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CN120400141A - 抑制AGT基因表达的siRNA、其缀合物或其前药、药物组合物以及用途 - Google Patents

抑制AGT基因表达的siRNA、其缀合物或其前药、药物组合物以及用途

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CN120400141A
CN120400141A CN202510096626.5A CN202510096626A CN120400141A CN 120400141 A CN120400141 A CN 120400141A CN 202510096626 A CN202510096626 A CN 202510096626A CN 120400141 A CN120400141 A CN 120400141A
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CN
China
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modified nucleotides
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nucleotide
fluoro
antisense strand
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Application number
CN202510096626.5A
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王书成
林国良
黄河
王岩
汪小君
牛丽姣
车玲玉
产运霞
耿玉先
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Beijing Fuyuan Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Beijing Fuyuan Pharmaceutical Co ltd
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Publication date
Application filed by Beijing Fuyuan Pharmaceutical Co ltd filed Critical Beijing Fuyuan Pharmaceutical Co ltd
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Abstract

本公开涉及抑制AGT基因表达的siRNA、其缀合物和前药、药物组合物以及用途。本公开提供的siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，该siRNA含有正义链和反义链。本公开提供的siRNA、其缀合物和前药以及药物组合物可以有效治疗和/或预防与AGT基因过表达相关的疾病。

Description

抑制AGT基因表达的siRNA、其缀合物或其前药、药物组合物以 及用途
技术领域
本公开属于生物医药领域，具体来说，本公开涉及一种用于抑制血管紧张素原(AGT)基因表达的siRNA、siRNA缀合物或其前药、药物组合物以及用途，以及用于在体内或体外抑制AGT基因表达的方法。
背景技术
血管紧张素原(AGT)，也被称为SERPINA8或ANHU，是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的成员并且是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的组分。AGT主要在肝脏中产生，并且释放到循环系统中，在此处肾素将其转化为血管紧张素I。随后通过血管紧张素转化酶(ACE)将血管紧张素I转化成血管紧张素II。血管紧张素II是引起血管收缩的肽激素，其进而可以增加血压。血管紧张素II也刺激肾上腺皮质的激素醛固酮的分泌。醛固酮使肾脏增加钠和水的重吸收，导致体内流体体积的增加，进而可以增加血压。RAAS途径的过度刺激或活动可导致高血压。
高血压是各种疾病、病症和病状的主要危险因素，所述疾病、病症和病状诸如预期寿命缩短、慢性肾病、中风、心肌梗塞、心力衰竭、血管动脉瘤(例如主动脉瘤)、外周动脉疾病、心脏损伤(例如，心脏扩大或肥大)和其他心血管相关疾病、病症和/或病状。然而，目前批准用于治疗高血压的疗法存在局限性，因为所有高血压患者未能实现足够的血压控制。例如，靶向肾素-血管紧张素-醛固酮系统系统(RAAS)途径的部分的药物诸如ACE抑制剂和血管紧张素受体阻滞剂(ARB)抑制RAAS途径的能力有限(Nobakht等人，Nat Rev Nephrol，2011，7:356-359)。另外，某些抗高血压药物(诸如ACE抑制剂)在患有肾病的高血压患者中是禁忌的，因为它们有可能危及患者的肾功能。因此，需要寻找替代疗法来抑制RAAS途径并治疗高血压。
目前尚无靶向AGT的药物上市，这些药物仍处于临床阶段，如Ionis的反义核酸药物ISIS-904处于临床1期，用于难治性高血压的治疗，因此开发靶向AGT的药物具有重大的意义和市场前景。
发明内容
发明要解决的问题
本公开旨在提供用于抑制血管紧张素原(AGT)基因表达的siRNA、siRNA缀合物或其前药、药物组合物，其可以有选择性地且有效抑制AGT基因的表达，从而实现疾病治疗的目的。
用于解决问题的方案
第一方面，本公开提供了一种能够抑制AGT基因表达的siRNA，所述siRNA包含正义链与反义链，其中所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中所述正义链含有核苷酸序列I，反义链含有核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，其中所述核苷酸序列I和核苷酸序列II选自以下序列：
(1)所述核苷酸序列I包含SEQ ID NO:137所示的核苷酸序列，且所述核苷酸序列II包含SEQ ID NO:138所示的核苷酸序列：
5’-CUGUUUGCUGUGU-3’(SEQ ID NO:137)
5’-ACACAGCAAACAG-3’(SEQ ID NO:138)；
(2)所述核苷酸序列I包含SEQ ID NO:139所示的核苷酸序列，且所述核苷酸序列II包含SEQ ID NO:140所示的核苷酸序列：
5’-UUCAAGUUGAGAACA-3’(SEQ ID NO:139)
5’-UGUUCUCAACUUGAA-3’(SEQ ID NO:140)；
(3)所述核苷酸序列I包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，且所述核苷酸序列II包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
(4)所述核苷酸序列I包含SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列，且所述核苷酸序列II包含SEQ ID NO:46所示的核苷酸序列；
(5)所述核苷酸序列I包含SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列，且所述核苷酸序列II包含SEQ ID NO:57所示的核苷酸序列；
(6)所述核苷酸序列I包含SEQ ID NO:67所示的核苷酸序列，且所述核苷酸序列II包含SEQ ID NO:68所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补；所述基本上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有错配。
在一个实施方案中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度各自独立地为0-6个核苷酸，其中所述核苷酸序列III连接在核苷酸序列I的5'末端，核苷酸序列IV连接在核苷酸序列II的3'末端，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV长度相等并且实质上反向互补或完全反向互补；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有错配；和/或，所述核苷酸序列III连接在核苷酸序列I的3'末端，核苷酸序列IV连接在核苷酸序列II的5'末端，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV长度相等并且实质上反向互补或完全反向互补；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有错配。
在一些实施方案中，所述siRNA包含正义链与反义链，其中所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中所述正义链含有核苷酸序列I和III，反义链含有核苷酸序列II和IV，所述核苷酸序列I和III与所述核苷酸序列II和IV至少部分地反向互补形成双链区，其中所述核苷酸序列I和III包含或由如SEQ ID NO:131所示的核苷酸序列组成，所述核苷酸序列II和IV包含或由如SEQ ID NO:132所示的核苷酸序列组成。
在一些实施方案中，所述正义链还含有核苷酸序列V和/或所述反义链还含有核苷酸序列VI，核苷酸序列V和VI的长度为0至3个核苷酸，核苷酸序列V连接在所述正义链的3'末端构成正义链的3'突出端，和/或核苷酸序列VI连接在所述反义链的3'末端构成反义链的3'突出端。在一些优选的实施方案中，所述核苷酸序列V或VI的长度为2个或3个核苷酸。在一些优选的实施方案中，按照5'到3'的方向，所述核苷酸序列V选自UG、CA、AC、GG、UU、AA、CC、AU，所述核苷酸序列VI选自GC、UC、GU、AC、GA、GAA、GG、AA。在一些优选的实施方案中，所述核苷酸序列V或VI与靶mRNA相应位置的核苷酸错配或互补。
在一些实施方案中，该双链区的长度是15-30个核苷酸对。在一些优选的实施方案中，双链区的长度是17-23个核苷酸对。在一些更优选的实施方案中，双链区的长度是19个、20个或21个核苷酸对。
在一些实施方案中，正义链或反义链具有15-30个核苷酸。在一些优选的实施方案中，正义链或反义链具有19-25个核苷酸。在一些更优选的实施方案中，正义链或反义链具有19-23个核苷酸，进一步优选正义链或反义链具有19个、20个、21个、22个或23个核苷酸。
在一些实施方案中，所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基；优选地，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基。
在一些实施方案中，所述siRNA包括不包含3’突出端核苷酸的正义链。
在一些实施方案中，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团，或所述反义链的5’末端核苷酸不连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团。
在一些实施方案中，所述正义链的5’末端核苷酸连接反向脱碱基脱氧核糖残基，和/或所述正义链的3’末端核苷酸连接反向脱碱基脱氧核糖残基。优选地，所述反向脱碱基脱氧核糖残基与所述正义链的3'末端核苷酸和/或5'末端核苷酸通过磷酸酯键、硫代磷酸酯键或其他核苷间键连接。
在一些实施方案中，所述修饰的核苷酸选自2’-氟代修饰的核苷酸、2’-烷氧基修饰的核苷酸、2’-取代的烷氧基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、2’-取代的烷基修饰的核苷酸、2’-脱氧核糖核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-取代的氨基修饰的核苷酸、核苷酸类似物或其中任意两种以上的组合。
在一些实施方案中，所述修饰的核苷酸选自2’-F修饰的核苷酸、2’-O-CH3修饰的核苷酸、2’-O-CH2-CH2-O-CH3修饰的核苷酸、2’-O-CH2-CH＝CH2修饰的核苷酸、2’-CH2-CH2-CH＝CH2修饰的核苷酸、2’-脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物或其中任意两种以上的组合。
在一些实施方案中，所述正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为2’-氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸。
在一些优选实施方案中，所述正义链中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于第7、9、10和11位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第9、10和11位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第7、9和11位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第3、7、9和11位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第9、11、12和13位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第9、11和16位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第8、9和11位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第5、9、10和11位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第5、9、11和13位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第3、7、8和9位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第5、9和11位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第9和11位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第7、9、11、13和15位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第9、11和13位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第7、9、11和13位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第3、7、11、16和17位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；和/或
所述反义链中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、6、14和16位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、6、8、9、14和16位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、14和16位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、6、8、9和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、3、4、5、7、10和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、7、10和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、5、10和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、3、10和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、5、7和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、5、14和16位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、7、12和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、6、12和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、3、6和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、6、8和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、10和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、7和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、3、5、7、10、12和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、3、7、10、12、14和24位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种，核苷酸类似物选自假尿嘧啶、异核苷酸、LNA、ENA、cET BNA、UNA和GNA中的一种。
在一些实施方案中，所述正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为2’-氟代修饰的核苷酸、2’-甲氧基修饰的核苷酸、GNA修饰的核苷酸、2’-脱氧核糖核苷酸、2'-甲氧基修饰的假尿嘧啶核苷酸(2'-O-甲基假尿苷)或其中任意两种以上的组合。
在一些优选实施方案中，所述正义链中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于第7、9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第7、9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第3、7、9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第9、11、12和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第9、11和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第8、9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第5、9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第3、7、8和9位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第5、9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第7、9、11、13和15位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第9、11和13位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第7、9、11和13位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第3、7、11、16和17位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；和/或
