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CN120005881A - 抑制ASGPR1基因表达的siRNA、siRNA缀合物或其前药和药物组合物及用途 - Google Patents

抑制ASGPR1基因表达的siRNA、siRNA缀合物或其前药和药物组合物及用途 Download PDF

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CN120005881A
CN120005881A CN202411630151.5A CN202411630151A CN120005881A CN 120005881 A CN120005881 A CN 120005881A CN 202411630151 A CN202411630151 A CN 202411630151A CN 120005881 A CN120005881 A CN 120005881A
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ribonucleotides
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黄河
王岩
王书成
汪小君
牛丽姣
产运霞
耿玉先
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Beijing Fuyuan Pharmaceutical Co ltd
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Beijing Fuyuan Pharmaceutical Co ltd
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Abstract

本发明涉及抑制去唾液酸糖蛋白受体1(ASGPR1)基因表达的siRNA、siRNA缀合物、包含其的药物组合物、及其用途。本发明的siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，该siRNA含有正义链和反义链。本发明的siRNA、siRNA缀合物及其前药和药物组合物可以有效治疗和/或预防与ASGPR1基因过表达相关的疾病。

Description

抑制ASGPR1基因表达的siRNA、siRNA缀合物或其前药和药物 组合物及用途
技术领域
本公开属于生物医药领域，具体来说，本公开涉及抑制去唾液酸糖蛋白受体1(ASGPR1)基因表达的siRNA、siRNA缀合物或其前药、包含其的药物组合物、其制备方法和用途。
背景技术
心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)严重危害人类健康。目前，中国心血管疾病死亡占城乡居民死亡原因的首位。动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)作为CVD的主要病理和生理基础，其发生发展是多个危险因素相互作用的结果，其中血脂代谢紊乱发挥着重要的作用。大量的临床研究表明，纠正血脂代谢紊乱对缓解动脉粥样硬化有明显的益处。除此之外，炎症的激活和血栓的形成也能促进动脉粥样硬化的进展。
去唾液酸糖蛋白受体1(ASGPR1)，又称为Ashwell-Morell受体，是发挥结合、内化去唾液酸糖蛋白和从循环清除去唾液酸糖蛋白的主要生理作用的跨膜蛋白。ASGPR1通过去唾液酸糖蛋白受体1基因(ASGPR1基因)表达，主要表达于肝脏中。目前已经明确有许多ASGPR1配体参与了糖蛋白代谢、脂质代谢、凝血以及自身免疫性炎症等过程。越来越多的研究表明ASGPR1在动脉粥样硬化中发挥着重要作用。流行病学研究表明ASGPR1基因突变会降低CVD的患病风险，动物实验研究发现ASGPR1缺失可以减缓动脉粥样硬化斑块的形成。另外，ASGPR1第4内含子的功能缺失突变，即ASGPR1del12突变，可影响血液中低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)水平。有证据表明ASGPR1与动脉粥样硬化的其他危险因素，如炎症激活、血小板异常等存在联系。因此，能够靶向ASGPR1基因并降低ASGPR1蛋白表达水平的治疗剂代表了治疗心血管疾病(包括冠状动脉疾病)的新型方式。
目前尚无靶向ASGPR1的产品获批上市，但是有两项处于临床阶段的项目，均为临床1期，其中一项为Inst Nuclear Energy Res(Originator)公司开发的诊断试剂，另一项为安进公司开发的单克隆抗体，适应症均为心血管紊乱。
发明内容
本发明旨在提供siRNA、siRNA缀合物或其前药以及药物组合物，其可以抑制肝脏中ASGPR1基因的表达，从而实现疾病治疗的目的。
在第一方面，本发明提供一种抑制去唾液酸糖蛋白受体1(ASGPR1)基因表达的siRNA，所述siRNA包含正义链与反义链，其中所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中所述正义链含有核苷酸序列I，反义链含有核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，其中所述核苷酸序列I和核苷酸序列II选自以下序列：
(1)所述核苷酸序列I包含SEQ ID NO:67所示的核苷酸序列，且所述核苷酸序列II包含SEQ ID NO:68所示的核苷酸序列：
5'-ACCCGUGGCGCUUU-3'(SEQ ID NO:67)
5'-AAAGCGCCACGGGU-3'(SEQ ID NO:68)；
(2)所述核苷酸序列I包含SEQ ID NO:69所示的核苷酸序列，且所述核苷酸序列II包含SEQ ID NO:70所示的核苷酸序列：
5'-AGCUUGAAACCCGUGG-3'(SEQ ID NO:69)
5'-CCACGGGUUUCAAGCU-3'(SEQ ID NO:70)。
在一些实施方案中，上述siRNA中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补；所述基本上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；所述完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有碱基错配。
在一些实施方案中，上述任一所述的siRNA中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV的长度各自独立地为0-8个核苷酸，其中所述核苷酸序列III连接在所述核苷酸序列I的5'末端，所述核苷酸序列IV连接在所述核苷酸序列II的3'末端，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV长度相等并且实质上反向互补或完全反向互补；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；所述完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有碱基错配；和/或
所述核苷酸序列III连接在所述核苷酸序列I的3'末端，所述核苷酸序列IV连接在所述核苷酸序列II的5'末端，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV长度相等并且实质上反向互补或完全反向互补；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；所述完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有碱基错配。
在一些实施方案中，上述任一所述的siRNA中，所述siRNA包含正义链与反义链，其中所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中所述正义链含有核苷酸序列I和III，反义链含有核苷酸序列II和IV，所述核苷酸序列I和III与所述核苷酸序列II和IV至少部分地反向互补形成双链区，其中所述核苷酸序列I和III、所述核苷酸序列II和IV选自以下序列：
(1)所述核苷酸序列I和III包含或由如SEQ ID NO:61所示的核苷酸序列组成，且所述核苷酸序列II和IV包含或由如SEQ ID NO:62所示的核苷酸序列组成；
(2)所述核苷酸序列I和III包含或由如SEQ ID NO:40所示的核苷酸序列组成，且所述核苷酸序列II和IV包含或由如SEQ ID NO:63所示的核苷酸序列组成；
(3)所述核苷酸序列I和III包含或由如SEQ ID NO:64所示的核苷酸序列组成，且所述核苷酸序列II和IV包含或由如SEQ ID NO:65所示的核苷酸序列组成；
(4)所述核苷酸序列I和III包含或由如SEQ ID NO:41所示的核苷酸序列组成，且所述核苷酸序列II和IV包含或由如SEQ ID NO:37所示的核苷酸序列组成；
(5)所述核苷酸序列I和III包含或由如SEQ ID NO:42所示的核苷酸序列组成，且所述核苷酸序列II和IV包含或由如SEQ ID NO:71所示的核苷酸序列组成；
(6)所述核苷酸序列I和III包含或由如SEQ ID NO:44所示的核苷酸序列组成，且所述核苷酸序列II和IV包含或由如SEQ ID NO:72所示的核苷酸序列组成；
(7)所述核苷酸序列I和III包含或由如SEQ ID NO:46所示的核苷酸序列组成，且所述核苷酸序列II和IV包含或由如SEQ ID NO:66所示的核苷酸序列组成。
在一些实施方案中，上述任一所述的siRNA中，所述正义链还含有核苷酸序列V和/或所述反义链还含有核苷酸序列VI，所述核苷酸序列V和所述核苷酸序列VI的长度为0-3个核苷酸，所述核苷酸序列V连接在所述正义链的3'末端构成正义链的3'突出端和/或所述核苷酸序列VI连接在所述反义链的3'末端构成反义链的3'突出端；优选地，所述核苷酸序列V或所述核苷酸序列VI的长度为1-2个核苷酸；
或者，所述核苷酸序列V或所述核苷酸序列VI与靶mRNA相应位置的核苷酸错配或互补。
在一些实施方案中，上述任一所述的siRNA中，所述双链区的长度是15-30个核苷酸对；优选地，所述双链区的长度是17-23个核苷酸对；更优选地，所述双链区的长度是19-23个核苷酸对。
在一些实施方案中，上述任一所述的siRNA中，所述正义链或所述反义链具有15-30个核苷酸；优选地，所述正义链或所述反义链具有19-25个核苷酸；更优选地，所述正义链或所述反义链具有19-23个核苷酸。
在一些实施方案中，上述任一所述的siRNA中，所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基；优选地，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基；和/或，所述siRNA包含不具有3'突出端核苷酸的正义链。
在一些实施方案中，上述任一所述的siRNA中，所述反义链5'末端核苷酸连接5'磷酸基团或5'磷酸衍生基团，或所述反义链的5'末端核苷酸不连接5'磷酸基团或5'磷酸衍生基团；和/或
所述正义链的5’末端和3’末端都不连接(invAb)，或所述正义链的仅5’末端连接一个(invAb)，或所述正义链的仅3’末端连接一个(invAb)，或所述正义链的5’末端和3’末端分别连接一个(invAb)。
在一些实施方案中，上述任一所述的siRNA中，所述修饰的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸、2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-取代的烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-取代的烷基修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-取代的氨基修饰的核苷酸、核苷酸类似物或其中任意两种以上的组合。
在一些实施方案中，上述任一所述的siRNA中，所述修饰的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸、2'-甲氧基修饰的核苷酸、2'-O-CH2-CH2-O-CH3修饰的核苷酸、2'-O-CH2-CH＝CH2修饰的核苷酸、2'-CH2-CH2-CH＝CH2修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸、核苷酸类似物或其中任意两种以上的组合；
所述核苷酸类似物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA或GNA。
在一些实施方案中，上述任一所述的siRNA中，所述正义链中的每一个核苷酸独立地为2’-氟代修饰的核苷酸或2’-甲氧基修饰的核苷酸；
沿5’末端向3’末端方向，所述正义链中第7位、第9位、第10位和第11位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述正义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链中第9位、第11位、第12位和第13位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述正义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链中第5位、第9位、第10位和第11位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述正义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链中第5位、第9位、第11位和第13位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述正义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链中第9位、第11位、第16位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述正义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链中第8位、第9位和第11位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述正义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸。
