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CN1297480A - 抗体片段－聚合物偶联物和人源化的抗白细胞介素－8单克隆抗体 - Google Patents

抗体片段－聚合物偶联物和人源化的抗白细胞介素－8单克隆抗体 Download PDF

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Abstract

本发明描述人源化抗IL－8单克隆抗体及其变体用于诊断用途和治疗炎性疾病。还描述了一种由抗体片段共价连接非蛋白类聚合物形成的偶联物,其中偶联物的表观大小至少为500kD。偶联物显示出在循环中的半衰期、平均滞留时间和/或清除率比未衍生处理的亲代抗体片段有显著改善。

Description

抗体片段-聚合物偶联物和人源化的抗白细胞介素-8单克隆抗体
                             发明领域
本申请涉及用聚合物衍生的抗体片段领域，特别涉及用这种衍生处理来提高抗体片段聚合物偶联物的循环半衰期。本申请还涉及人源化的抗白细胞介素-8(IL-8)抗体以及该抗体的高亲和性变体。
                                    背景
用聚乙二醇修饰蛋白(“PEG化”)能增加存留时间，减少体内免疫原性。例如，Knauf等，J.Biol.Chem.,263：15064-15070(1988)报道了白介素-2的各种聚氧化甘油和聚乙二醇修饰种类在大鼠中药效行为的研究。除了聚乙二醇化已知的优点外，聚乙二醇化的蛋白还没有广泛用于临床用途。就抗体片段而言，其聚乙二醇化并没有显示出血清半衰期可延长至有用的水平。Delgado等，Br.J.cancer,73：175-182(1996)、Kitamura等，Cancer Res.,51：4310-4315(1991)、Kitamura等，Biochem.Biophys.Res.Comm.,171：1387-1394(1990)以及Pedley等，Br.J.Cancer,70：1126-1130(1994)报道的研究分析了经低分子量(5kD)PEG衍生处理的某些抗肿瘤抗原抗体或抗体片段的血清除和组织摄取情况。Zapata等，FASEB J.,9：A1479(1995)报道了低分子量(5或10kD)PEG与Fab＇片段铰链区巯基的连接使得清除速率与亲代Fab＇分子相比有所减少。
白介素-8(IL-8)是嗜中性白细胞趋化肽，在对炎性介质应答反应中它由各种细胞分泌(综述参见Hebert等Cancer Investigation 11(6)：743(1993))。IL-8在炎性疾病(如成年人呼吸窘迫综合征(ARDS)、脓毒休克和多发性器官衰竭)发病机理中起重要作用。对这些炎性疾病的免疫治疗包括用抗IL-8抗体治疗受侵染的患者。
Sticherling等(J.Immunol 143：1628(1989))公开了抗IL-8的四种单克隆抗体的生产和性质鉴定。WO92/04372(1992年3月19日出版)公开了与IL-8和IL-8肽类似物的受体作用位点反应的多克隆抗体，以及这些抗体预防患者体内炎性反应的用途。St.John等(Chest 103：932(1993))回顾了ARDS、脓毒休克和多发性器官衰竭的免疫治疗方法，其中包括抗IL-8抗体的潜在治疗用途。Sekido等(Nature365：654(1993))公开了用抗IL-8的单克隆抗体预防家兔肺再灌输损伤。Mulligan等(J.Immunol.150：5585(1993))公开了抗人IL-8的小鼠单克隆抗体在大鼠炎性肺损伤中的保护作用。
WO95/23865(国际申请号No.PCT/US95/02589，1995年9月8日出版)证明了抗IL-8的单克隆抗体可在医疗上用来治疗其它炎性疾病(细菌性肺炎和炎性肠道疾病)。
另外，抗IL-8抗体可用作测定IL-8的试剂。例如，Sticherling等(Arch.Dermatol.Res.284：82(1992))公开了抗IL-8单克隆抗体在免疫组织化学研究中作为试剂的用途。Ko等(J.Immunol.Methods 149：227(1992))公开了抗IL-8单克隆抗体在测定IL-8的酶联免疫吸附试验(ELISA)中作为试剂的用途。
                              发明概述
本发明的一个方面是一种偶联物，该偶联物基本上由一种或多种抗体片段共价连接于一种或多种聚合物分子而组成，其中偶联物的表观大小至少约为500kD。
本发明的另一个方面是抗IL-8单克隆抗体或抗体片段，它包含图45(SEQ IDNO：)的6G4.2.5LV11N35E轻链多肽氨基酸序列的互补决定区。
本发明的其它方面是：一种核酸分子，它包含编码上述抗IL-8单克隆抗体或抗体片段的核酸序列；一种表达载体，它包含与调控序列操作性相连的该核酸分子，其中调控序列被载体转染的宿主细胞识别；转染了该载体的宿主细胞；以及一种生产抗体片段的方法，该方法包括在编码抗体片段的核酸表达的条件下培育宿主细胞，从而产生抗体片段，然后从宿主细胞中回收该抗体片段。
                            附图简述
图1显示了抗IL-8单克隆抗体5.12.14阻断IL-8介导弹性蛋白酶从嗜中性白细胞中释放出来。
图2显示了未标记的IL-8抑制了125I-IL-8与嗜中性白细胞的结合。
图3表明同种型匹配的阴性对照Fab(表示为“4D5 Fab”)不抑制125I-IL-8与人嗜中性白细胞的结合。
图4显示了IC50平均值为1.6nM的嵌合的5.12.14Fab抑制125I-IL-8与人嗜中性白细胞结合的情况。
图5显示了IC50平均值为7.5nM的嵌合的6G.4.25Fab抑制125I-IL-8与人嗜中性白细胞结合的情况。
图6表明嵌合的6G4.2.5Fab和嵌合的5.12.14Fab抑制人IL-8介导嗜中性白细胞趋化作用。
图7表明了嵌合的6G4.2.5Fab和嵌合的5.12.14Fab抑制家兔IL-8介导嗜中性白细胞趋化作用的相对能力。
图8显示了各种浓度的人和家兔IL-8刺激人嗜中性白细胞释放弹性蛋白酶。通过测定405nm下的吸光度来定量测定弹性蛋白酶的释放程度。数据用一式三份样品的平均值±SEM表示。
图9显示嵌合的6G4.2.5Fab和嵌合的5.12.14Fab抑制人IL-8刺激人嗜中性白细胞释放弹性蛋白酶的能力。将结果标准化，以反映单用100nM IL-8引起的弹性蛋白酶释放的百分数。数据用不同献血者在不同时间进行的三次独立试验的平均值±SEM表示。IC50值通过四种参数配合来计算。
图10显示了嵌合的6G4.2.5Fab和嵌合的5.12.14Fab抑制家兔IL-8刺激人嗜中性白细胞释放弹性蛋白酶的相对能力。将结果标准化，以反映单用100nMIL-8诱导弹性蛋白酶释放的百分数。数据用不同献血者在不同时间进行的三次独立试验的平均值±SEM表示。IC50值通过四种参数配合来计算。
图11A-11J这一组图显示了家兔溃疡性结肠炎模型中的下列参数：图11A显示了组织中的髓过氧化物酶水平；图11B显示了组织中的IL-8水平；图11C显示了结肠重量；图11D显示了总体发炎的情况；图11E显示了水肿情况；图11F显示了坏死程度；图11G显示了坏死的严重性；图11H显示了嗜中性白细胞附着边缘(margination)；图11I显示了嗜中性白细胞浸润；图11J显示了显示了单个核浸润。
图12显示了抗IL-8单克隆抗体治疗对感染了肺炎链球菌、大肠杆菌或绿浓杆菌的动物支气管肺泡灌洗液(BAL)中嗜中性白细胞数目的影响。与用同种型对照小鼠IgG治疗的动物相比，用6G4.2.5治疗显著减少了BAL液中的嗜中性白细胞数目(图12)。
图13显示设计用于每个轻链和重链的三个引物的DNA序列(SEQ ID NO：1-6)。设计了多个引物，以提高克隆单克隆抗体5.12.14的轻链和重链可变区时的引物杂交的机会和第一链cDNA合成的效率。
图14显示了用于5.12.14轻链可变区扩增的正向引物和反向引物的DNA序列(SEQ ID NO：7-10)。
图15显示了用于5.12.14重链可变区扩增的正向引物和反向引物的DNA序列(SEQ ID NO：11-18)。
图16显示了5.12.14轻链可变区和部分小鼠轻链恒定区的DNA序列(SEQ IDNO：19)和氨基酸序列(SEQ ID NO：20)。CDR用X-射线晶体图(下划线氨基酸)或Kabat序列比较(用星号表示的氨基酸)表示。重要的限制性位点以斜体表示。STⅡ的信号肽是氨基酸-23至-1。小鼠轻链可变区是氨基酸1至109。部分小鼠轻链恒定区是氨基酸110至123(斜体)。
图17显示了5.12.14重链可变区和部分小鼠重链恒定区的DNA序列(SEQ IDNO：21)和氨基酸序列(SEQ ID NO：22)。CDR用X-射线晶体图(下划线氨基酸)或Kabat序列比较(用星号表示的氨基酸)表示。重要的限制性位点以斜体表示。STⅡ的信号肽是氨基酸-23至-1。小鼠重链可变区是氨基酸1至120。部分小鼠重链恒定区是氨基酸121至130。
图18显示了用来将小鼠轻链和重链恒定区残基转变成人源等价物的扩增引物的DNA序列(SEQ ID NO：23-26)。
图19显示了5.12.14轻链可变区和人IgG1轻链恒定区的DNA序列(SEQ IDNO：27)和氨基酸序列(SEQ ID NO：28)。CDR用X-射线晶体图(下划线氨基酸)或Kabat序列比较(用星号表示的氨基酸)表示。人恒定区以斜体表示。STⅡ的信号肽是氨基酸-23至-1。小鼠轻链可变区是氨基酸1至109。人轻链恒定区是氨基酸110至215。
图20A-20B显示了5.12.14重链可变区和人IgG1重链恒定区的DNA序列(SEQ ID NO：29)和氨基酸序列(SEQ ID NO：30)。CDR用X-射线晶体图(下划线氨基酸)或Kabat序列比较(用星号表示的氨基酸)表示。人恒定区以斜体表示。STⅡ的信号肽是氨基酸-23至-1。小鼠重链可变区是氨基酸1至120。人重链恒定区是氨基酸121至229。
图21显示设计用于各轻链和重链的三个引物的DNA序列(SEQ ID NO：31-36)。设计了多个引物，以提高克隆单克隆抗体6G4.2.5的轻链和重链可变区时的引物杂交机会和第一链cDNA合成的效率。
图22显示了用于扩增6G4.2.5轻链可变区的正向引物和反向引物的DNA序列(SEQ ID NO：37-40)。
图23显示了用于扩增6G4.2.5重链可变区的正向引物和反向引物的DNA序列(SEQ ID NO：41-46)。
图24显示了6G4.2.5轻链可变区和部分小鼠轻链恒定区的DNA序列(SEQ IDNO：47)和氨基酸序列(SEQ ID NO：48)。CDR用X-射线晶体图(下划线氨基酸)或Kabat序列比较(用星号表示的氨基酸)表示。有用的克隆位点以斜体表示。STⅡ的信号肽是氨基酸-23至-1。小鼠轻链可变区是氨基酸1至114。部分小鼠轻链恒定区是氨基酸115至131。
图25显示了6G4.2.5重链可变区和部分小鼠重链恒定区的DNA序列(SEQ IDNO：49)和氨基酸序列(SEQ ID NO：50)。CDR用X-射线晶体图(下划线氨基酸)或Kabat序列比较(用星号表示的氨基酸)表示。有用的克隆位点以斜体表示。STⅡ的信号肽是氨基酸-23至-1。小鼠重链可变区是氨基酸1至122。部分小鼠重链恒定区是氨基酸123至135。
图26显示了用来将小鼠轻链和重链恒定区残基转变成人源等价物的引物的DNA序列(SEQ ID NO：51-54)。
图27A-27B显示了嵌合的6G4.2.5轻链的DNA序列(SEQ ID NO：55)和氨基酸序列(SEQ ID NO：56)。CDR用X-射线晶体图(下划线氨基酸)或Kabat序列比较(用星号表示的氨基酸)表示。人恒定区以斜体表示。STⅡ的信号肽是氨基酸-23至-1。小鼠轻链可变区是氨基酸1至114。人轻链恒定区是氨基酸115至220。
图28A-28B显示了嵌合的6G4.2.5重链的DNA序列(SEQ ID NO：57)和氨基酸序列(SEQ ID NO：58)。CDR用X-射线晶体图(下划线氨基酸)或Kabat序列比较(用星号表示的氨基酸)表示。人恒定区以斜体表示。STⅡ的信号肽是氨基酸-23至-1。小鼠重链可变区是氨基酸1至122。人重链恒定区是氨基酸123至231。
图29显示了在6G425人源化时，小鼠6G425轻链可变区(SEQ ID NO：59)、人源化的6G425 F(ab)-1轻链可变区(SEQ ID NO：60)、人轻链kI共有构架(SEQ IDNO：61)氨基酸序列的氨基酸序列对比，以及小鼠6G425重链可变区(SEQ ID NO：62)、人源化的6G425 F(ab)-1重链可变区(SEQ ID NO：63)、人IgG1亚组Ⅲ重链可变区(SEQ ID NO：64)氨基酸序列的氨基酸序列对比。轻链CDR标记为L1、L2、L3；重链CDR标记为H1、H2、H3。=和+表示CDR序列分别由X射线晶体图接触和序列超变性而确定。#表示对比序列间的差别。残基的编号根据Kabat等的方法。小写字母表示相对于humⅢ共有序列编号的氨基酸残基插入。
图30这三组(A、B和C)显示F(ab)-9(人源化的6G4V11 Fab)分别抑制人野生型IL-8、人单体IL-8和猕猴IL-8介导的嗜中性白细胞趋化的能力。组A表示在2nM人野生型IL-8存在下，浓度为0.06nM,6.25nM,12.5nM,25nM,50nM,100nM的F(ab)-9样品、浓度为100nM的同种型对照抗体(称为“4D5”)样品以及无抗体对照样品的抑制数据。组B表示在4nM人单体IL-8(称为“BD59”和“单体IL-8”)存在下，浓度为6.25nM,12.5nM,25nM,50nM的F(ab)-9样品、浓度为100nM的同种型对照抗体(称为“4D5”)样品以及无抗体对照样品的抑制数据。组C表示在2nM猕猴IL-8存在下，浓度为1nM,12.5nM,25nM和50nM的F(ab)-9样品、浓度为100nM的同种型对照抗体(称为“4D5”)样品以及无抗体对照样品的抑制数据。另外，组A、B和C各提出了各自抑制试验中没有IL-8的缓冲液对照样品(称为“缓冲液”)的数据。
图31A显示了N端与STⅡ前导肽融合的人源化抗IL-8 6G4.2.5V11轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：65)、N端与STⅡ前导肽融合的人源化的抗IL-8 6G4.2.5V11重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：66)、以及C端与M13噬菌体基因-Ⅲ包膜蛋白融合的肽接头的氨基酸序列(SEQ ID NO：67)。
图31B显示了N端与STⅡ前导肽融合的人源化抗IL-8 6G4.2.5V11轻链的核酸序列(SEQ ID NO：68)和翻译后的氨基酸序列(SEQ ID NO：65)。
图31C显示了N端与STⅡ前导肽融合的人源化抗IL-8 6G4.2.5V19轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：69)、N端与STⅡ前导肽融合的抗IL-8 6G4.2.5V19重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：70)。
图32是抗IL-8 6G4.2.5V11抗体的三维计算机模型。重链CDR环和可变区呈紫色，CDR-H3侧链残基呈黄色。重链恒定区是红色、轻链CDR环和可变区呈灰白色，CDR L1中35位氨基酸(N35)的Asn呈绿色。轻链恒定区呈琥珀色。
图33的Scatchard曲线显示了完整的小鼠6G4.2.5抗体(称为6G4小鼠单克隆抗体)、6G4.2.5小鼠-人嵌合的Fab(称为6G4嵌合物)、人源化的6G4.2.5 Fab 1型和11型(称为V1和V11)、以及变异体6G4.2.5V11N35A Fab(称为V11N35A)抑制125I-IL-8结合人嗜中性白细胞的情况。
图34的四组图(A、B、C和D)分别显示了6G4.2.5V11N35A Fab抑制人野生型IL-8、人单体IL-8、家兔IL-8和猕猴IL-8介导嗜中性白细胞趋化作用的情况。组A显示了在2nM人野生型IL-8存在下，浓度为0.5,1,2,4,8,16和33nM的6G4.2.5V11N35A Fab样品、浓度为33nM的同种型对照抗体(称为“4D5”)样品以及无抗体对照样品(称为“HuIL-8”)的抑制数据。组B显示了在2nM人单体IL-8存在下，浓度为0.5,1,2,4,8,16和33nM的6G4.2.5V11N35A Fab样品、浓度为33nM的完整6G4.2.5单克隆抗体样品、浓度为33nM的同种型对照抗体(称为“4D5”)样品以及无抗体对照样品(称为“BD59”)的抑制数据。组C显示了在2nM家兔IL-8存在下，浓度为0.5,1,2,4,8,16和33nM的6G4.2.5V11N35A Fab样品、浓度为33nM的完整6G4.2.5单克隆抗体样品、浓度为33nM的同种型对照抗体(称为“4D5”)样品以及无抗体对照样品(称为“Rab IL-8”)的抑制数据。组D显示了在2nM猕猴IL-8存在下，浓度为0.5,1,2,4,8,16和33nM的6G4.2.5V11N35A Fab样品、浓度为33nM的完整6G4.2.5单克隆抗体样品、浓度为33nM的同种型对照抗体(称为“4D5”)样品以及无抗体对照样品(称为“Rhe IL-8”)的抑制数据。另外，组B、C和D还示出了各试验中浓度为2nM的人野生型IL-8对照(称为“HuIL-8”)样品的数据，A、B、C和D组还示出了各试验中无IL-8的缓冲液对照(称为“缓冲液”)样品的数据。
图35示出了N端与STⅡ前导肽融合的人源化抗IL-8 6G4.2.5V11N35A轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：71)、N端与STⅡ前导肽融合的人源化抗IL-86G4.2.5V11N35A重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：66)、以及GCN4亮氨酸拉链肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：72)。6G4.2.5V11N35A轻链中氨基酸35位的Ala残基(取代了野生型的Asn残基)用粗体表示。GCN4亮氨酸拉链序列中推断的胃蛋白酶切割位点用下划线表示。
图36显示了N端与STⅡ前导肽融合的人源化抗IL-8 6G4.2.5V11N35A轻链的DNA序列(SEQ ID NO：73)和氨基酸序列(SEQ ID NO：71)。互补决定区L1、L2和L3用下划线表示。
图37A-37B显示了N端与STⅡ前导肽配合以及C端与GCN4亮氨酸拉链序列融合的人源化抗IL-8 6G4.2.5V11N35A重链的DNA序列(SEQ ID NO：74)和氨基酸序列(SEQ ID NO：75)。互补决定区H1、H2和H3用下划线表示。
图38的Scathcard曲线显示了6G4.2.5V11N35A Fab(称为Fab)、6G4.2.5V11N35A F(ab＇)2(称为F(ab＇)2)、以及人野生型IL-8对照(称为IL-8)抑制125I-IL-8结合人嗜中性白细胞的情况。
图39显示了6G4.2.5V11N35A F(ab＇)2和6G4.2.5V11N35A Fab抑制野生型人IL-8介导嗜中性白细胞趋化的能力的比较。图中显示了在2nM人野生型IL-8存在下，浓度为0.3,1,3,10,30和100nM的6G4.2.5V11N35A Fab样品(称为“N35AFab”)和6G4.2.5V11N35A F(ab＇)2样品(称为N35A F(ab＇)2)、浓度为100nM的同种型对照抗体(称为“4D5”)样品、以及无抗体对照样品的抑制数据。另外，还显示了无IL-8的缓冲液对照样品(称为“缓冲液”)的抑制数据。
图40显示了6G4.2.5V11N35A F(ab＇)2抑制人单体IL-8、猕猴IL-8和家兔IL-8介导嗜中性白细胞趋化的能力。人单体IL-8介导嗜中性白细胞趋化的数据是在浓度为0.5nM的人单体IL-8(称为“BD59”)存在下，浓度为0.3,1,3,和10nM的6G4.2.5V11N35A F(ab＇)2样品、浓度为100nM的同种型对照抗体(称为“4D5”)样品、以及无抗体对照样品(称为“BD59”)的数据。猕猴IL-8介导嗜中性白细胞趋化的数据是在2nM的猕猴IL-8存在下，浓度为0.3,1,3,和10nM的6G4.2.5V11N35A F(ab＇)2样品、无抗体对照样品的数据。家兔IL-8介导嗜中性白细胞趋化的数据是在2nM的家兔IL-8存在下，浓度为0.3,1,3,和10nM的6G4.2.5V11N35A F(ab＇)2样品、无抗体对照样品的数据。另外，还示出了无IL-8缓冲液对照样品(称为“缓冲液”)和2nM人野生型IL-8(称为“HuIL-8”)的抑制数据。
图41A-41Q显示了p6G4V11N35A.F(ab＇)2载体的核酸序列(SEQ ID NO：76)。
图42显示了人源化抗体6G4V11可变轻链CDR-L1中氨基酸35位随机诱变中所用的终止模板引物(SEQ ID NO：)和NNS随机化引物(SEQ ID NO：)的核酸序列。
图43的表中的数据描述了人源化抗体6G4V11可变轻链CDR-L1中氨基酸35位随机化获得的不同噬菌体展示克隆的频率。
图43B显示了6G4V11N35A、6G4V11N35D、6G4V11N35E和6G4V11N35G Fab表现出的抑制125I-IL-8结合嗜中性白细胞的替换曲线。
图44显示了抗IL-8抗体片段(6G4V11N35A F(ab＇)2)结合IL-8的典型的动力学曲线。图44还含有一组数据，这些数据提供了6G4V11N35A Fab结合IL-8的平衡常数(没有测定速率常数。“ND”)，以及6G4V11N35A F(ab＇)2和6G4V11N35EFab结合IL-8的平衡常数和速率常数。
图45显示N端与STⅡ前导肽融合的6G4V11N35E轻链的DNA序列(SEQ IDNO：)和氨基酸序列(SEQ ID NO：)。互补决定区L1、L2和L3用下划线表示。
图46显示了6G4V11N35E Fab抑制人IL-8(深色柱)和家兔IL-8(浅色柱)介导嗜中性白细胞趋化的能力。数据是在2nM人IL-8或2nM家兔IL-8存在下，浓度为0.4,1.2,3.7,11和37nM的6G4V11N35E Fab、浓度为100nM的同种型对照抗体(4D5)样品的数据。另外，还示出了无IL-8的缓冲液对照样品(称为“缓冲液”)以及人和家兔IL-8对照样品(称为“IL-8”)的抑制数据。
图47显示了编码6G4V11N35A重链氨基酸Leu4至Phe29的PvuⅡ-xhoⅠ合成核苷酸的有义链DNA序列(SEQ ID NO：)和反义链DNA序列(SEQ ID NO：)。
图48A-48T显示了质粒p6G4V11N35A.choSD9的DNA序列(SEQ ID NO：)。
图49显示了变体6G4V11N35A和6G411N35E的全长IgG1形式表现出的抑制125I-IL-8结合嗜中性白细胞的替换曲线。
图50A-50B显示了全长6G4V11N35A IgG1和6G4V11N35E IgG1抑制人IL-8(图50A)和家兔IL-8(图50B)介导嗜中性白细胞趋化的能力。
图51显示了全长抗IL-8抗体(6G4V11N35A IgG1)结合IL-8的典型动力学曲线。图51还含有一个表，表中数据提供了全长小鼠6G4.2.5 IgG2a、6G4V11N35AIgG1和6G4V11N35E IgG1结合IL-8的平衡常数和速率常数。
图52的替换曲线显示了用全长6G4V11N35A IgG1和6G4V11N35E IgG1进行的未标记IL-8/125I-IL-8竞争性放射免疫试验的结果。
图53显示了6G4V11N35A Fab＇重链(将6G4V11N35A Fab重链修饰成铰链区含有一个半胱氨酸残基)的DNA序列(SEQ ID NO：)和氨基酸序列(SEQ ID NO：)。
图54A-54C的替换曲线显示了PEG-马来酰亚胺修饰的6G4V11N35A Fab＇分子的IL-8结合和IC50。
图55A-55C显示了PEG-马来酰亚胺修饰的6G4V11N35A Fab＇分子抑制人IL-8和家兔IL-8介导的嗜中性白细胞趋化的能力。
图56A-56C显示了PEG-马来酰亚胺修饰的6G4V11N35A Fab＇分子抑制IL-8介导嗜中性白细胞释放β-葡糖醛酸糖苷酶的能力。
图57A-57B的替换曲线显示了PEG-琥珀酰亚胺修饰的6G4V11N35A Fab＇2分子显示抑制125I-IL-8结合嗜中性白细胞。
图58A-58B显示了PEG-琥珀酰亚胺修饰的6G4V11N35A F(ab＇)2分子抑制人IL-8介导嗜中性白细胞趋化的能力。
图59A-59B显示了PEG-琥珀酰亚胺修饰的6G4V11N35A F(ab＇)2分子抑制人IL-8介导嗜中性白细胞释放β-葡糖醛酸糖苷酶的能力。
图60显示了PEG-马来酰亚胺修饰的6G4V11N35A Fab＇分子的理论分子量(带点条)和有效大小(实心条)(经SEC-HPLC测得)。
图61的SDS-PAGE凝胶显示了各种PEG-马来酰亚胺修饰的6G4V11N35AFab＇分子的电泳迁移率。
图62的体积排阻层析(SEC-HPLC)图谱显示了各种PEG-琥珀酰亚胺修饰的6G4V11N35A F(ab＇)2分子的保留时间和有效(流体)大小。
图63显示了各种PEG-琥珀酰亚胺修饰的6G4V11N35A F(ab＇)2分子的理论分子量(空心柱)、有效大小(经SEC-HPLC测得)(实心柱)、以及真实分子量(经SEC-光散射测得(带阴影柱))。
图64的SDS-PAGE凝胶显示了各种PEG-琥珀酰亚胺修饰的6G4V11N35AF(ab＇)2分子的电泳迁移率。从左到右，泳道1含有未修饰的F(ab＇)2，泳道2含有与两个40kD支链PEG-琥珀酰亚胺分子偶联的F(ab＇)2(称为“Br(2)-40kD(N)-F(ab＇)2”)，泳道3含有与一个40kD支链PEG-琥珀酰亚胺分子偶联的F(ab＇)2(称为“Br(1)-40kD-(N)-Fab＇2”)，泳道4含有偶联了四个20kD直链PEG-琥珀酰亚胺分子的F(ab＇)2和偶联了5个20kD直链PEG-琥珀酰亚胺分子的F(ab＇)2的混合物(称为“L(4+5)-20kD-(N)-Fab＇2”)，泳道5含有偶联了一个20kD直链PEG-琥珀酰亚胺分子的F(ab＇)2(称为“L(1)-20kD-(N)-Fab＇2”)，泳道6含有分子量标准品。
图65比较了在家兔中各种PEG-马来酰亚胺修饰的6G4V11N35A Fab＇分子(上图)和各种PEG-琥珀酰亚胺修饰的6G4V11N35A F(ab＇)2分子(下图)的血清浓度对时间的曲线。在上图中，“bran.(1)40K(s)Fab＇”表示偶联了一个40kD支链PEG-马来酰亚胺分子的6G4V11N35A Fab＇，“lin.(1)40K(s)Fab＇”表示偶联了一个40kD直链PEG-马来酰亚胺分子的6G4V11N35A Fab＇，“lin.(1)30K(s)Fab＇”表示偶联了一个30kD直链PEG-马来酰亚胺分子的6G4V11N35A Fab＇，“lin.(1)20K(s)Fab＇”表示偶联了一个20kD直链PEG-马来酰亚胺分子的6G4V11N35A Fab＇。在下图中，“bran.(2)40K(N)Fab＇2”表示偶联了2个40kD支链PEG-琥珀酰亚胺分子的6G4V11N35A F(ab＇)2，“bran.(1)40K(N)Fab＇2”表示偶联了一个40kD支链PEG-琥珀酰亚胺分子的6G4V11N35A F(ab＇)2，“Fab＇2”表示未修饰的6G4V11N35A F(ab＇)2。在两张图中，“IgG”均表示下述实施例F中描述的人-小鼠嵌合抗家兔IL-8 Fab的全长IgG1等价物。
图66比较了偶联一个40kD支链PEG-马来酰亚胺分子的6G4V11N35AFab＇(称为“bran.(1)40K(s)Fab＇”)、偶联一个40kD支链PEG-琥珀酰亚胺分子的6G4V11N35A F(ab＇)2(称为“bran.(1)40K(N)Fab＇2”)、未修饰的6G4V11N35AF(ab＇)2(称为“Fab＇2”)、未修饰的6G4V11N35A Fab＇(称为“Fab＇”)、以及下述实施例F中所述的人-小鼠嵌合的抗家兔IL-8 Fab的全长IgG1等价物(称为“IgG”)。
图67显示了在ARDS家兔模型中，偶联了一个40kD支链PEG-马来酰亚胺分子(称为“PEG 40 kd”)的6G4V11N35A Fab＇以及小鼠抗家兔IL-8单克隆抗体6G4.2.5(全长IgG2a)(称为“6G4.2.5”)对于全肺总重量的影响。
图68显示了在ARDS家兔模型中，偶联了一个40kD支链PEG-马来酰亚胺分子(称为“PEG 40kd”)的6G4V11N35A Fab＇，以及小鼠抗家兔IL-8单克隆抗体6G4.2.5(全长IgG2a)(称为“6G4.2.5”)对BAL总白细胞(浅色柱)和多形核细胞(深色柱)计数的影响。未处理(不用药物)的对照动物数据用“对照”表示。
图69显示了在ARDS家兔模型中，偶联了一个40kD支链PEG-马来酰亚胺分子(称为“PEG 40 kd”)的6G4V11N35A Fab＇以及小鼠抗家兔IL-8单克隆抗体6G4.2.5(全长IgG2a)(称为“6G4.2.5”)对处理24小时(浅色柱)和48小时(深色柱)后PaO2/FiO2比值的影响。未处理(不用药物)的对照动物数据用“对照”表示。
                        较佳实施例描述
1．定义
通常，下列词语或术语用于描述、实施例和权利要求中时有确定的定义。
“聚合酶链反应”或“PCR”指一种过程或技术，其中如美国专利No.4,683,195(1987年7月28日授权)中所述的那样，核酸、RNA和/或DNA的小量特定片段。通常，需要获得感兴趣区域两端或其外延的序列信息，从而可以设计寡核苷酸引物；这些引物应与待扩增模板相反链的序列相同或相似。两个引物的5＇端核苷酸可以与扩增材料的两端恰好重合。可用PCR来扩增全部基因组DNA中的、从全细胞RNA、噬菌体或质粒序列等转录获得的cDNA中的特定RNA序列、特定DNA序列。见Mullis等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263(1987)；Erlich编辑，PCR Technology(Stockton Press,NY,1989)。本文所用的PCR被认为是扩增核酸试样的核酸聚合酶反应方法的一个但并非唯一的例子，该方法中采用已知的核酸作为引物和核酸聚合酶来扩增或产生特定片段的核酸。
“抗体(Ab)”和“免疫球蛋白(Ig)”是有相同结构特征的糖蛋白。抗体表现出对特定抗原有结合特异性，而免疫球蛋白包括抗体和其它缺少抗原特异性的抗体样分子。例如，对于后一类型的多肽，淋巴系统产生的水平较低，而骨髓瘤产生的水平增高。
“天然抗体和免疫球蛋白”通常是约150000道尔顿的异四聚体糖蛋白，它由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每个轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每个重链和轻链也具有固定间隔的链内二硫键。每个重链的一端有可变区(VH)，其后是几个恒定区。每个轻链的一端为可变区(VL)，另一端为恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区配对，轻链的可变区与重链的可变区配对。认为特定的氨基酸残基形成了轻链和重链可变区间的界面(Clothia等，J.Mol.Biol.186：651(1985)；Novotny和Haber,Proc.Natl.Aead.Sci.USA,82：4592(1985))。
术语“可变”指这样一个事实，即不同抗体的可变区的某些部分在序列上有很大差别，它们被用于各个特定抗体与其特定抗原结合和特异性。然而，可变性并非均匀分布在抗体整个可变区内。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区的三个节段中。更高度保守的可变区部分称为构架(FR)。天然重链和轻链的可变区中均包含四个FR区域，它们大都呈β-片层构型，由形成环连接的三个CDR(在一些情况下形成β-片层结构的一部分)来连接。每个链中的CDR通过非常靠近的FR区域与另一链的CDR聚在一起，从而形成了抗体的抗原结合位点(见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，National Institute of Health,Bethesda,MD(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出各种效应物功能，例如参与抗体依赖型细胞毒性。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段)，每个片段有一个抗原结合位点和一个残余的“Fc”片段(其名字反映了它很容易结晶的能力)。用胃蛋白酶处理则产生了一个F(ab＇)2片段，它有两个抗原结合位点并仍能与抗原交联。
“Fv”是最小抗体片段，它含有全部抗原识别和结合位点。在双链Fv种类中，该区域由一个重链和一个轻链可变区紧密但非共价联接的二聚体组成。在单链Fv种类(scFv)中，一个重链和一个轻链可变区可通过柔韧的肽接头共价连接，这样，轻链和重链可缔合成类似于双链Fv种类的“二聚体”结构。在该结构中，是每个可变区的三个CDR相互作用确定了VH-VL二聚体表面的抗原结合位点。总地来说，6个CDR赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是一个可变区(或Fv的一半，仅包含对抗原有特异性的三个CDR)也能识别并结合抗原，但是亲和力要低于整个结合位点。关于scFv的综述参见Pluckthun在The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag,New-York,269-315页(1994)。
Fab片段还含有轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab＇片段与Fab片段的不同是重链CH1区的羧基端增加了一些残基，其中包括抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab＇-SH在本文中的定义为Fab＇中恒定区的半胱氨酸残基携带了一个游离的巯基。F(ab＇)2抗体片段最初产生作为一对Fab＇片段，其间有铰链区半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联方式也是已知的。
来自任一脊椎动物的抗体(免疫球蛋白重链)的“轻链”可以根据恒定区氨基酸序列分成两类明显不同的类型，它们称为kappa(κ)和lambda(λ)。
据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的。
术语“抗体”具有最广泛的含义，其具体包括单克隆抗体(包括兴奋型和拮抗型)和具有多表位特异性的抗体组合物。
本文所用的术语“抗体片段”及其所有语法上的变体被定义成完整抗体的一部分，它包含完整抗体的抗原结合位点或可变区，其中该部分没有完整抗体的Fc区域的重链恒定区(即CH2、CH3和CH4，取决于抗体同种型)。抗体片段的例子包括Fab、Fab＇、Fab＇-SH、F(ab＇)2、和Fv片段；二抗体(diabody)；以及多肽一级结构由连续氨基酸残基的不间断序列组成的抗体片段(在本文中指“单链抗体片段”或“单链多肽”)，其包括(没有限制)：(1)单链Fv(scFv)分子；(2)仅含一个轻链可变区的单链多肽，或含有轻链可变区三个CDR、没有缔合的重链部分的片段；(3)仅含一个重链可变区的单链多肽，或含有重链可变区的三个CDR、没有联合的轻链部分的片段；以及抗体片段形成的多特异性或多价结构。在包含一个或多个重链的抗体片段中，重链可含有完整抗体非Fc区域中发现的任何恒定区序列(例如IgG同种型中的CH1)，和/或含有完整抗体发现的任何铰链区序列，和/或含有融合于或位于铰链区序列或重链恒定区序列中的亮氨酸拉链序列。合适的亮氨酸拉链序列包括Kostelney等在J.Immunol.,148：1547-1553(1992)提到的jun和fos亮氨酸拉链和下述实施例中所述GCN4亮氨酸拉链。
除非另有特指，本文描述和权利要求中的术语“偶联物”定义成一种或多种抗体片段与一种或多种聚合物分子共价连接形成的异质性分子，其中该异质性分子是水溶性的，即可溶于生理性体液(如血液)中，其中异质性分子没有结构聚集物。在前述定义的条件下，术语“结构聚集物”指(1)在水溶液中有球形或球形外壳结构的分子聚集物，因此异质性分子不呈胶团或其它乳剂结构，并且不固定在脂类双层、泡囊或脂质体上；和(2)固体或不溶形式的分子聚集物，例如在与水相接触时不会将异质性分子释放到溶液中的层析珠粒基质。因此，本文定义的术语“偶联物”包括前述在沉淀、沉降物、可生物侵蚀基质或能在固体水解时将异质性分子释放到水溶液中的其它固体中的异质性分子。
除非另有特指，术语“聚合物”、“聚合物分子”、“非蛋白类聚合物”和“非蛋白类聚合物分子”可互换使用，它们被定义成两个或多个单体共价连接形成的分子，其中单体并非丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gin)、精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)残基。
本文所用的术语“单克隆抗体”指从一类基本均一的抗体群体中获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体是高特异性的针对单个抗原位点。而且，与常规(多克隆)抗体制剂(通常是包括针对不同的决定簇(表位)的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的有利之处还在于它们可通过杂交瘤培养来合成，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示抗体的特性是从基本均一的抗体群获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等，Nature,256：495(1975)首先提出)制得，或可用重组DNA方法(例如参见美国专利No.4,816,567，授予Cabilly等人)制得。“单克隆抗体”也包括含有抗原识别和结合位点的抗体片段的克隆(Fv克隆)，它可用Clackson等Nature,352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离获得。
本文的单克隆抗体包括杂交和重组抗体，它可通过用恒定区(例如人源化的抗体)剪接抗IL-8抗体的可变区(包括超变区)，或用重链剪接轻链，或用另一种动物的链剪接一种动物的链，或与异源蛋白融合来制得，不论动物来源或免疫球蛋白类别或亚类的分类以及抗体片段(例如Fab,F(ab＇)2和Fv)如何，只要它们表现出所需的生物活性。(例如参见美国专利No.4,816,567，授予Cabilly等人；Mage和Lamoyi,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,79-97页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
本文的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)(其中重链和/或轻链的一部分与某特定动物抗体的对应序列相同或同源，或是属于特定的抗体类别或亚类，而链的其余部分则与另一动物抗体对应序列相同或同源、或是属于另一种抗体类别或亚类)以及抗体的片段，只要该片段具有所需的生物活性即可(Cabilly等，同上；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851(1984))。
“人源化”形式的非人(如小鼠)抗体是具体的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv,Fab,Fab＇,F(ab＇)2或抗体的其它抗原结合序列)，它们含有非人免疫球蛋白的最小序列。对于大多数情况，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者的互补决定区(CDR)残基被非人源(供者抗体)(例如有所需特异性、亲和力和活性的小鼠、大鼠或兔抗体)的CDR残基代替。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架残基被对应的非人残基代替。另外，人源化的抗体可包括既不存在于受者抗体、又不存在于导人的CDR或构架序列中的残基。作这些修饰能进一步精炼和最大化抗体的性能。通常，人源化抗体包含了基本上所有的(至少一个、通常两个)可变区，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体最好还包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的Fc部分。更详细的情况可参见Jones等，Nature,321：522(1986)；Reichmann等，Nature,332：323(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2：593(1992)。
“治疗”指治疗和预防措施。那些需要治疗的对象是已经患有疾病和易患疾病以及有待预防疾病的对象。
以治疗为目的的“哺乳动物”指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家用和农场、动物园、运动场动物，或宠物，如狗、马、猫、奶牛等。在这里，较佳的哺乳动物是人。
本文所用的蛋白、肽和多肽可互换使用，以表示一种氨基酸聚合物或一组两个或多个相互作用或结合的氨基酸聚合物。
本文所用的术语“炎性疾病”指导致发炎的病理上状态(通常由嗜中性白细胞趋化引起)。这些疾病的例子包括炎性皮肤病(包括牛皮癣)；与炎性结肠疾病相关的反应(如节段性回肠炎和溃疡性结肠炎)；缺血性再灌输；成年人呼吸窘迫综合征；皮炎；脑膜炎；脑炎；眼色素层炎；自免疫疾病，如类风湿性关节炎、Sjorgen综合征、脉管炎；涉及白细胞渗出的疾病；中枢神经系统(CNS)炎性疾病，次于败血病和创伤的多发性器官损伤综合征；酒精性肝炎，细菌性肺炎，抗原-抗体复合物介导的疾病；肺部发炎，包括胸膜炎、肺泡炎、脉管炎、肺炎、慢性支气管炎、支气管扩张和囊性纤维变性等。较适合的病征是细菌性肺炎和炎性结肠病(如溃疡性结肠炎)。
在这里，术语分子的“流体动力学大小”、“表观大小”、“表观分子量”、“有效大小”和“有效分子量”用作同义词，它指通过与球形蛋白分子量标准品在体积排阻层析系统中产生的标准曲线比较测得的分子大小，其中标准曲线是通过将各标准品的真实分子量对其在体积排阻层析系统中所见的洗脱时间作图而产生的。这样，用分子的洗脱时间从标准曲线可推断出推定分子量，从而获得测试样品的表观大小。较佳的，应选择用来产生标准曲线的分子量标准品，以使测试分子的表观大小在标准曲线的线性部分范围内。
Ⅱ．发明实施模式
一方面，本发明从令人惊奇的未预料到的发现产生，即有效大小或表观大小明显大于已有技术描述的抗体片段-聚合物偶联物的抗体片段-聚合物偶联物可提高血清半衰期，增加循环中的平均存留时间(MRT)，和/或比未衍生处理的抗体片段减少了血清清除速度，这些远远超过了本领域已知的抗体片段-聚合物偶联物在这些生物性能上所能获得的适当的变化。本发明者首次确定，将抗体片段的有效大小增加到至少约500000道尔顿，或使抗体片段的有效大小比亲代抗体片段的有效大小增加至少8倍，或用分子量至少约20000道尔顿的聚合物衍生处理抗体片段，就可产生具有商品化的有用的药物动力学图线的分子。本发明的偶联物大大延长了血清半衰期，延长了MRT，和/或降低了血清清除速率，这些性能使得该偶联物可以作为完整抗体的替代物来治疗许多病征。抗体片段提供了明显优于完整抗体的优点，其中值得注意的是重组抗体片段可在细菌细胞表达系统中产生。细菌细胞表达系统提供了比哺乳动物细胞表达系统更优的几个优点，包括时间减少，产品的研究、开发和生产阶段的成本降低。
另一方面，本发明还来自6G4.2.5小鼠抗家兔IL-8单克隆抗体(“6G4.2.5”)的人源化，该单克隆抗体在WO95/23865(PCT/US95/02589,1995年9月8日出版)中有所描述，其全部内容纳入本文作参考。如下实施例所述，生产抗体6G4.2.5的杂交瘤于1994年9月28日保藏在美国典型培养物保藏中心，给予ATCC登录号为No.HB 11722。一方面，本发明提供了6G4.2.5抗体的人源化衍生物变体11(本文称为“6G4.2.5v11”)，其中将小鼠6G4.2.5的CDR移植到人轻链kI和人IgG1重链亚组Ⅲ的共有构架中，然后将小鼠6G4.2.5亲代重链可变区序列的三个构架残基引人人模板序列的重链可变区类似部位上(如下实施例所述)。另一方面，本发明提供了具有某些氨基酸取代的6G4.2.5v11抗体的变体，导致对人IL-8的亲和力有所提高，和/或促进在重组生产方法有更高的效率。
应当理解，在第Ⅱ部分及其附属所有部分中，偶联物中的“一个抗体片段”、“该抗体片段”应指偶联物(与上述第Ⅰ部分提出的术语“偶联物”的定义相符)中的一个或多个抗体片段，除非明确指出了偶联物中抗体片段的数目。应当理解，在第Ⅱ部分及其附属所有部分中，偶联物中的“一个聚合物”、“一个聚合物分子”、“该聚合物”应指偶联物(与上述第Ⅰ部分提出的术语“偶联物”的定义相符)中的一个或多个聚合物分子，除非明确指出了偶联物中聚合物分子的数目。
1．有效大小大的抗体片段-聚合物偶联物
一方面，本发明提供抗体片段与聚合物共价连接，以形成有效大小或表观大小至少约500000道尔顿(D)的偶联物。另一方面，本发明提供抗体片段与聚合物共价连接，以形成表观大小至少约为亲代抗体片段表观大小8倍的偶联物。还有一方面，本发明提供抗体片段与分子量(MW)至少约20000道尔顿的聚合物共价连接。有利的是，通过利用任何类型或数目的聚合物分子来提供有效大小至少约500000D的偶联物，或用任何类型或数目的聚合物分子来提供有效大小比亲代抗体片段的有效大小至少高8倍的偶联物，或用任何类型或数目的聚合物，其中每个聚合物分子的分子量至少约20000D，可以使抗体片段血清半衰期和MRT的增加和/或血清清除速率的减少的幅度出乎意料地且令人惊奇地大。因此，本发明不依赖于任何特定的聚合物，或偶联物中抗体片段与聚合物之摩尔比。
另外，本发明的有利方面延伸至抗体片段而不考虑抗原特异性。尽管可预计到抗体之间的变化，但是给定抗体的抗原特异性基本上不会破坏本文所述的衍生处理抗体片段所获得的在抗体片段的血清半衰期、MRT和/或血清清除速率方面的不同寻常的进步。
在一个实例中，偶联物的有效大小至少约500,000D，或至少约800,000D，或至少约900,000D，或至少约1,000,000D，或至少约1,200,000D，或至少约1,400,000D，或至少约1,500,000D，或至少约1,800,000D，或至少约2,000,000D，或至少约2,500,000D。
在另一个实例中，偶联物的有效大小约为500,000D至10,000,000D、或500,000D至8,000,000D、或500,000D至5,000,000D、或500,000D至4,000,000D、或500,000D至3,000,000D、或500,000D至2,500,000D、或500,000D至2,000,000D、或500,000D至1,800,000D、或500,000D至1,600,000D、或500,000D至1,500,000D、或500,000D至1,000,000D。
在另一个实例中，偶联物的有效大小约为800,000D至10,000,000D、或800,000D至8,000,000D、或800,000D至5,000,000D、或800,000D至4,000,000D、或800,000D至3,000,000D、或800,000D至2,500,000D、或800,000D至2,000,000D、或800,000D至1,800,000D、或800,000D至1,600,000D、或800,000D至1,500,000D、或800,000D至1,000,000D。
在另一个实例中，偶联物的有效大小约为900,000D至10,000,000D、或900,000D至8,000,000D、或900,000D至5,000,000D、或900,000D至4,000,000D、或900,000D至3,000,000D、或900,000D至2,500,000D、或900,000D至2,000,000D、或900,000D至1,800,000D、或900,000D至1,600,000D、或900,000D至1,500,000D。
在另一个实例中，偶联物的有效大小约为1,000,000D至10,000,000D、或1,000,000D至8,000,000D、或1,000,000D至5,000,000D、或1,000,000D至4,000,000D、或1,000,000D至3,000,000D、或1,000,000D至2,500,000D、或1,000,000D至2,000,000D、或1,000,000D至1,800,000D、或1,000,000D至1,600,000D、或1,000,000D至1,500,000D。
在还有一个实例中，偶联物的有效大小比亲代抗体片段的有效大小至少高约8倍、或10倍、或12倍、或15倍、或18倍、或20倍、或25倍、或28倍、或30倍、或40倍。
在另一个实例中，偶联物的有效大小比亲代抗体片段的有效大小高约8至100倍、或8至80倍、或8至50倍、或8至40倍、或8至30倍、或8至28倍、或8至25倍、或8至20倍、或8至18倍、或8至15倍。
在另一个实例中，偶联物的有效大小比亲代抗体片段的有效大小高约12至100倍、或12至80倍、或12至50倍、或12至40倍、或12至30倍、或12至28倍、或12至25倍、或12至20倍、或12至18倍、或12至15倍。
在另一个实例中，偶联物的有效大小比亲代抗体片段的有效大小高约15至100倍、或15至80倍、或15至50倍、或15至40倍、或15至30倍、或15至28倍、或15至25倍、或15至20倍、或15至18倍。
在另一个实例中，偶联物的有效大小比亲代抗体片段的有效大小高约18至100倍、或18至80倍、或18至50倍、或18至40倍、或18至30倍、或18至28倍、或18至25倍、或18至20倍。
在另一个实例中，偶联物的有效大小比亲代抗体片段的有效大小高约20至100倍、或20至80倍、或20至50倍、或20至40倍、或20至30倍、或20至28倍、或20至25倍。
在另一个实例中，偶联物的有效大小比亲代抗体片段的有效大小高约25至100倍、或25至80倍、或25至50倍、或25至40倍、或25至30倍、或25至28倍。
在另一个实例中，偶联物的有效大小比亲代抗体片段的有效大小高约28至100倍、或28至80倍、或28至50倍、或28至40倍、或28至30倍。
在另一个实例中，偶联物的有效大小比亲代抗体片段的有效大小高约30至100倍、或30至80倍、或30至50倍、或30至40倍。
在另一个实例中，偶联物的有效大小比亲代抗体片段的有效大小高约40至100倍、或40至80倍、或40至50倍。
在还有一个实例中，偶联物中的抗体片段与实际分子量至少约20,000D的至少一个聚合物共价连接。
在还有一个实例中，偶联物中的抗体片段与实际分子量至少约30,000D的至少一个聚合物共价连接。
在还有一个实例中，偶联物中的抗体片段与实际分子量至少约40,000D的至少一个聚合物共价连接。
在另一个实例中，偶联物中与抗体片段共价连接的至少一个聚合物的实际分子量约为20,00D至300,000D、或30,000D至300,000D、或40,000D至300,000D。
在另一个实例中，偶联物中与抗体片段共价连接的至少一个聚合物的实际分子量约为20,000D至100,000D、或30,000D至100，000D、或40,000D至100,000D。
在另一个实例中，偶联物中与抗体片段共价连接的至少一个聚合物的实际分子量约为20,000D至70,000D、或30,000D至70,000D、或40,000D至70,000D。
在另一个实例中，偶联物中与抗体片段共价连接的至少一个聚合物的实际分子量约为20,000D至50,000D、或30,000D至50,000D、或40,000D至50,000D。
在另一个实例中，偶联物中与抗体片段共价连接的至少一个聚合物的实际分子量约为20,000D至40,000D、或30,000D至40,000D。
本发明的偶联物可用现在已知的或下文开发出的用聚合物衍生处理抗体片段的任何合适的技术来制得。应当理解，本发明不局限于在抗体片段和聚合物之间采用何种特殊类型键连的偶联物。
本发明的偶联物包括的种类中聚合物与亲代抗体片段上的一个或多个非特异性位点共价连接，即，聚合物的连接不靶向亲代抗体片段的特定区域或特定氨基酸残基。在该种实例中，化学偶联(例如)可利用亲代抗体中赖氨酸残基的游离ε氨基作为聚合物的连接位点，其中这些赖氨酸残基的氨基由聚合物随机地衍生处理。
另外，本发明的偶联物包括的种类中聚合物与亲代抗体片段上的一个或多个特异性位点共价连接，即，聚合物的连接靶向亲代抗体片段中的特定区域或特定氨基酸残基。在这些实例中，化学偶联(例如)可利用亲代抗体片段中非二硫键中的半胱氨酸残基的游离巯基。在一个实例中，一个或多个半胱氨酸残基被基因工程加工到亲代抗体片段中所选择的位点，以便为聚合物提供一个或多个特异性连接位点。聚合物可用能与亲代抗体上的游离的巯基或硫羟基特异性反应的官能团(例如马来酰亚胺、巯基、硫羟基、triflate、tesylate、氮丙啶、exirane和5-吡啶基官能团)激活。聚合物可用任何适用于所选偶联系统化学性质的方法来与亲代抗体片段偶联，这些方法例如是下文部分(Ⅱ)(1)或部分(T)实施例中描述的方法和系统。
在另一个实例中，聚合物的连接靶向亲代抗体片段的铰链区。根据亲代抗体的同种型，铰链区的位置有所不同。通常，IgG、IgD和IgA同种型重链的铰链区被包含在延伸于CH1和CH2区之间的富含脯氨酸的肽序列中。在一个较佳的实例中，将一个或多个半胱氨酸残基加工改造到亲代抗体片段的铰链区内，以便将聚合物特异性地偶联到铰链区中所选位置。
一方面，本发明包括一种偶联物，其中的聚合物与抗体片段之摩尔比使偶联物的表观大小在本文所述的所需范围内。偶联物的表观大小部分取决于所用聚合物的大小和形状、所用抗体片段的大小和形状、与抗体片段连接的聚合物分子的数目、该连接位点在抗体片段中的位置。这些参数易于鉴定和最大化，以便获得对于任何类型的抗体片段、聚合物和键连系统具有所需表观大小的偶联物。
另一方面，本发明包括一种偶联物，其中的聚合物与抗体片段之摩尔比不超过大约10∶1、或5∶1、或4∶1、或3∶1、或2∶1、或1∶1。
还有一个方面，本发明包括一种偶联物，其中抗体片段与大约10个或更少的聚合物分子连接，每个聚合物分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D。在另一个实例中，偶联物含有的抗体片段与大约5个或更少的聚合物分子连接，每个聚合物分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D。在还有一个实例中，偶联物含有的抗体片段与大约4个或更少的聚合物分子连接，每个聚合物分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D。在还有一个实例中，偶联物含有的抗体片段与大约3个或更少的聚合物分子连接，每个聚合物分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D。在另一个实例中，偶联物含有的抗体片段与大约2个或更少的聚合物分子连接，每个聚合物分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D。这里还提供了一种偶联物，偶联物所含的抗体片段与单个聚合物分子连接，聚合物分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D。
在还有一个实例中，本发明包括一种偶联物，其中偶联物中的每个聚合物分子的分子量约为20,000D至300,000D、或30,000D至300,000D、或40,000D至300,000D，且其中偶联物含有不超过10个聚合物分子、或不超过5个聚合物分子、或不超过4个聚合物分子、或不超过3个聚合物分子、或不超过2个聚合物分子、或不超过1个聚合物分子。
还有一方面，本发明包括一种偶联物，其中偶联物中的每个聚合物分子的分子量约为20,000D至100,000D、或30,000D至100,000D、或40,000D至100,000D，且其中偶联物含有不超过10个聚合物分子、或不超过5个聚合物分子、或不超过4个聚合物分子、或不超过3个聚合物分子、或不超过2个聚合物分子、或不超过1个聚合物分子。
还有一方面，本发明包括一种偶联物，其中偶联物中的每个聚合物分子的分子量约为20,000D至70,000D、或30,000D至70,000D、或40,000D至70,000D，且其中偶联物含有不超过10个聚合物分子、或不超过5个聚合物分子、或不超过4个聚合物分子、或不超过3个聚合物分子、或不超过2个聚合物分子、或不超过1个聚合物分子。
还有一方面，本发明包括一种偶联物，其中偶联物中的每个聚合物分子的分子量约为20,000D至50,000D、或30,000D至50,000D、或40,000D至50,000D，且其中偶联物含有不超过10个聚合物分子、或不超过5个聚合物分子、或不超过4个聚合物分子、或不超过3个聚合物分子、或不超过2个聚合物分子、或不超过1个聚合物分子。
还有一方面，本发明包括一种偶联物，其中偶联物中的每个聚合物分子的分子量约为20,000D至40,000D、或30,000D至40,000D，且其中偶联物含有不超过10个聚合物分子、或不超过5个聚合物分子、或不超过4个聚合物分子、或不超过3个聚合物分子、或不超过2个聚合物分子、或不超过1个聚合物分子。
据信如本文所述用聚合物衍生处理抗体片段，则任何抗体片段的血清半衰期、MRT和/或血清清除速率均可大大改善。在一个实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇、Fab＇-SH、Fv、scFv和F(ab＇)2。
在一个较佳的实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中偶联物中的每个聚合物分子与抗体片段的铰链区相连。
在另一个较佳的实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，偶联物中的每个聚合物分子与抗体片段的铰链区相连，且偶联物含有不超过10个聚合物分子、或不超过5个聚合物分子、或不超过4个聚合物分子、或不超过3个聚合物分子，或不超过2个聚合物分子、或不超过1个聚合物分子。
在另一个较佳的实例中，偶联物含有与不超过2个聚合物分子相连的F(ab＇)2抗体片段，其中每个聚合物分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键(连接轻链和重链)的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在另一个实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中抗体片段与不超过1个聚合物分子相连，且该聚合物与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在另一个实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，偶联物中每个聚合物分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D，偶联物中的每个聚合物分子与抗体片段的铰链区相连，且偶联物含有不超过10个聚合物分子、或不超过5个聚合物分子、或不超过4个聚合物分子、或不超过3个聚合物分子、或不超过2个聚合物分子、或不超过1个聚合物分子。
在另一个实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，偶联物中的每个聚合物分子的分子量约为20,000D至300,000D、或30,000D至300,000D、或40,000D至300,000D，偶联物中的每个聚合物分子与抗体片段的铰链区相连，偶联物含有不超过10个聚合物分子、或不超过5个聚合物分子、或不超过4个聚合物分子、或不超过3个聚合物分子、或不超过2个聚合物分子、或不超过1个聚合物分子。
在另一个实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，偶联物中的每个聚合物分子的分子量约为20,000D至100,000D、或30,000D至100,000D、或40,000D至100,000D，偶联物中的每个聚合物分子与抗体片段的铰链区相连，偶联物含有不超过10个聚合物分子、或不超过5个聚合物分子、或不超过4个聚合物分子、或不超过3个聚合物分子、或不超过2个聚合物分子、或不超过1个聚合物分子。
