CN107177659A - 一种发酵法生产赤霉素a7的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵法生产赤霉素A7的方法，利用赤霉素A4发酵生产用菌种通过改变培养基组成、发酵工艺控制，代谢途径向积累赤霉素A7转变，赤霉素A7发酵水平达到1039mg/L，特别的，赤霉素A7占赤霉素A4+7混合物的90％以上，所述菌种于2015年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO.11101，分类命名为：藤仓镰刀菌，菌种拉丁学名为：Fusarium fujikuroi。本发明中根据赤霉素A4与赤霉素A7转化机制，通过改变培养基组成及工艺条件，使其代谢途径由累积赤霉素A4向累积赤霉素A7转变，使得发酵终产物中赤霉素A7含量占赤霉素A4+7混合物的90％以上。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，涉及到利用一种原赤霉素A4生产用菌，通过改变培养基组成及工艺条件，发酵生产赤霉素A7的方法。特别的，发酵液中赤霉素A7含量占赤霉素A4+7混合物的比例由10％提升至90％以上。
背景技术
赤霉素(Gibberellins,GA)属四环二萜类化合物，是一类内源性植物调节物质，广泛存在于植物中，至今已分离鉴定129种该类物质。该类物质对种子萌发、茎叶生长、抽苔座果和块茎形成等有显著调节作用，于粮食、蔬菜水果的种植生产上应用广泛。
目前，赤霉素A3及赤霉素A4+7是市面上主要的赤霉素类产品，工业上常用微生物发酵生产。近年来，赤霉素A4+7在经济作物方面的应用得到关注，如用于保花保果、打破休眠等。但是，在应用过程中赤霉素A4和赤霉素A7发挥的作用存在明显差异，甚至起到反作用。鉴于赤霉素A4与赤霉素 A7对作物的不同作用，在实际应用过程中对赤霉素A4+7混合物中两者的比例有不同要求。目前市场上常见的GA4+7混合物剂型有GA4-rich(80％) mixture ofGA4and GA7，GA4-rich(65％)mixture of GA4and GA7，GA4-rich (60％)mixture ofGA4and GA7，GA7-rich(85％)mixture of GA4and GA7等，其中富含GA780％以上的GA4+7剂型市场销售价格比同含量GA4剂型高20％以上，经济价值显著。
由于发酵工艺所限，目前工业上发酵法直接生产得到的都是赤霉素A4+7的混合物，且赤霉素A7所占比例普遍在50％左右。为得到高含量赤霉素A7产品，企业一般采用在提取分离步骤破坏发酵液中赤霉素A4组份的方法来提高赤霉素A7含量。由于赤霉素A7的不稳定性，该方法使下游分离工艺变得复杂，产品总收率低，经济效益不明显。而其他如高效液相色谱、薄层层析等分离方法则存在分离速度不好控制、设备昂贵、生产规模不易放大等缺点。高水平的适合于工业生产的发酵法直接生产得到高含量赤霉素A7产品的菌种及技术方法未见报道。
赤霉素A4与赤霉素A7的分子结构相近(如下式)，控制微生物发酵在不同条件下进行，可实现相互转化。有学者研究发现，在较高的pH值下发酵，有利于赤霉素A4的积累，而在较低pH值下发酵，赤霉素A7会进一步代谢成赤霉素A3，因此在发酵各阶段选择合适的pH值是积累赤霉素A7的一个重要因素。日本学者岩崎等人发现，Zn2+,Al3+,Cu2+等金属离子的添加，有利于使代谢途径向赤霉素A4合成转变，而不利于赤霉素A7的合成。另外，也有研究表明，1,2-GA4脱氢酶是赤霉素A4转化成赤霉素A7进而再转化为赤霉素A3的主要酶种，NH4+能显著影响其活性。这些结论为本发明的可行性提供了很好的理论依据。
发明内容