在一些实施方案中，上述任一所述的siRNA中，当所述正义链的5’末端和3’末端都不连接(invAb)时，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
所述正义链3’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链3’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
或者，
所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
当所述正义链的仅5’末端连接一个(invAb)时，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端的(invAb)和5’末端起始的第1个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
当所述正义链的仅3’末端连接一个(invAb)时，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
所述正义链3’末端的(invAb)和3’末端起始的第1个核苷酸之间；
当所述正义链的5’末端和3’末端分别连接一个(invAb)时，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端的(invAb)和5’末端起始的第1个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链3’末端的(invAb)和3’末端起始的第1个核苷酸之间。
在一些实施方案中，上述任一所述的siRNA中，所述反义链中的每一个核苷酸独立地为2’-氟代修饰的核苷酸，2’-甲氧基修饰的核苷酸，GNA修饰的核苷酸或2’-脱氧核糖核苷酸；
沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第6位、第14位和第16位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第6位、第8位、第9位、第14位和第16位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第3位、第4位、第5位、第7位、第10位和第14位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第3位、第4位、第5位、第7位、第10位和第14位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中第6位的核糖核苷酸为核苷酸衍生物GNA修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第7位、第10位和第14位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第5位、第7位和第14位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第5位、第14位和第16位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第3位、第5位、第7位、第10位、第12位和第14位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中第6位的核糖核苷酸为核苷酸衍生物GNA修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第7位和第14位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中第5位和第12位的核糖核苷酸为2’-脱氧核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸。
在一些实施方案中，上述任一所述的siRNA中，所述反义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述反义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述反义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
所述反义链3’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述反义链3’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间。
在一些实施方案中，上述任一所述的siRNA中，其包含或选自由表1、表1-1和表2的siRNA组成的组；优选地，所述siRNA选自N-ER-FY018074、N-ER-FY018074D2、N-ER-FY018074M6、N-ER-FY018074M7、N-ER-FY018074M6D2、N-ER-FY018074M7D2、N-ER-FY018074M8、N-ER-FY018074M9、N-ER-FY018074M59、N-ER-FY018074M60、N-ER-FY018074M61、N-ER-FY018074M62、N-ER-FY018074M36、N-ER-FY018074M37、N-ER-FY018074M40、N-ER-FY018074M41、N-ER-FY018074M42、N-ER-FY018074M43、N-ER-FY018074M44、N-ER-FY018074M45、N-ER-FY018074M53、N-ER-FY018074M54、N-ER-FY018074M55、N-ER-FY018074M63、N-ER-FY018074M64、N-ER-FY018074M65、N-ER-FY018074M66、N-ER-FY018074M67、N-ER-FY018074M68、N-ER-FY018074M69组成的组。
在第二方面，本发明提供一种siRNA缀合物或其前药，所述siRNA缀合物含有上述任一所述的siRNA以及缀合至该siRNA的缀合基团。
在一些实施方案中，上述siRNA缀合物或其前药中，所述缀合基团包含药学上可接受的靶向基团和接头，并且所述siRNA、所述接头和所述靶向基团依次共价或非共价连接；
优选地，在所述siRNA缀合物中，siRNA的正义链与反义链互补形成所述siRNA缀合物的双链区，且所述正义链的3’末端形成平末端，所述反义链的3’末端具有1-3个延伸出所述双链区的突出的核苷酸；
或者，
在所述siRNA缀合物中，siRNA的正义链与反义链互补形成所述siRNA缀合物的双链区，且所述正义链的3’末端形成平末端，所述反义链的3’末端形成平末端。
在一些实施方案中，上述任一所述的siRNA缀合物或其前药中，其中所述缀合基团如下任意一种：
在一些实施方案中，所述siRNA缀合物含有本发明的siRNA以及缀合至该siRNA的缀合基团(如式II所示，双螺旋结构表示所述siRNA，并且所述缀合基团连接至所述siRNA的正义链3'末端)：
在一些实施方案中，上述siRNA缀合物或其前药中，所述siRNA缀合物包含或选自由表3的siRNA缀合物组成的组；优选地，所述siRNA缀合物选自N-ER-FY018074M6L96、N-ER-FY018074M7L96、N-ER-FY018074M8L96、N-ER-FY018074M9L96、N-ER-FY018074M59L96、N-ER-FY018074M60L96、N-ER-FY018074M62L96、N-ER-FY018074M40L96、N-ER-FY018074M42L96、N-ER-FY018074M44L96、N-ER-FY018074M45L96、N-ER-FY018074M63L96、N-ER-FY018074M64L96、N-ER-FY018074M65L96、N-ER-FY018074M66L96、N-ER-FY018074M67L96、N-ER-FY018074M68L96、N-ER-FY018074M69L96组成的组。
在第三方面，本发明提供一种药物组合物，其包含上述任一所述的siRNA，或上述任一所述的siRNA缀合物或其前药，以及药学上可接受的载体。
在第四方面，本发明提供一种试剂盒，其包含上述任一所述的siRNA，或上述任一所述的siRNA缀合物或其前药，或上述药物组合物。
在第五方面，本发明提供上述任一所述的siRNA，或上述任一所述的siRNA缀合物或其前药，或上述药物组合物用于制备抑制ASGPR1基因表达的药剂的用途。
在第六方面，本发明提供上述任一所述的siRNA，或上述任一所述的siRNA缀合物或其前药，或上述药物组合物用于制备预防和/或治疗ASGPR1基因过表达相关的疾病的药剂的用途；
优选地，所述疾病为肥胖症、代谢综合征、高脂质血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、异常脂质和/或胆固醇代谢、动脉粥样硬化、糖尿病、心血管疾病、冠状动脉疾病、心肌梗塞、外周血管疾病或脑血管疾病；优选地，所述疾病为动脉粥样硬化。
在第七方面，本发明提供一种抑制ASGPR1基因表达的方法，包括将治疗有效量的上述任一所述的siRNA，或上述任一所述的siRNA缀合物或其前药，或上述药物组合物与表达ASGPR1的细胞接触或给予有需要的受试者。
在第八方面，本发明提供一种治疗和/或预防ASGPR1基因过表达相关的疾病的方法，包括将治疗有效量的上述任一所述的siRNA，或上述任一所述的siRNA缀合物或其前药，或上述药物组合物给予有需要的受试者；
优选地，所述疾病为肥胖症、代谢综合征、高脂质血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、异常脂质和/或胆固醇代谢、动脉粥样硬化、糖尿病、心血管疾病、冠状动脉疾病、心肌梗塞、外周血管疾病或脑血管疾病；优选地，所述疾病为动脉粥样硬化。
有益效果
本申请提供的siRNA、siRNA修饰物、siRNA缀合物和药物组合物在体外细胞实验中显示出优异的ASGPR1基因表达抑制活性，具有良好的治疗ASGPR1基因过表达相关的疾病的潜力。例如，本申请公开的siRNA、siRNA修饰物和siRNA缀合物能够降低肝脏中ASGPR1 mRNA的表达，毒副作用低，血浆稳定性好，具有良好的临床应用前景。
本申请提供的siRNA、siRNA修饰物和siRNA缀合物在HepG2细胞中显示出对ASGPR1基因良好的抑制效果。在一些具体实施方案中，本申请提供的siRNA修饰物在1nM下48h抑制率在约85％以上，优选的抑制率在约90％以上，在0.1nM下48h抑制率在约80％以上；siRNA缀合物在1nM下48h抑制率在约90％以上，优选的抑制率在约95％以上，在0.1nM下48h抑制率在约90％以上。
在一些具体实施方案中，本申请提供的siRNA缀合物在PHH细胞中具有较高的ASGPR1基因抑制活性，例如，在自由摄取条件下，在20nM浓度的抑制率高达87.07％，在1nM浓度的抑制率高达80.94％；在转染条件下，在1nM浓度的抑制率高达90.03％，在0.1nM浓度的抑制率高达88.69％。
在一些具体实施方案中，本申请的siRNA缀合物在体内对hASGPR1基因具有较高的抑制活性，能够长时间降低hASGPR1蛋白水平。
在一些具体实施方案中，本申请的siRNA缀合物在高血脂模型的食蟹猴体内对肝脂肪含量变化改善效果明显，D56使肝脏脂肪含量降低达28.57％，D89使肝脏脂肪含量降低达42.86％；另外还能够明显降低食蟹猴肝脏ASGPR1 mRNA的表达量，D87肝脏mRNA剩余仅为19.30％。
在一些具体实施方案中，本申请的siRNA缀合物在血浆中半衰期较短，清除较快。
在一些具体实施方案中，本申请的siRNA缀合物主要富集于肝脏，在组织中保留时间较长，具有很好的体内和体外稳定性。
在一些具体实施方案中，本申请的siRNA缀合物毒性较低，具有优异的用药安全窗口。
在一些具体实施方案中，本申请的siRNA缀合物具有优异的体外稳定性。
具体实施方式
定义