在另一个实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，偶联物中的每个聚合物分子的分子量约为20,000D至70,000D、或30,000D至70,000D、或40,000D至70,000D，偶联物中的每个聚合物分子与抗体片段的铰链区相连，偶联物含有不超过10个聚合物分子、或不超过5个聚合物分子、或不超过4个聚合物分子、或不超过3个聚合物分子、或不超过2个聚合物分子、或不超过1个聚合物分子。
在另一个实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，偶联物中的每个聚合物分子的分子量约为20,000D至50,000D、或30,000D至50,000D、或40,000D至50,000D，偶联物中的每个聚合物分子与抗体片段的铰链区相连，偶联物含有不超过10个聚合物分子、或不超过5个聚合物分子、或不超过4个聚合物分子、或不超过3个聚合物分子、或不超过2个聚合物分子、或不超过1个聚合物分子。
在另一个实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，偶联物中的每个聚合物分子的分子量约为20,000D至40,000D、或30,000D至40,000D，偶联物中的每个聚合物分子与抗体片段的铰链区相连，偶联物含有不超过10个聚合物分子、或不超过5个聚合物分子、或不超过4个聚合物分子、或不超过3个聚合物分子、或不超过2个聚合物分子、或不超过1个聚合物分子。
在另一个实例中，偶联物含有与不超过2个聚合物分子相连的F(ab＇)2抗体片段，其中偶联物中每个聚合物分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D，且其中偶联物中每个聚合物分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在另一个实例中，偶联物含有与不超过2个聚合物分子相连的F(Fab＇)2抗体片段，其中偶联物中的每个聚合物分子的分子量约为20,000D至300,000D、或30,000D至300,000D、或40,000D至300,000D，且其中偶联物中每个聚合物分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在另一个实例中，偶联物含有与不超过2个聚合物分子相连的F(ab＇)2抗体片段，其中偶联物中的每个聚合物分子的分子量约为20,000D至100,000D、或30,000D至100,000D、或40,000D至100,000D，且其中偶联物中每个聚合物分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在另一个实例中，偶联物含有与不超过2个聚合物分子相连的F(ab＇)2抗体片段，其中偶联物中的每个聚合物分子的分子量约为20,000D至70,000D、或30,000D至70,000D、或40,000D至70,000D，且其中偶联物中每个聚合物分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在另一个实例中，偶联物含有与不超过2个聚合物分子相连的F(ab＇)2抗体片段，其中偶联物中的每个聚合物分子的分子量约为20,000D至50,000D、或30,000D至50,000D、或40,000D至50,000D，且其中偶联物中每个聚合物分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在另一个实例中，偶联物含有与不超过2个聚合物分子相连的F(ab＇)2抗体片段，其中偶联物中的每个聚合物分子的分子量约为20,000D至40,000D、或30,000D至40,000D，且其中偶联物中每个聚合物分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在其它实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中抗体片段与不超过1个聚合物分子相连，其中聚合物分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D，其中聚合物分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在另一个实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中抗体片段与不超过1个聚合物分子相连，其中聚合物分子的分子量约为20,000D至300,000D、或30,000D至300,000D、或40,000D至300,000D，其中聚合物分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在另一个实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中抗体片段与不超过1个聚合物分子相连，其中聚合物分子的分子量约为20,000D至100,000D、或30,000D至100,000D、或40,000D至100,000D，其中聚合物分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在另一个实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中抗体片段与不超过1个聚合物分子相连，其中聚合物分子的分子量约为20,000D至70,000D、或30,000D至70,000D、或40,000D至70,000D，其中聚合物分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在另一个实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中抗体片段与不超过1个聚合物分子相连，其中聚合物分子的分子量约为20,000D至50,000D、或30,000D至50,000D、或40,000D至50,000D，其中聚合物分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在另一个实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中抗体片段与不超过1个聚合物分子相连，其中聚合物分子的分子量约为20,000D至40,000D、或30,000D至40,000D，其中聚合物分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在还有一个实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中抗体片段与不超过1个聚合物分子相连，其中聚合物分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D，且其中聚合物分子与抗体片段的铰链区相连。
在另一个实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中抗体片段与不超过1个聚合物分子相连，其中聚合物分子的分子量约为20,000D至300,000D、或30,000D至300,000D、或40,000D至300,000D，且其中聚合物分子与抗体片段的铰链区相连。
在另一个实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中抗体片段与不超过1个聚合物分子相连，其中聚合物分子的分子量约为20,000D至100,000D、或30,000D至100,000D、或40,000D至100,000D，且其中聚合物分子与抗体片段的铰链区相连。
在另一个实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中抗体片段与不超过1个聚合物分子相连，其中聚合物分子的分子量约为20,000D至70,000D、或30,000D至70,000D、或40,000D至70,000D，且其中聚合物分子与抗体片段的铰链区相连。
在另一个实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中抗体片段与不超过1个聚合物分子相连，其中聚合物分子的分子量约为20,000D至50,000D、或30,000D至50,000D、或40,000D至50,000D，且其中聚合物分子与抗体片段的铰链区相连。
在另一个实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中抗体片段与不超过1个聚合物分子相连，其中聚合物分子的分子量约为20,000D至40,000D、或30,000D至40,000D，且其中聚合物分子与抗体片段的铰链区相连。
尽管在构建本发明的偶联物时可考虑采用任何类型的聚合物，包括下述部分(Ⅱ)(1)(b)中描述的聚合物和化学键体系，但是聚7二醇(PEG)聚合物较适合本文所用。
在一个实例中，偶联物中的抗体片段与实际分子量至少约20,000D的至少一个PEG共价连接。
在另一个实例中，偶联物中的抗体片段与实际分子量至少约30,000D的至少一个PEG共价连接。
在还有一个实例中，偶联物中的抗体片段与实际分子量至少约40,000D的至少一个PEG共价连接。
在另一个实例中，偶联物中与抗体片段共价连接的至少一个PEG的实际分子量约为20,000D至300,000D、或30,000D至300,000D、或40,000D至300,000D。
在另一个实例中，偶联物中与抗体片段共价连接的至少一个PEG的实际分子量约为20,000D至100,000D、或30,000D至100,000D、或40,000D至100,000D。
在另一个实例中，偶联物中与抗体片段共价连接的至少一个PEG的实际分子量约为20,000D至70,000D、或30,000D至70,000D、或40,000D至70,000D。
在另一个实例中，偶联物中与抗体片段共价连接的至少一个PEG的实际分子量约为20,000D至50,000D、或30,000D至50,000D、或40,000D至50,000D。
在另一个实例中，偶联物中与抗体片段共价连接的至少一个聚合物的实际分子量约为20,000D至40,000D、或30,000D至40,000D。
另一方面，本发明包括一种偶联物，其中的PEG与抗体片段之摩尔比不超过大约10∶1、或5∶1、或4∶1、或3∶1、或2∶1、或1∶1。
还有一个方面，本发明包括一种偶联物，其中抗体片段与大约10个或更少的PEG分子连接，每个PEG分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D。在另一个实例中，偶联物含有的抗体片段与大约5个或更少的PEG分子连接，每个PEG分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D。在还有一个实例中，偶联物含有的抗体片段与大约4个或更少的PEG分子连接，每个PEG分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D。在还有一个实例中，偶联物含有的抗体片段与大约3个或更少的PEG分子连接，每个PEG分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D。在另一个实例中，偶联物含有的抗体片段与大约2个或更少的PEG分子连接，每个PEG分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D。这里还提供了一种偶联物，该偶联物所含的抗体片段与单个PEG分子连接，PEG分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D。
另一方面，本发明包括一种偶联物，其中用PEG衍生处理抗体片段，其中偶联物中的每个PEG分子的分子量约为20,000D至300,000D、或30,000D至300,000D、或40,000D至300,000D，且其中偶联物含有不超过10个PEG分子、或不超过5个PEG分子、或不超过4个PEG分子、或不超过3个PEG分子、或不超过2个PEG分子、或不超过1个PEG分子。
另一方面，本发明包括一种偶联物，其中用PEG衍生处理抗体片段，其中偶联物中的每个PEG分子的分子量约为20,000D至100,000D、或30,000D至100,000D、或40,000D至100,000D，且其中偶联物含有不超过10个PEG分子、或不超过5个PEG分子、或不超过4个PEG分子、或不超过3个PEG分子、或不超过2个PEG分子、或不超过1个PEG分子。
另一方面，本发明包括一种偶联物，其中用PEG衍生处理抗体片段，其中偶联物中的每个PEG分子的分子量约为20,000D至70,000D、或30,000D至70,000D、或40,000D至70,000D，且其中偶联物含有不超过10个PEG分子、或不超过5个PEG分子、或不超过4个PEG分子、或不超过3个PEG分子、或不超过2个PEG分子、或不超过1个PEG分子。
另一方面，本发明包括一种偶联物，其中用PEG衍生处理抗体片段，其中偶联物中的每个PEG分子的分子量约为20,000D至50,000D、或30,000D至50,000D、或40,000D至50,000D，且其中偶联物含有不超过10个PEG分子、或不超过5个PEG分子、或不超过4个PEG分子、或不超过3个PEG分子、或不超过2个PEG分子、或不超过1个PEG分子。
另一方面，本发明包括一种偶联物，其中用PEG衍生处理抗体片段，其中偶联物中的每个PEG分子的分子量约为20,000D至40,000D、或30,000D至40,000D，且其中偶联物含有不超过10个PEG分子、或不超过5个PEG分子、或不超过4个PEG分子、或不超过3个PEG分子、或不超过2个PEG分子、或不超过1个PEG分子。
还有一方面，本发明包括一种偶联物，该偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇、Fab＇-SH、和F(ab＇)2，其中抗体片段与大约10个或更少的PEG分子连接，每个PEG分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D。在另一个实例中，前述偶联物含有的抗体片段与大约5个或更少的PEG分子连接，每个PEG分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D。在还有一个实例中，前述偶联物含有的抗体片段与大约4个或更少的PEG分子连接，每个PEG分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D。在还有一个实例中，前述偶联物含有的抗体片段与大约3个或更少的PEG分子连接，每个PEG分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D。在另一个实例中，前述偶联物含有的抗体片段与大约2个或更少的PEG分子连接，每个PEG分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D。这里还提供了一种前述偶联物，该偶联物所含的抗体片段与单个PEG分子连接，PEG分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D。
另一方面，本发明包括一种偶联物，该偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇、Fab＇-SH和F(ab＇)2，其中用PEG衍生处理该抗体片段，其中偶联物中的每个PEG分子的分子量约为20,000D至300,000D、或30,000D至300,000D、或40,000D至300,000D，且其中偶联物含有不超过10个PEG分子、或不超过5个PEG分子、或不超过4个PEG分子、或不超过3个PEG分子、或不超过2个PEG分子、或不超过1个PEG分子。
另一方面，本发明包括一种偶联物，该偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇、Fab＇-SH和F(ab＇)2，其中用PEG衍生处理该抗体片段，其中偶联物中的每个PEG分子的分子量约为20,000D至100,000D、或30,000D至100,000D、或40,000D至100,000D，且其中偶联物含有不超过10个PEG分子、或不超过5个PEG分子、或不超过4个PEG分子、或不超过3个PEG分子、或不超过2个PEG分子、或不超过1个PEG分子。
另一方面，本发明包括一种偶联物，该偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇、Fab＇-SH和F(ab＇)2，其中用PEG衍生处理该抗体片段，其中偶联物中的每个PEG分子的分子量约为20,000D至70,000D、或30,000D至70,000D、或40,000D至70,000D，且其中偶联物含有不超过10个PEG分子、或不超过5个PEG分子、或不超过4个PEG分子、或不超过3个PEG分子、或不超过2个PEG分子、或不超过1个PEG分子。
另一方面，本发明包括一种偶联物，该偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇、Fab＇-SH和F(ab＇)2，其中用PEG衍生处理该抗体片段，其中偶联物中的每个PEG分子的分子量约为20,000D至50,000D、或30,000D至50,000D、或40,000D至50,000D，且其中偶联物含有不超过10个PEG分子、或不超过5个PEG分子、或不超过4个PEG分子、或不超过3个PEG分子、或不超过2个PEG分子、或不超过1个PEG分子。
另一方面，本发明包括一种偶联物，该偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇、Fab＇-SH和F(ab＇)2，其中用PEG衍生处理该抗体片段，其中偶联物中的每个PEG分子的分子量约为20,000D至40,000D、或30,000D至40,000D，且其中偶联物含有不超过10个PEG分子、或不超过5个PEG分子、或不超过4个PEG分子、或不超过3个PEG分子、或不超过2个PEG分子、或不超过1个PEG分子。
在一个较佳的实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中用PEG衍生处理该抗体片段，该PEG的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D，且其中偶联物中的每个PEG分子与抗体片段的铰链区相连。
在另一个较佳的实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中用PEG衍生处理该抗体片段，该PEG的分子量约为20,000D至300,000D、或30,000D至300,000D、或40,000D至300,000D，且其中偶联物中的每个PEG分子与抗体片段的铰链区相连。
在另一个较佳的实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中用PEG衍生处理该抗体片段，该PEG的分子量约为20,000D至100,000D、或30,000D至100,000D、或40,000D至100,000D，且其中偶联物中的每个PEG分子与抗体片段的铰链区相连。
在另一个较佳的实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中用PEG衍生处理该抗体片段，该PEG的分子量约为20,000D至70,000D、或30,000D至70,000D、或40,000D至70,000D，且其中偶联物中的每个PEG分子与抗体片段的铰链区相连。
在另一个较佳的实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中用PEG衍生处理该抗体片段，该PEG的分子量约为20,000D至50,000D、或30,000D至50,000D、或40,000D至50,000D，且其中偶联物中的每个PEG分子与抗体片段的铰链区相连。
在另一个较佳的实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中用PEG衍生处理该抗体片段，该PEG的分子量约为20,000D至40,000D、或30,000D至40,000D，且其中偶联物中的每个PEG分子与抗体片段的铰链区相连。
在另一个实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中用PEG衍生处理该抗体片段，其中偶联物中的每个PEG分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D，其中偶联物中的每个PEG分子与抗体片段的铰链区相连，且其中偶联物含有不超过10个PEG分子、或不超过5个PEG分子、或不超过4个PEG分子、或不超过3个PEG分子、或不超过2个PEG分子、或不超过1个PEG分子。
在另一个较佳的实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中用PEG衍生处理该抗体片段，其中偶联物中的每个PEG分子的分子量约为20,000D至300,000D、或30,000D至300,000D、或40,000D至300,000D，其中偶联物中的每个PEG分子与抗体片段的铰链区相连，且其中偶联物含有不超过10个PEG分子、或不超过5个PEG分子、或不超过4个PEG分子、或不超过3个PEG分子、或不超过2个PEG分子、或不超过1个PEG分子。
在另一个较佳的实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中用PEG衍生处理该抗体片段，其中偶联物中的每个PEG分子的分子量约为20,000D至100,000D、或30,000D至100,000D、或40,000D至100,000D，其中偶联物中的每个PEG分子与抗体片段的铰链区相连，且其中偶联物含有不超过10个PEG分子、或不超过5个PEG分子、或不超过4个PEG分子、或不超过3个PEG分子、或不超过2个PEG分子、或不超过1个PEG分子。
在另一个较佳的实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中用PEG衍生处理该抗体片段，其中偶联物中的每个PEG分子的分子量约为20,000D至70,000D、或30,000D至70,000D、或40,000D至70,000D，其中偶联物中的每个PEG分子与抗体片段的铰链区相连，且其中偶联物含有不超过10个PEG分子、或不超过5个PEG分子、或不超过4个PEG分子、或不超过3个PEG分子、或不超过2个PEG分子、或不超过1个PEG分子。
在另一个较佳的实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中用PEG衍生处理该抗体片段，其中偶联物中的每个PEG分子的分子量约为20,000D至50,000D、或30,000D至50,000D、或40,000D至50,000D，其中偶联物中的每个PEG分子与抗体片段的铰链区相连，且其中偶联物含有不超过10个PEG分子、或不超过5个PEG分子、或不超过4个PEG分子、或不超过3个PEG分子、或不超过2个PEG分子、或不超过1个PEG分子。
在另一个较佳的实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中用PEG衍生处理该抗体片段，其中偶联物中的每个PEG分子的分子量约为20,000D至40,000D、或30,000D至40,000D，其中偶联物中的每个PEG分子与抗体片段的铰链区相连，且其中偶联物含有不超过10个PEG分子、或不超过5个PEG分子、或不超过4个PEG分子、或不超过3个PEG分子、或不超过2个PEG分子、或不超过1个PEG分子。
在另一个较佳的实例中，偶联物含有用PEG衍生处理的F(ab＇)2抗体片段，其中偶联物中每个PEG分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D，其中该抗体片段与不超过2个PEG分子相连，且其中每个PEG分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在另一个较佳的实例中，偶联物含有用PEG衍生处理的F(ab′)2抗体片段，其中偶联物中每个PEG分子的分子量约为20,000D至300,000D、或30,000D至300,000D、或40,000D至300,000D，其中该抗体片段与不超过2个PEG分子相连，且其中每个PEG分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在另一个较佳的实例中，偶联物含有用PEG衍生处理的F(ab＇)2抗体片段，其中偶联物中每个PEG分子的分子量约为20,000D至100,000D、或30,000D至100,000D、或40,000D至100,000D，其中该抗体片段与不超过2个PEG分子相连，且其中每个PEG分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在另一个较佳的实例中，偶联物含有用PEG衍生处理的F(ab＇)2抗体片段，其中偶联物中每个PEG分子的分子量约为20,000D至70,000D、或30,000D至70,000D、或40,000D至70,000D，其中该抗体片段与不超过2个PEG分子相连，且其中每个PEG分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在另一个较佳的实例中，偶联物含有用PEG衍生处理的F(ab＇)2抗体片段，其中偶联物中每个PEG分子的分子量约为20,000D至50,000D、或30,000D至50,000D、或40,000D至50,000D，其中该抗体片段与不超过2个PEG分子相连，且其中每个PEG分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在另一个较佳的实例中，偶联物含有用PEG衍生处理的F(ab＇)2抗体片段，其中偶联物中每个PEG分子的分子量约为20,000D至40,000D、或30,000D至40,000D，其中该抗体片段与不超过2个PEG分子相连，且其中每个PEG分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在还有一个较佳的实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中用PEG衍生处理该抗体片段，其中偶联物中每个PEG分子的分子量至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40，000D，其中抗体片段与不超过1个PEG分子相连，且其中该PEG分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在另一个较佳的实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中用PEG衍生处理该抗体片段，其中偶联物中每个PEG分子的分子量约为20,000D至300,000D、或30,000D至300,000D、或40,000D至300,000D，其中抗体片段与不超过1个PEG分子相连，且其中PEG分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在另一个较佳的实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中用PEG衍生处理该抗体片段，其中偶联物中每个PEG分子的分子量约为20,000D至100,000D、或30,000D至100,000D、或40,000D至100,000D，其中抗体片段与不超过1个PEG分子相连，且其中PEG分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在另一个较佳的实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中用PEG衍生处理该抗体片段，其中偶联物中每个PEG分子的分子量约为20,000D至70,000D、或30,000D至70,000D、或40,000D至70,000D，其中抗体片段与不超过1个PEG分子相连，且其中PEG分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在另一个较佳的实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中用PEG衍生处理该抗体片段，其中偶联物中每个PEG分子的分子量约为20,000D至50,000D、或30,000D至50,000D、或40,000D至50,000D，其中抗体片段与不超过1个PEG分子相连，且其中PEG分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
在另一个较佳的实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中用PEG衍生处理该抗体片段，其中偶联物中每个PEG分子的分子量约为20,000D至40,000D、或30,000D至40,000D，其中抗体片段与不超过1个PEG分子相连，且其中PEG分子与抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基相连，其中通过用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代对侧链中相应的半胱氨酸残基来避免形成二硫键。
应当理解，本发明所有上述采用PEG聚合物的实例包括的偶联物中PEG聚合物是直链或支链的。在一个较佳的实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中该抗体片段与不超过1个PEG分子相连，且其中PEG是支链的，其分子量至少约为40,000D。特别令人惊奇且出乎意料的发现是，本发明者发现前述偶联物表现出的血清半衰期、MRT和血清清除速率接近全长抗体(如下述实施例X所示)。
在另一个较佳的实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中抗体片段与不超过1个PEG分子相连，且其中该PEG分子有支链，其分子量约为40,000D至300,000D。
在另一个较佳的实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中抗体片段与不超过1个PEG分子相连，且其中该PEG分子有支链，其分子量约为40,000D至100,000D。
在另一个较佳的实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中抗体片段与不超过1个PEG分子相连，且其中该PEG分子有支链，其分子量约为40,000D至70,000D。
在另一个较佳的实例中，偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中抗体片段与不超过1个PEG分子相连，且其中该PEG分子有支链，其分子量约为40,000D至50,000D。
在另一个较佳的实例中，本发明提供了一种偶联物，该偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中抗体片段与不超过1个PEG分子相连，且其中该PEG分子有支链，分子量至少为40,000D，该PEG分子与抗体片段的铰链区相连。
在另一个较佳的实例中，本发明提供了一种偶联物，该偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中抗体片段与不超过1个PEG分子相连，且其中该PEG分子有支链，分子量约为40,000D至300,000D，该PEG分子与抗体片段的铰链区相连。
在另一个较佳的实例中，本发明提供了一种偶联物，该偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中抗体片段与不超过1个PEG分子相连，且其中该PEG分子有支链，分子量约为40,000D至100,000D，该PEG分子与抗体片段的铰链区相连。
在另一个较佳的实例中，本发明提供了一种偶联物，该偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中抗体片段与不超过1个PEG分子相连，且其中该PEG分子有支链，分子量约为40,000D至70,000D，该PEG分子与抗体片段的铰链区相连。
在另一个较佳的实例中，本发明提供了一种偶联物，该偶联物所含的抗体片段选自Fab、Fab＇和Fab＇-SH，其中抗体片段与不超过1个PEG分子相连，且其中该PEG分子有支链，分子量约为40,000D至50,000D，该PEG分子与抗体片段的铰链区相连。
一方面，本发明提供的上述任一偶联物中偶联物含有不超过1个抗体片段。本文还提供了上述任一偶联物，其中偶联物含有一个或多个抗体片段与一个或多个聚合物分子共价连接，例如偶联物含有两个或多个抗体片段一起与聚合物分子共价连接。在一个实例中，用一个聚合物分子来连接两个抗体片段，形成一哑铃形结构。这里还包括的偶联物是通过两个以上的抗体片段被聚合物分子连接形成玫瑰花形或其它形状的偶联物。这些结构中的抗体片段可以是相同或不同的片段类型，可以有相同或不同的抗原特异性。这些结构可用经多个官能团衍生的聚合物分子来直接连接、或利用双官能或多官能接头将两个或多个抗体片段连接到聚合物骨架而制得。
另一方面，本发明包括任何上述偶联物，该偶联物采用了含有与家兔IL-8和/或人IL-8结合的抗原识别位点的抗体片段。另一方面，本发明还包括采用了含有下述6G4.2.5LV/L1N35A或6G4.2.5LV/L1N35E的抗体片段的任何上述偶联物。还有一方面，本发明包括采用了含有下述6G4.2.5 HV11的抗体片段的任何上述偶联物。还有一方面，本发明包括采用了含有下述hu6G4.2.5LV/L1N35A或hu6G4.2.5LV/L1N35E的抗体片段的任何上述偶联物。另一方面，本发明包括采用了含有hu6G4.2.5HV的抗体片段的任何上述偶联物。本文还包括采用了包含6G4.2.5LV/L1N35A或6G4.2.5LV/L1N35E且还包含下述6G4.2.5HV的CDR的抗体片段的任何上述偶联物。本文还包括一种上述偶联物，该偶联物采用了包含hu6G4.2.5LV/L1N35A或hu6G4.2.5LV/L1N35E且还包含下述hu6G4.2.5HV的抗体片段。本文还包括采用了包含下述6G4.2.5LV11N35A或6G4.2.5LV11N35E的抗体片段的任何上述偶联物。本文还提供了采用了包含6G4.2.5LV11N35A或6G4.2.5LV11N35E且还包含下述6G4.2.5HV11的抗体片段的任何上述偶联物。
a．抗体片段的产生
抗体片段可用本领域已知的任何方法生产。通常，抗体衍生自亲代完整的抗体。亲代抗体可通过在多个部位多次皮下或腹膜内注射抗原和佐剂(如单磷酰类脂A(MPL)/trehalose dicrynomycolate(TDM)(Ribi Immunochem.Research,Inc.,Hamilton,MT))，引起抗所需抗原的多克隆血清产生。两周后，对动物进行加强注射。7至14天后，动物取血，测定血清的抗抗原滴度。加强注射动物直至滴度达到平稳。收获动物血清，用常规的免疫球蛋白纯化方法(如蛋白A-Sepharose层析、羟基磷灰石层析、凝胶过滤、透析或抗原亲和层析)从血清中分离出多克隆抗体。所需的抗体片段可用常规酶学方法从纯化的多克隆抗体制备物中产生，例如用胃蛋白酶切割完整的抗体产生F(ab＇)2片段，木瓜蛋白酶简单地消化完整的抗体产生Fab片段。
或者，从针对所需抗原而产生的单克隆抗体衍生获得抗体片段。单克隆抗体可用由Kohler等在Nature,256：495(1975)中首先描述的杂交瘤方法或重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)制得。
在杂交瘤方法中，如上所述免疫接种小鼠或其它合适的宿主动物(如仓鼠或猕猴)，以诱导淋巴细胞，而淋巴细胞产生或能产生特异性结合免疫接种用蛋白的抗体。或者，淋巴细胞可在体外受免疫。然后用合适的融合剂(如聚乙二醇)来融合淋巴细胞和骨髓瘤细胞，形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,59-103页(Academic Press,1986))。
将这样制得的杂交瘤细胞接种到合适的培养基中，使其生长，该培养基中最好含有一种或多种抑制未融合亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤培养基中通常加入了次黄嘌呤、氨基碟呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质抑制了HGPRT缺陷型细胞的生长。
较佳的骨髓瘤细胞是能有效融合、支持所选择的抗体生成细胞稳定而高水平地产生抗体、且对诸如HAT培养基之类的培养基敏感的那些细胞。其中较佳的骨髓瘤细胞系是小鼠骨髓瘤细胞系，如从MOPC-21和M.C.-11小鼠肿瘤衍生的细胞系(购自Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California USA)和SP-2或X63-Ag8-653细胞(购自American Type Culture Collection,Rockville,Maryland USA)。另外，用来生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系也已有所描述(Kozbor,J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonalantibody Production Techniques and Applications,51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
测定杂交瘤生长的培养液中有无针对抗原的单克隆抗体产生。杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性宜通过免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫试验(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA))测得。
单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等，Anal.Biochem.,107：220(1980)的Scatchard分析来测定。
在鉴定了能产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释步骤来亚克隆该克隆，并用标准方法(Goding,MonoclonalAntibodies：Principles and Practice,59-103页(Academic Press,1986))使其生长。用于该目的的合适的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤形式在动物体内生长。
用常规的免疫球蛋白纯化步骤(如蛋白A-Sepharose，羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)，将亚克隆细胞分泌的单克隆抗体适当地从培养基、腹水体液或血清中分离出来。
很容易分离获得编码单克隆抗体的DNA并用常规步骤对其测序(例如，用能与编码单克隆抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是此类DNA的较佳来源。一旦分离出后，可将DNA放入表达载体中，然后将该载体转染到宿主细胞(如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)中，在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于编码抗体的DNA在细菌中重组表达的综述文献包括Skerra等，Curr.Opinion inImmunol.,5：256(1993)和Pluckthun,Immunol.Revs.,130：151(1992)。
在一个较佳的实例中，抗体片段从人源化的抗体衍生获得。人源化非人抗体的方法是本领域中熟知的。通常，人源化的抗体中有导人的一个或多个非人源氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“导入”残基，它们通常取自“导入”可变区。应当理解，如本文所述，提供的从任何非人类动物噬菌体展示文库衍生的Fv克隆或任何非人类动物杂交瘤衍生的抗体克隆获得的可变区序列可作为“导入”可变区，用于构建本发明的人源化抗体。人源化可基本上根据Winter及其合作者(Jones等，Nature,321：522(1986)；Riechmann等，Nature,332：323(1988)；Verhoeyen等，Science,239：1534(1988))所述的方法，用非人类动物(例如啮齿类)的CDR或CDR序列来取代人抗体的相应序列。因此，这些“人源化”抗体是嵌合抗体(Cabilly等，同上)，其中基本上不到一个完整的人可变区被非人类动物的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是其中一些CDR残基以及可能还有一些FR残基被非人类动物(如啮齿类)抗体中类似部位的残基取代的人抗体。
选择人轻链和重链可变区用来制备人源化抗体对于减少抗原性来说非常重要。根据所谓的“最佳配合”方法，用已知人可变区序列的整个文库来筛选非人类动物(如啮齿类)抗体的可变区序列。然后，采用最接近非人类动物序列的人序列作为人源化抗体的人构架(FR)(Sims等，J.Immunol.,151：2296(1993)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196：901(1987))。另一种方法采用得自特定亚组的所有人抗体轻链或重链共有序列的特定构架。同一构架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；Presta等，J.Immnol.,151：2623(1993))。
抗体的人源化应保留对抗原的高亲和力以及其它有利的生物性能，这也很重要。为达到这一目的，制备人源化抗体的一个较佳的方法是，利用亲代序列和人源化序列的三维模型来分析亲代序列和各种概念上(conceptual)的人源化产物。免疫球蛋白的三维模型是本领域技术人员通常能获得的和熟知的。描述和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可以得到的。观察这些显示结果，就能分析残基在候选免疫球蛋白序列中可能起的作用，即，能分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合能力的残基。这样，就能从共有和导人序列中选出FR残基并将其组合，从而获得所需的抗体特性(如对靶抗原的亲和力提高)。通常，CDR残基直接影响和基本上完全影响到抗原的结合。
另外，本文所用的抗体片段可从人单克隆抗体衍生获得。针对感兴趣抗原的人单克隆抗体可用杂交瘤方法制得。用来生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系已有描述(例如，Kozbor,J,Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal antibody Production Techniques and Applications,51-63页(MarcelDekker,Inc.,New York,1987))；和Boerner等，J.Immunol.,147：86(1991)。
现在可以制备转基因动物(如小鼠)，它能在免疫接种后产生人抗体的全部组成成份而没有内源性免疫球蛋白的产生。例如，已经描述了嵌合的种系突变型小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失会导致完全抑制内源性抗体的产生。将人种系免疫球蛋白基因排列转移到这些种系突变型小鼠中会使其在抗原攻击时产生人抗体。例如参见，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature,362：255(1993)；Bruggermann等，Year in Immunol.,7：33(1993)。
另外，可以采用噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature,348：552(1990))从未免疫接种的供体的免疫球蛋白可变(V)区基因文库中在体外产生人抗体和抗体片段。根据该技术，抗体V区基因被框内克隆到丝状细菌噬菌体(如M13或fd)的主要或次要包膜蛋白基因内，并作为功能性抗体片段展示在噬菌体颗粒表面。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，因此根据抗体性能的选择就会导致选出编码显示有那些性能的抗体的基因。因此，噬菌体模拟了B-细胞的一些性能。噬菌体展示可以各种形式进行；关于它们的综述例如参见Johnson等，CurrentOpinion in Structural Biology 3：564(1993)。V基因节段的一些来源可用于噬菌体展示。Clackson等，Nature 352：624(1991)从经免疫小鼠脾脏获得的V基因的小随机组合文库中分离出抗-噁唑酮抗体的多种排列。基本上按照Marks等，J.Mol.Biol.222：581(1991)或Griffrth等，EMBO J.12：725(1993)所述的技术，可以构建出未免疫接种的人供体的V基因的全部组成，并可分离出对各种抗原(包括自身抗原)排列的抗体。
在天然的免疫反应中，抗体基因高速度地累积突变(体细胞高变)。引入的一些变化会赋予更高的亲和力，在随后的抗原攻击时，显示出高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞优先复制和分化。利用已知的“链改组(chain shuffling)”技术(Marks等，Bio/Technol,10：779(1992))可以模拟这一自然过程。在该方法中，通过用得自未免疫接种供体的V区基因中天然存在的变体全部组成依次替换重链和轻链V区基因，就可改进自噬菌体展示得到的“原代”人抗体的亲和力。该技术能产生亲和力在nM范围内的抗体和抗体片段。Waterhouse等Nucl.Acids Res.21：2265(1993)已经描述了制备非常大的噬菌体抗体文库的策略。
当人抗体的亲和力和特异性与起始的非人类动物抗体相似时，也可用基因改组来从非人类动物(例如啮齿类)抗体衍生获得人抗体。根据该方法(也称为“表位印记”)，用人可变区基因文库替换上述得自噬菌体展示技术的非人抗体片段的重链或轻链可变区，产生一群非人链/人链scFv或Fab嵌合体。用抗原选择，分离出非人链/人链嵌合的scFv或Fab，其中在原代噬菌体展示克隆中除去对应的非人链时，人链恢复了被破坏的抗原结合位点，即表位控制(印记)了人链配对物的选择。当重复该方法以便替换其余的非人链时，获得一种人抗体(参见PCT WO93/06213,1993年4月1日公布)。与传统的CDR移植来人源化非人抗体不同，该技术提供了完全的人抗体，它没有非人源的FR或CDR残基。
本发明还包括采用了具有对至少两个不同的抗原有特异性的双特异性和杂偶联(heteroconjugate)抗体片段。双特异性和杂偶联抗体可制成全长抗体或抗体片段(如F(ab＇)2双特异性抗体片段)。有两价以上(如三价或更高价的抗体片段)的抗体片段也可考虑用于本文。双特异性抗体、杂偶联抗体和多价抗体可如下文部分(Ⅱ)(3)(C)中所述那样制得。
如上所述，编码感兴趣的单克隆抗体或抗体片段的DNA可从其杂交瘤或原始的噬菌体展示克隆分离获得，然后可加工产生人源化的和/或亲和力成熟的构建物。此外，可采用已知的技术，将一个或多个氨基酸残基导入抗体片段多肽骨架上的所需位置中，例如将半胱氨酸残基置于重链的铰链区内，从而提供特异性连接聚合物分子的位点。在一个实例中，用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代抗体片段轻链或重链中通常会形成二硫键连接轻链和重链的半胱氨酸残基，以使对侧链中的配对半胱氨酸残基留有游离的巯基来特异性连接聚合物分子。
在构建编码所需抗体或抗体片段的克隆时，该克隆可用于如下文部分(Ⅱ)(4)所述重组生产抗体片段。最后，可以如下文部分(Ⅱ)(4)(F)所述的那样，从宿主细胞培养物中回收抗体或抗体片段产物并纯化。在一个实例中，采用的抗体片段被基因工程改造成缺少一个通常在轻链和重链之间形成二硫键的半胱氨酸残基，较佳的重组生产系统包括细菌表达和产物回收步骤采用了下文实施例T中“Fab＇-SH的另一种纯化方法”部分中所述的低pH渗透压休克方法。如果产生了全长抗体，则可通过使完整的抗体按照已知方法受酶消化(如下文部分(Ⅱ)(4)(G)中所述)从中获得所需的抗体片段。
b．抗体片段-聚合物偶联物的构建
本发明的抗体片段-聚合物偶联物可通过用惰性聚合物衍生处理所需抗体片段制得。应当理解，能提供具有所需表观大小的偶联物的惰性聚合物，或具有本文所选出的实际分子量的惰性聚合物，均适用于构建本发明的抗体片段-聚合物偶联物。
许多惰性聚合物适用于制药。例如参见，Davis等，Biomedical Polymers：Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical USE,441-451页(1980)。在本发明的所有实例中，采用的是非蛋白类聚合物。非蛋白类聚合物通常是亲水性合成聚合物，即在自然界没有发现的聚合物。然而，存在于自然界并通过重组或体外方法产生的聚合物，以及从天然来源分离出的聚合物也是适用的。亲水性聚乙烯聚合物在本发明范围内，例如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。特别适用的是聚亚烷基醚如聚乙二醇(PEG)；聚氧亚烷基如聚氧乙烯、聚氧丙烯、以及聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物(Pluronics)；聚甲基丙烯酸酯；carbomers；有支链或无支链多糖，它们包含糖单体D-甘露糖、D-和L-半乳糖、岩藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(如聚甘露糖醛酸或海藻酸)、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖和神经氨酸，包括均聚糖和异聚糖如乳糖、支链淀粉、淀粉、羟乙基淀粉、直链淀粉、硫酸葡聚糖、葡聚糖、糊精、糖元或酸性粘多糖的多糖亚单位，如透明质酸；糖醇的聚合物如聚山梨糖醇和聚甘露糖醇；肝素或类肝素(heparon)。聚合物在交联前不必但最好是水溶性的，但是最终的偶联物必须是水溶性的。较佳的，偶联物表现出的水溶解度至少约为0.01毫克/毫升，更佳的至少约为0.1毫克/毫升，还要佳的至少约1毫克/毫升。此外，聚合物不应在偶联物形式下有较高的免疫原性，也不应具有与静脉内灌输或注射不相容的粘度(如果偶联物打算采用这些途径来给药)。
在一个实例中，聚合物只含一个有反应性的基团。这有助于避免蛋白分子的交联。然而，使反应条件最大化来减少交联、或通过凝胶过滤或离子交换层析来纯化反应产物以回收基本均一的衍生物，这些在本发明的范围内。在其它实例中，聚合物含有两个或多个反应基团，以便使多个抗体片段与聚合物骨架相连。同样可用凝胶过滤或离子交换层析来回收基本上均一形式的所需的衍生物。
聚合物分的分子量可高达500,000D，较佳的至少约为20,000D、或至少约为30,000D、或至少约为40,000D。分子量的选择可取决于待获得的偶联物的有效大小、聚合物的特征(例如结构，如直链或支链)、衍生化的程度(即每个抗体片段的聚合物分子数)、以及抗体片段上的一个或多个聚合物连接位点。
聚合物可通过多官能交联剂与抗体片段共价连接，该交联剂与待连接的聚合物以及抗体片段的一个或多个氨基酸残基反应。然而，使衍生的聚合物与抗体片段反应(或反过来)来直接交联聚合物也在本发明的范围内。
抗体片段上的共价交联位点包括N端氨基和赖氨酸残基上的ε氨基，以及其它氨基、亚氨基、羧基、巯基、羟基或其它亲水性基团。聚合物可不用多官能(通常是双官能)交联剂与抗体片段直接共价键合。与氨基的共价结合可通过根据氰尿酰氯、羰基二咪唑、醛反应基团的已知化学机理(PEG醇盐加上溴代乙醛的二乙基缩醛；PEG加上DMSO和乙酸酐、或氯化PEG加上4-羟基苯甲醛的酚盐、活化的琥珀酰亚氨酯、活化的二硫代碳酸酯PEG、2,4,5-三氯苯基氯甲酸酯或P-硝基苯基氯甲酸酯活化的PEG)来实现。用碳化二亚胺偶联PEG-胺来衍生处理羧基。巯基通过偶联马来酰亚胺取代的PEG(例如1997年3月27日出版的WO97/10847中所述的烷氧基-PEG胺加上磺基琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯，或购自Shearwater Polymers,Inc.,Huntsville,AL的PEG马来酰亚胺)来衍生。另外，抗体片段上的游离的氨基(如赖氨酸残基上的ε氨基)可用2-亚氨基-硫烷(thiolane)(Traut试剂)来硫羟化，然后与含有马来酰亚胺的PEG衍生物偶联(如Pedley等在Br.J.Cancer 70：1126-1130(1994)中所述)。
聚合物将携带一个基团与连接的多肽的氨基酸侧链、或N端或C端直接反应，或与多官能交联剂反应。通常，已经知道携带这些反应基团的聚合物可用于制备固定化的蛋白质。为了在本文中采用这些化学机理，应当采用此前用于蛋白质固定的水溶性聚合物，或是经类似方式衍生处理的不溶的聚合物。在用于交联多糖时，溴化氰活化是特别有用的步骤。
起始聚合物的“水溶性”指用于偶联的该聚合物或其反应中间体足以溶于水中参与衍生反应。
该聚合物的取代程度将根据抗体片段上的反应位点的数目、聚合物的分子量、亲水性和其它特征、以及所选特定抗体片段衍生位点的不同而不同。通常，偶联物含有1至10个聚合物分子，但是也可考虑采用更多数目的聚合物分子与本发明的抗体片段连接。采用一个试验基质，改变时间、温度和其它反应条件以改变取代程度，然后用体积排阻层析或本领域已知的其它方法测定偶联物的聚合物取代程度，这样就很容易获得所需的衍生程度。
聚合物(如PEG)可通过各种已知的方法与抗体片段交联，其本质上是非蛋白类聚合物(如PEH)共价修饰蛋白质。然而，这些方法中的某些并不适用于本发明。氯化氰的化学机理导致了许多副反应，包括蛋白质的交联。另外，它还特别可能会导致含巯基的蛋白质被灭活。羰基二咪唑的化学作用(Beauchamp等，AnalBiochem.131,25-33[1983])需要较高的pH(＞8.5)，而这会使蛋白质灭活。而且，由于“活化的PEG”中间体会与水反应，因此需要摩尔量比蛋白质多得多的“活化的PEG”。羰基二咪唑化学机理所需的PEG高浓度还会在纯化时产生问题，对凝胶过滤层析和亲水作用层析均有不利影响。另外，高浓度的“活化的PEG”会使蛋白质沉淀，该问题本身在以前就已被注意到(Davis，美国专利No.4,179,337)。另一方面，醛的化学机理(Royer，美国专利No.4,002,531)更为有效，因为它只需要40倍摩尔过量的PEG和培育1至2小时。然而，Royer提出用于制备PEG醛的二氧化锰存在问题，因为PEG有显著的趋势与金属为基础的氧化剂形成配合物(Harris等，J.Polym.Sci.Polym.Chem.22版，341-52[1984])。采用DMSO和乙酸酐的Moffatt氧化反应避免了这个问题。另外，Royer提出的硼氢化钠必须在高pH下使用，并且有减少二硫键的明显的趋势。相反，在中性pH下有效的氰基硼氢化钠减少二硫键的趋势非常小，它是较佳的。在另一个较佳的实例中，马来酰亚胺活化的PEG用于偶联抗体片段上的游离的巯基。
用于修饰本发明抗体片段的官能化PEG聚合物得自Shearwater Polymers,Inc.(Huntsville,AL)。这些商业上可获得的PEG衍生物包括(但不局限于)氨基-PEG、PEG氨基酸酯、PEG酰肼、PEG-硫醇、PEG-琥珀酸盐、羧甲基化的PEG、PEG-丙酸、PEG氨基酸、PEG琥珀酸琥珀酰亚氨酯、PEG丙酸琥珀酰亚氨酯、羧甲基化的PEG琥珀酰亚氨酯、PEG的碳酸琥珀酰亚氨酯、氨基酸PEG的琥珀酰亚氨酯、PEG-氧羰基咪唑、PEG硝基苯基碳酸酯、PEG tresylate、PEG缩水甘油醚、PEG-醛、PEG乙烯砜、PEG-马来酰亚胺、PEG-原吡啶基-二硫化物、杂官能PEG、PEG乙烯基衍生物、PEG硅烷和PEG磷化物(phospholide)。这些PEG衍生物的偶联反应条件将根据蛋白质、PEG化所需程度以及所用PEG衍生物的不同而不同。涉及PEG衍生物选择的一些因素包括：所需的连接部位(如赖氨酸或半胱氨酸R基团)、衍生物的水解稳定性和反应性、键的毒性、抗原性、分析的适用性等。任何特定衍生物的具体使用说明可从生产商处获得。
用凝胶过滤或离子交换HPLC从未反应的起始物质分离出本发明的偶联物。以同样方式纯化分开异种类型的偶联物。
偶联物可用离子交换层析来纯化。许多亲电子活化的PEG的化学机理导致PEG化产物的氨基酸电荷减少。因此，可用高分辨力的离子交换层析来分离游离的和偶联的蛋白质，并分辨PEG化程度不同的种类。实际上，不同种类(如含有一个或两个PEG残基)也可根据未反应氨基酸的离子性质的不同来分辨。在一个实例中，根据WO 96/34015(国际专利申请号PCT/US96/05550,1996年10月31日公布)所述的方法来分辨PEG化水平不同的种类。
在一个较佳的实例中，用下述实施例的(T)部分所述的衍生处理和纯化方法来产生偶联物。
一方面，本发明提供了通过组成部分(即一个或多个抗体片段)与一个或多个聚合物分子共价连接形成的任何上述偶联物，而不问偶联物的共价分子结构的外部情况。
c．有效大小大的偶联物的其它衍生物
另一方面，可对任何上述偶联物进行修饰，使其除形成偶联物的抗体片段组分和聚合物组分外含有一种或多种组分，其中修饰不改变偶联物的基本官能性质，即与偶联物衍生来自的亲代抗体片段相比，具有显著改善的血清半衰期、MRT和/或血清清除速率。在一个实例中，本发明提供的任何上述偶联物被修饰成含有一种或多种非蛋白类官能团。例如，可对偶联物进行修饰以掺入非蛋白类标记或报道分子，例如放射性标记，包括用于医学治疗或显象或用于动物模型中的效应物功能或示踪物的任何放射性物质，如放射性同位素标记99Tc、90Y、111In、32p、14C、125I、3H、131I、11C、15O、13N、18F、35S、51Cr、57To、226Ra、60Co、59Fe、75Se、152Eu、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd、234Th、40K等，非放射性同位素标记如157Gd、55Mn、52Tr、56Fe等，荧光或化学发光标记，包括荧光团如稀土螯合物、荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、异硫氰酸盐、藻红素、藻蓝素、别藻蓝素、邻苯二醛、荧光胺、152Eu、丹磺酰、伞形酮、萤光素、发光标记、等发光(isoluminal)标记、芳族吖啶酯标记、咪唑标记、吖啶盐标记、草酸酯标记、水母发光蛋白标记、2,3-二氢二氨杂萘二酮、生物素/亲和素、旋转标记、稳定的自由基等。
可用常规方法使这些标记与偶联物的多肽抗体或聚合物组分共价结合。一方面，用任何上述非蛋白类标记衍生处理抗体片段组分来修饰本发明的任何偶联物，其中使标记直接或间接(通过偶联剂)与抗体片段相连，其中抗体片段的这种衍生处理不会将任何聚合物部分引入偶联物的分子结构中。例如，可用二醛类、碳化二亚胺、二马来酰亚胺、双咪唑(bis-imidate)、双重氮化的二氨基联苯等来将上述荧光或化学发光标记物标记到抗体片段上。例如参见，美国专利No.3,940,475(荧光计)、Morrison,Meth.Enzymol.32b,103(1974),Svyanen等,J.Biol.Chem.,284,3762(1973)和Bolton和Hunter,Biochem.J.,133,529(1973).
