[go: up one dir, main page]

HU230561B1 - Humán tumor nekrózis faktor-alfa specifikus antitest molekulák és alkalmazásuk - Google Patents

Humán tumor nekrózis faktor-alfa specifikus antitest molekulák és alkalmazásuk Download PDF

Info

Publication number
HU230561B1
HU230561B1 HU0202346A HUP0202346A HU230561B1 HU 230561 B1 HU230561 B1 HU 230561B1 HU 0202346 A HU0202346 A HU 0202346A HU P0202346 A HUP0202346 A HU P0202346A HU 230561 B1 HU230561 B1 HU 230561B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
seq
sequence
antibody molecule
group
antibody
Prior art date
Application number
HU0202346A
Other languages
English (en)
Inventor
Diljeet Singh Athwal
Derek Thomas Brown
Andrew Neil Charles Weir
Andrew George Popplevell
Andrew Paul Chapman
David John King
Original Assignee
Ucb Pharma S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9893121&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU230561(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ucb Pharma S.A. filed Critical Ucb Pharma S.A.
Publication of HUP0202346A2 publication Critical patent/HUP0202346A2/hu
Publication of HUP0202346A3 publication Critical patent/HUP0202346A3/hu
Publication of HU230561B1 publication Critical patent/HU230561B1/hu
Priority to HUS1700013C priority Critical patent/HUS1700013I1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Compression Of Band Width Or Redundancy In Fax (AREA)

Description

Humán tumor nekrózis faktor-alfa specifikus antitest molekulák és alkalmazásuk
A találmány olyan antitest molekulára vonatkozik, amely a humán tumor nekrózis faktor-alfa (THFö) antigén-determinánsaira specifikus, A találmány az nolekuia terápiás alkalmazására és az antitest molekula előállítási is vonatkozik,
A találmány tárgyát antitest molekulák képezik. Egy antitest molekula két nehéz láncbél és két könnyű láncból áll, Mindkét nehéz lánc és mindkét könnyű lánc Ntermmális vége variábilis domént tartalmaz. Az egyes variábilis dóménak négy-négy framework régióból (FRs) állnak váltakozva három komplementaritást meghatározó régióval (complementanty determining regions ~ CÖRs). A variábilis doménekben lévő csoportok a Kábát és munkatársai által kidolgozott rendsj megfelelően, megállapodás szerint vannak számozva, A rendszert a köt kiadvány Ismerteti: Kábát et at: Sequences of Proteins of Immunoi
US Oepartrnent of Health and Humán Services, IMIK, USA (1987) [a tövéi „Kabaf ef al. Csupra}”]. Ezt a számozási rendszert használjuk ebben a leírásban, ha másként nem jelezzük.
A Kabaf féle csoport jelölések nem mindig egyeznek meg pontosan az aminosavosoportek (amlnosavmaradékok) lineáris számozásával, A tényleges lineáris áminosavszekvenoia kevesebb vagy több aminosavaf tartalmazhat a A féle xSzámozáshoz képest, annak megfelelően, hogy az alap ábilis dómén szerkezet egy szerkezeti komponenséi - akár
A csoportok helyes Kabaf számozását egy adott antitestre égy lehet znfi hogy az antitest, szekvenciájában a homológ csoportokat összeigazifjuk egy „standard” Kábát szerint számozott szekvenciával.
A nehéz lánc variábilis dómén CDR-ei a 31-35-Os csoportnál (CDRH1), 5055-ös csoportnál (CDRH2) és 95-102-ös csoportnál (CDRH3) helyezkednek el a Kabát számozás szerint.
önnyű lánc variábilis donién CDR~ei a 24~34~es csoportnál (CDRL1), 50(CORL2) és S9-97-es csoportnál (CDRL3) helyezkednek el a
Kabát számozás szerint.
ÜDR~heültetett antitestek előállítását iga le az EP-A-023940Ö számú szabadalmi bejelentés, amely egy olyan eljárást ismertet, amelyben egy egér monoklonálls antitest CDR-eít egy humán immunglobulin variábilis doniénjeinek régióiba ültetik be helyre irányúié
használva. A CDR-ek határozzák meg az antitestek antígénkbfö fioitásat Ezek viszonylag rövid peptíd szekvenciák, amelyeket a variábilis bőmének framework régiéi hordoznak.
onálls antitestek CÖR-beültetéssel való humanizálását célzó szintetikus antigéneket - ilyen például az HP - felismerő monoklonálls antitestekkel végezték. Azonban olyan példákat, amelyekben lizozimet felismerő egér monoklonálls antitestet és humán T-sejteken lévő antigént felismerő patkány monoklonálls antitestet humanizáltak CÖR beültetéssel, Verhoeyen és munkatársai (Vedioeyen ef al., Science, 23R. 1534-1536 (1988)]
Riechmann és munkatársai megállapították, hegy egyedül a COR-rek átvitele [amint azt Kábát (Kabát et al., iásd fent) és Wu ef al. (J.Exp. kled., 132, 211-250 (1970) leírták] nem elégséges ahhoz, hogy kielégítő antigén kötő aktivitást biztosítson a CDR-heulíefetf termék számára. Azt találták, hogy számos framework csoportot meg kellett változtatni ahhoz, hogy megfeleljenek a donor framework régió csoportjainak. A WO 9Ö/Ű7861 számú nemzetközi közzétételi irat ajánlott kritériumokat tartalmaz azon framework csoportok kiválasztásához, amelyeket meg kell változtatni.
olyan összefoglald közleményt publikáltak, amef ágyainak, beleértve Vaughan és al., Natúré Bíofechooíogy, 15, 535-539 (1998)].
A TNPo egy pro-lnflammaíoríkus cifokin, amelyet az Immunrendszer sejtjei bocsátanak ki és amely az immunrendszer sejtjeivel kölcsönhat;.......
TNFo-t olyan makroíágok termelik, amelyeket Gram negatív v* lípopollszachandjal (I..PS) aktiváltak, ügy tűnik, hogy a
3--
hs szepszsssei ja re és pafegenaziséhen. Azt is kimutatták, hogy a TNFa számos humán betegségben felszaporodik, beleértve az olyan krónikus betegségeket, mint a rheumatoid arthritis, Crohn betegség, celitís ulcercsa és a scierosls multiplex. Humán TNFa transzgenikus egerek természetüknél fogva nagy mennyiségű TNFet termelnek és egy rheumatoid arthritishez hasonló spontán, destruktív poíiarthritíst fejlesztenek k·' [Koffer et el., FMBÖ d.. 10, 492Ö-4931 (1991)]. A TNFo-t ezért pro-inflammaiorikus citeklnnek nevezik.
Megelőzőleg már leírtak TNFe elleni monoklonélis antitesteket. Meager és munkatársai [Meager ét el, Hybridoma. 6, 3S9-37Ö (1987)] leírták a rekombináns TNFo elleni monoklonélis antitestek alkalmazását, ugyanakkor meghatározták a TNF~en lévő neufrallzáló epltópokat. Shimafömo és munkatársai [immunology Lellers, 17, 311-318 (1088)] TNFa elleni egér monoklonélis antitestek alkalmazásáról és égésekben endotoxikus sokk megelőzésére veié használatáról írtak. Ezenkívül a WO 32/11383 számú nemzetközi közzétételi irat TNFowra specifikus rekombináns antitestekre - beleértve a COR-heüitefetf antitesteket vonatkozik. Rankin és munkatársai [British J. Rheumafölcgy, 34Λ 334-342 (1995)] ilyen CDR-beülfefett antitestek rheumatoid arthritis kezelésében veié alkalmazását írták le. Az US-A-5 313 432 számú szabadalmi leírás anti-TNF kimére antitestekre és TNF jelenlétével összefüggő kóros állapotok kezelésében való alkalmazásukra
A TNFa elleni antitesteket endotoxikus sokk megelőzésére és kezelésére már javasolták (Bentler et al,, Science, 234, 470-474 (1985)]. Bcdmer és munkatársai [Critioal Case Medicina, 21, S441-S448 (1993)], valamint Wberry és munkatársai [Critioal Care Médiumé, .21., S438-S44Ö (1933)1 szeptikus sokk kezelésében az anti-TNFo antitestek terápiás potenciáljáról értekeztek. Az antiTNFa antitestek szeptikus sokk kezelésére való alkalmazását Kirsohenbaum és munkatársai ÍCritieal Care Medioine, 26,1625-1626 (1998)] is taglalták. Kollagénis
s.«it arthritis hatékonyan kezelhető anti-TNFo monokf alkalmazásával [Williams et al., RNÁS-USÁ, 89, 9784-9788 (1992)),
Rheumatoid arthritis-ben szenvedő paciensek ízületi nedvében és perifériás a TNFa megnövekedett szintjeit mutattak ki. Amikor ~4~ arthritisben szenvedő pacienseknek TNFo blokkoló szereket adtak be; ezek az ízület
Arthritis Rheum,
Az anti-TNFö antitestek rheumatoid arthritis és Crohn betegség kezelésében való alkalmazásáról a következő közlemények számoltak be; Feldman el at, Transplantatlon Proceedings, 30^4126-41127 (1098); Adorini et <, Trends in Immunoiogy Today, 18x 209-211 (1097) és Feldman et ai,s Advanoes in Immunoiogy, 64, 263-350 (1097). Az ilyen kezelésekhez használt TNFo elleni antitestek általában kimére antitestek. Ilyeneket tartalmaz az ÜS-A-8 919 452 számó szabadalmi bejelentés, jelenleg két TNFo blokkoló termék van engedélyezve rheumatoid arthritis kezelésére. Az elsőt - neve etaneroept ~~ az Immunex Corporation forgalmazza Enbrel márkanév alatt. Ez egy rekombináns fúziós protein, amely egy barnán immunglobulin Fc részhez kapcsolt két p75 oldható TNF-reoeptor domént tartalmaz. A másodikat, amelynek a neve inflixlrnab, a Centoear Corporation forgalmazza Remioade néven. Ez egy kimére antitest, amely egér anti-TNFo variábilis doméneket és humán IgGI konstans doméneket tartalmaz.
Az előzőek folyamán előállított rekombináns anfi-TNFe antitest molekuláknak általában gyenge affinitása volt TNFo-hoz, összehasonlítva azokkal az antitestekkel, amelyekből a variábilis régiék vagy a CDR-ek származtak Ezeket a molekulákat általában emlős sejtekben kellett termelni és költséges volt az előállításuk. Az előzőek szerint előállított antl-TNFo antitestek leírását lásd:
ms et al., Immunoiogy, Bő, 660-074 fi GB-A-2 297 145 szabadalmi bejelentés.
Stephens ás munkatársai (Immunoiogy, 1995, 85 csökkentett immunooenitással és génterápiára való
-A-2 246 570 és
hosszabb félélefidővel rendelkező, anti-hTNFe antitesten (CB0010) alapuló, GDPbeültetett, humanizált anti-humán~TNFo antitestet (CPD 571).
Igény van krónikus gyulladásos (inflammaforikus) betegségek kezelésére alkalmas olyan antitest molekulára, amely ismételten alkalmazható és könnyen, j kihozataliéi termei az affinitása TNFo-hoz és y van olyan antitest molekulára, ameí alacsony az immunogén hatása.
Első alakként egy TNFo-ra specifikus olyan antitest molekulát ismertetünk, amelyben a nehéz lánc variábilis dcménje tartalmaz olyan CDR-t [Kábát et ai. Csupra) definíciója szerinti, amelynek a szekvenciája CDRH1 esetén a 3. ábrán Hl-ként megadott (1. számú szekvencia vagy másszóval 1-ea azonosító számú szekvencia), CDRH2 esetén a 3. ébrén H2!»kénf megadott (2. számú szekvencia) vagy a 3. ábrán H2~kénf megadott (7. számú szekvencia), vagy CDRH3 esetén a
3. ábrán H3-kénf megadott (3. számú szekvencia).
Az első alak antitest molekulája legalább egy olyan CDR-t tartalmaz, amelyet a Hl, H2' vagy H2 és H3 (1. számú szekvencia; 2. számú szekvencia; vagy ?. számú szekvencia és 3. számú szekvencia) közül választunk a nehéz lánc variábilis dómén számára. Az antitest molekula előnyösen két vagy több CDR-t tartalmaz, előnyös, ha mindhárom CDR-t tartalmazza a nehéz lánc vanábihs doménfoen.
Második alakként egy TNFo-ra specifikus olyan antitest molekulát ismertetünk, amelyben a könnyű lánc variábilis dornénje tartalmaz olyan CDR-t [Kábát et ai. (lásd fent) definíciója szerint], amelynek a szekvenciája CDRL1 esetén a 3. ábrán L1-ként megadott (4. számú szekvencia). CDRL2 esetén a 3. ábrán L2~ként megadott (δ. számú szekvencia) vagy CDRL3 esetén a 3, ábrán Leként megadott (6. számú szekvencia),
A második alak antitest molekulája legalább egy olyan CDR-t tartalmaz, amelyet az L1, 12 és L3 (4. számú szekvenciától a 6. számú szekvenciáig) közül választunk a könnyű lánc variábilis doménhez, Az antitest molekula előnyösen legalább két vagy több CDR-t tartalmaz, előnyös, ha mindhárom CDR-t tartalmazza a könnyű lánc variábilis doménhen,
Az első és második alak antitest molekulái előnyösen komplementer könnyű láncot, illetve komplementer nehéz láncot tartalmaznak.
Előnyös, ha az első és második alak szerinti antitest molekula tartalmaz olyan nehéz láncot, amelyben a variábilis dómén tartalmaz olyan CDR-t [Kábát et al., (lásd fent) definíciója szerint], amelynek a szekvenciája CDRH1 esetén a 3. ábrán Hl-ként megadott (1, számú szekvencia), CDRH2 esetén a 3. ábrán H2Sként vagy H2-kénf megadott (2., számú szekvencia vagy 7. számú szekvencia) vagy CDRH3 esetén a 3. ábrán H3-ként megadott (3. számú szekvencia), és tartalmaz olyan könnyű láncot, amelyben a variábilis dómén tartalmaz olyan C0R4 [Kábát et al, (lásd fent) definíciója szerint], amelynek a szekvenciája CDRL1 esetén a 3. ábrán ti-ként megadott (4. számú szekvencia), CDRL2 esetén a 3. ábrán L2-kéni megadod (5. számú szekvencia), vagy CDRL3 esetén a 3, ábrán L3 ként megadott (6. számú szekvencia),
A fent említed CDR szekvenciák - azaz az 1, számú és a 3~7, számú szekvenciák, illetve a 3. ábrán szereplő szekvenciák - bTNF4ö egér monokionális antitestből származnak. A 2. számú szekvencia azonban egy hibrid CDR-ből áll. A hibrid CDR tartalmazza a bTNE40 egér monoklönáiis antitestből való nehéz lánc CDR2 (7. számú szekvencia) részét és egy humán 3-as csoportú csiravonal V régié szekvenciából való nehéz lánc CDR2 részét.
Az egér bTHF40 antitest variábilis doménjeínek teljes szekvenciáit á 6, ábra (könnyű lánc) (99. számú szekvencia) és a 7, ábra (nehéz lánc) (100. számú szekvencia) mutatja. Ezt az egér antitestet az alábbiakban „donor antitest-nek nevezzük.
Az első vagy második alak egy első vagylagos kiviteti tormája a hTNF'4ö egér roonokíonáhs antitest, amelynek könnyű és nehéz lánc variábilis dómén szekvenciád a 6 ábra (89. számú szekvencia), illetve a 7. ábra (100, számú szekvencia) mutatja be. A hTNE4ö könnyű lánc konstans régió koppá és a nehéz lánc konstans régió fgG2a.
Egy második vagylagos kiviteli formában az első vagy második alak közül valamelyik szerinti antitest egy kimére egér/humán antitest molekula, amelyet itt kiméra hTNF40 antitest molekulának nevezőnk. A kimére antitest molekula tartalmazza a hTNF’40 egér monokionélis antitest variábilis doménjalt (99. számú és 109. számú szekvencia) és tartalmaz humán konstans doméneket Előnyös, ha a kiméra ht'NF40 antitest molekula a humán C kapna domént tartalmazza [Hieter et ah, Celi, 22,197-207 (1980); Génbank lajstromszám: J90241) a könnyű láncban és a humán gamma 4 doméneket [Fíanagan ef al., Natúré, 300, 709-713 (1982)) a
Egy harmadik vagylagos kiviteli formában az első vagy második alak egyike szerinti antitest egy CDR-beülfetett antitest molekula. A „CDR-beültetett antitest molekula kifejezés, ahogyan itt használjuk, olyan antitest molekulára vonatkozik, amelyben a nehéz és/vagy könnyű lánc a donor antitestből (például egy egér monoklonálís antitestből) egy vagy több CDR-t (beleértve, ha kívánt, egy hibrid CDR-t) tartalmaz egy akceptor antitest (például egy humán antitest) nehéz és/vagy könnyű lánc variábilis régió frameworkhe beültetve.
Egy ilyen CDR-beültetett antitest variábilis doménje tartalmazhat akceptor framework régiókat, valamint egy vagy több fentiekben említett donor CDR-t,
A CDR-ek beültetésekor minden megfelelő akceptor variábilis régió framework használható, figyelembe véve annak a donor antitestnek az osztályát, típusát, amelyből a €OR~ek származnak, beleértve az egér, főemlős és humán framework régiókat, A találmányban alkalmazható humán framework szekvenciák például a következők; KOL, NEWM, REI, ED, TÖR, TEL LAY és PORI (Kábát et al., (lásd fent)). Például a KOL és NEWM a nehéz lánchoz használható, a REI a könnyű lánchoz használható és az ED, LAY és ROM mind a nehéz lánchoz, msnd használható, A könnye lánchoz előnyös framework régiók a t-es csoportba tartozó framework régiók, amelyek az 1. ábrán láthatók (83„ 88., 87, és SS, számú szekvenciák). A nehéz lánchoz előnyös framewerk régiók a humán 1-es csoportba és 3-as csoportba tartozó framework régiók,, amelyeket a 2. ábrán mutatunk be (91., 93,, 95, és 97. szárnű szekvenciák, illetve 1ÖCL W7,, 108. és 109. számú szekvenciák).
