0.61 * . F 2.52 2.63
Glu 139 . . . . . T C 1.13 -0.83 * . F 2.86 1.50
Glu 140 . . . . T T . 1.74 -0.84 . . F 3.40 2.03
Thr 141 . . . . T . . 1.43 -0.51 . . F 2.86 2.06
Gly 142 . . . . T T . 1.08 -0 46 . . F 2.42 1.72
Ser 143 . . . . T T . 0.43 0.33 . . F 1.33 0.86
Tyr 144 . . . . T T . 0.22 0.97 . . . 0.54 0.44
Thr 145 . . . . T T . -0.07 0.91 . . . 0.20 0.69
Phe 146 . . B B . . . -0.57 1.40 . . . -0.60 0.54
Val 147 . . B B . . . -1.03 1.70 . . . -0.60 0.29
Pro 148 . . B B . . . -1.03 1.63 . . . -0.60 0.16
Trp 149 A . . B . . . -1.49 1.53 . * . -0.60 0.25
Leu 150 A . . B . . . -1.13 1.53 * . . -0.60 0.29
表10(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Leu 151 A . . B . . . -0.32 0.89 * . . -0.30 0.38
Ser 152 A . . . . . . 0.19 0.46 * . . 0.20 0.71
Phe 153 . . . . T . . 0.10 -0.03 * . . 1.80 0.85
Lys 154 . . . . T T . -0.20 -0.33 * . F 2.60 1.38
Arg 155 . . . . . T C -0.20 -0.51 . . F 3.00 1.04
Gly 156 . . . . . T C 0.61 -0.21 . . F 2.25 0.99
Ser 157 A . . . . T . 0.91 -1.00 * . F 2.05 0.86
Ala 158 A A . . . . . 1.66 -1.00 * . F 1.35 0.76
Leu 159 A A . . . . . 1.61 -1.00 . . F 1.20 1.54
Glu 160 A A . . . . . 1.50 -1.43 . . F 0.90 1.98
Glu 161 A A . . . . . 1.89 -1.41 * . F 0.90 3.16
Lys 162 A A . . . . . 1.30 -1.91 * . F 0.90 7.66
Glu 163 A A . . . . . 1.08 -1.91 . . F 0.90 3.10
Asn 164 A A . . . . . 1.03 -1.23 * * F 0.90 1.48
Lys 165 A A . . . . . 1.08 -0.59 * . F 0.75 0.55
Ile 166 A A . . . . . 1.08 -0.59 * * . 0.60 0.63
Leu 167 A A . . . . . 0.72 -0.59 * * . 0.76 0.68
Val 168 A A . . . . . 0.38 -0.50 . * . 0.92 0.49
Lys 169 A A . . . . . 0.13 -0.07 * * F 0.93 0.69
Glu 170 A . . . . T . -0.61 0.00 * * F 1.64 1.32
Thr 171 . . . . T T . -0 42 0.10 . * F 1.60 1.54
Gly 172 . . . . T T . -0.50 0.24 * . F 1.29 0.67
Tyr 173 . . . . T T . 0.11 0.93 * * . 0.68 0.27
Phe 174 . . B B . . . -0.28 1.69 . . . -0.28 0.29
Phe 175 . . B B . . . -0.28 1.63 . * . -0.44 0.29
Ile 176 . . B B . . . -0.82 1.60 . . . -0.60 0.32
Tyr 177 . . B B . . . -1.29 1.49 . . . -0.60 0.28
Gly 178 . . . B T . . -1.29 1.39 . . . -0.20 0.26
Gln 179 . . . B T . . -0.90 1.36 . . . -0.20 0.59
Val 180 . . . B . . C -0.20 1.16 . . . -0.40 0.54
Leu 181 . . . B . . C 0.73 0.40 . . . -0.10 0.92
Tyr 182 . . . . T T . 0.67 -0.03 . . . 1.25 1.06
Thr 183 . . . . T T . 0.77 0.06 . . F 0.80 2.06
Asp 184 . . . . T T . 0.18 0.17 . . F 0.80 3.91
Lys 185 A . . . . T . 0.43 -0.01 . . F 1.00 2.52
Thr 186 A A . . . . . 0.90 -0.16 . . F 0.60 1.73
Tyr 187 A A . . . . . 1.11 -0.21 . . . 0.45 1.03
Ala 188 A A . . . . . 0.61 0.29 . . . -0.30 0.70
Met 189 A A . . . . . -0.28 0.97 . . . -0.60 0.40
Gly 190 A A . B . . . -0.32 1.17 * . . -0.60 0.18
His 191 A A . B . . . 0.10 0.81 * . . -0.60 0.31
Leu 192 A A . B . . . 0.39 0.31 . . . -0.30 0.61
Ile 193 A A . B . . . 1.02 -0.30 . . . 0.45 1.22
Gln 194 A A . B . . . 0.77 -0.73 . * . 0.75 1.80
Arg 195 A A . B . . . 1.08 -0.59 * * F 0.90 1.62
Lys 196 A A . B . . . 0.26 -0.77 * * F 0.90 3.14
Lys 197 A A . B . . . 0.37 -0.81 . * F 0.90 1.35
Val 198 . A B B . . . 0.91 -0.43 * * . 0.30 0.60
His 199 . A B B . . . 0.91 0.00 * * . 0.30 0.29
Val 200 . A B B . . . 0.80 0.00 * * . 0.30 0.25
表10(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Phe 201 . . B B . . . -0.06 0.00 * . . 0.30 0.57
Gly 202 A . . B . . . -0.40 0.04 . * . -0.30 0.35
Asp 203 A . . . . . . -0.36 -0.07 * . . 0.50 0.63
Glu 204 A . . . . . . -1.18 -0.03 * . . 0.50 0.60
Leu 205 A . . B . . . -0.63 -0.17 . . . 0.30 0.45
Ser 206 A . . B . . . -0.74 -0.11 . . . 0.30 0.39
Leu 207 A . . B . . . -1.10 0.57 . * . -0.60 0.18
Val 208 A . . B . . . -0.99 1.36 . * . -0.60 0.19
Thr 209 A . . B . . . -1.66 0.67 * * . -0.60 0.28
Leu 210 A . . B . . . -1.73 0.86 * . . -0.60 0.18
Phe 211 A . . B . . . -1.43 0.86 * . . -0.60 0.17
Arg 212 A . . B . . . -0.62 0.61 * . . -0.60 0.21
Cys 213 . . . B T . . -0.37 0.53 * . . -0.20 0.41
Ile 214 . . . B T . . -0.27 0.46 * . . -0.20 0.46
Gln 215 . . . B T . . 0.54 0.10 * . . 0.10 0.37
Asn 216 . . . B . . C 0.93 0.10 * . . 0.05 1.19
Met 217 . . . B . . C 0.01 0.01 * . F 0.20 2.44
Pro 218 . . . B . . C 0.47 0.01 * . F 0.44 1.16
Glu 219 . . . . T . . 1.36 0.04 * . F 1.08 1.12
Thr 220 . . . . . . C 1.36 0.04 * . F 1.12 1.82
Leu 221 . . . . . . C 1.06 -0.17 * . F 1.96 1.89
Pro 222 . . . . T . . 0.99 -0.21 . . F 2.40 1.46
Asn 223 . . . . T . . 0.96 0.36 . . F 1.41 0.54
Asn 224 . . . . T T . 0.66 0.63 . . F 1.22 1.03
Ser 225 . . . . T T . 0.38 0.33 . . F 1.13 0.89
Cys 226 . . . . T T . 0.84 0.40 . . . 0.74 0.56
Tyr 227 . . . . T T . 0.17 0.43 . . . 0.20 0.35
Ser 228 A . . . . . . -0.42 0.71 . . . -0.40 0.18
Ala 229 A A . . . . . -0.38 0.83 . . . -0.60 0.34
Gly 230 A A . . . . . -0.89 0.26 . . . -0.30 0.43
Ile 231 A A . . . . . -0.22 0.19 * . . -0.30 0.27
Ala 232 A A . . . . . 0.02 -0.20 * . . 0.30 0.46
Lys 233 A A . . . . . -0.02 -0.70 . . . 0.60 0.80
Leu 234 A A . . . . . 0.57 -0.70 . . F 0.90 1.13
Glu 235 A A . . . . . 0.91 -1.39 . . F 0.90 1.87
Glu 236 A A . . . . . 0.99 -1.89 . . F 0.90 1.62
Gly 237 A A . . . . . 1.58 -1.20 . * F 0.90 1.62
Asp 238 A A . . . . . 0.72 -1.49 . * F 0.90 1.62
Glu 239 A A . . . . . 0.94 -0.80 * * F 0.75 0.77
Leu 240 A A . . . . . 0.06 -0.30 * * . 0.30 0.79
Gln 241 A A . . . . . -0.16 -0.04 * . . 0.30 0.33
Leu 242 A A . . . . . 0.30 0.39 * . . -0.30 0.30
Ala 243 A A . . . . . 0.30 0.39 * . . -0.30 0.70
Ile 244 A A . . . . . 0.30 -0.30 . * . 0.30 0.70
Pro 245 A . . . . T . 0.52 -0.30 . * F 1.00 1.37
Arg 246 A . . . . T . 0.52 -0.49 . * F 1.00 1.37
Glu 247 A . . . . T . 0.44 -0.59 * * F 1.30 3.38
Asn 248 A . . . . T . 0.73 -0.59 * * F 1.30 1.53
Ala 249 A . . . . . . 0.81 -0.63 * * . 0.95 1.05
Gln 250 A . . . . . . 1.02 0.06 * * . -0.10 0.50
表10(续)
残基 位置 I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
Ile 251 A . . . . . . 0.57 0.06 * * . 0.15 0.52
Ser 252 . . . . . . C 0.57 0.09 . * . 0.60 0.51
Leu 253 . . . . . . C -0.29 -0.41 . * F 1.60 0.49
Asp 254 . . . . T T . -0.01 -0.17 . * F 2.25 0.52
Gly 255 . . . . T T . -0.71 -0.37 . * F 2.50 0.56
Asp 256 . . . . T T . -0.52 0.03 . * F 1.65 0.59
Val 257 A . . . . T . -0.57 0.13 . * F 1.00 0.30
Thr 258 A . . B . . . -0.34 0.56 . * . -0.10 0.30
Phe 259 A . . B . . . -1.16 0.63 . * . -0.35 0.18
Phe 260 A . . B . . . -0.77 1.31 . * . -0.60 0.20
Gly 261 A A . . . . . -1.58 0.67 . * . -0.60 0.28
Ala 262 A A . . . . . -1.53 0.87 . * . -0.60 0.27
Leu 263 A A . . . . . -1.61 0.77 * . . -0.60 0.26
Lys 264 A A . . . . . -1.30 0.41 * . . -0.60 0.33
Leu 265 A A . . . . . -0.99 0.41 . . . -0.60 0.42
Leu 266 A A . . . . . -1.03 0.34 * . . -0.30 0.65
在另一个实施方案中,本发明提供了结合一种多肽的抗体,所述多肽包含或由本发明多肽的一个携带表位的部分组成。这个多肽部分的表位可以是本发明本发明多肽的免疫原性或抗原性表位。“免疫原性表位”是指当整个蛋白质是免疫原时激发抗体应答的蛋白质一部分。另一方面,抗体可以结合的蛋白质分子的一个区域称为“抗原性表位”。蛋白质的免疫原性表位数目通常少于抗原性表位数目。见例如Geysen等(美国科学院院报81:3998-4002(1983))所述。
为选择携带抗原性表位的多肽(即含有抗体可以结合的蛋白质分子的一个区域),本领域熟知模拟蛋白质序列一部分的相对短的合成肽能激发与被部分模拟的蛋白质反应的抗血清。见例如Sutcliffe,J.G.,Shinnick,T.M.,Green,N.and Learner,R.A.(1983),“与蛋白质上预定位点反应的抗体”(科学219:660-666)所述。能激发蛋白质抗血清的肽通常在蛋白质的初级序列中表现,可以通过一系列简便的化学规则定性,并且确认为即不是完整蛋白质的免疫显性区域(即免疫原性表位),也不是氨基或羧基端。本发明携带抗原性表位的肽和多肽因此用于产生特异性结合本发明多肽的抗体,包括单克隆抗体。见例如Wilson等(细胞37:767-778(1984)在p777)所述。
在特异的实施方案中,本发明的抗体结合携带抗原性表位的BLyS肽和多肽,及优选含有BLyS多肽的氨基酸序列内包含的至少4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,20,25,30,40,50,及最优选大约15-30个氨基酸的一个序列。包含免疫原性或抗原性表位的优选多肽的长度为至少10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,或100个氨基酸残基。另外非排他的优选的抗原性表位包括本文所揭示的抗原性表位,以及其一部分。
可以用于产生BLyS特异性抗体及可以由本发明抗体结合的抗原性多肽或肽的非限制性实例包括:包含SEQ ID NO:3228的大约Phe-115至Leu-147氨基酸残基的多肽;包含SEQ ID NO:3228的大约Ile-150至Tyr-163氨基酸残基的多肽;包含SEQ ID NO:3228的大约Ser-171至Phe-194氨基酸残基的多肽;包含SEQ ID NO:3228的大约Glu-223至Tyr-246氨基酸的多肽;包含图1A和1B(SEQ IDNO:3228)的大约Ser-271至Phe-278氨基酸残基的多肽。文中“大约”是指在氨基端或羧基端或这两端比所述范围多或少一些,几个,5,4,3,2或1个氨基酸残基。这些肽片段已经确定携带BLyS多肽的抗原性表位,这是通过Jameson-Wolf抗原指数分析确定的,如上表9所示。
可以用于产生BLyS特异性抗体及可以由本发明抗体结合的抗原性多肽或肽的非限制性实例包括:包含SEQ ID NO:3229的大约Pro-32至Leu-47氨基酸残基的多肽;包含SEQ ID NO:3229的大约Glu-116至Ser-143氨基酸残基的多肽;包含SEQ ID NO:3229的大约Phe-153至Tyr-173氨基酸的多肽;包含SEQ ID NO:3229的大约Pro-218至Tyr-227氨基酸的多肽;包含SEQ ID NO:3229的大约Ala-232至Gln-241氨基酸的多肽;包含SEQ ID NO:3229的大约Ile-244至Ala-249氨基酸的多肽;及包含SEQ ID NO:3229的大约Ser-252至Val-257氨基酸的多肽。在文中“大约”是指在氨基端或羧基端或这两端比所述范围多或少一些,几个,5,4,3,2或1个氨基酸残基。这些多肽片段已经确定携带BLyS多肽的抗原性表位,这是通过Jameson-Wolf抗原指数分析确定的,如表10所示通过DNA*STAR计算机程序的Protean部分产生(如前所述)。
BLyS携带表位肽和多肽可以通过任何常规方法生产。见例如Houghten,R.A.(1985),快速固相合成大量肽的一般方法:在各别氨基酸水平抗原—抗体相互作用的特异性(美国科学院院报82:5131-5135);这种“同时多重肽合成(SMPS)”方法还见于Houghten等(1986)的美国专利No.4,631,211所述。
本发明涵盖了结合多肽的抗体,所述多肽包含具有SEQ IDNO:3228氨基酸序列的多肽的表位,或由ATCC中保藏号为No.97768的多核苷酸序列编码的多肽序列表位,或由与ATCC中保藏号为No.97768包含的cDNA序列杂交(例如在所述杂交条件下)的多核苷酸编码的多核苷酸序列的表位。
本发明还涵盖了结合多肽的抗体,所述多肽包含具有SEQ IDNO:3229氨基酸序列的多肽的表位,或由ATCC中保藏号为No.203518的多核苷酸序列编码的多肽序列表位,或由与ATCC中保藏号为No.203518包含的cDNA序列杂交(例如在所述杂交条件下)的多核苷酸编码的多核苷酸序列的表位。
术语“表位”是指在动物体内,优选在哺乳动物,最优选在人体内具有抗原性或免疫原性活性的多肽的一部分。在一个优选的实施方案中,本发明涵盖了结合包含一个表位的多肽的抗体。“免疫原性表位”是指在动物体内激发抗体应答的蛋白质的一部分,这是通过本领域任何已知的方法确定的,例如通过上述产生抗体的方法确定(见例如Geysen等,美国科学院院81:3998-4002(1983))所述。术语“抗原性表位”是指抗体可以免疫特异性结合其抗原的蛋白质一部分,这是通过本领域熟知的方法确定的,例如通过所述免疫测定方法。免疫特异性结合不包括非特异性结合,但非必需不包括与其它抗原交叉反应。抗原性表位非必需是免疫原性的。
作为表位的BLyS多肽片段可以通过任何常规方法产生。(见例如Houghten,美国科学院院报82:5131-5135(1985)所述,另外见于美国专利No.4,631,211所述)。
在本发明中,本发明的抗体结合抗原性表位,所述表位优选含有至少4,5,6,7个氨基酸,更优选至少8,9,10,11,12,13,14,15,20,25,30,40,50个氨基酸,最优选15-30个氨基酸的一个序列。可以由本发明抗体结合的包含免疫原性或抗原性表位的优选多肽的长度为至少10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,或100个氨基酸残基。其它非排他的优选抗原性表位包括在此揭示的抗原性表位,以及其部分。抗原性表位例如用于产生特异性结合所述表位的抗体,包括单克隆抗体。优选的抗原性表位包括在此揭示的抗原性表位,以及2,3,4,5或多个这些抗原性表位的任意组合。抗原性表位在免疫测定中可以用作靶分子。(见例如Wilson等,细胞37:767-778(1984);Sutcliffe等,科学219:660-666(1983)所述)。
相似地,免疫原性表位例如可以根据本领域熟知的方法用于诱导抗体(见例如Sutcliffe等,如前;Wilson等,如前;Chow等,美国科学院院报82:910-914;和Bittle等,普通病毒学杂志66:2347-2354(1985)。优选的免疫原性表位包括在此所揭示的免疫原性表位,以及2,3,4,5或多个这些免疫原性表位的任意组合。可以将包含一或多个BLyS免疫原性表位的多肽与载体蛋白如白蛋白一起呈递于动物系(如兔或小鼠),以激发抗体应答,或者,如果所述多肽是足够长的(至少大约25个氨基酸),可以将所述多肽不用载体而呈递。然而,包含少如8-10个氨基酸的免疫原性表位已经示出足以产生能至少与变性的多肽中的线性表位结合的抗体(例如在Western印迹中)。
携带表位的BLyS多肽可以用于诱导抗体,根据本领域熟知的方法包括但非限于体内免疫,体外免疫和噬菌体展示方法。见例如Sutcliffe等,如前;Wilson等,如前,及Bittle等(普通病毒学杂志66:2347-2354(1985))所述。如果使用体内免疫,可以将动物用游离肽免疫接种;然而,抗肽抗体效价可以通过将所述肽偶联于大分子载体而加强,所述载体如是匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)或破伤风类毒素。例如,含有半胱氨酸残基的肽可以使用一个接头如马来酰亚氨基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)偶联于载体,而其它肽可以使用更一般的连接剂如戊二醛偶联于载体。将动物如兔,大鼠和小鼠用游离的或偶联载体的肽免疫接种,例如通过腹膜内和/或皮内注射含有大约100ug的肽或载体蛋白和Freund’s佐剂或任何其它已知刺激免疫应答的佐剂的乳状液进行接种。可以需要一些加强注射,例如间隔大约两周,以提供可以检测的抗肽抗体的有效效价,例如使用吸附于固体表面的游离肽通过ELISA分析检测。来自免疫动物血清中的抗肽抗体的效价可以通过选择抗肽抗体而提高,例如根据本领域熟知的方法通过将所述肽吸附于固体支持物,并洗脱选择的抗体进行。
本领域技术人员将意识到并如上所述,本发明抗体可以结合这样的多肽,所述多肽包含融合于其它多肽序列的免疫原性或抗原性表位。例如,BLyS多肽可以与免疫球蛋白(IgA,IgE,IgG,IgM)的恒定区或其一部分(CH1,CH2,CH3或其任意组合及其一部分)融合,或与白蛋白(包括但非限于重组的人白蛋白或其片段或变体)融合(见例如1999年3月2日提请的美国专利No.5,876,969,欧洲专利No.0413 622,和1998年6月16日提请的美国专利No.5,766,883所述,在此将其全文并入参考),产生嵌合多肽。这种融合蛋白可以易于纯化并可以提高在体内的半衰期。已经示出嵌合蛋白由人CD4-多肽的前两个结构域和哺乳动物免疫球蛋白的重链或轻链的恒定区的各种结构域组成。见例如欧洲专利EP 394,827;Traunecker等,(自然331:84-86(1988))所述。在抗原(例如胰岛素)缀合于一个FcRn结合配体如IgG或Fc片段后,抗原穿经上皮屏障输送至免疫系统的能力提高(见例如PCT出版物WO 96/22024和WO 99/04813所述)。依靠IgG部分二硫键而具有二硫键连二聚体结构的IgG融合蛋白,已经发现比单体多肽或其片段更有效结合和中和其它分子。见例如Fountoulakis等(生物化学杂志270:3958-3964(1995))。编码上述表位的核酸还可以与作为表位标记(例如血凝素(HA)标记或flag标记)的相应基因进行重组,以助于检测和纯化表达的多肽。例如,Janknecht等所述的系统可以易于纯化在人体细胞系中表达的未变性的融合蛋白(Janknecht等,1991,美国科学院院报88:8972-897)。在整个系统中,将相应的基因亚克隆入一个牛痘重组质粒中,这样所述基因的开放读框经翻译后融合于由6个组氨酸组成的氨基端标记。所述标记作为融合蛋白的基质结合结构域。将来自用重组痘苗病毒感染的细胞的提取物加样于
氮川乙酸-琼脂糖层析柱上,并用含有咪唑的缓冲液选择性洗脱组氨酸标记的蛋白质。
在另一个实施方案中,本发明的抗体结合与异源抗原(例如多肽,碳水化合物,磷脂或核酸)融合的BLyS多肽和/或其携带表位的片段。在特异的实施方案中,所述异源抗原是一种免疫原。
在一个更特异的实施方案中,所述异源抗原是HIV的gp120蛋白或其片段。
在另一个实施方案中,本发明的抗体结合与另一种TNF配体家族成员的多肽序列(或其生物活性片段或变体)融合的BLyS多肽和/或其携带表位的片段。在一个特异的实施方案中,本发明的抗体结合的本发明的BLyS多肽是与CD40L多肽序列融合的。在一个优选的实施方案中,所述CD40L多肽序列是可溶的。
在另一个实施方案中,本发明的抗体结合突变的BLyS多肽,其已经通过在重组之前随机诱变编码BLyS多肽的多核苷酸产生,通过易错PCR,随机插入核苷酸或其它方法进行。在另一个实施方案中,本发明的抗体结合用一或多个异源分子的一或多种成分,基序,节段,部分,结构域,片段等重组的BLyS的一或多种成分,基序,节段,部分,结构域,片段等。在优选的实施方案中,所述异源分子例如是TNF-α,淋巴毒素-α(LT-α,也称为TNF-β),LT-β(见于复合异源三聚体LT-α2-β中),OPGL,FasL,CD27L,CD30L,CD40L,4-1BBL,DcR3,OX40L,TNF-γ(国际出版物No.WO 96/14328),AIM-I(国际出版物No.WO 97/33899),AIM-II(国际出版物No.WO97/34911),APRIL(实验医学杂志188(6):1185-1190),内因子-α(国际出版物No.WO 98/07880),OPG,OX40,和神经生长因子(NGF),及可溶形式的Fas,CD30,CD27,CD40和4-IBB,TR2(国际出版物No.WO96/34095),DR3(国际出版物No.WO 97/33904),DR4(国际出版物No.WO 98/32856),TR5(国际出版物No.WO 98/30693),TR6(国际出版物No.WO 98/30694),TR7(国际出版物No.WO 98/41629),TRANK,TR9(国际出版物No.WO 98/56892),TR10(国际出版物No.WO98/54202),312C2(国际出版物No.WO 98/06842),TR12,CAD,和v-FLIP。在另外的实施方案中,所述异源分子是TNF家族的任何成员。
在其它优选的实施方案中,本发明的抗体结合本发明的BLyS多肽(包括其生物活性片段或变体),所述多肽融合于可溶形式的APRIL多肽(例如SEQ ID NO:3239的105-250位氨基酸残基),或其生物活性片段或变体。
为改良或改变BLyS多肽的特性,可以应用蛋白质工程。本领域技术人员已知的重组DNA技术可以易于产生新的突变的蛋白或“突变蛋白”,包括单个或多个氨基酸取代,缺失,添加或融合蛋白。这种修饰的多肽可以示出例如活性增强或稳定性提高。另外,它们可以高产量纯化并示出比相应的天然多肽更好的溶解性,至少在一定的纯化和贮存条件下。例如,针对许多蛋白包括分泌的蛋白的胞外结构域或成熟形式,本领域已知在N末端或C末端可以缺失一或多个氨基酸,而基本不丧失生物功能。例如Ron等(生物化学杂志268:2984-2988(1993))报道了修饰的KGF蛋白,即使缺失3,8或27个氨基端氨基酸残基仍具有肝素结合活性。因此,本发明的抗体可以结合通过蛋白质工程产生的BLyS多肽突变体或变体。
目前,由于本发明的蛋白质是TNF多肽家族成员,SEQ IDNO:3228的N末端氨基酸的缺失直至第191位的Gly(G)残基,仍可保留一些生物活性,例如刺激淋巴细胞(例如B细胞)增殖,分化和/或活化的能力,及对适当靶细胞的细胞毒性。具有进一步N末端缺失(包括Gly(G)残基)的多肽,不期望保留生物活性,因为已知在TNF相关多肽中的这个残基是生物活性所需的保守结构域的起始。然而,即使在蛋白质的N末端缺失一或多个氨基酸,产生修饰或丧失蛋白质的一或多种生物功能,但其它功能活性仍保留。因此,当在N末端除去完整蛋白质或其胞外结构域的少量残基时,缩短的蛋白质诱导和/或结合识别完整蛋白或其胞外结构域的抗体的能力仍将保留。一种缺失完整蛋白N末端残基的特殊多肽是否保留这种免疫原性活性,可以易于通过本文所述和本领域已知的常规方法确定。
因此,本发明还提供了结合多肽的抗体,所述多肽在SEQ IDNO:3228所示BLyS氨基酸序列的氨基端缺失一或多个残基,直至缺失第191位的甘氨酸残基(自氨基端的Gly-191残基)。特别地,本发明提供了结合多肽的抗体,所述多肽包含SEQ ID NO:3228的n1-285残基的氨基酸序列,其中n1是SEQ ID NO:3228所示氨基酸序列的2-190位氨基酸残基位置范围内的任一整数。更特别地,本发明提供了结合多肽的抗体,所述多肽包含选自以下氨基酸残基组成的氨基酸序列:SEQ ID NO:3228的2-285,3-285,4-285,5-285,6-285,7-285,8-285,9-285,10-285,11-285,12-285,13-285,14-285,15-285,16-285,17-285,18-285,19-285,20-285,21-285,22-285,23-285,24-285,25-285,26-285,27-285,28-285,29-285,30-285,31-285,32-285,33-285,34-285,35-285,36-285,37-285,38-285,39-285,40-285,41-285,42-285,43-285,44-285,45-285,46-285,47-285,48-285,49-285,50-285,51-285,52-285,53-285,54-285,55-285,56-285,57-285,58-285,59-285,60-285,61-285,62-285,63-285,64-285,65-285,66-285,67-285,68-285,69-285,70-285,71-285,72-285,73-285,74-285,75-285,76-285,77-285,78-285,79-285,80-285,81-285,82-285,83-285,84-285,85-285,86-285,87-285,88-285,89-285,90-285,91-285,92-285,93-285,94-285,95-285,96-285,97-285,98-285,99-285,100-285,101-285,102-285,103-285,104-285,105-285,106-285,107-285,108-285,109-285,110-285,111-285,112-285,113-285,114-285,115-285,116-285,117-285,118-285,119-285,120-285,121-285,122-285,123-285,124-285,125-285,126-285,127-285,128-285,129-285,130-285,131-285,132-285,133-285,134-285,135-285,136-285,137-285,138-285,139-285,140-285,141-285,142-285,143-285,144-285,145-285,146-285,147-285,148-285,149-285,150-285,151-285,152-285,153-285,154-285,155-285,156-285,157-285,158-285,159-285,160-285,161-285,162-285,163-285,164-285,165-285,166-285,167-285,168-285,169-285,170-285,171-285,172-285,173-285,174-285,175-285,176-285,177-285,178-285,179-285,180-285,181-285,182-285,183-285,184-285,185-285,186-285,187-285,188-285,189-285,和190-285。本发明还涉及结合BLyS多肽的抗体,所述多肽包含与上述BLyS多肽氨基酸序列有至少80%,85%,90%,92%,95%,96%,97%,98%或99%相同性的氨基酸残基的连续序列。
另外,由于本发明BLyS多肽的推定的胞外结构域可以自身激发生物活性,因此在所述多肽的推定的胞外区域(跨越SEQ IDNO:3228的Gln-73至Leu-285)中缺失N或C末端氨基酸残基,仍可保留一些生物活性,如配体结合,刺激淋巴细胞(例如B细胞)增殖,分化和/或活化,及调节细胞复制或调节靶细胞活性。然而,即使从BLyS多肽的推定的胞外结构域的N末端缺失一或多个氨基酸,产生修饰或丧失多肽的一或多种生物功能,但其它功能活性仍可保留。因此,当从N末端除去完整多肽或成熟多肽或其胞外结构域的少量氨基酸残基时,缩短的多肽诱导和/或结合识别所述完整多肽或示出多肽或其胞外结构域的抗体的能力仍将保留。缺失完整多肽N末端残基的已知特殊多肽是否保留这种免疫活性,可以通过本文所述和本领域已知的其它常规方法确定。
因此,本发明还提供了结合多肽的抗体,所述多肽在SEQ IDNO:3228所示BLyg氨基酸序列的氨基端缺失一或多个残基,直至缺失第280位的甘氨酸残基(自氨基端的Gly-191残基)。特别地,本发明提供了结合多肽的抗体,所述多肽包含SEQ ID NO:3228的n2-285残基的氨基酸序列,其中n2是SEQ ID NO:3228所示氨基酸序列的73-280位氨基酸残基位置范围内的任一整数,而且第73位是BLyS多肽(SEQ ID NO:3228)的推定的胞外结构域N末端的第1个残基位。更特别地,在一些实施方案中,本发明提供了结合多肽的抗体,所述多肽包含选自以下氨基酸残基组成的氨基酸序列:SEQ IDNO:3228的Q-73至L-285;G-74至L-285;D-75至L-285;L-76至L-285;A-77至L-285;S-78至L-285;L-79至L-285;R-80至L-285;A-81至L-285;E-82至L-285;L-83至L-285;Q-84至L-285;G-85至L-285;H-86至L-285;H-87至L-285;A-88至L-285;E-89至L-285;K-90至L-285;L-91至L-285;P-92至L-285;A-93至L-285;G-94至L-285;A-95至L-285;G-96至L-285;A-97至L-285;P-98至L-285;K-99至L-285;A-100至L-285;G-101至L-285;L-102至L-285;E-103至L-285;E-104至L-285;A-105至L-285;P-106至L-285;A-107至L-285;V-108至L-285;T-109至L-285;A-110至L-285;G-111至L-285;L-112至L-285;K-113至L-285;I-114至L-285;F-115至L-285;E-116至L-285;P-117至L-285;P-118至L-285;A-119至L-285;P-120至L-285;G-121至L-285;E-122至L-285;G-123至L-285;N-124至L-285;S-125至L-285;S-126至L-285;Q-127至L-285;N-128至L-285;S-129至L-285;R-130至L-285;N-131至L-285;K-132至L-285;R-133至L-285;A-134至L-285;V-135至L-285;Q-136至L-285;G-137至L-285;P-138至L-285;E-139至L-285;E-140至L-285;T-141至L-285;V-142至L-285;T-143至L-285;Q-144至L-285;D-145至L-285;C-146至L-285;L-147至L-285;Q-148至L-285;L-149至L-285;I-150至L-285;A-151至L-285;D-152至L-285;S-153至L-285;E-154至L-285;T-155至L-285;p-156至L-285;T-157至L-285;I-158至L-285;Q-159至L-285;K-160至L-285;G-161至L-285;S-162至L-285;Y-163至L-285;T-164至L-285;F-165至L-285;V-166至L-285;P-167至L-285;W-168至L-285;L-169至L-285;L-170至L-285;S-171至L-285;F-172至L-285;K-173至L-285;R-174至L-285;G-175至L-285;S-176至L-285;A-177至L-285;L-178至L-285;E-179至L-285;E-180至L-285;K-181至L-285;E-182至L-285;N-183至L-285;K-184至L-285;I-185至L-285;L-186至L-285;V-187至L-285;K-188至L-285;E-189至L-285;T-190至L-285;G-191至L-285;Y-192至L-285;F-193至L-285;F-194至L-285;I-195至L-285;Y-196至L-285;G-197至L-285;Q-198至L-285;V-199至L-285;L-200至L-285;Y-201至L-285;T-202至L-285;D-203至L-285;K-204至L-285;T-205至L-285;Y-206至L-285;A-207至L-285;M-208至L-285;G-209至L-285;H-210至L-285;L-211至L-285;I-212至L-285;Q-213至L-285;R-214至L-285;K-215至L-285;K-216至L-285;V-217至L-285;H-218至L-285;V-219至L-285;F-220至L-285;G-221至L-285;D-222至L-285;E-223至L-285;L-224至L-285;S-225至L-285;L-226至L-285;V-227至L-285;T-228至L-285;L-229至L-285;F-230至L-285;R-231至L-285;C-232至L-285;I-233至L-285;Q-234至L-285;N-235至L-285;M-236至L-285;P-237至L-285;E-238至L-285;T-239至L-285;L-240至L-285;P-241至L-285;N-242至L-285;N-243至L-285;S-244至L-285;C-245至L-285;Y-246至L-285;S-247至L-285;A-248至L-285;G-249至L-285;I-250至L-285;A-251至L-285;K-252至L-285;L-253至L-285;E-254至L-285;E-255至L-285;G-256至L-285;D-257至L-285;E-258至L-285;L-259至L-285;Q-260至L-285;L-261至L-285;A-262至L-285;I-263至L-285;P-264至L-285;R-265至L-285;E-266全L-285;N-267全L-285;A-268至L-285;Q-269至L-285;I-270至L-285;S-271至L-285;L-272至L-285;D-273至L-285;G-274至L-285;D-275至L-285;V-276至L-285;T-277至L-285;F-278至L-285;F-279至L-285;和G-280至L-285。本发明还涉及结合BLyS多肽的抗体,所述多肽包含与上述BLyS多肽氨基酸序列有至少80%,85%,90%,92%,95%,96%,97%,98%或99%相同性的氨基酸残基连续序列。
本发明高度优选的实施方案涉及结合多肽的抗体,所述多肽包含与具有SEQ ID NO:3228的134-285位氨基酸序列的BLyS多肽具有至少80%,85%,90%相同性,优选至少95%,96%,97%,98%,99%或100%相同性的氨基酸序列。
本发明优选的实施方案涉及结合多肽的抗体,所述多肽包含与具有SEQ ID NO:3228的134-285位氨基酸序列的BLyS多肽具有至少90%相同性的氨基酸序列。本发明更优选的实施方案涉及结合多肽的抗体,所述多肽包含与具有SEQ ID NO:3228的134-285位氨基酸序列的BLyS多肽具有至少95%相同性的氨基酸序列。本发明更优选的实施方案涉及结合多肽的抗体,所述多肽包含与具有SEQ IDNO:3228的134-285位氨基酸序列的BLyS多肽具有至少96%相同性的氨基酸序列。
另外,本发明更优选的实施方案涉及结合多肽的抗体,所述多肽包含与具有SEQ ID NO:3228的134-285位氨基酸序列的BLyS多肽具有至少97%相同性的氨基酸序列。另外,本发明更优选的实施方案涉及结合多肽的抗体,所述多肽包含与具有SEQ ID NO:3228的134-285位氨基酸序列的BLyS多肽具有至少98%相同性的氨基酸序列。另外,本发明更优选的实施方案涉及结合多肽的抗体,所述多肽包含与具有SEQ ID NO:3228的134-285位氨基酸序列的BLyS多肽具有至少99%相同性的氨基酸序列。
在特异的实施方案中,本发明抗体结合包含N末端缺失的以下氨基酸残基之一的BLyS多肽片段:SEQ ID NO:3228的Ala-71至Leu-285,Ala-81至Leu-285,Leu-112至Leu-285,Ala-134至Leu-285,Leu-147至Leu-285,和Gly-161至Leu-285。
相似地,已知许多生物功能性C末端缺失多肽的实例。例如,干扰素γ示出在蛋白质的羧基端缺失8-10个氨基酸残基,活性高10倍(D_beli等,生物技术杂志7:199-216(1988))。由于本发明的蛋白是TNF多肽家族的一个成员,期望在C末端缺失氨基酸直至第284位的亮氨酸残基,仍可保留大部分(如果不是全部)生物活性,例如配体结合,刺激淋巴细胞(例如B细胞)增殖,分化和/或活化的能力,和调节细胞复制。缺失直至大约10个另外的C末端残基的多肽(即直至在第274位甘氨酸残基),也可保留一些活性例如受体结合,尽管这种多肽缺失一部分保守的TNF结构域,所述结构域延伸至SEQ ID NO:3228的大约Leu-284位。然而,即使在蛋白质C末端缺失一或多个氨基酸导致所述蛋白质的一或多种生物功能修改或丧失,但仍可保留其它功能活性。因此,当完整或成熟蛋白的少数残基从C末端除去时,缩短的蛋白质一般仍保留诱导和/或结合识别完整或成熟蛋白的抗体的能力。缺失完整蛋白C末端残基的一种特殊多肽是否保留这种免疫学活性,可易于通过本文所述或本领域已知的其它常规方法确定。
因此,本发明还提供了结合多肽的抗体,所述多肽是在SEQ IDNO:3228所示BLyS多肽的氨基酸序列羧基端缺失一或多个残基,直至在第274位的甘氨酸残基(Gly-274)。特别地,本发明提供了结合多肽的抗体,所述多肽包含SEQ ID NO:3228氨基酸序列的1-m1残基的氨基酸序列,其中m1是SEQ ID NO:3228中第274-284氨基酸残基位范围内的任一整数。更特别地,本发明提供了结合BLyS多肽的抗体,所述多肽包含选自SEQ ID NO:3228的1-274,1-275,1-276,1-277,1-278,1-279,1-280,1-281,1-282,1-283和1-284残基组成的氨基酸序列。本发明还涉及结合BLyS多肽的抗体,所述多肽包含与上述BLyS的氨基酸序列有至少80%,85%,90%,92%,95%,96%,97%,98%或99%氨基酸残基相同性的一个邻近序列。
本发明还提供了结合BLyS多肽的抗体,所述多肽包含在氨基端和羧基端均缺失一或多个氨基酸的BLyS多肽,其通常可以描述为具有SEQ ID NO:3228的n1-m1残基,其中n1和m1是上述范围内的的一个整数。本发明还包括结合多肽的抗体,所述多肽包含由ATCC中保藏号为No.97768的保藏的cDNA克隆编码的完整BLyS氨基酸序列的一部分,其中这个部分不包括保藏的质粒中cDNA克隆编码的完整氨基酸序列氨基端的1-190位氨基酸或C末端的1-11位氨基酸(或者这些N末端和C末端缺失的任意组合)。
相似地,缺失BLyS的推定胞外结构域的C末端氨基酸残基直至SEQ ID NO:3228第79位亮氨酸残基,仍可保留一些生物活性,例如配体结合,刺激淋巴细胞(例如B细胞)增殖,分化,和/或活化,及调节细胞复制或调节靶细胞活性。C末端进一步缺失包括缺失SEQ ID NO:3228的Leu-79的多肽,不期望保留生物活性。
然而,即使在多肽C末端缺失一或多个氨基酸导致所述多肽的一或多种生物功能被修饰或丧失,但仍可保留其它生物活性。因此,当完整的,成熟的或胞外形式的多肽在C末端缺失少数残基时,所述缩短的多肽诱导和/或结合识别所述完整,成熟或胞外形式多肽的抗体的能力一般仍将保留。缺失推定的胞外结构域的C末端残基的已知特殊多肽是否保留这种免疫活性,可易于通过本文所述或本领域已知的其它常规方法确定。
因此,本发明还提供了结合多肽的抗体,所述多肽是SEQ IDNO:3228所示BLyS多肽的推定的胞外结构域的氨基酸序列羧基端缺失一或多个残基,直至SEQ ID NO:3228的第79位亮氨酸。特别地,本发明提供了结合多肽的抗体,所述多肽包含SEQ ID NO:3228所示氨基酸序列的73-m2残基组成的氨基酸序列,其中m2是SEQ IDNO:3228氨基酸序列中第79-285氨基酸位范围内的任一整数,而且第78位残基是BLyS多肽推定的胞外结构域C末端的第一个残基位(如SEQ ID NO:3228所示)。更特别地,在一些实施方案中,本发明提供了结合多肽的抗体,所述多肽包含选自以下残基组成的氨基酸序列:SEQ ID NO:3228的Q-73至Leu-285;Q-73至L-284;Q-73至K-283;Q-73至L-282;Q-73至A-281;Q-73至G-280;Q-73至F-279;Q-73至F-278;Q-73至T-277;Q-73至V-276;Q-73至D-275;Q-73至G-274;Q-73至D-273;Q-73至L-272;Q-73至S-271;Q-73至I-270;Q-73至Q-269;Q-73至A-268;Q-73至N-267;Q-73至E-266;Q-73至R-265;Q-73至P-264;Q-73至I-263;Q-73至A-262;Q-73至L-261;Q-73至Q-260;Q-73至L-259;Q-73至E-258;Q-73至D-257;Q-73至G-256;Q-73至E-255;Q-73至E-254;Q-73至L-253;Q-73至K-252;Q-73至A-251;Q-73至I-250;Q-73至G-249;Q-73至A-248;Q-73至S-247;Q-73至Y-246;Q-73至C-245;Q-73至S-244;Q-73至N-243;Q-73至N-242;Q-73至P-241;Q-73至L-240;Q-73至T-239;Q-73至E-238;Q-73至P-237;Q-73至M-236;Q-73至N-235;Q-73至Q-234;Q-73至I-233;Q-73至C-232;Q-73至R-231;Q-73至F-230;Q-73至L-229;Q-73至T-228;Q-73至V-227;Q-73至L-226;Q-73至S-225;Q-73至L-224;Q-73至E-223;Q-73至D-222;Q-73至G-221;Q-73至F-220;Q-73至V-219;Q-73至H-218;Q-73至V-217;Q-73至K-216;Q-73至K-215;Q-73至R-214;Q-73至Q-213;Q-73至I-212;Q-73至L-211;Q-73至H-210;Q-73至G-209;Q-73至M-208;Q-73至A-207;Q-73至Y-206;Q-73至T-205;Q-73至K-204;Q-73至D-203;Q-73至T-202;Q-73至Y-201;Q-73至L-200;Q-73至V-199;Q-73至Q-198;Q-73至G-197;Q-73至Y-196;Q-73至I-195;Q-73至F-194;Q-73至F-193;Q-73至Y-192;Q-73至G-191;Q-73至T-190;Q-73至E-189;Q-73至K-188;Q-73至V-187;Q-73至L-186;Q-73至I-185;Q-73至K-184;Q-73至N-183;Q-73至E-182;Q-73至K-181;Q-73至E-180;Q-73至E-179;Q-73至L-178;Q-73至A-177;Q-73至S-176;Q-73至G-175;Q-73至R-174;Q-73至K-173;Q-73至F-172;Q-73至S-171;Q-73至L-170;Q-73至L-169;Q-73至W-168;Q-73至P-167;Q-73至V-166;Q-73至F-165;Q-73至T-164;Q-73至Y-163;Q-73至S-162;Q-73至G-161;Q-73至K-160;Q-73至Q-159;Q-73至I-158;Q-73至T-157;Q-73至P-156;Q-73至T-155;Q-73至E-154;Q-73至S-153;Q-73至D-152;Q-73至A-151;Q-73至I-150;Q-73至L-149;Q-73至Q-148;Q-73至L-147;Q-73至C-146;Q-73至D-145;Q-73至Q-144;Q-73至T-143;Q-73至V-142;Q-73至T-141;Q-73至E-140;Q-73至E-139;Q-73至P-138;Q-73至G-137;Q-73至Q-136;Q-73至V-135;Q-73至A-134;Q-73至R-133;Q-73至K-132;Q-73至N-131;Q-73至R-130;Q-73至S-129;Q-73至N-128;Q-73至Q-127;Q-73至S-126;Q-73至S-125;Q-73至N-124;Q-73至G-123;Q-73至E-122;Q-73至G-121;Q-73至P-120;Q-73至A-119;Q-73至P-118;Q-73至P-117;Q-73至E-116;Q-73至F-115;Q-73至I-114;Q-73至K-113;Q-73至L-112;Q-73至G-111;Q-73至A-110;Q-73至T-109;Q-73至V-108;Q-73至A-107;Q-73至P-106;Q-73至A-105;Q-73至E-104;Q-73至E-103;Q-73至L-102;Q-73至G-101;Q-73至A-100;Q-73至K-99;Q-73至P-98;Q-73至A-97;Q-73至G-96;Q-73至A-95;Q-73至G-94;Q-73至A-93;Q-73至P-92;Q-73至L-91;Q-73至K-90;Q-73至E-89;Q-73至A-88;Q-73至H-87;Q-73至H-86;Q-73至G-85;Q-73至Q-84;Q-73至L-83;Q-73至E-82;Q-73至A-81;Q-73至R-80;及Q-73至L-79。本发明还涉及结合BLyS多肽的抗体,所述多肽包含与上述BLyS多肽的氨基酸序列具有至少80%,85%,90%,92%,95%,96%,97%,98%或99%氨基酸残基相同性的一个连续序列。
本发明还提供了结合多肽的抗体,所述多肽在BLyS推定的胞外结构域的氨基端和羧基端均缺失一或多个氨基酸,其一般可以描述为具有SEQ ID NO:3228的n2-m2残基,其中n2和m2是如上述的整数。
在另一个实施方案中,本发明抗体结合的多肽具有由ATCC中保藏号为No.97768的保藏物中包含的cDNA质粒编码的BLyS氨基酸序列的胞外结构域的一部分,其中这部分不包括由ATCC中保藏号为No.97768的保藏物中包含的cDNA质粒编码的氨基酸序列的胞外结构域的氨基端的第1-大约206位氨基酸,或由ATCC中保藏号为No.97768的保藏物中包含的cDNA质粒编码的氨基酸序列的胞外结构域的羧基端的1-大约206位氨基酸,或由ATCC中保藏号为No.97768的保藏物中包含的cDNA质粒编码的氨基酸序列的完整胞外结构域的上述氨基端和羧基端缺失的任意组合。
如上所述,即使多肽N末端缺失一或多个氨基酸,导致所述多肽的一或多种功能活性(例如生物活性)被修饰或丧失,但其它生物活性仍可保留。因此,当全长多肽或成熟多肽或其胞外结构域的少数残基自N末端缺失时,所述缩短的蛋白质一般仍保留诱导和/或结合识别全长或成熟形式多肽或其胞外结构域的抗体的能力。缺失完整多肽N末端残基的一种特殊多肽是否保留这种免疫活性,可以通过本文所述或本领域已知其它常规方法确定。大量缺失N末端残基的BLyS突变蛋白可以保留一些功能活性(例如生物或免疫原性活性)是可能的。事实上,由少如6个BLyS氨基酸残基组成的肽通常可以激发免疫应答。
因此,本发明进一步提供了结合多肽的抗体,所述多肽是在SEQID NO:3228所示BLyS推定的全长氨基酸序列氨基端缺失一或多个残基,直至在SEQ ID NO:3228所示序列第280位的甘氨酸残基,及编码这种多肽的多核苷酸。特别地,本发明提供了结合多肽的抗体,所述多肽包含SEQ ID NO:3228所示序列的n3-285残基组成的氨基酸序列,其中n3是SEQ ID NO:3228所示氨基酸序列中第1-280氨基酸残基位范围内的一个整数。
更特别地,本发明提供了结合多肽的抗体,所述多肽包含选自以下的残基组成的氨基酸序列:SEQ ID NO:3228的D-2至L-285;D-3至L-285;S-4至L-285;T-5至L-285;E-6至L-285;R-7至L-285;E-8至L-285;Q-9至L-285;S-10至L-285;R-11至L-285;L-12至L-285;T-13至L-285;S-14至L-285;C-15至L-285;L-16至L-285;K-17至L-285;K-18至L-285;R-19至L-285;E-20至L-285;E-21至L-285;M-22至L-285;K-23至L-285;L-24至L-285;K-25至L-285;E-26至L-285;C-27至L-285;V-28至L-285;S-29至L-285;I-30至L-285;L-31至L-285;P-32至L-285;R-33至L-285;K-34至L-285;E-35至L-285;S-36至L-285;P-37至L-285;S-38至L-285;V-39至L-285;R-40至L-285;S-41至L-285;S-42至L-285;K-43至L-285;D-44至L-285;G-45至L-285;K-46至L-285;L-47至L-285;L-48至L-285;A-49至L-285;A-50至L-285;T-5 1至L-285;L-52至L-285;L-53至L-285;L-54至L-285;A-55至L-285;L-56至L-285;L-57至L-285;S-58至L-285;C-59至L-285;C-60至L-285;L-61至L-285;T-62至L-285;V-63至L-285;V-64至L-285;S-65至L-285;F-66至L-285;Y-67至L-285;Q-68至L-285;V-69至L-285;A-70至L-285;A-71至L-285;L-72至L-285;Q-73至L-285;G-74至L-285;D-75至L-285;L-76至L-285;A-77至L-285;S-78至L-285;L-79至L-285;R-80至L-285;A-81至L-285;E-82至L-285;L-83至L-285;Q-84至L-285;G-85至L-285;H-86至L-285;H-87至L-285;A-88至L-285;E-89至L-285;K-90至L-285;L-91至L-285;P-92至L-285;A-93至L-285;G-94至L-285;A-95至L-285;G-96至L-285;A-97至L-285;P-98至L-285;K-99至L-285;A-100至L-285;G-101至L-285;L-102至L-285;E-103至L-285;E-104至L-285;A-105至L-285;P-106至L-285;A-107至L-285;V-108至L-285;T-109至L-285;A-110至L-285;G-111至L-285;L-112至L-285;K-113至L-285;I-114至L-285;F-115至L-285;E-116至L-285;P-117至L-285;P-118至L-285;A-119至L-285;P-120至L-285;G-121至L-285;E-122至L-285;G-123至L-285;N-124至L-285;S-125至L-285;S-126至L-285;Q-127至L-285;N-128至L-285;S-129至L-285;R-130至L-285;N-131至L-285;K-132至L-285;R-133至L-285;A-134至L-285;V-135至L-285;Q-136至L-285;G-137至L-285;P-138至L-285;E-139至L-285;E-140至L-285;T-141至L-285;V-142至L-285;T-143至L-285;Q-144至L-285;D-145至L-285;C-146至L-285;L-147至L-285;Q-148至L-285;L-149至L-285;I-150至L-285;A-151至L-285;D-152至L-285;S-153至L-285;E-154至L-285;T-155至L-285;P-156至L-285;T-157至L-285;I-158至L-285;Q-159至L-285;K-160至L-285;G-161至L-285;S-162至L-285;Y-163至L-285;T-164至L-285;F-165至L-285;V-166至L-285;P-167至L-285;W-168至L-285;L-169至L-285;L-170至L-285;S-171至L-285;F-172至L-285;K-173至L-285;R-174至L-285;G-175至L-285;S-176至L-285;A-177至L-285;L-178至L-285;E-179至L-285;E-180至L-285;K-181至L-285;E-182至L-285;N-183至L-285;K-184至L-285;I-185至L-285;L-186至L-285;V-187至L-285;K-188至L-285;E-189至L-285;T-190至L-285;G-191至L-285;Y-192至L-285;F-193至L-285;F-194至L-285;I-195至L-285;Y-196至L-285;G-197至L-285;Q-198至L-285;V-199至L-285;L-200至L-285;Y-201至L-285;T-202至L-285;D-203至L-285;K-204至L-285;T-205至L-285;Y-206至L-285;A-207至L-285;M-208至L-285;G-209至L-285;H-210至L-285;L-211至L-285;I-212至L-285;Q-213至L-285;R-214至L-285;K-215至L-285;K-216至L-285;V-217至L-285;H-218至L-285;V-219至L-285;F-220至L-285;G-221至L-285;D-222至L-285;E-223至L-285;L-224至L-285;S-225至L-285;L-226至L-285;V-227至L-285;T-228至L-285;L-229至L-285;F-230至L-285;R-231至L-285;C-232至L-285;I-233至L-285;Q-234至L-285;N-235至L-285;M-236至L-285;P-237至L-285;E-238至L-285;T-239至L-285;L-240至L-285;P-241至L-285;N-242至L-285;N-243至L-285;S-244至L-285;C-245至L-285;Y-246至L-285;S-247至L-285;A-248至L-285;G-249至L-285;I-250至L-285;A-251至L-285;K-252至L-285;L-253至L-285;E-254至L-285;E-255至L-285;G-256至L-285;D-257至L-285;E-258至L-285;L-259至L-285;Q-260至L-285;L-261至L-285;A-262至L-285;I-263至L-285;P-264至L-285;R-265至L-285;E-266至L-285;N-267至L-285;A-268至L-285;Q-269至L-285;I-270至L-285;S-271至L-285;L-272至L-285;D-273至L-285;G-274至L-285;D-275至L-285;V-276至L-285;T-277至L-285;F-278至L-285;F-279至L-285;and G-280至L-285。本发明还涉及结合BLyS多肽的抗体,所述多肽包含与BLyS多肽的氨基酸序列有至少80%,85%,90%,92%,95%,96%,97%,98%或99%氨基酸残基相同性的一个连续序列。
也如上所述,即使蛋白质的C末端缺失一或多个氨基酸,导致所述蛋白质的一或多种功能活性(例如生物活性)被修饰或丧失,但其它生物活性仍可保留。因此,当全长多肽或成熟多肽或其胞外结构域的少数残基自C末端缺失时,所述缩短的BLyS突变蛋白一般仍保留诱导和/或结合识别全长或成熟形式多肽或其胞外结构域的抗体的能力。缺失完整多肽C末端残基的一种特殊多肽是否保留这种免疫活性,可以通过本文所述或本领域已知其它常规方法确定。大量缺失C末端残基的BLyS突变蛋白可以保留一些功能活性(例如生物或免疫原性活性)是可能的。事实上,由少如6个BLyS氨基酸残基组成的肽通常可以激发免疫应答。
因此,本发明在另一个实施方案中进一步提供了结合多肽的抗体,所述多肽在SEQ ID NO:3228所示BLyS氨基酸序列的羧基端缺失一或多个残基,直至在第6位的谷氨酸残基,及编码这种多肽的多核苷酸。 特别地,本发明提供了结合多肽的抗体,所述多肽包含SEQ ID NO:3228所示1-m3氨基酸残基序列,其中m3是SEQ IDNO:3228所示氨基酸序列中第6-284氨基酸残基位范围内的一个整数。
更特别地,本发明提供了结合多肽的抗体,所述多肽包含选自以下氨基酸残基序列:SEQ ID NO:3228的M-1至L-284;M-1至K-283;M-1至L-282;M-1至A-281;M-1至G-280;M-1至F-279;M-1至F-278;M-1至T-277;M-1至V-276;M-1至D-275;M-1至G-274;M-1至D-273;M-1至L-272;M-1至S-271;M-1至I-270;M-1至Q-269;M-1至A-268;M-1至N-267;M-1至E-266;M-1至R-265;M-1至P-264;M-1至I-263;M-1至A-262;M-1至L-261;M-1至Q-260;M-1至L-259;M-1至E-258;M-1至D-257;M-1至G-256;M-1至E-255;M-1至E-254;M-1至L-253;M-1至K-252;M-1至A-251;M-1至I-250;M-1至G-249;M-1至A-248;M-1至S-247;M-1至Y-246;M-1至C-245;M-1至S-244;M-1至N-243;M-1至N-242;M-1至P-241;M-1至L-240;M-1至T-239;M-1至E-238;M-1至P-237;M-1至M-236;M-1至N-235;M-1至Q-234;M-1至I-233;M-1至C-232;M-1至R-231;M-1至F-230;M-1至L-229;M-1至T-228;M-1至V-227;M-1至L-226;M-1至S-225;M-1至L-224;M-1至E-223;M-1至D-222;M-1至G-221;M-1至F-220;M-1至V-219;M-1至H-218;M-1至V-217;M-1至K-216;M-1至K-215;M-1至R-214;M-1至Q-213;M-1至I-212;M-1至L-211;M-1至H-210;M-1至G-209;M-1至M-208;M-1至A-207;M-1至Y-206;M-1至T-205;M-1至K-204;M-1至D-203;M-1至T-202;M-1至Y-201;M-1至L-200;M-1至V-199;M-1至Q-198;M-1至G-197;M-1至Y-196;M-1至I-195;M-1至F-194;M-1至F-193;M-1至Y-192;M-1至G-191;M-1至T-190;M-1至E-189;M-1至K-188;M-1至V-187;M-1至L-186;M-1至I-185;M-1至K-184;M-1至N-183;M-1至E-182;M-1至K-181;M-1至E-180;M-1至E-179;M-1至L-178;M-1至A-177;M-1至S-176;M-1至G-175;M-1至R-174;M-1至K-173;M-1至F-172;M-1至S-171;M-1至L-170;M-1至L-169;M-1至W-168;M-1至P-167;M-1至V-166;M-1至F-165;M-1至T-164;M-1至Y-163;M-1至S-162;M-1至G-161;M-1至K-160;M-1至Q-159;M-1至I-158;M-1至T-157;M-1至P-156;M-1至T-155;M-1至E-154;M-1至S-153;M-1至D-152;M-1至A-151;M-1至I-150;M-1至L-149;M-1至Q-148;M-1至L-147;M-1至C-146;M-1至D-145;M-1至Q-144;M-1至T-143;M-1至V-142;M-1至T-141;M-1至E-140;M-1至E-139;M-1至P-138;M-1至G-137;M-1至Q-136;M-1至V-135;M-1至A-134;M-1至R-133;M-1至K-132;M-1至N-131;M-1至R-130;M-1至S-129;M-1至N-128;M-1至Q-127;M-1至S-126;M-1至S-125;M-1至N-124;M-1至G-123;M-1至E-122;M-1至G-121;M-1至P-120;M-1至A-119;M-1至P-118;M-1至P-117;M-1至E-116;M-1至F-115;M-1至I-114;M-1至K-113;M-1至L-112;M-1至G-111;M-1至A-110;M-1至T-109;M-1至V-108;M-1至A-107;M-1至P-106;M-1至A-105;M-1至E-104;M-1至E-103;M-1至L-102;M-1至G-101;M-1至A-100;M-1至K-99;M-1至P-98;M-1至A-97;M-1至G-96;M-1至A-95;M-1至G-94;M-1至A-93;M-1至P-92;M-1至L-91;M-1至K-90;M-1至E-89;M-1至A-88;M-1至H-87;M-1至H-86;M-1至G-85;M-1至Q-84;M-1至L-83;M-1至E-82;M-1至A-81;M-1至R-80;M-1至L-79;M-1至S-78;M-1至A-77;M-1至L-76;M-1至D-75;M-1至G-74;M-1至Q-73;M-1至L-72;M-1至A-71;M-1至A-70;M-1至V-69;M-1至Q-68;M-1至Y-67;M-1至F-66;M-1至S-65;M-1至V-64;M-1至V-63;M-1至T-62;M-1至L-61;M-1至C-60;M-1至C-59;M-1至S-58;M-1至L-57;M-1至L-56;M-1至A-55;M-1至L-54;M-1至L-53;M-1至L-52;M-1至T-51;M-1至A-50;M-1至A-49;M-1至L-48;M-1至L-47;M-1至K-46;M-1至G-45;M-1至D-44;M-1至K-43;M-1至S-42;M-1至S-41;M-1至R-40;M-1至V-39;M-1至S-38;M-1至P-37;M-1至S-36;M-1至E-35;M-1至K-34;M-1至R-33;M-1至P-32;M-1至L-31;M-1至I-30;M-1至S-29;M-1至V-28;M-1至C-27;M-1至E-26;M-1至K-25;M-1至L-24;M-1至K-23;M-1至M-22;M-1至E-21;M-1至E-20;M-1至R-19;M-1至K-18;M-1至K-17;M-1至L-16;M-1至C-15;M-1至S-14;M-1至T-13;M-1至L-12;M-1至R-11;M-1至S-10;M-1至Q-9;M-1至E-8;M-1至R-7;和M-1至E-6。本发明还涉及结合BLyS多肽的抗体,所述多肽包含与BLyS多肽的氨基酸序列具有至少80%,85%,90%,92%,95%,96%,97%,98%或99%氨基酸相同性的一个连续序列。
本发明还提供了结合多肽的抗体,所述多肽是在BLyS多肽的氨基端和羧基端均缺失一或多个氨基酸,其一般可以描述为具有SEQID NO:3228的n3-m3残基,其中n3和m3是上述整数。
另外,由于SEQ ID NO:3229所示BLyS多肽的推定的胞外结构域可以自身激发功能活性(例如生物活性),因此从位于SEQ IDNO:3229的Gln-73至Leu-266位的推定的胞外结构域中缺失N或C末端氨基酸残基,仍可保留一些功能活性,例如配体结合,刺激淋巴细胞(例如B细胞)增殖,分化和/或活化,调节细胞复制,调节靶细胞活性和/或免疫原性。然而,即使BLyS多肽推定的胞外结构域N末端缺失一或多个氨基酸,导致所述多肽的一或多种功能活性(例如生物活性)被修饰或丧失,但其它生物活性仍可保留。因此,当全长多肽或成熟多肽或其胞外结构域的少数残基自N末端缺失时,所述缩短的蛋白质一般仍保留诱导和/或结合识别全长或成熟形式多肽或其胞外结构域的抗体的能力。缺失完整多肽N末端残基的一种特殊多肽是否保留这种免疫活性,可以通过本文所述或本领域已知其它常规方法确定。
因此,本发明还提供了结合多肽的抗体,所述多肽是在SEQ IDNO:3229所示BLyS的氨基酸序列氨基端缺失一或多个氨基酸残基,直至第261位的甘氨酸。特别地,本发明提供了结合多肽的抗体,所述多肽包含SEQ ID NO:3229的n4-266氨基酸残基序列,其中n4是SEQ ID NO:3229氨基酸序列的第73-261氨基酸位范围内的一个整数,而且第261位是BLyS多肽推定的胞外结构域N末端的第一个残基位(如SEQ ID NO:3229所示)。
更特别地,在一些实施方案中,本发明提供了结合多肽的抗体,所述多肽包含选自以下残基组成的氨基酸序列:SEQ ID NO:3229SEQID NO:3229的Q-73至L-266;G-74至L-266;D-75至L-266;L-76至L-266;A-77至L-266;S-78至L-266;L-79至L-266;R-80至L-266;A-81至L-266;E-82至L-266;L-83至L-266;Q-84至L-266;G-85至L-266;H-86至L-266;H-87至L-266;A-88至L-266;E-89至L-266;K-90至L-266;L-91至L-266;P-92至L-266;A-93至L-266;G-94至L-266;A-95至L-266;G-96至L-266;A-97至L-266;P-98至L-266;K-99至L-266;A-100至L-266;G-101至L-266;L-102至L-266;E-103至L-266;E-104至L-266;A-105至L-266;P-106至L-266;A-107至L-266;V-108至L-266;T-109至L-266;A-110至L-266;G-111至L-266;L-112至L-266;K-113至L-266;I-114至L-266;F-115至L-266;E-116至L-266;P-117至L-266;P-118至L-266;A-119至L-266;P-120至L-266;G-121至L-266;E-122至L-266;G-123至L-266;N-124至L-266;S-125至L-266;S-126至L-266;Q-127至L-266;N-128至L-266;S-129至L-266;R-130至L-266;N-131至L-266;K-132至L-266;R-133至L-266;A-134至L-266;V-135至L-266;Q-136至L-266;G-137至L-266;P-138至L-266;E-139至L-266;E-140至L-266;T-141至L-266;G-142至L-266;S-143至L-266;Y-144至L-266;T-145至L-266;F-146至L-266;V-147至L-266;P-148至L-266;W-149至L-266;L-150至L-266;L-151至L-266;S-152至L-266;F-153至L-266;K-154至L-266;R-155至L-266;G-156至L-266;S-157至L-266;A-158至L-266;L-159至L-266;E-160至L-266;E-161至L-266;K-162至L-266;E-163至L-266;N-164至L-266;K-165至L-266;I-166至L-266;L-167至L-266;V-168至L-266;K-169至L-266;E-170至L-266;T-171至L-266;G-172至L-266;Y-173至L-266;F-174至L-266;F-175至L-266;I-176至L-266;Y-177至L-266;G-178至L-266;Q-179至L-266;V-180至L-266;L-181至L-266;Y-182至L-266;T-183至L-266;D-184至L-266;K-185至L-266;T-186至L-266;Y-187至L-266;A-188至L-266;M-189至L-266;G-190至L-266;H-191至L-266;L-192至L-266;I-193至L-266;Q-194至L-266;R-195至L-266;K-196至L-266;K-197至L-266;V-198至L-266;H-199至L-266;V-200至L-266;F-201至L-266;G-202至L-266;D-203至L-266;E-204至L-266;L-205至L-266;S-206至L-266;L-207至L-266;V-208至L-266;T-209至L-266;L-210至L-266;F-211至L-266;R-212至L-266;C-213至L-266;I-214至L-266;Q-215至L-266;N-216至L-266;M-217至L-266;P-218至L-266;E-219至L-266;T-220至L-266;L-221至L-266;P-222至L-266;N-223至L-266;N-224至L-266;S-225至L-266;C-226至L-266;Y-227至L-266;S-228至L-266;A-229至L-266;G-230至L-266;I-231至L-266;A-232至L-266;K-233至L-266;L-234至L-266;E-235至L-266;E-236至L-266;G-237至L-266;D-238至L-266;E-239至L-266;L-240至L-266;Q-241至L-266;L-242至L-266;A-243至L-266;I-244至L-266;P-245至L-266;R-246至L-266;E-247至L-266;N-248至L-266;A-249至L-266;Q-250至L-266;I-251至L-266;S-252至L-266;L-253至L-266;D-254至L-266;G-255至L-266;D-256至L-266;V-257至L-266;T-258至L-266;F-259至L-266;F-260至L-266;and G-261至L-266。本发明还涉及结合BLyS多肽的抗体,所述多肽包含与上述BLyS多肽的氨基酸序列具有80%,85%,90%,92%,95%,96%,97%,98%或99%至少氨基酸残基相同性的一个连续序列。
相似地,缺失BLyS的推定的胞外结构域C末端氨基酸残基,直至在SEQ ID NO:3229第79位的亮氨酸残基,可以保留一些功能活性,例如配体结合,刺激淋巴细胞(例如B细胞)增殖,分化和/或活化的能力,调节细胞复制,调节靶细胞活性和/或免疫原性。进一步C末端缺失包括SEQ ID NO:3229的Leu-79的多肽不期望保留生物活性。
然而,即使多肽C末端缺失一或多个氨基酸,导致所述多肽的一或多种功能活性(例如生物活性)被修饰或丧失,但其它生物活性仍可保留。因此,当全长多肽或成熟多肽或其胞外结构域的少数残基自C末端缺失时,所述缩短的蛋白质一般仍保留诱导和/或结合识别全长或成熟形式多肽或其胞外结构域的抗体的能力。缺失完整多肽C末端残基的一种特殊多肽是否保留这种免疫活性,可以通过本文所述或本领域已知其它常规方法确定。
因此,本发明还提供了结合多肽的抗体,所述多肽是在in SEQ IDNO:3229所示BLyS的推定的胞外结构域羧基端缺失一或多个氨基酸残基。特别地,本发明提供了结合多肽的抗体,所述多肽具有SEQ IDNO:3229氨基酸序列的第73-m4位氨基酸残基序列,其中m4是SEQ IDNO:3229氨基酸序列中第79-265氨基酸残基位范围内的一个整数。