本发明的目的在于利用现有赤霉素A4发酵生产用菌种(该菌种于2015 年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO.11101，分类命名为藤仓镰刀菌，菌种拉丁学名为：Fusarium fujikuroi；并已申请专利，专利名称：一种新的藤仓镰刀菌及其发酵生产赤霉素A4的方法，申请号：CN201510630480.4)，根据赤霉素A4与赤霉素A7转化机制，通过改变培养基组成及工艺条件，使其代谢途径由累积赤霉素 A4向累积赤霉素A7转变，使得发酵终产物中赤霉素A7含量占赤霉素A4+7混合物的90％以上。
为了更好的阐述本发明所涉及的工艺改变，对利用上述菌种发酵生产赤霉素A4的工艺说明如下：
(1)平板培养：将菌种接至PDA培养基，温度24～30℃，培养3～6 天，得到活化的赤霉菌菌落。
PDA培养基组成(g/L)：土豆汁200、葡萄糖20、琼脂15～20。
(2)种子培养：分两级培养，两级种子培养基组成均为(g/L)：蔗糖40、黄豆粉12、NH4NO3 1.2、MgSO4·7H2O 1.5和KH2PO4 1.5。
一级种子培养：装液量25/250mL。灭菌后用无菌牙签将单一的活化的菌落从平板刮下，置入装有2mL水及约20颗直径0.3mm无菌玻璃珠的试管中强烈震荡10min，打散混匀，吸取0.5mL于种子培养基中，在温度30 ±1℃，摇床转速200rpm条件下，培养40～60h，得到种子液。
二级种子培养：装液量150/300L。将种子液以2～10％的比例接种至二级种子罐，在温度30±1℃，溶氧20～60％，pH自然条件下，培养40～60h，得到二级种子液。
(3)发酵培养：发酵培养基组成(g/L)：淀粉120，黄豆饼粉10、玉米浆干粉30、K2HPO44.0，K2SO4 2.0、MgSO4·7H2O 1.0、ZnSO4·7H2O 5× 10-3、CuSO4·5H2O 3×10-3、Al2O3 5×10-3，装液量1.5/3T。将二级种子液以2～10％的比例接种至发酵罐，在30±1℃，pH6.8～7.2，溶氧40～60％条件下，培养8～10天，得到发酵液。
(4)产物检测：取0.25mL发酵液加入4.75mL甲醇,强烈震荡10min 后,离心处理(2600rpm,10min),取上清液HPLC分析。HPLC条件：Hypersil BDS C18反相色谱柱(150mm×4.6mm)；流动相甲醇–水(60∶40，v/v) 溶液，流速0.80mL/min；紫外检测器波长203nm；进样体积20μL。检测结果：赤霉素A4 1342mg/L，赤霉素A7 149mg/L，赤霉素A4占GA4+7总量 90.0％(重量比)，赤霉素A7占GA4+7总量10.0％(重量比)。
本发明的技术方案为：
一种利用上述原产赤霉素A4菌种，通过改变培养基组成、发酵工艺控制，使代谢途径向累积赤霉素A7转变的方法。其中菌种活化、种子培养及产物检测方法同赤霉素A4，区别在于两方面：
第一方面，发酵培养基组成不同，用于发酵生产赤霉素A7的培养基组成 (g/L)：淀粉150～200、棕榈油20～50、棉籽粉10～40、玉米浆干粉10～40、 KH2PO4 0.8～1.2、K2HPO42～4、MgSO4·7H2O 0.8～1.2、FeSO4·7H2O 5×10-3～1 ×10-2，pH自然。将二级种子液以8-20％的比例接种至发酵罐，分阶段控制溶氧、温度及pH，培养8～12天，得到发酵液。
第二方面，关键工艺控制不同：
a.对pH的控制：起始pH自然，待发酵过程中pH降至3.5～5.0，用氨水控制pH在4.0～5.0，直至发酵结束。
b.对溶氧的控制：0～60小时不低于35％，60小时至发酵结束20～60％。
c.对温度的控制：0～30小时28±1℃，30小时至发酵结束32±1℃。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：
(1)种子培养：分两级培养，两级种子培养基组成均为(g/L)：蔗糖40、黄豆粉12、NH4NO3 1.2、MgSO4·7H2O 1.5和KH2PO4 1.5，pH自然。
