CN1368970A

CN1368970A - 作为酪氨酸激酶抑制剂的取代的1,4－二氢茚并[1,2－c]吡唑

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Publication number: CN1368970A
Application number: CN00808326A
Authority: CN
Inventors: K·J·多伊勒; P·拉菲蒂; R·W·斯特勒; A·图尔纳; D·J·维尔金斯; L·D·阿诺
Original assignee: Knoll Pharmaceutical Co
Current assignee: Knoll Pharmaceutical Co
Priority date: 1999-04-06
Filing date: 2000-03-28
Publication date: 2002-09-11
Also published as: ZA200107838B; JP2002541150A; NO20014864D0; EP1165544B1; TR200103789T2; WO2000059901A1; CZ20013580A3; PT1165544E; BR0009561A; KR20020015034A; DK1165544T3; CA2368686A1; HK1045500A1; HUP0201514A2; MXPA01010072A; EP1165544A1; BG106044A; IL145564A0; NO20014864L; DE60004340T2

Abstract

本发明涉及抑制蛋白激酶活性的式(I)化合物及其药学上可接受的盐,涉及含有这些吡唑类的药用组合物并涉及这些吡唑类的制备方法。

Description

作为酪氨酸激酶抑制剂的取代的1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑

相关申请

本申请书要求美国临时申请号：60/127963的权益，其全部内容均通过参考结合到本文中。

本发明涉及一些为蛋白激酶，尤其是酪氨酸激酶和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂的具有4，5(3，4)-双环稠合的3-芳基吡唑，其中一部分为新化合物，涉及含有这些吡唑类的药用组合物以及这些吡唑类的制备方法。

本发明的背景

至少有400种酶被鉴定为蛋白激酶。这些酶催化靶蛋白底物的磷酸化。这些磷酸化反应通常是将磷酸基团从ATP转移到蛋白质底物上的反应。磷酸基团所转移到的靶底物上的特殊结构是酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基。由于这些氨基酸残基是磷酰基转移的靶结构，因此这些蛋白激酶通常被称作酪氨酸激酶或丝氨酸/苏氨酸激酶。

酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基上的这些磷酸化反应，及其相反作用的磷酸酶反应涉及无数的细胞过程，此构成了对大量细胞内信号(通常由细胞受体介导)产生反应、调节细胞功能、以及细胞过程的激活或失活的基础。级联蛋白激酶通常参与细胞内信号转导并为实现这些细胞过程所必须。由于它们普遍存在于这些过程，可以发现蛋白激酶是质膜固有的一部分或者是胞质酶或者定位于细胞核，且通常作为酶复合体的组分。在许多情况下，这些蛋白激酶是决定细胞内的细胞过程在何时及何地发生的酶和结构性蛋白复合体的基本单元。酪氨酸蛋白激酶

酪氨酸蛋白激酶(PTKs)是催化细胞内蛋白中特定酪氨酸残基磷酸化反应的酶。这些底物蛋白，通常是酶自身的这种转移后修饰，充当着细胞增殖、激活或分化的分子开关(其综述参见，Schlessinger和Ulrich，1992，Neuron 9：383-391)。已经在多种疾病状态中发现PTK活性异常或过量，包括良性和恶性增殖性疾病以及由免疫系统异常激活导致的疾病(例如，自身免疫性疾病)、异体移植排斥反应和移植体抗宿主性疾病。此外，内皮细胞特异性受体PTKs如KDR和Tie-2介导血管生成过程，并因此参与支持癌的发展以及与异常血管化相关的其它疾病(例如，糖尿病性视网膜病、由年龄相关的黄斑变性导致的脉络膜新血管生成、牛皮癣、关节炎、新生儿血管瘤)的基础。

酪氨酸激酶可以是受体型(具细胞外、跨膜及细胞内结构域)或非受体型(全部在细胞内)。受体酪氨酸激酶(RTKs)

RTKs包括具有多种生物学活性的一个跨膜受体的大家族。目前，至少已经确认了十九(19)种不同的RTK亚家族。受体酪氨酸激酶(RTK)家族包括对于多种细胞类型的生长及分化极为重要的受体(Yarden和Ullrich，Ann.Rev.Biochem.57：433-478，1988；Ullrich和Schlessinger，Cell 61：243-254，1990)。RTKs的固有功能在结合配基时被激活，这导致受体和多重细胞内底物磷酸化，并随后导致多种细胞反应(Ullrich和Schlessinger，1990，CeH 61：203-212)。由此，受体酪氨酸激酶介导的信号转导的是在细胞外与特定生长因子(配基)相互作用下启动的，随后通常形成受体二聚体，激发酪氨酸蛋白激酶的固有活性以及受体的转移磷酸化。由此确立了细胞内信号转导分子的结合位点并且导致与许多细胞质信号分子形成复合体而促进适当的细胞反应(例如，细胞分裂、分化、代谢作用、细胞外微环境改变)(参见Schlessinger和Ullrich，1992，Neuron 9：1-20)。

具有SH2(src同源性-2)或磷酸酪氨酸结合(PTB)域的蛋白与激活的酪氨酸激酶受体及其对传入细胞的信号具有高度亲和力的底物结合。这两个域都识别磷酸酪氨酸(Fantl等，1992，Cell 69：413-423；Songyang等，1994，Mol.Cell.Biol.14：2777-2785；Songyang等，1993，Cell 72：767-778；Koch等，1991，Sience 252：668-678；Shoelson，Curr.Opin.Chem.Biol.(1997)，1(2)，227-234；和Cowburn，Curr.Opin.Struct.Biol.(1997)，7(6)，835-838)。已经鉴定出数种与受体酪氨酸激酶(RTKs)相关的细胞内底物蛋白。它们可以被分为两个主要组别：(1)具有催化域的底物；和(2)缺乏该区域但充当调节物并与催化活性分子相关的底物(Songyang等，1993，Cell 72：767-778)。受体或蛋白与其底物的SH2或PTB域之间相互作用的特异性由密切环绕磷酸化酪氨酸残基的氨基酸残基决定。例如，SH2域与特定受体上的磷酸酪氨酸残基周围的氨基酸序列的之间的结合亲和性差异与所观察到的它们的底物磷酸化特征的差异相关(Songyang等，1993，Cell 72：767-778)。观察表明各种受体酪氨酸激酶的功能不仅取决于它的表达形式和配基有效性，而且也取决于一系列的后续信号转导途径，后者由特殊受体以及这些刺激的时间及时程激活。因此，磷酸化提供了一个重要的调节步骤，这决定着特定生长因子受体对所采用的信号途径的选择性，以及因子受体的差异性。

已发现数种受体酪氨酸激酶，以及与之结合的生长因子，在血管发生中起作用，尽管某些可能是间接地促进血管生成(Mustonen和Alitalo，J.Cell Biol.129：895-898，1995)。这些受体酪氨酸激酶之一，名为“胎肝激酶1”(FLK-1)，属于RTKsIII型亚类的成员。人FLK-1的另一个名称是“含激酶插入域的受体(kinase insert domain-containing receptor)”(KDR)(Terman等，Onccogene 6：1677-83，1991)。FLK-1/KDR的又一个名称是“血管内皮细胞生长因子受体2”(VEGFR-2)因为它以高度的亲和力与VEGF结合。小鼠FLK-1/VEGFR-2变型(version)还被称作NYK(Oelrichs等，Oncogene 8(1)：11-15，1993)。已经分离出编码小鼠、大鼠及人FLK-1的DNAs，并且其核苷酸及其编码的氨基酸序列也被报道(Matthews等，Proc.Natl.Sci.USA，88：9026-30，1991；Terman等，1991，同上；Terman等，Biochem.Biophys.Res.Comm.187：1579-86，1992；Sarzani等，同上；以及Millauer等，Cell 72：835-846，1993)。许多研究如Millauer等(同上)所报道的那些，提示VEGF与FLK-l/KDR/VEGFR-2是分别在血管内皮细胞增殖、以及血管形成和新生，即血管发生和血管生成中起重要作用的配基-受体对。

另一种称作“鳍状(fins-like)酪氨酸激酶-1”(Flt-1)的亚型IIIR TK与FLK-1/KDR相关(DeVries等，Science 255：989-991，1992；Shibuya等，Oncogene 5：519-524，1990)。Flt-1的另一个名称是“血管内皮细胞生长因子受体1”(VEGFR-1)。迄今为止，已经发现FLK-1/KDR/VEGFR-2和Flt-1/VEGFR-1亚家族成员主要在内皮细胞上表达。这些亚型成员由血管内皮细胞生长因子(VEGF)家族的配基成员特异性激发(Klagsburn和D’Amore，Cytokine & Growth Factor Reviews7：259-270，1996)。内皮细胞生长因子(VEGF)与Flt-1接合的亲和力高于与FLK-1/KDR接合的亲和力，并且促进血管内皮细胞的有丝分裂(Terman等，1992，同上；Mustonen等，同上；DeVries等，同上)。据信在血管生成过程中Flt-1为内皮组织所必需.Flt-1表达与小鼠胚胎中的早期血管生成、以及伤口愈合期的新血管生成有关(Mustonen和Alitalo，同上)。成人器官如肾小球中的Flt-1的表达提示该受体具有与细胞生长无关的其他功能(Mustonen和Alitalo，同上)。

如前文所述，新近的证据提示VEGF同时在刺激正常与病理的血管发生中均起作用(Jakeman等，Endocrinology 133：848-859，1993；Kolch等，Breast Cancer Research and Treatment 36：139-155；1995；Ferrara等，Endocrine Reviews 18(1)；4-25，1997；Ferrara等，血管生成调节(Regulation of Angiogenesis)(L.D.Goldberg和E.M.Rosen主编)，209-232，1997)。此外，VEGF还与控制和促进血管通透性有关(Connolly等，J.Biol.Chem.264：20017-20024，1989；Brown等，Regulation of Angiogenesis(血管生成调节)(L.D.Goldberg和E.M.Rosen主编)，233-269，1997)。

来源于不同剪接的mRNA的不同形式的VEGF已经被报道，包括Ferrara等描述的四种(J.Cell.Biochem.47：211-218，1991)。Ferrara等(同上)鉴定了分泌及优势细胞相关种类(predominantly cell-associated species)的两类VEGF，并且已知该蛋白以二硫键连接的二聚体形式存在。

几个相关的VEGF同系物新近被鉴定。然而，它们在正常生理和疾病过程的作用尚未阐明。此外，VEGF家族成员在许多组织内经常与VEGF共表达，并且通常能够与VEGF形成杂合二聚体。这种特性可能改变受体特异性以及杂合二聚体生物学作用并进一步使阐明其下文描述的特定功能复杂化(Korpelainen和Alitalo，Curr.Opin.Cell Biol.，159-164，1998以及该文引用的参考文献)。

胎盘生长因子(PlGF)的氨基酸序列显示出与VEGF序列的显著同源性(Park等，J.Biol.Chem.269：25646-54，1994；Maglione等，Oncogene8：925-31，1993)。与VEGF类似，不同类型的PlGF来源于不同剪接的mRNA，并且该蛋白以二聚体形式存在(Park等，同上)。PlGF-1和PlGF-2与Flt-1结合具有高度亲和力，并且PlGF-2还极易结合神经纤维网因子-1(neuropilin-1)(Migdal等，J.Biol.Chem.273(35)：22272-22278)，但两者均不结合FLK-1/KDR(Park等，同上)。据报道PlGF既促进血管通透性也促进低浓度存在的VEGF对内皮细胞的致分裂作用(推测是由杂合二聚体形成所引致)(Park等，同上)。

以两种同工型形式(167和185个残基)生成的VEGF-B似乎也结合Flt-1/VEGFR-1。它可能通过调节尿激酶类纤溶酶原激活因子及纤溶酶原激活因子抑制物-1的表达及活性而在调节细胞外基质降解、细胞粘附、和迁移中发挥作用(Pepper等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1998)，95(20)：11709-11714)。

主要由淋巴结内皮细胞表达的VEGF-C最初是作为VEGFR-3/Flt-4的配基被克隆。在其完整生成形式下，VEGF-C也可以结合KDR/VEGFR-2而且在体外刺激内皮细胞的增生和迁移并在活体模型中刺激血管生成(Lymboussaki等，Am.J.Pathol(1998)，153(2)：395-403；Witzenbichler，等，Am.J.Pathol(1998)，153(2)：381-394)。VEGF-C转基因过量表达仅导致淋巴管增生和膨大，而血管则不受影响。与VEGF不同，VEGF-C的表达不受低氧诱导(Ristimaki等，J.Biol.Chem.(1998)，273(14)，8413-8418)。

最新发现的VEGF-D在结构上与VEGF-C非常相似。据报道VEGF-D至少结合并激活两种VEGFRs，VEGFR-3/Flt-4和KDR/VEGFR-2。其最初作为c-fos可诱导的成纤维母细胞促分裂素被克隆并且主要在肺和皮肤间质细胞中表达(Achen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1998)，95(2)，548-553以及该文参考文献)。

据称在活体Miles分析中皮肤组织注射VEGF-C和VEGF-D时引起血管通透性增加(PCT/US97/14696；WO98/07832，Witznbichler等，同上)。这些配基在其表达的组织中在调节血管高通透性以及内皮细胞的反应中的生理学作用及重要性尚待阐明。

基于VEGF和VEGFRs的其它同系物以及配基与受体杂合二聚作用的新发现，这些VEGF同系物的作用可能涉及形成VEGF配基杂合二聚体和/或受体杂合二聚体化，或结合尚未发现的VEGFR(Witzenbichler等，同上)。新近报道还指出神经纤维网因子-1(Migdal等，同上)或VEGFR-3/Flt-4(Witzenbichler等，同上)，或非KDR/VEGFR-2的其它受体可能负责诱导血管通透性(Stacker，S.A.，Domagala，T.，Nice，E.，和Wilks，A.F.，“血管生成与肿瘤”学术会(“Angiogenesis and Cancer”Conference)，美国癌症研究学会(Amer.Assoc.Cancer Res.)，1998年1月，Orlando，FL；Williams，Diabetelogia40：S118-120(1997))。迄今为止，尚未发现KDR在VEGF介导的血管高通透性中的基础作用的直接证据。非受体酪氨酸激酶

非受体酪氨酸激酶代表缺乏胞外及跨膜序列的细胞酶的集合。目前，已经鉴定至少24种独特的非受体酪氨酸激酶，包括十一(11)个亚家族(Src，Frk，Btk，Csk，Abl，Zap70，Fes/Fps，Fak Jak，Ack和LIMK)。目前，非受体酪氨酸激酶的Src亚家族包括的PTKs数量最多并包括Scr，Yes，Fyn，Lyn，Lck，Blk，Hck，Fgr和Yrk。已发现Src亚家族的酶与肿瘤发生相关。Bolen，1993，Oncogene 8：2025-2031提供了对非受体酪氨酸激酶的更详细的讨论，其通过参考文献结合到本文中。

已经发现许多酪氨酸激酶，不论是RTK或非受体酪氨酸激酶，所涉及的细胞信号传导途径与多种病原性疾病相关，包括癌症、牛皮癣、以及其它高增殖性疾病或高免疫性疾病。调节PTKs的化合物的进展