在采用放射性标记的实例中，可用直接和间接标记将所选放射性核素掺入偶联物。本文放射标记部分所用的术语“间接标记”和“间接标记方法”均指将螯合剂共价连接到偶联物的抗体片段部分或聚合物部分,将至少一种放射性核素插入螯合剂内。较佳的螯合剂和放射性核素列举在Srivagtava,S.C.和Mease,R.C.,"单克隆抗体标记的配体、核素和技术研究进展"，Nucl.Med.Bio.18(6)：589-603(1991)。一种特别佳的螯合剂是1-异硫氰酰苄基-3-甲基二乙烯三胺乙酸(1-isothiocycmatobenzyl-3-methyldiothelene triaminepent acetic acid)(“MX-DTPA”)。本文放射性标记部分所用的术语“直接标记”和“直接标记方法”均指放射性核素与偶联物的抗体片段部分(通常通过氨基酸残基)或聚合物部分直接共价连接。用于偶联物直接标记的较佳的放射性核素由Stivagtava和Mease(同上)提供。在一个实例中，将131I共价连接到酪氨酸残基上来直接标记偶联物。在另一个实例中，用上述任何放射性标记来直接或间接标记偶联物的抗体片段组分，其中抗体片段的这种标记方法不会将任何聚合物部分引入偶联物的分子结构中。
d．有效大小大的偶联物的治疗组合物和给药方式
本发明的偶联物可用来治疗亲代完整抗体可治疗的疾病适应征。例如，抗IL-8抗体或其片段衍生获得的偶联物可用来治疗如下文部分(Ⅱ)(5)(B)中所述的炎性疾病。利用下文部分(Ⅱ)(5)(B)中本发明抗IL-8抗体和片段制剂所述的相同步骤，可制得本发明偶联物的治疗剂。通过改变偶联物的不同药物动力学性质所需的、通常的医药知识和实践所确定的配方、剂量、给药方案、以及治疗方案的其它方面，可给予本发明的偶联物代替亲代抗体来治疗给定的疾病适应征。
e．有效大小大的偶联物作为试剂的用途
本发明的偶联物还可在动物模型中用作试剂而进行偶联物识别抗原的生物功能的体内研究。偶联物使实施者能在比本领域已知构建物长得多的时间内灭活或检测循环或组织中的关连抗原，同时从系统中排除任何Fc的作用(采用完整抗体时存在)。另外，采用Wei等，Int.Archs.Allergy Appl.Immunol.,64：84-99(1981)的过敏原耐受化方法，本发明偶联物半衰期的增加有助于在测试动物中诱导对未衍生处理抗体片段的耐受性，从而使实施者能用未衍生处理的亲代抗体片段重复攻击耐受动物，而不会产生抗亲代片段的免疫应答。
2．人源化的6G4.2.5单克隆抗体和抗体片段
在一个实例中，本发明提供了包含重链的抗体片段或全长抗体，此重链包含图37A-37B的人源化抗IL-8 6G4.2.5v11重链多肽氨基酸序列(SEQ ID NO：75)的氨基酸1-230(在这里称为“6G4.2.5HV11”)。
本发明包括含有6G4.2.5HV11、有或没有附加氨基酸序列的单链抗体片段.在一个实例中，本发明提供的单链抗体片段包含6G4.2.5HV11，且没有伴随的轻链氨基酸序列，即单链的种类组成了Fab抗体的一半。
本文另外提供的抗体或抗体片段含有6G4.2.5HV11，它还含有轻链，该轻链包含图31B的人源化抗IL-8 6G4.2.5v11轻链多肽氨基酸序列(SEQ ID NO：65)的氨基酸1-219(这里称为“6G4．2.5LV11”)。
在一个实例中，本发明提供了一种单链抗体片段，该单链多肽中含有6G4.2.5HV11和6G4.2.5LV11。在一个较佳的实例中，单链抗体片段含有的6G4.2.5HV11通过柔韧的肽接头序列与6G4.2.5LV11相连，其中重链和轻链区可以缔合成类似于双链Fab中形成的“二聚体”结构。在另一个实例中，单链抗体片段含有的6G4.2.5HV11通过接头与6G4.2.5LV11连接，该接头太短，不能使互补区发生分子内配对，而使单链多肽单体与另一个单体通过二聚化形成二抗体。
在另一个实例中，本发明提供的抗体片段包含多个多肽链，其中一个多肽链包含6G4.2.5HV11，第二个多肽链包含6G4.2.5LV11，这两个多肽链通过一个或多个链内二硫键共价连接。在一个较佳的实例中，前述有两个链的抗体片段选自Fab、Fab＇、Fab＇-SH和F(ab＇)2。
本发明另外提供的抗体或抗体片段包括含有6G4.2.5HV11的重链，并任选地还包括含有6G4.2.5LV11的轻链，其中重链以及任选的轻链与附加部分(如附加的免疫球蛋白恒定区序列)融合。可将恒定区序列加入重链和/或轻链中形成全长或部分长的重链和/或轻链。应当理解，任何同种型的恒定区可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，这些恒定区可从任何人或动物种类获得。较佳的，恒定区序列是人来源。合适的人恒定区序列可从Kabat等(同上)获得。
在一个较佳的实例中，抗体或抗体片段包含与酪氨酸拉链序列融合的重链中的6G4.2.5HV11，或含有亮氨酸拉链序列。亮氨酸拉链可增加感兴趣的抗体或抗体片段的亲和力和/或生产效率。合适的亮氨酸拉链序列包括Kostenlney等在J.Immunol.，148：1547-1553(1992)提到的jun和fos亮氨酸拉链和下述实施例中所述GCN4亮氨酸拉链。在一个较佳的实例中，抗体或抗体片段包含C端与GCN4亮氨酸拉链融合的6G4.2.5HV11，以产生图37A-37B的重链多肽氨基酸序列(SEQ IDNO：75)的氨基酸1-275(这里称为“6G4.2.5HV11 GCN4”)。
3．人源化的6G4.2.5单克隆抗体和抗体片段的变体
本发明还包括的人源化抗IL-8单克隆抗体和抗体片段包括6G4.2.5互补决定区(CDR)的变体或6G4.2.5v11可变区的变体，它表现出对人IL-8有更高的亲和力和/或在重组生产过程中效率较高的性质。
A.6G4.2.5LV变体
一方面，本发明提供的人源化的抗IL-8单克隆抗体和抗体片段包含图24的6G4.2.5轻链可变区氨基酸序列的互补决定区(这里称为“6G4.2.5LV的CDR”)L1、L2和L3，其中L1对应图24氨基酸序列的氨基酸24-39，L2对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸55-61，L3对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸94-102。在一个实例中，本发明提供了变体6G4.2.5人源化抗体或抗体片段，它们包含6G4.2.5LV CDR变体(这里称为“6G4.2.5LV/L1N35X35”)，其中L1对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸24-39(条件是氨基酸35位的Asn被非Asn氨基酸(称为“X35”)取代)，L2对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸55-61，L3对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸94-102。
此外，本发明提供了变体6G4.2.5人源化抗体或抗体片段，它们包含一个人源化的轻链可变区，该区含有图24(SEQ ID NO：48)6G4.2.5轻链可变区氨基酸序列的互补决定区L1、L2和L3的一个变体(这里称为6G4.2.5LV CDR变体)。在一个较佳的实例中，本发明提供了变体6G4.2.5人源化抗体或抗体片段，它们包含6G4.2.5LV CDR变体(这里称为“6G4.2.5LV/L1N35A”)，其中L1对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸24-39(条件是氨基酸35位Asn被Ala取代)，L2对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸55-61，L3对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸94-102。在另一个较佳的实例中，本发明提供了变体6G4.2.5人源化抗体或抗体片段，它们包含6G4.2.5LV CDR变体(这里称为“6G4.2.5LV/L1N35E”)，其中L1对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸24-39(条件是氨基酸35位Asn被Glu取代)，L2对应图24氨基酸序列(SEQID NO：48)的氨基酸55-61，L3对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸94-102。
第二方面，本发明提供了变体6G4.2.5人源化抗体或抗体片段，它们包含6G4.2.5LV CDR变体(这里称为“6G4.2.5LV/L1S26X26”)，其中L1对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸24-39(条件是氨基酸26位的Ser被非Ser氨基酸(称为“X26”)取代)，L2对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸55-61，L3对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸94-102。在一个较佳的实例中，本发明提供了变体6G4.2.5人源化抗体或抗体片段，它们包含6G4.2.5LVCDR变体(这里称为“6G4.2.5LV/L1S26A”)，其中L1对应图24氨基酸序列(SEQID NO：48)的氨基酸24-39(条件是氨基酸26位的Ser被Ala取代)，L2对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸55-61，L3对应图24氨基酸序列(SEQ IDNO：48)的氨基酸94-102。
第三方面，本发明提供了变体6G4.2.5人源化抗体或抗体片段，它们包含6G4.2.5LV CDR变体(这里称为“6G4.2.5LV/L3H98X98”)，其中L1对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸24-39，L2对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸55-61，L3对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸94-102(条件是氨基酸98位的His被非His氨基酸(称为“X98”)取代)。在一个较佳的实例中，本发明提供了变体6G4.2.5人源化抗体或抗体片段，它们包含6G4.2.5LV CDR变体(这里称为“6G4.2.5LV/L3H98A”)，其中L1对应图24氨基酸序列(SEQ IDNO：48)的氨基酸24-39，L2对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸55-61，L3对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸94-102(条件是氨基酸98位的His被Ala取代)。
第四方面，本发明提供了变体6G4.2.5人源化抗体或抗体片段，它们包含6G4.2.5LV CDR变体(这里称为“6G4.2.5LV/L1 S26X26,N35X35”)，其中L1对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸24-39(条件是氨基酸26位的Ser被非Ser氨基酸(称为“X26”)取代，氨基酸35位的Asn被非Asn氨基酸(称为“X35”)取代)，L2对应图24氨基酸序列(SEQID NO：48)的氨基酸55-61，L3对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸94-102。在一个较佳的实例中，本发明提供了变体6G4.2.5人源化抗体或抗体片段，它们包含6G4.2.5LV CDR变体(这里称为“6G4.2.5LV/L1S26A，N35A”)，其中L1对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸24-39(条件是氨基酸26位的Ser被Ala取代，氨基酸35位的Asn被Ala取代)，L2对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸55-61，L3对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸94-102。
第五方面，本发明提供了变体6G4.2.5人源化抗体或抗体片段，它们包含6G4.2.5LV CDR变体(这里称为“6G4.2.5LV/L1N35X35/L3H98X98”)，其中L1对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸24-39(条件是氨基酸35位的Asn被非Asn氨基酸(称为“X35”)取代)，L2对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸55-61，L3对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸94-102(条件是氨基酸98位的His被非His氨基酸(称为“X98”)取代)。在一个较佳的实例中，本发明提供了变体6G4.2.5人源化抗体或抗体片段，它们包含6G4.2.5LV CDR变体(这里称为“6G4.2.5LV/L1N35A/L3H98A”)，其中L1对应图24氨基酸序列(SEQID NO：48)的氨基酸24-39(条件是氨基酸35位的Asn被Ala取代)，L2对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸55-61，L3对应图24氨基酸序列(SEQ IDNO：48)的氨基酸94-102(条件是氨基酸98位的His被Ala取代)。
第六方面，本发明提供了变体6G4.2.5人源化抗体或抗体片段，它们包含6G4.2.5LV CDR变体(这里称为“6G4.2.5LV/L1S26X26/L3H98X98”)，其中L1对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸24-39(条件是氨基酸26位的Ser被非Ser氨基酸(称为“X26”)取代)，L2对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸55-61，L3对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸94-102(条件是氨基酸98位的His被非His氨基酸(称为“X98”)取代)。在一个较佳的实例中，本发明提供了变体6G4.2.5人源化抗体或抗体片段，它们包含6G4.2.5LV CDR变体(这里称为“6G4.2.5LV/L1S26A/L3H98A”)，其中L1对应图24氨基酸序列(SEQID NO：48)的氨基酸24-39(条件是氨基酸26位的Ser被Ala取代)，L2对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸55-61，L3对应图24氨基酸序列(SEQ IDNO：48)的氨基酸94-102(条件是氨基酸98位的His被Ala取代)。
第七方面，本发明提供了变体6G4.2.5人源化抗体或抗体片段，它们包含6G4.2.5LV CDR变体(这里称为“6G4.2.5LV/L1S26X26,N35X35/L3H98X98”)，其中L1对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸24-39(条件是氨基酸26位的Ser被非Ser氨基酸(称为“X26”)取代，氨基酸35位的Asn被非Asn氨基酸(称为“X35”)取代)，L2对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸55-61，L3对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸94-102(条件是氨基酸98位的His被非His氨基酸(称为“X98”)取代)。在一个较佳的实例中，本发明提供了变体6G4.2.5人源化抗体或抗体片段，它们包含6G4.2.5LV CDR变体(这里称为“6G4.2.5LV/L1S26A,N35A/L3H98A”)，其中L1对应图24氨基酸序列(SEQ IDNO：48)的氨基酸24-39(条件是氨基酸26位的Ser被Ala取代，氨基酸35位的Asn被Ala取代)，L2对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸55-61，L3对应图24氨基酸序列(SEQ ID NO：48)的氨基酸94-102(条件是氨基酸98位的His被Ala取代)。
本发明的人源化轻链可变区可用本领域已知的抗体人源化的任何技术来构建。人源化基本上可根据Winter及其合作者(Jones等，Nature,321：522(1986)；Riechmann等，Nature,332：323(1988)；Verhoeyen等，Science,239：1534(1988))所述的方法进行，用6G4.2.5LV的CDR或6G4.2.5LV CDR变体的CDR取代人抗体轻链可变区的对应序列。因此，这些含有6G4.2.5LV的CDR或6G4.2.5VL CDR变体的CDR的“人源化”衍生物是嵌合抗体(Cabilly等，同上)。包含6G4.2.5LVCDR或6G4.2.5LV CDR变体的CDR的人源化轻链可变区还含有一些FR残基，这些残基被小鼠6G4.2.5抗体轻链可变区(“6G4.2.5LV”)中类似位点的残基所取代。6G4.2.5LV的全部氨基酸序列组成图24氨基酸序列的氨基酸1-114(SEQID NO：48)。
本发明还提供了一种人源化的抗体或抗体片段，它们包含的人源化轻链可变区含有上述6G4.2.5LV的CDR或6G4.2.5LV CDR变体的CDR，另外包含的人源化重链可变区包含图25中6G4.2.5(小鼠单克隆抗体)重链可变区氨基酸序列的互补决定区(CDR)H1、H2和H3(SEQ ID NO：50)，其中H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111。上述6G4.2.5重链可变区(“6G4.2.5HV”)的H1、H2和H3 CDR统称为“6G4.2.5HV的CDR”。
在另一个实例中，本发明提供了人源化的抗体或抗体片段，它们包含的人源化轻链可变区包含上述的6G4.2.5LV的CDR或6G4.2.5LV CDR变体的CDR，另外包括的人源化重链可变区包含图25中6G4.2.5(小鼠单克隆抗体)重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的H1、H2和H3 CDR的变体(这里称为“6G4.2.5HVCDR变体”)。在一个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31Z31”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z31”)取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQIDNO：50)的氨基酸50-66，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111。在一个较佳的6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31A”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被Ala取代)， H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111。
在第二个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H2S54Z54”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z54”)取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111。在一个较佳的6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H2S54A”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被Ala取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111。
在第三个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H3D100E”)中，其中H1对应图25氨基酸序列(SEQID NO：50)的氨基酸26-35，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代)。
在第四个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H3R102K”)中，其中H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸102位的Arg被Lys取代)。
在第五个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H3D106E”)中，其中H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸106位的Asp被Glu取代)。
在第七个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H3D100E,R102K)中，其中H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66，H3对应图25氨基酸序列(SEQID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代，氨基酸102位的Arg被Lys取代)。
在第八个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H3R102K,D106E”)中，其中H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66，H3对应图25氨基酸序列(SEQID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸102位的Arg被Lys取代，氨基酸106位的Asp被Glu取代)。
在第九个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H3D100E,D106E”)中，其中H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66，H3对应图25氨基酸序列(SEQID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代，氨基酸106位的Asp被Glu取代)。
在第10个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H3D100E,R012K,D106E”)中，其中H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代，氨基酸102位的Arg被Lys取代，氨基酸106位的Asp被Glu取代)。
在第11个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z31”)取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z54”)取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111。在一个较佳的6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被Ala取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被Ala取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111。
在第12个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3D100E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z31”)取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代)。在一个较佳的6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31A/H3D100E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被Ala取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代)。
在第13个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S3IZ31/H3R102K”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31-位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z31”)取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66，H3对应图25氨基酸序列(SEQID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸102位的Arg被Lys取代)。在一个较佳的6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31A/H3R102K”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被Ala取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸102位的Arg被Lys取代)。
在第14个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3D106E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z31”)取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸106位的Asp被Glu取代)。在一个较佳的6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31A/H3D106E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被Ala取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸106位的Asp被Glu取代)。
在第15个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3D100E,R102K”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z31”)取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代，氨基酸102位的Arg被Lys取代)。在一个较佳的6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31A/H3D100E,R102K”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ IDNO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被Ala取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代，氨基酸102位的Arg被Lys取代)。
在第16个6G4.2.5HVCDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3R102K,D106E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z31”)取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸102位的Arg被Lys取代，氨基酸106位的Asp被Glu取代)。在一个较佳的6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31A/H3R102K,D106E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ IDNO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被Ala取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQID NO：50)的氨基酸50-66，H3对应图25氨基酸序列(SEQID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸102位的Arg被Lys取代，氨基酸106位的Asp被Glu取代)。
在第17个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3D100E，D106E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z31”)取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代，氨基酸106位的Asp被Glu取代)。在一个较佳的6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31A/H3D100E,D106E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ IDNO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被Ala取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代，氨基酸106位的Asp被Glu取代)。
在第18个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3D100E,R102K,D106E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z31”)取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代，氨基酸102位的Arg被Lys取代，氨基酸106位的Asp被Glu取代)。在一个较佳的6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31A/H3D100E,R102K,D106E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被Ala取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQID NO：50)的氨基酸50-66，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代，氨基酸102位的Arg被Lys取代，氨基酸106位的Asp被Glu取代)。
在第19个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3D100E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z54”)取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代)。在一个较佳的6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H2S54A/H3D100E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35，H2对应图25氨基酸序列(SEQID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被Ala取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代)。
在第20个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3R102K”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z54”)取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸102位的Arg被Lys取代)。在一个较佳的6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H2S54A/H3R102K”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35，H2对应图25氨基酸序列(SEQID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被Ala取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸102位的Arg被Lys取代)。
在第21个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3D106E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z54”)取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸106位的Asp被Glu取代)。在一个较佳的6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H2S54A/H3D106E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35，H2对应图25氨基酸序列(SEQID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被Ala取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸106位的Asp被Glu取代)。
在第22个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3D100E,R102K”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQID NO：50)的氨基酸26-35，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z54”)取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代，氨基酸102位的Arg被Lys取代)。在一个较佳的6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H2S54A/H3D100E,R102K”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ IDNO：50)的氨基酸26-35，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被Ala取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ IDNO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代，氨基酸102位的Arg被Lys取代)。
在第23个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/-H2S54Z54/H3R1 02K,D106E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z54”)取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸102位的Arg被Lys取代，氨基酸106位的Asp被Glu取代)。在一个较佳的6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H2S54A/H3R102K,D106E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ IDNO：50)的氨基酸26-35，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被Ala取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ IDNO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸102位的Arg被Lys取代，氨基酸106位的Asp被Glu取代)。
在第24个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3D100E,D106E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQID NO：50)的氨基酸26-35，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z54”)取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代，氨基酸106位的Asp被Glu取代)。在一个较佳的6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H2S54A/H3D100E,D106E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ IDNO：50)的氨基酸26-35，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被Ala取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ IDNO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代，氨基酸106位的Asp被Glu取代)。
在第25个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3D100E,R102K,D106E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z54”)取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代，氨基酸102位的Arg被Lys取代，氨基酸106位的Asp被Glu取代)。在一个较佳的6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H2S54A/H3D100E,R102K,D106E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35，H2对应图25氨基酸序列(SEQID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被Ala取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代，氨基酸102位的Arg被Lys取代，氨基酸106位的Asp被Glu取代)。
在第26个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1 S31Z31/IH2S54Z54/H3D100E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z31”)取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z54”)取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代)。在一个较佳的6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被Ala取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被Ala取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代)。
在第27个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3R102K”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z31”)取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z54”)取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸102位的Arg被Lys取代)。在一个较佳的6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3R102K”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被Ala取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被Ala取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸102位的Arg被Lys取代)。
在第28个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D106E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z31”)取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z54”)取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸106位的Asp被Glu取代)。在一个较佳的6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3D106E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被Ala取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被Ala取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸106位的Asp被Glu取代)。
在第29个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E,R102K”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z31”)取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z54”)取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代，氨基酸102位的Arg被Lys取代)。在一个较佳的6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S3IA/H2S54A/H3D100E,R102K”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被Ala取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被Ala取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代，氨基酸102位的Arg被Lys取代)。
在第30个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3R102K,D106E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z31”)取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z54”)取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸102位的Arg被Lys取代，氨基酸106位的Asp被Glu取代)。在一个较佳的6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3R102K,D106E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被Ala取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被Ala取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸102位的Arg被Lys取代，氨基酸106位的Asp被Glu取代)。
在第31个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E,D106E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z31”)取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z54”)取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代，氨基酸106位的Asp被Glu取代)。在一个较佳的6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E,D106E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被Ala取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被Ala取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代，氨基酸106位的Asp被Glu取代)。
在第32个6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E,R102K,D106E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z31”)取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被非Ser氨基酸(称为“Z54”)取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代，氨基酸102位的Arg被Lys取代，氨基酸106位的Asp被Glu取代)。在一个较佳的6G4.2.5HV CDR变体(这里称为“6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E,R102K,D106E”)中，H1对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸26-35(条件是氨基酸31位的Ser被Ala取代)，H2对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸50-66(条件是氨基酸54位的Ser被Ala取代)，H3对应图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸99-111(条件是氨基酸100位的Asp被Glu取代，氨基酸102位的Arg被Lys取代，氨基酸106位的Asp被Glu取代)。
在如上所述的轻链可变区人源化时，通过用6G4.2.5HV的CDR或6G4.2.5HVCDR变体的CDR替代人重链可变区的对应序列来构建人源化的重链可变区。包含6G4.2.5HV的CDR或6G4.2.5HV CDR变体的CDR的人源化重链可变区还可含有一些FR残基，这些残基被小鼠6G4.2.5抗体重链可变区类似部位的残基代替。6G4.2.5HV的完整的氨基酸序列为图25氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的氨基酸1-122。
用于制备人源化抗体和抗体片段的人轻链和重链可变区的选择对于减少抗原性来说很重要。根据所谓的“最佳匹配”方法，用啮齿动物抗体的可变区序列筛选已知的人可变区序列全部文库。将最接近啮齿动物序列的人序列作为人源化抗体的人构架(FR)(Sims等，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一种方法采用的特定构架衍生自轻链或重链特定亚组的所有人抗体的共有序列。同一构架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.151：2623(1993))。
本发明的抗体和抗体片段在人源化时应保留对人IL-8的高亲和力和其它有利的生物学性质，这也很重要。为了实现这一目的，制备本发明的人源化抗体和抗体片段的一个较佳的方法是用亲代和人源化序列的三维模型分析亲代序列和各种概念上的人源化产物。免疫球蛋白三维模型是可获得的，并且是本领域技术人员所熟知的。描述和展示所选候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序是可以获得的。观察了这些展示就可分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中起的作用，即，能分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原能力的残基。这样，就可从共有序列和亲代序列中选出FR残基并联合之，从而达到所需的抗体特性(如对靶抗原的亲和力提高)。
包含6G4.2.5LV CDR的所有人源化轻链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5LV”。
包含6G4.2.5LV/L1N35X35 CDR的所有人源化轻链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5LV/L1N35X35”。
包含6G4.2.5LV/L1N35A CDR的所有人源化轻链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5LV/L1N35A”。
包含6G4.2.5LV/L1N35E CDR的所有人源化轻链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5LV/L1N35E”。
包含6G4.2.5LV/L1S26X26 CDR的所有人源化轻链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5LV/L1S26X26”。
包含6G4.2.5LV/L1S26A CDR的所有人源化轻链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5LV/L1S26A”。
包含6G4.2.5LV/L3H98X98 CDR的所有人源化轻链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5LV/L3H98X98”。
包含6G4.2.5LV/L3H98A CDR的所有人源化轻链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5LV/L3H98A”。
包含6G4.2.5LV/L1S26X26，-N35X35 CDR的所有人源化轻链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5LV/L1 S26X26,N35X35”。
包含6G4.2.5LV/L1S26A,N35A CDR的所有人源化轻链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5LV/L1 S26A,N35A”。
包含6G4.2.5LV/L1N35X35/L3H98X98 CDR的所有人源化轻链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5LV/L1N35X35/L3H98X98”。
包含6G4.2.5LV/L1N35A/L3H98A CDR的所有人源化轻链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5LV/L1N35A/L3H98A”。
包含6G4.2.5LV/L1S26X26/L3H98X98 CDR的所有人源化轻链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5LV/L1S26X26/L3H98X98”。
包含6G4.2.5LV/L1S26A/L3H98A CDR的所有人源化轻链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5LV/L1S26A/L3H98A”。
包含6G4.2.5LV/L1 S26X26,N35X35/L3H98X98 CDR的所有人源化轻链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5LV/L1 S26X26,N35X35/L3H98X98”。
包含6G4.2.5LV/L1S26A,N35A/L3H98A CDR的所有人源化轻链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5LV/L1 S26A,N35A/L3H98A”。