所述反义链中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、6、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、6、8、9、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、14和16位，第6位为GNA修饰的核苷酸，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、6、14和16位，第7位为GNA修饰的核苷酸，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、6、8、9和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、3、4、5、7、10和14位，第6位核苷酸替换为脱氧核糖核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、7、10和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、5、10和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、3、10和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、5、7和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、5、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、7、12和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、6、12和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、3、6和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、6、8和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、10和14位，第5位核苷酸替换为脱氧核糖核苷酸，2’-脱氧核糖核苷酸位于反义链的第7位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、7和14位，第5位核苷酸替换为脱氧核糖核苷酸，2’-脱氧核糖核苷酸位于反义链的第12位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2和14位，2’-脱氧核糖核苷酸位于反义链的第7和12位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、3、5、7、10、12和14位，第6位核苷酸替换为脱氧核糖核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、3、7、10、12、14和24位，第5位核苷酸替换为脱氧核糖核苷酸，第6位核苷酸替换为脱氧核糖核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、3、7、10、12、14和24位，第6位核苷酸替换为脱氧核糖核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、7、10和14位，第6位核苷酸替换为脱氧核糖核苷酸，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、10和14位，2’-脱氧核糖核苷酸位于反义链的第7位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、10和14位，第6位核苷酸替换为脱氧核糖核苷酸，2’-脱氧核糖核苷酸位于反义链的第7位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、7、10和14位，第6位核苷酸替换为2'-甲氧基修饰的假尿嘧啶核苷酸，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、10和14位，第6位核苷酸替换为2'-甲氧基修饰的假尿嘧啶核苷酸，2’-脱氧核糖核苷酸位于反义链的第7位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，所述siRNA沿5’末端向3’末端方向，所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
所述正义链3’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链3’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
或者，
所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
或者，
所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端起始的反向脱碱基脱氧核糖残基与第1个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链3’末端起始的反向脱碱基脱氧核糖残基与第1个核苷酸之间；
或者，
所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
所述正义链3’末端起始的反向脱碱基脱氧核糖残基与第1个核苷酸之间。
在一些实施方案中，所述siRNA沿5’末端向3’末端方向，反义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述反义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述反义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
所述反义链3’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述反义链3’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间。
在另一些实施方案中，所述siRNA沿5’末端向3’末端方向，反义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述反义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述反义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
所述反义链3’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述反义链3’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
所述反义链3’末端起始的第3个核苷酸与第4个核苷酸之间。
在一些实施方案中，所述正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为2’-氟代修饰的核苷酸、2’-甲氧基修饰的核苷酸、GNA修饰的核苷酸、2’-脱氧核糖核苷酸、2'-甲氧基修饰的假尿嘧啶核苷酸(2'-O-甲基假尿苷)或其中任意两种以上的组合。
在一些优选实施方案中，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、10和11位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5'末端核苷酸连接5'磷酸基团。
在一些优选实施方案中，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、10和11位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、8、9、14和16位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5'末端核苷酸连接5'磷酸基团。
在一些优选实施方案中，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、10和11位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、14和16位，第6位为GNA修饰的核苷酸，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5'末端核苷酸连接5'磷酸基团。
在一些优选实施方案中，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、10和11位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，第7位为GNA修饰的核苷酸，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5'末端核苷酸连接5'磷酸基团。
在一些优选实施方案中，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、10和11位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5'末端核苷酸不连接5'磷酸基团或5'磷酸衍生基团。
在一些优选实施方案中，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、10和11位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、8、9、14和16位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5'末端核苷酸不连接5'磷酸基团或5'磷酸衍生基团。
在一些优选实施方案中，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、10和11位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、10和11位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、8、9、14和16位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、10和11位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、8、9和14位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5'末端核苷酸不连接5'磷酸基团或5'磷酸衍生基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、11、13和15位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第3、7、9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第3、7、11、16和17位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、3、4、5、7、10和14位，第6位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第9、11、12和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第9、11、12和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、7、10和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第9、11、12和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、5、10和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第9、11、12和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、3、10和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第9、11、12和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、5、7和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第9、11、12和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、5、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第9、11和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第8、9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、7、10和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、7、10和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第9、11、12和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、3、4、5、7、10和14位，第6位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、3、4、5、7、10和14位，第6位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、3、4、5、7、10和14位，第6位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第3、7、8和9位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、3、4、5、7、10和14位，第6位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第3、7、9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、3、4、5、7、10和14位，第6位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、3、4、5、7、10和14位，第6位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第3、7、8和9位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、7、10和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第3、7、9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、7、10和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、5、7和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、5、7和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、7、10和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、7、12和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、12和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、3、6和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、8和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、10和14位，第5位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸，2’-脱氧核糖核苷酸位于反义链的第7位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、7和14位，第5位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸，2’-脱氧核糖核苷酸位于反义链的第12位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2和14位，2’-脱氧核糖核苷酸位于反义链的第7和12位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、7、12和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、3、5、7、10、12和14位，第6位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、3、7、10、12、14和24位，第5位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸，第6位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、3、7、10、12、14和24位，第6位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、7、10和14位，第6位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、10和14位，2’-脱氧核糖核苷酸位于反义链的第7位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、10和14位，第6位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸，2’-脱氧核糖核苷酸位于反义链的第7位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、7、10和14位，第6位核苷酸替换为2'-甲氧基修饰的假尿嘧啶核苷酸，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、10和14位，第6位核苷酸替换为2'-甲氧基修饰的假尿嘧啶核苷酸，2’-脱氧核糖核苷酸位于反义链的第7位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
在一些优选实施方案中，所述siRNA选自表1和表1-1的siRNA；优选地，所述siRNA选自N-ER-FY014320、N-ER-FY014307、N-ER-FY014320M2、N-ER-FY014320M3、N-ER-FY014320M4、N-ER-FY014320M5、N-ER-FY014320M6、N-ER-FY014320M7、N-ER-FY014320M8、N-ER-FY014320M9、N-ER-FY014307M8、N-ER-FY014307M12、N-ER-FY014307M18、N-ER-FY014307M21、N-ER-FY014307M24、N-ER-FY014307M25、N-ER-FY014307M26、N-ER-FY014307M29、N-ER-FY014307M34、N-ER-FY014307M35、N-ER-FY014307M36、N-ER-FY014307M43、N-ER-FY014307M44、N-ER-FY014307M45、N-ER-FY014307M46、N-ER-FY014307M47、N-ER-FY014307M48、N-ER-FY014307M49、N-ER-FY014307M50、N-ER-FY014307M51、N-ER-FY014307M59、N-ER-FY014307M60、N-ER-FY014307M61、N-ER-FY014307M62、N-ER-FY014307M63、N-ER-FY014307M64、N-ER-FY014307M65、N-ER-FY014307M66、N-ER-FY014307M67、N-ER-FY014307M68、N-ER-FY014307M69、N-ER-FY014307M70、N-ER-FY014307M71、N-ER-FY014307M72、N-ER-FY014307M73、N-ER-FY014307M74、N-ER-FY014307M75、N-ER-FY014307M76、N-ER-FY014307M77、N-ER-FY014307M78、N-ER-FY014307M79、N-ER-FY014307M80、N-ER-FY014307M81、N-ER-FY014307M82、N-ER-FY014307M83、N-ER-FY014307M84、N-ER-FY014307M85、N-ER-FY014307M86、N-ER-FY014307M91、N-ER-FY014307M92、N-ER-FY014307M93、N-ER-FY014307M94、N-ER-FY014307M95、N-ER-FY014307M100、N-ER-FY014307M101、N-ER-FY014307M102、N-ER-FY014307M103、N-ER-FY014307M104。