由于总结认识到PTKs在控制、调节和调整细胞增殖、与非正常的细胞增殖相关的疾病和紊乱中的重要性，已经采用多种途径尝试鉴定出受体或非受体酪氨酸激酶“抑制剂”，包括采用突变型配基(美国专利No.4966849)、可溶性受体及抗体(专利申请号WO 94/10202；Kendall & Thomas，1994，Proc.Natl.Acad.Sci 90：10705-09；Kim等，1993，Nature 362：841-844)、RNA配基(Jellinek，等Biochemistry33：10450-56；Takano等1993，Mol.Bio.Cell 4：358A；Kinsella，等，1992，Exp.Cell Res.199：56-62；Wright，等，1992，J.Cellular Phys.152：448-57)以及酪氨酸激酶抑制剂(WO 94/03427；WO 92/21660；WO 91/15495；WO 94/14808；美国专利No.5330992；Mariani等，1994，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.35：2268)。

最近，进行了鉴定作为酪氨酸激酶抑制剂的小分子的尝试。例如，双单环、双环或杂环芳基化合物(PCT WO 92/20642)和亚乙烯基-氮杂吲哚衍生物(PCT WO 94/14808)已作为酪氨酸激酶抑制剂被普遍描述。苯乙烯基化合物(美国专利No.5217999)、苯乙烯基取代的吡啶基化合物(美国专利No.5302606)、某些喹唑啉衍生物(欧洲专利申请书No.0566266A1；Expert Opin.Ther.Pat.(1998)，8(4)：475-478)、硒代吲哚类和硒化物(PCT WO 94/03427)、三环多羟基化合物(PCT WO92/21660)以及苄基膦酸化合物(PCT WO 91/15495)已作为用作酪氨酸激酶抑制剂而用于治疗癌症的化合物被公开。苯胺基邻二氮杂萘类(PCT WO 97/34876)和喹唑啉衍生物化合物(PCT WO 97/22596，PCTWO 97/42187)已作为血管生成和血管渗透性抑制剂被描述。

此外，已经进行了鉴定作为丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂的小分子的尝试。特别是，已经描述了作为双(吲哚基马来酰亚胺)化合物可抑制PKC丝氨酸/苏氨酸激酶同工型，其功能障碍在VEGF相关疾病中与血管通透性改变有关(PCT WO97/40830，PCT WO97/40831)。

因此鉴定出通过调节受体或非受体酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸激酶活性而调节或修正异常或不适当的细胞增殖、分化、或代谢的特异性抑制信号转导的小分子化合物是需要的。特别是，对于导致水肿、腹水、隙透、渗出液、及大分子渗出与基质沉积以及相关疾病的血管生成过程或形成血管高通透性所必需的酪氨酸激酶的功能，鉴定其特异性抑制方法及化合物是有益的。

本发明概述

本发明提供式I化合物

及其药学上可接受的盐，其中L₁代表式(E)s(CH₂)q基团，其中E代表NR₂₄、O或S，s是0或1且q是0至6的整数，条件是当s是1时q至少是1，其中亚烷基链任选被一个或多个下列取代基取代：任选被一个或多个羟基、卤素或任选取代的氨基取代的C_1-6烷基；任选被一个或多个羟基、卤素或任选取代的氨基取代的C_1-6烷氧基；羟基；卤素；或任选取代的氨基；A代表CONH、NHCO、SO₂NH、NHSO₂、或NR₂₅；L₂代表式(CH₂)r基团，其中r是0至6的整数，其中亚烷基链任选被一个或多个下列取代基取代：任选被一个或多个羟基、卤素或任选取代的氨基取代的C_1-6烷基；任选被一个或多个羟基、卤素或任选取代的氨基取代的C_1-6烷氧基；羟基；卤素；或任选取代的氨基；R₂代表任选被一个或多个下列取代基取代的C_1-6烷基：卤素、羟基、C_1-6烷氧基或任选取代的氨基；任选被一个或多个下列取代基取代的C_1-6烷氧基：卤素、羟基、C_1-6烷氧基或任选取代的氨基；或R₂是卤素、羟基、氰基、硝基、氨基甲酰基、C_1-6链烷酰基、(C_1-6烷氧基)羰基或任选取代的氨基；n代表0、1、2或3；X代表a)取代的亚甲基，b)羰基，c)氧，d)式C＝NOR₇基团，其中R₇代表H或C_1-4烷基，e)式NR₈基团其中R₈代表H、任选取代的C_1-4烷基或任选取代的苯基，f)式(CH₂)n基团，其中n是1、2或3，或g)式S(O)p基团其中p是0、1或2；R₃、R₄、R₅和R₆独立地代表a)H，b)卤素，c)任选被一个或多个下列取代基取代的C_1-6烷基：羟基、C_1-6烷氧基、卤素或任选取代的氨基，d)任选被一个或多个下列取代基取代的C_1-6烷氧基：羟基；C_1-6烷氧基；卤素；或任选取代的氨基条件是这些基团不是结合在连接烷氧基的氧原子的碳原子上；e)任选取代的苯氧基，f)羟基，g)式CORa基团，其中Ra代表羟基、C_1-6烷氧基或Ra代表任选取代的氨基，h)任选取代的氨基，i)C_1-6链烷酰基，j)硝基，k)任选取代的苯基C_1-6烷基，l)任选取代的苯基C_1-6烷氧基，m)氰基，或o)C_2-4链烯基或C_2-4链炔基，其中每一个任选被苯基取代，而后者任选被一个或多个下列基团取代：C_1-6烷基，C_1-6烷氧基或卤素；并且1)当A是SO₂NH或NHSO₂时R₁代表a)任选取代的苯基，b)任选取代的杂芳基，c)五、六或七元含氮原子的饱和杂环，其任选含有选自O、S或N的另外杂原子并任选被C_1-6烷基取代，其中所述饱和环可以通过碳或杂原子连接，d)任选取代的氨基或e)C_1-6烷氧基；2)当A代表CONH或NHCO时R₁代表a)被硝基或一个或多个C_1-6烷氧基取代的苯基而所述烷氧基任选被一个或多个下列基团取代：卤素、羟基、C_1-6烷氧基或任选取代的氨基，b)任选取代的杂芳基或c)五、六或七元含氮原子的饱和杂环，其任选含选自O、S或N的另外杂原子并且任选被C_1-6烷基取代，其中所述饱和环可以通过碳连接或d)C_1-6烷氧基；3)当A代表NR₂₅基团且q至少是1时则R₁代表a)任选取代的苯基，b)任选取代的杂芳基或c)任选取代的氨基；以及4)当A代表NR₂₅基团并且q是0和s是0时，则R₁代表任选取代的杂芳基；R₂₄和R₂₅独立地代表H；任选被一个或多个下列基团取代的C_1-6烷基：羟基、C_1-6烷氧基、卤素或任选取代的氨基；C_1-6链烷酰基或C_1-6烷基磺酰基；条件是两杂原子不会连接于同一个sp3杂化碳原子。

本领域内技术人员能够理解，当n不是0或1时R₂基团可能相同或不同。

术语任选取代的氨基是指式NRkRl基团，其中Rk和Rl独立地代表氢、C_1-12烷基、C_1-12烷氧基、C_3-12环烷基、苯基、苯基C_1-6烷基、杂芳基或杂芳基C_1-6烷基，其中所述各基团任选被一个或多个下列基团取代：C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、羟基、卤素；或Rk和Rl与它们所连接的氮原子共同代表一个五、六或七元饱和杂环，其任选含选自O、S或N的另外杂原子并任选被C_1-6烷基取代。

本文采用的涉及苯基和杂芳基的术语“任选取代”是指被一个或多个下列基团取代a)卤素，b)任选被一个或多个下列基团取代的C_1-6烷基：羟基、卤素、任选取代的氨基或五、六或七元饱和含氮杂环，其任选另含选自O、S或N的杂原子并任选被C_1-6烷基取代，其中所述饱和环通过碳原子连接，c)C_1-6烷氧基，其任选被一个或多个下列基团取代：羟基；C_1-6烷氧基；卤素；或任选取代的氨基，条件是这些基团不与连接烷氧基的氧原子的碳原子连接，或五、六或七元饱和含氮杂环其任选另含选自O、S或N的杂原子并任选被C_1-6烷基取代，其中所述饱和环通过碳原子连接，d)任选取代的苯氧基，e)羟基，f)式CORa基团，其中Ra代表羟基、C_1-6烷氧基或Ra代表式NRbRc基团，其中Rb和Rc独立地代表氢、C_1-12烷基、C_3-12环烷基或苯基，其中烷基、环烷基和苯基任选被一个或多个下列基团取代：羟基、卤素、C_3-12环烷基或式NRhRj的氨基，其中Rh和Rj独立地代表氢或C_1-6烷基或其中Rh和Rj与它们所连接的氮原子共同代表一个五、六或七元饱和杂环，其任选另含选自O、S或N的杂原子并任选被C_1-6烷基取代，g)式NRdRe基团，其中Rd和Re相互独立地选自氢、C_1-12烷基、C_3-12环烷基或苯基或式CORf基团，其中Rf代表氢、C_1-12烷基、C_3-12环烷基、苯基C_1-6烷基或苯基，其中在各种情况下，烷基、环烷基和苯基任选被一个或多个下列基团取代：卤素、羟基、硝基或式NRhRj的氨基，其中Rh和Rj同前文定义，h)式O(CH₂)mRg基团，其中m是2、3、4或5且Rg代表羟基或式NRdRe基团其中Rd和Re同前文定义；或Rg代表式CORa基团其中Ra同前文定义且m是1、2、3、4或5，i)硝基，j)任选取代的苯基C_1-6烷基，k)任选取代的苯基C_1-6烷氧基，l)氰基，m)C_3-6链烯氧基，n)吡啶氧基或吡啶硫基，其中吡啶环任选被一个或多个下列基团取代：三氟甲基或硝基，o)羟基脒基，p)氨基甲基，q)甲酰氨基甲基，r)C_1-6烷硫基，s)苯基或t)C₂₄链烯基或C₂₄链炔基，其中每个均任选被苯基取代，而该苯基任选被一个或多个下列基团取代：C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或卤素。

术语杂芳基是指任选取代的单或双环芳族杂环，其中杂环含有1、2、3或4个选自氮、硫或氧的杂原子。该杂芳基可以通过碳或杂原子连接。合适的杂芳基包括咪唑基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噁唑基、噻唑基、异噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、喹啉基、异喹啉基、吲唑基、苯并噁唑基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、中氮茚基、咪唑并吡啶基或苯并(b)噻吩基，其中各基团如前文所述被任选取代。

当任选取代的氨基代表饱和杂环时该环优选为吗啉基、全氢噻嗪-4-基、哌啶子基、吡咯烷-1-基、哌嗪-1-基、4-甲基哌嗪-4-基、硫杂吗啉基、全氢-1，4-二氮杂-1-基或全氢氮杂基。

术语取代的亚甲基是指，例如，亚甲基被一个或多个下列基团取代：羟基或C_1-4烷基，其中烷基任选进一步被式N-RrRs基团取代其中Rr和Rs相互独立地代表H或C_1-6烷基。

应当理解本文中提及的任何基团含有三个或三个以上原子的链时表示其基团中的链可以是直链或支链的。例如，烷基可以包括丙基，其包括正丙基、异丙基，及丁基，其包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基。术语C_3-12环烷基包括桥联基团例如金刚烷基。术语“卤素”用于本文时表示氟、氯、溴和碘。

X优选为CH₂或S。

第一组优选的式I化合物中，X为CH₂且A是NR₂₅。

第二组优选的式I化合物中，X为S且A是NR₂₅。

第三组优选的式I化合物中，X为CH₂且A是HNSO₂。

第四组优选的式I化合物中，X为CH₂且A是SO₂NH。

第五组优选的式I化合物中，X为CH₂且A是CONH。

第六组优选的式I化合物中，X为CH₂且A是HNCO。

在最优选的式I化合物中，X为CH₂、A是NR₂₅、L₁是(CH₂)q其中q是1至6的整数且亚烷基链任选被一个或多个下列基团取代：任选被一个或多个羟基、卤素或任选取代的氨基取代的C_1-6烷基；任选被一个或多个羟基、卤素或任选取代的氨基取代的C_1-6烷氧基；羟基；卤素；或任选取代的氨基；L₂是一个键且R₁是任选取代的吡啶基。

式I化合物可以作为与药学上可接受的酸所成的盐存在。本发明包括这些盐。这些盐的实例包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐[例如(+)-酒石酸盐、(-)-酒石酸盐或其混合物包括外消旋混合物]、琥珀酸盐、苯甲酸盐以及与氨基酸例如谷氨酸形成的盐。这些盐可以通过本领域技术人员已知的方法制备。

某些含有酸性取代基的式I化合物可以作为与药学上可接受的碱所成的盐存在。本发明包括这些盐。这些盐的实例包括钠盐、钾盐、赖氨酸盐和精氨酸盐。这些盐可以通过本领域技术人员已知的方法制备。

某些式I化合物及其盐可以一种以上的晶体形式存在而本发明包括各种晶体形式及其混合物。

某些式I化合物及其盐还可以溶剂化物形式存在，例如水化物，而本发明包括各种溶剂化物及其混合物。

某些式I化合物可能存在一个或多个手性中心，并存在不同的光学活性形式。当式I化合物含有一个手性中心时，该化合物以两种对映异构体形式存在而本发明包括两种对映体以及对映体的混合物。该对映体可以通过本领域内技术人员已知的方法析分，例如通过形成可以被分离的非对映异构的盐，例如，通过结晶化；通过形成可以被被分离的的非对映异构体衍生物或复合体，例如，通过结晶、气-液或液相色谱；一种对映体选择性地与对映体特异性试剂反应，例如，酶促酯化反应；或手性环境下的气-液或液相色谱，例如与手性配基结合的硅胶或手性溶剂中的手性载体。应当理解当通过上述分离方法之一将所需对映体转化为另一种化学实体时，还需要释放所需的对映体另外步骤。或者，可以通过采用光学活性的试剂、底物、催化剂或溶剂通过不对称合成，或通过不对称转化将一种对映体转变为另一种而合成特定的对映体。

当式I化合物含有一个以上的手性中心时，其可能以非对映异构体形式存在。成对的非对映异构体可以通过本领域内技术人员所知的方法分离，例如色谱法或结晶法而每对中的单一对映体可以如前所述进行分离。本发明包括式I化合物的各种非对映异构体及其混合物。

某些式I化合物可能以不同的互变异构体形式或作为不同的几何异构体存在，而本发明包括式I化合物的每种互变异构体和/或几何异构体以及它们的混合物。

某些式I化合物可能以不同的可分离的稳定构象形式存在。由于一个不对称单键的限制性旋转所致的扭转不对称性，例如由于立体阻碍或环张力，可能使不同构象被分离。本发明包括式I化合物的每种构象异构体以及它们的混合物。

某些某些式I化合物可能以两性离子形式存在而本发明包括式I化合物的各种两性离子形式以及它们的混合物。

本发明化合物用作丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶抑制剂。特别是，本发明化合物用作酪氨酸激酶抑制剂，它对于高增殖性疾病，特别是在血管生成过程中是重要的。由于这些化合物是抗血管生成剂，因此它们是重要的抑制以血管生成为重要成分的疾病发展的物质。

