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CN1289671C - 对人肿瘤坏死因子α具有特异性的抗体分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗体分子，其包含至少一种来源于小鼠单克隆抗体的，对TNFα具有特异性的CDR。本发明还公开了一种移植了CDR的抗体，其中至少一种CDR是杂种CDR。本发明进一步公开了编码抗体分子链的DNA序列，载体，转化的宿主细胞，及抗体分子在治疗TNFα介导的疾病中的用途。

Description

对人肿瘤坏死因子α具有特异性的抗体分子及其用途
本发明涉及一种对人肿瘤坏死因子α(TNFα)的抗原决定簇具有特异性的抗体分子。本发明还涉及该抗体分子的治疗用途，及生产该抗体分子的方法。
本发明涉及抗体分子。在抗体分子中，有两个重链和两个轻链。各重链和各轻链的N-端均有一个可变域。各个可变域是由四个构架区(FRs)组成的，该构架区与三个互补性决定区(CDRs)相交替。可变域中的残基通常是根据Kabat等人设计的系统编号的。此系统是在Kabat等，1987，Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Department of Health and Human Services，NIH，USA(此后称为“Kabat等(supra)”)中提出的。除非另有说明，否则将该编号系统用于本发明的说明书中。
Kabat残基的命名并非总是与线性氨基酸残基的编号直接相关。与严格的Kabat编号方式相比，相应于缩短，或插入基本可变域结构的结构性组分，构架或CDR，实际的线性氨基酸序列可包括较少的或附加的氨基酸。通过与具有“标准”Kabat编号序列抗体中的同系物的残基进行序列对比，可确定所提供抗体残基正确的Kabat编号。
根据Kabat编号方式，重链可变域的CDRs位于第31-35位(CDRH1)，50-65(CDRH2)位和95-102位(CDRH3)的残基上。
根据Kabat编号方式，轻链可变域的CDRs位于第24-34位(CDRL1)，50-56位(CDRL2)和89-97位(CDRL3)残基上。
欧洲专利申请EP-A-0239400中描述了移植了CDR的抗体的结构，该文献还公开了一种方法，其中使用长链的寡核苷酸，通过定点诱变，把小鼠单克隆抗体的CDR移植到人免疫球蛋白可变域的构架区上。该CDR可确定抗体的抗原结合特异性，且其是携带在可变域构架区上相对较短的肽序列。
有关通过移植CDR而使单克隆抗体人源化的早期研究工作是在识别合成抗原，如NP的单克隆抗体上进行的。Verhoeyen等(Science，239，1534-1536，1988)和Riechmann等(Nature， 332，323-324，1988)分别描述了通过CDR移植，使识别溶菌酶的小鼠单克隆抗体和识别人T-细胞上抗原的大鼠单克隆抗体人源化的实施例。
Riechmann等发现单独转移CDR(如Kabat(Kabat等(supra)和Wu等，J.Exp.Med.， 132，211-250，1970)所定义的)不足以在移植了CDR的产物中提供令人满意的抗原结合活性。人们发现，不得不改变许多构架残基，以使它们与供体构架区的那些相对应。国际专利申请WO90/07861中描述了选择需改变的构架残基的草拟标准。
目前已公开了很多讨论移植了CDR的(CDR-grafted)抗体的评论，包括Vaughan等(Nature Biotechnology， 16，535-539，1998)。
TNFα是一种促炎细胞因子，它通过免疫系统的细胞释放并与之相互作用。因而，TNFα是通过巨噬细胞释放的，其中的巨噬细胞已经被革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS)活化。本身，TNFα是一种重要的内源介质，其涉及与细菌性脓毒症有关的内毒素性休克的发病和发展。TNFα还可以正向调节许多人类疾病，包括慢性疾病，如类风湿性关节炎，克罗恩氏病，溃疡性结膜炎和多发性硬化症。人TNFα的转基因鼠可产生组成型高水平的TNFα，并发展成一种自发的，有害的，类似类风湿性关节炎的多发型关节炎(Kaffer等，EMBO J.， 10，4025-4031，1991)。因此将TNFα称为促炎细胞因子。
在现有技术中已经描述了TNFα的单克隆抗体。Meager等，(Hybridoma， 6，305-311，1987)描述了鼠科动物重组TNFα的单克隆抗体。Fendly等，(Hybridoma， 6，359-370，1987)描述了鼠科动物重组TNFα的单克隆抗体在定义TNF上的中和表位中的用途。Shimamoto等(Immunology Letters， 17，311-318，1988)描述了鼠科动物TNFγ的单克隆抗体，及其在预防鼠类动物内毒素性休克中的用途。此外，国际专利申请WO92/11383公开了对TNFα具有特异性的重组抗体，包括移植了CDR的抗体。Rankin等(BritishJ.Rheumatology， 34，334-342，1995)描述了这种移植了CDR的抗体在治疗类风湿性关节炎中的用途。US-A-5 919 452公开了抗-TNF嵌合抗体及其在治疗与TNF存在有关的病状中的用途。
人们(Beutler等，Science， 234，470-474，1985)已经提出了TNFα的抗体在预防和治疗内毒素性休克中的用途。Bodmer等，(Critical Care Medicine， 21，S441-S446，1993)和Wherry等，(Critical Care Medicine， 21，S436-S440，1993)讨论了抗-TNFα抗体在治疗脓毒性休克中的治疗潜力。Kirschenbaum等(CriticalCare Medicine， 26，1625-1626，1998)也讨论了抗-TNFα抗体在治疗脓毒性休克中的用途。使用抗-TNFα单克隆抗体可有效地治疗胶原-诱导的关节炎(Williams等(PNAS-USA， 89，9784-9788，1992))。
在类风湿性关节炎患者的滑液和外周血中可见到TNFα水平的升高。当把TNFα阻断剂给予患类风湿性关节炎的患者时，它们可减轻炎症，改善症状并延缓关节的损害(McKown等(ArthritisRheum.， 42，1204-1208，1999)。
Feldman等(Transplantation Proceedings， 30，4126-4127，1998)，Adorini等(Trends in Immunology Today， 18，209-211，1997)和Feldman等(Advances in Immunology， 64，283-350，1997)讨论了抗-TNFα抗体在治疗类风湿性关节炎和克罗恩氏病中的用途。用于这种治疗的TNFα抗体通常是嵌合抗体，如US-A-5 919 452中描述的那些。
目前，已经批准了两种TNFα阻断产品用于治疗类风湿性关节炎。首先，是Immunex Corporation销售的EnbrelTM，称作etanercept。它是一种含两个p75可溶性TNF-受体域的重组融合蛋白，该TNF-受体域与人免疫球蛋白的Fc部分相连。第二，是Centocor Corporation销售的RemicadeTM，称作infliximab。它是一种具有鼠科动物抗-TNFα可变域和人IgG1不变域的嵌合抗体。
与导出可变域或CDR的抗体相比，现有技术中的抗-TNFα抗体分子对TNFα的亲和力降低，且其通常是在哺乳动物的细胞中产生的，造价昂贵。Stephens等，(Immunology， 85，668-674，1995)，GB-A-2 246570和GB-A-2 297 145描述了现有技术中的抗-TNFα抗体。
因而，需要一种治疗慢性炎症疾病的抗体分子，其可以重复地使用，并可以很容易地，有效地生产。还需要一种抗体分子，其对TNFα具有高亲和力，而对人具有低免疫原性。
在第一个方面中，本发明提供一种对TNFα具有特异性的抗体分子，其包含一个重链，其中的可变域包含一CDR(Kabat等(supra)定义的)，该CDR具有图3(SEQ ID NO：1)所列CDRH1的H1序列，图3(SEQ ID NO：2)所列CDRH2的H2’序列或图3(SEQ ID NO：7)所列CDRH2的H2序列，或图3(SEQ ID NO：3)所列CDRH3的H3序列。
本发明第一方面抗体分子的重链可变域包含至少一个选自H1，H2’或H2和H3(SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：3)的CDR。优选地，该抗体分子的重链可变域中包含至少两个，更优选全部三个CDR。
在本发明的第二个方面中，提供一种对人TNFα具有特异性的抗体分子，其包含一个轻链，其中的可变域含一CDR(如Kabat等(supra)所定义的)，该CDR具有图3(SEQ ID NO：4)所列CDRL1的L1序列，图3(SEQ ID NO：5)所列CDRL2的L2序列，或图3(SEQ ID NO：6)所列CDRL3的L3序列。
本发明第二方面抗体分子的轻链可变域包含至少一个选自L1，L2和L 3(SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：6)的CDR。优选地，该抗体分子的轻链可变域中包含至少两个，更优选全部三个CDR。
优选本发明第一和第二方面的抗体分子分别具有一个互补的轻链或一个互补的重链。
优选地，本发明第一或第二方面的抗体分子包含一个重链，其中的可变域包含一CDR(Kabat等(supra)定义的)，该CDR具有图3(SEQID NO：1)所列CDRH1的H1序列，图3(SHQ ID NO：2或SEQ ID NO：7)所列CDRH2的H2’或H2序列，或图3(SEQ ID NO：3)所列CDRH3的H3序列，和一个轻链，其中的可变域包含一CDR(如Kabat等(supra)所定义的)，该CDR具有图3(SEQ ID NO：4)所列CDRL1的L1序列，图3(SEQ ID NO：5)所列CDRL2的L2序列，或图3(SEQ ID NO：6)所列CDRL3的L3序列。
SEQ ID NO：1和3-7及图3中所列的CDR均来源于小鼠的单克隆抗体hTNF40。然而，SEQ ID NO：2是由杂种CDR组成的。该杂种CDR包含部分来源于小鼠单克隆抗体hTNF40的重链CDR2，和部分来源于人类3组种系V区序列的重链CDR2。
小鼠hTNF40抗体可变域的全序列在图6(轻链)(SEQ ID NO：99)和图7(重链)(SEQ ID NO：100)中列出。下面称此小鼠抗体为“供体抗体”。
本发明第一或第二方面的第一个优选实施例是小鼠单克隆抗体hTNF40，其具有图6(SEQ ID NO：99)和图7(SEQ ID NO：100)中分别列出的轻链和重链可变域序列。hTNF40的轻链不变区是κ，重链不变区是IgG2a。
在第二个优选实施例中，本发明第一或第二方面的抗体是一种嵌合的小鼠/人抗体分子，此处称其为嵌合hTNF40抗体分子。该嵌合抗体分子包含小鼠单克隆抗体hTNF40(SEQ ID NO：99和100)的可变域和人的不变域。优选地，该嵌合hTNF4O抗体分子的轻链中包含人Cκ域(Hieter等，Cell， 22，197-207，1980；Genebank accession numberJ00241)，重链中包含人γ4域(Flanagan等，Nature， 300，709-713，1982)。
在第三个优选实施例中，本发明第一和第二方面的抗体是一种移植了CDR的抗体分子。此处使用的术语“移植了CDR的抗体分子”指的是这样一种抗体分子，其中的重链和/或轻链包含一个或多个来源于供体抗体(例如，鼠科动物单克隆抗体)的CDR(包括，如果期望，一种杂种CDR)，其中的供体抗体被移植到受体抗体(例如，人的抗体)的重链和/或轻链可变区构架中。
优选地，这种移植了CDR的抗体有一个可变域，其包含人的受体构架区和上述一个或多个供体CDR。
当移植了CDR时，任一适当的受体可变区构架序列均可采用，只要注意到CDR从中衍生的供体抗体的种类/类型，包括小鼠，灵长类动物和人的构架区。用于本发明的人构架的实施例是KOL，NEWM，REI，EU，TUR，TEI，LAY和POM(Kabat等(supra))。例如，KOL和NEWM可用于重链，REI可用于轻链，EU，LAY和POM既可用于重链又可用于轻链。轻链的优选构架区是图1(SEQ ID NOS：83，85，87和89)所示人类1组构架区。重链的优选构架区是图2(SEQ ID NOS：91，93，95和97及SEQ ID NOS：106，107，108和109)分别所示的人类1组和3组的构架区。
在本发明移植了CDR的抗体中，优选将具有与供体抗体链同源的抗体作为受体抗体使用，其具有。受体的重链和轻链并不需要来源于相同的抗体，且可以，如果需要，包含复合链，其中该复合链具有来源于不同链的构架区。
且，在本发明移植了CDR的抗体中，构架区不需要具有与受体抗体的那些序列完全相同的序列。例如，可把稀有残基变为就受体链的种类或类型而言更经常出现的残基。选择性地，可改变受体构架区中选定的残基，以便使它们与在供体抗体相同位置发现的残基相一致。应使这种改变保持在最小，从而恢复供体抗体的亲和力。在WO91/09967中提出了一种选择受体构架区中需改变的残基的方案。
优选地，在本发明移植了CDR的抗体分子中，如果受体重链具有人类1组的构架区(图2所示)(SEQ ID NOS：91，93，95和97)，那么除一种或多种供体CDR之外，重链的受体构架区还包含28，69和71位的供体残基(根据Kabat等(supra))。
选择性地，如果受体重链具有1组的构架区，那么除一种或多种供体CDR之外，重链的受体构架区还包含28，38，46，67，69和71位的供体残基(根据Kabat等(supra))。
优选地，在本发明移植了CDR的抗体分子中，如果受体重链具有人类3组的构架区(图2所示)(SEQ ID NOS：106，107，108和109)，那么除一种或多种供体CDR之外，该重链的受体构架区还包含27，28，30，48，49，69，71，73，76和78位的供体残基(根据Kabat等(supra))。
优选地，在本发明移植了CDR的抗体分子中，如果受体轻链具有人类1组的构架区(图1所示)(SEQ ID NOS：83，85，87和89)，那么该轻链的受体构架区还包含46和60位的供体残基(根据Kabat等(supra))。