在说明书通篇中，如无特别说明，在本技术领域中，“G”、“C”、“A”、“T”和“U”通常分别代表鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶的碱基，但本领域中也通常知晓，“G”、“C”、“A”、“T”和“U”每个通常也代表分别含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶作为碱基的核苷酸，这在表示脱氧核糖核酸序列和/或核糖核酸序列中是常见的方式，因此在本申请的上下文中，“G”、“C”、“A”、“T”、“U”表示的含义包括上述各种可能的情形，本申请中“核苷酸”与“核糖核苷酸”可互换使用。小写字母a、u、c、g：表示2’-甲氧基修饰的核苷酸；Af、Gf、Cf、Uf：表示2’-氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；小写字母d：表示与该字母d右侧相邻的一个核苷酸为2’-脱氧核糖核苷酸；P1：表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5’-磷酸核苷酸；EVP：表示其右侧相邻的一个核苷酸为5’-反式乙烯基膦酸酯核苷酸；“G”、“C”、“A”、“T”和“U”(下划线+粗体+斜体)：表示GNA修饰的含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶作为碱基的核苷酸；(invAb)为反向脱碱基脱氧核糖残基。在上文及下文中，所述“2’-氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2’位的羟基被氟取代形成的核苷酸。“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2’位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2’位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。这些核糖基2’位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸是本领域技术人员所公知的，这些核苷酸可以选自2’-烷氧基修饰的核苷酸、2’-取代的烷氧基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、2’-取代的烷基修饰的核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-取代的氨基修饰的核苷酸、2’-脱氧核苷酸中的一种。
“烷基”包括直链、支链或环状的饱和烷基。例如，烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丁基、正戊基、环已基等类似基团。示例性的，“C1-6烷基”中的“C1-6”是指包含有1、2、3、4、5或6个碳原子的直链、支链或环状形式排列的基团。
“烷氧基”在本文中是指烷基基团通过氧原子与分子其余部分相连(-O-烷基)，其中所述烷基如本文中所定义。烷氧基的非限制性实例包括甲氧基、乙氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基等。
“核苷酸类似物”指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。如异核苷酸、桥联的核苷酸(bridged nucleic acid，简称BNA)或无环核苷酸。
BNA是指受约束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五元环、六元环、或七元环的具有“固定的”C3'-内切糖缩拢的桥联结构。通常将该桥掺入到该核糖的2'-、4'-位处以提供一个2',4'-BNA核苷酸，如LNA、ENA、cET BNA等，其中，LNA如式(1)所示，ENA如式(2)所示，cET BNA如式(3)所示：
无环核苷酸是核苷酸的糖环被打开形成的一类核苷酸，如解锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)，其中，UNA如式(4)所示，GNA如式(5)所示：
上述式(4)和式(5)中，R选自H、OH或烷氧基(O-烷基)。
异核苷酸是指核苷酸中碱基在核糖环上的位置发生改变而形成的化合物，例如，碱基从核糖环的1'-位移动至2'-位或3'-位而形成的化合物，如式(6)或(7)所示：
上述式(6)-式(7)化合物中，Base表示碱基，例如A、U、G、C或T；R选自H、OH、F或者如上所述的非氟基团。
在一些实施方式中，核苷酸类似物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET BNA、UNA和GNA中的一种。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸为2’-甲氧基修饰的核苷酸、GNA修饰的核苷酸或其中任意两种以上的组合。在一些优选的实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸均为2’-甲氧基修饰的核苷酸，在上文和下文中，所述2’-甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
所述“2-甲氧基修饰的核苷酸”指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。所述“硫代磷酸酯基”指磷酸酯基中的磷酸二酯键中的一个氧原子被硫原子取代而成的硫代磷酸酯基。
所述“硫代磷酸酯基”指下式：
所述“5’-磷酸核苷酸”指下式的结构：
在本说明书的上下文中，表述“互补”和“反向互补”可互相替代使用，并具有本领域技术人员周知的含义，即，在双链核酸分子中，一条链的碱基各自与另一条链上的碱基以互补的方式相配对。在DNA中，嘌呤碱基腺嘌呤(A)始终与嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)(或者在RNA中为尿嘧啶(U))相配对；嘌呤碱基鸟嘌呤(G)始终与嘧啶碱基胞嘧啶(C)相配对。每个碱基对都包括一个嘌呤和一个嘧啶。当一条链上的腺嘌呤始终与另一条链上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，以及鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对时，两条链被认为是彼此相互补的，以及从其互补链的序列中可以推断出该链的序列。与此相应地，“错配”在本领域中意指在双链核酸中，对应位置上的碱基并未以互补的形式配对存在。
在上文及下文中，如无特别说明，“基本上反向互补”是指所涉及的两段核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；“实质上反向互补”是指两段核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；“完全反向互补”是指两段核苷酸序列之间不存在碱基错配。
在上文及下文中，一个核苷酸序列与另外一个核苷酸序列存在“核苷酸差异”，是指前者与后者相比，相同位置的核苷酸的碱基种类发生了改变，例如，在后者中一个核苷酸碱基为A时，在前者的相同位置处的对应核苷酸碱基为U、C、G或者T的情况下，认定为两个核苷酸序列之间在该位置处存在核苷酸差异。在一些实施方式中，以无碱基核苷酸或其等同物代替原位置的核苷酸时，也可认为在该位置处产生了核苷酸差异。
在上下文中，“突出端”是指当siRNA的一条链的一个3’末端延伸超出另一条链的5’末端时从该siRNA的双链体结构突出的一个或多个不成对的核苷酸，或反之亦然。“平端”或“平末端”意指在该siRNA的那端处不存在不成对的核苷酸，即无核苷酸突出端。一种“平末端的”siRNA是一种在其整个长度上都是双链、即在该分子的任一端处都无核苷酸突出端的siRNA。
在本申请说明书上文及下文中，特别是在描述本申请的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物的制备方法时，除非特别说明，所述核苷单体指，根据欲制备的siRNA或siRNA缀合物中核苷酸的种类和顺序，固相亚磷酰胺合成中使用的修饰或未修饰的核苷亚磷酰胺单体。固相亚磷酰胺合成为本领域技术人员所公知的RNA合成中所用的方法。本申请所用的核苷单体均可商购得到。
在本申请的上下文中，除非另有说明，“缀合”是指两个或多个各自具有特定功能的化学部分之间以共价连接的方式彼此连接；相应地，“缀合物”是指该各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物。进一步地，“siRNA缀合物”表示一个或多个具有特定功能的化学部分共价连接至siRNA上而形成的化合物。siRNA缀合物应根据上下文，理解为多个siRNA缀合物的总称或者某个化学式所示的siRNA缀合物。在本申请说明书的上下文中，“缀合分子”应当理解为可通过反应缀合至siRNA，最终形成本申请的siRNA缀合物的特定化合物。
本发明所提供的siRNA缀合物还存在前药形式。本文所描述的siRNA缀合物的前药容易地在生理条件下发生化学变化从而转化成本发明的siRNA缀合物。可在体内转化以提供生物活性物质(即本发明所提供的siRNA缀合物)的任何物质均是在本发明的范围和主旨内的前药。
在本申请中可以使用各种羟基保护基团。一般来说，保护基团使化学官能团对特定的反应条件不敏感，并且可以在分子中的该官能团上附加以及去除，而不实质上损害分子的其余部分。在一些实施方式中，保护基团在碱性条件下稳定，但可以在酸性条件下脱除。在一些实施方式中，本申请可使用的羟基保护基的非排他性实例包括单甲氧基三苯甲基、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(Mox)。在一些实施方式中，本申请可使用的羟基保护基的非排他性实例包括Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4’-二甲氧基三苯甲基)和TMTr(4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基)。
如本说明书所使用的，“任选的”或“任选地”是指其后描述的事件或状况可以发生或不发生，并且所述描述包括事件或状况发生的情况和其中不发生的情况。
“受试者”一词，如本说明书所使用的，指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本申请的受试者包括但不限于人类、非人灵长类(例如，恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠、兔或任何种类的家禽。
如本说明书所使用的，“治疗”是指获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处。“治疗益处”意味着根除或改善被治疗的潜在障碍。此外，治疗益处通过根除或改善与潜在障碍相关的一个或多个生理症状，从而在受试者中观察到改善而获得，尽管受试者可能仍然受到潜在障碍的折磨。
如本说明书所使用的，“预防”是指获得有益或期望的结果的方法，包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”，可将siRNA、siRNA缀合物或药物组合物给予有罹患特定疾病风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种生理症状的受试者，即便可能该疾病的诊断尚未作出。
siRNA
本发明涉及一种能够抑制ASGPR1基因表达的siRNA。本发明的siRNA含有核苷酸基团作为基本结构单元，本领域技术人员公知，所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基。通常具有活性的，即功能性的siRNA的长度约为12-40个核苷酸，在一些实施方式中约为15-30个核苷酸。
本申请的siRNA含有正义链和反义链，所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中所述正义链含有一段核苷酸序列I，所述反义链含有一段核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区。在一些实施方式中，该双链区的长度是15-30个核苷酸对。在另一些实施方式中，双链区的长度是17-23个核苷酸对。在另一些实施方式中，双链区的长度是19-23个核苷酸对。在又另一些实施方式中，双链区的长度是19、21或23个核苷酸对。
在一些实施方式中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度各自独立地为0-8个核苷酸，所述核苷酸序列III连接在核苷酸序列I的5'末端，核苷酸序列IV连接在核苷酸序列II的3'末端，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV长度相等并且实质上反向互补或完全反向互补；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有错配。在一些实施方式中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度各自独立地为0-8个核苷酸，所述核苷酸序列III连接在核苷酸序列I的3'末端，核苷酸序列IV连接在核苷酸序列II的5'末端，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV长度相等并且实质上反向互补或完全反向互补；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有错配。在一些实施方式中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度各自独立地为0-8个核苷酸，所述核苷酸序列III连接在核苷酸序列I的5'末端，核苷酸序列IV连接在核苷酸序列II的3'末端，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV长度相等并且实质上反向互补或完全反向互补；和所述核苷酸序列III连接在核苷酸序列I的3'末端，核苷酸序列IV连接在核苷酸序列II的5'末端，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV长度相等并且实质上反向互补或完全反向互补；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有错配。
在一些实施方式中，所述正义链还含有核苷酸序列V和/或所述反义链还含有核苷酸序列VI，核苷酸序列V和VI的长度为0至3个核苷酸，核苷酸序列V连接在所述正义链的3'末端构成正义链的3'突出端，和/或核苷酸序列VI连接在所述反义链的3'末端构成反义链的3'突出端。在一些实施方式中，所述核苷酸序列V或VI的长度为1-2个核苷酸。在另一些实施方案中，所述核苷酸序列V或VI与靶mRNA相应位置的核苷酸错配或互补。