现在给出这些物质的优选定义。

R₁优选代表任选取代的苯基、任选取代的噻吩基、任选取代的吡啶基、任选取代的呋喃基或任选取代的吡咯基。

更加优选的R₁代表2-噻吩基、3-噻吩基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基，其中每一个均任选被取代，以及任选为一、二和三取代的苯基，其中取代基选自任选取代的烷氧基(特别是甲氧基、3-吗啉基丙氧基、2-吗啉基乙氧基、3-羧基丙氧基、羧基甲氧基、2-羧基乙氧基、2-氨甲酰基乙氧基、氨甲酰基甲氧基、3-氨甲酰基丙氧基、2-哌啶基乙氧基、2-(哌嗪-1-基)乙氧基、2-(吡咯烷-1-基)乙氧基、2-二甲氨基乙氧基、2-(全氢噻嗪-4-基)乙氧基、3-哌啶基丙氧基、3-(哌嗪-1-基)丙氧基、3-(吡咯烷-1-基)丙氧基、3-二甲氨基丙氧基、3-(全氢噻嗪-4-基)丙氧基)、低级烷基(特别是甲基)、卤素(特别是氟和氯)、芳基(特别是苯基)、羟基、芳氧基(特别是苯氧基)、芳基烷氧基(特别是苄氧基)、二-低级烷基氨基(特别是二甲氨基)、多卤代低级烷基、多卤代低级烷氧基(特别是三氟甲氧基)、硝基、氰基、低级烷硫基(特别是甲硫基)、羧基、低级烷氧基羰基(特别是甲氧羰基)、酰氨基(特别是乙酰氨基和苯甲酰氨基)以及任选取代的氨基甲酰基(特别是氨基甲酰基、N-甲基氨基甲酰基、N-苯基氨基甲酰基)和吡啶基氧基或吡啶基硫基，其中吡啶环任选被一个或多个下列取代基取代：三氟甲基或硝基。

最优选的R₁代表4-吡啶基、2-甲酰氨胺甲基-4-吡啶基、2-氨基甲基-4-吡啶基、2-(羟基脒基)-4-吡啶基、2-氨基甲酰基-4-吡啶基、4-吡啶基-N-氧化物、2-氯-4-吡啶基、2-氰基-4-吡啶基、5-甲基-2-呋喃基、5-(2-硝基-4-三氟甲基苯基)呋喃-2-基、苯基、4-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、2-甲氧基苯基、3，4-二甲氧基苯基、3，4，5-三甲氧基苯基、4-(3-吗啉基丙氧基)苯基、4-(2-吗啉基乙氧基)苯基、4-(3-羧基丙氧基)苯基、4-羧基甲氧基苯基、4-(3-氨基甲酰基丙氧基)苯基、4-氨甲酰基甲氧基苯基、3-(3-吗啉基-丙氧基)苯基、3-(2-吗啉基乙氧基)苯基、3-(3-羧基-丙氧基)苯基、4-羧基甲氧基苯基、3-(3-氨基甲酰基丙氧基)苯基、3-氨基甲酰基甲氧基苯基、2-羟基苯基、3-羟基苯基、4-羟基苯基、3-羟基-4-甲氧基苯基、4-羟基-3-甲氧基苯基、4-二氟甲氧基苯基、3-硝基苯基、4-硝基苯基、3，5-二-叔丁基-4-羟基苯基、4-甲基苯基、4-氟苯基、2-氯苯基、3-氯苯基、4-氯苯基、2，4-二氯苯基、2-氯-5-硝基苯基、4-氟-2-氯苯基、4-甲硫基苯基、4-联苯基、3-苯氧基苯基、4-苯氧基苯基、4-苄氧基苯基、4-二甲基氨基苯基、4-二乙基氨基苯基、4-甲氧羰基苯基、4-氨基甲酰基苯基、4-氰基苯基、4-N-甲基氨基甲酰基苯基、4-N-苯基氨基甲酰基苯基、4-乙酰氨基苯基、4-苯甲酰氨基苯基、4-羧基苯基、4-[N-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基]苯基、4-(丙-1-烯氧基)苯基、3-(2-羟基乙氧基)苯基、3-(N-(2-二乙基氨基乙基)-氨基甲酰基甲氧基)苯基、3-[3-(N-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基)丙氧基]苯基、4-(N-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基甲氧基)苯基、4-[3-(N-(2-二乙基氨基乙基)-氨基甲酰基)丙氧基]苯基、2-呋喃基、5-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-2-呋喃基、3-溴-2-噻吩基、5-甲氧基-2-呋喃基、5-(2-硝基-4-三氟甲基苯基)-2-呋喃基、3-N-(2-吗啉基乙基)氨基甲酰基甲氧基)苯基、3-[3-(N-(2-吗啉基乙基)氨基甲酰基)丙氧基苯基]、4-(N-(2-吗啉基乙基)-氨基甲酰基甲氧基)苯基、4-(吗啉基乙酰氨基)苯基和4-[3-(N-(2-吗啉基乙基)氨基甲酰基)丙氧基]-苯基。

优选的R₃、R₄、R₅和R₆独立地代表氢、卤素(尤其是氟)、任选取代的低级烷氧基(尤其是甲氧基、3-吗啉基丙氧基、2-吗啉基乙氧基、3-羧基丙氧基、羧基甲氧基、2-羧基乙氧基、2-氨基甲酰基乙氧基、3-氨基甲酰基丙氧基、2-哌啶基乙氧基、2-(哌嗪-1-基)乙氧基、2-(吡咯烷-1-基)乙氧基、2-二甲基氨基乙氧基、2-(全氢噻嗪-1-基)乙氧基、3-哌啶基丙氧基、3-(哌嗪-1-基)丙氧基、3-(吡咯烷-1-基)丙氧基、3-二甲基氨基丙氧基、3-(全氢噻嗪-4-基)丙氧基)、氨基甲酰基甲氧基、羟基丙氧基、羟基乙氧基、(3-吗啉基)丙氧基和(2-吗啉基)丙氧基、酰氨基(尤其是乙酰氨基和苯甲酰氨基)、任选取代的氨基甲酰基(尤其是氨基甲酰基、N-甲基-氨基甲酰基和N-苯基氨基甲酰基)、羧基、硝基和氨基。

更优选R₃、R₄、R₅和R₆代表下列基团：6，7-二甲氧基、6，7，8-三甲氧基、6-氟、6-乙酰氨基、7-甲氧基、6-氨基甲酰基、6-(N-甲基-氨基甲酰基)、6-(N-苯基氨基甲酰基)、(3-吗啉基)丙氧基和(2-吗啉基)乙氧基。

本文所用术语“低级”是指具有1至6个碳原子的基团。

本发明特别优选的化合物包括：4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑)-N-(4-吡啶基)苄胺N-[4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)苯基]苯磺酰胺4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-甲氧基乙基)苯甲酰胺4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(4-硝基苯基)苯甲酰胺4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)咪唑-1-基乙酰苯胺4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-[2-(咪唑-1-基)乙基]苯胺4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-吗啉基乙基)苯磺酰胺4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-甲氧基乙基)苯磺酰胺N-[2-(N，N-二乙基氨基)乙基]-4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)苄胺N-[2-(N，N-二乙基氨基)乙基]-4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)苯磺酰胺4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-吗啉基乙基)苄胺N-(4-乙氧基苯基)-4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)苄胺(S)-4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(吡咯烷-2-基甲基)苯甲酰胺4-(1H-[1]苯并噻吩并[3，2-c]吡唑-3-基)-N-[3-(咪唑-1-基)丙基]苄胺4-(1H-[1]苯并噻吩并[3，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-吗啉基乙基)苄胺

以及它们药学上可接受的盐，包括各对映体以及对映体的混合物。

本发明提供抑制酪氨酸激酶和丝氨酸/苏氨酸激酶的酶活性的方法，其包括将有效浓度的抑制所述激酶的酶活性的式I表示的化合物给予所述激酶。

本发明还包括这些化合物在含有药学上有效量的上述化合物和药学上可接受的载体或赋形剂的药用组合物中的用途。这些药用组合物可以给予个体以减慢或阻止伴有血管生成促成的疾病中的血管生成进程，或治疗水肿、渗漏、渗出、或腹水以及其它与血管通透性过高相关的疾病。本发明详述

本发明化合物具有抗血管生成特性。这些抗血管生成特性至少部分地是由于抑制血管生成过程所必需的酪氨酸蛋白激酶。因为如此，这些化合物可以用作抗如下疾病状态的活性药物：如关节炎、动脉粥样硬化、牛皮癣、血管瘤、心肌血管增生、冠脉或大脑血管侧枝形成(collaterals)、缺血肢端(limb)血管生成、伤口愈合、螺杆菌相关性消化道溃疡性疾病、骨折、猫抓热、潮红、血管新生性青光眼和视网膜病如那些与糖尿病相关的视网膜病或年龄相关性肌肉退化。此外，部分这些化合物可以用作抗实体瘤、恶性腹水、血癌和高增殖性疾病如甲状腺增生(尤其是Grave氏病)和囊肿(例如卵巢基质特征性血管过多的多囊卵巢综合征(Stein-Leventhal综合征))的活性药物，因为这些疾病需要血管细胞的增殖而生长和/或转移。

此外，部分这些化合物可以用作活性药物而抗灼伤、慢性肺病、中风、息肉、过敏反应、慢性和过敏性炎症、卵巢过度刺激(hyperstimulation)综合征、脑肿瘤相关性大脑水肿、高(high-altitude)、外伤或低氧导致的大脑或肺水肿、眼和黄斑水肿、腹水、以及其它以血管通透性过高、积液、渗漏、血管内蛋白渗出、或水肿为显著特征的疾病。这些化合物还可以用于治疗血管内蛋白渗出引起纤维蛋白以及细胞外基质沉积、促进基质增生的疾病(例如，纤维变性、硬化和腕管综合征)。

VEGF’s是已知唯一促进血管通透性过高并形成水肿的血管生成的独特的生长因子。事实上，与表达或给予许多其它生长因子相关的血管通透性过高看来是由VEGF生成而介导的。炎症细胞因子刺激VEGF的生成。低氧导致多种组织内VEGF的显著上调，这些情形涉及通常由于VEGF/VPF介导的反应导致的梗死、闭塞、局部缺血、贫血或血管损伤。血管通透性过高、相关性水肿、穿过内皮的交换的改变以及血管内大分子渗出，其经常伴随着血细胞渗出，可导致基质过度沉积、迷管基质增生、纤维变性，等等。因此，VEGF-介导的血管通透性过高在具有这些病因学特征的疾病中可能是重要诱因。

已发现与KDR/VEGFR-2和/或Flt-1/VEGF-1酪氨酸激酶相关的蛋白酪氨酸激酶可以介导上文列举的疾病达到显著程度。通过抑制这些酪氨酸激酶，因为作为病情组成部分的血管生成或血管通透性过高被严重削弱而使上列疾病的进程被阻止。对于较低选择性的酪氨酸激酶抑制剂使用时可能发生的副作用，本发明化合物的作用，以其对特定酪氨酸激酶的选择性而使之最小化。

本发明化合物对蛋白激酶具有抑制活性。即，这些化合物调节通过蛋白激酶的信号转导。本发明化合物抑制丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸类蛋白激酶。特别是，这些化合物选择性抑制KDR/FLK-1/VEGFR-2酪氨酸激酶活性。本发明的某些化合物还抑制其它酪氨酸激酶例如Ftl-1/VEGFR-1、Src-亚家族激酶如Lck、Src、fyn、yes等的活性。此外，本发明的部分化合物显著抑制丝氨酸/苏氨酸激酶如在细胞周期进程中具有重要作用的CDKs。本发明的一般化合物对特定激酶的作用强度和特异性通常通过取代基(即，R₁，R₂，R₃，R₄，R₅和R₆)的性质、数量和排列以及构象限制的变化而改变和优化。此外某些化合物的代谢产物也具有显著的蛋白激酶抑制活性。

本发明化合物，当对需要这些化合物的个体给药时，抑制这些个体的血管通透性过高以及水肿的形成。可以相信，这些化合物通过抑制与血管通透性过高及水肿形成进程有关的KDR酪氨酸激酶活性而起作用。此KDR酪氨酸激酶也被称为FLK-1酪氨酸激酶、NYK酪氨酸激酶或VEGFR-2酪氨酸激酶。当血管内皮细胞生长因子(VEGF)或其它活性配基(例如，VEGF-C、VEGF-D或HIV Tat蛋白)与分布于血管内皮细胞表面的KDR酪氨酸激酶受体的结合时KDR酪氨酸激酶被激活。这些KDR酪氨酸激酶激活后，随之发生血管通透性过高并且液体从血流中穿过血管壁进入组织间隙，由此形成水肿区域。该反应常常还伴有血细胞渗出。类似地，过高的血管通透性能够破坏重要组织和器官(例如，肺和肾)中正常的跨内皮的分子交换，由此导致血管内大分子渗出和沉积。据信KDR刺激的急性反应能够促进其后的血管生成进程，在此之后KDR酪氨酸激酶的长时刺激导致血管内皮细胞增生和趋化性以及形成新的血管。通过抑制KDR酪氨酸激酶活性，或者通过阻断激活配基的生成，通过阻断活性配基与KDR酪氨酸激酶受体结合，通过防止受体二聚化及磷酸根转移，通过抑制KDR酪氨酸激酶的酶活性(抑制酶的磷酸化功能)或通过某些干扰信号传递的其它机制(D.Mukhopedhyay等，Cancer Res.58：1278-1284(1998)及其参考文献)，可以抑制和最大限度地减少血管通透性过高，以及与之相关的血管外渗、后续水肿形成及基质沉积，和血管生成反应。

一组优选的本发明化合物具有抑制KDR酪氨酸激酶活性而不会显著抑制Flt-1酪氨酸激酶活性(Flt-1酪氨酸激酶又称VEGFR-1酪氨酸激酶)的活性。VEGF分别与KDR酪氨酸激酶受体及与Flt-1酪氨酸激酶受体结合而激活KDR酪氨酸激酶和Flt-1酪氨酸激酶。由于Flt-1酪氨酸激酶活性可能在血管内皮完整性及血管功能中介导重要事件，抑制该酶活性可能导致毒性作用或副作用。至少，这种抑制对于阻断血管生成反应、降低血管通透性过高以及水肿形成并非必要，因而对于个体来说是多余和没有价值的。某些优选的本发明化合物是独特的，因为它们抑制由活化的配基激活的VEGF-受体酪氨酸激酶(KDR)活性而不抑制其它酪氨酸激酶受体，例如Flt-1，其由某些活性配基激活。因此，优选的本发明化合物是在其酪氨酸激酶抑制活性中具有选择性的。

本发明化合物还用于治疗溃疡-细菌性、真菌性、莫伦氏溃疡和溃疡性结肠炎。

本发明化合物还用于治疗发生于病毒感染中如单纯疱疹、带状疱疹、AIDS、卡波济氏肉瘤，原生动物感染和弓形体病，继发于外伤、辐射、中风、子宫内膜异位、子宫过度刺激综合征，系统性红斑狼疮，肉瘤样结节病，滑膜炎，克罗恩氏病，镰刀状红细胞贫血，莱姆氏病，类天疱疮，佩吉特氏病，粘滞性过高综合征，Osler-Weber-Rendu病，慢性炎症，慢性闭塞性肺病，哮喘，类风湿性关节炎和骨关节炎的不需要的血管生成、水肿或基质沉淀的病症。

本发明化合物还用于治疗眼科病如眼和黄斑部水肿、眼球新血管病、巩膜炎、径向角膜切开术、葡萄膜炎、玻璃体炎、近视、眼部凹陷(optic pits)、慢性视网膜剥离、激光治疗后并发症、结膜炎、stargardt氏病和伊尔斯氏病以及视网膜病和黄斑部变性。

本发明化合物还用于治疗心血管病如动脉粥样硬化、再狭窄、血管闭塞和颈动脉梗塞性疾病。

本发明化合物还用于治疗癌症相关性适应症如实体瘤、肉瘤(尤其是尤因氏肉瘤和骨肉瘤)、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、成神经细胞瘤、恶性血癌，包括白血病和淋巴瘤，肿瘤引起的胸膜或心包膜积液、以及恶性腹水。

