CN120058818A - 一种有机化合物dimorine A的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种有机化合物dimorine A的制备方法及应用，涉及有机化合物技术领域。该有机化合物dimorine A的制备方法，具体包括以下步骤：S1.洗脱浸膏；S2.梯度洗脱；S3.收集分组；S4.进一步分离；S5.甲醇洗脱；S6.点板分析；S7.纯化洗脱；S8.收集目标化合物。本发明通过对不同提取溶剂的对比试验，最终选择乙酸乙酯作为最佳提取溶剂，能够高效分离纯化目标化合物，显著提高了纯度和收率，乙酸乙酯提取的浸膏极性适中，适合分离挖掘新颖骨架化合物，且大米发酵35天的菌株次生代谢产物更为丰富，提高了化合物的生物活性，该方法操作简便，实验周期短，成本低，检测灵敏度高，具有显著的环境和经济效益，适合大规模生产和应用。

Description

一种有机化合物dimorine A的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及有机化合物技术领域，具体为一种有机化合物dimorine A的制备方法及应用。

背景技术

有机化合物是由碳原子和氢原子通过共价键连接而成的化合物，通常还包含其他元素如氧、氮、硫等。这类化合物在自然界中广泛存在，从简单的分子如甲烷、乙醇到复杂的生物大分子如蛋白质和核酸。有机化合物在医药、农业、材料科学等多个领域都有着重要的应用，尤其是具有特定生物活性的有机化合物，常常作为药物或农药的先导化合物进行研究和开发。

现有的有机化合物dimorine A主要通过从内生真菌中提取分离得到。具体的方法包括使用大孔树脂洗脱液进行初步提取，然后通过反相色谱柱和凝胶柱色谱等方法进行多步骤的分离纯化。虽然这种方法可以成功地分离出dimorine A，但存在一些明显的缺点。首先，分离纯化过程复杂，需要多步操作，导致实验周期长、操作成本高。其次，现有方法的收率较低，难以大规模生产。最后，化合物dimorine A的纯度和检测灵敏度存在提升空间，这限制了其在实际应用中的效果和可靠性。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种有机化合物dimorine A的制备方法及应用，解决了现有的有机化合物dimorine A制备方式存在周期较长，成本较高，纯度较低的问题。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种有机化合物dimorineA的制备方法，具体包括以下步骤：

S1.洗脱浸膏

将二型伞霉发酵后提取的总浸膏用大孔树脂洗脱，将60%甲醇-水洗脱液洗脱部分减压浓缩至干，得到浸膏；

S2.梯度洗脱

用反相色谱柱对浸膏进行分离，以甲醇-水混合溶剂作为洗脱剂，设置洗脱梯度分别为30%，35%，40%，45%，50%，60%;

S3.收集分组

收集分离出的多个级分组分（A-K）；

S4.进一步分离

针对收集到的含有目标化合物可能性较高的级分（H组分）进行进一步分离，使用LH-20凝胶柱色谱分离；

S5.甲醇洗脱

以甲醇作为洗脱剂，从LH-20凝胶柱得到多个亚级分组分（H-1至H-6）；

S6.点板分析

通过TLC点板分析确定含有目标化合物dimorine A的亚级分（H-3）；

S7.纯化洗脱

使用半制备高效液相色谱Pre-HPLC对待纯化亚级分进行纯化，洗脱剂为乙腈：水=20:80，洗脱梯度为等度洗脱，洗脱流速为3.0mL/min;

S8.收集目标化合物

检测波长为210nm和254nm，在保留时间8min时收集目标化合物dimorine A，获得纯化后的化合物，化合物dimorine A的结构表征见表1和图2-图12，其中表1包括1H NMR(500MHz）和13C NMR(126MHz）数据，化合物dimorine A的结构表征数据，以1H NMR(500MHz）和13C NMR(126MHz）数据为例。

优选的，所述洗脱梯度中的溶剂比例可调整以优化化合物的分离效果。

优选的，所述目标化合物是由二型伞霉产生的化合物2,4-二羟基-3,5,6-三甲基苯甲酸中的-COOH（羧基）与同型半胱氨酸中的-HS（巯基）发生酰化反应脱去分子H₂O，通过菌株生物合成得到。