本申请提供的正义链和反义链的长度相同或不同，在一些实施方式中，正义链或反义链具有15-30个核苷酸。在另一些实施方式中，正义链或反义链具有19-25个核苷酸。在另一些实施方式中，正义链或反义链具有19-23个核苷酸。本申请提供的siRNA正义链和反义链的长度比可以是15/15、16/16、17/17、18/18、19/19、19/20、19/21、19/22、19/23、20/19、20/20、20/21、20/22、20/23、21/19、21/20、21/21、21/22、21/23、22/19、22/20、22/21、22/22、22/23、23/19、23/20、23/21、23/22、23/23、24/24、25/25、26/26、27/27、28/28、29/29、30/30、22/24、22/25、22/26、23/24、23/25或23/26等等。在一些实施方式中，所述siRNA正义链和反义链的长度比为19/19、21/21、19/21、21/23或23/23，此时，本申请的siRNA具有更好的细胞mRNA沉默活性。
研究发现，不同修饰策略会对siRNA的稳定性、生物活性及细胞毒性等指标产生截然不同的影响。例如，CN102140458B中对siRNA的多种化学修饰策略进行了研究，证实了7种有效的修饰方式，与未经修饰的siRNA相比，其中一种修饰方式所得的siRNA在提高血液稳定性的同时，还保持了与未经修饰的siRNA基本相当的抑制活性。
本发明的siRNA中的核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸。在一些实施方式中，本发明的siRNA中的每个核苷酸均为未经修饰的核苷酸；在一些实施方式中，本发明的siRNA中的部分或全部核苷酸为修饰的核苷酸，核苷酸基团上的这些修饰不会导致本发明的siRNA抑制ASGPR1基因表达的功能明显削弱或丧失。
在一些实施方式中，本申请的siRNA至少含有1个修饰的核苷酸。在本申请的上下文中，所使用的术语“修饰的核苷酸”是指核苷酸的核糖基2'位羟基被其他基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物，或者具有经修饰的碱基的核苷酸。所述修饰的核苷酸不会导致siRNA抑制基因表达的功能明显削弱或丧失。例如，可以选择J.K.Watts,G.F.Deleavey,andM.J.Damha,Chemically modified siRNA:tools and applications.Drug Discov Today,2008,13(19-20):842-55中公开的修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，本发明提供的siRNA的所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基；换句话说，所述正义链和所述反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基和/或核糖基的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基和/或具有修饰基团的核糖基。在一些实施方式中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基。
在一些实施方式中，所述siRNA包括不具有3’突出端核苷酸的正义链；即siRNA的正义链可以存在3’突出端核苷酸，将正义链的3’突出端核苷酸排除后形成平末端。在一些具体实施方式中，所述siRNA的正义链和反义链包含如表1、表1-1和表2的序列。
在一些实施方式中，当正义链与反义链的核苷酸序列互补形成双链区后，正义链的3’末端不存在突出的核苷酸时，在正义链的3’末端添加核苷酸序列V，作为突出的核苷酸。然后，当核苷酸序列V连接正义链的3'末端形成的核苷酸序列在完成化学修饰后，排除核苷酸序列V，相应地，siRNA的正义链形成平末端。
在一些实施方式中，当正义链与反义链的核苷酸序列互补形成双链区后，正义链的3’末端具有延伸出双链区的突出的核苷酸时，将正义链中位于3’末端的突出的核苷酸排除后作为正义链的核苷酸序列，相应地，siRNA的正义链形成平末端。
在一些实施方式中，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团。
示例性的5’磷酸基团的结构为：5’磷酸衍生基团的结构包括但不限于：等。
位于反义链的5’末端核苷酸连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团后，形成如下所示结构：
其中，Base表示碱基，例如A、U、G、C或T。R’为羟基或被本领域技术人员所知晓的各类基团所取代，例如，取代后的修饰的核苷酸可以为2’-氟代(2’-F)修饰的核苷酸，2’-烷氧基修饰的核苷酸，2’-取代的烷氧基修饰的核苷酸，2’-烷基修饰的核苷酸，2’-取代的烷基修饰的核苷酸，2’-氨基修饰的核苷酸，2’-取代的氨基修饰的核苷酸，2’-脱氧核苷酸。
在一些实施方式中，所述正义链和反义链的5’末端核苷酸不连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团，其结构如式(X)所示：
其中，Base表示碱基，例如A、U、G、C或T。R为羟基或氢或被本领域技术人员所知晓的各类基团所取代，例如，R可以为2'-氟代(2'-F)，2'-烷氧基，2'-取代的烷氧基，2'-烷基，2'-取代的烷基，2'-氨基，2'-取代的氨基、2'-脱氧核苷酸。
在一些实施方案中，所述正义链的5’末端和3’末端都不连接(invAb)，或所述正义链的仅5’末端连接一个(invAb)，或所述正义链的仅3’末端连接一个(invAb)，或所述正义链的5’末端和3’末端分别连接一个(invAb)。
示例性的修饰的核苷酸具有如下所示结构：
其中，Base表示碱基，例如A、U、G、C或T。核糖基团2’位的羟基被R取代。这些核糖基团2’位的羟基可以为本领域技术人员所知晓的各类基团所取代，例如，取代后的修饰的核苷酸可以为2’-氟代(2’-F)修饰的核苷酸，2’-烷氧基修饰的核苷酸，2’-取代的烷氧基修饰的核苷酸，2’-烷基修饰的核苷酸，2’-取代的烷基修饰的核苷酸，2’-氨基修饰的核苷酸，2’-取代的氨基修饰的核苷酸，2’-脱氧核苷酸。
在一些实施方案中，2’-烷氧基修饰的核苷酸为2’-甲氧基(2’-OMe，2’-O-CH3)修饰的核苷酸等等。
在一些实施方案中，2’-取代的烷氧基修饰的核苷酸为2’-甲氧基乙氧基(2’-O-CH2-CH2-O-CH3)修饰的核苷酸，2’-O-CH2-CH＝CH2修饰的核苷酸等。
在一些实施方案中，2’-取代的烷基修饰的核苷酸为2’-CH2-CH2-CH＝CH2修饰的核苷酸等等。
在一些实施方案中，所述正义链和/或所述反义链中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸。在一些实施方式中，本发明提供的siRNA的正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为2'-氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸。在一些实施方案中，每一个非氟代修饰的核苷酸为2'-甲氧基修饰的核苷酸、GNA修饰的核苷酸或2’-脱氧核苷酸，所述2'-甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在一些实施方案中，当所述正义链的5’末端和3’末端都不连接(invAb)时，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
所述正义链3’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链3’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
或者，
所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
当所述正义链的仅5’末端连接一个(invAb)时，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端的(invAb)和5’末端起始的第1个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
当所述正义链的仅3’末端连接一个(invAb)时，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
所述正义链3’末端的(invAb)和3’末端起始的第1个核苷酸之间；
当所述正义链的5’末端和3’末端分别连接一个(invAb)时，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端的(invAb)和5’末端起始的第1个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链3’末端的(invAb)和3’末端起始的第1个核苷酸之间。
在一些实施方案中，所述反义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述反义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述反义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
所述反义链3’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述反义链3’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间。
在一个实施方案中，所述正义链和所述反义链中的任意一个核苷酸独立地为2'-氟代修饰的核苷酸、2'-甲氧基修饰的核苷酸、GNA修饰的核苷酸、2’-脱氧核苷酸或其中任意两种以上的组合。
在一些具体实施方式中，所述siRNA修饰物的正义链和反义链包含如表2的序列。
siRNA缀合物或其前药
本发明涉及一种siRNA缀合物或其前药，所述siRNA缀合物含有上述siRNA以及缀合连接至该siRNA的缀合基团。
在本申请中，siRNA缀合物的正义链与反义链形成siRNA缀合物的双链区，并且，在siRNA缀合物的正义链的3’末端形成平末端。在一些实施方案中，siRNA缀合物的正义链的3’末端形成平末端，siRNA缀合物的反义链的3’末端具有1-3个延伸出所述双链区的突出的核苷酸。在另外一些实施方案中，siRNA缀合物的正义链的3’末端形成平末端，siRNA缀合物的反义链的3’末端形成平末端。
在一些优选地实施方案中，siRNA缀合物由siRNA与缀合基团缀合连接得到。其中，siRNA的正义链与反义链互补形成siRNA的双链区，并且，siRNA的正义链的3’末端形成平末端，缀合基团与具有平末端的正义链的3’末端缀合连接，形成siRNA缀合物。
在一些优选的实施方案中，siRNA的正义链的3’末端具有延伸出双链区的突出的核苷酸，将位于正义链中3’末端的突出的核苷酸排除后形成的具有3’平末端的序列作为用于连接缀合基团的核苷酸序列，在正义链的3’平末端连接缀合基团，形成siRNA缀合物。
在一些更优选实施方式中，当正义链与反义链的核苷酸序列互补形成双链区后，正义链的3’末端不存在突出的核苷酸时，在正义链的3’末端添加核苷酸序列V，作为突出的核苷酸。将位于正义链中3’末端的突出的核苷酸排除后形成的具有3’平末端的序列作为用于连接缀合基团的核苷酸序列，在正义链的3’平末端连接缀合基团，形成siRNA缀合物。
在一些更优选实施方式中，当正义链与反义链的核苷酸序列互补形成双链区后，正义链的3’末端具有延伸出双链区的突出的核苷酸时，将位于正义链中3’末端的突出的核苷酸排除后形成的具有3’平末端的序列作为用于连接缀合基团的核苷酸序列，在正义链的3’平末端连接缀合基团，形成siRNA缀合物。
示例性地，序列如N-ER-FY018073M6所示的siRNA，该siRNA修饰物的正义链的3’末端具有延伸出双链区的突出的核苷酸，将位于正义链中3’末端的突出的-scsu核苷酸排除后形成的gscsuugaAfaCfCfCfguggcgcuuu平末端序列作为用于连接L96缀合基团的核苷酸序列，因此，形成siRNA缀合物的序列为：正义链为
gscsuugaAfaCfCfCfguggcgcuuuL96，反义链为asAfsagcGfccacgggUfuUfcaagcsusc。
一般来说，所述缀合基团包含药学上可接受的至少一个靶向基团，或者进一步还包含接头(linker)，并且，所述siRNA、所述接头和所述靶向基团依次连接。在一些实施方式中，所述靶向基团为1-6个。在一些实施方式中，所述靶向基团为2-4个。所述siRNA分子可以非共价或共价缀合至所述缀合基团，例如可以共价缀合至所述缀合基团。siRNA与缀合基团的缀合位点可以在siRNA正义链的3’末端或5’末端，也可在反义链的5’末端，还可以在siRNA的内部序列中。在一些实施方式中，所述siRNA与缀合基团的缀合位点在siRNA正义链的3'末端。
在一些实施方式中，所述缀合基团可以连接在核苷酸的磷酸基团、2'-位羟基或者碱基上。在一些实施方式中，所述缀合基团还可以连接在3'-位羟基上，此时核苷酸之间采用2'-5'磷酸二酯键连接。当缀合基团连接在siRNA链的末端时，所述缀合基团通常连接在核苷酸的磷酸基团上；当缀合基团连接在siRNA的内部序列时，所述缀合基团通常连接在核糖糖环或者碱基上。各种连接方式可以参考文献：Muthiah Manoharan et.al.siRNAconjugates carrying sequentially assembled trivalent N-acetylgalactosaminelinked through nucleosides elicit robust gene silencing in vivo inhepatocytes.ACS Chemical biology,2015,10(5):1181-7.