Egy találmány szerinti ÜDR-heöíteteti antitestben előnyben részesítjük az olyan akceptor antitest használatát, amelynek: a láncai homológok a donor antitest láncaival. Nem feltétlenül szükséges, hogy a nehéz és könnyű lánc ugyanabból az antitestből származzék, és ha kivárd, tartalmazhat összetett láncokat, amelyben a kötői
Továbbá, egy CDR-beültetett antitestben nem szükséges, hogy a framework régiók szekvenciája pontosan ugyanaz, a szekvencia legyen, mint ez akceptor antitest framework régióié. Például a szokatlan csoportokat az ezen akceptor lánc osztályban vagy típusban gyakrabban előforduló csoportokká lehet változtatni. Eljárhatunk úgy is, hogy az akceptor framework régiókban a kiválasztott csoportokat ügy változtatjuk meg, hogy ezek megfeleljenek annak a csoportnak, amely a donor antitestben ugyanabban a pozícióban található. Ezeknél a változtatásoknál be kell tartani azt a szükséges minimumot, hogy ~8
a donor antitest affinitását, Az csoportok kiválasztásának metodikáját - azaz hogy melyeket szükséges megváltoztatni - a WO 91/0998? számú nemzetközi közzétételi irat ismerteti.
Egy CDR-beültetett antitest molekulában, amennyiben az akoeptor nehéz láncban Komán 1es csoportú íramework régiók vannak (lásd a 2, ábrát) (91., 93., 95. és 97. számú szekvenciák), akkor az az előnyös, ha a nehéz lánc a framework régiók az egy vagy több donor CDR-n kívül a 28,, 89, és 71.
(Kábát et al,, (lásd fent)) is donor csoportokat tartalmaznak.
Vagy pedig, ha az akoeptor nehéz lánc 1-es csoportú írarnework régiói tartalmaz, akkor a nehéz lánc akoeptor íramework régiók az egy vagy több donor CDR~en kívül, donor csoportokat tartalmaznak a 23,, 38,, 48., 87., 89. és 71. pozícióban (Kábát et al., (lásd fent) szerint).
Ha a CDR-beültetett antitest molekulában, amennyiben az akoeptor nehéz lánc humán 3-as csoportú íramework régiókat (lásd a 2, ábrát.) (108., 107 109. számú szekvencia) tartalmaz, akkor előnyös, ha a nehéz lánc íramework régiók az egy vagy több donor CDR-en kívül donor csoportokat tartalmaznak, a 27., 2.8,30., 48,, 49., 89., 71,, 73., 78, és 78. pozícióban (Kábát et al., (lásd fent) szerinti.
Egy CDR-beültetett antitest molekulában, amennyiben az akoeptor könnyű lánc - humán 1-es csoportú íramework régiói vannak (lásd az 1. ábrát) (83., 85., 87. és 89. számú szekvencia), akkor előnyös, ha a könnyű lánc akoeptor íramework régiós donor csoportokat tartalmaznak a 48, és 88. pozícióban (Kábát el al., (lásd fent) szerint).
A donor csoportok a donor antitestből származó csoportok, azaz abból az antitestből. amelyből a CDR~ek eredetileg származnak.
Az antitest molekula tartalmazhat: egy teljes antitest molekulát teljes hosszúságú nehéz és könnyű láncokkal; ennek egy fragmentumát ilyen egy Fab, módosított Fab, Fab\ F(ab:)2 vagy Fv fragmentum; könnyű lánc vagy nehéz lánc monomert vagy dlrnert: egyláncú antitestet, például egy egyláncú Fv-t, amelyben a nehéz lánc és a könnyű lánc variábilis domének. pepiid linkerrel vannak összekapcsolva. Hasonló módon, a nehéz és könnyű lánc variábilis domének is kombinálhatok más antitest doménekkeí, ahogy éppen helyénvaló.
-9Az antitest molekula tehet egy Fab fragmentum. Előnyös, ha a Fab fragmentum nehéz láncának a szekvenciáját a 711, számú szekvencia és könnyű Sáncának a szekvenciáját a 113. számú szekvencia adja meg. A 111, számú szekvencia és a 113, számú szekvencia szerinti aminosavszekvenciákat. előnyösen a 170. számú szekvencia, illetve a 112. számú szekvencia szerinti nukleotid szekvenciák kódolják.
Előnyősnek tartjuk, ha a találmány szerinti antitest molekula egy olyan módosított Fab fragmentum, amelynél a módosítás nehéz láncának C-termlnálís végéhez egy vagy több aminosav hozzáadása, hogy ez lehetővé tegye egy éffektór vagy riporter molekula hozzákapcsolását. Előnyös, ha a hozzáadott áminosavak egy módosított csukló régiót képeznek, amely egy vagy több olyan eisztéihesöpörtöí tartalmaz, amelyhez az eíféktor vagy riporter molekulát tehet kapcsolni. Egy Ilyen módosított Fab fragmentum előnyösen olyan nehéz láncot tartalmaz: amelynek a szekvenciáját a 715, számú szekvencia adja meg, és olyan könnyű láncot, amelynek a szekvenciáját a 713. számú szekvencia adja meg, A 115. számú szekvencia szerinti amínosavszekvencíát előnyösen a 114, számú szekvencia szerinti nukteotíd szekvencia kódolja.
Előnyös effekíor csoport egy polimer molekula, amelyet a módosított Fab fragmentumhoz kapcsolhatunk, hogy növeljük in vivő felezési idejét.
A polimer molekula általában szintetikus vagy tennészefhéh elöfordulö polimer lehet, például adott esetben egy szubsztítuált egyenes vagy elágazó láncú pohalkllén, polialkenlién vagy poíioxialkiién polimer vagy egy elágazó vagy nem elágazó láncú poliszaohand, például egy homo- vagy heteropoliszacharíd.
A fent említett szintetikus polimerekben a speciális tetszés szerinti szubszíltuensek közül jelen lehet egy vagy több hidroxíl-, metík vagy metoxícsoport A szintetikus polimerek konkrét példáiként említjük az adott esetben szubsztítuált egyenes vagy elágazó láncú polietlíéngiikolí, polípropílénglikolf, poíivínííaíkoholt vagy ezek származékait, főképpen az adott esetben szubsztítuált polietiléngiikolt, ilyenek pl. a metoxí-póltetíléngiíkoi vagy ennek származékai. A speciális, tennészetben előforduló polimerek közé tartozik a laktóz, amilóz, dextrán, glikogén vagy ezek származékai. „Származékok” - ahogyan itt használjuk - közé tartóznak a reaktív származékok, például a ticl-szelektív reaktív csoportok, • 10 mint a maiernsavimídek és hasonlók, A reaktív csoport közvetlenül vagy líhker szegmentumon keresztül köthető a polimerhez. Érthető, hegy egy Ilyen csoport maradéké bizonyos esetekben a termék részét fogja képezni, az antitest fragmentum és a polimer közötti összekötő csoportként
A polimer mérete kívánság szerint változhat, de átlagos molekulatömege általában 500 - 50 000 D, előnyösen 5 000 - 40 000 O, különösen 25 ÖÖO 40 000 D tartományban van. A polimer méretét elsősorban a termék tervbe vett alkalmazása alapján választhatjuk meg. Ennélfogva például ahol azt óhajtjuk, hogy a termék lépjen ki a keringésből és hatoljon be a szövetbe, például tumor kezelésében való alkalmazás esetén, ott előnyős lehet egy kis molekuiatömegö polimer használata, például egy SÖÖO D körüli molekulatömeggel. Olyan alkalmazásokhoz, ahol a termék a keringésben marad, egy magasabb molekuiatömegö polimer használata lehet előnyös, például amelynek a molekulatömege 25 000 D-tól 40 ÖÖO D-ig terjed.
A különösen előnyős polimerek közé tartozik egy polialkílén polimer, ilyen egy pölietilértgíikoi vagy különösen egy metoxi-polietíSénglikol vagy ennek egy származéka, leginkább körülbelül 25 ÖÖÖ Őrtől körülbelül 40 ÖÖÖ Ö~rg terjedő molekulatömeg tartományban,
A módosított antitest fragmentumhoz kapcsolt polimer molekulák kovalensen kötődhetnek a fragmentumban elhelyezkedő ciszteinesoport kénatomjához, A kovalens kötés általában egy ölszulfId kötés, vagy főként egy kénszén kötés.
Ahol kívánatos, az antitest fragmentumhoz egy vagy több effektor vagy riporter molekulát köthetünk. Az effektor vagy riporter molekulákat a fragmentumban rendelkezésre álló minden oldalláncon keresztül és terminális amínosav funkciós csoporton keresztül kapcsolhatjuk az antitest fragmentumra, például bármilyen szabad amino-, Imino, hidrokif- vagy karboxilcsoporton keresztül.
A fent leírt polimer-módositott antitest fragmentumok előállításához kiindulási anyagként aktivált polimert használhatunk, Aktivált polimer lehet minden olyan polimer, amely tartalmaz reaktív tiolcsoportot, ilyen például egy a-halogénkarbonsav vagy észter, például jód-acetamíd, egy Imid, például maleinsavimid,
- 11 egy vinil-ezuifön vagy egy diszutld. Az ilyen kiindulási anyagok a kereskedelemben kaphatók (például a Shearwater Polymers Inc,, Huntsvilíe, AL, USA cégtől beszerezhetők) vagy előállíthatok a kereskedelemből beszerezhető kiindulási anyagokból, hagyományos kémiai eljárások alkalmazásával.
Polietíiénglíko! (REG) csoportok kapcsolásával kapcsolatban megemlítjük a következő kiadványokat „Poly(ethylenglyeoí) Ckemisfry, Bioteehnioa! and Blomedicai Application3, szerk.: d. Milton Harsis, Plenum Press, New York (1992); „Pölyíelhyleneglycol) C-hemístry and Biological Applications”, szerk.: J. Milton Marsié és S, Zaiipsky, American Chemical Society, Washington DC. (1997); „Biooonjugation Protein Couplíng Techníques tor the Biomedioa! Bclences”, M. Aslam and A. Dont, Grove Publishers, New York (1998).
Amennyiben az a kívánatos, hogy effektor vagy riporter molekulához kötött antitest fragmentumot kapjunk, ezt standard kémiai vagy rekomhináns DNS eljárásokkal állíthatjuk elő úgy. hogy az antitest fragmentumot vagy közvetienü! kötjük az effektor vagy riporter molekulához, vagy egy kapcsoló ágens útján, az aktivált polimerrel való reakció előtt vagy ezután, ahogy éppen helyénvaló, Speciális kénmai eljárások például azok, amelyeket a WO 93/06231, WO 92/22583, WÖ 89/00195 és Wö 89/01478 nemzetközi közzétételi iratok ismertetnek. Vagy pedig ahol az effektor vagy riporter molekula protein vagy poiipeptid. ott a kötés rekombmáns DNS eljárásokkal valósítható meg, például úgy, ahogyan a Wö 88/01533 és az EP-A-8392745 iratokban leírták.
A találmány szerinti módosított Pab fragmentum előnyösen PEGilezett [azaz PEG (polieíiíénglikoi) kapcsolódik hozzá kovalens kötéssel) az EP-Á~ 0943544 számú szabadalmi bejelentésben leírt módszer szerint. Előnyös, ha a találmány szerinti antitest molekula egy olyan PEGilezett módosított Pab fragmentum, amilyet a 13, ábra mutat be. Mint a 13. ábrából kitűnik, a módosított Pab fragmentum egy maieinsavitnid csoportot tartalmaz kovalensen kötve egy egyetlen tíolcsoporthez egy módosított csukló régióban, A maleinsavimíd csoporthoz egy lizincsoport van kovalensen kapcsolódva A lizincsoporton lévő minden egyes amínocsoporthoz egy metoxi-políefilénglíkoi polimer kapcsolódik, amelynek körülbelül 20 000 0 a molekulatömege. A teljes effektor molekula összmolekulatömege tehát körülbelül 40 000 D.
Á 13, ábrán feltüntetett vegyűlefben előnyösen ez antitest rész nehéz láncának a szekvenciáját a 115, számú szekvencia írja le, a könnyű lánc szekvenciáét a 113, számú szekvencia. Ezt a vegyöletet itt CDP37ö-nok nevezzük,
A találmány szerinti antitest molekula konstans régié doménieit amennyiben ilyenek vannak - ez antitest molekula tervezett funkcióját és főképpen effektor funkcióit - amelyekre szükség lehet - tekintetbe véve választjuk ki. Például; a konstans régió domének lehetnek humán IgA, IgD, IgE, IgG tyhl domének. Pontosabban, humán IgG konstans régió domének hasz főképpen az IgGI és lgG3 izcflpusok ha az antitest molekulát h alkalmazásra szánjuk és antitest effektor funkciókra van szükség. Vagy igG2 és lgG4 izotipusoka? használhatunk, ha az antitest molekulát terápiás célokra számuk és nmos szükség antitest effektor funkciókra, azaz egyszerűen csak TNFa aktivitás blokkolásra van szükség.
Tehát a találmány szerinti antitest molekulához, egy effektor vagy egy riporter molekula kapcsolódhat. Ez például lehet egy kovalens híd szerkezet révén hozzákapcsolt makrociklusos molekula nehézfématommal való kelát képzéshez, vagy egy toxin, mint a ricin. Alternatív megoldásként rekombináns DNS technológiai eljárásokat alkalmazhatunk olyan antitest molekula előállítására, amelyben egy teljes immunglobulin molekula Pc fragmentumát (CH2, CHg és csukló dómén), vagy a CH? és CHS domént vagy a domént egy funkciós nemimmunglobulin proteinnel - ilyen egy enzim vagy toxín molekula ~ helyettesítettük, vagy amelyhez pepiid kötéssel ilyeneket hozzákapcsoltunk.
A találmány szerinti antitest molekula kötési affinitása előnyösen legalább 0,85 x 1ίΓ'β M, előnyösebben legalább 0,75 x 10'w M és a legelőnyösebben legalább 0,5 x 1O'!Ö M, [Érdemes megjegyezni, hogy a találmány szerinti előnyős humanizált antitest molekulának - mint alább leírjuk - az affinitása körülbelül 0,5 x 10'10 M, amely jobb, mint annak az. egér monokionális antitestnek az affinitása, 51 származott. Az egér anbtesi affinitása körülbelül 0,85 x 10 'öM}.
A találmány szerinti antitest molekula előnyösen tartalmazza a hTNF'40-gL.I könnyű lánc variábilis (8 számú szekvencia) és a gh3hTNP40,4 nehéz
77lánc variábilis domént (11, számú szekvencia), Ezen könnyű és nehéz lánc variábilis dóménak szekvenciáit a 3,, illetve 11. ábrán mutatjuk be.
A találmány szerinti antitest molekula olyan variánsait is ismertetjük, amelyeknek javított affinitása van a TNFa-boz. Ilyen variánsokat számos affinitás érlelő eljárással állíthatunk elő, beleértve a CDR~ek mutagenlzálását (Yang ef at, d. Mól Biot, 254, 392-403 (1995)], a lánc átalakítást [Marks et at: Sio/Tecbnölogy, 10, 779-733 (1992)), az E. coli mutátor törzsének használatát [tow at at, X Mot Biot, 250, 359-380 (1998)), A DNS átalakítást [Patton et al., Curr. öpin, Biofechnol, 3Α 724-733 (1997)], a fág display-t [Thompson et at, J. Mot Blöt, 955, (1995)1 és a szexuális PCR-f [Crameh et at, Natúré, 391,, 288-291 (1998)], feughan éa munkatársai (lásd fentebb) is tárgyalják az affinitás érés ezen
A találmány tárgyát képezi a találmány szerinti antitest molekula nehéz és/vagy könnyű láncát (láncait) kódoló DNS szekvencia is.
A DNS szekvencia kódolja előnyösen a találmány szerinti antitest molekula nehéz vagy könnyű láncát.
Egy előnyös kiviteli formában a DNS szekvencia könnyű láncot kódol, és tartalmazza a 8. számú szekvenciát (hTNF4ö-gL1) sgterei
Egy alternatív előnyős kiviteli formában a DNS szekvencia nehéz láncot kódol, éa tartalmazza a 11. számú szekvenciát (gh3h TNF40.4) vagy ennek degenerált megfelelőjét,
A találmány szerinti DNS szekvencia tartalmazhat szintetikus DNS-t, például olyat, amelyet kémiai feldolgozás útján állítanak elő, továbbá cDNS-t, lls DNS-t vám
A találmány olyan klónozó vagy expressziós vektorra is vonatkozik, amely egy W főbb találmány szerinti DNS szekvenciát tartalmaz. Előnyös, ha a klónozó vagy expressziós vektor két DNS szekvenciát tartalmaz, amelyek a találmány szerinti antitest molekula könnyű láncát, illetve nehéz láncát kódolják.
Olyan E. coli expressziós vektort is Ismertetünk, amely tartalmaz találmány szerinti DNS szekvenciát. Az expressziós vektor lehet a pTTG(CDP870), amelynek sematikus képe a 22. ábrán látható.
...
Ismertetjük a 19, ábrán bemutatott pDNÁbEng-G1 vektort is.
Az olyan általános módszerek, amelyekkel a vektorok megszerkeszihetők, továbbá a transzfekoíős módszerek és tenyésztési módszerek jól Ismertek a szakterületen jártas szakemberek előtt. E tekintetben referenciának tekintjük a „Current Protocols ín Molecuiar Biology” című kiadványt, szerk.: FM Ausubel, Wlley Interscíence, New York (1999) és a Manialis féle kézikönyvet, amelyet a Cold Spring Harbor Puhlishing cég adott ki,
A találmány szerinti antitest molekulát kódoló DNS szekvenciák olyan eljárásokkal állíthatók elő,, amelyeket jól ismernek a szakterületen gyakorlóit szakemberek. Például: az antitest nehéz és könnyű láncok részét vagy egészét kódoló DNS szekvenciák kívánság szerint vagy a meghatározott DNS szekvenciák vagy a megfelelő aminosavszekvenciák alapján szintetizálhatok.
Áz akoeptor framework-öt kódoló DNS szekvenciák a szakmában í« szakembereknek messzemenően rendelkezésére állnak és szintetizálhatok ismert aminosavszekvenciálk alapján,
A találmány szerinti antitest molekulát kódoló DNS szekvenciák előállításéra a molekuláris biológia standard technikái alkalmazhatók. A kívánt DNS szekvenciák egészben szintetizálhatok vagy részietekben, oligonukieofld szintetizáló technikák alkalmazásával. Helyre Irányuló mutagenezis és polimeráz lánc-reakció (PGR) technikák is alkalmazhatók, ahogy éppen
A találmány szerinti antitest molekulát kódoló kifejezésére bármilyen alkalmas gazdasejt/veki dehálls - például E. coli - és más mikrobiálk antitest fragmentumok, ilyenek az Fab és F(ab’h az Fv fragmentumok és egyláncű antitest egyláncú Fv-k expressziójához. Nagyobb antitest molekulák - beleértve a antitest molekulákat: - előállításához eukanóla, azaz emlős gazdasejt expresszlós rendszereket alkalmazhatunk. Alkalmas emlős gazdasejtek közé tartoznak a CHO,. mieioma vagy hibridoma sejtek.