更特别地,在一些实施方案中,本发明提供了结合多肽的抗体,所述多肽包含选自以下残基组成的氨基酸序列:SEQ ID NO:3229的Q-73至L-265;Q-73至K-264;Q-73至L-263;Q-73至A-262;Q-73至G-261;Q-73至F-260;Q-73至F-259;Q-73至T-258;Q-73至V-257;Q-73至D-256;Q-73至G-255;Q-73至D-254;Q-73至L-253;Q-73至S-252;Q-73至I-251;Q-73至Q-250;Q-73至A-249;Q-73至N-248;Q-73至E-247;Q-73至R-246;Q-73至P-245;Q-73至1-244;Q-73至A-243;Q-73至L-242;Q-73至Q-241;Q-73至L-240;Q-73至E-239;Q-73至D-238;Q-73至G-237;Q-73至E-236;Q-73至E-235;Q-73至L-234;Q-73至K-233;Q-73至A-232;Q-73至I-231;Q-73至G-230;Q-73至A-229;Q-73至S-228;Q-73至Y-227;Q-73至C-226;Q-73至S-225;Q-73至N-224;Q-73至N-223;Q-73至P-222;Q-73至L-221;Q-73至T-220;Q-73至E-219;Q-73至P-218;Q-73至M-217;Q-73至N-216;Q-73至Q-215;Q-73至I-214;Q-73至C-213;Q-73至R-212;Q-73至F-211;Q-73至L-210;Q-73至T-209;Q-73至V-208;Q-73至L-207;Q-73至S-206;Q-73至L-205;Q-73至E-204;Q-73至D-203;Q-73至G-202;Q-73至F-201;Q-73至V-200;Q-73至H-199;Q-73至V-198;Q-73至K-197;Q-73至K-196;Q-73至R-195;Q-73至Q-194;Q-73至I-193;Q-73至L-192;Q-73至H-191;Q-73至G-190;Q-73至Q-7389;Q-73至A-188;Q-73至Y-187;Q-73至T-186;Q-73至K-185;Q-73至D-184;Q-73至T-183;Q-73至Y-182;Q-73至L-181;Q-73至V-180;Q-73至Q-179;Q-73至G-178;Q-73至Y-177;Q-73至I-176;Q-73至F-175;Q-73至F-174;Q-73至Y-173;Q-73至G-172;Q-73至T-171;Q-73至E-170;Q-73至K-169;Q-73至V-168;Q-73至L-167;Q-73至I-166;Q-73至K-165;Q-73至N-164;Q-73至E-163;Q-73至K-162;Q-73至E-161;Q-73至E-160;Q-73至L-159;Q-73至A-158;Q-73至S-157;Q-73至G-156;Q-73至R-155;Q-73至K-154;Q-73至F-153;Q-73至S-152;Q-73至L-151;Q-73至L-150;Q-73至W-149;Q-73至P-148;Q-73至V-147;Q-73至F-146;Q-73至T-145;Q-73至Y-144;Q-73至S-143;Q-73至G-142;Q-73至T-141;Q-73至E-140;Q-73至E-139;Q-73至P-138;Q-73至G-137;Q-73至Q-136;Q-73至V-135;Q-73至A-134;Q-73至R-133;Q-73至K-132;Q-73至N-131;Q-73至R-130;Q-73至S-129;Q-73至N-128;Q-73至Q-127;Q-73至S-126;Q-73至S-125;Q-73至N-124;Q-73至G-123;Q-73至E-122;Q-73至G-121;Q-73至P-120;Q-73至A-119;Q-73至P-118;Q-73至P-117;Q-73至E-116;Q-73至F-115;Q-73至I-114;Q-73至K-113;Q-73至L-112;Q-73至G-111;Q-73至A-110;Q-73至T-109;Q-73至V-108;Q-73至A-107;Q-73至P-106;Q-73至A-105;Q-73至E-104;Q-73至E-103;Q-73至L-102;Q-73至G-101;Q-73至A-100;Q-73至K-99;Q-73至P-98;Q-73至A-97;Q-73至G-96;Q-73至A-95;Q-73至G-94;Q-73至A-93;Q-73至P-92;Q-73至L-91;Q-73至K-90;Q-73至E-89;Q-73至A-88;Q-73至H-87;Q-73至H-86;Q-73至G-85;Q-73至Q-84;Q-73至L-83;Q-73至E-82;Q-73至A-81;Q-73至R-80;Q-73至L-79;和Q-73至S-78。本发明还涉及结合BLyS多肽的抗体,所述多肽包含与上述BLyS多肽氨基酸序列具有至少80%,85%,90%,92%,95%,96%,97%,98%或99%氨基酸相同性的一个连续序列。
本发明还提供了BLyS的推定的胞外结构域的氨基端和羧基端均缺失一或多个氨基酸的多肽,其一般可描述为具有SEQ ID NO:3229的n4-m4残基,其中n4和m4是上述整数。
在另一个实施方案中,本发明的抗体结合的多肽由ATCC中保藏号为No.203518的保藏物中包含的cDNA克隆编码的BLyS氨基酸序列的胞外结构域的一部分组成,其中这个部分不包括由ATCC中保藏号为No.203518的保藏物中包含的cDNA克隆编码的氨基酸序列的胞外结构域氨基端的第1-大约260位氨基酸,或由ATCC中保藏号为No.203518的保藏物中包含的cDNA克隆编码的氨基酸序列的胞外结构域的羧基端的第1-大约187位氨基酸,或上述由ATCC中保藏号为No.203518的保藏物中包含的cDNA克隆编码的氨基酸序列的完整胞外结构域的氨基端和羧基端缺失的任意组合。
如上所述,即使多肽N末端缺失一或多个氨基酸,导致所述多肽的一或多种功能活性(例如生物活性)被修饰或丧失,但其它生物活性仍可保留。因此,当全长多肽或成熟多肽或其胞外结构域的少数残基自N末端缺失时,所述缩短的BLyS多肽一般仍保留诱导和/或结合识别全长或成熟形式多肽或其胞外结构域的抗体的能力。缺失完整多肽N末端残基的一种特殊多肽是否保留这种免疫活性,可以通过本文所述或本领域已知其它常规方法确定。大量缺失N末端残基的BLyS突变蛋白可以保留一些功能活性(例如生物或免疫原性活性)是可能的。事实上,由少如6个BLyS氨基酸残基组成的肽通常可以激发免疫应答。
因此,本发明还提供了结合多肽的抗体,所述多肽是在SEQ IDNO:3229所示BLyS多肽推定的全长氨基酸序列的氨基端缺失一或多个残基,直至在SEQ ID NO:3229所示序列第261位的甘氨酸残基,及编码这种多肽的多核苷酸。特别地,本发明提供了结合多肽的抗体,所述多肽包含SEQ ID NO:3229所示序列的第n5-266位残基组成的氨基酸序列,其中n5是SEQ ID NO:3229氨基酸序列的第1-261氨基酸位范围内的一个整数。
更特别地,本发明提供了结合多肽的抗体,所述多肽包含选自以下残基组成的氨基酸序列:SEQ ID NO:3229的D-2至L-266;D-3至L-266;S-4至L-266;T-5至L-266;E-6至L-266;R-7至L-266;E-8至L-266;Q-9至L-266;S-10至L-266;R-11至L-266;L-12至L-266;T-13至L-266;S-14至L-266;C-15至L-266;L-16至L-266;K-17至L-266;K-18至L-266;R-19至L-266;E-20至L-266;E-21至L-266;M-22至L-266;K-23至L-266;L-24至L-266;K-25至L-266;E-26至L-266;C-27至L-266;V-28至L-266;S-29至L-266;I-30至L-266;L-31至L-266;P-32至L-266;R-33至L-266;K-34至L-266;E-35至L-266;S-36至L-266;P-37至L-266;S-38至L-266;V-39至L-266;R-40至L-266;S-41至L-266;S-42至L-266;K-43至L-266;D-44至L-266;G-45至L-266;K-46至L-266;L-47至L-266;L-48至L-266;A-49至L-266;A-50至L-266;T-51至L-266;L-52至L-266;L-53至L-266;L-54至L-266;A-55至L-266;L-56至L-266;L-57至L-266;S-58至L-266;C-59至L-266;C-60至L-266;L-61至L-266;T-62至L-266;V-63至L-266;V-64至L-266;S-65至L-266;F-66至L-266;Y-67至L-266;Q-68至L-266;V-69至L-266;A-70至L-266;A-71至L-266;L-72至L-266;Q-73至L-266;G-74至L-266;D-75至L-266;L-76至L-266;A-77至L-266;S-78至L-266;L-79至L-266;R-80至L-266;A-81至L-266;E-82至L-266;L-83至L-266;Q-84至L-266;G-85至L-266;H-86至L-266;H-87至L-266;A-88至L-266;E-89至L-266;K-90至L-266;L-91至L-266;P-92至L-266;A-93至L-266;G-94至L-266;A-95至L-266;G-96至L-266;A-97至L-266;P-98至L-266;K-99至L-266;A-100至L-266;G-101至L-266;L-102至L-266;E-103至L-266;E-104至L-266;A-105至L-266;P-106至L-266;A-107至L-266;V-108至L-266;T-109至L-266;A-110至L-266;G-111至L-266;L-112至L-266;K-113至L-266;I-114至L-266;F-115至L-266;E-116至L-266;P-117至L-266;P-118至L-266;A-119至L-266;P-120至L-266;G-121至L-266;E-122至L-266;G-123至L-266;N-124至L-266;S-125至L-266;S-126至L-266;Q-127至L-266;N-128至L-266;S-129至L-266;R-130至L-266;N-131至L-266;K-132至L-266;R-133至L-266;A-134至L-266;V-135至L-266;Q-136至L-266;G-137至L-266;P-138至L-266;E-139至L-266;E-140至L-266;T-141至L-266;G-142至L-266;S-143至L-266;Y-144至L-266;T-145至L-266;F-146至L-266;V-147至L-266;P-148至L-266;W-149至L-266;L-150至L-266;L-151至L-266;S-152至L-266;F-153至L-266;K-154至L-266;R-155至L-266;G-156至L-266;S-157至L-266;A-158至L-266;L-159至L-266;E-160至L-266;E-161至L-266;K-162至L-266;E-163至L-266;N-164至L-266;K-165至L-266;I-166至L-266;L-167至L-266;V-168至L-266;K-169至L-266;E-170至L-266;T-171至L-266;G-172至L-266;Y-173至L-266;F-174至L-266;F-175至L-266;I-176至L-266;Y-177至L-266;G-178至L-266;Q-179至L-266;V-180至L-266;L-181至L-266;Y-182至L-266;T-183至L-266;D-184至L-266;K-185至L-266;T-186至L-266;Y-187至L-266;A-188至L-266;M-189至L-266;G-190至L-266;H-191至L-266;L-192至L-266;I-193至L-266;Q-194至L-266;R-195至L-266;K-196至L-266;K-197至L-266;V-198至L-266;H-199至L-266;V-200至L-266;F-201至L-266;G-202至L-266;D-203至L-266;E-204至L-266;L-205至L-266;S-206至L-266;L-207至L-266;V-208至L-266;T-209至L-266;L-210至L-266;F-211至L-266;R-212至L-266;C-213至L-266;I-214至L-266;Q-215至L-266;N-216至L-266;M-217至L-266;P-218至L-266;E-219至L-266;T-220至L-266;L-221至L-266;P-222至L-266;N-223至L-266;N-224至L-266;S-225至L-266;C-226至L-266;Y-227至L-266;S-228至L-266;A-229至L-266;G-230至L-266;I-231至L-266;A-232至L-266;K-233至L-266;L-234至L-266;E-235至L-266;E-236至L-266;G-237至L-266;D-238至L-266;E-239至L-266;L-240至L-266;Q-241至L-266;L-242至L-266;A-243至L-266;I-244至L-266;P-245至L-266;R-246至L-266;E-247至L-266;N-248至L-266;A-249至L-266;Q-250至L-266;I-251至L-266;S-252至L-266;L-253至L-266;D-254至L-266;G-255至L-266;D-256至L-266;V-257至L-266;T-258至L-266;F-259至L-266;F-260至L-266;和G-261至L-266。本发明还涉及结合BLyS多肽的抗体,所述多肽包含与上述BLyS多肽的氨基酸序列具有至少80%,85%,90%,92%,95%,96%,97%,98%或99%氨基酸残基相同性的一个连续序列。
也如上所述,即使蛋白质的C末端缺失一或多个氨基酸,导致所述蛋白质的一或多种功能活性(例如生物活性)被修饰或丧失,但其它生物活性仍可保留。因此,当全长多肽或成熟多肽或其胞外结构域的少数残基自C末端缺失时,所述缩短的BLyS突变蛋白一般仍保留诱导和/或结合识别全长或成熟形式多肽或其胞外结构域的抗体的能力。缺失完整多肽C末端残基的一种特殊多肽是否保留这种免疫活性,可以通过本文所述或本领域已知其它常规方法确定。大量缺失C末端残基的BLyS突变蛋白可以保留一些功能活性(例如生物或免疫原性活性)是可能的。事实上,由少如6个BLyS氨基酸残基组成的肽通常可以激发免疫应答。
因此,在另一个实施方案中,本发明还提供了结合多肽的抗体,所述多肽是在SEQ ID NO:3229所述BLyS氨基酸序列的羧基端缺失一或多个残基,直至在第6位的谷氨酸残基,及编码所述多肽的多核苷酸。特别地,本发明提供了结合多肽的抗体,所述多肽包含SEQID NO:3229的第1-m5残基组成的氨基酸序列,其中m5是SEQ IDNO:3229所示氨基酸序列第6-265位氨基酸残基位范围内的一个整数。
更特别地,本发明提供了结合多肽的抗体,所述多肽包含选自以下残基组成的氨基酸序列:SEQ ID NO:3229的M-1至L-265;M-1至K-264;M-1至L-263;M-1至A-262;M-1至G-261;M-1至F-260;M-1至F-259;M-1至T-258;M-1至V-257;M-1至D-256;M-1至G-255;M-1至D-254;M-1至L-253;M-1至S-252;M-1至I-251;M-1至Q-250;M-1至A-249;M-1至N-248;M-1至E-247;M-1至R-246;M-1至P-245;M-1至I-244;M-1至A-243;M-1至L-242;M-1至Q-241;M-1至L-240;M-1至E-239;M-1至D-238;M-1至G-237;M-1至E-236;M-1至E-235;M-1至L-234;M-1至K-233;M-1至A-232;M-1至I-231;M-1至G-230;M-1至A-229;M-1至S-228;M-1至Y-227;M-1至C-226;M-1至S-225;M-1至N-224;M-1至N-223;M-1至P-222;M-1至L-221;M-1至T-220;M-1至E-219;M-1至P-218;M-1至M-217;M-1至N-216;M-1至Q-215;M-1至I-214;M-1至C-213;M-1至R-212;M-1至F-211;M-1至L-210;M-1至T-209;M-1至V-208;M-1至L-207;M-1至S-206;M-1至L-205;M-1至E-204;M-1至D-203;M-1至G-202;M-1至F-201;M-1至V-200;M-1至H-199;M-1至V-198;M-1至K-197;M-1至K-196;M-1至R-195;M-1至Q-194;M-1至I-193;M-1至L-192;M-1至H-191;M-1至G-190;M-1至M-189;M-1至A-188;M-1至Y-187;M-1至T-186;M-1至K-185;M-1至D-184;M-1至T-183;M-1至Y-182;M-1至L-181;M-1至V-180;M-1至Q-179;M-1至G-178;M-1至Y-177;M-1至I-176;M-1至F-175;M-1至F-174;M-1至Y-173;M-1至G-172;M-1至T-171;M-1至E-170;M-1至K-169;M-1至V-168;M-1至L-167;M-1至I-166;M-1至K-165;M-1至N-164;M-1至E-163;M-1至K-162;M-1至E-161;M-1至E-160;M-1至L-159;M-1至A-158;M-1至S-157;M-1至G-156;M-1至R-155;M-1至K-154;M-1至F-153;M-1至S-152;M-1至L-151;M-1至L-150;M-1至W-149;M-1至P-148;M-1至V-147;M-1至F-146;M-1至T-145;M-1至Y-144;M-1至S-143;M-1至G-142;M-1至T-141;M-1至E-140;M-1至E-139;M-1至P-138;M-1至G-137;M-1至Q-136;M-1至V-135;M-1至A-134;M-1至R-133;M-1至K-132;M-1至N-131;M-1至R-130;M-1至S-129;M-1至N-128;M-1至Q-127;M-1至S-126;M-1至S-125;M-1至N-124;M-1至G-123;M-1至E-122;M-1至G-121;M-1至P-120;M-1至A-119;M-1至P-118;M-1至P-117;M-1至E-116;M-1至F-115;M-1至I-114;M-1至K-113;M-1至L-112;M-1至G-111;M-1至A-110;M-1至T-109;M-1至V-108;M-1至A-107;M-1至P-106;M-1至A-105;M-1至E-104;M-1至E-103;M-1至L-102;M-1至G-101;M-1至A-100;M-1至K-99;M-1至P-98;M-1至A-97;M-1至G-96;M-1至A-95;M-1至G-94;M-1至A-93;M-1至P-92;M-1至L-91;M-1至K-90;M-1至E-89;M-1至A-88;M-1至H-87;M-1至H-86;M-1至G-85;M-1至Q-84;M-1至L-83;M-1至E-82;M-1至A-81;M-1至R-80;M-1至L-79;M-1至S-78;M-1至A-77;M-1至L-76;M-1至D-75;M-1至G-74;M-1至Q-73;M-1至L-72;M-1至A-71;M-1至A-70;M-1至V-69;M-1至Q-68;M-1至Y-67;M-1至F-66;M-1至S-65;M-1至V-64;M-1至V-63;M-1至T-62;M-1至L-61;M-1至C-60;M-1至C-59;M-1至S-58;M-1至L-57;M-1至L-56;M-1至A-55;M-1至L-54;M-1至L-53;M-1至L-52;M-1至T-51;M-1至A-50;M-1至A-49;M-1至L-48;M-1至L-47;M-1至K-46;M-1至G-45;M-1至D-44;M-1至K-43;M-1至S-42;M-1至S-41;M-1至R-40;M-1至V-39;M-1至S-38;M-1至P-37;M-1至S-36;M-1至E-35;M-1至K-34;M-1至R-33;M-1至P-32;M-1至L-31;M-1至I-30;M-1至S-29;M-1至V-28;M-1至C-27;M-1至E-26;M-1至K-25;M-1至L-24;M-1至K-23;M-1至M-22;M-1至E-21;M-1至E-20;M-1至R-19;M-1至K-18;M-1至K-17;M-1至L-16;M-1至C-15;M-1至S-14;M-1至T-13;M-1至L-12;M-1至R-11;M-1至S-10;M-1至Q-9;M-1至E-8;M-1至R-7;和M-1至E-6。本发明还涉及结合BLyS多肽的抗体,所述多肽包含与上述BLyS多肽的氨基酸序列具有至少80%,85%,90%,92%,95%,96%,97%,98%或99%氨基酸残基相同性的一个连续序列。
本发明还提供了结合多肽的抗体,所述多肽是在BLyS多肽的氨基端和羧基端均缺失一或多个氨基酸,其一般可以描述为具有SEQID NO:3229的n5-m5残基,其中n5和m5是上述整数。
在另外的实施方案中,本发明提供了结合多肽的抗体,所述多肽包含SEQ ID NO:3228的134-m6氨基酸序列,其中m6代表SEQ IDNO:3228氨基酸残基位140-285范围内的一个整数。例如本发明提供了结合多肽的抗体,所述多肽包含以下残基组成的氨基酸序列:SEQ ID NO:3228的A-134至Leu-285;A-134至L-284;A-134至K-283;A-134至L-282;A-134至A-281;A-134至G-280;A-134至F-279;A-134至F-278;A-134至T-277;A-134至V-276;A-134至D-275;A-134至G-274;A-134至D-273;A-134至L-272;A-134至S-271;A-134至I-270;A-134至Q-269;A-134至A-268;A-134至N-267;A-134至E-266;A-134至R-265;A-134至P-264;A-134至I-263;A-134至A-262;A-134至L-261;A-134至Q-260;A-134至L-259;A-134至E-258;A-134至D-257;A-134至G-256;A-134至E-255;A-134至E-254;A-134至L-253;A-134至K-252;A-134至A-251;A-134至I-250;A-134至G-249;A-134至A-248;A-134至S-247;A-134至Y-246;A-134至C-245;A-134至S-244;A-134至N-243;A-134至N-242;A-134至P-241;A-134至L-240;A-134至T-239;A-134至E-238;A-134至P-237;A-134至M-236;A-134至N-235;A-134至Q-234;A-134至I-233;A-134至C-232;A-134至R-231;A-134至F-230;A-134至L-229;A-134至T-228;A-134至V-227;A-134至L-226;A-134至S-225;A-134至L-224;A-134至E-223;A-134至D-222;A-134至G-221;A-134至F-220;A-134至V-219;A-134至H-218;A-134至V-217;A-134至K-216;A-134至K-215;A-134至R-214;A-134至Q-213;A-134至I-212;A-134至L-211;A-134至H-210;A-134至G-209;A-134至M-208;A-134至A-207;A-134至Y-206;A-134至T-205;A-134至K-204;A-134至D-203;A-134至T-202;A-134至Y-201;A-134至L-200;A-134至V-199;A-134至Q-198;A-134至G-197;A-134至Y-196;A-134至I-195;A-134至F-194;A-134至F-193;A-134至Y-192;A-134至G-191;A-134至T-190;A-134至E-189;A-134至K-188;A-134至V-187;A-134至L-186;A-134至I-185;A-134至K-184;A-134至N-183;A-134至E-182;A-134至K-181;A-134至E-180;A-134至E-179;A-134至L-178;A-134至A-177;A-134至S-176;A-134至G-175;A-134至R-174;A-134至K-173;A-134至F-172;A-134至S-171;A-134至L-170;A-134至L-169;A-134至W-168;A-134至P-167;A-134至V-166;A-134至F-165;A-134至T-164;A-134至Y-163;A-134至S-162;A-134至G-161;A-134至K-160;A-134至Q-159;A-134至I-158;A-134至T-157;A-134至P-156;A-134至T-155;A-134至E-154;A-134至S-153;A-134至D-152;A-134至A-151;A-134至I-150;A-134至L-149;A-134至Q-148;A-134至L-147;A-134至C-146;A-134至D-145;A-134至Q-144;A-134至T-143;A-134至V-142;A-134至T-141;和A-134至E-140。本发明还涉及结合BLyS多肽的抗体,所述多肽包含与上述BLyS多肽的氨基酸序列具有至少80%,85%,90%,92%,95%,96%,97%,98%或99%氨基酸残基相同性的一个连续序列。
在另外的实施方案中,本发明的抗体可以结合多肽片段,所述多肽片段包含选自以下残基组成的氨基酸序列:SEQ ID NO:3228的M-1至C-15;D-2至L-16;D-3至K-17;S-4至K-18;T-5至R-19;E-6至E-20;R-7至E-21;E-8至M-22;Q-9至K-23;S-10至L-24;R-11至K-25;L-12至E-26;T-13至C-27;S-14至V-28;C-15至S-29;L-16至I-30;K-17至L-31;K-18至P-32;R-19至R-33;E-20至K-34;E-21至E-35;M-22至S-36;K-23至P-37;L-24至S-38;K-25至V-39;E-26至R-40;C-27至S-41;V-28至S-42;S-29至K-43;I-30至D-44;L-31至G-45;P-32至K-46;R-33至L-47;K-34至L-48;E-35至A-49;S-36至A-50;P-37至T-51;S-38至L-52;V-39至L-53;R-40至L-54;S-41至A-55;S-42至L-56;K-43至L-57;D-44至S-58;G-45至C-59;K-46至C-60;L-47至L-61;L-48至T-62;A-49至V-63;A-50至V-64;T-51至S-65;L-52至F-66;L-53至Y-67;L-54至Q-68;A-55至V-69;L-56至A-70;L-57至A-71;S-58至L-72;C-59至Q-73;C-60至G-74;L-61至D-75;T-62至L-76;V-63至A-77;V-64至S-78;S-65至L-79;F-66至R-80;Y-67至A-81;Q-68至E-82;V-69至L-83;A-70至Q-84;A-71至G-85;L-72至H-86;Q-73至H-87;G-74至A-88;D-75至E-89;L-76至K-90;A-77至L-91;S-78至P-92;L-79至A-93;R-80至G-94;A-81至A-95;E-82至G-96;L-83至A-97;Q-84至P-98;G-85至K-99;H-86至A-100;H-87至G-101;A-88至L-102;E-89至E-103;K-90至E-104;L-91至A-105;P-92至P-106;A-93至A-107;G-94至V-108;A-95至T-109;G-96至A-110;A-97至G-111;P-98至L-112;K-99至K-113;A-100至I-114;G-101至F-115;L-102至E-116;E-103至P-117;E-104至P-118;A-105至A-119; P-106至P-120;A-107至G-121;V-108至E-122;T-109至G-123;A-110至N-124;G-111至S-125;L-112至S-126;K-113至Q-127;I-114至N-128;F-115至S-129;E-116至R-130;P-117至N-131;P-118至K-132;A-119至R-133;P-120至A-134;G-121至V-135;E-122至Q-136;G-123至G-137;N-124至P-138;S-125至E-139;S-126至E-140;Q-127至T-141;N-128至V-142;S-129至T-143;R-130至Q-144;N-131至D-145;K-132至C-146;R-133至L-147;A-134至Q-148;V-135至L-149;Q-136至I-150;G-137至A-151;P-138至D-152;E-139至S-153;E-140至E-154;T-141至T-155;V-142至P-156;T-143至T-157;Q-144至I-158;D-145至Q-159;C-146至K-160;L-147至G-161;Q-148至S-162;L-149至Y-163;I-150至T-164;A-151至F-165;D-152至V-166;S-153至P-167;E-154至W-168;T-155至L-169;P-156至L-170;T-157至S-171;I-158至F-172;Q-159至K-173;K-160至R-174;G-161至G-175;S-162至S-176;Y-163至A-177;T-164至L-178;F-165至E-179;V-166至E-180;P-167至K-181;W-168至E-182;L-169至N-183;L-170至K-184;S-171至I-185;F-172至L-186;K-173至V-187;R-174至K-188;G-175至E-189;S-176至T-190;A-177至G-191;L-178至Y-192;E-179至F-193;E-180至F-194;K-181至I-195;E-182至Y-196;N-183至G-197;K-184至Q-198;I-185至V-199;L-186至L-200;V-187至Y-201;K-188至T-202;E-189至D-203;T-190至K-204;G-191至T-205;Y-192至Y-206;F-193至A-207;F-194至M-208;I-195至G-209;Y-196至H-210;G-197至L-211;Q-198至I-212;V-199至Q-213;L-200至R-214;Y-201至K-215;T-202至K-216;D-203至V-217;K-204至H-218;T-205至V-219;Y-206至F-220;A-207至G-221;M-208至D-222;G-209至E-223;H-210至L-224;L-211至S-225;I-212至L-226;Q-213至V-227;R-214至T-228;K-215至L-229;K-216至F-230;V-217至R-231;H-218至C-232;V-219至I-233;F-220至Q-234;G-221至N-235;D-222至M-236;E-223至P-237;L-224至E-238;S-225至T-239;L-226至L-240;V-227至P-241;T-228至N-242;L-229至N-243;F-230至S-244;R-231至C-245;C-232至Y-246;I-233至S-247;Q-234至A-248;N-235至G-249;M-236至I-250;P-237至A-251;E-238至K-252;T-239至L-253;L-240至E-254;P-241至E-255;N-242至G-256;N-243至D-257;S-244至E-258;C-245至L-259;Y-246至Q-260;S-247至L-261;A-248至A-262;G-249至I-263;I-250至P-264;A-251至R-265;K-252至E-266;L-253至N-267;E-254至A-268;E-255至Q-269;G-256至I-270;D-257至S-271;E-258至L-272;L-259至D-273;Q-260至G-274;L-261至D-275;A-262至V-276;I-263至T-277;P-264至F-278;R-265至F-279;E-266至G-280;N-267至A-281;A-268至L-282;Q-269至K-283;I-270至L-284;和S-271至L-285。本发明还涉及结合BLyS多肽的抗体,所述多肽包含与上述BLyS多肽的氨基酸序列具有至少80%,85%,90%,92%,95%,96%,97%,98%或99%氨基酸残基相同性的一个连续序列。
在另外的实施方案中,本发明的抗体可以结合多肽片段,所述多肽片段包含选自以下残基组成的氨基酸序列:SEQ ID NO:3229的M-1至C-15;D-2至L-16;D-3至K-17;S-4至K-18;T-5至R-19;E-6至E-20;R-7至E-21;E-8至M-22;Q-9至K-23;S-10至L-24;R-11至K-25;L-12至E-26;T-13至C-27;S-14至V-28;C-15至S-29;L-16至I-30;K-17至L-31;K-18至P-32;R-19至R-33;E-20至K-34;E-21至E-35;M-22至S-36;K-23至P-37;L-24至S-38;K-25至V-39;E-26至R-40;C-27至S-41;V-28至S-42;S-29至K-43;I-30至D-44;L-31至G-45;P-32至K-46;R-33至L-47;K-34至L-48;E-35至A-49;S-36至A-50;P-37至T-51;S-38至L-52;V-39至L-53;R-40至L-54;S-41至A-55;S-42至L-56;K-43至L-57;D-44至S-58;G-45至C-59;K-46至C-60;L-47至L-61;L-48至T-62;A-49至V-63;A-50至V-64;T-51至S-65;L-52至F-66;L-53至Y-67;L-54至Q-68;A-55至V-69;L-56至A-70;L-57至A-71;S-58至L-72;C-59至Q-73;C-60至G-74;L-61至D-75;T-62至L-76;V-63至A-77;V-64至S-78;S-65至L-79;F-66至R-80;Y-67至A-81;Q-68至E-82;V-69至L-83;A-70至Q-84;A-71至G-85;L-72至H-86;Q-73至H-87;G-74至A-88;D-75至E-89;L-76至K-90;A-77至L-91;S-78至P-92;L-79至A-93;R-80至G-94;A-81至A-95;E-82至G-96;L-83至A-97;Q-84至P-98;G-85至K-99;H-86至A-100;H-87至G-101;A-88至L-102;E-89至E-103;K-90至E-104;L-91至A-105;P-92至P-106;A-93至A-107;G-94至V-108;A-95至T-109;G-96至A-110;A-97至G-111;P-98至L-112;K-99至K-113;A-100至I-114;G-101至F-115;L-102至E-116;E-103至P-117;E-104至P-118;A-105至A-119;P-106至P-120;A-107至G-121;V-108至E-122;T-109至G-123;A-110至N-124;G-111至S-125;L-112至S-126;K-113至Q-127;I-114至N-128;F-115至S-129;E-116至R-130;P-117至N-131;P-118至K-132;A-119至R-133;P-120至A-134;G-121至V-135;E-122至Q-136;G-123至G-137;N-124至P-138;S-125至E-139;S-126至E-140;Q-127至T-141;N-128至G-142;S-129至S-143;R-130至Y-144;N-131至T-145;K-132至F-146;R-133至V-147;A-134至P-148;V-135至W-149;Q-136至L-150;G-137至L-151;P-138至S-152;E-139至F-153;E-140至K-154;T-141至R-155;G-142至G-156;S-143至S-157;Y-144至A-158;T-145至L-159;F-146至E-160;V-147至E-161;P-148至K-162;W-149至E-163;L-150至N-164;L-151至K-165;S-152至I-166;F-153至L-167;K-154至V-168;R-155至K-169;G-156至E-170;S-157至T-171;A-158至G-172;L-159至Y-173;E-160至F-174;E-161至F-175;K-162至I-176;E-163至Y-177;N-164至G-178;K-165至Q-179;I-166至V-180;L-167至L-181;V-168至Y-182;K-169至T-183;E-170至D-184;T-171至K-185;G-172至T-186;Y-173至Y-187;F-174至A-188;F-175至M-189;I-176至G-190;Y-177至H-191;G-178至L-192;Q-179至I-193;V-180至Q-194;L-181至R-195;Y-182至K-196;T-183至K-197;D-184至V-198;K-185至H-199;T-186至V-200;Y-187至F-201;A-188至G-202;M-189至D-203;G-190至E-204;H-191至L-205;L-192至S-206;I-193至L-207;0-194至V-208;R-195至T-209;K-196至L-210;K-197至F-211;V-198至R-212;H-199至C-213;V-200至I-214;F-201至Q-215;G-202至N-216;D-203至M-217;E-204至P-218;L-205至E-219;S-206至T-220;L-207至L-221;V-208至P-222;T-209至N-223;L-210至N-224;F-211至S-225;R-212至C-226;C-213至Y-227;I-214至S-228;Q-215至A-229;N-216至G-230;M-217至I-231;P-218至A-232;E-219至K-233;T-220至L-234;L-221至E-235;P-222至E-236;N-223至G-237;N-224至D-238;S-225至E-239;C-226至L-240;Y-227至Q-241;S-228至L-242;A-229至A-243;G-230至I-244;I-231至P-245;A-232至R-246;K-233至E-247;L-234至N-248;E-235至A-249;E-236至Q-250;G-237至I-251;D-238至S-252;E-239至L-253;L-240至D-254;Q-241至G-255;L-242至D-256;A-243至V-257;I-244至T-258;P-245至F-259;R-246至F-260;E-247至G-261;N-248至A-262;A-249至L-263;Q-250至K-264;I-251至L-265;和S-252至L-266。本发明还涉及结合BLyS多肽的抗体,所述多肽包含与上述BLyS多肽的氨基酸序列具有至少80%,85%,90%,92%,95%,96%,97%,98%或99%氨基酸残基相同性的一个连续序列。
在另外的实施方案中,本发明的抗体可以结合多肽片段,所述多肽片段包含选自以下残基组成的氨基酸序列:SEQ ID NO:3 8M-1至F-15;D-2至C-16;E-3至S-17;S-4至E-18;A-5至K-19;K-6至G-20;T-7至E-21;L-8至D-22;P-9至M-23;P-10至K-24;P-11至V-25;C-12至G-26;L-13至Y-27;C-14至D-28;F-15至P-29;C-16至I-30;S-17至T-31;E-18至P-32;K-19至Q-33;G-20至K-34;E-21至E-35;D-22至E-36;M-23至G-37;K-24至A-38;V-25至W-39;G-26至F-40;Y-27至G-41;D-28至I-42;P-29至C-43;I-30至R-44;T-31至D-45;P-32至G-46;Q-33至R-47;K-34至L-48;E-35至L-49;E-36至A-50;G-37至A-51;A-38至T-52;W-39至L-53;F-40至L-54;G-41至L-55;I-42至A-56;C-43至L-57;R-44至L-58;D-45至S-59;G-46至S-60;R-47至S-61;L-48至F-62;L-49至T-63;A-50至A-64;A-51至M-65;T-52至S-66;L-53至L-67;L-54至Y-68;L-55至Q-69;A-56至L-70;L-57至A-71;L-58至A-72;S-59至L-73;S-60至Q-74;S-61至A-75;F-62至D-76;T-63至L-77;A-64至M-78;M-65至N-79;S-66至L-80;L-67至R-81;Y-68至M-82;Q-69至E-83;L-70至L-84;A-71至Q-85;A-72至S-86;L-73至Y-87;Q-74至R-88;A-75至G-89;D-76至S-90;L-77至A-91;M-78至T-92;N-79至P-93;L-80至A-94;R-81至A-95;M-82至A-96;E-83至G-97;L-84至A-98;Q-85至P-99;S-86至E-100;Y-87至L-101;R-88至T-102;G-89至A-103;S-90至G-104;A-91至V-105;T-92至K-106;P-93至L-107;A-94至L-108;A-95至T-109;A-96至P-110;G-97至A-111;A-98至A-112;P-99至P-113;E-100至R-114;L-101至P-115;T-102至H-116;A-103至N-117;G-104至S-118;V-105至S-119;K-106至R-120;L-107至G-121;L-108至H-122;T-109至R-123;P-110至N-124;A-111至R-125;A-112至R-126;P-113至A-127;R-114至F-128;P-115至Q-129;H-116至G-130;N-117至P-131;S-118至E-132;S-119至E-133;R-120至T-134;G-121至E-135;H-122至Q-136;R-123至D-137;N-124至V-138;R-125至D-139;R-126至L-140;A-127至S-141;F-128至A-142;Q-129至P-143;G-130至P-144;P-131至A-145;E-132至P-146;E-133至C-147;T-134至L-148;E-135至P-149;Q-136至G-150;D-137至C-151;V-138至R-152;D-139至H-153;L-140至S-154;S-141至Q-155;A-142至H-156;P-143至D-157;P-144至D-158;A-145至N-159;P-146至G-160;C-147至M-161;L-148至N-162;P-149至L-163;G-150至R-164;C-151至N-165;R-152至I-166;H-153至I-167;S-154至Q-168;Q-155至D-169;H-156至C-170;D-157至L-171;D-158至Q-172;N-159至L-173;G-160至I-174;M-161至A-175;N-162至D-176;L-163至S-177;R-164至D-178;N-165至T-179;I-166至P-180;I-167至A-181;Q-168至L-182;D-169至E-183;C-170至E-184;L-171至K-185;Q-172至E-186;L-173至N-187;I-174至K-188;A-175至I-189;D-176至V-190;S-177至V-191;D-178至R-192;T-179至Q-193;P-180至T-194;A-181至G-195;L-182至Y-196;E-183至F-197;E-184至F-198;K-185至I-199;E-186至Y-200;N-187至S-201;K-188至Q-202;I-189至V-203;V-190至L-204;V-191至Y-205;R-192至T-206;Q-193至D-207;T-194至P-208;G-195至I-209;Y-196至F-210;F-197至A-211;F-198至M-212;I-199至G-213;Y-200至H-214;S-201至V-215;Q-202至I-216;V-203至Q-217;L-204至R-218;Y-205至K-219;T-206至K-220;D-207至V-221;P-208至H-222;I-209至V-223;F-210至F-224;A-211至G-225;M-212至D-226;G-213至E-227;H-214至L-228;V-215至S-229;I-216至L-230;Q-217至V-231;R-218至T-232;K-219至L-233;K-220至F-234;V-221至R-235;H-222至C-236;V-223至I-237;F-224至Q-238;G-225至N-239;D-226至M-240;E-227至P-241;L-228至K-242;S-229至T-243;L-230至L-244;V-231至P-245;T-232至N-246;L-233至N-247;F-234至S-248;R-235至C-249;C-236至Y-250;I-237至S-251;Q-238至A-252;N-239至G-253;M-240至I-254;P-241至A-255;K-242至R-256;T-243至L-257;L-244至E-258;P-245至E-259;N-246至G-260;N-247至D-261;S-248至E-262;C-249至I-263;Y-250至Q-264;S-251至L-265;A-252至A-266;G-253 to I-267;I-254 to P-268;A-255 to R-269;R-256 to E-270;L-257 to N-27 1;E-258 to A-272;E-259至Q-273;G-260至I-274;D-26 1至S-275;E-262至R-276;I-263至N-277;Q-264至G-278;L-265至D-279;A-266至D-280;I-267至T-281;P-268至F-282;R-269至F-283;E-270至G-284;N-27 1至A-285;A-272至L-286;Q-273至K-287;I-274至L-288;和S-275至L-289。本发明还涉及结合BLyS多肽的抗体,所述多肽包含与上述BLyS多肽的氨基酸序列具有至少80%,85%,90%,92%,95%,96%,97%,98%或99%氨基酸残基相同性的一个连续序列。
本领域普通技术人员应意识到BLyS多肽的一些氨基酸可以加以变化,而不明显影响所述多肽的结构和功能。如果序列中这种差别是预期的,应记得在所述多肽上要有决定活性的关键区域。
因此,本发明还包括结合BLyS多肽变体的抗体,所述变体示出BLyS多肽的功能活性(例如生物活性),或者包括BLyS多肽的区域,如本文所述的多肽片段。这种突变体包括根据本领域已知的一般规则选择的缺失,插入,转换,重复和模式取代,以对活性的影响较小。例如,关于怎样产生表型沉默氨基酸取代的指导见于Bowie,J.U.等(“解读蛋白质序列中的信息:对氨基酸取代的耐受”,科学247:1306-1310(1990))所述,其中作者指出有两种主要的方法研究氨基酸序列对变化的耐受。第一种方法依赖于进化过程,其中突变是通过自然选择接受或拒绝的。第二种方法是通过遗传工程在克隆的基因的特殊位置引入氨基酸变化,并通过选择或筛选以鉴别保留功能性的序列。
如作者所述,这些研究表明蛋白质令人惊奇地耐受氨基酸取代。作者还指出在所述蛋白质的一定位置允许氨基酸变化。例如,大多数隐蔽残基需要非极性侧链,而表面侧链的特征通常很少是保守的。其它这种表型沉默取代见于Bowie,J.U.等,如前所述,及本发明所引用的参考文献。脂肪族氨基酸Ala,Val,Leu和Ile的彼此转换;羟基残基Ser和Thr的相互交换,酸性残基Asp和Glu的交换,酰胺残基Asn和Gln之间的取代,碱性残基Lys和Arg之间的交换和芳香族残基Phe,Tyr之间的置换均属于典型的保守取代。
因此,本发明的抗体可以结合SEQ ID NO:3228多肽或由保藏的cDN质粒编码的多肽的片段,衍生物或类似物,如(i)其中一或多个氨基酸残基用保守或非保守的氨基酸残基取代(优选保守的氨基酸残基),而且这种取代的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的多肽;或(ii)其中一或多个氨基酸残基包括一个取代基团的多肽;或(iii)其中所述多肽的胞外结构域与另一种化合物融合的多肽,如一种提高所述多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇),或(iv)其中另外的氨基酸融合于所述多肽的胞外结构域,如一种IgG Fc融合区域肽或前导或分泌序列或用于纯化所述多肽的胞外结构域的序列或一种前体蛋白序列。
本发明的抗体可以结合SEQ ID NO:3229多肽或由保藏的cDNA质粒编码的多肽的片段,衍生物或类似物,如(i)其中一或多个氨基酸残基用保守或非保守的氨基酸残基取代(优选保守的氨基酸残基),而且这种取代的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的多肽;或(ii)其中一或多个氨基酸残基包括一个取代基团的多肽;或(iii)其中所述多肽的胞外结构域与另一种化合物融合的多肽,如一种提高所述多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇),或(iv)其中另外的氨基酸融合于所述多肽的胞外结构域,如另一种TNF配体家族成员(例如CD40配体)的可溶性生物活性片段,一种IgG Fc融合区域肽或前导或分泌序列或用于纯化所述多肽的胞外结构域的序列或一种前体蛋白序列。根据本发明教导,相信这种片段,衍生物和类似物在本领域技术人员技术范围内。
因此,本发明的抗体可以结合BLyS多肽,其包括来自自然突变或人工操纵的一或多个氨基酸取代,缺失或添加。如上所述,变化优选是较小的,如不明显影响所述蛋白质折叠或活性的保守氨基酸取代(见表13)。
表13:保守氨基酸取代
| 芳香族氨基酸疏水性氨基酸极性氨基酸碱性氨基酸酸性氨基酸小型氨基酸 | 苯丙氨酸色氨酸酪氨酸亮氨酸异亮氨酸缬氨酸谷氨酰胺天冬酰胺精氨酸赖氨酸组氨酸天冬氨酸谷氨酸丙氨酸丝氨酸苏氨酸甲硫氨酸甘氨酸 |
在本发明的一个实施方案中,本发明抗体结合的多肽包含一种BLyS多肽的氨基酸序列,所述BLyS多肽具有的氨基酸序列含有至少一个保守氨基酸取代,但不超过50个保守氨基酸取代,更优选地不超过40个保守氨基酸取代,更优选不超过30个,更优选不超过20个保守氨基酸取代。在本发明的一个实施方案中,本发明的抗体结合的多肽包含一种BLyS多肽的氨基酸序列,所述BLyS多肽具有含有至少一个保守氨基酸取代,但不超过10,9,8,7,6,5,4,3,2或1个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
例如,在BLyS的氨基酸水平的位点直接诱变可以通过用一个保守氨基酸取代置换一个特定的氨基酸进行。本发明的抗体可以结合含有SEQ ID NO:3228BLyS多肽保守取代突变的BLyS氨基酸序列,所述保守取代包括用A,G,I,L,S,T,或V置换M1;用E置换D2;用E置换D3;用A,G,I,L,T,M,或V置换S4;用A,G,I,L,S,M,或V置换T5;用D置换E6;用H,或K置换R7;用D置换E8;用N置换Q9;用A,G,I,L,T,M,或V置换S 10;用H,或K置换R11;用A,G,I,S,T,M,或V置换L12;用A,G,I,L,S,M,或V置换T13;用A,G,I,L,T,M,或V置换S14;用A,G,I,S,T,M,或V置换L16;用H,或R置换K17;用H,或R置换K18;用H,或K置换R19;用D置换E20;用D置换E21;用A,G,I,L,S,T,或V置换M22;用H,或R置换K23;用A,G,I,S,T,M,或V置换L24;用H,或R置换K25;用D置换E26;用A,G,I,L,S,T,或M置换V28;用A,G,I,L,T,M,或V置换S29;用A,G,L,S,T,M,或V置换130;用A,G,I,S,T,M,或V置换L31;用H,或K置换R33;用H,或R置换K34;用D置换E35;用A,G,I,L,T,M,或V置换S36;用A,G,I,L,T,M,或V置换S38;用A,G,I,L,S,T,或M置换V39;用H,或K置换R40;用A,G,I,L,T,M,或V置换S41;用A,G,I,L,T,M,或V置换S42;用H,或R置换K43;用E置换D44;用A,I,L,S,T,M,或V置换G45;用H,或R置换K46;用A,G,I,S,T,M,或V置换L47;用A,G,I,S,T,M,或V置换L48;用G,I,L,S,T,M,或V置换A49;用G,I,L,S,T,M,或V置换A50;用A,G,I,L,S,M,或V置换T51;用A,G,I,S,T,M,或V置换L52;用A,G,I,S,T,M,或V置换L53;用A,G,I,S,T,M,或V置换L54;用G,I,L,S,T,M,或V置换A55;用A,G,I,S,T,M,或V置换L56;用A,G,I,S,T,M,或V置换L57;用A,G,I,L,T,M,或V置换S58;用A,G,I,S,T,M,或V置换L61;用A,G,I,L,S,M,或V置换T62;用A,G,I,L,S,T,或M置换V63;用A,G,I,L,S,T,或M置换V64;用A,G,I,L,T,M,或V置换S65;用W,或Y置换F66;用F,或W置换Y67;用N置换Q68;用A,G,I,L,S,T,或M置换V69;用G,I,L,S,T,M,或V置换A70;用G,I,L,S,T,M,或V置换A71;用A,G,I,S,T,M,或V L72置换;用N置换Q73;用A,I,L,S,T,M,或V置换G74;用E置换D75;用A,G,I,S,T,M,或V置换L76;用G,I,L,S,T,M,或V置换A77;用A,G,I,L,T,M,或V置换S78;用A,G,I,S,T,M,或V置换L79;用H,或K置换R80;用G,I,L,S,T,M,或V置换A8 1;用D置换E82;用L83 A,G,I,S,T,M,或V置换;用N置换Q84;用A,I,L,S,T,M,或V置换G85;用K,或R置换H86;用K,或R置换H87;用G,I,L,S,T,M,或V置换A88;用D置换E89;用H,或R置换K90;用A,G,I,S,T,M,或V置换L9 1;用G,I,L,S,T,M,或V置换A93;用A,I,L,S,T,M,或V置换G94;用G,I,L,S,T,M,或V置换A95;用A,I,L,S,T,M,或V置换G96;用G,I,L,S,T,M,或V置换A97;用H,或R置换K99;用G,I,L,S,T,M,或V置换A100;用A,I,L,S,T,M,或V置换G101;用A,G,I,S,T,M,或V置换L102;用D置换E103;用D置换E104;用G,I,L,S,T,M,或V置换A105;用G,I,L,S,T,M,或V置换A107;用A,G,I,L,S,T,或M置换V108;用A,G,I,L,S,M,或V置换T109;用G,I,L,S,T,M,或V置换A110;用A,I,L,S,T,M,或V置换G111;用A,G,I,S,T,M,或V置换L112;用H,或R置换K113;用A,G,L,S,T,M,或V置换I114;用W,或Y置换F115;用D置换E116;用G,I,L,S,T,M,或V置换A119;用A,I,L,S,T,M,或V置换G121;用D置换E122;用A,I,L,S,T,M,或V置换G123;用Q置换N124;用A,G,I,L,T,M,或V置换S125;用A,G,I,L,T,M,或V置换S126;用N置换Q127;用Q置换N128;用A,G,I,L,T,M,或V置换S129;用H,或K置换R130;用Q置换N131;用H,或R置换K132;用H,或K置换R133;用G,I,L,S,T,M,或V置换A1 34;用A,G,I,L,S,T,或M置换V135;用N置换Q136;用A,I,L,S,T,M,或V置换G137;用D置换E139;用D置换E140;用A,G,I,L,S,M,或V置换T141;用A,G,I,L,S,T,或M置换V142;用A,G,I,L,S,M,或V置换T143;用N置换Q144;用E置换D145;用A,G,I,S,T,M,或V置换L147;用N置换Q148;用A,G,I,S,T,M,或V置换L149;用A,G,L,S,T,M,或V置换I150;用G,I,L,S,T,M,或V置换A151;用E置换D152;用置换S153;用D置换E154;用A,G,I,L,S,M,或V置换T155;用A,G,I,L,S,M,或V置换T157;用A,G,L,S,T,M,或V置换I158;用N置换Q159;用H,或R置换K160;用A,I,L,S,T,M,或V置换G161;用A,G,I,L,T,M,或V置换S162;用F,或W置换Y163;用A,G,I,L,S,M,或V置换T164;用W,或Y置换F165;用A,G,I,L,S,T,或M置换V166;用F,或Y置换W168;用A,G,I,S,T,M,或V置换L169;用A,G,I,S,T,M,或V置换L170;用A,G,I,L,T,M,或V置换S171;用W,或Y置换F172;用H,或R置换K173;用H,或K置换R174;用A,I,L,S,T,M,或V置换G175;用A,G,I,L,T,M,或V置换S176;用G,I,L,S,T,M,或V置换A177;用A,G,I,S,T,M,或V置换L178;用D置换E179;用D置换E180;用H,或R置换K181;用D置换E182;用Q置换N183;用H,或R置换K184;用A,G,L,S,T,M,或V置换I185;用A,G,I,S,T,M,或V置换L186;用A,G,I,L,S,T,或M置换V187;用H,或R置换K188;用D置换E189;用A,G,I,L,S,M,或V置换T190;用A,I,L,S,T,M,或V置换G191;用F,或W置换Y1 92;用W,或Y置换F193;用W,或Y置换F194;用A,G,L,S,T,M,或V置换I195;用F,或W置换Y196;用A,I,L,S,T,M,或V置换G197;用N置换Q198;用A,G,I,L,S,T,或M置换V199;用A,G,I,S,T,M,或V置换L200;用F,或W置换Y201;用A,G,I,L,S,M,或V置换T202;用E置换D203;用H,或R置换K204;用A,G,I,L S,M,或V置换T205;用F,或W置换Y206;用G,I,L,S,T,M,或V置换A207;用A,G,I,L,S,T,或V置换M208;用A,I,L,S,T,M,或V置换G209;用K,或R置换H210;用A,G,I,S,T,M,或V置换L211;用A,G,L,S,T,M,或V置换I212;用N置换Q213;用H,或K置换R214;用H,或R置换K215;用H,或R置换K216;用A,G,I,L,S,T,或M置换V217;用K,或R置换H218;用A,G,I,L,S,T,或M置换V219;用W,或Y置换F220;用A,I,L,S,T,M,或V置换G221;用E置换D222;用D置换E223;用A,G,I,S,T,M,或V置换L224;用A,G,I,L,T,M,或V置换S225;用A,G,I,S,T,M,或V置换L226;用A,G,I,L,S,T,或M置换V227;用A,G,I,L,S,M,或V置换T228;用A,G,I,S,T,M,或V置换L229;用W,或Y置换F230;用H,或K置换R23 1;用A,G,L,S,T,M,或V置换I233;用N置换Q234;用Q置换N235;用A,G,I,L,S,T,或V置换M236;用D置换E238;用A,G,I,L,S,M,或V置换T239;用A,G,I,S,T,M,或V置换L240;用Q置换N242;用Q置换N243;用A,G,I,L,T,M,或V置换S244;用F,或W置换Y246;用A,G,I,L,T,M,或V置换S247;用G,I,L,S,T,M,或V置换A248;用A,I,L,S,T,M,或V置换G249;用A,G,L,S,T,M,或V置换I250;用G,I,L,S,T,M,或V置换A25 1;用H,或R置换K252;用A,G,I,S,T,M,或V置换L253;用D置换E254;用D置换E255;用A,I,L,S,T,M,或V置换G256;用E置换D257;用D置换E258;用A,G,I,S,T,M,或V置换L259;用N置换Q260;用A,G,I,S,T,M,或V置换L261;用G,I,L,S,T,M,或V置换A262;用A,G,L,S,T,M,或V置换I263;用H,或K置换R265;用D置换E266;用Q置换N267;用G,I,L,S,T,M,或V置换A268;用N置换Q269;用A,G,L,S,T,M,或V置换I270;用A,G,I,L,T,M,或V置换S271;用A,G,I,S,T,M,或V置换L272;用E置换D273;用A,I,L,S,T,M,或V置换G274;用E置换D275;用A,G,I,L,S,T,或M置换V276;用A,G,I,L,S,M,或V置换T277;用W,或Y置换F278;用W,或Y置换F279;用A,I,L,S,T,M,或V置换G280;用G,I,L,S,T,M,或V置换A281;用A,G,I,S,T,M,或V置换L282;用H,或R置换K283;用A,G,I,S,T,M,或V置换L284;和/或用A,G,I,S,T,M,或V置换L285。
在另一个实施方案中,在BLyS的氨基酸水平的位点直接诱变可以通过用保守取代置换一个特定的氨基酸。本发明的抗体可以结合含有SEQ ID NO:3229多肽的保守取代突变的BLyS氨基酸序列,包括:用A,G,I,L,S,T,或V置换M1;用E置换D2;用E置换D3;用A,G,I,L,T,M,或V置换S4;用A,G,I,L,S,M,或V置换T5;用D置换E6;用H,或K置换R7;用D置换E8;用N置换Q9;用A,G,I,L,T,M,或V置换S10;用H,或K置换R11;用A,G,I,S,T,M,或V置换L12;用A,G,I,L,S,M,或V置换T13;用A,G,I,L,T,M,或V置换S14;用A,G,I,S,T,M,或V置换L16;用H,或R置换K17;用H,或R置换K18;用H,或K置换R19;用D置换E20;用D置换E21;用A,G,I,L,S,T,或V置换M22;用H,或R置换K23;用A,G,I,S,T,M,或V置换L24;用H,或R置换K25;用D置换E26;用A,G,I,L,S,T,或M置换V28;用A,G,I,L,T,M,或V置换S29;用A,G,L,S,T,M,或V置换I30;用A,G,I,S,T,M,或V置换L31;用H,或K置换R33;用H,或R置换K34;用D置换E35;用A,G,I,L,T,M,或V置换S36;用A,G,I,L,T,M,或V置换S38;用A,G,I,L,S,T,或M置换V39;用H,或K置换R40;用A,G,I,L,T,M,或V置换S41;用A,G,I,L,T,M,或V置换S42;用H,或R置换K43;用E置换D44;用A,I,L,S,T,M,或V置换G45;用H,或R置换K46;用A,G,I,S,T,M,或V置换L47;用A,G,I,S,T,M,或V置换L48;用G,I,L,S,T,M,或V置换A49;用G,I,L,S,T,M,或V置换A50;用A,G,I,L,S,M,或V置换T51;用A,G,I,S,T,M,或V置换L52;用A,G,I,S,T,M,或V置换L53;用A,G,I,S,T,M,或V置换L54;用G,I,L,S,T,M,或V置换A55;用A,G,I,S,T,M,或V置换L56;用A,G,I,S,T,M,或V置换L57;用A,G,I,L T,M,或V置换S58;用A,G,I,S,T,M,或V置换L61;用A,G,I,L,S,M,或V置换T62;用A,G,I,L,S,T,或M置换V63;用A,G,I,L,S,T,或M置换V64;用A,G,I,L,T,M,或V置换S65;用W,或Y置换F66;用F,或W置换Y67;用N置换Q68;用A,G,I,L,S,T,或M置换V69;用G,I,L,S,T,M,或V置换A70;用G,I,L,S,T,M,或V置换A71;用A,G,I,S,T,M,或V置换L72;用N置换Q73;用A,I,L,S,T,M,或V置换G74;用E置换D75;用A,G,I,S,T,M,或V置换L76;用G,I,L,S,T,M,或V置换A77;用A,G,I,L,T,M,或V置换S78;用A,G,I,S,T,M,或V置换L79;用H,或K置换R80;用G,I,L,S,T,M,或V置换A81;用D置换E82;用A,G,I,S,T,M,或V置换L83;用N置换Q84;用A,I,L,S,T,M,或V置换G85;用K,或R置换H86;用K,或R置换H87;用G,I,L,S,T,M,或V置换A88;用D置换E89;用H,或R置换K90;用A,G,I,S,T,M,或V置换L91;用G,I,L,S,T,M,或V置换A93;用A,I,L,S,T,M,或V置换G94;用G,I,L,S,T,M,或V置换A95;用A,I,L,S,T,M,或V置换G96;用G,I,L,S,T,M,或V置换A97;用H,或R置换K99;用G,I,L,S,T,M,或V置换A100;用A,I,L,S,T,M,或V置换G101;用A,G,I,S,T,M,或V置换L102;用D置换E103;用D置换E104;用G,I,L,S,T,M,或V置换A105;用G,I,L,S,T,M,或V置换A107;用A,G,I,L,S,T,或M置换V108;用A,G,I,L,S,M,或V置换T109;用G,I,L,S,T,M,或V置换A110;用A,I,L,S,T,M,或V置换G111;用A,G,I,S,T,M,或V置换L112;用H,或K置换113R;用A,G,L,S,T,M,或V置换I114;用W,或Y置换F115;用D置换E116;用G,I,L,S,T,M,或V置换A119;用A,I,L,S,T,M,或V置换G121;用D置换E122;用A,I,L,S,T,M,或V置换G123;用Q置换N124;用A,G,I,L,T,M,或V置换S125;用A,G,I,L,T,M,或V置换S126;用N置换Q127;用Q置换N128;用A,G,I,L,T,M,或V置换S129;用H,或K置换R130;用Q置换N131;用H,或R置换K132;用H,或K置换R133;用G,I,L,S,T,M,或V置换A134;用A,G,I,L,S,T,或M置换V135;用N置换Q136;用A,I,L,S,T,M,或V置换G137;用D置换E139;用D置换E140;用A,G,I,L,S,M,或V置换T141;用A,I,L,S,T,M,或V置换G142;用A,G,I,L,T,M,或V置换S143;用F,或W置换Y144;用A,G,I,L,S,M,或V置换T145;用W,或Y置换F146;用A,G,I,L,S,T,或M置换V147;用F,或Y置换W149;用A,G,I,S,T,M,或V置换L150;用A,G,I,S,T,M,或V置换L151;用A,G,I,L,T,M,或V置换S152;用W,或Y置换F153;用H,或R置换K154;用H,或K置换R155;用A,I,L,S,T,M,或V置换G156;用A,G,I,L,T,M,或V置换S157;用G,I,L,S,T,M,或V置换A158;用A,G,I,S,T,M,或V置换L159;用D置换E160;用D置换E161;用H,或R置换K162;用D置换E163;用Q置换N164;用H,或R置换K165;用A,G,L,S,T,M,或V置换I166;用A,G,I,S,T,M,或V置换L167;用A,G,I,L,S,T,或M置换V168;用H,或R置换K169;用D置换E170;用A,G,I,L,S,M,或V置换T171;用A,I,L,S,T,M,或V置换G172;用F,或W置换Y173;用W,或Y置换F174;用W,或Y置换F175;用A,G,L,S,T,M,或V置换1176;用F,或W置换Y177;用A,I,L,S,T,M,或V置换G178;用N置换Q179;用A,G,I,L,S,T,或M置换V180;用A,G,I,S,T,M,或V置换L181;用F,或W置换Y182;用A,G,I,L,S,M,或V置换T183;用E置换D184;用H,或R置换K185;用A,G,I,L,S,M,或V置换T186;用F,或W置换Y187;用G,I,L,S,T,M,或V置换A188;用A,G,I,L,S,T,或V置换M189;用A,I,L,S,T,M,或V置换G190;用K,或R置换H191;用A,G,I,S,T,M,或V置换L192;用A,G,L,S,T,M,或V置换I193;用N置换Q194;用H,或K置换R195;用H,或R置换K196;用H,或R置换K197;用A,G,I,L,S,T,或M置换V198;用K,或R置换H199;用A,G,I,L,S,T,或M置换V200;用W,或Y置换F201;用A,I,L,S,T,M,或V置换G202;用E置换D203;用D置换E204;用A,G,I,S,T,M,或V置换L205;用A,G,I,L,T,M,或V置换S206;用A,G,I,S,T,M,或V置换L207;用A,G,I,L,S,T,或M置换V208;用A,G,I,L,S,M,或V置换T209;用A,G,I,S,T,M,或V置换L210;用W,或Y置换F211;用H,或K置换R212;用A,G,L,S,T,M,或V置换I214;用N置换Q215;用Q置换N216;用A,G,I,L,S,T,或V置换M217;用D置换E219;用A,G,I,L,S,M,或V置换T220;用A,G,I,S,T,M,或V置换L221;用Q置换N223;用Q置换N224;用A,G,I,L,T,M,或V置换S225;用F,或W置换Y227;用A,G,I,L,T,M,或V置换S228;用G,I,L,S,T,M,或V置换A229;用A,I,L,S,T,M,或V置换G230;用A,G,L,S,T,M,或V置换I231;用G,I,L,S,T,M,或V置换A232;用H,或R置换K233;用A,G,I,S,T,M,或V置换L234;用D置换E235;用D置换E236;用A,I,L,S,T,M,或V置换G237;用E置换D238;用D置换E239;用A,G,I,S,T,M,或V置换L240;用N置换Q241;用A,G,I,S,T,M,或V置换L242;用G,I,L,S,T,M,或V置换A243;用A,G,L,S,T,M,或V置换I244;用H,或K置换R246;用D置换E247;用Q置换N248;用G,I,L,S,T,M,或V置换A249;用N置换Q250;用A,G,L,S,T,M,或V置换I251;用A,G,I,L,T,M,或V置换S252;用A,G,I,S,T,M,或V置换L253;用E置换D254;用A,I,L,S,T,M,或V置换G255;用E置换D256;用A,G,I,L,S,T,或M置换V257;用A,G,I,L,S,M,或V置换T258;用W,或Y置换F259;用W,或Y置换F260;用A,I,L,S,T,M,或V置换G261;用G,I,L,S,T,M,或V置换A262;用A,G,I,S,T,M,或V置换L263;用H,或R置换K264;用A,G,I,S,T,M,或V置换L265;和/或用A,G,I,S,T,M,或V置换L266。
在另一个实施方案中,在BLyS的氨基酸水平的位点直接诱变可以通过用一个保守取代置换一个特定的氨基酸。本发明的抗体可以结合含有SEQ ID NO:3230-3237任一多肽保守取代突变的BLyS氨基酸序列。
BLyS多肽中为功能所必需的氨基酸可以通过本领域已知方法鉴别,如位点直接诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,科学244:1081-1085(1989))。后一方法是在所述分子的每个氨基酸残基进行一个丙氨酸突变。然后将所得的突变分子测试其功能活性,如配体结合和刺激淋巴细胞(例如B细胞)的能力,例如刺激淋巴细胞增殖,分化和/或活化。因此,本发明的抗体可以结合BLyS多肽中为功能所必需的氨基酸。在优选的实施方案中,本发明的抗体结合BLyS多肽中为功能所必需的氨基酸并抑制BLyS多肽的功能。在其它优选的实施方案中,本发明的抗体结合BLyS多肽中为功能所必需的氨基酸并增强BLyS多肽功能。
特别感兴趣的是用其它带电的或中性的氨基酸取代带电的氨基酸,这可以使蛋白质具有高度需要的改良的特性,如减少凝集。凝集不仅导致活性降低,而且当制备药物配方时也有问题,因为凝集物可以是免疫原性的(Pinckard等,临床实验免疫学2:331-340(1967);Robbins等,糖尿病36:838-845(1987);Cleland等,治疗性药物载体系统Crit.Rev.10:307-377(1993)。