优选的，所述反相色谱柱分离过程可以采用不同比例的有机相与水相组合的洗脱液，以适应不同样品的具体情况。

优选的，所述化合物dimorine A的纯化还可以通过改变洗脱剂的比例、流速条件进一步优化。

优选的，所述dimorine A衍生物为理论上可接受的具有相似骨架结构的同型半胱氨酸类型化合物。

一种有机化合物 dimorine A制备方法获得的dimorine A及其衍生物在抑制植物病原真菌方面的应用。

本发明提供了一种有机化合物dimorine A的制备方法及应用。具备以下有益效果：

本发明提供了一种有机化合物dimorine A的制备方法及应用，本发明的方法通过从内生真菌中提取分离，得到了一种由二型伞霉产生的化合物2,4-二羟基-3,5,6-三甲基苯甲酸中的-COOH（羧基）与同型半胱氨酸中的-HS（巯基）发生酰化反应脱去一分子H₂O，通过菌株生物合成而形成的化合物dimorine A，这种方法相对于现有的化学合成法，内生真菌发酵产生次生代谢产物的方法对环境污染小，符合可持续发展的要求，发明的提取和纯化步骤相对简单，大幅缩短了实验周期，减少了操作成本，通过优化反相色谱柱和LH-20凝胶柱色谱的分离条件，本发明能够高效地分离纯化目标化合物dimorine A，显著提高了纯度和收率，本发明采用的TLC点板和半制备高效液相色谱技术，能够准确地检测和纯化出目标化合物，特别是在保留时间8min时，使用210nm和254nm的检测波长，确保了检测的高灵敏度，化合物dimorine A对多种植物病原真菌具有显著的抑制活性，尤其是对尖孢镰孢、灰葡萄孢和采绒革盖菌，MICs分别为31.25-15.63μg/mL和15.63-7.82μg/mL。这一发现为开发新型抗真菌剂提供了重要的理论基础和实践依据，本发明的制备方法不仅在环境友好性和操作简便性方面优于现有技术，而且在纯度、收率和检测灵敏度方面也表现出显著的优势，使得化合物dimorine A在农业上的应用前景更为广阔。

附图说明

图1为本发明的化合物dimorine A制备方法和应用技术路线图；

图2为本发明的化合物dimorine A在甲醇中的¹H NMR图；

图3为本发明的化合物dimorine A在甲醇中的¹³C NMR图；

图4为本发明的化合物dimorine A在甲醇中的DEPT图；

图5为本发明的化合物dimorine A在甲醇中的¹H-¹H COSY图；

图6为本发明的化合物dimorine A在甲醇中的HSQC图；

图7为本发明的化合物dimorine A在甲醇中的HMBC图；

图8为本发明的化合物dimorine A在甲醇中的NOESY谱图；

图9为本发明的化合物dimorine A在甲醇中的HR-TOF-ESI-MS图；

图10为本发明的化合物dimorine A在甲醇中的UV图；

图11为本发明的化合物dimorine A在甲醇中的IR图；

图12为本发明的化合物dimorine A的旋光光谱图；

图13为本发明的大米发酵28天和35提取物TLC分析图；

图14为本发明的替代方案技术路线图；

图15为本发明同型半胱氨酸类化合物和理论上可接受衍生物的分子结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1-15所示，本发明实施例提供一种有机化合物dimorine A的制备方法及应用，具体的为：

原料来源

实验所用的内生真菌二型伞霉（Umbelopsis dimorpha）菌株于2016年10月采自某县樟叶越橘健康植物根部组织分离得到，超低温（-80℃）冷冻保存于某大学西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室。

二型伞霉菌株活化和扩代

将二型伞霉菌种从-80℃的超低温冰箱中取出，放置于4℃冰箱解冻6h，在超净工作台无菌环境下将菌株接种到马铃薯蔗糖琼脂（PSA）培养基上，在28℃下恒温培养14天。待菌丝长满PSA培养基后，使用打孔器对PSA上的菌株进行打孔处理，得到直径为5mm的菌块，将菌块接在PSA培养基上进行扩代培养得到二代菌株。