第二方面，本公开提供了一种siRNA缀合物或其前药，所述siRNA缀合物含有本公开的siRNA以及缀合至该siRNA的缀合基团(如下式所示，双螺旋结构表示所述siRNA，并且所述缀合基团连接至所述siRNA的正义链3'末端)：
上述缀合物结构中X可选择为O或S，在一些实施方案中，X为O。
在一些实施方案中，所述缀合基团包含药学上可接受的靶向基团和接头，并且所述siRNA、所述接头和所述靶向基团依次共价或非共价连接；
优选地，在所述siRNA缀合物中，siRNA的正义链与反义链互补形成所述siRNA缀合物的双链区，且所述正义链的3’末端形成平末端，所述反义链的3’末端具有1-3个延伸出所述双链区的突出的核苷酸；
或者，
在所述siRNA缀合物中，siRNA的正义链与反义链互补形成所述siRNA缀合物的双链区，且所述正义链的3’末端形成平末端，所述反义链的3’末端形成平末端。
在一些实施方案中，所述缀合基团选自：
在一些优选实施方案中，所述siRNA缀合物为选自表2的siRNA缀合物；优选地，所述siRNA缀合物选自N-ER-FY014320M2L96、N-ER-FY014320M3L96、N-ER-FY014320M6L96、N-ER-FY014320M7L96、N-ER-FY014307M8L96、N-ER-FY014320M9L96、N-ER-FY014307M12L96、N-ER-FY014307M18L96、N-ER-FY014307M21L96、N-ER-FY014307M24L96、N-ER-FY014307M25L96、N-ER-FY014307M26L96、N-ER-FY014307M29L96、N-ER-FY014307M34L96、N-ER-FY014307M35L96、N-ER-FY014307M36L96、N-ER-FY014307M43L96、N-ER-FY014307M48L96、N-ER-FY014307M50L96、N-ER-FY014307M51L96、N-ER-FY014307M70L96、N-ER-FY014307M72L96、N-ER-FY014307M73L96、N-ER-FY014307M74L96、N-ER-FY014307M75L96、N-ER-FY014307M76L96、N-ER-FY014307M77L96、N-ER-FY014307M78L96、N-ER-FY014307M79L96、N-ER-FY014307M80L96、N-ER-FY014307M81L96、N-ER-FY014307M82L96、N-ER-FY014307M83L96、N-ER-FY014307M84L96、N-ER-FY014307M85L96、N-ER-FY014307M86L96、N-ER-FY014307M91L96、N-ER-FY014307M92L96、N-ER-FY014307M93L96、N-ER-FY014307M94L96、N-ER-FY014307M95L96、N-ER-FY014307M100L96、N-ER-FY014307M101L96、N-ER-FY014307M102L96、N-ER-FY014307M103L96、N-ER-FY014307M104L96。
第三方面，本公开还提供了一种药物组合物，其包含本公开的siRNA，或本公开的siRNA缀合物或其前药，以及药学上可接受的载体。
第四方面，本公开还提供了一种试剂盒，其包含本公开的siRNA，或本公开的siRNA缀合物或其前药，或本公开的药物组合物。
第五方面，本公开还提供了本公开的siRNA，或本公开的siRNA缀合物或其前药，或本公开的药物组合物在以下(a)和/或(b)中的用途：
(a)用于制备抑制AGT基因表达的药剂；
(b)用于制备预防和/或治疗AGT基因过表达相关的疾病的药剂。
在一些实施方案中，所述疾病为高血压病、高血压、临界性高血压、原发性高血压、继发性高血压、孤立性收缩期或舒张期高血压、妊娠相关高血压、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压、射血分数降低的高血压、戈德布拉特氏高血压、低血浆肾素活性或血浆肾素浓度相关的高血压、眼高血压、青光眼、肺动脉高血压、门静脉高血压、系统性静脉高血压、收缩期高血压、不稳定性高血压；高血压性心脏病、高血压性肾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、血管病变、糖尿病性肾病、子痫前期、糖尿病性视网膜病、慢性心力衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、肾小球硬化症、主动脉缩窄、主动脉瘤、心室纤维化、心力衰竭、心肌梗塞、心绞痛、中风、肾疾病、肾衰竭、系统性硬化症、宫内发育迟缓(IUGR)、胎儿生长受限、肥胖、肝脂肪变性/脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)；葡萄糖耐受不良、2型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病)和代谢综合征。
第六方面，本公开还提供了在体内和/或体外抑制AGT基因表达的方法，包括将治疗有效量的本公开的siRNA，或本公开的siRNA缀合物或其前药，或本公开的药物组合物与表达AGT的细胞接触或给予有需要的受试者。
第七方面，本公开还提供了治疗和/或预防AGT基因过表达相关的疾病的方法，包括将治疗有效量的本公开的siRNA，或本公开的siRNA缀合物或其前药，或本公开的药物组合物给予有需要的受试者。
有益效果
本公开提供的siRNA、药物组合物和siRNA缀合物在体外细胞实验中显示出优异的AGT基因表达抑制活性，具有良好的治疗AGT基因过表达相关的疾病的潜力。例如，本公开公开的siRNA及其缀合物能够降低肝脏中AGT mRNA的表达，毒副作用低，血浆稳定性好，具有良好的临床应用前景。
本公开提供的siRNA在人肝癌细胞Huh7中显示出对AGT基因良好的抑制效果。
在一些具体实施方案中，本公开的siRNA缀合物在体内对hAGT基因表达的蛋白具有较高的抑制活性，能够长时间降低hAGT蛋白水平，说明本公开设计的化合物能较好的抑制hAGT蛋白的生成，具有长效性。
附图说明
图1显示了实施例6中siRNA缀合物对hAGT蛋白表达的抑制率结果。
图2显示了实施例11中不同浓度的siRNA缀合物在PHH细胞中的抑制率结果。
图3～图5显示了实施例11中不同浓度的siRNA缀合物在PHH细胞中的脱靶实验结果。
具体实施方式
定义
除非有相反陈述，否则在本公开中所使用的术语具有下述含义。
在本公开的权利要求和/或说明书中，词语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。用以界定本公开的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因前述测试方法或装置所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
本公开上下文中使用的术语“AGT”，是指血管紧张素原。在本文中，术语“AGT”将包含基因及其mRNA产物以及相应的蛋白质产物。在一些实施方案中，术语“AGT”也可以指编码该蛋白的AGT基因(mRNA编号NM_001384479.1，Gene ID：183)。AGT的抑制可以指AGT蛋白的抑制、在转录水平上AGT基因的抑制和/或AGT酶促活性的抑制。
术语“多肽”、“蛋白”可互换地指通过共价键(例如肽键)相互连接的一串至少两个氨基酸残基，可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。多肽可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。
在说明书通篇中，如无特别说明，在本技术领域中，“G”、“C”、“A”、“T”和“U”通常分别代表鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶的碱基，但本领域中也通常知晓，“G”、“C”、“A”、“T”和“U”每个通常也代表分别含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶作为碱基的核苷酸，这在表示脱氧核糖核酸序列和/或核糖核酸序列中是常见的方式，因此在本公开的上下文中，“G”、“C”、“A”、“T”、“U”表示的含义包括上述各种可能的情形，本公开中“核苷酸”与“核糖核苷酸”可互换使用，本申请中“脱氧核糖核苷酸”与“2'-脱氧核糖核苷酸”可互换使用。小写字母a、u、c、g：表示2’-甲氧基修饰的核苷酸；Af、Gf、Cf、Uf：表示2’-氟代修饰的核苷酸；“dG”、“dC”、“dA”：表示2'-脱氧核糖核苷酸；当“T”在突出端位置时，表示胸腺嘧啶核糖核苷酸(T)；当在基序的双链区时，表示基序序列中对应位置的尿嘧啶核糖核苷酸(U)替换为胸腺嘧啶核糖核苷酸(T)；(invAb)为反向脱碱基脱氧核糖残基；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；P1：表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5’-磷酸核苷酸；EVP:表示该EVP右侧相邻的一个核苷酸为5’-反式乙烯基膦酸酯核苷酸；A、U、C、G(下划线+粗体+斜体)：表示GNA修饰的核苷酸；“T”(下划线+粗体+斜体)表示基序序列中对应位置的尿嘧啶核糖核苷酸(U)替换为胸腺嘧啶核糖核苷酸(T)并经GNA修饰；Base表示碱基，例如A、U、G、C或T。
在上文及下文中，所述“2’-氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2’位的羟基被氟取代形成的核苷酸。“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2’位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。本公开中，“非氟代修饰”还包括核苷酸的替换，例如将尿嘧啶(U)替换为胸腺嘧啶(T)；相应地，“非氟代修饰的核苷酸”也包括经过上述碱基替换后的核苷酸。在一些实施方案中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2’位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。这些核糖基2’位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸是本领域技术人员所公知的，这些核苷酸可以选自2’-烷氧基修饰的核苷酸、2’-取代的烷氧基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、2’-取代的烷基修饰的核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-取代的氨基修饰的核苷酸、2’-脱氧核糖核苷酸中的一种。
如本说明书所使用的，“核苷酸替换为脱氧核糖核苷酸”是指在修饰的过程中，将核糖核苷酸A、U、C、G替换为对应的脱氧核糖核苷酸A、T、C、G。例如，按照5’到3’的方向，N-ER-FY014307的反义链的第6位核苷酸替换为脱氧核糖核苷酸，其表示的是第6位的核糖核苷酸“U”替换为“T”；类似地，核糖核苷酸A替换为对应的脱氧核糖核苷酸A；核糖核苷酸C替换为对应的脱氧核糖核苷酸C；核糖核苷酸G替换为对应的脱氧核糖核苷酸G。
“烷基”包括直链、支链或环状的饱和烷基。例如，烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丁基、正戊基、环已基等类似基团。示例性的，“C1-6烷基”中的“C1-6”是指包含有1、2、3、4、5或6个碳原子的直链、支链或环状形式排列的基团。
“烷氧基”在本文中是指烷基基团通过氧原子与分子其余部分相连(-O-烷基)，其中所述烷基如本文中所定义。烷氧基的非限制性实例包括甲氧基、乙氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基等。
“核苷酸类似物”指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。如假尿嘧啶(Ψ)、异核苷酸、桥联的核苷酸(bridged nucleic acid，简称BNA)或无环核苷酸。
假尿嘧啶(Ψ)是指：一种尿嘧啶核苷的天然结构类似物，核糖不是与尿嘧啶N1相连，而是与嘧啶环的C5连接；假尿嘧啶的结构式如下所示：
BNA是指受约束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五元环、六元环、或七元环的具有“固定的”C3'-内切糖缩拢的桥联结构。通常将该桥掺入到该核糖的2'-、4'-位处以提供一个2',4'-BNA核苷酸，如LNA、ENA、cET BNA等，其中，LNA如式(1)所示，ENA如式(2)所示，cET BNA如式(3)所示：
Base表示碱基，例如A、U、G、C或T。
无环核苷酸是核苷酸的糖环被打开形成的一类核苷酸，如解锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)，其中，UNA如式(4)所示，GNA如式(5)所示：
上述式(4)和式(5)中，Base表示碱基，例如A、U、G、C或T，R选自H、OH或烷氧基(O-烷基)。
异核苷酸是指核苷酸中碱基在核糖环上的位置发生改变而形成的化合物，例如，碱基从核糖环的1'-位移动至2'-位或3'-位而形成的化合物，如式(6)或(7)所示：
上述式(6)和式(7)化合物中，Base表示碱基，例如A、U、G、C或T；R选自H、OH、F或者如上所述的非氟基团。
在一些实施方案中，核苷酸类似物选自假尿嘧啶、异核苷酸、LNA、ENA、cET BNA、UNA和GNA中的一种。在一些实施方案中，每一个非氟代修饰的核苷酸为2'-甲氧基修饰的核苷酸、GNA修饰的核苷酸或其中任意两种以上的组合。在一些优选实施方案中，每一个非氟代修饰的核苷酸均为2'-甲氧基修饰的核苷酸，在上文和下文中，所述2'-甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
所述“2'-甲氧基修饰的核苷酸”指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。所述“硫代磷酸酯基”指磷酸酯基中的磷酸二酯键中的一个氧原子被硫原子取代而成的硫代磷酸酯基。
所述“硫代磷酸酯基”指下式：
所述“5'-磷酸核苷酸”指下式的结构：
在本文中，“磷酸酯键“与“磷酸二酯键”可互换使用；“硫代磷酸酯键”与“硫代磷酸酯基”可互换使用。
在本公开的上下文中，表述“互补”和“反向互补”可互相替代使用，并具有本领域技术人员周知的含义，即，在双链核酸分子中，一条链的碱基各自与另一条链上的碱基以互补的方式相配对。在DNA中，嘌呤碱基腺嘌呤(A)始终与嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)(或者在RNA中为尿嘧啶(U))相配对；嘌呤碱基鸟嘌呤(G)始终与嘧啶碱基胞嘧啶(C)相配对。每个碱基对都包括一个嘌呤和一个嘧啶。当一条链上的腺嘌呤始终与另一条链上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，以及鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对时，两条链被认为是彼此相互补的，以及从其互补链的序列中可以推断出该链的序列。与此相应地，“错配”在本领域中意指在双链核酸中，对应位置上的碱基并未以互补的形式配对存在。
在上文及下文中，如无特别说明，“基本上反向互补”是指所涉及的两段核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；“实质上反向互补”是指两段核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；“完全反向互补”是指两段核苷酸序列之间不存在碱基错配。
在上文及下文中，一个核苷酸序列与另外一个核苷酸序列存在“核苷酸差异”，是指前者与后者相比，相同位置的核苷酸的碱基种类发生了改变，例如，在后者中一个核苷酸碱基为A时，在前者的相同位置处的对应核苷酸碱基为U、C、G或者T的情况下，认定为两个核苷酸序列之间在该位置处存在核苷酸差异。在一些实施方案中，以无碱基核苷酸或其等同物代替原位置的核苷酸时，也可认为在该位置处产生了核苷酸差异。
在上下文中，“双链区”是指siRNA的正义链与反义链互补形成所述siRNA的双链区；“突出端”是指当siRNA的一条链的一个3’末端延伸超出另一条链的5’末端时从该siRNA的双链体结构突出的一个或多个不成对的核苷酸，或反之亦然。“平端”或“平末端”意指在该siRNA的那端处不存在不成对的核苷酸，即无核苷酸突出端。一种“平末端的”siRNA是一种在其整个长度上都是双链、即在该分子的任一端处都无核苷酸突出端的siRNA。
在本公开的上下文中，特别是在描述本公开的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物的制备方法时，除非特别说明，所述核苷单体指，根据欲制备的siRNA或siRNA缀合物中核苷酸的种类和顺序，固相亚磷酰胺合成中使用的修饰或未修饰的核苷亚磷酰胺单体。固相亚磷酰胺合成为本领域技术人员所公知的RNA合成中所用的方法。本公开所用的核苷单体均可商购得到。
在本公开的上下文中，除非另有说明，“缀合”是指两个或多个各自具有特定功能的化学部分之间以共价连接的方式彼此连接；相应地，“缀合物”是指该各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物。进一步地，“siRNA缀合物”表示一个或多个具有特定功能的化学部分共价连接至siRNA上而形成的化合物。siRNA缀合物应根据上下文，理解为多个siRNA缀合物的总称或者某个化学式所示的siRNA缀合物。在本公开说明书的上下文中，“缀合分子”应当理解为可通过反应缀合至siRNA，最终形成本公开的siRNA缀合物的特定化合物。
在本公开中可以使用各种羟基保护基团。一般来说，保护基团使化学官能团对特定的反应条件不敏感，并且可以在分子中的该官能团上附加以及去除，而不实质上损害分子的其余部分。在一些实施方案中，保护基团在碱性条件下稳定，但可以在酸性条件下脱除。在一些实施方案中，本公开可使用的羟基保护基的非排他性实例包括单甲氧基三苯甲基、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(Mox)。在一些实施方案中，本公开可使用的羟基保护基的非排他性实例包括Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4’-二甲氧基三苯甲基)和TMTr(4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基)。
如本说明书所使用的，“任选的”或“任选地”是指其后描述的事件或状况可以发生或不发生，并且所述描述包括事件或状况发生的情况和其中不发生的情况。
“受试者”一词，如本说明书所使用的，指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本公开的受试者包括但不限于人类、非人灵长类(例如，恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠、兔或任何种类的家禽。
如本说明书所使用的，“治疗”是指获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处。“治疗益处”意味着根除或改善被治疗的潜在障碍。此外，治疗益处通过根除或改善与潜在障碍相关的一个或多个生理症状，从而在受试者中观察到改善而获得，尽管受试者可能仍然受到潜在障碍的折磨。
如本说明书所使用的，“预防”是指获得有益或期望的结果的方法，包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”，可将siRNA、siRNA缀合物或药物组合物给予有罹患特定疾病风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种生理症状的受试者，即便可能该疾病的诊断尚未作出。
如本说明书所述的“前药”是指可经某些化学或生理学过程(例如，酶促过程和代谢水解)而转化为活性化合物的化合物。因此，术语“前药”还指药学上可接受的生物活性化合物的前体。