在另一个实施方案中,本发明提供了结合多肽的抗体,所述多肽具有含有SEQ ID NO:3228所示氨基酸序列非保守取代的氨基酸序列的多肽。例如,SEQ ID NO:3228所示BLyS蛋白质序列的非保守取代包括:用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换M1;用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换D2;用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换D3;用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换S4;用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换T5;用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换E6;用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换 R7;用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换E8;用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换Q9;用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换S10;用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换R11;用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换L12;用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换T13;用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换S14;用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或P置换C15;用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换L16;用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换K17;用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换K18;用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换R19;用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换E20;用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换E21;用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换M22;用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换K23;用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换L24;用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换K25;用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换E26;用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或P置换C27;用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换V28;用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换S29;用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换I30;用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换L31;用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换P32;用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换R33;用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换K34;用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换E35;用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换S36;用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换P37;用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换S38;用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换V39;R40用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S41用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S42用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K43用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;D44用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G45用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K46用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L47用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L48用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A49用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A50用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;T5 1用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L52用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L53用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L54用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A55用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L56用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L57用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S58用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;C59用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或P置换;C60用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或P置换;L61用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;T62用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;V63用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;V64用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S65用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;F66用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;Y67用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;Q68用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;V69用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A70用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A71用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L72用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Q73用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;G74用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;D75用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L76用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A77用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S78用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L79用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;R80用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A81用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E82用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L83用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Q84用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;G85用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;H86用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;H87用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A88用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E89用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K90用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L91用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;P92用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;A93用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G94用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A95用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G96用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A97用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;P98用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;K99用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A100用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G101用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L102用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E103用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E104用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A105用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;P106用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;A107用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;V108用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;T109用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A110用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G111用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L112用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K113用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;I114用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;F115用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;E116用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;P117用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;P118用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;A119用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;P120用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;G121用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E122用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G123用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;N124用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;S125用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S126用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Q127用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;N128用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;S129用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;R130用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;N131用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;K132用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;R133用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A134用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;V135用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Q136用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;G137用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;P138用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;E139用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E140用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;T141用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;V142用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;T143用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Q144用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;D145用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;C146用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或P置换;L147用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Q148用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;L149用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;I150用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A151用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;D152用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S153用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E154用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;T155用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;P156用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;T157用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;I158用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Q159用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;K160用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G161用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S162用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Y163用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;T164用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;F165用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;V166用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;P167用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;W168用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;L169用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L170用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S171用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;F172用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;K173用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;R174用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G175用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S176用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A1 77用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L178用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E179用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E180用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K181用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E182用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;N183用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;K184用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;I185用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L186用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;V187用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K188用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E189用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;T190用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G191用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Y192用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;F193用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;F194用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;I195用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Y196用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;G197用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Q198用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;V199用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L200用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Y201用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;T202用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;D203用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K204用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;T205用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Y206用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;A207用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;M208用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G209用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;H210用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L211用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;I212用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Q213用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;R214用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K215用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K216用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;V217用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;H218用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;V219用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;F220用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;G221用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;D222用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E223用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L224用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S225用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L226用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;V227用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;T228用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L229用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;F230用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;R231用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;C232用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或P置换;I233用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Q234用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;N235用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;M236用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;P237用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;E238用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;T239用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L240用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;P241用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;N242用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;N243用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;S244用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;C245用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或P置换;Y246用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;S247用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A248用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G249用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;I250用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A25 1用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K252用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L253用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E254用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E255用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G256用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;D257用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E258用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L259用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Q260用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;L261用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A262用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;I263用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;P264用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;R265用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E266用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;N267用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;A268用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Q269用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;I270用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S271用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L272用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;D273用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G274用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;D275用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;V276用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;T277用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;F278用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;F279用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;G280用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A281用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L282用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K283用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L284用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;and/或L285用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换。
在另外的实施方案中,本发明的抗体结合的BLyS多肽包含一种BLyS氨基酸序列,其中一个以上的氨基酸(例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,30和50个)是用上述取代的氨基酸置换的(保守或非保守)。
在本发明另一个实施方案中,本发明的抗体结合BLyS多肽,其具有SEQ ID NO:3229序列的非保守取代,包括:M1用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;D2用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;D3用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S4用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;T5用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E6用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;R7用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E8用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Q9用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;S10用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;R11用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L12用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;T13用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S14用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;C15用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或P;L16用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K17用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K18用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;R19用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E20用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E21用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;M22用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K23用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L24用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K25用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E26用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;C27用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或P;V28用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S29用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;I30用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L3 1用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;P32用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;R33用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K34用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E35用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S36用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;P37用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;S38用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;V39用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;R40用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S41用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S42用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K43用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;D44用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G45用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K46用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L47用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L48用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A49用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A50用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;T51用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L52用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L53用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L54用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A55用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L56用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L57用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S58用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;C59用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或P;C60用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或P;L61用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;T62用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;V63用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;V64用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S65用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;F66用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;Y67用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;Q68用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;V69用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A70用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A71用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L72用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Q73用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;G74用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;D75用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L76用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A77用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S78用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L79用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;R80用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A8 1用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E82用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L83用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Q84用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;G85用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;H86用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;H87用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A88用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E89用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K90用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L91用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;P92用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;A93用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G94用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A95用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G96用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A97用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;P98用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;K99用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A100用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G101用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L102用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E103用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E104用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A105用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;P106用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;A107用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;V108用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;T109用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A110用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G111用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L112用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K113用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;I114用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;F115用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;E116用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;P117用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;P118用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;A119用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;P120用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;G121用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E122用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G123用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;N124用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;S125用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S126用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Q127用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;N128用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;S129用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;R130用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;N131用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;K132用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;R133用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A134用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;V135用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Q136用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;G137用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;P138用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;E139用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E140用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;T141用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G142用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S143用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Y144用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;T145用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;F146用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;V147用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;P148用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;W149用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;L150用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L151用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S152用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;F153用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;K154用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;R155用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G156用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S157用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A158用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L159用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E160用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E161用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K162用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E163用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;N164用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;K165用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;I166用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L167用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;V168用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K169用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E170用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;T171用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G172用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Y173用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;F174用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;F175用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;I176用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Y177用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;G178用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Q179用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;V180用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L181用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Y182用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;T183用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;D184用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K185用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;T186用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Y187用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;A188用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;M189用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G190用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;H191用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L192用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;I193用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Q194用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;R195用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K196用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K197用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;V198用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;H199用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;V200用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;F201用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;G202用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;D203用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E204用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L205用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S206用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L207用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;V208用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;T209用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L210用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;F211用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;R212用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;C213用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或P;I214用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Q215用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;N216用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;M217用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;P218用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;E219用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;T220用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L221用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;P222用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;N223用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;N224用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;S225用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;C226用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或P;Y227用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;S228用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A229用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G230用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;I231用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A232用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K233用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L234用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E235用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E236用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G237用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;D238用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E239用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L240用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Q241用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;L242用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A243用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;I244用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;P245用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,或C置换;R246用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;E247用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;N248用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;A249用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;Q250用D,E,H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,F,W,Y,P,或C置换;I251用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;S252用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L253用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;D254用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;G255用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;D256用H,K,R,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;V257用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;T258用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;F259用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;F260用D,E,H,K,R,N,Q,A,G,I,L,S,T,M,V,P,或C置换;G261用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;A262用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L263用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;K264用D,E,A,G,I,L,S,T,M,V,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;L265用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换;和/或L266用D,E,H,K,R,N,Q,F,W,Y,P,或C置换。
在另一个实施方案中,在BLyS氨基酸水平的位点直接诱变是通过用一个非保守的取代置换一个特定的氨基酸而进行的。本发明的抗体可以结合BLyS氨基酸序列,所述序列含有SEQ ID NO:3230-3237任一多肽的非保守取代突变。
在另一个实施方案中,本发明的抗体结合的BLyS多肽包含一种BLyS氨基酸序列,其中一个以上的氨基酸(例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,30和50个)是用上述取代的氨基酸置换的(保守或非保守)。
氨基酸的置换还可以改变配体与细胞表面受体结合的选择性。例如Ostade等(自然361:266-268(1993))阐述了一些突变导致TNF-α只选择性结合两种已知类型的TNF受体中的一种。由于BLyS是TNF多肽家族的一个成员,类似于TNF-α中的那些突变在BLyS多肽中可能具有相似作用。
配体—受体结合关键的位点也可以通过结构分析确定,如结晶化,核磁共振或光亲和标记(Smith等,分子生物学杂志224:899-904(1992)和Vos等,科学255:306-312(1992))。
由于BLyS是TNF-相关的蛋白质家族的一个成员,因此突变可以在编码TNF保守结构域的氨基酸序列中进行,例如在SEQ IDNO:3228的Gly-191至Leu-284位,或SEQ ID NO:3229的Gly-172至Leu-265位,突变可以调节而不是完全消除BLyS多肽或其片段或变体的功能活性(例如生物活性)。因此,本发明的抗体可以结合TNF保守结构域中有突变的BLyS多肽。在优选的实施方案中,本发明的抗体可以结合TNF保守结构域中有突变的BLyS多肽,并作为BLyS的拮抗剂。在其它优选的实施方案中,本发明的抗体可以结合TNF保守结构域中有突变的BLyS多肽,并作为BLyS的兴奋剂。
本领域技术人员已知的重组DNA技术(例如DNA改组,如前)可以用于产生包括一或多个氨基酸取代,缺失,添加的新突变的蛋白质或突变蛋白,或融合蛋白。这种修饰的多肽可以示出例如活性增强或稳定性提高。另外,它们可以高产量纯化,并示出比相应的天然蛋白更好的溶解性,至少在一定的纯化和存储条件下。
因此,本发明还涵盖了结合具有一或多个氨基酸残基缺失,添加或取代的BLyS衍生物和类似物的抗体,以在宿主细胞中产生更适于表达,放大等的BLyS多肽。例如,半胱氨酸残基可以缺失或用另一个氨基酸残基取代以消除;硫键;N-联糖基化位点可以改变或消除以达到例如表达更易于从酵母宿主中回收和纯化的同类产物,所述位点已知为高糖基化N-联位点。因此,在本发明BLyS多肽中的任一或多个糖基化识别序列上的第一个或第三个氨基酸位或这两个位置的各种氨基酸取代,和/或在任一或多个这种识别序列的第2个位置缺失一个氨基酸,将防止BLyS在修饰的三肽序列糖基化(见例如Miyajimo等,EMBO杂志5(6):1193-1197)。非限制例如,单独将第244位的丝氨酸突变为丙氨酸,或组合将第242位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺,可以阻止成熟可溶形式的BLyS(例如SEQ IDNO:3228的134-285位氨基酸)在酵母Pichea pastoris中表达时发生糖基化。一种突变的BLyS多肽,其中只有第242位的天冬氨酸突变为谷氨酰胺,当在Pichea pastoris中表达时仍糖基化。在这个突变体中,发生糖基化归因于在第244位的O-联糖基化位点的激活或暴露。影响糖基化的类似的突变还可以在SEQ ID NO:3229所示BLyS多肽中进行,即将SEQ ID NO:3229中第223位的天冬酰胺和/或第224位的丝氨酸突变为丙氨酸。此外,可将本发明多肽的一或多个氨基酸残基(例如精氨酸和赖氨酸残基)缺失或用另一个残基取代,以消除非所需的蛋白酶解,如弗林蛋白酶或kexins。这种突变的一个可能结果是本发明的BLyS多肽不从细胞表面裂解及释放。因此,本发明的抗体可以结合具有一或多个氨基酸残基缺失,添加或取代的BLyS衍生物和类似物。在其它实施方案中,本发明的抗体可以结合不能从细胞表面裂解的BLyS衍生物,变体或类似物。
在一个特异的实施方案中,本发明的抗体结合BLyS多肽,其中SEQ ID NO:3228所示BLyS序列的Lys-132和/或Arg-133突变为另一个氨基酸残基,或一起缺失,以防止或减少可溶形式的BLyS从表达BLyS的细胞中释放。在一个更特异的实施方案中,本发明的抗体结合BLyS多肽,其中SEQ ID NO:3228所示BLyS序列的Lys-132突变为Ala-132。在另一个非排他的实施方案中,本发明抗体结合BLyS多肽,其中SEQ ID NO:3228所示BLyS序列的Arg-133突变为Ala-133。这些突变的蛋白质具有例如离体治疗或基因治疗用途,以遗传工程化使细胞表达仍保留在工程化细胞表面的BLyS多肽。
在一个特异的实施方案中,本发明的抗体结合BLyS多肽,其中其中SEQ ID NO:3228所示BLyS序列的Cys-146突变为另一个氨基酸残基,或完全缺失,例如有助于突变的BLyS多肽当在表达系统中表达时,防止或减少寡聚。在一个特异的实施方案中,本发明的抗体结合BLyS多肽,其中Cys-146用丝氨酸残基置换。
在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体结合BLyS多肽,其中SEQ ID NO:3228所示BLyS序列的Cys-232突变为另一个氨基酸残基,或完全缺失,例如有助于突变的BLyS多肽当在表达系统这表达时防止或减少寡聚。在一个特异的实施方案中,本发明的抗体结合BLyS多肽,其中Cys-232用丝氨酸残基置换。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体结合BLyS多肽,其中SEQ ID NO:3228所示BLyS序列的Cys-245突变为另一个氨基酸残基,或完全缺失,例如有助于当突变的BLyS多肽在表达系统中表达时防止或减少寡聚。在一个特异的实施方案中,本发明抗体结合BLyS多肽,其中Cys-245用丝氨酸残基置换,编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
本发明的多肽优选是以分离形式提供的,并优选是基本纯化的。一种重组产生形式的BLyS多肽可以是通过一步方法基本纯化的,例如Smith和Johnson(基因67:31-40(1988))所述。
本发明抗体结合的BLyS多肽,包括由保藏的cDNA(ATCC保藏号No.97768)编码的完整多肽,包括保藏的cDNA编码的多肽的胞内,跨膜和胞外结构域,由保藏的cDNA编码的成熟可溶的多肽,蛋白质的胞外结构域减去胞内和跨膜结构域,SEQ ID NO:3228的完整多肽,成熟可溶的SEQ ID NO:3228多肽,例如SEQ ID NO:3228的134-285位氨基酸,SEQ ID NO:3228的胞外结构域,SEQ IDNO:3228的73-285位氨基酸残基减去胞内和跨膜结构域,以及与上述那些多肽具有至少80%,85%,90%相似性,优选具有至少95%相似性,更优选具有至少96%,97%,98%或99%相似性的多肽。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
本发明抗体结合的BLyS多肽,包括由保藏的cDNA(ATCC保藏号No.203518)编码的完整多肽,包括保藏的cDNA编码的多肽的胞内,跨膜和胞外结构域,由保藏的cDNA编码的成熟可溶的多肽,蛋白质的胞外结构域减去胞内和跨膜结构域,SEQ ID NO:3229的完整多肽,成熟可溶的SEQ ID NO:3229多肽,例如SEQ IDNO:3229的134-266位氨基酸,SEQ ID NO:3229的胞外结构域,SEQID NO:3229的73-266位氨基酸残基减去胞内和跨膜结构域,以及与上述那些多肽具有至少80%,85%,90%相似性,优选具有至少95%相似性,更优选具有至少96%,97%,98%或99%相似性的多肽。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
本发明的其它抗体结合的多肽包括与保藏的cDNA(ATCC,保藏号NO.97768)编码的多肽或与SEQ ID NO:3228多肽有至少80%,或至少85%相同性,更优选至少90%或95%相同性,最优选至少96%,97%,98%或99%相同性的多肽,还包括这种多肽一部分的抗体,所述多肽一部分具有至少30个氨基酸,更优选具有至少50个氨基酸。
本发明的其它抗体结合的多肽包括与保藏的cDNA(ATCC,保藏号NO.203518)编码的多肽或与SEQ ID NO:3229多肽有至少80%,或至少85%相同性,更优选至少90%或95%相同性,最优选至少96%,97%,98%或99%相同性的多肽,还包括这种多肽一部分的抗体,所述多肽一部分具有至少30个氨基酸,更优选具有至少50个氨基酸。编码这些多肽的多核苷酸也涵盖在本发明内。
两个多肽的“相似性%”是指通过对比两个多肽的氨基酸序列产生的相似性结果,使用Bestfit程序(Wisconsin序列分析包,Version8 for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575Science Drive,Madison,WI 53711)及设置默认值确定相似性。Bestfit使用Smith和Waterman的局部同源公式(应用数学进展2:482-489,1981),以发现两个序列之间的最佳相似片段。
一个序列与参比的BLyS多肽的氨基酸序列有至少例如95%“相同性”是指所述多肽的氨基酸序列与参比序列相同,除了所述多肽可以包含每100个参比的BLyS多肽的氨基酸中最多五个氨基酸变化。换句话讲,为获得与参比序列有至少95%相同性的一个氨基酸序列,参比序列中最多5%的氨基酸残基可以缺失或用另一个氨基酸取代,或者占参比序列中总氨基酸残基数的5%的氨基酸残基可以插入参比序列中。参比序列的这些变化可以发生在参比氨基酸序列的氨基端或羧基端,或者这些末端位置之间的任何位置,单独散布于参比序列的残基之间,或在参比序列内的一或多个连续基团内。
实际上,任何特殊的多肽是否与以下序列具有至少80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%相同性,可以使用已知计算机程序常规确定,如Bestfit程序(Wisconsin序列分析包,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711),所述序列例如是SEQ ID NO:3228所示氨基酸序列,由保藏的cDNA克隆HNEDU15(ATCC登记号No.97768)编码的氨基酸序列,或其片段,或者SEQ ID NO:3229所示氨基酸序列,由保藏的cDNA克隆HDPMC52(ATCC登记号No.203518)编码的氨基酸序列,或其片段。当利用Bestfit或者其他任何序列比对程序来确定某一序列是否与本发明的参照序列具有至少,例如,95%的相同性时,需要设置好参数,从而在全长的参照氨基酸序列上计算相同性的百分比,并允许最高达参照序列的氨基酸残基总数5%的同源性缺口。
在一个特异的实施方案中,确定参比(查询)序列(本发明的序列)和一个目的序列之间的最佳全局匹配,也称全局序列比对,的一个优选的方法可以利用基于Brutlag等(计算机应用生物科学,6:237-245(1990))的算法的FASTDB计算机程序。进行DNA序列的FASTDB比对以计算百分比相同性时优选的参数为:Matrix=PAM0,k-tuple=2,Mismath Penalty=1,Joining Penalty=20,RandomizationGroup Length=0,Cutoff Score=1,Window Size=序列长度,GapPenalty=5,Gap Size Penalty=0.05,Window Size=500或者目标氨基酸序列的长度,取较短的。根据本实施方案,如果目的序列因N或C末端缺失而非由于内部缺失而比查询序列短,那么必须对结果作手工修正。这是因为FASTDB程序在计算百分比相同性时不计算目的序列N和C末端的短缺。对于目的序列相对于查询序列N和C末端的短缺,百分比相同性的修正是通过计算不匹配的位于目的序列N和C末端的查询序列的氨基酸残基数,以作为查询序列总氨基酸残基数的百分比。通过FASTDB序列比对的结果来确定一个氨基酸是否匹配。然后将此百分数从百分比相同性中减去,从而获得最终的百分比相同性结果。此最终的百分比相同性结果才可用于本实施方案。只有在目的序列N和C末端外侧的氨基酸残基不与查询序列相匹配时,才需对百分比相同性结果进行手工调节。例如,一个90个氨基酸残基的目的序列与一个100个氨基酸残基的查询序列比对以确定百分比相同性。缺失发生于目的序列的N末端,因此,FASTDB比对不显示出N末端前10个氨基酸残基的匹配。这10个不匹配的氨基酸残基相当于序列的10%(N和C末端不匹配的氨基酸残基数/查询序列中的氨基酸残基总数),因而从FASTDB程序计算的百分比相同性中减去这10%。如果剩余的90个氨基酸残基都完全匹配,那么最终的百分比相同性就是90%。再例如,一个90个氨基酸残基的目的序列与一个100个氨基酸残基的查询序列相比较。这时的缺失是内部的残基,因而目的序列的N或C末端残基没有与查询序列不匹配的。在这种情况下,FASTDB程序计算的百分比相同性不需手工修正。再强调一次,只有目的序列的N或C末端残基与查询序列不匹配的才需要手工修正。对于本实施方案不需要进行其他的手工修正。