供体残基是来源于供体抗体，即，CDR最初从中衍生的抗体的残基。
本发明的抗体分子可包含：具有全长重链和轻链的完整抗体分子；其片段，如Fab，修饰的Fab，Fab’，F(ab’)2或Fv片段；轻链或重链的单体或二聚体；单链抗体，例如单链的Fv，其中重链和轻链的可变域是通过肽键连接的。类似地，重链和轻链的可变域可与其它抗体适当地结合。
本发明优选的抗体分子是Fab片段。优选的Fab片段有一个重链和一个轻链，该重链具有SEQ ID NO：111所列的序列，该轻链具有SEQID NO：113所列的序列。优选SEQ ID NO：111和SEQ ID NO：113中所列的氨基酸序列分别是由SEQ ID NO：110和SEQ ID NO：112中所列的核苷酸序列编码的。
选择性地，优选本发明的抗体分子是一种修饰的Fab片段，其中的修饰是指将一个或多个氨基酸添加到片段重链的C-端，从而与效应分子或报道分子相连接。优选地，附加的氨基酸形成含一个或两个半胱氨酸残基的修饰铰链区，从而可与效应分子或报道分子相连接。这种修饰的Fab片段优选具有一个重链和一个轻链，该重链具有SEQ IDNO：115所列的序列，该轻链具有SEQ ID NO：113所列的序列。SEQ IDNO：115中所列的氨基酸序列优选是由SEQ ID NO：114中所列的核苷酸序列编码的。
优选的效应子是一种聚合物分子，其可以与修饰的Fab片段相连接，以增加它在体内的半衰期。
该聚合物分子通常可以是一种合成的或天然存在的聚合物，例如，任选取代的直链或支链的聚亚烷基，聚亚烯基或聚亚氧烷基的聚合物，或支链或无支链的多糖，例如，同-或杂-多糖。
存在于上述合成聚合物上的特殊任选取代基包括一个或多个羟基，甲基或甲氧基。合成聚合物的特殊实施例包括任选取代的直链或支链的聚(乙二醇)，聚(丙二醇)，聚(乙烯醇)或其衍生物，特别是任选取代的聚(乙二醇)，如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。天然存在的特殊聚合物包括乳糖，直链淀粉，葡聚糖，糖原或其衍生物。此处使用的“衍生物”可包括反应性衍生物，例如巯基-选择性的反应基团，如马来酰亚胺等。该反应基团可直接或通过连接区段与聚合物相连。我们期望在某些例子中，作为抗体片段和聚合物之间的连接基团，这种基团的残基可形成产物的一部分。
聚合物的大小可根据需要而变化，但平均分子量通常在500Da-50000Da之间，优选在5000-40000Da，更优选25000-40000Da。聚合物的大小可根据产品的用途而选择。因而，例如，假如想使产物离开循环，渗透组织中，例如用于治疗肿瘤，可使用小分子量的聚合物，例如分子量为5000Da的聚合物。为使产物留在循环中，可使用分子量较高的聚合物，例如分子量为25000Da-40000Da的聚合物。
特别优选的聚合物包括聚亚烷基聚合物，如聚(乙二醇)或，特别是，甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，特别是具有约25000Da-约40000Da分子量的聚合物。
附着在修饰抗体片段上的各聚合物分子可与片段中半胱氨酸残基的硫原子共价连接。该共价键通常是二硫键或，特别是，硫-碳键。
需要时，该抗体片段可具有一个或多个与其连接效应分子或报道分子。该效应分子或报道分子可通过片段中任一可利用的氨基酸侧-链或末端氨基酸官能团，例如任一游离氨基，亚氨基，羟基或羧基与抗体片段连接。
在制备上述聚合物-修饰的抗体片段时，可将活化的聚合物用作起始材料。该活化聚合物可以是任一含巯基反应基团的聚合物，如α-卤羧酸或酯，例如，碘乙酰胺，酰亚胺，例如马来酰亚胺，乙烯基砜或二硫化物。这种起始材料可从商业上得到(例如，从Shearwater Polymers Inc.，Huntsville，Al，USA)或使用常规的化学方法从商业上可得到的起始物质制备。
关于连接聚(乙二醇)(PEG)部分，可参考“Poly(ethyleneglycol)Chemistry，Biotechnical andBiomedical Applications”，1992，J.Milton Harris(ed)，PlenumPress，New York，“Poly(ethyleneglycol)Chemistry andBiological Applications”，1997，J.Milton Harris和S.Zalipsky(eds)，American Chemical Society，Washington DC和“Bioconjugation Protein Coupling Techniques for theBiomedical Sciences”，1998，M.Aslam和A.Dent，GrovePublishers，New York。
如果希望得到连接到效应分子或报道分子上的抗体片段，则可通过标准的化学或重组DNA方法制备，其中抗体片段是在与活化的聚合物反应之前或之后，直接或经由偶联剂与效应分子或报道分子连接的。特殊的化学方法包括，例如，WO93/06231，WO92/22583，WO89/00195和WO89/01476中描述的那些。选择性地，如果效应分子或报道分子是一种蛋白或多肽，那么可以使用重组DAN方法，如WO86/01533和EP-A-0392745所描述的方法得到该键。
优选地，本发明修饰的Fab片段是根据EP-A-0948544中公开的方法PEG化的(即，PEG(聚(乙二醇)与其共价连接)。本发明优选的抗体分子是图13所示的PEG化的修饰Fab片段。如图13所示，该修饰的Fab片段具有一个与修饰铰链区中的单巯基共价连接的马来酰亚胺基团。赖氨酸残基与马来酰亚胺基团共价连接。赖氨酸残基的各胺基与分子量约为20,000Da的甲氧基聚(乙二醇)聚合物相连接。因此，整个效应分子总的分子量约为40,000Da。
优选地，在图13所示的化合物中，抗体部分的重链具有SEQ IDN0：115所列的序列，而轻链具有SEQ ID N0：113所列的序列。此处，称此化合物为CDP870。
本发明抗体分子的不变区，如果存在，可考虑抗体分子的建议功能，特别是根据建议的效应子功能而选择。例如，该不变区域可以是人IgA，IgD，IgE，IgG或IgM域。特别是，当抗体分子用于治疗用途并需要抗体的效应子功能时，可使用人IgG不变区域，特别是IgG1和IgG3的同种型。选择性地，当抗体分子用于治疗目的但不需要抗体的效应子功能，例如简单的阻断TNFα活性时，可使用IgG2和IgG4的同种型。
且，本发明的抗体分子可具有与其连接的效应分子或报道分子。例如，它可具有一个大环，用于螯合通过共价桥结构与其连接的重金属原子，或毒素，如篦麻毒蛋白。选择性地，可将重组DNA技术用于生产抗体分子，其中完整免疫球蛋白分子的Fc片段(CH2，CH3和铰链域)，CH2和CH3域或CH3域已经被替换为，或通过肽键附着于，功能性的非-免疫球蛋白，如酶或毒素分子上。
本发明的抗体分子优选具有至少0.85×10-10M，更优选至少0.75×10-10M，最优选至少0.5×10-10M的结合亲和力。(本发明优选的人源化抗体分子，如下所述，具有约0.5×10-10M的亲和力，其比它从中衍生的鼠科动物单克隆抗体的亲和力要好。鼠科动物抗体的亲和力约为0.85×10-10M。)
优选地，本发明的抗体分子包含轻链可变域hTNF40-gL1(SEQ IDNO：8)和重链可变域gh3hTNF40.4(SEQ ID NO：11)。这些轻链和重链可变域的序列分别在图8和11中列出。
本发明还涉及本发明抗体分子的变体，其对TNFα的亲和力提高。这种变体可通过许多亲和力成熟方案得到，该方案包括使CDR变异(Yang等，J.Mol.Biol.， 254，392-403，1995)，链改组(Marks等，Biol/Technology， 10，779-783，1992)，使用大肠杆菌的增变菌株(Low等，J.Mol.Biol.， 250，359-368，1996)，DNA改组(Patten等，Curr.Opin.Biotechnol.， 8，724-733，1997)，噬菌体展示(Thompson等，J.Mol.Biol.， 256，77-88，1996)和有性PCR(Crameri等，Na ture， 391，288-291，1998)。Vaughan等(supra)讨论了这些亲和力成熟的方法。
本发明还提供一种编码本发明抗体分子重链和/或轻链的DNA序列。
优选地，该DNA序列编码本发明抗体分子的重链或轻链。
在其中一个优选实施方案中，该DNA序列编码轻链，且包含SEQ IDNO：8(hTNF40-gL1)或SEQ ID NO：9(h-TNF40-gL2)所列的序列或其简并等价物。
在另一个优选实施方案中，该DNA序列编码重链，且包含SFQ IDNO：10(gh1hTNF40.4)或SEQ ID NO：11(gh3hTNF40.4)所列的序列或其简并等价物。
本发明的DNA序列可包含合成的DNA，例如通过化学方法生产的，cDNA，基因组DNA或其任意的组合。
本发明还涉及一种包含本发明一个或多个DNA序列的克隆或表达载体。优选地，该克隆或表达载体包含两个DNA序列，分别编码本发明抗体分子的轻链和重链。
在优选实施方案中，本发明提供一种含本发明DNA序列的大肠杆菌表达载体。优选地，该表达载体是图22中所示的pTTO(CDP870)。
本发明还包含图19所示的载体pDNAbEng-G1。
构造载体的普通方法，转染方法和培养方法对于本领域的那些技术人员来说是熟知的。这方面的参考文献是“Current Protocols inMolecular Biology”，1999，F.M.Ausubel(ed)，Wiley Interscience，New York和Cold Spring Harbor Publishing的Maniatis Manual。
编码本发明抗体分子的DNA序列可通过本领域技术人员熟知的方法得到。例如，编码部分或全部抗体重链和轻链的DNA序列可根据需要从预定的DNA序列，或根据相应的氨基酸序列而合成。
对于本领域的那些技术人员来说，编码受体构架序列的DNA可广泛地得到，且可以根据它们的已知氨基酸序列很容易地合成。
分子生物学的标准技术可用于制备编码本发明抗体分子的DNA序列。可使用寡核苷酸合成技术完全或部分地合成所期望的DNA序列。还可适当地使用定点诱变及聚合酶链反应(PCR)技术。
任一适当的宿主细胞/载体系统均可用于表达编码本发明抗体分子的DNA序列。细菌如大肠杆菌，及其它的微生物系统，可部分用于编码抗体片段，如Fab和F(ab’)2片段，特别是Fv片段和单链抗体片段，例如，单链的Fvs。真核生物，如哺乳动物的宿主细胞表达系统可用于生产较大的抗体分子，包括完整抗体分子。适当的哺乳动物宿主细胞包括CHO，骨髓瘤或杂交瘤细胞。
本发明还提供一种生产本发明抗体分子的方法，包含在适于从编码本发明抗体分子的DNA产生蛋白表达的条件下，培养含本发明载体的宿主细胞，并分离该抗体分子。
生产本发明抗体分子的优选方法包含在适于从DNA序列产生蛋白表达的条件下，培养含大肠杆菌表达载体的大肠杆菌，其中的大肠杆菌表达载体包含本发明的DNA序列，然后分离该抗体分子。该抗体分子可从细胞分泌，或通过适当的信号序列而被导向胞质。选择性地，该抗体分子可在细胞的胞质内积聚。优选地，该抗体分子被导向胞质。根据所生产的抗体分子及所使用的方法，可使抗体分子重折叠并接受功能性构像。使抗体分子重折叠的方法对于本领域的那些技术人员来说是熟知的。
该抗体分子可仅仅包含一个重链或轻链的多肽，其中编码序列的一个重链或轻链多肽需用于转染宿主细胞。为了生产既含重链又含轻链的产物，可用两个载体转染细胞系，其中第一个载体编码轻链的多肽，第二个载体编码重链的多肽。选择性地，可使用单个载体，该载体包括编码轻链和重链多肽的序列。
本发明还提供一种治疗或诊断组合物，其包含本发明的抗体分子及药学上可接受的赋形剂，稀释剂或载体。
本发明还提供一种制备治疗或诊断组合物的方法，包括将本发明的抗体分子与药学上可接受的赋形剂，稀释剂或载体混合。
该抗体分子在治疗或诊断组合物中可以是单一的活性成分，或与其它的活性成分，包括其它的抗体成分，例如抗-T细胞，抗-IFNγ或抗-LPS抗体，或非-抗体成分如黄嘌呤组合。
优选该药物组合物包含治疗有效量的本发明的抗体。此处使用的术语“治疗有效量”指的是治疗，改善或预防目标疾病或病症，或显示可检测的治疗或预防效果所需的治疗剂的量。对任一抗体而言，治疗的有效剂量最初可在细胞培养试验或动物模型，通常是啮齿类动物，兔子，狗，猪或灵长类动物中进行估量。该动物模型可用于确定适宜的浓度范围和给药途径。这种信息还可用于确定人的有效给药剂量和给药途径。
人类受试者准确的有效量取决于疾病状况的严重性，受试者的一般健康状况，受试者的年龄，体重和性，饮食，给药时间和频率，药物的组合，反应敏感性和对治疗的耐受性/反应。此剂量可通过常规的试验并在临床医师的判断范围内确定。通常，有效剂量为0.01mg/kg-50mg/kg，优选0.1mg/kg-20mg/kg，更优选约15mg/kg。如下列实施例所示，已经将1，5和20mg/kg的给药剂量用于治疗患类风湿性关节炎的患者。
可将组合物单独给予患者，或与其它药剂，药物或激素一起给药。
本发明抗体分子的给药剂量取决于所治病症的特性，抗体分子是用于预防还是治疗所存在的病症，待中和的TNFα水平高于或期望高于的水平的程度。
因而，例如，当该产品用于治疗或预防慢性炎症性疾病，如类风湿性关节炎时，本发明抗体分子的适宜剂量为0.5-50mg/kg，更优选1-20mg/kg，最优选约15mg/kg。给药频率取决于抗体分子的半衰期及其药效的持续时间。
如果抗体分子的半衰期较短(例如2-10小时)，则可以每天给药一次或多次。选择性地，如果抗体分子的半衰期较长(例如2-15天)，则只需每天，每周，甚至每1个月或2个月给药一次。
该药物组合物还可以包含用于给予抗体的药学上可接受的载体。该载体自身不应诱导生产对接受组合物的个体有害的抗体，且该载体应是无毒的。适宜的载体可以是大的，缓慢代谢的大分子，如蛋白，多肽，脂质体，多糖，聚乳酸，聚乙二醇酸，聚合氨基酸，氨基酸共聚物和非活性的病毒颗粒。
也可以使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，如盐酸盐，氢溴酸盐，磷酸盐和硫酸盐，或有机酸盐，如醋酸盐，丙酸盐，丙二酸盐和苯甲酸盐。