在本文中，考虑到存在反义链的5’末端核苷酸连接5’羟基的情况(即无磷酸基团)，这样的反义链在体内会先经磷酸化使5’末端核苷酸转变为携带5’磷酸基团的核苷酸，而后在体内发挥作用，因此，在本公开中也将这种的siRNA，siRNA修饰物，以及siRNA缀合物称为前药。例如，本公开中具有M6模式修饰的siRNA修饰物或缀合物是具有M2模式修饰的siRNA修饰物或缀合物的前药，因为M2模式修饰与M6模式修饰的区别就是反义链的5’末端是否有P1，同理，M7模式修饰和M3模式修饰的关系也是如此，因此，本文中siRNA包括其对应的前药。
siRNA
本公开涉及一种能够抑制AGT基因表达的siRNA。本公开的siRNA含有核苷酸基团作为基本结构单元，本领域技术人员公知，所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基。通常具有活性的，即功能性的siRNA的长度约为12-40个核苷酸，在一些实施方案中约为15-30个核苷酸。
本公开的siRNA含有正义链和反义链，所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中所述正义链含有一段核苷酸序列I，所述反义链含有一段核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区。在一些实施方案中，该双链区的长度是15-30个核苷酸对。在另一些实施方案中，双链区的长度是17-23个核苷酸对。在另一些实施方案中，双链区的长度是19-21个核苷酸对。在又另一些实施方案中，双链区的长度是19或21个核苷酸对。
在一些实施方案中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度各自独立地为0-6个核苷酸，所述核苷酸序列III连接在核苷酸序列I的5'末端，核苷酸序列IV连接在核苷酸序列II的3'末端，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV长度相等并且实质上反向互补或完全反向互补；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有错配。在一些实施方案中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度各自独立地为0-6个核苷酸，所述核苷酸序列III连接在核苷酸序列I的3'末端，核苷酸序列IV连接在核苷酸序列II的5'末端，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV长度相等并且实质上反向互补或完全反向互补；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有错配。在一些实施方案中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度各自独立地为0-6个核苷酸，所述核苷酸序列III连接在核苷酸序列I的5'末端，核苷酸序列IV连接在核苷酸序列II的3'末端，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV长度相等并且实质上反向互补或完全反向互补；和所述核苷酸序列III连接在核苷酸序列I的3'末端，核苷酸序列IV连接在核苷酸序列II的5'末端，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV长度相等并且实质上反向互补或完全反向互补；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有错配。
在一些实施方案中，所述正义链还含有核苷酸序列V和/或所述反义链还含有核苷酸序列VI，核苷酸序列V和VI的长度为0至3个核苷酸，核苷酸序列V连接在所述正义链的3'末端构成正义链的3'突出端，和/或核苷酸序列VI连接在所述反义链的3'末端构成反义链的3'突出端。在一些实施方案中，所述核苷酸序列V或VI的长度为2个或3个核苷酸。在另一些实施方案中，按照5'到3'的方向，所述核苷酸序列V选自UG、CA、AC、GG、UU、AA、CC、AU，所述核苷酸序列VI选自GC、UC、GU、AC、GA、GAA、GG、AA。在另一些实施方案中，所述核苷酸序列V或VI与靶mRNA相应位置的核苷酸错配或互补。
本公开提供的正义链和反义链的长度相同或不同，在一些实施方案中，正义链或反义链具有15-30个核苷酸。在另一些实施方案中，正义链或反义链具有19-25个核苷酸。在另一些实施方案中，正义链或反义链具有19-23个核苷酸。本公开提供的siRNA正义链和反义链的长度比可以是15/15、16/16、17/17、18/18、19/19、19/20、19/21、19/22、19/23、20/19、20/20、20/21、20/22、20/23、21/19、21/20、21/21、21/22、21/23、22/19、22/20、22/21、22/22、22/23、23/19、23/20、23/21、23/22、23/23、24/24、25/25、26/26、27/27、28/28、29/29、30/30、22/24、22/25、22/26、23/24、23/25或23/26等等。在一些实施方案中，所述siRNA正义链和反义链的长度比为19/19、21/21、19/21、21/23或23/23，此时，本公开的siRNA具有更好的细胞mRNA沉默活性。
研究发现，不同修饰策略会对siRNA的稳定性、生物活性及细胞毒性等指标产生截然不同的影响。例如，CN201010106762.1中对siRNA的多种化学修饰策略进行了研究，证实了7种有效的修饰方式，与未经修饰的siRNA相比，其中一种修饰方式所得的siRNA在提高血液稳定性的同时，还保持了与未经修饰的siRNA基本相当的抑制活性。
本公开的siRNA中的核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸。在一些实施方案中，本公开的siRNA中的每个核苷酸均为未经修饰的核苷酸；在一些实施方案中，本公开的siRNA中的部分或全部核苷酸为修饰的核苷酸，核苷酸基团上的这些修饰不会导致本公开的siRNA抑制AGT基因表达的功能明显削弱或丧失。
在一些实施方案中，本公开的siRNA至少含有1个修饰的核苷酸。在本公开的上下文中，所使用的术语“修饰的核苷酸”是指核苷酸的核糖基2'位羟基被其他基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物，或者具有经修饰的碱基的核苷酸。所述修饰的核苷酸不会导致siRNA抑制基因表达的功能明显削弱或丧失。例如，可以选择J.K.Watts,G.F.Deleavey,andM.J.Damha,Chemically modified siRNA:tools and applications.Drug Discov Today,2008,13(19-20):842-55中公开的修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供的siRNA的所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基；换句话说，所述正义链和所述反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基和/或核糖基的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基和/或具有修饰基团的核糖基。在一些实施方案中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基。
在一些实施方案中，所述siRNA包括不包含3’突出端核苷酸的正义链；即siRNA的正义链可以存在3’突出端核苷酸，将正义链的3’突出端核苷酸排除后形成平末端。
在一些实施方案中，当正义链与反义链的核苷酸序列互补形成双链区后，正义链的3’末端不存在突出的核苷酸时，在正义链的3’末端添加核苷酸序列V，作为突出的核苷酸。然后，当核苷酸序列V连接正义链的3'末端形成的核苷酸序列在完成化学修饰后，排除核苷酸序列V，相应地，siRNA的正义链形成平末端。
在一些实施方案中，当正义链与反义链的核苷酸序列互补形成双链区后，正义链的3’末端具有延伸出双链区的突出的核苷酸时，将正义链中位于3’末端的突出的核苷酸排除后作为正义链的核苷酸序列，相应地，siRNA的正义链形成平末端。
在一些实施方案中，反义链的5’末端核苷酸连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团。在一些实施方案中，所述反义链的5’末端核苷酸不连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团。
示例性的5’磷酸基团的结构为：5’磷酸衍生基团的结构包括但不限于：(EVP)，等。
位于反义链的5’末端核苷酸连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团后，形成如下所示结构：
其中，Base表示碱基，例如A、U、G、C或T。R’为羟基或被本领域技术人员所知晓的各类基团所取代，例如，取代后的修饰的核苷酸可以为2’-氟代(2’-F)修饰的核苷酸，2’-烷氧基修饰的核苷酸，2’-取代的烷氧基修饰的核苷酸，2’-烷基修饰的核苷酸，2’-取代的烷基修饰的核苷酸，2’-氨基修饰的核苷酸，2’-取代的氨基修饰的核苷酸，2’-脱氧核糖核苷酸。
在一些实施方案中，所述正义链或反义链的5’末端核苷酸不连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团(即正义链或反义链的5’末端核苷酸的核糖基团为5’羟基)，其结构如下所示：
其中，Base表示碱基，例如A、U、G、C或T。R为羟基或氢或被本领域技术人员所知晓的各类基团所取代，例如，R可以为2’-氟代(2’-F)，2’-烷氧基，2’-取代的烷氧基，2’-烷基，2’-取代的烷基，2’-氨基，2’-取代的氨基。
示例性的修饰的核苷酸具有如下所示结构：
其中，Base表示碱基，例如A、U、G、C或T。核糖基团2’位的羟基被R取代。这些核糖基团2’位的羟基可以为本领域技术人员所知晓的各类基团所取代，例如，取代后的修饰的核苷酸可以为2’-氟代(2’-F)修饰的核苷酸，2’-烷氧基修饰的核苷酸，2’-取代的烷氧基修饰的核苷酸，2’-烷基修饰的核苷酸，2’-取代的烷基修饰的核苷酸，2’-氨基修饰的核苷酸，2’-取代的氨基修饰的核苷酸，2’-脱氧核糖核苷酸。
在一些实施方案中，正义链可包含一个或多个封端残基或部分，在本领域中有时称为“帽”、“末端帽”或“封端残基”。如本文所用，“封端残基”是可以并入本文公开的siRNA的核苷酸序列的一个或多个末端处的非核苷酸化合物或其他部分。在一些情况下，封端残基可以为siRNA提供某些有益的特性，例如针对核酸外切酶降解的保护。在一些实施方案中，添加反向脱碱基脱氧核糖残基(invAb)作为封端残基。在一些实施方案中，封端残基出现在正义链的5'末端、3'末端或5'和3'末端两者。
在一些实施方案中，将一个或多个反向脱碱基脱氧核糖残基(invAb)添加至正义链的3'末端。在一些实施方案中，将一个或多个反向脱碱基脱氧核糖残基(invAb)添加至正义链的5'末端。在一些实施方案中，将一个或多个反向脱碱基脱氧核糖残基(invAb)添加至正义链的5'末端和正义链的3'末端。反向脱碱基脱氧核糖残基与末端核苷酸可经由磷酸酯键、硫代磷酸酯键或其它核苷间键连接。反向脱碱基脱氧核糖残基的化学结构如下所示：
当(invAb)位于siRNA内部时为式A；当(invAb)位于siRNA的3'末端时为式B；当(invAb)位于siRNA的5'末端时为式C：
其中，式A的磷酸酯键部分的键为朝向siRNA的3'末端的键。
在一些实施方案中，2’-烷氧基修饰的核苷酸为2’-甲氧基(2’-OMe，2’-O-CH3)修饰的核苷酸等等。
在一些实施方案中，2’-取代的烷氧基修饰的核苷酸为2’-甲氧基乙氧基(2’-O-CH2-CH2-O-CH3)修饰的核苷酸，2’-O-CH2-CH＝CH2修饰的核苷酸等。
在一些实施方案中，2’-取代的烷基修饰的核苷酸为2’-CH2-CH2-CH＝CH2修饰的核苷酸等等。
在一些实施方案中，所述正义链和/或所述反义链中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸。在一些实施方案中，本公开提供的siRNA的正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为2’-氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸。在一些实施方案中，每一个非氟代修饰的核苷酸为2’-甲氧基修饰的核苷酸、GNA修饰的核苷酸或其中任意两种以上的组合；所述2’-甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2’-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
siRNA缀合物
本公开涉及一种siRNA缀合物，所述siRNA缀合物含有上述siRNA以及缀合连接至该siRNA的缀合基团。
在本公开中，siRNA缀合物的正义链与反义链形成siRNA缀合物的双链区，并且，在siRNA缀合物的正义链的3’末端形成平末端。在一些实施方案中，siRNA缀合物的正义链的3’末端形成平末端，siRNA缀合物的反义链的3’末端具有1-3个延伸出所述双链区的突出的核苷酸。在另外一些实施方案中，siRNA缀合物的正义链的3’末端形成平末端，siRNA缀合物的反义链的3’末端形成平末端。
在一些优选地实施方案中，siRNA缀合物由siRNA与缀合基团缀合连接得到。其中，siRNA的正义链与反义链互补形成siRNA的双链区，并且，siRNA的正义链的3’末端形成平末端，缀合基团与具有平末端的正义链的3’末端缀合连接，形成siRNA缀合物。
在一些优选的实施方案中，siRNA的正义链的3’末端具有延伸出双链区的突出的核苷酸，将位于正义链中3’末端的突出的核苷酸排除后形成的具有3’平末端的序列作为用于连接缀合基团的核苷酸序列，在正义链的3’平末端连接缀合基团，形成siRNA缀合物。
在一些更优选实施方案中，当正义链与反义链的核苷酸序列互补形成双链区后，正义链的3’末端不存在突出的核苷酸时，在正义链的3’末端添加核苷酸序列V，作为突出的核苷酸。将位于正义链中3’末端的突出的核苷酸排除后形成的具有3’平末端的序列作为用于连接缀合基团的核苷酸序列，在正义链的3’平末端连接缀合基团，形成siRNA缀合物。
在一些更优选实施方案中，当正义链与反义链的核苷酸序列互补形成双链区后，正义链的3’末端具有延伸出双链区的突出的核苷酸时，将位于正义链中3’末端的突出的核苷酸排除后形成的具有3’平末端的序列作为用于连接缀合基团的核苷酸序列，在正义链的3’平末端连接缀合基团，形成siRNA缀合物。
示例性地，序列如N-ER-FY014203M2所示的siRNA，该siRNA的正义链的3’末端具有延伸出双链区的突出的核苷酸，将位于正义链中3’末端的突出的-sTsT核苷酸排除后形成的gsasagauUfgAfCfAfgguucaua平末端序列作为用于连接L96缀合基团的核苷酸序列，因此，形成siRNA缀合物的序列为：正义链为gsasagauUfgAfCfAfgguucauaL96，反义链为P1usAfsugaAfccugucaAfuCfuucsTsT。
一般来说，所述缀合基团包含药学上可接受的至少一个靶向基团，或者进一步还包含接头(linker)，并且，所述siRNA、所述接头和所述靶向基团依次连接。在一些实施方案中，所述靶向基团为1-6个。在一些实施方案中，所述靶向基团为2-4个。所述siRNA分子可以非共价或共价缀合至所述缀合基团，例如可以共价缀合至所述缀合基团。siRNA与缀合基团的缀合位点可以在siRNA正义链的3'末端或5'末端，也可在反义链的5'末端，还可以在siRNA的内部序列中。在一些实施方案中，所述siRNA与缀合基团的缀合位点在siRNA正义链的3'末端。
在一些实施方案中，所述缀合基团可以连接在核苷酸的磷酸基团、2'-位羟基或者碱基上。在一些实施方案中，所述缀合基团还可以连接在3'-位羟基上，此时核苷酸之间采用2'-5'磷酸二酯键连接。当缀合基团连接在siRNA链的末端时，所述缀合基团通常连接在核苷酸的磷酸基团上；当缀合基团连接在siRNA的内部序列时，所述缀合基团通常连接在核糖糖环或者碱基上。各种连接方式可以参考文献：Muthiah Manoharan et.al.siRNAconjugates carrying sequentially assembled trivalent N-acetylgalactosaminelinked through nucleosides elicit robust gene silencing in vivo inhepatocytes.ACS Chemical biology,2015,10(5):1181-7.
在一些实施方案中，所述siRNA与缀合基团间可以通过酸不稳定的、或可还原的化学键相连，在细胞内涵体的酸性环境下，这些化学键可降解，从而使siRNA成为自由状态。对于不可降解的缀合方式，缀合基团可连接在siRNA的正义链，从而尽量降低缀合对siRNA活性的影响。
在一些实施方案中，所述药学上可接受的靶向基团可以是siRNA给药领域常规使用的配体，例如WO2009082607A2中描述的各种配体，以引用的方式全文纳入本说明书。
在一些实施方案中，所述药学上可接受的靶向基团可以选自以下靶向分子或其衍生物形成的配体中的一种或多种：亲脂分子，例如胆固醇、胆汁酸、维生素(例如维生素E)、不同链长的脂质分子；聚合物，例如聚乙二醇；多肽，例如透膜肽；适配体；抗体；量子点；糖类，例如乳糖、聚乳糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)；叶酸(folate)；肝实质细胞表达的受体配体，例如去唾液酸糖蛋白、去唾液酸糖残基、脂蛋白(如高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等)、胰高血糖素、神经递质(如肾上腺素)、生长因子、转铁蛋白等。
在一些实施方案中，所述的每个配体独立地选自一个能够与细胞表面受体结合的配体。在一些实施方案中，至少一个配体是能够与肝细胞表面受体结合的配体。在一些实施方案中，至少一个配体是能够与哺乳动物细胞表面受体结合的配体。在一些实施方案中，至少一个配体是能够与人肝细胞表面受体结合的配体。在一些实施方案中，至少一个配体是能够与肝表面去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合的配体。这些配体的种类为本领域技术人员所公知，其作用一般是与靶细胞表面的特异性受体相结合，介导与配体连接的siRNA递送至靶细胞。
在一些实施方案中，所述药学上可接受的靶向基团可以是与哺乳动物肝细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合的任意一种配体。在一些实施方案中，每个配体独立地为去唾液酸糖蛋白，例如去唾液酸血清类粘蛋白(asialoorosomucoid，ASOR)或去唾液酸胎球蛋白(asialofetuin，ASF)。在一些实施方案中，所述配体为糖或糖的衍生物。
在一些实施方案中，至少一个配体是糖。在一些实施方案中，每个配体均是糖。在一些实施方案中，至少一个配体是单糖、多糖、修饰的单糖、修饰的多糖或糖衍生物。在一些实施方案中，至少一个所述配体可以是单糖，双糖或三糖。在一些实施方案中，至少有一个配体是修饰的糖。在一些实施方案中，每一个配体均为修饰的糖。在一些实施方案中，每个配体均独立地选自多糖、修饰的多糖、单糖、修饰的单糖、多糖衍生物或单糖衍生物。在一些实施方案中，每一个或至少一个配体选自于由以下糖所组成的组：葡萄糖及其衍生物、甘露聚糖及其衍生物、半乳糖及其衍生物、木糖及其衍生物、核糖及其衍生物、岩藻糖及其衍生物、乳糖及其衍生物、麦芽糖及其衍生物，阿拉伯糖及其衍生物、果糖及其衍生物和唾液酸。
在一些实施方案中，每个所述配体可独立地选自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-三氟乙酰半乳糖胺、N-丙酰半乳糖胺、N-正丁酰半乳糖胺、N-异丁酰半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖或L-4-硫代核糖。所述配体的其它选择可参见例如CN105378082A的记载，以引用的方式全文纳入本说明书。
在一些实施方案中，所述siRNA缀合物中药学上可接受的靶向基团可以是半乳糖或N-乙酰半乳糖胺，其中，半乳糖或N-乙酰半乳糖胺分子可以是一价、二价、三价、四价。应当理解的是，这里所述的一价、二价、三价、四价分别指siRNA分子与含有作为靶向基团的半乳糖或N-乙酰半乳糖胺分子的缀合基团形成siRNA缀合物后，该siRNA缀合物中siRNA分子与半乳糖或N-乙酰半乳糖胺分子的摩尔比为1:1、1:2、1:3或1:4。在一些实施方案中，所述药学上可接受的靶向基团是N-乙酰半乳糖胺。在一些实施方案中，当本公开所述的siRNA与含有N-乙酰半乳糖胺的缀合基团缀合时，N-乙酰半乳糖胺分子是三价或四价。在一些实施方案中，当本公开所述的siRNA与含有N-乙酰半乳糖胺的缀合基团缀合时，N-乙酰半乳糖胺分子是三价。