本发明化合物还用于治疗糖尿病症状如青光眼、糖尿病性视网膜病和微血管病。

可以想象上文列举的疾病可以由VEGF受体(例如，KDR和Fil-1)相关的酪氨酸蛋白激酶介导至显著性程度。通过抑制这些受体酪氨酸激酶的活性，所列举的疾病的进程被抑制，因为作为疾病状态组成部分的血管生成被严重减弱。本发明化合物的作用，通过它们对特异性酪氨酸激酶的选择性，致使在使用低选择性的酪氨酸激酶抑制剂时可能发生的副作用最小化。

另一个方面本发明提供前文最初定义(包括前提条件)的用作治疗药物，特别是作为蛋白激酶活性例如酪氨酸激酶活性、丝氨酸激酶活性和苏氨酸激酶活性抑制剂的式I化合物。在又一个方面本发明提供前文最初定义(包括前提条件)的式I化合物在制备用于抑制蛋白激酶活性的药物中的用途。

在本发明中，下列定义是适用的：

“药学上可接受的盐”指保留了游离碱的生物学效用和特性并且通过与无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸反应或与有机酸如磺酸、羧酸、有机磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、乳酸、酒石酸等反应获得的那些盐。

“烷基”指饱和脂肪族烃，包括含1-4个碳原子的直链和支链基团。

“烷氧基”指“O-烷基”基团，其中烷基同上述定义。药用制剂

本发明化合物可以采用治疗或改善血管通透性过高、水肿及相关症状的剂量以其自身或它们与合适的载体或赋形剂混合组成的药用组合物给予人类患者。这些化合物的混合物也可以简单混合或适当配制成药用组合物给药。治疗有效剂量进一步指一种或数种化合物足以产生预防或减轻不良新血管生成、过度增殖性疾病发展、水肿、VEGF-相关性血管通透性过高和/或VEGF-相关性低血压的量。这些化合物制剂及给药的直接应用技术可见于最新版“Remington氏药物学(Remington’s Pharmaceutical Siences)”Msck出版公司，Easton，PA。给药途径

合适的给药途径可以，例如，包括口服、滴眼、直肠内、透粘膜、局部、或肠内给药；胃肠外给药，包括肌肉内、皮下、骨髓注射，以及鞘内、直接心室内注射、静脉内、腹腔内、鼻内、或眼内注射。

此外，这些化合物通常可以以植入剂或缓释制剂进行局部给药而非全身给药，例如，将化合物直接注射到水肿部位。

而且，可以用靶向释药系统，例如，以内皮细胞特异性抗体包衣的脂质体给药。组合物/制剂

本发明药用组合物可以用不言自明的方法，例如，混合、溶解、制粒、制糖衣丸、磨光、乳化、填胶囊、压片或冻干处理的常规方法制备。

根据本发明使用的药用组合物可以按照常规方法采用一种或多种生理学上可接受的载体包括赋形剂和辅料(它们使活性化合物易于进入制剂并且在药物学上是可用的)配制。正确的制剂取决于所选择的给药途径。

对于注射给药，本发明的药物可以配制成水溶液，优选生理学上相容的缓冲剂如Hank’s溶液、Ringer’s溶液、或生理盐水缓冲液。对于粘膜给药，适合穿过屏障的渗透剂被用于制剂中。这些渗透剂通常是本领域内已知的。

对于口服给药，通过使活性化合物与本领域内熟知的药学上可接受的载体混合即可容易配制该化合物。这些载体使得本发明化合物能够被配制成适合待治疗患者口服的片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、胶体、糖浆剂、浆剂、混悬液等。用于口服的制剂可以通过将活性化合物与固体赋形剂混合，任选研磨所得混合物而获得，如果需要的话，在加入合适的辅料后，将混合物加工成颗粒，以获得片剂或糖衣芯。特别地，合适的赋形剂是，填充剂如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇、或山梨糖醇；纤维素制品如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或海藻酸或它们的盐如海藻酸钠。

对糖衣芯给予适当包衣。为此，可以使用浓的糖溶液，其可以任选含有阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯树胶(carbopolgel)、聚乙二醇和/或二氧化钛、腊克漆溶液，以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或色素加入片剂或糖衣丸包衣材料中，以鉴别或区分活性化合物剂量的不同组合。

可以用于口服的药用制剂包括明胶制成的推合胶囊，以及由明胶及增塑剂，如甘油或山梨糖醇制成的封闭软胶囊。推合胶囊可以含有活性成分与填充剂如乳糖，粘合剂如淀粉，和/或润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁以及，任选稳定剂的混合物。在软胶囊中，活性化合物可溶解或悬浮于合适的液体中，如脂肪油、液体石蜡、或液态聚乙二醇。此外，可以加入稳定剂。所有口服给药制剂应当是适合如此给药的单位剂型。

对于颊内给药，组合物可以采用以常规方法配制的片剂或锭剂形式。

对于吸入给药，按照本发明使用的化合物通常从压力容器或喷雾器中以气雾剂喷雾的形式释药，其采用合适的抛射剂，例如，二氯二氟甲烷、三氯一氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气雾剂的情况下，其剂量单位可取决于给定的释药计量的值。胶囊或药筒，例如由明胶制备的，被用于吸入剂或吹入剂时应当被配制成含有化合物与合适的粉末性基质如乳糖或淀粉的混合粉末。

这些化合物可以配制成适合于胃肠外给药的注射剂，例如，大剂量(bolus)注射或连续滴注。注射用制剂可以以单位剂型存在，例如，装入安瓿或多剂量容器中，可加入防腐剂。组合物可采用以油或水为溶媒的悬液、溶液或乳浊液的这些形式，并且可以含有制剂用试剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

胃肠外给药用的药用制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外，活性化合物的混悬液可以制备成合适的油性注射混悬液。合适的亲脂性溶剂或溶媒包括脂肪油如麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。注射用水悬液可以含有增加混悬液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇，或葡聚糖。混悬液还任选含有合适的稳定剂或增加化合物溶解性的物质使之能够制备高浓度的溶液。

此外，活性成分可以是适合在临用前以合适溶媒，如无菌无热源的水配制的粉末形式。

这些化合物还可以配制成直肠给药的制剂例如，含有常规栓剂基质如可可油或其它甘油酯的栓剂或滞留灌肠剂。

除前文描述的制剂外，这些化合物还可以配制成植入制剂。这些长效制剂可以通过植入法给药(例如皮下或肌肉内或肌内注射)。因此，例如，这些化合物可以与合适的聚合物或疏水性物质(例如可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂进行配制，或配制为微溶性衍生物，例如配制为微溶性的盐。

用作本发明疏水性化合物的药用载体的一个实例是含有苯甲醇、非极性表面活性剂、水可溶混的有机聚合物和水相的共溶系统(co-solvent system)。此共溶系统可以是VPD共溶系统。VPD是含3％w/v苯甲醇、8％w/v非极性表面活性剂吐温80和65％w/v聚乙二醇300，添加无水乙醇至总体积的溶液。此VPD共溶系统(VPD：5W)由5％葡聚糖水溶液按1∶1稀释VPD而组成。此VPD共溶系统很好地溶解疏水性化合物，并且其自身在系统给药中产生的毒性很低。事实上，在不破坏其溶解性和毒性的特征下，该共溶系统的组成比例可以在较大范围内改变。此外，共溶剂组分的成分可以改变，例如，可以采用其它低毒非极性表面活性剂代替吐温80；聚乙二醇部份的大小可以改变；聚乙二醇可以被其它生物相容性聚合物代替，例如聚乙烯吡咯烷酮；并且葡聚糖可以被其它糖或多糖代替。

或者对于疏水性药用化合物可以采用其它的释药系统。脂质体和乳剂是熟知的疏水性药物的释药溶媒或载体的例子。某些有机溶剂如二甲亚砜也可以被采用，尽管通常以较大的毒性为代价。此外，这些化合物可以采用缓释系统释药，例如，含有治疗药的固体疏水性聚合物的半渗透性基质。已经有多种缓释材料被确立并且为本领域内技术人员所熟知。缓释胶囊，根据其化学性质，可以释放该化合物数周至多达超过100天。根据治疗药的化学性质和生物学稳定性，可以采用稳定蛋白的其它措施。

药用组合物还可以包括合适的固体或凝胶态载体或赋形剂。这些载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖类、淀粉类、纤维素衍生物、明胶和聚合物如聚乙二醇。

许多本发明的有机分子化合物可以作为与药学上相容性抗衡离子所成盐的的形式提供。药学上相容性的盐可以与许多酸形成，包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等等。与相应的游离碱形式相比，盐在水或其它质子性溶剂中可能具有更好的溶解性。有效剂量

用于本发明的药用组合物包括含有能够达到预定目的的有效量的活性成分的组合物。更具体地说，治疗有效量是指有效预防被治疗患者的症状发展或减轻现有症状的量。本领域内技术人员在其能力范围之内能够确定有效量。

对于用于本发明的方法中的任何化合物，其治疗有效剂量最初可以通过细胞测定而估算。例如，可以用公式计算在细胞和动物模型中获得某一循环浓度范围时的剂量，其浓度范围包括由细胞测定所确定的IC₅₀(即，达到对给定蛋白激酶活性最大抑制一半时的待测化合物浓度)。在某些情况下，应当在3-5％血清白蛋白存在下测定IC₅₀，因为这样的测定近似血浆蛋白对化合物的结合作用。这项资料可以用于更准确地确定人体有效剂量。此外，用于系统给药的最优选的化合物在完整细胞中可以在安全达到的血浆水平下有效蛋白激酶的信号。

治疗有效量是指达到改善患者症状的化合物的量。这些化合物的毒性和治疗作用可以在细胞培养或实验动物中通过标准药学方法测定，例如，测定最大耐受剂量(MTD)和ED₅₀(50％最大反应的有效剂量)。毒性与治疗作用的剂量比为治疗指数而它可以用MTD与ED₅₀的比率表示。优选呈现出较高治疗指数的化合物。由这些细胞测定和动物实验中获得的数据可以用于制订用于人体的剂量范围。这些化合物的剂量优选在包括ED₅₀而仅有较小或没有毒性的循环浓度范围内。其剂量可以在此范围内根据所采用的剂型及所采用的给药途径而变化。其准确的剂型、给药途径和剂量可以由各位医师根据对患者病情的判断而选择(例见，Fingl等，1975，“治疗学的药理学基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics)”，第1章，第1页)。在治疗危重病例时，可能要求以接近MTD的快速大剂量注射或滴注以获得快速反应。

可以分别地调整剂量和给药间隔以获得足以维持激酶调节作用的活性基团的血浆水平，或最小有效浓度(MEC)。各化合物的MEC会有变化但可以通过体外数据推算；例如，采用本说明书描述的检测法测定的达到蛋白激酶50-90％抑制的必需浓度。达到MEC的必需剂量将取决于各自的特性及给药途径。然而，HPLC分析或生物学检测可以用于测定血浆浓度。

给药间隔也可以采用MEC值确定。化合物所采用的给药方案应当保持血浆浓度在10-90％，优选在30-90％并最优选在50-90％之间的时间里高于MEC直至达到所需的症状减轻。在局部给药或选择吸收的情况下，药物的有效局部浓度可以与血浆浓度无关。

当然，组合物的给予量取决于受治疗的对象、治疗对象的体重、病情严重程度、给药方式以及责任医师的判断。包装

如果需要的话，这些组合物可以以一种包装或自动配药装置提供，其可以含有一个或多个含活性成分的单位剂型。例如该包装可以含有金属或塑料箔衣，例如，泡罩包装。这些包装或自动配药装置应当附有用药说明书。也可以制备以相容性药用载体配制的含有本发明化合物的组合物，置于合适的容器内，并标明所治疗的适应症。

在某些制剂中，使用精细颗粒形式，例如通过流能磨粉碎所获得的本发明化合物可能是有益的。

如果需要，在本发明组合物中活性化合物可以与适配的其它药理学活性成分联用。例如，本发明的化合物可以与一种或多种抑制或预防VEGF生成、削弱对VEGF的细胞内反应、阻断细胞内信号传导、抑制血管通透性过高、减少炎症，或抑制或预防肿瘤形成或新血管产生的其它药物联合给药。无论那种给药途径合适，本发明化合物都可以先于、随后或同时与其它药物给药。其它药物包括但不限于抗水肿甾族化合物、NSAIDS、ras抑制剂、抗-TNF药、抗-IL-1药、抗组胺药、PAF-拮抗剂、COX-1抑制剂、COX-2抑制剂、NO合成酶抑制剂、PKC抑制剂和PI3激酶抑制剂。本发明化合物与这些其它药物的作用或者是相加的或者是协同的。因此，抑制血管通透性过高和/或抑制水肿形成的这些物质的联合给药与单独给予各物质相比，可以更好地减轻高增殖性疾病、血管生成、血管通透性过高或水肿的有害作用。在治疗恶性疾病中可以与抗增殖或细胞毒化疗药或放疗联合。

本发明还包括式I化合物作为治疗药的用途。

Src和Syk两个家族的激酶在免疫反应的调节中起着关键作用。目前已知Src家族包括Fyn、Lck、Fgr、Fes、Lyn、Src、Yes、Hck和Blk。目前已知Syk家族仅包括Zap和Syk。Janus家族的激酶涉及生长因子和促炎细胞因子信号通过一系列受体的传导。尽管Tec家族激酶的成员，BTK和ITK，在免疫学中作用还不够清楚，但抑制剂对它们的调节可能被证明是有治疗效果的。激酶RIP、IRAK-1、IRAK-2、NIK、IKK-1和IKK-2与重要的促炎细胞因子TNF和IL-1前体的信号转导途径有关。由于它们能够抑制一种或多种的此类激酶，式I化合物可以作为免疫调节剂而有益于维持同种异体移植和治疗自身免疫性疾病。尽管它们能够调节T细胞的激活或增强炎症过程，这些化合物可以用于治疗这些自身免疫性疾病。由于排斥现象，无论是宿主针对移植体的实体器官或移植物针对宿主的骨髓，移植都受到当前所能获得的免疫抑制剂的毒性的限制，但将从改善治疗指数的有效药物中获得益处。基因靶向实验已经证明Src在破骨细胞生物学中的基础性作用，这些细胞负责骨质的再吸收。由于式I化合物能够调节Src，它可以用于治疗骨质疏松症、骨质硬化症、佩吉特氏病、肿瘤诱发的高血钙以及用于治疗骨转移。

许多蛋白激酶已经被证明是原癌基因。染色体断裂(位于5号染色体上的ltk激酶断裂点)、易位如在含BCR(费城(philadelphia)染色体)的Abl基因的情形中、截短如在c-Kit或EGFR的实例中、或突变(例如，Met)导致产生异常调节蛋白而将它们由原癌基因转变为致癌基因。在其它肿瘤中，自分泌或旁分泌性配基/生长因子受体相互作用促进肿瘤形成。Src-家族激酶成员典型地与下游信号传递有关，因此增强肿瘤形成而且它们自身通过过度表达或突变而成为致癌性的。通过抑制这些蛋白质的蛋白激酶活性可以终止其疾病进程。血管再狭窄可能涉及FGF和/或PDGF的作用-促进平滑肌及内皮细胞增生。抑制FGFr或PDGFr激酶活性可能是抑制这种现象的有效措施。式I化合物抑制正常或异常的c-kit、c-met、c-fms、src-家族成员、EGFr、erbB2、erbB4、BCR-Abl、PDGFr、FGFr以及其他受体或细胞质酪氨酸激酶的激酶活性可能治疗良性和肿瘤性的增殖性疾病有价值。

