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JP2761881B2 - 抗体を固定化したアフイニテイクロマトグラフイ用担体 - Google Patents

抗体を固定化したアフイニテイクロマトグラフイ用担体

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JP2761881B2
JP2761881B2 JP63057299A JP5729988A JP2761881B2 JP 2761881 B2 JP2761881 B2 JP 2761881B2 JP 63057299 A JP63057299 A JP 63057299A JP 5729988 A JP5729988 A JP 5729988A JP 2761881 B2 JP2761881 B2 JP 2761881B2
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carrier
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affinity chromatography
protease
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昭彦 近藤
昌明 岸村
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアフイニテイークロマトグラフイ用担体に関
する。
〔従来の技術〕
バイオテクノロジーの急速な発展は、従来の工業技術
とは異なる多様な付加価値のあるものの生産を可能にし
ている。すなわち遺伝子工学や細胞融合技術などの発展
に伴い、生物機能を利用する有用物質の生産はますます
多岐にわたつてきているが、それらの効率的な高純度精
製法は実験室的にも工業的にも重要な問題となつてい
る。例えば遺伝子操作はホルモンやリンホカインなどの
極微量の生理活性物質を工業レベルで生産することを可
能にしたが、これらの物質を安定かつ効率良く分離する
操作、不純物を除く操作など、高度の分離精製技術が望
まれている。この様な分離・精製は従来、ゲル過、イ
オン交換などが利用されてきたが、必要な純度を得るに
は多段階の操作を要し、コストも高く収率も低い。
本来、生体内で生理的な機能を発現するこの様な物質
の分離に、生体系における特異的分子認識を利用するこ
とは目的にかなつたことと考えられる。従つて酵素と阻
害剤、酵素と基質、抗原と抗体、ホルモンとレセプター
といつた特定の生化学物対間の特異的親和力を利用し
て、分離するといういわゆるアフイニテイクロマトグラ
フイが盛んになり、分離精製への広範な利用の道が拓か
れることとなつた。特に抗原と抗体の反応を利用するも
のはイムノアフイニテイクロマトグラフイといわれ、生
物学的親和特異性が著しく高いのが特徴である。この方
法によれば、目的物質に対する抗体をリガンドとして不
溶性の担体に結合させた吸着体を使用して目的物質を選
択的に吸着し、精製する。イムノアフイニテイクロマト
グラフイは抗体作製の可能な蛋白質、糖蛋白質、ペプチ
ド、酵素、ペプチド系ホルモンなどに適用できる。
従来のイムノアフイニテイクロマトグラフイは抗原を
ウサギ、馬、牛、山羊などの動物に免疫して血液中より
糖蛋白質の抗体をとりだし、ゲル過、イオン交換、プ
ロテインＡアフイニテイクロマトグラフイなどで精製
後、不溶性担体に固定化する。次に抗体という蛋白質と
抗原との特異的結合能を介して免疫学的方法によつて抗
原を精製する。抗原と抗体との結合は比較的強力であ
り、反応後の複合体は安定である。結合は可逆的であ
り、条件を変えることによつて抗原は固定化抗体より解
離して精製される。
〔発明が解決しようとする課題〕
上記従来の技術で用いられる抗体は蛋白質である。し
かるに抗原を含む試料溶液は多くの場合、蛋白質分解酵
素（プロテアーゼ）を含む。このため、固定化抗体が、
プロテアーゼにより分解され、アフイニテイクロマトグ
ラフイを利用する抗原との結合の活性を失つてしまう。
抗体には高価なものやごく微量しか入手できないものが
あり、これを効率的に、即ち失活させずに持続的に利用
することが重要となる。本発明はプロテアーゼにより分
解されにくく、くり返し使用しても活性を失ないにく
い、抗体が固定化されたアフイニテイクロマトグラフイ
用担体を提供することを目的とする。
〔課題を解決するための手段〕
本発明は、活性化ポリエチレングリコール（以下「PE
G」と略記する。）により化学修飾された抗体が不溶性
担体に固定化されてなるアフイニテイクロマトグラフイ
用担体である。
活性化PEGの例としてはメトキシポリエチレングリコ
ールと塩化シアヌル酸の縮合物があり、後記実施例で使
用したものはA.Abucowaki:Journal of Biological Chem
istry25巻3582ページ（1977年）の方法で調製したもの
である。この活性化PEGで抗体を化学修飾する方法は次