靶向基团可经由合适的接头与siRNA分子相连，本领域技术人员可以根据靶向基团的具体类型选择合适的接头。这些接头、靶向基团的种类以及与siRNA的连接方式，可参见WO2015006740A2的公开内容，以引用的方式全文纳入本说明书。
siRNA的合成方法
通过本领域常规的固相亚磷酰胺法，按照核苷酸排布顺序自3'-5'方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体都包括脱保护、偶联、氧化或硫化、盖帽四步反应。其中，两个核苷酸之间采用磷酸酯连接时，连接后一个核苷单体时，包括脱保护、偶联、氧化、盖帽四步反应。两个核苷酸之间采用硫代磷酸酯连接时，连接后一个核苷单体时，包括脱保护、偶联、硫化、盖帽四步反应。本公开根据合成目标序列选取核苷酸单体，选取的核苷酸单体为本领域技术人员常用的核苷酸单体，例如合成A的核苷酸单体可以为但不限于选择腺苷-3-磷酸。应理解这些单体当存在于寡核苷酸中时通过5’-3’磷酸二酯键或者5’-3’硫代磷酸酯基互相连接，当例如按5’到3’方向最后一个核苷酸3’位置为羟基时，根据本领域技术常规手段实现。
例如，本公开的siRNA的合成条件可以如下：
脱保护的条件包括：反应温度为25℃，反应时间为70秒，脱保护试剂选自二氯乙酸的二氯甲烷溶液(3％V/V)，脱保护试剂与固相载体上的4,4’-二甲氧基三苯甲基保护基的摩尔比为5:1。
偶联反应条件包括：反应温度为25℃，反应时间为600秒，偶联试剂选自5-乙硫基-1H-四氮唑(ETT)的0.25M乙腈溶液，固相载体上连接的核酸序列与核苷单体的摩尔比为1:10，固相载体上连接的核酸序列和偶联试剂的摩尔比为1:65。
氧化反应条件包括：反应温度为25℃，反应时间为15秒，氧化试剂选自0.05M碘四氢呋喃溶液，氧化试剂与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为30:1。反应在四氢呋喃:水:吡啶＝3:1:1的混合溶剂中进行。
硫化反应条件包括：反应温度为25℃，反应时间为300秒，硫化试剂选自氢化黄原素，硫化试剂与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为120:1。反应在乙腈:吡啶＝1:1的混合溶剂中进行。
盖帽反应条件包括：反应温度为25℃，反应时间为15秒，盖帽试剂选自摩尔比为1:1的CapA(10％乙酸酐乙腈溶液)和CapB(10％的N-甲基咪唑吡啶/乙腈溶液)的混合溶液，盖帽试剂与固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为乙酸酐：N-甲基咪唑:固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为1:1:1。
在将所有核苷单体连接之后，依次对固相载体上连接的核酸序列进行氨解、纯化、脱盐，得到siRNA正义链和反义链，最后将两条链进行加热退火得到产品。
氨解、纯化、脱盐和退火的方法是本领域中公知的。例如，通过将连接有固相载体的核苷酸序列与浓氨水接触进行氨解；通过色谱法进行纯化；通过反相色谱进行脱盐；通过在不同严格条件下等摩尔比混合正义链和反义链后逐渐降温冷却。
合成的siRNA如表1和表1-1所示。
siRNA缀合物合成方法
以L96的合成为例：
第一步，通过将DMTr-L96和丁二酸酐反应，得到化合物L96-A：
制备过程：将DMTr-L96、丁二酸酐、4-二甲基氨基吡啶和二异丙基乙胺加入二氯甲烷中，25℃下搅拌反应24小时，然后用0.5M三乙胺磷酸盐洗涤反应液，水相以二氯甲烷洗涤三次，合并有机相减压蒸干得粗品。然后柱层析纯化得到纯品L96-A。
第二步，将L96-A与NH2-SPS反应得到L96-B：
制备过程：将L96-A、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和二异丙基乙胺(DIPEA)混合溶于乙腈中，室温搅拌5分钟得到均一溶液，加入氨甲基树脂(NH2-SPS，100-200目)至反应液体中，25℃下开始摇床反应，反应18小时后过滤，滤饼依次用二氯甲烷和乙腈洗涤，得滤饼。所得滤饼用CapA/CapB混合溶液进行盖帽反应得到L96-B，即为含有缀合分子的固相载体。
第三步，siRNA缀合物的合成：
将L96-B作为固相载体按照前文所述的siRNA合成方法合成siRNA缀合物的正义链，采用前文所述的siRNA合成方法合成siRNA缀合物的反义链，退火生成本申请的siRNA缀合物。
合成的siRNA缀合物如表2所示。
药物组合物
本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有如上所述的siRNA作为活性成分和药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可以是siRNA给药领域常规使用的载体，例如但不限于脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticle，LNP)、磁性纳米粒(magnetic nanoparticles，如基于Fe3O4或Fe2O3的纳米粒)、碳纳米管(carbon nanotubes)、介孔硅(mesoporous silicon)、磷酸钙纳米粒(calcium phosphate nanoparticles)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)、聚酰胺型树形高分子(polyamidoamine(PAMAM)dendrimer)、聚赖氨酸(poly(L-lysine)，PLL)、壳聚糖(chitosan)、1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)、聚D型或L型乳酸/羟基乙酸共聚物(poly(D&L-lactic/glycolic acid)copolymer，PLGA)、聚(氨乙基乙撑磷酸酯)(poly(2-aminoethylethylene phosphate)，PPEEA)和聚(甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯)(poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate)，PDMAEMA)以及它们的衍生物中的一种或多种。
所述药物组合物中，对siRNA和药学上可接受的载体的含量没有特别要求，可以是各组分常规的含量。
在一些实施方案中，所述药物组合物中，还可以包含药学上可接受的其它辅料，该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种。例如，所述药学上可接受的其它辅料可以包括pH缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。
所述pH缓冲液可以为pH值7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液和/或pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，例如可以为pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。
所述保护剂可以为肌醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖和葡萄糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准，所述保护剂的含量可以为0.01-30重量％。
所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克(mOsm/kg)。根据所需渗透压，本领域技术人员可以容易地确定所述渗透压调节剂的含量。
在一些实施方案中，所述药物组合物可以为液体制剂，例如注射液；也可以为冻干粉针剂，实施给药时与液体辅料混合，配制成液体制剂。所述液体制剂可以但不限于用于皮下、肌肉或静脉注射给药，也可以但不限于通过喷雾给药到肺脏、或通过喷雾经肺脏给药到其它脏器组织(如肝脏)。在一些实施方案中，所述药物组合物用于静脉注射给药。
在一些实施方案中，所述药物组合物可以为脂质体制剂的形式。在一些实施方案中，所述脂质体制剂中使用的药学上可接受的载体包含含胺的转染化合物(下文也可将其称为有机胺)、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质。
以下实施例用于进一步说明本公开，但不对本公开进行任何限制。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方案)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
下述实施例中使用的细胞、试剂如下表所示：
实施例1：siRNA的制备
由天霖生物科技(上海)有限公司合成了具有以下序列的siRNA分子。
表1siRNA及其序列
表1-1
其中，大写字母“G”、“C”、“A”、“T”和“U”每个通常代表分别含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶作为碱基的核苷酸；小写字母a、u、c、g：表示2’-甲氧基修饰的核苷酸；Af、Gf、Cf、Uf：表示2’-氟代修饰的核苷酸；“dG”、“dC”、“dA”：表示2'-脱氧核糖核苷酸；当“T”在突出端位置时，表示胸腺嘧啶核糖核苷酸(T)；当在基序的双链区时，表示基序序列中对应位置的尿嘧啶核糖核苷酸(U)替换为胸腺嘧啶核糖核苷酸(T)；(invAb)为反向脱碱基脱氧核糖残基；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；P1：表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5’-磷酸核苷酸；EVP:表示该EVP右侧相邻的一个核苷酸为5’-反式乙烯基膦酸酯核苷酸；A、U、C、G(下划线+粗体+斜体)：表示GNA修饰的核苷酸；“T”(下划线+粗体+斜体)表示基序序列中对应位置的尿嘧啶核糖核苷酸(U)替换为胸腺嘧啶核糖核苷酸(T)并经GNA修饰；(pMeU)：表示2’-甲氧基修饰的假尿嘧啶核苷酸，结构如下：
由天霖生物科技(上海)有限公司合成了具有以下序列的siRNA缀合物：
表2siRNA缀合物及其序列：
其中，L96通过磷酸二酯键与表1和表1-1中正义链的3’末端或正义链的3’末端形成的平末端连接，L96为：
表1、表1-1和表2中，正义链、修饰的正义链和连接缀合基团的修饰的正义链的5’末端核苷酸左侧如果没有标有P1或EVP，则代表该5’末端核苷酸没有连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团(即5’末端核苷酸的核糖基团为5’羟基)，其结构如式X所示：
其中，Base表示碱基，例如A、U、G、C或T；R为羟基或氢或被本领域技术人员所知晓的各类基团所取代，例如，R可以为2’-氟代(2’-F)、2’-烷氧基、2’-取代的烷氧基、2’-烷基、2’-取代的烷基、2’-氨基、2’-取代的氨基。
表1、表1-1和表2中，反义链和修饰的反义链的5’末端核苷酸左侧如果没有标有P1或EVP，则代表该5’末端核苷酸没有连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团，其结构也如式X所示。
表1、表1-1和表2中，正义链和修饰的正义链的3’末端核苷酸、反义链和修饰的反义链的3’末端核苷酸的3’位置为羟基。
实施例2siRNA抑制AGT基因表达
2.1实验材料
人肝癌细胞Huh7，JCRB cell bank，货号JCRB0403；
RNA提取试剂盒，96Kit，QIAGEN，货号QIAGEN-74182；
转染试剂，购自Invitrogen，货号13778-150；
Opti-medium：减血清培养基，购自Gibco，货号31985-070；
Fastking RT Kit(with gDNase)，购自TIANGEN，货号KR116-02；
FastStart universal probe master(ROX)，购自Roche，货号04914058001；
AO/PI，购自Counterstar，货号RE010212；
Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)，购自Gibco，货号11965-092；
Target AGT primer and probe set(Thermo,Assay ID:Hs01586213_m1)；
Target GAPDH primer and probe set(Thermo,Assay ID:Hs02786624_g1)。
2.2实验方法
2.2.1取20μL细胞悬液，与AO/PI(1：1)充分混合；调整细胞密度至5.5×105细胞/mL，用10％FBSDMEM稀释细胞悬液至所需的最终细胞密度2×105cell/mL；然后以每孔20,000个细胞的密度接种到96孔板中，每孔培养液为100μL。将Huh7细胞置于5％CO2、37℃孵箱中培养过夜。
2.2.2将待测siRNA(为便于描述，本实施例实验过程描述中统称为siRNA)的干粉以低温高速离心，然后用超纯蒸馏水(ULtraPure Distilled Water)溶解，配制成100μM的siRNA母液。
2.2.3配制2nM的siRNA稀释液Z和0.2nM的siRNA稀释液W
(1)0.1μM siRNA贮备液X和0.01μM siRNA贮备液Y的制备：
a)取上述步骤2.2.2中制得的100μM siRNA母液2μL，加入18μL超纯蒸馏水，得到终浓度为10μM的siRNA稀释液；
b)取步骤a)中制得的10μM的siRNA稀释液2μL，加入18μL超纯蒸馏水，得到终浓度为1μM的siRNA稀释液；
c)取步骤b)中制得的1μM的siRNA稀释液2μL，加入18μL超纯蒸馏水，得到终浓度为0.1μM的siRNA贮备液X；
d)取步骤c)中制得的0.1μM的siRNA贮备液X 2μL，加入18μL超纯蒸馏水，得到终浓度为0.01μM的siRNA贮备液Y；
d)取步骤c)中制得的0.1μM的siRNA贮备液X 2μL，加入18μL超纯蒸馏水，得到终浓度为0.01μM的siRNA贮备液Y；
(2)取上述配制好的siRNA贮备液X和siRNA贮备液Y各2μL，分别加入98μLOpti-medium，分别得到2nM的siRNA稀释液Z和0.2nM的siRNA稀释液W。
2.2.4转染Huh7细胞
(1)取转染试剂3μL，加入97μL Opti-medium，得到转染试剂稀释液；将转染试剂稀释液与步骤2.2.3中制得的2nM siRNA稀释液Z以1:1体积比混合制备成转染混合物，静置5分钟，取10μL转染混合物加入到96孔板中转染步骤2.2.1中培养的Huh7细胞(终体积100μL，该体系中siRNA的浓度为0.1nM)；
(2)取转染试剂3μL，加入97μL Opti-medium，得到转染试剂稀释液；将转染试剂稀释液与步骤2.2.3中制得的0.2nM siRNA稀释液W以1:1体积比混合制备成转染混合物，静置5分钟，取10μL转染混合物加入到96孔板中转染步骤2.2.1中培养的Huh7细胞(终体积100μL，该体系中siRNA的浓度为0.01nM)。
上述转染后培养24小时；每个浓度(0.1nM和0.01nM)设置2个重复。
2.2.5根据96Kit试剂盒产品说明书，提取步骤2.2.4中获得的Huh7细胞的总RNA。
2.2.6对提取的总RNA使用Fastking RT Kit(with gDNase)进行逆转录至cDNA，按照以下步骤进行：
a)按照下表用gDNA酶除去gDNA；
表3
体积/μL
5×gDNABuffer 2
Sample(RNA) 8
42℃，3min；4℃，静置。
b)如下所述进行逆转录程序
表4
体积/μL
FastKingRTEnzymeMix 1
FQ-RTPrimerMix 2
10×KingRTBuffer 2
RNase-FreeddH2O 5
42℃，15min；95℃，3min。
c)将逆转录产物储存在-20℃以进行实时PCR分析。
2.2.7使用FastStart universal probe master(ROX)进行实时PCR分析
a)如下表所示制备qPCR反应混合物，在整个操作过程中，所有试剂都放置在冰上；
表5
体积/μL
2×FastStartuniversalprobemaster 5
20×targetspecialgeneTaqMan探针引物(AGT) 0.5
20×targetspecialgeneTaqMan探针引物(GAPDH) 0.5
步骤2.2.6得到的cDNA和H2O 4
总体积 10
b)如下所述进行qPCR程序
95℃，10分钟；
95℃，15秒；60℃，1分钟(40个循环)。
2.2.8结果分析
a)使用Quant Studio 7软件采用默认设置，自动计算Ct值；
b)使用以下公式计算基因的相对表达量：
ΔCt＝Ct(AGT基因)–Ct(GAPDH)
ΔΔCt＝ΔCt(检测样品组)-ΔCt(Mock组)，其中Mock组表示和检测样品组相比，未加入siRNA的组；
相对于Mock组的mRNA表达＝2-ΔΔCt
抑制率(％)＝(Mock组mRNA相对表达量–检测样品组mRNA相对表达量)/Mock组mRNA相对表达量×100％
2.3实验结果
选取浓度0.1nM和0.01nM进行测试。其中，AD-85481为阳参，其正义链为gsuscaucCfaCfAfAfugagaguacaL96(SEQ ID NO:175)，反义链为usGfsuacTcucauugUfgGfaugacsgsa(SEQ ID NO:176)，该序列公开于CN112313335A。
表6本公开的siRNA的抑制率
表6-1
表6和表6-1中，表示未测数据。
从表6和表6-1可以看出，本公开的siRNA在0.1nM和0.01nM下均可显著抑制AGT基因的表达。
实施例3siRNA抑制AGT基因表达的IC50测定
下述待测siRNA测定浓度范围设置(nM)：10、2.5、0.625、0.156、0.039、0.010、0.0024、0.0006)，再按照与实施例2相同的方法进行IC50测定。
结果分析：a)使用Quant Studio 6Flex软件采用默认设置，自动计算Ct值；
b)使用以下公式计算基因的相对表达量：
ΔCt＝Ct(AGT基因)–Ct(GAPDH)
ΔΔCt＝ΔCt(检测样品组)–ΔCt(Mock组)，其中Mock组表示和检测样品组相比，未加入siRNA的组；
相对于Mock组的mRNA表达＝2-ΔΔCt
抑制率(％)＝(Mock组mRNA相对表达量–检测样品组mRNA相对表达量)/Mock组mRNA相对表达量×100％
计算过程：以siRNA浓度的log值作为X轴，百分比抑制率为Y轴，采用分析软件GraphPad Prism 8的“log(抑制剂)vs.响应变量斜率”功能模块，来拟合量效曲线，从而得出各个siRNA的IC50值。
拟合公式为：Y＝Bottom+(Top Bottom)/(1+10^((logIC50 X)*HillSlope))
其中：Top表示顶部平台处的百分比抑制率，曲线的Top标准一般在80％～120％；Bottom表示底部平台处的百分比抑制率，曲线的Bottom一般在－20％～20％之间；HillSlope表示百分比抑制率曲线的斜率。
表7
siRNAID IC50/nM
N-ER-FY014307M70L96 0.011
N-ER-FY014307M91L96 0.015
N-ER-FY014307M92L96 0.019
N-ER-FY014307M93L96 0.010
N-ER-FY014307M94L96 0.010
N-ER-FY014307M95L96 0.014
N-ER-FY014307M100L96 0.011
N-ER-FY014307M101L96 0.008
N-ER-FY014307M102L96 0.032
N-ER-FY014307M103L96 0.007
N-ER-FY014307M104L96 0.009
从表7中可以看出，本申请的siRNA缀合物具有很高的AGT基因抑制活性。
实施例4siRNA缀合物抑制AGT基因表达的抑制率测定
4.1试验材料：
人原代肝细胞PHH细胞，由上海药明康德新药开发有限公司提供；
PHH培养基：invitroGRO CP Meduim serum free BIOVIT，货号：S03316；
转染试剂，购自Invitrogen，货号：13778-150；
RNA提取试剂盒96Kit，购自QIAGEN，货号：QIAGEN-74182；
逆转录试剂盒FastKing RT Kit(With gDNase)，购自TianGen，货号：KR116-02；
FastStart Universal Probe master(ROX)，购自Roche，货号：04914058001；
针对AGT及GAPDH的引物，由上海药明康德新药开发有限公司提供。
4.2试验方法