在许多病理条件下(例如，原发性实体瘤及转移、卡波氏肉瘤、类风湿性关节炎、异常的眼新血管生成所致的失明、牛皮癣和动脉粥样硬化)，疾病的发展伴随有持续的血管生成。疾病组织或相关的炎症细胞通常产生多肽生长因子，而且其相应的内皮细胞特异性受体酪氨酸激酶(例如，KDR/VEGFR-2、Flt-1/VEGFR-1、Tie-2/Tek和Tie)对于刺激内皮细胞生长、迁移、排列、分化以及建立起所需的新的功能性血管结构是必需的。

由于VEGF的“血管通透性因子”活性是介导血管高通透性原因，也相信VEGF刺激的VEGFR激酶在形成肿瘤性腹水，大脑及肺水肿，胸膜和心包膜积液，迟发性过敏反应，继发于外伤、烧伤、局部缺血、糖尿病并发症、子宫内膜异位症、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、心肺旁路术后相关的低血压及通透性过高的组织水肿及器官功能障碍，以及眼水肿所致的青光眼或异常新血管生成所致的失明中也起着重要作用。除VEGF外，新近鉴定出的VEGF-C和VEGF-D、及HIV-Tat蛋白也能够通过刺激VEGFR激酶而导致血管通透性过高的反应。

Tie-2还在一选定的造血干细胞群体中表达，其可能在它们的聚集、粘附、调节和分化中起作用(Blood 89，4317-4326(1997))；这些表达Tie-2的群体可能作为循环的血管生成内皮细胞的祖细胞起作用。根据式I的某些药物能够阻断内皮细胞特异性激酶的活性，因而能够抑制涉及这些情况的疾病进程。

式I化合物或其盐或含有效治疗量的式I化合物的药用组合物可以用于治疗良性或肿瘤性的增殖性疾病和免疫系统疾病。这些疾病包括自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、甲状腺炎、I型糖尿病、多发性硬化、肉瘤样结节病、炎性肠道病、重症肌无力和系统性红斑狼疮；牛皮癣，器官移植排斥反应(例如，肾排斥、移植体抗宿主性疾病)，良性和肿瘤性增殖性疾病，人类癌症如肺、乳房、胃、膀胱、结肠、胰腺、卵巢、前列腺和直肠癌以及造血细胞(例如白血病和淋巴癌)，和与异常血管化有关的疾病如糖尿病性视网膜病、由于年龄相关的黄斑区退化所致的脉络膜新血管生成、和人类中的小儿血管瘤。此外，这些抑制剂可以用于治疗与VEGF介导的水肿、腹水、积液和渗出液相关的疾病，例如包括黄斑区水肿、大脑水肿、和成人呼吸窘迫综合征(ARDS)。

本发明化合物还可用于预防上述疾病。

本发明的另一个方面提供式I化合物或其盐在制备用于治疗哺乳动物，尤其是人类的血管通透性过高、血管生成依赖性疾病、增殖性疾病和/或免疫系统疾病的药物中的用途。

本发明还提供治疗血管通透性过高、异常新血管化、增殖性疾病和/或免疫系统疾病的方法，其包括以有效治疗量的式I化合物给予有需要的哺乳动物，尤其是人类。

化合物在体外抑制这些蛋白激酶的效力可以通过下文详述的方法测定。

化合物的效力可以通过检测待测化合物与对照物对外源性底物(例如，合成多肽(Z.Songyang等，Natrue 373：536-539))磷酸化抑制的量而测定。采用杆状病毒系统制备KDR酪氨酸激酶：

采用从HUVEC细胞中分离的cDNAs通过PCR获得人类KDR细胞内结构域(aa789-1354)的编码序列。还在此蛋白质的N-端引入六聚组氨酸(poly-His6)序列。将该片段克隆到转染载体pVL1393的Xba 1和Not1位上。重组杆状病毒(BV)采用BaculoGold Trahsfection试剂(PharMingen)通过共转染获得。重组BV以空斑法纯化并通过Western分析法确证。至于蛋白质生成，使SF-9细胞以2×10⁶/ml的密度生长于SF-900-II培养基中，并且以每个细胞0.5个空斑形成单位(MOI)进行感染。细胞在感染后48小时收获。KDR纯化

将50ml Triton X-100溶胞缓冲液(20mM Tris，pH8.0，137mMNaCl，10％甘油，1％Triton X-100，1mM PMSF，10μg/ml抑肽酶、1μg/ml亮抑酶肽)加入到1L细胞培养液的细胞团中使表达(His)₆KDR(aa789-1354)的SF-9细胞溶解。该溶胞产物在Sorval SS-34转子中在4C下以19000rpm离心30分钟。将该细胞溶解产物加于5ml NiCl₂螯合的琼脂糖柱上，以50mM HEPES，pH7.5，0.3M NaCl平衡。以含有0.25M咪唑的相同缓冲液洗脱KDR。柱纯化部分采用SDS-PAGE和测定激酶活性的ELISA检测法(见下文)分析。纯化的KDR转移到25mMHEPES，pH7.5，25mM NaCl，5mM DTT缓冲液中并于-80℃保存。人类Tie-2激酶的产生与纯化

采用从人血小板中分离的cDNAs为模板，通过PCR获得人类Tie-2细胞内结构域(aa775-1124)的编码序列。将聚合-His6序列引入N-端并将该结构克隆到转染载体pVL1939的Xba 1和Notl位点上。重组BV采用BaculoGold转染试剂(PharMingen)通过共转染获得。空斑法纯化重组BV并以Western分析法确证。至于蛋白产生，使SF-9细胞以2×10⁶/ml的密度生长于SF-900-II培养基中，并且以0.5 MOI进行感染。His-靶向激酶的纯化采用类似于KDR中的描述筛选。人类Flt-1酪氨酸激酶的制备和纯化

采用表达载体pVL1393(Phar Mingen，Los Angeles，CA)的杆状病毒。编码六聚-His6的核苷酸序列置于编码人类Flt-1(氨基酸786-1338)的完整细胞内激酶结构域的核苷酸结构域的5’端。编码激酶域的核苷酸序列采用从HUVEC细胞中分离的cDNA基因文库通过PCR制备。组氨酸残基使之能够以类似于KDR和ZAP70的方式进行蛋白质亲和性纯化。以0.5的感染复数感染SF-9昆虫细胞并在感染48小时后收获。EGFR酪氨酸激酶来源

EGFR购自Sigma(Cat#E-3641；500单位/50μl)而EGF配基得自Oncogene Research Products/Calbiochem(Cat#PF011-100)。ZAP70表达

所采用的杆状病毒的表达载体是pVL1393(Pharmingen，LosAngeles，Ca.)。编码氨基酸M(H)6 LVPR₉S的核苷酸序列置于编码全部ZAP70(氨基酸1-619)的5’。编码ZAP70的密码区的核苷酸序列采用从Jurkat的无限增殖化T细胞中分离的cDNA基因文库，通过PCR生成。组氨酸残基使蛋白能够被亲和性纯化(见下文)。LVPR₉S键桥构成了凝血酶对蛋白水解裂解的识别序列，使之能够从酶上除去亲和性标记物。以0.5的感染复数感染SF-9昆虫细胞并在感染48小时后收获。ZAP70的提取和纯化

使SF-9细胞在含有20mM Tris、PH8.0、137mM NaCl、10％甘油、1％Triton X-100、1mM PMSF、1μg/ml亮抑酶肽、10μg/ml抑肽酶和1mM原钒酸钠的缓冲液中溶解。将可溶性溶解产物应用于以50mM HEPES，PH7.5，0.3M NaCl平衡的琼脂糖HiTrap螯合柱(Pharmacia)上。以250mM咪唑洗脱融合蛋白。该酶贮存于含50mMHEPES，pH7.5，50mM NaCl和5mM DTT的缓冲液中。Lck来源

Lck或截断形式的Lck从商业上获得(例如来自UpstateBiotechnology Inc.(Saranac Lake，N.Y)和Santa Cruz BiotechnologyInc.(Santa Cruz，Ca.))或者采用常规方法从已知天然或重组来源的原料中纯化。Cdc2来源

人类重组酶和检测缓冲液可以从商业上获得(New EnglandBiolabs，Beverly，MA.USA)或者采用常规方法从已知天然或重组来源的材料中纯化。Cdc2测定

所采用的方案是对所采购试剂的条件稍加改进来提供。简单地说，该反应在缓冲液中进行该缓冲液含有50mM Tris，pH 7.5，100mMNacl，1mM EGTA，2mM DTT，0.01％Brij，5％DMSO和10mMMgCl₂(商品缓冲剂)，并补充有新配制的终浓度为300μM的ATP(31μCi/ml)和30μg/ml的IIIss型组蛋白。反应体积80μL，含有单位酶，反应在抑制剂存在或不存在下在25℃进行20分钟。通过加入120μL 10％乙酸终止该反应。通过将混合物点样(spotting)于磷酸纤维素纸而从未结合的标记物中分离底物，随后用75mM磷酸洗涤3次，每次5分钟。在液闪剂存在下以β计数计测定数值。

本发明的某些化合物在低于50μM浓度下显著抑制cdc2。PKC激酶来源

PKC催化亚单位可以从商业上获得(Calbiochem)。PKC激酶检测

放射活性的激酶采用下列文献方法检测(Yasuda，I.，Kirshimoto，A.，Tanaka，S.，Tominaga，M.，Sakurai，A.，Nishizuka，Y.，Biochemicaland Biophysical Research Communication 3：166，1220-1227(1990))。简要地说，全部反应在由50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl₂，2mMDTT，1mM EGTA，100μM ATP，8μM肽，5％DMSO和³³PATP(8Ci/mM)组成的激酶缓冲液中进行。化合物和酶在反应瓶中混合并通过加入ATP和底物混合物启动反应。然后通过加入10μL终止缓冲液(75mM磷酸溶液中含5mM ATP)终止反应，部分混合物点样于磷酸纤维素滤纸上。点染的样品在室温下在75mM磷酸以5至15分钟洗涤三次。放射标记物的结合以液体闪烁计数器定量。Erk2酶来源

重组的小鼠酶和测定缓冲液可以从商业上获得(New EnglandBiolabs，Beverly MA.USA)或采用常规方法从已知的天然或重组来源的材料中纯化。Erk2酶检测

简要地说，该反应在含有50mM Tris，pH 7.5，1mM EGTA，2mMDTT，0.01％Brij，5％DMSO和10mM MgCl₂(商品缓冲液)并按照供货商的建议补充新配制的100μM ATP(31μCi/ml)和30μM髓鞘质碱性蛋白的缓冲液中进行。反应体积和结合的放射活性的测定方法见PKC分析中的描述(见上文)。PTKs酶联免疫吸附分析法(ELISA)

采用酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测和测量所存在的酪氨酸激酶活性。ELISA按照已知方案进行，其描述于，例如，Voller，等，1980，“酶联免疫吸附分析”，及临床免疫学手册(Manual of ClinicalImmunology)，第2版，Rose和Friedman主编，359-371页，美国微生物学会(Am.Soc.Of Microbiology)，Washington，D.C.。

此公开的方案适用于测定特异性PTK的活性。例如，进行ELISA实验的优选方案提供如下。对于测定PTK家族受体的其它成员，以及非受体酪氨酸激酶的化合物活性的这些方案进行适当调整，是本领域内技术人员的能力之内的事。为达到测定抑制剂选择性的目的，采用通用的PTK底物(例如，20,000-50,000MW的聚(Glu₄ Tyr)的随机共聚物)和同时在测定中采用浓度约为表观Km的两倍的ATP(通常5μM)。

下例步骤用于测定本发明化合物对KDR，Flt-1，Tie-2，EGFR和ZAP70酪氨激酶活性的抑制作用：缓冲液和溶液：

PGT：聚(Glu，Tyr)4∶1

粉末贮存于-20℃下。使粉末在磷酸缓冲盐水(PBS)中溶解成50mg/ml的溶液。以每份1ml等分贮存于-20℃。制板时以Gibco PBS稀释成250μg/ml。

反应用缓冲液：100mM Hepes，20mM MgCl₂，4mM MnCl₂，5mMDTT，0.02％BSA，200μM NaVO₄，pH7.10

ATP：以每份100mM等分贮存于-20℃。以水稀释成20μM。

洗涤用缓冲液：含0.1％吐温20的PBS

抗体稀释缓冲液：含0.1％小牛血清白蛋白(BSA)的PBS

TMB底物：使用前将TMB底物与过氧化(Peroxide)溶液按9∶1混合或采用购自Neogen的K-Blue底物

终止液：1M磷酸步骤1.培养板制备

以PBS将PGT贮存液(50mg/ml，冷冻)稀释至250μg/ml。Corning改进的高亲和性ELISA平底培养板(Corning#25805-96)的每个培养孔中加入125μl。空白孔中加入125μl PBS。封口胶覆盖并于37℃下孵育过夜。以250μl洗涤缓冲液洗涤一次并在37℃干燥培养箱中干燥约2小时。将培养板以刻度袋(scaled bag)包裹贮存于4℃下直至使用。2酪氨酸激酶反应

按4×浓度以20％DMSO水溶液制备抑制剂溶液。

制备反应缓冲液。

制备酶溶液使50μl中含有所需单位，例如，对于KDR配制成为1ng/μl，使每个反应孔中的总量为50ng。冰浴保存。

由100mM的贮存液以水制备20μM的4×浓度的ATP溶液。冰浴保存。

每孔加入50μl酶溶液(根据激酶的特异性活性通常为5-50ng酶/孔)。

加入25μl 4×的抑制剂。

加入25μl 4×的ATP用于抑制剂测定。

室温下孵育10分钟。

每孔加入50μl 0.05N HCl终止反应。

洗涤培养板。

^**反应终浓度：5μM ATP，5％DMSO3.抗体结合

以含0.1％BSA的PBS通过两步稀释(100×，然后200×)将每份1mg/ml的PY20-HRP(Pierce)抗体(一种磷酸酪氨酸抗体)稀释至50ng/ml。

每孔加入100μlAb。室温下孵育1小时。4℃下孵育1小时。

培养板洗涤4次。4.显色反应

制备TMB底物并每孔加入100μl。

650nm下监测OD值直至达到0.6。

以1M磷酸终止反应。摇动平板读数器。

迅速读出450nm下的OD值。

根据每批酶的制备，其最适培养时间以及酶反应条件稍有改变并可以由经验决定。

对于Lck，在类似的测定条件下采用100mM MOPSO，pH6.5，4mMMnCl₂，20mM，MgCl₂，5mM DTT，0.2％BSA，200mM NaVO₄的反应缓冲液。

式I化合物在治疗与已鉴定的，包括本文未提及的那些疾病，以及未鉴定的能够被式I化合物抑制的酪氨酸蛋白激酶有关的疾病中具有治疗上的应用价值。本文中的所有示例化合物在50微摩尔或更低浓度下都显著抑制KDR激酶。本发明的某些化合物在50微摩尔更低浓度下还显著抑制其它的PTKs例如lck。T细胞激活的体外模型

在促分裂原或抗原激活下，T细胞被诱导分泌IL-2，一种支持后续增殖期的生长因子。因此原始T细胞或合适的T细胞系产生的IL-2或细胞增殖的测定都可以都代替T细胞激活检测。这两种检测法都见于文献描述而且它们的参数也有充分的文献资料(见CurrentProtocols in Immunology，Vol2，7.10.1-7.11.2)。