hu6G4.2.5LV/L1N35X35、hu6G4.2.5LV/L1 S26X26、hu6G4.2.5LV/L1S26X26/L3H98X98、hu6G4.2.5LV/L1 S26X26,N35X35、hu6G4.2.5LV/L1N35X35/L3H98X98、hu6G4.2.5LV/L1S26X26/L3H98X98和hu6G4.2.5LV/L1 S26X26,N35X35/L3H98X98的人源化轻链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5LV/vL1-3X”。
hu6G4.2.5LV/L1N35A、hu6G4.2.5LV/L1 S26A、hu6G4.2.5LV/L1S26A/L3H98A、hu6G4.2.5LV/L1 S26A,N35A、hu6G4.2.5LV/L1N35A/L3H98A、hu6G4.2.5LV/L1S26A/L3H98A和hu6G4.2.5LV/L1 S26A,N35A/L3H98A的人源化轻链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5LV/vL1-3A”。
包含6G4.2.5HV CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV”。
包含6G4.2.5HV/H1S31Z31 CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31Z31”。
包含6G4.2.5HV/H1S31A CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31A”。
包含6G4.2.5HV/H2S54Z54 CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H2S54Z54”。
包含6G4.2.5HV/H2S54A CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H2S54A”。
包含6G4.2.5HV/H3D100E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H3D100E”。
包含6G4.2.5HV/H3R102K CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H3R102K”。
包含6G4.2.5HV/H3D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H3D106E”。
包含6G4.2.5HV/H3D100E,R102K CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H3D100E,R102K”。
包含6G4.2.5HV/H3R102K,D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H3R102K.D106E”。
包含6G4.2.5HV/H3D100E,D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H3D100E,D106E”。
包含6G4.2.5HV/H3D100E,R102K,D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H3D100E,R102K,D106E”。
包含6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54 CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54”。
包含6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3D100E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3D100E”。
包含6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3R102K CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3R102K”。
包含6G4.2.5HV/H1S31Z31/-H3D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3D106E”。
包含6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3D100E,R102K CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3D100E,R102K”。
包含6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3R102K,D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3R102K,D106E”。
包含6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3D100E,D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3D100E,D106E”。
包含6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3D100E,R102K,D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3D100E,R102K,D106E”。
包含6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3D100E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3D100E”。
包含6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3R102K CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3R102K”。
包含6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3D106E”。
包含6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3R102K，D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3R102K,D106E”。
包含6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3D100E,D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3D100E,D106E”。
包含6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3D100E,R102K,D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3D100E,R102K,D106E”。
包含6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E”。
包含6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3R102K CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3R102K”。
包含6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D106E”。
包含6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E,R102K CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E,R102K”。
包含6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3R102K,D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3R102K，D106E”。
包含6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E,D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E,D106E”。
包含6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E,R102K,D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E,R102K,D106E”
包含6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A”。
包含6G4.2.5HV/H1S31A/H3D100E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31A/H3D100E”。
包含6G4.2.5HV/H1S31A/H3R102K CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31A/H3R102K”。
包含6G4.2.5HV/H1S31A/H3D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31A/H3D106E”。
包含6G4.2.5HV/H1S31A/H3D100E,R102K CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31A/H3D100E,R102K”。
包含6G4.2.5HV/H1S31A/H3R102K,D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31A/H3R102K,D106E”。
包含6G4.2.5HV/H1S31A/H3D100E,D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31A/H3D100E,D106E”。
包含6G4.2.5HV/H1S31A/H3D100E,R102K,D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1 S31A/H3D100E,R102K,D106E”。
包含6G4.2.5HV/H2S54A/H3D100E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H2S54A/H3D100E”。
包含6G4.2.5HV/H2S54A/H3R102K CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H2S54A/H3R102K”。
包含6G4.2.5HV/H2S54A/H3D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H2S54A/H3D106E”。
包含6G4.2.5HV/H2S54A/H3R102K,D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H2S54A/H3R102K,D106E”。
包含6G4.2.5HV/H2S54A/H3D100E,D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H2S54A/H3D100E,D106E”。
包含6G4.2.5HV/H2S54A/H3D100E,R102K,D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H2S54A/H3D100E,R102K,D106E”。
包含6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E”。
包含6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3R102K CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3R102K”。
包含6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3D106E”。
包含6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E,R102K CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E,R102K”。
包含6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3R102K,D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3R102K,D106E”。
包含6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E,D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E,D106E”。
包含6G4.2.5HV/H1 S31A/H2S54A/H3D100E,R102K,D106E CDR的所有人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E,R102K,D106E”。
hu6G4.2.5HV/H1S31Z31、hu6G4.2.5HV/H2S54Z54、hu6G4.2.5HV/H3D100E、hu6G4.2.5HV/H3R102K、hu6G4.2.5HV/H3D106E、hu6G4.2.5HV/H3D100E，R102K、hu6G4.2.5HV/H3R102K,D106E、hu6G4.2.5HV/H3D100E,D106E、hu6G4.2.5HV/D100E,R102K,D106E、hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54、hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3D100E、hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3R102K、hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3D106E、hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3D100E，R102K、hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3R102K,D106E、hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3D100E，D106E、hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H3D100E,R102K,D106E、hu6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3D100E、hu6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3R102K、hu6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3D106E、hu6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3R102K,D106E、hu6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3D100E,D106E、hu6G4.2.5HV/H2S54Z54/H3D100E,R102K,D106E、hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E、hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3R102K、hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D106E、hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E,R102K、hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/R102K,D106E、hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E,D106E、hu6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54/H3D100E,R102K,D106E的人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/vH1-3Z”。
hu6G4.2.5HV/H1S31A、hu6G4.2.5HV/H2S54A、hu6G4.2.5HV/H3D100E、hu6G4.2.5HV/H3R102K、hu6G4.2.5HV/H3D106E、hu6G4.2.5HV/H3D100E,R102K、hu6G4.2.5HV/H3R102K,D106E、hu6G4.2.5HV/H3D100E,D106E、hu6G4.2.5HV/D100E,R102K,D106E、hu6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A、hu6G4.2.5HV/H1S31A/H3D100E、hu6G4.2.5HV/H1S31A/H3R102K、hu6G4.2.5HV/H1S31A/H3D106E、hu6G4.2.5HV/H1S31A/H3D100E,R102K、hu6G4.2.5HV/H1S31A/H3R102K,D106E、hu6G4.2.5HV/H1S31A/H3D100E,D106E、hu6G4.2.5HV/H1S31A/H3D100E,R102K,D106E、hu6G4.2.5HV/H2S54A/H3D100E、hu6G4.2.5HV/H2S54A/H3R102K、hu6G4.2.5HV/H2S54A/H3D106E、hu6G4.2.5HV/H2S54A/R102K,D106E、hu6G4.2.5HV/H2S54A/H3D100E,D106E、hu6G4.2.5HV/H2S54A/H3D100E,R102K, D106E、hu6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E、hu6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3R102K、hu6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3D106Ehu6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E,R102K、hu6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3R102K,D106E、hu6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E,D106E和hu6G4.2.5HV/H1S31A/H2S54A/H3D100E,R102K,D106E的人源化重链可变区氨基酸序列在本文统称为“hu6G4.2.5HV/vH1-3A”。
本发明提供了一种人源化抗体或抗体片段，它们所含的轻链可变区包含hu6G4.2.5LV/vL1-3X。在另一实施方案中，本发明提供了一种人源化抗体或抗体片段，它们所含的轻链可变区包含hu6G4.2.5LV/vL1-3A。在另一实施方案中，本发明提供的人源化抗体或抗体片段所含的轻链可变区包含hu6G4.2.5LV/L1N35X35。在另一实施方案中，本发明提供的人源化抗体或抗体片段所含的轻链可变区包含hu6G4.2.5LV/L1N35A。在另一实施方案中，本发明提供的人源化抗体或抗体片段所含的轻链可变区包含hu6G4.2.5LV/L1N35E。
本发明还提供一种人源化抗体或抗体片段，它们含有的轻链可变区包含hu6G4.2.5LV/vL1-3X，并且另含有的重链可变区包含hu6G4.2.5HV或hu6G4.2.5HV/vH1-3Z。在另一实施方案中，本发明提供的人源化抗体或抗体片段所含的轻链可变区包含hu6G4.2.5LV/vL1-3A，并且另含有的重链可变区包含hu6G4.2.5HV或hu6G4.2.5HV/vH1-3Z。在另一实施方案中，本发明提供的人源化抗体或抗体片段所含的轻链可变区包含hu6G4.2.5LV/vL1-3A，并且另含有的重链可变区包含hu6G4.2.5HV/vH1-3A。
在另一实施方案中，本发明提供了一种人源化抗体或抗体片段，它们所含的轻链可变区包含hu6G4.2.5LV/L1N35X35，并且另含有的重链可变区包含hu6G4.2.5HV或hu6G4.2.5HV/vH1-3Z。在另一实施方案中，本发明提供的人源化抗体或抗体片段所含的轻链可变区包含hu6G4.2.5LV/N35X35，并且另含有的重链可变区包含hu6G4.2.5HV/vH1-3A。在一优选实施方案中，该抗体或抗体片段所含的轻链可变区包含hu6G4.2.5LV/L1N35X35，并且另含有的人源化重链包含6G4.2.5HV11的氨基酸序列。
在另一实施方案中，本发明提供了一种人源化抗体或抗体片段，它们所含的轻链可变区包含含hu6G4.2.5LV/L1N35A，并且另含有的重链可变区包含hu6G4.2.5HV或hu6G4.2.5HV/vH1-3Z。在另一实施方案中，本发明提供了一种人源化抗体或抗体片段，它们所含的轻链可变区包含hu6G4.2.5LV/N35A，并且另含有的重链可变区包含hu6G4.2.5HV/vH1-3A。在另一实施方案中，人源化抗体或抗体片段所含的轻链可变区包含hu6G4.2.5LV/L1N35A，并且另含有的重链可变区包含hu6G4.2.5HV。在另一实施方案中，该人源化抗体或抗体片段所含的轻链可变区包含hu6G4.2.5LV/L1N35E，并且另含有的重链可变区包含hu6G4.2.5HV。在一优选实施方案中，该抗体或抗体片段所含的轻链可变区包含hu6G4.2.5LV/L1N35A，并且另含有的重链可变区包含hu6G4.2.5HV11的氨基酸序列。在另一优选实施方案中，该抗体或抗体片段所含的轻链可变区包含hu6G4.2.5LV/L1N35E，并且另含有的人源化重链包含hu6G4.2.5HV11的氨基酸序列。
本发明包括一种单链抗体片段，它含有hu6G4.2.5LV/vL1-3X，另外还含有或不含有其他氨基酸序列。在一实施方案中，本发明提供了一种单链抗体片段，含有hu6G4.2.5LV/vL1-3X，不结合重链可变区氨基酸序列，即一种组成Fv片段一半的单链抗体。在另一实施方案中，本发明提供一种单链抗体片段，包含hu6G4.2.5LV/vL1-3A，不结合重链可变区的氨基酸序列。在另一实施方案中，本发明提供的单链抗体片段含有hu6G4.2.5LV/L1N35X35，不结合重链可变区的氨基酸序列。在一优选实施方案中，本发明提供的单链抗体片段包含hu6G4.2.5LV/L1N35A，不结合重链可变区氨基酸序列。在另一优选实施方案中，本发明提供的单链抗体片段包含hu6G4.2.5LV/L1N35E，不结合重链可变区氨基酸序列。
在一实施方案中，本发明提供了一种单链抗体片段，其中hu6G4.2.5LV/vL1-3X和hu6G4.2.5HV或hu6G4.2.5HV/vH1-3Z包含在一条单链多肽中。在一优选实施方案中，该单链抗体片段是一种scFv，它所含的hu6G4.2.5LV/vL1-3X，通过一韧性肽接头序列与hu6G4.2.5HV或hu6G4.2.5HV/vH1-3Z连接，其中的重链和轻链可变区可以结合成类似双链Fv的“二聚体”结构。在另一实施方案中，该单链抗体片段所含的hu6G4.2.5LV/vL1-3X通过一段接头与hu6G4.2.5HV或hu6G4.2.5HV/vH1-3Z连接，因该接头太短使得两个可变区无法分子内配对，而致一个单链多肽单体，与另一单体进行二聚反应形成二抗体(diabody)。
在另一实施方案中，本发明提供了一种单链抗体片段，其中的hu6G4.2.5LV/vL1-3A和hu6G4.2.5HV或hu6G4.2.5HV/vH1-3Z被包含在同一单键多肽内。在一优选实施方案中，该单链抗体片段是一种scFv，它所含的hu6G4.2.5LV/vL1-3A通过一韧性肽接头序列与hu6G4.2.5HV或hu6G4.2.5HV/vH1-3Z连接，其中的重链和轻链可变区可以结合成类似于双链Fv的“二聚体”结构。在另一实施方案中，该单链抗体片段包含的hu6G4.2.5LV/vL1-3A通过一段接头与hu6G4.2.5HV或hu6G4.2.5HV/vH1-3Z连接，因该接头太短，使得两可变区无法分子内配对，而致一个单链多肽单体，与另一单体二聚反应形成二抗体。
在另一实施方案中，本发明提供了一种单链抗体片段，其中的hu6G4.2.5LV/vL1-3A与hu6G4.2.5HV/vH1-3A包含在同一单链多肽内。在一优选实施方案中，该单链抗体片段是一种scFv，它所含的hu6G4.2.5LV/vL1-3A通过一段韧性肽接头序列与hu6G4.2.5HV/vH1-3A连接，其中的重链和轻链可变区可以结合成类似于双链Fv的“二聚体”结构。在另一实施方案中，该单链抗体所含的hu6G4.2.5LV/vL1-3A通过一段接头与hu6G4.2.5HV/vH1-3A连接。因该接头太短使得两可变区无法分子内配对，而致一个单链多肽单体，与另一单体二聚反应形成二抗体。
在另一实施方案中，本发明提供了一种单链抗体片段，其中的hu6G4.2.5LV/L1N35X35与hu6G4.2.5HV或hu6G4.2.5HV/vH1-3Z包含在同一多肽链内。在优选实施方案中，该单链抗体片段是一种scFv，它所含的hu6G4.2.5LV/L1N35X35通过一段韧性肽接头序列与hu6G4.2.5HV或hu6G4.2.5HV/vH1-3Z连接，其中的重链和轻链可变区可以结合成类似于双链Fv中的“二聚体”结构。在另一实施方案中，该单链抗体片段含有的hu6G4.2.5LV/L1N35X35通过一段接头与hu6G4.2.5HV或hu6G4.2.5HV/vH1-3Z连接，因该接头很短，使得两个可变区无法分子内配对，而致一个单链多肽单体，与另一单体二聚反应形成二抗体。
在另一实施方案中，本发明提供了一种单链抗体片段，其中的hu6G4.2.5LV/L1N35X35与hu6G4.2.5HV/vH1-3A包含在同一条多肽链内。在一优选实施方案中，该单链抗体片段是一种scFv，所含的hu6G4.2.5LV/L1N35X35通过一段韧性肽接头序列与hu6G4.2.5HV/vH1-3A连接，其中的重链和轻链可变区可以结合成类似于双链Fv中的“二聚体”结构。在另一实施方案中，该单链抗体片段含有的hu6G4.2.5LV/L1N35X35通过一段接头与hu6G4.2.5HV/vH1-3A连接，因该接头很短，使得两个可变区无法分子内配对，而致一个单链多肽单体，与另一单体二聚反应形成二抗体。
在另一实施方案中，本发明提供了一种单链抗体片段，其中hu6G4.2.5LV/L1N35A与hu6G4.2.5HV或hu6G4.2.5HV/vH1-3Z包含在同一多肽链内。在一优选实施方案中，该单链抗体片段是一种scFv，所含的hu6G4.2.5LV/L1N35A通过一段韧性肽接头序列与hu6G4.2.5HV或hu6G4.2.5HV/vH1-3Z连接，其中的重链和轻链可变区可以结合或类似于双链Fv中的“二聚体”结构。在另一实施方案中，该单链抗体片段所含的hu6G4.2.5LV/L1N35A通过一段接头与hu6G4.2.5HV或hu6G4.2.5HV/vH1-3Z连接，因该接头很短，使得两个可变区无法分子内配对，而致一个单链多肽单体，与另一单体二聚反应形成二抗体。
在此还提供一种单链抗体片段，其中的hu6G4.2.5LV/L1N35E和hu6G4.2.5HV包含在同一多肽链内。在一优选实施方案中，该单链抗体片段是一种scFv，所含的hu6G4.2.5LV/L1N35E通过一段韧性的肽接头序列与hu6G4.2.5HV连接，其中的重链和轻链可变区可以结合成类似于双链Fv中的“二聚体”结构。在另一实施方案中，该单链抗体片段所含的hu6G4.2.5LV/L1N35E通过一段接头与hu6G4.2.5HV连接，因该接头很短，令两个可变区无法分子内配对，而致一个单链多肽单体，与另一单体二聚反应形成二抗体。
在另一实施方案中，本发明还提供了一种单链抗体片段，其中的hu6G4.2.5LV/L1N35A与hu6G4.2.5HV/vH1-3A包含在同一多肽链内。在一优选实施方案中，该单链抗体片段是一种scFv，所含的hu6G4.2.5LV/L1N35A通过一段韧性肽接头序列与hu6G4.2.5HV/vH1-3A连接，其中重链和轻链的可变区可以结合成类似双链Fc中的“二聚体”结构。在另一实施方案中，该单链抗体片段所含的hu6G4.2.5LV/L1N35A与hu6G4.2.5HV/vH1-3A通过一段接头连接，因接头很短，使得两个可变区无法分子内配对，而致一个单链多肽单体，与另一单体二聚反应形成二抗体。
在另一实施方案中，本发明提供的抗体片段包含多条多肽链，其中一条含有hu6G4.2.5LV/vL1-3X，另一条多肽链含有hu6G4.2.5HV或hu6G4.2.5HV/vH1-3Z，两条多肽链通过一对或多对链间二硫键共价连接。
在另一实施方案中，本发明提供的抗体片段包含多条多肽链，其中一条含有hu6G4.2.5LV/vL1-3X，另一条链含有hu6G4.2.5HV/vH1-3A，这两多肽链通过一对或多对链间二硫键连接。在优选实施方案中，本发明提供的抗体片段含有多条多肽链，其中一条含有hu6G4.2.5LV/vL1-3X，另一条多肽链含有6G4.2.5HV11的氨基酸序列，这两条多肽通过一对或多对链间二硫链连接。
在另一实施方案中，本发明提供的抗体片段包含多条多肽链，其中一条含有hu6G4.2.5LV/vL1-3A，另一条多肽链含有hu6G4.2.5HV或hu6G4.2.5HV/vH1-3Z，这两条多肽链通过一对或多对二硫键共价连接。
在另一实施方案中，本发明提供的抗体片段含有多条多肽链，其中一条含有hu6G4.2.5LV/vL1-3A，另一条多肽链含有hu6G4.2.5HV/vH1-3A，这两条肽链通过一对或多对链间二硫键共价连接。在优选实施方案中，本发明的抗体片段含有多条多肽链，其中一条含有hu6G4.2.5HV/vL1-3A，另一条链含有hu6G4.2.5HV11的氨基序列，这两条多肽链通过一对或多对链间二硫键共价连接。
本发明还包括的一种抗体片段含有多条多肽链，其中一条含有hu6G4.2.5LV/L1N3X35另一条链含有hu6G4.2.5HV或hu6G4.2.2HV/vH1-3Z，这两条多肽链通过一对或多对链间二硫键共价连接。
在另一实施方案中，本发明提供的抗体片段含有多条多肽链，其中一条含有hu6G4.2.5LV/L1N35X35，另一链含有hu6G4.2.5HV/vH1-3A，这两条多肽链通过一对或多对链间二硫键连接。在优选实施方案中，本发明提供的抗体片段含有多条多肽链，其中一条含有hu6G4.2.5LV/L1N35X35，另一条链含有hu6G4.2.5HV11的氨基酸序列，这两多肽链通过一对或多对链间二硫键连接。
本发明还包括的另一种抗体片段包含多条多肽链，其中一条含有hu6G4.2.5LV/L1N35A，另一条链含有hu6G4.2.5HV或hu6G4.2.5HV/vH1-3Z，这两条多肽链通过一对或多对链间二硫键连接。
本发明还包含的另一种抗体片段含有多条多肽链，其中一条含有hu6G4.2.5LV/L1N35E，另一条链含有hu6G4.2.5HV，这两条链通过一对或多对链间二硫键共价连接。
在另一实施方案中，本发明提供的抗体片段含有多条多肽链，其中一条含有hu6G4.2.5LV/L1N35A，另一条链含有hu6G4.2.5HV/vH1-3A，这两条多肽链通过一对或多对链间二硫键共价连接。在优选实施方案中，本发明的抗体片段包含多条多肽链，其中一条含有hu6G4.2.5LV/L1N35A，另一条链含有hu6G4.2.5HV11的氨基酸序列，两多肽链通过一对或多对链间二硫键共价连接。在另一优选实施方案中，本发明提供的抗体片段含有多条多肽链，其中一条含有hu6G4.2.5LV/L1N35E，另一条链含有hu6G4.2.5HV11的氨基酸序列，两多肽链通过一对或多对链间二硫键连接。
在优选实施方案中，上述双链抗体片段均选自Fab、Fab＇、Fab＇-SH、Fv和F(ab＇)2。在另一优选实施方案中，抗体片段选自Fab、Fab＇、Fab＇-SH、Fv和F(ab＇)2，其中抗体片段所含的一条多肽链含有hu6G4.2.5LV/L1N35X35，另一条链含有hu6G4.2.5HV。在另一优选实施方案中，抗体片段选自Fab、Fab＇、Fab＇-SH、Fv、F(ab＇)2，其中抗体片段所含的一条多肽链含hu6G4.2.5LV/L1N35A，另一条多肽链含hu6G4.2.5HV。在另一优选实施方案中，抗体片段选自Fab、Fab＇、Fab＇-SH、Fv和F(ab＇)2，其中抗体片段所含的一条多肽链含hu6G4.2.5LV/L1N35E，另一条多肽链含有hu6G4.2.5HV。在另一优选实施方案中，抗体片段是F(ab＇)2，它所含的一条多肽链包含hu6G4.2.5LV/L1N35A，另一条多肽链包含hu6G4.2.5HV11的氨基酸序列。在另一优选实施方案中，抗体片段是F(ab＇)2，它所含的一条多肽链含hu6G4.2.5LV/L1N35E，另一条多肽链含有hu6G4.2.5HV11的氨基酸序列。
本发明还提供了另一种抗体或抗体片段，它们包含的轻链可变区含有hu6G4.2.5LV/vL1-3X，并且还任选地包含重链可变区，其中含hu6G4.2.5HV或hu6G4.2.5HV/vH1-3Z，其中的轻链可变区和可能有的重链可变区与另一部分，例如免疫蛋白恒定区融合。恒定区序列可以与重链和/或轻链序列加合，形成全长或部分长度的重链和/或轻链抗体。可以理解的是，各同种型的恒定区都可用于上述目的，其中包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE的恒定区，而且，上述恒定区可获自人或各种动物。较好的是人源的恒定区序列。要获得合适的人恒定区序列可参见Kabat等。
本发明另提供的一种抗体或抗体片段包含的轻链可变区含有hu6G4.2.5LV/vL1-3X；并且任选地还含有重链可变区，它含有hu6G4.2.5HV/vH1-3A，其中的轻链可变区和可能有的重链可变区与另一部分，例如免疫球蛋白恒定区融合。恒定区序列可以与重链和/或轻链序列加合，形成全长或部分长度重链和/或轻链抗体。可以理解的是，各同种型的恒定区均可用于上述目的，其中包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且，上述恒定区可以获自人或各种动物。较好的是人源的恒定区。要获得合适的人恒定区序列可参见Kabat等。
本发明另提供的一种抗体或抗体片段包含的轻链可变区含有hu6G4.2.5LV/L1N35X35；并且任选地还含有重链可变区，它含有hu6G4.2.5HV或hu6G4.2.5HV/vH1-3Z，其中的轻链可变区和可能有的重链可变区与另一部分，例如免疫球蛋白恒定区融合。恒定区序列可以与重链和/或轻链序列加合，形成全长或部分长度重链和/或轻链抗体。可以理解的是，各同种型的恒定区均可用于上述目的，其中包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且，上述恒定区可以获自人或各种动物。较好的是人源的恒定区。要获得合适的人恒定区序列可参见Kabat等。
本发明提供的另一种抗体或抗体片段包含的轻链可变区含有hu6G4.2.5LV/L1N35X35；并且任选地还含有重链可变区，它包含hu6G4.2.5HV/vH1-3A，其中的轻链可变区和可能有的重链可变区与另一部分，例如免疫球蛋白恒定区融合。恒定区序列可以与重链和/或轻链序列加合，形成全长或部分长度的重链和/或轻链抗体。可以理解的是，各同种型的恒定区均可用于上述目的，其中包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且，上述恒定区可以获自人或各种动物。较好的是人源恒定区。要获得合适的人恒定区序列可参见Kabat等。
本发明提供的另一种抗体或抗体片段包含的轻链可变区含有hu6G4.2.5LV/LIN35A；并且任选地还含有重链可变区，它包含hu6G4.2.5HV或hu6G4.2.5HV/vH1-3Z。其中的轻链可变区和可能有的重链可变区与另一部分，例如免疫球蛋白恒定区融合。恒定区序列可以与重链和/或轻链序列加合，形成全长或部分长度的重链和/或轻链抗体。可以理解的是，各同种型的恒定区均可用于上述目的，其中包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且，上述恒定区可以获自人或各种动物。较好的是人源恒定区。要获得合适的人恒定区序列可参见Kabat等。
本发明也包括的另一种抗体或抗体片段包含的轻链可变区含有hu6G4.2.5LV/L1N35A；并且任选地还含有重链可变区，它包含hu6G4.2.5HV/vH1-3A。其中的轻链恒区和可能有的重链可变区与另一部分，例如免疫球蛋白恒定区融合。恒定区序列可以与重链和/或轻链序列加合，形成全长或部分长度的重链和/或轻链抗体。可以理解的是，各同种型的恒定区均可用于上述目的，其中包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且，上述恒定区可以获自人或各种动物。较好的是人源恒定区。要获得合适的人恒定区序列可参见Kabat等。
本发明提供的另一种抗体或抗体片段包含的轻链可变区含有hu6G4.2.5LV/L1N35A；并且任选地还含有的重链可变区包含有hu6G4.2.5HV11的氨基酸序列。其中的轻链可变区和可能有的重链可变区与另一部分，例如免疫球蛋白恒定区融合。恒定区序列可以与重链和/或轻链序列加合，形成全长或部分长度的重链和/或轻链抗体。可以理解的是，各同种型的恒定区均可用于上述目的，其中包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且，上述恒定区可以获自人或各种动物。较好的是人源恒定区。要获得合适的人恒定区序列可参见Kabat等。
本发明提供的另一种抗体或抗体片段包含的轻链可变区含有hu6G4.2.5LV/L1N35A；并且任选地还含有重链可变区，它包含hu6G4.2.5HV11的氨基酸序列。其中的轻链可变区和可能有的重链可变区与另一部分，例如免疫球蛋白恒定区融合。恒定区序列可以与重链和/或轻链序列加合，形成全长或部分长度重链和/或轻链抗体。可以理解的是，各同种型的恒定区均可用于上述目的，其中包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且，上述恒定区可以获自人或各种动物。较好的是人源恒定区。要获得合适的人恒定区序列可参见Kabat等。
在优选实施方案中，该抗体或抗体片段所含的轻链可变区含有hu6G4.2.5LV/vL1-3X，并还含有重链中的hu6G4.2.5HV或hu6G4.2.5HV/vH1-3Z，所述的重链融合或含有一段亮氨酸拉链序列。该亮氨酸拉链能提高感兴趣抗体或抗体片段的亲合性和生产效率。合适的亮氨酸拉链序列包括jun和fos亮氨酸拉链，参见Kostelney等，免疫学杂志，148：1553(1992)和后文实施例所述的GCN4亮氨酸拉链。
本发明特别提供了一种抗体或抗体片段，它们所含的轻链包含变异的人源化抗-IL-8 6G4.2.5v11轻链多肽氨基酸序列(图31B(SEQ ID NO：65))中的氨基酸1-219，条件是，在氨基酸第35位，Asn被非Asn氨基酸(称"X35")替换(称"6G4.2.5LV11N35X35")。
在另一实施例中，本发明提供了一种抗体或抗体片段，所含的轻链包含变异的人源化抗-IL-86G4.2.5v11轻链多肽氨基酸序列(图31B(SEQ ID NO：65))中的氨基酸1-219，条件是，在氨基酸第26位，Ser被非Ser氨基酸(称"X26")替换(称"6G4.2.5LV11 S26X26")。
在另一实施例中，本发明提供了一种抗体或抗体片段，所含的轻链包含变异的人源化抗-IL-86G4.2.5v11轻链多肽氨基酸序列(图31B(SEQ ID NO：65))中的氨基酸1-219，条件是，在氨基酸第98位，His被非His氨基酸(称"X98")替换(称"6G4.2.5LV11H98X98")。
在另一实施例中，本发明提供了一种抗体或抗体片段，所含的轻链包含变异人源化抗-IL-86G4.2.5v11轻链多肽氨基酸序列(图31B(SEQ ID NO：65))中的氨基酸1-219，条件是，氨基酸第26位上的Ser被非Ser氨基酸(称"X26")替换，氨基酸35位上的Asn被非Asn氨基酸("X35")替换，(称"6G4.2.5LV11S26X26/N35X35")。
在另一实施例中，本发明提供了一种抗体或抗体片段，所含的轻链包含变异的人源化抗-IL-86G4.2.5v11轻链多肽氨基酸序列(图31B(SEQ ID NO：65))中的氨基酸1-219，条件是，氨基酸第35位上的Asn被非Asn氨基酸(称"X35")替换，氨基酸98位上的His被非His氨基酸("X98")替换，(称"6G4.2.5LV11N35X35/H98X98")。
在另一实施例中，本发明提供了一种抗体或抗体片段，所含的轻链包含变异的人源化抗-IL-8 6G4.2.5v11轻链多肽氨基酸序列(图31B(SEQ ID NO：65))中的氨基酸1-219，条件是，氨基酸26位上的Ser被非Ser氨基酸(称"X26")替换氨基酸，98位上的His被非His氨基酸("X98")替换，(称"6G4.2.5LV11S26X26/H98X98")。
本发明还包括一种抗体或抗体片段，所含的轻链包含变异的人源化抗-IL-86G4.2.5v11轻链多肽氨基酸序列(图31B(SEQ ID NO：65))中的氨基酸1-219，条件是，氨基酸26位上的Ser被非Ser氨基酸(称"X26")替换，氨基酸35位上的Asn被非Asn氨基酸("X35")替换，氨基酸98位上的His被非His氨基酸("X98")替换(称"6G4.2.5LV11S26X261N35X35/N98X98")。
此外，本发明提供了一种抗体或抗体片段，所含的轻链含有变异的人源化抗-IL-8 6G4.2.5v11轻链多肽氨基酸序列(图36(SEQ ID NO：71)，称"6G4.2.5LV11N35A")的氨基酸1-219。
本发明还提供了一种抗体或抗体片段，所含的轻链含有变异的人源化抗-IL8 6G4.2.5v11轻链多肽氨基酸序列(图45(SEQ ID NO：71)，称"6G4.2.5LV11N35E")的氨基酸1-219。
在另一实施方案中，本发明提供了一种抗体或抗体片段，所含的轻链含有变异的人源化抗-IL-8 6G4.2.5v11轻链多肽氨基酸序列(图31B(DEQ ID NO：65))的氨基酸1-219，条件是，氨基酸第98位上的His被换成Ala(称“6G4.2.5LV11H98A”)。
在另一实施方案中本发明提供一种抗体或抗体片段，所含的轻链含有变异的人源化抗IL-86G4.2.5v11轻链多肽氨基酸序列(图31B(SEQ.ID.No：65))的氨基酸1-219。条件是氨基酸第26位上的Ser被换成Ala(称为6G4.2.5LV11S26A)。
在另一实施方案中，本发明提供了一种抗体或抗体片段，所含的轻链含有变异的人源化抗-IL-86G4.2.5v11轻链多肽氨基酸序列(图31B(DEQ ID NO：65))的氨基酸1-219，条件是，氨基酸第26位上的Ser换成Ala，氨基酸35位上的Asn换成Ala(称“6G4.2.5LV11S26A/N35A”)。
在另一实施方案中，本发明提供了一种抗体或抗体片段，所含的轻链含有变异的人源化抗-IL-86G4.2.5v11轻链多肽氨基酸序列(图31B(DEQ ID NO：65))的氨基酸1-219，条件是，氨基酸第26位上的Ser换成Ala，氨基酸第98位上的His换成Ala(称“6G4.2.5LV11S26A/H98A”)。
本发明还包括一种抗体或抗体片段，所含的轻链含有变异的人源化抗-IL-86G4.2.5v11轻链多肽氨基酸序列(图31B(DEQ ID NO：65))的氨基酸1-219，条件是，氨基酸第35位的Asn换成Ala，氨基酸第98位上的His换成Ala(称“6G4.2.5LV11N35A/H98A”)。
本发明还包括一种抗体或抗体片段，所含的轻链含有变异的人源化抗-IL-86G4.2.5v11轻链多肽氨基酸序列(图31B(DEQ ID NO：65))的氨基酸1-219，条件是，氨基酸第26位上的Ser换成Ala，第35位上的Asn换成Ala，第98位上的His换成Ala(称“6G4.2.5LV11S26A/N35A/H98A”)。
本发明提供了一种单链抗体片段，它所含的变异型轻链选自6G4.2.5LV11N35X35、6G4.2LV11S26X26、6G4.2.5LV11H98X98、6G4.2.5LV11S26X26/N35X35、6G4.2.5LV11N35X35/H98X98、6G4.2.5LV11S26X26/H98X98和6G4.2.5LV11S26X26/N35X35/H98X98，它们含有或不含其他氨基酸序列。可以理解的是，由6G4.2.5LV11N35X35、6G4.2LV11S26X26、6G4.2.5LV11H98X98、6G4.2.5LV11S26X26/N35X35、6G4.2.5LV11N35X35/H98X98、6G4.2.5LV11S26X26/H98X98和6G4.2.5LV11S26X26/N35X35/H98X98构成的组配本文统称为“6G4.2.5LV11X变异组”，其中的各个体统称为“6G4.2.5LV11X变体”。在一实施方案中，本发明提供了一种单链抗体片段，它所含的6G4.2.5LV11X变体不结合任何重链氨基酸序列，为构成Fab片段的一半的一种单链抗体片段。在优选实施方案中，本发明提供的6G4.2.5LV11N35X35变体不结合任何重链氨基酸序列。
本发明提供了一种单链抗体片段，它所含的变异型轻链选自6G4.2.5LV11N35A、6G4.2LV11S26A、6G4.2.5LV11H98A、6G4.2.5LV11S26A/N35A、6G4.2.5LV11N35A/H98A、6G4.2.5LV11S26A/H98A和6G4.2.5LV11S26A/N35A/H98A，它们含有或不含其他氨基酸序列。可以理解的是，由6G4.2.5LV11N35A、6G4.2LV11 S26A、6G4.2.5LV11H98A、6G4.2.5LV11S26A/N35A、6G4.2.5LV11N35A/H98A、6G4.2.5LV11S26A/H98A和6G4.2.5LV11S26A/N35A/H98A构成的组本文统称为“6G4.2.5LV11A变异组”，其中的各个体统称为“6G4.2.5LV11A变体”。在一实施方案中，本发明提供了一种单链抗体片段，它所含的6G4.2.5LV11A变体不结合任何重链氨基酸序列，为构成Fab片段的一半的一种单链抗体片段。在优选实施方案中，本发明提供的6G4.2.5LV11N35A不结合任何重链氨基酸序列。
本发明还提供一种抗体或抗体片段，其所含的轻链含有6G4.2.5LV11变体，其所含的重链含有6G4.2.5Hv11。在一个优选实施方案中，本发明提供的抗体或抗体片段含有6G4.2.5LV11N35X35变体和6G4.2.5HV11。在优选实施方案中，本发明提供的抗体或抗体片段包含6G4.2.5LV11A和6G4.2.5HV11。在另一优选实施方案中，本发明提供的抗体或抗体片段含有6G4.2.5LV11N35E和6G4.2.5HV11。
在实施方案中，本发明提供了一种单链抗体片段，其中的6G4.2.5LV11X变体与6G4.2.5HV11包含在同一多肽链内。在优选实施方案中，该单链抗体片段包含的6G4.2.5LV11X变体通过一段韧性肽接头序列与6G4.2.5HV11连接，其中的轻链区和重链区可以结合成类似于双链Fab中的“二聚体”结构。在另一实施方案中，单链抗体片段所含的6G4.2.5LV11X变体通过一段接头与6G4.2.5HV11连接，接头很短以致不可能发生互补区之间的分子内互配，而致一个单链多肽单体与另一单体二聚反应形成二抗体。
在另一实施方案中，本发明提供了一种单链抗体片段，其中的6G4.2.5LV11N35X35变体与6G4.2.5HV11。包含在同一多肽链内。在优选实施方案中，该单链抗体片段包含的6G4.2.5LV11N35X33变体通过一段韧性肽接头序列与6G4.2.5HV11连接，其中的轻链区和重链区可以结合成类似于双链Fab中的“二聚体”结构。在另一实施方案中，该单链抗体片段所含的6G4.2.5LV11N35X35变体通过一段接头与6G4.2.5HV11连接，因接头很短以致不可能发生互补区之间的分子内互配，而致一个单链多肽单体与另一单体二聚反应形成二抗体。
在另一实施方案中，本发明提供了一种单链抗体片段，其中的6G4.2.5LV11X变体与6G4.2.5HV11包含在同一多肽链内。在优选实施方案中，该单链抗体片段包含的6G4.2.5LV11N35A通过一段韧性肽接头序列与6G4.2.6HV11连接，其中的轻链区和重链区可以结合成类似于双链Fab中的“二聚体”结构。在另一实施方案中，该单链抗体片段所含的6G4.2.5LV11N35A通过一段接头与6G4.2.5HV11连接，因接头很短以致不可能发生互补区之间的分子内互配，而致一个单链多肽单体与另一单体二聚反应形成二抗体。
在另一实施方案中，本发明提供了一种单链抗体片段，其中的6G4.2.5LV11N35E与6G4.2.5HV11包含在同一多肽链内。在优选实施方案中，该单链抗体片段包含的6G4.2.5LV11N35E通过一段柔韧性肽接头序列与6G4.2.5HV11连接，其中的轻链区和重链区可以结合成类似于双链Fab中的“二聚体”结构。在另一实施方案中，单链抗体片段所含的6G4.2.5LV11N35E通过一段接头与6G4.2.5HV11连接，因接头很短以致不可能发生互补区之间的分子内互配，而致一个单链多肽单体，与另一单体二聚反应形成二抗体。
在另一实施方案中，本发明提供的抗体片段包含多条多肽链，其中一条包含6G4.2.5LV11X变体，另一条链包含6G4.2.5HV11，这两条多肽链通过一对或多对链间二硫键共价连接。在另一实施方案中，本发明提供的抗体片段包含多条条肽链，其中一条包含6G4.2.5LV11N35X35变体，另一条链包含6G4.2.5HV11，这两条多肽链通过一对或多对链间二硫键共价连接。在优选实施方案中，上述双链抗体片段均选自Fab、Fab＇、Fab＇-SH和F(ab＇)2。在另一优选实施方案中，该双链抗体片段是F(ab＇)2，其中一条多肽链包含6G4.2.5LV11N35A，另一条肽链包含6G4.2.5HV11。在另一优选实施方案中，抗体片段是Fab、Fab＇、Fab＇-SH和F(ab＇)2，其中的一条肽链包含6G4.2.5LV11N35E，另一条肽链包含6G4.2.5HV11。在特别优选的实施方案中，抗体片段是后文实施例中所述的6G4V11N35AF(ab＇)2GCN4亮氨酸拉链。在另一特别优选的实施方案中，抗体片段是后文实施例所述的6G4V11N35E F(ab＇)2GCN4亮氨酸拉链。在另一特别优选的实施方案中，抗体片段是后文实施例所述的6G4V11N35E Fab。
本发明还提供另一种抗体或抗体片段，它们所含的轻链包含6G4.2.5LV11X变体，并且任选地还含有的重链包含6G4.2.5HV11，其中轻链和可能有的重链与另一部分，例如另一免疫球蛋白恒定区序列融合。恒定区序列可与重链和/或轻链序列加合，形成全长或部分长度的重链和/或轻链。可以理解的是，各同种型的恒定区均可用于上述目的，其中包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，上述恒定区可以获自人或动物。较好的是人源恒定区序列。要获得合适的人源恒定区序列可参见Kabat等。
本发明还提供另一种抗体或抗体片段，它们所含的轻链包含6G4.2.5LV11N35X35变体，并且任选地还含有的重链包含6G4.2.5HV11，其中轻链和可能有的重链与另一部分，例如另一免疫球蛋白恒定区序列融合。恒定区序列可与长度的重链和/或轻链序列加合，形成全长或部分重链和/或轻链。可以理解的是，各同种型的恒定区均可用于上述目的，其中包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，上述恒定区可以来自各种人或动物。较好的是人源恒定区序列。要获得合适的人源恒定区序列可参见Kabat等。
本发明还提供另一种抗体或抗体片段，它们所含的轻链包含6G4.2.5LV11N35A，并且任选地还含有的重链包含6G4.2.5HV11，其中轻链和可能有的重链与另一部分，例如另一免疫球蛋白恒定区序列融合。恒定区序列可与重链和/或轻链序列加合，形成全长或部分长度的重链和/或轻链。可以理解的是，各同种型的恒定区均可用于上述目的，其中包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，上述恒定区可以来自各种人或动物。较好的是人源恒定区序列。要获得合适的人源恒定区序列可参见Kabat等。
本发明还提供一种抗体或抗体片段，它们所含的轻链包含6G4.2.5LV11N35E，并且任选一还含有的重链包含6G4.2.5HV11，其中轻链和可能有的重链与另一部分，例如另一免疫球蛋白恒定区序列融合。恒定区序列可与重链和/或轻链序列加合，形成全长或部分重链和/或轻链。可以理解的是，各同种型的恒定区均可用于上述目的，其中包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，上述恒定区可以来自各种人或动物。较好的是人源恒定区序列。要获得合适的人源恒定区序列可参见Kabat等。
在优选实施方案中，抗体或抗体片段包含轻链和重链，轻链包含6G4.2.5LV11X变体，重链包含6G4.2.5HV11，并融合或含有一段亮氨酸拉链序列。该亮氨酸拉链能够提高感兴趣的抗体或抗体片段的亲和性或生产效率。合适的亮氨酸拉链序列包括jun和fos亮氨酸拉链，参见Kostelney等，J.Immunol.,148：1547-1553(1992)，以及后文实施例所述的GCN4亮氨酸拉链。在另一优选实施方案中，抗体或抗体片段包含轻链和重链，轻链包含6G4.2.5LV11N35A，重链包含6G4.2.5HV11，并与GCN4亮氨酸拉链融合。在另一优选实施方案中，抗体或抗体片段包含轻链或重链，轻链包含6G4.2.5LV11N35E，重链包含6G4.2.5HV11并与GCN4亮氨酸拉链融合。
B.6G4.2.5HV变体
本发明提供人源化的抗体或抗体片段包含6G4.2.5HV CDR变体的CDR。在本发明的人源化抗体或抗体片段中使用6G4.2.5HV CDR变体的优点在于，对人IL-8有较高的亲和力，和/或改善了重组法生产的经济性。