A találmány egy találmány szerinti antitest molekula előállítására alkalmas eljárásra is vonatkozik, amelyben egy találmány szerinti vektort tartalmazó gazdasejtet olyan körülmények között tenyésztünk, ameiye
es
15hogy a találmány szerinti antitest molekulát kódoló DNS-böl a protein expresszióját ösztönözzék és Izoláljuk az antitest molekulát.
Előnyös, ha a találmány szerinti antitest molekula előállítására szolgáló eljárásban olyan E. coll expressziós vektort tartalmazó E. colét tenyésztünk, amely tartalmazza a találmány szerinti DNS szekvenciát, A tenyésztést olyan körülmények között végezzük, amelyek alkalmasak arra, hegy a DNS szekvenciából a protein expresszijét ösztönözzék, majd izoláljuk az antitest molekulát. Az antitest molekula a sejtből szekretélödhat, vagy pedig megfelelő szignál szekvenciák révén a pehplazmatikus térbe juthat. Más megoldásként az antitest molekulák összegyűlhetnek a sejten belüli cítopíazmában, Előnyös, ha az antitest molekula a pehplazmatikus térbe jut, A termelendő antitest molekulától és az alkalmazott eljárástól függően ajánlatos, ha hagyjuk, hogy az antitest molekulák felgomholyodjanak és hogy funkciós konformációt vegyenek fel. Az antitest molekulák felcornbelyodásához lehetőséget biztosító eljárásokat lói Ismerik a szakterületen
rendelkező szakemberek.
az antitest molekula csak nehéz vagy könnyű lánc polipeptldet tartalmaz, ebben az esetben csak egy nehéz lánc vagy könnyű lánc polif véneiét kell használni a tlyan előállifásáhöz, amelyek mind nehéz, mind könnyű láncot tartalmaznak, a Iálhatjuk két vektorral, amlkoris az egyik vektor egy könnyű lánc polipeptídet és a másik vektor egy nehéz lánc polipeptldet kódol. Alternatív megoldásként egyetlen vektort használhatunk, amennyiben a vektor könnyű lánc és nehéz lánc polipeptídet kódoló szekvenciákat, tartalmaz.
A találmány olyan terápiás vagy diagnosztikai készítményre is vonatkozik, amely egy találmány szerinti antitest molekulát győgyszerészetíleg elfogadott töltőanyaggal, higlfőszerrel vagy vivőanyaggal együtt tartalmaz.
Olyan terápiás vagy diagnosztikai készítmény előállítására alkalmas eljárást is ismertetünk, amelyben a találmány szerinti antitest molekulát egy össze,
A terápiás vagy diagnosztikai készítményben az antitest molekula lehet az len aktív alkotórész, vagy pedig más aktív alkotórészekkel lehet együtt.
beleértve más antitest alkotórészeket, például anti-T sejt, antl-IFNy vagy anll-tPS antitesteket, vagy nem antitest alkotórészeket, mint például Kaolinokat.
A gyógyszerkészítményeknek lehetőleg tartalmazniuk kell a találmány szerinti antitest terápiásán hatásos mennyiséget. A „terápiásán hatásos mennyiség, ahogyan itt használjuk., egy terápiás hatóanyagból olyan mennyiséget jelent, amely a megcélzott betegség vagy állápét kezeléséhez, enyhítéséhez vagy megelőzéséhez szükséges vagy amely kimutatható terápiás vagy preventív hatást felt ki. Minden antitestre nézve a terápiásán hatásos dózist először vagy sejttenyésztési vizsgálatokkal, vagy állat modellekben - rendszerint rágcsálókban, ük meg. Az
CSUi nyuiaknan. kutvakoan, serre· állat modell arra is használható, hogy meghatározzak a helyes koncentrációtartományt és a beadás módját. Ezt az információt ezután felhasználhatjuk embereknél a használható dózisok és az alkalmazási módok meghatározásához. Egy beteg embernél a pontos hatásos mennyiség a betegség súlyosságától, a beteg általános egészségi állapotától, korától, súlyától és a beteg nemétől függ, továbbá az alkalmazás rendjétől, idejétől és gyakoriságától, a gyógyszer kombmáclő('k)tói; a reakció fogékonyságtól és a terápiával szembeni toleranciától és a terápiára adott választól. Ez a mennyiség rutin kísérletezéssel megállapítható, és az orvos megítélése szabja meg. Egy hatásos dózis általában 0,01 - 50 mg/kg. előnyösen 0,1 ~~ 20 mg/kg, előnyösebben körülbelül 15 mg/kg. Az alábbi példákban bemutatjuk, hegy 1,5 és 20 mg/kg dózisokat használtunk rheumatoid arthritisben szenvedő paciensek kezelésére.
A készítmények alkalmazhatók önállóan egy betegnél, vagy alkalmazhatjuk más hatóanyagokkal, gyógyszerekkel vagy hormonokkal kombinálva.
A találmány szerinti antitest molekula bevitelénél alkalmazott dózis a kezelendő állapot saiá függ, továbbá attól, hogy a TNFe szintje milyen mértékig neutralizálandó, vagy mennyire emelendő egy kívánt szint fölé, és attól, hogy az antitest molekulát profilaktikusan alkalmazzuk-e vagy egy fennálló állapot
Így például, amikor a termék egy krónikus gyulladásos betegség ~~ ilyen a rheumatoid arthritis ™ kezelését, vagy megelőzését szolgaija, a találmány szerinti antitest molekula megfelelő dózisa 0,5 és 6Ö mg/kg közé esik, előnyösebben 1 és
-1720 mg/kg közé, a legelőnyösebb dózis pedig körülbelül 15 mg/kg. Az adagolás gyakorisága az antitest molekula felezési Idejétől és hatásának időtartamától függ.
Amennyiben az antitest molekulának rövid a felezési Ideje (azaz 2-10 óra), szükség lehet naponta egy vagy több dózis beadására. Vagy pedig amennyiben az antitest molekulának hosszú a felezési ideje (azaz 2-15 nap), akkor csak naponta vagy hetente egyszer, sőt 1 vagy 2 hónaponként egyszer lenne szükséges beadni egy adagot,
A gyógyszerkészítmény gyógyszerészeíileg elfogadott vivőanyagot is tartalmazhat az antitest alkalmazása céljából. Maga a vivőanyag nem indukálhat antitest termelést, amely káros arra az egyénre nézve, aki a készítményt kapja és nem lehet toxikus. Az. alkalmas vivőanyagok lehetnek nagy, lassan metabolizálódó makromolekulák, mint a proteinek, poilpeptidek, liposzómák, poiiszachaddok, polifejsavak, poligllkolsavak, polimer amínosavak, amínosav kopolimerek és Inaktív vírus partikulák.
Használhatunk gyogyszerészetileg elfogadott sókat, például ásványi savak sóit, Ilyenek a hldroklorldck, hldrobromldok, foszfátok és szulfátok, vagy szerves savak sóit, Ilyenek az aoefátok, propionátok, malonáfok és benzoátok.
Terápiás készítményekben a gyógyszerészetlleg elfogadott vivóanyagok tartalmazhatnak továbbá folyadékokat, például vizet, fiziológiás konyhasó oldatot, glicerint és etanolt. Ezenkívül az ilyen készítmények segédanyagokat, például nedveslföszereket, emuigeáíószereket vagy pH pofferoíó tartalmazhatnak. Ezek a vivóanyagok lehetővé teszik a gyógyszer! formulálását tablettákká, pirulákká, emulziókká (síussies) és szeszpe a paciens be tudja venni e
Az a!
alkalmasak a parenterális bevitelhez, például Injekcióval vagy infúzióval, igy bolusz injekcióval vagy folyamatos infúzióval. Amennyiben Injekciós vagy infúziós termékről van sző, ez. lehet szuszpenzié, oldat vagy emulzió formában, olajos vagy vizes vivöanyagban és tartalmazhat formulálőszereket, például szuszpendálő-, konzerváló-, stabilizáló- és/vagy diszpergálószereket Az antitest molekula száraz formában is készülhet, megfelelő steril folyadékkal a használat előtti vísszaoldáshoz.
-18Amim a találmány szerinti készítmények formulálása megtörtént, közvetlenül beadhatok a betegnek. A kezelendő betegek állatok Is lehetnek. Azonban előnyösnek tartjuk, ha a készítményeket humán pacienseknél való alkalmazáshoz adaptáljuk szerinti számos.
szénné alkalmazhatók, beleértve - de nem kizárólag ~ az orális, intramuszkuláns, intraarteriálls, Intramedulíáns, intratekális, intravenfrikuláns, transzdermálís, transzkulán (lásd például: WO 98/20734), szubkután, intrapehtoneálís, íntranazáíís, enterális, topikáhs, szubfínguáíís, íntravaginálís vagy rektálls alkalmazásokat. Hípospray~k szintén használhatok a találmány szerinti gyógyszerkészítmények alkalmazásához A terápiás készítményeket általában Injekcióhoz alkalmas készítmény formájában, akár folyékony oldat vagy szuszpenzió formában állítjuk elő. Szilárd formák is előállíthatok, amelyekből az injekció előtt folyékony vivőanyagban oldatok vagy szuszpenziók készíthetők.
A készítmények közvetlen beadását általában injekcióban, szubkután, íntraperttoneálisan, intravénásán vagy íntramuszkulábsan végezzük, vagy egy szövet interstíciáhs terébe visszük be a készítményeket A készítményeket láziéba is bevihetjük. Az adagolással végzett kezelés egy adagos program vagy több adagos program szerint történhet.
Tisztában kell lenni azzal, hogy a készítményben lévő aktív alkotórész egy antitest mo!
lamos a
Tehát ha a készítményt a gyomor-bél traktust használva kell beadni, a készítménynek olyan szereket kell tartalmaznia, amelyek megvédik az antitestet a degradációtéi, de amelyekből felszabadul az antitest, mihelyt a gyomor-bél traktusból felszívódott.
A gyógyszerészetiig elfogadott vivőanyagokat mélyrehatóan tárgyalja a Remington’s Pharmaceutical Sciences (tvlack Pubüshing Gompany, N J. 1991).
Szándékunkban van az is, hogy a találmány szerinti antitest génterápia alkalmazásával beadható legyem Ennek megvalósítása céljából az antitest molekula nehéz és könnyű láncát kódoló DNS szekvenciákat megfelelő DNS komponensek szabályozása alatt úgy visszük be egy paciensbe, hogy az antitest láncok a DNS szekvenciákból kifejeződjenek és in situ összeszerel
Biztosíthatjuk a fentiekbe?·? leírt antitest molekulát TNFo által közvetített betegség kezelésében történő alkalmazásra.
Biztosíthatjuk a találmány szerinti antitest molekula alkalmazását ss TNFo által közvetített betegség kezelésére alkalmazható gyógyszer előállításában.
A találmány szerinti antitest molekula bármilyen olyan terápiában hasznosítható, ahol az emberi vagy állati szervezetben lévő biológiailag aktív TNFo szintjének a csökkentése kívánatos, A TNFo keringhet a szervezetben vagy nem kívánatos magas szintben jelen lehet a szervezet egy speciális helyére lokalizálva,
A TNFo emelkedett szintjei kísérik például az akut és krónikus immun- és immunreguiációs rendellenességeket, a fertőzéseket, beleértve a szeptikus, endotoxíkus és kardiovaszkuláris sokkot, a neurodegei'ieratív betegségeket, rosszindulatú betegségeket és az alkohol által indukált hepatitist. A TNFo i több rendellenességet részletesen té
eme sz
452 számú szabadalmi be
L A találmány szerinti antitest molekula a átható, Jelentős betegségek, amelyek a találmány szerinti antitest molekulával kezelhetők, például a következők: szepszls, szívszéíhüdés, szeptikus vagy endotoxíkus sokk, oachexia, felnőttkori respirációs distress szindróma, AIDS, allergiák, pszoriázls, TB, gyulladásos csontrandelienességek, véralvadási rendellenességek, égések, szerves szővefátúíteiés utáni kilökődés! epizódok, Crohn betegség és betegségek, mint a
Az antitest molekula vagy készítmény ezenkívül a daganatos betegségek folyamán TNFo képződéssel társult mellékhatások csökkentésére használható,, használható továbbá graft kilökődés anti-limfoeifa antitesttel végzett kezelésével vagy megelőzésével társult sokkhoz hasonló szindrómák kiküszöbölésére vagy csökkentésére; vagy több szervet érintő elégtelenség (multiorgan failure) kezelésére,
A találmány szerinti antitest molekulát előnyösen rheumatoid vagy osteoarthritls, Crohn-betegség vagy pszoriázls kezelésére használjuk.
Eljárást is ismertetünk olyan beteg emberek vagy állatok kezelésére, akik, illetve amelyek TNFo által közvetített rendellenességben szenvednek, vagy náluk ennek kockázata áh fenn. Az. eljárás tartalmazza, hogy a betegnek a találmány szerinti antitest molekula hatásos mennyiségét adjuk he,
A találmány szerinti antitest molekulát felhasználhatjuk diagnózisra,
In vivő diagnózisra és arra, hogy képet kapjunk olyan betegségi á amelyekben a TNFu emelkedett szintjei vannak jelen.
Ismertetünk olyan hibrid CDR-t tartalmazó antitest molekulát Is,
CDR-t t.
csonka donor CDR szekvenciát tartalmaz, amelyben a csonka donor CDR hiányzó részét egy más szekvenciával helyettesítettük és ezzel működőképes CDRrt k. A „hibrid CDR” kifejezés - ahogyan itt használjuk - egy olyan donor mazó CDRrt jelent, amelyet egy vagy több pozíciónál vagy egyik vagy mindkét végén. A csonka donor CDR szekvenciával ügy helyettesítettük, hogy teljes és CDRrt kapjunk A hibrid CDR-hen legalább egy aminosav cseréje a teljes donor CDR-hez viszonyítva. A CDR csonkított részét szekvencia bármilyen szekvencia lehet. Előnyös, ha a CÖR szekvencia nem-donor része abból az antitestből származik, amelyből az antitest molekula framework régiói származnak, Ilyen egy csíravonal antitest szekvencia.
Azt találtuk, hogy a hibrid CDR-t tartalmazó antitest molekulák ugyanazt a kötési affinitást tartják meg, mint amivel egy kompieb donor CDR-eket tartalmazó antitest molekula rendelkezik, A „lényegében azonos kötési affinitás” kifejezés ™ hiányzó valósul r heí ahogyan itt használjuk - a teljes donor CDR-eket tartalmazó megfelelő antitest molekula kötési affinitásának legalább 70 %-át jelenti. Mint fent megjegyeztük, bizonyos esetekben a találmány szerinti antitest affinitása nagyobb lehet, mint a donor antitesté. A hibrid CDR használata a kővetkező előnyöket nyújtja; csökkenti az antitest molekulában lévő idegen (azaz donor) szekvencia mennyiségét és növelheti az antitest molekula kötési affinitását, összehasonlítva a teljes donor CDR-eket tartalmazó megfelelő antitest molekulával.
Az antitest molekula bármely CDR-je lehet hibrid. Előnyös, ha az antitest molekulában a nehéz lánc CDR2-je hibrid.
A donor CDR csonkítása előnyösen 1*8 aminosavra, előnyösebben 4-6 aminosavra terjed ki. Előnyös továbbá, ha a csonkítást a CDR C-termlnálís végén végezzük.
A CDR csonkított részének szekvenciájától és a hiányzó részt helyettesítő más szekvencia szekvenciáiétól függően több amínesavat lehet cserélni. Előnyős, ha legalább 2 amínosavat cserélünk ki, előnyösebben legalább 3 amínosavat cserélünk ki és a legelőnyösebb, ha 4 amínosavat cserélünk ki.
Egy speciális kiviteli formában az antitest az itt leírt első alaknak felel meg, amikohs az antitestben a nehéz, láncban lévő második CDR szekvenciáját a 2, énjéhez, mint azé a donor szama szekvencia iga le, Ennek jobb az *»; antitesté, amelyből a CDR rész származott.
olyan nukleinsavszekvencíát is, amely a találmány szerinti mazo atw
Ismertetünk olyan nokleinsav szekvenciát tartalmazó expresszibe vektort Is, amely a hibrid CDRrt tartalmazó találmány szerint) antitest molekulát kódolja.
A találmány tárgyát képezi a találmány szerinti vektorral transzformált gazdasejt Is.
Ismertetőnk egy hibrid CDRt tartalmazó antitest molekula előállítására szolgáié eljárást is, amelyben a találmány szerinti g lzoiá|uk az antitest molekulát.
A találmányt a továbbiakban az alább leírt példákkal szemléltet! amelyekben a csatolt ábrákra hivatkozunk.
Az 1. ábra az 1-es alcsoportba tartozó humán könnyű lánc fe régiéit mutatja a hTMFO könnyű lánc framework régióival összehasonlítva (83-90. számú szekvenciák).
A 2, ábra az 1~es alcsoportba és 3-as alcsoportba tartozó humán nehéz lánc framework régiókat mutatja a KTNF4Ö nehéz lánc framewerk régióival összehasonlítva (91-98. számú szekvenciák és 108-109. számú szekvenciák).
A 3. ábra a hTNF4ö CDR~ek amincsavszekvenciát (1-7. számú szekvenciák) mutatja, amelyekben a CDR H2' olyan hibrid CDR, amelyben a C~ terminális hat amlnosav a humán 3-as alcsoporté csiravonal antitest H2 CDR szekvenciájából származik, A hibridizációból származó amlnosav cseréket a a pMRIő.l vek Az 8. ábra a pMR14 vakl
-22A 6. ábra az egér hTNF40VÍ nukleotíd szekvenciáját és előrelátható arnínosav szekvenciáját mutatja (99. számú szekvencia).
A 7, ábra az egér hTNF40Vh nukleotíd szekvenciáját és előrelátható arnínosav szekvenciáját mutatja (1ÖÖ, szarná szekvencia).
A 8. ábra a hTNF4ö-gL1 nukleotíd szekvenciáját és előrelátható arnínosav szekvenciáját mutatja (8. számú szekvencia).
Á 9. ábra a hTNF40~gL2 nukteotid szekvenciáját és előrelátható arnínosav szekvenciáját mutatja (9. számú szekvencia),
A 10. ábra a ghlhTNF40.4 nukleotíd szekvenciáját és előrelátható arnínosav szekvenciáját mutatja (10. számú szekvencia).
A 11. ábra a gh3hTNF40.4 nukteotid szekvenciáját és előrelátható arnínosav szekvenciáját mutatja (11. számú szekvencia).
A 12. ábra a CTILS gLö vektort mutatja.