に示すとおりである。
（上記式においてＡは抗体を表わす。） 即ち、メトキシPEGと塩化シアヌル酸とを反応させて
まず活性化PEGをつくり、ついで抗体を付加すると活性
化PEGで修飾された抗体ができる。
又、他の活性化PEGとして次の様なものも利用しても
良い（昭和61年生化学会講演要旨集4P−4M11）。
PEGとしては分子量が様々なものがあるが、本発明で
は特に限定されない。
活性化PEGで修飾された抗体を担体に固定化するとプ
ロテアーゼ抵抗性が未修飾抗体の場合よりも大きくなる
のでアフイニテイカラムの活性が永く保たれ、長期にわ
たりアフイニテイクロマトグラフイによる精製が行なわ
れ、経済的に効果がある。本発明の様にリガンドを修飾
して、リガンド効率をあげるということは従来の技術で
はないことであり、分離精製の技術の上で画期的なこと
である。
活性化PEG修飾抗体固定化担体の調整方法は次の様な
ものがあるが、本発明は特に限定されず、どんな方法で
も良い。
（イ）：活性化PEG修飾抗体をつくり、これを担体に固
定化する。
（ロ）：抗体をまず担体に固定化して、ついで活性化PE
Gで抗体を修飾する。
（ハ）：（イ）又は（ロ）の方法において抗体をあらか
じめ抗原でブロツクしておく。
抗体を担体に固定化する方法は特に限定されるもので
はなく、例えば「実験と応用 アフイニテイクロマトグ
ラフイー」（講談社、1976年）に記述されているような
ハロゲン化シアン法、エピクロルヒドリン法、ビスエポ
キシド法、ヒドラジド誘導体法などを利用することがで
きる。使用される担体もセルロース、デキストラン、ア
ガロース、ポリアクリルアミド、多孔性ガラスなどがあ
り、特に限定されない。担体の粒度、多孔性も特に限定
されない。
又、本発明のアフイニテイクロマトグラフイ用担体を
製造するのに用いる抗体はポリクロナール抗体でもモノ
クローナル抗体でも良い。
実施例１ 抗原として牛血清アルブミン（以下BSAと略記す
る。）を使用し、このBSAの抗体を作製して担体に結合
後、活性化PEGで修飾しプロテアーゼ活性を調べた。そ
の詳細は以下のようである。
（１）抗BSA抗体の作製・・・ウサギを用いて常法に従
つて作製した（例えば、E.Sada,S.Katoh,A.Kondo and
A.Kiyokawa:Journal of Chemical Enginnering Japan 1
9巻502ページ（1986年）参照）。
（２）抗体の担体への固定化・・・抗体を0.1Mホウ酸バ
ツフアー＋0.5M塩化ナトリウムに5mg/mlになる様に溶解
させて抗体溶液とする。不溶性担体として市販のフアル
マシア社のCNBr−セフアロース（商標）4Bを用いた。抗
体の固定化方法は常法通りで（例えば、「実験と応用
アフイニテイクロマトグラフイ」（講談社、1976年）参
照）、次の様にしておこなつた。CNBr−セフアロース4B
の乾燥品2gを1mM塩酸400mlを用いて数回洗滌する。これ
に前記の抗体溶液14mlを加え、４℃で１夜反応させる。
反応終了後同じリン酸バツフアーでよく担体を洗滌す
る。次いで0.1Mエタノールアミン溶液14mlを加え、室温
で２時間攪拌する。最後に上記のリン酸バツフアーでよ
く洗滌する。
（３）活性化PEGによる修飾・・・（２）の抗体固定化
担体を0.1M四ホウ酸ナトリウム水溶液70mlに懸濁させ塩
化シアヌル活性化PEGを195mg加え５℃で１時間攪拌し
た。同じ四ホウ酸ナトリウム水溶液でよく洗滌した。こ
の場合の添加活性化PEGのモル比は1.0であつた。尚、こ
こにいうモル比の計算は次の式による。
アミノ残基数はトリニトロベンゼンスルホン酸法（TN
BS法）で測定した。未修飾抗体固定化担体の場合はこの
活性化PEGによる処理がない。
このようにして活性化PEG修飾抗BSA抗体結合アフイニ
テイクロマトグラフイ用担体と抗BSA抗体結合アフイニ
テイクロマトグラフイ用担体が調整でき、抗体の担体へ
の結合量は紫外吸収スペクトルにおける280nmの吸収の
測定結果各々9.0mg/（ml担体）であつた。
（４）抗原（BSA）結合量の測定・・・（３）で調整し
た抗体結合の担体をカラムにつめて、直径1.8cm、高さ
2.8cm、体積7.0mlのベツドとする。BSA溶液（0.2mg/m
l、0.1Mリン酸バツフアーpH7.6）を約200ml流しBSAを飽
和吸着させ、その後、0.1N−塩酸で脱着させ紫外吸収ス
ペクトルにおける280nmの吸収の測定から得られた脱着
量より、プロテアーゼ処理前の抗体結合担体のBSAの結
合量を算出した。実験は25℃で行なつた。
（５）プロテアーゼ分解処理・・・（４）のカラムの担
体を種々のプロテアーゼ溶液（5mg/ml;ペプシン 0.1M
酢酸バツフアー pH3.6、トリプシン，プロテアーゼ
0.1Mリン酸バツフアー pH7.6）中に30分間浸漬するこ
とを１サイクルとし、これを繰返しおこなつた。実験温
度は25℃である。
（６）プロテアーゼ処理後の抗原（BSA）の担体への結
合量・・・（５）の様にしてプロテアーゼ処理した担体