基本上如前文(Ⅱ)(2)(A)所述，包含6G4.2.5HV CDR变体CDR的重链可变区可以连接含有6G4.2.5LV的CDR，或6G4.2.5LV CDR变体的CDR的轻链而人源化。在实施方案之一中，本发明提供的人源化抗体或抗体片段所含的6G4.2.5HVCDR变体选自6G4.2.5HV/H1S31Z31、6G4.2.5HV/H2S54Z54和6G4.2.5HV/H1S31Z31/H2S54Z54。此外，本发明提供的人源化抗体或抗体片段所含的6G4.2.5HV CDR变体选自6G4.2.5HV/H1S31A、6G4.2.5HV/H2S54A和6G4.2.5HV/HIS31A/H2S54A。特别的是，6G4.2.5HV CDR变体可用来构建包含hu6G4.2.5HV/vH1-3Z的人源化抗体或抗体片段，如前文(Ⅱ)(2)(A)所述。
本发明还提供一种人源化抗体或抗体片段，它们所含的重链可变区包含hu6G4.2.5HV/vH1-3Z，所含的轻链变区包含hu6G4.2.5LV或hu6G4.2.5LV/vL1-3X。
本发明还包括一种单链人源化抗体片段，它包含hu6G4.2.5HV/vH1-3Z，并含有或不含任何其他氨基酸序列。在实施方案之一中，本发明的单链抗体片段包含hu6G4.2.5HV/vH1-3Z，不结合任何重链可变区氨基酸序列，即是一种组成Fv片段一半的单链抗体。
在实施方案之一中，本发明提供了一种单链人源化抗体片段，其中的hu6G4.2.5HV/vH1-3Z和hu6G4.2.5LV或hu6G4.2.5LV/VL1-3X包含在同一条多肽链内。在优选实施方案中，该单链抗体片段是一种scFv抗体，所含的hu6G4.2.5HV/vH1-3Z通过一段柔韧性肽接头序列与hu6G4.2.5LV或hu6G4.2.5LV/vL1-3X连接，其中重链和轻链可变区可以结合成类似于双链Fv抗体中的“二聚体”结构。在另一实施方案中，单链抗体片段所含的hu6G4.2.5LV/vL1-3Z通过一段接头与hu6G4.2.5LV或hu6G4.2.5LV/vL1-3X连接，因接头很短以致两可变区不可能分子内互配，而致一个单链多肽单体与另一单体二聚反应形成二抗体。
在另一实施方案中，本发明提供的人源化抗体片段包含多条多肽链，其中一条包含hu6G4.2.5HV/vH1-3Z，另一条链包含hu6G4.2.5LV或hu6G4.2.5LV/vL1-3X，这两条多肽链通过一对或多对链间二硫键连接。在优选实施方案中，上述双链抗体片段选自Fab、Fab＇、Fab＇-SH、Fv和F(ab＇)2。
本发明还提供一种人源化抗体或抗体片段，它们所含的重链可变区包含hu6G4.2.5HV/vH1-3Z，任选地含有的轻链可变区包含hu6G4.2.5LV或hu6G4.2.5LV/vL1-3X，其中的重链可变区和可能含有的轻链可变区与另一部分，例如免疫球蛋白恒定区融合。恒定区序列可以与重链和/或轻链序列加合，形成全长或部分长度的重链和/或轻链。可以理解的是，各同种型的恒定区均可用于上述目的，其中包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，这些恒定区可以获自人或动物。较好的是人源恒定区。要获得合适的人恒定区序列可参见Kabat等。
在优选实施方案中，人源化抗体或抗体片段所含的重链内包含了hu6G4.2.5HV/vH1-3Z，并融和或含有亮氨酸拉链序列。该亮氨酸拉链可以提高感兴趣抗体或抗体片段的亲和性和生产效率。合适的亮氨酸拉链序列包括jun和fos亮氨酸拉链，参见Kostelney等，J.Immunol.148：1547-1553(1992)，以及后文实施例所述的GCN4亮氨酸拉链。
此外，本发明提供了一种人源化抗体或抗体片段，其中重链含有6G4.2.5HV11多肽氨基酸序列(图37A-37B(SEQ ID NO：75))中的氨基酸1-230，条件是，氨基酸第31位的Ser换成Ala(称"6G4.2.5HV11S31A")。
在另一实施方案中，本发明提供了一种人源化抗体或抗体片段，其中重链含有6G4.2.5HV11多肽氨基酸序列(图37A-37B(SEQ ID NO：75))中的氨基酸1-230，条件是，氨基酸第54位的Ser换成Ala(称"6G4.2.5HV11S54A")。
此外，本发明提供了一种人源化抗体或抗体片段，其中重链含有6G4.2.5HV11多肽氨基酸序列(图37A-37B(SEQ ID NO：75))中的氨基酸1-230，条件是，氨基酸第31位的Ser换成Sla，氨基酸54位的Ser换成Ala(称“6G4.2.5HV11S31A/S54A”)。
本发明还提供其它人源化抗体或抗体片段，其中包含的各种轻链与重链的组合，如下文表1和表2中所列举。
               表    1
    重    链          轻    链
6G4.2.5HV11 S31A   6G4.2.5LV11
6G4.2.5HV11S31A    6G4.2.5LV11N35A
6G4.2.5HV11S31A    6G4.2.5LV11S26A
6G4.2.5HV11S31A    6G4.2.5LV11H98A
6G4.2.5HV11S31A    6G4.2.5LV11S26A/N35A
6G4.2.5HV11S31A    6G4.2.5LV11S26A/H98A
6G4.2.5HV11S31A    6G4.2.5LV11N35A/H98A
6G4.2.5HV11S31A    6G4.2.5LV11S26A/N35A/H98A
6G4.2.5HV11S54A    6G4.2.5LV11
6G4.2.5HV11S54A    6G4.2.5LV11N35A
6G4.2.5HV11S54A    6G4.2.5LV11S26A
6G4.2.5HV11S54A    6G4.2.5LV11H98A
                          表    2
  重    链                    轻 链
6G4.2.5HV11S54A        6G4.2.5LV11S26A/N35A
6G4.2.5HV11S54A        6G4.2.5LV11S26A/H98A
6G4.2.5HV11S54A        6G4.2.5LV11N35A/H98A
6G4.2.5HV11S54A        6G4.2.5LV11S26A/N35A/H98A
6G4.2.5HV11S31A/S54A   6G4.2.5LV11
6G4.2.5HV11S31A/S54A   6G4.2.5LV11N35A
6G4.2.5HV11S31A/S54A   6G4.2.5LV11S26A
6G4.2.5HV11S31A/S54A   6G4.2.5LV11H98A
6G4.2.5HV11S31A/S54A   G4.2.5LV11S26A/N35A
6G4.2.5HV11S31A/S54A   6G4.2.5LV11S26A/H98A
6G4.2.5HV11S31A/S54A   6G4.2.5LV11N35A/H98A
6G4.2.5HV11S31A/S54A   6G4.2.5LV11S26A/N35A/H98A
6G4.2.5HV11S31A        6G4.2.5LV11
6G4.2.5HV11S31A        6G4.2.5LV11N35X35
6G4.2.5HV11S31A        6G4.2.5LV11S26X26
6G4.2.5HV11S31A        6G4.2.5LV11H98X98
6G4.2.5HV11S31A        6G4.2.5LV11 S26X26/N35X35
6G4.2.5HV11S31A        6G4.2.5LV11S26X26/H98X98
6G4.2.5HV11S31A        6G4.2.5LV11N35X35/H98X98
6G4.2.5HV11S31A        6G4.2.5LV11S26X26/N35X35/H98X98
6G4.2.5HV11S54A        6G4.2.5LV11
6G4.2.5HV11S54A        6G4.2.5LV11N35X35
6G4.2.5HV11S54A        6G4.2.5LV11S26X26
6G4.2.5HV11S54A        6G4.2.5LV11H98X98
6G4.2.5HV11S54A        6G4.2.5LV11S26X26/N35X35
6G4.2.5HV11S54A        6G4.2.5LV11S26X26/H98X98
6G4.2.5HV11S54A        6G4.2.5LV11N35X35/H98X98
6G4.2.5HV11S54A        6G4.2.5LV11S26X26/N35X35/H98X98
6G4.2.5HV11S31A/S54A   6G4.2.5LV11
6G4.2.5HV11S31A/S54A   6G4.2.5LV11N35X35
6G4.2.5HV11S31A/S54A   6G4.2.5LV11S26X26
6G4.2.5HV11S31A/S54A   6G4.2.5LV11H98X98
6G4.2.5HV11S31A/S54A   6G4.2.5LV11 S26X26/N35X35
6G4.2.5HV11S31A/S54A   6G4.2.5LV11S26X26/H98X98
6G4.2.5HV11S31A/S54A   6G4.2.5LV11N35X35/H98X98
6G4.2.5HV11S31A/S54A   6G4.2.5LV11S26X26/N35X35/H98X98
本发明包括一种单链人源化抗体片变，它所含的变异型重链选自6G4.2.5HV11S31A、6G4.2.5HV11S54A和6G4.2.5HV11S31A/S54A，另含或不含其他氨基酸序列。可以理解的是，含有6G4.2.5HV11S31A、6G4.2.5HV11S54A和6G4.2.5HV11S31A/S54A的一组统称为"6G4.2.5HV11A变体组"，其中的各成员称为“6G4.2.5HV11A变体”。在一个实施方案中，本发明提供的单链人源化抗体片段包含6G4.2.5HV11A变体，不结合任何轻链氨基酸序列，即一种构成Fab片段一半的单链抗体。
本发明还提供了一种人源化抗体或抗体片段，它们所含的重链包含6G4.2.5HV11A变体，所含的轻链包含6G4.2.5LV11A变体或6G4.2.5LV11X变体。在另一实施方案中，人源化抗体或抗体片段包含前文表1和表2中所列的轻链和重链组合。在实施方案之一中，本发明提供的人源化抗体或抗体片段包含6G4.2.5HV11A变体和6G4.2.5LV11N35X35。在较佳实施方案中，本发明提供的人源化抗体或抗体片段包含6G4.2.5HV11A变体和6G4.2.5LV11N35A。
在另一实施方案中，本发明提供了一种单链人源化抗体片段，其中的6G4.2.5HV11A变体和6G4.2.5LV11包含在同一多肽链内。在另一实施方案中，本发明提供了一种单链人源化抗体片段，其中前文表1和表2中所列的轻重链配对包含在同一多肽链内。在另一实施方案中，本发明提供一种人源化单链抗体片段，其中6G4.2.5HV11A变体和6G4.2.5LV11变体包含在一条多肽链中，在另一实施方案中，本发明提供一种单链人源化抗体片段，其中的6G4.2.5HV11A变体和6G4.2.5LV11N35X35变体包含于同一多肽链内。在另一实施方案中，本发明提供一种单链人源化抗体片段，其中的6G4.2.5HV11A变体和6G4.2.5LV11N35A变体包含于同一多肽链内。
在一个优选实施方案中，单链人源化抗体片段所含的6G4.2.5HV11A变体通过一段韧性肽接头序列与6G4.2.5LV11X变体、6G4.2.5LV11N35X35变体、6G4.2.5LV11N35A变体或6G4.2.5LV11连接，其中的重链区和轻链区可以结合成类似于双链Fab中的“二聚体”结构。在另一实施方案中，该人源化单链抗体片段所含的6G4.2.5HV11A变体通过一段接头与6G4.2.5LV11X变体，6G4.2.5LV11N35X35变体、6G4.2.5LV11N35A变体或6G4.2.5LV11连接，因该接头很短以致互补的两区不可能分子内互配，而致一个单链多肽单体与另一单体二聚反应形成二抗体。
在另一实施方案中，单链人源化抗体片段包含表1和表2中所列的任何轻重链配对，它们通过一段韧性肽接头序列连接，其中的轻链区和重链区可以结合成类似于双链Fab中的“二聚体”结构。在另一实施方案中，单链人源化抗体片段包含表1和表2中所列的任何轻重链配对，它们通过一段接头连接，因接头很短以致互补的两区不可能分子内互配，而致一个单链多肽单体与另一单体二聚化形成二抗体。
在另一实施方案中，本发明提供的人源化抗体片段包含多条多肽链，其中一条包含6G4.2.5HV11A变体，另一条链包含6G4.2.5LV11X变体、6G4.2.5LV11X35X35变体、6G4.2.5LV11N35A变体或6G4.2.5LV11，这两条多肽链通过一对或多对链间二硫键共价连接。在优选实施方案中，上述双链抗体片段选自Fab、Fab＇、Fab＇-SH和F(ab＇)2。
在另一实施方案中，本发明提供了一种双链人源化抗体片段，它包含表1和表2所列的任何重轻链配对，其中各链包含在不同分子内。在另一实施方案中，包含表1和表2中任何重轻链对的双链抗体片段选自Fab、Fab＇、Fab＇-SH和F(ab＇)2。在优选实施方案中，双链人源化抗体片段是F(ab＇)2，它包含表1和表2中的任何重轻链对。在另一优选实施方案中，双链人源化抗体片段是F(ab＇)2，其中一条多肽链包含6G4.2.5HV11A变体，另一链包含6G4.2.5LV11N35A。
本发明还提供一种人源化抗体或抗体片段，它们所含的重链包含6G4.2.5HV11A变体，并且任选地含有的轻链包含6G4.2.5LV11X变体、6G4.2.5LV11N35X35变体、6G4.2.5LV11N35A或6G4.2.5LV11，其中的重链和可能有的轻链与另一部分，例如另一免疫球蛋白恒定区序列配合。恒定区序列可以与重链和/或轻链序列加合，形成全长或部分长度的重链和/或轻链。可以理解的是，各同种型的恒定区均可用于上述目的，它们包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，上述恒定区可以获自人或动物。较好的是人源恒定区序列。可自Kabat等获得合适的人恒定区序列。
在优选实施方案中，人源化抗体或抗体片段的重链内包含6G4.2.5HV11A变体，并融合或含有一段亮氨酸拉链序列。该亮氨酸拉链序列能提高感兴趣抗体或抗体片段的亲和性或生产效率。合适的亮氨酸拉链序列包括jun和fos亮氨酸拉链(参见kostelney等，J.Immunol.148：1547-1553(1992))以及后文实施例所述的GCN4亮氨酸拉链。
C.双特异性抗体
双特异性抗体是单克隆的，最好是人的或人源化的抗体，它们对至少两种不同的抗原具有结合特异性。在本发明中，其结合特异性之一是针对IL-8的，另一特异性则针对任何其他抗原。例如，特异性结合IL-8和神经营养细胞因子、或结合两类不同IL-8多肽的双特异性抗体属于本发明的范围。
制造双特异性抗体的方法是本领域已知的。通常，重组法生产双特异性抗体是基于两对免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中的两条重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello,Nature305：537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机组合，杂交瘤(四交瘤)可能产生由10种不同抗体分子组成的混和物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。纯化这种正确的分子通常通过亲和层析来进行，十分繁琐费力，而且得率很低。类似的过程参见WO93/08829(公开于1993年5月13日)，和Traunecker等，EMBO J.10：3655(1991)。
按照一种不同的但更好的方法，具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白的恒定区序列融合。最好是与免疫球蛋白的重链恒定区融合，该恒定区包含至少部分绞链区，CH2和CH3区。最好在含有轻链结合所必需位点的第一重链恒区(CH1)内有至少一处融合。将编码免疫球蛋白重链融合体和免疫球蛋白轻链(如有必要)的DNA插入不同的表达载体中，并共转染到同一合适的宿主生物体内。这为在实施中调节三种多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性，当结构中使用比例不相等的三种多肽链将提供最大产率。然而，当至少两种多肽链以等比例高产率产生时，或者当比例无特别意义时，可以将2种多肽链或全部3种多肽链的编码序列插入同一表达载体中。在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体含有的杂交免疫球蛋白重链一臂内具有第一结合特异性，另一臂内具有一对杂交免疫球蛋白的重链-轻链对(提供第二结合特异性)。这种不对称结构有利于将所需的双特异性化合物与其他不需要的免疫球蛋白链组合物相分离，因为免疫球蛋白轻链仅存在于双特异性分子的一半中从而为分离提供了方便。有关产生双特异性抗体的进一步细节参见Suresh等，Methods inEnzymology(酶学方法)121：210(1986)。
根据另一种方法，可以对一对抗体分子间的界面进行基因工程改造从而尽可能提高从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分率。较好的界面包括抗体恒定区CH3区的至少一部分。在该方法中，第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链被换成大的侧链(例如：酪氨酸或色氨酸)。在第二抗体分子的界面上，将大氨基酸侧链换成小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)，由此产生与大侧链大小相同或相似的互补性的“槽穴”。这就提供了一种机制，可籍以提高异二聚体的得率，高于诸如均二聚体之类不需要的终产物。
双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联抗体中的一个抗体可以与亲和素连接，而另一个与生物素连接。曾提出这样的抗体可用于将免疫细胞导向不需要的细胞(US专利4,676,980)，和用于治疗HIV感染(WO9I/00360,WO92/00373和EP03089)。异源偶联抗体可用常规的交联方法制得。合适的交联剂是本领域已知的，和许多交联技术一起公开在美国专利4,676,980中。
由抗体片段产生双特异性抗体的方法也已在文献中有所描述。例如，可以通过化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等，Science(科学)229：81(1985)描述了一种方法，其中完整的抗体经蛋白酶切割产生F(ab＇)2片段。这些片段在二巯基化物(dithiol)络合剂砷酸钠存在下被还原，稳定了连位的二巯基化物，并防止形成分子间二硫键。产生的Fab＇片段然后转化成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后，Fab＇-TNB衍生物之一经巯基乙胺还原转化成Fab＇-硫醇，并与等摩尔量的其它Fab＇-TNB衍生物混合，形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可以用来选择性地固定化酶。
最近的进展促进了从大肠杆菌直接回收Fab′-SH，后者可化学偶联形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.,175：217-225(1992)描述了一种完全人源化双特异性抗体F(ab＇)2分子的生产。各Fab＇片段分别由大肠杆菌分泌，然后经体外直接化学偶联形成双特异性抗体。由此形成的双特异性抗体能够结合过量表达HER2受体的细胞和正常人T细胞，并触发人细胞毒性淋巴细胞对人乳房肿瘤目标的溶细胞活性。
已经描述了从重组细胞培养物中直接制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，已经用亮氨酸拉链生产出了双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992)。Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab’部分连接。该抗体均二聚体在绞链区经还原形成单体，然后再氧化形成抗体异二聚体。该方法也可以用来生产抗体均二聚体。Hollinger等在Droc NatlAcad Sci USA(美国科学)院院报90：6444-6448(1993)中所述的“二抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的另一种机理。片段中所含的重链可变区(VH)与所含的轻链可变区(VL)通过一段接头连接，接头很短，使得同一链内的两区无法配对。所以，同一片段内的VH和VL被迫与另一片段上与之互补的VL或VH区配对，由此形成了两个抗原结合位点。还报道了另一种用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体片段的方法。参见Gruber等，J Immunot(免疫学杂志)，152：5368(1994)。
还考虑过两价以上的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等，免疫学杂志，147：60(1991)。
4．生产人源化抗-IL-86G4.2.5单克隆抗体，抗体片段和变体。
本发明的抗体和抗体片段可以利用本领域已知的各种抗体生产方法来生产。通常用重组表达系统来制备抗体或抗体片段。可以在同一宿主细胞表达系统中生产多种多肽链抗体或抗体片段，其中宿主细胞生产出抗体或抗体片段的各条单链，然后将这些多肽链体内组装成多聚体结构以形成抗体或抗体片段，然后再从宿主细胞中回收抗体或抗体片段。例如，适用于生产完整抗体或抗体片段的重组表达系统可参见Lucas等，Nucleic Acids Res.24：1774-1779(1996)。或者，可以在不同的表达宿主细胞内表达所需抗体或抗体片段的各个多肽链，分别自不同的宿主细胞回收，然后在一定条件下体外混合，此条件能够形成感兴趣的多亚基抗体或抗体片段。例如，Cabill等的美国专利4,816,567和Carter等Bio/Technology.,10：163-167(1992)提供的方法是在不同的表达宿主内重组生产抗体的重链和轻链，然后在体外由分离得到的重链和轻链组装成抗体。
以下讨论的重组表达方法可等同地用于生产单链抗体多肽和生产多亚基抗体和抗体片段。以下提供的所有生产抗体或抗体片段的重组方法都应该理解为是：(1)生产单链抗体作为最终产物；(2)生产多亚基抗体或抗体片段，即在同一宿主细胞内生产所有的亚基，在该宿主细胞内组装亚基，然后由宿主细胞将多亚基终产物分泌到培养基中，再从宿主细胞和/或培养基回收多亚基终产物；(3)通过在不同的宿主细胞内生产不同的亚基制造产多亚基抗体或抗体片段(然后可以由宿主细胞将亚基分泌到培养基中)，从不同的宿主细胞和/或培养基回收亚基，然后在体外将亚基组装成多亚基终产物。如果是在同一宿主细胞内生产多亚基抗体或抗体片段，可以理解的是，各种亚基的产生可能受到同一载体上多个多肽编码核酸序列的表达的影响，或者受到包含于宿主细胞内所含多个载体上的多肽编码核酸序列的表达的影响。
A．构建编码人源化6G4.2.5单克隆抗体、抗体片段和变体的DNA
在根据上文所述的方法选出本发明的人源化抗体或抗体片段后，实验者就可以利用遗传密码来设计编码所需抗体或抗体片段的DNA。在实施方案之一中，在设计编码所需抗体或抗体片段的DNA时，使用的是表达宿主细胞所喜欢的密码子。编码所需抗体或抗体片段的DNA可用本领域已知的多种方法来制备。这些方法包括但不限于各种化学合成法，参见Engels等，Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.28：716-734(1989)，本文将其全部内容纳为参考，这些方法例如三酯法、亚磷酸酯法、亚磷酰胺和H-磷酸酯法。上述方法的一个变化是考虑使用基因融合，其中在载体内，编码抗体或抗体片段的基因与编码另一种蛋白或另一种蛋白片段的基因结合。这导致宿主细胞产生的抗体或抗体片段与另一种蛋白融合。这“另一种”蛋白通常是一种能够由细胞分泌的蛋白质或肽，这样就可以从培养基中分离和纯化所需的蛋白，而不需要当在所需蛋白存留在细胞内时那样必须破坏宿主细胞。或者，融合蛋白可以在细胞内表达。使用高表达的融合蛋白是十分有益的。
使用基因融合虽非必须但是有助于大肠杆菌内异源蛋白的表达，而且有助于这些基因产物随后的转化(Harris,T.J.R.,Genetic Engineering,Williamson,R.编辑，Academic,Lodon,Vol.4,P.127(1983)；Uhlen,M.&Moks,T.,Methods Enzymol.185：129-143(1990))。常用的是蛋白A融合，因为蛋白A，更具体地说是蛋白A的Z区与IgG的结合提供了纯化融合蛋白的“亲和手柄”。(Nillsson,B.&Abrahmsen,L.,)Methods Enzymol.185：144-161(1990))。已经证明，许多异源蛋白直接在大肠杆菌内表达时会被降解，但以融合蛋白表达时是稳定的。(Marston,F.A.O.,Biochem J.240：1(1986))。
融合蛋白可以用化学试剂来切割，例如在甲硫氨酸处切断的溴化氰，或在Asn和Gly之间切断的羟基胺。使用标准DNA重组方法学可以将编码这些氨基酸的核苷酸碱基对刚好插入在抗体或抗体片段基因的5’端之前。
或者，可用蛋白酶来切割融合蛋白，最近刚对该方法进行了论述(Carter,P.(1 990),Protein Purification：From Molecular Mechanism to Large-Scale Process,Ladisch,M.R.,Willson,R.C.,Painton,C.C.,和Builder,S.E.k编辑，AmericanChemical Society Symposium Series No.427,Ch 13,181-193)。
蛋白酶，例如Xa因子、凝血酶、枯草杆菌蛋白酶以及它们的变体都已经被成功用于切割融合蛋白。通常，在“另一”蛋白(例如蛋白A的Z区)和所需蛋白(例如人源化抗IL-8抗体或抗体片段)之间插入一段易被所用蛋白酶切断的肽接头。使用重组DNA方法学，在基因之间或编码其它蛋白的基因或基因片段间插入编码接头的核苷酸碱基对。然后就可以对天然融合蛋白或还原或变性的融合蛋白进行蛋白酶切割，来部分纯化含有正确接头的融合蛋白。
目前还有许多技术可以用来生产各种人源化抗体或抗体片段，与亲本人源化抗体或抗体片段相比，所得到蛋白的氨基酸序列具有插入，缺失和改变。
在说明过程中，因为使用的是编码已知人源化抗体或抗体片段的表达载体，所以可以对抗体或抗体片段的DNA进行点特异性诱变(Kunkel等，MethodsEnzymol.204：125-139(1991)；Carter,P.等，Nucl.Acids.Res.13：4331(1986)；Zoller,M.J.等，Nucl.Acids.Res.10：6487(1982))，盒式诱变(Wells,J.A.等，Gene34：315(1985))，限制性选择诱变(Wells,J.A.等，Philos.Trans.R.Soc.London SerA317：415(1986)或其它已知技术。可以将变异DNA插入上文表达载体内取代亲本DNA。含有携带着变异DNA表达载体的宿主菌生长能够生产出变异的人源化抗体或抗体片段，然后按上文所述进行分离。
B．将DNA插入克隆载体
将编码抗体或抗体或抗体片段的DNA插入在可复制载体内作进一步克隆(DNA的扩增)或表达。有许多载体可供使用，适宜载体的选择取决于：(1)载体是用于DNA的扩增还是DNA表达，(2)插入载体的DNA的大小，和(3)用该载体转化的宿主细胞。根据各自的功能(DNA扩增或DNA表达)和其相容性宿主细胞，各个载体含有不同的组成成分。载体的组成通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列，复制起始位点，一个或多个标志基因，增强子元件，启动子，和转录终止序列。
      (ⅰ)信号序列
通常，信号序列可以是载体的一个组分，或可以是插入载体的抗体或抗体片段DNA的一部分。较好的是，选用异源信号序列，将其与抗体或抗体片段的DNA融合，这样，相应的融合蛋白内的信号序列会在宿主细胞的蛋白质分泌系统内被识别，转运和加工(即被信号肽酶切割)。如果是原核宿主细胞，信号序列选自例如碱性磷酸酯酶、青霉素酶、1pp或热稳定性外毒素Ⅱ的前导序列。在优选实施方案中，如下文实施例所述，使用的是STⅡ信号序列。就酵母菌分泌而言，天然信号序列可以代之以酵母菌转化酶前导序列，α因子前导序列(包括酿酒酵母和克鲁维酵母的α因子前导序列)或者酸性磷酸酯酶前导序列，C.Albicans葡糖淀粉酶的前导序列，或WO90/13646中所述的信号。在哺乳动物细胞表达中，则可得到哺乳动物信号序列和病毒分泌前导序列，例如单纯性庖疹病毒gD信号。
      (ⅱ)复制起始位点
表达载体和克隆载体都包含一段使得载体能够在一种或多种选定的宿主细胞内复制的核酸序列。通常，在克隆载体内，此序列是一种使载体能够独立于宿主染色体DNA之外进行复制，并包含复制起始位点的序列，或自主复制序列。许多细菌、酵母和病毒的这类序列都是已知的。质粒pBR322的复制起始位点适用于大多数革兰阴性菌，质粒2μ的复制起始位点适用于酵母菌，各种病毒(SV40，多瘤病毒，腺病毒，VSV或BPV)的起始位点适用于哺乳动物细胞内的克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起始位点(通常使用SV40复制起始位点只是因为它含有早期启动子)。
大多数表达载体是“穿梭”载体，即，它们能够在至少一类生物体内复制，并能被转染到另一生物体内进行表达。例如，先将一载体在大肠杆菌内克隆，然后在将该载体转染酵母菌或哺乳动物细胞进行表达，即使该载体不能独立于宿主细胞染色体进行复制。
还可以通过插入宿主的基因组来扩增DNA。例如，使用杆菌作为宿主细胞，将一段与杆菌基因组DNA内某序列同源的DNA序列包含在载体内就可以方便地做到这一点。
用这样的载体转染杆菌就能够导致该基因组与插入的抗体或抗体片段的DNA同源重组。
      (ⅲ)选择基因
表达载体和克隆载体都应含有一个选择基因，该基因又称可选性标志。该基因编码着被转化宿主细胞在选择性培养基上存活和生长所必需的蛋白。未被含选择基因的载体转化的宿主细胞在选择培养基上不能存活。通常选择基因编码的蛋白(a)提供对抗生素或其他毒素(例如氨卞青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四环素)的抗性，(b)弥补营养陷型缺，或(c)提供复合培养基中所没有的关键营养素，例如编码杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个实施例使用某种药物来阻止宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的宿主细胞表达了赋予药物抗性的蛋白，因此能够通过选择程序而存活。这类优势选择的实施例使用的药物是新霉素(Southern等，J.Molec.Appl.Genet.,1：327(1982))、霉酚酸(Mulligan等，Science,209：1422(1980))或潮霉素(Sugden等，Mol.Cell.Biol.,5：410-413(1985))。以上三个实例使用在真核调控下的细菌基因来传递对相应药物(G418或新霉素(遗传霉素)，xgPt(霉酚酸)和潮霉素)的抗性。
适用于哺乳动物细胞的可选标志的另一个例子是：能够确定能摄取抗体或抗体片段核酸的细胞，例如二氢叶酸还原酶(DHFR)或胸腺嘧啶激酶。将哺乳动物细胞转化体置于选择压力下，这种压力使得只有转化体因为摄取了标志而得以生存。选择压力是这样形成的：在特定条件下培养转化体，该特定条件为不断改变培养基中的选择剂浓度，造而导致选择基因和编码抗体或抗体片段的DNA一同扩增。扩增是一种过程，在此过程中产生生长必需蛋白的需求较大的基因在不断产生的重组细胞的染色体内反复地复制成串。由这些扩增的DNA合成了数量增加的抗体或抗体片段。
例如，首先将所有的转化体培养在含有DHFR竞争性拮抗剂氨甲蝶呤(Mtx)的培养基中，先鉴定出带有DHFR选择基因的转化细胞。当使用的是野生型DHFR时，合适的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)，该细胞系的制备和繁殖参见Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.77：4216(1980)。然后令转化细胞接触浓度增高的氨甲蝶呤。由此合成DHFR基因的多重拷贝，同时合成含有表达载体的其他DNA(例如编码抗体或抗体片段的DNA)的多重拷贝。如果(例如)使用的是对Mtx具有高度抗性的突变型DHFR基因(EP117060)，虽然有内源性DHFR存在，上述扩增技术可用于其它合适的宿主细胞，例如ATCC No CCLl6CHO-K1。或者，将细胞培养在含有针对各可选性标志的选择剂(例如卡那霉素，新霉素或G418等氨基糖苷类抗生素)的培养基中，由此可以选择出用编码抗体或抗体片段、野生型DHFR蛋白和氨基糖苷3’磷酸转移酶(APH)之类其他可选标志的DNA序列转染或共转染的宿主细胞(尤其是含有内源DHFR的野生型宿住)。参见美国专利4,965,199。
适用于酵母菌的选择基因是存在于酵母质粒Yrp7中的trpl基因。Stinchcomb等，Nature(自然)，282：39(1979)；Kingsman等，Gene(基因)，7：141(1979)或Tschemper等，Gene(基因)，10：157(1980)。trp1基因为在缺乏色氨酸中生长能力的突变型酵母菌株(例如ATCC No 44076或PEP4-1)提供了选择标志。Jones.Genetics 85：12(1977)酵母宿主细胞基因组内存在的trp1损伤，通过在色氨酸缺乏下的生长为测定是否转化提供了有效的环境。与此相似，已知的携带Leu2基因的质粒可以补偿Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)。
    (ⅳ)启动子
表达载体通常含有一个启动子，它能被宿主生物识别并操作性地与抗体或抗体片段核酸连接。启动子是位于结构基因起始密码子上游(5’)(一般在100至1000bp之内)的非翻译序列，它控制着与之操作性连接的特定核酸序列(例如抗体或抗体片段的编码序列)的转录和翻译。这样的启动子一般分为两类，诱导型和组成型。诱导型启动子会对培养条件中的某种变化(例如某种营养素的有无或温度的改变)作出反应，即提高受其调控的DNA的转录水平。当前，可被多种潜在宿主细胞识别的大量启动子已众所周知。
适用于原核宿主的启动子包括β-乳糖酶和乳糖启动子系统(Chang等，Nature(自然)，275：615(1978)和Goeddel等，自然，281：544(1979))，碱性磷酸酶和色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel,Nucleic.Acids.Res.8：4057(1980)和EP36776)和杂交启动子，例如tac启动子(deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80：21-25(1983))。但是，已知的其他细菌启动子也适用。它们的核酸序列已经公开，由此，使本领域技术人员能够利用接头或衔接子将它们与编码抗体或抗体片段的DNA操作性连接，以提供各种需要的限制性位点。(Siebeulist等，Cell20：269(1980))。用于细菌系统的启动子通常还含有与编码抗体或抗体片段的DNA操作性连接的Shine-Dalgarno(SD)序列。
适用于酵母宿主的启动序列包括3-磷酸甘油酯激酶的启动子(Hitzeman等，J.Biol.Chem.,255：2073(1980))或其他糖酵解酶(Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.,7：149(1968)；和Holland,Biochemistry,17：4900(1978))，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酯突变酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶的启动子。
其他酵母启动子-另具有转录受生长条件控制这一优点的诱导型启动子-是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酯酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶和负责麦牙糖和半乳糖的利用的酶的启动子区域。Hitzeman等，EP73657A中对适用于酵母菌表达的载体和启动子有更具体的说明。有利的是与酵母菌启动子一同使用酵母菌增强子。
真核生物的启动子序列是已知的。几乎所有的真核生物基因都具有一段AT丰富区，位于转录起始位点上游约25-30碱基处。存在于许多基因转录起始位点上游70-80碱基处的另一段序列是CXCAAT区，其中的X可以是任何核苷酸。大多数真核基因的3’末端是AATAAA序列，这可能是编码序列的3’末断加入聚A尾的信号。所有以上序列都适合插入哺乳动物表达载体内。
哺乳动物宿主细胞内抗体或抗体片段编码DNA的载体驱动转录可能受以下病毒的基因组启动子的调控，如多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日公开的英国专利2211504)、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒，最好是猴病毒40(SV40)；受异源哺乳动物启动子的启动子(例如肌动蛋白启动子和免疫球蛋白启动子)的调控，和受热休克启动子的启动子的调控，只要这些启动子与宿主细胞系统相容。
可以方便地获得SV40病毒的早期和晚期启动子作为SV40限制性片段，其中还包含SV40病毒的复制起始位点。Fiers等，Nature,273：113(1978)；Mulligan和Berg,Science(科学)，209：1422-1427(1980)；Pavalakis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,78：7398-7402(1981)。可以方便地获得人巨细胞病毒的立即早期启动子，它是HindⅢ E限制性片段。Greenaway等，Gene,18：355-360(1982)。美国专利4,419,446说明了一种用于在哺乳动物宿主中表达DNA的系统，它使用牛乳头瘤病毒作为载体。美国专利4,601,978描述了该系统的改进。参见Gray等，Nature,295,503-508(1982)有关在猴细胞内表达编码人干扰素的cDNA,Reyes等，Nature,297,598-601(1982)有关在小鼠细胞内在单纯庖疹病毒的胸腺嘧啶激酶启动子调控下表达人干扰素的cDNA,Canaani和Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,79：5166-5170(1982)有关在培养的小鼠和家兔细胞内表达人干扰素1基因，和Gorman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,79：6777-6781(1982)有关利用罗斯(Rose)肉瘤病毒的长末端重复序列作为启动子在CV-1猴肾细胞、鸡胚胎成纤维细胞、中国仓鼠卵巢细胞、Hela细胞和小鼠NIH-3T3细胞内表达细菌CAT序列。
      (ⅴ)增强子
在载体内插入增强子序列通常能够提高高级真核宿主细胞对编码抗体或抗体片段的DNA的转录。增强子是DNA顺式作用元件，通常约为10-300bp，它作用于启动子以提高转录。增强子具有相对的取向和位置独立性，它存在于转录单元的3’端(Lusky等，Mol.Cell.Bio.,3：1180(1983))和5’端(Laimins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,78：993(1981)，位于一内含子内部(Banerji等，Cell,33：729(1983))并位于编码序列本身之内(Osborne等，Mol.Cell.Bio.,4：1293(1984))。许多哺乳动物基因的增强子序列现在已知道(珠蛋白，弹性蛋白酶，白蛋白，胚胎(feto)蛋白和胰岛素)。但是，通常使用的是真核细胞病毒的增强子。例如位于复制起始位点晚期侧(100-270bp)的SV40增强子，巨细胞病毒早期启动子的增强子，复制起始位点晚期侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。有关激活真核生物启动子的增强元件还可以参见Yaniv,Nature,297：17-18(1982)。在载体内，增强子可以拼接在抗体或抗体片段DNA的5’或3’端，但最好是在启动子的5’位置。
      (ⅵ)转录终止序列
用于真核宿主细胞(酵母菌，真菌，昆虫，植物，动物，人或其他多细胞生物的有核细胞)的表达载体还可以含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。这样的序列通常可得自真核生物或病毒DNA或cDNA的5’端，有时是于3’端非翻译区。这些区域含有转录后成为聚腺苷酸化片段的核苷酸节段，位于编码抗体或抗体片段的mRNA的非翻译区。3’端的非翻译区还包含转录终止位点。
包含一个或多个上述部件和所需的编码和调控序列的合适载体是用标准连接技术来构建的。将分离后的质粒或DNA片段按照需要的形式切割，缝合和重新连接，产生所需的质粒。
为了分析证实构建的质粒内的序列是正确的，用连接混合物来转化大肠杆菌K12的294菌株(ATCC 31,446)，适时地用氨卞青霉素或四环素抗性选出转化成功的转化体。从转化体制备质粒，用限制性核酸内切酶消化来进行分析，并且/或者用Messing等的方法，Nucleic Acids Res.,9：309(1981)或Maxam等的方法，Methodsin Enzymology,65：499(1980)来测序。
本发明实施中特别有用的是提供编码抗体或抗体片段的DNA在哺乳动物细胞内临时表达的表达载体。一般地说，临时表达涉及到：使用能够在宿主细胞内有效复制的表达载体，使得宿主细胞内积累该表达载体的许多拷贝，然后高水平地合成该表达载体编码的所需多肽。
适用于在重组脊椎动物细胞培养中合成抗体或抗体片段的其他方法，载体和宿主细胞参见Gething等，Nature,293：620-625(1981)；Mantei等，Nature,281：40-46(1979)；Levinson等，EP117,060和EP117,058。特别适用于在哺乳动物细胞培养中表达IgE肽拮抗剂的质粒是pRK5(EP专利公开307,247)或pSV16B(1991年6月13日公开的PCT专利申请WO91/08291)。
C．宿主细胞的选择和转化
适合克隆或表达本发明载体的宿主细胞是上文所述的原核细胞，酵母细胞或高级真核细胞。合适的原核细胞包括革兰阴性菌和革兰阳性菌等真细菌，例如，大肠杆菌，诸如枯草牙孢杆菌之类的牙孢杆菌，绿脓杆菌，鼠伤寒沙门菌或粘质沙雷菌等假单孢菌。一个优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446)，虽然其他大肠杆菌例如大肠杆菌B、大肠杆菌1776(ATCC31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC27,325)也适用。以上举例是说明性的，而不是限制性的。宿主细胞最好能够分泌少量的蛋白水解酶。在一个优选实施例中，如下文实施例所述，用大肠杆菌49D6作为表达宿主。论述在细菌宿主细胞内重组生产抗体的综述文献包括Skerra等，Curr.Opinion in Immuno1.,5：256(1993)和Plumckthun,Immunol.Revs.,130：151(1992)。
除了原核细胞以外，真核微生物，例如丝状真菌或酵母也适合作为含有抗体或抗体片段编码DAN载体的宿主。在低级真核宿主微生物中，最常用的是酿酒酵母或普通的面包酵母。但是，许多其他属、种和菌株也通常可得而且可用于本发明，例如S.Pombe(Beach & Nurse,Nature,290：140(1981))、lactis克鲁维酵母(Louvencourt等，J.Bacteriol.,737(1983))、yarrowia(EP402,226)、Pichiapastoris(EP183,070)、Trichoderma reesia(EP244,234)、Neurospora crassa(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,76：5259-5263(1979)和曲霉属宿主，例如黑曲霉(Ballance等，Biochem.Biophys.Res.Commun.,112：284-289(1983)；Tilburn等，Gene,26：205-221(1983)；Yelton等，)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,81：1470-1474(1984))和A.niger(Kelly & Hynes,EMBO J.,4：475-479(1985))。
还可以使用来自多细胞生物的宿主细胞来重组生产抗体或抗体片段。这样的宿主细胞具有复杂加工和糖基化的能力。原则上说，高级真核细胞培养物均可使用，不论是脊椎动物的还是非脊椎动物的。非脊柱动物的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了大量杆状病毒株和变体，以及相应的允许的昆虫宿主细胞，这些细胞来自宿主：Spodoptera frugiperda(蛾)，Aedes aegypti(蚊),Aedesalbopictus(蚊),Drosophila melanogaster(果蝇)和Bombyx mori宿主细胞已获鉴定。参见Luckow等，Bio/Technology,6：47-55(1988)；Miller等，Genetic Engineering,Setlow,J.K.等，8：277-279(Plenum Publishing,1986)，和Maeda等，Nature,315：592-594(1985)。这类病毒株中有许多是公众能够得到的，例如Autographacalifornica NPV的L-1变株和Bombyx mori NPV的Bm-5毒株，以上病毒也可以用作本发明的病毒，尤其适用于转染Spodoptera frugiperda细胞。
可以使用棉花，玉米，土豆，大豆，矮牵牛(petunia)，西红柿和烟草等植物细胞培养物作为宿主。植物细胞一般通过与根瘤土壤杆菌的特定菌株一起培养来进行转染，所用的菌株已经经加工而含有了抗体或抗体片段的DNA。在植物细胞与根瘤土壤杆菌一起培养期间，编码抗体或抗体片段的DNA被转染给植物细胞宿主，植物细胞由此被转染并将在合适的条件下表达抗体或抗体片段的DNA。此外，与植物细胞相容的调控序列和信号序列也可获得，例如胭脂氨酸合成酶启动子和聚腺苷酸化信号序列。Depicker等，J.Mol.Appl.Gen.,1：561(1982)。此外，分离自T-DNA780基因上游区域的DNA节段能够激活或提高植物可表达基因在含有重组DNA的植物组织内的转录水平。
脊椎动物细胞培养物尤宜于重组法生产全长抗体。近年来，脊椎动物细胞在培养物(组织培养物)中的繁殖已经成为一种常规方法(Tissue Culture,AcademicPress,Kruse & Patterson编辑(1973))。适用的哺乳动物宿主细胞系例如被SV40转染的猴肾CV1细胞系(COS-7,ATCC CRL 1651)人胚胎肾细胞系(293或293亚克隆细胞，用于在悬浮培养中生长，Granham等，J.Gen Virol.,36：59(1977)，乳仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub & Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,77：4216(1980)；小鼠足(sertoli)细胞(TM4,Mather,Biol.Repord.,23：243-251(1980)；猴肾细胞(CV1,ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL2)；狗肾细胞(MDCK ATCC CCL34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2,HB8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TR1细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.,383：44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep2)。优选的宿主细胞是人胚胎肾293细胞和中国仓鼠卵巢细胞。不生成免疫球蛋白的骨髓瘤细胞也可以用作宿主细胞来重组生产全长抗体。
宜用上文所述的本发明的表达或克隆载体转染，最好是转化宿主细胞，然后培养在适合诱导启动子、挑选转化体，或者扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中。
转染指表达载体被宿主细胞所摄取，而不论实际上编码序列表达与否。本领域普通技术人员已知有许多转染方法，例如CaPO4沉淀法和电穿孔法。当宿主细胞内出现此载体活动的迹象，通常认为转染成功。
转化指将DNA引入生物体，使DNA或者作为染色体外元件或者通过与染色体的整合而复制。转化是根据所用的宿主细胞用适合该细胞的标准技术来进行的。对于含有坚实的细胞壁屏障的原核细胞和其他细胞一般如Sambrook等文献中第1.82章所述，用氯化钙进行钙处理。用根瘤土壤杆菌感染被用来转化特定的植物细胞，参见Shaw等，Gene,23：315(1983)和1989年6月29日公开的WO89/05859。对于没有细胞壁的哺乳动物细胞来说，宜采用磷酸钙沉淀法，参见Sambrook等文献中第16.30-16.37章。有关哺乳动物细胞宿主系统的全面信息可参考1983年8月16日授权于Axel等的美国专利4,399,216。转化酵母细胞一般是根据以下文献中的方法进行的，参见Van Solingen等，J.Bact.,130：946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,76：3829(1979)。然而，也可以使用其他将DNA引入细胞的方法，例如细胞核注射，电穿孔，或细胞质融合。
D．培养宿主细胞
将用来生产抗体或抗体片段的原核细胞培养在合适的培养基中，参见Sambrook等，同上。
用来生产抗体或抗体片段的哺乳动物宿主细胞可以在多种培养基中培养。可购得的商品化培养基Ham’sF10(Sigma)，极限必需培养基((MEM),Sigma),RPMI-1640(Sigma)和Dulbeceo’s改进的Eagle’s培养基((DMEM),Sigma)适合培养宿主细胞。此外，可以用作宿主细胞培养基的还有被本文纳为参考的以下文献中所述的培养基：Ham & Wallance,Meth.Enz.58：44(1979),Barnes & Sato,Anal.Biochem..102：255(1980)，美国专利4,767,704；4,657,866；4,927,762；或4,560,655；WO90/03430；WO87/00195；U.S.Pat.Re.30,985或U.S.Pat.5,122,469。以上培养基都可以根据需要补充以激素和/或其他生长因子(例如胰岛素，运铁蛋白或表皮生长因子)，盐(例如氯化钠，钙镁盐或磷酸盐)，缓冲液(例如HEPES)，核苷酸(例如腺嘌呤和胸腺嘧啶)，抗生素(例如庆大霉素TM)，微量元素(终浓度一般在微摩尔级的无机化合物)，和葡萄糖或与之相当的能源。培养基中还可以包含适当浓度的其他必需补充成分，这些都是本领域技术人员已知的。培养条件，例如温度和pH等，与先前用于所选宿主细胞表达的相同，而且，这对本领域技术人才来说是显而易见的。
本发明所指的宿主细胞包括体外培养中的细胞和宿主动物体内的细胞。
E．检测基因的扩增/表达
可以直接测定样品中基因的扩增和/或表达，例如利用常规Southern印迹、Northern印迹来定量mRNA转录产物(Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,77：5201-5205(1980))，斑点印迹(DNA分析)或根据本发明提供的序列利用适当标记的探针进行原位杂交。有许多标记可以使用，最常用的是放射性同位素，尤其是32p。然而，也可以使用其他技术，例如用生物素修饰的核苷酸测定引入多核苷酸。生物素起着结合亲和素或抗体(可以进行多种类型的标记，例如放射性核素，荧光团，酶等)的位点的作用。或者，可以使用能识别特定双链(包括DNA双链，RNA双链，DNA-RNA杂交双链或DNA-蛋白质双链)的抗体。然后可以标记该抗体，并如下进行测试：当双链与某表面结合，在表面上形成双链之后测定与之结合的抗体的存在。
或者，可以利用免疫学方法来测定基因的表达，例如对组织切片的免疫组织化学染色和对细胞培养物或体液的测试，用以直接定量基因产物的表达。免疫组织化学染色法包括通过脱水和固定来制备细胞样品，然后与经标记的对基因产物有特异性的抗体反应，所述的标记通常是可以目测的，例如酶标记，荧光标记，发光团标记等。适用于本发明的一种特别灵敏的染色技术参见Hsu等，Am.J.Clin.Path.75：734-738(1980)。
F．抗体或抗体片段的纯化
如果是在宿主细胞分泌系统中，抗体或抗体片段是从培养基中回收的。或者，抗体可以形成于胞内，或形成于细菌宿主细胞的周质间隙中。如果抗体形成于胞内，第一步是裂解宿主细胞，然后用例如离心或超滤去除生成的碎片颗粒。Cater等在Bio/Technology 10：163-167(1992)中说明了一种分离分泌在大肠杆菌周质间隙内的抗体的方法。简而言之，在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)中融化细胞浆状物30分钟。离心去除细胞碎片。如果抗体被分泌在培养基中，通常首先用市售的蛋白质浓缩滤膜(例如Amicon或Millipore超滤单元)浓缩这类表达系统的上清液。在以上各步骤中都可以使用PMSF之类蛋白酶抑制剂来抑制蛋白水解作用，还可以加入抗生素来防止偶然污染物的生长。
从细胞制取的抗体组分可用以下方法纯化，例如：羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和性层析，纯化技术以亲和性层析为佳。蛋白A是否适用作为亲和性配体取决于抗体中免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用于纯化人γ1,γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有的小鼠同种型和人γ3(Guss等，EMBO J.5：1567-1575(1986))。固定亲和性配体的基质通常是琼脂糖，但是也可以使用其他基质。机械性能稳定的基质，例如孔径可控的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯，可以允许比用琼脂糖快的流速和较短的操作时间。当抗体含有CH3区时，可以用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)来进行纯化。根据欲回收的抗体，还可以使用其他蛋白质纯化技术，例如离子交换柱组分、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅层析、肝素SepharoseTM层析、阴离子或阳离子交换树脂层析(例如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在初步纯化之后，可以对含有所需抗体和杂质的混合物进行低pH疏水作用层析，所用洗脱缓冲液的pH在约2.5-4.5之间，最好在低盐浓度(例如含盐约0-0.25M)下进行。