A 13. ábra a CDP87Ö nevű vegyö let szerkezetét mutatja, amely a HTNF4Ö antitestből származó módosított Fab fragmentumot tartalmazza, Ez egy ciszteincseporton keresztül kovalens kötéssel egy lizH-mateinsaviniid linkéihez van kötve, ahol a lizilceoporton lévő minden aminocsoporthoz agy metoxi-PEG csoport -amelyben n körülbelül 420 - kapcsolódik.
A 14. ábra a pTTQ9 vektort mutatja.
A 16. ábra az OmpA oliígooukteotid adapter szekvenciáját mutatja (101. számú szekvencia),
A 16, ábra a pACYC 184 vektort mutatja.
A 17. ábra a pTTO-1 vektort mutatja.
A 18, ábra a pTTO-2 vektort mutatja.
A 19, ábra a pDNÁbEng vektort mutatja,
A 20. ábra a különböző intergenikus szekvenciákat kódoló oligonuklectid kazettákat mutatja E. coli módosított Fab expresszióhoz (102-105. számú szekvenciák).
A 21, ábra az IGS (intergenikus szekvencia) variánsok módosította Fab periplazmatikus akkumulációját mutatja.
A 22. ábra a pTTO (CP870) vektort mutatja.
A 23. aura a betegser
SCOffö mutatja a különböző dóziső CDP8?Ö-nel és a placebö-val kezelt betegekben. A két es populációnál, ahol az utolsó megfigyelésig végeztük a vizsgálatokat. A kis pf és a nagy négyszögek 20 mg/kg-ot jelentenek,
A 24, ábra a puha ízületek számát, a duzzadt ízületek számát, a fájdalom a kiértékelők által a betegség aktivitásra adott összevont értékelést, a egészség értékelési kérdőívet (health assesament questionnaire ~ k a C reaktív proteint (CRP) és a vőrösvérsejí: ülepedés! sebességét (ESR ~ vihmr.vrn sedimentation rate) ábrázolja a CDP57Ö különböző dózisaival és a plaoeho-val kezelt pacienseknél. A kapott középértékeket és IQ tartományokat tjük a protoköíionkéníl populációnál, ahol az utolsó megfigyelésig végeztük kai, A kis négyszögek jelentése: placebo, a rombuszok 1 mg/kg-ot, a 5 mg/kg-ot és a nagy négyszögek 20 mg/kg-of jelentenek.
Kimére hTNF4ö antitest molekula óén klónozása és
RNS előállítása hTNF4ö híbrl
Ossz RNS-t állítottunk elő 3 x 1Ö7 hTNF4ö hibridemé sejtekből, mint alább leírjuk. A sejteket fiziológiás konyhasó-oldatban mostuk és RNÁzol-ban (0,2 ml/W® sejt) oldottuk. Kloroformot adtunk hozzá (0,2 mi/2 ml homogenizálom), a keveréket erőteljesen ráztuk 15 másodpercig, ezután 15 percig jégen tartottuk. A keletkezett vizes és szerves oldószeres fázist Rppeodorf centrifugában 15 perces centrifugálással elválasztottuk, majd az RNS~f a vizes fázisból kicsaptuk azonos térfogatú izoprcpanoi hozzáadásával. Miután az elegy 15 percig állt jégen, az RNS~f centrifugálással ülepítettük, 7ö %-os efanollel mostuk
RNÁz mentes vízben mostuk. Az RNS kitermelés 400 pg volt.
A hTNF4Ö Vh és VI POR klónozása
A KTNF40 nehéz és könnyű láncok variábilis doméneit kódoló cDNS szekvenciákat reverz transzkriptáz használatával szintetizáltuk az ossz RNS-ben jelenlévő mRMS egyszálú cDMS másolatainak előállítása céljából, ezt követte a cDNS-ek polinwáz lánc reakcióval (PCR-rel) való sokszorezása specifikus oligonukleotid primerek alkalmazásával.
A cDMS-t 20 pl reakciótéríogatban szintetizáltuk, amely a következő reagenseket tartalmazta: 50 mM trisz.HCL pH 8,3, 75 mM káiium-kiond, 10 mM dítiotreifoi, 3 mM magnézium-kloriő, 0,5-05 mM a dezoxiribonukleezid Irifoszfáiekböi, 20 egység RNAsin. 75 ng rendem hexanukleotld primer, 2 pg hTNF4ö RNS és 200 egység Moloney Marino Leukémia Vírus roverz transzkriptáz. A reakcióelegyet 42 ΰ C-on 60 percig inkubáltuk, majd a reakciót 5 percig 05 ÖC~on való melegítéssel állítottuk le.
b) POR
A cDNS részleteivel PCR-t végeztünk nehéz és könnyű láncra specifikus primerek kombinációinak alkalmazásával, A nehéz és könnyű láncokhoz való 5’ primerek nukleetid szekvenciáit az 1,, Illetve 2, táblázatban mutatjuk be. Mindegyik ilyen szekvencia - sorrendben - a következőket tartalmazza: egy restrikciós helyet, amely F végeiktől 7 nukloofld távolságra kezdődik, a GCCGOCACC szekvenciát (12. számú szekvencia), hegy a kapott mRNS-ek optimális transzlációját lehetővé tegye, egy inieiáclos kodont, és 20-30 olyan nukleolidot, amelyek isméd egér antitestek vezér pepiid szekvenciáin alapulnak (Kábát eí al., Sequences of preteins of ímmunobgical interest, 5. kiadás, 1091, US Departhwtt of Health and Humán Services, Public Health Service, National Institutes of Health),
-263!
A 3’ primerekef a 3. táblázat mutatja. A könnyű lánc primer az antitest 3-C jünkctőjál fogja át és az Spll enzim számára egy msfhkciés helyet tartalmaz, hogy a VL PCR fragmentum klónozását. A nehéz lánc 3’ primerek alkotnak, amelyet arra szántunk, hogy az antitest 3-C junkelójáf fogja át, restrikciós helyet tartalmaz a klónozás megkönnyítésére. A primerek 3* régiója kevert szekvenciát tartalmaz, amely ismert egér antitestekben talált 3: szekvenciákon alapul (Kábát et al., lásd fentebb).
A primerek fent leirt kombinációi lehetővé teszik, hogy a Vh és VI POR termékeket közvetlenül a megfelelő expresszibe veirtorba (lásd alább) klónozzuk be kimére (egér-humán) nehéz és könnyű láncok előállítása céljából és ezeket a géneket emlős sejtekben fejezzük ki a kívánt Izotipusű kimére előállítása céljából.
A PCR Inkubációkat (100 pl) a következeképpen Indítottuk. Minden reakció 10 mM tnsz.HÜM (pH 8,3), 1,3 mM magnézíum-klohdot, 58 mM káíium-kíoíidot, 0,01 lömeg/térf.% zselatint, 0,25-0,25 mM-t a dezoxiribonukleözió-tnfoszfáfokböl, 10 pM 5; primer mix-et (4. táblázat), 10 ptvl 3' prímért [CL12 (könnyű lánc) vagy R2155 (nehéz lánc) (3. táblázat)], 1 pl cDNS~t és 1 egység Tag polimerázf tartalmazott. A reakcióelegyeket 95 öC~on 5 percig inkuháltuk, majd ciklusonként a következő hőmérsékleteket és időket alkalmaztuk: 94 ÖC 1 percig, 56 1 percig ás 72 8C 1 percig. Harminc ciklus után az egyes makclóelegyek részleteit agaróz gélben elektreforózissel analizáltuk. Az 1-es, 2-es és 7-es könnyű lánc poolokbél való 5’ primer keverékeket tartalmazó könnyű lánc reakciókból kapott sávok olyan méreteknek feleltek meg, amelyek a teljes hosszúságú VI fragmentumokkal a 3-as nehéz lánc reakció pooilai végzett reakcióból olyan ς amelynek a mérete egy Vh génre várt méret volt. Az 1-es lánc poel primerek által produkált sávot nem követtük, mivel előzetes eredmények azt mutatták, hogy az a sáv a hibridoma sejt által termelt könnyű lánc pszeuóogénnek felel meg. A 7-es könnyű lánc pool primerek által produkált sáv gyengébb volt, mint a 2-es pool primerekböl kapott sáv és ezért nem követtük. Csak a 2-es könnyű lánc reakció pool-bél kapott sávot - amely a legerősebb sávot adta - követtük.
c) A POR fragmentumok molekuláris klónozása
A 2«es könnyű lánc reakció pociban kapott DNS fragmentumokat BstBi és SpO enzimmel emésztettük, etanolcs kicsapással betöményítettük, 1,4 %-os agarőz gélben eiektroferefizáítuk és a 400 bázis pár tartományban lévő DNS sávokat Izoláltuk. Ezeket a BstBI-gyel és Spll-gyei hasított pMR15.' ábra) való iigálássaí klónoztuk, Llgálás után a keverékekkel E. coll sejteket transzformáltunk és a kapott baktéhumtelepekből származó plazmldokat BsiBkgyel és Spll-gyel való emésztéssel inszertumokra szűrtük. Az egyes ligálásokbóí származó inszertumok mintáit tovább analizáltuk nukleotid szekvenálással.
A 3-as nehéz lánc reakció pociban kapott DNS fragmentumokat - hasonló módon ··· Mind lll-mal és Apai-gyei emésztettük, és lllndlll-mal és Apai-gyei hasított pMR14 vektorba (ö. ábra) klónoztuk be. Az inszertumokaf tartalmazó reprezentatív plazmldokat szinten nukleotid szekvenálással analizáltuk.
d) Nukleotid szekvencia analízis
Vh ínszertumot tartalmazó Izolálómból plazmíd ÖNS-t szekvenáitunk az R1Ö53 primer (lásd az 5. táblázatot) (amely a pMR 14-ben a HCMV promoter 3’ régiójában hat) és az R720 primer (lásd az 5. táblázatot) (amely a humán C-gamma 4 5’ régiójában hat és lehetővé teszi pMR14~en a DNS inszertum szekvenalásáf elejétől végig) alkalmazásával. Azt találtuk, hogy a Vh Inszertum nukleotid szekvenciák számos klánban azonosak voltak, a szignál pepiidben és a J régiókban lévő különbségek kivételével. Ez azt jelentette, hogy a vizsgált klánok független izolátornak, amelyek a RCR lépés folyamán a különböző primerek használata következtében az oligenukleofid keverékekből keletkeztek. A hTNF4Ö (hTNF40Vh) antitest nehéz lánc variábilis dómén meghatározott leinsav szekvenciáját és előrelátható aminosavszekvenciáját a 7. ábrán be (100. számú szekvencia).
A könnyű lánc kiónok analízise céljából megvizsgáltuk az R1053 primer (lásd az 5. táblázatot) és R684 primer (62. számú szekvencia) (amely a humán C- 27 >
5’ re hat és lehetővé teszi pMR1§.1-en a DNS inszertum szekvenálását elejétől végig) használatéval kapott szekvenciát Hasonló módon analizáltuk a 2-es pociban lefolyt reakciókból keletkezett VI gének nukleotid szekvenciáját és az előrelátható aminosav szekvenciát, Megint azt találtuk, hegy a VI inszertum nukleotid szekvenciák számos klánban azonosak voltak, kivéve a szignál pepiidben és d régiókban, ami azt jelenti, hogy a vizsgált kiónok független izolátomok, amelyek a PCR lépés folyamán használt oligonukleotid keverékből keletkeztek a különböző primerek alkalmazása következtében, A hTNF40 (hTNFéOV) antitest könnyű lánc variábilis dómén megbatározott nokieinsav szekvenciáját és előrelátható amlnosav szekvenciáját a 8. ábrán mutatjuk be (99. számú szekvencia).
1. táblázat
Oi
CH1 ; 5'ATGAAATGCAGCTGGGTCAT(G,C)TTCTT3’ (13. száma szekvencia) CH2 ; 5\ATGGGATGGAGeT(A,G)TATCAT{C,GKC,T)TCTT3‘ (14. számú szekvencia)
CH3 ; 5AT6AAG(A(T)TGTGGTTAAACTGGGTTTT3’ (15. számú
CH4 ; 5,ATG(G,A)AC-n'TGGG(T,G)TCAGCTTG(G,A)T3< (18. számú szel CHS: S’ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTZTT3’ (17, számú szekvencia)
GH8 : 5!ATGGCTGTC(C,T)T(G!A)G(G,C)GCT(G,A)CTCTTCTG3i (18. számú szekvencia)
CH7 : 5,ATGG(GíA}ATGGAGC(G5T)GG(GtA)TCTTT(A(C)TCTT3’ (19. számú szekvencia)
CH8 : SATGAGAGTGCTGATTCrnTGTG3: (2Ö. számú szekvencia)
CHS ; 5,ATGG(CÍA)TTGGGTGTGGA(A,C)CTTGCTATT3’ (21. számú szekvencia) CH10 : 5ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCT3·' (22, számú szekvencia)
CH11 : 5ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG31 (23. számú szekvencia) CH12 ; 5! ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCT3S (24. számú szekvencia) primer §’ végéhez hozzál 8!GCGCGCAAGCTTGCCGCCACC~3‘ (28. számú szekvencia).
lik az
2. táblázat
Olígcnckleotici primerek egér könnyű láncok 5' réglőj CL1 : S'ATGAAGTTGCGTGTTÁGGCTGTTGGTGCTS' (28 számú szekvencia) CL2 : 5ATGGAG{TA)CAGACACACTC€TG(T>C}TATGGGT3> (27. számú szekvencia)
CL3 ; S'ATGAGTGTGCTGACTCAGGTCCTO’ (26. szarná szekvencia)
CL4 ; 5fATGAGG(G!A)CCCCTGCTCAG(A!T)TT(CíT)TTGG3í (29. számú szekvencia)
CLS ; §*ATGGATTT(T.A)CAGGTGCAGATT(T.A)TCAGCTT3í (30. számú
CL5A : S'ATGGATTT(T;A)CAíAiG)GTGCAGATT(T!A)TCAGCTT3< (31. számú
CL6 ; 5’ATGAGGT(TiG)C{TCXT,C)TG(T!C)T{G,C)AG(T<C)T(T:C)CTG(A(G)G3' (32. számú szekvencia)
CL? : 5!ATGGGC(T;A)TCAAGAI'GGAGTCACA3! (33. számú szekvencia)
CL6 · 5ATGTGGGGA(T!C)CT(GíT)rnfr,C)C(AÍC)(A>C)TnTrCAAT3i(34. számú szekvencia)
GL9 . SATGGTíGyXjTCCCTAlCAíGGICTCAGTTCCTrS’ (36. számú szekvencia) CL 10 ; 3!ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTC3! (36. számú szekvencia)
CL.11 : S'ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTS' (3?. számú szekvencia) CL12A: SATGCA^jAGTiTCXAJjCAGACCCAGGTCTTCT.CXA,©)!^ (3S, számú szekvencia)
CL12B ; S’ATGGAGACACATTCTCAGGTCTTTGT3’ (39. számú szekvencia) CL13: 6!ATGGAJTGAGAGGCGCAGGTTCTTAT3! (40. számú szekvencia)
CL14 : 5’ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTT3' (41. számú szekvencia)
GL15 ; 6ÍATG>AATTIGCGTGTTCATCTCTTGGTGGT3! (42. számú szekvencia) CL 16 : 5'ATGGATTTTCAATTGGTCCTCATCTCCTT3‘ (43. számú szekvencia) GL17A: S<ATGAGGTGCCTA(A>G)CT(C,G)AGTTCCTG(A>G)G3' (44. számú ^^GCTGAGTTTGTAGGS’
GLÍ7S : S'ATGf
CL17C ; 5’ATGAGGCATTCTCTTGAATTCTTGGG3' (46. számú szekvencia)
Mindegyik fenti primer 5’
GGACTGTTCGAAGCCGCCACC-d’ (47. számú szekvencia)
ZZásrtí1 az S!o.
ík egér Vb és VI gének 3: végéhes syu lánc (CL 12); G-GGA73 (48. számú
Nehéz lánc (R2155):
S'~GCAGATGGGCCCTTCGTTGAGGCTG(A>C){A,G)6AGAC(G!T(A)GTGA3’ (49. számú szekvencia)
4, táblázat
a) 6’ Primer keverékek könnyű tánc FCR reakciókhoz
1. poci: CL2
2. poci: CL?
3. pool; CL73
4. pool; cte
6 pool; CL5A, CL9, C L17A
6. pool; CL8
7. pool; CL72A
3. pool; CL1, GI..3, CL· & ct s ‘Tj; Ví.v\í
CL17C
.14, CL75. CL18, CL77B,
7.
v
b) 5S Primer keverékek nehez lánc FCR reakc k CH7, CH2,CH3, CH4.
</ x Í W ; VZm í: A
3, poci CHO, CH10, CH11, CH12
5, táblázat
Nukleotid szekvencia analízisben használt primerek
5'-GCTGAGÁGÁCTAACAGACTGTTCC3! (50, számú szekvencia) 5'-GCTCTCGGAGGTGCTCCT3' (51. száma szekvencia)
Kimére gének aktivitásának kiértékelése
A kimére gének aktivitását úgy értékeltük ki, hegy emlős sejtekben velő kifejezések után ez öjonnan szintetlzálódctt antitesteket tisztítottuk és mértük. A metodikát az alábbiakban írjuk le, ezt követi az antitestek biológiai vizsgálatához alkalmazott: biokémiai és sejt alapú assay-k leírása.
a) Kimére h')W4Q antitest molekula előállítása
Biológiai kiértékeléshez a kimére antitestet a megfelelő nehéz és könnyű párok kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtekbe veié kotranszfekciéja kalcium-foszfát preclpitáciőt alkalmazva - után tranziens expressziével állítottuk elő,
A banszfekciő előtti napon CHÖ-L761 sejtek félig összefolyt palackiéit fripszinnel kezeltük, a sejteket számláltuk és T75 palackokat készítettünk egyenként 10' sejttel.