治疗组合物中药学上可接受的载体还可以附带地包含液体，如水，盐水，甘油和乙醇。附带地，辅助物质，如湿润剂或乳化剂或pH缓冲物质，也可存在于这种组合物中。这种载体可将药物组合物制成适于患者摄入的片剂，丸剂，糖衣丸剂，胶囊，液体，凝胶，糖浆，浆和混悬液。
优选的给药形式包括适于非肠道给药的形式，例如，通过注射或输注，如快速浓注或连续的输注。当产品用于注射或输注时，它可以是油性或水性介质中的混悬液，溶液或乳状液，且它可以包含formulatory剂，如混悬剂，防腐剂，稳定剂和/或分散剂。选择性地，该抗体分子可以是干燥形式，使用前用适当的无菌液体再组成。一旦配制好后，可将本发明的组合物直接给予患者。接受治疗的患者可以是动物。然而，优选将该组合物给予人类患者。
本发明的药物组合物可通过任一途径给药，包括，但不限制于，静脉内，肌内，房内，髓内，鞘内，心室内，透皮，经皮(例如，见WO98/20734)，皮下，腹膜内，鼻内，肠内，局部，舌下，阴道内或直肠给药途径。Hyposprays也可用于给予本发明的药物组合物。代表性地，可将该治疗组合物制备成可注射的液体溶液或混悬液。还可以制备用于注射前配制于液体赋形剂的溶液或混悬液的固体形式。
组合物的直接传递通常可通过皮下，腹膜内，静脉内或肌内注射来完成，或将组合物传递到组织的间隙空间。还可以将该组合物给药到损伤中。治疗方案可以是单一给药或复合给药。
期望组合物中的活性成分是抗体分子。这样，其在胃肠道中的降解令人怀疑。因而，如果该组合物是通过胃肠道途径给药，那么该组合物需包含防止抗体降解，但一旦从胃肠道吸收则释放该抗体的药剂。
有关药学上可接受载体的彻底讨论见Remington’s PharmaceutiaclSciences(Mack Publishing Company，N.J.1991)。
通过基因治疗给予本发明的抗体也是可以想到的。为了实现这一点，将在适当DNA组分的控制下编码抗体分子重链和轻链的DNA序列引入到患者中，从而自DNA序列表达抗体链并原位装配(in situassembly)。
本发明还提供用于治疗TNFα介导的疾病的抗体分子。
本发明进一步提供本发明抗体分子在制备治疗TNFα介导疾病的药剂中的用途。
本发明的抗体分子可用于任意一种治疗当中，其中希望能降低存在于人或动物体中生物活性的TNFα的水平。该TNFα可在体内循环，或以不期望的高水平存在于体内的特殊位置。
例如，TNFα水平的升高参与急性和慢性的免疫和免疫调节疾病，感染包括脓毒性，内毒素性的和心血管性休克，炎症疾病，神经变性疾病，恶性疾病和酒精诱导的肝炎。与TNFα水平升高有关的多种疾病的描述在US-A-5919452中提出。本发明的抗体分子可用于治疗TNFα介导的疾病。可用本发明抗体分子治疗的，特别相关的疾病包括脓毒症，充血性心力衰竭，脓毒性或内毒素性的休克，恶病质，成人呼吸窘迫综合症，AIDS，变态反应，牛皮癣，TB，炎性骨疾病，血液凝聚病，烧伤，器官或组织移植后的排斥反应发作，克罗恩氏病和自身免疫疾病，如甲状腺炎和类风湿性-和骨-关节炎。
附带地，该抗体分子或组合物还可用于：减轻在肿瘤治疗过程中与TNFα产生有关的副作用；消除或减轻与使用抗-淋巴细胞抗体治疗或预防移植排斥相关的休克症状；或治疗多-器官衰竭。
本发明的抗体分子优选用于治疗类风湿性-或骨-关节炎。
本发明还提供一种治疗患TNFα介导的疾病或具有患TNFα介导疾病风险的人或动物受试者的方法，该方法包括给予受试者有效量的本发明的抗体分子。
本发明的抗体分子还可用于诊断，例如体内诊断，及反映疾病的状况，其中该疾病涉及TNFα水平的升高。
本发明还提供一种含杂种CDR的抗体分子，其中的CDR含截短的供体CDR序列，其中截短的供体CDR的缺失部分被不同的序列代替，并形成功能性的CDR。此处使用的术语“杂种CDR”指的是一种含供体CDR的CDR，其中在一个或多个位置，例如，在其一个或两个末端平截该供体CDR。用不同的序列代替截短的供体CDR的缺失部分，从而形成一个完整的，功能性的CDR。与完整的供体CDR相比，该杂种CDR具有至少一个氨基酸的改变。代替CDR截短部分的序列可以是任一序列。优选地，CDR序列的非-供体部分来源于抗体，而该抗体又是抗体分子构架区从中衍生的抗体，如种系抗体序列。
人们已经发现含杂种CDR的抗体分子基本上保留了与含完整供体CDR的抗体分子相同的结合亲和力。此处使用的术语“基本上相同的结合亲和力”指的是与相应的含完整供体CDR的抗体分子相比，至少70％，更优选至少85％，最优选至少95％相同的结合亲和力。如上所述，在某些例子中，本发明抗体的亲和力可比供体抗体的亲和力大很多。杂种CDR的使用提供了这样一种有利之处，即减少了存在于抗体分子中外源(即供体)序列的量，且与相应含完整供体CDR的抗体分子相比，增加了抗体分子的结合亲和力。
任一抗体分子的CDR均可以是杂种的。优选在抗体分子中重链的CDR2是杂种。
优选平截供体CDR的1-8个氨基酸，更优选4-6个氨基酸。进一步优选在CDR的C-端进行平截。
根据CDR截短部分的序列和代替缺失部分的不同序列的序列，可进行多种氨基酸的改变。优选进行至少2个，更优选至少3个，最优选至少4个氨基酸的改变。
本发明此方面的特殊实施方案是本发明第一方面的抗体，其中重链中的第二个CDR具有SEQ ID NO：2所列的序列。与部分CDR从中衍生出的供体抗体相比，其对抗原的亲和力更好。
本发明还提供一种核酸序列，其编码含本发明杂种CDR的抗体分子。
本发明还提供一种含核酸序列的表达载体，其中的核酸序列编码含本发明杂种CDR的抗体分子。
本发明还提供一种用本发明载体转染的宿主细胞。
本发明还提供一种生产含杂种CDR的抗体分子的方法，包含培养本发明的宿主细胞，并分离该抗体分子。
下面，参考附图并结合实施例对本发明进行进一步的描述，其中：
图1表示与hTNF40轻链(SEQ ID NOS：83-90)的构架区相比，人轻链1亚组的构架区；
图2表示与hTNF40重链(SEQ ID NOS：91-98及106-109)的构架区相比，人重链1亚组和3亚组的构架区；
图3表示hTNF4 0CDR(SEQ ID NOS：1-7)的氨基酸序列，其中CDR H2’是一种杂种CDR，其中C-端的六个氨基酸来源于人3亚组种系抗体的H2 CDR序列，并在氨基酸下划线，其中该氨基酸变为由此杂交所产生的序列；
图4表示载体pMR15.1；
图5表示载体pMR14；
图6表示鼠科动物hTNF40V1(SEQ ID NO：99)的核苷酸序列及预测的氨基酸序列；
图7表示鼠科动物hTNF40Vh(SEQ ID NO：100)的核苷酸序列及预测的氨基酸序列；
图8表示鼠科动物hTNF40-gL1(SEQ ID NO：8)的核苷酸序列及预测的氨基酸序列；
图9表示鼠科动物hTNF40-gL2(SEQ ID NO：9)的核苷酸序列及预测的氨基酸序列；
图10表示鼠科动物gh1hTNF40.4(SEQ ID NO：10)的核苷酸序列及预测的氨基酸序列；
图11表示鼠科动物gh3hTNF40.4(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列及预测的氨基酸序列；
图12表示载体CTIL5-gL6；
图13表示称作CDP870的化合物的结构，该化合物包含来源于抗体hTNF40的Fab片段，其中抗体hTNF40是经由半胱氨酸残基与赖氨酰-马来酰亚胺键共价连接的，其中各个赖氨酰残基上的氨基与甲氧基PEG残基共价连接，其中的n约为420；
图14表示载体pTTQ9；
图15表示OmpA寡核苷酸连接物(SEQ ID NO：101)的序列；
图16表示载体pACYC184；
图17表示载体pTTO-1；
图18表示载体pTTO-2；
图19表示载体pDNAbEng-G1；
图20表示寡核苷酸弹夹，该弹夹编码大肠杆菌修饰的Fab表达的不同基因间序列(SEQ ID NO：102-105)；
图21表示IGS变体的胞质修饰的Fab积聚；
图22表示载体pTTO(CDP870)；
图23表示用不同剂量的CDP870和安慰剂治疗的患者的疾病活动性值(DAS)。提出中值和IQ范围。小方块代表安慰剂，菱形代表1mg/kg，三角形代表5mg/kg，大方块代表20mg/kg。
图24表示用不同剂量的安慰剂和CDP870治疗的患者的触痛关节数，肿胀关节数，疼痛值，评估员对疾病活动性的综合评估，改进的健康评估调查表(HAQ)，C反应性蛋白(CRP)和血沉速率(ESR)。提出中值和IQ范围。小方块代表安慰剂，菱形代表1mg/kg，三角形代表5mg/kg，大方块代表20mmg/kg。
实施例
嵌合的hTNF40抗体分子的基因克隆和表达
从hTNF40杂交瘤细胞制备RNA
总的RNA是按照下列描述从3×107个hTNF40杂交瘤细胞制备的。在生理盐水中清洗细胞并在RNAzo1(0.2ml/106个细胞)中将其溶解。加入氯仿(0.2ml/2ml匀浆)，用力振荡该混合物15秒，然后将其放在冰上15分钟。在Eppendorf离心机中离心15分钟，使最终的水相和有机相分离，然后通过加入等体积的异丙醇使RNA从水相中沉淀出来。在冰上放置15分钟后，通过离心使RNA成团，用70％乙醇清洗，干燥，并将其溶解在无菌的，RNA酶游离水中。RNA的产量为400μg。hTNF40Vh和V1的PCR克隆
编码hTNF40重链和轻链可变域的cDNA序列是使用反向转录酶合成的，并产生存在于总RNA中的mRNA的单链cDNA模板，接下来用特异性的寡核苷酸引物在cDNA上进行聚合酶链反应(PCR)。
a)cDNA的合成
cDNA是在含下列试剂的20μl反应体积内合成的：50mM Tris-HClpH8.3，75mM KCl，10mM二硫苏糖醇，3mM MgCl2，0.5mM脱氧核糖核苷磷酸盐，20个单位的RNA酶抑制剂，75ng的任意六核苷酸引物，2μg的hTNF40 RNA和200个单位的莫洛尼鼠科动物白血病病毒反向转录酶。在42℃培养60分钟后，通过在95℃加热5分钟而终止反应。
b)PCR
使用对重链和轻链具有特异性的引物组合，使cDNA的等分试样经历PCR反应。重链和轻链5’引物的核苷酸序列分别在表1和2中列出。这些序列均包含，适宜的，一个从5’端启动7个核苷酸的限制位点，序列为GCCGCCACC(SEQID NO：12)，以使生成的mRNA，一个起始密码子和基于已知小鼠抗体前导肽序列的20-30个核苷酸的翻译达到最佳(Kabat等，Sequences of proteins of immunological interest，5th Edition，1991，U.S.Department of Health and Human Services，Public Health Service，National Institutes of Health)。3’引物在表3中列出。轻链的引物越过抗体的J-C连接，且包含SplI酶的一个限制位点，从而促进V1 PCR片段的克隆。重链的3’引物是一种越过抗体J-C连接的混合物。该3’引物包括促进克隆的ApaI限制位点。引物的3’区包含一混合序列，该混合序列是以在已知小鼠抗体中发现的那些(Kabat等，1991，supra)为基础的。
上述引物的组合可使Vh和V1的PCR产物直接被克隆适当的表达载体(见下面)，从而生产嵌合的(小鼠-人)的重链和轻链，且可使这些基因的PCR产物在哺乳动物细胞中表达，从而生产出所需同种型的嵌合抗体。
下面提出PCR的培养物(100μl)。各反应物均包含10mMTris-HClpH8.3，1.5mM MgCl2，50mM KCl，0.01％w/v明胶，0.25mM脱氧核糖核苷三磷酸盐，10pmoles的5’引物混合物(表4)，10pmoles的3’引物(CL12(轻链)或R2155(重链)(表3))，1μl的cDNA和1个单位的Taq聚合酶。在95℃培养该反应物5分钟，然后94℃循环1分钟，55℃循环1分钟，72℃循环1分钟。30次循环之后，通过在琼脂糖胶上进行电泳而分析各反应物的等分试样。来源于轻链库1，2，和7的含5’引物混合物的轻链反应物产生与全长V1片段大小相同的带，而来源于重链反应库3的反应物则产生与Vh基因预期大小相同的片段。由于上述结果显示此带与杂交瘤细胞产生的轻链假基因相对应，因而没有研究轻链库1引物生产的带。轻链库7引物所产生的带比库2引物所产生的带要弱，因此没有研究它。仅研究了来源于轻链反应库2的带，其是最强的带。
c)PCR片段的分子克隆
用BstBI和SplI酶消化在轻链反应库2中产生的DNA片段，通过乙醇沉淀浓缩，在1.4％琼脂糖胶上进行电泳，回收在400个碱基对范围内的DNA。通过将其连接到载体pMR15.1(图4)中而克隆该DNA，其中该载体已经被BstBI和SplI限制过了。连接之后，将混合物转化大肠杆菌LM 1035，而来源于最终细菌群体的质粒通过用BstBI和SplI消化来筛选插入片段，具有每一种连接的插入片段的代表，进一步通过核苷酸测序分析。
在类似的方法中，在重链反应库3中产生的DNA片段是用HindIII和ApaI消化的，并被克隆载体pMR14(图5)，其中该载体已经被HindIII和ApaI限制过了。又，通过核苷酸测序分析含插入片段的代表性质粒。
d)核苷酸序列的分析
使用引物R1053(见表5)(其在pMR14的HCMV启动子的3’区中作为引物)和R720(见表5)(其在人C-γ4的5’区中作为引物，并通过pMR14上的DNA插入片段测序)测序质粒DNA，其中该质粒DNA来源于许多含Vh插入片段的分离物。人们已经发现，许多克隆中的Vh插入片段的核苷酸序列除信号肽和J区不同外，均是相同的。这表明所检验的克隆是独立的分离物，这是由于在PCR阶段，使用了来源于寡核苷酸混合物的不同引物。抗体hTNF40(hTNF40Vh)重链可变域的所确定的核苷酸序列和所预测的氨基酸序列在图7(SEQ ID NO：100)中列出。
为了分析轻链的克隆，检验了用R1053(见表5)和R68 4(SEQ IDNO：62)(其在人C-κ的5’区中作为引物，并通过pMR15.1上的DNA插入片段测序)作为引物所得到的序列。由于在库2中反应，可类似地分析V1基因的核苷酸序列和所预测的氨基酸序列。又，人们还发现许多克隆中的V1插入片段的核苷酸序列除信号肽和J区不同之外，均是相同的，这些表明由于在PCR阶段使用了来源于寡核苷酸混合物的不同引物，所检验的克隆是独立的分离物。抗体hTNF40(hTNF40V1)轻链可变域的确定核苷酸序列和预测的氨基酸序列在图6(SEQ IDNO：99)中列出。
表1
小鼠重链5’区的寡核苷酸引物。
CH1：5’ATGAAATGCAGCTGGGTCAT(G，C)TTCTT3’(SEQ ID NO：13)