在一些实施方式中，所述siRNA与缀合基团间可以通过酸不稳定的、或可还原的化学键相连，在细胞内涵体的酸性环境下，这些化学键可降解，从而使siRNA成为自由状态。对于不可降解的缀合方式，缀合基团可连接在siRNA的正义链，从而尽量降低缀合对siRNA活性的影响。
在一些实施方式中，所述药学上可接受的靶向基团可以是siRNA给药领域常规使用的配体，例如WO2009082607A2中描述的各种配体，以引用的方式全文纳入本说明书。
在一些实施方式中，所述药学上可接受的靶向基团可以选自以下靶向分子或其衍生物形成的配体中的一种或多种：亲脂分子，例如胆固醇、胆汁酸、维生素(例如维生素E)、不同链长的脂质分子；聚合物，例如聚乙二醇；多肽，例如透膜肽；适配体；抗体；量子点；糖类，例如乳糖、聚乳糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)；叶酸(folate)；肝实质细胞表达的受体配体，例如去唾液酸糖蛋白、去唾液酸糖残基、脂蛋白(如高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等)、胰高血糖素、神经递质(如肾上腺素)、生长因子、转铁蛋白等。
在一些实施方式中，所述的每个配体独立地选自一个能够与细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个配体是能够与肝细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个配体是能够与哺乳动物细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个配体是能够与人肝细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个配体是能够与肝表面去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合的配体。这些配体的种类为本领域技术人员所公知，其作用一般是与靶细胞表面的特异性受体相结合，介导与配体连接的siRNA递送至靶细胞。
在一些实施方式中，所述药学上可接受的靶向基团可以是与哺乳动物肝细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合的任意一种配体。在一些实施方式中，每个配体独立地为去唾液酸糖蛋白，例如去唾液酸血清类粘蛋白(asialoorosomucoid，ASOR)或去唾液酸胎球蛋白(asialofetuin，ASF)。在一些实施方式中，所述配体为糖或糖的衍生物。
在一些实施方式中，至少一个配体是糖。在一些实施方式中，每个配体均是糖。在一些实施方式中，至少一个配体是单糖、多糖、修饰的单糖、修饰的多糖或糖衍生物。在一些实施方式中，至少一个所述配体可以是单糖，双糖或三糖。在一些实施方式中，至少有一个配体是修饰的糖。在一些实施方式中，每一个配体均为修饰的糖。在一些实施方式中，每个配体均独立地选自多糖、修饰的多糖、单糖、修饰的单糖、多糖衍生物或单糖衍生物。在一些实施方式中，每一个或至少一个配体选自于由以下糖所组成的组：葡萄糖及其衍生物、甘露聚糖及其衍生物、半乳糖及其衍生物、木糖及其衍生物、核糖及其衍生物、岩藻糖及其衍生物、乳糖及其衍生物、麦芽糖及其衍生物，阿拉伯糖及其衍生物、果糖及其衍生物和唾液酸。
在一些实施方式中，每个所述配体可独立地选自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-三氟乙酰半乳糖胺、N-丙酰半乳糖胺、N-正丁酰半乳糖胺、N-异丁酰半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖或L-4-硫代核糖。所述配体的其它选择可参见例如CN105378082A的记载，以引用的方式全文纳入本说明书。
在一些实施方式中，所述siRNA缀合物中药学上可接受的靶向基团可以是半乳糖或N-乙酰半乳糖胺，其中，半乳糖或N-乙酰半乳糖胺分子可以是一价、二价、三价、四价。应当理解的是，这里所述的一价、二价、三价、四价分别指siRNA分子与含有作为靶向基团的半乳糖或N-乙酰半乳糖胺分子的缀合基团形成siRNA缀合物后，该siRNA缀合物中siRNA分子与半乳糖或N-乙酰半乳糖胺分子的摩尔比为1:1、1:2、1:3或1:4。在一些实施方式中，所述药学上可接受的靶向基团是N-乙酰半乳糖胺。在一些实施方式中，当本申请所述的siRNA与含有N-乙酰半乳糖胺的缀合基团缀合时，N-乙酰半乳糖胺分子是三价或四价。在一些实施方式中，当本申请所述的siRNA与含有N-乙酰半乳糖胺的缀合基团缀合时，N-乙酰半乳糖胺分子是三价。
靶向基团可经由合适的接头与siRNA分子相连，本领域技术人员可以根据靶向基团的具体类型选择合适的接头。这些接头、靶向基团的种类以及与siRNA的连接方式，可参见WO2015006740A2的公开内容，以引用的方式全文纳入本说明书。
药物组合物
本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有如上所述的siRNA作为活性成分和药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可以是siRNA给药领域常规使用的载体，例如但不限于脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticle，LNP)、磁性纳米粒(magnetic nanoparticles，如基于Fe3O4或Fe2O3的纳米粒)、碳纳米管(carbon nanotubes)、介孔硅(mesoporous silicon)、磷酸钙纳米粒(calcium phosphate nanoparticles)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)、聚酰胺型树形高分子(polyamidoamine(PAMAM)dendrimer)、聚赖氨酸(poly(L-lysine)，PLL)、壳聚糖(chitosan)、1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)、聚D型或L型乳酸/羟基乙酸共聚物(poly(D&L-lactic/glycolic acid)copolymer，PLGA)、聚(氨乙基乙撑磷酸酯)(poly(2-aminoethylethylene phosphate)，PPEEA)和聚(甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯)(poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate)，PDMAEMA)以及它们的衍生物中的一种或多种。
所述药物组合物中，对siRNA和药学上可接受的载体的含量没有特别要求，可以是各组分常规的含量。
在一些实施方式中，所述药物组合物中，还可以包含药学上可接受的其它辅料，该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种。例如，所述药学上可接受的其它辅料可以包括pH缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。
所述pH缓冲液可以为pH值7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液和/或pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，例如可以为pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。
所述保护剂可以为肌醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖和葡萄糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准，所述保护剂的含量可以为0.01-30重量％。
所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克(mOsm/kg)。根据所需渗透压，本领域技术人员可以容易地确定所述渗透压调节剂的含量。
在一些实施方式中，所述药物组合物可以为液体制剂，例如注射液；也可以为冻干粉针剂，实施给药时与液体辅料混合，配制成液体制剂。所述液体制剂可以但不限于用于皮下、肌肉或静脉注射给药，也可以但不限于通过喷雾给药到肺脏、或通过喷雾经肺脏给药到其它脏器组织(如肝脏)。在一些实施方式中，所述药物组合物用于静脉注射给药。
在一些实施方式中，所述药物组合物可以为脂质体制剂的形式。在一些实施方式中，所述脂质体制剂中使用的药学上可接受的载体包含含胺的转染化合物(下文也可将其称为有机胺)、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质。
表1siRNA序列信息
表1-1
表2siRNA修饰物
表1和表2中，大写字母“G”、“C”、“A”、“T”和“U”每个通常代表分别含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶作为碱基的核苷酸；小写字母a、u、c、g：表示2’-甲氧基修饰的核苷酸；Af、Gf、Cf、Uf：表示2’-氟代修饰的核苷酸；小写字母s：表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；小写字母d：表示与该字母d右侧相邻的一个核苷酸为2’-脱氧核糖核苷酸；EVP：表示其右侧相邻的一个核苷酸为5’-反式乙烯基膦酸酯核苷酸；C(下划线+粗体+斜体)：表示GNA修饰的含有胞嘧啶作为碱基的核苷酸；(invAb)为反向脱碱基脱氧核糖残基。
表3siRNA缀合物
表3中L96通过磷酸二酯键与表2中正义链的3’末端或正义链的3’末端形成的平末端连接，L96也即式I所示的缀合物基团GalNAc：
表1、表2和表3中，正义链、修饰的正义链和连接缀合基团的修饰的正义链的5’末端核苷酸左侧如果没有标有EVP或(invAb)，则代表该5’末端核苷酸没有连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团或(invAb)，其结构如式X所示：
其中，Base表示碱基，例如A、U、G、C或T；R为羟基或被本领域技术人员所知晓的各类基团所取代，例如，R可以为2’-氟代(2’-F)、2’-烷氧基、2’-取代的烷氧基、2’-烷基、2’-取代的烷基、2’-氨基、2’-取代的氨基、2’-脱氧核苷酸。
表1、表2和表3中，反义链和修饰的反义链的5’末端核苷酸左侧如果没有标有EVP，则代表该5’末端核苷酸没有连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团，其结构也如式X所示。
表1和表2中，当正义链和修饰的正义链的3’末端没有连接(invAb)时，正义链和修饰的正义链的3’末端核苷酸的3’位置为羟基，表1、表2和表3中反义链和修饰的反义链的3’末端核苷酸的3’位置为羟基。
表2和表3中，修饰的正义链和连接缀合基团的修饰的正义链中，
当(invAb)位于3’末端的时候，(invAb)结构为
当(invAb)位于5’末端的时候，(invAb)结构为
当(invAb)连在中间的时候(即在3’末端连接L96时)，(invAb)结构式为
上面连正义链的3’末端，下面连缀合基团。
以下实施例用于进一步说明本发明，但不对本发明进行任何限制。
实施例
本申请的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本申请的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本申请的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
Phosphate Buffered Saline(PBS)购自Gibco，货号：10010-023；
TaqMan探针引物(GAPDH)购自Thermo，货号：4351268Assay ID：Hs02786624_g1；
TaqMan探针引物(ASGPR1)购自Thermo，货号：4351368Assay ID：Hs01586213_m1。
实施例1:siRNA的合成
1.1siRNA序列设计
根据人ASGPR1基因mRNA序列，选择不同位点设计多对ASGPR1 siRNA，设计的所有单个siRNA均能靶向靶基因的所有转录本(如表4)，这些多对siRNA经序列相似性软件比对与其他所有非靶标基因序列有最低同源性。
表4
靶基因 物种 NM_ID
ASGPR1 Homo sapiens NM_001671.5
1.2合成方法描述
通过本领域常规的固相亚磷酰胺法，按照核苷酸排布顺序自3’-5’方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体都包括脱保护、偶联、氧化或硫化、盖帽四步反应。其中，两个核苷酸之间采用磷酸二酯键连接时，连接后一个核苷单体时，包括脱保护、偶联、氧化、盖帽四步反应。两个核苷酸之间采用硫代磷酸酯基连接时，连接后一个核苷单体时，包括脱保护、偶联、硫化、盖帽四步反应。本发明根据合成目标序列选取核苷酸单体，选取的核苷酸单体为本领域技术人员常用的核苷酸单体，例如合成A的核苷酸单体可以为但不限于选择腺苷-3-磷酸。应理解这些单体当存在于寡核苷酸中时通过5’-3’磷酸二酯键或者5’-3’硫代磷酸酯基互相连接，当例如按5’到3’方向最后一个核苷酸3’位置为羟基时，根据本领域技术常规手段实现。
1.3合成条件给定如下
核苷单体以0.1M浓度的乙腈溶液提供，每一步的脱保护反应的条件均相同，即温度为25℃，反应时间为70秒，脱保护试剂为二氯乙酸的二氯甲烷溶液(3％V/V)，二氯乙酸与固相载体上4,4’-二甲氧基三苯甲基保护基的摩尔比为5:1。
每一步偶联反应的条件均相同，包括温度为25℃，反应时间为600秒，偶联试剂为5-乙硫基-1H-四氮唑(ETT)的0.25M乙腈溶液，固相载体上连接的核酸序列与核苷单体的摩尔比为1:10，固相载体上连接的核酸序列和偶联试剂的摩尔比为1:65。
每一步氧化反应的条件均相同，包括温度为25℃，反应时间为15秒，氧化试剂为0.05M碘的四氢呋喃溶液，碘与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为30:1。反应在四氢呋喃:水:吡啶＝3:1:1的混合溶剂中进行。