简要地说，T细胞可以通过与过敏刺激细胞共培养一种称作单向混合的淋巴吞噬细胞反应的方法而激活。按照各制造商说明书的Ficoll-Hypaque梯度(Pharmacia)纯化外周血液中单核细胞的反应者和刺激者。以丝裂霉素C(Sigma)或γ射线处理使刺激细胞有丝分裂活性丧失。在有或无检测化合物的存在下反应细胞和刺激细胞以2∶1的比率共培养。通常10⁵个反应细胞与5×10⁴个刺激细胞混合并植入(200μl体积)U形底微量滴定板(Costar Scientific)。使这些细胞培养于补充有热灭活的小牛血清(Hyclone Laboratories)，或来源于男性供体的混合人AB血清，5×10^-5M 2巯基乙醇和0.5％DMSO的RPMI 1640中。培养物在收获前一天(通常在第三天)以0.5μCi的³H胸腺嘧啶核苷(Amersham)激发(pulsed)。收获(Betaplate收获器，Wallac)培养物并且通过液体闪烁计数器(Betaplate，Wallac)测定同位素的吸收量。

可以采用相同的培养系统通过测定IL-2的生成量测定T细胞激活。培养开始18至24小时后，去上清液并根据制造商的说明书以ELISA(R&D系统)测定IL-2浓度。T-细胞激活的体内模型

已知在直接测定T细胞激活或证明T细胞是效应子的动物模型中可检测化合物的体内功效。通过以单克隆抗CD-3抗体(Ab)阻断恒定部分的T-细胞受体而激活体内的T-细胞。在此模型中，BALB/c小鼠在放血前2小时腹腔给予10μg的抗CD-3 Ab。接受实验药物的动物在给予抗CD-3 Ab前1小时用单剂量的化合物预处理。T-细胞激活的标志物，促炎细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的血清水平通过ELISA测定。一种类似模型采用以特异性抗原如钥孔虫戚血蓝素(KLH)激发体内T-细胞，既而以相同抗原第二次在体内攻击流出的淋巴结细胞。与前述相同，细胞因子生成量的测定用于评价培养细胞的激活状态。简单地说，在第0天通过皮下注射在完全福氏佐剂(CFA)中乳化的100μg KLH使C57BL/6小鼠免疫。动物在免疫前一天及免疫后的第一、二和三天以化合物预处理。在第4天收获流出的淋巴结细胞并将它们的细胞按6×10⁶/ml在组织培养基中(RPMI 1640，补充有热灭活小牛血清(Hyclone Laboratories)，5×10^-5M 2-巯基乙醇和0.5％DMSO)培养24小时和48小时。然后以ELISA测定培养物上清液中的自分泌的T-细胞生长因子白介素-2(IL-2)和/或IFN-γ的水平。

在人类疾病的动物模型中也检测先导化合物。这些是通过实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)和胶原诱导的关节炎(CIA)证实的。模拟人类多发性硬化的大鼠及小鼠EAE模型都已经有报道(综述：FASEB J.5：2560-2566，1991；小鼠模型：Lab.Invest.4(3)：278，1981；啮齿类动物模型：J.Immunol 146(4)：1163-8，1991)。简单地说，小鼠和大鼠以髓磷脂碱性蛋白(MBP)的乳化液，或它们的衍生物神经原肽及CFA免疫。可以加入细菌毒素如百日咳博德特氏菌(bordetellapertussis)诱导急性疾病。复发/缓和疾病通过接受由源自MBP/肽免疫动物的T-细胞过继性转移诱导。

DBA/1小鼠的CIA可以通过II型胶原蛋白免疫而诱导(J.Immunol：142(7)：2237-2243)。小鼠可以早在抗原攻击后十天发生关节炎体征并可在免疫后保持长达九十天。在EAE和CLA两种模型中，化合物既可以预防给药也可以在发病后的时程中给药。有效的药物应减轻疾病的严重性和/或发病率。

抑制一种或多种促血管生成受体PTK、和/或介导炎症反应的蛋白激酶如lck的部分本发明化合物在这些模型中可以减轻关节炎的严重性和发病率。

还可以在小鼠同种异体移殖，皮肤移殖(Ann.Rev.Immunol.，10：333-58，1992；Transplantation：57(12)：1701-1706，1994的综述)或心脏移殖(Am.J.Anat.：113：273，1963)模型中检验化合物。简单地说，将完全厚度的皮肤移殖物由C57BL/6小鼠移殖到BALB/c小鼠。从第六天开始，每日检查移殖物的排斥反应迹象。在新生小鼠的心脏移殖模型中，幼体心脏由C57BL/6小鼠异位移殖到成年CBA/J小鼠的耳廓。心脏移殖后开始跳动到四至七天并且采用解剖显微镜查找搏动停止而视觉评价排斥反应。细胞受体PTK测定

下列细胞测定用于测定本发明的不同化合物对KDR/VEGFR2的活性和作用水平。采用本领域内熟知的技术按照相同的路线采用特异性配基刺激物可以设计适合其它酪氨酸激酶的类似受体PTK的检测法。

VEGF-诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的KDR磷酸化通过蛋白质印迹法检测。

1.HUVEC细胞(来源于混合的供体)购自Clonetics(San Diego，CA)并按照制造商的说明书培养。仅早期的传代(3-8代)被用于这种检测法。细胞采用完全EBM培养基(Clonetics)在100mm的培养皿(Falcon，组织培养用；Becton Dickinson；Plymouth，England)中培养.

2.对于化合物抑制活性的评价，细胞以胰酶消化并以0.5-1.0×10⁵个细胞/孔接种于6-孔组合(cluster)培养板(Costar，Cambridge，MA)的每个培养孔中。

3.接种3至4天后，培养板90-100％融合。从每个培养孔中去除培养基，以5-10ml的PBS漂洗细胞并以5ml无补充剂(即，无血清)的EBM基本培养基孵育18-24小时。

4.将在1ml EBM培养基中的系列稀释的抑制剂(终浓度为25μM，5μM，或1μM)加入到细胞中并在37℃下孵育1小时。然后按50ng/ml的终浓度将2ml含有人重组VEGF₁₆₅(R & D(system))的EBM培养基加入到所有培养孔中并在37℃下孵育10分钟。对照组细胞不以或仅以VEGF处理用于评价本底磷酸化反应和VEGF诱导的磷酸化反应。

然后所有培养孔都以5-10ml含1mM原钒酸钠(Sigma)的冷PBS漂洗并且使细胞溶解并收获于200μl的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7，150mM NaCl，1％NP-40，0.25％去氧胆酸钠，1mM EDTA)中，其含有蛋白酶抑制剂(PMSF 1mM，抑肽酶1μg/ml，胃酶抑素1μg/ml，亮抑酶肽1μg/ml，钒酸钠1mM，氟化钠1mM)和1μg/mlDnase(所有化学试剂均来自Sigma Chemical Company，St Louis，MO)。溶胞产物以14000rpm离心30分钟，以去除细胞核。

然后通过加入冷(-20℃)乙醇(2体积)保持最少1小时或最长过夜使等量蛋白沉淀。沉淀以含有5％β-巯基乙醇(BioRad；Hercules，CA)的Laemli样品缓冲液重新组成并煮沸5分钟。蛋白质以聚丙烯酰胺凝胶电泳(6％，1.5mm Novex，San Deigo，CA)分离并采用Novex系统转移到硝化纤维素膜上。用小牛血清白蛋白(3％)阻断后，蛋白质在4℃下以抗-KDR多克隆抗体(C20，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)或以抗磷酸酪氨酸单克隆抗体(4G 10，Upstate Biotechnology，LakePlacid，NY)过夜探针识别(probed)。洗涤并与羊抗兔或羊抗鼠IgG的HRP-结合的F(ab)₂孵育1小时后采用化学发光(ECL)系统(AmershamLife Sciences，Arlington Height，IL)观察电泳带(bands)。

本发明的某些实施例化合物在低于50μM的浓度下，显著抑制细胞VEGF-介导的KDR酪氨酸激酶磷酸化。内体子宫水肿模型

该检测法测定化合物对雌激素刺激后最初几小时内发生的小鼠子宫重量急性增加的抑制效力。已知这种早期发生的子宫重量增加的原因是子宫脉管系统通透性增加所引起的水肿。Cullinan-Bove和Koss(Endocrinology(1993)，133：829-837)证明了雌激素刺激的子宫水肿与子宫中VEGF mRNA表达增加之间的瞬时密切关系。这些结果通过采用对VEGF的中和单克隆抗体所证实，VEGF显著减少雌激素刺激后的子宫重量快速增加(WO97/42187)。因而，该系统可以用作抑制VEGF信号以及相关的通透性过高和水肿的体内模型。材料：全部激素均为购自Sigma(St.Louis，MO)或Cal Biochem(La Jolla，CA)的冻干粉末并按照供应商说明书制备。

溶媒化合物(DMSO，Cremaphor EL)购自Sigma(St.Louis，MO)。

小鼠(Balb/c，8-12周龄)购自Taconic(Germantown，NY)并按照动物保护与使用委员会指南(Animal Care and Use Committee Guidelines)饲养于无病原动物房。方法：

第1天：Balb/c小鼠腹腔注射(i.p.)给予12.5单位的孕马血清促性腺激素(PMSG)。

第3天：小鼠腹腔注射接受15单位的人绒毛膜促性腺激素(hCG)。

第4天：将小鼠随机分成5-10组。根据溶解性和溶媒以i.p.，i.v.或p.o.途径按1-100mg/kg的剂量给予实验化合物。

30分钟后，试验组、溶媒组和1个未治疗组腹腔注射给予17β-雌二醇(500μg/kg)。2-3小时后，通过二氧化碳窒息处死动物。沿中线切开后，分离并沿子宫颈下端以及输卵管与子宫连接处切开而取出各子宫。小心除去脂肪和结缔组织，以免在称重前破坏子宫的完整性。比较治疗组与未治疗组或溶媒处理组的平均重量。显著性以Student’s t-检验判断。未刺激对照组用于监测雌二醇反应。

结果表明以多种途径系统给药时，本发明的部分化合物能够抑制水肿形成。

作为血管生成受体酪氨酸激酶抑制剂的部分本发明化合物在新血管形成的Matrigel移植模型中也表现出活性。Matrigel新血管形成模型涉及在移植的皮下的透明的“大理石”样细胞外基质中的新血管形成，其由肿瘤细胞产生的前血管生成因子所诱导(例见：Passaniti，A.，等，Lab.Investig.(1992)，67(4)，519-528；Anat.Rec.(1997)，249(1)，63-73；Int.J.Cancer(1995)，63(5)，694-701；Vasc Biol.(1995)，15(11)，1857-6)。该模型优选进行3-4天并且其结果包括在取出移植物后比较对照组与抑制剂未处理的动物的新血管形成的显微观察/图像纪录、微血管密度的显微检测、以及血红蛋白定量(Drabkin法)。该模型可以选择采用bFGF或HGF作为刺激剂。

抑制一种或多种肿瘤形成、原癌基因或增殖依赖性蛋白激酶，或血管生成受体PTK的部分本发明化合物还抑制原代小鼠异种移植的小鼠、大鼠或人肿瘤生长，或在小鼠模型中的转移。

实施例I.合成

式I化合物可以按照下列描述制备。在下文中

A代表CONH的式I化合物可以通过使式TL₁CORt化合物，其中Rt是离去基团例如卤素或烷氧基，与式H₂N-L₂-R₁的胺在0-250℃范围内的温度下，在任选溶剂存在下反应来制备。

L₁A代表Ch₂NH的式I化合物可以通过使A代表CONH的式I化合物与还原剂，如氢化铝锂在0-250℃范围内的温度下，在任选溶剂存在下反应来制备。

或者，L₁A代表CH₂NH的式I化合物可以使通过式TL₁CHO化合物与式H₂N-L₂-R₁的胺，在还原剂如三乙酰氧基硼氢化钠存在下，在0-250℃的温度范围内任选在溶剂存在下反应来制备。

或者L₁-A-L₂-R₁基团可以以苯环存在及可按下文描述构成环系其中

美国专利3843665和美国专利3843666中提出了两种合成式I化合物环系的常规方法。

在美国专利3843665中，通过在惰性溶剂和催化量的酸中加热式II化合物和式III芳香族磺酰肼而使吡唑环环化。该反应优选在75℃-100℃的温度下进行5-30小时并获得R₁是氢的式I化合物。

其中：

p是0、1、2；W是低级烷基；且R、R₃、R₄、R₅、R₆及X同前文定义。式II化合物是在酸或碱催化剂存在下以式V的醛处理合适的官能化的式IV化合物来制备的(Braun，R.A.；Mosher，W.A.J.Amer.Chem.Soc.1958，80，2749)。

制备式I化合物环系的第二种方法由美国专利3843666提出，其中通式VI化合物与催化量的有机羧酸或有机磺酸在惰性溶剂如芳香族烃中，在75℃-175℃中加热6-24小时，

其中：R、R₃、R₄、R₅、R₆及X同前文定义。

式VI化合物通过在惰性溶剂中以肼处理通式VII化合物来制备。该反应在15℃-20℃下进行最多长达24小时。

或者，式I化合物可以在不分离式VI化合物下直接由式VII化合物与肼反应制备，例如在惰性溶剂，如甲醇中，在催化剂，如乙酸存在下，在60℃至所采用的惰性溶剂的沸点间的温度下加热式VII化合物和肼。

式I化合物还可以通过使式XVI化合物其中：

R、R₃、R₄、R₅、R₆及X同前文定义，与肼在惰性溶剂，如甲醇中，在15℃至所采用的惰性溶剂的沸点间的温度下反应而制备。

具结构式VII的化合物可以在碱性条件下以式V的醛处理式VIII化合物而制备。该反应在惰性溶剂中在5℃至10℃温度下进行3-6小时的时间，

其中：

Y是任何常规离去基团，例如氯、溴、碘、甲苯磺酸根或甲磺酸根而R₃、R₄、R₅、R₆及X同前文定义。

式VII的化合物还可以通过式II化合物与环氧化试剂，如过氧化氢，在惰性试剂，如甲醇、二氯甲烷、水或它们的混合物中，在0℃-100℃下，任选在碱存在下反应而制备。

VI的环化也可以通过用无机酸如盐酸、硫酸或磷酸处理而进行。该反应在低级烷醇中在15℃-20℃温度下进行12-48小时。然后该反应产物，IX，可以通过与有机羧酸或有机磺酸在直链醚或环醚中，在50℃-150℃温度下加热8-30小时而被芳香化。

式IX可以通过用式(RxCO)₂O(结构X)的酸酐，其中Rx是C_1-4烷基，在惰性溶剂如芳族烃，在35℃-200℃温度下处理5-8小时而二乙酰化得到式XI化合物。

然后式XI化合物通过与无机酸或有机酸在惰性溶剂中，在35℃-200℃温度下加热4-8小时而芳香化为式XII化合物。最后，式XII化合物可以通过在惰性溶剂如水或低级醇中在碱金属或碱土金属氢氧化物存在下，在50℃-150℃温度下加热8-30小时而转变成式I化合物。