免疫特异性结合BLyS多肽的抗体
本发明还涵盖了免疫特异性结合BLyS多肽的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),这种抗体包含scFv的所有或部分重链和/或轻链可变结构域,如表1所示。
本发明还涵盖了检测,诊断和/或预测动物体内,优选哺乳动物,最优选人体内与异常BLyS或BLyS受体表达或者不适当的BLyS或BLyS受体功能相关的疾病或功能失调的方法,包括使用免疫特异性结合BLyS的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)。可以用本发明抗体检测,诊断或预测的疾病和功能失调包括但非限于:免疫失调(例如狼疮,类风湿性关节炎,多发性硬化,重症肌无力,Hashimoto’s病,和免疫缺陷综合征),炎症(例如哮喘,过敏性疾病和类风湿性关节炎),感染性疾病(例如AIDS),和增殖性疾病(例如白血病,癌症和淋巴瘤)。
本发明还涵盖了在动物体内,优选哺乳动物及更优选人体内,预防,治疗或减轻与异常BLyS或BLyS受体表达或不适当的BLyS或BLyS受体功能相关的疾病或功能受体的方法和组合物,包括为所述动物施用有效量的免疫特异性结合BLyS的一或多种抗体(包括包含或由抗体片段或其变体组成的分子)。可以通过施用有效量的本发明抗体预防,治疗或减轻的疾病和功能失调包括但非限于免疫失调(例如狼疮,类风湿性关节炎,多发性硬化,重症肌无力,Hashimoto’s病和免疫缺陷综合征),炎症(例如哮喘,过敏性疾病和风湿性关节炎),感染性疾病(例如AIDS),和增殖性疾病(例如白血病,癌症和淋巴瘤)。
抗BLyS抗体
本发明的抗体是使用噬菌体展示方法部分揭示的。筛选在噬菌体颗粒表面展示单链抗体分子(“scFv”),以鉴别那些免疫特异性结合BLyS的抗体,包括膜结合形式和可溶形式的BLyS。本发明涵盖了经鉴别免疫特异性结合BLyS的scFv及其一部分,包括免疫特异性结合可溶形式BLyS的scFv,免疫特异性结合膜结合形式BLyS的scFv,和免疫特异性结合可溶形式和膜结合形式BLyS的scFv。特别地,本发明涵盖了包含表1所示SEQ ID NO:1-2128氨基酸序列的scFv。优选地,本发明的scFv包含SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908的氨基酸序列。所述scFv包括结合可溶性BLyS的scFv(例如包含SEQ ID NO:1563-1880的氨基酸序列的scFv),结合膜结合形式BLyS的scFv(例如包含SEQID NO:1881-2128氨基酸序列的scFv),和结合可溶形式和膜结合形式BLyS的scFv(例如包含SEQ ID NO:1-1562氨基酸序列的scFv)。免疫特异性结合BLyS的包含这些scFv的片段或变体的分子,也涵盖在本发明范围内,编码这些scFv,分子,片段和/或变体的核酸分子也涵盖在本发明内。
在本发明的一个实施方案中,免疫特异性结合BLyS的scFv包含一种多肽,所述多肽具有表1所示任一VH结构域和/或任一VL结构域的氨基酸序列。在优选的实施方案中,本发明的scFv包含来自表1所示相同scFv的VH结构域和VL结构域的氨基酸序列。在另一个实施方案中,本发明的scFv包含来自表1所示不同scFv的VH结构域和VL结构域的氨基酸序列。在另一个实施方案中,免疫特异性结合BLyS的scFv包含一种多肽,所述多肽具有表1所示任一个,两个,三个或多个VH CDR的氨基酸序列,和/或表1所示的任一个,两个,三个或多个VL CDR的氨基酸序列。在优选的实施方案中,本发明的scFv包含来自表1所示相同scFv的VH CDR和VL CDR的氨基酸序列。在另一个实施方案中,本发明的scFv包含来自表1所示不同scFv的VH CDR和VL CDR的氨基酸序列。免疫特异性结合BLyS的包含这些scFv的片段或变体的分子,也涵盖在本发明范围内,编码这些scFv,分子,片段和/或变体的核酸分子也涵盖在本发明内。(表1见于说明书后,权利要求书之前)。
在本发明的另一个实施方案中,免疫特异性结合可溶形式BLyS的一种scFv包含表1所示SEQ ID NO:1563-1880氨基酸序列。在一个优选的实施方案中,免疫特异性结合可溶形式BLyS的scFv包含SEQ ID NO:1570-1595氨基酸序列。在一个更优选的实施方案中,免疫特异性结合可溶形式BLyS的scFv包含SEQ ID NO:1563-1569氨基酸序列。
在本发明另一个实施方案中,免疫特异性结合膜结合形式BLyS的scFv包含表1所示SEQ ID NO:1881-2128氨基酸序列。在一个优选的实施方案中,免疫特异性结合膜结合形式BLyS的scFv包含SEQ ID NO:1886-1908氨基酸序列。在一个更优选的实施方案中,免疫特异性结合膜结合形式BLyS的scFv包含SEQ ID NO:1881-1885氨基酸序列。
在本发明的另一个实施方案中,免疫特异性结合可溶形式和膜结合形式BLyS的scFv包含表1所示SEQ ID NO:1-1562氨基酸序列。在一个优选的实施方案中,免疫特异性结合可溶形式和膜结合形式BLyS的scFv包含SEQ ID NO:834-872氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中,免疫特异性结合可溶形式和膜结合形式BLyS的scFv包含SEQ ID NO:1-46或321-329所示任一个氨基酸序列。免疫特异性结合可溶形式和膜结合形式BLyS的包含这些scFv的片段或变体的分子,也涵盖在本发明范围内,编码这些scFv,分子,片段和/或变体的核酸分子也涵盖在本发明内。
在本发明另一个实施方案中,免疫特异性结合可溶形式BLyS的本发明的scFv,包含一种多肽,其具有表1揭示的SEQ ID NO:1563-1880中包含的任一个VH结构域的氨基酸序列,和/或表1揭示的SEQ ID NO:1563-1880中包含的任一个VL结构域的氨基酸序列。在优选的实施方案中,免疫特异性结合可溶形式BLyS的本发明scFv,包含一种多肽,其具有表1所示相同scFv的VH CDR和VL CDR的氨基酸序列。在另一个实施方案中,免疫特异性结合可溶形式BLyS的本发明scFv,包含一种多肽,其具有表1所示不同scFv的VH CDR和VL CDR的氨基酸序列。在另一个实施方案中,免疫特异性结合可溶形式scFv包含一种多肽,其具有表1揭示的SEQ ID NO:1563-1880的任一个,两个,三个或多个VH CDR的氨基酸序列,和/或表1揭示的SEQ ID NO:1563-1880的任一个,两个,三个或多个VLCDR的氨基酸序列。在优选的实施方案中,免疫特异性结合可溶形式BLyS的本发明scFv,包含一种多肽,其具有表1所示相同scFv的VH结构域和VL结构域的氨基酸序列。在另一个实施方案中,免疫特异性结合可溶形式BLyS的本发明scFv,包含一种多肽,其具有表1所示不同scFv的VH结构域和VL结构域的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中,免疫特异性结合可溶形式scFv包含一种多肽,其具有表1揭示的SEQ ID NO:1563-1880的任一个VH CDR3的氨基酸序列,和/或表1揭示的SEQ ID NO:1563-1880的任一个VL CDR3的氨基酸序列。在优选的实施方案中,免疫特异性结合可溶形式BLyS的本发明scFv,包含一种多肽,其具有表1所示相同scFv的VH CDR和VL CDR的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中,免疫特异性结合可溶形式BLyS的本发明scFv,包含一种多肽,其具有表1所示不同scFv的VH CDR和VL CDR的氨基酸序列。免疫特异性结合BLyS,优选可溶形式BLyS的包含这些scFv的片段或变体的分子也涵盖在本发明内,编码这些scFv,分子,片段和/或变体的核酸分子也涵盖在本发明内。
在本发明另一个实施方案中,免疫特异性结合膜结合形式BLyS的本发明的scFv,包含一种多肽,其具有表1揭示的SEQ ID NO:1881-2128中包含的任一个VH结构域的氨基酸序列,和/或表1揭示的SEQ ID NO:1881-2128中包含的任一个VL结构域的氨基酸序列。在优选的实施方案中,免疫特异性结合膜结合形式BLyS的本发明scFv,包含一种多肽,其具有表1所示相同scFv的VH CDR和VLCDR的氨基酸序列。在另一个实施方案中,免疫特异性结合膜结合形式BLyS的本发明scFv,包含一种多肽,其具有表1所示不同scFv的VH CDR和VL CDR的氨基酸序列。在另一个实施方案中,免疫特异性结合膜结合形式scFv包含一种多肽,其具有表1揭示的SEQ ID NO:1881-2128的任一个,两个,三个或多个VH CDR的氨基酸序列,和/或表1揭示的SEQ ID NO:1881-2128的任一个,两个,三个或多个VL CDR的氨基酸序列。在优选的实施方案中,免疫特异性结合膜结合形式BLyS的本发明scFv,包含一种多肽,其具有表1所示相同scFv的VH结构域和VL结构域的氨基酸序列。在另一个实施方案中,免疫特异性结合膜结合形式BLyS的本发明scFv,包含一种多肽,其具有表1所示不同scFv的VH结构域和VL结构域的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中,免疫特异性结合膜结合形式scFv包含一种多肽,其具有表1揭示的SEQ ID NO:1881-2128的任一个VH CDR3的氨基酸序列,和/或表1揭示的SEQID NO:1881-2128的任一个VL CDR3的氨基酸序列。在优选的实施方案中,免疫特异性结合膜结合形式BLyS的本发明scFv,包含一种多肽,其具有表1所示相同scFv的VH CDR和VL CDR的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中,免疫特异性结合膜结合形式BLyS的本发明scFv,包含一种多肽,其具有表1所示不同scFv的VH CDR和VL CDR的氨基酸序列。免疫特异性结合BLyS,优选膜结合形式BLyS的包含这些scFv的片段或变体的分子也涵盖在本发明内,编码这些scFv,分子,片段和/或变体的核酸分子也涵盖在本发明内。
在本发明另一个实施方案中,免疫特异性结合可溶形式和膜结合形式BLyS的本发明的scFv,包含一种多肽,其具有表1揭示的SEQ ID NO:1-1562中包含的任一个VH结构域的氨基酸序列,和/或表1揭示的SEQ ID NO:1-1562中包含的任一个VL结构域的氨基酸序列。在优选的实施方案中,免疫特异性结合可溶形式和膜结合形式BLyS的本发明scFv,包含一种多肽,其具有表1所示相同scFv的VH CDR和VL CDR的氨基酸序列。 在另一个实施方案中,免疫特异性结合膜结合形式BLyS的本发明scFv,包含一种多肽,其具有表1所示不同scFv的VH CDR和VL CDR的氨基酸序列。在另一个实施方案中,免疫特异性结合可溶形式和膜结合形式scFv包含一种多肽,其具有表1揭示的SEQ ID NO:1-1562的任一个,两个,三个或多个VH CDR的氨基酸序列,和/或表1揭示的SEQ ID NO:1-1562的任一个,两个,三个或多个VL CDR的氨基酸序列。在优选的实施方案中,免疫特异性结合可溶形式和膜结合形式BLyS的本发明scFv,包含一种多肽,其具有表1所示相同scFv的VH结构域和VL结构域的氨基酸序列。在另一个实施方案中,免疫特异性结合可溶形式和膜结合形式BLyS的本发明scFv,包含一种多肽,其具有表1所示不同scFv的VH结构域和VL结构域的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中,免疫特异性结合可溶形式和膜结合形式scFv包含一种多肽,其具有表1揭示的SEQ ID NO:1-1562的任一个VH CDR3的氨基酸序列,和/或表1揭示的SEQ ID NO:1-1562的任一个VL CDR3的氨基酸序列。在优选的实施方案中,免疫特异性结合可溶形式和膜结合形式BLyS的本发明scFv,包含一种多肽,其具有表1所示相同scFv的VH CDR和VL CDR的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中,免疫特异性结合可溶形式和膜结合形式BLyS的本发明scFv,包含一种多肽,其具有表1所示不同scFv的VH CDR和VL CDR的氨基酸序列。免疫特异性结合BLyS,优选可溶形式和膜结合形式BLyS的包含这些scFv的片段或变体的分子也涵盖在本发明内,编码这些scFv,分子,片段和/或变体的核酸分子也涵盖在本发明内。
本发明提供了免疫特异性结合BLyS多肽或多肽片段的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)。特别地,本发明提供了相当于表1所示scFv的抗体,这种scFv可以常规地转变为免疫球蛋白分子,通过例如将编码scFv的VH和/或VL结构域的核苷酸序列插入含有恒定区序列的表达载体中,并工程化以指导免疫球蛋白的表达而转变,如实施例20中的详细阐述。
在一个实施方案中,本发明提供了包含一种多肽的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),其中所述多肽具有表1所示序列中包含的任一个VH结构域的氨基酸序列。本发明还提供了免疫特异性结合BLyS多肽或多肽片段的抗体,其中所述抗体包含一个多肽,所述多肽具有表1所示序列中包含的任一个,两个,三个或多个VH CDR的氨基酸序列。免疫特异性结合BLyS或BLyS片段的包含这些抗体,或抗体片段或其变体的分子,涵盖在本发明内,编码这些抗体,分子,片段和/或变体的核酸分子也涵盖在本发明内。
在本发明的一个实施方案中,免疫特异性结合BLyS的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),包含具有表1所示一个VH CDR的氨基酸序列的多肽。特别地,本发明提供了免疫特异性结合BLyS的抗体,其包含一种多肽,所述多肽具有表1揭示的SEQ ID NO:1-46,321-329,1563-1569,或1881-1885中含有的一个VH CDR1氨基酸序列。在另一个实施方案中,免疫特异性结合BLyS的抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:I-46,321-329,1563-1569,或1881-1885中包含的一个VH CDR2氨基酸序列。在一个优选的实施方案中,免疫特异性结合BLyS的抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,1563-1569,或1881-1885中包含的一个VH CDR3氨基酸序列。在又一个实施方案中,免疫特异性结合BLyS的抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:834-872,1570-1595,或1886-1908中包含的一个VH CDR1氨基酸序列;表1所示SEQ ID NO:834-872,1570-1595,或1886-1908中包含的一个VH CDR2氨基酸序列;和/或表1所示SEQ ID NO:834-872,1570-1595,或1886-1908中包含的一个VH CDR3氨基酸序列。优选地,本发明的抗体包含衍生自表1所示相同scFv的VH CDR。免疫特异性结合BLyS的包含这些抗体片段或变体的分子涵盖在本发明内,编码这些抗体,分子,片段或变体的核酸分子也涵盖在本发明内。
本发明提供免疫特异性结合BLyS多肽或多肽片段的抗体(包括包含抗体片段或变体的分子)。特别地,本发明提供了抗体,其中所述抗体包含一个VL结构域,所述VL结构域具有表1所示任一个VL结构域的氨基酸序列。本发明还提供了免疫特异性结合BLyS多肽或多肽片段的抗体,其中所述抗体包含一个VL CDR,所述VLCDR具有表1所示序列中包含的任一个,两个,三个或多个VL CDR的氨基酸序列。免疫特异性结合BLyS的包含这些抗体片段或变体的分子涵盖在本发明内,编码这些抗体,分子,片段或变体的核酸分子也涵盖在本发明内。
在本发明的一个实施方案中,免疫特异性结合BLyS的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),包含具有表1所示一个VL CDR的氨基酸序列的多肽。特别地,本发明提供了免疫特异性结合BLyS的抗体,其包含一种多肽,所述多肽具有表1揭示的SEQ ID NO:1-46,321-329,1563-1569,or 1881-1885中含有的一个VL CDR1氨基酸序列。在另一个实施方案中,免疫特异性结合BLyS的抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,1563-1569,or 1881-1885中包含的一个VL CDR2氨基酸序列。在一个优选的实施方案中,免疫特异性结合BLyS的抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,1563-1569,或1881-1885中包含的一个VL CDR3氨基酸序列。在又一个实施方案中,免疫特异性结合BLyS的抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:834-872,1570-1595,或1886-1908中包含的一个VL CDR1氨基酸序列;表1所示SEQ ID NO:834-872,1570-1595,或1886-1908中包含的一个VL CDR2氨基酸序列;和/或表1所示SEQ ID NO:834-872,1570-1595,或1886-1908中包含的一个VL CDR3氨基酸序列。优选地,本发明的抗体包含衍生自表1所示相同scFv的VL CDR。免疫特异性结合BLyS的包含这些抗体片段或变体的分子涵盖在本发明内,编码这些抗体,分子,片段或变体的核酸分子也涵盖在本发明内。
本发明还提供免疫特异性结合BLyS多肽或多肽片段的抗体(包括包含抗体片段或变体的分子),其中所述抗体包含表1所示scFv之一的一个VH结构域,组合表1所示scFv之一的一个VL结构域,或其它VL结构域。本发明还提供免疫特异性结合BLyS多肽或多肽片段的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),其中所述抗体包含表1所示scFv之一的一个VL结构域,组合表1所示scFv之一的一个VH结构域,或其它VH结构域。在一个优选的实施方案中,免疫特异性结合BLyS多肽或多肽片段的抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908包含的一个VH结构域的氨基酸序列和表1所示SEQID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908包含的一个VL结构域的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中,本发明的抗体包含来自表1所示同一scFv的一个VH和一个VL结构域。免疫特异性结合BLyS的包含这些抗体片段或其变体的分子涵盖在本发明内,编码这些抗体,分子,片段或变体的核酸分子也涵盖在本发明内。
本发明还提供了免疫特异性结合BLyS多肽或多肽片段的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),其中所述抗体包含表1所示的一个,两个,三个或多个VH CDR和表1所示的一个,两个,三个或多个VL CDR。特别地,本发明提供了免疫特异性结合BLyS多肽或多肽片段的抗体,其中所述抗体包含表1所示一个VH CDR1和一个VL CDR1,一个VH CDR1和一个VL CDR2,一个VH CDR1和一个VL CDR3,一个VH CDR2和一个VL CDR1,VH CDR2和VL CDR2,一个VH CDR2和一个VL CDR3,一个VH CDR3和一个VH CDR1,一个VH CDR3和一个VL CDR2,一个VH CDR3和一个VL CDR3,或者VH CDR和VL CDR的任意组合。在一个优选的实施方案中,一或多种这种组合来自表1揭示的相同scFv。免疫特异性结合BLyS的包含这些抗体片段或其变体的分子涵盖在本发明内,编码这些抗体,分子,片段或变体的核酸分子也涵盖在本发明内。
在一个优选的实施方案中,本发明提供了抗体,其中VH CDRX(X=1,2,或3)和VL CDRY(Y=1,2,或3)来自具有相同特异性的scFv,即来自结合可溶性BLyS的scFv,结合膜结合形式BLyS的scFv,或来自结合可溶的和膜结合形式BLyS的scFv。免疫特异性结合BLyS的包含这些抗体片段或其变体的分子涵盖在本发明内,编码这些抗体,分子,片段或变体的核酸分子也涵盖在本发明内。
本文所用术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分,即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。因此,术语“抗体”不仅涵盖了整个抗体分子,还涵盖了抗体片段,以及抗体和抗体片段的变体(包括衍生物)。本发明的抗体包括但非限于单克隆的,多特异性的,人或嵌合的抗体,单链抗体,单链Fvs(scFv),Fab片段,F(ab′)2片段,Fd片段,二硫键联的Fvs(sdFvs),抗独特型(抗-Id)抗体(包括例如本发明抗体的抗-Id抗体),和上述任何抗体的表位结合片段。本发明的免疫球蛋白分子可以是任何类型的(例如IgG,IgE,IgM,IgD,IgA和IgY),类别(例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白。本发明的抗体还包括包含一种多肽的分子,所述多肽具有SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908包含的一部分氨基酸序列的氨基酸序列。优选地,本发明抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示序列中任一序列的一个VH结构域,VH CDR,VL结构域或VL CDR的氨基酸序列。本发明的抗体还包括免疫特异性结合BLyS的包含上述抗体的片段或变体的分子。
最优选地,本发明的抗体是免疫特异性结合人BLyS的整个抗体分子或抗体片段。免疫特异性结合人BLyS的本发明的抗体片段包括但非限于上述任何Fab,Fab′和F(ab′)2,Fd片段,单链Fvs(scFv),单链抗体,二硫键联Fvs(sdFvs),包含VL结构域或VH结构域的片段,及表位结合片段。
结合BLyS的抗体片段,包括单链抗体,可以只包含可变区或组合完整或部分以下区域:绞链区,CH1,CH2,和CH3结构域。在一个优选的实施方案中,本发明的抗体包含免疫特异性结合BLyS的一种多肽,所述多肽包含表1所示的一个,两个,三个,四个,五个,六个或多个CDR,优选地,多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,or 1881-1908包含的一个VH CDR3和/或一个VL CDR3的氨基酸序列。最优选地,本发明的抗体包含来自表1所示相同scFv的一个,两个,三个,四个,五个,六个或多个CDR。本发明的抗体可以来源自任何动物,包括鸟类和哺乳动物。优选地,所述抗体是源自人,鼠(例如小鼠和大鼠),驴,绵羊,兔,山羊,豚鼠,骆驼,马或鸡。最优选地,所述抗体是人抗体。本文所用“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体,及包括分离自人免疫球蛋白文库和已经遗传工程化产生人抗体异种小鼠或其它有机体的抗体。关于产生人抗体和人单克隆抗体的技术及产生这种抗体的的详细论述见于例如PCT出版物WO98/24893;WO 92/01047;WO 96/34096;WO 96/33735;欧洲专利No.0598 877;美国专利Nos.5,413,923;5,625,126;5,633,425;5,569,825;5,661,016;5,545,806;5,814,318;5,885,793;5,916,771;和5,939,598;及Lonberg和Huszar,Int.Rev.Immunol.13:65-93(1995),上述文献以其全文在此并入参考。人抗体或“人化”嵌合抗体可以使用本文所述和本领域已知的方法产生。例如,本领域已知产生嵌合抗体的方法。参见以下以其全文并入参考的文献:Morrison,科学229:1202(1985);Oi等,生物技术4:214(1986);Cabilly等,美国专利No.4,816,567;Taniguchi等,EP 171496;Morrison等,EP 173494;Neuberger等,WO 8601533;Robinson等,WO 8702671;Boulianne等,自然312:643(1984);Neuberger等,自然314:268(1985)。另外,Abgenix公司(Freemont,CA)和Genpharm公司(San Jose,CA)可以提供直接抗选择的抗原的人抗体,使用类似于上述的方法。
本发明的抗体可以是一价,二价,三价或多价的。例如,一价的scFv可以通过化学多聚或通过与另一种蛋白质或物质缔合而多聚。融合于6组氨酸标记或Flag标记的一个scFv可以使用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)多聚,或使用抗Flag抗体(Stratagene公司)多聚。
本发明的抗体可以是单特异性,双特异性,三特异性或更多特异性的。多特异性抗体可以特异于BLyS多肽或其片段的不同表位,或即特异于BLyS多肽或其片段,又特异于一个异源表位,所述异源表位如是一种异源多肽或固体支持物。见例如PCT出版物WO93/17715;WO 92/08802;WO 9I/00360;WO 92/05793;Tutt,等,免疫学杂志147:60-69(1991);美国专利Nos.4,474,893;4,714,681;4,925,648;5,573,920;5,601,819;Kostelny等,免疫学杂志148:1547-1553(1992)。
本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),可以免疫特异性结合人BLyS(例如具有人BLyS(SEQ ID NO:3228和/或3229)的氨基酸序列的多肽)或在人单核细胞上表达的BLyS;小鼠BLyS(SEQ ID NO:3230 and/or 3231)或在小鼠单核细胞上表达的BLyS;大鼠BLyS(SEQ ID NO:3232,3233,3234 and/or 3235所示可溶形式,或膜结合形式,例如缔合在大鼠单核细胞表面);或猴BLyS(例如SEQ ID NO:3236和/或3237所示猴BLyS多肽,可溶形式的猴BLyS,或在猴单核细胞上表达的BLyS),优选地,本发明抗体免疫特异性结合人BLyS。优选地,本发明抗体免疫特异性结合人BLyS和小鼠BLyS。更优选地,本发明抗体免疫特异性结合人和猴BLyS。同样优选地,本发明抗体免疫特异性结合人BLyS和小鼠BLyS。更优选地,本发明抗体免疫特异性结合人BLyS和小鼠BLyS,及与人BLyS的亲和性比与小鼠BLyS的高。
本发明的抗体还可以用其交叉反应性加以阐述和说明。本发明包括不结合本发明多肽的任何其它类似物,直向同源物或同源物的抗体。本发明还包括结合与本发明多肽具有至少95%,90%,85%,80%,75%,70%,65%,60%,55%和至少50%相同性(使用本领域已知方法和本发明所述方法计算的)的多肽的抗体。在一个特异的实施方案中,本发明的抗体与APRIL(SEQ ID NO:3239;基因库登记号No.AF046888;实验方法杂志188(6):1185-1190;PCT国际出版物WO97/33902)交叉反应。在特异的实施方案中,本发明的抗体与人蛋白的小鼠,大鼠和/或兔同源物及其相应表位交叉反应。本发明还包括不结合与本发明多肽具有至少95%以下,90%以下,85%以下,80%以下,75%以下,70%以下,65%以下,60%以下,55%以下,和50%以下相同性(使用本领域已知单独和本发明所述方法计算的)的多肽的抗体。在特异的实施方案中,上述交叉反应性是关于本发明揭示的任一特异性抗原性或免疫原性多肽,或2,3,4,5,或多个特异性抗原性和/或免疫原性多肽的组合。本发明还包括结合由多核苷酸编码的多肽的抗体,所述多核苷酸在杂交条件下(如本发明所示)与本发明的多核苷酸杂交。
在优选的实施方案中,本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),免疫特异性结合BLyS,但与任何其它抗原不交叉反应。在更优选的实施方案中,本发明的抗体免疫特异性结合BLyS,但不与TRAIL,APRIL,Endokine-α,TNF-α,TNF-β,Fas-L或LIGHT交叉反应。
本发明还提供了一般分离的编码本发明抗体(包括包含抗体片段或其变体)的核酸分子。在一个实施方案中,本发明的核酸分子编码一种抗体,所述抗体包含具有表1所示任一VH结构域的氨基酸序列的一个VH结构域。在另一个实施方案中,本发明的核酸分子编码一种抗体,所述抗体包含表1所示任一VH CDR1的氨基酸序列的一个VH CDR1。在另一个实施方案中,本发明的核酸分子编码一种抗体,所述抗体包含表1所示任一VH CDR2的氨基酸序列的一个VH CDR2。在另一个实施方案中,本发明的核酸分子编码一种抗体,所述抗体包含表1所示任一VH CDR3的氨基酸序列的一个VH CDR3。编码免疫特异性结合BLyS并包含VH结构域和/或VHCDR的片段或变体的核酸分子也涵盖在本发明内。
在另一个实施方案中,本发明的核酸分子编码一种抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),所述抗体包含具有表1所示任一VL结构域的氨基酸序列的一个VL结构域。在另一个实施方案中,本发明的核酸分子编码一种抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),所述抗体包含具有表1所示任一VLCDR1的氨基酸序列的一个VLCDR1。在另一个实施方案中,本发明的核酸分子编码一种抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),所述抗体包含具有表1所示任一VLCDR2的氨基酸序列的一个VLCDR2。在另一个实施方案中,本发明的核酸分子编码一种抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),所述抗体包含具有表1所示任一VLCDR3的氨基酸序列的一个VLCDR3。编码免疫特异性结合BLyS并包含VL结构域和/或VL CDR的片段或变体的抗体的核酸也涵盖在本发明内。
在另一个实施方案中,本发明的核酸分子编码一种抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),所述抗体包含具有表1所示任一VH结构域的氨基酸序列的一个VH结构域和具有表1所示任一VL结构域的氨基酸序列的一个VH结构域。在另一个实施方案中,本发明的核酸分子编码一种抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),所述抗体包含具有表1所示氨基酸序列的一个VH CDR1,一个VL CDR1,一个VH CDR2,一个VL CDR2,一个VH CDR3,一个VL CDR3或其任意组合。编码免疫特异性结合BLyS并包含vL和/或VH结构域和/或一或多个VHCDR和/或一或多个VLCDR的片段或变体的抗体的核酸也涵盖在本发明内。
本发明还提供了免疫特异性结合BLyS的抗体,所述抗体包含本发明所述VH结构域,VH CDR,VL结构域和VL CDR的变体(包括衍生物)。可以使用本领域已知的标准技术在编码本发明分子的核苷酸序列中产生突变,包括例如位点直接诱变和PCR介导的诱变,这将产生氨基酸取代。优选地,所述变体(包括衍生物)编码与参照的VH结构域,VHCDR1,VHCDR2,VHCDR3,VL结构域,VLCDR1,VLCDR2,或VLCDR3相关的少于50个,40个,30个,25个,20个,15个,10个,5个,4个,3个,或少于2个的氨基酸取代。在特异的实施方案中,所述变体编码VHCDR3取代。在一个优选的实施方案中,所述变体在一或多个推定的非必需氨基酸残基上具有保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中所述氨基酸残基用具有相似电荷的侧链的氨基酸残基置换。本领域已经阐明了具有相似电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸,精氨酸和组氨酸),酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸,谷氨酸),无电荷的碱性侧链(例如甘氨酸,天冬酰胺,谷氨酰胺,丝氨酸,苏氨酸,酪氨酸,半胱氨酸),非极性侧链(例如丙氨酸,缬氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,脯氨酸,苯丙氨酸,甲硫氨酸,色氨酸),β-分支侧链氨基酸(例如苏氨酸,缬氨酸,异亮氨酸)和芳香族侧链氨基酸(例如酪氨酸,苯丙氨酸,色氨酸,组氨酸)。或者,突变可以随机在全部或部分编码序列产生,如通过饱和诱变进行,而且可以筛选所得突变体的生物活性,以鉴别保留活性的突变体(例如结合BLyS的能力)。在诱变之后,将编码的蛋白质常规表达,并可以使用本发明所述方法或本领域已知的常规形式方法确定所述编码的蛋白质的功能和/或生物活性(例如免疫特异性结合BLyS的能力)。
本发明的抗体包括修饰的衍生物(即变体),例如通过将任何类型的分子共价吸附于抗体,这样共价吸附不影响抗体免疫特异性结合BLyS的能力。非限制性例如,本发明的衍生物包括已经修饰的抗体,例如通过利用已知的保护/封阻基团进行糖基化,乙酰化,PEG化,磷酸化,酰胺化,衍生化,蛋白酶解,与细胞配体或其它蛋白质等连接等修饰。可以通过已知方法进行任何化学修饰,包括但非限于特异性化学裂解,乙酰化,甲酰化,衣霉素的代谢合成等。另外,所述衍生物可以含有一或多个非经典氨基酸。
在一个特异的实施方案中,本发明特异性结合BLyS的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)包含由一种核苷酸序列编码的氨基酸序列,所述核苷酸序列在本领域已知的严格杂交条件和高度严格杂交条件或其它杂交条件下,与互补于表1所示VH或VL结构域之一的核苷酸序列的核苷酸序列杂交,所述严格杂交条件例如是在大约45℃在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交结合滤膜的DNA,随后在大约50-65℃在0.2×SSC/0.1%SDS中冲洗一或多次,高度严格杂交条件例如是在大约45℃在6×SSC中杂交结合滤膜的核酸,随后在大约68℃在0.1×SSC/0.2%SDS中冲洗一或多次(见例如Ausubel,F.M.等编辑,1989,分子生物学通用方案,第1卷,Green Publishing Associates,Inc.和John Wiley & Sons,Inc.,New York在p6.3.1-6.3.6和2.10.3所述)。在另一个实施方案中,本发明免疫特异性结合BLyS的抗体包含一种由核苷酸序列编码的氨基酸序列,所述核苷酸序列在如上述严格杂交条件或本领域已知其它严格杂交条件下,与互补于编码VH CD3Rs之一的核苷酸序列的核苷酸序列杂交。在另一个实施方案中,本发明免疫特异性结合BLyS的抗体包含一种由核苷酸序列编码的氨基酸序列,所述核苷酸序列在如上述严格杂交条件或本领域已知其它严格杂交条件下,与互补于编码VH CDR或VL CDR之一的核苷酸序列的核苷酸序列杂交。编码这些抗体的核酸分子也涵盖在本发明内。
在另一个实施方案中,本发明免疫特异性结合BLyS的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),包含具有一种氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列与表1所示任一VH结构域具有至少35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,或至少99%相同性。在另一个实施方案中,本发明免疫特异性结合BLyS的抗体包含具有一种氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列与表1所示任一VH CDR具有至少35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,或至少99%相同性。在另一个实施方案中,本发明免疫特异性结合BLyS的抗体包含具有一种氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列与表1所示任一VH CDR3具有至少35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,或至少99%相同性。编码这些抗体的核酸分子也涵盖在本发明内。
在另一个实施方案中,本发明免疫特异性结合BLyS的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)包含具有一种氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列与表1所示任一VL结构域具有至少35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,或至少99%相同性。在另一个实施方案中,本发明免疫特异性结合BLyS的抗体包含具有一种氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列与表1所示任一VL CDR具有至少35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,或至少99%相同性。在另一个实施方案中,本发明免疫特异性结合BLyS的抗体包含具有一种氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列与表1所示任一VLCDR3具有至少35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,或至少99%相同性。编码这些抗体的核酸分子也涵盖在本发明内。
本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)也可以其与BLyS多肽或BLyS多肽的片段或变体的亲和性加以阐述或说明(例如与可溶形式BLyS和/或膜结合形式BLyS的亲和性)。在特异的实施方案中,本发明的抗体结合BLyS多肽或其片段或变体,解离常数或KD小于或等于5×10-2M,10-2M,5×10-3M,10-3M,5×10-4M,10-4M,5×10-5M,or 10-5M。更优选地,本发明的抗体结合BLyS多肽或其片段或变体,解离常数或KD小于或等于5×10-6M,10-6M,5×10-7M,10-7M,5×10-8M,或10-8M。更优选地,本发明的抗体结合BLyS多肽或其片段或变体,解离常数或KD小于或等于5×10-9M,10-9M,5×10-10M,10-10M,5×10-11M,10-11M,5×10-12M,10-12M,5×-13M,10-13M,5×10-14M,10-14M,5×10-15M,或10-15M。本发明涵盖了结合BLyS多肽的抗体,解离常数或KD在每个单独列出数值之间任一范围内。
在特异的实施方案中,本发明的抗体结合BLyS多肽或其片段或变体,解离速率(koff)小于或等于5×10-2sec-1,10-2sec-1,5×10-3sec-1或10-3sec-1。更优选地,本发明的抗体结合BLyS多肽或其片段或变体,解离速率(koff))小于或等于5×10-4sec-1,10-4sec-1,5×10-5sec-1,或10-5sec-1 5×10-6sec-1,10-6sec-1,5×10-7sec-1或10-7sec-1。本发明涵盖了结合BLyS多肽的抗体,解离速率(koff)在每个单独列出的数值之间的任一范围内。
在其它实施方案中,本发明的抗体结合BLyS多肽或其片段或变体,结合速率(kon)高于或等于103M-1sec-1,5×103M-1sec-1,104M-1sec-1或5×104M-1sec-1。更优选地,本发明的抗体结合BLyS多肽或其片段或变体,结合速率(kon)高于或等于105M-1sec-1,5×105M-1sec-1,106M-1sec-1,或5×106M-1sec-1或107M-1sec-1。本发明涵盖了结合BLyS多肽的抗体,结合速率(kon)在每个单独列出的数值之间的任一范围内。
本发明还涵盖了与本发明所述一或多种抗体具有一或多种相同生物特征的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)。“生物特征”是指所述抗体在体外或体内的活性或性质,例如结合BLyS(可溶形式BLyS,膜结合形式BLyS,可溶的和膜结合形式BLyS,和/或BLyS的抗原性和/或表位区)的能力,基本阻断BLyS/BLyS受体(例如TACI-基因库登记号AAC51790和/或BCMA-基因库登记号NP 001183)结合的能力,或者阻断BLyS介导的生物活性的能力(例如刺激B细胞增殖和免疫球蛋白产生)。任选地,本发明的抗体结合与本发明特别阐述的至少一种抗体相同的表位。这种表位结合可以常规使用本领域已知方法确定。
本发明还提供了中和BLyS或其片段的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),所述抗体包含表1所示一个scFv的一部分(即一个VH结构域,VL结构域,VH CDR1,VH CDR2,VH CDR3,VLCDR1,VL CDR2,或VL CDR3),更优选具有SEQ ID NO:834-872,1570-1595,或1886-1908中包含的氨基酸序列,更优选的是具有SEQ ID NO:1-46,321-329,1563-1569,或1881-1885这包含的氨基酸序列,或其片段或变体。“中和BLyS或其片段”的抗体是指一种抗体,其降低或消除BLyS结合其受体(例如TACI和BCMA),刺激B细胞增殖,刺激B细胞分泌免疫球蛋白,和/或刺激BLyS受体信号级联放大的能力。在一个实施方案中,中和BLyS或其片段的一种抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908中包含的一个VH结构域的氨基酸序列。在另一个实施方案中,中和BLyS或其片段的一种抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908中包含的一个VL结构域的氨基酸序列或其片段或变体。在另一个实施方案中,中和BLyS或其片段的一种抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ IDNO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908中包含的一个VH CDR的氨基酸序列或其片段或变体。在一个优选的实施方案中,中和BLyS或其片段的一种抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908中包含的一个VH CDR3的氨基酸序列或其片段或变体。在另一个实施方案中,中和BLyS或其片段的一种抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908中包含的一个VL CDR的氨基酸序列或其片段或变体。在另一个优选的实施方案中,中和BLyS或其片段的一种抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908中包含的一个VLCDR3的氨基酸序列或其片段或变体。编码这些抗体的核酸分子也涵盖在本发明内。
本发明还提供了抑制(即降低或消除)BLyS介导的B细胞增殖的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),如通过本领域抑制方法确定,例如实施例21和22中所述的方法,所述抗体包含一个scFv的一部分(例如一个VH结构域,VL结构域,VH CDR1,VHCDR2,VH CDR3,VL CDR1,VL CDR2,或VL CDR3),所述scFv具有表1所示SEQ ID NO:834-872,1570-1595,1886-1908的所示一个氨基酸序列,更优选地具有SEQ ID NO:1-46,321-329,1563-1569,1881-1885所示的一个氨基酸序列或其片段或变体。在一个实施方案中,抑制BLyS介导的B细胞增殖的抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908中包含的一个VH结构域的氨基酸序列或其片段或变体。在另一个实施方案中,抑制BLyS介导的B细胞增殖的抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908中包含的一个VL结构域的氨基酸序列或其片段或变体。在一个优选的实施方案中,抑制BLyS介导的B细胞增殖的抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908中包含的一个VH CDR3的氨基酸序列或其片段或变体。在另一个优选的实施方案中,抑制BLyS介导的B细胞增殖的抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908中包含的一个VL CDR3的氨基酸序列或其片段或变体。编码这些抗体的核酸序列也涵盖在本发明内。
本发明还提供了增强BLyS或其片段活性的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),所述抗体包含一个scFv的一部分(即一个VH结构域,VL结构域,VH CDR1,VH CDR2,VH CDR3,VLCDR1,VL CDR2,或VL CDR3),所述scFv具有表1所示SEQ IDNO:834-872,1570-1595,或1886-1908所示的一个氨基酸序列,优选具有表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,1563-1569,或1881-1885所示的一个氨基酸序列或其片段或变体。“增强BLyS或其片段”活性的抗体是指一种提高BLyS结合其受体(例如TACI或BCMA),刺激B细胞增殖,刺激B细胞分泌免疫球蛋白,和/或刺激BLyS受体信号级联放大的能力。在一个实施方案中,增强BLyS或其片段活性的抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ IDNO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908中包含的一个VH结构域的氨基酸序列或其片段或变体。在另一个实施方案中,增强BLyS或其片段活性的抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908中包含的一个VL结构域的氨基酸序列或其片段或变体。在另一个实施方案中,增强BLyS或其片段活性的抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908中包含的一个VH CDR的氨基酸序列或其片段或变体。在一个优选的实施方案中,增强BLyS或其片段活性的抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908中包含的一个VH CDR3的氨基酸序列或其片段或变体。在另一个实施方案中,增强BLyS或其片段活性的抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908中包含的一个VL CDR的氨基酸序列或其片段或变体。在另一个优选的实施方案中,增强BLyS或其片段活性的抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,或1881-1908中包含的一个VL CDR3的氨基酸序列或其片段或变体。编码这些抗体的核酸分子也涵盖在本发明内。
本发明还提供了刺激BLyS介导的B细胞增殖的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),这是通过本领域已知方法确定的,例如实施例21和22中所述方法,所述抗体包含一个scFv的一部分(例如一个VH结构域,V结构域,VH CDR1,VH CDR2,VH CDR3,VL CDR1,VL CDR2,或VL CDR3),所述scFv具有SEQ ID NO:834-872,1570-1595,或1886-1908所示的一个氨基酸序列,优选地具有SEQ ID NO:1-46,321-329,1563-1569,或1881-1885所示的一个氨基酸序列或其片段或变体。在一个实施方案中,刺激BLyS介导的B细胞增殖的一种抗体包含一种多肽,所述多肽含有表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,or 1881-1908所包含的一个VH结构域的氨基酸序列或其片段或变体。在另一个实施方案中,刺激BLyS介导的B细胞增殖的一种抗体包含一种多肽,所述多肽含有表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,or 1881-1908所包含的一个VL结构域的氨基酸序列或其片段或变体。在一个优选的实施方案中,刺激BLyS介导的B细胞增殖的一种抗体包含一种多肽,所述多肽含有表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,or 1881-1908所包含的一个VHCDR3的氨基酸序列或其片段或变体。在另一个优选的实施方案中,刺激BLyS介导的B细胞增殖的一种抗体包含一种多肽,所述多肽含有表1所示SEQ ID NO:1-46,321-329,834-872,1563-1595,or1881-1908所包含的一个VL CDR3的氨基酸序列或其片段或变体。编码这些抗体的核酸分子也涵盖在本发明内。
本发明还制备了融合蛋白,其包含免疫特异性结合BLyS的一种抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)和一个异源多肽。优选地,抗体与其融合的所述异源多肽对B细胞功能或对将所述抗体定向于B细胞是有益的。在另一个优选的实施方案中,抗体与其融合的所述异源多肽对单核细胞功能或对将所述抗体定向于单核细胞是有益的。在另一个实施方案中,抗体与其融合的所述异源多肽是白蛋白(包括但非限于重组的人血清白蛋白或其片段或变体(见例如1999年3月2日提请的美国专利No.5,876,969,欧洲专利0413622,和1998年月16日提请的美国专利No.5,766,883所述,在此将其全文并入参考))。在一个优选的实施方案中,本发明的抗体(包含抗体片段或其变体),是与成熟形式人血清白蛋白(即欧洲专利0 322094的兔1和2所示的人血清白蛋白的1-585位氨基酸,以其全文并入参考)融合的。在另一个优选的实施方案中,本发明的抗体(包含抗体片段或其变体),是与多肽片段融合的,所述多肽片段包含人血清蛋白蛋白1-x残基,其中x是1-585之间的一个整数,而且所述白蛋白片段具有人血清白蛋白活性。在另一个优选的实施方案中,本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),是与多肽片段融合的,所述多肽片段包含人血清白蛋白的1-z残基,其中z是369-419之间的一个整数,如美国专利No.5,766,883所述,在此以其全文并入参考。本发明的抗体(包括其片段或变体)可以融合于异源多肽(例如免疫球蛋白的Fc多肽或人血清白蛋白多肽)的N或C末端。
在一个实施方案中,本发明的融合蛋白包含一种多肽和一个异源多肽序列,所述多肽具有表1所示任一个VH结构域的氨基酸序列或表1所示任一个VL结构域的氨基酸序列,或它们的片段或变体。在另一个实施方案中,本发明的融合蛋白包含一种多肽和一个异源多肽序列,所述多肽具有表1所示任一个,两个,三个或多个VH CDR的氨基酸序列或表1所示任一个,两个,三个或多个VL CDR的氨基酸序列,或它们的片段或变体。在一个优选的实施方案中,所述融合蛋白包含一种多肽和一个异源多肽序列,所述多肽具有表1所示的一个VH CDR3的氨基酸序列或其片段变体,这种融合蛋白免疫特异性结合BLyS。在另一个实施方案中,融合蛋白包含一种多肽和一个异源的多肽序列,所述多肽具有表1所示至少一个VH结构域的氨基酸序列和表1所示至少一个VL结构域的氨基酸序列,或它们的片段或变体。优选地,融合蛋白的VH和VL结构域相当于表1所示相同scFv。在另一个实施方案中,本发明的融合蛋白包含一种多肽和一个异源多肽序列,所述多肽具有表1所示的任一个,两个,三个或多个VH CDR的氨基酸序列及表1所示任一个,两个,三个或多个VL CDR的氨基酸序列,或它们的片段或变体。优选地,两个,三个,四个,五个,六个或多个VHCDR(s)或VLCDR(s)相当于表1所示相同的scFv。编码这些融合蛋白的核酸分子也涵盖在本发明内。
本发明还提供了:免疫特异性结合可溶形式BLyS的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子);免疫特异性结合膜结合形式BLyS的抗体;和免疫特异性结合可溶形式和膜结合形式BLyS的抗体。
在本发明的一个实施方案中,免疫特异性结合可溶形式BLyS的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1563-1880中包含的任一个或多个VH结构域的氨基酸序列和/或表1所示SEQ ID NO:1563-1880中包含的任一个或多个VL结构域的氨基酸序列,或它们的片段或变体(包括衍生物)。优选地,所述抗体的VH结构域和VL结构域相当于表1所示相同scFv。在另一个实施方案中,提供了免疫特异性结合可溶形式BLyS的抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1563-1880中包含的任一个,两个,三个或多个VH CDR的氨基酸序列,和/或表1所示SEQ ID NO:1563-1880中包含的任一个,两个,三个或多个VL CDR的氨基酸序列,或它们的片段或变体。优选地,所述抗体的两个,三个,四个,五个,六个或多个VH和VL CDR相当于表1所示相同scFv。在一个优选的实施方案中,提供了免疫特异性结合可溶形式BLyS的抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1563-1880中包含的任一个或多个VH CDR3的氨基酸序列和/或表1所示SEQ ID NO:1563-1880中包含的任一个或多个VL CDR3的氨基酸序列,或它们的片段或变体。优选地,所述抗体的VH CDR3和VLCDR3相当于表1所示相同scFv。编码这些抗体的核酸序列也包含在本发明内。
在本发明的另一个实施方案中,提供了免疫特异性结合膜结合形式BLyS的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1881-2128中包含的任一个或多个VH结构域的氨基酸序列和/或表1所示SEQID NO:1881-2128中包含的任一个或多个VL结构域的氨基酸序列,或它们的片段或变体(包括衍生物)。优选地,所述抗体的VH结构域和VL结构域相当于表1所示相同scFv。在另一个实施方案中,提供了免疫特异性结合膜结合形式BLyS的抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1881-2128中包含的任一个,两个,三个或多个VH CDR的氨基酸序列,和/或表1所示SEQ ID NO:1881-2128中包含的任一个,两个,三个或多个VL CDR的氨基酸序列,或它们的片段或变体。优选地,所述抗体的两个,三个,四个,五个,六个或多个VH和VL CDR相当于表1所示相同scFv。在一个优选的实施方案中,提供了免疫特异性结合膜结合形式BLyS的抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1881-2128中包含的任一个或多个VH CDR3的氨基酸序列和/或表1所示SEQ ID NO:1881-2128中包含的任一个或多个VL CDR3的氨基酸序列,或它们的片段或变体。优选地,所述抗体的VH CDR3和VL CDR3相当于表1所示相同scFv。编码这些抗体的核酸序列也包含在本发明内。
在本发明的另一个实施方案中,提供了免疫特异性结合可溶形式和膜结合形式BLyS的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-1562中包含的任一个或多个VH结构域的氨基酸序列和/或表1所示SEQ ID NO:1-1562中包含的任一个或多个VL结构域的氨基酸序列,或它们的片段或变体(包括衍生物)。优选地,所述抗体的VH结构域和VL结构域相当于表1所示相同scFv。在另一个实施方案中,提供了免疫特异性结合可溶形式和膜结合形式BLyS的抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-1562中包含的任一个,两个,三个或多个VH CDR的氨基酸序列,和/或表1所示SEQID NO:1-1562中包含的任一个,两个,三个或多个VL CDR的氨基酸序列,或它们的片段或变体。优选地,所述抗体的两个,三个,四个,五个,六个或多个VH和VL CDR相当于表1所示相同scFv。在一个优选的实施方案中,提供了免疫特异性结合可溶形式和膜结合形式BLyS的抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-1562中包含的任一个或多个VH CDR3的氨基酸序列和/或表1所示SEQ ID NO:1-1562中包含的任一个或多个VLCDR3的氨基酸序列,或它们的片段或变体。优选地,所述抗体的VH CDR3和VL CDR3相当于表1所示相同scFv。
本发明还提供了免疫特异性结合BLyS的抗体混合物(包括包含抗体片段或其变体的scFv和其它分子),其中所述混合物具有本发明的至少一个,两个,三个,四个,五个或多个不同的抗体。特别地,本发明提供了免疫特异性结合可溶形式BLyS,膜结合形式BLyS和/或可溶形式和膜结合形式BLyS的不同抗体的混合物。在特异的实施方案中,本发明提供了免疫特异性结合BLyS的至少2个,优选至少4,6,8,10,12,15,20,或至少25个不同抗体的混合物,其中所述混合物的至少1,2,4,6,或10个抗体是本发明抗体。在一个特异的实施方案中,混合物的每个抗体均是本发明抗体。
本发明还提供了免疫特异性结合BLyS的一组抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv和其它分子),其中所述一组抗体具有本发明的至少一个,两个,三个,四个,五个或多个不同抗体。特别地,本发明提供了免疫特异性结合可溶形式BLyS,膜结合形式BLyS和/或可溶形式和膜结合形式BLyS的不同抗体组。在特异的实施方案中,本发明提供了对BLyS具有不同亲和性,不同特异性,或具有不同解离速度的抗体组。本发明提供了具有至少10,优选至少25,50,75,100,125,150,175,200,250,300,350,400,450,500,550,600,650,700,750,800,850,900,950或至少1000个抗体的抗体组。抗体组例如可用于96孔平板中进行分析,如进行ELISAs。
本发明还提供了组合物,所述组合物包含一或多种抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv和其它分子)。在一个实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1563-1880中包含的任一或多个VH结构域的氨基酸序列,或其变体。在另一个实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1563-1880中包含的任一或多个VH CDR1的氨基酸序列,或其变体。在另一个实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1563-1880中包含的任一或多个VH CDR2的氨基酸序列,或其变体。在一个优选的实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQID NO:1563-1880中包含的任一或多个VH CDR3的氨基酸序列,或其变体。
本发明还提供了组合物,所述组合物包含一或多种抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv和其它分子)。在一个实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1881-2128中包含的任一或多个VH结构域的氨基酸序列,或其变体。在另一个实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1881-2128中包含的任一或多个VH CDR1的氨基酸序列,或其变体。在另一个实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1881-2128中包含的任一或多个VH CDR2的氨基酸序列,或其变体。在一个优选的实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1881-2128中包含的任一或多个VH CDR3的氨基酸序列,或其变体。
本发明还提供了组合物,所述组合物包含一或多种抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv和其它分子)。在一个实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-1562中包含的任一或多个VH结构域的氨基酸序列,或其变体。在另一个实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-1562中包含的任一或多个VH CDR1的氨基酸序列,或其变体。在另一个实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-1562中包含的任一或多个VH CDR2的氨基酸序列,或其变体。在一个优选的实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-1562中包含的任一或多个VH CDR3的氨基酸序列,或其变体。
以下列出了提供包含一或多种抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv和其它分子)的组合物的其它实施方案。在一个实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1563-1880中包含的任一或多个VL结构域的氨基酸序列,或其变体。在另一个实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1563-1880中包含的任一或多个VL CDR1的氨基酸序列,或其变体。在另一个实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1563-1880中包含的任一或多个VL CDR2的氨基酸序列,或其变体。在一个优选的实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1563-1880中包含的任一或多个VL CDR3的氨基酸序列,或其变体。
以下列出了本发明提供包含一或多种抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv和其它分子)的组合物的其它实施方案。在一个实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1881-2128中包含的任一或多个VL结构域的氨基酸序列,或其变体。在另一个实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1881-2128中包含的任一或多个VL CDR1的氨基酸序列,或其变体。在另一个实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQID NO:1881-2128中包含的任一或多个VL CDR2的氨基酸序列,或其变体。在一个优选的实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1881-2128中包含的任一或多个VL CDR3的氨基酸序列,或其变体。
以下列出了提供包含一或多种抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv和其它分子)的组合物的其它实施方案。在一个实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-1562中包含的任一或多个VL结构域的氨基酸序列,或其变体。在另一个实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-1562中包含的任一或多个VL CDR1的氨基酸序列,或其变体。在另一个实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-1562中包含的任一或多个VL CDR2的氨基酸序列,或其变体。在一个优选的实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示SEQ ID NO:1-1562中包含的任一或多个VL CDR3的氨基酸序列,或其变体。
在一个优选的实施方案中,本发明的组合物包含一,二,三,四,五或多种抗体,所述抗体包含一种多肽,所述多肽具有表1所示任一个或多个VH结构域的氨基酸序列或其变体,和表1所示任一个或多个VL结构域的氨基酸序列或其变体,其中VH和VL结构域来自具有相同特异性的scFv(即来自结合可溶形式的scFv(SEQ IDNO:1563-1880),来自结合膜结合形式BLyS的scFv(SEQ ID 1881-2128),或来自结合可溶和膜结合形式scFv(SEQ ID NO:1-1562))。在一个优选的实施方案中,本发明提供了抗体,其中VH CDRX(其中X=1,2,或3)和VL CDRY(其中Y=1,2,或3)来自具有相同特异性的scFv((即来自结合可溶形式的scFv(SEQ ID NO:1563-1880),来自结合膜结合形式BLyS的scFv(SEQ ID 1881-2128),或来自结合可溶和膜结合形式scFv(SEQ ID NO:1-1562))。在另一个实施方案中,本发明的组合物包含一或多个融合蛋白。
如以下更详细的阐述,本发明的组合物可以单独使用或与其它组合物组合使用。所述抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv和其它分子)还可进一步在N或C末端重组融合于一个异源多肽,或者化学缀合(包括共价和非共价缀合)于多肽或其它组合物。例如,本发明的抗体可以重组融合或缀合于在检测分析中用作标记的分子,及效应器分子如异源多肽,药物,放射性核素,或毒素。见例如PCT出版物WO 92/08495;WO 91/14438;WO 89/12624;美国专利No.5,314,995;和EP 396,387所述。
本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv和其它分子)可以用于例如但非限于纯化和检测BLyS,及将本发明的多肽定向于表达膜结合BLyS或BLyS受体的细胞,包括在体外和体内诊断和治疗方法。例如所述抗体已经用于免疫分析中,以定量和定性测定生物饮品中BLyS的水平。见例如Harlow等,抗体:实验室指导(冷泉港实验室出版社,第二版,1988)(在此以其全文并入参考)。
生产抗体的方法
本发明的抗体(包括包含本发明抗体片段或变体的scFv和其它分子)可以通过本领域已知的合成抗体的任何方法产生,尤其是通过化学合成或优选地通过重组表达方法。
表1所示的单链Fvs是使用本领域已知的噬菌体展示方法产生的。另外,免疫特异性结合BLyS的其它scFv可以使用本领域已知的噬菌体展示方法产生。在噬菌体展示方法中,功能性抗体结构域由携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒展示在噬菌体颗粒表面。特别地,编码VH和VL结构域的DNA序列是从动物的cDNA文库(例如人或小鼠的淋巴组织cDNA文库)或合成的cDNA文库中扩增的。将编码VH和VL结构域的DNA通过一个scFv接头通过PCR连接在一起,并克隆入一个噬菌粒载体中(例如pCANTAB 6或pComb 3 HSS)。将所述载体电穿孔入大肠杆菌中,并用辅助噬菌体感染所述大肠杆菌。用于这些方法中的噬菌体典型地是包括fD和M13的丝状噬菌体,而且VH和VL结构域通常重组融合于噬菌体基因III或基因VIII之一。表达结合相应抗原(即BLyS或其片段)的抗原结合结构域的噬菌体,可以用抗原选择或鉴别,例如使用标记的抗原或结合或捕获于固体表面或珠的抗原。可以用于生产本发明抗体的噬菌体展示方法例如包括但非限于Brinkman等(免疫学方法杂志182:41-50(1995)),Ames等(免疫学方法杂志184:177-186(1995)),Kettleborough等(欧洲免疫学杂志24:952-958(1994))Persic等(基因187 9-18(1997))Burton等(免疫学进展57:191-280(1994))PCT申请No.PCT/GB91/O1 134;PCT出版物WO 90/02809;WO91/10737;WO 92/01047;WO 92/18619;WO 93/1 1236;WO 95/15982;WO 95/20401;WO97/1 3844;和美国专利Nos.5,698,426;5,223,409;5,403,484;5,580,717;5,427,908;5,750,753;5,821,047;5,571,698;5,427,908;5,516,637;5,780,225;5,658,727;5,733,743和5,969,108所述;所述文献在此均以其全文并入参考。
如上述参考文献所述,在噬菌体选择后,可以分离来自噬菌体的抗体编码区,并用于产生整个抗体,包括人抗体,或任何其他所需的抗原结合片段,并在任何所需宿主中表达,包括哺乳动物细胞,昆虫细胞,植物细胞,酵母,和细菌,例如以下所述。 也可以使用本领域已知方法重组产生Fab,Fab′和F(ab′)2片段的方法,如PCT出版物WO 92/22324;Mullinax等(生物技术12(6):864-869(1992));Sawai等(AJRI 34:26-34(1995));and Better等(科学240:1041-1043(1988))所述(所述参考文献以其全文并入参考)。
为产生全抗体,可以使用PCR引物在scFv克隆中扩增VH或VL序列,所述PCR引物包括VH或VL核苷酸序列,一个限制位点,和一个侧翼序列以保护限制位点。使用本领域已知克隆方法,可以将PCR扩增的VH结构域克隆入表达VH恒定区(例如人γ4恒定区)的载体中,而且PCR扩增的VL结构域可以克隆入表达VL恒定区(例如人κ或λ恒定区)的载体中。优选地,表达VH或VL结构域的载体包含一个适于在选择的表达系统中指导重链和轻链表达的启动子,一个分泌信号,一个针对免疫球蛋白可变区,免疫球蛋白恒定区的克隆位点,和一个选择标记如新霉素。所述VH和VL结构域还可以克隆入一个表达必需恒定区的载体中。然后使用本领域技术人员已知方法,将重链转化载体和轻链转化载体共同转染入细胞系中,以产生表达全长抗体(例如IgG)的稳定或瞬时细胞系。
表达包含本发明svFvs的VH和VL结构域的抗体的细胞系,已经保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中,日期如表2所示,ATCC保藏号如表2所示。ATCC位于美国弗吉尼亚马纳萨斯大学道20110-2209,邮编10801。ATCC保藏物是根据针对专利程序的的微生物保藏物国际认可的布达佩斯条约保藏的。
| 细胞系 | 相应的scFv | SEQ IDNO: | ATCC保藏号 | ATCC保藏日期 |
| NSO-B11-15 | I050B11-15 | 24 | PTA-3238 | 2001年3月27日 |
| NSO-抗-BLyS-6D08-18 | I006D08 | 2 | PTA-3239 | 2001年3月27日 |
| NSO-抗-BLyS-116A01-60 | I116A01 | 327 | PTA-3240 | 2001年3月27日 |
| IO26C04K | I026C04-K | 1563 | PTA-3241 | 2001年3月27日 |
| IO50A12 | I050A12 | 12 | PTA-3242 | 2001年3月27日 |
| IO50-B11 | I050B11 | 9 | PTA-3243 | 2001年3月27日 |
因此,在一个实施方案中,本发明提供了包含本发明scFv的VH和VL结构域的抗体。
在一个优选的实施方案中,本发明的抗体是由细胞系NSO-B11-15表达的抗体。
在一个优选的实施方案中,本发明的抗体是由细胞系NSO-抗-BLyS-6D08-18表达的抗体。
在一个优选的实施方案中,本发明的抗体是由细胞系NSO-抗-BLyS-116A01-60表达的抗体。
在一个优选的实施方案中,本发明的抗体是由细胞系IO26C04K表达的抗体。
在一个优选的实施方案中,本发明的抗体是由细胞系IO50A12表达的抗体。
在一个优选的实施方案中,本发明的抗体是由细胞系NSO-B11表达的抗体。
在其他优选实施方案中,本发明提供了抗体,其竞争性抑制一种包含表1所示scFv的一个片段(例如VH结构域,VL结构域,VHCDR1,VHCDR2,VHCDR3,VLCDR1,VLCDR2,或VLCDR3)或其变体的抗体与BlyS多肽结合。在一个优选的实施方案中,本发明提供了抗体,其在一个竞争性抑制分析中使一种包含表1所示scFv的一个片段(例如VH结构域,VL结构域,VHCDR1,VHCDR2,VHCDR3,VLCDR1,VLCDR2,或VLCDR3)或其变体的抗体与BlyS多肽的结合降低1%-10%。在一个优选的实施方案中,本发明提供了抗体,其在一个竞争性抑制分析中使一种包含表1所示scFv的一个片段(例如VH结构域,VL结构域,VHCDR1,VHCDR2,VHCDR3,VLCDR1,VLCDR2,或VLCDR3)或其变体的抗体与BLyS多肽的结合降低1%-10%。
在一个优选的实施方案中,本发明提供了抗体,其在一个竞争性抑制分析中使一种包含表1所示scFv的一个片段(例如VH结构域,VL结构域,VHCDR1,VHCDR2,VHCDR3,VLCDR1,VLCDR2,或VLCDR3)或其变体的抗体与BlyS多肽的结合降低至少10%-接近20%。
本发明提供了抗体,其在一个竞争性抑制分析中使一种包含表1所示scFv的一个片段(例如VH结构域,VL结构域,VHCDR1,VHCDR2,VHCDR3,VLCDR1,VLCDR2,或VLCDR3)或其变体的抗体与BlyS多肽的结合降低至少20%-接近30%。
本发明提供了抗体,其在一个竞争性抑制分析中使一种包含表1所示scFv的一个片段(例如VH结构域,VL结构域,VHCDR1,VHCDR2,VHCDR3,VLCDR1,VLCDR2,或VLCDR3)或其变体的抗体与BlyS多肽的结合降低至少30%-接近40%。
本发明提供了抗体,其在一个竞争性抑制分析中使一种包含表1所示scFv的一个片段(例如VH结构域,VL结构域,VHCDR1,VHCDR2,VHCDR3,VLCDR1,VLCDR2,或VLCDR3)或其变体的抗体与BlyS多肽的结合降低至少40%-接近50%。
本发明提供了抗体,其在一个竞争性抑制分析中使一种包含表1所示scFv的一个片段(例如VH结构域,VL结构域,VHCDR1,VHCDR2,VHCDR3,VLCDR1,VLCDR2,或VLCDR3)或其变体的抗体与BlyS多肽的结合降低至少50%-接近60%。
本发明提供了抗体,其在一个竞争性抑制分析中使一种包含表1所示scFv的一个片段(例如VH结构域,VL结构域,VHCDR1,VHCDR2,VHCDR3,VLCDR1,VLCDR2,或VLCDR3)或其变体的抗体与BlyS多肽的结合降低至少60%-接近70%。
本发明提供了抗体,其在一个竞争性抑制分析中使一种包含表1所示scFv的一个片段(例如VH结构域,VL结构域,VHCDR1,VHCDR2,VHCDR3,VLCDR1,VLCDR2,或VLCDR3)或其变体的抗体与BlyS多肽的结合降低至少70%-接近80%。
本发明提供了抗体,其在一个竞争性抑制分析中使一种包含表1所示scFv的一个片段(例如VH结构域,VL结构域,VHCDR1,VHCDR2,VHCDR3,VLCDR1,VLCDR2,或VLCDR3)或其变体的抗体与BlyS多肽的结合降低至少80%-接近90%。
本发明提供了抗体,其在一个竞争性抑制分析中使一种包含表1所示scFv的一个片段(例如VH结构域,VL结构域,VHCDR1,VHCDR2,VHCDR3,VLCDR1,VLCDR2,或VLCDR3)或其变体的抗体与BlyS多肽的结合降低90%-接近100%。
在其他优选的实施方案中,本发明提供了抗体,其竞争性抑制由ATCC保藏号为PTA-3238的细胞系产生的抗体与BLyS多肽的结合。
在其他优选的实施方案中,本发明提供了抗体,其竞争性抑制由ATCC保藏号为PTA-3239的细胞系产生的抗体与BLyS多肽的结合。
在其他优选的实施方案中,本发明提供了抗体,其竞争性抑制由ATCC保藏号为PTA-3240的细胞系产生的抗体与BLyS多肽的结合。
在其他优选的实施方案中,本发明提供了抗体,其竞争性抑制由ATCC保藏号为PTA-3241的细胞系产生的抗体与BLyS多肽的结合。
在其他优选的实施方案中,本发明提供了抗体,其竞争性抑制由ATCC保藏号为PTA-3242的细胞系产生的抗体与BLyS多肽的结合。
在其他优选的实施方案中,本发明提供了抗体,其竞争性抑制由ATCC保藏号为PTA-3243的细胞系产生的抗体与BLyS多肽的结合。