二型伞霉菌株大米规模发酵培养与提取

将培养好的二代菌株按上述打孔处理方法进行打孔，然后将菌块转移至300个500mL发酵瓶中，每个发酵瓶放置五个菌块，每个发酵瓶中有50g大米和50mL水，在接入菌块前，将发酵瓶放入高压灭菌锅中煮熟并灭菌处理，然后将其在室温下培养35天，然后用等体积的乙酸乙酯提取4次，并在50℃下减压浓缩得到浸膏（244.47g）。将浸膏用D101大孔树脂吸附，分别用纯水，30%, 60%, 90%甲醇-水混合溶液对提取的浸膏进行梯度洗脱，将浸膏分成三个不同极性的大段，便于后续分离纯化。

dimorine A的分离纯化流程：

① 将60%甲醇-水洗脱液减压浓缩得到6.5g浸膏，然后用ODSC₁₈反相色谱柱进行柱层析分离，以甲醇：水为流动相进行梯度洗脱，洗脱梯度依次为甲醇：水=30:70，35:65，40:60，45:55，50:50，60:40，洗脱得到11个级分（A-K）。

② 将上述11个级分中的H段组分（225mg）用LH-20凝胶色谱柱分离，洗脱剂为甲醇，得到6个亚级分（H-1, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6），将H-3经半制备高效液相色谱分离，用乙腈：水=20:80等度洗脱，洗脱流速为3.0 mL/min，检测波长为210nm和254nm，在保留时间为8min时，分离纯化得到7.3mg化合物dimorine A。化合物dimorine A制备和应用技术路线如图1所示。

实验例1

(1）将大孔树脂洗脱的60%甲醇-水洗脱液减压浓缩得到6.5g浸膏，将浸膏用反相色谱柱进行分离，得到11个级分组分（A-K），洗脱剂用甲醇-水混合溶剂，洗脱梯度分别为30%，35%，40%，45%，50%，60%。然后对反相住洗脱得到的A-K段的组分进行进一步的分离和纯化。

实验例2

(2）将11个级分中的H组分（225mg）进行LH-20凝胶柱分离，洗脱剂为甲醇，得到6个亚级分组分（H-1, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6）。进一步对H-1至H-6不同段的组分进行分离纯化，经过TLC点板后发现，目标化合物dimorine A位于H-3中，因此，选择用半制备高效液相色谱分离，洗脱剂为乙腈：水=20:80，洗脱梯度为等度洗脱，洗脱流速为3.0 mL/min，检测波长为210nm和254nm，在保留时间8min时纯化得到目标化合物dimorine A，质量为7.3mg，化合物dimorineA结构表征见表1和图2-图12。

实验例3

(3）将化合物dimorine A采用96孔板微量双倍稀释法，以噻菌灵和多菌灵为阳性对照，等浓度的二甲基亚砜溶液为阴性对照，测定了化合物dimorine A对五种植物病原菌抑菌活性。五种植物病原真菌分别为Alternaria brassicola（芸苔链格孢）、Fusariumgraminearum (禾谷镰孢）、F. oxysporum (尖孢镰孢）、Botrytis cinerea（灰葡萄孢）和Coriolus versicolor（采绒革盖菌）。在28℃下培养48小时后，观察化合物的最低抑菌浓度（MIC）。化合物dimorine A对五种植物病原真菌具有一定的抑制活性。其中，对尖孢镰孢和灰葡萄孢有中等程度的抑制作用，MICs为31.25-15.63 μg/mL；对采绒革盖菌有一定的抑制作用，MICs为15.63-7.82 μg/mL，详见表2。