通式II化合物可以通过在惰性溶剂，如甲醇中，在35℃-150℃的温度范围内与肼反应而环化成为式XIII化合物。

式I化合物可以通过使式XIII化合物与脱氢试剂，如硫、氧、钯、二氧化锰或二氧化铅，任选在一种惰性溶剂，如烃存在下，在15℃-250℃的温度范围内反应来制备。

上述转化反应的特定实例可见于美国专利3843665和3843666。

通过相应的腙的Wolf-Kishner还原反应可以使桥联羰基转化为亚甲基(Mosher，W.A.，Tawfik，E.-Z.，Lipp，D.W.J.Org.Chem.1971，36，3890)。

桥联羰基官能化的其它方法以及特定实例可见于日本专利申请JP 60130521 A2，和B.Loev，美国专利3004983(1960)。

式I化合物可以通过使式XIV化合物与强碱，如正丁基锂在-78℃至25℃的温度范围内反应，随后与式R₂COG(结构XV)化合物反应来制备，其中R₂同前文定义且G代表C_1-6烷氧基。

式IV、VIII、XIV、XV和XVI化合物或者从商业上获得或者通过本领域内技术人员已知的方法制备。

X代表SO、或SO₂的式I化合物可以通过本领域内技术员已知的方法，例如采用适当摩尔当量数的3-氯过苯甲酸氧化X代表S的式I化合物而制备。

X代表式-C＝NOR₇基团的式I化合物可以通过本领域内技术人员已知的方法使X代表羰基的式I化合物，与式H₂NOR₇化合物反应而制备。

R₁＝4-吡啶基的式I化合物可以通过本领域内技术人员已知的方法在吡啶环的2-位进一步官能化，例如，通过吡啶-N-氧化物介导的重排反应。

式I化合物的某些取代基可以通过本领域内技术人员已知的方法相互转化。例如烷氧基取代基可以与适当的醚解离试剂如氢溴酸、三溴化硼或盐酸吡啶反应获得具有羟基取代基的式I化合物。或者，可以使具有羟基取代基的式I化合物烷基化而制备具有烷氧基取代基的式I化合物。羧酸酯取代基可以转变成羧基或酰胺取代基并且羧酸取代基可以转变成羧酸酯或酰胺取代基。硝基取代基可以被还原成胺并且胺可以通过本领域内技术人员已知的方法酰化。

本领域内技术人员能够理解，某些取代基可与上述步骤中所述的某些试剂反应。在此情况下应当采用其它方法或在反应前保护反应性取代基并在反应后去保护。

下列实施例用于解释本发明，其仅为举例而已。各实施例的终产物通过下列一种或多种方法鉴别：高效液相色谱，元素分析，核磁共振谱，红外光谱和高分辨率质谱。下列缩略语被采用

IMS＝工业用甲基化酒精

LCMS＝液相色谱/质谱实施例1

a)将茚满-1-酮(3.3g)、4-甲酰苯甲酸甲酯(5.0g)，哌啶(0.6ml)和冰醋酸(0.5ml)的混合物蒸汽浴加热3小时。所得固体物质在工业用甲基化酒精(200ml)中煮沸然后乘热过滤。所得固体残留物以工业用甲基化酒精洗涤并干燥得到4-(1-氧代亚茚满-2-基甲基)苯甲酸甲酯，m.p.194-198℃。

b)将得自a)的产物(1.5g)混悬于甲醇(10ml)和二氯甲烷(15ml)中并搅拌在0-5℃下，同时先后加入2M氢氧化钠溶液(2.7ml)和30％过氧化氢(100vol.1.1ml)。在0-5℃下搅拌该混合物5分钟，然后在室温下搅拌24小时。将二氯甲烷(100ml)加入到混合物中，然后以盐水(2×50ml)洗涤、干燥、过滤并蒸发得到4-(1-氧代螺[茚满-2，2’-环氧乙烷]-3’-基)苯甲酸甲酯，m.p.160-163℃。水相以5M盐酸酸化并以二氯甲烷萃取获得4-(1-氧代螺[茚满-2，2’-环氧乙烷]-3’-基)苯甲酸，m.p.220℃分解。

c)将得自b)的4-(1-氧代螺[茚满-2，2’-环氧乙烷]-3’-基)苯甲酸(780mg)、甲醇(50ml)、水合肼(0.18ml)和冰醋酸(6滴)沸腾回流24小时。冰浴冷却该混合物并过滤得到4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)苯甲酸，m.p.＞320℃。

d)将得自c)的产物(5.3g)和二氯甲烷(250ml)的混合物在室温下搅拌，然后加入草酰氯(5ml)和无水N，N-二甲基甲酰胺(6滴)，将混合物在室温下搅拌10分钟然后沸腾回流90分钟。减压去溶剂得到粗制酰氯，其直接用于下一步实验。

e)室温下将来自d)的酰氯(3.73g)在二氯甲烷(150ml)中搅拌，然后加入三乙胺(3ml)，再加入4-氨基吡啶(0.9g)。将该混合物在室温搅拌3小时。加入水(150ml)和5M氢氧化钠溶液(50ml)并将混合物在室温搅拌90分钟。过滤该混合物并以二氯甲烷和水洗涤残留物。合并滤液和洗液，分离并干燥二氯甲烷层并蒸发得到固体与起先过滤所得固体混合并通过快速硅胶柱层析，采用二氯甲烷/乙醇(10∶1)洗脱分离得到N-(4-吡啶基)-4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-苯甲酰胺。

f)在室温下，向搅拌的无水四氢呋喃(50ml)中的得自e)的产物(1.9g)的混合物中分批加入氢化锂铝(830mg)。将该混合物沸腾回流1小时。将混合物冷却到0-5℃并加入到乙酸乙酯(70ml)中，然后加入水(70ml)。将混合物搅拌10分钟并过滤得到固体A。分离水相并进一步以乙酸乙酯(100ml)萃取。固体A以乙醇搅拌并过滤。合并乙酸乙酯萃取物和乙醇滤液并蒸干。所得残留物通过快速柱层析纯化采用二氯甲烷/乙醇(10∶1)洗脱得到4-(1，4-二氯茚并[1，2-c]吡唑)-N-(4-吡啶基)苯甲胺，m.p.270-274℃。

实施例2

a)在氮气中，将茚满-1-酮(20.0g)、4-硝基苯甲醛(27.0g)、冰醋酸(3.0g)和哌啶(3.06g)的混合物在95℃下加热3.5小时。将该混合物冷却到20℃并过滤得到固体，使其在工业用甲基化酒精中重结晶得到2-(4-硝基亚苄基)茚满-1-酮。

b)在20℃下用二氯甲烷(100ml)和甲醇(100ml)搅拌得自a)的产物(28.0g)，然后先后加入2M氢氧化钠溶液(50ml)和过氧化氢(20ml，100vol.)。将混合物在20℃下搅拌24小时。加入另外的过氧化氢(10.0ml，100vol.)并将混合物再搅拌24小时。再加入另外的过氧化氢(10ml，100vol.)并将混合物再搅拌64小时。用冰醋酸中和反应混合物并过滤收集形成的固体并干燥得到3’-(4-硝基苯基)-1-氧代螺[茚满-2，2’-环氧乙烷]。

c)使得自b)的产物(10.0g)溶解于甲醇(180ml)中并将水合肼(1.78g)加入到所得溶液中，随后加入冰醋酸(30滴)。将该混合物沸腾回流5小时，然后冷却至20℃并在此温度下静置18小时。过滤收集固体并在丙酮中重结晶得到3-(4-硝基苯基)-1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑，m.p.267-270℃。

d)使得自c)的产物(3.0g)混悬于工业用甲基化酒精(200ml)中并加入5％披钯碳(250mg)，随后加入甲酸铵(2.05g)。搅拌该混合物并在70℃下加热3小时，然后冷却至室温并再过滤。减压浓缩滤液并以二氯甲烷研磨得到4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)苯胺，m.p.253-254℃。

e)使得自d)的产物(1.0g)溶解于二氯甲烷(30ml)中并加入三乙胺(0.62ml)。将该混合物冷却至0℃并在搅拌中加入苯磺酰氯(0.79g)。将该混合物升温至20℃并在此温度下搅拌2小时。再加入三乙胺(0.62ml)和苯磺酰氯(0.79g)并将混合物在室温下搅拌4小时，再令其在室温下静置16小时。先后加入乙醚(80ml)，水(40ml)。过滤收集沉淀的固体，以碳酸氢钠溶液和醚洗涤，然后在60℃下真空干燥。该物质在丙酮中重结晶得到固体，通过快速硅胶柱层析纯化，采用二氯甲烷洗脱得到固体，其被鉴定为4’-(1-苯基-磺酰基(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)N-苯磺酰基苯胺。

f)使得自e)的产物(0.56g)混悬于甲醇(40ml)中并加入2M氢氧化钠溶液(5.3ml)。在20℃下搅拌所得清澈溶液20分钟。将该混合物倒入2M盐酸(75ml)中并通过过滤收集所得固体，以饱和碳酸钠(25ml)和乙酸乙酯(25ml)将所得固体搅拌30分钟，然后过滤得到N-[4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)苯基]苯磺酰胺，m.p.286-288℃。

实施例3

将得自实施例1 d)的酰氯(100mg)、二氯甲烷(5ml)、2-甲氧基乙醇(26μl)和三乙胺(84μl)的混合物在室温下搅拌20小时。该混合物以碳酸氢钠溶液(5ml饱和溶液)搅拌并过滤。蒸发滤液得到的固体用二氯甲烷/工业用甲基化酒精(25∶2)作为流动相通过快速柱层析纯化，得到4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-甲氧基乙基)苯甲酰胺的无色固体。实施例4

使得自实施例1 d)的酰氯(100mg)、二氯甲烷(5ml)、4-硝基苯胺(41mg)和三乙胺(64μl)的混合物在室温下搅拌20小时。该混合物以饱和碳酸氢钠溶液(5ml)搅拌10分钟然后过滤。所得固体先后以二氯甲烷，乙醇洗涤并干燥得到4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(4-硝基苯基)苯甲酰胺的无色固体。

实施例5

a)使得自实施例2 d)的苯胺(6g)溶解于二氯甲烷(200ml)中，然后加入三乙胺(7.4ml)。将该混合物冷却至0℃然后在搅拌中加入氯代乙酰氯(4.2ml)并使混合物升温至20℃。过滤该混合物并将所得固体先后以水洗涤和醚洗涤并干燥得到中间体，其已在吡唑1-位氮和起始苯胺的NH₂位置上被氯代乙酰化。

b)将得自a)的产物(1.4g)、咪唑(0.95g)和四氢呋喃(40ml)在氮气中于90℃下沸腾回流6小时。过滤该混合物并将滤液减压蒸发得到的残留物在乙酸乙酯和2M盐酸之间分配。过滤收集所得固体并干燥得到4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)咪唑-1-基乙酰苯胺二盐酸盐。m.p.264-266℃。

实施例6

在氮气中搅拌下，将得自实施例5产物(0.27g)混悬于四氢呋喃(30ml)中并加入氢化锂铝(87mg)。在20℃下搅拌该混合物18小时。该混合物以饱和硫酸钠(40ml)淬灭并以乙酸乙酯(2×30ml)萃取获得一固体使其溶解于乙醇(3ml)中并加入浓盐酸(10滴)。除去乙醇得到的黄色固体以乙醚研磨得到4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-[2-(咪唑-1-基)乙基]苯胺二盐酸盐，m.p.205-209℃。实施例7

a)将丙酮(70ml)中的4-氰基苯磺酰氯(5.15g)在室温下搅拌，然后在搅拌中逐滴加入2-吗啉乙胺(6.7ml)的丙酮(15ml)溶液。在室温下搅拌该混合物2小时，然后蒸发除去丙酮，残留物用乙酸乙酯在硅胶床上洗脱得到4-氰基-N-2-吗啉基乙基苯磺酰胺。

b)将得自a)的产物(0.65g)和无水甲苯(30ml)在0-5℃下搅拌并在0-5℃下加入氢化二异丁基铝(4.4ml 1.0M的环己烷溶液)。加入后溶液在30分钟内升温至室温，然后沸腾回流30分钟以上并煮沸3小时。冷却该混合物并在10-15℃下加入到5M盐酸(10ml)中。然后将混合物加热至90℃ 10分钟，再冷却并分离出甲苯层。水层以乙酸乙酯洗涤然后，以5M氢氧化钠溶液中和到pH 7-8。该混合物以乙酸乙酯萃取、干燥、过滤并蒸发得到的胶状物在40℃下真空干燥得到固体，其被鉴定为4-甲酰基-N-(2-吗啉乙基)苯磺酰胺，m.p.114-116℃。

c)将得自b)的产物(200mg)、2-溴二氢茚酮(142mg)和无水甲醇(3ml)在0℃下搅拌，并向该混合物中加入甲醇钠(44mg)的甲醇(0.5ml)溶液。将该混合物在0℃下搅拌2小时得到一固体，过滤收集之，以甲醇洗涤并真空干燥得到环氧化物。

d)将得自c)的产物(3.7g)、水合肼(1ml)、冰醋酸(10滴)和乙醇(100ml)沸腾回流26小时并使乙醇通过Soxhlet提取器的分子筛干燥。减压去溶剂并以快速柱层析纯化残留物得到4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-吗啉乙基)苯磺酰胺，m.p.218-220℃。

实施例8

以类似实施例7的方法制备，只是采用2-甲氧基乙胺代替2-吗啉乙胺，所得产物为4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-甲氧基乙基)苯磺酰胺。实施例9

a)茚满-1-酮(3.3g)、4-甲酰基苯甲酸甲酯(5.0g)、哌啶(0.6ml)和冰醋酸(0.5ml)在蒸汽浴上加热3小时。所得固形物质在工业用甲基化酒精(200ml)中加热沸腾并乘热过滤。所得固体残留物以工业用甲基化酒精洗涤并干燥得到4-(1-氧代亚茚满-2-基甲基)苯甲酸甲酯，m.p.194-198℃。

b)将得自a)的产物(1.5g)混悬于甲醇(10ml)和二氯甲烷(15ml)中并在0-5℃下搅拌期间先后加入2M氢氧化钠溶液(2.7ml)和30％过氧化氢(100vol.1.1ml)。在0-5℃下搅拌该混合物5分钟，然后在室温下搅拌24小时。将二氯甲烷(100ml)加入到混合物中，然后以盐水(2×50ml)洗涤，干燥、过滤并蒸发得到4-(1-氧代螺[茚满-2，2’-环氧乙烷]-3’-基)苯甲酸甲酯，m.p.160-163℃。水相以5M盐酸酸化并以二氯甲烷萃取得到4-(1-氧代螺[茚满-2，2’-环氧乙烷]-3’-基)苯甲酸，m.p.220℃下降解。

c)将4-(1-氧代螺[茚满-2，2’-环氧乙烷]-3’-基)苯甲酸甲酯(750mg)、甲醇(30ml)和水合肼(0.16ml)的混合物在室温下搅拌，同时加入冰醋酸(6滴)。将该混合物沸腾回流24小时然后令其在室温下静置24小时，然后冷却至0℃并过滤得到4-(1，4-.二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)苯甲酸甲酯，m.p.224-226℃。

d)使得自c)的酯(2.20g)和N，N-二乙基乙二胺(7ml)沸腾回流4.5小时。使该混合物冷却至室温，然后加入沸点为40-60℃的石油醚(50ml)。过滤混合物得到酰胺。

e)使此酰胺(2.75g)混悬于四氢呋喃(80ml)中并在室温下氮气中搅拌下加入氢化锂铝(1.14g)。将混合物搅拌3.5小时，然后再加入氢化锂铝(1.14g)和四氢呋喃(40ml)。22.5小时后加入第三份氢化锂铝然后将该混合物搅拌24小时。使该混合物沸腾回流2.5小时，然后在室温下静置过夜。该混合物在氮气中冰浴下冷却期间先后加入乙酸乙酯(100ml)，和水(100ml)，分离有机层，洗涤、干燥并蒸发得到油，使其在快速硅胶柱上以乙酸乙酯/乙醇/三乙胺(7∶2∶1)纯化。合并合适的流分并蒸发得到胶状物(0.85g)，使其加温溶解于乙醇(5ml)中并向该溶液中加入浓盐酸(0.6ml)。减压蒸发该混合物并将残留的胶状固体以乙醇(10ml)煮沸，然后以冰浴冷却并过滤得到N-[2-(N，N-二乙胺基)乙基]-4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)苄胺三盐酸盐，m.p.225℃。