G．抗体片段的纯化
已经开发出了多种方法来生产本发明的人源化抗体片段，包括Fab、Fab’、Fab’-SH或F(ab’)2片段。这些片段一般是通过蛋白酶消化完整抗体而衍生得到的(参见Morimoto等，Jounal of  Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)和Brennan等，Science,229：81(1985))。但是，现在可以由重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，可以直接由大肠杆菌回收Fab’-SH片段，然后化学偶联形成F(ab’)2片段(Cater等，Bio/Technology,10：163-167(1992))。根据另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养物中回收F(ab’)2片段。生产抗体片段的其他技术是本领域技术人员已知的。
5．抗-IL-8抗体的用途
    A．用于诊断
为了检测或定量IL-8作为诊断应用，本发明的抗体或抗体片段通常应加以可测标记。任何能够直接或间接产生可测信号的标记都可以使用。例如，可测标记可以是放射性同位素，如3H、14C、32P、35S或125I；荧光素或化学发光化合物，例如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素；放射性同位素标记，例如125I、32P、14C或3H；或酶，例如碱性磷酸酶、B-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。
用于分别将抗体或抗体片段与可测部分偶联的各种本领域已知方法均可使用，其中包括以下文献中的方法：Hunter等，Nature,144：945(1962)；David等，Biochemistry 13：1014(1974)；Pain等，J.Immunol.Meth.40：219(1981)；和Nygren,J.Histochem.And CytoChem.30：407(1982)。
本发明的抗体和抗体片段可用于各种已知试验方法中，例如竞争性结合试验，直接和间接夹心试验和免疫沉淀试验。例如，参见Zola,Monoclonal Antibodies：A Mannual ofTechniques,pp.147-158(CRC Press,Inc.,1987)。
竞争性结合试验是根据标记的标准物(可以是IL-8或其免疫活性部分)与测试样品中的分析物竞争结合有限量抗体或抗体片段的能力。测试样品中IL-8的含量与结合抗体的标准物的量成反比。为了有助于测定结合的标准物的量，通常在竞争前或竞争后将抗体或抗体变成不溶性析出，这样，可以方便地将与抗体结合的标准物和分析物与未结合的标准物和分析物分离开来。
夹心试验使用两种抗体，各自能够与待测的IL-8蛋白上不同的抗原性部分或表位结合。在夹心实验中，测试样品分析物与固定在固相载体上的第一抗体结合，然后第二抗体与分析物结合，由此形成不溶的三元复合物(美国专利4,376,110)。第二抗体本身带有可测标记(直接夹心试验)，或者可以用带可测标记标的抗免疫球蛋白抗体来测定(间接夹心试验)。例如，夹心试验中的一种是ELISA试验，其中的可测部分是酶(例如辣根过氧化物酶)。
IL-8抗体和抗体片段还可用于从重组细胞培养物或天然来源中亲和纯化IL-8。例如，可用已知技术将抗体固定于固相载体，用于从培养物上清液或组织等来源纯化IL-8。
B．抗-IL-8抗体的治疗用组合物和给药
本发明的人源化抗-IL-8抗体和抗体片段可以用来治疗炎性疾病，例如成人呼吸困难综合征(ARDS)、低血容量性休克、溃疡性结肠炎和类风湿关节炎。如下制备人源化抗IL-8抗体和抗体片段的治疗用制剂用于保存：将纯度达标的抗体或抗体片段与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington’sPharmaceutical Science，同上)混合，制成冷冻干燥块或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用剂量和浓度对使用者来说是无毒的，它们包括磷酸，柠檬酸和其他有机酸缓冲液，维生素C之类抗氧化剂，低分子量的多肽(少于约10个残基)，血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白之类蛋白质，诸如聚乙烯吡硌烷酮的亲水性聚合物，甘氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸之类氨基酸，包括葡萄糖、麦牙糖或糊精在内的单糖、多糖和其他碳水化合物，诸如EDTA之类的螯合剂，甘露醇或山梨醇等糖醇，诸如钠的盐形成反离子，和/或非离子表面活性剂，例如吐温、Pluronics或聚乙二醇(PEG)。
用于体内给药的人源化抗IL-8mAb或抗体片段必须是无菌的。在冷冻干燥和再生之前或之后通过无菌滤膜过滤很容易做到这一点。一般以冷冻干燥或溶液的形式来保存人源化抗IL-8mAb或抗体片段。
一般将治疗用人源化抗IL-8mAb或抗体片段组合物保存在具有无菌入口的容器内，例如塞子可用皮下注射针头刺穿的静脉输液袋或瓶。
人源化抗IL-8mAb或抗体片段的给药途径按已知方法进行，例如吸入，静脉注射或输液，腹膜内，脑内，肌内，眼内，动脉内或损伤内途径，使用灌肠剂或拴剂，或者使用下文提到的缓释系统。抗体最好全身性给药或在炎症部位给药。缓释制剂的合适例子包括成型的半透性聚合物基质，例如膜或微囊。缓释基质包括聚酯、水凝胶、polyactide(美国专利3,773,919,EP58,481)、L谷氨酸和γ-L谷氨酸乙酯的共聚物(Sidman等，Biopolymers,22：547(1983))、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15：167(1981)和Langer,Chem.Tech.12：98(1982))、乙烯乙酸乙酯(Langer等，同上)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP133988)。缓释的人源化抗IL-8 mAb或抗体片段组合物还包括脂质体包埋的抗体或抗体片段。含有抗体或抗体片段的脂质体是通过以下已知方法来制备的：DE3,218,121；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,77：4030(1980)；EP52,322；EP36,676；EP88,046；EP143,949；EP142,641；日本专利申请83-118008；美国专利4,485,045和4,544,545；和EP102,324。脂质体一般是小(约200-800_)单室型，其中脂成分为摩尔百分比30％以上的胆固醇，为了达到抗体或抗体片段的最好治疗效率需要调节所选的比例。
用于治疗的人源化抗IL-8mAb或抗体片段的“有效量”取决于治疗目的、给药途经和病人状态等。所以，为了获得最佳的治疗效果，医生需要确定剂量和修改给药途径。一般，医生将不断给予人源化抗IL-8mAb或抗体片段直到达到能够获得所需效果的剂量。用常规试验能够方便地监控这种治疗的进程。
在用本发明的人源化抗IL-8mAb或抗体片段治疗和预防炎性疾病时，必须以符合良好医疗规范的方式来进行抗体组合物的配制、确定剂量和给药。此时需要考虑的因素包括待治疗的具体病症、待治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床情况、病因、抗体欲送达的部位、抗体的具体类型、给药方法、疗程安排，以及医生知道的其他因素。确定“治疗有效量”的抗体需要考虑以上因素，这是预防，缓解或治疗炎性疾病所需的最小量，包括治疗急性或慢性呼吸道疾病，缓解炎性反应。此剂量宜低于对宿主造成毒性或者明显增加宿主对感染的易感性的用量。
作为一般提议：非肠胃道给药每剂抗体或抗体片段的最初药学有效量为每日患者体重0.1-50mg/kg之间，抗体使用的通常起始剂量为0.3-20mg/kg/d，较好的是0.3-15mg/kg/d。
但是如上文所述，必须让以上抗体或抗体片段的建议剂量经受大量治疗方面的考验。选择合适剂量和治疗方案的关键因素是看所得结果。
抗体或抗体片段不需要但是最好与一种或多种目前用来预防或治疗炎症的药物配制在一起。以类风湿关节炎为例，可以将抗体与糖皮质类药物一起给药。其他药物的有效量取决于制剂中抗体或抗体片段的含量、疾病或疗法的类型，以及上文所述的其他因素。它们的使用剂量和给药途径与现有文献中的大致相同，或者说是现有文献中使用剂量的1％至99％。
以下实施例是用来说明本发明的，而不是限定本发明的范围。说明书中引用的参考文献，以及其中所公开的内容都被本文纳为参考。
                              实施例
A.抗人IL-8单克隆抗体的产生和特性分析
用重悬在MPL/TDM(Rijbi Immunolchem.Research Inc.,Hamilton,MT)中的10μg重组人IL-8(产品为(ser-IL-8)与遍在蛋白(泛素)(Hebert等，J.Immunology,145：3033-3040(1990)；IL-8可以向Pepro Tech Inc.,Rocky Hill,NJ购买))的融合物在小鼠两后足垫注射或腹膜内注射免疫Balb/c小鼠，用同样剂量的IL-8进行两次加强免疫。在这类实验中，除非另作说明，“IL-8”表示(ser-IL-8)72。最后一次加强免疫在细胞融合前3天进行，给予10μgIL-8。如上文所述，使用35％的聚乙二醇，将脾细胞或腘窝淋巴节细胞与小鼠骨髓瘤P3X63Ag8U.1(ATCC CRL1597)融合，后者是骨髓瘤P3X63Ag8的一种非分泌性克隆。细胞融合后10天，用ELISA筛选培养物上清液，是否存在IL-8的单克隆抗体。
如下进行ELISA。Nunc96孔免疫测试板(Flow Lab,McLean,VA)以磷酸缓冲液(PBS)配成的2μg/ml IL-8溶液，每孔50μl包被4℃过夜。以后步骤在室温下进行。用0.5％的牛血清白蛋白(BSA)封闭非特异性结合位点1小时。将测试板与50μl/孔的自672个活亲本融合格的杂交瘤培养物上清液一起培育1小时，然后与50μl/格碱性磷酸酶偶联山羊抗小鼠Ig(Tago Co.,Foster Coty,CA)(1mg/ml储备液)1∶1000稀释液培育1小时。加入r-磷酸硝基苯酯(以pH9.6碳酸钠缓冲液配成0.5mg/ml)液100μl/孔，测定与测试板结合的酶联抗体的水平。用ELISA读数仪(Titertrek Multiscan,Flow Lab,McLean,VA)在405nm处测定显色反应。在各步骤之间，测试板用含有0.05％吐温20的PBS洗涤3次。
选出能促进IL-8结合比对照培养基高4倍以上的培养物上清液作为阳性。根据这一标准，672个有细胞生长的亲本融合孔(2％)有16个是阳性。采用有限稀释技术，将这些阳性杂交瘤细胞系克隆至少2次。
然后，对其中7个阳性杂交瘤进一步作如下特性分析。将Nunc96孔免疫测试板(Flow Lab,McLean,VA)包被IL-8过夜，用BSA封闭，与培养物上清液一起培育，然后加入预定量的碱性磷酸酶交联的同种异型特异性的山羊抗小鼠Ig(FisherBiotech,Pittsburgh,PA)，测定单克隆抗体的同种异型。如前所述，加入γ-磷酸硝基苯酯液来测定与测试板结合的交联抗体的水平。
被测的全部单克隆抗体都属于免疫球蛋白IgG1或IgG2。在ELISA中，将产生最大结合之50％的稀释系数取倒数，由此测得，含有上述单克隆抗体的腹水其抗体效价在10,000-100,000之间。
为了评估计这些单克隆抗体是否结合相同的表位而进行了竞争性结合ELISA。当生物素化的mAb与未标记的mAb比率为1∶100时，生物素标记的mAb5.12.14的结合作用受到其同源mAb的显著抑制，但是不受mAb4.1.3的抑制，同时，生物素化mAb4.1.3的结合作用受到mAb4.1.3的抑制，但是不受mAb5.12.14的抑制。单克隆抗体mAb5.2.3的表现与mAb4.1.3类似，而单克隆抗体mAb4.8和12.3.9与mAb5.12.14类似。所以，mAb4.1.3和mAb5.12.14结合的表位与单克隆抗体12.3.9,4.8和5.12.14所识别的表位是不同的。
通过免疫斑点印迹评价了抗体与固定在硝酸纤维纸上的IL-8的反应活性。7种抗体都能够识别固定在纸上的IL-8，但是作为对照的小鼠IgG则不能。
采用放射免疫沉淀试验(RIP)评价了这些单克隆抗体捕捉可溶性125I-IL-8的能力。简而言之，在室温下，示踪剂125I-IL-8(4×104cpm)与单克隆抗IL-8抗体(以含0.5％BSA和0.05％吐温20的PBS(测试缓冲液)配制的)各种浓度的稀释液一起培育1小时。加入100μl已知浓度的山羊抗小鼠Ig抗血清(Pel-Freez,Rogers,AR)，将混合物在室温下培育1小时。加入0.5ml 6％聚乙二醇(M.W.8000)并静置于4℃，沉淀出免疫复合物。4℃2,000xg离心20分钟后，吸弃上清液，在γ读数仪上测定残留在沉淀中的放射活性。如下计算特异性结合的百分比：(沉淀cpm-背景cpm)/(总cpm-背景cpm)。在RIP中，单克隆抗体4.1.3,5.2.3,4.8,5.12.14和12.3.9捕捉125I-IL-8非常有效，而抗体9.2.4和8.9.1则不能捕捉可溶性125I-IL-8，尽管它们能够结合包被在ELISA测试板上的IL-8(表1)。
采用竞争性结合RIP试验测定了这些单克隆抗体的解离常数。简而言之，采用前述的RIP测定了各种浓度非标记IL-8对各个抗体结合125I-IL-8(20000-40000cpm/各个试验)的竞争性抑制。利用VersaTerm-PRO程序(Synergy Software,Reading,PA)中的Scatchard图线分析法(Munson等，Anal.Biochem.,107：220(1980))测定了各个mAb的解离常数(亲和力)。这些单克隆抗体的Kd(除了9.2.4和8.9.1外)在2×10-8至3×10-10M。单克隆抗体5.12.14的Kd为3×10-10M，在所有被测单克隆抗体中表现出最高的亲和力(表3)。
                 表3．抗IL-8单克隆抗体的特征说明
抗体 与IL-8特异性结合的％     Kd(M)  同种异型     pI
 4.1.3     58   2×10-9  IgG1  4.3-6.1
 5.2.3     34   2×10-8  IgG1  5.2-5.6
 9.2.4     1     -  IgG1  7.0-7.5
 8.9.1     2     -  IgG1  6.8-7.6
 4.8     62  3×10-8  IgG2a  6.1-7.1
 5.12.14     98  3×10-10  IgG2a  6.2-7.4
 12.3.9     86  2×10-9  IgG2a  6.5-7.1
为了评价上述抗体中和IL-8活性的能力，在各种含量培养上清液和纯化单克隆抗体存在下，测定了与人嗜中性白细胞结合的125I-IL-8的量。用单-聚(Mono-Poly)分辨培养基(M-PRM)(Flow Lab.Inc.,McLean,VA)来制备嗜中性白细胞。以血液与培养基之比为3.5∶3.0的比例将新鲜的肝素化人血铺在M-PRM上，300xg室温离心30分钟。收集富集在中间层的嗜中性白细胞，用PBS洗涤1次。根据Wright’s Giemsa染色法测定，这样的制备物一般含95％以上的嗜中性白细胞。如下进行受体结合试验。在室温下，将50μl125I-IL-8(5ng/ml)与50μl非标记的IL-8(100μg/ml)或单克隆抗体(以在含有0.1％BSA的PBS型)溶液一起培育30分钟。然后，将混合物与100μl嗜中性白细胞(107细胞/ml)37℃培育15分钟。将此混合物上样在0.4ml含有20％蔗糖和0.1％BSA的PBS上。然后300xg离心15分钟，将结合的125I-IL-8与未结合物质分离。吸弃上清液，在γ读数仪中计数沉淀的放射活性。
当IL-8比mAb为1∶25摩尔比时，单克隆抗体4.1.3,5.2.3,4.8,5.12.14和12.3.9对IL-8与人嗜中性白细胞结合的抑制达85％以上。另一方面，单克隆抗体9.2.4和8.9.1看来加强了IL-8与人嗜中性白细胞上其受体的结合。因为作为对照的小鼠IgG也加强IL-8在人嗜中性白细胞上的结合，mAb9.2.4和8.9.1加强IL-8与其受体的结合看来是非特异性的。所以，单克隆抗体4.1.3,5.1.3,4.8,5.12.14和12.3.9是潜在的中和性单克隆抗体，而单克隆抗体9.2.4和8.9.1则是非中和性单克隆抗体。
如下测定了IL-8诱导的抗IL-8抗体阻断嗜中性白细胞趋化性的能力。用Boyden仓室法来测定IL-8诱导的嗜中性白细胞趋化性(Larson等，Science243：1464(1989))。将100μl人嗜中性白细胞(106细胞/ml)重悬在含有0.1％BSA的RPMI中，将其置于上室，将29μl含有或没有单克隆抗体的IL-8(20nM)置于下室。细胞在37℃培养1小时。迁移到下室的嗜中性白细胞被Wright’s Giemsa染色，然后在显微镜下计数(放大100倍)。对每个实验组检查10个不同视野。当IL-8与mAb之比为1∶10时，中和性单抗5.12.14和4.1.3阻断了大鸡70％的IL-8嗜中性细胞趋化活性。
使用Fast凝胶系统(Phamacia,Piscataway,NJ)，将纯化的抗体上样在IEF聚丙烯酰胺凝胶(pH3-9,Pharmacia)上，测定各个mAb的等电点聚焦(IEF)形式。IEF凝胶已经在上样前用含有1％Triton X100的pharmalyte预处理了10分钟。根据制造商的说明，用银染色来显现IEF形式。各单克隆抗体均具有不同的IEF形式，这证明它们来自不同的克隆。各抗体的pI值见表3。
所有这些单克隆抗体与IL-8的(ala-IL-8)77和(ser-IL-8)72的两个形式结合得一样好。因为IL-8与炎性细胞因子(例如β-TG(Van Damme等，Eur.J.Biochem.181：337(1989)；Tanaka等，FEB,236(2)：467(1988))和PF4(Deuel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,74：2256(1977))的血小板因子4(PF4)家族的其他成员的序列同源性高于30％，所以测试了它们与β-TG和PF4以及另一嗜中性白细胞活化因子C5α的可能交叉反应性未观察到对这些蛋白质的可测见结合。例外的是mAb4.1.3，它与β-有轻度交叉反应。
对抗体之一，mAb5.12.14进行了进一步的研究，确定它是否能够阻断IL-8诱导的嗜中性白细胞释放弹性蛋白酶。简言之，将人嗜中性白细胞重悬在含有1.0％BSA，组分V(Sigma,St.Louis,MO),2mg/mlα-D葡萄糖(Sigma),4.2mM碳酸氢钠和0.01M HEPES,pH7.1(JRH Bioscience,Lenexa,KS)的Hanks平衡盐溶液(Gibco,Grand Island,NY)中。将细胞松弛素B(Sigma)溶于二甲砜(Sigma)(5mg/ml)制成储备液，保存在2-8℃。将细胞松弛素B加入嗜中性白细胞制备物，使其终浓度达到5μg/ml，37℃培养15分钟。人IL-8与mAb5.12.14(20μl)或阴性对照抗体置于lml聚丙烯试管(DBM,Scientific,San Fernando,CA)中37℃培育30分钟。IL-8的最终测试浓度为50和500nM。稀释单克隆抗体，产生以下比例(IL-8：Mab)：1∶50，1∶10，1∶2，1∶1和1∶0.25。加入细胞松弛素B处理过的嗜中性白细胞(100μl/试管)，25℃培养2小时。试管离心(210Xg,2-8℃)10分钟，将上清液转移到96孔组织培养板上(30μl/孔)。制备弹性蛋白酶底物储备液，即10mM甲氧基琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-丙酰-缬氨酰-对硝基酰基苯胺(Calbiochem,La Jolla,CA)的DMSO溶液，并保存在2-8℃。将弹性蛋白酶底物溶液(1.2mM底物，1.2M NaCl(Mallinckrodt,Paris,Kentucky),0.12M HEPES的蒸馏水溶液pH7.2)加入上清液(170μl/孔)中，37℃培育0.5-2小时(直到对照孔O.D.达到1.0)。在405nm测定吸光度(SLT 340 ATTC测试板读数仪，STL实验室设备，Austria)。
结果见图1。当IL-8比mAb5.12.14为1∶1时，抗体能够有效阻抑嗜中性白细胞的弹性蛋白酶释放。
产生抗体5.12.14的杂交瘤已经于1993年2月15日在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,USA.)进行了保藏，保藏登录号为ATCC HB11553
B．抗兔IL-8单克隆抗体的产生和特性分析
使用兔IL-8作为免疫原(由C.Broaddus提供；也可参见Yoshimura等，J.Immunol.146：3483(1991))，产生抗兔IL-8抗体的方法与产生抗人IL-8抗体的基本相同。如上所述对此抗体进行特性分析，即与ELISA测试板上包被的其他细胞因子的结合；没有发现与MGSA、fMLP、C5a、b-TG、TNF、PF4或IL-1有可测水平的结合。
产生抗体6G4.2.5的杂交瘤已经于1994年9月28日在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,USA.)进行了保藏，保藏登录号为ATCC HB11722。
如下构建5.12.14和6G4.2.5的重组人-小鼠嵌合Fabs。以下将嵌合6G4.2.5Fab与嵌合5.12.14Fab进行了详细的比较。
1．5.12.14-Fab与6G4.2.5-Fab对IL-8结合人嗜中性白细胞的抑制作用
通过竞争性结合试验测定了5.12.14-Fab与6G4.2.5-Fab两种嵌合Fab有效结合IL-8从而阻止IL-8结合人嗜中性白细胞受体的能力，该试验计算的是IC50-抑制50％的IL-8结合所需的浓度。
在各种浓度(0-300nM)的5.12.14-Fab与6G4.2.5-Fab、同种异型对照(4D5-Fab)或非标记IL-8存在下，将人嗜中性白细胞(5X105)与0.5nM125I-IL-8一起4℃培养1小时。然后，通过20％蔗糖和0.1％牛血清白蛋白磷酸缓冲液离心，去除未结合的125I-IL-8，通过在γ计数仪中计数细胞沉淀物来测定与细胞结合的125I-IL-8的量。图2显示了非标记IL-8对125I-IL-8与人嗜中性白细胞结合的抑制。图3显示了与Fab匹配的阴性同种异型抗体不抑制125I-IL-8与人嗜中性白细胞结合。5.12.14-Fab(图4)与6G4.2.5-Fab(图5)这两种抗IL-8 Fab都能抑制125I-IL-8与人嗜中性白细胞的结合，它们的平均IC50分别是1.6nM和7.5nM。
2．5.12.14-Fab与6G4.2.5-Fab对IL-8介导的嗜中性白细胞趋化的抑制作用
分离并计数人嗜中性白细胞，然后重悬(5×106细胞/ml)在含有0.1％牛血清白蛋白的Hank’s平衡盐溶液(缩写为HBSS；不含钙和镁)中。加入终浓度为2.0μM的calcein AM(Molecular Probe,Eugene,OR)进行嗜中性白细胞的标记。37℃培养30分钟后，细胞用HBSS-BSA洗涤两次，并重悬成5×106细胞/ml。
在Neuro Probe(Cabin John,MD)96孔测试室MBB96型中进行趋化实验。将实验样品(只有对照缓冲液、只有IL-8或IL-8+Fab)上样在Polyfiltronics 96孔View测试板(Nero Probe Inc.)上置于下室中。将100μl经calcein AM标记的嗜中性白细胞加入上室，并让其通过一5微米多空隙的无PVP聚碳酸酯框形滤膜(Neuro Probe Inc.)向下室样品迁移。然后，趋化仪在5％CO2中37℃培育40-60分钟。培育末吸取留在上室的嗜中性白细胞，用PBS洗涤上室3次。然后取下聚碳酸酯滤膜，用PBS湿润的扫帚扫下非迁移细胞，滤膜在空气中干燥15分钟。
测定滤膜的荧光强度，测定下室内容物的荧光强度，将以上两值相加，确定透过滤膜发生迁移的嗜中性白细胞的相对数量(嗜中性白细胞迁移指数)。调整CytoFluor 2300荧光板读数仪(Millipore Corp.Bedford,MA)适合读取Coming96孔测试板，使用的是485nm-20nm的激发滤光镜和530-25nm的发射滤光镜，灵敏度设置为3，来测定荧光强度。
结果显示在图6和7中。图6显示嵌合5.12.14-Fab与6G4.2.5-Fab对人IL-8介导的嗜中性白细胞趋化的抑制作用。图7显示嵌合5.12.14-Fab与6G4.2.5-Fab对兔IL-8介导的嗜中性白细胞趋化抑制的相对能力。
3．不同浓度的5.12.14-Fab与6G4.2.5-Fab对IL-8介导的嗜中性白细胞释放弹性蛋白酶的抑制作用
将健康男性供血者的血液抽入肝素化针管。通过葡聚糖沉淀，淋巴细胞分离液离心(Organon Teknika,Durham,NC)和低渗裂解污染的红细胞来分离嗜中性白细胞，参见Berman et al.,J.Cell Biochem.52：183(1993)。将最后的嗜中性白细胞沉淀在试验缓冲液中重悬成1X107细胞/ml，试验缓冲液是补充了1.0％BSA(组分V,Sigma,St.Louis,MO)、2mg/ml葡萄糖、4.2mM碳酸氢钠和0.01M HEPES，pH7.2.的Hanks平衡盐溶液(GIBCO,Grand Island,NY)。嗜中性白细胞于4℃保存不超过1小时。
在1ml聚丙烯试管内将IL-8(10μl)与抗IL-8 Fab、同种型的对照Fab或缓冲液(20μl)混合，并在37℃的水浴中培养30分钟。在剂量应答研究(图8)中使用的IL-8的终浓是0.01-1000nM，在有关Fab对弹性蛋白酶释放实验(图9和10)中所用的终浓为100nM。Fab浓度在20nM至300nM之间，使Fab：IL-8之比为0.2∶1至3∶1。嗜中性白细胞悬液中加入5μg/ml细胞松弛素B(Sigma)(使用5mg/ml的DMSO储备液)，细胞在37℃的水浴中培养15分钟。然后将细胞松弛素B处理过的嗜中性白细胞(100μl)加入IL-8/Fab混合物中。室温培养3小时后，离心沉淀嗜中性白细胞(200xg，5分钟)，取等分的无细胞上清液转移到96孔测试板上(30μl/孔)。将弹性蛋白酶的底物，甲氧基琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-丙酰-缬氨酰-对硝基酰基苯胺(Calbiochem,LaJolla,CA)制备成10nM的DMSO储备液，并保存在4℃。弹性蛋白酶底物的工作液在临使用前才配制(1.2mM弹性蛋白酶底物，1.2M NaCl,0.12M HEPES,pH7.2)，在每个含有样品的孔中加入170μl。测试板在37℃的组织培养箱中培养30分钟，或直到阳性对照孔的光密度值至少达到1.0。用STL340测试板读数仪(SLT LabInstrument,Austria)测定405纳米处的吸光度。图9显示嵌合性抗IL-8抗体具有抑制人IL-8激发的人嗜中性白细胞弹性蛋白酶释放的能力；图10显示，嵌合性抗IL-8抗体具有抑制兔IL-8激发的人嗜中性白细胞弹性蛋白酶释放的能力。
C．鼠5.12.14(抗IL-8)单克隆抗体轻链和重链可变区的分子克隆
从1×108细胞(杂交瘤细胞系ATCC HB-11722)分离总RNA，参见Chomczynski& Sacchi(Anal.Biochem.162：156(1987))所述的方法。设计合成的DNA寡核苷酸，使其能够与编码kappa轻链或IgG2a重链恒定区(这些区域的DNA序列公开在Sequences of Proteins of Immunological Interests,Kabat,E.A.etal.,(1991)NIHPublication 91-3242,V1-3)的小鼠RNA区段杂交，特异性引导mRNA反应，由此合成cDNA第一链。针对轻链和重链分别设计了3段引物(SEQID NO：1-6)，用于提高引物杂交的机会和合成cDNA第一链的效率(图13)。用两套合成的DNA寡核苷酸引物来完成由cDNA第一链到双链DAN的扩增：用于轻链可变区扩增的一段正向引物(SEQ ID NO：7-9)和一段反向引物(SEQ ID NO：10)(图14)，以及用于重链变可区扩增的一段正向引物(SEQ ID NO：11-14)和一段反向引物(SEQ ID NO：15-18)(图15)。5.12.14轻链或重链的N末端序列头8个氨基酸用于产生一段对应于该区域的推定鼠DNA序列。(用Edman降解蛋白质测序技术，测定了轻链和重链可变区自N末端起总共29个氨基酸)。该信息用于设计正向扩增引物，这些引物某些密码子的第三位有简并性，以提高引物与天然小鼠DNA密码子杂交的机会，而且这些引物还含有独特限制性位点MluⅠ，它有利于轻链可变区和重链可变区正向引物与克隆载体中的STⅡ元件的3’末端连接。反向扩增引物设计成能够退火结合对应于轻链或重链可变区/恒定区连接处附近的恒定区部位的鼠DNA序列。轻链可变区的反向引物含有独特的BstBⅠ限制性位点，而重链可变区的反向引物含有独特的ApaⅠ限制性位点，用来与载体(pB13.1(轻链)和pB14(重链))内的人IgGl轻链恒定区或者IgG1重链恒定区的5’端连接。聚合酶链反应中使用这些引物产生的DNA片段长约400bp。编码5.12.14轻链可变区的cDNA被克隆在载体pB13.1中形成pA51214VL，5.12.14重链可变区被克隆在载体pB14中形成pA51214VH。通过DNA测序对cDNA插入物进行了特性分析，以图16(鼠轻链变区)中的DNA序列(SEQIDNO：19)和氨基酸序列(SEQ ID NO：20)和图17(鼠重链可变区)中的DNA序列(SEQID NO：21)和氨基酸序列(SEQ ID NO：22)表示。
D．A5.12.14FAb载体的构建
初始结构物pA51214VL中，5.12.14鼠轻链可变区末端到人IgG轻链恒定区内独特克隆位点BstBI之间的氨基酸是相应于小鼠IgG恒区(图16)的头13个氨基酸的鼠源序列。所以，该质粒含有一段多余的鼠重链部分将5.12.14鼠轻链可变区与人IgG轻链恒定区分开。该插入序列会改变嵌合体的氨基酸序列，而且很可能产生错误折叠的Fab。在A109之后立即截断cDNA克隆，并通过聚合酶链反应来将BstBⅠ位点移位到可变区/恒定区连接处解决了这一问题。图18显示了用于实现上述修饰的扩增引物。正向引物VL前(SEQ ID NO：23)被设计成与STⅡ信号序列的最后5个氨基酸(包括MluⅠ克隆位点)和5.12.14鼠轻链可变区序列的头4个氨基酸匹配。该序列头两个密码子D1和I2的第三位与原cDNA不同，D1(T变成C)和I2(C变成T)，由此形成一个独特的EcoRV克隆位点供以后的构建使用。反向引物VL后(SEQ IDNO：24)被设计成与人IgG1轻链恒定区序列的头3个氨基酸和5.12.14轻链可变区序列的最后7个氨基酸(包含独特的BstBI克隆位点)相匹配。在添加BstBI位点时，编码几个氨基酸的核苷酸序列被改变：L106(TTG变成CTT)，造成对精氨酸的保守性氨基酸取代的K107(AAA变成CGA)以及R108(CGG变成AGA)。然后在两部分连接反应中将编码修饰的5.12.14轻链可变区序列的PCR产物亚克隆到pB13.1中。将被MluI-BstBI消化的编码轻链可变区的5.12.14 PCR产物连接到MluI-BstBI消化的载体中，形成质粒pA51214VL’。通过DNA测序对修饰的cDNA进行特性分析。5.12.14轻链的编码序列见图19。
类似的，pA51214VH内重链可变区末端至人IgG1重链恒定区内独特的克隆位点Apal之间的DNA序列，经重新构建将该区域的鼠氨基酸序列改成人氨基酸序列。这是通过聚合酶链反应进行的。用图18中的引物进行鼠5.12.14重链可变区序列的扩增。正向PCR引物(SEQ ID NO：25)被设计成与pA51214VH内STⅡ信号序列上游的核苷酸867-887和编码重链可变区的推定cDNA序列相匹配，并包括独特的克隆位点SpeⅠ。反向PCR引物(SEQ ID NO：26)被设计成与5.12.14重链可变区序列的最后4个氨基酸和人IgGl重链恒定区序列相应的头6个氨基酸，(也包含独特的克隆位点ApaⅠ)相匹配。然后在两部分连接反应中将编码修饰的5.12.14重链可变区序列的PCR产物亚克隆到表达质粒pMHM24.2.28中。用SpeⅠ-Apal消化此载体，将被SpeⅠ-Apal消化的编码重链可变区的PCR产物连接到其中，形成质粒pA51214VH’。通过DNA测序对此修饰的cDNA进行特性分析。5.12.14重链的编码序列见图20A-20B的DNA序列(SEQ ID NO：29)和氨基酸序列(SEQ ID NO：30)。
用EcoRV和Bpul102Ⅰ消化pA51214VH’，用编码pA51214VL’的鼠5.12.14轻链可变区的EcoRV-Bpu1102Ⅰ片段替换原EcoRV-Bpu1102Ⅰ片段，构建出编码5.12.14嵌合Fab的第一表达质粒pantiIL-8.1(泛抗IL-8.1)。所得的质粒同时含有5.12.14轻链和重链的鼠-人可变区/恒定区。
对使用p抗IL-8.1进行的Fab表达的初步分析显示，轻链和重链都产生在细胞内，但只有很少分泌到大肠杆菌的外周质间隙内。为了纠正这一问题构建了第二表达质粒。
第二表达质粒泛抗IL-8.2是用质粒pmy187作为载体构建的。用MluⅠ和SphⅠ消化pmy187，在其中连人泛抗IL-8.1的编码鼠5.12.14鼠-人嵌合Fab的MluⅠ(部分)-SphⅠ片段，制成质粒泛抗IL-8.2。所得的质粒同时含有5.12.14轻链和重链的鼠-人可变区/恒定区。
质粒泛抗IL-8.2于1995年2月10日在美国典型培养物保藏中心(ATTCC)(12301Parklawn Drive,Rockville,MD.USA.)进行了保藏，保藏登录号为ATCC 97056。
E．小鼠6G4.2.5单克隆抗体轻链和重链可变区的分子克隆
从1X108细胞(杂交瘤细胞系6G4.2.5)分离总RNA，方法参见Chomczynski &Sacchi(Anal.Biochem.162：156(1987))所述。设计合成的DNA寡核苷酸，使其能够与编码kappa轻链或IgG2a重链恒定区(这些区域的DNA序列公开在Sequences ofProteins of Immunological Interests,Kabat,E.A.et al.,(1991)NIH Publication 91-3242，V1-3)的鼠RNA区段杂交，特异性引导mRNA反应，由此合成cDNA第一链针对轻链和重链分别合成了3段引物(SEQ ID NO：31-36)，用于提高引物杂交的机会和合成cDNA第一链的效率(图21)。用两套合成DNA寡核苷酸引物来完成由cDNA第一链到双链DAN的扩增：用于轻链可变区扩增的一段正向引物(SEQ IDNO：37-39)和一段反向引物(SEQID NO：40)(图22)，以及用于重链可变区扩增的一段正向引物(SEQID NO：41-42)和一段反向引物(SEQ ID NO：43-46)(图23)。6G4.2.5轻链或重链的N末端序列头8个氨基酸用于产生一段对应于该区域的推定鼠DNA序列。(用Edman降解蛋白质测序技术，测定了轻链和重链可变区自N末端起总共29个氨基酸)。该信息用于设计正向扩增引物，其中部分密码子的第三位具有密码子简并性，以提高引物与天然小鼠DNA密码子杂交的机会，而且这些引物还含有对轻链可变区正向引物的独特限制性位点，Nsil和对重链可变区正向引物的独特限制性位点MluⅠ，它有利于引物与载体pchimFab中的STⅡ元件的3’末端连接。反向扩增引物设计成能够退火结合对应于轻链或重链可变区/恒定区连接处附近的恒定区部位的鼠DNA序列。轻链可变区的反向引物含有独特MunⅠ限制性位点，而重链可变区的反向引物含有独特的ApaⅠ限制性位点，用来与载体pchimFab内的人IgG1轻链恒定区或者IgG1重链恒定区的5’端连接。聚合酶链反应中使用这些引物产生的DNA片段约长400bp，并将它们分别克隆到载体pchimFab内，形成p6G425VL和p6G425VH。通过DNA测序对cDNA插入物进行了特性分析，以图24(鼠轻链可变区)中的DNA序列(SEQ ID NO：47)和氨基酸序列(SEQ ID NO：48)和图25(鼠重链可变区)中的DNA序列(SEQ ID NO：48)和氨基酸序列(SEQ ID NO：49)表示。
F．6G4.2.5嵌合Fab载体的构建
初始构建物p6G425VL中，6G4.2.5鼠轻链可变区末端到人IgG轻链恒定区内独特克隆位点MunⅠ之间的氨基酸来自小鼠。这些氨基酸序列必须与人IgG1的氨基酸序列匹配，从而形成嵌合Fab的正确折叠。两个小鼠氨基酸D115和S121与人IgG1恒定区β链环区内的氨基酸明显不同，它们通过用图26中的引物(SEQ ID NO：51-54)进行定点诱变被转化成合适的人氨基酸残基V115和F121。通过DNA测序证实了这种特异性诱变，此修饰后的质粒称为p6G425VL’。其编码序列见图27A-27B中的DNA序列(SEQ ID NO：55)和氨基酸序列(SEQ ID NO：56)。
类似的，重新构建了p6G425VH重链可变区末端和人IgG1重链恒定区内得独特克隆位点ApaⅠ之间的序列，以将该区域内的鼠氨基酸改变为人氨基酸。在重链可变区末端附近发现了一个BstEⅡ位点为这一过程提供了帮助。这一位点和ApaⅠ位点用于加入编码人IgG1相应氨基酸序列的合成DNA片段。合成的寡核苷酸显示在图26中，它们被设计成彼此互补，以便形成一段27bp的双链DNA。构建以三元连接的形式进行，因为质粒p6G425VH在其载体序列内还含有另一个BstEIⅡ位点。P6G425VH经MluⅠ-ApaⅠ消化产生的5309bp片段，与含有6G4.2.5重链可变区的338bp片段和编码人IgG1恒定区头6个氨基酸的27 bp合成DNA片段连接，形成质粒p6G425VH’。通过DNA测序证实了合成DNA片段的插入。此编码序列见图28A-28B中的DNA序列(SEQID NO：57)和氨基酸序列(SEQ ID NO：58)。编码6G4.2.5的嵌合Fab的表达质粒p6G425chim2是如下构建的：用MluⅠ和Apal消化p6G425chimVL’以去除STⅡ-鼠HPC4重链可变区，并代之以p6G425chimVH’内编码STⅡ鼠6G4.2.5重链可变区的MluⅠ-Apal片段。所得的质粒同时含有6G4.2.5轻重链的鼠人可变区/恒定区。
质粒p6G425chim2于1995年2月10日在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(12301 Parklawn Drive,Rockville,MD.USA.)进行了保藏，保藏登录号为ATCC 97055。
G．人源化抗IL-8抗体6G4.2.5的构建
用来自杂交瘤细胞系6G4.2.5的鼠cDNA序列信息构建鼠抗IL-8抗体的人源化变体。第一种人源化变体F(ab)-1是如下构建的：将编码重链和轻链的鼠CDR的合成性DNA寡核苷酸引物移植到噬菌粒载体pEMX1(Werther et al.J.Immunol.,157：4986-4995(1996))上，后者含有一段人IgG亚组Ⅰ轻链和一段人IgG亚组Ⅲ重链(图29)。用Carter等在PANS89：4285(1992)和Eigenbrot等在J.Mol.Biol.229：969(1993)中所述的方法比较小鼠的和人源化的6G4.2.5(F(ab)-1)可变区，由此鉴定包括了抗体框架的氨基酸，它们对于维持互补性决定区(CDR)高亲和力结合IL-8所需的构象至关重要。从这些模型获得的信息构建了其他人源化框架的变体(F(ab)2-9)，列于表4。在这些变体中，使用了定点诱变法以特异的人框架残基与鼠6G4.2.5中的相应部分交换，方法见Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,82：488(1985)。然后，用DNA测定序法来确定各变体的整个编码序列。Werther等描述表达和纯化了各种F(ab)变体，所不同的是省略了纯化过程中的鸡蛋白溶菌酶。利用SDS-PAGE、电喷射质谱和氨基酸分析对诸变异型抗体进行了分析。
          表4-人源化的6G425变体
a．相对于所用模板而作的氨基酸改变。小鼠残基用粗斜体表示，残基编号按照Kabat等。
b．改变的目的是根据在人源化和鼠可变区分子模型中观察到的相互反应。
c．在竞争性结合试验中抑制碘标IL-8结合人嗜中性白细胞所必需的变体的浓度nM。
d．嵌合F(ab)即，所带的小鼠重链和轻链可变区分别与人轻链kⅠ恒定区和人重链Ⅲ亚组恒定区Ⅰ融合的F(ab)。
e．rhu4D5F(ab)与人源化6G425 F(ab)属于同一同种型，而且是一种人源化抗HER2 F(ab)，所以应不结合IL-8。
第一种人源化变体F(ab)-1是一种没有改变的CDR交换(swap)，以x光晶体图和序列超变性研究明确了其中所有的小鼠CDR氨基酸，将其转移给人框架。按照上述(B)(1)所述方法测定了纯化F(ab)抑制125I-IL-8与人嗜中性白细胞结合的能力，由表4可见，结合亲和力降低了5.5倍。然后，对F(ab)-1加以基因工程改造，使形成的CDR环的三维结构以更有利的构象结合IL-8。用人嗜中性白细胞按上文(B)(1)所述的竞争性结合试验测定了各F(ab)变体的相对亲和力，结果显示在表4中。F(ab)-2-3轻微降低IL-8的结合(＜2倍)，而F(ab)3-5只轻微提高IL-8的结合。F(ab)-6对IL-8的亲和力提高最大(约2倍)，其与IL-8结合的亲和力为34.6nM，而F(ab)-1与IL-8结合的亲和力则为63nM。预计，H69位鼠Leu变成Ile和H78位鼠Ala变成Leu影响了CDR H1和H2的包装。还以F(ab)-6为模板进行了进一步框架取代，以使结合亲和力更接近于嵌合F(ab)。体外结合实验显示，F(ab)-7的亲和力(38.4nM)没有改变，而F(ab)-8/9的亲和性明显提高，分别为14nM和19nM。根据对抗IL-8抗体的3D计算机模型分析假定，在F(ab)-8内H38位以Arg替代鼠Lys将对CDR-H2造成影响，而F(ab)-9内H6位的Glu代替鼠Gln的变化将对CDR-H3造成影响。对人抗体序列的氨基酸变异性检查发现，残基H38为Arg的频率在99％以上，而残基H6则要么是Gln(约20％)要么是Glu(约80％)(Kabat等，Sequence of Proteins of Immunological Interests，第5版，(1991))。所以，为了减少引起对此抗体的免疫应答的可能性，F(ab)-9比F(ab)-8更适合被选用于进一步进行亲和力成熟研究。还测试了F(ab)-9抑制IL-8介导的趋化性的能力(图30)。该抗体能够阻抑由野生型人IL-8、人单体IL-8和猕猴IL-8诱导的嗜中性白细胞迁移，按上文(B)(2)所述，进行的IL-8介导的嗜中性白细胞趋化抑制试验中，IC50分别约为12nM、15nM和22nM。变体F(ab)-8的氨基酸序列见图31c。发现F(ab)-8抑制人和猕猴IL-8介导的趋化性，按上文(B)(2)章所述进行的IL-8介导的嗜中性白细胞趋化性抑制试验中，IC50分别为12 nM和10nM。
H．构建抗IL-8基因Ⅲ融合蛋白用于噬菌体展示和丙氨酸扫描诱变
将编码融合蛋白(人源化6G4.2.5V11抗体重链和M13噬菌体基因-Ⅲ包膜蛋白的重链)的表达质粒pPh6G4.V11，和人源化6G4.2.5V11抗体的轻链装配起来，以在噬菌体颗粒上产生抗IL-8抗体的单价展示。此构建物这样制得：用EcoRV和ApaⅠ消化质粒pFPHX，除去存在的不相关的抗体编码序列，用编码人源化6G4.2.5V11抗IL-8抗体的质粒p6G4.V11中的1305bp的EcoRV-ApaⅠ片段代替。图31A显示了人源化6G4.2.5V11重链(SEQ ID NO：66)、肽接头和基因Ⅲ包膜蛋白的序列(SEQ ID NO：67)翻译后的序列。pFPHX质粒是phGHam-3的衍生物，它在人生长激素和基因-Ⅲ DNA编码序列间含有框内琥珀密码子(TAG)。当其转化到琥珀抑制型大肠杆菌菌株中，密码子(TAG)被读为谷氨酸，从而产生了生长激素(hGH)-基因Ⅲ融合蛋白。同样，在正常的大肠杆菌菌株中，密码子(TAG)被读为终止子而防止翻译读入基因-Ⅲ序列，从而产生可溶性hGH。pGHam-3质粒在Methods：A Companion to Methods in Enzvmology,3：205(1991)中有所描述。将最终产物pPh6G4.V11用作丙氨酸扫描诱变CDR以及构建人源化6G4.V11抗体的随机化CDR文库的模板。
1．人源化抗体6G4.2.5V11型的丙氨酸扫描诱变
通过分析计算机产生的抗IL-8抗体的三维模型，确定了人源化抗IL-86G4.2.5 V11型抗体(h6G4V11)的CDR中接触溶剂的氨基酸残基。为了确定CDR中与溶剂接触的氨基酸哪些会影响与白介素-8的结合，使接触溶剂的每个氨基酸各自变为丙氨酸，从而产生了一组突变型抗体，其中每个突变体在一个溶剂接触残基处含有一个丙氨酸取代。该丙氨酸扫描诱变方法如Leong等在J.Biol.Chem.,269：19343(1994)所述的那样进行。
用Cunningham等(EMBO J.13：2508(1994))和Lee等(Science 270：1657(1995))所述的竞争性噬菌体ELISA试验建立h6G4V11野生型和突变型抗体的IC50(相对亲和力)。此试验测定了在溶液中各种浓度(0.2-1uM)的游离IL-8存在下每个抗体与包被在96孔板上的IL-8结合的能力。试验的第一步需要将携带野生型和突变型抗体的噬菌体的浓度标准化，从而能比较每个抗体的相对亲和力。标准化通过在IL-8包被的板上滴定噬菌体并建立其EC50来实现。使包被巯基的96孔结合板与K64C IL-8(赖氨酸64被半胱氨酸取代，以便使K64C IL-8的游离巯基与巯基包被板间形成二硫键，从而使IL-8的受体结合区朝向溶液界面)的0.1mg/ml溶液在25℃(EC)、含1mM EDTA的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH6.5)中培育1小时，然后用PBS洗涤三次，最后再和含1.75mg/ml L半胱氨酸-HCl和0.1M NaHCO3的PBS溶液一起培育，以封闭板上所有游离的活性巯基。再次洗板，4℃覆盖保藏，每个孔内有200ul PBS。使展示有参照抗体h6G4V11或突变型h6G4V11抗体的噬菌体生长，并用PEG沉淀来收获。将噬菌体重悬于500ul 100mM Tris-HCl pH7.5，1mM EDTA和100mM NaCl中并于4℃放置不超过3小时。取各噬菌体等份用含0.05％吐温-20(BioRad,Richmond,Ca.)和0.5％BSA RIA级(Sigma,St.Louis,Mo.)(PBB)的PBS稀释4倍，加入包被了IL-8的板中，用25mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)配的50mg/ml脱脂奶粉于25℃封闭至少2小时。然后，将噬菌体依次在板中从孔A到孔H作3倍系列稀释。使各板25℃培育1小时，然后用含0.05％吐温-20的PBS(PBST)迅速洗涤9次。然后使板与稀释度为1∶3200的家兔抗噬菌体抗体和稀释度为1∶1600的第二山羊抗家兔-Fc HRP-偶联抗体25℃培育15分钟，然后用PBST迅速洗9次。使板在25℃，每孔加入80μl的1mg/ml OPD(Sigrna,St.Louis,Mo)(用含0.015％H2O2的柠檬酸磷酸缓冲液(pH5.0)配)显色4分钟，加入40ul 4.5M硫酸终止反应。在SLT模式340ATTC板读数器(SLT Lab Instruments)中OD492下分析该板。用Kaleidagraph程序(Synergy,Software,Reading,Pa.)和4-参数匹配方程分析数据确定各个EC50=s。然后，迅速用PBB稀释置于4℃的噬菌体，获得对应于其各自EC50或试验竞争性部分的靶OD492的最终浓度，并将其分置于含有4倍系列稀释的可溶性IL-8的96孔板中，IL-8浓度孔A为1uM，孔H为0.2uM。用12-通道移液管将100ul噬菌体/IL-8混合物转移到IL-8包覆的96孔板中，并如上所述实施。每份样品做一式三份—每份三个柱。
    表5-丙氨酸扫描抗IL-86G4V11 CDR突变体的相对亲和力(IC50)
    CDR 氨基酸残基 IC50平均值(nM) 标准偏差(Std Dev)
    V11     参照     11.5     6.4
    CDR-L1     S26     6.3     2.9
    Q27     10.2     2.4
    S28     14.2     5.2
    V30     29.1     12.3
    H31     580.3     243.0
    I33     64.2     14.6
    N35     3.3     0.7
    T36     138.0     nd
    Y37     NDB     nd
    CDR-L2     K55     24.3     14.9
    V56     15.5     3.8
    S57     12.4     4.0
    N58     17.6     3.7
    R59     nd     nd
    CDR-L3     S96     10.8     4.4
    T97     70.6     55.2
    H98     8.0     1.2
    V99     19.6     1.9
    CDR-H1     S28     8.6     3.1
    S30     nd     nd
    S31     7.8     2.5
    H32     13.3     5.8
    Y53     48.2     15.8
    CDR-H2     Y50     35.6     13.0
    D52     13.3     7.5
    S53     6.0     3.4
    N54     96.0     5.8
    E56     15.8     4.5
    T57     8.4     1.6
    T58     11.3     1.8
    Y59     9.1     3.7
    Q61     12.6     6.4
    K64     18.5     12.1
    CDR-H3     D96     NDB     nd
    Y97     NDB     nd
    R98     36.6     15.3
    Y99     199.5     nd
    N100     278.3     169.4
    D102     159.2     44
    W103     NDB     nd
    F104     NDB     nd
    F105     209.4     72.3
    D106     25.3     21.7
每份样品每次试验一式三份。
NDB=没有可检测的结合/nd=值未测定*
残基的编号根据Kabat等人的编号。
丙氨酸扫描的结果归纳在上表5中。许多突变型抗体中的丙氨酸取代对IL-8的结合亲和力没有或有很少不利影响(小于3倍)。发现未显示出可检测IL-8结合(NDB)的突变体推测可能是由于CDR中的关键的结构性或隐蔽氨基酸而导致抗体的构象结构破坏。根据扫描结果，确定CDR-H3(重链，第三个CDR)为结合IL-8的主要结合表位。该CDR中的丙氨酸取代导致结合亲和力减少3至26倍以上。氨基酸Y597、Y599和D602是特别感兴趣的，因为根据计算机产生的抗IL-8抗体的模型，确定这些残基是与溶剂接触的，且这些残基可能参与了与IL-8或影响与IL-8的结合或影响CDR-H3环结构构象的抗体其它氨基酸的氢键键合或电荷相互作用。(见图32所示模型)。注意到CDR-H1的S528和S531和CDR-H2的S553的结合亲和力有出乎意料的增长(1.8＞2.7倍)。
令人惊奇的是，发现位于CDR-L1(轻链的第一个CDR)中的丙氨酸突变体N35A的结合亲和力显著增加。发现亲和力比野生型h6G4V11抗体增加3-6倍。IL-8结合能力的这一增加可能是N35A很接近CDR-H3的结果。丙氨酸取代可能使CDR-L1构象稍有改变，这改变了CDR-H3上邻近氨基酸残基的压紧相互作用，从而将CDR-H3的环扭成更适合接触IL-8的构象。同样，N35A还会影响CDR-L1中氨基酸的取向或其与IL-8的直接相互作用。在CDR-L1的S26和CDR-L3的H98也发现亲和力有出乎意料的增加(约2倍)。
J．人源化抗IL-8抗体6G4V11N35A特性分析
用pPh6G4.V11转化琥珀非阻遏基因大肠杆菌菌株34B8，使培养物在低磷酸盐培养基中生长24小时，获得可溶的6G4V11N35A Fab抗体。收集周质组分，通过Hi-trap蛋白-G柱(Pharmacia,Piscataway,NJ.)，然后进行脱盐和浓缩。用SDS-PAGE、质谱法和氨基酸分析法分析蛋白质。蛋白质有正确的大小和氨基酸组成(图35)。测试6G4VIIN35A Fab抑制125I-IL-8结合人嗜中性白细胞、抑制IL-8介导嗜中性白细胞趋化作用的能力(如上文(B)(1)和(B)(2)章所述)。如图33所示，发现杂交瘤获得的完整的小鼠抗体(6G4小鼠单克隆抗体)、重组6G4小鼠-人嵌合Fab、重组人源化Fab 1型和11型、以及6G4V11N35A Fab抑制了125I-IL-8结合人嗜中性白细胞，平均IC50分别为5nM,8nM,40nM,10nM和3nM。6G4V11N35AFab的亲和力比6G4.2.5嵌合Fab至少高2倍，比6G4V11至少高3倍。如图34所示，发现6G4V11N35A Fab抑制野生型和单体型人IL-8以及两种不同动物(即家兔和猕猴)IL-8诱导的IL-8介导嗜中性白细胞趋化作用。不相关的同种型对照Fab(4D5)不抑制嗜中性白细胞迁移。IC50平均值为3nM(野生型IL-8)、1nM(单体型IL-8)、5nM(家兔IL-8)和10nM(猕猴IL-8)。
K．6G4V11N35A F(ab＇)2亮氨酸拉链的构建
人源化抗IL-8 6G4V11N35A Fab的F(ab＇)2的生产通过用酵母GCN4亮氨酸拉链构建融合蛋白来实现。p6G4V11N35A.F(ab＇)2的表达质粒这样来制得：用限制性酶bsaⅠ和apaⅠ消化质粒p6G425chim2.fab2，除去编码6G4.2.5小鼠-人嵌合Fab的DNA序列，用Ph6G4.V11N35A的2620bp bsaⅠ-apaⅠ片段代替之。质粒p6G425chim2.fab2是编码融合蛋白(GCN4亮氨酸拉链与抗-CD18的重链融合)和抗-CD18抗体的轻链的pS1130的衍生物。表达质粒p6G4V11N35A.F(ab＇)2于1996年2月20日保藏在美国典型培养物保藏中心(12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,USA(ATCC))中，登录号为ATCCNo.97890。抗体铰链区的胃蛋白酶断裂位点有利于除去亮氨酸拉链，留下两个免疫球蛋白单体，这两个单体由形成链内二硫键的半胱氨酸连接。h6G4V11N35A.F(ab＇)2的DNA序列和蛋白质序列显示在图35-37中。