每一步硫化反应的条件均相同，包括温度为25℃，反应时间为300秒，硫化试剂为氢化黄原素。硫化试剂与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为120:1。反应在乙腈:吡啶＝1:1的混合溶剂中进行。
每一步盖帽反应的条件均相同，包括温度为25℃，反应时间为15秒，盖帽试剂为摩尔比为1:1的CapA(10％的乙酸酐/乙腈溶液)和CapB(10％的N-甲基咪唑吡啶/乙腈溶液)的混合溶液，盖帽试剂与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比，即乙酸酐:N-甲基咪唑:固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为1:1:1。
待最后一个核苷单体连接完成后，依次对固相载体上连接的核酸序列进行切割、脱保护、纯化、脱盐，随后冻干得到siRNA正义链和反义链，最后将两条链进行加热退火得到产品，冻干，得到冻干粉。
合成的siRNA如表1所示，合成的siRNA修饰物如表2所示。
实施例2：siRNA缀合物(GalNAc-siRNA)的合成
2.1siRNA缀合物具有如下式II所示的结构：
2.2siRNA缀合物的合成过程
第一步，通过将DMTr-L96和丁二酸酐反应，得到化合物L96-A：
制备过程：将DMTr-L96、丁二酸酐、4-二甲基氨基吡啶和二异丙基乙胺加入二氯甲烷中，25℃下搅拌反应24小时，然后用0.5M三乙胺磷酸盐洗涤反应液，水相以二氯甲烷洗涤三次，合并有机相减压蒸干得粗品。然后柱层析纯化得到纯品L96-A。
第二步，将L96-A与NH2-SPS反应得到L96-B：
制备过程：将L96-A、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和二异丙基乙胺(DIPEA)混合溶于乙腈中，室温搅拌5分钟得到均一溶液，加入氨甲基树脂(NH2-SPS，100-200目)至反应液体中，25℃下开始摇床反应，反应18小时后过滤，滤饼依次用二氯甲烷和乙腈洗涤，得滤饼。所得滤饼用CapA/CapB混合溶液进行盖帽反应得到L96-B，即为含有缀合分子的固相载体，然后在偶联反应下将核苷单体连接至缀合分子，随后按照前文所述的siRNA分子合成方法合成连接至缀合物分子的siRNA正义链，采用前文所述的siRNA分子合成方法合成siRNA反义链，退火生成本申请的siRNA缀合物。
合成的siRNA缀合物如表3所示。
实施例3：siRNA、siRNA修饰物、siRNA缀合物抑制ASGPR1基因表达
3.1实验材料：
HepG2细胞，购自ATCC，货号HB-8065；
96Kit，购自QIAGEN，货号QIAGEN-74182；
RNAiMAX转染试剂，购自Invitrogen，货号13778-150；
MEM培养基，购自Gibco，货号41090036；
FastStart Universal SYBR Green Master,购自Roche，货号4913914001；
Opti-medium：减血清培养基，购自Gibco，货号31985-070；
Fastking RT Kit(含gDNase)，购自TianGen，货号KR116-02。
3.2实验方法：
3.2.1将HepG2细胞铺于96孔板的新鲜MEM培养基中培养24小时，将所培养的细胞用无PS(青霉素链霉素混合液)的MEM培养基重悬，制成密度为5.55×104/mL的细胞悬液，铺到96孔板中，每孔加90μL细胞悬液，即5000个细胞/孔。
3.2.2将待测siRNA、siRNA修饰物和siRNA缀合物(为便于描述，本实施例实验过程描述中统称为siRNA)的干粉以低温高速离心，然后用超纯蒸馏水溶解，配制成100μM的siRNA母液。
3.2.3配制2nM的siRNA稀释液Z和20nM的siRNA稀释液W
a)取上述步骤制得的100μM siRNA母液2μL，加入18μL超纯蒸馏水，得到终浓度为10μM的siRNA稀释液；
b)取步骤a)中制得的10μM的siRNA稀释液2μL，加入18μL超纯蒸馏水，得到终浓度为1μM的siRNA贮备液Y；
c)取步骤b)中制得的1μM的siRNA稀释液2μL，加入18μL超纯蒸馏水，得到终浓度为0.1μM的siRNA贮备液X；
取上述配置好的siRNA贮备液X和siRNA贮备液Y各2μL，分别加入98μL Opti-medium，分别得到2nM的siRNA稀释液Z和20nM的siRNA稀释液W。
3.2.4转染HepG2细胞
(1)取RNAiMAX转染试剂3μL，加入97μL Opti-medium，得到RNAiMAX转染试剂稀释液；将RNAiMAX转染试剂稀释液与上述步骤3.2.3中制得的2nM的siRNA稀释液Z以1:1体积比混合制备成转染混合物，静置5分钟，取10μL转染混合物加入到96孔板中转染上述步骤3.2.1中培养的HepG2细胞(终体积100μL，该体系中siRNA的浓度为0.1nM)；
(2)取RNAiMAX转染试剂3μL，加入97μL Opti-medium，得到RNAiMAX转染试剂稀释液；将RNAiMAX转染试剂稀释液与上述步骤3.2.3中制得的20nM的siRNA稀释液W以1:1体积比混合制备成转染混合物，静置5分钟，取10μL转染混合物加入到96孔板中转染上述步骤3.2.1中培养的HepG2细胞(终体积100μL，该体系中siRNA的浓度为1nM)；
上述转染后培养48小时，每个浓度(1nM和0.1nM)设置2个重复。
3.2.5根据96Kit试剂盒产品说明书，提取步骤3.2.4获得的转染后HepG2细胞中的总RNA。
3.2.6对提取的总RNA使用Fastking RT Kit(含gDNase)进行逆转录至cDNA，按照以下步骤进行：
a)按照表5用gDNase除去gDNA：
表5
体积/μL
5×gDNA Buffer(含gDNase) 2
总RNA样品 8
42℃，3min；4℃，静置。
b)向步骤a)得到的体系中加入如表6所述各试剂并进行逆转录：
表6
体积/μL
FastKing RT Enzyme Mix 1
FQ-RT Primer Mix 2
10×King RT Buffer 2
RNase-Free ddH2O 5
42℃，15min；95℃，3min。
c)将步骤b)所得逆转录产物储存在-20℃，以进行实时PCR分析。
3.2.7进行实时PCR分析
a)如表7所示制备实时PCR反应混合物，在整个操作过程中，所有试剂都放置在冰上：
表7
体积/μL
2×FastStart Universal SYBR Green Master 5
20×靶基因特异性TaqMan探针引物(ASGPR1) 0.5
20×靶基因特异性TaqMan探针引物(GAPDH) 0.5
步骤3.2.6得到的cDNA和H2O 4
总体积 10
b)如下所述进行qPCR程序：
95℃，10分钟；
95℃，15秒，60℃，1分钟(该操作40个循环)。
3.2.8结果分析
a)使用Quant Studio 7软件采用默认设置，自动计算Ct值；
b)使用以下公式计算基因的相对表达量：
ΔCt＝Ct(ASGPR1基因)–Ct(GAPDH)
ΔΔCt＝ΔCt(检测样品组)-ΔCt(Mock组)，其中Mock组表示和检测样品组相比，未加入siRNA的组；
相对于Mock组的mRNA表达＝2-ΔΔCt。
抑制率＝(Mock组mRNA表达量–检测样品组mRNA表达量)/Mock组mRNA表达量×100％
3.3沉默实验结果
选取siRNA浓度1nM和0.1nM进行测试，结果如表8、表9和表10所示。
对比序列
P1：表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5’-磷酸核苷酸。
表8
siRNA ID 1nM-48h(％) 0.1nM-48h(％)
N-ER-FY018074D2 91.92 89.63
N-ER-FY018081 89.22 89.15
N-ER-FY018082 85.81 84.03
N-ER-FY018083 88.66 85.51
N-ER-FY018084 83.96 77.32
表9
siRNA ID 1nM-48h(％) 0.1nM-48h(％)
N-ER-FY018073M6 78.92 59.83
N-ER-FY018073M7 76.98 63.36
N-ER-FY018074M6 83.86 66.15
N-ER-FY018074M7 83.68 62.74
N-ER-FY018074M7D2 84.72 75.29
N-ER-FY018074M8 89.79 84.93
N-ER-FY018074M9 89.30 86.97
N-ER-FY018080M6 79.72 57.31
N-ER-FY018080M7 78.59 56.33
N-ER-FY018074M59 82.02 72.68
N-ER-FY018074M60 90.52 86.84
N-ER-FY018074M61 70.28 42.20
N-ER-FY018074M62 80.07 60.43
N-ER-FY018074M36 76.96 41.83
N-ER-FY018074M37 71.39 38.78
N-ER-FY018074M40 88.57 68.65
N-ER-FY018074M41 81.97 44.31
N-ER-FY018074M42 85.17 61.77
N-ER-FY018074M43 63.19 36.74
N-ER-FY018074M44 89.66 83.78
N-ER-FY018074M45 84.27 70.95
N-ER-FY018074M53 91.43 81.86
N-ER-FY018074M54 91.25 83.03
N-ER-FY018074M55 91.14 82.32
N-ER-FY018081M56 91.25 81.99
N-ER-FY018081M57 89.07 81.63
N-ER-FY018081M58 88.05 82.41
N-ER-FY018074M63 93.91 86.52
N-ER-FY018074M64 87.23 69.71
N-ER-FY018074M65 99.35 90.19
N-ER-FY018074M66 80.46 40.91
N-ER-FY018074M67 82.98 66.27
N-ER-FY018074M68 77.38 54.84
N-ER-FY018074M69 98.24 93.82
N-ER-FY018074M2 82.95 64.60
表10
siRNA ID 1nM-48h(％) 0.1nM-48h(％)
N-ER-FY018074M8L96 90.58 88.98
N-ER-FY018074M9L96 90.44 88.56
N-ER-FY018074M59L96 92.31 88.97
N-ER-FY018074M60L96 92.77 90.18
N-ER-FY018074M62L96 82.68 68.47
N-ER-FY018074M40L96 89.96 83.14
N-ER-FY018074M42L96 87.57 76.57
N-ER-FY018074M44L96 95.09 89.12
N-ER-FY018074M45L96 81.36 43.05
N-ER-FY018074M63L96 95.40 87.66
N-ER-FY018074M64L96 89.25 62.63
N-ER-FY018074M65L96 99.13 93.90
N-ER-FY018074M66L96 83.64 61.68
N-ER-FY018074M67L96 85.56 54.88
N-ER-FY018074M68L96 76.30 43.36
N-ER-FY018074M69L96 99.31 94.93
从表8、表9和表10可以看出，本公开的siRNA、siRNA修饰物和siRNA缀合物在1nM和0.1nM下均可显著抑制ASGPR1基因的表达，并且显示了剂量依赖效应。其中，siRNA修饰物在1nM下48h抑制率在约85％以上，优选的抑制率在约90％以上，在0.1nM下48h抑制率在约80％以上；siRNA缀合物在1nM下48h抑制率在约90％以上，优选的抑制率在约95％以上，在0.1nM下48h抑制率在约90％以上。
实施例4：siRNA缀合物抑制ASGPR1基因表达的抑制率测定
4.1实验材料：
人原代肝细胞PHH细胞，由上海药明康德新药开发有限公司提供；
PHH培养基：invitroGRO CP Meduim serum free BIOVIT，货号：S03316；
RNAiMAX转染试剂，购自Invitrogen，货号：13778-150；
96Kit，购自QIAGEN，货号：QIAGEN-74182；
FastKing RT Kit(含gDNase)，购自TianGen，货号：KR116-02；
FastStart Universal SYBR Green Master，购自Roche，货号：4913914001；
针对ASGPR1及GAPDH的引物，由上海药明康德新药开发有限公司提供。
4.2实验方法
siRNA缀合物(siRNA缀合物终浓度分别为1nM和0.1nM，复孔)通过转染进入PHH细胞，过程如下所述：取冻存的PHH细胞，复苏，计数，调整细胞到6×105细胞/mL，同时应用RNAiMax转染试剂将siRNA缀合物转入细胞，以每孔54,000个细胞的密度接种到96孔板中，每孔培养液为100μL。细胞置于5％ CO2、37℃孵箱中培养。48小时后，去除培养基并收集细胞用于总RNA提取。根据试剂盒产品说明书使用96Kit提取总RNA。
siRNA缀合物(siRNA缀合物终浓度分别为20nM和1nM，复孔)通过自由摄取进入PHH细胞，过程如下所述：取冻存的PHH细胞，复苏，计数，调整细胞到6×105细胞/mL，同时加入siRNA缀合物，以每孔54,000个细胞的密度接种到96孔板中，每孔培养液为100μL。细胞置于5％ CO2、37℃孵箱中培养。48小时后，去除培养基并收集细胞用于总RNA提取。根据试剂盒产品说明书使用96Kit提取总RNA。
采用与实施例3中相似的方法，通过逆转录反应将提取的总RNA逆转录为cDNA，以及通过qPCR对逆转录得到的ASGPR1 cDNA进行定量扩增。GAPDH cDNA将作为内部对照进行平行扩增。PCR反应程序为：95℃，10分钟，然后进入循环模式，95℃，15秒，随后60℃，60秒，共40个循环。
结果分析：
a)使用Quant Studio 7软件采用默认设置，自动计算Ct值；
b)使用以下公式计算基因的相对表达量：
ΔCt＝Ct(ASGPR1基因)–Ct(GAPDH)
ΔΔCt＝ΔCt(检测样品组)–ΔCt(Mock组)，其中Mock组表示和检测样品组相比，未加入siRNA缀合物的组；
相对于Mock组的mRNA表达＝2-ΔΔCt