一级种子培养：装液量25/250mL。灭菌后用无菌牙签将单一的活化的菌落从平板刮下，置入装有2mL水及约20颗直径0.3mm无菌玻璃珠的试管中强烈震荡10min，打散混匀，吸取0.5mL于种子培养基中，在温度30 ±1℃，摇床转速200rpm条件下，培养40～60h，得到种子液。
二级种子培养：装液量150/300L。将种子液以2～10％的比例接种至二级种子罐，在温度30±1℃，溶氧控制20～60％，pH自然条件下，培养40～60h，得到二级种子液。
(2)发酵培养：装液量1.5/3T。发酵培养基组成(g/L)：淀粉150～200、棕榈油20～50、棉籽粉10～40、玉米浆干粉10～40、KH2PO4 0.8～1.2、K2HPO4 2～4、MgSO4·7H2O 0.8～1.2、FeSO4·7H2O 5×10-3～1×10-2，pH自然。将二级种子液以8-20％的比例接种至发酵罐，分阶段控制溶氧、温度及pH，培养8天，得到发酵液。各阶段控制溶氧、温度及pH控制如下：
a.pH。起始pH自然，待发酵过程中pH降至3.5～5.0，用氨水控制pH 在4.0～5.0，直至发酵结束。
b.溶氧。0～60小时不低于35％，60小时至发酵结束20～60％。
c.温度。0～30小时28±1℃，30小时至发酵结束32±1℃。
(3)产物检测：取0.25mL发酵液加入4.75mL甲醇,强烈震荡10min 后,离心处理(2600rpm,10min),取上清液HPLC分析。HPLC条件： HypersilBDS C18反相色谱柱(150mm×4.6mm)；流动相甲醇–水(60∶40， v/v)溶液，流速0.80mL/min；紫外检测器波长203nm；进样体积20μL。检测结果：赤霉素A4 107mg/L，赤霉素A7 1039mg/L，赤霉素A7占GA4+7总量90.7％(重量比)。
实施例2：
(1)种子培养同实施例1.
(2)发酵培养：培养基组成在实施例1的基础上，添加ZnSO4·7H2O 5 ×10-3、CuSO4·5H2O 3×10-3、Al2O3 5×10-3。将二级种子液以8～20％的比例接种至发酵罐，培养8天，得到发酵液。各阶段控制溶氧、温度及pH控制如下：
a.pH。同实施例1。
b.溶氧。同实施例1。
c.温度。同实施例1。
(3)产物检测：检测方法同实施例1，检测结果：赤霉素A4 270mg/L，赤霉素A7829mg/L，赤霉素A7占GA4+7总量76.8％(重量比)。
实施例3：
(1)种子培养同实施例1。
(2)发酵培养：培养基同赤霉素A4生产培养基，组成为(g/L)：淀粉120，黄豆饼粉10、玉米浆干粉30、K2HPO4 4.0、K2SO4 2.0、MgSO4·7H2O 1.0、 ZnSO4·7H2O 5×10-3、CuSO4·5H2O 3×10-3、Al2O3 5×10-3。将二级种子液以8～20％的比例接种至发酵罐，培养8天，得到发酵液。各阶段控制溶氧、温度及pH控制如下：
a.pH。同实施例1。
b.溶氧。同实施例1。
c.温度。同实施例1。
(3)产物检测：检测方法同实施例1，检测结果为：赤霉素A4 331mg/L，赤霉素A7551mg/L，赤霉素A7占GA4+7总量62.7％(重量比)。
实施例4：
(1)种子培养同实施例1。
(2)发酵培养：配方同实施例1。将二级种子液以8～20％的比例接种至发酵罐，培养8天，得到发酵液。各阶段控制溶氧、温度及pH控制如下：
a.pH。同实施例1。
b.溶氧。同实施例1。
c.温度。发酵全程维持培养温度30±1℃。
(3)产物检测：检测方法同实施例1，检测结果：赤霉素A4 170mg/L，赤霉素A7929mg/L，赤霉素A7占GA4+7总量85.3％(重量比)。
实施例5：
(1)种子培养同实施例1。
(2)发酵培养：培养基组成及培养周期同实施例1。各阶段控制溶氧、温度及pH控制如下：