CH2：5’ATGGGATGGAGCT(A，G)TATCAT(C，G)(C，T)TCTT3’(SEQ ID NO：14)
CH3：5’ATGAAG(A，T)TGTGGTAAACTGGGTTT(SEQ ID NO：15)
CH4：5’ATG(G，A)ACTTTGGG(T，C)TCAGCTTG(G，A)T3’(SEQ ID NO：16)
CH5：5’ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTT3’(SEQ ID NO：17)
CH6：5’ATGGCTGTC(C，T)T(G，A)G(G，C)GCT(G，A)CTCTTCTG3’(SEQ ID NO：18)
CH7：5’ATGG(G，A)ATGGAGC(G，T)GG(G，A)TCTTT(A，C)TCTT3’(SEQ ID NO：19)
CH8：5’ATGAGAGTGCTGATTCTTTTTGTG3’(SEQ ID NO：20)
CH9：5’ATGG(C，A)TTGGGTGTGGA(A，C)CTTGCTATT3’(SEQ ID NO：21)
CH10：5’ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCT3’(SEQ ID NO：22)
CH11：5’ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG3’(SEQ ID NO：23)
CH12：5’ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCT3’(SEQ ID NO：24)
上述各引物均具有加入到其5’端的序列
5’GCGCGCAAGCTTGCCGCCACC3’(SEQ ID NO：25)
表2
小鼠轻链5’区的寡核苷酸引物。
CL1：5’ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT3’(SEQ ID NO：26)
CL2：5’ATGGAG(T，A)CAGACACACTCCTG(T，C)TATGGGT3’(SEQ ID NO：27)
CL3：5’ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCT3’(SEQ ID NO：28)
CL4：5’ATGAGG(G，A)CCCCTGCTCAG(A，T)TT(C，T)TTGG3’(SEQ ID NO：29)
CL5：5’ATGGATTT(T，A)CAGGTGCAGATT(T，A)TCAGCTT3’(SEQ ID NO：30)
CL5A：5’ATGGATTT(T，A)CA(A，G)GTGCAGATT(T，A)TCAGCTT3’(SEQ ID NO：31)
CL6：5’ATGAGGT(T，G)C(T，C)(T，C)TG(T，C)T(G，C)AG(T，C)T(T，C)CTG(A，G)G3’(SEQID NO：32)
CL7：5’ATGGGC(T，A)TCAAGATGGAGTCACA3’(SEQ ID NO：33)
CL8：5’ATGTGGGGA(T，C)CT(G，T)TTT(T，C)C(A，C)(A，C)TTTTTCAAT3’(SEQ IDNO：34)
CL9：5’ATGGT(G，A)TCC(T，A)CA(G，C)CTCAGTTCCTT3’(SEQ ID NO：35)
CL10：5’ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTC3’(SEQ ID NO：36)
CL11：5’ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTT3’(SEQ ID NO：37)
CL12A：5’ATG(A，G)AGT，C)(A，T)CAGACCCAGGTCTT(T，C)(A，G)T3’(SEQ IDNO：38)
CL12B：5’ATGGAGACACATTCTCAGGTCTTTGT3’(SEQ ID NO：39)
CL13：5’ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTAT3’(SEQ ID NO：40)
CL14：5’ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTT3’(SEQ ID NO：41)
CL15：5’ATGAATTTGCCTGTTCATCTCTTGGTGCT3’(SEQ ID NO：42)
CL16：5’ATGGATTTTCAATTGGTCCTCATCTCCTT3’(SEQ ID NO：43)
CL17A：5’ATGAGGTGCCTA(A，G)CT(C，G)AGTTCCTG(A，G)G3’(SEQ ID NO：44)
CL17B：5’ATGAAGTACTCTGCTCAGTTTCTAGG3’(SEQ ID NO：45)
CL17C：5’ATGAGGCATTCTCTTCAATTCTTGGG3’(SEQ ID NO：46)
上述各引物均具有加入到其5’端的序列
5’GGACTGTTCGAAGCCGCCACC3’(SEQ ID NO：47)。
表3
小鼠Vh和V1基因3’端的寡核苷酸引物。
轻链(CL12)：
5’GGATACAGTTGGTGCAGCATCCGTACGTTT3’(SEQ ID NO：48)
重链(R2155)：
5’GCAGATGGGCCCTTCGTTGAGGCTG(A，C)(A，G)GAGAC(G，T，A)GTGA3’
(SEQ ID NO：49)
表4
a)轻链PCR反应的5’引物混合物
库1：CL2
库2：CL7
库3：CL13
库4：CL6
库5：CL5A，CL9，CL17A
库6：CL8
库7：CL12A
库8：
CL1，CL3，CL4，CL5，CL10，CL11，CL2B，CL14，CL15，CL16，CL17B，CL17C
b)重链PCR反应的5’引物混合物
库1：CH1，CH2，CH3，CH4
库2：CH5，CH6，CH7，CH8
库3：CH9，CH10，CH11，CH12
表5
用于核苷酸序列分析的引物
R1053：5’GCTGACAGACTAACAGACTGTTCC3’(SEQ ID NO：50)
R720：5’GCTCTCGGAGGTGCTCCT3’(SEQ ID NO：51)
嵌合基因活性的评估
嵌合基因的活性是通过在哺乳动物细胞中表达，纯化它们，并测定新合成抗体的数量而评估的。下面描述其操作方法，及用于抗体生物特性描述的细胞和生物化学测定法。
a)嵌合hTNF40抗体分子的生产
用于生物评估的嵌合抗体是通过使用磷酸钙沉淀共-转染成中国仓鼠卵巢(CHO)细胞之后，瞬时表达适当的重链和轻链对而生产的。
在转染之前，使半-融合瓶的CHO-L761细胞接受胰蛋白酶作用，计算细胞数，每个T75瓶含107个细胞。
第二天，在转染之前3个小时，改变培养基。为了进行转染，将1.25ml各含50μg重链和轻链表达载体的0.25M CaCl2和1.25ml2xHBS(1升水中含16.36g NaCl，11.0g HEPES和0.4g Na2HPO4，并用NaOH调节pH值至7.1)混合，并立即加入到细胞的培养基中制备磷酸钙沉淀。在37℃的CO2培养箱中培养3小时后，除去培养基和沉淀，通过在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中加入15ml 15％的甘油1分钟来振荡细胞。除去甘油，用PBS洗该细胞一次，并在25ml含10mM丁酸钠的培养基中培养48-96小时。通过结合并从蛋白A-琼脂糖上洗脱而从培养基纯化抗体。
b)ELISA
为了进行ELISA，用浓度为5μg/ml的多克隆山羊抗-人Fc片段特异性抗体(Jackson Immunoresearch，code 109-006-098)的F(ab)2片段的包被缓冲液(15mM碳酸钠，35mM碳酸氢钠，pH6.9)4℃过夜覆盖Nunc ELISA平板。用蒸馏水清洗5次，除去未包被的抗体。将定量的样品和纯标准品稀释至在共轭缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH7.0，0.1M NaCl，0.2％v/v Tween 20，0.2％w/v Hammersten酪蛋白)中的浓度约为1μg/ml。以2-倍的稀释度在微量滴定板中滴定该样品，使得每个孔中的最终体积达到0.1ml，室温下振荡培养该平板1小时。第一次培养后，用蒸馏水清洗该板10次，然后如前所述，用0.1ml，在共轭缓冲液中的稀释度为1∶700的小鼠单克隆抗-人κ(克隆GD12)过氧化物酶缀合抗体(结合位点，密码MP135)培养该板1小时。再次清洗平板，并向各个孔中加入底物溶液(0.1ml)。该底物溶液在10ml 0.1M醋酸钠/柠檬酸钠中，含150μl N，N，N，N-四甲基联苯胺(在DMSO中的浓度为10mg/ml)，150μl过氧化氢(30％的溶液)，pH6.0。使该板展开5-10分钟，直到630nm处的吸光度相对于最高标准约为1.0。630nmm处的吸光度是使用平板阅读器测量的，而样品的浓度则是通过与标准的滴定曲线相对照而测定的。
c)通过BiaCore分析测定亲和力常数
使用BIA技术调查研究hTNF40和人TNF之间的结合相互作用。使用标准的NHS/EDC化学过程，将hTNF40不变区的亲和纯化山羊多克隆抗体固定在葡聚糖聚合物传感器芯片的表面上。捕获相对低水平(200-500RU)的hTNF40，以确保传质效率达到最小。捕获的hTNF40越过不同浓度的人TNF，从而评估缔合动力学。注射配位体之后，缓冲液越过该表面，从而测量解离作用。计算固相hTNF40和人TNF之间相互作用的缔合和解离常数，得到KD值。
实施例1
hTNF40的CDR-移植
上面已经描述了hTNF40抗体重链和轻链可变区基因的分子克隆，及其用于生产嵌合(小鼠-人)hTNF40抗体的用途。鼠科动物hTNF40V1和Vh的核苷酸和氨基酸序列分别在图6和7(SEQ ID NO：99和100)中列出。此实施例描述hTNF40抗体的CDR-移植。hTNF40轻链的CDR-移植
hTNF40轻链的构架区与四个人轻链亚组的构架区的序列对比(Kabat等，1991，supra)显示了hTNF40与人轻链的亚组1中的抗体是最类似的。因此，为了构造移植了CDR的轻链，选择与人类1组共有序列的那些构架区相对应的构架区。
鼠科动物hTNF40构架区与共有序列人类1组轻链的氨基酸序列的对比在图1中列出，其显示两个序列之间有22个不同之处(下面划线的部分)。就这些构架的任一不同之处对于抗原结合的贡献进行分析，确定了2个用于研究的残基，它们位于46和60位。根据此分析构造了两个移植了CDR的轻链的译本。第一个是hTNF40-gL1(SEQ IDNO：8)，残基46和60来源于hTNF40的轻链，而第二个是hTNF40-gL2(SEQ ID NO：9)，除了60号残基之外，所有残基均是人的共有序列，而60号残基则来源于hTNF40的轻链。移植了CDR的轻链hTNF40-gL1的结构
hTNF40-gL1的结构在下面详细给出。将下列重叠的寡核苷酸(P7982-P7986)用于聚合酶链反应(PCR)中，从而装配出截短的移植轻链。所评估的片段缺少抗体前导序列和构架1开始的17个氨基酸。
寡1P7982：
5’ GAATTCAGGGTCACCATCACTTGTAAAGCCAGTCAGAACGTAGGTACTAACGTAGCCTGGTATCAGCAAA3’(SEQ ID NO：52)
寡2P7983：
5’ATAGAGGAAAGAGGCACTGTAGATGAGGGCTTTTGGGGCTTTACCTGGTTTTTGCTGATACCAGGCTACGT3’(SEQ ID NO：53)
寡3P7984：
5’TACAGTGCCTCTTTCCTCTATAGTGGTGTACCATACAGGTTCAGCGGATCCGGTAGTGGTACTGATTTCAC3’(SEQ ID NO：54)
寡4P7985
5’GACAGTAATAAGTGGCGAAATCTTCTGGCTGGAGGCTACTGATCGTGAGGGTGAAATCAGTACCACTACCG3’(SFQID NO：55)
寡5 P7986：
5’ATTTCGCCACTTATTACTGTCAACAGTATAACATCTACCCACTCACATTCGGTCAGGGTACTAAAGTAGAAATCAAACGTACGGAATTC3’(SEQ ID NO：56)
Fwd P7981：
5’GAATTCAGGGTCACCATCACTTGTAAAGCC3’(SEQ ID NO：57)
Bwd P7980
5’GAATTCCGTACGTTTGATTTCTACTTTAGT3’(SEQ ID NO：58)，
制备100μl的PCR反应物，其包含10mM Tris-HCl pH8.3，1.5mMMgCl2，50mM KCl，0.01％w/v明胶，0.25mM脱氧核糖核苷三磷酸盐，2pmoles的P7982，P7983，P7984，P7985，P7986，10pmoles的P7980，P7981和1个单位的Taq聚合酶。该反应在94℃循环1分钟，55℃循环1分钟，72℃循环1分钟。30次循环之后，通过在琼脂糖胶上进行电泳而分析各反应物，从凝胶上切除PCR片段，并用Mermaid试剂盒回收。在适当的缓冲液中用BstEII和SplI酶限制回收的片段。最后，使最终的产物经过琼脂糖胶电泳，从凝胶切片回收270个碱基对DNA片段，并将其连接到载体CTIL5-gL6(图12)中，该载体已经预先用相同的酶消化过了。上述载体提供缺失抗体前导序列和构架1开始的17个氨基酸。
该连接混合物用于转化大肠杆菌菌株LM1035及通过PCR分析得到的克隆，限制酶消化和核苷酸测序。hTNF40-gL1的V1区的核苷酸和氨基酸序列在图8中列出(SEQ ID NO：8)。
移植了CDR的轻链hTNF40-gL2的结构
使用PCR构造hTNF40-gL2(SEQ ID NO：9)。下列寡核苷酸用于引入氨基酸变化。
  R1053：5’GCTGACAGACTAACAGACTGTTCC3’(SEQ ID NO：59)
  R5350：5’TCTAGATGGCACACCATCTGCTAAGTFTGATGCAGCATAGAT
         CAGGAGCTTAGGAGC3’(SEQ ID NO：60)
  R5349：5’GCAGATGGTGTGCCATCTAGATTCAGTGGCAGTGGATCA
         GGCACAGACTTTACCCTAAC3’(SEQ ID NO：61)