实施例10

本实施例化合物以类似实施例7的方法制备，仅其采用N’，N-二乙氨基乙胺代替2-吗啉乙胺。所得化合物为N-[2-(N，N-二乙氨基)乙基]-4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)苯磺酰胺二盐酸盐，m.p.192-196℃。

实施例11

本实施例化合物以类似实施例9的方法制备，但用2-吗啉乙胺代替N，N-二乙基乙二胺。所得产物为4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-吗啉乙基)苄胺二盐酸盐，m.p.266-269℃(分解)。

实施例12

此以类似实施例1的方法制备，但用4-乙氧基-苯胺代替2-甲氧基乙胺。所得化合物为N-(4-乙氧基苯基)-4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)苄胺，m.p.180℃(分解)。

实施例13

此以类似实施例9d)的方法制备，但用(S)-(+)-2-(氨甲基)吡咯烷代替N，N-二乙基乙二胺。所得化合物为(S)-4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(吡咯烷-2-基甲基)-苯甲酰胺二盐酸盐，m.p.222-226℃(分解)。实施例14

a)搅拌中将硫代水杨酸甲酯(9.89ml)加入到甲醇钠(11.6g)的乙醇溶液(100ml)中。15分钟后加入4’-溴苯甲酰甲基溴(20.0g)的乙醇(100ml)溶液并将混合物搅拌和沸腾回流18小时。冷却该混合物并以10％盐酸(150ml)酸化。收集固体并直接用于下一步实验。

b)将得自a)的产物(18.0g)在乙醇(150ml)中在含4分子筛的Soxhlet提取器套管填充的烧瓶中搅拌并沸腾回流。先后加入1滴冰醋酸和水合肼(3.9ml)并使该混合物沸腾并在回流条件下搅拌64小时。冷却该混合物和收集沉淀并直接用于下一步实验。

c)将得自b)的产物(4.0g)溶解于四氢呋喃(200ml)并在0℃下氮气中逐滴搅拌加入到氢化钾(1.53g)的四氢呋喃(100ml)的搅拌混悬液中。加入后，将混合物搅拌15分钟然后冷却到-78℃。逐滴加入叔丁基锂(17.0ml的1.5M戊烷溶液)并在此温度下搅拌45分钟后加入二甲基甲酰胺(4.7ml)。在-78℃的温度下保持一小时，然后令反应混合物缓慢升温至室温。小心加入1M盐酸(200ml)淬灭该混合物。分离有机层，以水、饱和碳酸氢盐、盐水洗涤，然后干燥、过滤和蒸发得到红色蜡状固体，将其以快速硅胶柱层析纯化，用含20％乙酸乙酯的石油醚为移动相沸点为260-280℃，得到3-(4-甲酰苯基)-1H-[1]苯并噻吩并[3，2-c]吡唑，m.p.261-263℃。

d)将得自c)的产物(100mg)、3-(1-咪唑基)丙胺(58mg)的含冰醋酸(0.03ml)的1，2-二氯乙烷溶液在室温下搅拌1小时。加入三乙氧基硼氢化钠(84mg)并将该混合物在室温下搅拌16小时。加入另外的三乙氧基硼氢化钠(90mg)并将混合物在室温下搅拌24小时。将该混合物倒入搅拌的饱和碳酸氢钠水溶液(约20ml)中。分离有机层并以二氯甲烷萃取水层。合并的有机层和萃取液以水洗涤、干燥并减压蒸发得到固体使其溶解于乙醇(15ml)并加入2滴浓盐酸。减压浓缩该溶液得到的固体以二乙醚研磨、过滤并干燥得到4-(1H-[1]苯并噻吩并[3，2-c]吡唑-3-基)-N-[3-(咪唑-1-基)丙基]苯甲酰胺三盐酸盐，m.p.206-208℃(分解)。

实施例15

该实施例化合物的制备是以类似实施例14的方法，通过使3-(4-甲酰苯基)-1H-[1]苯并噻吩并[3，2-c]吡唑与2-吗啉乙胺反应获得4-(1H-[1]苯并噻吩并[3，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-吗啉乙基)苄胺三盐酸盐，m.p.270-272℃。

实施例A

下列描述是说明本发明化合物在制备药用组合物中的用途。在此描述中术语“活性化合物”是指任何本发明化合物，特别是前述实施例之一的终产物的任何化合物。

a)胶囊

在胶囊制备中，将10份重量的活性化合物和240份重量的乳糖分散并混合。将该混合物填充到硬明胶胶囊中，每粒胶囊含有1个单位剂量或部分单位剂量的活性化合物。

b)片剂

以下列成份制备片剂。

重量份

活性化合物 10

乳糖 190

玉米淀粉 22

聚乙烯吡咯烷酮 10

硬脂酸镁 3

将活性化合物、乳糖和部分淀粉分散、混合并将所得混合物以聚乙烯吡咯烷酮的乙醇溶液制粒。将干燥颗粒与硬脂酸镁及剩余淀粉混合。然后在压片机中将该混合物压片得到每片含有一个单位剂量或单位剂量一部分的活性化合物的片剂。

c)肠溶包衣片

以上述(b)中描述的方法制备片剂。采用20％邻苯二甲酸醋酸纤维素和3％邻苯二甲酸二乙脂的乙醇：二氯甲烷(1∶1)溶液以常规方法对片剂进行肠溶包衣。

d)栓剂

在栓剂制备中，将100份重量的活性化合物与1300份重量的甘油三酯栓剂基质合并并混合形成每粒含治疗有效量的活性成份的栓剂。等效性

尽管本发明已经以其优选实施方案进行特别说明和描述，本领域技术人员应当懂得在不背离附属权利要求书定义的本发明的精神和范围下可以进行多种形式上的改变和细化。本领域内技术人员能够仅以常规经验识别或可以界定，与本说明书特别描述的本发明特定实施方案等价的诸多方案。这些等价方案包括在权利要求的范围之内。

Claims

1.式I化合物

及其药学上可接受的盐，其中

L₁代表式(E)s(CH₂)q基团，其中E代表NR₂4、O或S，s是0或1且q是0至6的整数，条件是当s是1时q至少是1，其中亚烷基链任选被一个或多个下列取代基取代：任选被一个或多个羟基、卤素或任选取代的氨基取代的C_1-6烷基；任选被一个或多个羟基、卤素或任选取代的氨基取代的C_1-6烷氧基；羟基；卤素；或任选取代的氨基；

A代表CONH、NHCO、SO₂NH、NHSO₂、或NR₂₅；

L₂代表式(CH₂)r基团，其中r是0至6的整数，其中亚烷基链任选被一个或多个下列取代基取代：任选被一个或多个羟基、卤素或任选取代的氨基取代的C_1-6烷基；任选被一个或多个羟基、卤素或任选取代的氨基取代的C_1-6烷氧基；羟基；卤素；或任选取代的氨基；

R₂代表任选被一个或多个下列取代基取代的C_1-6烷基：卤素、羟基、C_1-6烷氧基或任选取代的氨基；任选被一个或多个下列取代基取代的C_1-6烷氧基：卤素、羟基、C_1-6烷氧基或任选取代的氨基；或R₂是卤素、羟基、氰基、硝基、氨基甲酰基、C_1-6链烷酰基、(C_1-6烷氧基)羰基或任选取代的氨基；

n代表0、1、2或3；

X代表a)取代的亚甲基，b)羰基，c)氧，d)式C＝NOR₇基团，其中R₇代表H或C_1-4烷基，e)式NR₈基团，其中R₈代表H、任选取代的C_1-4烷基或任选取代的苯基，f)式(CH₂)n基团，其中n是1、2或3，或g)式S(O)p基团，其中p是0、1或2；

R₃、R₄、R₅和R₆独立地代表a)H，b)卤素，c)任选被一个或多个下列取代基取代的C_1-6烷基：羟基、C_1-6烷氧基、卤素或任选取代的氨基，d)任选被一个或多个下列取代基取代的C_1-6烷氧基：羟基；C_1-6烷氧基；卤素；或任选取代的氨基，条件是这些基团不是结合在烷氧基的氧原子结合的碳原子上；e)任选取代的苯氧基，f)羟基，g)式CORa基团，其中Ra代表羟基、C_1-6烷氧基或Ra代表任选取代的氨基，h)任选取代的氨基，i)C_1-6链烷酰基，j)硝基，k)任选取代的苯基C_1-6烷基，l)任选取代的苯基C_1-6烷氧基，m)氰基，或o)C_2-4链烯基或C_2-4链炔基，其中的每一个任选被苯基取代，而后者任选被一个或多个下列基团取代：C_1-6烷基，C_1-6烷氧基或卤素；

并且

1)当A是SO₂NH或NHSO₂时

R₁代表a)任选取代的苯基，b)任选取代的杂芳基，c)含氮原子的五、六或七元饱和杂环，其任选含有选自O、S或N的另外的杂原子并任选被C_1-6烷基取代，其中所述饱和环可以通过碳或杂原子连接，d)任选取代的氨基或e)C_1-6烷氧基；

2)当A代表CONH或NHCO时

R₁代表a)被硝基或一个或多个C_1-6烷氧基取代的苯基，所述烷氧基任选被一个或多个下列基团取代：卤素、羟基、C_1-6烷氧基或任选取代的氨基，b)任选取代的杂芳基或c)含氮原子的五、六或七元饱和杂环，其任选另含选自O、S或N的杂原子并且任选被C_1-6烷基取代，其中所述饱和环可以通过碳原子连接或d)C_1-6烷氧基；

3)当A代表NR₂₅基团且q至少是1时，则

R₁代表a)任选取代的苯基，b)任选取代的杂芳基或c)任选取代的氨基；以及

4)当A代表NR₂₅基团并且q是0和s是0时，则R₁代表任选取代的杂芳基；

R₂₄和R₂₅独立地代表H；C_1-6烷基，其任选被一个或多个下列基团取代：羟基、C_1-6烷氧基、卤素或任选取代的氨基；C_1-6链烷酰基或C_1-6烷基磺酰基；条件是两杂原子不连接于同一个sp3杂化碳原子。

2.根据权利要求1的化合物，其中X是CH₂或S。

3.根据权利要求1的化合物，其中X是CH₂且A是NR₂₅。

4.根据权利要求1的化合物，其中X是S且A是NR₂₅。

5.根据权利要求1的化合物，其中X是CH₂且A是HNSO₂。

6.根据权利要求1的化合物，其中X是CH₂且A是SO₂NH。

7.根据权利要求1的化合物，其中X是CH₂且A是CONH。

8.根据权利要求1的化合物，其中X是CH₂且A是HNCO。

9.根据权利要求1的化合物，其中X是CH₂，A是NR₂₅、L₁是(CH₂)q，其中q是1-6的整数并且烷基链任选被一个或多个下列取代基取代：任选被一个或多个羟基、卤素或任选取代的氨基取代的C_1-6烷基；任选被一个或多个羟基、卤素或任选取代的氨基取代的C_1-6烷氧基；羟基；卤素；或任选取代的氨基；L₂是键且R₁是任选取代的吡啶基。

10.一种化合物，它选自：

4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑)-N-(4-吡啶基)苄胺

N-[4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)苯基]苯磺酰胺

4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-甲氧基乙基)苯甲酰胺

4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(4-硝基苯基)苯甲酰胺

4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)咪唑-1-基乙酰苯胺

4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-[2-(咪唑-1-基)乙基]苯胺

4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-吗啉乙基)苯磺酰胺

4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-甲氧基乙基)苯磺酰胺

N-[2-(N，N-二乙基氨基)乙基]-4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)苄胺

N-[2-(N，N-二乙基氨基)乙基]-4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)苯磺酰胺

4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-吗啉乙基)苄胺

N-(4-乙氧基苯基)-4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)苄胺

(S)-4-(1，4-二氢茚并[1，2-c]吡唑-3-基)-N-(吡咯烷-2-基甲基)苯甲酰胺

4-(1H-[1]苯并噻吩并[3，2-c]吡唑-3-基)-N-[3-(咪唑-1-基)丙基]苄胺

4-(1H-[1]苯并噻吩并[3，2-c]吡唑-3-基)-N-(2-吗啉基乙基)苄胺

及其药学上可接受的盐，包括单一的对映体以及对映体的混合物。

11.一种药用组合物，其包括权利要求1定义的式I化合物与药学上可接受的稀释剂或载体。

12.权利要求1定义的式I化合物作为药物的用途。

13.权利要求1定义的式I化合物作为抑制蛋白激酶活性药物的用途。

14.权利要求1定义的式I化合物在用于抑制蛋白激酶活性的药物制备中的用途。

15.一种抑制蛋白激酶活性的方法，该方法包括对所述激酶给予足够抑制所述激酶的酶活性的浓度的式I化合物。

16.权利要求15的方法，其中所述蛋白激酶是酪氨酸激酶。

17.权利要求16的方法，其中所述酪氨酸激酶是受体酪氨酸激酶或非受体酪氨酸激酶。

18.权利要求17的方法，其中所述酪氨酸激酶选自包括KDR、flt-1、TIE-2、Lck、Src、fyn和yes。

19.权利要求15的方法，其中所述酪氨酸激酶活性影响血管生成。

20.权利要求19的方法，其中所述酪氨酸激酶的抑制是抗血管生成。

21.权利要求20的方法，其中所述酪氨酸激酶的所述抑制作用抑制选自下列一组疾病的病情发展：癌症、关节炎、动脉粥样硬化、牛皮癣、血管瘤、心肌血管生成、冠脉及脑血管侧枝形成、缺血性肢端血管生成、角膜病、潮红、新血管性青光眼、黄斑变性、伤口愈合、消化性溃疡、螺杆菌相关性疾病、骨折、糖尿病性视网膜病和猫抓热。

22.权利要求16的方法，其中所述酪氨酸激酶活性引起血管通透性过高或水肿形成。

23.权利要求22的方法，其中所述酪氨酸激酶的抑制是抗水肿的。

24.权利要求23的方法，其中所述酪氨酸激酶的抑制作用抑制选自下列一组疾病病情的发展：烧伤、慢性肺病、中风、息肉、牛皮癣、过敏性炎症、黄斑变性、糖尿病性视网膜病、卵巢过度刺激综合征和脑肿瘤相关性脑水肿。

25.权利要求16的方法，其中所述酪氨酸激酶的抑制具有抗肿瘤作用。

26.权利要求16的方法，其中所述酪氨酸活性的抑制作用与抗生育或堕胎作用相关。

27.权利要求15的方法，其中所述蛋白激酶是丝氨酸激酶。

28.权利要求15的方法，其中所述蛋白激酶是苏氨酸激酶。

29.权利要求16的方法，其中所述酪氨酸激酶是KDR。

30.与说明书描述相同的制备方法。