siRNA缀合物(siRNA缀合物终浓度分别为5nM和0.5nM，复孔)通过转染进入PHH细胞，过程如下所述：取冻存的PHH细胞，复苏，计数，调整细胞到6×105细胞/mL，同时应用分别将siRNA及siRNA缀合物转入细胞，以每孔54,000个细胞的密度接种到96孔板中，每孔加入PHH培养基100μL。细胞置于5％CO2、37℃孵箱中培养。48小时后，去除培养基并收集细胞用于总RNA提取。根据试剂盒产品说明书使用96Kit提取总RNA。
siRNA缀合物(siRNA缀合物终浓度分别为100nM和10nM，复孔)通过自由摄取进入PHH细胞，过程如下所述：取冻存的PHH细胞，复苏，计数，调整细胞到6×105细胞/mL，同时分别加入siRNA及siRNA缀合物，以每孔54,000个细胞的密度接种到96孔板中，每孔培养液为100μL。细胞置于5％CO2、37℃孵箱中培养。48小时后，去除培养基并收集细胞用于总RNA提取。根据试剂盒产品说明书使用96Kit提取总RNA。
采用与实施例2中类似的方法，通过逆转录反应将提取的总RNA逆转录为cDNA,以及通过qPCR对逆转录得到的AGT cDNA进行定量扩增。GAPDH cDNA将作为内部对照进行平行扩增。PCR反应程序为：95℃，10分钟，然后进入循环模式，95℃，15秒，随后60℃，60秒，共40个循环。
结果分析：
a)使用Quant Studio 7软件采用默认设置，自动计算Ct值；
b)使用以下公式计算基因的相对表达量：
ΔCt＝Ct(AGT基因)–Ct(GAPDH)
ΔΔCt＝ΔCt(检测样品组)–ΔCt(Mock组)，其中Mock表示和检测样品组相比，未加入siRNA缀合物的组；
相对于Mock组的mRNA表达＝2-ΔΔCt
抑制率(％)＝(Mock组mRNA相对表达量–检测样品组mRNA相对表达量)/Mock组mRNA相对表达量×100％
表8siRNA缀合物抑制AGT基因表达的抑制率
从表8中可以看出，本公开的siRNA缀合物可显著抑制AGT基因表达。实施例5体外肝匀浆稳定性实验
1.实验试剂及耗材
仪器/试剂名称 品牌 货号/型号/CAS号
恒温振荡金属浴 大龙 HCM100-PRO
大鼠肝脏 / /
1MMgCl2 碧云天 ST269
碳酸氢铵 天津光复精细化工 GB663-78
磷酸二氢钠 天津光复精细化工 GB/T1267-1999
磷酸氢二钠 天津光复精细化工 10039-32-4
乙腈 Honeywell AH015-4HC
ClarityOTXLysis-loadingBuffer 艾杰尔-飞诺美 AL0-8579
甲醇 Honeywell AH230-4HC
pH计 梅特勒-托利多 PE20
ClarityOTX96孔板 艾杰尔-飞诺美 100mg
固相萃取装置(正压) 艾杰尔-飞诺美 SPE96-196-F0011
真空浓缩仪 湖南可成 ZL3-2K
0.5MEDTA Beyotime ST066
2.实验步骤
2.1配制肝匀浆
2.1.1研磨液配制
2.1.2组织匀浆
将大鼠肝组织与研磨液按100mg:5mL配制肝匀浆(浓度为20mg/mL)；配制后加入研磨珠放入匀浆仪，研磨参数设置如下。
运行速度 60Hz
运行时间 30s
暂停时间 15s
运行次数 4次
运行温度 -20℃
2.2样品配制
siRNA缀合物样品用无酶水配制为1mg/mL的溶液，待用。内标样品用无酶水配制为0.125mg/mL浓度。
2.3样本孵育
(1)在2mL无酶管中加入250μL配置好的肝匀浆，
(2)在步骤1基础上加入50μL核酸样品；
(3)体系为300μL的生物样本，涡旋，静置5min；
(4)分为2管，每管100μL；
(5)体系孵育时间：48h。
2.4生物样本处理
每100μL生物样本体系涡旋，混匀，加入300μL clarity OTX裂解液涡旋，静置30min,加入100μL内标溶液，涡旋，静置5min，离心1min，待用(样本总体积约500μL)。
2.5固相萃取：
(1)固相萃取试剂配制
活化剂：取200mL甲醇至流动相瓶中，标记为活化剂；
平衡液：配置1M磷酸缓冲溶液【877mL磷酸二氢钠(1.56g/L)+123mL磷酸氢二钠(3.58g/L)】，稀释100倍，使用磷酸调pH至5.5，标记为平衡液；
冲洗液：取500mL平衡液至1L流动相瓶中，加入500mL乙腈，使用磷酸调pH至5.5，混匀，标记为冲洗液；
洗脱液：称取碳酸氢铵7.9g至1L流动相瓶中，加入1L水，取碳酸氢铵溶液500mL至1L流动相瓶中，加入500mL乙腈，使用氢氧化钠调节pH＝9，混匀，标记为洗脱液；
(2)萃取步骤如下所示：
2.6后处理
取洗脱液(分两次取，一次600mL，共计1200mL)置于2mL EP管中，真空浓缩6小时，转速1800rpm；浓缩后的样品加入100μL流动相(初始比例)进行复溶，低速离心2min，取上清液10μL注入高分辨质谱。采用LC-MS/MS方法半定量检测本申请siRNA缀合物的反义链比例，在大鼠肝匀浆中体外孵育48小时后的代谢结果如下表9所示。
表9siRNA缀合物的反义链剩余百分比
siRNAID AS％
N-ER-FY014307M8L96 80.33
N-ER-FY014307M43L96 93.58
N-ER-FY014307M50L96 94.91
N-ER-FY014307M51L96 95.82
N-ER-FY014307M70L96 97.88
N-ER-FY014307M91L96 94.43
N-ER-FY014307M92L96 87.13
N-ER-FY014307M93L96 89.34
N-ER-FY014307M94L96 97.15
N-ER-FY014307M95L96 95.63
N-ER-FY014307M100L96 95.07
N-ER-FY014307M101L96 93.43
N-ER-FY014307M102L96 94.14
N-ER-FY014307M103L96 96.29
N-ER-FY014307M104L96 96.12
表9中，AS表示siRNA的反义链，AS剩余量越大，说明药物的稳定性越好，且药物的长效性也越好。从表9可以看出，本公开的siRNA缀合物在大鼠肝匀浆中具有优异的体外稳定性。
实施例6siRNA缀合物在人源化小鼠中对人AGT(hAGT)基因表达的抑制作用
6-8周龄的C57BL/6-hAGT小鼠(由江苏集萃药康生物科技股份有限公司提供)进入饲养设施，适应性喂养7天后，siRNA缀合物以3mg/kg的单一剂量对小鼠分别皮下给药AD-85481、N-ER-FY014307M8L96、N-ER-FY014307M43L96、N-ER-FY014307M70L96、N-ER-FY014307M50L96、N-ER-FY014307M51L96和N-ER-FY014307M86L96(每组5只小鼠)。给药后第7日、第14日、第21日、第28日、第35日、第49日、第56日、第63日、第70日、第77日、第84日、第98日和第112日分别检测血清hAGT蛋白表达量，由此得出siRNA缀合物对hAGT蛋白表达的抑制率，结果如下表10和表10-1所示。
表10
表10-1
表10和表10-1中，“--”表示未测。
通过表10、表10-1及图1可以看出，本公开的siRNA缀合物对hAGT蛋白表达的抑制率均显著优于AD-85481。
实施例7siRNA缀合物在人源化小鼠中对人AGT(hAGT)基因表达的抑制作用
6-8周龄的C57BL/6-hAGT小鼠(由江苏集萃药康生物科技股份有限公司提供)进入饲养设施，适应性喂养7天后，siRNA缀合物以1mg/kg的单一剂量对小鼠分别皮下给药(每组5只小鼠)。给药后第7日、第14日、第21日、第28日、第35日、第42日、第49日、第56日分别检测血清hAGT蛋白表达量，由此得出siRNA缀合物对hAGT蛋白表达的抑制率，结果如下表11所示。
表11
通过表11可以看出，在第56天的测试中，本公开缀合物N-ER-FY014307M70L96对hAGT蛋白表达的抑制率均优于AD-85481(来自Alnylam，处于临床研究中)、AD00163-3(公开于WO2023088227)，且N-ER-FY014307M70L96能在长达D56的实验期间维持对hAGT蛋白表达的较高抑制率，长效性明显优于提供的对比序列。
实施例8siRNA缀合物在食蟹猴体内的药效实验
3～6岁食蟹猴(体重2～4kg)9只(国科赛赋河北医药技术有限公司)，随机分成3组，进行14天适应性喂养后，给药。给药当天定义为Day 1(D1)。具体给药设计概述见下表12。
表12
注射位点为腰背皮肤或其他适宜部位。将注射位点周围毛发剔除干净，使用碘伏和酒精消毒皮肤后，进行皮下给药。D-3(给药前)与给药后D7、D14、D21、D28、D35、D42、D49、D56和D63采血进行AGT蛋白表达量检测，结果如下表13所示。
表13
从表13可以看出，本公开的siRNA缀合物在食蟹猴体内能够明显降低食蟹猴血清中AGT蛋白的表达量。
实施例9siRNA缀合物在高血压食蟹猴体内的药效实验
自发高血压种群食蟹猴中(≥8岁)选取动物进行实验，需满足以下条件：SBP(收缩压)≥130(mmHg)和DBP(舒张压)≥70(mmHg)，肝功、肾功、血液学指标正常。随机分成2组，PBS组两只，给药组4只，进行14天适应性喂养后，给药。给药当天定义为Day 1(D1)。具体给药设计概述见下表14。
表14
注射位点为腰背皮肤或其他适宜部位。将注射位点周围毛发剔除干净，使用碘伏和酒精消毒皮肤后，进行皮下给药。给药后D8，D15，D22，D29，D36，D43，D57，进行血压测量。结果如下表15所示。
表15
从表15可以看出，本公开的siRNA缀合物N-ER-FY014307M70L96在高血压食蟹猴体内能够明显降低收缩压与舒张压。
实施例10SD大鼠皮下注射给予N-ER-FY014307M70L96重复给药毒性试验
本试验共设3组，主试验组每组雌、雄各10只SD大鼠，分别皮下注射给予溶媒对照品(0.9％氯化钠注射液)、100mg/kg和200mg/kg的N-ER-FY014307M70L96，每两周给药一次，共3次，给药容量为5mL/kg。于D30对每组雌、雄各10只动物进行给药期末计划解剖。设置卫星组(给药剂量及给药方式同主试验组动物)，每组雌、雄各5只大鼠用于细胞因子研究采血。另外，设置TK组(给药方式及剂量同主试验组动物)，其中溶媒对照组雌、雄各4只大鼠，供试品组每组雌、雄各8只大鼠用于TK研究采血。
本试验的毒性指标包括：死亡/濒死、一般观察、体重、摄食量、眼科检查、临床病理学指标(血液学和凝血指标、血清生化指标、免疫功能指标、尿液指标、骨髓涂片)、大体剖检、脏器重量、组织病理学检查以及组织分布。卫星组动物分别于适应期，D1及D29给药后4h、24h采集血液样本用于细胞因子分析。TK组动物分别于D1及D29的给药前及给药后0.25、0.5、1、2、4、6、8和24小时采集血液样本用于毒代动力学分析。
试验期间，所有动物均存活至计划解剖，所有动物一般观察、体重、摄食量、眼科检查、细胞因子、临床病理学指标(血液学、凝血、血清生化、免疫功能指标、尿液指标、骨髓涂片)、大体剖检均未见与供试品相关的明显异常。因此，SD大鼠皮下注射给予N-ER-FY014307M70L96的未观察到不良反应的剂量水平(No Observed Adverse Effect Level,NOAEL)考虑为200mg/kg。
实施例11体外脱靶实验
11.1主要试剂和耗材
InvitroGRO CP Medium,serum-free(BioreclamationIVT-S03316)，胎牛血清(ExCellBio-FSP500)，青霉素/链霉素(Hyclone-SV30010)，AO/PI染色液(Countstar-RE010212)，Nuclease-free water(Invitrogen-AM9932)，核糖核酸提取试剂盒(miRNeasyTissue/Cells Advanced Mini Kit，Qiagen-217604)，安捷伦核糖核酸分析试剂盒(Agilent RNA 6000Nano Kit，Agilent-5067-1511)，转录组文库构建试剂盒(Universal V10RNA-seq Library Prep Kit for Illumina，Vazyme-NR606-02)，双链脱氧核糖核酸高灵敏度浓度测定试剂盒(Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit，Thermo FisherScientific-Q33231)，高灵敏度脱氧核糖核酸预制电泳胶条(High SensitivityD1000ScreenTape，Agilent-5067-5584)，二代测序高通量输出试剂盒(NovaSeq 6000S4Reagent Kit v1.5(300cycles)(Illumina-20028312))，人原代肝细胞(PHH)(批次：BXU)，由上海药明康德新药开发有限公司提供。
11.2主要仪器
生物安全柜(力新(上海)仪器有限公司，Hfsafe-1800LCA2)，微量紫外-可见分光光度计(NanoDrop One，Thermo Fisher Scientific)，安捷伦2100生物分析仪(Agilent2100Bioanalyzer，Agilent)，热循环仪(T100 thermal cycler，Bio-Rad)，荧光仪(Qubit4fluorometer，Thermo Fisher Scientific)，安捷伦4200自动化电泳系统(Agilent4200TapeStation)，测序仪(NovaSeq 6000(Illumina))，全自动细胞荧光分析仪(RigelS2，Countstar)。
11.3培养基配方
20mL含有10％胎牛血清的细胞培养基配制体系：17.8mL体外无血清培养基InvitroGRO CP Medium,serum-free(BioreclamationIVT-S03316)，2mL胎牛血清(ExCellBio-FSP500)，0.2mL青霉素/链霉素(Hyclone-SV30010)。
11.4实验过程
11.4.1细胞铺板
化合物N-ER-FY014307M70L96通过自由摄取进入人原代肝细胞，过程如下所述：
1)用无核酸酶水稀释化合物N-ER-FY014307M70L96至终浓度(终浓度为0.05nM、0.5nM和5nM)的10倍。
2)从液氮罐中取出1支冻存的细胞，水浴锅中轻轻摇晃至冻存液溶化，将细胞转移至含有10％胎牛血清的细胞培养基中，调整细胞最终密度为6.7*105cells/mL。
3)取1)中50μL化合物至胶原包被的24孔细胞板中，再加入步骤2)的450μL细胞悬液，最终细胞密度为30万每孔。N-ER-FY014307M70L96终浓度为0.05nM、0.5nM和5nM，每个化合物测试3复孔，未加化合物的孔作为对照组。
4)培养72小时后，每孔用PBS洗涤一遍，再加入260μL裂解液裂解细胞，进行后续实验。
11.4.2二代测序
1)根据制造商(Qiagen-217604_miRNeasy Tissue/Cells Advanced Mini Kit)的指南从细胞中纯化总RNA。
2)使用NanoDrop One检测总RNA的浓度，根据制造商(Agilent 2100Bioanalyzer\Agilent-5067-1511_Agilent RNA 6000Nano Kit)的指南分析RNA完整性。
3)根据制造商(Universal V10RNA-seq Library Prep Kitfor Illumina)的指南进行文库制备。
4)根据制造商(Thermo Fisher Scientific-Qubit 4fluorometer\ThermoFisher Scientific-Q33231_Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit)的指南检测文库浓度，根据制造商(Agilent 4200TapeStation\Agilent-5067-5584_High Sensitivity D1000ScreenTape)分析文库片段大小。
5)根据制造商(Illumina-NovaSeq 6000\Illumina-20028312_NovaSeq6000S4Reagent Kit v1.5(300cycles))的指南进行文库测序。
本试验基于二代测序技术，研究人肝细胞自由摄取供试品(N-ER-FY014307M70L96)后对转录组表达的影响。设定|log2(FoldChange)|>1&padj.<0.05作为差异基因的筛选标准。
11.5PHH细胞中的IC50测试
待测siRNA的N-ER-FY014307M70L96测定浓度范围设置(nM)：100.0、20.0、4.0、0.8、0.16、0.032和0.0064，再按照与实施例3和实施例4中相同的方法进行IC50测定(PHH细胞中自由摄取)，得出N-ER-FY014307M70L96在人肝细胞中的自由摄取IC50为0.014nM。各个浓度的抑制率结果如图2所示。
N-ER-FY014307M70L96在0.05nM、0.5nM和5nM浓度下经过测序后，发现符合|log2(FoldChange)|>1&padj<0.05的差异基因在三种浓度下分别为0个、1个(ENSG00000269604)和3个(ENSG00000254990、RN7SL1和PRKD1)(如图3、图4和图5所示)，可知三种浓度下的差异基因没有重合，说明差异基因不存在剂量依赖效应，即N-ER-FY014307M70L96在体外PHH细胞实验中未发现脱靶基因。N-ER-FY014307M70L96在PHH细胞中的IC50为0.014nM，选定脱靶的三个浓度分别为IC50的3.6倍、36倍和360倍，可见，化合物安全窗口达到数百倍，因此在体内脱靶风险较低，安全性好，具备较好的成药性。
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方案的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方案予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。

Claims (28)

1.一种抑制AGT基因表达的siRNA，所述siRNA包含正义链与反义链，其中所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中所述正义链含有核苷酸序列I，反义链含有核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，其中所述核苷酸序列I和核苷酸序列II选自以下序列：
(1)所述核苷酸序列I包含SEQ ID NO:137所示的核苷酸序列，且所述核苷酸序列II包含SEQ ID NO:138所示的核苷酸序列：
5’-CUGUUUGCUGUGU-3’(SEQ ID NO:137)
5’-ACACAGCAAACAG-3’(SEQ ID NO:138)；
(2)所述核苷酸序列I包含SEQ ID NO:139所示的核苷酸序列，且所述核苷酸序列II包含SEQ ID NO:140所示的核苷酸序列：
5’-UUCAAGUUGAGAACA-3’(SEQ ID NO:139)
5’-UGUUCUCAACUUGAA-3’(SEQ ID NO:140)；
(3)所述核苷酸序列I包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，且所述核苷酸序列II包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
(4)所述核苷酸序列I包含SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列，且所述核苷酸序列II包含SEQ ID NO:46所示的核苷酸序列；
(5)所述核苷酸序列I包含SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列，且所述核苷酸序列II包含SEQ ID NO:57所示的核苷酸序列；
(6)所述核苷酸序列I包含SEQ ID NO:67所示的核苷酸序列，且所述核苷酸序列II包含SEQ ID NO:68所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的siRNA，其中所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补；所述基本上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；所述完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有错配。