  R684：5’TTCAACTGCTCATCAGAT3’(SEQ ID NO：62)
  制备各20μl的两个反应物，每个均包含10mM Tris-HCl pH8.3，1.5mM MgCl2，50mM KCl，0.01％w/v明胶，0.25mM脱氧核糖核苷三磷酸盐，0.1μg hTNF40-gL1，6pmoles的R1053/R5350或R5349/R684和0.25个单位的Taq聚合酶。该反应在94℃循环1分钟，55℃循环1分钟，72℃循环1分钟。30次循环之后，通过在琼脂糖胶上进行电泳而分析各反应物，并从凝胶切除PCR片段，然后用Mermaid试剂盒回收。
使这些反应物的等分试样经历第二个PCR循环。100μl该反应物含10mM Tris-HCl pH8.3，1.5mM MgCl2，50mM KCl，0.01％w/v明胶，1/5来源于第一组反应的各PCR片段，30pmoles的R1053和R684，和2.5个单位的Taq聚合酶。反应温度如上所述。PCR之后，先用苯酚/氯仿提取该混合物，然后用氯仿提取，并用乙醇沉淀。通过离心回收乙醇沉淀，将其溶解在适当的缓冲液中，并用Bs tEII和SplI酶限制。最后，使最终的产物经过琼脂糖胶电泳，从凝胶切片回收270个碱基对DNA片段，并使其连接到载体pMR15.1(图4)中，该载体已经预先用相同的酶消化了。
该连接混合物用于转化大肠杆菌菌株LM1035及通过PCR分析的最终群体，限制酶消化和核苷酸测序。HTNF40-glL2的V1区的核苷酸和氨基酸序列在图9中列出(SEQ ID NO：9)。
HTNF40重链的CDR-移植
hTNF40重链的CDR-移植是使用与轻链相同的策略完成的。hTNF40重链与属于1亚组的人重链最类似，因此选择人亚组1构架的共有序列来接受hTNF40重链的CDR。
为了调查研究同源的人构架充当CDR移植的受体构架的要求，选择第二个构架，人类3组从而使hTNF40重链人源化。
hTNF40与两个不同构架区的对比在图2中列出，从中可看出hTNF40与32位(下面划线的部分)的人1亚组共有序列不同，与40位的人3亚组共有序列不同(下面划线的部分)。在分析任一结果之后，可知使用1组构架将残基28，38，46，67和71作为供体保留在移植了CDR的重链gh1hTNF40.1，从而可使抗原结合。使用3组构架将残基27，28，30，48，49，69，71，73，76和78作为供体保留在移植了CDR的重链，gh3hTNF40.4中。使用1组构架将残基28，69和71作为供体保留在移植了CDR的重链，gh1hTNF40.4中。
移植了CDR的重链gh1hTNF40.4的结构
gh1hTNF40.4(SEQ ID NO：10)是在有适当引物参与的情况下，通过使重叠的寡核苷酸经历PCR而装配的。下列寡核苷酸用于PCR中：1组移植物
寡1P7989：
5’GAAGCACCAGGCTTCTTAACTCTGCTCCTGACTGGACCAGCTGCACCTGAGAGTGCACGAATTC3’(SEQ ID NO：63)
寡2P7990：
5’GGTTAAGAAGCCTGGTGCTTCCGTCAAAGTTTCGTGTAAGGCCTCAGGCTACGTGTTCACAGACTATGGTA3’(SEQ ID NO：64)
寡3P7991：
5’CCAACCCATCCATTCAGGCCTTGTCCCGGGGCCTGCTTGACCCAATTCATACCATAGTCTGTGAACACGT3’(SEQ ID NO：65)
寡4P7995：
5’G3CCTGAAATGGATGGGTTGGATTAATACTACATTGGAGAGCCTATTTATGTTGACGACTTCAAGGGCAGATTCACGTTC3’(SEQ ID NO：66)
寡5P7992：
5’CCATGTATGCAGTGCGTTGTGGAGGTGTCTAGAGTGAACGTGAATCTGCCCTTGAA3’(SEQ ID NO：67)
寡6P7993：
5’CCACAAGCACTGCATACATGGAGCTGTCATCTCTGAGATCCGAGGACACCGCAGTGTACTAT3’(SEQ ID NO：68)
寡7 P7994：
5’GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCATGGCATAAGATCTGTATCCTCTAGCACAATAGTACACTGCGGTGTCCTC3’(SEQ ID NO：69)
Fwd：P7988：
5’GAATTCGTGCACTCTCAGGTGCAGCTGGTC3’(SEQ ID NO：70)
Bwd P7987：
5’GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCAT3’(SEQ ID NO：71)
类似的100μl反应物含10mM Tris-HCl pH8.3，1.5mM MgCl2，50mMKCl，0.01％w/v明胶，0.25mM脱氧核糖核苷三磷酸盐，2pmoles的P7989，P7990，P7991，P7995，P7992，P7993和P7994，10pmoles的P7988，P7987和1个单位的Taq聚合酶。反应在94℃循环1分钟，55℃循环1分钟，72℃循环1分钟。30次循环之后，先用苯酚/氯仿(1/1)提取反应物，然后用氯仿提取，并用乙醇沉淀。离心之后，将DNA溶解在适当的限制缓冲液中，并用ApaLI和KpnI消化。从琼脂糖胶分离最终的片段，并将其连接到pMR14(图5)中，该载体已经预先用相同的酶消化过了。当周ApaLI和KpnI使pMR14裂开时，pMR14包含人γ4重链不变区，该裂开的载体可接收消化的DNA，这样所消化DNA的3’端在读框中与编码γ4不变区序列的5’端相连接。因此，从此载体表达的重链是γ4的同型。该连接混合物用于转化大肠杆菌菌株LM1035，并通过限制消化及核苷酸序列分析筛选最终的细菌群体。在此方法中，鉴定了含gh1hTNF40.4(图10)(SEQ ID NO：10)正确序列的质粒。
移植了CDR的重链gh3hTNF40.4的结构
gh3hTNF4 0.4(SEQ ID NO：11)是在有适当引物参与的情况下，通过使重叠的寡核苷酸经历PCR而装配的。下列寡核苷酸用于PCR中：
3组移植物
寡1P7999：
5’GATCCGCCAGGCTGCACGAGACCGCCTCCTGACTTCGACCAGCTGAACCTCAGAGTGCACGAATTC3’(SEQ ID NO：72)
寡2P8000：
5’TCTCGTGCAGCCTGGCGGATCGCTGAGATTGTCCTGTGCTGCATCTGGTTACGTCTTCACAGACTATGGAA3’(SEQ ID NO：73)
寡3P8001
5’CCAACCCATCCATTTCAGGCCCTTTCCCGGGGCCTGCTTAACCCAATTCATTCCATAGTCTGTGAAGACGT3’(SEQ ID NO：74)
寡4P7995：
5’GGCCTGAAATGGATGGGTTGGATTAATACTTACATTGGAGAGCCTATTTATGTTGACGACTTCAAGGGCAGATTCACGTTC3’(SEQ ID NO：66)
寡5P7997：
5’GGAGGTATGCTGTTGACTTGGATGTGTCTAGAGAGAACGTGAATCTGCCCTTGAA3’(SEQ ID NO：75)
寡6P7998：
5’CCAAGTCAACAGCATACCTCCAAATGAATAGCCTGAGAGCAGAGGACACCGCAGTGTACTAT3’(SEQ ID NO：76)
寡7P7993：
5’GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCATGGCATAAGATCTGTATCCTCTAGCACAATAGTACACTGCGGTGTCCTC3’(SEQ ID NO：77)
Fwd P7996：
5’GAATTCGTGCACTCTGAGGTTCAGCTGGTC3’(SEQ ID NO：78)Bwd P7987：
5’GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCAT3’(SEQ ID NO：71)
100μl的装配反应物含10mM Tris-HCl pH8.3，1.5mM MgCl2，50mMKCl，0.01％w/v明胶，0.25mM脱氧核糖核苷三磷酸盐，2pmoles的P7999，P8000，P8001，P7995，P7997，P7998和P7993，10pmoles的P7996，P7987和1个单位的Taq聚合酶。反应在94℃循环1分钟，55℃循环1分钟，72℃循环1分钟。30次循环之后，先用苯酚/氯仿(1/1)提取反应物，然后用氯仿提取，并用乙醇沉淀。离心之后，将DNA溶解在适当的限制缓冲液中，并用ApaLI和KpnI消化。从琼脂糖胶上分离最终的片段，并将其连接在pMR14(图5)中，该载体已经预先用相同的酶消化过了。pMR14包含人γ4重链不变区。当用ApaLI和KpnI使pMR14裂开时，该裂开的载体可接收消化的DNA，这样所消化DNA的3’端在读框中与编码γ4不变区序列的5’端相连接。因此，从此载体表达的重链是γ4的同型。该连接混合物用于转化大肠杆菌菌株LM1035，并通过限制消化和核苷酸序列分析筛选最终的细菌群体。在此方法中，鉴定了含gh3hTNF4 0.4(SEQ ID NO：11)(图11)正确序列的质粒。
移植了CDR的修饰Fab片段的生产
使用大肠杆菌载体pTTO-1构造基于抗体hTNF40的，移植了CDR的修饰Fab片段。将抗体hTNF40的可变区亚-克隆此载体，优化基因间的序列以制造pTTO(CDP870)。该pTTO表达载体引起可溶的，重组蛋白在大肠杆菌中的胞质积累。此质粒的主要特征是：
(i)四环素抗性标记-没有被抗性基因产物灭活的抗生素，因此保持了对含质粒细胞的选择；
(ii)低拷贝数-来源于质粒p15A的复制源，其适合含colE1的质粒，其中colE1得自复制子；
(ii)用于转录克隆基因的较强的，诱导tac启动子；
(iv)lacIq基因-提供lac阻遏蛋白的基本表达，保持阻抑状态中的tac启动子，直到用IPTG/异乳糖诱导；
(v)OmpA信号序列-提供克隆基因的胞质分泌；和
(vi)OmpA信号序列至短lacZ肽的翻译偶联，可有效的引发翻译。
该载体用于从双顺反子信息表达修饰的Fab片段，以根据经验从一系列目标-建立的弹夹选择最佳的基因间序列。还描述了其在构造pTTO(CDP870)中的应用。
材料和方法
DNA技术
用于此方案的标准方法包括DNA限制，琼脂糖胶电泳，连接和转化。限制酶和DNA修饰酶是从New England Biolabs或BoehringerMannheim得到的，并根据供应商的建议使用。使用GeneClean方案(BIO101)从琼脂糖纯化DNA片段。寡核苷酸是由Oswel OligonucleotideService提供的，并在40nm的等级合成。使用Qiagen的质粒DNAMini/Midi试剂盒分离质粒DNA。使用推荐的Perkin Elmer‘Amplitaq’进行PCR。使用应用生物系统Taq循环测序试剂盒进行DNA测序。
摇瓶诱导
大肠杆菌W3110培养物是在添加了四环素(7.5μg/ml)的L-肉汤中生长的。为了进行诱导，在2L带挡板摇瓶的200mL的L-肉汤中，将新鲜的隔夜培养物(在30℃生长)稀释成0.1的OD600，并在30℃的轨道培养箱中生长。加入200μM，0.5的OD600的IPTG。间隔采集样品(相对于OD标准化的)。
胞质提取物
在冰上冷冻培养样品(5分钟)，然后通过离心采集细胞。在提取缓冲液(100mM Tris.HCl，10mM EDTA，pH7.4)中重混悬后，30℃过夜培养该样品，然后通过离心使其澄清。
装配试验
修饰Fab的浓度是通过ELISA测定的。用抗-人Fd 6045(2μg/ml的包被缓冲液，生理盐水，每个孔100μl)4℃过夜覆盖平板。清洗后，每个孔装入100μl的样品；将最初为2μg/ml的纯化A5B7γ-1 Fab’用作标准样品。越过平板在样品共轭缓冲液(每升：6.05g三氨基甲烷；2.92g NaCl；0.1ml Tween-20；1ml酪蛋白(0.2％))中连续稀释2-倍；室温下搅拌培养平板1小时。清洗并干燥平板，然后加入100μl的抗-人C-κ(GD12)-过氧化物酶(在样品共轭缓冲液中稀释)。室温下搅拌培养1小时。清洗并干燥平板，然后加入100μl的底物溶液(10ml醋酸钠/柠檬酸钠溶液(0.1M pH6))；100μl的H2O2溶液；100μl的四甲基联苯胺溶液(10mg/ml的二甲基sulphoxide)。加入底物后，读4-6分钟630nm处的吸光度。
质粒pTTO-1的结构
(a)pTTQ9多接头的置换
质粒pTTQ9是从Amersham获得的，并在图14中列出。用限制酶SalI和EcoRI消化等分试样(2μg)，该消化是在1％琼脂糖胶上进行的，纯化大的DNA片段(4520bp)。当共同退火时，合成两个寡核苷酸，其编码图15所示的OmpA多接头区。此序列具有粘性末端，其与由pTTQ9限制所产生的SalI和EcoRI相一致。通过把此寡核苷酸“弹夹”克隆pTTQ9载体，SalI位点没有再生，但保留了EcoRI位点。该弹夹编码在OmpA基因的Shine Dalgarno核糖体结合位点前加上的，大肠杆菌外-膜蛋白Omp-A的信号序列的前13个氨基酸。另外，存在XabI，MunI，StyI和SplI酶的限制位点。MunI和StyI位点位于OmpA信号序列的编码区内，并将作为基因插入的5’克隆位点。组成此弹夹的两个寡核苷酸通过在5pmoles/μl的浓度混合，并在水浴中加热至95℃3分钟而共同退火，然后缓慢冷却至室温。将退火的序列连接到SalI/EcoRI半裂pTTQ9中。最终的质粒中间体，称作pTQOmp，是通过DNA测序加以证实的。
(b)片段的制备和连接
 质粒pTTO-1是通过将来源于质粒pACYC184的一个DNA片段与来源于pTQOmp的两个片段连接而成的。质粒pACYC184从New EnglandBiolabs得到，限制性酶切图在图16中给出。消化等分试样(2μg)以包括限制酶StyI，然后用绿豆核酸酶处理；通过切掉后面的5’碱基突出端而产生平端。苯酚提取和乙醇沉淀之后，用酶PvuII限制该DNA，产生2348，1081，412和403bp的片段。2348bp的片段是在进行琼脂糖胶电泳后纯化的。此片段编码四环素抗性标记和p15A的复制源。然后用小牛小肠碱性磷酸酶处理该片段，以除去5’端的磷酸盐，从而防止此分子的自身连接作用。