A következő napon a transztekcló előtt 3 órával lecseréltük a táptalajt, Transzíekeióhoz a kalcium-foszfát precipitátumol a következőképpen készítettük; a nehéz és a könnyű lánc expresszibe vektorból 50-50 pg-et tartalmazó 0,25 M kaicíuro-kloríd 1,25 ml-ét 1,25 ml 2 x HBS-sel (16.36 g NaCI, 11,0 g KERES és 0,4 g Na^HHO^ 1 liter vízben oldva; a pH 7,1-re beállítva NaQH-vaí} kevertük össze és rögtön hozzáadtuk a sejtek táptalajához. Miután 3 őrén át 37 °C~on COs inkubátorban tartottuk a reakeióelegyet, a táptalajt és a precípitáturoot eltávolltettuk és a sejteket 15 ml 15 %-os glicerin - foszfáttal pufféról! konyhasó
- 31 oldatban (PBS) ~~ hozzáadásával sokkoltuk 1 percig A glicerint eltávolítottuk, a sejteket egyszer mostuk PBS-sel és 484)6 órán át mkuhálfuk 25 ml 10 mM náfnum-butirátof tartalmazó táptalajban. Az antitest a táptalajból tisztítható protein A~Sephrose~ra való kötéssel, majd ieoidással.
b) E1JSÁ
BUSA módszerhez Huné EIJSA lemezeket fedtünk egy éjszakán át 4 ^C-en egy polikloaális kecske antihumán Fc fragmentum specifikus antitest F(ab)g fragmentumával (Jackson Immunoresearch, kód: 109-008-098), fedő pufféiban (15 mól nátrium-karbonát, 35 mM nátrlum-hidrogén-karbonát, pH 8,9) 5 pg/ml koncentráció mellett. A kötetlen antitest eltávolítása céljából desztillált vízzel ötször mostuk a lemezeket. A vizsgálandó mintákat és tisztított standardokat körülbelül 1 pg/ml-re hígítottuk konjugálő púderrel (0,1 M írisz Hül pH 7,0 0,1 M náírtum-kiorid, 0,2 térfogat)·» Tween 20, 0,2 tömeg/férfögat)» Hammersten kazein), A mintákból a mskrohtráió lemezek tartályaiba kétszeres hígításokat mértünk be ügy, hogy minden tartályban ö,1 ml legyen a végső mennyiség és a lemezeket szobahőmérsékleten 1 óra hosszat inkubáltuk rázással Az első inkubációs lépés után a lemezeket 10-szer mostuk desztillált vízzel, ezután 0.1 ml peroxldázzal konjugált egér monoklonálils antihumán kappa (GD1.2 kién) antitesttel (The Binding Bité, köd: MP135) - 1:70ö hígítás konjugálő púderben - inkubáltuk 1 órán át. A lemezeket újból mostuk és minden tartályhoz 0,1 ml szubsztrátum oldatét adtunk. A szubsztrátum oldat 150 pl Ν,Ν,Ν,Ν-tetrametll-benzidint (10 mg/ml DMSO), 150 pl hldrogén-peroxidot (30 %-os oldat) tartalmazott 10 ml 0,1 M nátrium-acefát/nátdum-citrát oldatban (pH 8,0). A lemez kifejlesztését 8-10 percig végeztük, amíg 830 nm-en az abszorpció el nem érte a körülbelül 1,0 értéket a top standardra. Lemez leolvasó segítségével mértük 830 nm-nél az abszorpciót és a minta koncentrációját a titrációs görbéknek a standard görbékhez való hasonlítása
c) Affinitás konstansok meghatározása BioCore analízissel
-32FTNF4Ö és a humán INF közötti kötési kölcsönhatást 8IA technológiával konstans régiója elleni, affinitás-tisztított kecske poifkíonális antitestet ímmööílizáftunk dextrán polimer szenzor csíp felületre standard NHS/EDC kémiai eljárással. A hTNF4ö viszonylag alacsony szintjeit (2Ö0-SÖÖ Rü) fogtuk be, hogy biztosítsuk a tömeg transzport hatások minimalizálását, Különböző koncentrációjú humán TNF-et vittünk át a befogott hTNF4ö~en, hogy lehetővé tegyük az asszociációs kinetika meghatározását. A ligandum injekciója után, puffért engedtünk át a felületen, hogy mérhessük a disszociációt, Á szilárd fázisú hTNF4ö és a humán INF közötti kölcsönhatásra kiszámítottuk az asszociációs és dlsszociáoiős sebességi konstansokat és levezettünk egy Ko értéket.
példa
-beült
A fentiekben leírtuk a hTNF40 antitest nehéz és könnyű lánc variábilis >k génjeinek molekuláris klónozását és alkalmazásukat kiméra (egér-humán) F4ö antitestek termelésére. Az egér hTNF4Ö VI ós Vh nukleotid és amlnosav wncíákaf a ó.s illetve a 7. ábra (99.. számú és 100. számú szekvencia) antitest CDR-beültetését íriuk le.
A h'TNFAO könnyű lánc CDR beültetése
A h'TNEÁÖ könnyű lánc framework régióinak és a négy humán könnyű lánc alcsoport megfelelő régióinak egymáshoz Igazítása (Kabát et ak, 1991, supra) felfedte, hogy a hINF40 leginkább azokkal az antitestekkel volt homológ, amelyek a humán könnyű lánc 1~es alcsoportba tartoznak, Közveíkezésképpen a ÜDR~ beültetett könnyű lánc szerkesztéséhez választolt framework régiók a humán 1-es csoportú konszenzus szekvencia framework régióinak felellek meg.
Az egér hTNF40 framework régiók amlnosav szekvenciáinak és a konszenzus humán 1-es csoportú könnyű láncoknak az összehasonlítása az 1, ábrán látható, amely mulatja, hogy 22 különbözőség (aláhúzva) van a két szekvencia között Analizáltuk, hogy ezek közűi a íramework különbözőségek közül bármelyik hozzájárul-e az antigénkötéshez. Két vizsgálandó csoportot azonosítottunk; ezek a 46. és 80. pozmsók voltak. Ennek az analízisnek az alapján a GDP-beültetett könnyű lánc két változatát szerkesztettük meg. Az egyikben hTNF40~gL1 (8. számú szekvencia) - a 46. és 80. csoport a hTNF40 könnyű táncbét származott, m'ig a másodikban ~~ hTNF4ö~gl2 (9, számé szekvencia) ~~ csoport általánosan elfogadott, (konszenzus) humán csoport volt, kivéve a -as számú csoportot, amely a hTNF4Ö könnyű láncbél származott.
)-oL1 könnyű lánc szí
A hTNF4Ö~gL1 szerkesztését alább részletesen ismertetjük. A kővetkező oligonukieotldöka? (P7982-P7988) használtuk a polimeráz láncreakcióban a csonkított beültetett könnyű lánc összeszerelésére. Az összeszerelt fragmentumból hiányzik az antitest vezérszekvencia és a íramework 1 első 17 amlnosava.
oligo 1 P7982.
5’ G)
TACTAAC GTAGCCTGGTATCAGCAAA3’ (82. számú szekvencia) oiigo 2 P7983:
^CTGGTTTTTGCTGATACCAGGCTACGTS’ (63, számú szekvencia) oiigo 3 P7984:
GGATCCGGT AGTGGTACTGATTTCAC3* (84. számú szekvencia) ohgo 4 r í o’Wví
S’GACAGTAATAAGTGGCGAAATCTTCTGGCTGGAGGCTACTGATCGTG AGGGTGAAATCAGTACCACIACCG3’ (85, számú szekvencia)
-34~ öilge 3 Ρ73>·.· b’ATTTCGCCACTTATTACTGTC
AGTATAACAICTACCCACTCACAT számú szekvencia)
Fwd P7931:
5'GAATTCAGGGTCACCATCACTTGTAAAGCC3' (57. számú szekvencia)
Bwd P978C 5’ szarná
PCR reakcióelegyet készítettünk 100 μΙ-ben, amely a következeket sazta: 10 mM Írisz.HCI, pH 3,3, 1,5 mM magnézium-klohd, 50 mM kálium0,001 témegdérfogat% zselatin, 0,25-0,25 mM a dezoxiribonukleozidtrifoszíátokbői, 2-2 pM P7932, P7083, P7934, P7935, P7083, 10-10 pM P 7030, P 7031 és 1 egység Tag polimeráz. Egy reakciöciklushan 94 öC-t 1 percig, 55 *04 1 percig és 72 *C~t 1 percig alkalmaztunk. Harminc ciklus után minden reakciót agaréz gélben való elektroforézissel analizáltunk, a PCR fragmentumot a gélből kimetszettük és Martnaid kit segítségévei izoláltuk. A kapott fragmentumot BstEH és Spll enzimmel hasítottuk megfelelő pufferben. A kapott terméket végül agaráz gélben elektreforetizálfek és a 270 bázsspár méretű fragmentumot egy gél szeletből izoláltuk, majd a CTIt5~gL6 vektorba (12. ábra) ligáltuk, amelyet előzőleg ugyanezen enzimekkel emésztettünk. A fenti vektor szolgáltatja a hiányzó antitest vezér szekvenciát és a framework 1 első 17 aminosavát
A iigámós keveréket használtuk az E. coli Lm 1035 törzs transzformálására és a kapott telepeket PCR-rel, restrikciós enzimes emésztésekkel és nukleotid szekvonálással analizáltuk A htNB40~gt1 VI régió nukleotid és aminosav szekvenciája a 3, ábrán látható (3. számú szekvencia), lánc szerkesztése
- <55
A hTNF4ö-gL2-t (9. számú szekvencia) PCR használatával szed*
A kővetkező eligonukleotidckat használtuk az aminosav cserék bevezetéséhez:
R1Ö63: 5'GCTGACAGACTAACAGACTGTTCC3’ (59. számú szekvencia)
R5350; 6’ TCTAGATGGCACACCATCTGCTAAGTTTGATGCAGCATAGA1 GAGGAGCTTAGGAGC3' (90. számé szekvencia)
R5349: 5'GCAGATGGTGTGCCATCTAGATTCAGTGGCAGTGGATCA
GGCACAGAC;nTACCCTAAC3f (61. számú szekvencia)
R684: STFCAACTGCTCATCAGATS* (62. számú szekvencia) >t 20 pl-es reakclőelegyet készítettünk. Mindkettő a kövr ta; 10 mM trisz.HCI, pH 8,3, 1,6 mM magnézium-klorid, ISO mM káliumkledé, 0,61 fömegrtérfogat% zselatin, 0,35-6,26 mM a dézexiribonukleozidtrifeszfátokból, 0,1 pg hTNF40~gl1. 6 pM R1Ö53/R6350 vagy R5349/R684 és 0,25 egység Tag polimeráz, A reakciót a következő ciklusén vittük át; 94 1 percig, 66 eC 1 percig és 72 ÖC 1 percig. Harminc ciklus után a reakcióelegyeket agaréz gélben való elektroforézissel analizáltuk, a PCR fragmentumokat a gélből kimetszettük és Mermaid kit alkalmazásával izoláltuk.
Ennek részleteit egy második menet PCR-nek vetettek alá. A reakcióetegy ™ 1ÖÖ pl - a kővetkezőket tartalmazta: 19 mM trisz.HCI, pH 8,3, 1,6 mM magnézium-klorid, 50 mM kállum-klend, 0,01 tömeg.rtérfega!% zselatin, az elsős reakciómenetből kapott PCR fragmentumok mindegyikéből 1/6 rész, 36 pM Rí 066 és R684 és 2,6 egység Tag potimeráz. A reakciöbőmérsékiefek ugyanazok voltak, mint fent, PCR után a keveréket fenol/klcrcfcrm-mal, majd kloroform-mai jk és etanoilal kicsaptuk. Az etanoios csapadékét eenfrifugáiással ük ki,
EH és Spll enzimmel hasik kapott terméket végül agaróz gélben olektreforetizáltuk és a 270 bázis pár méretű DNS fragmentumot egy gél szeletből izoláltuk, végül az előzőleg ugvan^Tw enzimekkel emésztett pMFIS.1 vektorba (4. ábra) ligáitok.
- 36 ··
A ligációs keveréket E. coíi LM 1035 sejtek transzformálására használtuk, és a kapott telepeket FCR-rel, restrikciós enzimes emésztéssel és nukleotld szekvenálással analizáltuk, A hTNF4Ü-gt2 VI régió nukleotld és amlnosavszekvenoiéje a 9, ábrán látható (9, számú szekvencia).
A bTMF4Ö nehéz lánc CDR-beültetése hTHF4ö nehéz lánc CDR-beöttefését ugyanannak a stratégiának az végeztük, mint amelyet a könnyű láncnál leírtunk. Úgy találtuk, hegy a hTNF40 nehéz lánc az 1-es alcsoportba tartózó humán nehéz láncokkal a leginkább homológ és ezért a humán 1-es csoport framework-ök általánosan elfogadott (konszenzus) szekvenciád választottuk a hTNF40 nehéz lánc CDR-ek befogadására.
Vizsgálni kívántuk, hogy mi az előfeltétele annak, hogy egy homológ humán framework úgy működjön a CDR beültetéshez, mint egy akceptor framework, ezért egy második framework-öt - humán 3-as csoport - választottunk a bTNF4Ö nehéz lánc humanizálására.
A KTNF40 framework régió és a két különböző framework régió összehasonlítását a 2, ábrán mutatjuk be, ahol látható, hogy a hTNF4Ö 32 pozíciónál (aláhúzva) különbözik a humán 1-es alcsoporfbeli konszenzus csoportoktól és 40 pozíciónál (aláhúzva) a humán 3~as alcsoportban konszenzus csoportoktól. Miután analizáltuk, hegy ezek közül valamelyik hozzájárulhat-e az antigén kötéshez, a 28-as, 38-as, 46-os, 87-es, 69-es és 71-es csoportot tartottuk meg donorként a gh1hTNF4Ö,1 CÜR-beüiteteft nehéz láncban az. 1-es csoportú framework használatával. A 27-es, 23-as, 3ö~as, 48-as, 48-as, 69-es, 71-es, 73as, 78-os és 78-as csoportot tartottuk meg donorként a gh3hTIMF48,4 CDRbeültetett nehéz láncban a 3-as csoportú framework használatával. A 28-as, 89-es és 71-es csoportot tartottuk meg donorként a gh1hTNF40.4 CDR-beúltetett nehéz láncban az 1-es csoportú framework használatával.
lánc
A gh1hTNF4ö.4~et (10. számú szekvencia) PCR~ben szereltük össze egymást átfedő cligenuklectldokat használva s megfelelő primerek jelenlét PCR~ben a következő oliconukleotidokat használtuk.
-es csoportú graft oligo 1 P7989:
S'GAAGCACCAGGCTTCTTAACCTCTGCTCCTGÁCTGGACG.AGCTGCAC CTGAG AGTGCACGAATTC3’ (63. számú szekvencia) ebgo;
ő’GGTTAAGAAGCCTGGTGC’nCCGTCAAAGTTTCGTGTAAGGCCTCAG GCTAGGTGTTCACAGACTATGGTA3’ (64. számú szekvencia) olige 3 P7991:
ebgo
ATTTATGTrGACGACTTCAAGGGCAGATTGACGTTC3! (66, számú oligo 6 P7992;
5OG.ATGTATGC
GCCCT7GAA3' (67, számú szekvencia) oligo 6 P7993;
ö’CCACAAGCACTGCATACATGGAGCTGTCATCTCTGAGATCCGAGGAC
ACCGCAGTGTACTATS’ (68, számú szekvencia) oilgo 7 F7994:
S’GAATTGGGTACCCTGGCCGCAGTAGTCGATGGCATAAGATCTGTATC GTGTAGCACAATAGTACAGTGCGGTGÍCCTC3' (69. számú szekvencia)
(7ö. számú szekvencia)
Bwd R7987:
S'GAATTGGGTAGGGTGGCGCGÁGTAGTCCATO' (71. számú szekvencia)
Áz összeszereléshez szolgáló raakclóeiegy. 100 pl, a következőket tartalmazta: 10 mM trisz.HCI, pH 8,3, 1,5 mM magnézium-klorid, 80 mM káliumklohd, 0,01 fömeg/tértegatTé zselatin, 0,25-0,25 mM a de trífoszfátokból, 2-2 pM P7989, P790Ö, P7081, P7992, P7993 és R7904, 10P7088 ás P7987 és 2 egység Tag pollmeráz. Egy reakció-ciklusban 94 °C~t i percig, 55 °C~t 1 percig és 72 *C-t 1 percig alkalmaztunk. Harminc ciklus után a reakciőelegyet fenol.ádoroform eíegyévei (1/1}, majd kloroformmal eztrabáltuk és etenollel kicsaptuk, Centníugálás után a DNS-t megfelelő restrikciós pufferben gélből izoláltuk és pMRI 4-be (5. ábra) ligáitok, amelyet előzőleg ugyanezen enzimekkel emésztettünk. A pMR.14 a humán gamma 4 nehéz lánc konstans régióját tartalmazza. Amikor a pMR14-et ApaLI-gyel és Kpnl-gyel hasítjuk, a hasitok vektor úgy tudja befogadni az emésztett ÖNS-t, hogy az emésztett DNS 3' vége a gamma 4 konstans régiót kódoló szekvencia 8' végéhez leolvasási keretben csatlakozik. Ennélfogva az. ebből a vektorból kifejeződő nehéz lánc gamma 4 izotípusó lesz. A ligáciés keveréket használtuk az E. coli LM 1035 sejtek transzformálására és a kapott baktéhumfelepeket restrikciós emésztéssel és nokleotid szekvencia analízissel szűrtük. Ilyen mádon azonosítottunk egy plazmidot, amely a helyes gh1hTNF4Ö.4 szekvenciát (10. ábra) (10. számú szekvencia) tartalmazta.
A gh3hTNF40.4 CDR-beültetett nehéz lánc szerkesztése
A gh3hTNF40.4~et (11 számú szekvencia) PCR-ben szereltük össze egymást átfedő eligonukleetidokat használva a megfelelő primerek jelenlétében. A PCR-ben a kővetkező oliqonukleotldokat használtuk.
3~as csoportú olígo 1 P7999;
SOATGCGCCAGGCTGCACGAGACCGCCTCCTGACTCGACCAGCTG, CCTCAG AGTGCACGAATTC3* (72. számú szekvencia) eilgő 2 P8090:
5'TCTCGTGCAGCCTGGCGGATCGCTGAGATTGTCCTGTGCTGCATCT GGTTACGTCTÍCACAGAC ÍATGGAA3' (73. számú szekvencia) qllgc 3
5‘CCAA
TCATTCCATAGTCTGTGAAGACGT3* (74. számú szekvencia) ellge 4 P799S;
számú szekvencia) oliqo 5 P7897:
ATCTGCCCTTG.AA8’ (75. számú szekvencia)
ACCGCAGTGTAGTAT3’ (76. számú szekvencia)
5OAATTCGTGCACTCTGAGGTTCAGCTGGTC3* (78. számú szekvencia)
Bwd P7987:
5OAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCAT3’ (71. számú szekvencia)
Az összeszereléshez szolgáló reakcíóeiegy, 100 pl, összetétele a következő volt: 10 mM frisz.HCI, pH 8/3, 1,5 mM magnézium-klond, 50 mkl káíium-klohd, 8,81 tömeg/térfogat% zselatin, 0/25-0,25 mM a dezoxlrlbonukieezidfoszfátokból 2-2 pM P7999 és P7993.