针对一些应用,包括在人体内使用抗体和在体外检测分析中,优选使用人抗体或嵌合抗体。完全的人抗体是特别适于治疗人患者。也见于美国专利Nos.4,444,887 and 4,716,111;和PCT出版物WO98/46645,WO 98/50433,WO 98/24893,WO98/16654,WO 96/34096,WO 96/33735,和WO 91/10741所述;所述文献均以其全文并入参考。在一个特异的实施方案中,本发明的抗体包含相当于本发明人scFv的一或多个VH和VL结构域和来自另外的免疫球蛋白分子优选人免疫球蛋白分子的框架区。在一个特异的实施方案中,本发明的抗体包含相当于本发明人scFv的一或多个CDR,和来自另外的免疫球蛋白分子优选人免疫球蛋白分子的框架区。在其他实施方案中,本发明的抗体包含相当于表1所示一或多个人scFv或其片段或变体的1,2,3,4,5,6或多个VL CDR或VH CDR,及来自人免疫球蛋白分子的框架区(及任选地,CDR不衍生自表1中的scFv)。在一个优选的实施方案中,本发明的抗体包含相当于表1所示相同或不同scFv或其片段或变体的VH CDR3,VL CDR3或这二者,及来自人免疫球蛋白的框架区。
嵌合抗体是一种分子,其中抗体的不同部分衍生自不同的免疫球蛋白分子,如抗体具有衍生自人抗体的可变区和非人免疫球蛋白恒定区。本领域已知产生嵌合抗体的方法。见例如Morrison,科学229:1202(1985);Oi等,生物技术4:214(1986);Gillies等,免疫学方法杂志125:191-202(1989);美国专利Nos.5,807,715;4,816,567;和4,816,397,所述文献在此均以全文并入参考。可以使用本领域已知的各种方法产生嵌合抗体,所示嵌合抗体包含来自人的一或多个CDR和来自非人免疫球蛋白分子的框架区(例如来自犬或猫免疫球蛋白分子的框架区),所述方法包括例如CDR-移植(EP 239,400;PCT出版物WO 91/09967;美国专利Nos.5,225,539;5,530,101;和5,585,089),镶盖或再涂层(EP 592,106;EP 519,596;Padlan,分子免疫学28(4/5):489-498(1991);Studnicka等,蛋白质工程7(6):805-814(1994);Roguska等,PNAS 91:969-973(1994)),及链改组(美国专利No.5,565,332)。在一个优选的实施方案中,嵌合抗体包含具有表1所示任一个VH CDR3或VL CDR3的氨基酸序列或其片段或变体的一个人CDR3,和不同于表1所示相应scFv中那些框架的非人框架区或人框架区。通常地,框架区中的框架残基用来自CDR供体抗体的相应残基取代,以改变优选改良抗原结合。这些框架取代是通过本领域熟知方法鉴别的,例如通过模拟所述CDR与框架残基之间的相互作用,以鉴别对抗原结合具有重要性的框架残基,并进行序列对比以鉴别在特殊位置不寻常的框架残基。(见例如Queen等,美国专利No.5,585,089;Riechmann等,自然332:323(1988),以其全文并入参考)。
另外,使用本领域熟知的方法,本发明的抗体可以用于产生“模拟”BLyS多肽的抗独特型抗体(见例如Greenspan & Bona,FASEB杂志7(5):437-444(1993);和Nissinoff,免疫学杂志147(8):2429-2438(1991))。例如,结合BLyS并且竞争性抑制BLyS与其受体结合(通过本领域熟知的方法测定的,如前述)的本发明的抗体,可以用于产生“模拟”BLyS配体/受体结合结构域,从而结合并中和BLyS受体(例如TACI,BCMA,和TR20)的抗独特型抗体。这种中和的抗独特型抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子,如这种抗独特型的Fab片段),可以用于治疗方案中以中和BLyS。例如这种抗独特型抗体可以用于结合BLyS配体/受体,并从而阻断BLyS介导的生物活性。或者,“模拟”BLyS结合结构域的抗独特型抗体可以结合BLyS受体,并诱导BLyS受体介导的信号化(例如激活的T细胞的核因子(NF-AT),细胞核因子κB(NF-κB)和/或AP-1的活化)。这种兴奋性抗独特型抗体(包括这些抗独特型抗体的兴奋性Fab片段)可以用于治疗方案中以产生或增强BLyS受体介导的信号化。例如,这种抗独特型抗体可以用于结合BLyS配体/受体,并从而刺激BLyS介导的生物活性(例如B细胞增殖和/或免疫球蛋白产生)。
诱导本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)一经化学合成或重组表达,其可以通过本领域已知的纯化免疫球蛋白分子或更一般地纯化蛋白质分子的任何方法纯化,例如通过层析(例如离子层析,亲和性,尤其通过在蛋白质A之后针对特异性抗原亲和性层析,和大小排阻层析),离心,不同的溶解性,或通过纯化蛋白质的任何其他标准技术纯化。另外,本发明的抗体可以融合于本发明所述的或本领域已知的其他异源多肽,以易于纯化。
编码抗体的多核苷酸
本发明提供了多核苷酸,其包含编码本发明抗体(包括包含抗体分子或其片段)的核苷酸序列。本发明还涵盖了在如前所述的高度严格杂交条件下,或在中等严格杂交条件下,或在较低严格杂交条件下,与互补于核酸的多核苷酸杂交,所述核酸具有编码本发明抗体或其片段或变体的多核苷酸序列。
通过本领域已知的任何方法可以获得所述多核苷酸,及确定所述多核苷酸的核苷酸序列。由于所述scFv抗体和VH结构域,VL结构域及其CDR的氨基酸序列是已知的(如表1所示),因此可以使用本领域熟知的方法确定编码这些抗体的核苷酸序列,即装配已知编码特定氨基酸的所述核苷酸密码子,以此产生编码所述抗体的核酸。这种编码抗体的多核苷酸可以从化学合成的寡核苷酸中装配(例如.Kutmeier等,生物技术17:242(1994)所述),简而言之,包括合成含有编码抗体的序列一部分的重叠寡核苷酸,退火并连接这些寡核苷酸,然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
或者,编码抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)的多核苷酸,可以从来自适当源料的核酸中产生。如果不能获得含有编码特殊抗体的核酸的克隆,但已知抗体分子的序列,可以通过化学合成编码免疫球蛋白的核酸,或得自适当的来源(例如来自表达所述抗体的任何组织或细胞的抗体cDNA文库,或产生自其中的cDNA文库,或分离自其中的核酸,优选聚A+RNA,所述组织或细胞如是选择的表达本发明抗体的杂交瘤细胞),使用可杂交所述序列3’和5’末端的合成引物通过PCR进行扩增,或通过使用特异于特殊基因序列的寡核苷酸探针克隆,以鉴别例如来自编码所述抗体的cDNA文库的严格cDNA克隆。通过PCR产生的扩增的核酸然后可以使用本领域熟知的方法克隆入可复制的克隆载体中。
一旦确定了抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)的核苷酸序列,所述抗体的核苷酸序列可以使用本领域熟知的操纵核苷酸序列的方法操纵,例如重组DNA技术,位点直接诱变,PCR等(见例如Sambrook等,1990,分子克隆实验指导,第二版,冷泉港实验室,冷泉港NY和Ausubel等编辑,1998,分子生物学通用方法,JohnWiley & Sons,NY,所述文献以其全文并入参考),以产生具有不同氨基酸序列的抗体,例如产生氨基酸确定,缺失和/或插入。
在一个特异的实施方案中,将表1所示一或多个VH和VL结构域或其片段或变体,使用本领域已知的重组DNA技术插入框架区内。在一个特异的实施方案中,使用本领域已知的重组DNA技术,将表1所示的一,二,三,四,五,六或多个CDR插入框架区内。所述框架区可以是天然存在的或共有的框架区,而且优选人框架区(见例如Chothia等,分子生物学杂志278:457-479(1998)列出了人框架区,其内容全文并入参考)。优选地,通过重组框架区和CDR产生的多核苷酸编码特异性结合BLyS的一种抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)。优选地,如前所述,编码具有一或多个氨基酸取代的抗体的变体或抗体片段的多核苷酸,可以在框架区内产生,而且优选地,所述氨基酸取代增强所述抗体与其抗原的结合。另外,使用这种方法可以产生一或多个可变区半胱氨酸残基的氨基酸取代或缺失,所述半胱氨酸残基参与链内二硫键合,以产生缺失一或多个链内二硫键抗体分子,或抗体片段或变体。本发明还涵盖了所述多核苷酸的其他变化,这些在本领域技术范围内。
抗体的重组表达
重组表达本发明抗体(包括包含抗体片段或其变体(例如本发明抗体的重链或轻链或其一部分,或本发明单链抗体)的svFvs和其他分子)),需要构建含有编码所述抗体的多核苷酸的表达载体。一旦获得编码抗体分子(例如全抗体,抗体的重链或轻链,或其一部分(优选地但非必需含有重链或轻链可变结构域))的多核苷酸,产生抗体分子的载体可以通过本领域熟知的重组DNA技术生产。因此,本发明阐述了通过表达含有抗体编码核苷酸序列的多核苷酸制备蛋白质的方法。可以使用本领域熟知的方法构建表达载体,所述表达载体含有抗体编码序列和适当的转录和翻译控制信号。这些方法包括例如体外重组DNA技术,合成技术,和体内遗传重组。本发明因此提供了可复制的载体,所述载体包含编码本发明抗体分子(例如全抗体,抗体的重链或轻链,抗体的重链或轻链可变结构域,或其一部分,重链或轻链CDR,单链Fv,或其片段或变体)的核苷酸序列,可操纵地连接于一个启动子。这种载体可以包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(见例如PCT出版物WO 86/05807;PCT出版物WO 89/01036;和美国专利No.5,122,464,其内容全文并入参考),而且所述抗体的可变结构域可以克隆入这种载体中,以表达全部重链,全部轻链或全部的重链和轻链。
通过常规技术将表达载体移至一个宿主细胞中,然后通过常规技术培养转染的细胞,以产生本发明的抗体。因此,本发明包括含有编码本发明抗体(例如全抗体,抗体的重链或轻链,或其一部分,单链抗体,或其片段或变体)的多核苷酸的宿主细胞,所述多核苷酸可操纵地连接一个异源启动子。在一个优选的实施方案中,为表达完整抗体分子,编码重链和轻链的载体可以在所述宿主细胞中共表达,以表达完整免疫球蛋白分子,如下所述。
可以使用各种宿主表达载体系统表达本发明的抗体分子。这种宿主表达系统作为媒介,通过其可以产生相应的编码序列并随后纯化,但也作为细胞,其当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时,原位表达本发明的抗体分子。这些宿主表达系统包括但非限于微生物如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA,质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌,B.subtilis);用含有抗体编码序列的酵母表达载体转化的酵母(例如Saccharomyces,Pichia);用含有抗体编码序列的重组的病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系;用含有抗体编码序列的重组的病毒病毒载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV;烟草花叶病毒TMV)感染的植物细胞系,或用含有抗体编码序列重组的质粒表达载体(例如
质粒)转化的植物细胞系;或携带重组表达构建体的哺乳动物细胞系,所述构建体含有衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子),或衍生自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子;痘苗病毒7.5K启动子)。优选地,细菌细胞如大肠杆菌,及更优选地尤其表达整个重组抗体分子的真核细胞,用于表达重组抗体分子。例如,哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO),缀合来自人巨细胞病毒的主要中等早期基因启动子,是一种抗体的有效表达系统(Foecking等,基因45:101(1986);Cockett等,生物/技术8:2(1990))。
在细菌系统中,可以根据针对表达的抗体分子的使用,选择一些表达载体。例如,当产生大量这种蛋白质时,为产生抗体分子的药物组合物,需要指导易于纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体。这种载体包括但非限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等,EMBO杂志2:1791(1983)),其中所述抗体编码序列可以单独连接于载体具有lacZ编码区的框架内,以便产生融合蛋白;pIN载体(Inouye& Inouye,核酸研究13:3101-3109(1985);Van Heeke & Schuster,生物化学杂志24:5503-5509(1989))等。PGEX载体也可以用于将外源多肽表达为具有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常地,这种融合蛋白是可溶的,而且易于从裂解的细胞中纯化,通过吸附并结合于谷胱甘肽琼脂糖珠,随后在存在游离谷胱甘肽的情况下洗脱。所述pGEX载体设计为包含凝血酶或因子Xa蛋白酶解位点,以便克隆的靶基因产物可以从GST组分中释出。
在一个昆虫系统中,苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)可以用作表达外源基因的载体。所述病毒在草地夜蛾细胞中生长。抗体编码序列可以单独克隆入病毒的非必需区域(例如多角蛋白基因),并在AcNPV启动子(例如多角蛋白启动子)的控制下放置。
在哺乳动物宿主细胞中,可以利用许多基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况中,相应的抗体编码序列可以连接于一个腺病毒转录/翻译控制复合物,例如晚期启动子和三重引导序列。这个嵌合的基因然后可以通过体外或体内重组插入腺病毒基因组。在病毒基因组的一个非必需区域中(例如E1或E3区)的插入,将产生重组的病毒,其能在感染的宿主中表达所述抗体分子(例如参见Logan & Shenk,美国科学院院报81:355-359(1984))。特异性起始信号也可以是有效翻译插入的抗体编码序列所需的。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。另外,所述起始密码子必需具有所需编码序列的读框,以保证全部插入体的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是各种来源的,天然的和合成的。表达效力可以通过包含适当的增强因子,转录终止子等而加强(见例如Bittner等,酶学中的方法153:51-544(1987))。
另外,可以选择以所需特异方式调节插入序列表达或修饰和加工基因产物的宿主细胞菌株。这种对蛋白质产物的修饰(例如糖基化)和加工(例如裂解)对所述蛋白质的功能是重要的。不同的宿主细胞具有特有的和特异的翻译后加工和修饰蛋白质和基因产物的机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统,以保证正确修饰和加工表达的外源蛋白。为此,可以使用具有适当加工原始转录物,糖基化和磷酸化基因产物的真核宿主细胞。这种哺乳动物宿主细胞包括但非限于CHO,VERY,BHK,Hela,COS,NSO,MDCK,293,3T3,W138,尤其乳腺癌细胞系如BT483,Hs578T,HTB2,BT2O和T47D,及正常乳腺细胞系如CRL7O3O和HsS78Bst。
为长期高产量生产重组的蛋白质,优选适当的表达。例如可以将稳定表达所述抗体的细胞系工程化。除了使用含有病毒复制起源的表达载体之外,宿主细胞可以用由适当表达控制元件(例如启动子,增强子,序列转录终止子,多聚腺苷酸化稳定等)控制的DNA,和一个可选择标记转化。在导入外源DNA后,可以使工程化的细胞在富集培养基中生长1-2天,然后转变为选择性培养基。重组质粒中可选择标记授予对选择的抗性,并使细胞稳定地将所述质粒整合入其染色体中,并生长形成转化灶,然后将所述转化灶克隆及扩展入细胞系中。这个方法可用于工程化表达抗体分子的细胞系。这种工程化细胞系可特别用于筛选和评价与所述抗体分子直接或间接相互作用的组合物。
可以使用许多筛选系统,包括但非限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等,细胞11:223(1977)),次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska& Szybalski,美国科学院院报48:202(1992)),和腺苷磷酸核糖转移酶(Lowy等,细胞22:8 17(1980))基因,可以分别用于tk-,hgprt-或aprt-细胞中。同样,抗代谢物抗性可以用作选择以下基因的基础:dhfr,其授予对氨甲蝶呤抗性(Wigler等,美国科学院院报77:357(1980);O′Hare等,美国科学院院报78:1527(1981));gpt,其授予对霉酚酸抗性(Mulligan & Berg,美国科学院院报78:2072(1981));neo,其授予对氨基糖苷G-418抗性(临床药理学12:488-505;Wu和Wu,生物治疗3:87-95(1991);Tolstoshev,药物毒性分析研究32:573-596(1993);Mulligan,科学260:926-932(1993);及Morgan和Anderson,生物化学分析研究62:191-217(1993);TIB TECH 11(5):155-215(May,1993));及hygro,其授予对潮霉素抗性(Santerre等,基因30:147(1984))。可以常规使用本领域已知的重组DNA技术,选择所需的重组克隆,这种方法见例如Ausubel等(编辑),分子生物学通用方法,John Wiley & Sons,NY(1993);Kriegler,基因转移和表达实验指导,Stockton出版社NY(1990);及Dracopoli等(编辑),人类遗传学通用方法,第12和13章,John Wiley & Sons,NY(1994);Colberre-Garapin等,分子生物学杂志150:1(1981),以其全文并入参考。
抗体分子的表达水平可以通过载体扩增而提高(参见Bebbington和Hentschel,在DNA克隆中,使用基于基因扩增的载体在哺乳动物细胞中表达克隆的基因,第3卷(科学出版社,纽约,1987))。当表达抗体的载体系统中的一个标记是可扩增的时,宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平提高,将提高标记基因的拷贝数。由于扩增的区域是与抗体的编码序列相关,因此抗体的产生也将增加(Crouse等,分子细胞生物学3:257(1983))。
所述宿主细胞可以用本发明的两种表达载体共同转染,第一种载体编码重链衍生的多肽,第二种载体编码轻链衍生的载体。这两种载体可以含有相同的可选择标记,其能相同表达重链和轻链多肽。或者,可以使用编码而且能表达重链和轻链多肽的一个载体。在这种情况中,轻链优选置于重链之前,以避免毒性游离重链过量(Proudfoot,自然322:52(1986);Kohler,美国科学院院报77:2 197(1980))。重链和轻链的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。
本发明的抗体分子一经通过重组表达产生,可以通过本领域已知的纯化免疫球蛋白分子的方法纯化,或更普通地,使用纯化蛋白质的方法纯化,例如通过层析(例如离子交换,亲和性,特别是通过在蛋白质A后对特异性抗原的亲和性,及大小排阻层析),离心,不同的溶解性,或通过纯化蛋白质的任何其他标准方法。另外,本发明的抗体可以融合于本发明所述或本领域已知的其他异源多肽序列以易于纯化。
抗体鉴定
本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv及其他分子),可以通过各种方式鉴定。特别地,可以分析本发明的抗体及相关分子免疫特异性结合BLyS或BLyS片段(例如可溶形式或膜结合形式BLyS) 的能力,使用本发明所述的方法或本领域已知的常规修饰技术。可由本发明的组合物免疫特异性结合的BLyS或BLyS片段,包括但非限于人BLyS(SEQ ID NO:3228和/或3229)或在人单核细胞上表达的BLyS;小鼠BLyS(SEQ ID NO:3230和/或3231)或在小鼠单核细胞上表达的BLyS;大鼠BLyS(可溶形式的SEQ IDNO:3232,3233,3234和/或3235,或膜结合形式的,例如结合在大鼠单核细胞表面);或猴BLyS(例如猴BLyS多肽SEQ ID NO:3236和/或3237,可溶形式的BLyS,或在猴单核细胞上表达的BLyS)或其片段。优选地,本发明的组合物结合人BLyS(SEQ ID NO:3228和/或3229)或其片段。分析本发明抗体免疫特异性结合BLyS或其片段的能力,可以在溶液(例如Houghten,生物/技术13:412-421(1992)),珠(例如Lam,自然354:82-84(1991)),芯片(例如Fodor,自然364:555-556(1993)),细菌(例如美国专利No.5,223,409),孢子(例如美国专利Nos.5,571,698;5,403,484;和5,223,409),质粒(例如Cull等,美国科学院院报89:1865-1869(1992))或在噬菌体(例如Scott和Smith,科学249:386-390(1990);Devlin,科学249:404-406(1990);Cwirla等,美国科学院院报87:6378-6382(1990);及Felici,分子生物学杂志222:301-310(1991))中进行(所述文献均以全文并入参考)。经过鉴别的免疫特异性结合BLyS或其片段的抗体继而可以使用本发明所述的或本领域已知的常规修饰技术分析其对BLyS或其片段的特异性和亲和性。
可以通过本领域已知的任何方法,分析本发明的抗体免疫特异性结合BlyS的能力及与其他抗原的交叉反应性。特别地,抗体免疫特异性结合可溶形式或膜结合形式BLyS的能力,及所述抗体,其片段或变体对来自特定种属(例如小鼠,猴或人,优选人)的BLyS的特异性,可以使用本发明所述的或本领域已知的常规修饰的方法确定。
可用于分析免疫特异性结合和交叉反应性的免疫分析,包括但非限于竞争性和非竞争性分析系统,使用如Western印迹,放射免疫分析,ELISA(酶联免疫吸附测定),“夹心”免疫分析,免疫沉淀分析,沉淀反应,凝胶扩散沉淀反应,免疫扩散分析,凝集分析,补体固定分析,免疫放射分析,荧光免疫分析,和蛋白A免疫分析等,在此只例举了一部分分析方法。这种分析是本领域常规使用并熟知的(见例如Ausubel等编辑1994,分子生物学通用方法,第1卷,John Wiley & Sons公司,纽约,在此以其全文并入参考)。以下简要阐述了免疫分析(非限制性)。
免疫沉淀方法通常包括在裂解缓冲液中裂解一群细胞,所述裂解缓冲液如是RIPA缓冲液(1%NP-40或Triton X-100,1%脱氧胆酸钠,0.1%SDS,0.15 M
,0.01 M磷酸钠pH 7.2,l%Trasylol),补加了蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如EDTA,PMSF,抑酶肽,钒酸钠),将相应抗体加入细胞裂解物中,在40℃温育一段时间(例如1-4小时),在所述细胞裂解物中加入蛋白A和/或蛋白G琼脂糖珠,在40℃温育大约1或多个小时,在裂解缓冲液中冲洗此珠,并将此珠再悬浮于SDS/样品缓冲液中。相应抗体免疫沉淀一种特殊抗原的能力可以通过例如Western印迹分析测定。本领域技术人员可以对已知参数加以修改,以提高抗体与抗原的结合并降低背景(例如用琼脂糖珠预先清洁细胞裂解物)。关于免疫沉淀方法的进一步阐述见例如Ausubel等编辑,1994,分子生物学通用方法,第1卷,John Wiley & Sons公司,纽约,在10.16.1章。
Western印迹分析一般包括制备蛋白质样品,将所述蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳(例如,根据所述抗原的分子量采用8%-20%SDS-PAGE),将来自聚丙烯酰胺凝胶的蛋白质样品移至一个膜上,如硝基纤维素膜,PVDF或尼龙膜上,在封阻溶液中将此膜封阻(例如含有3%BSA或脱脂奶粉的PBS),在冲洗缓冲液(例如PBS-Tween 20)冲洗此膜,用在封阻溶液中稀释的第一抗体(相应抗体)封阻此膜,在冲洗缓冲液中冲洗此膜,用在封阻溶液中稀释的第二种抗体(其识别初级抗体,例如抗人抗体)封阻此膜,所述第二种抗体缀合于酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(例如32P或125I),将此膜在冲洗缓冲液中冲洗,并检测抗原的存在情况。本领域技术人员应熟知对参数加以修改,以提高信号检测并降低背景干扰。关于Western印迹的进一步阐述见例如Ausubel等编辑,1994,分子生物学通用方法,第1卷,John Wiley& Sons公司,纽约,在10.8.1章节。
ELISAs包括制备抗原,用所述抗原包被一个96孔微滴定平板的孔,冲去未结合孔的抗原,在所述孔中加入缀合于一种可检测化合物如酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的相应抗体,并温育一段时间,冲洗去未结合的抗体或非特异性结合的抗体,并检测特异性结合包被孔的抗原的抗体的存在情况。在ELISAs中,本发明的抗体不用缀合于可检测化合物;取而代之,将缀合于可检测化合物的第二种抗体(其识别相应抗体)加入所述孔中。另外,不用所述抗原包被孔,而是用抗体包被孔。在这种情况中,可检测分子可以是缀合可检测化合物如酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的抗原。本领域技术人员应熟知对参数加以修改以提高信号检测,以及本领域已知的其他ELISAs变化方式。关于ELISAs的进一步阐述见例如Ausubel等编辑,1994,分子生物学通用方法,第1卷,John Wiley & Sons公司,纽约,在11.2.1章节。
抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv或其他分子)与抗原的结合亲和性,和抗体—抗原相互作用的off-rate,可以通过竞争性结合分析测定。竞争性结合分析的一个实例是放射免疫分析,包括用相应抗体在未标记抗原数量增加的情况下,温育标记的抗原 (例如用3H或125I标记),并检测结合标记的抗原的抗体。本发明抗体对BLyS的亲和性及结合off-rates,可以通过Scatchard印迹分析的数据中确定。用第二种抗体的竞争还可以使用放射免疫分析测定。在这种情况中,BLyS在未标记的第二种抗BLyS抗体数量增加的情况下,用缀合于标记的化合物(例如3H或125I标记)的本发明抗体温育。
在一个优选的实施方案中,使用BIAcore动力学分析确定抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv和其他分子)与BLyS的结合和off rates。BIAcore动力学分析包括分析BLyS从在其表面具有固定的抗体的芯片中的结合和解离,详见于实施例6,12,17和18所述。
也可以对本发明抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv和其他分子)抑制,提高或不明显改变BLyS与其受体结合(例如TACI和BCMA)的能力进行分析,使用本领域已知的方法。例如,可以将表达BLyS受体的细胞(例如IM9,REH,ARH-77细胞,Namalwa,和RPMI-8226 B细胞肿瘤细胞系以及外周CD20+B细胞),在抗体存在或不存在的情况下与BLyS接触,可以测定所述抗体的抑制,提高或不明显改变BLyS与细胞结合的能力,例如通过流式细胞术或闪烁计数分析。BLyS或所述抗体可以用可检测化合物标记,如放射性标记(例如32P,35S,和125I)或荧光标记(例如异硫氰酸荧光素,罗丹明,藻红蛋白,藻青蛋白,别藻蓝蛋白,σ-邻苯二醛和荧光胺),以能检测BLyS与其受体和/或BLys与本发明抗体之间的相互作用。或者,本发明抗体抑制,提高或不明显改变BLyS与其受体结合的能力,可以在无细胞分析中确定。例如,可以将天然或重组的BLyS(例如具有SEQ ID NO:3228的134-285位氨基酸序列)或其变体与抗体接触,以确定所述抗体抑制,提高或不明显改变BLyS与其受体结合的能力。优选地,所述抗体固定于固体支持物的表面,而且BLyS或其片段用一种可检测化合物标记。或者,BLyS或其片段固定于固体支持物,而且所述抗体用一种可检测化合物标记。BLyS可以是部分或完全纯化的(例如部分或完全没有其他多肽)或部分细胞裂解物。另外,所述BLyS多肽可以是融合蛋白,其包含BLyS或其生物活性部分,和一个结构域如免疫球蛋白Fc或谷胱甘肽-S-转移酶。例如TACI的1-154位氨基酸残基(基因库登记号AAC51790),或BCMA的1-48氨基酸残基(基因库登记号NP 001183),可以融合于IgG分子的Fc区域,并用于无细胞分析中,以确定本发明抗体抑制,提高或不明显改变BLyS与其受体结合的能力。或者,BLyS可以使用本领域熟知的方法生物素酰化(例如生物素酰化试剂盒,Pierce Chemicals;Rockford,IL)。
也可以使用本领域已知的方法,分析本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv或其他分子)抑制,刺激或不明显改变BLyS诱导的B细胞增殖的能力。例如,B细胞增殖可以通过3H-胸苷掺入分析和台盼蓝细胞计数测定(见例如Moore等,科学285:260-263(1999))。另外,可以使用本领域已知方法,分析本发明的抗体或其片段或变体阻断,刺激或不明显改变BLyS诱导的细胞信号分子的激活和转录因子如钙调节剂和亲环蛋白配体(“CAML”),钙调磷酸酶,激活的T细胞转录因子的核因子(“NF-AT”),核因子-κB(“NF-κB”),和AP-1的活化(见例如Bulow和Bram,科学278:138-141(1997))。例如,NF-AT活性可以通过电迁移凝胶移位分析,通过检测已知由NF-AT调节的蛋白质的表达(例如IL-2表达),通过检测报告基因的诱导(例如可操纵地连接于编码可检测标记的核酸的NF-AT调节因子,所述可检测标记如是荧光素酶,β-半乳糖苷酶或氯霉素乙酰转移酶(CAT)),或通过检测细胞应答(例如细胞分化,或细胞增殖)而确定。
还可以分析本发明的抗体或其片段或变体中和,增强或不明显改变BLyS活性的能力。例如,抗体或其片段或变体,可以常规测试其抑制BLyS结合表达BLyS受体的细胞的能力(见实施例3)。
选择和筛选免疫特异性结合可溶性BLyS的抗体
可以在多种分析中筛选本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv和其他分子),以鉴别那些免疫特异性结合可溶形式BLyS的抗体。在一个特殊的分析中,在溶液中结合生物素酰化的可溶形式BLyS的抗体捕获在链亲和素包被的磁珠上。这个分析可以相关地用于鉴别中和和/或结合BLyS的本发明抗体。另外,可以在本发明所述的中和分析中或在本领域已知的其他方法中分析抗体(见实施例3)。例如,可以测试抗体抑制可溶的BLyS(例如生物素酰化的BLyS)结合IM9细胞的能力。在这个分析中,将标记的可溶的BLyS(例如生物素酰化的BLyS)用候选的抗BLyS抗体孵育,以形成BLyS-抗BLyS抗体复合物。在孵育后,将等分的BLyS-抗BLyS抗体样品加入IM9细胞中。可溶的BLyS的结合可以使用本领域已知方法测定。例如,生物素酰化的BLyS与IM9细胞的结合可以使用荧光计检测,随后加入链亲和素6。生物素酰化的BLyS,如果未被中和BLyS的抗体结合,可结合于细胞并被检测。据此,可降低结合IM9细胞的bio-BLyS数量的抗体(相对于对照样品,其中BLyS已经用一种不相关的抗体或根本不用抗体孵育)即可鉴别为结合并中和可溶形式的BlyS的抗体。在另一个分析中,使用ELISAs筛选结合生物素酰化的可溶的BLyS,但不结合膜结合形式BLyS(例如来自U937细胞膜上的BLyS)的那些抗体(见实施例2和9)。在这些分析中,将可溶的BLyS(例如生物素酰化的BLyS)和膜结合形式的BLyS(例如在U937膜上)的样品分别用相同的抗体孵育,并捕获和鉴别那些结合可溶形式BLyS(例如生物素酰化的BLyS)但不结合膜结合形式BLyS(例如在U937膜上)的抗体。
可以测试本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv或其他分子),以鉴别那些与APRIL,内因子-α,VEGI,TRAIL,TNF-α,TNF-β,Fas-L,LIGHT,和PBS不交叉反应的抗体(见实施例4)。还可以测试抗体对BLyS的亲和性,例如使用BIAcore分析(见实施例6,12,17和18)。也可以使用本领域已知方法,测试抗体刺激,抑制或改变BLyS诱导免疫球蛋白产生和/或B细胞增殖的能力。例如,可以将人B细胞,BLyS和抗体一起在96孔平板中孵育,并使用闪烁计数仪测定3H-胸苷掺入情况。
选择和筛选免疫特异性结合膜结合形式BLyS的抗体
可以在多种分析中筛选本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv和其他分子),以鉴别那些免疫特异性结合膜结合形式BLyS的抗体。在一个特殊的分析中,捕获了结合U937膜上的BLyS或固定的组氨酸标记的BLyS的抗体。表达BLyS的可用于测试结合膜结合形式BlyS的抗体的其他细胞系包括K-562,HL-60和THP-1细胞。在另一个分析中,使用ELISAs筛选那些结合U937膜上的BLyS或组氨酸标记的BLyS的抗体(或抗体片段或变体)。在这个分析中,将抗体加入用U937膜或组氨酸标记的BLyS包被的96孔平板中,并捕获了结合U937膜或组氨酸标记的BLyS的那些抗体或其片段或变体。在另一个分析中,使用ELISAs筛选那些不结合生物素酰化的BLyS(可溶形式BLyS),但结合膜结合形式BLyS如来自U937细胞膜上的BLyS的的抗体(或抗体片段或变体)(见实施例2)。在这些分析中,将可溶的BLyS(例如生物素酰化的BLyS)和膜结合的BLyS(例如U937膜上的BLyS)的样品分别用相同的抗体(或抗体片段或变体)孵育,并捕获和鉴别那些不结合可溶BLyS(例如生物素酰化的BLyS),但结合膜结合形式BLyS(例如U937膜上的BLyS)的抗体(或抗体片段或变体)。在其他分析中,使用ELISAs筛选抗体,以确定哪个抗体(或抗体片段或变体)既结合组氨酸标记的BLyS或U937膜,又不与APRIL,内因子-α,VEGI,TRAIL,TNF-α,TNF-β,Fas-L,LIGHT,和PBS交叉反应(见实施例4)。也可以使用ELISAs确定哪个抗体(或抗体片段或变体)既结合组氨酸标记的BLyS或U937膜,又在存在TNF-α的情况下结合BLyS(见实施例4)。还可以使用高产量的BIAcore分析测试免疫特异性结合膜结合形式BLyS的抗体或其片段或变体对组氨酸标记的BLyS的亲和性(见实施例14)。
另外,可以筛选抗工程化表达“不可裂解”形式BLyS的细胞的本发明抗体,以确定其对膜结合形式BLyS的特异性。可以达到这个结果的BLyS中的突变包括但非限于SEQ ID NO:3228所示BLyS序列中Lys-132和/或Arg-133氨基酸残基的突变或缺失。一个典型的诱变可以包括将一或这两个Lys-132或Arg-133残基突变为丙氨酸残基。表达这种“不可裂解”形式BLyS的细胞提供了一种具有深远意义的试剂,用于分析抗体结合膜结合形式BLyS的能力。
选择和筛选免疫特异性结合可溶和膜结合形式BLyS的抗体
可以在多种分析中筛选本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv和其他分子),以鉴别那些免疫特异性结合可溶形式和膜结合形式BLyS的抗体或抗体片段或变体。在一个特殊的分析中,捕获了结合固定的BLyS的抗体。在另一个分析中,使用ELISAs筛选那些抑制可溶的BLyS(例如可溶的生物素酰化的BLyS)与IM-9细胞结合的抗体(或抗体片段或其变体),如前所述。在其他分析中,使用ELISAs筛选那些结合U937细胞膜的抗体。另外,可以使用本领域已知方法进行进一步的ELISA分析,以确定哪个抗体不与APRIL,内因子-α,VEGI,TRAIL,TNF-α,TNF-β,Fas-L,LIGHT,和PBS交叉反应,或在存在TNF-α的情况下与BLyS结合的那些抗体(见实施例4)。可以使用本发明所述的和本领域已知的其他方法,在中和分析中分析抗体。也可以使用高产量的BIAcore分析,测试免疫特异性结合可溶的和膜结合形式BLyS的抗体对BLyS的亲和性。
抗体缀合
本发明涵盖的抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv或其他分子)包括重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)于一种异源多肽(或其一部分,优选所述多肽的至少10,20,30,40,50,60,70,80,90,或100个氨基酸)scFv所产生的融合蛋白。所述融合非必需是直接的,可以通过接头序列发生。例如,本发明的抗体可以用于将异源多肽在体外或体内定向于特殊类型的细胞(例如单核细胞系细胞和B细胞),通过将所述异源多肽融合或缀合于对特殊细胞表面抗原(例如单核细胞系细胞上的膜结合BLyS)具有特异性的,或与结合特殊细胞表面受体(例如位于B细胞上是TACI和/或BCMA)的抗原结合的本发明抗体。融合或缀合于异源多肽的抗体还可以使用本领域已知的方法,用于体外免疫分析和纯化。见例如Harbor等,如前,和PCT出版物WO 93/2 1232;EP 439,095;Naramura等,免疫学信息39:91-99(1994);美国专利No.5,474,981;Gillies等,PNAS 89:1428-1432(1992);Fell等,免疫学杂志146:2446-2452(1991),以其全文并入参考。
在一个实施方案中,融合蛋白包含一个具有表1所示任一个VH结构域的氨基酸序列的多肽,和一个异源多肽。在另一个实施方案中,融合蛋白包含一个具有表1所示任一个VH CDR1的氨基酸序列的多肽,和一个异源多肽。在另一个实施方案中,融合蛋白包含一个具有表1所示任一个VH CDR2的氨基酸序列的多肽,和一个异源多肽。在一个优选的实施方案中,融合蛋白包含一个具有表1所示任一个VH CDR3s的氨基酸序列的多肽(即SEQ ID NO:2129-3227),和一个异源多肽。
在另一个实施方案中,融合蛋白包含一个具有表1所示任一个VL结构域的氨基酸序列的多肽,和一个异源多肽。在另一个实施方案中,融合蛋白包含一个具有表1所示任一个VL CDR1的氨基酸序列的多肽,和一个异源多肽。在又一个实施方案中,融合蛋白包含一个具有表1所示任一个VL CDR2的氨基酸序列的多肽,和一个异源多肽。在一个优选的实施方案中,融合蛋白包含一个具有表1所示任一个VL CDR3的氨基酸序列的多肽,和一个异源多肽。
在另一个实施方案中,融合蛋白包含一个具有表1所示任一个VH结构域和一或多个VL结构域的氨基酸序列的多肽,和一个异源多肽。在另一个实施方案中,本发明的融合蛋白包含一个具有表1所示任一个VH CDR和任一个VL CDR的氨基酸序列的多肽,和一个异源多肽。
本发明还包括组合物,所述组合物包含融合或缀合于抗体片段的异源多肽。例如,所述异源多肽可以融合或缀合于Fab片段,Fd片段,Fv片段,F(ab)2片段,或其一部分。本领域已知将多肽融合或缀合于抗体部分的方法。见例如美国专利Nos.5,336,603;5,622,929;5,359,046;5,349,053;5,447,851;5,112,946;EP 307,434;EP 367,166;PCT出版物WO 96/04388;WO 9 1/06570;Ashkenazi等,美国科学院院报88:10535-10539(1991);Zheng等,免疫学杂志154:5590-5600(1995);和Vil等,美国科学院院报89:11337-11341(1992)(所述文献以其全文并入参考)。
本发明的另外的融合蛋白可以通过基因改组,基序改组,外显子改组和/或密码子改组方法产生(统称为“DNA改组”)。DNA改组可用于调节抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv和其他分子)的活性,可以使用这些方法产生活性改变的抗体(例如具有高亲和性和低解离率的抗体)。通常见于美国专利Nos.5,605,793;5,811,238;5,830,721;5,834,252;和5,837,458,及Patten等,生物技术通用观点8:724-33(1997);Harayama,生物技术趋势16(2):76-82(1998);Hansson,等,分子生物学杂志287:265-76(1999);及Lorenzo和Blasco,生物技术24(2):308-13(1998)(每个专利和出版物在此均以全文并入参考)。在一个实施方案中,在重组前可以通过易错PCR进行随机诱变,随机核苷酸插入或其他方法,改变编码本发明抗体的多肽。在另一个实施方案中,编码免疫特异性结合BLyS的抗体的多核苷酸的一或多个部分,可以与一或多个异源分子的一或多个成分,基序,节段,部分,结构域,片段等重组。
另外,本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv和其他分子),可以融合于标记序列,如一种多肽,以易于纯化。在优选的实施方案中,所述标记氨基酸序列是一个6组氨酸多肽,如pQE载体中提供的标记(QIAGEN公司,9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311),许多标记是商品化的。如Gentz等(美国科学院院报86:821-824(1989))所述,提供6组氨酸以常规纯化融合蛋白。用于纯化的其他肽标记包括但非限于血凝素“HA”标记,其相对于衍生自流感血凝素蛋白的一个表位(Wilson等,细胞37:767(1984)),和“flag”标记(DYKDDDDK,(SEQ ID No:3238)Stratagene,La Jolla,CA)。
本发明还涵盖了缀合于一种诊断或治疗剂的抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv和其他分子)。所述抗体可以诊断性用于例如监测或预测肿瘤的发生和进展,作为临床检测程序的一部分,例如用于确定特定治疗方案的效力。可以通过将所述抗体偶联于一种可检测物质而易于检测。可检测物质例如包括但非限于各种酶,辅基,荧光物,发光物,生物发光物,放射性物质,用于各种正电子发射断层成像的可检测的正电子发射物质,和非放射性顺磁性金属离子。可以使用本领域已知方法,将所述可检测物质直接偶联于或缀合于所述抗体,或间接通过中间物(例如本领域已知的接头)偶联或缀合于所述抗体。见例如美国专利No.4,741,900阐述了可以缀合于抗体的金属离子,可以根据本发明用作诊断剂。适当的酶包括例如包括但非限于辣根过氧化物酶,碱性磷酸酶,β-半乳糖苷酶,或乙酰胆碱酯酶;适当的辅基复合物例如包括但非限于链亲和素和抗生物素蛋白/生物素;适当的荧光物包括但非限于伞形酮,荧光素,异硫氰酸荧光素,罗丹明,二氯三嗪基胺荧光素,丹磺酰氯或藻红蛋白;发光物例如包括但非限于鲁米诺;生物发光物例如包括但非限于荧光素酶,荧光素,和水母发光蛋白;及适当放射性物质包括但非限于,碘(131I,125I,123I,121I),碳(14C),硫(35S),氚(3H),铟(115mIn,113mIn,112In,111In),和锝(99Tc,99mTc),铊(201Ti),镓(68Ga,67Ga),钯(103Pd),钼(99Mo),氙(133Xe),氟(18F),153Sm,177Lu,159Gd,149Pm,140La,175Yb,166Ho,90Y,47Sc,186Re,188Re,142Pr,105Rh,97Ru,68Ge,57Co,65Zn,85Sr,32P,153Gd,169Yb,51Cr,54Mn,75Se,113Sn,和117Tin。
另外,本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv和其他分子),可以缀合于一种治疗成分如细胞毒素,例如抑制细胞生长的或杀细胞的制剂,一种治疗剂或一种放射性金属离子,例如α发射体,例如213Bi。在特异的实施方案中,本发明的抗体吸附于大环类鳌合剂,用于将放射性金属离子,包括但非限于111In,177Lu,90y,166Ho和153Sm缀合于多肽。在优选的实施方案中,与吸附于本发明抗体的大环类鳌合剂相关的放射性金属离子是111In。在优选的实施方案中,与吸附于本发明抗体的大环类鳌合剂相关的放射性金属离子是90y。在特异的实施方案中,大环类鳌合剂是1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N′,N″,N_-四乙酸(DOTA)。在其他特异的实施方案中,DOTA通过一个接头分子附于本发明抗体。用于将DOTA缀合于多肽的接头分子例如是本领域已知的那些,见例如DeNardo等,临床癌症研究4(10):2483-90,1998;Peterson等,生物缀合化学10(4):553-7,1999;和Zimmerman等,核酸医学生物学26(8):943-50,1999,所述文献以其全文并入参考。
细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害的任何制剂,并包括如细菌,真菌,植物或动物源的小分子毒素和酶促活性毒素这样的分子,或其片段。例如包括但非限于紫杉醇,细胞松弛素B,短杆菌肽D,溴化乙啶,吐根碱,丝裂霉素,表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(VP-16),tenoposide,长春新碱,长春花碱,秋水仙素,阿霉素,柔红霉素,dihydroxyanthracin dione,米托蒽昆,光辉霉素,放线菌素D,1-去氢睾酮,糖皮质激素,普鲁卡因,丁卡因,利多卡因,心得安,胸苷激酶,核酸内切酶,RNAse,和嘌呤霉素及其片段,变体或类似物。治疗剂包括但非限于抗代谢物(例如氨甲蝶呤,6-巯基嘌呤,6-硫鸟嘌呤,阿糖胞苷,5-氟尿嘧啶decarbazine),烷化剂(例如二氯甲基二乙胺,苯丁酸氮芥,苯丙氨酸氮芥,亚硝基脲氮芥(BSNU)和环己亚硝脲(CCNU),环磷酰胺,二甲磺酸丁酯,二溴甘露醇,链脲霉素,丝裂霉素C,和顺铂),蒽环类药物(例如柔红酶素(从前的daunomycin)和阿霉素),博来霉素,光辉霉素和氨茴霉素(AMC)),及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱),甲磺丙胺,哌酰硫烷,苄替派,卡巴醌,美妥替派,乌瑞替派,六甲蜜胺,曲他胺,trietylenephosphoramide,triethylenethiophosphaoramide三羟甲胺三嗪,双氯乙基β萘胺,cholophosphamide,雌二醇氮芥,异环磷酰胺,novembichin,胆甾醇苯乙酸氮芥,prednimustine,氯乙环磷酰胺,尿嘧啶氮芥,吡葡亚硝脲,福莫司汀,nimustine,ranimustine雷莫司汀,阿克拉霉素,偶氮丝氨酸,放线菌素,calichearnicin,carabicin,洋红霉素,嗜癌菌素,色霉素,地托比星,6-diazo-5-oxo-L-norleucine,表阿霉素,去氧阿霉素,去甲氧柔红霉素,马赛罗霉素,麦考酚酸,诺加拉霉素,橄榄霉素,培洛霉素,potfiromycin,三铁阿霉素,罗多比星,链黑霉素,tubercidin,乌苯美司,净司他丁,佐柔比星,denopterin,蝶罗呤,三甲曲沙,氟达拉滨,thiamiprine,安西他滨,氮胞苷,6-azauridine,氟基嘧啶,双脱氧尿苷,去氧氟尿苷,依诺他滨,氟尿苷,5-FU,二甲睾酮,丙酸甲雄烷醇酮,环硫雄醇,甲环硫甾烷,睾丸内脂,氨基导眠能,二氧苯二氯乙烷,曲洛司坦,frolinic acid,乙酰葡醛酯,醛磷酰胺,氨基乙酰丙酸,安丫啶,bestrabucil,比生群,依达曲沙,地磷酰胺,dernecolcine,亚胺醌,elfornithine,依利醋铵,乙环氧啶,硝酸镓,羟基脲,香菇多糖,氯尼达明,丙脒腙,莫派达醇,硝基胺,戊糖苷,phenamet,吡喃阿霉素,podophyllinic acid,2-ethylhydrazide,甲基苄肼,PSKO,丙亚胺,西左南,锗螺胺,tenuazonic acid,三亚胺醌,三氯乙胺,氨基甲酸乙酯,长春地新,氮烯咪胺,甘露醇氮芥,二溴甘露醇,二溴乳糖,双溴丙酰哌嗪,阿糖胞苷(″Ara-C″),紫杉醇类,如:紫杉醇(″泰素″,Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,NJ)doxetaxel(″泰素帝″,Rh6ne-Poulenc Rorer,Antony,France),吉西他滨,异环磷酰胺,异长春花碱,新霉酰胺,米托蒽醌,威猛,氨蝶呤,卡西他滨,ibandronate,CPT-I 1,拓扑异构酶抑制剂RFS 2000,difluoromethylornithine(DMFO),维甲酸,esperamicins,卡西他滨,及手术物质的药物适当的盐,酸或衍生物。还包括抗激素剂,作为调节或抑制激素对肿瘤的作用,如抗雌激素剂包括例如三苯氧胺,雷洛昔芬,芳香酶抑制性4(5)-imidazoles,4 hydroxytamoxifen,曲沃昔芬,雷洛昔芬,LY 117018,奥那斯酮,氯三苯氧胺(Fareston),和抗雄激素剂如氟他胺,尼鲁米特,比卡鲁胺,抑那通,和戈舍瑞林,及上述物质的药物适当的盐,酸或衍生物。
可使用本领域已知的方法标记本发明的抗体。这种方法包括但非限于使用双重功能的缀合剂(见例如美国专利Nos.5,756,065;5,714,631;5,696,239;5,652,361;5,505,931;5,489,425;5,435,990;5,428,139;5,342,604;5,274,119;4,994,560;和5,808,003;所述内容均以全文并入参考)及直接偶联反应(例如Bolton-Hunter和Chloramine-T反应)。
缀合的本发明的抗体可以用于修饰给定的生物应答,不必受传统化学治疗剂的限制而构建治疗剂或药物组分。例如所述药物组分可以是具有所需生物活性的一种蛋白质或多肽。这种蛋白质可以包括但非限于毒素,例如相思豆毒素,蓖麻毒素A,α毒素,假单胞菌外毒素,或白喉毒素,saporin,momordin,gelonin,pokeweed抗病毒蛋白,alpha-sarcin和霍乱毒素;蛋白质如肿瘤坏死因子,α-干扰素,β-干扰素,神经生长因子,血小板衍生的生长因子,组织纤溶酶原激活物,细胞程序死亡因子例如TNF-α,TNF-β,AIM I(s见国际出版物No.WO 97/33899),AIM II(见国际出版物No.WO 97/34911),Fas Ligand(Takahashi等,免疫学研究6:1567-1574(1994)),VEGI(见国际出版物No.WO 99/23105),血栓形成因子或抗血管发生因子,例如制管张素或endostatin;或者生物应答修饰因子例如淋巴因子,白细胞介素-1(IL-1),白细胞介素-2(IL-2),白细胞介素-6(IL-6),粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),粒细胞集落刺激因子(G-CSF),或其他生长因子。
本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv和其他分子),还可以附于固体支持物,其特别用于免疫分析或靶抗原纯化中。这种固体支持物包括但非限于玻璃,纤维素,聚丙烯酰胺,尼龙,聚苯乙烯,聚氯乙烯或聚丙烯。
将治疗组分缀合于抗体的方法是熟知的,见例如Arnon等,“在癌症治疗中免疫定向药物的单克隆抗体”,单克隆抗体与癌症治疗,Reisfeld等(编辑),pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.1985);Hellstrom等,“针对药物输送的抗体”,控制的药物输送(第2版),Robinson等(编辑),pp.623-53(Marcel Dekker,Inc.1987);Thorpe,“在癌症治疗中细胞毒剂的抗体载体回顾”,单克隆抗体‘84:生物和临床应用,Pinchera等(eds.),pp.475-506(1985);“在癌症治疗中使用放射标记的抗体的分析,结果和预后”,针对癌症检测和治疗的单克隆抗体,Baldwin等(编辑),pp.303-16(学术出版社1985),和Thorpe等,“抗体—毒素缀合物的制备和胞毒性”,免疫学研究62:119-58(1982)。
或者,本发明的抗体抗原缀合于第二种抗体,形成抗体复共轭对配合物,如Segal在美国专利No.4,676,980中所述,以其全文并入参考。
本发明抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv和其他分子)无论有或无治疗组分缀合,无论单独施用或与细胞毒因子和/或细胞因子组合,均可以用作一种治疗剂。
使用抗体进行表位作图
本发明提供了可用于鉴别BLyS表位的抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv和其他分子)。特别地,本发明的抗体可用于鉴别人BLyS(SEQ ID NO:3228和/或3229)或在人单核细胞上表达的BLyS的表位;小鼠BLyS(SEQ ID NO:3230和/或3231)或在小鼠单核细胞上表达的BLyS的表位;大鼠BLyS(可溶形式的SEQID NO:3232,3233,3234和/或3235,或者膜结合形式,例如结合在大鼠单核细胞表面的)的表位;猴BLyS(例如猴BLyS多肽SEQ IDNO:3236和/或3237,可溶形式的BLyS,或在猴单核细胞上表达的BLyS)的表位,使用本发明所述和本领域已知的其他方法。作为表位的片段可以通过任何常规方式产生(见例如Houghten,美国科学院院报82:5131-5135(1985),另外见于美国专利No.4,631,211)。
抗体的诊断性使用
标记的特异性结合BLyS的本发明抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv分子),可以用于诊断目的以检测,诊断或监测与BLyS或BLyS受体表达和/或活性异常相关的疾病和/或功能失调。本发明提供了检测BLyS异常表达的方法,包括:(a)使用免疫特异性结合BLyS的一或多种本发明抗体,分析来自个体的生物样品中BLyS的表达;(b)将BLyS水平与标准BLyS水平(例如正常生物样品中)进行对比,从而分析的BLyS水平与标准BLyS水平相比提高或降低,表明异常表达。
“生物样品”是指得自个体的任何液体和/或细胞,体液,机体组织,机体细胞,细胞系,组织培养物,或含有BLyS蛋白或mRNA的其他源料。体液包括但非限于血清,血浆,尿液,滑膜液,脑脊液,唾液和粘液。组织样品实际上可以取自机体的任何组织。组织样品还可以得自尸检。本领域熟知从哺乳动物中获得活检组织和体液的方法。其中所述生物样品包括mRNA,活检组织是优选的源料。
本发明还提供了检测BLyS受体异常表达的方法,包括(a)用只免疫特异性结合可溶形式BLyS,但不抑制BLyS/BLyS受体结合的一或多种抗体或其片段或变体,分析BLyS受体在生物样品中的表达。这种抗体为例如但不限于能从溶液中捕获生物素酰化的BLyS(见实施例8),但不阻止BLyS与IM-9细胞结合(见实施例3)的抗体;(b)将所述BLyS受体水平与标准BLyS受体水平(例如在正常组织或细胞样品中)相对比,从而所分析的BLyS受体水平与标准BLyS受体水平相比提高或降低,则表示异常表达。
特异性结合BLyS的本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的scFv分子),可以用于诊断目的以检测,诊断,预测或监测自身免疫疾病和/或免疫缺陷,和/或相关疾病或状况。本发明提供了检测BLyS异常表达的方法,包括:(a)使用免疫特异性结合BLyS的一或多种本发明抗体,分析来自个体的生物样品中BLyS的表达;(b)将BLyS水平与标准BLyS水平(例如正常生物样品中)进行对比,从而所分析的BLyS水平与标准BLyS水平相比提高或降低,表示存在自身免疫功能失调或疾病和/或免疫缺陷。在特异的实施方案中,BLyS的分析水平提高表示自身免疫功能失调或疾病。在其他特异的实施方案中,BLyS的分析水平降低表示免疫缺陷。
特异性结合BLyS,但不抑制BLyS/BLyS受体结合的本发明抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),可以用于诊断目的,以检测,诊断,预测或监测自身免疫功能失调和/或免疫缺陷,和/或相关疾病或状况。本发明提供了检测BLyS受体异常表达的方法,包括:(a)使用免疫特异性结合BLyS的一或多种本发明抗体,分析来自个体的生物样品中BLyS受体的表达;(b)将BLyS受体水平与标准BLyS受体水平(例如正常生物样品中)进行对比,从而所分析的BLyS受体水平与标准BLyS受体水平相比提高或降低,表示存在自身免疫功能失调或疾病和/或免疫缺陷。在特异的实施方案中,BLyS受体的分析水平提高表示自身免疫功能失调或疾病。在其他特异的实施方案中,BLyS受体的分析水平降低表示免疫缺陷。
可以用本发明抗体检测,诊断,预测或监测的自身免疫功能失调,疾病或状况,包括但非限于自身免疫性溶血性贫血,自身免疫性新生儿血小板减少,特发性血小板减少性紫癜,自身免疫性中性粒细胞减少,自身免疫性血细胞减少,溶血性贫血,抗磷脂综合征,皮炎,谷蛋白敏感性肠道病,变应性脑脊髓膜炎,心肌炎,复发性多软骨炎,风湿性心脏病,肾小球肾炎(例如IgA肾病),多发性硬化,神经炎,眼色素层眼炎,多发内分泌腺病,紫癜(例如Henloch-Scoenlein紫癜),Reiter’s病,Stiff-Man综合征,自身免疫性肺炎,心肌炎,IgA肾小球肾炎,密集沉积疾病,风湿性心脏病,胰岛素依赖性糖尿病,和自身免疫性眼炎,自身免疫性甲状腺炎,甲状腺功能低下(即Hashimoto′s甲状腺炎,系统性红斑狼疮,盘状狼疮,Goodpasture′s综合征,天疱疮,自身免疫性受体疾病例如(a)突眼性甲状腺肿,(b)重症肌无力和(c)胰岛素抗性,自身免疫性溶血性贫血,自身免疫性血小板减少性紫癜,类风湿性关节炎,抗胶原抗体schleroderma,混合性结缔组织病,多发性肌炎/皮肌炎,恶性贫血,特发性Addison′s病,不孕症,肾小球肾炎如原发性肾小球肾炎和IgA肾病,大疱性类天疱疮,干燥综合征,糖尿病,和肾上腺素抗性(包括哮喘或囊肿性纤维化的肾上腺素抗性),慢性活动性肝炎,原发性胆汁性肝硬化,其它内分泌腺病变,白癜风,血管炎,后-MI,心切开术综合征,风疹,遗传过敏性皮炎,哮喘,炎症性心肌病,和其它炎症,肉芽肿,退化和萎缩,及其他功能失调如炎症性皮肤疾病包括银屑病和硬化,与炎症性肠病相关的反应(如Crohn′s病和溃疡性结肠炎),呼吸窘迫综合征(包括成人呼吸窘迫综合征ARDS),脑膜炎,脑炎,大肠炎,过敏反应如湿疹和其他状况包括T细胞侵润,和慢性侵润炎症反应,动脉硬化,白细胞黏附不足,雷诺氏综合征,及在肺结核,肉瘤,肉芽肿病中发现的由细胞因子和T淋巴细胞介导的与急性和迟发过敏性相关的免疫反应,及白细胞渗出,中枢神经系统(CNS)炎症,多器官损伤综合征,抗原—抗体复合物介导的疾病,抗肾小球基底膜疾病,Lambert-Eaton肌无力综合征,白塞氏病,巨细胞动脉炎,免疫复合物肾炎,IgA肾病,IgM多发性神经炎或自身免疫性血小板减少症等。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了检测,诊断和/或预测与血丙种球蛋白过多相关的疾病或功能失调(例如AIDS,自身免疫疾病和一些免疫缺陷)的方法和组合物。在其他特异的实施方案中,本发明涵盖了检测,诊断和/或预测与血丙种球蛋白过低相关的疾病或功能失调(例如免疫缺陷)的方法和组合物。
可以用本发明的抗体检测,诊断,预测或监测的免疫缺陷包括但非限于X连锁的重度联合免疫缺损(SCID),常染色体SCID,腺苷脱氨酶缺陷(ADA缺陷),X连锁的无丙种球蛋白血症(XLA),Bruton’s病,先天性无丙种球蛋白血症,X连锁的婴儿无丙种球蛋白血症,成人发作的无丙种球蛋白血症,晚期发作的无丙种球蛋白血症,异常γ球蛋白血症,低γ球蛋白血症,幼儿暂时低γ球蛋白血症,非特异性低γ球蛋白血症,无丙种球蛋白血症,普通可变免疫缺陷(CVID)(获得性),Wiskott-Aldrich综合征(WAS),高IgM的X-连锁的免疫缺陷,高IgM的非X连锁的免疫缺陷,选择性IgA缺陷,IgG亚类缺陷(具有或无IgA缺陷),Igs水平正常或提高的抗体免疫缺陷,具有胸腺瘤的免疫缺陷,Ig重链缺失,κ链缺损,B细胞淋巴增殖性失调(BLPD),选择性IgM免疫缺陷,隐性无丙种球蛋白血症(Swiss型),网状细胞发育不全,新生儿中性粒细胞减少,重度先天性白细胞减少,免疫缺陷性胸腺淋巴细胞减少—发育不全或发育异常,共济失调性毛细管扩张,短肢矮小症,X连锁的淋巴细胞增殖性综合征(XLP),联合Igs免疫缺陷的Nezelof综合征,嘌呤核苷磷酸化酶缺损(PNP),MHC II型缺损(裸淋巴细胞综合征)和重度联合免疫缺损。
在患有系统性红斑狼疮(SLE)的患者血清中已经观测到可溶性BLyS的水平提高。将150个SLE患者的血清与38个对照个体的血清相对比,发现大多数SLE患者具有5ng/ml以上的血清BLyS,30%以上的SLE患者水平高于10ng/ml,而且大约10%的SLE患者的血清SLE水平高于20ng/ml。相反,多数正常对照组的BLyS水平低于5ng/ml,而且少于10%的对照组BLyS水平高于10ng/ml。血清中BLyS蛋白的水平提高是可溶形式的,并具有在体外刺激抗IgM处理的B细胞的能力这样的生物活性。发现具有高于15ng/ml血清BLyS水平的SLE患者,与正常对照组和血清BLyS低于5ng/ml的SLE患者相比,抗-dsDNA抗体的水平提高(数据未示出)。
另外,分析两小组患者血清的BLyS水平,所述患者抗核抗体阳性(ANA+),但不符合美国风湿病学学会(ACR)关于SLE的分类标准。第一小组血清是取自不具有SLE临床表现的患者的ANA+血清。这个小组的BLyS水平只轻度提高(~9ng/ml BLyS)。然而,第二小组血清是取自具有SLE临床表现的患者的ANA+血清,其BLyS水平明显提高。(~15ng/ml)。这些结果提示BLyS水平提高出现于满足ACR标准之前。所述ACR标准见于Tan,E.M.等,关节炎和风湿病25:1271-1277(1982)所述。
因此,在特异的实施方案中,特异结合BLyS的本发明的抗体可以用于诊断目的以检测,诊断,预测或监测系统性红斑狼疮或与其相关的状况。本发明提供了监测BLyS异常表达的方法,包括:(a)使用免疫特异性结合BLyS的一或多种本发明抗体,分析来自个体的生物样品中BLyS的表达;(b)将BLyS水平与标准BLyS水平(例如正常生物样品中)进行对比,从而所分析的BLyS水平与标准BLy8水平相比提高,提示患有SLE。
在其他实施方案中,特异结合BLyS的本发明的抗体可以用于诊断目的以检测,诊断,预测或监测IgA肾病或与其相关的状况。本发明提供了监测BLyS异常表达的方法,包括:(a)使用免疫特异性结合BLyS的一或多种本发明抗体,分析来自个体的生物样品中BLyS的表达;(b)将BLyS水平与标准BLyS水平(例如正常生物样品中)进行对比,从而所分析的BLyS水平与标准BLyS水平相比提高,提示患有IgA肾病。
在其他实施方案中,特异结合BLyS的本发明的抗体可以用于诊断目的以检测,诊断,预测或监测干燥综合征或与其相关的状况。本发明提供了监测BLyS异常表达的方法,包括:(a)使用免疫特异性结合BLyS的一或多种本发明抗体,分析来自个体的生物样品中BLyS的表达;(b)将BLyS水平与标准BLyS水平(例如正常生物样品中)进行对比,从而分析的BLyS水平与标准BLyS水平相比提高,提示患有干燥综合征。
在其他实施方案中,特异结合BLyS的本发明的抗体可以用于诊断目的以检测,诊断,预测或监测HIV感染或与其相关的状况(例如AIDS)。本发明提供了监测BLyS异常表达的方法,包括:(a)使用免疫特异性结合BLyS的一或多种本发明抗体,分析来自个体的生物样品中BLyS的表达;(b)将BLyS水平与标准BLyS水平(例如正常生物样品中)进行对比,从而所分析的BLyS水平与标准BLyS水平相比提高,提示患有HIV感染。
在其他实施方案中,特异结合BLyS的本发明的抗体可以用于诊断目的以检测,诊断,预测或监测重症肌无力或与其相关的状况。本发明提供了监测BLyS异常表达的方法,包括:(a)使用免疫特异性结合BLyS的一或多种本发明抗体,分析来自个体的生物样品中BLyS的表达;(b)将BLyS水平与标准BLyS水平(例如正常生物样品中)进行对比,从而所分析的BLyS水平与标准BLyS水平相比提高,提示患有重症肌无力。
在其他实施方案中,特异结合BLyS的本发明的抗体可以用于诊断目的以检测,诊断,预测或监测特发性血小板减少性紫癜或与其相关的状况。本发明提供了监测BLyS异常表达的方法,包括:(a)使用免疫特异性结合BLyS的一或多种本发明抗体,分析来自个体的生物样品中BLyS的表达;(b)将BLyS水平与标准BLyS水平(例如正常生物样品中)进行对比,从而所分析的BLyS水平与标准BLyS水平相比提高,提示患有先天性血小板减少性紫癜(ITP)。
在其他实施方案中,特异结合BLyS的本发明的抗体可以用于诊断目的以检测,诊断,预测或监测溶血性贫血或与其相关的状况。本发明提供了监测BLyS异常表达的方法,包括:(a)使用免疫特异性结合BLyS的一或多种本发明抗体,分析来自个体的生物样品中BLyS的表达;(b)将BLyS水平与标准BLyS水平(例如正常生物样品中)进行对比,从而所分析的BLyS水平与标准BLyS水平相比提高,提示患有溶血性贫血。
在其他实施方案中,特异结合BLyS的本发明的抗体可以用于诊断目的以检测,诊断,预测或监测甲状腺炎或与其相关的状况。本发明提供了监测BLyS异常表达的方法,包括:(a)使用免疫特异性结合BLyS的一或多种本发明抗体,分析来自个体的生物样品中BLyS的表达;(b)将BLyS水平与标准BLyS水平(例如正常生物样品中)进行对比,从而所分析的BLyS水平与标准BLyS水平相比提高,提示患有甲状腺炎。
在其他实施方案中,特异结合BLyS的本发明的抗体可以用于诊断目的以检测,诊断,预测或监测Goodpasture′s综合征或与其相关的状况。本发明提供了监测BLyS异常表达的方法,包括:(a)使用免疫特异性结合BLyS的一或多种本发明抗体,分析来自个体的生物样品中BLyS的表达;(b)将BLyS水平与标准BLyS水平(例如正常生物样品中)进行对比,从而所分析的BLyS水平与标准BLyS水平相比提高,提示患有Goodpasture′s综合征。
在其他实施方案中,特异结合BLyS的本发明的抗体可以用于诊断目的以检测,诊断,预测或监测多发性硬化或与其相关的状况。本发明提供了监测BLyS异常表达的方法,包括:(a)使用免疫特异性结合BLyS的一或多种本发明抗体,分析来自个体的生物样品中BLyS的表达;(b)将BLyS水平与标准BLyS水平(例如正常生物样品中)进行对比,从而所分析的BLyS水平与标准BLyS水平相比提高,提示患有多发性硬化。
在其他实施方案中,特异结合BLyS的本发明的抗体可以用于诊断目的以检测,诊断,预测或监测类风湿性关节炎或与其相关的状况。本发明提供了监测BLyS异常表达的方法,包括:(a)使用免疫特异性结合BLyS的一或多种本发明抗体,分析来自个体的生物样品中BLyS的表达;(b)将BLyS水平与标准BLyS水平(例如正常生物样品中)进行对比,从而所分析的BLyS水平与标准BLyS水平相比提高,提示患有类风湿性关节炎。
在其他实施方案中,特异结合BLyS的本发明的抗体可以用于诊断目的以检测,诊断,预测或监测基于免疫的风湿性疾病(例如SLE,类风湿性关节炎,CREST综合征(特征在于钙质沉着,Raynaud′s现象,食管能动性失调,硬皮症,和毛细血管扩张的一种硬皮病),血清阴性脊椎关节病(SpA),多发性肌炎/皮肌炎,显微下多血管炎,丙型肝炎相关性关节炎,Takayasu’s动脉炎和未分化的结缔组织病)或与其相关的状况。本发明提供了监测BLyS异常表达的方法,包括:(a)使用免疫特异性结合BLyS的一或多种本发明抗体,分析来自个体的生物样品中BLyS的表达;(b)将BLyS水平与标准BLyS水平(例如正常生物样品中)进行对比,从而所分析的BLyS水平与标准BLyS水平相比提高,提示患有基于免疫的风湿性疾病。
使用71个SLE患者的样品,已经观测到血清BLyS水平与肾病性蛋白尿(24小时尿中蛋白>3gm)水平相反(p=0.019)。71个SLE患者在经静脉抽血确定血清BlyS后的一个月内检测蛋白尿。基于针对正常对照组的5%-95%,将血清BLyS分为低,正常,或高水平。肾病蛋白尿与血清Neutrokine-α水平相反。因此,在特异的实施方案中,经诊断具有基于免疫的风湿性疾病(例如SLE,风湿性关节炎,CREST综合征(一种硬皮病的变种,特征在于钙质沉着,Raynaud′s现象,食管能动性失调,硬皮症和毛细血管扩张),血清阴性脊椎关节病变(SpA),多肌炎/皮肌炎,显微polyangiitis,丙型肝炎相关的关节炎,Takayasu’s动脉炎和未分化的结缔组织病)的个体中BLyS的血清水平(使用一或多种本发明抗体确定的)可以用于确定,诊断,预测或监测所述疾病的症状或某些方面(如肾病性蛋白尿)的严重程度。
在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体用于诊断,预测,治疗或预防与CVID相关的病变,包括但非限于与急性和复发感染相关的病变(例如肺炎,支气管炎,鼻旁窦炎,中耳炎,脓血症,脑膜炎,脓毒性关节炎和骨髓炎),慢性肺部疾病,自身免疫性肉芽肿性疾病,淋巴瘤,癌症(例如乳腺癌,胃癌,结肠癌,口腔癌,前列腺癌,肺癌,宫颈癌,卵巢癌,皮肤癌,和黑色素形成细胞癌(即黑素瘤),炎症性肠病(例如Crohn’s病,溃疡性结肠炎,和溃疡性直肠炎),吸收不良,霍奇金病,和Waldenstrom’s巨球蛋白血症。
本发明提供了一种诊断或预测疾病或功能失调的方法,包括:(a)使用免疫特异性结合BLyS的本发明的一或多种抗体,分析个体的生物样品中BLyS的水平;(b)将所述BLyS水平与标准BLyS水平(例如在取自没有疾病或功能失调的人的生物样品中)相对比,从而所分析的BLyS水平与标准BLyS水平相对比提高或降低,表示存在特定的疾病或功能失调。关于癌症,在取自个体活检组织中存在相对高数量的BLyS,可能提示易患所述疾病,或可以提供一种在临床表现出现之前检测疾病的方法。这种类型的更确切诊断可以使医生较早应用预防措施或积极治疗,从而预防癌症的发生或进一步进展。
在特异的实施方案中,在生物样品中存在相对高数量的膜结合BLyS,提示单核细胞相关的白血病或淋巴瘤(例如急性髓性白血病)和/或其严重程度。
在其他特异的实施方案中,生物样品中存在相对高数量的BLyS(使用结合可溶性BLyS,但不抑制BLyS/BLyS受体结合的本发明的一或多个抗体确定的)的受体,提示B细胞相关的白血病或淋巴瘤(例如慢性淋巴细胞性白血病,多发性骨髓瘤,非霍奇金淋巴瘤,和霍奇金病)和/或其严重程度。
在特异的实施方案中,本发明提供了一种诊断或预测系统性红斑狼疮的方法,包括:(a)使用免疫特异性结合BLyS的本发明的一或多种抗体,分析个体的生物样品中BLyS的水平;(b)将所述BLyS水平与标准BLyS水平(例如在取自没有系统性红斑狼疮的人的生物样品中)相对比,从而所分析的BLyS水平与标准BLyS水平相比提高,提示存在系统性红斑狼疮。
在特异的实施方案中,本发明提供了一种诊断或预测类风湿性关节炎的方法,包括:(a)使用免疫特异性结合BLyS的本发明的一或多种抗体,分析个体的生物样品中BLyS的水平;(b)将所述BLyS水平与标准BLyS水平(例如在取自没有类风湿性关节炎的人的生物样品中)相对比,从而所分析的BLyS水平与标准BLyS水平相比提高或降低,提示存在风湿性关节炎。
本发明提供了一种诊断或预测疾病或功能失调的方法,包括:(a)使用只免疫特异性结合可溶性BLyS,但不中和BLyS/BLyS受体结合的本发明的一或多种抗体,分析个体的生物样品中BLyS受体的水平;(b)将所述BLyS受体水平与标准BLyS受体水平(例如在取自没有疾病或功能失调的人的生物样品中)相对比,从而所分析的BLyS受体水平与标准BLyS受体水平相对比提高或降低,提示存在特定的疾病或功能失调。关于癌症,在取自个体活检组织中存在相对高数量的BLyS受体,可能提示易患所述疾病,或可以提供一种在临床表现出现之前检测疾病的方法。此类疾病的更确切诊断可以使医生较早应用预防措施或积极治疗,从而预防癌症的发生或进一步进展。
使用本领域已知的那些传统的免疫组织学方法(例如见Jalkanen,等,细胞生物学杂志101:976-985(1985);Jalkanen,等,细胞生物学杂志105:3087-3096(1987)),本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)可以用于分析生物学样品中蛋白质水平。用于检测蛋白质基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫分析,如酶联免疫吸附测定(ELISA),和放射免疫测定(RIA)。本领域已知适当的抗体分析标记,包括酶标记如葡糖氧化酶,碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶;放射性同位素,如碘(121I,123I,125I,131I),碳(14C),硫(35S),氚(3H),铟(111In,112In,113mIn,115mIn),锝(99Tc,99mTc),铊(201Ti),镓(68Ga,67Ga),钯(103Pd),钼(99Mo),氙(133Xe),氟(18F),153Sm,177Lu,159Gd,149Pm,140La,175Yb,166Ho,90Y,47Sc,186Re,188Re,142Pr,105Rh,和97Ru;发光物标记,如鲁米诺;和荧光标记,如荧光素和罗丹明,及生物素。
本发明的一方面是在动物,优选哺乳动物及最优选在人体内检测及诊断与BLyS或BLyS受体异常表达相关的疾病或功能失调。在一个实施方案中,诊断包括:a)为对象施用有效量的免疫特异性结合BLyS的标记的本发明抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子);b)施用后等待一段时间,使标记的抗体优先在所述对象的BLyS表达部位浓缩(并将未结合的标记的分子从背景水平中清除);c)确定背景水平;及d)检测所述对象中标记的抗体,这样检测的标记的抗体或其片段的水平高于背景水平及高于或低于在没有疾病或功能失调的人体内观测到的水平,提示所述对象患有与BLyS或BLyS受体异常表达相关的疾病或功能失调。 背景水平可以通过各种方法确定,包括将检测的标记的分子数量与针对特定系统预先测定的标准值对比而确定。
本领域知晓所述对象的大小和所用的成像系统决定需要产生诊断性成像的成像组分的数量。在放射性同位素的情况下,针对人,注射的放射性物质数量通常为大约5-20millicuries的99Tc。然后所述标记的抗体优先在含有特异蛋白质的细胞区域积累。在体内肿瘤成像如S.W.Burchiel等,“放射标记的抗体及其片段的免疫药物动力学”(肿瘤成像:癌症的化学检测,第13章,S.W.Burchiel和B.A.Rhodes编辑,Masson出版公司(1982))。
根据一些变量,包括所用标记的类型和施用模式,施用后需一段时间以使标记的分子优先在对象的特定部位积累,并将未结合的标记分子从背景中清除,所述间隔为6-48小时,或6-24小时或6-12小时。在另一个实施方案中,施用后的时间间隔为5-20天或5-10天。
在一个实施方案中,监测疾病或功能失调是通过重复诊断疾病和功能失调的方法进行的,例如在初次诊断一个月后,六个月后,一年后等进行监测。
标记分子的存在可以通过在患者体内用本领域已知的体内扫描方法检测。这些方法依赖于所用标记的类型。技术人员能确定检测特殊标记的适当方法。可以用于本发明诊断方法中的方法和设备包括但非限于计算机X线断层成像(CT),全身扫描如正电子发射断层成像(PET),磁共振成像(MRI),及超声。
在特异的实施方案中,所述分子是用放射性同位素标记的,并使用辐射应答外科设备在患者体内检测(Thurston等,美国专利No.5,441,050)。在另一个实施方案中,所述分子是用一种荧光化合物标记的,并用荧光应答扫描设备在患者体内检测。在另一个实施方案中,所述分子是用一种发射正电子的金属标记的,并用正电子发射断层成像在患者体内检测。在另一个实施方案中,所述分子是用一种顺磁性标记标记的,并用磁共振成像(MRI)在患者体内检测。
免疫分型
本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),可以通过其BLyS表达或BLyS受体表达,用于免疫分型细胞系和生物样品。可以利用各种方法,使用本发明的抗体,片段或变体,筛选表达BLyS或BLyS受体的细胞群(即免疫细胞,特别是单核细胞或B细胞),并包括使用抗体包被的磁珠磁性分离,用附于固体基质(即平板)的抗体“淘选”,及流式细胞计数(见例如美国专利5,985,660;和Morrison等,细胞96:737-49(1999))。
这些方法可以筛选特殊的细胞群,如血液系统恶性肿瘤(即急性白血病患者中的微小残留病变(MRD))及在移植中的“非自身”细胞,以预防移植物抗宿主疾病(GVHD)。或者,这些方法可以筛选能增殖和/或分化的造血干细胞和前体细胞,所述细胞可见于人脐带血中。
在一个实施方案中,本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)用于鉴别源于单核细胞或B细胞的细胞。
抗体的治疗用途
本发明还涉及了基于抗体的疗法,包括将本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)施用于动物,优选哺乳动物,最优选人类患者,以治疗一或多种疾病,功能失调或病变。本发明的治疗化合物包括但非限于本发明的抗体及编码本发明抗体(及抗独特型抗体)的核酸。本发明的抗体可以用于治疗,减轻或预防与BLyS或BLyS受体的异常表达和/或活性相关疾病,功能失调或病变,包括但非限于本文所述的任一种或多种疾病,功能失调或病变。与BLyS或BLyS受体的异常表达和/或活性相关疾病,功能失调或病变的治疗和/或预防,包括但非限于减轻与那些疾病相关的症状。本发明的抗体可以在如本领域已知的或本发明所述的药物适当组合物中提供。
作为BLyS,优选BLyS诱导的信号转导的兴奋剂或拮抗剂的本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),可以施用于动物,以治疗,预防或改善与BLyS异常表达,缺乏BLyS功能,异常BLyS受体表达,或缺乏BLyS受体功能相关的疾病或功能失调。例如,破坏BLyS与其受体之间相互作用的本发明抗体,可以施用于动物,以治疗,预防或改善与异常BLyS表达,过分的BLyS功能,异常的BLyS受体表达,或过分的BLyS受体功能相关的疾病或功能失调。不阻止BLyS与其受体结合,但抑制或负调节BLyS诱导的信号转导的本发明抗体,可以施用于动物,以治疗,预防或改善与异常BLyS表达,过分的BLyS功能,异常的BLyS受体表达,或过分的BLyS受体功能相关的疾病或功能失调。特别地,通过特异性识别未结合的BLyS,受体结合的BLyS或未结合的和受体结合的BLyS而阻止BLyS诱导的信号转导的本发明抗体,可以施用于动物,以治疗,预防或改善与异常BLyS表达,过分的BLyS功能,异常的BLyS受体表达,或过分的BLyS受体功能相关的疾病或功能失调。本发明抗体抑制或负调节BLyS诱导的信号转导的能力,可以通过本文所述方法或本领域已知的其他方法确定。例如,BLyS诱导的受体激活和信号分子激活,可以通过检测所述受体或信号分子的磷酸化(例如酪氨酸或丝氨酸/苏氨酸)而确定,通过免疫沉淀,随后通过Western印迹分析进行(例如本文所述方法)。