3.根据权利要求1或2所述的siRNA，其中所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度各自独立地为0-6个核苷酸，其中所述核苷酸序列III连接在核苷酸序列I的5'末端，核苷酸序列IV连接在核苷酸序列II的3'末端，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV长度相等并且实质上反向互补或完全反向互补；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有错配；和/或，所述核苷酸序列III连接在核苷酸序列I的3'末端，核苷酸序列IV连接在核苷酸序列II的5'末端，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV长度相等并且实质上反向互补或完全反向互补；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；所述完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有错配。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的siRNA，所述siRNA包含正义链与反义链，其中所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中所述正义链含有核苷酸序列I和III，反义链含有核苷酸序列II和IV，所述核苷酸序列I和III与所述核苷酸序列II和IV至少部分地反向互补形成双链区，其中所述核苷酸序列I和III包含或由如SEQ ID NO:131所示的核苷酸序列组成，所述核苷酸序列II和IV包含或由如SEQ ID NO:132所示的核苷酸序列组成。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的siRNA，所述正义链还含有核苷酸序列V和/或所述反义链还含有核苷酸序列VI，核苷酸序列V和VI的长度为0至3个核苷酸，核苷酸序列V连接在所述正义链的3'末端构成正义链的3'突出端和/或核苷酸序列VI连接在所述反义链的3'末端构成反义链的3'突出端；优选地，所述核苷酸序列V或VI的长度为2或3个核苷酸；更优选地，按照5'到3'的方向，所述核苷酸序列V选自UG、CA、AC、GG、UU、AA、CC、AU，所述核苷酸序列VI选自GC、UC、GU、AC、GA、GAA、GG、AA；
或者，所述核苷酸序列V或VI与靶mRNA相应位置的核苷酸错配或互补。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的siRNA，其中，所述双链区的长度是15-30个核苷酸对；优选地，双链区的长度是17-23个核苷酸对；更优选地，双链区的长度是19-21个核苷酸对。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的siRNA，其中正义链或反义链具有15-30个核苷酸；优选地，正义链或反义链具有19-25个核苷酸；更优选地，正义链或反义链具有19-23个核苷酸，进一步优选具有19个、20个、21个、22个或23个核苷酸。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的siRNA，其中所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基；
优选地，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基；和/或，所述siRNA包括不包含3’突出端核苷酸的正义链。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的siRNA，其中，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团，或所述反义链的5’末端核苷酸不连接5’磷酸基团或5’磷酸衍生基团。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的siRNA，其中，所述正义链的5’末端核苷酸连接反向脱碱基脱氧核糖残基，和/或所述正义链的3’末端核苷酸连接反向脱碱基脱氧核糖残基；
优选地，所述反向脱碱基脱氧核糖残基与所述正义链的3'末端核苷酸和/或5'末端核苷酸通过磷酸酯键、硫代磷酸酯键或其他核苷间键连接。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的siRNA，其中所述修饰的核苷酸选自2’-氟代修饰的核苷酸、2’-烷氧基修饰的核苷酸、2’-取代的烷氧基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、2’-取代的烷基修饰的核苷酸、2’-脱氧核糖核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-取代的氨基修饰的核苷酸、核苷酸类似物或其中任意两种以上的组合；
优选地，所述修饰的核苷酸选自2’-F修饰的核苷酸、2’-O-CH3修饰的核苷酸、2’-O-CH2-CH2-O-CH3修饰的核苷酸、2’-O-CH2-CH＝CH2修饰的核苷酸、2’-CH2-CH2-CH＝CH2修饰的核苷酸、2’-脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物或其中任意两种以上的组合。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的siRNA，其中所述正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为2’-氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸；
优选地，所述正义链中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于第7、9、10和11位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第9、10和11位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第7、9和11位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第3、7、9和11位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第9、11、12和13位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第9、11和16位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第8、9和11位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第5、9、10和11位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第5、9、11和13位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第3、7、8和9位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第5、9和11位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第9和11位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第7、9、11、13和15位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第9、11和13位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第7、9、11和13位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第3、7、11、16和17位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；和/或
所述反义链中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、6、14和16位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、6、8、9、14和16位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、14和16位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、6、8、9和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、3、4、5、7、10和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、7、10和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、5、10和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、3、10和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、5、7和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、5、14和16位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、7、12和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、6、12和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、3、6和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、6、8和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、10和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、7和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、3、5、7、10、12和14位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、3、7、10、12、14和24位，其余位置为非氟代修饰的核苷酸。
13.根据权利要求12所述的siRNA，其中每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种，所述核苷酸类似物选自假尿嘧啶、异核苷酸、LNA、ENA、cET BNA、UNA和GNA中的一种。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的siRNA，其中所述正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为2’-氟代修饰的核苷酸、2’-甲氧基修饰的核苷酸、GNA修饰的核苷酸、2’-脱氧核糖核苷酸、2'-甲氧基修饰的假尿嘧啶核苷酸或其中任意两种以上的组合；
优选地，所述正义链中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于第7、9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第7、9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第3、7、9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第9、11、12和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第9、11和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第8、9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第5、9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第3、7、8和9位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第5、9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第7、9、11、13和15位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第9、11和13位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第7、9、11和13位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第3、7、11、16和17位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；和/或
所述反义链中，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、6、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、6、8、9、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、14和16位，第6位为GNA修饰的核苷酸，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、6、14和16位，第7位为GNA修饰的核苷酸，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、6、8、9和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、3、4、5、7、10和14位，第6位核苷酸替换为脱氧核糖核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、7、10和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、5、10和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、3、10和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、5、7和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、5、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、7、12和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、6、12和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、3、6和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、6、8和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、10和14位，第5位核苷酸替换为脱氧核糖核苷酸，2’-脱氧核糖核苷酸位于反义链的第7位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、7和14位，第5位核苷酸替换为脱氧核糖核苷酸，2’-脱氧核糖核苷酸位于反义链的第12位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2和14位，2’-脱氧核糖核苷酸位于反义链的第7和12位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、3、5、7、10、12和14位，第6位核苷酸替换为脱氧核糖核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、3、7、10、12、14和24位，第5位核苷酸替换为脱氧核糖核苷酸，第6位核苷酸替换为脱氧核糖核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、3、7、10、12、14和24位，第6位核苷酸替换为脱氧核糖核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、7、10和14位，第6位核苷酸替换为脱氧核糖核苷酸，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、10和14位，2’-脱氧核糖核苷酸位于反义链的第7位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、10和14位，第6位核苷酸替换为脱氧核糖核苷酸，2’-脱氧核糖核苷酸位于反义链的第7位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、7、10和14位，第6位核苷酸替换为2'-甲氧基修饰的假尿嘧啶核苷酸，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；或者，2'-氟代修饰的核苷酸位于第2、10和14位，第6位核苷酸替换为2'-甲氧基修饰的假尿嘧啶核苷酸，2’-脱氧核糖核苷酸位于反义链的第7位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的siRNA，按照5’末端到3’末端的方向，所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
所述正义链3’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链3’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
或者，
所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
或者，
所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端起始的反向脱碱基脱氧核糖残基与第1个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链3’末端起始的反向脱碱基脱氧核糖残基与第1个核苷酸之间；
或者，
所述正义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述正义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述正义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
所述正义链3’末端起始的反向脱碱基脱氧核糖残基与第1个核苷酸之间。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的siRNA，按照5’末端到3’末端的方向，所述反义链包含位于如下所示位置处的硫代磷酸酯基：
所述反义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述反义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
所述反义链3’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述反义链3’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
或者，
所述反义链5’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述反义链5’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
所述反义链3’末端起始的第1个核苷酸与第2个核苷酸之间；
所述反义链3’末端起始的第2个核苷酸与第3个核苷酸之间；
所述反义链3’末端起始的第3个核苷酸与第4个核苷酸之间。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的siRNA，其中所述正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为2’-氟代修饰的核苷酸，2’-甲氧基修饰的核苷酸，GNA修饰的核苷酸、2’-脱氧核糖核苷酸、2'-甲氧基修饰的假尿嘧啶核苷酸或其中任意两种以上的组合；
优选地，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、10和11位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5'末端核苷酸连接5'磷酸基团；