10-10 pM P7998 ás F7987 és 1 egység Tag pellmeráz, A reakcióéi kővetkező ciklust alkalmaztuk: 94 °C 1 percig, 55 ÖC 1 percig és 72 ÖC 1 percig. Harminc ciklus után a reakciőelegyef fenoi/ktoroformmal (1/1), majd kloroformmal extraháltak, és efanollai kicsaptuk. Centhfugálás után a DNS-t megfelelő restrikciós pufferben feloldottuk és ApaLI-ígyel és Kpal-gyel emésztettük. A kapott fragmentumét agarőz gélből izoláltuk és pMR14~be (5, ábra) ligáitok, amelyet előzőleg ugyanezen enzimekkel emésztettünk. A pMR14 a humán gamma 4 nehéz lánc konstans régiét tartalmazza. Amikor a pMR14~ef ApaLI-gyel és Kpnlgyel hasítjuk, a hasított vektor úgy képes befogadni az emésztett DNS-t hegy az emésztett DNS 33 vége a gamma 4 konstans régiót kódoló szekvencia 5’ végéhez leolvasási keretben csatlakozik. Ennélfogva az ebből a vektorból kifejeződő nehéz lánc gamma 4 izefipusű lesz. A Iigációs keveréket használtuk az E. coli LM1Ö38 sejtek transzformálására és a kapott baktérium telepeket restrikciós emésztéssel és nukleotid szekvencia analízissel szűrtük. Ilyen mádon egy olyan píazmiőot azonosítottunk, amely a helyes gh3hTNF40.4 szekvenciát (11. számú szekvencia) (11, ábra) tartalmazta.
CDR-beUltetett módosított Fab fragmentum előállítása
A PTTÖ-1 E, coli vektor alkalmazásával előállítottunk módosított Eab fragmentumot a hTNF40 antitestre alapozva. A hTNF4ö antitest variábilis régiéit ebbe a vektorba szubkléneztuk és az intergeníkus szekvencia optimalizálásával hoztuk létre a pTTO(CÖP870) vektort. A vektort úgy szerkesztettük, hogy a rekombináns proteinek ötöm natikus akkumulációját valósítsa meg E, coli-ben. E plazmld főbb vonásai
uh (Iii) (iv) • «ciklín rezisztencia markor - a rezisztencia gén termék nem inaktiváija az antibiotikumot, ennélfogva a plazmid tartalmú sejtek szelekciója megmarad, alacsony másolatszám - a repilkáoiós orlgo a piSA származik, amely a colEi eredetű repilkonokai tartat plazmátokkal kompatibilis;
erős, indukálható lac promoter a klónozott gén(ek) lacH gén - a lao represszor protein konstitutív expresszióját biztosítja, a lac prorootert represszált állapotban tartva az IPTG/alloiakfózzal való indukcióig;
GmpÁ szignál szekvencia - a klónozott gén(ek) periplazroa szekrécióját biztosítja, az OmpA szignál szekvencia transzlációs kapcsolódása egy .ww LacZ pepiidhez, amely a transzláció hatékony megindulását
A vektort módosított Fab fragmentumok expresszíójára fejlesztettük ki egy dicisztronos message-ből egy olyan módszer kigondolása révén, amely empirikus módon szelektálja az optimális intergeníkus szekvenciát egy sor négyféle rendeltetésű kazettából. Ennek alkalmazását a pTTÖfCDFWö) szerkesztésénél írtuk le.
Anyagok és módszerek
IS technikák
Standard eljárásokat használtunk a technikák kivitelezésére, beleértve a DNS hasítást, agaróz gél eíektroforézíst, ligálást és transzformálást. A restrikciós enzimeket és a DNS módosító enzimeket a New England Siolabs vagy a Boehnnger Mannheim cégtől szereztük be és a szállító cégek előírásai szerint alkalmaztuk. A DNS fragmentumokat agarozbol tisztítottuk GeneClean technika (BIÖ 101) alkalmazásával Az ollgonukleotldokat az Osweil Gligonudeofide Service szállította és 40 nrn méretben voltak szintetizálva, Plazmld DNS-i a Plasmíd DMA fdínl/Mídí Kitek (Qiagen) segítségével izoláltunk, PCR-t Perkín Elmer féle „Ampíiiaq” használatával végeztünk, a cég előírásai szedőt. DNS szekvenáláshoz az Applied Biosystems Tag nyele eequencing kitet használtuk.
Rázott palack indukció
Az E, coli W311Ö kultúrákat teiraeikiinnsl (7,5 pg/ml) kiegészített L-levesben tenyésztettük. Indukcióhoz a friss, egy-éjszakás kultúrákat (tenyésztés 30 *C-on) ODsoö ~ 0,1-re hígítottuk 2-literes tereiölemezes palackban 200 mi L~ievesben, dd 30 δΟ·οη tenyésztettük orbltális inkubátorban. ÖDsoo 0.5 elérésekor IPTG-t dntákal (OO~re korrigálva) vettünk.
Peripíazmatikus extrakeié részebuwtakaí fással arattuk le. Rxirakcms ps va , majd oenlriíugáiássaí derítettük
rt egy éjszakán át 30 ®C-on
Az összeszerelés vizsgálata
A módosított Fab koncentrációkat EtlSA módszerrel határoztuk mag. A lemezeket 4 °C-on egy éjszakán át anti-humán Fd 6ö46tel fedtük (2 pg/ml fedő pufferben, fiziológiás konyhasó oldatban, 100 pl/tartály). Mosás után 7ÖÖ pl mintát mértünk be tartályonként; standardként tisztított AőB? gamma-1 Fab-f kezdetként 2 pg/ml-t ~ használtunk, A mintákból 2-szeres sorozathlgifást a lemezen végig minta konjugátum pufferben (literenként 6,05 g főszamino-metán, 2,92 g náfnum-klodd, 0,7 ml Tween-20, 7 ml kazein (0.2 %-os); a lemezeket 1 érán ál szobahőmérsékleten inkufeáltuk, rázással. A lemezeket mostok, szárítottuk, majd 1ÖÖ pl anb-humán C-kappa (GD12)-peroxldáz reagenst (minta konjugátum pufiérben hígítva) adtunk hozzá. Az inkubálást szobahőmérsékleten végeztük, 7 ónén át, rázással A lemezeket mostuk, szántottuk, ezután hozzáadtunk 1ÖÖ pl szubsztrátum oldatot [10 ml nátriumacetát/oitráf oldat (0,1 M, pH ), 1ÖÜ pl hidrogén-peroxid oldat, ÍÓÖ pl tetrametllbenzidin oldat (70 mg/'mí dlmefíl-szulfoxídhanh, A szubsztrátum hozzáadása után
4-6 perc múlva olvastuk le az abszorpciót 630 nm~en.
A pTTO-1 plazmid szerkesztése (a) A pTTG9 poliíinker helyettesítése
A pTTGt) plazmidot az Ámersham cégtől szereztük be és a 14. ábrán mutatjuk be. Egy részletét (2 pg) Ball és EcoRI restrikciós enzimmel emésztettük, az emésztett anyagot 1 %~os agarőz gélen futtattuk és a nagy DNS fragmentumot (4520 bp) tisztítottuk. Két ollgonukleotídot szintetizáltunk, amelyek egymáshoz anellálva az ÖmpA poliíinker régiót kódolják, Lásd a 15, ábrát Ez a szekvencia ragadós végeket tartalmaz, amelyek a pTTQÖ hasítása következtében képződött Sáli és EcoRI végekkel kompatibilisek Ennek a „kazettának” a pTTQá vektorba való klónozása nem regenerálja a Sáli helyet, de az EcoRI hely megmarad. Ez a amelyet az OmpA gén Sbine Dalgarno riboszóma kötőhelye előz mén - első 7 3 aminosavát kódolja. Ezenkívül a következő enzimek száméra tartalmaz restrikciós helyeket; Xbal, Nlunl, Btyl és Spll. A Münl és Styl helyek az OmpA szignál szekvencia kódoló régióján beiül vannak és mint 5’ klónozó helyek gének beépítését szolgálják, A két olígonukleotidot, amelyek ezt a kazettái: létrehozták, ágy anellálluk egymáshoz, hogy 5 pM/pl kcncentráoióban összekevertük, vízfürdőben 95 öC~on 3 percig hevítettük őket, majd lassan szobahőmérsékletre hütőttük Az anellált szekvenciát ezután a Sall/EeoRFgyel hasított p'UQO-be llgáltuk. A kapott köztitermék plazmidot PTQOmp~nek neveztük és DNS szekvanálással ellenőriztük.
(b) Fragmentum előállítás és ligáiás
Á pTTO-1 plazmidot ágy állítottuk elő, hogy egy DNS fragmentumot, amely
7C184 plazmidhóí származott, két olyan fragmentumhoz llgáltonk, amelyek ámp-ből keletkeztek, A pACYCI 84 plazmidot a New England Biolabsrtól szereztük be, a plazmid restrikciós térképe a 18, ábrán látható. Egy részletét (2 pg) teljesen megemésztettük a Styl restrikciós enzimmel, majd Mung Beán nukleázzal kezeltük', az a kezelés tompa végeket hoz létre azáltal, hogy visszavágja az 5' túlnyúló bázisokat. Fenolős extrahálás és efanoíos klosapás után a ONSrt Pvull-vel hasítottuk és Így kaptuk a 2348; 1081, 412 és 403 bp mérető fragmentumokat. A .2348 bp méretű fragmentumot agaróz gél elektroforézb után tisztítottuk. Ez a fragmentum kódolja a letraciktín rezisztencia markert és a pl5Á replikációs origo-t A fragmentumot ezután borjúból alkalikus foszíatázzai kezeltük, hogy ettávoíifsuk az 5’ ternvnális foszfátokat, hogy ezáltal megakadályozzuk a molekula őn-ligációjáí.
A pTQOmp plazmid egy részletét (2 pg) Sspí és EooRI enzimmel emésztettük és a 2350 bp hosszú fragmentumot, agaróz gél elektrcforézis után, megtisztítottuk a nem kívánatos 2040 bp és 170 bp bosszú fragmentumoktól; ez a fragmentum kódolja a transzkripció termlnáíor régiót és a laolq gént. A pTQOmp egy másik részletét (2 pg) BcoRI-gye! és Xmnhgyeí emésztettük és Így kaptuk a 2289, 1670, 350 és 250 bp méretű fragmentumokat. A 350 bp hosszú fragmentumot, amely a tac promotert, az OmpÁ szignál szekvenciát és a többszörös klónozó helyet kódolja, gélben tisztítottuk.
három fragmentumot ezután ligáltuk, az egyes fragmentumok nmeláris mennyiségeket használva. Minden kiónezási junkciót
DNS szekvenálássai ellenőriztünk. A piazmid restrikciós térképét a 17, ábra mutatja. A pTTÖ-2 plazmidot ezután a humán lg könnyű lánc kappa konstans dornént kódoló DNS beépítésével készítettük el, Ezt a pHC132 plazmidbői kaptuk Spll-EcoRÍ restríokiós fragmentumként, amelyet a pTTO-1 megfelelő helyére építettünk be A pTTÖ-2 piazmid a 18, ábrán lf
Humanizált hTNF4Ö variábilis ρΤΤΟ-2-be
A hTNF40gL1 variábilis könnyű lánc régiót (8. számú szekvencia) a megfelelő, emlős sejt expressziéhez való pMR1ö~1 vektorból, PCR-rel való „kiszabadítás (RCR jescue) útján kaptuk meg. Az ömpA vezérszekvencia helyettesíti az eredeti lg vezérszekvenciát, A RCR primerek szekvenciáját az
GGCGCGGCAATTGCA GTGGCCTTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAAG
3! primer:
TTCAACTGCTCATCAGATGG (80, számú szekvencia)
A standard teltételek mellett végzett FCR után a terméket tisztítottuk, Muci és Spll enzimmel emésztettük, majd gélben tisztítottuk. A tisztifoff fragmentumot ezután a pTTG-2 Munl/Spll helyére építettük be, a pTTOc'hTNFéöU könnyű tánc köztitennék előállítása céljából,
A gh3hTNF4ö.4 variábilis nehéz lánc régiót hasonló módon kaptuk a pGamma-4 vektorból. A FGR primereket alább ismertetjük.
o primer;
GCTATCGCAATTGCAGTGGCGCTAGCTGGTTTCGCCACCGTGGCGCAAG (81, számú szekvencia)
31 primer;
GCCTGAGTTCCAGGAGAC számú sze
PCR után a terméket tisztítottuk, Nhel és Apai enzimmel emésztettük, majd a pöNÁbEng-GI vektorba (19. ábra) szubklónoztuk, DNS szekvenáiással való ellenőrzés után a nehéz láncot EcoRI enzimmel hasítottuk és a pTTO(hTNF4ÖL) EcoRI helyére klónoztuk be, miáltal megkaptuk a p'TTÖ(hTNF40) E. coli ntergenikus szekvencia optimalizálása módosított Fab expresszióhoz
A p'FTO vektorban a módosított Fab expressziója történik meg agy olyan dicisztronos message-ből, amely először a könnyű láncot, majd a nehéz láncot kódolja, A két gén közötti DNS szekvencia (intergenikus szekvencia ~ IGS) befolyásolhatja a nehéz lánc expressziójának szintjét azzal, hogy kihat a transzláció elindulásának a gyorsaságára. Például; egy rövid intergenikus szekvencia transzláció kapcsolódást eredményezhet a könnyű és nehéz lánc között;, amennyiben a transzlafáló fihoszőma nem teljesen válik el a mRNS-lői a könnyű lánc szintézis befejeződése után, a nehéz lánc szintézis megindulása előtt. Bármelyik Shine Dalgamo (SD) ribcszöma kötőhely (a 163 rRNS-sei homológ) „erejének” („strengfb”) is lehet hatása, mint ahogy hatása lehet az SD és az ATG start kodon közötti távolságnak és szekvencia összetételének. Az ATG körül a mRNS potenciális másodlagos szerkezete egy másik fontos faktor; az
ATG-nek „hurokéban kell lennie és nem egy „száC-on belül beszorítva, míg a fordítottja érvényes az SD-re, Tehát az IGS összetételének és hosszúságának a módosításával lehetővé válik a transzláció iniciációs erejének a módosítása és ennélfogva a nehéz lánc termelődés szintiének a módosítása. Valószínű, hogv a transzláció elindulásának optimális gyorsaságot kell elérnie ahhoz, hogy egy adott Fab nehéz láncának az expressziőját maximalizálja Például; az. egyik módosított Fab esetén a magas szintű expresszié tolerálható, de egy eltérő módosított, elférő ammosavszekwnoiájú Fab esetén toxikusnak bizonyulhat, talán a szekréció vagy a felgombolyodás eltérő eredményessége miatt. Ezért négy intergenikus szekvencia sorozatot terveztünk (20, ábra), amely lehetővé tette, hogy a hTNF40alapú módosított Fab számára empirikusan határozzuk meg az optimális IGS t Az IGS1 és IGS2 nagyon rövid intergenikus szekvenciák (-1, illetve +1} és várhatóan szorosan összekapcsolódó transzlációt eredményeznek; az SD szekvenciák (aláhúzva) kevéssé különböznek. Ez a két szekvencia nagy valószínűséggel a transzlációs íniclácló magas szintjét biztosítja. Az IGSS-han ás íGS4-han hosszabb a távolság a start és a stop kodon között (-M3) és szekvencia összetételük különbözik; az IGS3~nak „erősebb az Sö szekvenciája, Mindet szekvencia másodlagos szerkezetét tanulmányoztuk (az m/fold programot használtuk) és amennyire lehetett, „optimalizáltuk; azonban a két lánc transzlációjának szoros összekapcsolódása esetén a nboszómálls disszociáció hiánya azt jelenti, hogy a mRNG nem lehet JeceupaszltotF, amely megakadályozza a másodlagos szerkezet kialakulását.
IGS variánsok klónozása.
A 2ö, ábrán látható IGS kazetták határos Sacl és Munl klónozó h Imaznak, Ezeket komplementer oligonukleotíd párok anehélása révén lük. Vektor fragmentumot készítettünk a pTíÖ(hTNF40) Saoí-gyei és Notlgyel való emésztésével, a nehéz lánc fragmentumot pedig a pDNAbEngG'1(hTNF40H) Muní-gyei és Notl-gyel való emésztésével állítottuk elő. Három lépéses llgáciökaf végeztünk úgy, hogy a két restrikciós fragmentum ekvimoíárís mennyiségeit használtuk és az egyes anollált oíigo kazettákból plazmidot állítottuk elő: PTTO(bTNF40 IGS-1), pTTO(hTNF4Q lGS-2), pTTQ(hTNF40 IGS-3). pTTO(hTNF4ö IGS-4),
Rázott palackos expresszié analízis.
A négy plazmiddal E. coll W3110 törzset transzformáltunk, ugyanakkor az eredeti expressziós szerkezettel is, majd a rázott palackok tartalmát expressziére analizáltuk, ahogyan leírtuk. Egy jellemző kisédei eredményeit a 21, ábrán be. A különböző intergeníkus szekvenciák különböző ex«r profilokat eredményeztek. Az IGS1 és IGS2 gyorson akkumulálja pertplazmatikus módosított Fafe-t egy csúccsal az indukció után 1 óra múlva, azután a kinyerés szintje esik, í6S1-néí a csúcs nagyobb, az esés élesebb. Ezek az eredmények egybevágnak a szintézis magas szintjével, mint várható volt ezeknél a szerkezeteknél a szoros transzlációs kapcsolódás következtében. Kétségtelen, hogy az IGS1 a nehéz lánc expresszié magasabb szintjét eredményezi, mint az IGG2. Ebben az esetben úgy tűnik, hogy ez a magasabb szintű expresszió nehezen tolerálható, mivel a pertplazmatikus expressziős szintek az 1 órás csúcs amely az Indukció után 1 óra múlva eléri a csúcsot az esés előtt, amiből halálra és lizisre lehet következtetni. Áz IGS3 lassabban akkumulálja a módosított Fab-f, de az indukció után 2 órával magasabb csúcs értékkel (325 ng/ml/GD) éh el a csúcsot, mielőtt a szintek esnek. Ennek a tenyészetnek a növekedése 3 órán át folytatódott az Indukció után és magasabb csúccsal érte ei a biomasszát (nem mutatjuk). Ez egybevág egy alacsonyabb szintű nehéz lánc szintézissel. Az IGS4 az anyagot még lassabban akkumulálja és nem sikerül elérnie a másik 3 szerkezet termelékenységének magas csúcsát. Mindegyik IGS variáns teljesítményben jelentősen felülmúlja az eredeti vektorét. Azt a hipotézist, hogy a különböző IGG szekvenciák a transzlációt különböző gyorsasággal indítják el, ezek a kísérteti eredmények alátámasztják, Ami a hTNF4Ö alapú módosított Fab-t illeti, úgy tűnik, hogy a nehéz lánc transzláció Inlcláció magas üteme kevéssé tolerált és ezért nem optimális. Egy lassabb ütem, amit az IGS3 biztosit, jobb növekedési tulajdonságokat eredményez és ennek következtében idővel jobb hozam halmozódik fel.