a.pH。发酵全程维持pH 6.8～7.2。
b.溶氧。同实施例1。
c.温度。同实施例1。
(3)产物检测：检测方法同实施例1，检测结果为：赤霉素A4 461mg/L，赤霉素A7528mg/L，赤霉素A7占GA4+7总量53.4％(重量比)。
实施例6：
(1)种子培养同实施例1。
(2)发酵培养：培养基组成及培养周期同实施例1。各阶段控制溶氧、温度及pH控制如下：
a.pH。同实施例1。
b.溶氧。发酵全程维持溶氧40～60％。
c.温度。同实施例1。
(3)产物检测：检测方法同实施例1，检测结果为：赤霉素A4 169mg/L，赤霉素A7932mg/L，赤霉素A7占GA4+7总量84.6％(重量比)。
以上实施例改变了发酵培养中的培养基组成及pH、温度、溶氧控制，从各实施例的结果分析，培养基组成及pH对所采用菌种的代谢途径起到决定性作用。另外，在发酵各阶段控制温度及pH在适当范围内，也有利于代谢途径向累积赤霉素A7转变。以上实施例中，实施例1是本发明的最佳实施例。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的实质精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种发酵法生产赤霉素A7的方法，利用赤霉素A4发酵生产用菌种通过改变培养基组成、发酵工艺控制，代谢途径向积累赤霉素A7转变，赤霉素A7发酵水平达到1039mg/L，特别的，赤霉素A7占赤霉素A4+7混合物的90％以上，所述菌种于2015年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO.11101，分类命名为：藤仓镰刀菌，菌种拉丁学名为：Fusarium fujikuroi。
2.如权利要求1所述的发酵法生产赤霉素A7的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)将权利要求1中所述的菌种接种至含有一级种子培养基的摇瓶中，一级种子培养基组成如下(g/L)：蔗糖30～50、黄豆粉10～15、NH4NO31.0～2.0、MgSO4·7H2O 1.4～2.0、KH2PO41.0～2.0，pH自然；装液量8-15％，于30±1℃，摇床转速200rpm，pH自然条件下，培养1～3天，得到一级种子液；(2)将一级种子液以5～15％(v/v)的比例接种至300L种子罐，培养基组成同一级种子培养基，装液量40-60％，于30±1℃，溶氧30-60％，pH自然条件下，培养1～3天，得到二级种子液；(3)将二级种子液以5-20％的比例接种至发酵罐，发酵培养基组成如下(g/L)：淀粉150～200、棕榈油20～50、棉籽粉10～40、玉米浆干粉10～40、KH2PO40.8～1.2、K2HPO42～4、MgSO4·7H2O 0.8～1.2、FeSO4·7H2O 5×10-3～1×10-2，pH自然，装液量1.5/3T，分阶段控制溶氧、温度及pH，培养8～12天，得到发酵液。
3.如权利要求2所述的发酵法生产赤霉素A7的方法，其特征在于：上述步骤(3)的发酵过程中使用氨水调节pH。
4.如权利要求2所述的发酵法生产赤霉素A7的方法，其特征在于：上述步骤(3)的发酵过程中各时间段pH控制：起始pH自然，待发酵过程中pH降至3.5～5.0，用氨水控制pH在4.0～5.0，直至发酵结束。
5.如权利要求2所述的发酵法生产赤霉素A7的方法，其特征在于：上述步骤(3)的发酵过程中各时间段溶氧控制：0～60小时不低于35％，60小时至发酵结束：维持在20～60％。
6.如权利要求2所述的发酵法生产赤霉素A7的方法，其特征在于：上述步骤(3)的发酵过程中各时间段温度控制：0～30小时28±1℃，30小时至发酵结束32±1℃。
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