在一个特异的实施方案中,将本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)施用于动物,以治疗,预防或改善与异常BLyS表达,过分的BLyS功能,异常的BLyS受体表达,或过分的BLyS受体功能相关的疾病或功能失调,所述抗体将BLyS的活性相对于无所述抗体的情况下BLyS活性抑制或负调节至少95%,90%,85%,80%,75%,70%,60%,50%,45%,40%,45%,35%,30%,25%,20%,或至少10%。在另一个实施方案中,将抗体的组合,抗体片段的组合,抗体变体的组合,或抗体,抗体片段和/或其变体的组合施用于动物,以治疗,预防或改善与异常BLyS表达,过分的BLyS功能,异常的BLyS受体表达,或过分的BLyS受体功能相关的疾病或功能失调,所述组合将BLyS的活性相对于没有所述抗体,抗体片段,和/或抗体变体的情况下BLyS活性抑制或负调节至少95%,90%,85%,80%,75%,70%,60%,50%,45%,40%,45%,35%,30%,25%,20%,或至少10%。
另外,将本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)施用于动物,以治疗,预防或改善与异常BLyS表达,过分的BLyS功能,异常的BLyS受体表达,或过分的BLyS受体功能相关的疾病或功能失调,所述抗体激活BLyS诱导的信号转导。这些抗体可以加强或激活BLyS介导的受体活化的全部或一部分生物活性,例如通过诱导BLyS的多聚化和/或BLyS受体的多聚化进行。本发明的抗体可以与或不与BLyS预先复合而施用。在一个特异的实施方案中,将本发明的抗体施用于动物,以治疗,预防或改善与异常BLyS表达,过分的BLyS功能,异常的BLyS受体表达,或过分的BLyS受体功能相关的疾病或功能失调,所述抗体将BLyS的活性相对于没有所述抗体情况下BLyS活性提高至少5%,10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,或至少99%。在另一个实施方案中,将抗体的组合,抗体片段的组合,抗体变体的组合,或抗体,抗体片段和/或其变体的组合施用于动物,以治疗,预防或改善与异常BLyS表达,过分的BLyS功能,异常的BLyS受体表达,或过分的BLyS受体功能相关的疾病或功能失调,所述组合将BLyS的活性相对于没有所述抗体,抗体片段,和/或抗体变体的情况下BLyS活性提高至少5%,10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,或至少99%。
免疫特异性结合BLyS的本发明的一或多种抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)可以作为治疗剂局部或系统用于机体。本发明的一或多种抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),与其他单克隆或嵌合抗体组合,或与淋巴因子或造血生长因子(例如IL-2,IL-3和IL-7)组合也是有利的,例如提高与抗体相互作用的效应细胞的数量或活性。
本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)可以单独或与其他类型治疗组合施用(例如放疗,化疗,激素疗法,免疫疗法,抗肿瘤剂,抗血管生成剂和抗炎剂)。通常地,施用源于与患者相同种属的产物或种属反应(在抗体的情况下)与患者相同是优选的。因此,在一个优选的实施方案中,将人抗体,片段,或变体(例如衍生物),或核酸施用于人类患者以进行治疗或预防。
针对免疫测定及治疗与BLyS多核苷酸或多肽或其片段相关的疾病,优选使用高亲和性和/或有效的本发明体内抑制和/或中和抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)(所述抗体免疫特异性结合BlyS)或编码免疫特异性结合BLyS的抗体的多核苷酸。这种抗体优选与BLyS和/或BLyS片段具有亲和性。优选的结合亲和性包括解离常数KD小于或等于5×10-2M,10-2M,5×10-3M,10-3M,5×10-
4M,10-4M,5×1-5M,或10-5M。更优选的,本发明的抗体结合BLyS多肽或其片段或变体的解离常数或KD小于或等于5×10-6M,10-6M,5×10-7M,10-7M,5×10-8M,或10-8M。更加优选地,本发明的抗体结合BLyS多肽或其片段或变体的解离常数或KD小于或等于5×10-9M,10-9M,5×10-10M,10-10M,5×10-11M,10-11M,5×10-12M,10-
12M,5×-13M,10-13M,5×10-14M,10-14M,5×10-15M,或10-15M。本发明涵盖了结合BLyS多肽的解离常数在上述各个数值内之间的任何范围内的抗体。
在一个优选的实施方案中,本发明的抗体中和BLyS活性。在另一个优选的实施方案中,本发明的抗体抑制B细胞增殖。
在一个优选的实施方案中,本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)抑制或降低可溶形式BLyS与其受体的结合。在另一个优选的实施方案中,本发明的抗体抑制或降低由可溶形式BLyS诱导的B细胞增殖。在另一个优选的实施方案中,本发明的抗体抑制或降低由可溶形式BLyS诱导的免疫球蛋白产生。
在一个优选的实施方案中,本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)抑制或降低膜结合形式BLyS与其受体的结合。在另一个优选的实施方案中,本发明的抗体抑制或降低由膜结合形式BLyS诱导的B细胞增殖。在另一个优选的实施方案中,本发明的抗体抑制或降低由膜结合形式BLyS诱导的免疫球蛋白产生。
在一个优选的实施方案中,本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子),抑制或降低可溶的和膜结合形式BLyS与其受体的结合。在另一个优选的实施方案中,本发明的抗体抑制或降低由任一种或这两种形式BLyS诱导的B细胞增殖。在另一个优选的实施方案中,本发明的抗体抑制或降低由任一种或这两种形式BLyS诱导的免疫球蛋白产生。
在一个实施方案中,本发明提供了一种将本发明的抗体缀合物输送于靶细胞的方法,所述靶细胞例如是表达膜结合形式BLyS的单核细胞,或表达BLyS受体的B细胞。
在一个实施方案中,本发明提供了一种通过施用与异源多肽或核酸缔合的本发明分子将本发明的抗体和抗体缀合物特异输送于细胞的方法。在一个实施方案中,本发明提供了一种将一种治疗蛋白输送于靶细胞的方法。在另一个实施例中,本发明提供了将一种单链核酸(例如反义核酸或核酶)或双链核酸(例如能整合入细胞基因组或附加型复制及能被转录的核酸),输送至靶细胞的方法。
在另一个实施方案中,本发明提供了一种通过施用本发明的抗体或抗体缀合物(例如与放射性同位素,毒素,或细胞毒性前体药物缀合的抗体)以特异性破坏细胞(例如破坏肿瘤细胞)的方法。在另一个实施方案中,本发明提供了一种通过施用免疫特异性结合膜结合形式BlyS的本发明的抗体或抗体缀合物(例如与放射性同位素,毒素,或胞毒性前体药物缀合的抗体)以特异性破坏单核细胞系细胞(例如与白血病或淋巴瘤相关的单核细胞,例如急性白血病)的方法。在另一个特异实施方案中,本发明提供了一种通过施用结合可溶形式BlyS,但不抑制BlyS与其在B细胞上的受体结合的本发明的抗体或抗体缀合物(例如与放射性同位素,毒素,或胞毒性前体药物缀合的抗体)以特异性破坏B细胞系细胞(例如白血病或淋巴瘤相关的B细胞(例如慢性淋巴细胞性白血病,多发性骨髓瘤,非霍奇金淋巴瘤和霍奇金病))的方法。
在另一个优选的实施方案中,本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)促进或增强由可溶形式BLyS诱导的B细胞增殖。在另一个优选的实施方案中,本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)促进或增强由膜结合形式或可溶形式APRIL诱导的B细胞增殖。在另一个优选的实施方案中,本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)提高或增强由可溶形式BLyS诱导的免疫球蛋白产生。在另一个优选的实施方案中,本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)促进或增强由膜结合形式或可溶形式APRIL诱导的免疫球蛋白产生。在另一个优选的实施方案中,本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)提高或增强应答T细胞依赖性免疫原的免疫球蛋白产生。在另一个优选的实施方案中,本发明的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子)提高或增强应答T细胞非依赖性免疫原的免疫球蛋白产生。
在另一个实施方案中,将本发明在治疗或药物组合物施用于动物,以治疗,预防或减轻免疫功能失调。免疫功能失调包括但非限于自身免疫功能失调(例如关节炎,移植体排斥,Hashimoto′s甲状腺炎,胰岛素依赖型糖尿病,狼疮,特发性血小板减少性紫癜,系统性红斑狼疮和多发性硬化),选择性IgA缺陷,共济失调性毛细血管扩张,普通可变免疫缺陷(CVID),X-连锁的低血丙种球蛋白血症,重度联合免疫缺损(SCID),Wiskott-Aldrich综合征,特发性高嗜酸性粒细胞综合征,单核细胞性类白血病反应,单核细胞性白细胞增多,单核细胞性白细胞减少,单核细胞减少症,单核细胞增多症,和移植体排斥反应。
如本发明所揭示,本发明的抗体或抗体组合物可以用于在哺乳动物优选人体内治疗,预防,减轻,诊断或预测各种免疫系统相关的功能失调和/或与这些功能失调相关的病变。许多自身免疫功能失调得自免疫细胞把自身作为外源物而不适当地识别。这种不适当的识别导致引起破坏宿主组织的免疫应答。因此,施用能抑制免疫应答,尤其是抑制B细胞增殖和/或免疫球蛋白产生的本发明抗体和抗体组合物,可以有效治疗和/或预防自身免疫功能失调。因此,在优选的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物用于治疗,预防,减轻,诊断和/或预测自身免疫功能失调,或这种失调相关的病变。
可以用本发明的治疗和药物组合物治疗,预防,减轻,诊断和/或预测的自身免疫功能失调及与这些失调相关的病变,包括但非限于自身免疫性溶血性贫血,自身免疫性新生儿血小板减少,特发性血小板减少性紫癜,自身免疫性中性粒细胞减少,自身免疫性血细胞减少,溶血性贫血,抗磷脂综合征,皮炎,谷蛋白敏感性肠道病,变应性脑脊髓炎,心肌炎,复发性多软骨炎,风湿性心脏病,肾小球肾炎(例如IgA肾病),多发性硬化,神经炎,眼色素层眼炎,多发内分泌腺病,紫癜(例如Henloch-Scoenlein紫癜),Reiter’s病,Stiff-Man综合征,自身免疫性肺炎,心肌病,IgA肾小球肾炎,密集沉积疾病,风湿性心脏病,格林-巴利综合征,胰岛素依赖性糖尿病,和自身免疫性眼炎。
其他可以用本发明的治疗和药物组合物治疗,预防,减轻,诊断和/或预测的自身免疫功能失调及与这些失调相关的病变,包括但非限于自身免疫性甲状腺炎,甲状腺功能低下(即Hashimoto′s甲状腺炎)(通常以例如细胞介导和体液性甲状腺毒性为特征),系统性红斑狼疮(通常以例如循环性和局部产生的免疫复合物为特征),盘状狼疮,Goodpasture′s综合征(通常以例如抗基低膜抗体为特征),天疱疮(通常以例如表皮棘层松解抗体为特征),自身免疫性受体疾病例如(a)突眼性甲状腺肿(通常以例如甲状腺素受体抗体为特征),(b)重症肌无力(通常以例如乙酰胆碱受体抗体为特征)和(c)胰岛素抗性(通常以例如胰岛素受体抗体为特征),自身免疫性溶血性贫血(通常以例如抗体致敏的红细胞吞噬作用为特征),自身免疫性血小板减少性紫癜(通常以例如抗体致敏的血小板吞噬作用为特征)。
其他可以用本发明的治疗和药物组合物治疗,预防,减轻,诊断和/或预测的自身免疫功能失调及与这些失调相关的病变,包括但非限于类风湿性关节炎(通常以例如关节内的免疫复合物为特征),抗胶原抗体schleroderma(通常以例如核仁抗体或其他核抗体为特征),混合性结缔组织病(通常以例如可提取核抗原(例如以核糖核蛋白)抗体为特征),多发性肌炎/皮肌炎(通常以例如非组蛋白抗核抗体为特征),恶性贫血(通常以例如抗壁细胞,微粒体,和内在因子抗体为特征),特发性Addison′s病(通常以例如体液性或细胞介导的肾上腺细胞毒性为特征),不孕症(通常以例如抗精子抗体为特征),肾小球肾炎(通常以例如肾小球基底膜抗体或免疫复合物为特征)如原发性肾小球肾炎和IgA肾病,大疱性类天疱疮(通常以例如基底膜内的IgG和补体为特征),干燥综合征(通常以例如多组织抗体,和/或特异性非组蛋白抗核抗体((SS-B)为特征),糖尿病(通常以例如细胞介导的和体液介导的胰岛细胞抗体为特征),和肾上腺素抗性(包括哮喘或囊肿性纤维化的肾上腺素抗性)(通常以例如β肾上腺素受体抗体为特征),慢性活动性肝炎(通常以例如平滑肌抗体为特征),原发性胆汁性肝硬化(通常以例如线粒体抗体为特征),其它内分泌腺病变(通常以例如一些病例中的组织特异性抗体为特征),白癜风(通常以例如黑素细胞抗体为特征),血管炎(通常以例如血管壁内的Ig和补体和/或低血清补体为特征),后-MI(通常以例如心肌抗体为特征),心切开术综合征(通常以例如心肌抗体为特征),风疹(通常以例如IgE的IgG和IgM抗体为特征),遗传过敏性皮炎(通常以例如抗IgE的IgG和IgM抗体为特征),哮喘(通常以例如抗IgE的IgG和IgM抗体为特征),炎症性心肌病,和其它炎症,肉芽肿,退化和萎缩。
在优选的实施方案中,将本发明的治疗和药物组合物用于治疗,预防,减轻,诊断或预测下列疾病之一:自身免疫性溶血性贫血,原发肾小球肾炎,IgA肾小球肾炎,Goodpasture′s综合征,特发性血小板减少症,多发性硬化,天疱疮,多发性肌炎/皮肌炎,复发性多软骨炎,类风湿性关节炎,干燥综合征,系统性红斑狼疮,眼色素层炎,血管炎和原发性胆汁性硬化。
在另一个优选的实施方案中,本发明的治疗和药物组合物用于治疗,预防,减轻,诊断或预测一种基于免疫的风湿性疾病,例如SLE,类风湿性关节炎,CREST综合征(特征在于钙质沉着,雷诺现象,食管能动性失调,硬皮症,和毛细血管扩张的一种硬皮病),血清阴性脊椎关节病(SpA),多发性肌炎/皮肌炎,显微镜下多血管炎,丙型肝炎相关性关节炎,Takayasu’s动脉炎和未分化结缔组织病。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗和药物组合物用于治疗,预防,减轻,诊断或预测类风湿性关节炎和/或与其相关的病变。
例如,本发明的抗体用于治疗临床诊断为类风湿性关节炎(RA)的患者。所治疗的患者优选不具有B细胞恶性肿瘤。另外,所述患者任选地还用用于治疗RA的一或多种制剂治疗,如水杨酸盐;非类固醇类抗炎药物如消炎痛,保泰松,苯乙酸衍生物(例如布洛芬和fenoprofen),萘乙酸(萘普生),pyrrolealkanoic acid(tometin),吲哚乙酸(sulindac),卤化的邻氨基苯甲酸钠(meclofenamate sodium),piroxicam,氯苯酰二甲基吡咯乙酸,和抗疟药如氯喹;金制剂;青霉胺;或免疫抑制剂如氨甲蝶呤或皮质类固醇,剂量为这些药物的已知剂量或低于已知剂量。然而,优选地,所述患者只用本发明的抗体进行治疗。本发明的抗体施用于RA患者,所用剂量进度如下所述,这可为本领域技术人员轻易确定。初级反应通过Paulus指数确定(Paulus等,风湿性关节炎33:477-484(1990)),即晨僵,疼痛和红肿关节数,红细胞沉降(ESR)改善,及由患者和医生评价的5点病情程度标准中至少2点改善。施用本发明的抗体将减轻如上述治疗的患者的一或多种症状。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗和药物组合物用于治疗,预防,减轻,诊断或预测狼疮和/或与其相关的病变。可以用本发明抗体治疗,预防,减轻,诊断或预测的与狼疮相关的病变包括但非限于血液系统异常(例如溶血性贫血,血细胞减少症,淋巴细胞减少症,及血小板减少症),免疫功能失调(例如抗DNA抗体,和抗Sm抗体),光敏性皮疹,口腔溃疡,关节炎,发热,疲劳,体重减轻,浆膜炎(例如胸膜炎),肾脏疾病(例如肾炎),神经功能失调(例如癫痫,周围神经病变,中枢神经系统相关的病变),胃肠道病变,雷诺现象和心包炎。在一个优选的实施方案中,本发明的治疗和药物组合物用于治疗,预防,减轻,诊断或预测与系统性红斑狼疮相关的肾脏病变。在一个更优选的实施方案中,本发明的治疗和药物组合物用于治疗,预防,减轻,诊断或预测与系统性红斑狼疮相关的肾炎。在另一个更优选的实施方案中,将本发明的治疗和药物组合物施用于动物,以治疗,预防,改善狼疮或肾小球肾炎。
在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体用于治疗,抑制,预测,诊断或预防溶血性贫血。例如,用本发明的抗体治疗经诊断有自身免疫性溶血性贫血(AIHA)的患者,例如冷球蛋白血症或Coombs阳性贫血。AIHA是一种获得性溶血性贫血,归因于与患者的红细胞反应的自身抗体。所治疗的患者优选不具有B细胞恶性肿瘤。可以组合另外的辅助疗法(如糖皮质激素,强的松,咪唑硫嘌呤,环磷酰胺,荷载长春花的血小板或达那唑),但优选所述患者的整个治疗过程只用本发明抗体治疗。将本发明的抗体施用于溶血性贫血的患者,剂量进度如下文所述,所述剂量进度可易于由本领域技术人员确定。总体反应率的确定基于血细胞计数改善,输血需求降低,血色素水平改善和/或通过标准化学参数确定的溶血证据减少。为如上述治疗的溶血性贫血的患者施用本发明抗体,可以改善任一个或多个症状。例如,如上述治疗的患者示出血色素提高及溶血的化学参数改善或恢复到正常水平,如通过血清乳脱氢酶和/或胆红素测定。
在另一个特异的实施方案中,将本发明的治疗和药物组合物用于治疗,预防,改善,诊断或预测干燥综合征和/或与其相关的病变。
在另一个特异的实施方案中,将本发明的治疗和药物组合物用于治疗,预防,改善,诊断或预测HIV感染和/或与其相关的病变(例如AIDS)。
在另一个特异的实施方案中,将本发明的治疗和药物组合物用于治疗,预防,改善,诊断或预测重症肌无力和/或与其相关的病变。
在另一个特异的实施方案中,将本发明的治疗和药物组合物用于治疗,预防,改善,诊断或预测IgA肾病和/或与其相关的病变。
在另一个特异的实施方案中,将本发明的治疗和药物组合物用于治疗,预防,改善,诊断或预测溶血性贫血和/或与其相关的病变。
在另一个特异的实施方案中,将本发明的治疗和药物组合物用于治疗,预防,改善,诊断或预测甲状腺炎和/或与其相关的病变。
在另一个特异的实施方案中,将本发明的治疗和药物组合物用于治疗,预防,改善,诊断或预测Goodpasture′s综合征和/或与其相关的病变。
在另一个特异的实施方案中,将本发明的治疗和药物组合物用于治疗,预防,改善,诊断或预测多发性硬化和/或与其相关的病变。
在另一个特异的实施方案中,将本发明的治疗和药物组合物用于治疗,预防,改善,诊断或预测慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和/或与其相关的病变。
在另一个特异的实施方案中,将本发明的治疗和药物组合物用于治疗,预防,改善,诊断或预测多发性骨髓瘤和/或与其相关的病变。
在另一个特异的实施方案中,将本发明的治疗和药物组合物用于治疗,预防,改善,诊断或预测非霍奇金淋巴瘤和/或与其相关的病变。
在另一个特异的实施方案中,将本发明的治疗和药物组合物用于治疗,预防,改善,诊断或预测霍奇金病和/或与其相关的病变。
在另一个特异的实施方案中,将本发明的治疗和药物组合物用于治疗,预防,改善,诊断或预测成人免疫性血小板减少性紫癜。成人免疫性血小板减少性紫癜(ITP)是一种相对罕见的造血功能失调,构成最通常的免疫介导的血细胞减少。这种疾病的典型表现为严重的血小板减少伴急性出血,骨髓中存在正常至增多的巨核细胞。大多数ITP患者具有直接抗血小板膜表面靶抗原的IgG抗体,导致脾中的血小板汇集而且加速血小板在网状内皮组织破坏(Bussell,J.B.Hematol.Oncol.Clin.North Am.(4):179(1990))。许多治疗措施已经示出有效治疗ITP。类固醇通常认为是第一线治疗,之后大多数患者候选静脉内注射免疫球蛋白(IVIG),脾切除术,或其他医学治疗,包括应用长春新碱或免疫抑制剂/细胞毒制剂。接近80%的ITP患者最初对类固醇有反应,但很少完全或持续缓解。脾切除术已经认为是类固醇失效后的标准的第二线治疗,而且可达到接近60%的长期缓解,但可以导致抗感染免疫力降低。脾切除术是一种主要的外科手术程序,其可以出现相关并发症(15%)和死亡(2%)。IVIG也已经用作第二线治疗,尽管只有小部分成人ITP患者达到缓解。通过选择干扰激活的B细胞产生自身抗体的治疗,为一部分ITP患者提供了一种重要的治疗方法,这种方法没有皮质类固醇和/或脾切除术治疗中出现的相关的并发症。经临床诊断的ITP患者用本发明的抗体进行治疗,任选地组合类固醇治疗。所治疗的患者不具有B细胞恶性肿瘤。将本发明的抗体根据下文所述剂量进度施用于RA患者,所述剂量进度可以易于为本领域技术人员确定。患者的总体反应率是基于间隔两周的两个连续治疗后测定血小板计数而确定的。见George等“通过美国血液学学会揭示的方法产生的特发性血小板减少性紫癜实用指导”血液88:3-40(1996),在此一起全文并入参考。
在另一个实施方案中,将本发明的治疗或药物组合物实用于动物以治疗,预防或改善IgE-介导的过敏反应或组胺介导的过敏反应。过敏反应例如包括但非限于哮喘,鼻炎,湿疹,慢性风疹,和遗传性光过敏性皮炎。在另一个实施方案中,将本发明的治疗或药物组合物实用于动物以治疗,预防或改善过敏性反应,对抗原性分子超敏,或血型不相容。在另一个实施方案中,将本发明的治疗或药物组合物施用于动物以治疗,预防或改善或调节炎症或炎症性失调。可以用本发明的治疗和药物组合物治疗,预防或改善的慢性和急性炎症失调包括但非限于慢性前列腺炎,肉芽肿性前列腺炎和软化斑,与感染相关的炎症(例如脓毒性休克,脓血症,或全身性炎症反应综合征(SIRS)),缺血一再灌注损伤,内毒素致命性,关节炎,补体介导的超急性排斥,肾炎,细胞因子或趋化因子导致的肺部损伤,Crohn′s病,炎症性肠道疾病,慢性和急性肺部疾病,细菌感染,牛皮癣,败血病,脑疟,关节炎,胃肠炎,和肾小球肾炎。
在另一个实施方案中,将本发明的治疗或药物组合物施用于动物以治疗,预防或改善缺血和动脉硬化。这种病变例如包括但非限于再灌注损伤(例如在心或脑)和心脏肥大。
本发明的治疗和药物组合物还可以施用于动物,以调节血液凝集及治疗或预防凝血机能异常,例如抗体介导的血栓症(即抗磷脂抗体综合征(APS))。例如,本发明的治疗或药物组合物可以抑制参与抗心磷脂抗体产生的细胞的增殖和分化。本发明的这些组合物可以用于治疗,预防,改善,诊断和/或预测与血栓形成相关的病变,包括但非限于中风(和再发中风),心脏病发作,深静脉血栓,肺栓塞,心梗,冠心病(例如抗体介导的冠心病),血栓症,心血管手术后移植体再闭塞(例如冠状动脉侧支移植体),再发流产,再发心血管血栓。
还可以施用本发明的治疗或药物组合物治疗,预防或改善器官排斥或移植物抗宿主病(GVHD)和/或与其相关的病变。由宿主细胞发生的器官排斥通过免疫应答破坏移植的组织。相似地,免疫应答还参与GVHD,但在这种情况中,外源移植的免疫细胞破坏宿主组织。施用抑制免疫应答的本发明抗体,在预防器官排斥或GVHD中可以是一种有效疗法。
在另一个实施方案中,将本发明的治疗或药物组合物施用于动物以治疗,预防或改善与细胞程序死亡提高相关的一种疾病或病变,包括但非限于AIDS,神经退行性病变(如早老性痴呆,帕金森氏病,肌萎缩性脊髓侧索硬化,眼点视网膜炎,小脑退化),骨髓异常增生综合征(如再生障碍性贫血),缺血性损伤(如由心梗,休克和再灌注导致的损伤),毒素导致的肝脏病变(如由乙醇导致的),脓毒性休克,恶液质,厌食。在另一个实施方案中,将本发明的治疗或药物组合物施用于动物以治疗,预防或改善骨髓病变,例如再生障碍性贫血和骨髓异常增生综合征。
在另一个实施方案中,将本发明的治疗或药物组合物施用于动物以治疗,预防或改善恶性肿瘤的生长,进展和/或转移,及与细胞存活提高或抑制细胞程序死亡相关的增殖性病变。这种病变例如包括但非限于白血病(例如急性白血病如急性淋巴细胞性白血病,和急性单核细胞性白血病),新生物,肿瘤(例如纤维肉瘤,粘液肉瘤,脂肪肉瘤,软骨肉瘤,骨源性肉瘤,脊索癌,血管肉瘤,内皮肉瘤,淋巴肉瘤,淋巴内皮肉瘤,滑膜肉瘤,间皮瘤,Ewing′s肿瘤,平滑肌肉瘤,横纹肌肉瘤,结肠癌,胰腺癌,乳腺癌,卵巢癌,前列腺癌,鳞状上皮细胞癌,基底细胞癌,腺癌,汗腺癌,皮脂腺癌,乳癌,乳头状腺癌,囊腺癌,髓样癌,支气管癌,肾细胞癌,肝细胞癌,胆管癌,绒毛膜癌,精原细胞瘤,胚癌,Wilms′肿瘤,宫颈癌,睾丸癌,肺癌,小细胞肺癌,膀胱癌,上皮细胞癌,神经胶质瘤,星状细胞瘤,成神经管细胞瘤,颅咽管瘤,室鼓膜瘤,松果体瘤,成血管细胞瘤,蜗神经瘤,oligodendroglioma,脑膜瘤,黑素瘤,成神经细胞瘤,和眼癌),重链病,转移,或任何特征在于非控制的细胞生长的疾病或病变。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用于治疗或预防一种特征在于高γ球蛋白血症的疾病(例如AIDS,自身免疫疾病,和一些免疫缺陷)。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用于治疗或预防一种特征在于血清免疫球蛋白的产生不足,反复感染,和/或免疫系统功能紊乱的疾病。另外,本发明的治疗或药物组合物用于治疗或预防关节,骨,皮肤,感染和/或腮腺,血行播散性感染(例如脓血症,脑膜炎,脓毒性关节炎和/或骨髓炎),自身免疫疾病(例如本文所揭示的那些疾病),炎症疾病和恶性肿瘤,和/或与这些感染,疾病,功能失调和/或恶性肿瘤相关的任何疾病或功能失调或病变,包括但非限于CVID,其他原发免疫缺陷,HIV疾病,CLL,再发支气管炎,鼻窦炎,中耳炎,结膜炎,肺炎,肝炎,脑膜炎,带状疱疹(例如重度带状疱疹),和/或卡氏肺囊虫病。
本发明的治疗或药物组合物用于治疗或预防一或多种以下疾病或功能失调,或与其相关的病变:原发免疫缺陷,免疫介导的血小板减少症,Kawasaki综合征,骨髓移植(例如在成人或儿童中的新近骨髓移植),慢性B细胞淋巴细胞性白血病,HIV感染(例如成人或小儿HIV感染),慢性炎症性脱髓鞘多神经病变和输血后紫癜。
另外,本发明的治疗或药物组合物用于治疗或预防一或多种以下疾病或功能失调,或与其相关的病变:格林-巴利综合征,贫血(例如与细小病毒B19相关的贫血,有高感染危险(例如反复感染)的稳定的多发骨髓瘤患者,自身免疫性溶血性贫血(例如温抗体型自身免疫性溶血性贫血),血小板减少症(例如新生儿血小板减少症),和免疫介导的中性粒细胞减少症),移植(例如巨细胞病毒(CMV)阳性器官的CMV阴性受者),低丙种球蛋白血症(例如具有感染和死亡危险的低丙种球蛋白血症的婴儿),癫痫(例如难处理的癫痫),系统性血管炎综合征,重症肌无力(例如重症肌无力中的呼吸困难),和多发性肌炎。
本发明另外优选的实施方案包括但非限于在以下应用中使用本发明的治疗或药物组合物:
施用于动物(例如小鼠,大鼠,兔,仓鼠,,豚鼠,猪,小猪,鸡,骆驼,山羊,马,牛,绵羊,狗,猫,非人灵长类动物,和人,最优选人),以加强免疫系统产生数量增加的一或多种抗体(例如IgG,IgA,IgM,和IgE),诱导高亲和性抗体产生(例如IgG,IgA,IgM,和IgE),和/或提高免疫应答。在一个特异的实施方案中,施用本发明的治疗或药物组合物,以加强所述免疫系统产生数量增加的IgG。在另一个特异的实施方案中,施用本发明的治疗或药物组合物,以加强所述免疫系统产生数量增加的IgA.在另一个特异的实施方案中,施用本发明的治疗或药物组合物,以加强所述免疫系统产生数量增加的IgM。
施用于动物(包括但非限于以上列出的那些动物,而且还包括转基因动物),所述动物不能产生功能性内源性抗体分子,或具有一个受损的内源性免疫系统,但能通过来自另一个动物的重建或部分重建的免疫系统而产生人免疫球蛋白分子(见例如出版的PCT申请Nos.WO98/24893,WO/9634096,WO/9633735,和WO/9110741)。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用作疫苗佐剂,增强对特异性抗原的免疫应答。在一个特异的实施方案中,所述疫苗是本发明所述的一种抗体。在另一个特异的实施方案中,所述疫苗佐剂是本发明所述的一种多核苷酸(例如一种抗体多核苷酸产生的疫苗佐剂)。如本发明所述,本发明的治疗或药物组合物可以使用本领域已知的方法施用,包括但非限于脂质体输送,重组载体输送,注射裸DNA,及基因枪输送。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用作佐剂以增强肿瘤特异性免疫应答。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用作佐剂以增强抗病毒免疫应答。可以使用本发明的组合物作为佐剂而增强的抗病毒免疫应答,包括但非限于本发明所述的或本领域已知的与病毒相关的疾病或综合征。在一个特异的实施方案中,本发明的组合物用作佐剂以增强对选自以下的病毒,疾病或症状的免疫应答:AIDS,脑膜炎,登革热,EB病毒,和肝炎(例如乙型肝炎)。在另一个特异的实施方案中,本发明的组合物用作佐剂以增强对选自以下的病毒,疾病或症状的免疫应答:HIV/AIDS,呼吸道合胞病毒,登革热,轮状病毒,日本乙型脑炎,流感病毒A和B,副流感病毒,麻疹,巨细胞病毒,狂犬病,Junin,Chikungunya,Rift Valley fever,单纯疱疹,和黄热病。在另一个特异的实施方案中,本发明的组合物用作佐剂以增强对HIV gp120抗原的免疫应答。
在一个特异的实施方案中,本发明的组合物用作佐剂以增强抗细菌或抗真菌免疫应答。可以用本发明组合物作为佐剂而增强的抗细菌或抗真菌免疫应答,包括本发明所述的或本领域已知的细菌或真菌及与细菌或真菌相关的疾病或症状。在一个特异的实施方案中,本发明的组合物用作佐剂以增强对选自以下的细菌或真菌,疾病或症状的免疫应答:破伤风,白喉,肉毒中毒,和乙型脑膜炎。在另一个特异的实施方案中,本发明的组合物用作佐剂以增强对选自以下的细菌或真菌,疾病或症状的免疫应答:霍乱弧菌,分枝杆菌,沙门氏菌,副伤寒,脑膜炎双球菌,肺炎链球菌,乙型链球菌,志贺氏菌。产肠毒素的大肠杆菌,出血性大肠杆菌,疏螺旋体,和疟原虫(疟疾)。
在一个特异的实施方案中,本发明的组合物用作佐剂以增强对抗寄生虫的免疫应答。可以用本发明组合物作为佐剂增强的抗寄生虫免疫应答包括本发明所述的或本领域已知的寄生虫及与寄生虫相关的疾病或症状。在特异的实施方案中,本发明的组合物用作佐剂以增强对寄生虫的免疫应答。在另一个特异的实施方案中,本发明的组合物用作佐剂以增强对疟原虫(疟疾)的免疫应答。
在一个特异的实施方案中,本发明的组合物可以作为疫苗佐剂施用于患者。在一个更特异的实施方案中,本发明的组合物可以作为疫苗佐剂施用于免疫缺陷的患者。 在一个更特异的实施方案中,本发明的组合物可以作为疫苗佐剂施用于HIV患者。
在一个特异的实施方案中,本发明的组合物可以用于提高或增强对标准和实验疫苗的抗原特异性抗体应答。在一个特异的实施方案中,本发明的组合物可以用于增强经标准和实验疫苗处理的病人的血清转化。在另一个特异的实施方案中,本发明的组合物可以用于在对标准和实验接种的应答中提高抗体识别独特表位的所有功能。
在一个优选的实施方案中,本发明的抗体(包括抗体片段和变体,及抗-抗体抗体)通过调节可溶形式BLyS与其受体(例如BCMA和TACI)的结合,提高或增强对标准或实验疫苗的抗原特异性的抗体应答。在另一个优选的特异实施方案中,本发明的抗体(包括抗体片段和变体,及抗-抗体抗体),通过调节可溶形式APRIL与其受体(例如BCMA和TACI)的结合,提高或增强对标准或实验疫苗的抗原特异性的抗体应答。
在一个优选的实施方案中,本发明的抗体(包括抗体片段和变体,及抗-抗体抗体),通过调节可溶形式BLyS与其受体(例如BCMA和TACI)的结合,提高或增强用标准和实验疫苗治疗的患者的血清转化。在另一个优选的实施方案中,本发明的抗体(包括抗体片段和变体,及抗-抗体抗体),通过调节可溶形式APRIL与其受体(例如BCMA和TACI)的结合,提高或增强用标准和实验疫苗治疗的患者的血清转化。
在一个优选的实施方案中,本发明的抗体(包括抗体片段和变体,及抗-抗体抗体)通过调节可溶形式BLyS与其受体(例如BCMA和TACI)的结合,提高或增强抗体在对标准和实验接种的应答中识别独特表位的所有功能。在另一个优选的实施方案中,本发明的抗体(包括抗体片段和变体,及抗-抗体抗体),通过调节可溶形式APRIL与其受体(例如BCMA和TACI)的结合,提高或增强抗体在对标准和实验接种的应答中识别独特表位的所有功能。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用作B细胞对病原体应答的刺激剂。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用作在接受免疫抑制治疗之前,提高个体免疫状况的制剂。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用作产生高亲和性抗体的制剂。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用作提高血清免疫球蛋白浓度的制剂。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用作促进免疫抑制的个体的恢复的制剂。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用作加强老年人免疫应答的制剂。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用作在骨髓移植或其他移植(例如同种异体或异种器官移植)之前,期间或之后作为免疫系统增强剂。关于移植,本发明的组合物可以在移植之前,同时和/或之后施用。在一个特异的实施方案中,本发明的组合物是在移植之后,在T细胞群恢复开始之前施用的。在另一个特异的实施方案中,本发明的组合物第一次是在移植后在T细胞群开始恢复之后,但在B细胞群全部恢复之前施用的。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物在B细胞免疫缺陷的个体中用作加强免疫应答的制剂,例如在部分或完全脾切除的患者中。通过施用本发明的抗体和/或组合物可以改善或治疗的B细胞免疫缺陷,包括但非限于X连锁的重度联合免疫缺损(SCID),常染色体SCID,腺苷脱氨酶缺陷(ADA缺陷),X连锁的低丙种球蛋白血症(XLA),Bruton’s病,先天性低丙种球蛋白血症,X连锁的婴儿低丙种球蛋白血症,获得性低丙种球蛋白血症,成人发作的低丙种球蛋白血症,晚期发作的低丙种球蛋白血症,异常低丙种球蛋白血症,低丙种球蛋白血症,婴儿短暂低丙种球蛋白血症,不明低丙种球蛋白血症,无丙种球蛋白血症,普通可变的免疫缺陷(CVID)(获得性),Wiskott-Aldrich综合征(WAS),X-连锁的高IgM免疫缺陷,非X连锁的高IgM免疫缺陷,选择性IgA缺陷,IgG亚类缺陷(有或无IgA缺陷),正常或高水平Igs的抗体缺陷,胸腺瘤免疫缺陷,Ig重链缺失,κ链缺陷,B细胞淋巴增殖性功能失调(BLPD),选择性IgM免疫缺陷,隐性低丙种球蛋白血症(Swiss型),网状细胞发育不全,新生儿中性粒细胞减少症, 重度先天性白细胞减少,胸腺淋巴发育不全或具有免疫缺陷的发育不全,共济失调毛细血管扩张,短肢矮小,X连锁的淋巴增殖综合征(XLP),组合Igs免疫缺陷的Nezelof综合征,嘌呤核苷磷酸化酶缺陷(PNP),II型MHC缺陷(无淋巴细胞综合征),和重度联合免疫缺陷。
在一个特异的实施方案中,施用本发明的抗体和/或组合物治疗或改善选择性IgA缺陷。
在另一个特异的实施方案中,施用本发明的抗体和/或组合物治疗或改善共济失调毛细血管扩张。
在另一个特异的实施方案中,施用本发明的抗体和/或组合物治疗或改善普通可变免疫缺陷。
在另一个特异的实施方案中,施用本发明的抗体和/或组合物治疗或改善X连锁的低免疫球蛋白血症。
在另一个特异的实施方案中,施用本发明的抗体和/或组合物治疗或改善重度联合免疫缺陷(SCID)。
在另一个特异的实施方案中,施用本发明的抗体和/或组合物治疗或改善Wiskott-Aldrich综合征。
在另一个特异的实施方案中,施用本发明的抗体和/或组合物治疗或改善高IgM的X连锁的Ig免疫缺陷。
作为加强获得性B细胞功能丧失的个体免疫应答的制剂。可以通过施用本发明的抗体和/或组合物改善或治疗的导致获得性丧失B细胞功能的病变,包括但非限于HIV感染,AIDS,骨髓移植,和B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用作加强暂时免疫缺陷的个体免疫应答的制剂。可以通过施用本发明的抗体和/或组合物改善或治疗的导致暂时免疫缺陷的病变,包括但非限于从病毒感染中康复(例如流感),与营养不良相关的病变,从传染性单核细胞增多症中康复,或与应激状态相关的病变,从麻疹中康复,从输血中康复,从外科手术中康复。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用作由单核细胞,树状细胞,T细胞和/或B细胞呈递的抗原的调节剂。在一个实施方案中,抗体多肽或多核苷酸在体外或体内增强抗原呈递或对抗抗原呈递。另外,在相关的实施方案中,这种抗原呈递的增强或对抗可以用于抗肿瘤治疗或调节免疫系统。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用作粘膜免疫应答的介导剂。BlyS在单核细胞上的表达,BlyS受体在B细胞上的表达,及B细胞对BlyS的应答,提示其可以参与B细胞和单核细胞或其分化的子代之间的信号交换。这种活性许多方面与B细胞和T细胞之间的CD40-CD154信号化相似。本发明的抗BlyS抗体和组合物因此可以是对环境病原的T细胞非依赖型免疫应答的一种良好的调节剂。特别地,与粘膜位点相关的及对人体内许多自然免疫可应答的非传统的B细胞群(CD5+),可以应答本发明的抗体或组合物,从而增强或抑制个体免疫状况。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用作指导个体免疫系统产生与TH1细胞应答相反的体液应答(即TH2)。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用作导致肿瘤增殖并因此使其对抗肿瘤制剂更敏感的一种手段。例如,多发性骨髓瘤是一种缓慢分裂的疾病,及因此实际上难以被所有的抗肿瘤方案控制。如果使这些细胞更快速增殖,其敏感性很可能改变。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用作一种单核细胞特异性结合蛋白,以附着细胞生长的特异性激活剂或抑制剂。结果是强化这种激活剂或抑制剂对正常的,病变的,或癌变的B细胞群的活性。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物通过其特异性用作检测单核细胞的一种手段。这种应用需要用生物素或其它制剂(例如本发明所述)标记蛋白质,以提供检测方法。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物通过其特异性用作检测B细胞系细胞的一种手段。这种应用需要用生物素或其它制剂(例如本发明所述)标记蛋白质,以提供检测方法
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物在如AIDS,慢性淋巴细胞功能失调和/或普通可变免疫缺陷等病变中,作为B细胞产生的刺激剂。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用作单核细胞选择设施的一部分,其功能是从一种异源细胞混合物中分离单核细胞。本发明的抗体可以偶联于固体支持物,然后单核细胞特异地与其结合。冲洗去未结合的细胞,随后洗脱结合的细胞。使用这种选择可以在移植之前从例如骨髓或周围血中除去肿瘤细胞。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用作B细胞选择设施的一部分,其功能是从一种异源细胞混合物中分离B细胞。结合可溶性BLyS的本发明的抗体(不抑制BLyS/BLyS受体相互作用)可以偶联于固体支持物,然后B细胞特异地与其结合。冲洗去未结合的细胞,随后洗脱结合的细胞。使用这种选择可以在移植之前从例如骨髓或周围血中除去肿瘤细胞。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物可用在手术,外伤或遗传缺陷后淋巴组织产生和/或再生的一种疗法。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用作遗传获得的导致无免疫能力的病变(如在SCID患者中观测到的)一种基于基因的疗法。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用作抗原,产生抗体以抑制或增强BLyS介导的应答。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用作激活单核细胞/巨噬细胞的手段,以抵御影响单核细胞的寄生虫病如利什曼原虫。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用于在移植之前预处理骨髓样品。这种处理提高B细胞表现度并因此加快恢复。
在一个特异的实施方案中,本发明的治疗或药物组合物用于调节分泌的细胞因子,所述细胞因子是由BLyS和/或BLyS受体激发的。
本发明的抗体多肽或多核苷酸可以用于在体外或体内调节IgE浓度。
另外,本发明的多肽或多核苷酸可以用于治疗,预防和/或诊断IgE介导的过敏反应。这种过敏反应包括但非限于哮喘,鼻炎,和湿疹。
在一个特异的设施方案中,施用本发明的抗体多肽或多核苷酸治疗,预防,诊断和/或改善选择性IgA缺陷。
在另一个特异的设施方案中,施用本发明的抗体多肽或多核苷酸治疗,预防,诊断和/或改善共济失调毛细血管扩张。
在另一个特异的设施方案中,施用本发明的抗体多肽或多核苷酸治疗,预防,诊断和/或改善普通可变免疫缺陷。
在另一个特异的设施方案中,施用本发明的抗体多肽或多核苷酸治疗,预防,诊断和/或改善X-连锁的低丙种球蛋白血症。
在另一个特异的设施方案中,施用本发明的抗体多肽或多核苷酸治疗,预防,诊断和/或改善重度联合免疫缺陷(SCID)。
在另一个特异的设施方案中,施用本发明的抗体多肽或多核苷酸治疗,预防,诊断和/或改善Wiskott-Aldrich综合征。
在另一个特异的设施方案中,施用本发明的抗体多肽或多核苷酸治疗,预防,诊断和/或改善高IgM的X-连锁的Ig缺陷。
在一个特异的设施方案中,施用本发明的抗体多肽或多核苷酸治疗,预防,诊断和/或改善高IgM的X连锁的Ig缺陷。
在另一个特异的设施方案中,施用本发明的抗体多肽或多核苷酸治疗,预防,和/或诊断慢性髓性白血病,白血病,组织细胞性白血病,单核细胞性白血病(例如急性单核细胞性白血病),白血病网状细胞过多症,Shilling型单核细胞白血病,和/或其它源于单核细胞和/或单核细胞系细胞和/或组织的白血病。
在另一个特异的设施方案中,施用本发明的抗体多肽或多核苷酸治疗,预防,诊断和/或改善单核细胞性类白血病反应,例如在肺结核中所见。
在另一个特异的设施方案中,施用本发明的抗体多肽或多核苷酸治疗,预防,诊断和/或改善单核细胞性白细胞增多,单核细胞性白血病减少,单核细胞减少症和/或单核细胞增多症。
在一个特异的设施方案中,施用本发明的抗体多肽或多核苷酸治疗,预防,检测和/或诊断单核细胞功能失调和/或疾病,和/或与其相关的病变。
在一个特异的设施方案中,施用本发明的抗体多肽或多核苷酸治疗,预防,检测和/或诊断原发B淋巴细胞功能失调和/或疾病,和/或与其相关的病变。在一个设施方案中,这种原发B淋巴细胞功能失调,疾病,和/或与其相关的病变,特征在于完全或部分丧失体液免疫。特征在于完全或部分丧失体液免疫,及可以用本发明组合物预防,治疗,检测和/或诊断的原发B淋巴细胞功能失调,疾病和/或与其相关的病变,包括但非限于X连锁的低丙种球蛋白血症(XLA),重度联合免疫缺陷(SCID),和选择性IgA缺陷。
在一个优选的设施方案中,本发明的抗体多肽或多核苷酸用于治疗,预防和/或诊断影响机体的任一种或多种粘膜的疾病或功能失调,或与其相关的病变。这种疾病或功能失调包括但非限于例如mucositis,mucoclasis,粘膜大肠炎,粘膜皮肤利什曼虫病(例如美国利什曼虫病利什曼虫病美国人,鼻咽利什曼虫病,和新大陆利什曼虫病),粘膜皮肤淋巴结综合征(例如Kawasaki病),粘膜肠炎,粘膜上皮癌,粘膜上皮肿瘤,粘膜上皮发育不良,粘液样癌, 粘液样变性;粘液瘤病变性,粘液样中央变性(例如膀胱动脉中层坏死),粘脂沉积症(包括例如I型粘脂沉积症,II型粘沉积症,III型粘脂沉积症,IV型粘脂沉积症),mucolysis功能失调,粘膜肠炎,mucoenteritis,粘多糖病(例如I型粘多糖病(即Hurler′s综合征),IS型粘多糖病(即Scheie′s综合征或V型粘多糖病),II型粘多糖病(即Hunter′s综合征),III型粘多糖病(即Sanfilippo′s综合征),IV型粘多糖病(即Morquio′s综合征),VI型粘多糖病(即Maroteaux-Lamy综合征),VII型粘多糖病(即归因于β-glucuronidase缺乏所致粘多糖病),和mucosulfatidosis),mucopolysacchariduria,粘液脓性结肠炎,mucopus,mucormycosis(即zygomycosis),粘膜病(即牛病毒腹泻),粘液性结肠炎(例如,mucocolitis和myxomembranous结肠炎),和mucoviscidosis(例如囊肿型纤维化,胰腺囊肿性纤维化,Clarke-Hadfield综合征,胰腺的纤维囊性病变,mucoviscidosis,和viscidosis).在一个特别优选的设施方案中,本发明的抗体多肽或多核苷酸用于治疗,预防,和/或诊断mucositis,尤其与化疗相关。
在一个优选的设施方案中,本发明的抗体多肽或多核苷酸用于治疗,预防和/或诊断影响或与鼻窦炎相关的疾病或功能失调。
另一个可以用本发明抗体多肽或多核苷酸治疗,预防和/或诊断的病变,疾病或症状是骨髓炎。
另一个可以用本发明抗体多肽或多核苷酸治疗,预防和/或诊断的病变,疾病或症状是心内膜炎。
所有上述应用同样可以用于兽医学。
本发明的抗体多肽或多核苷酸可以用于治疗,预防和/或诊断肺系疾病或功能失调(例如支气管如鼻窦肺和支气管感染和与这些疾病或功能失调相关的病变和其它呼吸道疾病和功能失调)。在同样的实施方案中,这种疾病和功能失调包括但非限于支气管腺瘤,支气管哮喘,肺炎(例如支气管肺炎,和结核性支气管肺炎),慢性阻塞性肺部疾病(COPD),支气管扩张(例如干性支气管扩张,管型支气管扩张和囊性支气管扩张),支气管腺癌,支气管癌,细支气管炎(如渗出性细支气管炎,细支气管fibrosa obliterans,和增殖性细支气管炎),支气管肺泡癌,支气管哮喘,支气管炎(例如哮喘性支气管炎,Castellani′s支气管炎,慢性支气管炎,格鲁布性支气管炎,纤维蛋白支气管炎,出血性支气管炎,传染性鸟支气管炎,闭塞性支气管炎,plastic支气管炎,假膜支气管炎,腐败的支气管炎,和虫害支气管炎),支气管性肉芽肿病,支气管水肿, 支气管食管瘘,支气管原癌,支气管原囊肿,支气管结石,支气管霉菌病(如支气管肺曲霉病),支气管肺螺旋体病,出血性支气管炎,支气管粘液溢,支气管痉挛,bronchostaxis,支气管狭窄,Biot′s呼吸,支气管呼吸,Kussmaul呼吸,Kussmaul-Kien呼吸,呼吸性酸中毒,呼吸性碱中毒,新生儿呼吸窘迫综合征,呼吸不足,呼吸道硬结,呼吸道合胞病毒等。
在一个特异的实施方案中,本发明的抗体多肽或多核苷酸用于治疗,预防,和/或诊断慢性阻塞性肺部疾病(COPD)。
在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体多肽或多核苷酸用于治疗,预防,和/或诊断纤维化或与纤维化相关的病变,包括但非限于囊肿性纤维化(包括如胰腺囊肿性纤维化,Clarke-Hadfield综合征,胰腺纤维性病变,胰腺纤维性囊肿病和viscidosis),心肌内纤维化,先天性腹膜后纤维化,柔脑脊膜纤维化,纵隔纤维化,表皮下小结纤维化,中枢周围纤维化,肌周围纤维化,咽鼓管纤维化,置换纤维化subadventitial纤维化,和Symmers′clay咽鼓管纤维化。
在另一个实施方案中,将本发明的治疗或药物组合物施用于动物,治疗,预防或改善感染性疾病。感染性疾病包括与酵母,真菌,病毒和细菌感染相关的疾病。可以根据本发明治疗或预防的,导致病毒感染的病毒包括但非限于逆转录病毒(例如I型和II型人T细胞嗜淋巴细胞病毒(HTLV)和人免疫缺陷病毒(HIV)),疱疹病毒(例如I型和II型单纯疱疹病毒(HSV),Epstein-Barr病毒,HHV6-HHV8,和巨细胞病毒),沙粒病毒(例如拉沙热病毒),副粘病毒(例如麻疹病毒,人呼吸道合胞病毒,腮腺炎病毒,和肺病毒),腺病毒,布尼奥罗病毒(例如汉坦病毒),cornaviruses,线状病毒(例如Ebola病毒),fiaviviruses(例如丙肝病毒(HCV),黄热病病毒,和日本脑炎病毒),嗜肝DNA病毒(例如乙肝病毒(HBV)),正年病毒(例如流感病毒A,B和C),乳多空病毒(例如乳头瘤病毒)小核糖核酸病毒(例如鼻病毒,肠道病毒和甲肝病毒),痘病毒,呼肠弧病毒(例如轮状病毒),外衣病毒(例如风疹病毒),棒状病毒(例如狂犬病毒)。导致细菌感染的微生物病原包括但非限于化脓链球菌,肺炎链球菌,淋病奈瑟氏球菌,脑膜炎奈瑟氏球菌白喉棒杆菌,肉毒梭菌,产气荚膜梭菌,破伤风梭菌,流感嗜血菌,肺炎克雷伯氏菌,肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种,肺炎克雷伯氏菌鼻硬结亚种,金黄色葡萄球菌,霍乱弧菌,大肠杆菌,铜绿假单胞菌,胚胎弯曲杆菌,空肠弯曲国际,嗜水气单胞菌,蜡状芽孢杆菌,迟钝爱德华氏菌,小肠结肠炎耶尔森氏菌,鼠疫耶尔森氏菌,假结核耶尔森氏菌,痢疾志贺氏菌,弗氏裂解志贺氏菌,索氏志贺氏菌,鼠伤寒沙门氏菌,苍白密螺旋体,极细密螺旋体,斑点病密螺旋体,奋森氏疏螺旋体,布氏疏螺旋体,Leptospiraicterohemorrhagiae,结核分支杆菌,Toxoplasma gondii,Pneumocystiscarinii,土拉热弗朗西丝氏菌,流产布鲁氏菌,猪布鲁氏菌,马耳他布鲁氏菌,枝原体spp.,普氏立克次氏体,恙虫热立克次氏体,衣原体spp.,和幽门螺杆菌。
基因治疗
在一个特异的实施方案中,施用包含编码抗体或其功能衍生物的序列的核酸,通过基因疗法治疗,抑制或预防与BLyS和/或其受体异常表达和/或活性相关的疾病或功能失调。基因治疗是指通过为对象施用表达的或可表达的核酸进行治疗。在本发明的这个实施方案中,所述核酸产生其编码的蛋白质,产生治疗效应。
根据本发明,可以使用本领域可用的的基因治疗的任何方法。例如以下阐述了一些方法。
针对基因治疗的一般方法,见Goldspiel等,临床药理学12:488-505(1993);Wu和Wu,生物治疗3:87-95(1991);Tolstoshev,药物毒性学分析研究32:573-596(1993);Mulligan,科学260:926-932(1993);及Morgan和Anderson,生物化学分析研究62:191-217(1993);May,TIBTECH 11(5):155-215(1993)。可以使用的本领域已知的重组DNA技术的方法见于Ausubel等编辑,分子生物学通用方法,JohnWiley & Sons,NY(1993);及Kriegler,基因转移和表达实验指导,Stockton出版社,NY(1990)。
在一个优选方面,本发明的组合物包含编码抗体的核酸,所述核酸是在适当的宿主中表达抗体或其片段或嵌合蛋白或重链或轻链的表达载体的一部分。特别地,这种核酸具有启动子,优选异源启动子,可操纵地连于抗体编码区,所述启动子是可诱导的或组成型的,并任选地是组织特异性的。在另一个特别的实施方案中,所使用的核酸分子其中所述抗体的编码序列和任何其它所需序列,位于在基因组中所需位点促进同源重组的区域两侧,因此提供抗体编码核酸在染色体内表达(Koller和Smithies,美国科学院院报86:8932-8935(1989);Zijlstra等,自然342:435-438(1989))。在一个特异的实施方案中,表达的抗体分子是scFv;或者,所述核酸序列包括编码抗体重链和轻链的序列,或其片段或变体。
将所述核酸可以直接或间接输送于患者,直接输送是将患者直接暴露于所述核酸或携带核酸的载体,间接输送是将细胞首先用所述核酸在体外转化,然后移植入患者体内。这两种方法分别称为体内或离体基因治疗。
在一个特异的实施方案中,所述核酸序列是直接在体内施用以表达产生其编码的产物。这可以通过本领域已知的任何方法完成,例如通过将它们构建为适当的核酸表达载体的一部分,并施用以使其成为胞内的,例如通过使用缺陷的或弱化的逆转录病毒载体或其它病毒载体感染(见美国专利No.4,980,286),或通过直接注射裸DNA,或通过微粒轰击(例如基因枪;Biolistic,Dupont),或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被,包装在脂质体,微粒或微囊中,或通过将其与已知进入核的肽连接施用,通过将其与配体连接进行受体介导的胞吞(见例如Wu和Wu,生物化学杂志262:4429-4432(1987))(其可以用于定向特异性表达所述受体的细胞)等。在另一个实施方案中,可以形成核酸—配体复合物,其中所述配体包含一种融合病毒肽,破坏内涵体,使所述核酸免于被溶酶体降解。在另一个实施方案中,所述核酸可以在体内定向以进行细胞特异性摄取和表达,通过定向一个特异性受体进行(见例如PCT出版物WO 92/06180;WO 92/22635;WO92/203 16;WO93/14188,WO 93/20221)。或者,所述核酸可以导入细胞内,并掺入宿主细胞DNA内以表达,通过同源重组进行(Koller和Smithies,美国科学院院报86:8932-8935(1989);Zijlstra等,自然342:435-438(1989))。
在一个特异的实施方案中,使用含有编码本发明抗体或其片段或变体的核酸序列的病毒载体。例如,可以使用逆转录病毒载体(见Miller等,酶学方法217:581-599(1993))。这些逆转录病毒含有正确包装病毒基因组及整合入宿主细胞DNA所必需的成分。将编码基因治疗中所用抗体的核酸序列克隆入一或多个载体中,所述载体促进所述基因输送至患者体内。关于逆转录病毒的更详细阐述可见于Boesen等,生物治疗6:29 1-302(1994),其阐述了使用一种逆转录病毒将mdr 1基因输送至造血干细胞中,以使所述干细胞对化疗更有抗性。其它例证了在基因治疗中使用逆转录病毒的参考文献见于:Clowes等,临床研究杂志93:644-651(1994);Klein等,血液83:1467-1473(1994);Salmons和Gunzberg,人体基因治疗4:129-141(1993);及Grossman和Wilson,遗传和发育中的通用观点3:110-114(1993)。
腺病毒是可用于基因治疗中的其它病毒载体。腺病毒是将基因输送于呼吸道上皮的特别有效的运载体。腺病毒自然感染呼吸道上皮,在此其导致轻微的疾病。基于腺病毒的输送系统的其它靶位是肝,中枢神经系统,内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能感染非分裂的细胞的优点。Kozarsky和Wilson(遗传学和发育中的通用观点3:499-503(1993))提出了一种关于基于腺病毒的基因治疗的评价。Bout等(人体基因治疗5:3-10(1994))论证了使用腺病毒载体将基因转移至恒河猴呼吸道上皮。在基因治疗中使用腺病毒的其它例子可见于Rosenfeld等,科学252:431-434(1991);Rosenfeld等,细胞68:143-155(1992);Mastrangeli等,临床研究杂志91:225-234(1993);PCT出版物WO94/12649;及Wang,等,基因治疗2:775-783(1995)。在一个优选的实施方案中。使用腺病毒载体。
腺相关病毒(AAV)已经被提议用于基因治疗中(Walsh等,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289-300(1993);美国专利No.5,436,146)。
基因治疗的另一种方法包括将基因移至组织培养的细胞中,通过如电穿孔,脂染,磷酸钙介导的转染,或病毒感染等方法。通常地,所述转移方法包括将一个可选择标记移至所述细胞。然后将此细胞在选择下放置,以分离已经摄取并表达转移的基因的那些细胞。然后将那些细胞输送于患者。
在这个实施方案中,在体内施用所得重组细胞之前,将所述核酸导入细胞中。这种导入可以通过本领域已知的任何方法进行,包括但非限于转染,电穿孔,微注射,用含有所述核酸序列的病毒或噬菌体载体感染,细胞融合,染色体介导的基因转移,微细胞介导的基因转移,原生质体融合等。本领域已知许多将外源基因导入细胞的方法(见例如Loeffler和Behr,酶学方法217:599-618(1993);Cohen等,酶学方法217:618-644(1993);临床药物治疗29:69-92m(1985)),根据本发明可以使用这些方法,使受体细胞的必需发育和生理功能不被破坏。所述技术应稳定地将所述核酸移至细胞,以便所述核酸由细胞表达,及优选地可由其子代继承和表达。
所得重组细胞可以通过本领域移至的各种方法输送于患者。重组的血细胞(例如造血干细胞或前体细胞)优选通过静脉内注射施用。所用细胞数量依赖于所需作用,患者状态等而定,并可以由本领域技术人员确定。
将核酸导入其中以进行基因治疗的细胞,涵盖了任何所需的可获得的细胞,包括但非限于上皮细胞,内皮细胞,成纤维细胞,肌细胞,肝细胞;血细胞如T淋巴细胞,B淋巴细胞,单核细胞,巨噬细胞,中性粒细胞,嗜酸性粒细胞,巨核细胞,粒细胞;各种干细胞或前体细胞,尤其造血干细胞或前体细胞,例如得自骨髓,脐带血,周围血,胎儿肝脏的细胞等。
在一个优选的实施方案中,用于基因治疗的细胞为患者的自体细胞。
在一个使用重组细胞进行基因治疗的实施方案中,将编码抗体或其片段的核酸序列导入细胞中,这样其可由细胞或其子代表达,然后将所述重组的细胞体内施用以进行治疗。在一个特异的实施方案中,施用干细胞或前体细胞。根据本发明的这个实施方案,优选使用可以在体外分离并维持的任何干细胞和/或前体细胞(见例如PCT出版物WO 94/08598;Stemple和Anderson,细胞71:973-985(1992);Rheinwald,细胞生物学方法21A:229(1980);及Pittelkow和Scott,Mayo Clinic Proc.61:771(1986))。
在一个特异的实施方案中,导入的以进行基因治疗的核酸包含一个可诱导启动子,其可操纵地连接于编码区,这样所述核酸的表达可通过存在或不存在适当的转录诱导剂而控制。
本发明的化合物优选在体外测试,然后在体内测试所需的治疗或预防活性,之后用于人体。例如,可以使用的确定是否需要施用本发明特异抗体或组合物的体外分析,包括体外细胞培养分析,其中将患者组织样品在培养物中生长,并暴露于或另外施用一种本发明的抗体或组合物,观测本发明这种抗体或组合物对所述组织样品的作用。在各种特异的实施方案中,可以用参与患者疾病的代表性细胞进行体外分析,以确定本发明的抗体或组合物对这种细胞是否具有所需的作用。优选地,本发明的抗体或组合物也在体外分析和动物模型系统中进行测试,之后施用于人体。
用于治疗的本发明抗体或组合物,可以在适当的动物模型系统中测试其毒性,包括但非限于大鼠,小鼠,鸡,牛,猴和兔。针对测试抗体或组合物毒性,可以使用本领域已知的任何动物模型系统。
治疗或预防病毒感染的效力,可以通过检测本发明抗体或组合物抑制病毒复制,抑制传播或阻止病毒在其宿主中安置,或预防,改善或减轻疾病进展的能力而论证。如果在施用本发明抗体或组合物后,病毒荷载减少,一或多个症状改善,或死亡率和/或发病率降低,则认为所述治疗具有治疗效力。
可以测试本发明的抗体或组合物诱导细胞因子如IFN-γ表达的能力,通过将细胞优选人体细胞与本发明的抗体或组合物或对照抗体或对照组合物接触,并确定本发明抗体或组合物诱导一或多个细胞因子的能力。可使用本领域已知的技术测定细胞因子的表达水平。例如,细胞因子的表达水平可以通过以下方法测定:通过例如RT-PCR和Northern印迹分析分析细胞因子的RNA水平,及通过例如免疫沉淀随后通过Werstern印迹分析和ELISA分析细胞因子的水平。在一个优选的实施方案中,测试本发明的一种化合物诱导IFN-γ表达的能力。
可以测试本发明抗体或组合物调节免疫细胞生物活性的能力,通过将免疫细胞优选人免疫细胞(例如T细胞,B细胞和天然杀伤细胞)与本发明的抗体或组合物或一种对照的化合物接触,并确定本发明抗体或组合物调节(即提高或降低)免疫细胞生物活性的能力。本发明抗体或组合物调节免疫细胞生物活性的能力,可以通过检测抗原的表达,检测免疫细胞的增殖(即B细胞增殖),检测信号分子的活化,检测免疫细胞的效应器功能,或检测免疫细胞的分化而确定。可以使用本领域已知的技术测定这些活性。例如,细胞增殖可以通过3H-胸苷掺入分析和台盼蓝细胞计数确定。抗原表达可以通过例如免疫分析确定,所述分析包括但非限于竞争性和非竞争性分析系统,使用如Werstern印迹,免疫组织化学放射免疫分析,ELISA(酶联免疫吸附测定),“夹心”免疫分析,免疫沉淀分析,沉淀反应,凝胶扩散沉淀反应,免疫扩散分析,凝集反应,补体固定分析,免疫放射性分析,荧光免疫分析,蛋白A免疫分析和FACS分析。信号分子的活化可以通过例如激酶分析和电泳迁移分析(EMSAs)确定。在一个优选的实施方案中,测定本发明的抗体或组合物诱导B细胞增殖的能力。在另一个优选的实施方案中,测定本发明的抗体或组合物调节免疫球蛋白表达的能力。
可以在体外,离体和体内分析中,测试本发明抗体或组合物降低肿瘤形成的能力。还可以在体外和体内分析中,测试本发明抗体或组合物抑制病毒复制或降低病毒荷载的能力。还可以在本领域已知的体外和体内分析中,测试本发明抗体或组合物降低细菌数目的能力。还可以测试本发明的抗体或组合物减轻与癌症,免疫功能失调(例如炎症),神经功能失调或感染性疾病相关的一或多种症状的能力。还可以测试本发明抗体或组合物降低感染性疾病的感染次数的能力。另外,还可以测试本发明的抗体或组合物提高患病动物的存活期的能力,所患疾病包括癌症,免疫功能失调或感染性疾病。可以使用本领域已知的方法分析本发明抗体或组合物在体内的功能。
治疗/预防组合物及使用
本发明提供了治疗,抑制和预防方法,是为对象施用有效量的本发明抗体(或其片段或变体)或药物组合物,优选本发明抗体。在一个优选的方面,本发明的抗体或其片段或变体是基本纯化的(即基本没有限制其作用或产生非所需副作用的物质)。所述对象优选是动物,包括但非限于如牛,猪,马,鸡,猫,狗等动物,优选是哺乳动物,最优选是人。
当所述化合物包含一种核酸或免疫球蛋白时,施用配方和方法如上所述;另外的适当施用配方和途径,可以选自以下所述那些配方和途径。
已知许多输送系统可以用于施用本发明的抗体或其片段或变体,例如包装在脂质体,微粒,微囊,能表达抗体或抗体片段的重组细胞,受体介导的胞吞(见例如Wu和Wu,生物化学杂志262:4429-4432(1987)),将一种核酸构建为逆转录病毒载体或其它载体的一部分等。导入方法包括但非限于皮内,肌内,腹膜内,静脉内,皮下,鼻内,硬脑膜和口服途径。所述组合物可以通过任何常规途径施用,例如通过输注或冲击量注射,通过经上皮或粘膜与皮肤内层吸收(例如口腔粘膜,直肠粘膜和小肠粘膜等),及可以与其它生物活性剂一起施用。可以全身性或局部施用。另外,可以通过任何适当途径将本发明的药物组合物导入中枢神经系统,包括心室内和鞘内注射;心室内注射通过例如附于reservoir如Ommaya reservoir的心室内导管可以便于进行。也可以肺部施用,例如通过使用吸入器或喷雾器,用形成雾状的制剂配制。
在一个特异的实施方案中,可以将本发明的药物组合物局部施用于需要处理的部位;这可以通过例如但非限于在手术期间局部灌注,局部应用例如在手术后与伤口敷料联合应用,通过注射,通过导管,通过栓剂,或通过植入物,所述植入物是多孔的,无孔的或凝胶物,包括膜,如塑料膜或纤维膜。优选地,当施用本发明的蛋白包括抗体时,必需注意使用不吸附蛋白质的材料。
在另一个实施方案中,所述组合物可以在一种运载体中输送,特别是在脂质体中(见Langer,科学249:1527-1533(1990);Treat等,感染性局部和癌症治疗中的脂质体,Lopez-Berestein和Fidler(编辑),Liss,纽约,pp.353-365(1989);Lopez-Berestein,如前,pp.3 17-327;如前)。
在另一个实施方案中,所述组合物可以在一个控制释放系统中输送。在一个实施方案中,可以使用泵(见Langer,如前;Sefton,CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:20 1(1987);Buchwald等,外科学88:507(1980);Saudek等,N.Engl.J.Med.321:574(1989))。在另一个实施方案中,可以使用聚合物(见控制释放的医学应用,Langer和Wise(编辑),CRC出版社,Boca Raton,Florida(1974);控制的药物生物可利用度,药物制品设计和性能,Smolen和Ball(编辑),Wiley,纽约(1984);Ranger和Peppas,J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61(1983);Levy等,科学228:190(1985);During等,Ann.Neurol.25:351(1989);Howard等,J.Neurosurg.7 1:105(1989))。在另一个实施方案中,可以将一种控制释放的系统置于接近治疗靶位即脑的附近,这样只需要全身用量的一部分(见例如Goodson,控制释放的医学应用,如前,第2卷pp.115-138(1984))。
其它控制释放系统见于Langer所述(科学249:1527-1533(1990))。
在本发明组合物是一种编码蛋白质的核酸的一个特异实施方案中,所述核酸可以体内施用以促进其编码的蛋白质的表达,通过将其构建为一种适当的核酸表达载体的一部分并施用,以便成为胞内的,例如通过使用逆转录病毒载体(见美国专利No.4,980,286),或通过直接注射,或通过使用微粒轰击(例如基因枪;Biolistic,Dupont),或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被,或通过将其与已知进入核的一种类同源框肽连接而施用(见例如Joliot等,美国科学院院报88:1864-1868(1991))等。或者,可以通过同源重组将核酸导入胞内并掺入宿主细胞内表达。
本发明还提供了药物组合物。这种组合物包含一种有效治疗剂量的抗体或其片段,及一种药物适当的载体。在一个特异的实施方案中,术语“药物适当的”是指联邦政府管理机构认可的或美国药典或其它认可的药典里列出的,用于动物尤其人体的那些载体。术语“载体”是指使用其施用治疗剂的一种稀释剂,佐剂,赋形剂或运载体。这种药物可以是无菌液体如水和油,包括那些源于石油,动物,植物或合成品,如花生油,豆油,矿物油,芝麻油等。当所述药物组合物静脉内施用时,水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖溶液和甘油溶液也可以用作液体载体,尤其针对可注射溶液。适当的药物赋形剂包括淀粉,葡萄糖,乳糖,蔗糖,凝胶,麦芽,米,面粉,石灰,硅胶,硬脂酸钠,甘油一酯,滑石,氯化钠,干燥脱脂奶,甘油,乙二醇,水,乙醇等。如果需要,本发明的组合物还可以包含微量增湿剂或乳化剂,或pH缓冲剂。这些组合物可以是溶液,悬浮液,乳化液,片剂,药丸,胶囊,粉末,缓释配方等。所述组合物可以配制为栓剂,用传统的结合剂和载体如甘油三酯配制。口服配方可以包括标准载体如药物级甘露醇,乳糖,淀粉,硬脂酸镁,糖精钠,纤维素,碳酸镁等。适当的药物载体例如见于E.W.Martin“Remington′s药物学”所述。这种组合物含有一种治疗有效量的抗体或其片段,优选是纯化形式,及适量的载体,以为患者提供正确的施用方式。所述配方应适于施用模式。
在一个优选的实施方案中,所述组合物是根据配制静脉内施用于人的药物组合物的常规方式配制的。典型地,静脉内施用的组合物是在无菌等渗水缓冲液中的溶液。如果需要,所述组合物还可以包括一种增溶剂和一种局部麻醉剂如lignocamne,以减轻注射部位的疼痛。通常地,配料在单位剂量中是单独或混合一起,例如在密封容器的冻干粉末或无水浓缩物,所述容器如是指示活性剂数量的安瓶或sachette。如所述组合物是通过输注施用,其可以输液瓶分发,所述输液瓶中含有无菌药物级水或盐水。在所述组合物是通过注射施用之处,提供一安瓶的注射用水或盐水,以便所述配料可以在施用之前混合。
本发明的组合物可以配制为中性或盐形式。药物适当的盐包括与阴离子形成的盐,包括盐酸盐,磷酸盐,乙酸盐,草酸盐,酒石酸盐等,及与阳离子形成的盐如钠盐,钾盐,铵盐,钙盐,氢氧化铁,异丙胺,三乙胺,2-乙氨乙醇,组氨酸,普鲁卡因等。
有效治疗,抑制和预防与本发明多肽异常表达和/或活性相关的疾病或功能失调的本发明组合物的数量,可以通过标准临床方法确定。另外,可任选地应用体外分析以助于鉴别最佳剂量范围。配方中应用的准确剂量还依赖于施用途径,及疾病或功能失调的程度,而且应根据医生的判断和每个患者的情况确定。有效剂量可以从体外或动物模型测试系统产生的剂量应答曲线中推断出。
就抗体而言,施用于患者的剂量典型地为0.1mg/kg体重至100mg/kg体重。优选地,施用于患者的剂量在0.1mg/kg和20mg/kg体重之间,更优选在1mg/kg至10mg/kg体重之间。通常地,人抗体在人体内比其它种属的抗体的半衰期长,这归因于对外源多肽的免疫应答。因此,以较低剂量的人抗体和较少的施用频率施用通常是可能的。另外,本发明的治疗或药物组合物的施用剂量和频率,可以通过增强抗体的吸收和组织渗透力(例如进入脑)而降低,这可以通过对抗体加以修饰例如通过脂化而进行。
本发明的抗体和抗体组合物可以单独施用或与其它佐剂组合施用。可以与本发明的抗体和抗体组合物一起施用的佐剂包括但非限于明矾,明矾加上脱氧胆酸盐(ImmunoAg),MTP-PE(Biocine公司),QS21(Genentech公司),BCG,和MPL。在一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与明矾组合施用的。在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与QS-21组合施用的。可以与本发明抗体和抗体组合物一起施用的其它佐剂包括但非限于单磷脂免疫调节剂,AdjuVax 100a,QS-21,QS-18,CRL1005,铝盐,MF-59,和病毒体佐剂。可以与本发明抗体和抗体组合物一起施用疫苗包括但非限于保护性直接抗MMR(麻疹,腮腺炎,风疹),脊髓灰质炎,水痘,破伤风/白喉,甲肝,乙肝,流感嗜血杆菌B,百日咳,肺炎,流感,Lyme′s病,轮状病毒,霍乱,黄热病,乙型脑炎,脊髓灰质炎,狂犬病,伤寒,和百日咳,和/或PNEUMOVAX-23TM。组合物可以例如作为混合物,单独但同时伴随施用;或相继施用。这包括其中所述组合的制剂作为治疗混合物一起施用,也包括其中所述组合的制剂单独但同时施用,例如通过单独的静脉内途径输注于相同个体内。“组合”施用还包括先单独施用一种给定的化合物或制剂,随后再施用第二种。
在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物与PNEUMOVAX-23TM组合施用,以治疗,预防和/或诊断相关的任何疾病,功能失调和/或病变。在一个实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物与PNEUMOVAX-23TM组合施用,以治疗,预防和/或诊断任何革兰氏阳性菌感染和/或任何相关的疾病,功能失调和/或病变。在另一个实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物与PNEUMOVAX-23TM组合施用,以治疗,预防和/或诊断肠球菌属和/或链球菌属的一或多个成员相关的感染和/或任何相关的疾病,功能失调和/或病变。在另一个实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物与PNEUMOVAX-23TM组合施用,以治疗,预防和/或诊断与B组链球菌属的一或多个成员相关的感染和/或任何相关的疾病,功能失调和/或病变。在另一个实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物与PNEUMOVAX-23TM组合施用,以治疗,预防和/或诊断肺炎链球菌感染和/或任何相关的疾病,功能失调和/或病变。
本发明的抗体和抗体组合物可以单独或与其它治疗剂组合施用,所述治疗剂包括但非限于化疗剂,抗生素,抗病毒剂,类固醇和非类固醇抗炎剂,常规免疫治疗剂和细胞因子。组合物可以例如作为混合物单独但同时伴随施用;或相继施用。这包括其中所述组合的制剂作为治疗混合物一起施用,也包括其中所述组合的制剂单独但同时施用,例如通过单独的静脉内途径输注于相同个体内。“组合”施用还包括先单独施用一种给定的化合物或制剂,随后再施用第二种。
在一个实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物与其它TNF家族成员组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物一起施用的TNF,TNF相关的或类TNF分子,包括但非限于可溶形式的TNFα,淋巴毒素-α(LT-α,也称为TNF-β),LT-β(见于异源三聚体复合物LT-α2-β中),OPGL,FasL,CD27L,CD30L,CD40L,4-1 BBL,DcR3,OX40L,TNF-γ(国际公开No.WO 96/14328),TRAIL,AIM-II(国际公开No.WO 97/34911),APRIL(J.Exp.Med.188(6):1185-1190(1998)),内因子-α(国际公开No.WO 98/07880),Neutrokine-α(国际公开No.WO98/18921),OPG,OX40,和神经生长因子(NGF),及可溶形式的Fas,CD30,CD27,CD40和4-IBB,TR2(国际公开No.WO 96/34095),DR3(国际公开No.WO 97/33904),DR4(国际公开No.WO 98/32856),TR5(国际公开No.WO 98/30693),TR6(国际公开No.WO 98/30694),TR7(国际公开No.WO 98/41629),TRANK,TR9(国际公开No.WO98/56892),312C2(国际公开No.WO 98/06842),和TR12,及可溶形式的CD154,CD70,和CD153。
在一个优选的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物与以下物质组合施用:CD40配体(CD40L),可溶形式的CD40L(例如AVRENDTM),CD40L的生物活性片段,变体或衍生物,抗CD40L抗体(例如兴奋抗体或拮抗抗体)。
在另一个实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物单独或与抗血管发生剂组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物一起施用的抗血管发生剂,包括但非限于制管张素(Entremed,Rockville,MD),肌钙蛋白-1(Boston Life Sciences,Boston,MA),抗侵袭因子,视黄酸及其衍生物,paclitaxel(Taxol),苏拉明,金属蛋白酶-1的组织抑制剂,金属蛋白酶-2的组织抑制剂,VEGI,血纤溶酶原激活物抑制剂-1,血纤溶酶原激活物抑制剂-2,及各种形式的lighter“d组”过渡金属。
Lighterd″组″过渡金属包括例如钒,钼,钨,钛,铌,和钽。这种过渡金属可以形成过渡金属化合物。上述过渡金属的适当化合物包括含氧过渡金属化合物。
钒化合物的代表性实例包括含氧钒化合物如钒酸盐和氧钒化合物。适当的钒酸盐化合物包括偏钒酸盐和原钒酸盐化合物例如偏钒酸铵,偏钒酸钠和原钒酸钠。适当的氧钒化合物包括例如氧钒乙酰丙酮化物,氧钒硫酸盐包括氧钒硫酸盐水合物如氧钒硫酸单和三水合物。
钨和钼化合物的代表性实例包括含氧化合物。适当的含氧钨化合物包括钨酸盐和钨氧化物化合物。适当的钨酸盐化合物包括钨酸铵,钨酸钙,钨酸钠二水合物,和钨酸。适当的钨氧化物包括钨(四价)氧化物和钨(六价)氧化物。适当的含氧钼化合物包括钼酸盐,钼氧化物,和氧钼化合物。适当的钼酸盐化合物包括钼酸铵及其水合物,钼酸钠及其水合物,及钼酸钾及其水合物适当的钼氧化物包括钼(六价)氧化物,和钼酸。适当的氧钼化合物例如包括氧钼基乙酰丙酮化物。其它适当的钨和钼化合物包括衍生自例如甘油,酒石酸和糖的hydroxo衍生物。
许多其它抗血管发生因子也可用于本发明中。代表性实例包括但非限于血小板因子4;硫酸鱼精蛋白;硫酸壳多糖衍生物(从雪花蟹壳中制备的)(Murata等,癌症研究51:22-26,1991);硫酸多糖肽聚糖复合物(SP-PG)(这个化合物的功能可以通过类固醇如雌激素和三苯氧胺柠檬酸盐加强);星形孢菌素;基质代谢调节剂包括例如脯氨酸类似物,顺羟脯氨酸,d,L-3,4-脱羟脯氨酸,Thia proline,α-α-联吡啶,氨基丙腈延胡索酸酯;4-丙基-5-(4-嘧啶基)-2(3H)-唑酮;氨甲蝶呤;Mitoxantrone;肝素;干扰素;2血清巨球蛋白;ChIMP-3(Pavloff等,生物化学杂志267:17321-17326,1992);胰凝乳蛋白酶抑制剂(Tomkinson等,生物化学杂志286:475-480,1992);环糊精Tetradecasulfate;Eponemycin;喜树碱;烟曲霉素(Ingber等,自然348:555-557,1990);硫代苹果酸金钠(″GST″;Matsubara和Ziff,临床研究杂志79:1440-1446,1987);血清抗胶原酶;α2-抗纤溶酶(Holmes等,生物化学杂志262(4):1659-1664,1987);Bisantrene(国际癌症研究);Lobenzarit磷酸氢二钠(N-(2)-羧基苯基-4-氯氨基苯甲酸)磷酸氢二钠,或″CCA″;(Takeuchi等,Agents Actions 36:312-316,1992);和金属蛋白酶抑制剂如BB94。