抑制率(％)＝(Mock组mRNA相对表达量–检测样品组mRNA相对表达量)/Mock组mRNA相对表达量×100％。
实验结果如表11所示。
表11siRNA缀合物抑制ASGPR1基因表达的抑制率
从表11中可以看出，本公开的siRNA缀合物可显著抑制ASGPR1基因表达。在转染和自由摄取两种方式下，均显示了剂量依赖效应。在自由摄取条件下，在20nM浓度的抑制率高达87.07％，在1nM浓度的抑制率高达80.94％；在转染条件下，在1nM浓度的抑制率高达90.03％，在0.1nM浓度的抑制率高达88.69％。
实施例5：siRNA缀合物在表达人ASGPR1(hASGPR1)基因的小鼠体内沉默效果
5.1AAV构建过表达hASGPR1基因小鼠模型
6-8周龄的C57BL/6小鼠(由江苏集萃药康生物科技股份有限公司提供)进入设施，适应性喂养3-5天后，尾静脉单次注射hASGPR1基因的腺相关病毒AAV(pAAV[Exp]-CBh>SEAP(ns):T2A:{ASGPR1 CDS+3'utr}:WPRE，病毒由云舟生物提供，病毒ID：VB230114-1055twa)进行靶基因过表达造模，给药体积：100μL(3*1011vg)/只，随后普通饲料喂养。
5.2针对hASGPR1小鼠模型体内沉默siRNA药效考察
AAV病毒注射14日后，分组(每组6只)，小鼠皮下给药单一的1mg/kg或3mg/kg剂量的本申请siRNA缀合物，给药体积为5μL/g小鼠体重，溶剂为无RNA酶的无菌PBS，空白组注射同等体积的无RNA酶的无菌PBS。给药后第7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天和第56天检测SEAP蛋白表达量(即hASGPR1蛋白表达量)。
hASGPR1的抑制率计算公式为：抑制率(％)＝(1-检测样品组SEAP蛋白相对表达量/空白组SEAP蛋白相对表达量)*100％。
对比序列
结果如表12所示。
表12
从该实验中可以得出，本公开的siRNA缀合物在体内对hASGPR1基因具有较高的抑制活性，能够长时间降低hASGPR1蛋白水平；当给药剂量为3mpk时，给药后56天，N-ER-FY018074M44L96和N-ER-FY018074M65L96的抑制率仍然在80％以上，优选地N-ER-FY018074M65L96的抑制率在85％以上。
实施例6:siRNA缀合物在高血脂模型食蟹猴中的药效实验
6.1 10岁以上HFD(High-fat diet，高脂饮食)诱导的高血脂雄性食蟹猴(体重>8kg)6只(由昆明亚灵/科灵生物科技有限公司提供)，分成两组，进入饲养设施喂养，给药前的Day-9进行肝脏组织病理染色(油红O)，Day-7进行肝脏穿刺活检。
6.2给药观察期
动物将进行13周给药观察期。给药当天定义为Day 0(D0)。具体给药设计概述见表13，其中N-ER-FY018074M6L96使用无RNA酶的无菌PBS进行溶解。
表13
注射位点为肩胛骨/颈外侧皮肤松弛区域。将注射位点周围毛发剔除干净，使用碘伏和酒精消毒皮肤后，进行皮下给药。给药后D56和D89进行肝脏组织病理染色(油红O)，计算肝组织油红O染色中的脂肪变化百分比；D28、D56和D87肝脏穿刺活检进行mRNA表达分析，计算肝脏mRNA剩余百分比。结果如表14和表15。
表14
从表14可以看出，本公开的siRNA缀合物在高血脂模型的食蟹猴体内对肝脂肪含量变化改善效果明显，D56使肝脏脂肪含量降低达28.57％，D89使肝脏脂肪含量降低达42.86％。
表15
从表15可以看出，本公开的siRNA缀合物在高血脂模型的食蟹猴体内能够明显降低食蟹猴肝脏ASGPR1 mRNA的表达量，D87肝脏mRNA剩余仅为19.30％。
实施例7：siRNA缀合物在CD-1小鼠中的血浆动力学研究
试验动物：CD-1小鼠，SPF级，雄性，30g左右，购买于斯贝福(北京)生物技术有限公司。
给药剂量和方式：siRNA缀合物在3mg/kg(10mL/kg)的剂量下给药，随机分组后单次皮下注射给药，每组6只小鼠。
样品采集：采集给药后0.0833、0.25、0.5、1、2、4、8、24、36、48h全血样品，共10个点。每组前3只采集0.0833、0.5、2、8、36h，后3只采集0.25、1、4、24、48h，采集全血后离心分离血浆进行检测分析。
样品检测与分析：采用LC-MS/MS方法检测各时间点血浆样品中原形药物的浓度，使用WinNonlin软件计算PK参数：Cmax、Tmax、AUC、MRT、t1/2。
从该实验中可以得出，本公开的siRNA缀合物在血浆中半衰期较短，清除较快。
实施例8：siRNA缀合物在CD-1小鼠中的组织分布试验
试验动物：CD-1小鼠，SPF级，雄性，30g左右，购买于斯贝福(北京)生物技术有限公司。
给药剂量和方式：siRNA缀合物在3mg/kg(10mL/kg)的剂量下给药，随机分组后单次皮下注射给药，每个时间点3只动物，共24只小鼠。
样品采集：
给药后24h：采集血浆、肝、肾、脾；
给药后72h：采集血浆、肝、肾、脾；
给药后168h(1周)：采集血浆、肝、肾、脾、脑、心、肺、胃、小肠、肌肉、睾丸；
给药后336h(2周)：采集血浆、肝、肾、脾；
给药后672h(4周)：采集血浆、肝、肾、脾、脑、心、肺、胃、小肠、肌肉、睾丸；
给药后1008h(6周)：采集血浆、肝、肾、脾；
给药后1344h(8周)：采集血浆、肝、肾、脾；
给药后1680h(10周)：采集血浆、肝、肾、脾、脑、心、肺、胃、小肠、肌肉、睾丸。
样品检测与分析：采用LC-MS/MS方法检测各时间点血浆和组织样品中原形药物的浓度，采用梯形面积法计算血浆及组织中的AUC。
从该实验中可以得出，本公开的siRNA缀合物主要富集于肝脏，在组织中保留时间较长，具有很好的稳定性。
实施例9：大鼠肝匀浆体外稳定性实验
9.1实验步骤
9.1.1配置肝匀浆
9.1.1.1研磨液配置
表16
9.1.1.2组织匀浆
将大鼠肝组织与研磨液按100mg:5mL配制肝匀浆(浓度为20mg/mL)；配制后加入研磨珠放入匀浆仪，研磨参数设置如下。
表17
运行速度 60Hz
运行时间 30s
暂停时间 15s
运行次数 4次
运行温度 -20℃
9.2样品配置
siRNA缀合物样品用无酶水配制为1mg/mL的溶液，待用。内标样品用无酶水配制为0.125mg/mL浓度。
9.3样本孵育
(1)在2mL无酶管中加入250μL配置好的肝匀浆，
(2)在步骤1基础上加入50μL核酸样品；
(3)体系为300μL的生物样本，涡旋，静置5min；
(4)分为2管，每管100μL；
(5)体系孵育时间：48h。
9.4生物样本处理
每100μL生物样本体系涡旋，混匀，加入300μL clarity OTX裂解液(Clarity OTXLysis-loading Buffer，购自艾杰尔-飞诺美，货号AL0-8579)涡旋，静置30min，加入100μL内标溶液，涡旋，静置5min，离心1min，待用(样本总体积约500μL)。
9.5固相萃取：
(1)固相萃取试剂配置
活化剂：取200mL甲醇至流动相瓶中，标记为活化剂；
平衡液：配置1M磷酸缓冲溶液【877mL磷酸二氢钠(1.56g/L)+123mL磷酸氢二钠(3.58g/L)】，稀释100倍，使用磷酸调pH至5.5，标记为平衡液；
冲洗液：取500mL平衡液至1L流动相瓶中，加入500mL乙腈，使用磷酸调pH至5.5，混匀，标记为冲洗液；
洗脱液：称取碳酸氢铵7.9g至1L流动相瓶中，加入1L水，取碳酸氢铵溶液500mL至1L流动相瓶中，加入500mL乙腈，使用氢氧化钠调节pH＝9，混匀，标记为洗脱液；
(2)萃取步骤，如下表所示：
表18
9.6后处理
取洗脱液(分两次取，一次600mL，共计1200mL)置于2mL EP管中，真空浓缩6小时，转速1800rpm；浓缩后的样品加入100μL流动相(初始比例)进行复溶，低速离心2min，取上清液10μL注入高分辨质谱。采用LC-MS/MS方法半定量检测本申请siRNA缀合物的反义链AS剩余量及主要活性代谢产物的反义链AS(n-1)(即反义链3’少一个碱基)含量。
表19
从该实验中可以得出，本公开的siRNA缀合物N-ER-FY018074M44L96、N-ER-FY018074M45L96、N-ER-FY018074M63L96、N-ER-FY018074M64L96和N-ER-FY018074M65L96在大鼠肝匀浆中具有优异的体外稳定性，且均优于N-ER-FY018074M2L96。

Claims (26)

1.一种抑制去唾液酸糖蛋白受体1(ASGPR1)基因表达的siRNA，所述siRNA包含正义链与反义链，其中所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中所述正义链含有核苷酸序列I，反义链含有核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，其中所述核苷酸序列I和核苷酸序列II选自以下序列：
(1)所述核苷酸序列I包含SEQ ID NO:67所示的核苷酸序列，且所述核苷酸序列II包含SEQ ID NO:68所示的核苷酸序列：
5'-ACCCGUGGCGCUUU-3'(SEQ ID NO:67)
5'-AAAGCGCCACGGGU-3'(SEQ ID NO:68)；
(2)所述核苷酸序列I包含SEQ ID NO:69所示的核苷酸序列，且所述核苷酸序列II包含SEQ ID NO:70所示的核苷酸序列：
5'-AGCUUGAAACCCGUGG-3'(SEQ ID NO:69)
5'-CCACGGGUUUCAAGCU-3'(SEQ ID NO:70)。
2.根据权利要求1所述的siRNA，其中所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补；所述基本上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；所述完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有碱基错配。
3.根据权利要求1或2所述的siRNA，其中所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV的长度各自独立地为0-8个核苷酸，其中所述核苷酸序列III连接在所述核苷酸序列I的5'末端，所述核苷酸序列IV连接在所述核苷酸序列II的3'末端，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV长度相等并且实质上反向互补或完全反向互补；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；所述完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有碱基错配；和/或
所述核苷酸序列III连接在所述核苷酸序列I的3'末端，所述核苷酸序列IV连接在所述核苷酸序列II的5'末端，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV长度相等并且实质上反向互补或完全反向互补；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；所述完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有碱基错配。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的siRNA，所述siRNA包含正义链与反义链，其中所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中所述正义链含有核苷酸序列I和III，反义链含有核苷酸序列II和IV，所述核苷酸序列I和III与所述核苷酸序列II和IV至少部分地反向互补形成双链区，其中所述核苷酸序列I和III、所述核苷酸序列II和IV选自以下序列：
(1)所述核苷酸序列I和III包含或由如SEQ ID NO:61所示的核苷酸序列组成，且所述核苷酸序列II和IV包含或由如SEQ ID NO:62所示的核苷酸序列组成；
(2)所述核苷酸序列I和III包含或由如SEQ ID NO:40所示的核苷酸序列组成，且所述核苷酸序列II和IV包含或由如SEQ ID NO:63所示的核苷酸序列组成；
(3)所述核苷酸序列I和III包含或由如SEQ ID NO:64所示的核苷酸序列组成，且所述核苷酸序列II和IV包含或由如SEQ ID NO:65所示的核苷酸序列组成；
(4)所述核苷酸序列I和III包含或由如SEQ ID NO:41所示的核苷酸序列组成，且所述核苷酸序列II和IV包含或由如SEQ ID NO:37所示的核苷酸序列组成；
(5)所述核苷酸序列I和III包含或由如SEQ ID NO:42所示的核苷酸序列组成，且所述核苷酸序列II和IV包含或由如SEQ ID NO:71所示的核苷酸序列组成；
(6)所述核苷酸序列I和III包含或由如SEQ ID NO:44所示的核苷酸序列组成，且所述核苷酸序列II和IV包含或由如SEQ ID NO:72所示的核苷酸序列组成；
(7)所述核苷酸序列I和III包含或由如SEQ ID NO:46所示的核苷酸序列组成，且所述核苷酸序列II和IV包含或由如SEQ ID NO:66所示的核苷酸序列组成。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的siRNA，其中所述正义链还含有核苷酸序列V和/或所述反义链还含有核苷酸序列VI，所述核苷酸序列V和所述核苷酸序列VI的长度为0-3个核苷酸，所述核苷酸序列V连接在所述正义链的3'末端构成正义链的3'突出端和/或所述核苷酸序列VI连接在所述反义链的3'末端构成反义链的3'突出端；优选地，所述核苷酸序列V或所述核苷酸序列VI的长度为1-2个核苷酸；
或者，所述核苷酸序列V或所述核苷酸序列VI与靶mRNA相应位置的核苷酸错配或互补。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的siRNA，其中所述双链区的长度是15-30个核苷酸对；优选地，所述双链区的长度是17-23个核苷酸对；更优选地，所述双链区的长度是19-23个核苷酸对。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的siRNA，其中所述正义链或所述反义链具有15-30个核苷酸；优选地，所述正义链或所述反义链具有19-25个核苷酸；更优选地，所述正义链或所述反义链具有19-23个核苷酸。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的siRNA，其中所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基；优选地，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基；和/或，所述siRNA包含不具有3'突出端核苷酸的正义链。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的siRNA，其中所述反义链5'末端核苷酸连接5'磷酸基团或5'磷酸衍生基团，或所述反义链的5'末端核苷酸不连接5'磷酸基团或5'磷酸衍生基团；和/或