或者，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、10和11位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、8、9、14和16位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5'末端核苷酸连接5'磷酸基团；
或者，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、10和11位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、14和16位，第6位为GNA修饰的核苷酸，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5'末端核苷酸连接5'磷酸基团；
或者，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、10和11位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，第7位为GNA修饰的核苷酸，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5'末端核苷酸连接5'磷酸基团；
或者，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、10和11位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5'末端核苷酸不连接5'磷酸基团或5'磷酸衍生基团；
或者，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、10和11位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、8、9、14和16位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5'末端核苷酸不连接5'磷酸基团或5'磷酸衍生基团；
或者，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、10和11位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、10和11位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、8、9、14和16位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、10和11位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸；按照5’到3’的方向，2’-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、8、9和14位，其余位置为2’-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5'末端核苷酸不连接5'磷酸基团或5'磷酸衍生基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、11、13和15位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第3、7、9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第3、7、11、16和17位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第7、9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、3、4、5、7、10和14位，第6位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第9、11、12和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第9、11、12和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、7、10和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第9、11、12和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、5、10和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第9、11、12和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、3、10和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第9、11、12和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、5、7和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第9、11、12和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、5、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第9、11和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第8、9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、14和16位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、7、10和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、7、10和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第9、11、12和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、3、4、5、7、10和14位，第6位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、3、4、5、7、10和14位，第6位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、3、4、5、7、10和14位，第6位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第3、7、8和9位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、3、4、5、7、10和14位，第6位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第3、7、9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、3、4、5、7、10和14位，第6位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、3、4、5、7、10和14位，第6位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第3、7、8和9位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、7、10和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第3、7、9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、7、10和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、5、7和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、5、7和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、7、10和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、7、12和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、12和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、3、6和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、6、8和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、10和14位，第5位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸，2’-脱氧核糖核苷酸位于反义链的第7位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、7和14位，第5位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸，2’-脱氧核糖核苷酸位于反义链的第12位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2和14位，2’-脱氧核糖核苷酸位于反义链的第7和12位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第9和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、7、12和14位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、3、5、7、10、12和14位，第6位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、3、7、10、12、14和24位，第5位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸，第6位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、11和13位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、3、7、10、12、14和24位，第6位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸并经GNA修饰，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、7、10和14位，第6位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、10和14位，2’-脱氧核糖核苷酸位于反义链的第7位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、10和14位，第6位核苷酸替换为胸腺嘧啶核苷酸，2’-脱氧核糖核苷酸位于反义链的第7位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、7、10和14位，第6位核苷酸替换为2'-甲氧基修饰的假尿嘧啶核苷酸，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团；
或者，按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于正义链的第5、9、10和11位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸；按照5'到3'的方向，2'-氟代修饰的核苷酸位于反义链的第2、10和14位，第6位核苷酸替换为2'-甲氧基修饰的假尿嘧啶核苷酸，2’-脱氧核糖核苷酸位于反义链的第7位，其余位置为2'-甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的5’末端核苷酸连接5’-反式乙烯基膦酸酯基团。
18.根据权利要求1-17所述的siRNA，其选自表1和表1-1的siRNA；优选地，所述siRNA选自N-ER-FY014320、N-ER-FY014307、N-ER-FY014320M2、N-ER-FY014320M3、N-ER-FY014320M4、N-ER-FY014320M5、N-ER-FY014320M6、N-ER-FY014320M7、N-ER-FY014320M8、N-ER-FY014320M9、N-ER-FY014307M8、N-ER-FY014307M12、N-ER-FY014307M18、N-ER-FY014307M21、N-ER-FY014307M24、N-ER-FY014307M25、N-ER-FY014307M26、N-ER-FY014307M29、N-ER-FY014307M34、N-ER-FY014307M35、N-ER-FY014307M36、N-ER-FY014307M43、N-ER-FY014307M44、N-ER-FY014307M45、N-ER-FY014307M46、N-ER-FY014307M47、N-ER-FY014307M48、N-ER-FY014307M49、N-ER-FY014307M50、N-ER-FY014307M51、N-ER-FY014307M59、N-ER-FY014307M60、N-ER-FY014307M61、N-ER-FY014307M62、N-ER-FY014307M63、N-ER-FY014307M64、N-ER-FY014307M65、N-ER-FY014307M66、N-ER-FY014307M67、N-ER-FY014307M68、N-ER-FY014307M69、N-ER-FY014307M70、N-ER-FY014307M71、N-ER-FY014307M72、N-ER-FY014307M73、N-ER-FY014307M74、N-ER-FY014307M75、N-ER-FY014307M76、N-ER-FY014307M77、N-ER-FY014307M78、N-ER-FY014307M79、N-ER-FY014307M80、N-ER-FY014307M81、N-ER-FY014307M82、N-ER-FY014307M83、N-ER-FY014307M84、N-ER-FY014307M85、N-ER-FY014307M86、N-ER-FY014307M91、N-ER-FY014307M92、N-ER-FY014307M93、N-ER-FY014307M94、N-ER-FY014307M95、N-ER-FY014307M100、N-ER-FY014307M101、N-ER-FY014307M102、N-ER-FY014307M103、N-ER-FY014307M104。
19.一种siRNA缀合物或其前药，所述siRNA缀合物含有权利要求1-18中任一项所述的siRNA以及缀合至该siRNA的缀合基团。
20.根据权利要求19所述的siRNA缀合物或其前药，其中所述缀合基团包含药学上可接受的靶向基团和接头，并且所述siRNA、所述接头和所述靶向基团依次共价或非共价连接；
优选地，在所述siRNA缀合物中，siRNA的正义链与反义链互补形成所述siRNA缀合物的双链区，且所述正义链的3’末端形成平末端，所述反义链的3’末端具有1-3个延伸出所述双链区的突出的核苷酸；
或者，
在所述siRNA缀合物中，siRNA的正义链与反义链互补形成所述siRNA缀合物的双链区，且所述正义链的3’末端形成平末端，所述反义链的3’末端形成平末端。
21.根据权利要求19或20所述的siRNA缀合物或其前药，其中所述缀合基团选自：
22.根据权利要求19-21中任一项所述的siRNA缀合物或其前药，其中所述siRNA缀合物为选自表2的siRNA缀合物；优选地，所述siRNA缀合物选自N-ER-FY014320M2L96、N-ER-FY014320M3L96、N-ER-FY014320M6L96、N-ER-FY014320M7L96、N-ER-FY014307M8L96、N-ER-FY014320M9L96、N-ER-FY014307M12L96、N-ER-FY014307M18L96、N-ER-FY014307M21L96、N-ER-FY014307M24L96、N-ER-FY014307M25L96、N-ER-FY014307M26L96、N-ER-FY014307M29L96、N-ER-FY014307M34L96、N-ER-FY014307M35L96、N-ER-FY014307M36L96、N-ER-FY014307M43L96、N-ER-FY014307M48L96、N-ER-FY014307M50L96、N-ER-FY014307M51L96、N-ER-FY014307M70L96、N-ER-FY014307M72L96、N-ER-FY014307M73L96、N-ER-FY014307M74L96、N-ER-FY014307M75L96、N-ER-FY014307M76L96、N-ER-FY014307M77L96、N-ER-FY014307M78L96、N-ER-FY014307M79L96、N-ER-FY014307M80L96、N-ER-FY014307M81L96、N-ER-FY014307M82L96、N-ER-FY014307M83L96、N-ER-FY014307M84L96、N-ER-FY014307M85L96、N-ER-FY014307M86L96、N-ER-FY014307M91L96、N-ER-FY014307M92L96、N-ER-FY014307M93L96、N-ER-FY014307M94L96、N-ER-FY014307M95L96、N-ER-FY014307M100L96、N-ER-FY014307M101L96、N-ER-FY014307M102L96、N-ER-FY014307M103L96、N-ER-FY014307M104L96。
23.一种药物组合物，其包含权利要求1-18中任一项所述的siRNA，或权利要求19-22中任一项所述的siRNA缀合物或其前药，以及药学上可接受的载体。
24.一种试剂盒，其包含权利要求1-18中任一项所述的siRNA，或权利要求19-22中任一项所述的siRNA缀合物或其前药，或权利要求23所述的药物组合物。
25.权利要求1-18中任一项所述的siRNA，或权利要求19-20中任一项所述的siRNA缀合物或其前药，或权利要求23所述的药物组合物在以下(a)和/或(b)中的用途：
(a)用于制备抑制AGT基因表达的药剂；
(b)用于制备预防和/或治疗AGT基因过表达相关的疾病的药剂。
26.根据权利要求25所述的用途，所述疾病为高血压病、高血压、临界性高血压、原发性高血压、继发性高血压、孤立性收缩期或舒张期高血压、妊娠相关高血压、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压、射血分数降低的高血压、戈德布拉特氏高血压、低血浆肾素活性或血浆肾素浓度相关的高血压、眼高血压、青光眼、肺动脉高血压、门静脉高血压、系统性静脉高血压、收缩期高血压、不稳定性高血压；高血压性心脏病、高血压性肾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、血管病变、糖尿病性肾病、子痫前期、糖尿病性视网膜病、慢性心力衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、肾小球硬化症、主动脉缩窄、主动脉瘤、心室纤维化、心力衰竭、心肌梗塞、心绞痛、中风、肾疾病、肾衰竭、系统性硬化症、宫内发育迟缓(IUGR)、胎儿生长受限、肥胖、肝脂肪变性/脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)；葡萄糖耐受不良、2型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病)和代谢综合征。
27.一种在体内和/或体外抑制AGT基因表达的方法，包括将治疗有效量的权利要求1-18中任一项所述的siRNA，或权利要求19-22中任一项所述的siRNA缀合物或其前药，或权利要求23所述的药物组合物与表达AGT的细胞接触或给予有需要的受试者。
28.一种治疗和/或预防AGT基因过表达相关的疾病的方法，包括将治疗有效量的权利要求1-18中任一项所述的siRNA，或权利要求19-22中任一项所述的siRNA缀合物或其前药，或权利要求23所述的药物组合物给予有需要的受试者。
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