用基本上如上文(Ⅱ)(3)(C)章所述的p6G4V11N35A.F(ab＇)2转化大肠杆菌菌株49D6，获得表达宿主细胞。转化的宿主大肠杆菌49D6(p6G4V11N35A.F(ab＇)2)于1997年2月20日保藏在ATCC，登录号为ATCCNo.98332。使转化的宿主细胞在培养中生长，从宿主细胞周质空隙收获6G4V11N35A F(ab＇)2(基本上如上文(Ⅱ)(3)(F)所述)。
L．人源化6G4V11N35AF(ab＇)2亮氨酸拉链的特性分析
根据上文(B)(1)所述步骤，测试6G4V11N35A Fab和F(ab＇)2抑制125I-IL-8结合嗜中性白细胞的能力。图38显示了一式两份进行的代表性结合试验的替换曲线。这些数据的Scatchard分析表明6G4V11N35A F(ab＇)2抑制了125I-IL-8结合人嗜中性白细胞，IC50平均值为0.7nM(+/-0.2)。这比杂交瘤获得的完整小鼠抗体的亲和力(IC50平均值为5nM)高至少7倍，比Fab型的亲和力(IC50平均值为2nM)高至少2.8倍。
另外，根据上文(B)(2)所述的步骤，还测试了6G4V11N35A F(ab′)2抑制IL-8介导嗜中性白细胞趋化的能力。一式四份的典型趋化试验的结果显示在图39中。如图39所示，6G4V11N35A F(ab＇)2抑制了人IL-8介导的嗜中性白细胞趋化。6G4V11N35A F(ab＇)2表现出IC50平均值为1.5nM(与6G4V11N35A Fab的2.7nM相比)，这表明抗体中和IL-8作用的能力提高约2倍。不相关的同种型对照Fab(4D5)不抑制嗜中性白细胞迁移。另外，在如上所述进行的嗜中性白细胞趋化试验中，6G4V11N35A F(ab＇)2抗体保留了单体型IL-8及其它两种不同动物(即家兔和猕猴)的IL-8抑制IL-8介导的嗜中性白细胞趋化的能力。图40中显示了各次试验。IC50平均值为1nM(单体型IL-8)、4nM(家兔IL-8)和2.0nM(猕猴IL-8)。
M．人源化抗体6G4V11 CDR-L1中的轻链氨基酸(N35A)的随机诱变
如上部分(Ⅰ)中所述，当人源化6G4V11单克隆抗体中的CDR-L1(轻链)中35位的天冬酰胺被取代成丙氨酸时，发现抑制125I-IL-8结合人嗜中性白细胞的IC50提高3倍。这一结果可能是归因于抗原抗体结合界面之间接触的改善，这一改善是由于较小的非极性侧链(R基团)的取代可能改变了CDR-L1或邻近的CDR-H3(重链)的构象，因而使得抗原停靠更可及。CDR-L135位接受丙氨酸表明该位置对提高亲和力有作用，因此敢保证在该部位用其它氨基酸重新作CDR环/抗原-结合区造型进行评估。通过随机诱变CDR-L1的35位和构建抗体噬菌体文库，进行人源化6G4.V11单克隆抗体亲和力成熟型的选择(Kunkel,T.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82：488(1995))。将CDR-L1的35位天冬酰胺(N)的密码子作为20种已知氨基酸的任何一种的随机化目标。
最初，制得终止模板(stop template)pPh6G4.V11-stop，以从文库中消除野生型N35污染序列。这是通过pPH6g4V11(上文(H)所述)定点诱变(Muta-Gene Kit,Biorad,Ricmond,CA)用引物SL.97.2(SEQ ID NO：)(图42)将N35的密码子(AAC)替换成终止密码子(TAA)来实现的。用DNA测序来确认终止密码子的掺入。随后，按照Lowman(Methods in Molecular Biology,87章25：1-15(1997))描述的方法，用经终止模板转化的大肠杆菌CJ236衍生获得的含尿嘧啶单链DNA产生抗体-噬菌体文库。预计该文库产生的变体产生了一组抗体，抗体CDR-L1的N35位有20种已知氨基酸中的一种。用具有序列NNS(N=A/G/T/C；S=G/C)(SEQ IDNO：)(图42)的简并寡核苷酸引物(SL.97.3)定点诱变来实现氨基酸取代。采用了该密码子，就可表达20种氨基酸中的任何一种—括琥珀终止密码子(TAG)。通过电穿孔将抗体-噬菌体变体收集物转染到大肠杆菌菌株XL-1蓝(Stratagene,SanDiego,CA)内，并使其37℃生长过夜以扩增文库。如上文(Ⅰ)所述，将文库置于包被IL-8的96孔板上淘选，实现了紧密结合的人源化6G4V11 Fab的选择。在淘选前，将噬菌体/文库的数目标准化到1.1×1013个噬菌体/毫升(它产生的最大的OD260读数为1个OD单位)，在加入噬菌体(每次分拣采用8个IL-8包被的孔/文库)前，使IL-8包被的板与封闭溶液(含50mg/ml脱脂牛奶的碳酸盐缓冲液25mN)培育2小时。在封闭和洗涤步骤后，每次分拣开始以8个IL-8包被孔每个中加入100ul抗体-噬菌体(滴度为1.1×1013个噬菌体/毫升)为开始，然后25℃培育1小时。用PBS-0.05％吐温-20(PBS-吐温)迅速洗涤10次，除去非特异性结合的抗体-噬菌体。对于第一次分拣，采用低严谨性的洗涤(每个孔100ul PBS-吐温，25℃培育10分钟)，以捕获小部分与固相化IL-8紧密结合的抗体-噬菌体。每孔用100ul200mM甘氨酸(pH2.0)25℃洗脱与IL-8特异性结合的抗体-噬菌体变体5分钟。然后，合并8个孔洗脱下的抗体-噬菌体变体，用1M Tris-HCl pH8.0(1/3洗脱体积)中和。如上文(Ⅰ)所述对噬菌体滴定并使其增殖。每一轮淘选逐渐增加洗涤的严谨性，这取决于一次分拣后的噬菌体回收百分数。洗涤条件如下：第2次分拣，4×15分钟间隔，总时间60分钟；第3次分拣，#3a为8×15分钟间隔，或#3b为12×10分钟间隔，总时间120分钟。每次分拣后回收的噬菌体总数依次减少，这提示被选出的是针对不结合或结合较弱的结合物选择的。在整个淘选中，阴性对照(抗体-噬菌体停止变体(antibody-phage stop variant))的回收保持恒定(约0.0001至0.00001百分数)。
通过DNA测序分析第3次分拣的18种随机变体，以寻找CDR-L135位的共有氨基酸。图43A所示数据表明在测序的变体中，甘氨酸占据35位的占33％。然而，在修正了NNS密码子组合/氨基酸的数目，甘氨酸的频率降低至16.6％。谷氨酸表现出最高的频率(22％)，其后是天冬氨酸和甘氨酸(16.6％)。野生型天冬酰胺和取代型丙氨酸的回收频率只有5.6％。令人感兴趣的是，高频率的甘氨酸也许表明对CDR-L1环可允许宽得多的构象，这可能是由于单个氢原子作为侧链从而减少了键角(φ-ψ)配对的空间位阻。相反，35位的谷氨酸可能由于更具刚性的、大的带电荷极性侧链使得旋转自由度低，从而限制了环的柔韧性。
如上文(J)所述，制得亲和力成熟的变体(N35G、N35D、N35E和N35A)的可溶性Fab，以评价它们封闭IL-8结合的能力。如图43B所示，发现变体N35A、N35D、N35E和N35G抑制了125I-IL-8结合人嗜中性白细胞，IC50分别约为0.2nM,0.9nM,0.1nM和3.0nM。所有亲和力成熟的变体显示出与IL-8的结合比人源化6G4V11单克隆抗体高3-100倍。亲和力成熟的变体6G4V11N35E封闭IL-8结合人嗜中性白细胞的能力比丙氨酸扫描变体6G4V11N35A还要高2倍。
如Blake等，J.Bio1.Chem.271：27677(1996)描述的那样，用KinEXATM自动化免疫试验系统(Sapidyne Instruments Inc.,Idaho City,ID)对变体6G4V11N35A和6G4V11N35E作平衡和动力学测定。对制备抗原包被颗粒的步骤作如下修饰：用含20ug/ml人IL-8的50mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)包被1毫升活化琼脂糖珠粒(Reacti-Gel 6X；Pierce,Rochford,IL)，在摇床上轻微搅拌，25℃培育过夜。然后用1M Tris-HCl(pH7.5)洗涤IL-8包被珠，以灭活珠上未反应的基团，用Superblock(Pierce,Rockford,IL)25℃封闭1小时，以减少非特异性结合。将珠重悬于测试缓冲液(0.1％牛血清白蛋白，PBS配)中至最终体积为30毫升。每次用550ul等份的IL-8包被珠悬液，装填组成KinEXA观察单元中新鲜的4毫米高的柱。用荧光标记的第二抗体定量测定平衡和动力学试验中被IL-8包被珠所捕获的抗体-抗原混合物中未结合的抗体量。用R-PE AffiniPure F(ab＇)2山羊抗小鼠IgG，Fc片段特异性2°抗体(Jackson Immuno Research Laboratories,West Grove,PA)检测小鼠6G4.2.5，用R-PE AffiniPure F(ab′)2驴抗人IgG(H+L)2°抗体(JacksonImmunoresearch Laboratories,West Grove,PA)检测人源化的亲和力成熟的N35A(Fab和F(ab＇)2)和N35E Fab；两者的稀释度均为1∶1000。
用各种浓度(0,0.009,0.019,0.039,0.078,0.156,0.312,0.625,1.25,2.5nM)的人IL-8和恒定量(0.005ug/ml)的抗IL-8抗体一起培育，测定平衡曲线。25℃培育抗体-抗原混合物2小时，使分子达到平衡。随后，使每份样品以0.5毫升/分钟的流速通过IL-8包被珠自然堆积的KinEXA观察单元，每份样品共9分钟。用Sapidyne Instruments Inc.提供的软件计算平衡常数(Kd)。
通过培育恒定量的抗体和抗原，测定与IL-8包被珠结合未复合抗IL-8随时间而变的量来确定缔合速度(ka)和解离速度(kd)。动力学试验中所用的抗体浓度与上述平衡试验中所用的相同。通常，人IL-8用量是从平衡试验的结合曲线获得的浓度，它使抗IL-8与IL-8包被珠的结合有70％受抑制。每隔15分钟测定一次，收集大约9个数据点。用Sapidyne Instruments,Inc.提供的软件计算ka。用方程式kd=Kd/ka计算解离速度。
图44显示了亲和力成熟的变体6G4V11N35E和6G4V11N35A Fab的平衡常数(Kd)分别约为54pM和114pM。6G4V11N35E Fab对IL-8亲和力的提高是由于6G4V11N35E Fab的缔合速度(Kon)为4.7×106，比6G4V11N35A F(ab＇)2的2.0×106快2倍。(6G4V11N35A F(ab＇)2和6G4V11N35A Fab的Kd相同)。解离速度(Koff)没有明显差别。分子模型表明，用谷氨酸代替天冬酰胺可能会直接或间接通过中和CDR中的邻近残基R98(CDR-H3)或K50(CDR-L2)的电荷促进与IL-8的接触来影响抗体与IL-8的作用。另一种作用可能是形成了一种更稳定的CDR-R1环构象，它能使其它CDR-L1环残基更合适地接触IL-8。图45中示出了轻链中天冬酰胺被取代成谷氨酸的p6G4V11N35E.Fab的DNA序列(SEQ ID NO：)和氨基酸序列(SEQ ID NO：)。
N．人源化抗IL-8变体6G4V11N35E Fab的特性分析
如上文(B)(2)所述那样测试亲和力成熟的Fab变体6G4V11N35E抑制IL-8介导嗜中性白细胞趋化的能力。用无内毒素的含有5-微米无PVP聚碳酸酯滤膜的一次性趋化室(ChemoTx101-5,Neuro Probe,Inc.Cabin John,MD)代替部分(B)(2)中所述的可重复使用的96孔趋化室。如图46所示，变体N35E有效地阻断了2nM家兔或人IL-8刺激诱导的IL-8介导嗜中性白细胞趋化作用。实际上，抗体浓度在3.7nM-33nM之间的抑制水平与缓冲液对照没有显著差别，这表明变体N35E可完全抑制该反应。家兔和人IL-8的IC50分别约为2.8nM和1.2nM。不相关的同种型对照Fab(4D5)不抑制嗜中性白细胞迁移，这表明亲和力成熟的变体N35E所观察到的结果是IL-8特异性的。
O．人源化6G4V11N35E F(ab＇)2亮氨酸拉链的构建
用类似于上文(K)所述的方法来构建6G4V11N35E的F(ab＇)2表达质粒。表达质粒p6G4V11N35E.F(ab＇)2这样制得：用限制性酶ApaⅠ和NdeⅠ消化质粒p6G4V11N35A.F(ab＇)2(上文(K)所述)，分离获得2805bp编码重链恒定区-GCN4亮氨酸拉链的片段，将其与上文(M)中描述的p6G4V11N35E噬菌体展示克隆(编码6G4V11N35E Fab)的3758bp ApaⅠ-NdeⅠ片段相连。通过DNA测序确认整个编码序列的完整性。
P.全长人源化6G4V11N35A IgG表达质粒的构建
用双顺反子DHFR-内含子表达载体(Lucas等，Nucleic Acids Res.,24：1774-1779(1996)，它含有6G4.2.5抗IL8单克隆抗体的全长重组小鼠-人嵌合体)制得人源化抗IL-8变体6G4V11N35A的全长IgG1型。编码人源化变体6G4V11N35A的表达质粒如下方式装配。为了将人源化抗IL-8变体6G4V11N35A的重链可变区的编码序列穿梭到含有嵌合6G4.5抗IL-8抗体的重链可变区的pRK56G4chim.2Vh，首先制得中间质粒(pSL-3)。用PvuⅡ和ApaⅠ消化载体pRK56G4chim.Vh，以除去嵌合抗体的重链可变区，再与80bp PvuⅡ-XhoⅠ合成寡核苷酸(编码6G4V11N35A的Leu4至Phe29)(图47)以及携带6G4V11N35A重链可变序列其余部分的p6G4V11N35A.7的291bp XhoⅠ-ApaⅠ片段相连，形成pSL-3。将该中间质粒与其它两个质粒p6G4V11N35A.F(ab′)2和p6G425chim2.choSD连接，产生哺乳动物表达质粒p6G4V11N35AchoSD.9(确定为p6G4V11N35A.choSD，于1997年12月16日保藏在ATCC中，登录号为ATCCNo.209552)。该表达构建物用下列DNA片段以4部分连接装配成：编码哺乳动物表达质粒调节元件的5,203bp ClaⅠ-BlpⅠ片段(p6G425 chim2.choSD)、含有人源化6G4V11N35A抗体重链可变区的451bp ClaⅠ-ApaⅠ片段(pSL-3)、携带6G4V11N35A重链恒定区的1,921bp ApaⅠ-EcoRⅤ片段(p6G425chim2.choSD)和编码6G4V11N35A轻链可变区和恒定区的554bp EcoRⅤ-BlpⅠ片段(p6G4V11N35A.F(ab＇)2)。克隆p6G4V11N35A.choSD.9的DNA序列(SEQ ID NO：)通过DNA测序来确认，并显示在图48中。
Q．全长人源化6G4V11N35E IgG表达质粒的构建
人源化6G4V11N35E的哺乳动物表达载体以如下方式用6G4V11N35E代替6G4V11N35A的轻链可变区：将p6G4V11N35A.choSD.9的7,566bp EcoRⅤ-BlpⅠ片段(缺乏编码6G4V11N35A轻链可变区的554bp片段)与pPH6G4V11N35E.7的554bp EcorⅤ-BlpⅠ片段(编码6G4V11N35E的轻链可变区)相连。p6G4V11N35E.choSD.10的轻链N35位的突变通过DNA测序得到确认。
R.N35A和N35E变体的稳定性CHO细胞系
为了稳定地表达最终人源化的IgG1变体(6G4V11N35A和6G4V11N35E)，用上述双顺反子载体(分别是p6G4V11N35A.choSD.9和p6G4V11N35E.choSD.10)转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)DP-12，以共同表达重链和轻链(Lucas等，Nucleic AcidRes.24：1774-79(1996))。通过脂转染法将质粒导入CHO DP12细胞，并在无GHT培养基中选择生长(Chisholm,V.哺乳动物细胞中的基因高效转移，在Glover,DM,Hames,BD.DNA Cloning4.Mammalian systems.Oxford Univ.Press,Oxford 1-41页(1996))。随机选出约20个未扩增的克隆，再次接种到96孔板中。用ELISA定量测定3天后每个孔中累积的全长人IgG，用荧光染料(Calcien AM)作为每个孔中存活细胞数的代替标记，监测每个菌落的相对比生产力。根据这些数据，选择一些未扩增的克隆，在增加浓度的氨甲喋呤存在下作进一步扩增。选出在10、50和100nM氨甲喋呤下存活的单个克隆，转移到96孔板中进行生产力筛选。在T形瓶中繁殖每个抗体的一个克隆(克隆#1933 aIL8.92 NB 28605/12用于6G4V11N35A；克隆#1934 aIL8.42 NB 28605/14用于6G4V11N35E)(该克隆可重复表现出高比生产率)，并用来接种到旋转培养中。在传代几次后，将适应悬浮的细胞接种到补加了各种激素和蛋白水解物的含GHT、无血清培养基中中进行生产性培养。收获含有重组人源化抗IL-8的细胞培养液，用蛋白质A-SepharoseCL-4B纯化。该步骤后的纯度约为99％。随后用离子交换层析步骤纯化至均一。第一轮扩增后的人源化6G4V11N35E IgG1抗体和第二轮扩增后的6G4V11N35AIgG1的生产滴度分别为250mg/L和150mg/L。
S.人源化6G4V11N35A/EIgG变体的特性分析
测试6G4.2.5的人源化全长IgG变体抑制125I-IL-8结合并中和人嗜中性白细胞活化的能力；步骤如上文(B)(1)和(B)(2)所述。如图49所示，变体6G4V11N35A和6G4V1IN35E的全长IgG1形式同等地抑制了125I-IL-8与人嗜中性白细胞的结合，IC50分别约为0.3nM和0.5nM。这表明，与全长小鼠单克隆抗体(IC50=7.5nM)相比，对IL-8结合的阻断提高15-25倍。同样，这两个抗IL-8变体在抑制IL-8介导人嗜中性白细胞趋化方面显示了相同的中和能力(图50A-50B)。6G4V11N35A和6G4V11N35E IgG1IC50对于人IL-8的分别为4.0nM和6.0nM，对于家兔IL-8分别为4.0nM和2.0nM。不相关的同种型对照Fab(4D5)不抑制嗜中性白细胞迁移。
用上文(M)所述的KinExA测定了与小鼠6G4.2.5单克隆抗体相关的这些变体对IL-8的亲和力。图51显示，全长亲和力成熟的变体6G4V11N35E IgG1和6G4V11N35A IgG1的平衡常数(Kd)分别约为49pM和88pM。6G4V11N35AIgG1的Kd直接从动力学试验测得。从其各自Fab的报道来看，亲和力的这种改进可能归因于6G4V11N35E IgG1的缔合速度(ka=3.0×106)比6G4V11N35AIgG1(ka=8.7×105)高大约2倍。另外，用碘标的人IL-8作竞争性放射免疫试验来确认这些结果。使50pM的6G4V11N35A IgG1或6G4V11N35E IgG1与30-50pm的125I-IL-8以及各种浓度(0-100nM)的未标记的IL-8 25℃培育2小时。然后使抗体-抗原混合物在4℃与10μl蛋白质A-珠粒的70％糊浆(预先用0.1％BSA封闭)培育1小时。将珠粒在微量离心机中稍稍旋转，弃去上清液以除去未结合的125I-IL-8。在γ计数器中计数蛋白质-A颗粒，确定与抗IL-8抗体特异性结合的125I-IL-8的量。Kd大概值与KinEXA测定值相似。6G4V11N35A IgG1和6G4V11N35E IgG1的平均Kd值分别为54pM(18-90pM)和19pm(5-34pM)(图52)。
T．用于聚乙二醇修饰的人源化6G4V11N35A/E Fab的构建
如下构建6G4V11N35A的Fab表达载体：用限制性酶ApaⅠ和NdeⅠ消化质粒p6G4V11N35A.F(ab＇)2，除去编码与酵母GCN4亮氨酸拉链融合的人IgG1恒定区的2805bp片段，用Eigenbrot等，Proteins：Struct.Funct.Genet.,18：49-62(1994)中描述的质粒pCDNA.18的2683bp ApaⅠ-NdeⅠ片段代替。pCDNA.18 ApaⅠ-NdeⅠ片段携带了人IgG1重链恒定区的编码序列，其中包括用来连接PEG分子的铰链区中的游离半胱氨酸。从p6G4V11N35A.F(ab＇)2中分离获得3758bp ApaⅠ-NdeⅠ片段(编码6G4V11N35A的轻链和重链区)，将其与pCDNA.18的2683bp ApaⅠ-NdeⅠ片段连接，形成p6G4V11N35A.PEG-1。通过DNA测序确认了整个编码序列的完整性。图53列出了铰链区带有半胱氨酸的重链恒定区的核苷酸序列和翻译后的氨基酸序列。
以类似方法制得6G4V11N35E的Fab表达质粒，用限制性酶ApaⅠ和NdeⅠ消化pPH6G4V11N35E(来自上文(O))，分离获得携带6G4V11N35E完整轻链和重链可变区的3758bp ApaⅠ-NdeⅠ DNA片段，并将其与p6G4V11N35A.PEG-1的2683bp ApaⅠ-NdeⅠDNA片段连接，形成p6G4V11N35E.PEG-3。通过DNA测序确认整个编码序列的完整性。
如下所述，用20kD直链甲氧基-PEG-马来酰亚胺、30kD直链甲氧基-PEG-马来酰亚胺、40kD直链甲氧基-PEG-马来酰亚胺、或40kD支链甲氧基-PEG-马来酰亚胺修饰抗IL-8 6G4V11N35A Fab变体。所用所有PEG均购自ShearwaterPolymers,Inc.
a．材料和方法
Fab＇-SH的纯化
如Carter等，Bio/Technology 10,163-167(1992)所述，使在发酵罐中生长至高细胞密度的大肠杆菌表达亲和力成熟的抗体6G4V11N35A的Fab＇SH抗体片段。Fab＇-SH片段的制备这样来进行：用4＇,4＇-二硫代二吡啶(PDS)保护Fab-SH＇片段，部分纯化受保护的Fab＇-PDS片段，用二硫苏糖醇(DTT)除去Fab＇-PDS的保护，最后用凝胶渗滤层析分离游离的Fab＇-SH。
用PDS保护Fab＇-SH
将发酵浆液样品溶解在3倍体积20mM MES,5mM EDTA,pH6.0中，每克发酵浆含有10.7毫克4＇,4＇-二硫代二比啶，使悬浮液pH接近6.0。使悬液通过匀浆器，然后在匀浆物中加入5％PEI(w/v)(pH6)，至最终浓度为0.25％。然后，离心混合物除去固体，加入冷水将澄清上清液的电导率调节至低于3mS。
用离子交换层析部分纯化Fab＇-SH分子
将经调节的上清液上样于以20mM MES,pH6.0平衡过的ABX(Baker)柱中。用平衡缓冲液洗柱，然后用15倍柱体积(从20mM MES,pH6.0到20mMMES,350mM氯化钠)的线性梯度液的洗脱Fab＇-SH。以280nm吸光度洗脱监测柱，分级收集洗脱液。
用DTT除去Fab＇-SH抗体片段的保护
加入稀盐酸，调节ABX合并物的pH至4.0。然后加入DTT至最终浓度为0.2mM，以除去pH调节后溶液的保护。培育溶液约30分钟，然后上样于凝胶过滤Sephadex G25柱中，该柱用15mM磷酸钠、 25mM MES(pH4.0)平衡。洗脱后将合并物的pH升高到5.5，立即迅速-70℃冷冻保藏，或如下所述用PEG-MAL衍生处理。
另一种Fab＇-SH纯化方法
另外，可用下列步骤来纯化Fab＇-SH片段。在200毫升50mM乙酸(pH2.8)、2mM EDTA、1mM PMSF存在下融化100克发酵浆液。在室温下剧烈混合30分钟后，使抽提物与100毫克母鸡蛋白溶菌酶共育。在烧结玻璃漏斗上用10mMMES,pH5.5,1mM EDTA平衡DEAE快速流树脂(约100毫升)。然后使含有Fab＇-SH片段的渗透压休克(破裂)抽提物过滤通过树脂。
用10mM MES，pH5.5,1mM EDTA平衡蛋白质G Sepharose柱，然后用DEAE流通样品上样。柱用4倍柱体积的10mM MES,pH5.5,1mMEDTA洗三次。用100mM乙酸，pH2.8,1mM EDTA从柱上洗脱含有游离巯基的Fab＇-SH抗体片段。洗脱后，将合并物的pH升高到5.5，立即迅速-70℃冷冻保藏，或如下所述用PEG-MAL衍生处理。
Fab＇-S-PEG的制备
按照Creighton在Protein Structure：A Practical Approach,Creighton,T.E.编辑，IRL Press(Oxford,UK：1990),155-167页中的方法，通过与5,5＇-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反应来测定如上所述获得的Fab＇-SH制备物的游离巯基含量。游离巯基的浓度从412nm吸光度的增加计算得到，对于硫代硝基苯甲酸阴离子采用e412=14,150cm-1M-1，对于Fab＇-SH抗体，Mr=48,690，e280=1.5。在Fab＇-SH蛋白G Sepharose合并物或去保护的Fab＇-SH凝胶渗滤合并物中加入5摩尔当量的PEG-MAL，立即用10％NaOH调节pH至6.5。
用2.5×20cm阳离子交换柱(Poros 50-HS)纯化Fab＇-S-PEG。柱用含20mM MES，pH5.5的缓冲液平衡。用去离子水稀释含PEG化抗体片段的偶联反应物至电导率约为2.0mS。然后将经过调节的偶联反应物上样于平衡过的Poros 50 HS柱中。用2倍柱体积的20mM MES，pH5.5从柱中洗出未反应的PEG-MAL。用15倍以上柱体积的20mM MES，pH5.5(从0至400mM NaCl)的线性梯度液从柱中洗脱Fab＇-S-PEG。
或者，可用Bakerbond ABX柱纯化Fab＇-S-PEG分子。柱经20mM MES，pH6.0(缓冲液A)平衡。用去离子水稀释偶联反应物，直至电导率等于缓冲液A的电导率(约2.0mS)，再上样于柱。用2倍柱体积的20mM MES，pH6.0从柱中洗出未反应的PEG-MAL。用15倍以上柱体积的20mM MES，pH6.0从0至100mM(NH4)2SO4的线性梯度液从柱中洗脱Fab＇-S-PEG。
体积排阻层析
用Pharmacia Superose-6HR 10/30柱(10×300nm)测定每个分子的流体动力学或有效大小。流动相为200mM NaCl，50mM磷酸钠，pH6.0。流速为0.5毫升/分钟，柱保持于环境温度下。当PEG几乎不提供信号时，监测280nm吸光度。用含有维生素B12、肌红蛋白、卵白蛋白、IgG、甲状腺球蛋白单体和二聚体的Biorad分子量标准品制成标准曲线，根据该曲线来估计PEG化物质的有效大小。
b．结果
体积排阻层析
用体积排阻层析鉴定各个修饰过的抗体片段的有效大小。结果显示在下图60中。图中显示了经PEG 5kD、10kD、20kD、30kD、40kD(直链)、40kD(支链)或100,000kD修饰的抗IL-8 Fab片段的理论分子量以及通过HPLC体积排阻层析获得的PEG化片段的表观分子量。与Fab＇-S-PEG片段的理论分子量相比，通过增加与片段连接的PEG的大小，表观分子量(经体积排阻HPLC计算得到)大幅度增加。与低分子量PEG(例如PEG 10,000D)连接仅使PEG化抗体片段的理论分子量(59,700D)增加3倍，变为表观分子量为180,000D。相反，抗体片段与高分子量PEG(例如100,000D PEG)相连可使PEG化抗体片段的理论分子量(158,700D)增加12倍，变为表观分子量为2,000,000D。
SDS-FAGE
在图61中，上面一组显示了在还原条件下经分子量为5kD(直链)、10kD(直链)、20kD(直链)、30kD(直链)、40kD(直链)、40kD(支链)或100kD(直链)PEG修饰的抗IL-8 Fab片段的大小。第2组从右到左显示了未修饰的Fab。经PAGE测得，Fab的重链和轻链的分子量约为30kD。各个PEG化片段样品产生了两条带：(1)第一条带(由轻链产生)表现出分子量为30kD；(2)第二条链(由PEG和铰链区SH特异性连接的重链产生)表现出分子量增加至40、45、70、110、125、150和300kD。该结果表明，PEG化特别局限于Fab的重链，而轻链保持非修饰。
下面一组是非还原性PAGE的结果，它显示了用分子量为5kD(直链)、10kD(直链)、20kD(直链)、30kD(直链)、40kD(直链)、40kD(支链)或100kD(直链)PEG修饰的抗IL-8 Fab片段的大小。PEG化片段表现出分子量约为70kD,115kD,120kD,140kD,200kD和300kD。
SDS PAGE凝胶确认所有Fab＇-S-PEG分子被纯化到均一，而这些分子只是在与其连接的PEG分子大小方面不同。
U．抗IL-8 F(ab＇)2片段的胺特异性PEG化
用大分子量或支链PEG产生PEG化的F(ab＇)2抗体片段，以获得大的有效大小，而使蛋白修饰对活性的影响最少。修饰涉及与伯胺(赖氨酸和N-端)反应的N-羟基琥珀酰亚氨化学机理。为了减少紧靠CDR区的N-端的修饰可能性，采用pH为8的反应(而不是常用的pH7)。在pH8.0下，赖氨酸ε-NH2基团的反应物质的量(带电荷NH3 +)(pKa=10.3)比氨基端α-NH2基团(pKa约为7)多。对于直链PEG，采用NHS-PEG的甲氧基-琥珀酰亚氨衍生物，因为其在溶液中的半衰期(pH8.0,25℃下为17分钟)明显比PEG的NHS酯(在上述条件下半衰期5-7分钟)长。采用不易水解的PEG，则用较少的PEG就可获得较高程度的修饰。用支链PEG可导致抗体片段的有效大小有较大的增加。
a．材料
所有PEG试剂购自Shearwater Polymer，它保藏于-70℃干燥器中；有支链的N-羟基琥珀酰亚氨基-PEG(PEG2-NHS-40KDa)在两个支链上均有一个20kDa的PEG，甲氧基-琥珀酰亚氨基丙酸-PEG(M-SPA-20000)是具有20kDa PEG的直链PEG分子。如上文(K)和(O)中所述那样，在大肠杆菌中重组制得蛋白质并纯化成F(ab＇)2。
b．方法
IEX方法：利用修饰赖氨酸时电荷的不同，用J.T.Beker Wide-Pore羧基砜(CSX)、5微米、7.75×100mm HPLC柱分离不同的PEG化产物。将柱加热至40℃。采用下表7所示的梯度，其中缓冲液A是25mM硼酸钠/25mM磷酸钠(pH6.0)，缓冲液B是1M硫酸铵，缓冲液C是50mM乙酸钠(pH5.0)。
                  表7
时间(分钟)    ％B    ％C    流速(毫升/分钟)
   0          10      10         1.5
  20          18     7.5         1.5
  25          25     7.5         1.5
  27          70     3.0         2.5
  29          70     3.0         2.5
  30          10     10          2.5
  33          10    10           2.5
SEC-HPLC：用Pharmacia Superose-6 HR 10/30柱(10×300mm)测定每个分子的流体动力学大小或有效大小。流动相为200mM NaCl，50mM磷酸钠(pH6.0)。流速为0.5毫升/分钟，柱保持于环境温度下。当PEG几乎不提供信号时，监测280nm吸光度。用含有维生素B12、肌红蛋白、卵白蛋白、IgG、甲状腺球蛋白单体和二聚体的Biorad分子量标准品制成标准曲线，根据该曲线来估计PEG化抗体片段的有效大小。
SEC-HPLC-光散射：为了测定确切的分子量，使该柱与装有三个检测角(50°、90°和135°)的光散射检测仪(Wyatt Minidawn)在线(on-line)相连。还联接一个折射指数检测仪(Wyatt)来测定浓度。所有缓冲液用Millipore 0.1μ滤膜过滤；另外在柱前串联(on-line)放置一个0.02μWhatman Anodisc 47。
散射光强度与散射物质的分子量(M)直接成正比，它不取决于形状，根据：
M=R0/K·c
其中R0是瑞利比，K是与溶剂折射指数、入射光波长、和dn/dc有关的光学常数，当溶质浓度c改变时，溶剂和溶质间的折射指数不同。系统用甲苯标定(632.8nm下R0为1.406×10-5)；dn/dc为0.18，采用的消光系数为1.2。系统的质量精确度偏差约为5％。
SDS-PAGE：用4-12％Tris-甘氨酸Novex微型凝胶和Novex供应的Tris-甘氨酸跑样缓冲液。在每个孔中加入10-20ug蛋白质，使凝胶在冷却盒中150mV/凝胶下跑电泳45分钟。然后用胶体考马斯蓝(Novex)对凝胶染色，然后水洗数小时，然后在干燥缓冲液(Novex)中保存和干燥。
直链(1)20KDa-(N)-(Fab＇)2的制备：将最初配制在pH5.5缓冲液中的4毫克/毫升抗IL-8对pH8.0磷酸钠缓冲液透析过夜。以3∶1的摩尔比混合5毫升蛋白质。在15毫升聚丙烯Falcon试管中进行反应，加入PEG并低速搅拌样品5秒种。然后将其置于章动器(nutator)上30分钟。用SDS-PAGE评价修饰的程度。将全部5毫升反应混合物中注入IEX中以除去未反应的PEG并纯化单PEG化或双PEG化的物质。上述反应产生了50％单个标记的抗IL-8的混合物。使另50％的未反应抗IL-8循环通过PEG化/纯化步骤。将合并的PEG化产物对pH5.5缓冲液透析，以便进行体外试验和动物PK研究。在给予动物或进行细胞为基础的试验之前测定内毒素水平。水平低于0.5eu/ml。另外还在SDS-PAGE上对该级分跑电泳以确认均一性。通过用1.34的消光系数测定280nm下的吸光度，以及氨基酸分析，估计产品最终浓度。
支链(1)40KDa-(N)-(Fab＇)2的制备：将配制在pH5.5缓冲液中的4毫克/毫升抗IL-8(Fab＇)2对pH8.0磷酸钠缓冲液透析过夜。在两等份5毫升蛋白质中加入固体PEG粉末，最终使PEG：蛋白质摩尔比为6∶1。每个固体PEG等份加入15毫升聚丙烯Falcon试管的蛋白质中，并低速搅拌5秒，然后将其置于章动器上15分钟。通过SDS-PAGE用4-12％Tris-甘氨酸(Novex)凝胶和胶体考马斯蓝(Novex)染色来评价修饰的程度。将5毫升PEG-蛋白混合物注入离子交换柱中以除去未反应的PEG。上述反应产生的混合物含37％未反应的、45％单个标记的、以及双标记和三标记(18％)的抗体。这是每个抗体只有1个PEG而不是高级分子量加成物获得最大蛋白回收的最优条件。再循环未修饰的抗IL-8。分离PEG化产物，在falcon管中分级，然后对pH5.5缓冲液透析，以便进行体外试验和动物PK研究。内毒素水平低于0.5eu/ml。另外还在SDS-PAGE上对该级分跑电泳以确认均一性。通过用1.34的消光系数测定280nm下吸光度，以及氨基酸分析，估计产品最终浓度。
支链(2)-40KDa-(N)(Fab＇)2的制备：通过加入摩尔比为3∶1的PEG与已修饰的支链(1)-40KDa-(N)-(Fab＇)2三次(每次间隔15分钟)，可最有效地制得该分子。该分子在IEX上纯化成50％支链(2)-40KDa-(N)-(Fab＇)2。再循环未修饰的分子，直至分离获得约20毫克蛋白质进行动物PK研究。用SEC-光扫描和SDS-PAGE对产物作特性分析。
c．结果
经凝胶过滤(SEC-HPLC)测得，PEG明显增加了产物的流体动力学或有效大小。图62显示了280nmUV检测PEG化F(ab′)2抗体的SEC曲线。参照标准分子量校准估计每个分子的流体动力学大小。如图62所归纳的，加入一个直链20kDaPEG分子，F(ab＇)2有效大小的增加约7倍，加入一个支链("Br(1)")40kDa PEG分子，增加约11倍，而加入两个支链("Br(2)")PEG分子则增加得更多。
光散射检测提供了产物的确切分子量，并确认了修饰程度(图63)。SDS-PAGE(图64)显示了纯化抗体的均一性。未衍生处理的F(ab＇)2迁移至120kDa，直链(1)29KD-(N)-F(ab＇)2迁移至220kDa处的条带，Br(1)-40KD(N)-F(ab′)2迁移的主要条带在400kDa处，Br(2)-40KD-(N)-F(ab′)2迁移的主要条带在约500kDa处。由于PEG的位阻效应，蛋白质显示出稍高于其绝对分子量。
V．PEG修饰的6G4V11N35A Fab＇片段的体外活性鉴定(马来酰亚胺化学偶联方法)
测试经5-40kD直链PEG分子和40kD支链PEG分子修饰的抗IL-86G4V11N35A Fab＇变体抑制IL-8结合和激活人嗜中性白细胞的能力；步骤如上文(B)(1)、(B)(2)和(B)(3)所述。PEG-马来酰亚胺修饰的6G4V11N35A Fab＇分子的结合曲线和IC50显示在图54A-54C中。5kD PEG化的Fab＇的IC50(350pM)和Fab对照的IC50平均值(366pM)没有明显差别，这表明加入5kD分子量的PEG不会影响IL-8与修饰的Fab＇的结合(图54A)。然而，发现IL-8与10kD和20kD PEG化Fab＇分子的结合减少，正如其IC50(分别为537pM和732pM)逐渐高于天然Fab的IC50平均值所预计的那样。这些值表明只有最少的结合活性损失(在1.5至2倍之间)。发现30kD和40kD直链PEG抗体(图54B)与IL-8结合的差别较不显著(图54B)。与Fab对照的802pM值相比，IC50分别为624pM和1.1nM。40kD支链PEG Fab＇在IL-8的结合中显示出相对于天然Fab有最大的减少(2.5倍)(图54C)。尽管如此，这些PEG化Fab与IL-8结合的减少还是最少的。
用PMN趋化(根据上文B(2)所述的方法)和β-葡糖醛酸酶释放试验(根据Lowman等，J.Biol.Chem.,271：14344(1996)所述方法)证明PEG化抗体能封闭IL-8介导的人嗜中性白细胞活化。图55A-55C显示了封闭IL-8介导趋化作用的IC50。5-20kD直链PEG化的Fab＇抗体封闭IL-8介导趋化作用的能力是未PEG化Fab对照的2-3倍(图55A)。这一差别并不显著，因为这类试验本身的偏差可高达2倍。然而，如30kD直链PEG-Fab＇(2.5nM)和40kD直链PEG-Fab＇(3.7nM)的IC50高于Fab对照(0.8nm)(图55B)所描述的那样，30kD和40kD直链PEG化Fab＇抗体可检测到明显的差别。40kD支链PEG Fab＇分子封闭IL-8介导趋化的能力与40 kD直链PEG Fab＇相似(图55C)。至多，PEG化Fab＇抗体封闭IL-8介导趋化的能力仅减少2-3倍。另外，用嗜中性白细胞颗粒释放β-葡糖醛酸酶作为评价IL-8介导激活人PMN的另一个标准。图56A(显示了5kD、10kD和20kD直链PEG获得的结果)、图56B(显示了30kD和40kD直链PEG获得的结果)和图56C(显示了40kD支链PEG获得的结果)表明，所有PEG化的Fab＇抗体能象未PEG化Fab＇对照那样抑制IL-8介导释放β-葡糖醛酸酶，或比其更佳。数据总的表明PEG化变体具有生物活性，它能在采用人嗜中性白细胞的体外试验中能抑制大量外源IL-8。
W．PEG修饰的6G4V11N35A F(ab＇)2片段的体外活性性质鉴定(琥珀酰亚氨基化学偶联方法)
用以下方式修饰抗IL-8变体6G4V11N35AF(ab＇)2：(a)每个F(ab＇)2有一个20kD直链PEG分子；(b)每个F(ab＇)2有一个40kD支链PEG分子；(c)每个F(ab＇)2有3、4或5个20kD直链PEG分子(每个F(ab＇)2有三个PEG分子、每个F(ab＇)2有四个PEG分子以及每个F(ab＇)2有五个PEG分子的混合物；称为“20kD直链PEG(3,4,5)F(ab＇)2”)；或(d)每个F(ab＇)2有两个40kD支链PEG分子(称为“40kD支链PEG(2)F(ab＇)2”)，测试它们抑制125I-IL-8结合并中和人嗜中性白细胞活化的能力。所用步骤如上文(B)(1)、(B)(2)和(B)(3)所述。图57A-57B显示了PEG化F(ab＇)2变体的结合曲线。发现F(ab＇)2对照、一个20kD直链PEG修饰的F(ab＇)2以及一个40kD支链PEG修饰的F(ab＇)2之间没有明显的差别(图57)。然而，含有多个PEG分子的F(ab＇)2变体却显示出结合IL-8的能力稍有减少(小于2倍)。与F(ab＇)2对照的349pM相比，20kD直链PEG(3,4,5)F(ab＇)2和40kD支链PEG(2)F(ab＇)2变体的IC50分别为437pM和510pM(图57B)。
图58A-58B显示了这些PEG化F(ab＇)2变体封闭IL-8介导嗜中性白细胞趋化的能力。与PMN结合数据一致，单个直链和支链PEG F(ab＇)2变体能象未PEG化的F(ab＇)2对照那样封闭IL-8介导的趋化作用(图58A)。40kD支链PEG(2)F(ab＇)2变体抑制PMN趋化的能力与对照F(ab＇)2相同，而20kD直链PEG(3,4,5)F(ab＇)2混合物能以3倍于对照抗体的能力抑制(图58B)。
图59A和59B显示了β-葡糖醛酸酶释放试验的结果，该试验测定的是IL-8刺激人嗜中性白细胞引起的脱颗粒。单个20kD直链PEG修饰的F(ab＇)2和单个40kD支链PEG修饰的F(ab＇)2变体能象F(ab＇)2对照那样抑制β-葡糖醛酸酶的释放(图59A)。40kD支链PEG(2)F(ab＇)2抑制该反应的能力是F(ab＇)2对照的2倍(图59B)。没有测试20kD直链PEG(3,4,5)分子。总之，F(ab＇)2PEG化的抗IL-8抗体具有生物活性，能有效地防止IL-8结合人嗜中性白细胞以及防止导致细胞活化的信号行为。
X．PEG化抗IL-8(人源化)F(ab＇)2和Fab＇片段的8种构建物在正常家兔静脉给药后的药物动力学和安全性研究
本研究的目的是评价PEG化对6种PEG化人源化抗IL-8构建物(上文(T)和(U)中获得的PEG化的6G4V11N35A.Fab＇和PEG化6G4V11N35A.F(ab＇)2)在正常家兔中的药物动力学和安全性的影响(相对于未PEG化片段而言)。通过用一种抗IL-8构建物单次静脉(Ⅳ)丸剂使8组(每组2/3只)雄家兔接受等蛋白量的PEG化6G4V11N35A.Fab＇或PEG化6G4V11N35A.F(ab＇)2构建物(2mg/kg)。根据下表8所示方案收集血清样品，用ELISA分析抗IL-8蛋白浓度和抗IL-8构建物的抗体形成。
                              表8
组编号 剂量水平/途径 材料 血样收集
1 2mg/kg(蛋白浓度)IV丸剂 Fab′对照 0,5,30分钟；1,2,3,4,6,8,10,14,20,24,360小时
2 直链(1)20K(s)Fab′ 0,5,30分钟；1,2,4,6,8,10,12,24,28,32,48,72,96,168,216,264,336,360小时
3 直链(1)40K(s)Fab′
4 支链(1)40K(N)F(ab′)2
5 F(ab′)2对照 0,5,30分钟；1,2,4,6,8,10,12,24,28,32,48,52,56,336小时
6 支链(2)40K(s)Fab′ 0,5,30分钟；1,2,4,6,8,10,12,24,28,32,48,72,96,168,216,264,336小时；17,21,25天
7 支链(2)40K(N)F(ab′)2 0,5,30分钟；1,2,4,6,8,10,12,24,28,32,48,72,144,192,240小时；13,16,20,23天
8 直链(1)30K(s)Fab′ 0,5,30分钟；1,2,4,6,8,10,12,24,28,32,48,72,96,168,216,264,336小时；17,21,25天
a.方法
使每组三只新西兰(NZW)白兔(组7例外，有2只)通过耳缘静脉以Ⅳ丸剂形式接受等量6G4V11N35A蛋白(Fab＇或F(ab＇)2)构建物(2mg/kg)。分析氨基酸组成，测定280nm吸光度(对6G4V11N35A Fab＇构建物采用的消光系数为1.26，对6G4V11N35AF(ab＇)2为1.34)，以测定蛋白浓度。在上表的时间点通过耳动脉插管(非给药耳的另一耳)收集全血样品。收获样品中的血清，用IL-8结合ELISA测定游离的6G4V11N35AFab＇或F(ab′)2构建物。当可获得样品时，在整个研究中进行试验。在末次抽血后处死所有动物，对组1、4-8的所有动物进行解剖。由于抗6G4V11N35A构建物的抗体的产生，仅根据168小时内浓度对时间的数据进行非区室药物动力学分析。
b．结果
在四只动物(动物B、P、Q、V)中，ELISA试验检测到对家兔血清的干扰(即预先给药时有可测浓度的抗IL-8抗体)。然而，因为这些抗体值位非显著水平，不影响药物动力学分析，因此数据未对此干扰作校正。
一只动物(动物G；第3组)在研究终止前贫血，因此将其排除在药物动力学分析之外。在4小时时，该动物表现出据信与药物不相关的中风症状，家兔在通过耳动脉插管抽血后会发生这种现象。
图65显示了8种抗IL8构建物在正常家兔中的平均浓度-时间曲线，8种构建物的药物动力学参数归纳在下表9中。在所有给药组(组1(Fab＇对照)除外)中，到第13/14天均明显存在抗IL-8构建物的抗体。
表9．药物动力学参数
分子 Fab’ F(ab’)2
组编号PEG结构PEG数PEG MW 1--- 2直链120K 8直链130K 3直链140K 6支链140K 5--- 4支链140K 7支链240K
剂量(mg/kg)Vc(mL/Kg)aVss(mL/Kg)bCmax(μg/mL)cTmax(分钟)dt1/2term(小时)eAUCo(小时μg/mL)fCL(mL/hr/kg)gMRT(小时)h动物数 258±368±835±153.0±0.918±3110±170.61±0.153 236±380±858±3544±280±472.5±0.232±23 235±1110±1557±1543±7910±1402.2±0.445±93 234796055016001.3632 244±188±2145±15105±113400±13000.63±0.20140±183 245±559±445±658.5±2.1140±314±04.2±0.33 236±150±356±2545±32200±770.92±0.0355±33 23252625482500.83642
a分布的最初体积
b稳定状态下的分布体积
c观察到的最高浓度
dCmax时的观察时间
et1/2term=浓度随时间曲线最终阶段相关的半衰期
f浓度时间曲线下的面积(外推至无限)
gCL=血清清除速率
hMRT=平均滞留时间
分布的最初体积接近Fab＇和F(ab＇)2的血浆体积。如下表10所示，PEG化减少了抗IL-8片段的血清CL，延长了终点半衰期和MRT。
表10PEG化抗IL-8片段的清除率、终点半衰期和MRT的减少/增加倍数
    抗IL-8片段     Fab＇     F(ab＇)2
    组编号 1        2    8     3    6 5    4        7
    PEG结构PEG数PEGMW -      直链  直链 直链  支链-       1     1    1      1-      20K   30K  40K    40K -  支链      支链-    1         2-   40K       40K
 CL：平均值(mL/hr/kg)减少倍数 110   2.5   2.2   1.3    0.631     46    51     90    180   14   0.92   0.831    15     17
 t1/2term平均值(hr)增加倍数 3.0    44    43    50    1101     14    14    17    35  8.5   45      481     5.3     5.7
 MRT平均值(hr)增加倍数 0.61  32    45    63     1401    53    73    100    240  4.2   55     641    13     15
对于PEG化抗IL-8 Fab＇片段，CL减少46-180倍。终点半衰期和MRT分别增加14-35倍和53-240倍。对于PEG化的抗IL-8F(ab′)2分子，PEG化使CL减少15-17倍，终点半衰期和MRT分别增加超过5倍和13倍。PEG化Fab＇和F(ab＇)2的这些参数的变化随着PEG分子量的增加而增加，并接近全长抗IL-8的数值(终点半衰期为74小时，MRT为99小时，CL为0.47mL/hr/kg)。与支链(1)40KFab＇(第6组)和支链(1)40K F(ab＇)2(第4组)相比，发现了出乎意料的药物动力学参数。PEG化的Fab＇分子看来滞留血清的时间比PEG化F(ab＇)2更长(见图66)。支链(1)40K Fab＇的CL平均值为0.63mL/hr/kg，但是发现支链(1)40kD F(ab＇)2有更高的CL值(CL为0.92mL/hr/kg)。同样，Fab＇的终点半衰期比F(ab＇)2PEG化分子长(110对45小时)。
药物动力学数据证明，PEG化减少了抗IL-8片段(Fab＇和F(ab＇)2)的CL，并增加了终点t1/2和MRT，接近全长抗IL-8的值。PEG化使Fab＇的清除率减少46-180倍，使F(ab＇)2的清除率减少约16倍。Fab＇抗IL-8片段的终点半衰期提高14-35倍，而F(ab′)2抗IL-8约提高5倍。同样，Fab＇的MRT延长53-240倍，F(ab＇)2延长约14倍。支链(1)40kD Fab＇具有比支链40kD(1)F(ab＇)2更长的终点半衰期和更低的清除率。
Y．抗IL-8抗体试剂在局部缺血/再灌输以及酸吸入诱导急性呼吸道窘迫综合征(ARDS)的家兔模型中的体内效率测试
在家兔ARDS模型中测试全长小鼠抗家兔IL-8单克隆抗体6G4.2.5、40kD支链PEG-6G4V11N35A Fab＇以及对照抗体(抗HIV gpl20单克隆抗体9E3.1F10)。对动物称重，在肌内注射氯胺酮(50mg/kg体重)、甲苯噻嗪(5mg/kg体重)和乙酰丙嗪(0.75mg/kg体重)进行麻醉。在除去血管夹之前15分钟肌内给予第二剂(第一剂的20％)，在气管切开时给予第三剂(第一剂的60％)。将动脉内导管(22G，1英寸，Angiocath)和静脉内导管(24G，1英寸，angiocath)置于耳中央动脉和后缘耳静脉内以便分别用于取血样(动脉血液气体和CBC分析)以及给予抗IL-8和液体给药。将麻醉后的动物转移成仰卧在操作台上；修剪腹部区域毛发准备进行外科手术。通过中线剖腹，分离出肠系膜上动脉(SAM)，在主动脉出口使用微型血管动脉夹。在用9mm伤口夹(Autoclip,Bacter)暂时封合腹部前，在腹腔膜内给予15毫升生理盐水作液体补充。在肠局部缺血110分钟后，重新打开腹部切口，松开动脉夹进行再灌输。在封合前，向腹腔膜内给予5毫升生理盐水作体液替换。用两层封合关闭剖腹切口，使动物清醒。
手术后，将动物置于加热垫(38℃)上并在再灌输后连续监测6小时，静脉内给予乳酸盐Ringer试剂8-12毫升/千克/小时作体液补充。
再灌输22-24小时后，在麻醉状态下将气管切开。用水以1∶3稀释普通生理盐水并调节至pH1.5(用1N HCl调节)；然后在气管内滴注3毫升/千克体重。用恒温加热治疗垫(K-ModⅡ,Baxter)维持直肠温度为37±1℃。静脉内以5毫升/千克/小时的速度给予体液补充(LRS)。每小时监测血液气体。连续监测6小时后将家兔放回笼内。
在抽吸前，用盐水、对照单克隆抗体(抗HIV gp-120 IgG 9E3.1F10)、全长小鼠抗家兔IL8(6G4.2.5小鼠IgG2a抗家兔IL8)或PEG化6G4V11N35A Fab＇(如上文T所述用40kD支链马来酰亚胺PEG修饰的6G4V11N35A Fab＇，称为“40kD支链PEG-6G4V11N35A Fab”)处理动物。组合盐水或对照抗体处理的动物的数据作为“对照”。每天进行动脉血液气体和A-aPO2梯度测定。每天静脉内补充体液。在再灌输96小时时测定A-aPO2梯度。A-aPO2梯度的计算如下：
A-aPO2=[FIO2(PB-PH2O)-(PaCO2/RQ)]-PaO2。
在环境空气和100％氧气下24和48小时时测定PaO2/FiO2之比。
在最终的A-aPO2梯度测定后，用100mg/kg戊巴比妥静脉内麻醉动物，横向切开腹主动脉处死动物，以减少红血细胞污染支气管肺泡灌洗液(BAL)。整块取出肺。对整个肺称重，然后用30毫升HBSS和利多卡因进行气管内导管(Hi-Lo气管导管，3mm)灌洗。测定BAL中全部和分化白血球数。对每个动物的右肺的每一叶作组织学检查，以确认损伤/病变。
图67、68和69分别显示了肺总重量、BAL中的全部白血球和多形核白细胞计数以及获得的PaO2/FiO2数据。与“对照”组相比，用40kD支链PEG-6G4V11N35A Fab＇处理显示其对模型中测定的生物参数没有影响。然而，数据与上文(Ⅴ)和(Ⅹ)中40kD支链PEG-6G4V11N35A Fab＇的药物动力学分析或体外活性分析的结果并不矛盾。另外，这些数据也不与40kD支链PEG-6G4V11N35A Fab＇能到达并作用于循环或其它组织中的疾病效应物靶相矛盾。
下列生物物质已经保藏在美国典型培养物保藏中心，12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,USA(ATCC)中：材料                                    ATCC登录号   保藏日期杂交瘤细胞系5.12.14                     HB11553      1993年2月15日杂交瘤细胞系6G4.2.5                     HB11722      1994年9月28日pantiIL-8.2，大肠杆菌菌株294mm          97056        1995年2月10日p6G425chim2，大肠杆菌菌株294mm          97055        1995年2月10日p6G4V11N35A.F(ab＇)2                   97890        1997年2月20日大肠杆菌菌株49D6(p6G4V11N35A.F(ab＇)2) 98332        1997年2月20日p6G4V11N35A.choSD                       209552       1997年12月16日克隆#1933 aIL8.92 NB 28605/12           CRL-12444    1997年12月11日克隆#1934 aIL8.42 NB 28605/14           CRL-12445    1997年12月11日
这些保藏是根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的规定及其细则来实施的。这保证了保藏物自保藏日起30年存活。这些细胞系可根据布达佩斯条约并且根据Genentech,Inc.和ATCC间的合同从ATCC获得，这保证了公众可在美国专利授权或任何美国或外国专利申请向公众公布时(以在先发生行为为准)永久地、无限制性地获得该细胞系，并保证由美国专利商标委员会根据35USC§122及其附属委员会规定(包括37CRF§1.14，特别是参照886 OG 638)确定的人均可获得该细胞系。
本申请的持有者已经同意，如果保藏的细胞系在合适的条件下培育时丢失或被破坏，他们会在收到通知后立即用同一细胞系的样品代替。保藏细胞系的可获得性不应理解成是实施本发明的许可证，这是违背任何政府根据其专利法授予的权利的。
                   序列表(1)一般信息：(ⅰ)申请人：Hsei,Vanessa
          Koumenis,Iphigenia
          Leong,Steven R.