A fermentorban kapott kitermelés összehasonlítása után az IGS3 szerkezetet választottuk, minthogy ez adta a legmagasabb hozamot és pTTO(CDPS70)~nek neveztük el - lásd a 22. ábrát.
A pTTO(CDP870) plazmíd által kódolt nehéz lánc szekvenciáját a 115. számú szekvencia mutatja és a könnyű lánc szekvenciáját a 113. számú szekvencia
-49~
A CDR-beültetett, hTNE4Q-aiapú módosított Fab PEGilezése.
A tisztított, módosított Fab-t heíy-speeiíikusan konjugálfuk egy elágazó láncú REG molekulával. Ezt ügy értük el, hogy a módosított Fab csonkított csokié régiójában egyetlen oiszteln csoportot aktiváltunk, majd (PEGMíziLmalelnsavimiddél reagáltattuk, mint előzőleg leírták [Ά.Ρ. Chapman et al. Natúré Bíotecbnology, IX, 78Ö-783 (1991)1 Á PEGilezett molekulái a 13, ábrán mutáljuk be és a vegyületet CDP870-nek neveztük el. A PEGilezett CDR-beültetett. h7NF40-alapú módosított. Fab (CDP870) hatékonysága a rheumatoid arthritis kezelésében.
A CDP87ö~nek hosszú a felezési ideje, körülbelül 11 nap.
Egy intravénás COP870 ártalmatlanságát és hí -vak, ptacebo-eííenöízőtt, növekvő dózissal
A londoni, cambhdgei, nerfolki és norwichi (UK) Rheuroalológiai Klinikák ambuláns betegei közül olyan 18 és 75 év közötti korú pacienseket választetfunk, akik kielégítették az American College of Rbeumafology (ACR) 1937-ben átdolgozott, rheumatoid arthrtis~re (RÁ) vonatkozó diagnosztikai kritériumait [Árnett et ak, Arthritis Rheuro., 31, 315-324 (1983)1 Megszabtuk, hogy a pacienseknek klinikailag aktív betegsége legyen, amelyet a következő kritériumok közül legalább 3 határoz meg; a 8 fájdalmas vagy érzékeny ízület, a 45 percig tartó kora reggeli merevség; és a vörösvérsejt ülepedés! sebesség (ESR ~ erythrocyte sedimentafion taté) z 28 mm/h. Legalább egy betegség módosító reuma ellenes gyógyszerre (Disease Modlfying Antl-Rbeumatio Drog ~ DRARDj ne tudjanak válaszolni és legalább 4 hete nem kaptak kezelést. A kortikoszteroldok voltak, ha a dózis prednízoionböl a 7,5 mg/nap volt. Kizártuk a röket és azokat a nőket, akik szülőképes korúak és nem nv fogamzásgátlási módszert. Azokat a pacienseket is kizártuk, rok a megelőző kortörténetében rosszindulatú betegség fordult elő, amely súlyos, ellenőrizhetetlen egészségi állapottal járt együtt, továbbá akiknél előzőleg s-neufralizáió terápia nem volt sikeres vagy akik poiiet.ilén~glil allergiásak. Felvétel előtt minden pacb kunk, A vizsgálatokat a hét etikai búrt
RA beteget 3 csoportba osztottunk, mindegyik csoport a vizsgálati gyógyszerből növekvő dózist (1,5 vagy 20 mg/kg) kapott. Mindegyik 12 főből állá találomra 8 főre - akik COPSTOtet kaptak - és 4 főm - akik placebo-f osztottunk, A CDP870~et egyetlen intravénás infúzióban (összesen Wö ml) adtok be 60 perc alatt, A piacéból (nátrium-acélát pufféi) hasonlóan adtuk be egyetlen 100 ml-es infúzióként 50 perc alatt. A kezelést anteulanter végeztük. >'olo hét múlva minden betegnek alkalmat adtunk, hogy nyíltan vagy 5, vagy 20
Klinikai kiértékelés:
A RA betegség aktivitásét a World Health Organizabon and International League of Ássociations fór Rhenmateíogy [Boers et at, d. RheumateL kiegészítés, 411 36-39 (1904)) és a European League Agalnst Rheumatism (EÜLAR) [Beolt et al, Clin, Exp. RheumateL, 10 621-525 (1992)) 28 Ízület ponfszámait tertaimazo alap-adat készletek (oore dala sete wlth 28 joint counts) alapján értékeltük ki, A betegség aktivitásában bekövetkező változásokat a Disease Actlvlty Bccre (betegség aktivitás pontszám) [Preavo et a!., Arthritis Rheum., 38λ 727-735 (1995)] segítségévei értékeltük. Az értékeléseket a kezelés előtt és a terápia után az 1., 2,, 4., 6. és 8. héten végeztük el, A pacienseknél a vizsgálati gyógyszer ártalmatlanságát ás elviseihetőségét is értékeltük. Minden vizitnél hematológiai és biokémiai értékelést végeztünk, vizsgáltuk továbbá az anti-CDP87Ö antitesteket és a káros mellékhatásokat..
COP870 plazma koncentráció és anfi-CDP870 antitestek:
A CDP87Ö~et enzlm-immunassay-veí (ELÍSA) mértük. A paciensekből nyert plazma sorozathígításait rekombínáns humán TMPo-val (Sfrathmann Bíetecb
- 51 GmbH, Hannover) fedett mikrotltráló lemezeken (Huné) inkuháltuk. A bet CDP87Ö-et torma peroxidázzal konjugáít kecske antbhumán kappa könnyű lánc (Cappel, ICN), ezt követően tetrametil-benzldin (TM8) szubsztráfum hozzáadásával matattuk ki,
CDP87Ö elleni antitestekre (1/10 plazma hígítás mellett) kettős antigén szendvics ELÍSA - második rétegként hiotinezett CDP870 szolgált - használatával szűrtünk. A megkötött antitesteket HRP-szfreptavídin és TMB szubsztráfum segítségével mutattuk ki, Az assay-t egy hipehmmun nyúl IgG standardot znáiva kalibráltuk. Egy egységnyi aktivitás 1 pg nyúl kódo ki 0,284 teljes oki ah mag
Statisztikai analízis
A vizsgálat kutatási jellegű volt és a minta mennyisége hasonló szerekkel tapasztalaton alapult. A CDP870 hatékonyságát a betegség aktivitási score ” DAS) kiszámításával analizáltuk, az válaszokat a kezelésbe való bevonáshoz használtuk és profokollonként tesztelési eljárást használtunk. A betegség aktivitás pontszernél a óképpen számítottuk ki; DAS ~ 0,555 x (28 puha ízület) négyzetgyöke v x (28 duzzadt ízület) négyzetgyöke * 0,7 x In (ESR) * 0,0142 x (a beteg értékelése). Először az egyesített aktív csoportokat hasonlítottuk a . Ha ez ez összehasonlítás 5 %-os szinten szignifikáns volt, mindegyik iási csoportnál elvégeztük az összehasonlítást. Minden összehasonlítást két iwo felied) módszerrel végeztünk 5 %-os szlgniíikancia szinttel. Minden plsérletí analízisből származott és ezek nem használta
EREDMÉNYEK
Demográfia;
Harminchat RÁ pacienst toboroztunk, demográfiai adataikat a 8. táblázat tartalmazza. Az átlag életkor §8 év volt és 30 paciens volt nő. A RA közepes időtartama 13 év volt és 21 paciens rheumatoid faktor pozitív volt. A különböző csoportokba tartozó pacienseknek hasonló demográfiai jellemzőik voltak. A vak adagolási szakaszban 8/12 piacebo-kezeil paciens visszalépett a vizsgálatból az no adagolás után > 4 héttel rosszabbodó RA miatt. A CÖP870-kezelf paciensek közöl 2/24 visszalépett, mindkettő az 1 mg/kg csoportból, rosszabbodó RA miatt, illetve nem vett részt a követésben > 4 héttel az adagolás után. A különbség statisztikailag szignifikáns veit (p ~ 0,009, Rsher egzakt teszt).
± standard eltérés)
Szám Nem (Férfimé) Kor Betegség időtartama Rheumatoid faktor lÜözőDNSRÖT száma
Piacéba 12 1.11 51 ±8 1218 8 (87%) 5M
1 mg/kg 0 1:7 50±7 12±7 4 (80%)
5 mg/kg 8 2:0 54113 1315 5 (63%) Sl2
20 mg/kg 8 2.0 61 ±11 14±13 4 (50%) 4±2
Klinikai hatékonyság:
A protokcllonkénti populációnál az elvégzett utolsó megfigyelésig az ACR2Ö javulást mutató paciensek százalékos aránya piacéba és 1,5 és 20 mg/kg CDP870 után 18,7, 50, 87,5, illetve 62,5 % volt (összevont kezelési eredmény p « 0,001) a 4. héten és 18.7, 25, 75 és 75 % (p ~ 0,032) a 8. héten, A pmtokcllonkéntl populációnál az elvégzett utolsó megfigyelésig a ÖAS pontokban elért csökkenés (médián) placebe, 1,5 és 20 mg/kg CDP870 adása után 0,15, 1,14, 1,91 és 1,88 volt (összevont kezelési eredmény p - 0,801) a 4. héten és
0,31, 0,09, 2,09 és 1,70 (p 0,008) a 8. héten (23. ábra). A World Health örganization and International League of Ássociaficn fór Rheumatoiogy alap ada készlet individuális összetevőiben
A CÖP870 kódolatlan címkével ellátott dózisának adása után hasonló )/ hatásokat értünk el A vizsgálatba bevont 38 beteg közül 32 kapott rnásc CDP87Ö Infúziót, Az előző első infúziótól az ACR2Ö javulást mutató aránya 72,2 és 35,6 % volt 5 és 2í
COP870-nél a 4, héten és 55,0 és Of
1,7 % a 8. héten.
reiést jól tűrték a paciensek, infúzióval kapcsolatos reakció nem k allergiás reakciói vagy bőrkiütést, Á kettős-vak fázisban 19, 38, 8 és 14 kedveződen esemény fordult elő a piacéba, 1,9, illetve 20 mg/kg csoportban. A legáltalánosabb a fejfájás volt 5 paciensnél (piacebonái 1, 1 mg/kgnál 3 és 20 mg/kg~nál 1) 9 esetben. Egy paciensnél, aki piacéból kapott és 3 paciensnél, akik CDP870-et kaptak (5 mg/kg-nál 1 és 20 mg/kg-nál .2) alsó légúti 5zés alakult ki, Ezeket enyhe vagy közepes lefolyásúnak mondták, orális antibiotikumokkal kezelték és 1-2 bét alatt megszűntek. Három paciensnél - az 1 és 5 mg/kg csoportban ······· és egy paciensnél a 20 mg/kg csoportban húgyúti fertőzés alakult ki 1-2 hónappal a CDP870 kezelés után. Egy kedvezőtlen eseményt súlyosnak írtak le, ez egy nyakl fájdalom volt, amely 1 mg/kg-os infúzió után 3 nappal fordult elő. Négy paciensnél anti-nukleáds antitest növekedést észleltek: a piacéba csoportban 1 (negaflvröl IMO-re), az 1 mg/kg csoportban 2 (negatívról 1/4ü~re, negatívról 1/80-ra) és a 20 mg/kg csoportban 1 (negatívról 1/40-re). Nem találtak változást az anti-DNS vagy anti-kardiollpin antitestekben.
CDP370 plazma koncentráció és antl-CDP8?0 szintek,
Mint várható volt, a CDP87Ö minden dózis szintjénél a plazma koncentráció az infúzió befejezésekor érte el csúcsát, dózis arányos volt a plazma koncentrációval, majd ezután lassan csökkent. A CDPS7Ö plazma koncentráció profilja nagyon hasonlónak látszott ahhoz, amelyet önkéntesekben előzőleg megfigyeltünk, amikor úgy számoltunk, hogy a felezési idő körülbelül 14 nap. Újbóli adáskor az egy~adagos infúziónál hasonló profilt figyeltünk meg.
Egy egy-adagos intravénás infúziót követően az anti-CDP370 szintek alacsonyak vagy klmutathatatíanok voltak.
A TNFg centralizálása RA-ban egy hatékony kezelési stratégia. Ehhez jelenleg biológiai hatóanyagok használatára van szükség, ilyen egy kimére mAt vagy egy oldható receptor/humán Fc fúziós protein, amelyeknek költséges az előállítása. Egy terápiás TNEa neufraiizálő szemek magas affinitással kell kötnie a TNEo-t és hosszú felezési idővel, alacsony antigenicitássai kell rendelkeznie,
igen jó az elvvel hefösége és legyen ártalmatlan, Legyen RA beteg számára, akiknél a TNFö blokád jótékony hatású, jy olyan technológia, amellyel ezek a célok elérhetők egy E. coli-ben előállított TNFo kötő antitest fragmentum polietllen-glikollal való konjugálása. Ebben az előzetes vizsgálatban úgy találtuk, hogy a CDP870, egy PEGilezett, anti-TNFo, módosított Fan, hatásos és a RA betegek jól tűrik
In vlfro kísérletekben kimutattuk, hogy a CDP870 hasonló TNFo neutralizáló hatást lejt ki, mint az eredeti egér anti-TNFo antitest. Ez a vizsgálat megerősítette, hogy a CDP87Ő csökkenti a gyulladást és javítja a RÁ tüneteit. A klinikai javulás az 5 és 28 mg/kg csoportban (75 %, 75 %) - az ACR20 válasz kritériumokkal mérve - hasonlítható volt az efaneroepl-hez (80 %) [Moreland et at, Annals Int, Med. 130« 478-488 (1999)j és az lndiximab«boz (50 %) [Meinl et at, Lanoef. 354, 1932-1933 (1999)]. A vizsgáit közepes és legmagasabb adagolási szinteknél a terápiás hatás 6 hétig tartott, amely az előző többi mAt-bez hasonlítható (PIllőt et al,, Láncét, 344, 1105-1110 (1994) és Rankin et al,, Sr, d, Rbeumafol,, 34,.,.,.,.,. 334342 (1985}j . Előző vizsgálatban kimutatták, hogy az anti-TNFo antitest terápiás hatása plazma felezési idejével és keringő antitestek képződésével van összefüggésben [Main! et. al., Arthritis Rheum., 36, (kiegészítés): S188 (1895) (kivonat)]. A mi vizsgálatunk kimutatta, hogy a CDP87G felezési ideje 14 nap, ami azonos egy teljes antitestével (Rankin ef al,, lásd fentebb) és sokkal hosszabb a konjugálaflan Fab! fragmentumok felezési idejénél. Ezenkívül a CDPB7Ö ellen csak alacsony szinteken képződött antitest válasz.
Ennek a tanulmánynak egyik fontos célja az volt, hogy megvizsgáljuk ezen PEGilezett Fab* alkalmazásának elviselhetőségét és ártalmatlanságát. A mi vizsgálatunkban a CDP870 jól eiviselhetőnek mutatkozott Mindazonáltal további vizsgálat lesz szükséges ahhoz, hogy kiértékeljük a hosszantartó toxicitást különösen a demielinlzálő betegség, fertőzés és bőr kiütés kockázatát, amelyről az efanereept és lófllximab alkalmazásával kapcsolatban számoltak be.
összegezve, a CDP870 terápiásán hatásos RA-ban és ebben a rövid lejáratú vizsgálatban jól eiviselhetőnek bizonyult.
Magától értetődik, hogy a fenti példák csapán a szemléltetés célját szolgálják és nem korlátozzák a találmány oltalmi körét, amelyet a következő igénypontokban határoztunk meg
S2EKVE2C2A O22TA <212> 2.
<2113 S <212s 227' <2133 Uesiersépar saekveacie < 2 203 <2233 A sasaPerseees ssekvenel.a lei rése:hTNS4 0 CSEHI < 4 0 0 > 1
Asp Tyr Giy Ast Asn 2 b •<21Ö> 2 <2113 27 <2123 227' <223> beste;:séges esekvenci-s <2203 <223s A sreslrersépes szekvencia 2eiress:h<hF40/hai0ÁA hibrid SGRH2 <4003 .2
Trp lie Ásn Thr l’yr lile Oly Gl.a Pro lls Tyr Alá Asp Ser Vsl Lys 2 5 775 ' 22 y
<22.0> 3 <221> 2 <2227· 227’ < 2 2 3> M s s te r s é ge s s a sí k ver; cl a <2203 <223> A sfiesterxégsx szekvencia leírása;hTFF4.0 CDRH3 <7 00,- 2
Oly Tyr Arp Ser 7'v,r Alá bet Asp Cyr 2 ' 8 <210;- 7 <22.1> 12.
<212> PA7: <2 2 3> b® x t e r s é a a x se k 3r e a c 1 á <222>
<223> A mesterséges szekvencia leirése:0727240 CORlb.
<400> 4
Lys Alá Ser Sin Aer; Va2. Oly ?br Asn Vei Alá 1 8 16 <210> δ <211> 7 <212> rr?
<2 13 > s t ez s é ge ;s se k ve ?,ci -3 <220>
<223:> A srestereéges szekvetscis. ieíréssxhTNFáü 0DRL2 <400> 5
Ser Ale Ser ?he Le» Fyr Ser 1 3 .·' ·> '; ·< j”j .· '\x: -a v f'.í'.w
v.:-χ\Λ < 2 X. 2 > Ue s t s r sége e s e e kve ne ie <223> A {mesterséges szekvencia leírása; hTNFéü CDRL3 <RSS> ·5 •lle Gl.e ?yr Ase He ?yr Pre Lee ?ltr 1 3 <210> 7 <<·.}.> 17 <2l2.> PPL <213> Mesterséges szskvencis <22 0>
<223> A mesterséges szekvencia leírása ;h'2URéO C0S.Í12 <40ö> ?