也可以用于本发明的另外抗血管发生因子包括Thalidomide,(Celgene,Warren,NJ);Angiostatic steroid;AGM-1470(H.Brem and J.Folkman J Pediatr.Surg.28:445-51(1993));an integrin alpha v beta 3拮抗剂(C.Storgard等,临床研究杂志103:47-54(1999));羧基氨基咪唑;羧基酰氨基三唑(CAI)(国际癌症研究学会Bethesda,MD);Conbretastatin A-4(CA4P)(OXiGENE,Boston,MA);Squalamine(Magainin Pharmaceuticals,Plymouth Meeting,PA);TNP-470,(TapPharmaceuticals,Deerfield,IL);ZD-0101 AstraZeneca(London,UK);APRA(CT2584);Benefin,Byrostatin-1(SC339555);CGP-41251(PKC412);CM101;Dexrazoxane(ICRF187);DMXAA;Endostatin;Flavopridiol;Genestein;GTE;ImmTher;Iressa(ZD1839);Octreotide(Somatostatin);Panretin;Penacillamine;Photopoint;PI-88;Prinomastat(AG-3340)Purlytin;Suradista(FCE26644);他莫昔芬(Nolvadex);Tazarotene;Tetrathiomolybdate;Xeloda(Capecitabine);和5-氟尿嘧啶。
可以鱼本发明化合物组合施用的抗血管发生剂可以通过各种机制起作用,包括但非限于抑制胞外基质的蛋白酶解,阻断内皮细胞—胞外基质附着分子的功能,通过拮抗血管发生诱导剂如生长因子的功能,及抑制在增殖的内皮细胞上表达的整联蛋白受体。干扰胞外基质蛋白酶解,及可以鱼本发明抗体和抗体组合物组合施用的抗血管发生抑制剂例如包括但非限于AG-3340(Agouron,La Jolla,CA),BAY-12-9566(Bayer,West Haven,CT),BMS-275291(Bristol MyersSquibb,Princeton,NJ),CGS-27032A(Novartis,East Hanover,NJ),Marimastat(British Biotech,Oxford,UK),和Metastat(Aeterna,St-Foy,Quebec)。通过阻断内皮细胞—胞外基质附着分子的功能而起作用,及可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的抗血管发生抑制剂例如包括但非限于EMD-121974(Merck KcgaA Darmstadt,Germany)和Vitaxin(Ixsys,La Jolla,CA/Medimmune,Gaithersburg,MD)。通过直接拮抗或抑制血管发生诱导剂而起作用,及可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的抗血管发生剂例如包括但非限于Angiozyme(Ribozyme,Boulder,CO),-VEGF抗体(Genentech,S.San Francisco,CA),PTK-787/ZK-225846(Novartis,Basel,Switzerland),SU-101(Sugen,S.San Francisco,CA),SU-5416(Sugen/Pharmacia Upjohn,Bridgewater,NJ),和SU-6668(Sugen)。其它抗血管发生剂通过间接抑制血管发生而起作用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的血管发生的间接抑制剂例如包括但非限于IM-862(Cytran,Kirkland,WA),α-干扰素,IL-12(Roche,Nutley,NJ),和多硫酸戊聚糖酯(Georgetown大学,华盛顿DC)。
在一个特异的实施方案中,将本发明的抗体和抗体组合物与抗血管发生剂组合使用,预期治疗,预防和/或改善一种自身免疫疾病,例如本文所述自身免疫疾病。
在一个特异的实施方案中,将本发明的抗体和抗体组合物与抗血管发生剂组合使用,预期治疗,预防和/或改善关节炎。在一个更特异的实施方案中,将本发明的抗体和抗体组合物与抗血管发生剂组合使用,预期治疗,预防和/或改善风湿性关节炎。
在另一个实施方案中,将本发明的抗体和抗体组合物与抗凝血剂组合使用。可以与本发明抗体和抗体组合物一起施用的抗凝血剂包括但非限于肝素,杀鼠灵和阿斯匹林。在一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与肝素和/或杀鼠灵组合施用的。在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与杀鼠灵组合施用的。在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与杀鼠灵和阿斯匹林组合施用的。在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与肝素组合施用的。在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与肝素和阿斯匹林组合施用的。
在另一个实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与抑制抗心磷脂抗体产生的一种制剂组合施用的。在特异的实施方案中,本发明的多核苷酸是与一种制剂组合施用的,所述制剂阻断和/或降低抗心磷脂抗体与磷脂结合血浆蛋白β2-糖蛋白(b2GPI)的结合能力。
在一些实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与以下物质组合施用的:抗逆转录病毒剂,核苷逆转录酶抑制剂,非核苷逆转录酶抑制剂,和/或蛋白酶抑制剂。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的核苷逆转录酶抑制剂包括但非限于RETROVIRTM(齐多夫定/AZT),VIDEXTM(didanosine/ddI),HIVIDTM(扎西他滨/ddC),ZERITTM(stavudine/d4T),EPIVIRTM(拉米夫定/3TC),和COMBIVIRTM(齐多夫定/拉米夫定)。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的非核苷逆转录酶抑制剂包括但非限于VIRAMUNETM(nevirapine),RESCRIPTORTM(delavirdine),和SUSTIVATM(efavirenz)。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的蛋白酶抑制剂包括但非限于CRIXIVANTM(indinavir),NORVIRTM(ritonavir),INVIRASETM(saquinavir),和VIRACEPTTM(nelfinavir)。在特异的实施方案中,抗逆转录病毒剂,核苷逆转录酶抑制剂,非核苷逆转录酶抑制剂,和/或蛋白酶抑制剂,可以与本发明抗体和抗体组合物任意组合使用,以治疗,预防和/或诊断HIV感染。
在其它实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物可以与抗机会感染剂组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的抗机会感染剂包括但非限于TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLETM,DAPSONETM,PENTAMIDINETM,ATOVAQUONETM,ISONIAZIDTM,RIFAMPINTM,PYRAZINAMIDETM,ETHAMBUTOLTM,RIFABUTINTM,CLARITHROMYCINTM,AZITHROMYCINTM,GANCICLOVIRTM,FOSCARNETTM,CIDOFOVIRTM,FLUCONAZOLETM,ITRACONAZOLETM,KETOCONAZOLETM,ACYCLOVIRTM,FAMCICOLVIRTM,PYRIMETHAMINETM,LEUCOVORINTM,NEUPOGENTM(filgrastim/G-CSF),和LEUKINETM(sargramostim/GM-CSF)。在一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物可以与TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLETM,DAPSONETM,PENTAMIDINETM,和/或ATOVAQUONETM任意组合施用,以预防性治疗,预防和/或诊断一种机会Pneumocystis carinii肺部感染。在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物与 ISONIAZIDTM,RIFAMPINTM,PYRAZINAMIDETM,和/或ETHAMBUTOLTM任意组合施用,以预防性治疗,预防和/或诊断机会Mycobacterium avium复合物感染。在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物与RIFABUTINTM,CLARITHROMYCINTM,和/或AZITHROMYCINTM任意组合施用,以预防性治疗,预防和/或诊断机会性肺结核杆菌感染。在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物与GANCICLOVIRTM,FOSCARNETTM,和/或CIDOFOVIRTM任意组合施用,以预防性治疗,预防和/或诊断机会性巨细胞病毒感染。在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物与FLUCONAZOLETM,ITRACONAZOLETM,和/或KETOCONAZOLETM任意组合施用,以预防性治疗,预防和/或诊断机会性真菌感染。在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物与ACYCLOVIRTM和/或FAMCICOLVIRTM任意组合施用,以预防性治疗,预防和/或诊断机会性I型和II型单纯疱疹病毒感染。在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物与PYRIMETHAMINETM和/或LEUCOVORINTM任意组合施用,以预防性治疗,预防和/或诊断机会性Toxoplasma gondii感染。在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物与LEUCOVORINTM和/或NEUPOGENTM任意组合施用,以预防性治疗,预防和/或诊断机会性细菌感染。
在另一个实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物与一种抗病毒剂组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的抗病毒剂包括但非限于无环鸟苷,三唑核苷,金刚烷胺和remantidine。
在另一个实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物与一种抗生素组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的抗生素组合物包括但非限于阿摩西林,氨基糖苷,β-内酰胺(糖肽),β-内酰胺酶,氯洁霉素,氯霉素,头孢菌素,卷须霉素,ciprofloxacin,红霉素,氟代喹诺酮,大环内酯类药物,甲硝唑,青霉素,喹诺酮,利福平,链霉素,磺胺类药物,四环素,甲氧苄氨嘧啶,甲氧苄氨嘧啶新诺明,和万古霉素。
可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的常规非特异性免疫抑制剂包括但非限于类固醇,环孢霉素,环孢霉素类似物环磷酰胺,环磷酰胺IV,甲基强的松龙,强的松龙,咪唑硫嘌呤,FK-506,15-deoxyspergualin,及其它通过抑制T细胞应答功能而起作用的免疫抑制剂。
在特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物与一种免疫抑制剂组合施用。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的免疫抑制剂制品包括但非限于ORTHOCLONETM(OKT3),SANDIMMUNETM/NEORALTM/SANGDYATM(环孢菌速),PROGRAFTM(tacrolimus),CELLCEPTTM(mycophenolate),咪唑硫嘌呤,glucorticosteroids和RAPAMUNETM(sirolimus)。在一个特异的实施方案中,可以使用免疫抑制剂预防器官或骨髓移植排斥。
在一个优选的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与类固醇治疗组合施用的。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的类固醇包括但非限于口服皮质类固醇,强的松和甲基强的松龙(例如IV甲基强的松龙)。在一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与强的松组合施用的。在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与强的松和一种免疫抑制剂组合施用的。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的免疫抑制剂是本文所述的那些,并包括但非限于咪唑硫嘌呤,环磷酰胺和环磷酰胺IV。在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与甲基强的松龙组合施用的。在一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与甲基强的松龙和一种免疫抑制剂组合施用的。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的免疫抑制剂是本文所述的那些,并包括但非限于咪唑硫嘌呤,环磷酰胺和环磷酰胺IV。
在一个优选的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与一种抗疟药组合施用的。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的抗疟药包括但非限于羟化氯喹,氯喹和/或奎纳克林。
在一个优选的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与NSAID组合施用的。
在一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与一,二,三,四,五,十或多种以下药物组合施用的:NRD-101(HoechstMarion Roussel),双氯酚酸钠(Dimethaid),丙嗪钾(Monsanto),mecasermin(Chiron),T-614(Toyama),pemetrexed disodium(Eli Lilly),atreleuton(Abbott),valdecoxib(Monsanto),eltenac(Byk Gulden),campath,AGM-1470(Takeda),CDP-571(Celltech Chiroscience),CM-101(CarboMed),ML-3000(Merckle),CB-2431(KS Biomedix),CBF-BS2(KS Biomedix),IL-1Ra基因治疗(Valentis),JTE-522(日本烟草),paclitaxel(Angiotech),DW-166HC(Dong Wha),darbufelone mesylate(Warner-Lambert),可溶的TNF受体1(synergen;Amgen),IPR-6001(Institute for Pharmaceutical Research),trocade(Hoffman-La Roche),EF-5(Scotia Pharmaceuticals),BIIL-284(Boehringer Ingelheim),BIIF-1149(Boehringer Ingelheim),LeukoVax(Inflammatics),MK-663(Merck),ST-1482(Sigma-Tau),和butixocort propionate(WarnerLambert)。
在一个优选的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与一,二,三,四,五或多种以下药物组合施用的:氨甲蝶呤,sulfasalazine,硫代马来酸亚金钠,醋硫葡金,环孢霉素,青霉胺,咪唑硫嘌呤,一种抗疟药(例如本文所述),环磷酰胺,苯丁酸氮芥,金,ENBRELTM(Etanercept),抗-TNF抗体,LJP 394(La Jolla制药公司,San Diego,California)和强的松龙。
在一个更优选的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与一种抗疟药,氨甲蝶呤,抗TNF抗体,ENBRELTM和/或柳氮璜吡啶组合施用的。在一个实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与氨甲蝶呤组合施用的。在另一个实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与抗TNF抗体组合施用的。在另一个实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与氨甲蝶呤和抗TNF抗体组合施用的。在另一个实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与柳氮璜吡啶组合施用的。在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与氨甲蝶呤,抗TNF抗体,和柳氮璜吡啶组合施用的。在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与ENBRELTM组合施用的。在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与ENBRELTM和氨甲蝶呤组合施用的。在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与ENBRELTM,氨甲蝶呤和柳氮璜吡啶组合施用的。在其它实施方案中,一或多种抗疟药是与与上述组合之一组合施用的。在一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与一种抗疟药(例如羟化氯喹),ENBRELTM,氨甲蝶呤和柳氮璜吡啶组合施用的。在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与一种抗疟药(例如羟化氯喹),柳氮璜吡啶,抗TNF抗体和氨甲蝶呤组合施用的。
在另外的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是单独施用或与一或多种静脉内免疫球蛋白制品组合施用的。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的静脉内免疫球蛋白制品包括但非限于GAMMARTM,IVEEGAMTM,SANDOGLOBULINTM,GAMMAGARDS/DTM,和GAMIMUNETM。在一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物在移植治疗(例如骨髓移植)中是与静脉内免疫球蛋白制品组合施用的。
CD40配体(CD40L),一种可溶形式的CD40L(例如AVRENDTM),CD40L的生物活性片段,变体或衍生物,抗CD40L抗体(例如兴奋抗体或拮抗抗体),和/或抗CD40抗体(例如兴奋抗体或拮抗抗体)。
在另外的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是单独施用的或与一种抗炎剂组合施用的。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的抗炎剂包括但非限于糖皮质激素和非类固醇抗炎剂,氨基芳香羧酸衍生物,芳香乙酸衍生物,芳香丁酸衍生物,芳香羧酸,芳香丙酸衍生物,吡唑,吡唑啉酮,水杨酸衍生物,噻嗪氨甲酰,e-乙酰氨基己酸,S-腺苷甲硫氨酸,3-氨基-4-羟丁酸,amixetrine,苄吲酸,苄达明,定环己巴比妥,吡啶联苯基乙酰胺,双苯唑醇,依莫法宗,愈创蓝油烃,那布米酮,nimesulide,超氧化物歧化酶,醋羟脯氨酸,胍苯叉芴,哌异唑,哌酰苯肟,proquazone,胺丙二唑,和替尼达普。
在另一个实施方案中,本发明的组合物是与一种化疗剂组合施用的。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的化疗剂包括但非限于抗生素衍生物(例如阿霉素,博来霉素,道诺霉素,和更生霉素);抗雌激素(例如三苯氧胺);抗代谢物(例如氟尿嘧啶,5-FU,氨甲蝶呤,氟尿苷,干扰素α-2b,谷氨酸,plicamycin,巯基嘌呤,和6-硫鸟嘌呤);胞毒剂(例如亚硝基脲氮芥,BCNU,环己亚硝脲,CCNU,胞嘧啶阿拉伯糖苷,环磷酰胺,雌氮芥,羟基脲,甲基苄肼,丝裂霉素,甲磺酸丁二醇二酯,顺铂和长春新碱硫酸盐);激素(例如甲孕酮,雌氮芥磷酸钠,乙炔雌二醇,雌二醇,醋酸甲地孕酮,甲睾酮,二己烯雌酚二磷酸酯,氯烯雌醚,和睾内酯);氮芥衍生物(例如mephalen,chorambucil,二氯甲基二乙胺(氮芥)和三胺硫磷);类固醇及组合物(例如bethamethasone磷酸钠);及其它物质(例如dicarbazine,天冬酰胺酶,米托坦,长春新碱硫酸盐,长春花碱硫酸盐和依托泊苷)。
在一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与CHOP(环磷酰胺,阿霉素,长春新碱,和强的松)或CHOP组分的任意组合物组合施用的。在一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与Rituximab组合施用的。在另一个特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与Rituxmab和CHOP,或者Rituxmab与CHOP组分的任意组合物组合施用的。
在一个另外的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与细胞因子组合施用的。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的细胞因子包括但非限于GM-CSF,G-CSF,IL2,IL3,IL4,IL5,IL6,IL7,IL10,IL12,IL13,IL15,抗-CD40,CD40L,IFN-α,IFN-β,IFN-γ,TNF-α,和TNF-β。在优选的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与BLyS(例如SEQ ID NO:3228的134-285位氨基酸)组合施用的。在另一个实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与任何白细胞介素组合施用的,所述白细胞介素包括但非限于IL-1α,IL-1β,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8,IL-9,IL-10,IL-11,IL-12,IL-13,IL-14,IL-15,IL-16,IL-17,IL-18,IL-19,IL-20,IL-21,和IL-22。在优选的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与IL4和IL10组合施用的。
在一个实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与一或多种趋化因子组合施用的。在特异的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与选自以下的α(CxC)趋化因子组合施用的:γ干扰素可诱导蛋白-10(γIP-10),白细胞介素-8(IL-8),血小板因子-4(PF4),中性粒细胞激活蛋白(NAP-2),GRO-α,GRO-β,GRO-γ,中性粒细胞激活肽,(ENA-78),粒细胞趋化蛋白-2(GCP-2),和基质细胞衍生因子-1(SDF-1,或前-B细胞刺激因子(PBSF));和/或一种β(CC)趋化因子,选自RANTES(调节活化,正常T细胞表达和分泌),巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α),巨噬细胞炎症蛋白-1β(MIP-1β),单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1),单核细胞趋化蛋白-2(MCP-2),单核细胞趋化蛋白-3(MCP-3),单核细胞趋化蛋白-4(MCP-4)巨噬细胞炎症蛋白-1γ(MIP-1γ),巨噬细胞炎症蛋白-3α(MIP-3α),巨噬细胞炎症蛋白-3β(MIP-3β),巨噬细胞炎症蛋白-4(MIP-4/DC-CK-1/PARC),eotaxin,Exodus,和1-309;和/或γ(C)趋化因子,lymphotactin。
在另一个实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与趋化因子β-8,趋化因子β-1,和/或巨噬细胞炎症蛋白-4组合施用的。在一个优选的实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与趋化因子β-8组合施用的。
在另一个实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与IL-4拮抗剂组合施用的。可以与本发明抗体和抗体组合物一起施用的IL-4拮抗剂包括但非限于:可溶的IL-4受体多肽,聚合形式的可溶IL-4受体多肽;结合IL-4而不转导由IL-4激发的生物信号的抗IL-4受体抗体,阻断IL-4与一或多种IL-4受体结合的抗IL4抗体,和结合IL-4受体但不转导由IL-4激发的生物信号的IL-4突变蛋白。优选地,根据这种方法应用的抗体是单克隆抗体(包括抗体片段,例如本发明所述)。
本发明还涵盖将本发明的多核苷酸和/或多肽(和/或其兴奋剂或拮抗剂)与其它提议的或常规的造血治疗方法组合施用。例如本发明的多核苷酸和/或多肽(和/或其兴奋剂或拮抗剂)可以与只具有红细胞生成刺激作用的化合物组合,所述化合物如红细胞生成素,睾丸激素,原细胞刺激因子,类胰岛素生长因子,前列腺素,5-羟色胺,环AMP,促乳素,和triiodothyzonine。本发明还涵盖了将本发明抗体和抗体组合物与一般用于治疗再生障碍性贫血的化合物组合施用,所述化合物例如是methenolene,吡唑甲氢龙,和诺龙;以治疗缺铁性贫血,例如铁储备不足;治疗恶性贫血,例如缺乏维生素B12和/或叶酸;治疗溶血性贫血,例如肾上腺皮质激素例如肾上腺皮质素。见例如Resegotti等,Panminerva Medica,23:243-248(1981);Kurtz,FEBS信息,14a:105-108(1982);McGonigle等,肾脏研究,25:437-444(1984);及Pavlovic-Kantera,Expt.Hematol.,8(supp.8)283-291(1980),所述文献以其全文并入参考。
增强或协同红细胞生成素作用的化合物在此也用作佐剂,包括但非限于肾上腺素兴奋剂,甲状腺素,雄激素,肝红细胞生成因子,和erythrogenins,见例如Dunn,″红细胞生成中的通用观点″,JohnWiley及Sons(Chichester,England,1983);Kalmani,肾脏研究22:383-391(1982);Shahidi,新英格兰医学杂志,289:72-80(1973);Urabe等,实验方法杂志149:1314-1325(1979);Billat等,Expt.Hematol.,10:133-140(1982);Naughton等,Acta Haemat,69:171-179(1983);Cognote等in abstract 364,Proceedings 7th Intl.Cong.ofEndocrinology(Quebec City,Quebec,July 1-7,1984);及Rothman等,1982,J.Surg.Oncol.,20:105-108(1982)。刺激红细胞生成的方法包括为患者施用一种造血有效量(即影响血细胞生成的数量)的药物组合物,所述组合物含有本发明的多核苷酸和/或多肽(和/或其兴奋剂或拮抗剂)。将本发明的多核苷酸和/或多肽(和/或其兴奋剂或拮抗剂)施用于患者是通过任何适当方法施用的,包括但非限于非肠道,舌下,局部,肺内和鼻内施用,及那些本发明进一步揭示的方法。所述药物组合物任选地含有选自以下的一或多种成分:红细胞生成素,睾丸激素,原细胞刺激因子,类胰岛素生长因子,前列腺素,5-羟色胺,环AMP,促乳素,triiodothyzonine,methenolene,吡唑甲氢龙,和诺龙,铁制品,维生素B12,叶酸和/或肾上腺皮质素
在另一个实施方案中,本发明抗体和抗体组合物是与造血生长因子组合施用的。可以与本发明抗体和抗体组合物一起施用的造血生长因子包括但非限于LEUKINETM(SARGRAMOSTIMTM)和NEUPOGENTM(FILGRASTIMTM)。
在另一个实施方案中,本发明的抗体和抗体组合物是与成纤维细胞生长因子组合施用的。可以与本发明抗体和抗体组合物组合施用的成纤维细胞生长因子包括但非限于FGF-1,FGF-2,FGF-3,FGF-4,FGF-5,FGF-6,FGF-7,FGF-8,FGF-9,FGF-10,FGF-11,FGF-12,FGF-13,FGF-14,和FGF-15。
另外,本发明的抗体和抗体组合物可以单独施用或与其它治疗方案组合施用,所述方案包括但非限于放疗。这种组合治疗可以相继施用和/或伴随施用。
试剂盒
本发明还提供了一种药物包装或试剂盒,其包含一或多个充填一或多种本发明药物组合物的配料。任选地与这种容器相关的是一个由调节药物或生物制品的生产,使用和销售的政府机构规定的告示,其告知了许可使用于人体的生产,使用或销售机构。
本发明提供了可用于上述方法中的试剂盒。在一个实施方案中,一个试剂盒在一或多个容器中含有本发明的抗体,优选纯化的抗体。在另一个实施方案中,试剂盒含有免疫特异性结合BLyS的抗体片段。在一个特异的实施方案中,本发明的试剂盒含有一种基本分离的BLyS多肽作为对照。优选地,本发明的试剂盒还包含与BLyS不反应的一种对照抗体。在另一个特异的实施方案中,本发明的试剂盒含有一种检测抗体与BLyS结合的手段(例如抗体可以缀合于一种可检测底物乳荧光化合物,酶底物,放射性化合物或发光化合物,或识别第一种抗体的第二种抗体可缀合于一种可检测底物)。在特异的实施方案中,所述试剂盒可以包括一种重组产生的或化学合成的BLyS。试剂盒中的BLyS还可以吸附于一种固体支持物。在一个更特异的实施方案中,所述试剂盒的检测手段包括IBLyS吸附于其的一种固体支持物。这种试剂盒还包括一种未吸附的受体标记的抗人抗体。在这个实施方案中,抗体与BLyS的结合可以通过所述受体标记的抗体的结合而检测。
在另一个实施方案中,本发明包括一种诊断试剂盒,用于筛选含有本发明多肽的抗原的血清。所述诊断试剂盒包括与BLyS特异性免疫反应的一种基本分离的抗体,及检测BLyS与抗体结合的方法。在一个实施方案中,所述抗体吸附于一种固体支持物。在一个特异的实施方案中,所述抗体可以是一种单克隆抗体。所述试剂盒的检测方法可以包括另一种标记的单克隆抗体。或者,或另外,所述检测方法可以包括一种标记的竞争抗原。
在一个诊断性构型中,将测试血清与一种固相试剂反应,所述固相试剂具有通过本发明方法获得的表面结合的BLyS。在BLyS与特异性抗体结合后,通过冲洗除去未结合的血清成分,加入受体标记的抗人抗体,通过冲洗除去未结合的抗人抗体,将一种试剂与受体标记的抗人抗体反应,受体与所述试剂的结合与在固体支持物上结合的抗BLyS抗体的数量成比例。典型地,所述受体是一种酶,其是通过在存在适当的荧光,发光或显色底物的情况下,温育所述固相试剂而检测的。
上述分析中的所述固相试剂是通过本领域已知的将蛋白质物质吸附于固相物质如聚合物珠,蘸棒,96孔平板或滤膜的方法制备的。这些吸附方法通常包括将所述蛋白质非特异性吸附于支持物,或将蛋白质共价吸附于,典型地通过一个游离氨基团,固相支持物上的一个化学反应基团,如激活的羧基,羟基或醛基团。或者,链亲和素包被的平板可以与生物素化抗原联合使用。
因此,本发明提供了一种分析系统或试剂盒,以进行这种诊断方法。所述试剂盒一般包括具有表面结合的重组BLyS的支持物,和受体标记抗人抗体,以检测表面结合的抗BLyS抗体。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种单链Fv(scFv),其具有SEQ ID NO:1至2128所示之一的氨基酸序列。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种单链Fv(scFv),其具有SEQ ID NO:1至46,321至329,1563至1595,及1881至1908所示之一的氨基酸序列。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种单链Fv(scFv),其具有SEQ ID NO:1563至1880所示之一的氨基酸序列。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种单链Fv(scFv),其具有SEQ ID NO:1881至2128所示之一的氨基酸序列。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种单链Fv(scFv),其具有SEQ ID NO:1至1562所示之一的氨基酸序列。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种抗体或其片段,其包含来自具有SEQ ID NO:1至2128之一氨基酸序列的scFv的一个VH结构域,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合BLyS。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种抗体或其片段,其包含来自具有SEQ ID NO:1至46,321至329,1563至1595,及1881至1908所示之一氨基酸序列的scFv的一个VH结构域。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种抗体或其片段,其包含来自具有SEQ ID NO:1881至2128之一氨基酸序列的scFv的一个VH结构域,其中所述抗体或抗体片段免疫特异性结合膜结合形式BLyS。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种抗体或其片段,其包含来自具有SEQ ID NO:1563至1880之一氨基酸序列的scFv的一个VH结构域,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合可溶形式BLyS。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种抗体或其片段,其包含来自具有SEQ ID NO:1至2128之一氨基酸序列的scFv的一个VL结构域,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合BLyS。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种抗体或其片段,其包含来自具有SEQ ID NO:1至46,321至329,1563至1595,及1881至1908之一氨基酸序列的scFv的一个VL结构域。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种抗体或其片段,其包含来自具有SEQ ID NO:1881至2128之一氨基酸序列的scFv的一个VL结构域,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合膜结合形式BLyS。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种抗体或其片段,其包含来自具有SEQ ID NO:1563至1880之一氨基酸序列的scFv的一个VL结构域,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合可溶形式BLyS。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种抗体或其片段,其包含来自具有SEQ ID NO:1至2128之一氨基酸序列的scFv的一个VL结构域,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合BLyS,而且其还包含来自具有SEQ ID NO:1至2128所示之一氨基酸序列的scFv的一个VH结构域。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种抗体或其片段,其包含来自具有SEQ ID NO:1至2128之一氨基酸序列的scFv的一个VL结构域,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合BLyS,而且其还包含来自具有SEQ ID NO:1至2128所示之一氨基酸序列的scFv的一个VH结构域,其中所述VL和VH结构域来自具有SEQ ID NO:1至2128所示之一氨基酸序列的相同scFv。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种抗体或其片段,其包含来自具有SEQ ID NO:2129至3227之一的氨基酸序列,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合BLyS。
在特异的实施方案中,本发明的抗体或其片段是一个完整的免疫球蛋白分子。
在特异的实施方案中,本发明的抗体或其片段是一种Fab片段。
在特异的实施方案中,本发明的抗体或其片段是一种Fv片段。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种嵌合蛋白,其包含共价连接于一种异源多肽的本发明抗体或其片段。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种组合物,其包含两或多种类型的本发明抗体或其片段或变体,每种类型均免疫特异性结合BLyS,而且每种抗体或其片段均包含来自不同svFv的一个VH结构域,所述scFv具有SEQ ID NO:1至2128所示之一的氨基酸序列。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种组合物,其包含两或多种类型的本发明抗体或其片段或变体,每种类型均免疫特异性结合BLyS,而且每种抗体或其片段均包含来自不同svFv的一个VL结构域,所述scFv具有SEQ ID NO:1至2128所示之一的氨基酸序列。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种组合物,其包含两或多种类型的本发明抗体或其片段或变体,每种类型均免疫特异性结合BLyS,而且每种抗体或其片段均包含来自不同svFv的一个VH结构域,所述scFv具有SEQ ID NO:1至2128所示之一的氨基酸序列,而且每种抗体或其片段还包含来自不同svFv的一个VH结构域,所述scFv具有SEQ ID NO:1至2128所示之一的氨基酸序列。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种组合物,其包含两或多种类型的本发明抗体或其片段或变体,每种类型均免疫特异性结合BLyS,而且每种抗体或其片段均包含具有SEQ ID NO:3129至3227所示之一氨基酸序列的一个VH CDR3。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种组合物,其包含两或多种类型的本发明抗体或其片段或变体,每种类型均免疫特异性结合BLyS,而且每种抗体或其片段均包含来自不同svFv的一个VH结构域,所述scFv具有SEQ ID NO:1至2128所示之一的氨基酸序列。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种组合物,其包含两或多种类型的本发明抗体或其片段或变体,每种类型均免疫特异性结合BLyS,而且每种抗体或其片段均包含来自不同svFv的一个VL结构域,所述scFv具有SEQ ID NO:1至2128所示之一的氨基酸序列。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种组合物,其包含两或多种类型的本发明抗体或其片段或变体,每种类型均免疫特异性结合BLyS,而且每种抗体或其片段均包含来自不同svFv的一个VL结构域,所述scFv具有SEQ ID NO:1至2128所示之一的氨基酸序列,而且每种本发明抗体或其片段均包含来自不同scFv的一个VH结构域,所述scFv具有SEQ ID NO:1至2128所示之一的氨基酸序列。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种组合物,其包含两或多种类型的本发明抗体或其片段或变体,每种类型均免疫特异性结合BLyS,而且每种抗体或其片段均包含来自不同svFv的一个VHCDR3,所述scFv具有SEQ ID NO:2129至3227所示之一的氨基酸序列。
在特异的实施方案中,本发明的抗体或其片段组在96孔平板的孔中。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种包含编码抗体或抗体片段的核苷酸序列的分离的核酸分子,所述抗体或其片段包含来自一个scFv的一个VH结构域,所述scFv具有SEQ ID NO:1至2128所示之一的氨基酸序列,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合BLyS。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种包含编码抗体或抗体片段的核苷酸序列的分离的核酸分子,所述抗体或其片段包含来自一个scFv的一个VH结构域,所述scFv具有SEQ ID NO:1至46,321至329,1563至1595,及1881至1908所示之一的氨基酸序列,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合BLyS。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种包含编码抗体或抗体片段的核苷酸序列的分离的核酸分子,所述抗体或其片段包含来自一个scFv的一个VH结构域,所述scFv具有SEQ ID NO:1881至1908所示之一的氨基酸序列,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合膜结合形式BLyS。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种包含编码抗体或抗体片段的核苷酸序列的分离的核酸分子,所述抗体或其片段包含来自一个scFv的一个VH结构域,所述scFv具有SEQ ID NO:1563至1569所示之一的氨基酸序列,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合可溶形式BLyS。本发明还涵盖了包含上述分离的核酸分子的载体,包括包含调节由上述核酸分子编码的抗体或其片段的表达的一个核苷酸序列的载体。另外,本发明还涵盖了宿主细胞,包括包含可操纵地连接于一个异源启动子的上述核酸分子的哺乳动物宿主细胞,以及包括包含上述载体的哺乳动物宿主细胞。 另外,本发明还提供了一种生产抗体或其片段的方法,包括将上述宿主细胞在所述核酸分子表达的条件下培养。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种包含编码抗体或抗体片段的核苷酸序列的分离的核酸分子,所述抗体或其片段包含来自一个scFv的一个VL结构域,所述scFv具有SEQ ID NO:1至2128所示之一的氨基酸序列,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合BLyS。本发明还涵盖了包含上述分离的核酸分子的载体,包括包含调节由上述核酸分子编码的抗体或其片段的表达的一个核苷酸序列的载体。另外,本发明还涵盖了宿主细胞,包括包含可操纵地连接于一个异源启动子的上述核酸分子的哺乳动物宿主细胞,以及包括包含上述载体的哺乳动物宿主细胞。另外,本发明还提供了一种生产抗体或其片段的方法,包括将上述宿主细胞在所述核酸分子表达的条件下培养。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种包含编码抗体或抗体片段的核苷酸序列的分离的核酸分子,所述抗体或其片段包含来自一个scFv的一个VL结构域,所述scFv具有SEQ ID NO:1至46,321至329,1563至1595,和1881至1908所示之一的氨基酸序列,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合BLyS。本发明还涵盖了包含上述分离的核酸分子的载体,包括包含调节由上述核酸分子编码的抗体或其片段的表达的一个核苷酸序列的载体。另外,本发明还涵盖了宿主细胞,包括包含可操纵地连接于一个异源启动子的上述核酸分子的哺乳动物宿主细胞,以及包括包含上述载体的哺乳动物宿主细胞。另外,本发明还提供了一种生产抗体或其片段的方法,包括将上述宿主细胞在所述核酸分子表达的条件下培养。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种包含编码抗体或抗体片段的核苷酸序列的分离的核酸分子,所述抗体或其片段包含来自一个scFv的一个VL结构域,所述scFv具有SEQ ID NO:1881至2128所示之一的氨基酸序列,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合膜结合形式BLyS。本发明还涵盖了包含上述分离的核酸分子的载体,包括包含调节由上述核酸分子编码的抗体或其片段的表达的一个核苷酸序列的载体。另外,本发明还涵盖了宿主细胞,包括包含可操纵地连接于一个异源启动子的上述核酸分子的哺乳动物宿主细胞,以及包括包含上述载体的哺乳动物宿主细胞。另外,本发明还提供了一种生产抗体或其片段的方法,包括将上述宿主细胞在所述核酸分子表达的条件下培养。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种包含编码抗体或抗体片段的核苷酸序列的分离的核酸分子,所述抗体或其片段包含来自一个scFv的一个VL结构域,所述scFv具有SEQ ID NO:1563至1880所示之一的氨基酸序列,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合可溶形式BLyS。本发明还涵盖了包含上述分离的核酸分子的载体,包括包含调节由上述核酸分子编码的抗体或其片段的表达的一个核苷酸序列的载体。另外,本发明还涵盖了宿主细胞,包括包含可操纵地连接于一个异源启动子的上述核酸分子的哺乳动物宿主细胞,以及包括包含上述载体的哺乳动物宿主细胞。另外,本发明还提供了一种生产抗体或其片段的方法,包括将上述宿主细胞在所述核酸分子表达的条件下培养。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种包含编码抗体或抗体片段的核苷酸序列的分离的核酸分子,所述抗体或其片段包含来自一个scFv的一个VL结构域,所述scFv具有SEQ ID NO:1至2128所示之一的氨基酸序列,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合BLyS,而且其还包含来自具有SEQ ID NO:1至2128所示之一氨基酸序列的scFv的一个VH结构域。本发明还涵盖了包含上述分离的核酸分子的载体,包括包含调节由上述核酸分子编码的抗体或其片段的表达的一个核苷酸序列的载体。另外,本发明还涵盖了宿主细胞,包括包含可操纵地连接于一个异源启动子的上述核酸分子的哺乳动物宿主细胞,以及包括包含上述载体的哺乳动物宿主细胞。另外,本发明还提供了一种生产抗体或其片段的方法,包括将上述宿主细胞在所述核酸分子表达的条件下培养。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种包含编码抗体或抗体片段的核苷酸序列的分离的核酸分子,所述抗体或其片段包含来自一个scFv的一个VL结构域,所述scFv具有SEQ ID NO:1至2128所示之一的氨基酸序列,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合BLyS,而且其还包含一个来自scFv的VH结构域,所述scFv具有SEQ ID NO:1至2128所示之一的氨基酸序列,其中所述VL和VH结构域衍生自具有SEQ ID NO:1至2128所示之一氨基酸序列的相同scFv。本发明还涵盖了包含上述分离的核酸分子的载体,包括包含调节由上述核酸分子编码的抗体或其片段的表达的一个核苷酸序列的载体。另外,本发明还涵盖了宿主细胞,包括包含可操纵地连接于一个异源启动子的上述核酸分子的哺乳动物宿主细胞,以及包括包含上述载体的哺乳动物宿主细胞。 另外,本发明还提供了一种生产抗体或其片段的方法,包括将上述宿主细胞在所述核酸分子表达的条件下培养。
在特异的实施方案中,本发明涵盖了一种包含编码抗体或抗体片段的核苷酸序列的分离的核酸分子,所述抗体或其片段包含来自一个scFv的一个VHCDR3,所述scFv具有SEQ ID NO:2129至3227所示之一的氨基酸序列,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合BLyS。本发明还涵盖了包含上述分离的核酸分子的载体,包括包含调节由上述核酸分子编码的抗体或其片段的表达的一个核苷酸序列的载体。另外,本发明还涵盖了宿主细胞,包括包含可操纵地连接于一个异源启动子的上述核酸分子的哺乳动物宿主细胞,以及包括包含上述载体的哺乳动物宿主细胞。另外,本发明还提供了一种生产抗体或其片段的方法,包括将上述宿主细胞在所述核酸分子表达的条件下培养。
在特异的实施方案中,本发明提供了免疫特异性结合BLyS的一种抗体或其片段,所述抗体或其片段包含一个VH结构域的氨基酸序列,编码所述VH结构域的核苷酸序列在严格杂交条件下,与编码来自具有SEQ ID NO:1至2128所示之一氨基酸序列的scFv的一个VH结构域的核苷酸序列杂交。
在特异的实施方案中,本发明提供了免疫特异性结合BLyS的一种抗体或其片段,所述抗体或其片段包含一个VL结构域的氨基酸序列,编码所述VL结构域的核苷酸序列在严格杂交条件下,与编码来自具有SEQ ID NO:1至2128所示之一氨基酸序列的scFv的一个VL结构域的核苷酸序列杂交。
在特异的实施方案中,本发明提供了免疫特异性结合BLyS的一种抗体或其片段,所述抗体或其片段包含一个VH结构域的氨基酸序列,编码所述VH结构域的核苷酸序列在高度严格杂交条件下,与编码来自具有SEQ ID NO:1至2128所示之一氨基酸序列的scFv的一个VH结构域的核苷酸序列杂交。
在特异的实施方案中,本发明提供了免疫特异性结合BLyS的一种抗体或其片段,所述抗体或其片段包含一个VL结构域的氨基酸序列,编码所述VL结构域的核苷酸序列在高度严格杂交条件下,与编码来自具有SEQ ID NO:1至2128所示之一氨基酸序列的scFv的一个VL结构域的核苷酸序列杂交。
在特异的实施方案中,本发明提供了免疫特异性结合BLyS的一种抗体或其片段,所述抗体或其片段包含一个CDR的氨基酸序列,编码所述CDR的核苷酸序列在高度严格杂交条件下,与编码来自具有SEQ ID NO:1至2128所示之一氨基酸序列的scFv的一个CDR的核苷酸序列杂交。
在特异的实施方案中,本发明提供了免疫特异性结合BLyS的一种抗体或其片段,所述抗体或其片段包含一个VH CDR3的氨基酸序列,编码所述VHCDR3的核苷酸序列在严格杂交条件下,与编码来自具有SEQ ID NO:2129至3227所示之一氨基酸序列的scFv的一个VH CDR3的核苷酸序列杂交。
在特异的实施方案中,本发明提供了免疫特异性结合BLyS的一种抗体或其片段,所述抗体或其片段包含一个VHCDR3的氨基酸序列,编码所述VHCDR3的核苷酸序列在高度严格杂交条件下,与编码来自具有SEQ ID NO:2129至3227所示之一氨基酸序列的scFv的一个VH CDR3的核苷酸序列杂交。
在一个特异的实施方案中,本发明提供了一种检测BLyS异常表达的方法,包括:
使用免疫特异性结合BLyS的一或多种抗体或其片段或变体,分析个体的细胞或组织样品中BLyS的表达水平;及
将分析的细胞或组织样品中BLyS的表达水平,与标准BLyS水平或没有异常BLyS表达的个体的细胞或组织样品中BLyS的表达水平相比较,其中分析的BLyS水平或来自没有BLyS异常表达的个体的细胞或组织样品中BLyS水平与标准BLyS水平相比较提高或降低,表示异常表达。
在特异的实施方案中,本发明提供了一种诊断与异常BLyS表达或活性相关的疾病或功能失调的方法,包括:
为对象施用免疫特异性结合BLyS的有效量的标记的抗体或其片段;
在施用后等待一段时间,以使标记的抗体或其片段在对象中BLyS表达的部位优先浓缩;
确定背景水平;及
检测对象中标记的抗体或其片段,这样在背景水平之上检测到标记的抗体或其片段,表示所述对象具有与BLyS异常表达相关的一种特殊疾病或功能失调。
在特异的实施方案中,就在上述的两种方法中使用本发明的抗体或其片段包含来自具有SEQ ID NO:1至2128所示之一的氨基酸序列的scFv的一个VH结构域。
在特异的实施方案中,就在上述的两种方法中使用本发明的抗体或其片段包含来自具有SEQ ID NO:1至2128所示之一的氨基酸序列的scFv的一个VL结构域。
在特异的实施方案中,就在上述的两种方法中使用本发明的抗体或其片段包含来自具有SEQ ID NO:2129至3227所示之一的氨基酸序列的一个VH CDR3。
在特异的实施方案中,就在上述两种方法中使用的本发明抗体或其片段缀合于一种诊断剂。
在特异的实施方案中,就在上述两种方法中使用的本发明抗体或其片段缀合于一种诊断剂,其中所述诊断剂是辣根过氧化物酶,碱性磷酸酶,β-半乳糖苷酶,或乙酰胆碱酯酶。
在特异的实施方案中,就在上述两种方法中使用的本发明抗体或其片段缀合于一种诊断剂,其中所述诊断剂是荧光素,异硫氰酸荧光素,罗丹明,二氯三嗪胺荧光素,丹磺酰氯或藻红蛋白。
在特异的实施方案中,就在上述两种方法中使用的本发明抗体或其片段缀合于一种诊断剂,其中所述诊断剂是125I,131I,111In,90Y或99Tc。
在特异的实施方案中,就在上述两种方法中使用的本发明抗体或其片段缀合于一种诊断剂,其中所述诊断剂是荧光素酶,虫荧光素或水母发光蛋白。
一种药物组合物包含至少一种抗体或其片段及一种药物适当的载体,所述抗体或其片段包含来自具有SEQ ID NO:1至2128所示之一氨基酸序列的scFv的一个VH结构域,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合BLyS。
一种药物组合物包含至少一种抗体或其片段及一种药物适当的载体,所述抗体或其片段包含来自具有SEQ ID NO:1至2128所示之一氨基酸序列的scFv的一个VL结构域,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合BLyS。
一种药物组合物包含至少一种抗体或其片段及一种药物适当的载体,所述抗体或其片段包含来自具有SEQ ID NO:1至2128所示之一氨基酸序列的scFv的一个VL结构域,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合BLyS,而且还包含来自具有SEQ ID NO:1至2128所示之一氨基酸序列的scFv的一个VH结构域。
一种药物组合物包含至少一种抗体或其片段及一种药物适当的载体,所述抗体或其片段包含来自具有SEQ ID NO:2129至3227所示之一的氨基酸序列,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合BLyS。
一种治疗,预防或改善与异常BLyS表达或活性相关的疾病或功能失调的方法,包括为需要治疗的动物使用有效量的所述药物组合物,所述药物组合物包含至少一种抗体或其片段及一种药物适当的载体,所述抗体或其片段包含来自具有SEQ ID NO:1至2128所示之一氨基酸序列的scFv的一个VL结构域,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合BLyS,而且还包含来自具有SEQ ID NO:1至2128所示之一氨基酸序列的scFv的一个VH结构域,以治疗,预防或改善所述疾病或功能失调。这种方法可以用于治疗感染性病变,癌症和/或自身免疫疾病如狼疮或肾小球肾炎。
一种治疗,预防或改善与异常BLyS表达或活性相关的疾病或功能失调的方法,包括为需要治疗的动物使用有效量的所述药物组合物,所述药物组合物包含至少一种抗体或其片段及一种药物适当的载体,所述抗体或其片段包含来自具有SEQ ID NO:1至2128所示之一氨基酸序列的scFv的一个VL结构域,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合BLyS,以治疗,预防或改善所述疾病或功能失调。这种方法可以用于治疗感染性病变,癌症和/或自身免疫疾病如狼疮或肾小球肾炎。
一种治疗,预防或改善与异常BLyS表达或活性相关的疾病或功能失调的方法,包括为需要治疗的动物使用有效量的所述药物组合物,所述药物组合物包含至少一种抗体或其片段及一种药物适当的载体,所述抗体或其片段包含来自具有SEQ ID NO:1至2128所示之一氨基酸序列的scFv的一个VL结构域,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合BLyS,而且还包含来自具有SEQ ID NO:1至2128所示之一氨基酸序列的scFv的一个VH结构域,以治疗,预防或改善所述疾病或功能失调。这种方法可以用于治疗感染性包被,癌症和/或自身免疫疾病如狼疮或肾小球肾炎。
一种治疗,预防或改善与异常BLyS表达或活性相关的疾病或功能失调的方法,包括为需要治疗的动物使用有效量的所述药物组合物,所述药物组合物包含至少一种抗体或其片段及一种药物适当的载体,所述抗体或其片段包含来自具有SEQ ID NO:2129至3227所示之一的氨基酸序列,其中所述抗体或其片段免疫特异性结合BLyS,而且还包含来自具有SEQ ID NO:1至2128所示之一氨基酸序列的scFv的一个VH结构域,以治疗,预防或改善所述疾病或功能失调。这种方法可以用于治疗感染性包被,癌症和/或自身免疫疾病如狼疮或肾小球肾炎。
实施例
缩写
0.2M
,0.5mM EDTA,0.5M蔗糖(TES)
1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]氢氧化碳二亚胺(EDC)
补加100μg/ml氨苄青霉素和2%葡萄糖的2TY(2TYAG)
补加100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的2TY(2TYAK)
3,3’,5,5’-四甲基对二氨基联苯(TMB)
50%抑制浓度(IC50)
含有18%Marvel封闭溶液的6xPBS(6xMPBS)
吸光度(A)
牛血清白蛋白(BSA)
酶联免疫吸附测定(ELISA)
胎牛血清(FCS)
重链变体(VH)
Hepes缓冲的盐水(HBS)
辣根过氧化物酶(HRP)
固定金属亲和层析(IMAC)
异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)
轻链变体(VL)
感染复数(MOI)
N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙磺酸](Hepes)
纳摩尔(nM)
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)
含有3%Marvel的PBS(MPBS)
磷酸盐缓冲盐水(PBS)
磷酸盐缓冲盐水+0.1%(v/v)Tween 20(PBST)
皮摩尔(pM)
单链片段变体(scFv)
肿瘤坏死因子α(TNF-α)
肿瘤坏死因子β(TNF-β)
TNF-相关的细胞程序死亡诱导配体(TRAIL)
定义
在以下章节中,“固定的BLyS”是指一种包被在塑料分析平板上(例如96孔平板)的可溶形式的BLyS或生物素化BLyS,但不是包被在塑料分析平板上的组氨酸标记的BLyS;“生物素化BLyS”是一种可溶形式的BLyS,除了用于包被ELISA平板时,在这种情况下,其是“固定的BLyS”。膜结合形式的BLyS包括但非限于U937和P388质膜。
实施例1:免疫特异性结合可溶和膜结合形式BLyS的抗体
在一个分析中筛选噬菌体文库,以鉴别那些展示免疫特异性结合可溶形式和膜结合形式BLyS的scFv。在对固定的BLyS进行淘选及通过ELISA评定与固定的BLyS的结合后,鉴别展示结合固定的BLyS的scFv的噬菌体。在这些分析中固定在平板上的BLyS是从用杆状病毒表达构建体感染的Sf9细胞上清中纯化的,见Moore等,科学285:260-263所述,以其全文并入参考。然后对每种鉴别的scFv进行测序。将一些序列多次分离,因此产生一组含有每个独特序列的一个成员的序列(第1组),并根据其免疫特异性结合可溶形式和膜结合形式BLyS的能力而进一步定性。
这些scFv衍生的氨基酸序列示于表1。将所述scFv的各个VH和VL节段在V-BASE中连接于已知人种系序列(Tomlinson等,www.mrc-cpe.cam.ac.uk),并鉴别最接近的种系。
实施例2:scFv对BLyS和膜结合BLyS的特异性
每种scFv对BLyS和膜结合BLyS的特异性是通过噬菌体ELISA确定的。将BLyS固定在塑料平板上,以蛋白质的纯化可溶形式或以呈递在来自人类巨噬细胞系(U937)的质膜制品上的膜结合形式。
维持U937细胞
U937是已知在其质膜上表达BLyS的人类单核细胞的,组织细胞淋巴瘤细胞系。将它们维持在补加4mM L-谷氨酰胺,10%FCS,10U青霉素,100μg/ml链霉素的RPMI-1640中(所有试剂均得自Sigma公司)。将细胞从冷冻的原种中解冻,并用于制备质膜或在培养2天后当细胞密度达到1×106/ml时分裂为1∶5。
制备U937质膜
为制备质膜,从培养基中通过在台式离心器中以1000rpm,在4℃离心5分钟收集1×109U937细胞。将细胞悬浮在40ml 12mMTris,pH7.5,250mM蔗糖中,并置于冰上。然后将细胞用手持电动匀质器(Labortechnik IKA Ultra-Turrax)裂解4,1分钟脉冲。为证实细胞裂解已经发生,将10ul细胞裂解物加入10ul台盼蓝,并在显微镜下检测细胞裂解物。在证实裂解后,将匀浆在4℃以270×g离心10分钟以沉淀核成分,保留上清。将上清在4℃以8000×g离心10分钟,以沉淀线粒体和溶酶体成分,保留上清。然后将所述上清在4℃以100000×g离心60分钟,以沉淀富集质膜的成分。弃去上清,将所述质膜沉淀再悬浮于1ml PBS中并贮存在-70℃。使用蛋白质量化试剂盒(Biorad)确定所述质膜成分的蛋白质浓度。典型的产量在5-10mg质膜之间。
噬菌体ELISA
为确定每种scFv的特异性,对每种scFv抗人BLyS,U937质膜,TNFα(R&D Systems,Minneapolis,MN),BSA和未包被的孔进行噬菌体ELISA。将含有代表来自1组的一个独特的scFv的噬菌粒的各个大肠杆菌集落,接种于含有100μl 2TYAG培养基/孔的96孔平板中。将平板在37℃摇动温育4小时。将M13KO7辅助噬菌体加入每个孔中至MOI为10,并将所述平板在37℃进一步温育1小时。将所述平板在台式离心器中以2000rpm离心10分钟。除去上清,将细胞沉淀再悬浮于100μl 2TYAK中,并在30℃摇动温育过夜。第二天,将平板在2000rpm离心10分钟,并从每个孔中将100μl含有噬菌体的上清小心移至一个新鲜的96孔平板中。将20μl的6xMPBS加入每个孔中,并在室温温育1小时以在ELISA之前预封闭所述噬菌体。
将柔软的96孔平板(Falcon)在4℃用PBS中人BLyS(1μg/ml),PBS中U937质膜(10μg/ml),PBS中TNFα□(1μg/ml),PBS中BSA(1μg/ml)或PBS包被过夜。在包被后,将所述溶液从孔中除去,并将所述平板在MPBS中在室温封闭1小时。将所述平板用PBS冲洗3次,然后在每个孔中加入50μl预封闭的噬菌体。将所述平板在室温温育1小时,然后用3种变化的PBST冲洗,随后用3种变化的PBS冲洗。在每个孔中加入在MPBS中稀释1∶5000的50μl抗基因VIII-HRP缀合物(Pharmacia),然后将所述平板在室温温育1小时。将每个平板用PBST冲洗3次,随后用PBS冲洗3次。然后加入在3%MPBS中稀释1/50的50ul HRP-标记的抗小鼠聚合物(DAKO EnVision),在室温温育1小时。然后将每个平板用PBST冲洗3次,随后用PBS冲洗3次。然后在每个孔中加入50μl的TMB底物,在室温温育30分钟或直至发生变色。通过加入25μl的0.5M
结束反应。产生的信号通过用微滴定平板读器(Bio-Rad 3550)读数在450nm的吸光度(A450)而测定。
3个克隆(I006E07,I008D05和I016F04)的结果示于图1。所有3种scFv均识别固定的BLyS和U937质膜,但不识别TNFα,BSA或未包被的孔(只有PBS)。这些结果表明这些scFv特异性识别固定的BLyS和膜结合的BLyS。
实施例3:通过噬菌体scFv在体外受体结合分析中的抑制
对1组中所有独特的噬菌体scFv,确定其抑制可溶性BLyS结合IM9细胞上其同类受体的能力。
生物素化BLyS
将100ug人或小鼠BLyS在4℃,使用玻片-a-lyzer盒(Pierce)用50mM重碳酸钠(碳酸氢钠)pH8.5透析过夜。第二天,将NHS-生物素(Pierce)溶解于DMSO中至13.3mg/ml。然后将其加入BLyS中,摩尔比率为20∶1生物素:BLyS,混合并在冰上温育2小时。然后将生物素化BLyS在4℃使用玻片-a-lyzer盒用无菌PBS(Sigma)透析过夜。所述生物素化BLyS的生物活性使用受体结合抑制分析证实(如下所述)。
维持IM9细胞
IM9是人B淋巴细胞系。将它们维持在补加4mM L-谷氨酰胺,10%FCS,10U青霉素,100μg/ml链霉素的RPMI-1640中(所有试剂均得自Sigma)。将细胞从冷冻的原种中解冻,并在培养5天后达到4-8×105/ml密度时用于分析中。
受体结合抑制分析
将含有代表来自1组的一个独特scFv的噬菌粒的各个大肠杆菌集落,接种于含有100μl 2TYAG培养基/孔的96孔平板中。将平板在37℃摇动温育4小时。在每个孔中加入M13KO7辅助噬菌体至MOI为10,将平板在37℃进一步温育1小时。将所述平板在台式离心器中以2000rpm离心10分钟。除去上清,将细胞沉淀再悬浮于100μl 2TYAK中,并在30℃摇动温育过夜。第二天,将平板在2000rpm离心10分钟,从每个孔中将100μl含有噬菌体的上清小心移至一个新鲜的96孔平板中。将噬菌体在使用之前在MPBS中稀释为1∶2。
将平底96孔平板(Costar)以100ul/孔L用在PBS中1∶10稀释的聚L-赖氨酸(Sigma)在室温包被1小时。然后将平板用水冲洗两次,在空气中干燥,并置于4℃过夜。然后将100μl的IM9细胞(在RPMI-1640培养基中106/ml)加入每个孔中。将平板在3200rpm离心5分钟以沉淀细胞。将培养基小心抽吸出,并在每个孔中加入200ul的MPBS。然后将所述平板在室温封闭1小时。
在一个单独的96孔平板中加入10ul在MPBS中的生物素化BLyS(162.5ng/ml),至终浓度为25ng/ml。将55ul每种适当的噬菌体上清加入每个孔中,至每个孔中终体积为65ul。然后将平板在室温温育30分钟。
将IM9包被的平板在PBS中冲洗两次,抽吸干燥并立即加入50ul噬菌体/生物素化BLyS混合物,在室温温育1小时。将平板用PBST冲洗3次及用PBS冲洗3次,抽吸干燥,并在每个孔中加入在厂商的分析缓冲液中1∶1000稀释的50ul链亲和素-Delfia(Wallac)。将平板抽吸干燥后,加入100ul/孔富集Delfia的溶液(Wallac)。将平板轻轻抽吸以促进胶态离子形成,在室温温育10分钟,在Wallac 1420在6520nM读荧光性。
3个噬菌体scFv(I001C09,I018D07和I016H07)抑制生物素化BLyS的结果示于图2。图中还示出了生物素化BLyS与其受体的最大结合(仅生物素化BLyS),在没有生物素化BLyS的情况下的背景信号(无生物素化BLyS),及使用不相关的噬菌体抗体(即不识别BLyS)的结果。所有3个噬菌体scFv均抑制生物素化BLyS与其IM9细胞上的受体的结合,确定这些scFv是结合可溶形式BLyS的scFv。这些svFv还结合U937膜,因此它们还结合膜结合形式的BLyS。
选择第1组中在这个分析中有最大抑制作用的噬菌体颗粒的48个scFv进行进一步研究。这48个scFv示于表3。
表3:抑制生物素化BLyS与其受体结合的scFv
| 抗体 | 抗体 | 抗体 | 抗体 | 抗体 |
| I008C02 | I029D07 | I008C03 | I008C12 | I028A06 |
| I022E02 | I061E07 | I007H08 | I061H01 | I031C03 |
| I018C02 | I006D07 | I008A11 | I006D08 | I031F02 |
| I008B01 | I017D10 | I061D02 | I026E03 | I031F09 |
| I016F04 | I007B03 | I008A09 | I027A07 | I031G11 |
| I016E05 | I018C10 | I007F11 | I016H07 | I050A07 |
| 1018H08 | I001C09 | I037E07 | I021B05 | I050A12 |
| I018H09 | I018D07 | I037E12 | I031G10 | I050B11 |
| I029F11 | I016F02 | I031G08 | I051C04 | |
| I022D01 | I031C07 | I003F12 | ||
| I012A06 |
实施例4:抗BLyS抗体的特异性
使用噬菌体ELISA确定表3中示出的48个scFv对人和小鼠BLyS的特异性。
噬菌体EUSA
为确定这48个scFv的特异性,用人和小鼠BLyS,和一组相关的不相关的抗原进行噬菌体ELISA,所述抗原是:Fas配体,TRAIL,TNFα,TNFβ,和PBS。所述Fas配体,TRAIL,TNFα,和TNFβ抗原得自R&D Systems,Minneapolis,MN。将含有噬菌粒的各个大肠杆菌集落接种于5ml 2YTAG中,并在37℃摇动温育4小时。将M13KO7辅助噬菌体(Pharmacia)加入每个试管中,至MOI为10,并在37℃温育1小时,前30分钟静态温育,后30分钟轻轻摇动温育。将细胞通过在3,500rpm离心10分钟沉淀,弃去上清。将细胞沉淀再悬浮于5ml 2TYAK中,并在30℃摇动温育过夜。第二天,将细胞通过在3,500rpm离心10分钟沉淀。将含有噬菌体的上清(5ml)小心移至一个新鲜试管中,加入的1ml的6MPBS,将所述试管在室温温育1小时,以在ELISA之前预封闭所述噬菌体。
将所有抗原在1μg/ml包被。基本如实施例2所述进行ELISAs。唯一不同之处是检测噬菌体抗体预小鼠BLyS的结合,在此省略了用HRP标记的抗小鼠聚合物温育的步骤。如在实施例2的章节中所述的用TMB检测与小鼠BLyS的结合。
所有48个scFv均特异于固定的人BLyS,而且48个当中有43个scFv与固定的小鼠BLyS交叉反应,但与任何其它不相关的或相关的测试抗原不反应。I008C03,I007F11,I037E07,I037E12,和I016H07不结合小鼠BLyS。这两个scFv,I022D01和I031F02,的结果示于图3。这两个scFv均特异性识别人和小鼠BLyS,但与任何其它的不相关的或相关的测试抗原均不反应。
实施例5:对膜结合形式BLyS的特异性
通过实施例2中所述的噬菌体ELISA确定48个scFv对膜结合BLyS的特异性。将BLyS固定在塑料平板上,作为呈递在人巨噬细胞细胞系U937的质膜上的膜结合形式。这个细胞系已知表达膜结合形式的人BLyS。
为证实这种结合是特异于膜结合形式BLyS的,进行竞争性ELISA以确定各个抗体在U937上的ELISA信号是否可以通过用BLyS或TNFα预温育而竞争去掉。期望识别膜结合BLyS的抗BLyS抗体表明用游离BLyS信号降低,但用游离TNFα信号不降低。
竞争性ELISA
将含有表3所示48个scFv的每种噬菌粒的各个大肠杆菌集落,接种于5ml 2YTAG中,并在37℃摇动温育4小时。将M13KO7辅助噬菌体(Pharmacia)加入每个试管中至MOI为10,并在37℃温育1小时,前30分钟静态温育,后30分钟轻轻摇动温育。将细胞通过在3,500rpm离心10分钟沉淀,弃去上清。将细胞沉淀再悬浮于5ml 2TYAK中,并在30℃摇动温育过夜。第二天,将细胞通过在3,500rpm离心10分钟沉淀。将含有噬菌体的上清(5ml)小心移至一个新鲜试管中。
针对表3所示48个scFv的每一个,将两份20ul等份的6xMPBS移液至96孔平板(Greiner)的各个孔中。将第一个等份补加BLyS至终浓度为0.5ug/ml。将第二个等份补加TNF-α至终浓度为0.5ug/ml。一式三份进行实验。然后将100ul每个噬菌体上清加入每个等份中,通过上下移液混合。将所述噬菌体在室温温育(+接种抗原)1小时。
将96孔平板(Falcon)在4℃用50μl的10μg/ml U937质膜包被过夜。在包被后,将所述平板用PBS冲洗3次,并在室温用200μlMPBS封闭1小时。将平板用PBS冲洗3次,在每个适当的孔中加入50μl噬菌体(+竞争抗原)。将平板在室温温育1小时,然后用3种变化的PBST冲洗,随后用3种变化的PBS冲洗。在每个孔中加入在MPBS中1∶5000稀释的50μl小鼠抗基因VIII-HRP缀合物(Pharmacia),并将平板在室温温育1小时。将每个平板用PBST冲洗3次,随后用PBS冲洗3次。然后加入在3%MPBS中1∶50稀释的50ul的HRP-标记的抗小鼠聚合物(DAKO EnVision),在室温温育1小时。然后将平板用PBST冲洗3次,随后用PBS冲洗3次。然后在每个孔中加入50μl的TMB底物,在室温温育30-60分钟或直至产生变色。通过加入25μl的0.5M
终止反应。产生的信号通过使用微滴定平板读器(Bio-Rad 3550)在450nm吸光度(A450)读数测定。
所有48个scFv均结合U937质膜。这个信号可以通过用BLyS预温育噬菌体抗体而竞争去掉,但用TNFα预温育不能去掉。这表明所述48个scFv均特异性识别膜结合形式的BLyS以及可溶形式的BLyS。典型的结果是通过scFv I031F09,I050A12和I051C04例证的,并示于图4。所有3种scFv均表明结合U937质膜。这种结合可用BLyS特异性竞争去掉,但用TNF不能,表明对膜结合BLyS的特异性识别。
实施例6:scFv的解离速率(Off-rate)的测定
所有解离速率测定均在BIAcore 2000设备上进行,使用BIAcore 2000控制软件,及使用BIAevaluation 3.0软件评价。
制备低密度BLyS表面
用纯化的scFv制备500RU表面以进行动力学研究。低密度BLyS表面(偶联500RU BLyS)是在流动池2中通过将胺偶联于一个CM5芯片制备的。将一个新CM5芯片插入BIAcore中,并用HBS缓冲液以5μl/min流速发起传感。将NHS和EDC偶联溶液(BIAcore)根据厂商指导混合,并将30μl注入CM5表面。然后注射在10mM,pH4乙酸钠缓冲液中的1μg/ml的50μl BLyS,随后注射30μl乙醇胺-HCl溶液(BIAcore)。然后将流速调节为20μl/min,在所述表面注入HBS中10μl的4M盐酸胍。这可以剥去表面未共价结合的BLyS。
在低密度表面上测定scFv的解离速率动力学
将含有低密度BLyS表面的芯片插入BIAcore中。在HBS中制备系列稀释的纯化的scFv,典型地从50μg/ml加倍稀释液至1.5ug/ml。然后将此系列稀释液相继注入低密度BLyS表面(和空白对照),使用以下程序:
MAIN
FLOWCELL 1,2,3,4
APROG genab r1d1 ab1
APROG genab r1d2 ab2
APROG genab r1d3 ab3
APROG genab r1d4 ab4
APROG genab r1d5 ab5
APROG genab r1d6 ab6
APPEND CONTINUE
END
DEFINE APROG genab
PARAM%Abpos%AbId
FLOW 20
KINJECT%Abpos 200 80
INJECT r1c6 10!guanidine hydrochloride regeneration step
EXTRACLEAN
END
通过在scFv样品之间的表面上注射HBS中10μl 4M GuHCl除去结合的scFv。
使用BIAevaluation软件分析各个scFv的结合曲线,以确定抗体解离速率。对典型的scFv抗体I003C02的动力学分析示于图5。
I003C02的Koff=6×10-3s-1。
实施例7:通过scFv抗体在体外受体结合分析中的抑制
纯化表3所示48个scFv,并确定其抑制BLyS结合其IM9细胞上受体的能力。
纯化scFv
为确定抗BLyS的scFv的抑制能力,首先通过IMAC制备scFv。用单个的集落接种2TYAG(5ml),并在30℃摇动生长过夜。然后将此过夜培养物用于接种含有100μg/ml氨苄青霉素和0.1%葡萄糖的500ml的2TY,并在30℃摇动生长,直至达到A600为1.0。
加入IPTG至1mM,并将培养物在30℃进一步生长3.5小时。
通过在5,000rpm离心收集细胞,并再悬浮于10ml的TES中。加入另外15ml的1∶5的TES稀释液(在水中),并将细胞悬浮液在4℃在转轮上温育30分钟。这导致渗压震扰并产生含有所述scFv的周质提取物。通过在9,000rpm在4℃离心20分钟沉淀残留细胞和碎片。将上清移至一个新试管中,加入50μl的1M
。然后在周质提取物中加入用缓冲液(50mM磷酸钠pH8,300mM
)预冲洗的2ml Ni-NTA琼脂糖(Qiagen),及一种蛋白酶抑制剂片(Boehringer Mannheim)。将制品4℃旋转温育过夜。将Ni-NTA通过在2000rpm离心5分钟沉淀,抽吸上清。将琼脂糖珠用50ml冲洗缓冲液冲洗3次,在每次冲洗之间离心收集琼脂糖。在最后冲洗后加入10ml冲洗缓冲液,将浆液加样于polyprep层析柱中(BioRad)。在流出的琼脂糖中加入2ml洗脱缓冲液(50mM
(磷酸钠),pH8,300mM