表1 化合物dimorineA在CD₃OD中的¹H (500 MHz）和¹³C NMR (126 MHz）数据

表2 化合物dimorine A对五种植物病原真菌抑制活性

以对照试验作为比较例，如反应温度为20-50℃，可提供20-50范围外的反应温度对应的试验方案

比较例1：（1）二型伞霉菌株大米规模发酵培养与提取部分中，大米规模发酵完成后，石油醚、乙酸乙发酵物进行4次提取。以二氯甲烷：甲醇=10:1为展开剂，经过TLC点板后分析发现，石油醚提取的化合物极性偏小，与大部分新骨架化合物的极性相差较大，因此，不适合用于分离纯化骨架新颖的化合物。

比较例2：（2）二型伞霉菌株大米规模发酵培养与提取部分中，大米规模发酵完成后，用工业级别己酸乙酯对发酵物进行4次提取。以二氯甲烷：甲醇=10:1为展开剂，经过TLC点板后分析发现，乙酸乙酯提取的浸膏和已报道的大部分活性先导化合物极性较接近，因此，乙酸乙酯提取的浸膏在新骨架化合物的分离的挖掘有更大的潜力。

比较例3：二型伞霉菌株大米规模发酵培养与提取部分，大米规模发酵完成后，用工业级别甲醇对发酵物进行4次提取。以二氯甲烷：甲醇=10:1为展开剂，经过TLC点板后分析发现，甲醇提取的浸膏极性偏大，挖掘新颖骨架化合物的可能性较小。因此，甲醇提取的浸膏相较于乙酸乙酯提取的浸膏没有太大的潜力。

比较例4：（4）根据上述分析，最终选择使用乙酸乙酯作为溶剂对发酵完成的大米进行提取。比较了大米发酵提取物第28天和第35天次生代谢产物的产生情况，对两个不同时间段的大米用乙酸乙酯进行提取，通过TLC点板后分析后发现，大米发酵35天的菌株次生代谢产物相较于发酵28天的更为丰富，如图13所示。

图15中同型半胱氨酸类化合物和理论上可接受的衍生物，具有式I和II所示的结构中的任意一种。

当R₁为OH，R₂为A时或R₁为A，R₂为OH为时，记为式II-1；

当R₁为OH，R₂为B时或R₁为B，R₂为OH为时，记为式II-2；

当R₁为OH，R₂为C时或R₁为C，R₂为OH为时，记为式II-3；

当R₁为OH，R₂为D时或R₁为D，R₂为OH为时，记为式II-4；

当R₁为OH，R₂为E时或R₁为E，R₂为OH为时，记为式II-5；

当R₁为OH，R₂为时OAc或R₁为OAc，R₂为OH为时，记为式II-6；

当R₁为OAc，R₂为OAc时，记为式II-7。

技术方案中，对内生真菌二型伞霉菌株进行了规模化的大米发酵，可将大米发酵改为马铃薯蔗糖（PSB）液体培养基发酵。和大米固体发酵一样，PSB液体培养基发酵也可以给内生真菌的生长发育提供营养元素，可以作为另外一种发酵方式来获得化合物dimorineA。在使用乙酸乙酯提取前，可以先用石油醚提取4次，该操作可以将发酵物中的脂肪酸先提取出来，然后再用乙酸乙酯继续提取，便于后续目标化合物的分离和纯化，节约实验成本和分离纯化的时间。

生物农药主要指由动物、植物、微生物等天然生物资源产生的次生代谢产物开发而成的农用制剂。本研究提出了一种由植物内生真菌产生的骨架新颖，且有较好抑菌活性的化合物dimorine A。近年来，由微生物的代谢物作为生物农药的发展十分迅速，占生物农药总量的90%左右，具有安全低毒、易降解、无残留、特异性强、不易产生抗药性等特点。据统计，从内生真菌中发现新活性化合物的比例为51%，远远超过土壤微生物38%的比例，其分子骨架类型多、变化大，具有丰富的结构多样性，可以从中筛选得到许多结构新颖的活性先导化合物，具有巨大的研究开发利用潜力，是解决农业病害的有效途径之一。