の各サイクル後の抗原（BSA）の結合量を測定してプロ
テアーゼ抵抗性を調べた。BSA結合量の測定方法は
（４）の通りである。
その結果を図１に示す。図１において、縦軸は処理前
の初期BSA吸着量（mg/ml）Aiに対する分解処理後のBSA
吸着量（mg/ml）Ａの比率を表わす。横軸はプロテアー
ゼ分解処理回数を表わす。この結果から明らかな様に、
特異的にペプチド結合を切断するトリプシン、ペプシン
でも活性化PEGで修飾された抗体の方が分解を受けず、
吸着量の減少率が少なく、プロテアーゼに対する抵抗性
がある。非特異的にペプチド結合を切断するプロテアー
ゼでは、活性化PEGで修飾された抗体の方がプロテアー
ゼに対する低抗性が著しく増加している。
実施例２ 次に活性化PEGの修飾モル比を種々変えて抗体の修飾
率を変化させた場合のプロテアーゼに対する抵抗性を調
べた。その方法は添加活性化PEGがモル比３の場合292m
g、モル比0.7の場合68mg、モル比0.5の場合49mgと変わ
る以外は実施例１と同様である。
その結果を図２に示す。モル比0.7以上になると明ら
かにプロテアーゼに対する抵抗性が増加していることが
明らかである。
〔発明の効果〕
本発明によればアフイニテイクロマトグラフイ用担体
における固定化された抗体がプロテアーゼにより分解さ
れにくく、くり返し使用によつても、その活性が持続す
る。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明に係る活性化ポリエチレングリコールで修
飾された抗体が不溶性担体に固定化されてなるアフイニ
テイクロマトグラフイ用担体と、そのような修飾のない
抗体が不溶性担体に固定化されてなるアフイニテイクロ
マトグラフイ用担体の、種々のプロテアーゼでくり返し
処理したときの活性低下の様子を示す図である。第２図
は、活性化PEGの修飾モル比を種々変えたときの不溶性
担体に固定化された抗体をプロナーゼでくり返し処理し
たときの該抗体の活性低下の様子を示す図である。 これらの図において、Aiはプロテアーゼ処理前のBSA吸
着量（mg/mlベツド）、Ａはプロテアーゼ処理後のBSA吸
着量（mg/mlベツド）を表わす。 又、第１図において、 「○」のプロツトは非修飾固定化抗体のプロナーゼ処理
に対する活性低下の様子、 「△」のプロツトは非修飾固定化抗体のトリブシン処理
に対する活性低下の様子、 「「□」のプロツトは非修飾固定化抗体のペプシン処理
に対する活性低下の様子、 「●」のプロツトは修飾された固定化抗体のプロナーゼ
処理に対する活性低下の様子、 「▲」のプロツトは修飾された固定化抗体のトリプシン
処理に対する活性低下の様子、 「■」のプロツトは修飾された固定化抗体のペプシン処
理に対する活性低下の様子、をそれぞれ表わす。 図２において、「△」のプロツトは未修飾固定化抗体
の、「●」のプロツトは添加活性化PEGのモル比が３の
場合の修飾された固定化抗体の、「▲」のプロツトは添
加活性化PEGのモル比が１の場合の修飾された固定化抗
体の、「■」のプロツトは添加活性化PEGのモル比が0.7
の場合の修飾された固定化抗体の、「▼」のプロツトは
添加活性化PEGのモル比が0.5の場合の修飾された固定化
抗体の、プロナーゼ処理に対する活性低下の様子を表わ
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 30/48

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】不溶性担体に抗体が直接固定化され、かつ
    該抗体が活性化ポリエチレングリコールで修飾されてい
    ることを特徴とするアフイニテイークロマトグラフイ用
    担体。
JP63057299A 1988-03-10 1988-03-10 抗体を固定化したアフイニテイクロマトグラフイ用担体 Expired - Lifetime JP2761881B2 (ja)

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CA000592993A CA1337402C (en) 1988-03-10 1989-03-07 Carrier for affinity chromatography immobilized antibodies and preparation thereof
KR1019890002875A KR910004069B1 (ko) 1988-03-10 1989-03-09 항체를 고정시킨 친화성 크로마토그래피를 위한 담체 및 이의 제조방법
US07/827,917 US5147537A (en) 1988-03-10 1992-01-31 Carrier for affinity chromatography immobilized with antibodies

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