用酶SspI和EcoRI消化质粒pTQOmp的等分试样(2μg)，进行琼脂糖胶电泳后，从不需要的2040bp和170bp的片段纯化2350bp的片段；此片段编码转录终止子区和lacIq基因。用EcoRI和XmnI消化pTQOmp的另一个等分试样，产生2289，1670，350和250bp的片段。凝胶纯化该编码tac启动子，OmpA信号序列和多克隆位点的350bp的片段。
然后使用约等量的各片段连接上述三个片段，以产生质粒pTTO-1。所有的克隆连接均是通过DNA测序加以证实的。此质粒的限制性酶切图在图17中给出。然后通过插入编码人Ig轻链κ不变域的DNA而生产质粒pTTO-2。其作为SplI-EcoRI的限制片段，是从质粒pHC132得到的，并被插入到pTTO-1的相应位点中。质粒pTTO-2在图18中列出。
将人源化的hTNF40可变区插入到pTTO-2中
可变轻链区hTNF40gL1(SEQ ID NO：8)是通过PCR从哺乳动物细胞表达pMR10.1的相应载体‘拯救’得到的。OmpA的前导序列代替天然的Ig前导序列。PCR引物的序列如下所示；
5’引物：
CGCGCGGCAATTGCAGTGGCCTTGGCGGTTTCGCTACCGTAGCGCAAGCTGACATTCAAATGACCCAGAGCCC(SEQ ID NO：79)
3’引物：
TTCAACTGCTCATCAGATGG(SEQ ID NO：80)
在标准条件下进行PCR后，纯化产物，用MunI和SplI酶消化，然后进行凝胶纯化。将纯化的片段插入到pTTO-2的MunI/SplI位点中，以产生轻链中间体pTTO(hTNF40L)。
gh3hTNF40.4的可变重链区是用相同的方法从载体pγ-4获得的。
PCR引物的序列如下所示：
5’引物：
GCTATCGCAATTGCAGTGGCGCTAGCTGGTTTCGCCACCGTGGCGCAAGCTGAGGTTCAGCTGGTCGAGTCAGGAGGC(SEQ ID NO：81)
3’引物：
GCCTGAGTTCCACGACAC(SEQ ID NO：82)
进行PCR后，纯化产物，用NheI和ApaI酶消化，然后将其亚-克隆载体pDNAbEng-G1(图19)。通过DNA测序加以证实后，用EcoRI酶限制重链，并将其亚-克隆pTTO(hTNF40L)的EcoRI位点，以生产大肠杆菌的表达质粒pTTO(hTNF40)。
修饰Fab表达的基因间序列的优化
在pTTO载体中，修饰的Fab表达是从先编码轻链然后编码重链的双顺反子信息发生的。两个基因(基因间的序列，IGS)间的DNA序列可通过影响转录的起始速率而影响重链的表达水平。例如，短的基因间序列可导致轻链和重链间的转录偶联，其中在完成轻链合成之后，引发重链合成之前，翻译核糖体不可能完全与mRNA分离。任一Shine Dalgarno(SD)核糖体结合位点(与16S rRNA同源)的‘强度’还可影响SD和ATG起始密码子之间的距离和序列组成。ATG周围的mRNA的潜在二级结构是另一个重要的因素；当反向用于SD时，ATG应位于‘环’中，而不应被限制在‘茎区’中。因而通过改进IGS的长度和组成，可修饰转录起始的长度，和重链的生产水平。很可能需获得转录起始的最佳速率，以使所提供修饰Fab重链的表达达到最大值。例如，具有一个修饰的Fab，可容许高水平的表达，但对于具有不同氨基酸序列的不同修饰Fab来说，高水平的表达可能是有毒的，这可能是由于不同的分泌或折叠效率。由于这个原因，设计了一系列4个基因间序列(图20)，可根据经验确定基于hTNF40的修饰的Fab的最佳IGS。IGS1和IGS2具有非常短的基因间序列(分别-1和+1)，可提供紧密偶联的翻译；SD序列(下面划线的部分)稍有不同。这两个序列最可能提供高水平的转录起始。IGS3和IGS4在起始和终止密码子(+13)之间具有较长的距离，且与它们的组成不同；IGS3具有‘较强’的SD序列。研究所有序列的二级结构(使用m/fold程序)并尽可能地使其优化；然而，随着两个链翻译的紧密偶联，核糖体解离的缺少意味着mRNA可以不是裸露的，防止二级结构形成。IGS变体的克隆
图20所示的IGS弹夹具有侧面SacI和MunI克隆位点。它们是通过退火互补的寡核苷酸对而建立的。载体片段是通过用SacI和NotI消化pTTO(hTNF40)而制备的，重链片段是通过用MunI和NotI消化pDNAbEngG1(hTNF40H)而制备的。然后使用两个等量的限制片段，和各约0.05pmoles的退火寡弹夹进行三交连。其产生四个表达质粒pTTO(hTNF40 IGS-1)，pTTO(hTNF40 IGS-2)，pTTO(hTNF40 IGS-3)，pTTO(hTNF40 IGS-4)。
摇瓶表达分析
将上述四个质粒转化大肠杆菌菌株W3110，和原始的表达构造，然后分析摇瓶中的表达。代表性试验的结果在图21中列出。不同的基因间序列提供不同的表达分布。在诱导后1小时，IGS1和IGS2迅速积累胞质的修饰Fab至最大值，之后水平又降低。IGS1的最大值更大，并更急剧地降低。如所期望的这些结构的紧密翻译偶联，这些结果与高水平的合成一致。IGS1较之IGS2明显提供较高水平的重链表达。在这个实施例中，在1小时的峰值之后，因为胞质表达水平降低，所容许的高水平表达较差。这可在IGS1培养物(未标出)的生长分布中见到，下降之前，其在诱导后1小时达到峰值，表明细胞死亡并溶解。在水平降低之前，IGS3更缓慢地累积修饰Fab，其在诱导后2小时达到峰值，但峰值更高(325ng/ml/OD)。此培养物的生长在诱导后又继续了3个小时，并达到更高的峰值生物量(未标出)。其与低水平的重链合成相一致。IGS4仍然以较低的速率积累材料，但与其他三个结构相比，其不能达到其它3个结构的峰值产率。所有IGS变体均显著out-完成原始载体。有关不同的IGS序列提供不同的翻译初始速率的假设是通过这些试验结果支持的。对于hTNF40-修饰的Fab来说，似乎高速率的重链翻译初始耐受较差，因此其不是最佳的。IGS3提供的较低速率产生较好的生长特性，和超时的较好的产率累积。
对比发酵罐中的产率，IGS3结构的产率最高，并将其称为pTTO(CDP870)-见图22。
由质粒pTTO(CDP870)编码的重链具有SEQ ID NO：115所列的序列，轻链具有SEQ ID NO：113所列的序列。
移植了CDR的，hTNF40基-修饰Fab的PEG化作用
纯化的修饰Fab与支链的PEG分子位点-特异性缀合。其可以通过活化修饰Fab的截短铰链区中的单一半胱氨酸残基，接着按照上述(A.P.Chapman等，nature Biotechnology  17，780-783，1999)与(PEG)-赖氨酰马来酰亚胺反应而获得。该PEG化的分子在图13中列出，并将其称为化合物CDP870。
PEG化的移植了CDR的，hTNF40基修饰Fab(CDP870)在治疗类风湿性关节炎中的功效。
CDP870具有约11天的较长半衰期。
我们评估了静脉内CDP870在患RA患者的随机，双盲，安慰剂-对照，给药逐渐升高试验中的安全性和功效。
方法
患者：
患者的年龄在18-75岁之间，满足1987年修订的类风湿性关节炎(RA)的American College of Rheumatology(ACR)诊断标准，上述患者是从位于伦敦，剑桥，诺福克和Norwich(英国)的风湿病诊所的门诊病人中征募的。要求患者具有由至少3个下列标准定义的临床活性疾病：≥6个疼痛或触痛的关节；≥45分钟的早晨的强直；及血沉速率(ESR)≥28mm/hr。它们必须至少对一种疾病改善抗-类风湿药物(DRARD)没有良好的反应，且至少已经4周没有治疗。如果泼尼松龙的给药剂量≥7.5mg/day，则可以给皮质类固醇。怀孕的妇女，哺乳的妇女和未使用有效的避孕方法，可能分娩的妇女被排除在外。具有恶性肿瘤既往史，伴发严重的不可控制的内科病症，TNFα-中和治疗失败的既往史，或对聚乙二醇过敏的患者被排除在外。书面提供的同意书是在登记之前从各患者处得到的。该研究由地方研究伦理委员会证实。
治疗方案：
将36名RA患者分成3组，每位患者均接受给药剂量逐渐增加的试验药物(1，5或20mg/kg)。把每组的12个人随机的分成8个人接受CDP870，4个人接受安慰剂。静脉内单独输注CDP870(总量100ml)超过60分钟。类似地，将100ml安慰剂(醋酸钠缓冲液)静脉内单独输注超过60分钟。在门诊病人的基础上提供治疗。8周之后，所有的患者均有机会开放地接受5或20mg/kg的CDP870的输注。
临床评估：
根据世界卫生组织和International League of Associations forRheumatology(Boers等，J.Rheumatol-Supplement， 41，86-89，1994)和  European League Against  Rheumatism(EULAR)(Scott等，Clin.Exp.Rheumatol.， 10，521-525，1992)用28个关节计数组合的核心数据评估RA的疾病活动性。通过疾病活动性值(Prevoo等，Arthritis Rheum.， 38，44-48，1995)和ACR反应标准(Felson等，Arthritis Rheum.， 38，727-735，1995)评估疾病活动性的变化。在治疗前和治疗后的第1，2，4，6和8周进行评估。而且还评估患者对所研究药物的耐受性和安全性。并且评估了Haematology，生物化学，抗-CDP870抗体和不利事件。
CDP870的血浆浓度和抗-CDP870的抗体：
CDP870是通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测量的。在用重组人TNFα(Strathmann Biotech GmbH，Hannover)包被的微量滴定平板(Nunc)中培养患者血浆的连续稀释液。用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗-人κ轻链(Cappel，ICN)，和四甲基联苯胺(TMB)底物显示捕获的CDP870。
使用生物素化的CDP870作为第二层的双抗原夹层ELISA筛选CDP870的抗体(1/10的血浆稀释度)。使用HRP-链霉抗生物素和TMB底物显示束缚抗体。使用超免疫兔IgG标准校准该测定法。1个单位的活动性等于1μg兔的标准。
统计分析
该研究实质上是探察性的，样品的多少是根据先前相似药剂的经验而确定的。CDP870的功效可通过计算疾病活动性值(DAS)和ACR20/50来分析，其使用闭合的试验方法治疗。疾病的活动性值是按照下列公式计算的：DAS＝0.555x(28个触痛关节)的平方根+0.284x(28个肿胀关节)的平方根+0.7xIn(ESR)+0.0142x(患者的综合评估)。首先，将活性组与安慰剂组进行对比。如果此对比在5％水平是显著的，则将各给药组与安慰剂组对比。所有的对比是双尾的具有5％显著水平的。所有的P值均来源于探察性的分析，且不应用于推论解释。
结果
统计学
征募36个患RA的患者。它们的统计数据在表6中给出。平均年龄56岁，30名患者为女性。患RA的平均时间为13年，21名患者的类风湿因子显阳性。不同组的患者具有相似的统计特性。在盲给药时，6/12用安慰剂治疗的患者因为给药后RA≥4，疾病恶化而退出本研究。2/24用CDP870治疗的患者退出，均为1mg/kg组的，其在给药之后＞4周，RA恶化。其差值在统计学上是显著的(p＝0.009，Fisher精确试验)。
表6：统计数据(平均值±标准偏差)
数   性别(M∶F)   年龄   疾病的持续时间 类风湿因子 以前DMARD的数
  安慰剂1mg/kg5mg/kg20mg/kg     12888     1.111∶72∶62.6   51±859±754±1361±11     12±812±713±514±13   8(67％)4(50％)5(63％)4(50％)     5±14±15±24±2
临床功效：
在给安慰剂，1，5和20mg/kg的CDP870(联合治疗效果p＝0.012)之后第4周，ACR20提高的患者的比例分别为16.7，50，87.5和62.5％，给药后第8周的比例分别为16.7，25，75和75％(p＝0.032)。在给安慰剂，1，5和20mg/kg的CDP870(联合治疗效果p＝0.001)之后第4周，DAS值(中值)降低的比例分别为0.15，1.14，1.91和1.95％，给药后第8周的比例分别为0.31，0.09，2.09和1.76％(p＝0.008)(图23)。世界卫生组织和International League of Associations forRheumatology各成员核心数据值的改变在图24中列出。
给予CDP870的开放标记剂量后，可获得相似的有益效果。上述36个该研究招募的患者，其中的32个患者接受CDP870的第二次输注。第一次输注5和20mg/kg CDP后第4周，ACR20提高的患者的比例为72.2和55.6％，在第8周后为55.6和66.7％。
不利的结果
该治疗可较好地耐受，且没有与输注相关的反应产生。没有关于变态反应或皮疹的报道。在双-盲阶段，在安慰剂，1，5和20mg/kg组中分别有19，38，8和14个不利事件。最普遍的是5个患者中有9次头痛发作(安慰剂组1个，1mg/kg组3个，20mg/kg组1个)。一个接受安慰剂的患者和三个接受CDP870的患者(1个为5mg/kg，2个为20mg/kg)有较弱的呼吸道感染。据报道这些为轻度或中度。他们是用口服抗生素治疗的，且症状在1-2周后消退。1和5mg/kg组的三个患者和20mg/kg组的一个患者在用CDP870治疗之后1-2个月出现泌尿道感染。还有一个严重的不利事件是患者在用1mg/kg的剂量输注3天后，出现颈部疼痛。在4个患者中可见到抗-核抗体的增加：安慰剂组1个(低1/40)，1mg/kg组2个(低1/40，低1/80)，20mg/kg组1个(低1/40)。抗-DNA或抗-心脂质抗体没有变化。CDP870的血浆浓度和抗-CDP870的水平
对于CDP870的所有给药水平来说，峰值血浆浓度出现在输注结束的时候，且血浆浓度水平随着给药的比例而缓慢降低。CDP870的血浆浓度与先前在志愿者中观察到的非常相似，所计算的半衰期约为14天。再-给药时，观察到单一给药输注的相似分布。
单独静脉内输注后，抗-CDP870水平较低或检测不到.