          Presta,Leonard G.
          Shahrokh,Zahra
          Zapata,Gerardo A.(ⅱ)发明名称：抗体片段-聚合物偶联物和人源化的抗白细胞介素-8单克隆抗体(ⅲ)序列数目：76(ⅳ)通信地址：
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  (A)申请号：PCT/US98/03337
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  (A)长度：405碱基对
  (B)类型：核酸
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  (A)长度：242氨基酸
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  (D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：56：Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe1               5                  10                  15Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr
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        110                     115                 120His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
        125                     130                 135Arg Ala Val Ala Ala Pro Thr Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Ser
        140                     145                 150Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
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        200                     205                 210Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
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            230                 235                 240Glu Cys
242(2)SEQ ID NO：57的信息：(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：762碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：57：ATGAAAAAGA  ATATCGCATT  TCTTCTTGCA  TCTATGTTCG  TTTTTTCTAT  50TGCTACAAAC  GCGTACGCTG  AGATTCAGCT  GCAGCAGTCT  GGACCTGAGC  100TGATGAAGCC  TGGGGCTTCA  GTGAAGATAT  CCTGCAAGGC  TTCTGGTTAT  150TCATTCAGTA  GCCACTACAT  GCACTGGGTG  AAGCAGAGCC  ATGGAAAGAG  200CCTTGAGTGG  ATTGGCTACA  TTGATCCTTC  CAATGGTGAA  ACTACTTACA  250ACCAGAAATT  CAAGGGCAAG  GCCACATTGA  CTGTAGACAC  ATCTTCCAGC  300ACAGCCAACG  TGCATCTCAG  CAGCCTGACA  TCTGATGACT  CTGCAGTCTA  350TTTCTGTGCA  AGAGGGGACT  ATAGATACAA  CGGCGACTGG  TTTTTCGATG  400TCTGGGGCGC  AGGGACCACG  GTCACCGTCT  CCTCCGCCTC  CACCAAGGGC  450CCATCGGTCT  TCCCCCTGGC  ACCCTCCTCC  AAGAGCACCT  CTGGGGGCAC  500AGCGGCCCTG  GGCTGCCTGG  TCAAGGACTA  CTTCCCCGAA  CCGGTGACGG  550TGTCGTGGAA  CTCAGGCGCC  CTGACCAGCG  GCGTGCACAC  CTTCCCGGCT  600GTCCTACAGT  CCTCAGGACT  CTACTCCCTC  AGCAGCGTGG  TGACCGTGCC  650CTCCAGCAGC  TTGGGCACCC  AGACCTACAT  CTGCAACGTG  AATCACAAGC  700CCAGCAACAC  CAAGGTGGAC  AAGAAAGTTG  AGCCCAAATC  TTGTGACAAA  750ACTCACACAT  GA 762(2)SEQ ID NO：58的信息：(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：253氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：58：Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe1               5                  10                  15Ser Ile Ala Thr Ash Ala Tyr Ala Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser
             20                  25                  30Gly Pro Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys
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             50                  55                  60Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp
             65                  70                  75Pro Ser Asn Gly Glu Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys
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             95                 100                 105Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
            110                 115                 120Arg Gly Asp Tyr Arg Tyr Asn Gly Asp Trp Phe Phe Asp Val Trp
            125                 130                 135Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
            140                 145                 150Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
            155                 160                 165Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
            170                 175                 180Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
            185                 190                 195His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
            200                 205                 210Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
            215                 220                 225Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
            230                 235                 240Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
            245                 250         253(2)SEQ ID NO：59的信息：(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：114氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：59：Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu1               5                  10                  15Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val
             20                  25                  30His Gly Ile Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
             35                  40                  45Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Lys Val Ser Asn Arg
             50                  55                  60Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Asp Ser Gly Ser Gly Thr
             65                  70                  75Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
             80                  85                  90Leu Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly
             95                 100                 105Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
             110            114(2)SEQ ID NO：60的信息：(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：114氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：60：Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val1               5                  10                  15Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val
             20                  25                  30His Gly Ile Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
             35                  40                  45Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Lys Val Ser Asn Arg
             50                  55                  60Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
             65                  70                  75Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
             80                  85                  90Thr Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly
             95                 100                 105Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
             110            114(2)SEQ ID NO：61的信息：(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：109氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：61：Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val1               5                  10                  15Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Thr Ile Ser
             20                  25                  30Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
             35                  40                  45Leu Leu Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro
             50                  55                  60Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
             65                  70                  75Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
             80                  85                  90Gln His Asn Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
             95                 100                 105Glu Ile Lys Arg
        109(2)SEQ ID NO：62的信息：(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：117氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：62：Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys Pro Gly1               5                  10                  15Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser
             20                  25                  30Ser His Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu
             35                  40                  45Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asp Pro Ser Asn Gly Glu Thr Thr Tyr
             50                  55                  60Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser
             65                  70                  75Ser Ser Thr Ala Asn Val His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp
             80                  85                  90Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Arg Gly Asp Tyr Arg Tyr Asn
             95                 100                 105Gly Asp Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr
            110                 115     117(2)SEQ ID NO：63的信息：(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：117氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：63：Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1               5                  10                  15Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser
             20                  25                  30Ser His Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
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             50                  55                  60Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
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  (A)长度：242氨基酸
  (B)类型：氨基酸
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242(2)SEQ ID NO：66的信息：(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：253氨基酸
  (B)类型：氨基酸
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  (A)长度：159氨基酸
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  (A)长度：780碱基对
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  (A)长度：242氨基酸
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            215                 220                 225His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
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242(2)SEQ ID NO：70的信息：(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：253氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：70：Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe1               5                  10                  15Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
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            185                 190                 195His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
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            245                 250         253(2)SEQ ID NO：71的信息：(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：242氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：71：Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe1               5                  10                  15Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
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            140                 145                 150Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
            155                 160                 165Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
            170                 175                 180Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
            185                 190                 195Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
            200                 205                 210Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
            215                 220                 225His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
            230                 235                 240Glu Cys
242(2)SEQ ID NO：72的信息：(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：45氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：72：Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Arg Met Lys1               5                  10                  15Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His
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             35                  40                  45(2)SEQ ID NO：73的信息：(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：780碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：73：ATGAAAAAGA  ATATCGCATT  TCTTCTTGCA  TCTATGTTCG  TTTTTTCTAT  50TGCTACAAAC  GCATACGCTG  ATATCCAGAT  GACCCAGTCC  CCGAGCTCCC  100TGTCCGCCTC  TGTGGGCGAT  AGGGTCACCA  TCACCTGCAG  GTCAAGTCAA  150AGCTTAGTAC  ATGGTATAGG  TGCTACGTAT  TTACACTGGT  ATCAACAGAA  200ACCAGGAAAA  GCTCCGAAAC  TACTGATTTA  CAAAGTATCC  AATCGATTCT  250CTGGAGTCCC  TTCTCGCTTC  TCTGGATCCG  GTTCTGGGAC  GGATTTCACT  300CTGACCATCA  GCAGTCTGCA  GCCAGAAGAC  TTCGCAACTT  ATTACTGTTC  350ACAGAGTACT  CATGTCCCGC  TCACGTTTGG  ACAGGGTACC  AAGGTGGAGA  400TCAAACGAAC  TGTGGCTGCA  CCATCTGTCT  TCATCTTCCC  GCCATCTGAT  450GAGCAGTTGA  AATCTGGAAC  TGCTTCTGTT  GTGTGCCTGC  TGAATAACTT  500CTATCCCAGA  GAGGCCAAAG  TACAGTGGAA  GGTGGATAAC  GCCCTCCAAT  550CGGGTAACTC  CCAGGAGAGT  GTCACAGAGC  AGGACAGCAA  GGACAGCACC  600TACAGCCTCA  GCAGCACCCT  GACGCTGAGC  AAAGCAGACT  ACGAGAAACA  650CAAAGTCTAC  GCCTGCGAAG  TCACCCATCA  GGGCCTGAGC  TCGCCCGTCA  700CAAAGAGCTT  CAACAGGGGA  GAGTGTTAAG  CTGATCCTCT  ACGCCGGACG  750CATCGTGGCC  CTAGTACGCA  ACTAGTCGTA  780(2)SEQ ID NO：74的信息：(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：927碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：74：AAAAGGGTAT  CTAGAGGTTG  AGGTGATTTT  ATGAAAAAGA  ATATCGCATT  50TCTTCTTGCA  TCTATGTTCG  TTTTTTCTAT  TGCTACAAAC  GCGTACGCTG  100AGGTTCAGCT  AGTGCAGTCT  GGCGGTGGCC  TGGTGCAGCC  AGGGGGCTCA  150CTCCGTTTGT  CCTGTGCAGC  TTCTGGCTAC  TCCTTCTCGA  GTCACTATAT  200GCACTGGGTC  CGTCAGGCCC  CGGGTAAGGG  CCTGGAATGG  GTTGGATATA  250TTGATCCTTC  CAATGGTGAA  ACTACGTATA  ATCAAAAGTT  CAAGGGCCGT  300TTCACTTTAT  CTCGCGACAA  CTCCAAAAAC  ACAGCATACC  TGCAGATGAA  350CAGCCTGCGT  GCTGAGGACA  CTGCCGTCTA  TTACTGTGCA  AGAGGGGATT  400ATCGCTACAA  TGGTGACTGG  TTCTTCGACG  TCTGGGGTCA  AGGAACCCTG  450GTCACCGTCT  CCTCGGCCTC  CACCAAGGGC  CCATCGGTCT  TCCCCCTGGC  500ACCCTCCTCC  AAGAGCACCT  CTGGGGGCAC  AGCGGCCCTG  GGCTGCCTGG  550TCAAGGACTA  CTTCCCCGAA  CCGGTGACGG  TGTCGTGGAA  CTCAGGCGCC  600CTGACCAGCG  GCGTGCACAC  CTTCCCGGCT  GTCCTACAGT  CCTCAGGACT  650CTACTCCCTC  AGCAGCGTGG  TGACCGTGCC  CTCCAGCAGC  TTGGGCACCC  700AGACCTACAT  CTGCAACGTG  AATCACAAGC  CCAGCAACAC  CAAGGTCGAC  750AAGAAAGTTG  AGCCCAAATC  TTGTGACAAA  ACTCACACAT  GCCCGCCGTG  800CCCAGCACCA  GAACTGCTGG  GCGGCCGCAT  GAAACAGCTA  GAGGACAAGG  850TCGAAGAGCT  ACTCTCCAAG  AACTACCACC  TAGAGAATGA  AGTGGCAAGA  900CTCAAAAAGC  TTGTCGGGGA  GCGCTAA  927(2)SEQ ID NO：75的信息：(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：298氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：75：Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe1               5                  10                  15Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser
             20                  25                  30Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
             35                  40                  45Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Ser His Tyr Met His Trp Val
             50                  55                  60Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asp
             65                  70                  75Pro Ser Asn Gly Glu Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg
             80                  85                  90Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
             95                 100                 105Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
            110                 115                 120Arg Gly Asp Tyr Arg Tyr Asn Gly Asp Trp Phe Phe Asp Val Trp
            125                 130                 135Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
            140                 145                 150Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
            155                 160                 165Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
            170                 175                 180Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
            185                 190                 195His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
            200                 205                 210Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
            215                 220                 225Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
            230                 235                 240Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
            245                 250                 255Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Arg Met Lys Gln Leu
            260                 265                 270Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu
            275                 280                 285Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg
            290                 295         298(2)SEQ ID NO：76的信息：(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：6563碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：76：GAATTCAACT TCTCCATACT TTGGATAAGG AAATACAGAC ATGAAAAATC 50TCATTGCTGA GTTGTTATTT AAGCTTGCCC AAAAAGAAGA AGAGTCGAAT 100GAACTGTGTG CGCAGGTAGA AGCTTTGGAG ATTATCGTCA CTGCAATGCT 150TCGCAATATG GCGCAAAATG ACCAACAGCG GTTGATTGAT CAGGTAGAGG 200GGGCGCTGTA CGAGGTAAAG CCCGATGCCA GCATTCCTGA CGACGATACG 250GAGCTGCTGC GCGATTACGT AAAGAAGTTA TTGAAGCATC CTCGTCAGTA 300AAAAGTTAAT CTTTTCAACA GCTGTCATAA AGTTGTCACG GCCGAGACTT 350ATAGTCGCTT TGTTTTTATT TTTTAATGTA TTTGTAACTA GAATTCGAGC 400TCGGTACCCG GGGATCCTCT CGAGGTTGAG GTGATTTTAT GAAAAAGAAT 450ATCGCATTTC TTCTTGCATC TATGTTCGTT TTTTCTATTG CTACAAACGC 500ATACGCTGAT ATCCAGATGA CCCAGTCCCC GAGCTCCCTG TCCGCCTCTG 550TGGGCGATAG GGTCACCATC ACCTGCAGGT CAAGTCAAAG CTTAGTACAT 600GGTATAGGTG CTACGTATTT ACACTGGTAT CAACAGAAAC CAGGAAAAGC 650TCCGAAACTA CTGATTTACA AAGTATCCAA TCGATTCTCT GGAGTCCCTT 700CTCGCTTCTC TGGATCCGGT TCTGGGACGG ATTTCACTCT GACCATCAGC 750AGTCTGCAGC CAGAAGACTT CGCAACTTAT TACTGTTCAC AGAGTACTCA 800TGTCCCGCTC ACGTTTGGAC AGGGTACCAA GGTGGAGATC AAACGAACTG 850TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA 900TCTGGAACTG CTTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA 950GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC 1000AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC 1050AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC 1100CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA 1150ACAGGGGAGA GTGTTAAGCT GATCCTCTAC GCCGGACGCA TCGTGGCCCT 1200AGTACGCAAC TAGTCGTAAA AAGGGTATCT AGAGGTTGAG GTGATTTTAT 1250GAAAAAGAAT ATCGCATTTC TTCTTGCATC TATGTTCGTT TTTTCTATTG 1300CTACAAACGC GTACGCTGAG GTTCAGCTAG TGCAGTCTGG CGGTGGCCTG 1350GTGCAGCCAG GGGGCTCACT CCGTTTGTCC TGTGCAGCTT CTGGCTACTC 1400CTTCTCGAGT CACTATATGC ACTGGGTCCG TCAGGCCCCG GGTAAGGGCC 1450TGGAATGGGT TGGATATATT GATCCTTCCA ATGGTGAAAC TACGTATAAT 1500CAAAAGTTCA AGGGCCGTTT CACTTTATCT CGCGACAACT CCAAAAACAC 1550AGCATACCTG CAGATGAACA GCCTGCGTGC TGAGGACACT GCCGTCTATT 1600ACTGTGCAAG AGGGGATTAT CGCTACAATG GTGACTGGTT CTTCGACGTC 1650TGGGGTCAAG GAACCCTGGT CACCGTCTCC TCGGCCTCCA CCAAGGGCCC 1700ATCGGTCTTC CCCCTGGCAC CCTCCTCCAA GAGCACCTCT GGGGGCACAG 1750CGGCCCTGGG CTGCCTGGTC AAGGACTACT TCCCCGAACC GGTGACGGTG 1800TCGTGGAACT CAGGCGCCCT GACCAGCGGC GTGCACACCT TCCCGGCTGT 1850CCTACAGTCC TCAGGACTCT ACTCCCTCAG CAGCGTGGTG ACCGTGCCCT 1900CCAGCAGCTT GGGCACCCAG ACCTACATCT GCAACGTGAA TCACAAGCCC 1950AGCAACACCA AGGTCGACAA GAAAGTTGAG CCCAAATCTT GTGACAAAAC 2000TCACACATGC CCGCCGTGCC CAGCACCAGA ACTGCTGGGC GGCCGCATGA 2050AACAGCTAGA GGACAAGGTC GAAGAGCTAC TCTCCAAGAA CTACCACCTA 2100GAGAATGAAG TGGCAAGACT CAAAAAGCTT GTCGGGGAGC GCTAAGCATG 2150CGACGGCCCT AGAGTCCCTA ACGCTCGGTT GCCGCCGGGC GTTTTTTATT 2200GTTAACTCAT GTTTGACAGC TTATCATCGA TAAGCTTTAA TGCGGTAGTT 2250TATCACAGTT AAATTGCTAA CGCAGTCAGG CACCGTGTAT GAAATCTAAC 2300AATGCGCTCA TCGTCATCCT CGGCACCGTC ACCCTGGATG CTGTAGGCAT 2350AGGCTTGGTT ATGCCGGTAC TGCCGGGCCT CTTGCGGGAT ATCGTCCATT 2400CCGACAGCAT CGCCAGTCAC TATGGCGTGC TGCTAGCGCT ATATGCGTTG 2450ATGCAATTTC TATGCGCACC CGTTCTCGGA GCACTGTCCG ACCGCTTTGG 2500CCGCCGCCCA GTCCTGCTCG CTTCGCTACT TGGAGCCACT ATCGACTACG 2550CGATCATGGC GACCACACCC GTCCTGTGGA TCCTCTACGC CGGACGCATC 2600GTGGCCGGCA TCACCGGCGC CACAGGTGCG GTTGCTGGCG CCTATATCGC 2650CGACATCACC GATGGGGAAG ATCGGGCTCG CCACTTCGGG CTCATGAGCG 2700CTTGTTTCGG CGTGGGTATG GTGGCAGGCC CCGTGGCCGG GGGACTGTTG 2750GGCGCCATCT CCTTGCACGC ACCATTCCTT GCGGCGGCGG TGCTCAACGG 2800CCTCAACCTA CTACTGGGCT GCTTCCTAAT GCAGGAGTCG CATAAGGGAG 2850AGCGTCGTCC GATGCCCTTG AGAGCCTTCA ACCCAGTCAG CTCCTTCCGG 2900TGGGCGCGGG GCATGACTAT CGTCGCCGCA CTTATGACTG TCTTCTTTAT 2950CATGCAACTC GTAGGACAGG TGCCGGCAGC GCTCTGGGTC ATTTTCGGCG 3000AGGACCGCTT TCGCTGGAGC GCGACGATGA TCGGCCTGTC GCTTGCGGTA 3050TTCGGAATCT TGCACGCCCT CGCTCAAGCC TTCGTCACTG GTCCCGCCAC 3100CAAACGTTTC GGCGAGAAGC AGGCCATTAT CGCCGGCATG GCGGCCGACG 3150CGCTGGGCTA CGTCTTGCTG GCGTTCGCGA CGCGAGGCTG GATGGCCTTC 3200CCCATTATGA TTCTTCTCGC TTCCGGCGGC ATCGGGATGC CCGCGTTGCA 3250GGCCATGCTG TCCAGGCAGG TAGATGACGA CCATCAGGGA CAGCTTCAAG 3300GATCGCTCGC GGCTCTTACC AGCCTAACTT CGATCACTGG ACCGCTGATC 3350GTCACGGCGA TTTATGCCGC CTCGGCGAGC ACATGGAACG GGTTGGCATG 3400GATTGTAGGC GCCGCCCTAT ACCTTGTCTG CCTCCCCGCG TTGCGTCGCG 3450GTGCATGGAG CCGGGCCACC TCGACCTGAA TGGAAGCCGG CGGCACCTCG 3500CTAACGGATT CACCACTCCA AGAATTGGAG CCAATCAATT CTTGCGGAGA 3550ACTGTGAATG CGCAAACCAA CCCTTGGCAG AACATATCCA TCGCGTCCGC 3600CATCTCCAGC AGCCGCACGC GGCGCATCTC GGGCAGCGTT GGGTCCTGGC 3650CACGGGTGCG CATGATCGTG CTCCTGTCGT TGAGGACCCG GCTAGGCTGG 3700CGGGGTTGCC TTACTGGTTA GCAGAATGAA TCACCGATAC GCGAGCGAAC 3750GTGAAGCGAC TGCTGCTGCA AAACGTCTGC GACCTGAGCA ACAACATGAA 3800TGGTCTTCGG TTTCCGTGTT TCGTAAAGTC TGGAAACGCG GAAGTCAGCG 3850CCCTGCACCA TTATGTTCCG GATCTGCATC GCAGGATGCT GCTGGCTACC 3900CTGTGGAACA CCTACATCTG TATTAACGAA GCGCTGGCAT TGACCCTGAG 3950TGATTTTTCT CTGGTCCCGC CGCATCCATA CCGCCAGTTG TTTACCCTCA 4000CAACGTTCCA GTAACCGGGC ATGTTCATCA TCAGTAACCC GTATCGTGAG 4050CATCCTCTCT CGTTTCATCG GTATCATTAC CCCCATGAAC AGAAATTCCC 4100CCTTACACGG AGGCATCAAG TGACCAAACA GGAAAAAACC GCCCTTAACA 4150TGGCCCGCTT TATCAGAAGC CAGACATTAA CGCTTCTGGA GAAACTCAAC 4200GAGCTGGACG CGGATGAACA GGCAGACATC TGTGAATCGC TTCACGACCA 4250CGCTGATGAG CTTTACCGCA GCTGCCTCGC GCGTTTCGGT GATGACGGTG 4300AAAACCTCTG ACACATGCAG CTCCCGGAGA CGGTCACAGC TTGTCTGTAA 4350GCGGATGCCG GGAGCAGACA AGCCCGTCAG GGCGCGTCAG CGGGTGTTGG 4400CGGGTGTCGG GGCGCAGCCA TGACCCAGTC ACGTAGCGAT AGCGGAGTGT 4450ATACTGGCTT AACTATGCGG CATCAGAGCA GATTGTACTG AGAGTGCACC 4500ATATGCGGTG TGAAATACCG CACAGATGCG TAAGGAGAAA ATACCGCATC 4550AGGCGCTCTT CCGCTTCCTC GCTCACTGAC TCGCTGCGCT CGGTCGTTCG 4600GCTGCGGCGA GCGGTATCAG CTCACTCAAA GGCGGTAATA CGGTTATCCA 4650CAGAATCAGG GGATAACGCA GGAAAGAACA TGTGAGCAAA AGGCCAGCAA 4700AAGGCCAGGA ACCGTAAAAA GGCCGCGTTG CTGGCGTTTT TCCATAGGCT 4750CCGCCCCCCT GACGAGCATC ACAAAAATCG ACGCTCAAGT CAGAGGTGGC 4800GAAACCCGAC AGGACTATAA AGATACCAGG CGTTTCCCCC TGGAAGCTCC 4850CTCGTGCGCT CTCCTGTTCC GACCCTGCCG CTTACCGGAT ACCTGTCCGC 4900CTTTCTCCCT TCGGGAAGCG TGGCGCTTTC TCATAGCTCA CGCTGTAGGT 4950ATCTCAGTTC GGTGTAGGTC GTTCGCTCCA AGCTGGGCTG TGTGCACGAA 5000CCCCCCGTTC AGCCCGACCG CTGCGCCTTA TCCGGTAACT ATCGTCTTGA 5050GTCCAACCCG GTAAGACACG ACTTATCGCC ACTGGCAGCA GCCACTGGTA 5100ACAGGATTAG CAGAGCGAGG TATGTAGGCG GTGCTACAGA GTTCTTGAAG 5150TGGTGGCCTA ACTACGGCTA CACTAGAAGG ACAGTATTTG GTATCTGCGC 5200TCTGCTGAAG CCAGTTACCT TCGGAAAAAG AGTTGGTAGC TCTTGATCCG 5250GCAAACAAAC CACCGCTGGT AGCGGTGGTT TTTTTGTTTG CAAGCAGCAG 5300ATTACGCGCA GAAAAAAAGG ATCTCAAGAA GATCCTTTGA TCTTTTCTAC 5350GGGGTCTGAC GCTCAGTGGA ACGAAAACTC ACGTTAAGGG ATTTTGGTCA 5400TGAGATTATC AAAAAGGATC TTCACCTAGA TCCTTTTAAA TTAAAAATGA 5450AGTTTTAAAT CAATCTAAAG TATATATGAG TAAACTTGGT CTGACAGTTA 5500CCAATGCTTA ATCAGTGAGG CACCTATCTC AGCGATCTGT CTATTTCGTT 5550CATCCATAGT TGCCTGACTC CCCGTCGTGT AGATAACTAC GATACGGGAG 5600GGCTTACCAT CTGGCCCCAG TGCTGCAATG ATACCGCGAG ACCCACGCTC 5650ACCGGCTCCA GATTTATCAG CAATAAACCA GCCAGCCGGA AGGGCCGAGC 5700GCAGAAGTGG TCCTGCAACT TTATCCGCCT CCATCCAGTC TATTAATTGT 5750TGCCGGGAAG CTAGAGTAAG TAGTTCGCCA GTTAATAGTT TGCGCAACGT 5800TGTTGCCATT GCTGCAGGCA TCGTGGTGTC ACGCTCGTCG TTTGGTATGG 5850CTTCATTCAG CTCCGGTTCC CAACGATCAA GGCGAGTTAC ATGATCCCCC 5900ATGTTGTGCA AAAAAGCGGT TAGCTCCTTC GGTCCTCCGA TCGTTGTCAG 5950AAGTAAGTTG GCCGCAGTGT TATCACTCAT GGTTATGGCA GCACTGCATA 6000ATTCTCTTAC TGTCATGCCA TCCGTAAGAT GCTTTTCTGT GACTGGTGAG 6050TACTCAACCA AGTCATTCTG AGAATAGTGT ATGCGGCGAC CGAGTTGCTC 6100TTGCCCGGCG TCAACACGGG ATAATACCGC GCCACATAGC AGAACTTTAA 6150AAGTGCTCAT CATTGGAAAA CGTTCTTCGG GGCGAAAACT CTCAAGGATC 6200TTACCGCTGT TGAGATCCAG TTCGATGTAA CCCACTCGTG CACCCAACTG 6250ATCTTCAGCA TCTTTTACTT TCACCAGCGT TTCTGGGTGA GCAAAAACAG 6300GAAGGCAAAA TGCCGCAAAA AAGGGAATAA GGGCGACACG GAAATGTTGA 6350ATACTCATAC TCTTCCTTTT TCAATATTAT TGAAGCATTT ATCAGGGTTA 6400TTGTCTCATG AGCGGATACA TATTTGAATG TATTTAGAAA AATAAACAAA 6450TAGGGGTTCC GCGCACATTT CCCCGAAAAG TGCCACCTGA CGTCTAAGAA 6500ACCATTATTA TCATGACATT AACCTATAAA AATAGGCGTA TCACGAGGCC 6550CTTTCGTCTT CAA 6563

Claims (52)

1．一种偶联物，它基本上由一种或多种抗体片段共价连接一个或多个非蛋白类聚合物分子组成，其中偶联物的表观大小至少为500kD。
2．根据权利要求1所述的偶联物，其中偶联物的表观大小至少为800kD。
3．根据权利要求1所述的偶联物，其中偶联物的表观大小至少为1400kD。
4．根据权利要求1所述的偶联物，其中偶联物的表观大小至少为1800kD。
5．根据权利要求1所述的偶联物，其中偶联物的表观大小至少约为抗体片段的表观大小的8倍。
6．根据权利要求5所述的偶联物，其中偶联物的表观大小至少约为抗体片段的表观大小的15倍。
7．根据权利要求6所述的偶联物，其中偶联物的表观大小至少约为抗体片段的表观大小的25倍。
8．根据权利要求1所述的偶联物，其中偶联物含有不超过1个抗体片段，且其中抗体片段选自Fab,Fab＇,Fab＇-SH,Fv,scFv和F(ab＇)2。
9．根据权利要求8所述的偶联物，其中抗体片段是F(ab＇)2。
10．根据权利要求1所述的偶联物，其中抗体片段与不超过约10个非蛋白类聚合物分子共价连接。
11．根据权利要求10所述的偶联物，其中抗体片段与不超过约5个非蛋白类聚合物分子共价连接。
12．根据权利要求11所述的偶联物，其中抗体片段与不超过约2个非蛋白类聚合物分子共价连接。
13．根据权利要求12所述的偶联物，其中抗体片段与不超过1个非蛋白类聚合物分子共价连接。
14．根据权利要求12所述的偶联物，其中抗体片段包含衍生自亲代抗体的重链和轻链，其中在亲代抗体中，重链和轻链通过轻链中的半胱氨酸残基和重链中的半胱氨酸残基间的二硫键共价连接，其中在抗体片段中轻链或重链的半胱氨酸残基被另一个氨基酸取代，而对侧链的半胱氨酸残基与非蛋白类聚合物分子共价连接。
15．根据权利要求8所述的偶联物，其中抗体片段选自Fab,Fab＇和Fab＇-SH。
16．根据权利要求15所述的偶联物，其中抗体片段与不超过1个非蛋白类聚合物分子共价连接。
17．根据权利要求16所述的偶联物，其中偶联物中的非蛋白类聚合物分子与抗体片段的铰链区共价连接。
18．根据权利要求1所述的偶联物，其中非蛋白类聚合物是聚乙二醇PEG。
19．根据权利要求18所述的偶联物，其中PEG的平均分子量至少约为20kD。
20．根据权利要求19所述的偶联物，其中PEG的平均分子量至少约为40kD。
21．根据权利要求20所述的偶联物，其中PEG是单链分子。
22．根据权利要求20所述的偶联物，其中PEG是有支链的分子。
23．根据权利要求19所述的偶联物，其中偶联物含有不超过1个抗体片段，且其中抗体片段是F(ab＇)2，它与不超过约2个PEG分子共价连接。
24．根据权利要求19所述的偶联物，其中偶联物含有不超过1个抗体片段，其中抗体片段选自Fab,Fab＇和Fab＇-SH，它与不超过1个PEG分子共价连接。
25．根据权利要求24所述的偶联物，其中PEG分子与抗体片段的铰链区共价连接。
26．根据权利要求1所述的偶联物，其中抗体片段有一个与人IL-8结合的抗原结合位点。
27．根据权利要求26所述的偶联物，其中偶联物含有不超过1个抗体片段，其中抗体片段选自Fab,Fab＇和Fab＇-SH，其中抗体片段与不超过1个非蛋白类聚合物分子共价连接，其中非蛋白类聚合物分子是实际分子量至少约为30kD的聚乙二醇。
28．根据权利要求1所述的偶联物，其中抗体片段是人源化的。
29．根据权利要求1所述的偶联物，其中偶联物含有不超过1个抗体片段。
30．一种组合物，它包含权利要求1所述的偶联物和一种载体。
31．根据权利要求30所述的组合物，它是无菌的。
32．一种偶联物，它由一种或多种抗体片段与一种或多种非蛋白类聚合物分子共价连接而成，其中偶联物的表观大小至少约为500kD，其中偶联物的分子结构中没有其它物质。
33．一种偶联物，它由一种或多种抗体片段与一种或多种非蛋白类聚合物分子共价连接而成，其中偶联物的表观大小至少约为500kD，其中抗体片段掺入了非蛋白类的不含任何聚合物的标记，其中偶联物的分子结构没有其它物质。
34．根据权利要求33所述的偶联物，其中非蛋白类标记是放射性标记。
35．一种多肽，它选自：(1)抗IL-8单克隆抗体或抗体片段的多肽，它们包含轻链氨基酸序列，该序列包含图36轻链多肽氨基酸序列的互补决定区；和(2)抗IL-8单克隆抗体或抗体片段的多肽，它包含轻链氨基酸序列，该序列包含图45的轻链多肽氨基酸序列的互补决定区。
36．根据权利要求35所述的多肽，其中轻链氨基酸序列包含图45轻链多肽氨基酸序列的互补决定区。
37．根据权利要求35所述的多肽，它还包含重链氨基酸序列，该序列包含图37A-37B重链多肽氨基酸序列的互补决定区。
38．根据权利要求35所述的多肽，其中轻链氨基酸序列选自(1)包含图36轻链多肽氨基酸序列的氨基酸1-219的轻链氨基酸序列；和(2)包含图45轻链多肽氨基酸序列的氨基酸1-219的轻链氨基酸序列。
39．根据权利要求38所述的多肽，其中轻链氨基酸序列包含图45轻链氨基酸序列的氨基酸1-219。
40．根据权利要求38所述的多肽，它还包含重链氨基酸序列，该序列包含图37A-37B的重链多肽氨基酸序列的氨基酸1-230。
41．根据权利要求40所述的多肽，其中重链氨基酸序列的C端与亮氨酸拉链氨基酸序列融合。
42．根据权利要求41所述的多肽，其中亮氨酸拉链序列包含图37A-37B重链多肽氨基酸序列的氨基酸231-275。
43．根据权利要求35所述的多肽，它是选自Fab,Fab＇,Fab＇-SH,Fv,scFv和F(ab＇)2的抗体片段。
44．根据权利要求38所述的多肽，它是F(ab＇)2抗体片段，其中抗体片段包含第一重链氨基酸序列和第二重链氨基酸序列，这些序列每一个都包含图37A-37B的重链多肽氨基酸序列的氨基酸1-238，且其中第一重链氨基酸序列中231位和234位的每个Cys残基与第二重链氨基酸序列中的相同Cys残基成二硫键连接。
45．根据权利要求38所述的多肽，它是Fab＇或Fab＇-SH抗体片段，其中抗体片段包含重链氨基酸序列，该序列包含图53重链多肽氨基酸序列的氨基酸1-233。
46．根据权利要求35所述的多肽，它是抗体。
47．一种核酸分子，它包含编码权利要求35所述多肽的核酸序列。
48．一种表达载体，它包含权利要求47所述的核酸分子，该核酸分子与该载体所转染的宿主细胞识别的控制序列操作性相连。
49．一种宿主细胞，它包含权利要求48所述的载体。
50．一种生产多肽的方法，该方法包括在核酸序列表达的条件下培养权利要求49所述的宿主细胞，由此产生多肽并从宿主细胞中回收多肽。
51．一种组合物，它包含权利要求35所述的多肽和载体。
52．根据权利要求51所述的组合物，它是无菌的。
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