,250mM咪唑),并收集洗脱物。IMAC纯化的scFv通过使用Nap 5层析柱(Pharmacia),根据厂商指导置换为PBS中。读数A280及使用摩尔消光系数测定的蛋白质浓度为1mg/ml蛋白质=A2801.4。纯化的scFv以500μl等份贮存于-70℃。
受体结合抑制分析
将平底的96孔平板(Costar)用100ul/孔的在PBS中1∶10稀释的聚L-赖氨酸(Sigma),在室温包被1小时。然后将平板用水冲洗两次,在空气中干燥,并置于4℃过夜。然后在每个孔中加入100μl的IM9细胞(106/ml在RPMI-1640中)。然后将平板在3200rpm离心5分钟以沉淀细胞。将培养基小心吸出,并在每个孔中加入200ul的MPBS。然后将平板置于室温封闭1小时。
在一个单独的96孔平板中,加入在MPBS中滴定测试scFv,一式三份,浓度为10ug/ml至0.001ug/ml。在每个孔中最终测试体积为55ul。在每个分析还包括用未标记的BLyS竞争作为对照。在MPBS中未标记的BLyS典型地一式三份滴定测试,浓度范围是1ug/mi至0.001ug/ml。将MPBS中10ul生物素化BLyS(162.5ng/ml)加入每个孔中,终浓度为25ng/ml。然后将平板在室温温育30分钟。
将IM9包被的平板在PBS中冲洗两次,抽吸干燥,并立即加入50ul的scFv/生物素化BLyS混合物,在室温温育1小时。将平板在PBST中冲洗3次,在PBS中冲洗3次,抽吸干燥,并加入在厂商的分析缓冲液中1∶1000稀释的50ul/孔链亲和素-Delfia(Wallac)。然后将平板在室温温育1小时,并在Delfia冲洗溶液(Wallac)中冲洗6次。在通过抽吸将平板干燥后,加入100ul/孔富集Delfia的溶液(Wallac)。将平板轻轻抽吸以促进胶态离子形成,在室温温育10分钟,并在Wallac 1420工作站在6520nM读取荧光。
两种scFv抗体,I007F11和I050A07,典型的滴定曲线示于图6。未标记的BLyS竞争其受体结合的IC50值为0.8nM。I007F11和I050A07的IC50值分别为7.9nM和17.1nM。一式三份进行此分析,并示出标准误差。表现为最大抑制的9个scFv示于表4。这个数据还证实这9个scFv识别可溶形式BLyS。
表4:在BLyS受体结合抑制分析中示出最大效力的9个scFv
| ScFv抗体 |
| I017D10 |
| I022D01 |
| I008A11 |
| I006D08 |
| I031F02 |
| I050A12 |
| I050B11 |
| 1051C04 |
| I003F12S |
实施例8:识别可溶形式BLyS的抗体
在一个分析中筛选一个噬菌体文库,以鉴别那些展示没有特异性结合可溶形式但不结合膜结合形式BLyS的scFv的噬菌体。
筛选噬菌体文库结合生物素化BLyS的能力。将所述噬菌体暴露于生物素化BLyS,间隔一段时间以结合生物素化BLyS。然后通过在链亲和素包被的磁珠上捕获以分离结合生物素化BLyS的噬菌体。
然后将在上述筛选中鉴别的噬菌体(生物素化BLyS从溶液中捕获的)通过ELISA筛选其结合固定的BLyS的能力。然后克隆和测序由结合固定的BLyS的噬菌体表达的scFv。
另外,多次鉴别一些序列,然后对因此由表达独特scFv的每个噬菌体组成的一组(第2组)进行进一步定性。
这些scFv的衍生的氨基酸序列示于上表1。将scFv的各个VH和VL节段与已知的人种系序列在V-BASE(Tomlinson等,www.mrc-cpe.cam.ac.uk)中进行序列对比,并鉴别了最接近的种系。
实施例9:针对可溶性BLyS的特异性
基于其结合BLyS的可溶形式的能力从一噬菌体文库中分离scFv。简要地,将噬菌体在溶液中与生物素化的BLyS预保温。然后用链亲和素包被的磁珠分离与这种生物素化的BLyS结合的噬菌体。
每种独特的scFv对BLyS以及对膜结合形式的BLyS的特异性用噬菌体ELISA确定。将BLyS以纯化的可溶形式蛋白质或存在于来自人巨噬细胞样细胞系U937的质膜制备物上的膜结合形式固定化于一塑料上。U937细胞的维持和质膜制备如实施例2所述进行。
噬菌体ELISA
为确定每种scFv的特异性,进行每种抗体抗人BLyS、U937质膜、TNFα和BSA以及未包被孔的噬菌体ELISA。除了人BLyS外,抗原包被条件如实施例2所述。BLyS先生物素化(如实施例3所述),然后于室温以1μg/ml包被在链亲和素包被的板(Reacti-Bind,Pierce)上30分钟。然后洗板,封闭并进行噬菌体ELISA,如实施例2详述。
图7示出了结合可溶形式BLyS但不结合膜结合形式BLyS的3个克隆(I074B12,I075F12 and I075A02)的结果。图7也示出了作为对照的识别TNFα的噬菌体抗体。用抗BLyS scFv和抗TNFα对照可以看出在U937质膜上用小量非特异性背景信号。所有3个抗BLySscFv均识别BLyS但不识别U937质膜、TNFα、BSA或未包被的孔(仅含PBS)。这表明scFv不结合膜结合形式的BLyS。另外,这些scFv是基于其结合可溶的生物素化BLyS而分离这一事实表明它们结合可溶形式的BLyS。实施例10进一步证实这些scFv对BLyS的特异性。
实施例10:在一体外受体结合分析中噬菌体scFv所致的抑制作用
评价来自第2组的所有独特噬菌体scFv抑制BLyS与在IM9细胞上的其关联受体的结合的能力。BLyS的生物素化、IM9细胞的维持以及受体结合抑制分析如实施例3所述进行。
图8示出了两个噬菌体scFv,I0025B09和I026C04的结果。还示出了生物素化BLyS与其受体的最大结合(仅bio-BLyS),在不存在生物素化BLyS时的背景信号(无bio-BLyS),以及使用无关(即不识别BLyS)噬菌体抗体的结果。两个噬菌体scFv均抑制生物素化BLyS与其在IM9细胞上的受体的结合。鉴别了来自第2组的33个独特的scFv以用于进一步的研究,这33个scFv作为此分析中的噬菌体颗粒具有最大抑制作用并列于表5。
表5:对生物素化BLyS与其受体的结合具有最显著抑制作用的33个针对游离BLyS的噬菌体scFv的鉴别
| 抗体 | 抗体 | 抗体 | 抗体 |
| I026C04 | I074B12 | I073F04 | I065D04 |
| I003C06 | I075A02 | I078D08 | I068C08 |
| I025B09 | I068B08 | I078D02 | I068F03 |
| I027B12 | I068B04 | I075G01 | I069B07 |
| I025B06 | I068C06 | I071B03 | |
| I030A10 | I075F12 | I072B09 | |
| I002A01R | I065D08 | I078H08 | |
| I002A01K | I065F08 | I064C04 | |
| I026C04R | I067B10 | I064C07 | |
| I026C04K | I067F05 |
实施例11:抗BLyS scFv的特异性
用噬菌体ELISA确定33个scFv(表5所示)对固定化人和鼠BLyS的特异性。
噬菌体ELISA
为确定33个scFv的特异性,如实施例4所述进行抗人和小鼠BLyS以及一组相关人抗原TRAIL,LIGHT,TNFα,TNFβ,以及未包被孔(仅PBS)的噬菌体ELISA。
图9示出两个scFv,I067F05和I078D02的典型结果。也示出了特异识别TNFα的对照抗体。两个抗BLyS scFv均特异识别固定化的人和小鼠BLyS但不识别任何其它所测抗原。
所有33个scFv均特异于人BLyS。33个中的14个(14/33)与小鼠BLyS交叉反应,但不与任何其它所测无关或相关抗原交叉反应。
实施例12:scFv解离速率测定
如实施例6所述进行解离速率测定、低密度BLyS表面的制备和动力学测定。
各scFv的结合曲线用BIAevaluation软件进行分析以确定抗体解离速率。图10示出了一典型scFv抗体I002A01的动力学分析。
I002A01的Koff=9×10-4s-1。
实施例13:scFv抗体在体外受体结合分析中的抑制作用
将表5所示33个scFv制备成纯化的scFv并评价其抑制BLyS与其在IM9细胞上的受体的结合的能力。如实施例6.1.8所述纯化scFv并在受体结合抑制分析中进行分析。
图11示出了两个scFv即I0068C06和I074B12的典型滴定曲线。未标记的BLyS竞争结合其受体,抑制常数50(IC50)值为0.66nM。I0068C06和I074B12的IC50值分别为61nM和13nM。分析以三份进行,并示出标准误差杆。表6示出了作为scFv具有最大抑制作用的7个scFv。
表6:作为纯化的scFv对生物素化BLyS与其受体的结合具有最显著抑制作用的7个针对游离BLyS的scFv
| 抗体 |
| I002A01-R |
| I002A01-K |
| I026C04-R |
| I026C04-K |
| I068C06 |
| I075F12 |
| I067B10 |
实施例14:识别膜结合BLyS的ScFv
在一分析中筛选噬菌体文库以鉴别展示免疫特异性结合膜结合BLyS而不结合可溶形式BLyS的scFv的噬菌体。
首先,在固定化HIS标记的BLyS上淘选表达scFv抗体的噬菌体文库。随后对淘选分离的噬菌体筛选其结合HIS标记的BLyS的能力。通过用pQE9载体(Qiagen Inc.,Valencia,CA)在大肠杆菌中表达SEQ ID NO:3228的第71-285位氨基酸并纯化表达的蛋白质而获得HIS标记的BLyS。然后对由这一筛选过程鉴别的噬菌体克隆进行测序,测序后,产生一组(第3组)噬菌体,其中每个噬菌体均表达一种与HIS标记的BLyS结合的独特的scFv,对这一组噬菌体进行进一步鉴定。
表1示出了来自第3组的独特scFv的衍生氨基酸序列。ScFv的VH和VL区段与V-BASE(Tomlinson et al,www.mrc-cpe.cam.ac.uk)中的已知人种系序列进行序列对比,鉴别出最接近的种系。
实施例15:膜结合BLyS的识别
通过噬菌体ELISA确定每种独特的scFv对膜结合形式BLyS和可溶形式BLyS的特异性。
如实施例9所述,BLyS作为纯化的可溶形式蛋白质或生物素化形式固定在塑料上并包被在链亲和素板上。用与HIS标记的BLyS的结合作为初次筛选,以筛选结合膜结合形式BLyS的ScFv(见下述)。膜结合形式BLyS作为来自人巨噬细胞样细胞系U937或鼠细胞系P388的质膜制备物而存在。
根据标准程序产生抗His标记的BLyS的小鼠单克隆抗体。这些小鼠单克隆抗体的鉴定揭示它们特异地识别His标记的BLyS和U937细胞上的膜结合形式的BLyS,但不识别可溶形式BLyS。因此,His标记的BLyS的特异识别可以用作膜结合形式BLyS被噬菌体和scFv抗体识别的支持证据。
噬菌体ELISA
为确定每种scFv的特异性,对每种抗体进行抗His标记的人BLyS,U937质膜,TNFα,BSA和未包被孔的噬菌体ELISA。除了人BLyS外,抗原包被条件如实施例2所述。BLyS首先生物素化(如实施例3所述)并于室温下以1μg/ml包被在链亲和素包被的板(Reacti-Bind,Pierce)上30分钟。然后洗板,封闭,并如实施例2所述进行噬菌体ELISA。
图12示出3个克隆I079C01,I081C10和I082A02以及识别TNFα的一种对照噬菌体抗体的结果。所有3个scFv均识别U937质膜(U937)和His标记的BLyS(HIS-BLyS)但不识别生物素化BLyS(bio-BLyS)或未包被的孔(PBS)。这表明所述scFv识别膜结合形式BLyS。
实施例16:针对膜结合BLyS的特异性
用竞争ELISA证实所述scFv仅针对膜结合形式BLyS而非可溶形式BLyS的特异性。这一分析评价了所测噬菌体scFv在不同形式竞争性BLyS存在下结合U937质膜上的膜结合形式BLyS的能力。竞争性BLyS是His标记形式的BLyS或可溶性BLyS。预期特异于膜结合BLyS的scFv通过与His标记的BLyS预保温而竞争掉,但与可溶BLyS预保温不会竞争掉。
U937细胞的维持和质膜制备如实施例2所述进行。
竞争ELISA
U937质膜(每孔50μl)以10μg/ml于PBS中在4℃过夜包被Falcon96-孔板。
将含有噬菌粒(代表一个来自第3组的独特scFv)的大肠杆菌菌落逐个分别接种进含有5ml 2TYAG培养基的50ml试管(Falcon)中。这些试管于37℃振荡保温4小时。以MOI为10向每一试管中加入M13KO7辅助噬菌体并在37℃继续保温1小时。以3500rpm在一台式离心机中离心试管10分钟,弃上清,将细胞沉淀重悬于5ml2TYAK中并于30℃振荡保温过夜。第二天,试管以3500rpm离心10分钟,将含有噬菌体的上清小心转移至一新鲜试管。
对于每种测试噬菌体抗体,将3等份20μl 18%marvel/6xPBS转移进96孔板的不同孔中。第一个等份补加终浓度为60μg/ml的His标记的BLyS,第二等份补加终浓度为60μg/ml的可溶BLyS,第三等份不补加任何竞争抗原。然后向每一等份中加入100μl噬菌体上清,于室温下封闭1小时。
用PBS洗涤抗原包被的板,随后加入200μl/孔3%marvel/PBS。将这些板置于37℃封闭1小时,随后用PBS洗板1次。将50μl预封闭的噬菌体的双份样品(如上所述)加入到抗原包被的板中,置于室温1小时。用PBS/0.1%Tween 20洗板3次,然后再用PBS洗板3次。加入50μl/孔小鼠抗M13 HRP(Pharmacia)(1/5000于3%Marvel/PBS中),置于室温1小时。用PBS/0.1%Tween 20洗板3次,然后再用PBS洗板3次。加入50μl/孔HRP标记的抗小鼠Envision聚合物(DAKO)(1/50于3%marvel/PBS)中,置于室温1小时。用PBS/0.1%Tween 20洗板3次,然后再用PBS洗板3次。随后加入50μl/孔TMB(Sigma)使板显色30-60分钟。当显现足够的颜色时,加入25μl/孔0.5M
终止反应。在一微滴板阅读器(Bio-Rad 3550)上读取平板在450nm的读数。
图13示出3个克隆I079B04,I079F08和I080B01以及一识别TNFα的对照噬菌体抗体的结果。所有3个scFv均识别U937质膜(U937)。在His标记的BLyS(HIS-BLyS)存在下,这一结合被竞争降至背景水平(即与用抗TNFα噬菌体抗体观察到的信号相当),但在生物素化BLyS(bio-BLyS)存在下无此现象。这证实所述scFv特异识别膜结合形式BLyS,而不识别可溶形式BLyS。
实施例17:高通量BIAcore筛选以鉴别高亲和性scFv
这是一种96-孔筛选,其中测试样品(scFv)衍生自各个表达抗体克隆的1ml的周质提取物。然后,原则上在BIAcore中给出大量结合至HIS-BLyS表面的总RU的scFv被鉴别为潜在的高亲和性scFv。这种分级方法假设来自每个克隆的scFv产量大约相等。由于情况并非总是这样,因此有一些scFv仅仅是由于表达高水平scFv而被鉴别出。这些可以通过进一步鉴定scFv而与高亲和性scFv区分开(见实施例18)。
从1ml大肠杆菌培养物中提取scFv
将含有一个噬菌粒(代表一个来自第3组的独特scFv)的大肠杆菌菌落逐个接种进每孔含有100μl 2TYAG培养基的96孔板中。每板设8个孔分别加入阳性和阴性对照样品。以120rpm于30℃振荡培养平板。
第二天,向一高压灭菌的96深孔板(Beckman)的每孔中加入1mlof 2TYAG+345mM蔗糖。重悬20μl每个过夜培养物并转移进该深孔板的合适孔中。平板以250rpm于30℃振荡培养约3.5小时(或直至OD600=0.6)。向5ml 2TY中加入50μl 1M IPTG并将10μl这种溶液加入每孔中。平板以250rpm于30℃振荡培养过夜。
余下程序中将平板保持于4℃。将过夜平板(上述)于4℃以3500rpm离心10分钟以沉淀细胞,倾倒除去上清,将每一沉淀重悬于100μl TES(0.2M Tris
pH8.0,0.5mM EDTA,0.5M蔗糖)中并转移至一新鲜96孔板。将该平板于冰上保温30分钟,然后于4℃以3500rpm离心10分钟以沉淀细胞碎片。离心过程中,将15μl新鲜制备的蛋白酶抑制剂混合物(Roche,1片溶于1.5ml水中)加至一新96孔板的每孔中。然后将来自离心的平板的上清转移至含有蛋白酶抑制剂的平板中。将该板于4℃以3500rpm离心10分钟并将上清转移至另一96-孔板中。这一步骤至少再重复1次或者直至离心后没有任何细胞碎片的痕迹。最后,用箔纸盖住平板以防止BIAcore过程中样品蒸发。
高密度HIS-BLvS表面的产生
所有BIAcore分析均在BIAcore 2000仪器上使用BIAcore 2000控制软件进行,并用BIAevaluation 3.0软件评价。通过胺偶联至CM5芯片而在流动池2中制备高密度His标记的BLyS表面(偶联有>1000RU HIS-BLyS)。将一新的CM5芯片插入BIAcore中,用HBS缓冲液以5μl/min流速在流动池2中开始sensorgram。NHS和EDC溶液以1∶1混合,之后取30μl注射在CM5表面上。注射50μl HIS-BLyS(10μg/ml于乙酸钠缓冲液中,pH4)并使之偶联于该表面。随后注射30μl of乙醇胺-HCl溶液以封闭游离的NHS酯。在使用芯片之前,将10μl 4M盐酸胍于HBS中注射在表面上以去除表面上非共价结合的BLyS。在流动池1上也制备一空白表面(无HIS-BLyS)从而可以从HIS-BLyS结合曲线中减去非特异性结合作用。
典型地,以此方式产生5000 RU的His标记的BLyS表面并用于分离自大肠杆菌周质的scFv的96孔分析。
BIAcore分析
将含有周质scFv的96-孔板固定在BIAcore内。2ml 4M盐酸胍于HBS中排列在BIAcore内以用于在样品之间再生HIS-BLyS表面。以20μl/分钟的流速在流动池1和2上进行sensorgram,运行下述方法:
MAIN
FLOWCELL 1,2,3,4
LOOP cycle STEP
APROG inj%pos
ENDLOOP
APPEND CONTINUE
END
DEFINE LOOP cycle
LPARAM%pos
r1a1
r1b1
r1c1
r1d1
r1e1
r1f1 etc(all wells listed until rlh12)
END
DEFINE APROG inj
PARAM%pos
FLOW 20
KINJECT%pos 35 30!scfv injection
QUICKINJECT r2f3 10!regeneration
EXTRACLEAN
END
运行完毕后,针对每一样品,用BIAevaluation软件从流动池2的数据中减去流动池1的sensorgram数据。原则上根据随着scFv从表面上解离而发生的整体RU变化比较各个克隆。另外,鉴别了少数具有潜在较慢的解离速率的scFv。图14示出了8个scFv的典型sensorgram的解离部分的例子。一种不识别BLyS的抗TNFα抗体用作对照。在所例举的8个scFv中,鉴别出I079F06用于进一步研究,因为其具有相对较高的结合至表面的RU数。
原则上,如果scFv具有超过1200的RU变化则鉴别出它们,也鉴别了少量具有比典型解离速率潜在较慢的解离速率的scFv。基于这些标准选择了总共28个克隆,并列于表7。
表7:由BIAcore鉴别的具有最显著RU变化的28个针对膜结合BLyS的抗体
| 抗体 | 抗体 |
| I079C01 | I084C04 |
| I082H08 | I080E05 |
| I079E02 | I083B12 |
| I079B05 | I082G01 |
| I079F06 | I082G02 |
| I079F08 | I082C03 |
| I079F11 | I082A05 |
| I079B12 | I082D07 |
| I080B01 | I082B08 |
| I080G09 | I084A01 |
| I099D03 | I084B02 |
| I080D03 | I080A08 |
| I080A03 | I084C11 |
| I083G03 | |
| I080G07 |
实施例18:scFv亲和性测定
用BIAcore测定所述28个scFv的亲和性(KD)。
用于动力学研究的低密度HIS-BLyS表面
使用500RU表面来进行纯化的scFv与HIS-BLyS结合的动力学研究。制备这些表面的方法与实施例17所述相同,只是注入较少体积的HIS-BLyS。
ScFv结合动力学的测定
将含有低密度HIS-BLyS表面的芯片插入BIAcore中。在HBS中进行这28种纯化的scFv(如实施例6所述制备)中的每一种的系列稀释(典型地从50μg/ml scFv开始并双倍稀释至1.5μg/ml)。随后将系列稀释液用如下程序依次注射在空白对照(流动池1)和低密度HIS-BLyS表面(流动池2)上:
MAIN
FLOWCELL 1,2,3,4
APROG genab r1d1 ab1
APROG genab r1d2 ab2
APROG genab r1d3 ab3
APROG genab r1d4 ab4
APROG genab r1d5 ab5
APROG genab r1d6 ab6
APPEND CONTINUE
END
DEFINE APROG genab
PARAM%Abpos%AbId
FLOW 20
KINJECT%Abpos 200 80
INJECT r2f3 10
EXTRACLEAN
END
通过将10μl 4M盐酸胍于HBS中(上述程序中的位置r2f3)在样品之间注于在表面上而除去结合的scFv。用BIAevaluation软件分析各个scFv的结合曲线以确定抗体的结合速率(on-rate)和解离速率。
图15示出所产生的scFv抗体I082C03的结合曲线的典型例子。这一克隆的解离速率计算为2×10-3s-3。假设scFv活性为100%,I082C03的亲和性计算为20nM。表8给出了。
表8:作为scFv具有最高亲和性的5个抗膜结合BLyS抗体的鉴别
| 抗体 | 亲和性(KD) |
| I079F11 | 5nM |
| I079E02 | 10nM |
| I082G02 | 6nM |
| I082H08 | 1nM |
| I099D03 | 4nM |
实施例19:小鼠膜结合BLyS的识别
用竞争ELISA测定表8所列5个scFv识别鼠膜结合BLyS的能力。这一分析评价在存在不同形式竞争性人BLyS时所测噬菌体scFv结合鼠细胞系P388质膜上的膜结合形式BLyS的能力。竞争BLyS以His标记形式BLyS或可溶形式BLyS存在。识别小鼠膜结合BLyS的scFv在P388质膜上应给出如下的ELISA信号,即该信号可通过与His标记的BLyS预保温而被竞争掉,但与可溶BLyS预保温不会被竞争掉。
P388.D1细胞的维持和质膜的制备
P388.D1细胞是一种小鼠单核细胞-巨噬细胞样细胞系。它们在补加2mM L-谷氨酰胺、10%CS、10U青霉素、100g/ml链霉素的L-15培养基中培养(所有试剂均来自Sigma)。每3-4天将细胞以1∶4分离以保持细胞密度为2-8×105/ml。每6周从液氮中融解新鲜的细胞等份。质膜部分的制备如实施例2所述。
竞争ELISA
将P388质膜(50μl/孔)以10μg/ml于PBS中包被到Falcon 96-孔板上,4℃包被过夜。该方法基本上如实施例16所述。
图16示出了3个克隆I079E02,I082H08和I099D03的结果。所有3个scFv均识别P388质膜。这一结合在存在His标记的BLyS(HIS-BLyS)时被竞争,但在存在生物素化BLyS(bio-BLyS)时不被竞争。这证实这些scFv也识别膜结合形式的小鼠BLyS,但不识别可溶形式的小鼠BLyS。
实施例20:将scFv转成IgG1形式
将我们希望转成IgG分子的scFv的VH结构域和VL结构域克隆进含有编码合适的重链(人IgG1)或轻链(人kappa或人lambda)恒定区的核苷酸序列的载体中,以便当将这些载体转染进合适的宿主细胞中时可以从这些载体表达完整的重链或轻链分子。另外,当克隆的重链和轻链在一个细胞系中(从一个载体或两个载体)同时表达时,它们可组装成完整的有功能的抗体分子,分泌进细胞培养物培养基。将scFv转成常规抗体分子是本领域熟知的技术。
产生表达抗BLyS抗体(IgG1)的NS0细胞系
用Pvu I限制酶分别线性化含有重链和轻链的质粒,用酚-氯仿提取、乙醇沉淀而纯化线性化的DNA并重悬于水中。来自一培养物的NS0细胞(107)在PBS中用12.5μg线性化重链质粒DNA和37.5μg线性化轻链DNA电穿孔(0.25kV和975μF)。细胞在20ml非选择性培养基(10%FCS于补加6mM谷氨酰胺、氨基酸和青霉素/链霉素的DMEM中)洗涤,然后在12.5ml培养基中转移至一T75cm2培养瓶中,并在37□C,5%
/空气中保温过夜。转染第二天,将细胞重悬于含有1mg/ml遗传霉素的选择性培养基中并以200μl/孔分配进5个96-孔板中。在37□C(5%
/空气)培养18天后,用检测组装的人IgG的ELISA筛选集落上清,以鉴别表达IgG的菌落。扩增约20个阳性集落并在无血清的选择性培养基上适应生长。建立双份T25cm2培养瓶。来自一个培养瓶的细胞被冷冻作为原种,来自第二个培养瓶的细胞生长至饱和。饱和培养物的产率用ELISA评价。然后选择具有最高产量的细胞系用于大规模抗体生产。
上述程序用I006D08抗BLyS抗体构建体举例示出。电穿孔和选择NS0细胞后,来自93孔(各含有一个单集落)的上清经ELISA筛选以检测组装的IgG1抗体。鉴别出有27个上清含有IgG。将来自24个阳性孔的集落转移至在一24孔板的1ml选择性培养基中并培养2天。然后将该1ml细胞培养物加至在一T25cm2培养瓶中的含有降低量的血清(0.5%FCS)的4ml选择性培养基中。当培养物达到汇合时,在一T25cm2培养瓶中将1ml细胞用4ml选择性无血清培养基稀释。在汇合时,再次重复这一传代培养方案。最后来自含有0.1%FCS的培养物的1ml细胞用9ml无血清选择性培养基稀释并分进2个T25cm2培养瓶中以形成饱和培养物和原种培养物。当培养物汇合时在液氮中冷冻并储存原种培养物。饱和培养物持续培养直至培养物存活率<10%。原始扩增的24个集落中有23个成功地在无血清培养基中适应。通过ELISA定量饱和的5ml无血清培养物,这些无血清适应的细胞系的产量为0.3-17μg/ml。I006D08-32细胞系产量为17μg/ml。
大规模生产IgG
将最高产量的细胞系从冷冻的原种中复原,然后在2升滚瓶中在选择性无血清培养基中扩展为400ml。将细胞在37□C生长,并在4rpm滚动,顶部空间每2-3天用5%CO2/空气再平衡。最后通过加入不具选择性的无血清培养基(400ml/2L滚瓶),将培养物扩展为4升体积。然后将培养物生长至饱和。
这个程序通过从I006D08-32细胞系中生产I006D08抗体举例示出。将冷冻的原种复原为T25cm2,含有具有1mg/ml遗传霉素的5ml无血清培养基,并在37□C在5%
/空气温育器中生长。在生长两天后,将培养物用7.5ml新鲜培养基稀释,并移至一个T75cm2烧瓶中。在温育器中另外生长3天后,将细胞移至130ml选择性培养基中,并移至一个2升滚瓶中。在生长3天后,将细胞用500ml选择性培养基稀释,并分液入2×2升滚瓶中。2天后,在每个滚瓶中加入100ml新鲜的选择性培养基。最后,在第二天,将培养物用无选择性培养基扩展为总体积4升,并分液入10×2升滚瓶中。3天后,将培养基补加6mM谷氨酰胺。将细胞生长17天,从最后次培养为4升体积。将细胞生长为3×106个细胞/ml,之后存活力降为<0.2×106个细胞/ml。在此低存活力,收集培养上清。ELISA分析表明所述培养上清含有33μg/ml IgG。因此4升培养物含有132mg IgG。
IgG纯化
使用通常用于生产抗体的常规技术组合,从发酵肉汤中纯化IgG。典型地,将培养收集物澄清以除去细胞和细胞碎片,之后开始纯化方案。这通常可以使用离心或过滤收集物而达到。在澄清后,将抗体在蛋白A琼脂糖上使用亲和层析捕获和明显纯化。将所述抗体在碱性pH下结合蛋白A琼脂糖,及随后冲洗基质后,通过降低pH而洗脱。然后通过凝胶过滤达到进一步纯化。以及为了从抗体中除去具有不同分子量的成分,这个步骤也可以用于将缓冲液转变为所需的最终配制缓冲液
纯化I006D08 IgG1
将收集物通过0.5um和0.22um滤膜相继过滤澄清。然后将澄清的收集物用于在pH8平衡的重组蛋白A琼脂糖层析柱中,并用所述平衡缓冲液冲洗。通过应用pH3.5的缓冲液从蛋白A琼脂糖中洗脱I006D08抗体。然后将收集的含有洗脱物的抗体通过加入pH8的缓冲液中和为pH7.4。将中和的洗脱物通过使用30Kda滤膜超滤浓缩然后将浓缩的物质通过Sephacryl S300HR凝胶过滤纯化,使用磷酸盐缓冲盐水作为活动相。然后将来自凝胶过滤层析柱的最终的单体IgG1级分,通过使用30Kda滤膜超滤浓缩为所需配制浓度。将最终产物通过0.22um滤膜过滤。
实施例21:通过掺入3HdT测定的小鼠脾细胞增殖的抗体中和
为确定抗体是否已知BLyS介导的B细胞增殖,进行脾细胞增殖分析。简而言之,通过用一个25号针头和10ml完全培养基(具有含有100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素,4mM谷氨酰胺,5×10-5Mβ-巯基乙醇的10%FBS的RPMI1640)冲洗脾而分离小鼠脾细胞。将细胞经过100微米尼龙滤膜除去细胞块。然后将细胞悬浮液在400×g在室温ficolled 25分钟(一个15ml锥形管/脾3ml ficol,10ml细胞悬浮液/脾;得自Sigma的Ficol 1083)。将回收的细胞在完全培养基中冲洗3次并计数。然后将回收的细胞在含有3×浓度SAC的完全培养基中稀释为3×106/ml浓度(3X=1∶33,333原种稀释度)(Staph.aureus Cowan strain;Calbiochem)。
针对每种抗体,将50ul的浓度为30μg/ml,3.0μg/ml,和0.3μg/ml的抗体稀释液,一式三份等份加入孔平板的各个孔中。还使用适当的阳性对照,例如单克隆抗体15C10。将不含有抗体的培养基(及需要时,人同种型对照(商购的))用作阴性对照。
将BLyS蛋白在完全培养基中稀释至浓度为300ng/ml,90ng/ml和30ng/ml。然后将50ul每种BLyS稀释液加入平板中所述抗体稀释液中。然后将含有所述抗体和BLyS稀释液的平板在37℃,5% 中温育30分钟,之后,在所有的孔中加入含有SAC的脾细胞悬浮液。然后将所述平板温育72小时(37℃,5%
)。
在72小时后,将每个孔补加50μl含有0.5μCi的3H-胸苷(6.7Ci/mM;Amersham)的完全培养基,并将细胞另外温育20-24小时(37℃,5%
)。温育后,使用Tomtec细胞收集器收集细胞,并使用TopCount闪烁计数器(Packard)计数滤物。
实施例22:人B细胞增殖分析以在体外筛选BLyS拮抗剂分子
在96孔一式三份进行确定推定的BLyS拮抗剂的作用的生物分析,所述孔中混合了等体积的BLyS,应答细胞,和推定的拮抗剂,每种试剂均制备为3X原液试剂。
B淋巴细胞是通过MACS(抗CD3损耗)纯化自人扁桃体,冲洗,并再悬浮于完全培养基(CM)中(RPMI 1640具有10%FBS含有100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素,4mM谷氨酰胺,5×10E-5Mβ-巯基乙醇),浓度为3×106细胞/mL。将Staphylococcus aureus,CowanI(SAC,CalBiochem)加入细胞中,浓度为3X(3X=1∶33,333原种稀释液)。
其间,在CM中制备潜在拮抗剂的8个系列稀释液(3倍),这样所述稀释的拮抗剂是3×分析测试终浓度。将抗体在10ug/mL终浓度开始常规测试,至大约1.5ng/mL。
在CM中制备3×浓缩的人rBLyS(3X=300ng/mL,30ng/mL,和3ng/mL)。在个别的BLyS浓度常规测试潜在的抑制剂,以避免归因于未期望的低亲和性或拮抗剂浓度的错误否定。
将50ul稀释的拮抗剂和50ul稀释的BLyS加入推定的拮抗剂系列稀释液中。
然后将细胞在充分增湿的腔中温育72小时(37℃,5%
)。72小时后,将细胞补加0.5μCi/孔3H-胸苷(6.7 Ci/mmol),并另外温育24小时。将平板使用Tomtec细胞收集仪收集,并在TopCount闪烁计数仪(Packard)中计数滤物。
本申请说明书中所引用的每篇文献(包括专利,专利申请说明书,杂志文章,摘要,实验指导,书籍或其它揭示),均以全文并入参考。另外,美国临时专利申请No.60/212,210(2000年6月16日申请),No.60/240,816(2000年10月17日申请),No.60/276,248(2001年3月16日申请),No.60/277,379(2001年3月21日申请),No.60/293,499(2001年5月25日申请)均以全文并入参考。
表1:与BLyS免疫特异性结合的scFv
克隆ID scFv VL的 VL VL VL VH的 VH VH VH CDR3 VH CDR3序列(SEQ ID NO)
SEQ ID AA CDR1的 CDR2的 CDR3的 AA CDR1 CDR2 的AA
NO AA AA AA 的AA 的AA
I003F12S 1 138-248 160-173 189-195 228-237 1-122 26-35 50-66 99-111 HDDDVLTGYYFES(SEQ ID NO:2130)
I006D08 2 139-249 163-173 189-195 228-238 1-123 26-35 50-66 99-112 SRDLLLFPHYGMDV(SEQ ID NO:2133)
I008A11 3 144-254 166-179 195-201 234-243 1-128 26-37 52-69 102-117 DRYDILTGYYYYGMDV(SEQ ID NO:2129)
I017D10 4 148-255 169-179 195-201 234-244 1-132 26-35 50-66 99-121 VQMDSEYYDLLTGINVGPYYFDY(SEQ ID NO:2132)
I022D01 5 142-249 163-173 189-195 228-238 1-126 26-35 50-66 99-115 DGYYDILTGYSYYGMDV(SEQ ID NO:2135)
I031F02 6 137-251 160-173 189-195 228-240 1-121 26-35 50-66 99-110 GYDSSAFRAFDI(SEQ ID NO:2136)
I050A12 7 140-250 164-174 190-196 229-239 1-124 26-35 50-66 99-113 APYDLLTHYFHYFDY(SEQ ID NO:2134)
I051C04 8 145-256 168-181 197-203 236-245 1-129 26-35 50-66 99-118 AATTSQKHNKYAYYFYGMDV(SEQ ID NO:2131)
I050B11 9 141-251 166-177 193-199 232-240 1-125 26-35 50-66 99-114 PFYDTLTSYVFQYFDH(SEQ ID NO:2137)
I050B11-01 10 141-251 166-177 193-199 232-240 1-125 26-35 50-66 99-114 PFYDTLTSYVFQVWVA(SEQ ID NO:2143)
I050B11-02 11 141-251 166-177 193-199 232-240 1-125 26-35 50-66 99-114 PFYDTLTSYVFQVWVA(SEQ ID NO:2143)
I050B11-03 12 141-251 166-177 193-199 232-240 1-125 26-35 50-66 99-114 PFYDTLTRYVFQYFDH(SEQ ID NO:2144)
I050B11-04 13 141-251 166-177 193-199 232-240 1-125 26-35 50-66 99-114 PFYDTLTGYVFQYFDH(SEQ ID NO:2141)
I050B11-05 14 141-251 166-177 193-199 232-240 1-125 26-35 50-66 99-114 PFYDTLTRYVFQVWVA(SEQ ID NO:2142)
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I077G06 1878 141-251 163-176 192-198 231-240 1-125 26-35 50-66 99-114 MEYDILTGYYGGYFDY(SEQ ID NO:2179)
I077H02 1879 141-248 164-174 190-196 229-237 1-125 26-35 50-66 99-114 MEYDILTGYYGGYFDY(SEQ ID NO:2179)
I078B05 1880 143-253 165-178 194-200 233-242 1-127 26-35 50-66 99-116 ESHYDILTGYYSNPSFDI(SEQ ID NO:2994)
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Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu Pro Asn165 170 175Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly Asp Glu180 185 190Leu Gln Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu Asp Gly195 200 205Asp Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu210 215<210> 3238<211> 8<212> PRT<213> 人工序列<220><221> site<222> (1)..(8)<223> Flag Tag<400> 3238Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1 5<210> 3239<211> 250<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 3239Met Pro Ala Ser Ser Pro Phe Leu Leu Ala Pro Lys Gly Pro Pro Gly1 5 10 15Asn Met Gly Gly Pro Val Arg Glu Pro Ala Leu Ser Val Ala Leu Trp20 25 30Leu Ser Trp Gly Ala Ala Leu Gly Ala Val Ala Cys Ala Met Ala Leu35 40 45Leu Thr Gln Gln Thr Glu Leu Gln Ser Leu Arg Arg Glu Val Ser Arg50 55 60Leu Gln Gly Thr Gly Gly Pro Ser Gln Asn Gly Glu Gly Tyr Pro Trp65 70 75 80Gln Ser Leu Pro Glu Gln Ser Ser Asp Ala Leu Glu Ala Trp Glu Asn85 90 95Gly Glu Arg Ser Arg Lys Arg Arg Ala Val Leu Thr Gln Lys Gln Lys100 105 110Lys Gln His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys115 120 125Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg130 135 140Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala145 150 155 160Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe165 170 175Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr180 185 190Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr195 200 205Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile210 215 220Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro225 230 235 240His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu245 250PCT/RO/134表关于微生物保藏的说明(PCT细则13之二) PCT/RO/134表(2001年1月)ATCC保藏号97768加拿大申请人请求专利局长仅当基于一项申请的加拿大专利被授权时或者该申请被驳回或放弃或不再恢复或被撤回时,才授权将该申请中提及的保藏的生物材料的样品提供给由局长指明的独立专家,申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局。挪威申请人在此请求仅当申请被公开(由挪威专利局)或最终由挪威专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据挪威专利法第22款和33(3)款公开时递交到挪威专利局。如果申请人递交了这种请求,第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是挪威专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。澳大利亚申请人在此指出微生物样品仅在专利授权前或在专利申请被放弃、拒绝或撤回前提供给在本发明中没有利益的熟练技术人员(澳大利亚专利法3.25(3)款)。芬兰申请人在此请求仅当申请被公开(由国家专利局)或最终由国家专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。联合王国申请人在此请求仅向专家提供微生物样品。申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局有关此项请求。ATCC保藏号97768丹麦申请人在此请求仅当申请被公开(由丹麦专利局)或最终由丹麦专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据丹麦专利法第22款和33(3)款公开时递交到丹麦专利局。如果申请人递交了这种请求,第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是丹麦专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。瑞典申请人在此请求仅当申请被公开(由瑞典专利局)或最终由瑞典专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。此项请求应在优先权日起16个月内递交到国际局(最好用PCT申请人指南卷I附件Z中的表格PCT/RO/134)。如果申请人递交了这种请求,第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是瑞典专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。荷兰申请人请求仅当荷兰专利被授权时或者该申请被拒绝或撤回或失效时,才能根据专利法31F(1)款将样品提供给专家。此项请求必须由申请人在根据荷兰王国专利法第22C款或25款公开前递交到荷兰工业产权局,以两者中较早日为准。关于微生物保藏的说明(PCT细则13之二) PCT/RO/134表(2001年1月)ATCC保藏号203518加拿大申请人请求专利局长仅当基于一项申请的加拿大专利被授权时或者该申请被驳回或放弃或不再恢复或被撤回时,才授权将该申请中提及的保藏的生物材料的样品提供给由局长指明的独立专家,申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局。挪威申请人在此请求仅当申请被公开(由挪威专利局)或最终由挪威专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据挪威专利法第22款和33(3)款公开时递交到挪威专利局。如果申请人递交了这种请求,第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是挪威专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。澳大利亚申请人在此指出微生物样品仅在专利授权前或在专利申请被放弃、拒绝或撤回前提供给在本发明中没有利益的熟练技术人员(澳大利亚专利法3.25(3)款)。芬兰申请人在此请求仅当申请被公开(由国家专利局)或最终由国家专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。联合王国申请人在此请求仅向专家提供微生物样品。申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局有关此项请求。ATCC保藏号203518丹麦申请人在此请求仅当申请被公开(由丹麦专利局)或最终由丹麦专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据丹麦专利法第22款和33(3)款公开时递交到丹麦专利局。如果申请人递交了这种请求,第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是丹麦专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。瑞典申请人在此请求仅当申请被公开(由瑞典专利局)或最终由瑞典专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。此项请求应在优先权日起16个月内递交到国际局(最好用PCT申请人指南卷I附件Z中的表格PCT/RO/134)。如果申请人递交了这种请求,第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是瑞典专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。荷兰申请人请求仅当荷兰专利被授权时或者该申请被拒绝或撤回或失效时,才能根据专利法31F(1)款将样品提供给专家。此项请求必须由申请人在根据荷兰王国专利法第22C款或25款公开前递交到荷兰工业产权局,以两者中较早日为准。关于微生物保藏的说明(PCT细则13之二) PCT/RO/134表(2001年1月)ATCC保藏号PTA-3238加拿大申请人请求专利局长仅当基于一项申请的加拿大专利被授权时或者该申请被驳回或放弃或不再恢复或被撤回时,才授权将该申请中提及的保藏的生物材料的样品提供给由局长指明的独立专家,申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局。挪威申请人在此请求仅当申请被公开(由挪威专利局)或最终由挪威专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据挪威专利法第22款和33(3)款公开时递交到挪威专利局。如果申请人递交了这种请求,第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是挪威专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。澳大利亚申请人在此指出微生物样品仅在专利授权前或在专利申请被放弃、拒绝或撤回前提供给在本发明中没有利益的熟练技术人员(澳大利亚专利法3.25(3)款)。芬兰申请人在此请求仅当申请被公开(由国家专利局)或最终由国家专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。联合王国申请人在此请求仅向专家提供微生物样品。申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局有关此项请求。ATCC保藏号PTA-3238丹麦申请人在此请求仅当申请被公开(由丹麦专利局)或最终由丹麦专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据丹麦专利法第22款和33(3)款公开时递交到丹麦专利局。如果申请人递交了这种请求,第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是丹麦专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。瑞典申请人在此请求仅当申请被公开(由瑞典专利局)或最终由瑞典专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。此项请求应在优先权日起16个月内递交到国际局(最好用PCT申请人指南卷I附件Z中的表格PCT/RO/134)。如果申请人递交了这种请求,第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是瑞典专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。荷兰申请人请求仅当荷兰专利被授权时或者该申请被拒绝或撤回或失效时,才能根据专利法31F(1)款将样品提供给专家。此项请求必须由申请人在根据荷兰王国专利法第22C款或25款公开前递交到荷兰工业产权局,以两者中较早日为准。关于微生物保藏的说明(PCT细则13之二) PCT/RO/134表(2001年1月)ATCC保藏号PTA-3239加拿大申请人请求专利局长仅当基于一项申请的加拿大专利被授权时或者该申请被驳回或放弃或不再恢复或被撤回时,才授权将该申请中提及的保藏的生物材料的样品提供给由局长指明的独立专家,申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局。挪威申请人在此请求仅当申请被公开(由挪威专利局)或最终由挪威专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据挪威专利法第22款和33(3)款公开时递交到挪威专利局。如果申请人递交了这种请求,第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是挪威专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。澳大利亚申请人在此指出微生物样品仅在专利授权前或在专利申请被放弃、拒绝或撤回前提供给在本发明中没有利益的熟练技术人员(澳大利亚专利法3.25(3)款)。芬兰申请人在此请求仅当申请被公开(由国家专利局)或最终由国家专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。联合王国申请人在此请求仅向专家提供微生物样品。申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局有关此项请求。ATCC保藏号PTA-3239丹麦申请人在此请求仅当申请被公开(由丹麦专利局)或最终由丹麦专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据丹麦专利法第22款和33(3)款公开时递交到丹麦专利局。如果申请人递交了这种请求,第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是丹麦专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。瑞典申请人在此请求仅当申请被公开(由瑞典专利局)或最终由瑞典专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。此项请求应在优先权日起16个月内递交到国际局(最好用PCT申请人指南卷I附件Z中的表格PCT/RO/134)。如果申请人递交了这种请求,第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是瑞典专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。荷兰申请人请求仅当荷兰专利被授权时或者该申请被拒绝或撤回或失效时,才能根据专利法31F(1)款将样品提供给专家。此项请求必须由申请人在根据荷兰王国专利法第22C款或25款公开前递交到荷兰工业产权局,以两者中较早日为准。关于微生物保藏的说明(PCT细则13之二) PCT/RO/134表(2001年1月)ATCC保藏号PTA-3240加拿大申请人请求专利局长仅当基于一项申请的加拿大专利被授权时或者该申请被驳回或放弃或不再恢复或被撤回时,才授权将该申请中提及的保藏的生物材料的样品提供给由局长指明的独立专家,申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局。挪威申请人在此请求仅当申请被公开(由挪威专利局)或最终由挪威专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据挪威专利法第22款和33(3)款公开时递交到挪威专利局。如果申请人递交了这种请求,第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是挪威专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。澳大利亚申请人在此指出微生物样品仅在专利授权前或在专利申请被放弃、拒绝或撤回前提供给在本发明中没有利益的熟练技术人员(澳大利亚专利法3.25(3)款)。芬兰申请人在此请求仅当申请被公开(由国家专利局)或最终由国家专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。联合王国申请人在此请求仅向专家提供微生物样品。申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局有关此项请求。ATCC保藏号PTA-3240丹麦申请人在此请求仅当申请被公开(由丹麦专利局)或最终由丹麦专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据丹麦专利法第22款和33(3)款公开时递交到丹麦专利局。如果申请人递交了这种请求,第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是丹麦专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。瑞典申请人在此请求仅当申请被公开(由瑞典专利局)或最终由瑞典专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。此项请求应在优先权日起16个月内递交到国际局(最好用PCT申请人指南卷I附件Z中的表格PCT/RO/134)。如果申请人递交了这种请求,第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是瑞典专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。荷兰申请人请求仅当荷兰专利被授权时或者该申请被拒绝或撤回或失效时,才能根据专利法31F(1)款将样品提供给专家。此项请求必须由申请人在根据荷兰王国专利法第22C款或25款公开前递交到荷兰工业产权局,以两者中较早日为准。关于微生物保藏的说明(PCT细则13之二) PCT/RO/134表(2001年1月)ATCC保藏号PTA-3241加拿大申请人请求专利局长仅当基于一项申请的加拿大专利被授权时或者该申请被驳回或放弃或不再恢复或被撤回时,才授权将该申请中提及的保藏的生物材料的样品提供给由局长指明的独立专家,申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局。挪威申请人在此请求仅当申请被公开(由挪威专利局)或最终由挪威专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据挪威专利法第22款和33(3)款公开时递交到挪威专利局。如果申请人递交了这种请求,第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是挪威专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。澳大利亚申请人在此指出微生物样品仅在专利授权前或在专利申请被放弃、拒绝或撤回前提供给在本发明中没有利益的熟练技术人员(澳大利亚专利法3.25(3)款)。芬兰申请人在此请求仅当申请被公开(由国家专利局)或最终由国家专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。联合王国申请人在此请求仅向专家提供微生物样品。申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局有关此项请求。ATCC保藏号PTA-3241丹麦申请人在此请求仅当申请被公开(由丹麦专利局)或最终由丹麦专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据丹麦专利法第22款和33(3)款公开时递交到丹麦专利局。如果申请人递交了这种请求,第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是丹麦专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。瑞典申请人在此请求仅当申请被公开(由瑞典专利局)或最终由瑞典专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。此项请求应在优先权日起16个月内递交到国际局(最好用PCT申请人指南卷I附件Z中的表格PCT/RO/134)。如果申请人递交了这种请求,第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是瑞典专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。荷兰申请人请求仅当荷兰专利被授权时或者该申请被拒绝或撤回或失效时,才能根据专利法31F(1)款将样品提供给专家。此项请求必须由申请人在根据荷兰王国专利法第22C款或25款公开前递交到荷兰工业产权局,以两者中较早日为准。关于微生物保藏的说明(PCT细则13之二) PCT/RO/134表(2001年1月)ATCC保藏号PTA-3242加拿大申请人请求专利局长仅当基于一项申请的加拿大专利被授权时或者该申请被驳回或放弃或不再恢复或被撤回时,才授权将该申请中提及的保藏的生物材料的样品提供给由局长指明的独立专家,申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局。挪威申请人在此请求仅当申请被公开(由挪威专利局)或最终由挪威专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据挪威专利法第22款和33(3)款公开时递交到挪威专利局。如果申请人递交了这种请求,第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是挪威专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。澳大利亚申请人在此指出微生物样品仅在专利授权前或在专利申请被放弃、拒绝或撤回前提供给在本发明中没有利益的熟练技术人员(澳大利亚专利法3.25(3)款)。芬兰申请人在此请求仅当申请被公开(由国家专利局)或最终由国家专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。联合王国申请人在此请求仅向专家提供微生物样品。申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局有关此项请求。ATCC保藏号PTA-3242丹麦申请人在此请求仅当申请被公开(由丹麦专利局)或最终由丹麦专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据丹麦专利法第22款和33(3)款公开时递交到丹麦专利局。如果申请人递交了这种请求,第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是丹麦专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。瑞典申请人在此请求仅当申请被公开(由瑞典专利局)或最终由瑞典专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。此项请求应在优先权日起16个月内递交到国际局(最好用PCT申请人指南卷I附件Z中的表格PCT/RO/134)。如果申请人递交了这种请求,第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是瑞典专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。荷兰申请人请求仅当荷兰专利被授权时或者该申请被拒绝或撤回或失效时,才能根据专利法31F(1)款将样品提供给专家。此项请求必须由申请人在根据荷兰王国专利法第22C款或25款公开前递交到荷兰工业产权局,以两者中较早日为准。关于微生物保藏的说明(PCT细则13之二)
PCT/RO/134表(2001年1月)ATCC保藏号PTA-3243加拿大申请人请求专利局长仅当基于一项申请的加拿大专利被授权时或者该申请被驳回或放弃或不再恢复或被撤回时,才授权将该申请中提及的保藏的生物材料的样品提供给由局长指明的独立专家,申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局。挪威申请人在此请求仅当申请被公开(由挪威专利局)或最终由挪威专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据挪威专利法第22款和33(3)款公开时递交到挪威专利局。如果申请人递交了这种请求,第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是挪威专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。澳大利亚申请人在此指出微生物样品仅在专利授权前或在专利申请被放弃、拒绝或撤回前提供给在本发明中没有利益的熟练技术人员(澳大利亚专利法3.25(3)款)。芬兰申请人在此请求仅当申请被公开(由国家专利局)或最终由国家专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。联合王国申请人在此请求仅向专家提供微生物样品。申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局有关此项请求。ATCC保藏号PTA-3243丹麦申请人在此请求仅当申请被公开(由丹麦专利局)或最终由丹麦专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据丹麦专利法第22款和33(3)款公开时递交到丹麦专利局。如果申请人递交了这种请求,第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是丹麦专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。瑞典申请人在此请求仅当申请被公开(由瑞典专利局)或最终由瑞典专利局决定不予公开时,才向本领域专家提供样品。此项请求应在优先权日起16个月内递交到国际局(最好用PCT申请人指南卷I附件Z中的表格PCT/RO/134)。如果申请人递交了这种请求,第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是瑞典专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。荷兰申请人请求仅当荷兰专利被授权时或者该申请被拒绝或撤回或失效时,才能根据专利法31F(1)款将样品提供给专家。此项请求必须由申请人在根据荷兰王国专利法第22C款或25款公开前递交到荷兰工业产权局,以两者中较早日为准。
| A.对说明书第152页,表2所述的微生物的说明。 | |
| B.保藏事项 其它保藏在补充页中□ | |
| 保藏单位名称美国典型培养物保藏中心 | |
| 保藏单位地址(包括邮政编码和国名)美国弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801号(20110-2209) | |
| 保藏日期2001年3月27日 | 保藏编号PTA-3243 |
| C.补充说明(必要时) 本栏有补充页□ | |
| D.本说明是为下列指定国作的(如果说明不是为所有指定国而作的) | |
| 欧洲对于欧洲专利指定,保藏微生物的样品仅在欧洲专利授权公告时或申请被驳回、撤回或视为撤回时才提供,这种样品仅提供给需要样品的人指明的专家(EPC第28条(4))。(其余见补充页) | |
| E.补充说明(必要时) | |
| 下列说明将随后向国际局提供(写出说明的类别,例如:“保藏的编号”) |
Claims (96)
1.一种免疫特异性结合BLyS的抗体,所述抗体包含一第一种氨基酸序列,该第一种氨基酸与选自以下一组的第二种氨基酸序列有至少95%相同性,所述的组为:
(a)一种氨基酸序列,其包含SEQ ID NO:1至2128所示的任一个scFv的VHCDR氨基酸序列;和
(b)一种氨基酸序列,其包含SEQ ID NO:1至2128所示的任一个scFv的VLCDR的氨基酸序列。
2.权利要求1的抗体,其中所述第二种氨基酸序列由SEQ IDNO:2129至3227所示的任一个scFv的VHCDR3的氨基酸序列组成。
3.权利要求1的抗体,其中所述第二种氨基酸序列由SEQ IDNO:1至2128所示的任一个scFv的一个VH结构域的氨基酸序列组成。
4.权利要求3的抗体,其中所述VH结构域由SEQ ID NO:1至1562所示的任一个scFv的VH结构域的氨基酸序列组成。
5.权利要求4的抗体,其中所述抗体免疫特异性地结合可溶形式和膜结合形式的BLyS。
6.权利要求4的抗体,其中所述VH结构域由SEQ ID NO:1至46和SEQ ID NO:321至329所示的任一个scFv的VH结构域的氨基酸序列组成。
7.权利要求6的抗体,其中所述VH结构域由SEQ ID NO:2,9,和327所示的任一个scFv的VH结构域的氨基酸序列组成。
8.权利要求4的抗体,其中所述VH结构域由SEQ ID NO:834至872所示的任一个scFv的VH结构域的氨基酸序列组成。
9.权利要求3的抗体,其中所述VH结构域由SEQ ID NO:1563至1880所示的任一个scFv的VH结构域的氨基酸序列组成。
10.权利要求9所述的抗体,其中所述抗体免疫特异性地结合可溶形式的BLyS。
11.权利要求9的抗体,其中所述VH结构域由SEQ ID NO:1563至1569所示的任一个scFv的VH结构域的氨基酸序列组成。
12.权利要求9的抗体,其中所述VH结构域由SEQ ID NO:1570至1595所示的任一个scFv的VH结构域的氨基酸序列组成。
13.权利要求3的抗体,其中所述VH结构域由SEQ ID NO:1881至2128所示的任一个scFv的VH结构域的氨基酸序列组成。
14.权利要求13的抗体,其中所述抗体免疫特异性地结合膜结合形式的BLyS。
15.权利要求13的抗体,其中所述VH结构域由SEQ ID NO:1881至1885所示的任一个scFv的VH结构域的氨基酸序列组成。
16.权利要求13的抗体,其中所述VH结构域由SEQ ID NO:1886至1908所示的任一个scFv的VH结构域的氨基酸序列组成。
17.权利要求1的抗体,其中所述第二种氨基酸序列由SEQ ID NO:1至2128所示的任一个scFv的一VL结构域的氨基酸序列组成。
18.权利要求17的抗体,其中所述VL结构域由SEQ ID NO:1至1562所示的任一个scFv的VL结构域的氨基酸序列组成。
19.权利要求18的抗体,其中所述抗体免疫特异性地结合可溶形式和膜结合形式的BLyS。
20.权利要求18的抗体,其中所述VL结构域由SEQ ID NO:1至46和SEQ ID NO:321至329所示的任一个scFv的VL结构域的氨基酸序列组成。
21.权利要求20的抗体,其中所述VL结构域由SEQ ID NO:2,9和327所示的任一个scFv的VH结构域的氨基酸序列组成。
22.权利要求18的抗体,其中所述VL结构域由SEQ ID NO:834至872所示的任一个scFv的VL结构域的氨基酸序列组成。
23.权利要求17的抗体,其中所述VL结构域由SEQ ID NO:1563至1880所示的任一个scFv的VL结构域的氨基酸序列组成。
24.权利要求23的抗体,所述抗体免疫特异性地结合可溶形式的BLyS。
25.权利要求23的抗体,其中所述VL结构域由SEQ ID NO:1563至1569所示的任一个scFv的VL结构域的氨基酸序列组成。
26.权利要求23的抗体,其中所述VL结构域由SEQ ID NO:1570至1595所示的任一个scFv的VL结构域的氨基酸序列组成。
27.权利要求17的抗体,其中所述VL结构域由SEQ ID NO:1881至2128所示的任一个scFv的VL结构域的氨基酸序列组成。
28.权利要求27的抗体,其中所述抗体免疫特异性地结合膜结合形式BLyS。
29.权利要求27的抗体,其中所述VL结构域由SEQ ID NO:1881至1885所示的任一个scFv的VL结构域的氨基酸序列组成。
30.权利要求27的抗体,其中所述VL结构域由SEQ ID NO:1886至1908所示的任一个scFv的VL结构域的氨基酸序列组成。
31.权利要求3的抗体,其还包含一种氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1至2128所示的任一个scFv的VL结构域的氨基酸序列有至少95%的相同性。
32.权利要求31的抗体,其中所述VH和VL结构域来相同的scFv。
33.权利要求32的抗体,其中所述svFv是SEQ ID NO:2的scFv。
34.权利要求32的抗体,其中所述svFv是SEQ ID NO:9的scFv。
35.权利要求32的抗体,其中所述svFv是SEQ ID NO:327的scFv。
36.权利要求1的抗体,其中所述第一种氨基酸序列与所述第二种氨基酸序列相同。
37.权利要求36的抗体,其中所述第二种氨基酸序列由SEQ IDNO:1至2128所示的任一个scFv的VH结构域的氨基酸序列组成。
38.权利要求36的抗体,其中所述第二种氨基酸序列由SEQ IDNO:1至2128所示的任一个scFv的VL结构域的氨基酸序列组成。
39.权利要求37的抗体,其还包含一种氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1至2128所示的任一个scFv的VL结构域的氨基酸序列100%相同。
40.权利要求39的抗体,其中所述scFv是SEQ ID NO:2的scFv。
41.权利要求39的抗体,其中所述scFv是SEQ ID NO:9的scFv。
42.权利要求39的抗体,其中所述scFv是SEQ ID NO:327的scFv。
43.权利要求1的抗体,其中所述BLyS是一种BLyS同源三聚体。
44.权利要求43的抗体,其中所述BLyS同源三聚体的各个蛋白质成分由成熟形式的BLyS组成。
45.权利要求1-44任一项的抗体,其中所述BLyS是一种BLyS异源三聚体。
46.权利要求45的抗体,其中所述BLyS异源三聚体包含至少一个BLyS多肽和至少一个APRIL多肽。
47.权利要求46的抗体,其中所述BLyS多肽由成熟形式的BLyS组成,所述APRIL多肽由成熟形式APRIL组成。
48.权利要求1-47任一项的抗体,其中所述抗体选自以下一组:
(a)一种完整的免疫球蛋白分子;
(b)一种scFv;
(c)一种单克隆抗体;
(d)一种人抗体;
(e)一种嵌合抗体;
(f)一种人源化抗体;
(g)一种Fab片段;
(h)一种Fab′片段;
(i)一种F(ab′)2;
(j)一种Fv;及
(k)一种二硫键连接的Fv。
49.权利要求3或37的抗体,其还包含选自以下一组的一种重链免疫球蛋白恒定区:
(a)一种人IgM恒定区;
(b)一种人IgG1恒定区;
(c)一种人IgG2恒定区;
(d)一种人IgG3恒定区;
(e)一种人IgG4恒定区;及
(f)一种人IgA恒定区。
50.权利要求17或38的抗体,其还包含选自以下一组的一种轻链免疫球蛋白恒定区:
(a)一种人Igκ恒定区;
(b)一种人Igλ恒定区。
51.权利要求1-50任一项的抗体,其中所述抗体具有选自以下一组的解离常数(KD):
(a)在10-7M和10-8M之间的解离常数(KD);
(b)在10-8M和10-9M之间的解离常数(KD);
(c)在10-9M和10-10M之间的解离常数(KD);
(d)在10-10M和10-11M之间的解离常数(KD);
(e)在10-11M和10-12M之间的解离常数(KD);及
(f)在10-12M和10-13M之间的解离常数(KD)。
52.权利要求1-51任一项的抗体,其中所述抗体缀合于一种可检测标记。
53.权利要求52的抗体,其中所述可检测标记是放射性标记。
54.权利要求53的抗体,其中所述放射性标记是125I,131I,111In,90Y,99Tc,177Lu,166Ho,或153Sm。
55.权利要求52的抗体,其中所述可检测标记是一种酶,一种荧光标记,一种发光标记或一种生物发光标记。
56.权利要求1-51任一项的抗体,其中所述抗体被生物素化。
57.权利要求1-51任一项的抗体,其中所述抗体缀合于一种治疗剂或胞毒剂。
58.权利要求57的抗体,其中所述治疗剂或胞毒剂选自以下一组:
(a)一种抗代谢物;
(b)一种烷化剂;
(c)一种抗生素;
(d)一种生长因子;
(e)一种细胞因子;
(f)一种抗血管发生因子;
(g)一种抗有丝分裂剂;
(h)一种anthracycline;毒素;及
(j)一种细胞程序死亡因子。
59.权利要求1-58任一项的抗体,其中所述抗体中和BLyS或其片段。
60.权利要求59的抗体,其使BLyS或其片段结合其受体的能力降低或消除。
61.权利要求60的抗体,其中所述受体是TACI。
62.权利要求60的抗体,其中所述受体是BCMA。
63.权利要求59的抗体,其使BLyS或其片段刺激B细胞增殖的能力降低或消除。
64.权利要求59的抗体,其使BLyS或其片段刺激B细胞分泌免疫球蛋白的能力降低或消。
65.权利要求1-58任一项的抗体,其增强BLyS或其片段的活性。
66.权利要求65的抗体,其提高BLyS或其片段结合其受体的能力。
67.权利要求66的抗体,其中所述受体是TACI。
68.权利要求66的抗体,其中所述受体是BCMA。
69.权利要求65的抗体,其使BLyS或其片段刺激B细胞增殖的能力提高。
70.权利要求65的抗体,其使BLyS或其片段刺激B细胞分泌免疫球蛋白的能力提高。
71.权利要求1-70任一项的抗体,其共价连接于一种异源多肽。
72.权利要求71的抗体,其中所述异源多肽是人血清白蛋白。
73.在一种药物学可接受载体中的权利要求1-72任一项的抗体。
74.一种包含权利要求1-73任一项的抗体的试剂盒。
75.一种分离的核酸分子,其编码权利要求1-74任一项的抗体。
76.一种包含权利要求75的分离的核酸分子的载体。
77.权利要求76的载体,其还包含一种核苷酸序列,所述核苷酸序列调节由所述核酸分子编码的抗体的表达。
78.一种包含权利要求77的核酸分子的宿主细胞。
79.一种工程细胞系,其表达权利要求1-78任一项的抗体。
80.一种与权利要求1-79所述任一种抗体结合相同表位的抗体。
81.一种竞争性抑制ATCC保藏号PTA-3239的细胞系产生的抗体的结合作用的抗体。
82.一种竞争性抑制ATCC保藏号PTA-3240的细胞系产生的抗体的结合作用的抗体。
83.一种竞争性抑制ATCC保藏号PTA-3243的细胞系产生的抗体的结合作用的抗体。
84.一种降低权利要求1-83任一项的抗体的结合作用的第二抗体,其降低所述结合作用有选自如下一组的百分率范围的增幅:
(a)从50%直至60%;
(b)从60%直至70%;
(c)从70%直至80%;
(d)从80%直至90%;及
(e)从90%直至100%。
85.一种免疫特异性地结合BLyS的抗体,所述抗体包含由一种核苷酸序列编码的VH结构域的氨基酸序列,所述核苷酸序列在严格杂交条件下与编码包含SEQ ID NO:1至2128任一氨基酸序列的scFv的一个VH结构域的核苷酸序列杂交。
86.一种免疫特异性地结合BLyS的抗体,所述抗体包含由一种核苷酸序列编码的VL结构域的氨基酸序列,所述核苷酸序列在严格杂交条件下与编码包含SEQ ID NO:1至2128任一氨基酸序列的scFv的一个VL结构域的核苷酸序列杂交。
87.一种检测BLyS蛋白异常表达的方法,包括:
(a)使用权利要求1-86任一项的一或多种抗体,分析个体的第一种生物学样品中BLyS的表达水平;及
(b)将在生物学样品中分析的BLyS水平与标准BLyS表达水平或第二种正常生物学样品中的BLyS表达水平相对比;
(c)其中第一种生物学样品中BLyS表达水平与第二种正常生物学样品中BLyS表达水平相比提高或降低,表示存在异常表达。
88.一种诊断与异常BLyS表达或活性相关的疾病或功能失调的方法,包括:
(a)给予个体有效量的权利要求52-58任一项的标记的抗体,所述抗体免疫特异性地结合BLyS;
(b)给药后等待一段时间,使权利要求52-58任一项的标记的抗体优先在个体中表达BLyS的部位浓缩;
(c)确定背景水平;及
(d)在所述个体中检测权利要求52-58任一项的标记的抗体,这样检测到标记的抗体在背景水平之上,表示所述个体患有与BLyS异常表达相关的一种特定疾病或功能失调。
89.一种治疗,预防或改善与BLyS异常表达或活性相关的疾病或功能失调的方法,包括为需要治疗的动物施用有效量的权利要求73的药物组合物,以治疗,预防或改善所述疾病或功能失调。
90.权利要求89的方法,其中所述疾病或功能失调是癌症。
91.权利要求89的方法,其中所述疾病或功能失调是免疫系统病变。
92.权利要求91的方法,其中所述疾免疫系统病或功能失调是自身免疫系统疾病或功能失调。
93.权利要求92的方法,其中所述免疫系统疾病或功能失调是选自以下的自身免疫系统疾病或功能失调:
(a)系统性红斑狼疮;及
(b)类风湿性关节炎。
94.权利要求91的方法,其中所述免疫系统疾病或功能失调是一种免疫缺陷。
95.权利要求92的方法,其中所述免疫系统疾病或功能失调是选自以下的一种免疫缺陷:
(a)普通可变免疫缺陷(CVID);及
(b)AIDS。
96.权利要求91的方法,其中所述免疫系统疾病或功能失调是癌症。
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