讨论
中和TNFα对于RA来说是一种有效的治疗策略。目前，这种治疗还需要使用生物制剂，如嵌合mAb或可溶性受体/人Fc融合蛋白，但其成本较高。治疗性的TNFα中和剂需要结合具有高亲和力的TNFα，且其具有较长的血浆半衰期，低抗原性和高耐受性及安全性。且它需要接近所有从阻断TNFα受益的RA患者。可达到这些目的的其中一个技术是与大肠杆菌中产生的TNFα结合抗体片段的聚乙二醇相缀合。在初步研究中，我们发现CDP870，PEG化的，抗-TNFα，修饰的Fab，是有效的，且RA患者可很好地耐受。
体外研究证实CDP870具有与鼠科动物抗-TNFα亲代抗体相似的TNFα中和活性。此研究证实CDP870可减轻炎症，并改善RA的症状。将通过ACR20反应标准所测量的5和20mg/kg组(75％，75％)对临床的改善作用与etanercept(60％)(Moreland等，AnnalsInt.Med.， 130，478-486，1999)和infliximab(50％)(Maini等，Lancet， 354，1932-1939，1999)相对照。在中间和最高给药水平进行试验，与前面其它的mAbs(Elliott等，Lancet， 344，1105-1110，1994和Rankin等，Br.J.Rheumatol.， 34，334-342，1995)相比，其治疗效果可持续8周。先前的研究已经证实抗-TNFα抗体的治疗效果与它的血浆半衰期和循环抗体的产生有关(Maini等，ArthritisRheum，38，(增刊)：S186 1995(摘要))。我们的研究则显示CDP870的血浆半衰期为14天，与全抗体的血浆半衰期相等(Rankin等，(supra))，比未缀合的Fab片段的半衰期要长得多。此外，CDP870所产生抗体反应的水平非常低。
本研究的其中一个重要目的是为了检测给予此PEG化Fab的耐受性和安全性。在我们的研究中，CDP870显示了良好的耐受性。虽然进一步的研究还需要评估其长期毒性，但现有技术已经报道过了与etanercept和infliximab有关的脱髓鞘性疾病，感染和皮疹。
总之，CDP870可有效的治疗RA，且其在此短期研究中可很好地耐受。
应当理解，上述实施例仅仅是举例说明，不能用来限制本发明的范围，本发明的范围在下列权利要求中限定。
                     序列表
<110>CELLTECH CHIROSCIENCE LIMITED
<120>生物制品
<130>P021741GB
<140>
<141>
<160>115
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：hTNF40 CDRH1的描述
<400>1
Asp Tyr Gly Met Asn
1               5
<210>2
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：hTNF40/人类杂交CDRH2的描述
<400>2
Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1                5                  10                   15
Gly
<210>3
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：hTNF40 CDRH3的描述
<400>3
Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
 1                5
<210>4
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：hTNF40 CDRL1的描述
<400>4
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
  1               5                  10
<210>5
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：hTNF40 CDRL2的描述
<400>5
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
  1               5
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：hTNF40 CDRL3的描述
<400>6
Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu Thr
  1               5
<210>7
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：hTNF40 CDRH2的描述
<400>7
Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Val Asp Asp Phe Lys
  1               5                  10                  15
Gly
<210>8
<211>321
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(321)
<220>
<223>人工序列：hTNF40-gL1的描述
<400>8
 gac att caa atg acc cag agc cea tcc agc ctg agc gca tct gta gga    48
 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
   1               5                  10                  15
 gac cgg gtc acc atc act tgt aaa gcc agt cag aac gta ggt act aac    96
 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
              20                  25                  30
gta gcc tgg tat cag caa aaa cca ggt aaa gcc cca aaa gcc ctc atc  144
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
         35                  40                  45
tac agt gcc tct ttc ctc tat agt ggt gta cca tac agg ttc agc gga  192
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
tcc ggt agt ggt act gat ttc acc ctc acg atc agt agc ctc cag cca  240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
gaa gat ttc gcc act tat tac tgt caa cag tat aac atc tac cca ctc  288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu
                 85              90                      95
gca ttc ggt cagggt act aaa gta gaa atc aaa                       321
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>9
<211>321
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(321)
<220>
<223>人工序列：hTNF40-gL2的描述
<400>9
gac att caa atg acc cag agc cca tcc agc ctg agc gca tct gta gga  48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
gac cgg gtc acc atc act tgt aaa gcc agt cag aac gta ggt act aac  96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
             20                  25                  30
gta gcc tgg tat cag caa aaa cca ggt aaa gcc cca aaa ctc ctc atc    144
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
         35                  40                  45
tac agt gcc tct ttc ctc tat agt ggt gta cca tac agg ttc agc gga    192
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
tcc ggt agt ggt act gat ttc gcc ctc acg atc agt agc ctc cag cca    240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
gaa gat ttc gcc act tat tac tgt caa cag tat aac atc tac cca ctc    288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu
                 85                  90                  95
aca ttc ggt cag ggt act aaa gta gaa atc aaa                        321
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>10
<211>354
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(354)
<220>
<223>人工序列：gh1hTNF40.4的描述(图10)
<400>10
cag gtg cag ctg gtc cag tca gga gca gag gtt aag aag cct ggt gct   48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
  1               5                  10                  15
tcc gtc aaa gtt tcg tgt aag gcc tca ggc tac gtg ttc aca gac tat   96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
             20                  25                  30
ggt atg aat tgg gtc aga cag gcc ccg gga caa ggc ctg gaa tgg atg   144
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
         35                  40                  45
ggt tgg att aat act tac att gga gag cct att tat gct caa aag ttc   192
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
     50                  55                  60
cag ggc aga gtc acg ttc act cta gac acc tcc aca agc act gca tac   240
Gln Gly Arg Val Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
atg gag ctg tca tct ctg aga tcc gag gac acc gca gtg tac tat tgt   288
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
gct aga gga tac aga tct tat gcc atg gac tac tgg ggc cag ggt acc   336
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
cta gtc aca gtc tcc tca                                           354
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>11
<211>354
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(354)
<220>
<223>人工序列：gh3hTNF40.4的描述(图11)
<400>11
gag gtt cag ctg gtc gag tca gga ggc ggt ctc gtg cag cct ggc gga  48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
  1               5                  10                  15
tca ctg aga ttg tcc tgt gct gca tct ggt tac gtc ttc aca gac tat  96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
             20                  25                  30
gga atg aat tgg gtt aga cag gcc ccg gga aag ggc ctg gaa tgg atg  144
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
         35                  40                  45
ggt tgg att aat act tac att gga gag cct att tat gct gac agc gtc  192
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val
     50                  55                  60
aag ggc aga ttc acg ttc tct cta gac aca tcc aag tca aca gca tac  240
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
ctc caa atg aat agc ctg aga gca gag gac acc gca gtg tac tat tgt  288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
gct aga gga tac aga tct tat gcc atg gac tac tgg ggc cag ggt acc  336
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
cta gtc aca gtc tcc tca                                          354
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>12
<211>9
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：部分引物序列的描述
<400>12
gccgccacc                                                       9
<210>13
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CH1的描述
<400>13
atgaaatgca gctgggtcat sttctt                                          26
<210>14
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CH2的描述
<400>14
atgggatgga gctrtatcat sytctt                                          26
<210>15
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CH3的描述
<400>15
atgaagwtgt ggttaaactg ggtttt                                          26
<210>16
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CH4的描述
<400>16
atgractttg ggytcagctt grt                                             23
<210>17
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CH5的描述
<400>17
atggactcca ggctcaattt agtttt                                           26
<210>18
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CH6的描述
<400>18
atggctgtcy trgsgctrct cttctg                                           26
<210>19
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CH7的描述
<400>19
atggratgga gckggrtctt tmtctt                                           25
<210>20
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CH8的描述
<400>20
atgagagtgc tgattctttt gtg                                             23
<210>21
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CH9的描述
<400>21
atggmttggg tgtggamctt gctatt                                          26
<210>22
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CH10的描述
<400>22
atgggcagac ttacattctc attcct                                          26
<210>23
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CH11的描述
<400>23
atggattttg ggctgatttt ttttattg                                        28
<210>24
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CH12的描述
<400>24
atgatggtgt taagtcttct gtacct                                       26
<210>25
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物5’端
<400>25
gcgcgcaagc ttgccgccac c                                            21
<210>26
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CL1的描述
<400>26
atgaagttgc ctgttaggct gttggtgct                                    29
<210>27
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CL2的描述
<400>27
atggagwcag acacactcct gytatgggt                                    29
<210>28
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CL3的描述
<400>28
 atgagtgtgc tcactcaggt cct                                           23
<210>29
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CL4的描述
<400>29
atgaggrccc ctgctcagwt tyttgg                                        26
<210>30
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CL5的描述
<400>30
atggatttwc aggtgcagat twtcagctt                                     29
<210>31
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CL5A的描述
<400>31
atggatttwc argtgcagat twtcagctt                                    29
<210>32
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CL6的描述
<400>32
atgaggtkcy ytgytsagyt yctgrg                                       26
<210>33
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CL7的描述
<400>33
atgggcwtca agatggagtc aca                                          23
<210>34
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CL8的描述
<400>34
atgtggggay ctktttycmm tttttcaat                                    29
<210>35
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CL9的描述
<400>35
 atggtrtccw casc tcagtt cctt                                       24
<210>36
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CL10的描述
<400>36
atgtatatat gtttgttgtc tatttc                                      26
<210>37
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CL11的描述
<400>37
atggaagccc cagctcagct tctctt                                      26
<210>38
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CL12A的描述
<400>38
atgragtywc agacccaggt cttyrt                                      26
<210>39
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CL12B的描述
<400>39
atggagacac attctcaggt ctttgt                                      26
<210>40
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CL13的描述
<400>40
atggattcac aggcccaggt tcttat                                     26
<210>41
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CL14的描述
<400>41
atgatgagtc ctgcccagtt cctgtt                                     26
<210>42
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CL15的描述
<400>42
atgaatttgc ctgttcatct cttggtgct                                  29
<210>43
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CL16的描述
<400>43
atggattttc aattggtcct catctcctt                                  29
<210>44
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CL17A的描述
<400>44
atgaggtgcc tarctsagtt cctgrg                                    26
<210>45
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CL17B的描述
<400>45
atgaagtact ctgctcagtt tctagg                                    26
<210>46
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CL17C的描述
<400>46
atgaggcatt ctcttcaatt cttggg                                    26
<210>47
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物5’端
<400>47
ggactgttcg aagccgccac c                                         21
<210>48
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物CL12的描述
<400>48
ggatacagtt ggtgcagcat ccgtacgttt                                 30
<210>49
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物R2155的描述
<400>49
gcagatgggc ccttcgttga ggctgmrgag acdgtga                        37
<210>50
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物R1053的描述
<400>50
gctgacagac taacagactg ttcc                                      24
<210>51
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物R720的描述
<400>51
gctctcggag gtgctcct                                             18
<210>52
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：寡核苷酸P7982的描述
<400>52
gaattcaggg tcaccatcac ttgtaaagcc agtcagaacg taggtactaa cgtagcctgg 60
tatcagcaaa                                                        70
<210>53
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：寡核苷酸P7983的描述
<400>53
atagaggaaa gaggcactgt agatgagggc ttttggggct ttacctggtt tttgctgata 60
ccaggctacg t                                                      71
<210>54
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：寡核苷酸P7984的描述
<400>54
tacagtgcct ctttcctcta tagtggtgta ccatacaggt tcagcggatc cggtagtggt 60
actgatttca c                                                      71
<210>55
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：寡核苷酸P7985的描述
<400>55
gacagtaata agtggcgaaa tcttctggct ggaggctact gatcgtgagg gtgaaatcag 60
taccactacc g                                                      71
<210>56
<211>89
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：寡核苷酸P7986的描述
<400>56
atttcgccac ttattactgt caacagtata acatctaccc actcacattc ggtcagggta 60
ctaaagtaga aatcaaacgt acggaattc                                   89
<210>57
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：寡核苷酸P7981的描述
<400>57
gaattcaggg tcaccatcac ttgtaaagcc                                  30
<210>58
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：寡核苷酸P7980的描述
<400>58
gaattccgta cgtttgattt ctactttagt                                  30
<210>59
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：寡核苷酸R1053的描述
<400>59
 gctgacagac taacagactg ttcc                                       24
<210>60
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：寡核苷酸R5350的描述
<400>60
tctagatggc acaccatctg ctaagtttga tgcagcatag atcaggagct taggagc    57
<210>61
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：寡核苷酸R5349的描述
<400>61
gcagatggtg tgccatctag attcagtggc agtggatcag gcacagactt taccctaac  59
<210>62
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：寡核苷酸R684的描述
<400>62
ttcaactgct catcagat                                               18
<210>63
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物P7989的描述
<400>63
gaagcaccag gcttcttaac ctctgctcct gactggacca gctgcacctg agagtgcacg 60
aattc                                                             65
<210>64
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物P7990的描述
<400>64
ggttaagaag cctggtgctt ccgtcaaagt ttcgtgtaag gcctcaggct acgtgttcac 60
agactatggt a                                                      71
<210>65
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物P7991的描述
<400>65
ccaacccatc catttcaggc cttgtcccgg ggcctgcttg acccaattca taccatagtc 60
tgtgaacacg t                                                      71
<210>66
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物P7995的描述
<400>66
ggcctgaaat ggatgggttg gattaatact tacattggag agcctattta tgttgacgac 60
ttcaagggca gattcacgtt c                                           81
<210>67
<211>56
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物P7992的描述
<400>67
ccatgtatgc agtgcgttgt ggaggtgtct agagtgaacg tgaatctgcc cttgaa    56
<210>68
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物P7993的描述
<400>68
ccacaagcac tgcatacatg gagctgtcat ctctgagatc cgaggacacc gcagtgtact 60
at                                                                62
<210>69
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物P7994的描述
<400>69
 gaattcggta ccctggcccc agtagtccat ggcataagat ctgtatcctc tagcacaata 60
 gtacactgcg gtgtcctc                                               78
<210>70
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物P7988的描述
<400>70
gaattcgtgc actctcaggt gcagctggtc                                   30
<210>71
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物P7987的描述
<400>71
gaattcggta ccctggcccc agtagtccat                                   30
<210>72
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物P7999的描述
<400>72
gatccgccag gctgcacgag accgcctcct gactcgacca gctgaacctc agagtgcacg 60
aattc                                                             65
<210>73
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物P8000的描述
<400>73
tctcgtgcag cctggcggat cgctgagatt gtcctgtgct gcatctggtt acgtcttcac 60
agactatgga a                                                      71
<210>74
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物P8001的描述
<400>74
ccaacccatc catttcaggc cctttcccgg ggcctgctta acccaattca ttccatagtc60
tgtgaagacg t                                                     71
<210>75
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物P7997的描述
<400>75
ggaggtatgc tgttgacttg gatgtgtcta gagagaacgt gaatctgccc ttgaa       55
<210>76
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物P7998的描述
<400>76
ccaagtcaac agcatacctc caaatgaata gcctgagagc agaggacacc gcagtgtact  60
at                                                                 62
<210>77
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物P7993的描述
<400>77
gaattcggta ccctggcccc agtagtccat ggcataagat ctgtatcctc tagcacaata 60
gtacactgcg gtgtcctc                                               78
<210>78
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物P7996的描述
<400>78
gaattcgtgc actctgaggt tcagctggtc                                  30
<210>79
<211>74
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：5’引物
<400>79
cgcgcggcaa ttgcagtggc cttggctggt ttcgctaccg tagcgcaagc tgacattcaa 60
atgacccaga gccc                                                   74
<210>80
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：3’引物
<400>80
ttcaactgct catcagatgg                                             20
<210>81
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：5’引物
<400>81
gctatcgcaa ttgcagtggc gctagctggt ttcgccaccg tggcgcaagc tgaggttcag 60