樟叶越橘（Vaccinium dunalianum Wight）属杜鹃花科越橘属植物，主产于云南、四川、贵州省和西藏自治区，自明代开始其幼嫩芽叶经干燥后作为一种茶饮用至今，具有一定的药用价值。二型伞霉是从樟叶越橘根部分离出的优势菌株。目前关于菌株二型伞霉的研究主要集中在促进宿主植物生长、提高其抗旱能力，产生与宿主相同或相似的成分、转化宿主主要成分的能力，其次生代谢产物的研究较少，开发比较新颖的化合物阻止农业病虫害的生物农药具有重要的意义。

本发明的制备方法首次得到了一种由苯系物和氨基酸结合的稀有骨架的化合物dimorine A，该化合物由2,4-二羟基-3,5,6-三甲基苯甲酸中的-COOH（羧基）与同型半胱氨酸中-HS（巯基）发生酰化反应脱去一分子H₂O得到，并且提出了几种理论上可接受的同型半胱氨酸结构类型的化合物。化合物dimorine A的骨架在先前的研究中鲜有报道。由此推断，内生真菌产生的次生代谢产物有较大的潜力，筛选得到更多结构新颖的活性先导化合物，具有巨大的研究开发利用潜力，有望成为解决农业病害的有效途径之一。抑菌活性测试发现，化合物dimorine A对五种植物病原真菌具有抑制活性。其中，对尖孢镰孢和灰葡萄孢有中等程度的抑制作用，抑制率（MICs）为31.25-15.63 μg/mL；对采绒革盖菌有一定的抑制作用，MICs为15.63-7.82 μg/mL，因此，此类骨架新颖的化合物有望成为廉价易得、对环境友好的生物农药。化合物dimorine A的发现填补了同型半胱氨酸苯系化合物的空白，为生物农药的开发提供了非常有价值的参考。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种有机化合物dimorine A的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

S1.洗脱浸膏

将二型伞霉发酵后提取的总浸膏用大孔树脂洗脱，将60%甲醇-水洗脱液洗脱部分减压浓缩至干，得到浸膏；

S2.梯度洗脱

用反相色谱柱对浸膏进行分离，以甲醇-水混合溶剂作为洗脱剂，设置洗脱梯度分别为30%，35%，40%，45%，50%，60%;

S3.收集分组

收集分离出的多个级分组分，A-K；

S4.进一步分离

针对收集到的含有目标化合物可能性较高的级分，H组分，进行进一步分离，使用LH-20凝胶柱色谱分离；

S5.甲醇洗脱

以甲醇作为洗脱剂，从LH-20凝胶柱得到多个亚级分组分，H-1至H-6；

S6.点板分析

通过TLC点板分析确定含有目标化合物dimorine A的亚级分，H-3；

S7.纯化洗脱

使用半制备高效液相色谱Pre-HPLC对待纯化亚级分进行纯化，洗脱剂为乙腈：水=20:80，洗脱梯度为等度洗脱，洗脱流速为3.0mL/min;

S8.收集目标化合物

检测波长为210nm和254nm，在保留时间8min时收集目标化合物dimorine A，获得纯化后的化合物。

2.根据权利要求1所述的一种有机化合物dimorine A的制备方法，其特征在于：所述洗脱梯度中的溶剂比例可调整。

3.根据权利要求1所述的一种有机化合物dimorine A的制备方法，其特征在于：所述目标化合物是由二型伞霉产生的化合物2,4-二羟基-3,5,6-三甲基苯甲酸中的-COOH羧基与同型半胱氨酸中的-HS巯基发生酰化反应脱去分子H₂O，在菌株内通过生物合成得到。

4.根据权利要求1所述的一种有机化合物dimorine A的制备方法，其特征在于：所述反相色谱柱分离过程采用不同比例的有机相与水相组合的洗脱液。

5.根据权利要求1所述的一种有机化合物dimorine A的制备方法，其特征在于：所述化合物dimorine A的纯化通过改变洗脱剂的比例、流速条件进一步优化。

6.根据权利要求1所述的一种有机化合物dimorine A的制备方法，其特征在于：所述dimorine A衍生物为理论上可接受的具有相似骨架结构的同型半胱氨酸类型化合物。

7.根据权利要求1-6任意一项所述的一种有机化合物 dimorine A制备方法获得的dimorine A及其衍生物在抑制植物病原真菌方面的应用。