所述正义链的5’末端和3’末端都不连接(invAb)，或所述正义链的仅5’末端连接一个(invAb)，或所述正义链的仅3’末端连接一个(invAb)，或所述正义链的5’末端和3’末端分别连接一个(invAb)。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的siRNA，其中所述修饰的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸、2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-取代的烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-取代的烷基修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-取代的氨基修饰的核苷酸、核苷酸类似物或其中任意两种以上的组合。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的siRNA，其中所述修饰的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸、2'-甲氧基修饰的核苷酸、2'-O-CH2-CH2-O-CH3修饰的核苷酸、2'-O-CH2-CH＝CH2修饰的核苷酸、2'-CH2-CH2-CH＝CH2修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸、核苷酸类似物或其中任意两种以上的组合；
所述核苷酸类似物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA或GNA。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的siRNA，其中所述正义链中的每一个核苷酸独立地为2’-氟代修饰的核苷酸或2’-甲氧基修饰的核苷酸；
沿5’末端向3’末端方向，所述正义链中第7位、第9位、第10位和第11位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述正义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链中第9位、第11位、第12位和第13位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述正义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链中第5位、第9位、第10位和第11位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述正义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链中第5位、第9位、第11位和第13位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述正义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链中第9位、第11位、第16位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述正义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链中第8位、第9位和第11位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述正义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸。
13.根据权利要求1-12任一项所述的siRNA，其中当所述正义链的5’末端和3’末端都不连接(invAb)时，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
所述正义链3’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链3’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
或者，
所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
当所述正义链的仅5’末端连接一个(invAb)时，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端的(invAb)和5’末端起始的第1个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
当所述正义链的仅3’末端连接一个(invAb)时，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
所述正义链3’末端的(invAb)和3’末端起始的第1个核苷酸之间；
当所述正义链的5’末端和3’末端分别连接一个(invAb)时，沿5’末端向3’末端方向，所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端的(invAb)和5’末端起始的第1个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链3’末端的(invAb)和3’末端起始的第1个核苷酸之间。
14.根据权利要求1-13任一项所述的siRNA，其中所述反义链中的每一个核苷酸独立地为2’-氟代修饰的核苷酸，2’-甲氧基修饰的核苷酸，GNA修饰的核苷酸或2’-脱氧核糖核苷酸；
沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第6位、第14位和第16位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第6位、第8位、第9位、第14位和第16位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第3位、第4位、第5位、第7位、第10位和第14位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第3位、第4位、第5位、第7位、第10位和第14位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中第6位的核糖核苷酸为核苷酸衍生物GNA修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第7位、第10位和第14位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第5位、第7位和第14位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第5位、第14位和第16位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第3位、第5位、第7位、第10位、第12位和第14位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中第6位的核糖核苷酸为核苷酸衍生物GNA修饰的核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸；
或者，沿5’末端向3’末端方向，所述反义链中第2位、第7位和第14位的核糖核苷酸为2’-F修饰的核糖核苷酸，所述反义链中第5位和第12位的核糖核苷酸为2’-脱氧核糖核苷酸，所述反义链中其余位置的核糖核苷酸为2’-O-CH3修饰的核糖核苷酸。
15.根据权利要求1-14任一项所述的siRNA，其中所述反义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述反义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述反义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
所述反义链3’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述反义链3’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间。
16.根据权利要求1-15任一项所述的siRNA，其包含或选自由表1、表1-1和表2的siRNA组成的组；优选地，所述siRNA选自N-ER-FY018074、N-ER-FY018074D2、N-ER-FY018074M6、N-ER-FY018074M7、N-ER-FY018074M6D2、N-ER-FY018074M7D2、N-ER-FY018074M8、N-ER-FY018074M9、N-ER-FY018074M59、N-ER-FY018074M60、N-ER-FY018074M61、N-ER-FY018074M62、N-ER-FY018074M36、N-ER-FY018074M37、N-ER-FY018074M40、N-ER-FY018074M41、N-ER-FY018074M42、N-ER-FY018074M43、N-ER-FY018074M44、N-ER-FY018074M45、N-ER-FY018074M53、N-ER-FY018074M54、N-ER-FY018074M55、N-ER-FY018074M63、N-ER-FY018074M64、N-ER-FY018074M65、N-ER-FY018074M66、N-ER-FY018074M67、N-ER-FY018074M68、N-ER-FY018074M69组成的组。
17.一种siRNA缀合物或其前药，所述siRNA缀合物含有权利要求1-16任一项所述的siRNA以及缀合至该siRNA的缀合基团。
18.根据权利要求17所述的siRNA缀合物或其前药，其中所述缀合基团包含药学上可接受的靶向基团和接头，并且所述siRNA、所述接头和所述靶向基团依次共价或非共价连接；
优选地，在所述siRNA缀合物中，siRNA的正义链与反义链互补形成所述siRNA缀合物的双链区，且所述正义链的3’末端形成平末端，所述反义链的3’末端具有1-3个延伸出所述双链区的突出的核苷酸；
或者，
在所述siRNA缀合物中，siRNA的正义链与反义链互补形成所述siRNA缀合物的双链区，且所述正义链的3’末端形成平末端，所述反义链的3’末端形成平末端。
19.根据权利要求17或18所述的siRNA缀合物或其前药，其中所述缀合基团选自如下任意一种：
20.根据权利要求17-19任一项所述的siRNA缀合物或其前药，其中所述siRNA缀合物包含或选自由表3的siRNA缀合物组成的组；优选地，所述siRNA缀合物选自N-ER-FY018074M6L96、N-ER-FY018074M7L96、N-ER-FY018074M8L96、N-ER-FY018074M9L96、N-ER-FY018074M59L96、N-ER-FY018074M60L96、N-ER-FY018074M62L96、N-ER-FY018074M40L96、N-ER-FY018074M42L96、N-ER-FY018074M44L96、N-ER-FY018074M45L96、N-ER-FY018074M63L96、N-ER-FY018074M64L96、N-ER-FY018074M65L96、N-ER-FY018074M66L96、N-ER-FY018074M67L96、N-ER-FY018074M68L96、N-ER-FY018074M69L96组成的组。
21.一种药物组合物，其包含权利要求1-16任一项所述的siRNA，或权利要求17-20任一项所述的siRNA缀合物或其前药，以及药学上可接受的载体。
22.一种试剂盒，其包含权利要求1-16任一项所述的siRNA，或权利要求17-20任一项所述的siRNA缀合物或其前药，或权利要求21所述的药物组合物。
23.权利要求1-16任一项所述的siRNA，或权利要求17-20任一项所述的siRNA缀合物或其前药，或权利要求21所述的药物组合物用于制备抑制ASGPR1基因表达的药剂的用途。
24.权利要求1-16任一项所述的siRNA，或权利要求17-20任一项所述的siRNA缀合物或其前药，或权利要求21所述的药物组合物用于制备预防和/或治疗ASGPR1基因过表达相关的疾病的药剂的用途；
优选地，所述疾病为肥胖症、代谢综合征、高脂质血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、异常脂质和/或胆固醇代谢、动脉粥样硬化、糖尿病、心血管疾病、冠状动脉疾病、心肌梗塞、外周血管疾病或脑血管疾病；优选地，所述疾病为动脉粥样硬化。
25.一种抑制ASGPR1基因表达的方法，包括将治疗有效量的权利要求1-16任一项所述的siRNA，或权利要求17-20任一项所述的siRNA缀合物或其前药，或权利要求21所述的药物组合物与表达ASGPR1的细胞接触或给予有需要的受试者。
26.一种治疗和/或预防ASGPR1基因过表达相关的疾病的方法，包括将治疗有效量的权利要求1-16任一项所述的siRNA，或权利要求17-20任一项所述的siRNA缀合物或其前药，或权利要求21所述的药物组合物给予有需要的受试者；
优选地，所述疾病为肥胖症、代谢综合征、高脂质血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、异常脂质和/或胆固醇代谢、动脉粥样硬化、糖尿病、心血管疾病、冠状动脉疾病、心肌梗塞、外周血管疾病或脑血管疾病；优选地，所述疾病为动脉粥样硬化。
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