ctggtcgagt caggaggc                                               78
<210>82
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：3’引物
<400>82
gcctgagttc cacgacac                                           18
<210>83
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：人类1组共有序列的构架L1的描述
<400>83
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
             20
<210>84
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：hTNF40的构架L1的描述
<400>84
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
             20
<210>85
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：人类1组共有序列的构架L2的描述
framework L2
<400>85
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
  1               5                  10                  15
<210>86
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：hTNF40的构架L2的描述
<400>86
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile Tyr
  1               5                  10                  15
<210>87
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：人类1组共有序列的构架L3的描述
<400>87
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
  1               5                  10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
             20                  25                  30
<210>88
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：hTNF40的构架L3的描述
<400>88
Gly Val Pro Tyr Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
 1                5                  10                  15
Leu Thr Ile Ser Thr Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys
             20                  25                  30
<210>89
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：人类1组共有序列的构架L4的描述
<400>89
 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
  1                5                  10
<210>90
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：hTNF40的构架L4的描述
<400>90
 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
   1               5                  10
<210>91
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：人类1组共有序列的构架H1的描述
<400>91
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
  1               5                  10                  15
SerVal Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
            20                  25                  30
<210>92
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：hTNF40的构架H1的描述
<400>92
 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
   1               5                  10                  15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr
             20                  25                  30
<210>93
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：人类1组共有序列的构架H2的描述
<400>93
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
  1               5                  10
<210>94
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：hTNF40的构架H2的描述
<400>94
Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Ala Phe Lys Trp Met Gly
  1               5                  10
<210>95
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：人类1组共有序列的构架H3的描述
<400>95
Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
  1               5                  10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
             20                  25                  30
<210>96
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：hTNF40的构架H3的描述
<400>96
Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe Leu Gln
  1               5                  10                  15
Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg
             20                  25                  30
<210>97
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：人类1组共有序列的构架H4的描述
<400>97
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
  1               5                  10
<210>98
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：hTNF40的构架H4的描述
<400>98
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
  1               5                  10
<210>99
<211>324
<212>DNA
<213>鼠科动物
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(324)
<223>小鼠hTNF40轻链的可变域
<400>99
 gac att gtg atg acc cag tct caa aaa ttc atg tcc aca tca gta gga  48
 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
   1               5                  10                  15
 gac agg gtc agc gtc acc tgc aag gcc agt cag aat gtg ggt act aat  96
 Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
             20                  25                  30
gta gcc tgg tat caa cag aaa cca gga caa tct cct aaa gca ctg att    144
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
         35                  40                  45
tac tcg gca tcc ttc cta tat agt gga gtc cct tat cgc ttc aca ggc    192
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Thr Gly
     50                  55                  60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc arc agc act gtg cag tct    240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Thr Val Gln Ser
 65                  70                  75                  80
gaa gac ttg gca gag tat ttc tgt cag caa tat aac atc tat cct crc    288
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu
                 85                  90                  95
acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa cgt                    324
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
            100                 105
<210>100
<211>354
<212>DNA
<213>鼠科动物
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(354)
<223>小鼠hTNF40重链的可变域
<400>100
 cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gagctg aag aag cct gga gag   48
 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
   1               5                  10                  15
 aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tot gga tat gtt ttc aca gac tat  96
 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
              20                  25                  30
 gga atg aat tgg gtg aag cag get cca gga aag gct ttc aag tggatg   144
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Ala Phe Lys Trp Met
         35                  40                  45
ggc tgg ata aac acc tac att gga gag cca ata tat gtt gat gac ttc  192
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Val Asp Asp Phe
     50                  55                  60
aag gga cga ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc act gcc ttt  240
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe
 65                  70                  75                  80
ttg cag atc aac aac ctc aaa aat gag gac acg gct aca tat ttc tgt  288
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                 85                  90                  95
gca aga ggt tac cgg tcc tat gct atg gac tac tgg ggt caa gga acc  336
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
tca gtc acc gtc tct tca                                          354
Ser Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>101
<211>84
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(29)..(67)
<223>人工序列：OmpA寡核苷酸连接物的描述
<400>101
tcgagttcta gataacgagg cgtaaaaa atg aaa aag aca gct atc gca att  52
                               Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile
                                 1               5
 gca gtg gcc ttg gct ctgacgtacg agtcagg                         84
 Ala Val Ala Leu Ala
      10
<210>102
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(2)..(40)
<220>
<221>CDS
<222>(43)..(66)
<220>
<223>人工序列：IGS弹夹-1的描述
<400>102
g agc tca cca gta aca aaa agt ttt aat aga gga gag tgt ta atg aag  48
  Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys    Met Lys
    1               5                   10                    15
aag act gct ata gca att g                                         67
Lys Thr Ala Ile Ala Ile
                 20
<210>103
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(2)..(43)
<220>
<221>CDS
<222>(45)..(68)
<220>
<223>人工序列：IGS弹夹-2的描述
<400>103
g agc tca cca gta aca aaa agt ttt aat aga ggg gag tgt taa a atg  47
  Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys       Met
    1               5                  10                    15
aag aag act gct ata gca att g                                    69
Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile
                 20
<210>104
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(2)..(43)
<220>
<221>CDS
<222>(57)..(80)
<220>
<223>人工序列：IGS弹夹-3的描述
<400>104
g agc tca cca gta aca aaa agc ttt aat aga gga gag tgt tga       43
  Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    1               5                  10
ggaggaaaaa aaa atg aag aaa act gct ata gca att g                81
               Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile
                15                  20
<210>105
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(2)..(43)
<220>
<221>CDS
<222>(57)..(80)
<220>
<223>人工序列：IGS弹夹-4的描述
<400>105
g agc tca cca gta aca aaa agt ttt aat aga gga gag tgt tga    43
  Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    1               5                  10
cgaggattat ata atg aag aaa act gct ata gca att g             81
               Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile
                15                  20
<210>106
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：人类3组共有序列的构架H1的描述
<400>106
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
  1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
             20                  25                  30
<210>107
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：人类3组共有序列的构架H2的描述
<400>107
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1                  5                     10
<210>108
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：人类3组共有序列的构架H3的描述
<400>108
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
  1               5                  10                  15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
             20                  25                  30
<210>109
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：人类3组共有序列的构架H4的描述
<400>109
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
  1               5                  10
<210>110
<211>648
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Fab的移植重链
<400>   110
gaggttcagc tggtcgagtc aggaggcggt ctcgtgcagc ctggcggatc actgagattg  60
tcctgtgctg catctggtta cgtcttcaca gactatggaa tgaattgggt tagacaggcc  120
ccgggaaagg gcctggaatg gatgggttgg attaatactt acattggaga gcctatttat  180
gctgacagcg tcaagggcag attcacgttc tctctagaca catccaagtc aacagcatac  240
ctccaaatga atagcctgag agcagaggac accgcagtgt actattgtgc tagaggatac  300
agatcttatg ccatggacta ctggggccag ggtaccctag tcacagtctc ctcagcttcc  360
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca  420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac  480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc  540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc  600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtcgaca agaaagtt               648
<210>111
<211>216
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Fab的移植重链
<400>111
 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
 1               5                   10                  15
 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
             20                  25                  30
 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
         35                  40                  45
 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val
     50                  55                  60
 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
 Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
             100                 105                 110
 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
        115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
    130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                  155                160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
            180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
        195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
    210                 215
<210>112
<211>642
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Fab的移植轻链和修饰的Fab
<400>112
 gacattcaaa tgacccagag cccatccagc ctgagcgcat ctgtaggaga ccgggtcacc  60
 atcacttgta aagccagtca gaacgtaggt actaacgtag cctggtatca gcaaaaacca  120
 ggtaaagccc caaaagccct catctacagt gcctctttcc tctatagtgg tgtaccatac  180
 aggttcagcg gatccggtag tggtactgat ttcaccctca cgatcagtag cctccagcca  240
 gaagatttcg ccacttatta ctgtcaacag tataacatct acccactcac attcggtcag  300
 ggtactaaag tagaaatcaa acgtacggta gcggccccat ctgtcttcat cttcccgcca  360
 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat  420
 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag  480
 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg  540
 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc  600
 ctgagctcac cagtaacaaa aagctttaat agaggagagt gt                     642
<210>113
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Fab的移植轻链和修饰的Fab
<400>113
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                170                  175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                185                  190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 5er
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
   210
<210>114
<211>687
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>修饰Fab的移植重链
<400>114
gaggttcagc tggtcgagtc aggaggcggt ctcgtgcagc ctggcggatc actgagattg  60
tcctgtgctg catctggtta cgtcttcaca gactatggaa tgaattgggt tagacaggcc  120
ccgggaaagg gcctggaatg gatgggttgg attaatactt acattggaga gcctatttat  180
gctgacagcg tcaagggcag attcacgttc tctctagaca catccaagtc aacagcatac  240
ctccaaatga atagcctgag agcagaggac accgcagtgt actattgtgc tagaggatac  300
agatcttatg ccatggacta ctggggccag ggtaccctag tcacagtctc ctcagcttcc  360
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca  420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac  480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc  540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc  600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtcgaca agaaagttga gcccaaatct  660
tgtgacaaaa ctcacacatg cgccgcg                                      687
<210>115
<211>229
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>修饰Fab的移植重链
<400>115
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val
     50                  55                 60
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met AspTyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
        115                120                  125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
    130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
            180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
        195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
    210                 215                 220
His Thr Cys Ala Ala
225

Claims (53)

1.一种对人TNFα具有特异性的抗体分子，其包含一个重链，其中的可变域包含一CDR，该CDR包含至少一个CDRH1的SEQ ID NO：1，CDRH2的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7，或CDRH3的SEQ ID NO：3；和一个轻链，其中的可变域包含一CDR，该CDR包含至少一个CDRL1的SEQ ID NO：4，CDRL2的SEQ ID NO：5，或CDRL3的SEQ ID NO：6。
2.如权利要求1的抗体分子，其包含CDRH1的SEQ ID NO：1，CDRH2的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7，CDRH3的SEQ ID NO：3，CDRL1的SEQID NO：4，CDRL2的SEQ ID NO：5，和CDRL3的SEQ ID NO：6。
3.如权利要求2的抗体分子，其包含CDRH2的SEQ ID NO：2。
4.如权利要求1的抗体分子，其中重链可变域的人受体构架区是以人类1组共有序列为基础的，且包含28，69和71位的非-人供体残基。
5.如权利要求1的抗体分子，其中重链可变域的人受体构架区是以人类1组共有序列为基础的，且包含28，38，46，67，69和71位的非-人供体残基。
6.如权利要求1的抗体分子，其中重链可变域的人受体构架区是以人类3组共有序列为基础的，且包含27，28，30，48，49，69，71，73，76和78位的非-人供体残基。
7.如权利要求1的抗体分子，其中轻链可变域的人受体构架区是以人类1组共有序列为基础的，且包含46和60位的非-人供体残基。
8.如权利要求1的抗体分子，其包含如SEQ ID NO：8所示的轻链可变域hTNF40-gL1和如SEQ ID NO：11所示的重链可变域gh3hTNF40.4。
9.如权利要求1的抗体分子，其是一种Fab片段。
10.如权利要求9的抗体分子，其是一种Fab片段，其中包含一个具有SEQ ID NO：111所列序列的重链和一个具有SEQ ID NO：113所列序列的轻链。
11.如权利要求1的抗体分子，其是一种修饰的Fab片段，该片段重链的C-端具有一个或多个氨基酸，允许与效应分子或报道分子相连接。
12.如权利要求11的抗体分子，其中附加的氨基酸形成含一个或两个半胱氨酸残基的修饰铰合区，效应分子或报道分子可与之相连接。
13.如权利要求8的抗体分子，其是一种修饰的Fab片段，该片段含一个具有SEQ ID NO：115所列序列的重链，和一个具有SEQ IDNO：113所列序列的轻链。
14.如权利要求1的抗体，其是鼠抗-TNFα的单克隆抗体hTNF40。
15.如权利要求1的抗体分子，其是一种嵌合抗体分子，其中含权利要求14的单克隆抗体的轻链可变域和重链可变域。
16.权利要求1的抗体分子，所示抗体分子包含杂种CDR，该杂种CDR包含被平截了1-8个氨基酸的供体CDR序列，其中CDR序列的缺失部分来源于具有共有序列构架区的种系抗体，供体CDR的缺失部分可用不同的序列代替，并形成一功能性的CDR，且重链的CDRH2是在抗体分子中杂交的。
17.如权利要求16的抗体分子，其中平截4-6个氨基酸。
18.如权利要求16的抗体分子，其中在CDR的C-端进行平截。
19.如权利要求1的抗体分子，其中轻链包含SEQ ID NO：113所列序列。
20.如权利要求1的抗体分子，其中轻链由SEQ ID NO：113所列序列组成。
21.如权利要求1的抗体分子，其中重链包含SEQ ID NO：115所列序列。
22.如权利要求1的抗体分子，其中重链由SEQ ID NO：115所列序列组成。
23.一种对人TNFα具有特异性的抗体分子，其具有一个含SEQ IDNO：113所列序列的轻链，和一个含SEQ ID NO：115所列序列的重链。
24.一种对人TNFα具有特异性的抗体分子，其具有一个由SEQ IDNO：113所列序列组成的轻链，和一个由SEQ ID NO：115所列序列组成的重链。
25.一种含权利要求11-13和19-24中任意一项抗体分子的化合物，具有共价连接到抗体分子重链C-端的一个氨基酸上或抗体分子重链C-端的效应分子或报道分子。
26.如权利要求25的化合物，其包含一种效应分子。
27.如权利要求26的化合物，其中的效应分子包含一种或多种聚合物。
28.如权利要求27的化合物，其中的一种或多种聚合物是任选取代的直链或支链聚亚烷基，聚亚烯基或聚亚氧烷基的聚合物，或支链或无支链的多糖。
29.如权利要求28的化合物，其中的一种或多种聚合物是甲氧基聚乙二醇。
30.一种含权利要求13的抗体分子的化合物，其中位于抗体分子重链C-端的其中一个半胱氨酸残基与赖氨酰-马来酰亚胺基相连接，其中各个赖氨酰残基的氨基共价连接到具有约20,000Da分子量的甲氧基聚乙二醇上。
31.一种含对人TNFα具有特异性的抗体分子的化合物，其具有一个含SEQ ID NO：113所列序列的轻链，和一个含SEQ ID NO：115所列序列的重链，位于抗体分子重链C-端的其中一个半胱氨酸残基与一种或多种合成或天然存在的聚合物相连接。
32.一种含对人TNFα具有特异性的抗体分子的化合物，其具有一个由SEQ ID NO：113所列序列组成的轻链，和一个由SEQ ID NO：115所列序列组成的重链，位于抗体分子重链C-端的其中一个半胱氨酸残基与一种或多种合成或天然存在的聚合物相连接。
33.一种含权利要求19的抗体分子的化合物，其具有与位于重链C-端的一个半胱氨酸残基相连接的赖氨酰-马来酰亚胺基，其中各个赖氨酰残基的氨基共价连接到具有约20,000Da分子量的甲氧基聚乙二醇残基上。
34.一种含权利要求20的抗体分子的化合物，其具有与位于重链C-端的一个半胱氨酸残基相连接的赖氨酰-马来酰亚胺基，其中各个赖氨酰残基的氨基共价连接到具有约20,000Da分子量的甲氧基聚乙二醇残基上。
35.一种含权利要求21的抗体分子的化合物，其具有与位于重链C-端的一个半胱氨酸残基相连接的赖氨酰-马来酰亚胺基，其中各个赖氨酰残基的氨基共价连接到具有约20,000Da分子量的甲氧基聚乙二醇残基上。
36.一种含权利要求22的抗体分子的化合物，其具有与位于重链C-端的一个半胱氨酸残基相连接的赖氨酰-马来酰亚胺基，其中各个赖氨酰残基的氨基共价连接到具有约20,000Da分子量的甲氧基聚乙二醇残基上。
37.一种含对人TNFα具有特异性的抗体分子的化合物，其具有一个含SEQ ID NO：113所列序列的轻链和一个含SEQ ID NO：115所列序列的重链，位于抗体分子重链C-端的其中一个半胱氨酸残基与赖氨酰-马来酰亚胺基相连接，其中各个赖氨酰残基的氨基共价连接到具有约20,000Da分子量的甲氧基聚乙二醇残基上。
38.一种含对人TNFα具有特异性的抗体分子的化合物，其具有一个由SEQ ID NO：113所列序列组成的轻链和一个由SEQ ID NO：115所列序列组成的重链，位于抗体分子重链C-端的其中一个半胱氨酸残基与赖氨酰-马来酰亚胺基相连接，其中各个赖氨酰残基的氨基共价连接到具有约20,000Da分子量的甲氧基聚乙二醇残基上。
39.一种编码权利要求1、16或24中任意一项的抗体分子的重链和轻链的DNA序列。
40.如权利要求39的DNA序列，其包含SEQ ID NO：8或112所列的序列与SEQ ID NO：10、11、110或114所列的序列。
41.一种含权利要求39的DNA序列的克隆或表达载体。
42.一种含权利要求39-40中任意一项DNA序列的大肠杆菌表达载体。
43.如权利要求42的大肠杆菌表达载体，其是插入了CDP870基因的载体pTTO。
44.一种用权利要求41-43任意一项载体转化的宿主细胞。
45.一种生产权利要求1、16或24中任意一项抗体分子的方法，包含培养权利要求44的宿主细胞，并分离该抗体分子。
46.一种生产权利要求1、16或24中任意一项抗体分子的方法，包括培养含大肠杆菌表达载体的大肠杆菌，其中该大肠杆菌表达载体含权利要求41的DNA序列，并分离该抗体分子。
47.如权利要求46的方法，其中该抗体分子被导向胞质。
48.一种治疗或诊断组合物，其包含权利要求1、16或24中任意一项的抗体分子或权利要求25的化合物。
49.对人TNFα具有特异性的，权利要求1、16或24中任意一项的抗体分子，或权利要求25的化合物在制备治疗TNFα介导的病状的药物中的用途。
50.如权利要求49的用途，其中的病状是类风湿性关节炎或骨关节炎。
51.载体pDNAbEng-G1。
52.插入了CDP870基因的载体pTTO。
53.一种多肽，所述多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO：1-7中任意一个所列氨基酸序列。
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