Trp He Asn. Thr Tyr He Sry Gin Pro He Tyr Vei Asp Asp £*he Lys 1 ' 3 ' 10 ' 15
Giy «2X0 8 <211> 721 <212> DNS <213> Mes tér céges s zekven.c i &
<220>
<22ir COS <222> 11),.(321} <220>
<223<' A mesterséges szekvencia laírásajMWéÖ-ghX <400 8 gac ett -sas etg sec cég ege cos tcc ege ctg ege gca tet gta ggs
Asp Ile Alt Get Thr Gin Ser Pro Ser Ser tea Ser Alá Ser Vei Aiy i s 10 IS
gae cgg gr?:: acc Thr 20 ;j:j He art; tgt eae gee agt eag aae gta ggt aet Thr aae 0$ Aae
ASp Arp Val Thr Cys Lys AI® 25 Ser Gin Aaa Val Sly 00
gta geo agg tat aag eaa aaa ara mm aaa gee aaa aaa gaa etc ate 144
val Al a Trp Tyr Gin Gin Lys Őre Gly Gys Alá ara Lvs Alá Len 11®
3 5 40 45
tac aat gác t: ct ttc ere. tat ag r. ggt gta ee.a tac agg ttc agc gga 102
Tyr S®r Air Ser She Lee Tyr Ser Gly val Pro Tyr Arg Aha Se r Gly
50 SS 00
tee GGt agt ggt act get rt.e a ee ate a cg agt ege etc eag i;a 240
Ο® X G.ty Sör Gly Thr Asp Oh® Thr Leu Thr 11¾ Sőt Sár Lee Gin Őre
85 ?h £· ,· , s> 00
gaa gat tta gee aet tat tac tgt eaa cag tat aaa ate tac eaa rte 228
Gin Asp rhe j..·::; Thr Tyr Tyr Gya Gin: Gin Tyr Asn 11a Tyr Őre Lan
35 90 05
JJ tte 2<m aag mm •GtCti gta gaa ere aaa *> A
Thr Oh® G1 y Gla Gly Thr Lys? Vei Gin 11® Sva
100 105
<21Ö> 9 <211> 321 <212> LSS <213 > Gee tarreg e a s reiveacla
<220> <221 > GhS <22 2 > L; . i' 321 ·
<220> <223> A ffirnnter'.aggös árökvöncia leírásaxhThl'4ö-gt2
<400> 9
ga.e att csá atg aee eeg age aaa tee aga atg aga gaa tat gta aga 4 0
Aaa 11® Gin T Get Thr Gin Sár Sre Ser Ser Lee Ser Alá Ser val Gly 5 10 IS
gae agg gte aae ate att tgt aaa gee agy eag aae gta ggt att aae SS
Aap Arg Val Thr Xla Thr Cys Lys Alá Ser Gin Asm Val. Gly Thr Asn 20 ' 25 30
gta gén tgg tat eag eaa aaa aaa ggt aaa gee tea aaa. cta ate ata 144
Val Alá Tra 05 Tyr Sít Gin Lys Őre Gly Lys A le Sre Lys tea Lee. 11® 40 45
tar agt gee tét tte etc tat agt ggt gta cca tar: agg tea age gga 102
Tyr Ser Alá 50 Sár Gee Lön Tyr Ser Gly Val Őre Tyr Arg Áh® Ser Gly 55 Síi
tea ggt agt ggt aae gat tta eee eta aaa ate agt age ere aag eaa 240
Ser Gly Ser SS Gly Tér Asp Ohe Thr Lee Tér He Ser Sö:r Lee. Gin Ara 20 7 5 00
gaa gat át a g cc art tat tar Agg eaa esg tat eae atc tat cca ere
üt Asp 2h« A1 a Thr Tyr Tyr Gye ür Cl a Tyr Asn üe Tyr Pro tea
55 ü 95
CCS ·::::? üt esc tü art aas gr a gaa sec aaa
Tar 3 he Gly Cl a ily Thr Lys laí ün ric Lye
1SÍ1 333 <2i0.> 13 <215> 354 <212.> ü <215> Mestsrs^g«s szekvencia <22Ü <221> CDS <222> 31}.. {354;
<22 3 >
<223> A ggaterségas szekvencia. leírása:güATAüO.4 !1O. ábra;
<43Ö> 13
rag Gin. 1 gtg Vei rag ün ctg tea gtg ü a rag Cin tea •Ser gga Ciy CCS Ai s gag üa 10 gtt Val aag tys< aag ?5ys Art 3rr üt Giy IS get Alá ·':«· O
t cc gtg a a a gtt t.gg tet. aag gec tea gye tsc gtg cte ara gae tat Aj :·>
Ser Vei Lys Vei 20 Se·: iys 3ys Áia Ser 25 C.ty Tyr Vai CAe Thr 30 Asp Tyr
ggt ctg aat tü tar ags 9.8.0: ere gga & ege ctg gss tgg atg 144:
C.i y Aet Aha Trp ül Arg üt Ara Orr üy Üti üy tag Ü: Trp Mer
35 4 3 45
Ü: Ü att aat art tar att gga T< cet att r at get caa aag t:tr:
üy Trp üe Asa Bit Tyr Üe Cl y Üe üe Tyr A.is cm Lys The
55 55 60
rác agg aga ctg agg tcc get cta gae arc tcc ara aga art g ea tag 240
Gin ily Arg Vas. Tar 3Ae Tar Lee Asp Tér Ser TAr Ser TAr Aia Tyr
65 3 0 15 80
atg gag rtg tea tea ctg aga á re gag gse agg ec a ctg tar tat tgt ·' $·
Met Cl a .Léc Ser Ser tea Arg Ser üe Asp TAr aga Vei Tyr Tyr 5ys:
83 33 35
get aga ü i. .. c aga tet tat gec atg gae tag tgg ggg cég- ggt sec 333=
Áia Arg xú Á. V Tyr Arg Ser Tyr A1 a Cet Asp Tyr Trp üy űé üy TAr
133 555 115
cta gtc ara gtc tcc tea tet Vél Tar Val Sár Ser ül
354
-60<2)0 11 <210 354 <2 32> OS <210 MssítérSégc.a gzSB.7s?as:.:.is <220 <220 COS <220 O} 034) <220 <222> A restexóyes 8S6kve-:CÍ3 3eirs SS x gaOsTG P4 5 .4 <11. ábra) <400 11
g a g Gin 3 gtt cég ctg ytc gag tea gga gye ggt cte gtg eag cet ege Giy 15 ggs 4 0 Giy
Vei Gin Lee Vsa Gie 3 Ser Giy Oly Giy <333 Let Vei G,i.ti: Pác
tea ctg aga ttg tee tgt get gca tét ggt tse atc ttc SOS gae tst 36
Sár- Let Árg Lee Let Cys Aia Aia O Gty Tya Vei Phe Thr Aep Tyr
20 23 30
gás atg sst tgg gat áss tag gee eag gga sas ggs ctg gaa tgg a t: g 3.4 4
C.:.y O 30? a Op 7a X Arg Alii Pa a Giy Lys CXy AíSAS G3.e Tép Uet
35 40 43
ggt tag stt sst ser. tae art gga gsg sst ·;:: tat get gas age ata 122
CXy Trp 11® &sn Tar Te- 13a Giy ·.: .. < Pre 13a Tyr 21 a Ásá- Ser 03
se 33 50
aag gas aga ttc tag tte tat el: s se áss aaa a ág te:· ssá ges tae 240
Oys Giy Arg phe Átr- P2e Sex- Len Asp Tar Sex- Lys Ser Tár- 2.1 s Tyr
55 7Ö ? 3 03)
cte csa atg sst ágó ctg aga ges gae gee sec ges gtg táé tat tgt 253
Let GXa rtet Aaa Ser tea Ara Alt CXt Asp Tar Alá ox Tyr Tyr Gye
05 30 35
<;O aga ggs tar ags test tat ges atg ges tae tag ggs eag ggt sea 335
2.1 a Arg <.,.<.<.· Tyr 2rg Sex- Tyr A3.a Met Asp Tyr Trp CXy Gin C.ty 37; r
3.00 105 3X33'
cfca ctc sca ate tcc tea 5314
Lse Vai Tar 0 3 Ser Se a
3:0.5 <20 12 <23 3> 0 <21.2 > «3 <23.2> Mesterséges ésekveheía <220 <223.> 2 mesterséges szekvencia leirOsa; sri«:er szekvencia réssé <430 12 geegssscc
- 61 <21ö> 13 <21 i> 23 <212> 323 <213> Mesterséges sze éveseia <22é>
<223> A mesterséges szekvencia Leírása: printer CH1 <40ö> 13 atgeeetgeá getgggtcat sfctctt
<210» 1.4
<21 la 2$
<212> 223
<213> Meséd ségd s rekvencis
<220.>
<22:3> A mesterséges s zekvenc i a. Idd sár &r léd
<4333 14 atgggatgga gctrtdoai svédé <21 0> 12 <211> 22 <212 > 332 <213> Mestarséges s eekvsneí a <22 0>
<223> A zestezséges szekvencia leírásaipriaer 223 d00> 13 atgasgidgt ggt i aaactg ggtétt <213;> lé <2ÍÍ> 23 <212> 23» <2Í3> Meséérssösá szekvencia.
<22 0>
<223> A sieséezségas szekvencia leírass: primer 224 <löö> lé aé gr ad tég g g vtcágétt gr t <210> 12 <211> 2.2 <212> 232 <2I3> Mesterséges szekvencia <22ö>
<223> A Snesédségés dekddia leírása:primer CK5 <430> 1?
aéggacteea. ggctcaettt agtttfc 2é <2X0 18 <2ΧΧ> .26 <2Χ2> οο <213 > fe .¾ t: e t s é gns s t e fc ve ne X a <223> A mesterséges stekvenOs lettesei grXme?: CHS <4 20> IS stggetgtey fcrgsgctrefc ettstg <2X0 O <2XX> 2t <2iO CCS <2 X 3 > Ma s fcer sé ge s s ?t ekv e acia <220 <223> A mesterséges stekrenels: leírása;prímet 287 <400 1$ et gg ra fc gg s g c kgg r fc et t fcjst et1 <2X0 20 <2XX> 22 <O2:> DNS < 2 X3 > Ne í; te r s égé s s sa kveneia <220 <222> A. rssisterséges sjeisveiicia lei rése ;ptí:ner CHS <400 '20 sfcgegsgtgfci fcgafcfctifcttt gtg •CCO 21 <2X1> 28 <2 22,·· DNS <2X0 Mesterséges szekvencia <220 <223> A méstarséges ssékvenOa XeXtésa;prímet CO <4 00,> 21 a fc ggmtt ggg fc g t g ess; t: fc fc g e fc a fc fc 2 6 <210 O <220 26 <210 OS < ,2 X '3 > Paa fc e t s é ges s te fc va ne X a <22 ö>
<223> A íseeterségas ssekvetiéls 1árrése:primer CHXO <400> 22 afcgggesgac fctacafcfcctc stfc.eefc 26
-63<210> 25 <210 25 <212> OS <210- Mesterséges srekraacifií <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása tprisser CHli <400 2 <
a t gg® 111tg ggc t gs 11 rr 11.11 a1t g <2MO 22 <2iO 26 <2i2> OS <2X3> Mesterséges szekvencia <220 <223> A mesterséges szekvencia leírása^primer 2532 <400 24 a t g ét g gt gt t eset t ct t ct gt a cet <210 2a <210 21 <212> 223 <2i5> Mesterséges- szekvencia <220 <123> & mesterséges szekvencia ieításarprir&sr 5'-vég <450> 25 g c gcgcaa gc 1t gccácsac c <22.0 24 <210 22 <21.2> ÖS <2 1 3> Mesterségea saeOanci a <220>
<223> & mestérségéé .szekvencia leírása:primer CLi <4 00 25 atgasgttgc ctgttaggct gitggtgct <210 27 <210 25 <212> << 213 > Me s te x:sege s s ze kvenc i a <2.20 <223> A mesterséges szekvencia, leírása;primer 02 <400 27 stggagwcsg acscacieet gvtatgggfc <210 28 <211> 23 <2l2> 05 < 213 » Μa s t e í; s é gs s s :í « kv ® n c i a <220>
<223» A mesterséges szekvencia lelrása:primer CL3
<400» 28 atgagtgtgc tcacocsggt ess <210» 23 <211> 20 <212» DOS <213> Mesterséges szekvencia <22ö> <22 3> & siésterssgás szekvencia leírása;primer CL3
<4ÖO> 23 stgaggrccc ctgctcagwt tyttgg <2-0» 30 <211> 23 <212» DNS <213» Mas taxa ég® s szekvencia <220» <223» & mesterséges szekvencia leírása:primer CLS <400» 30 a tggat1twc a getgcagat twt cagctt < 213 > Me s te r s égé s aze k ve se la <220» <223» A mesterséges szekvencia 1 sirass :pri:ser ClöA <480» 31 a ·: gge tttwc arg tg csg a 1 twt cag c 0t
<212» 32 <2il> 20 <212» DNS <213> Mesterséges szekvencia
<220 > x-‘ ··' A mesterséges szekvencia leírása;primer CLa
<400» 32 stgagatkcy ytgytságyt yctgrg <210» 33 <211.> 23 <212» DNS <213» Uesterséges s zekvencia <220» <223» A mesterséges szekvencia leírásaiprimer CL?
- 65 <400 33 atgggcsffcca agaéggagtc ess <2iC>> 34 <211> 33 <212> 033 <213 > Haa t s s ség a s; s :; a k v s x< c 1 a <220
<223> A s;:«starségös szekvencia 1 e i rá se; p r isse r 03
<408> 34
s t gt gggg a y ct k 111 yaam· téttt eaa t
<210 35
<210 24
<212> 053
<210 Mesterséges sí zekvancis
<220>
<220 A sastességés szekvencia isivé ss :pri:ees 3L3
<O3> 35 atggkrkccn sssOcsgtt cctt
<210 35
<210 26
<212> OS
<213> Ma s és r s é gv s sas k ve nnla
<220 <22 3> A. nestérségéé szekvancia leírása:primer 0110
<400 35
etgtsí : se t gélt gt t g t c t at t1 s
<21C» 3?
<210 26
<212> 033
<213> Mese exeéges s askvensia
<220 <223> A sert erséges s sakvencia leírása:primer OH
<4δδ> 3?
sfcggaageec sagetssgct letett <210 33 <210 25 <212> 053 <213> He stsraέgaa s; sekveneí« <220 <223> A sisstességss szekvencia leilásá;primer CLI2&
<4ö0> 38 a tgtsöt ywe .¾g secceget c11 y r t <210» 35 <211» 56 <212» 332 <213» Mesterséges szerváncl a «220 «223» & íse-sterséges' szekvencia leiréssíprimer CLX38 <4ö0> 33 ·;: ·: ggaga esc á t t r: t ·::·.; cg t nt1 t gt <210» 40 <2ll> 20 <2:.2> DNS «21 3» Mesterséges szekvencia <220» <223> & mesterséges szekvencia lei rése ;pr isaex: CL13 <400» 40 atggettcsc aggcccsggt tnttat <210» 41 «211» 26 «2X2» S»S <213» SíDa te r s<lges s re k véne1 s <22··>
<223» & mesterséges szekvencia leírása5primer CDI4 <456» 41 etgefcgegtc ctgcecagtfc cctgtt <216» 42 <211» 26 <212» DOS <213» Mesterséges szekvencia <220» <223» .4 nsstereégca szekvencia leírása:primer CDI3 <406» 42 >s tgsstttgc cfcgttcatct cttggtgct <210» 43 <211» 26 <22.2» DOS ν ' '' C»»'\fse<»» s.ekw.'D'i
Z <i\.: ·· «223» A mesterséges szekvencia leírása;primer CtlO <200» 43 a t gg a 1tt r c a a t1 gg i. ·.::<:» est c t cet t <210» 44 <211» 26 <212» DOS bz < 213 > M© s t«x:x; ege s s z « k ve ne la
<220» <223» A mesterséges sxskvexjcia isiresa; primer C:,Í?A
<400» 4 4
a tgaggtg c¢: t a r a t x;a g t1 cctg r g
<210» 45
<211» 25
<212» ÜSS
<2l3> Ma a t© x' x: 2 g exs e 2 © k ven 8 i. a
<220»
<220- A xkaatiiteégxxe szekvencia leírása; primer CL1~S
<40«·· 43 atgaagfcact etgetcagtt x;ct3gg
<220» 4 5
<211» 25
<242» DOS
<243» ki g t e rség©x; e se x:<© ncie
<22 5>
<223© A mesterséges szekvencia leírásaxprimer CL!?C
<450» 4 5 xs tgagg ceti ctcttcaatt cttggg
<210» 47
<211 > 24
<212» Dk*
<213» Ma 8 t ars í g e x; s z a kve ne is
<220»
,,· 88 < :· A mesterséges szekvencia .leírása :primer 5 ’ - -vég
<405» 4 7 ggeetgxicg eegongccec a
<240» 5 5 <211» 30 <212» 005 <213» Mesterséges szekvencia
<220» <223» A mesterséges szekvencia leírása xprimer CL 12
<100» 43 ggatacegtt ggtgcagcat ccgtx’cgttt <210» 4 5 <211» 3?
<212» 27·'2 <213> Mentei: ség©xi szekvencia <220» <223» A mesterséges szekvencia leírása:prissr A2153 < 4 0 Ο > 4 0 gcegecgcgc eetfecgttge ggctgmrgag acdgtga <210> 50 <21 í> 24 <212> 0K5 <213» Mese erséges szetednela <220.>
<223> A mesterséges szekvencia. leírása^primer Rí 033 <400> 50 getgacacac éaacagactg ttcc 24 <210 51 <210 12 <212> 03 < 213 > dest: aλ's 0 ge55 ;s aa kvenc 1 a <220 <220 A x&sstarségss szekvencia leírása :prOer 0723 <iOO> SÍ gctefcsggag gl:get cet 13 <210' 52 <211:·-' 70 <212> 0140 <213 > Restet55 égs® s s e te=® ·::.:. a <2 20 >
<223> A mesterséges sscekveacO leírása; <; 1 igcnnkleotid P7982 <400 32 gaattcaggg fccaccsttac ttgtsasgcc agtcagaacg ceggcactsa sgtagcetgg 00 ói. csecse a 30 <210> 33 <210 1 <212> 003 < 213 > Sfó ater ség as sz«kvenei&
s <· <: ' ϊ >
< '' ' <o ' \sei' ' ν'» vO to <400> 33 atacssggaas gaggeastat agatgaggge ttfcfcggggct ttscctggtt tttgetgata 30 ccagcceacs t 71 <210> 54 <21O 71 <212> DOS <213:> Oföstasr séges s re temet a <22 O <223> A mestetaéges ssetemeia iairáss;oligcnoieotid 27334 <405:5·· 34 >:.acagtgcct ctttccfccta tagtggtgta ccatacaggt tcageggefcc cggtegfcggt 60 aétgattfcca c 71 <210> 55 <212 > 08 <213> Mesterséges szekvnncia <220 <220 A mesterséges ssstencis leírása;cligonvk.lei>ti« 07585 <400 55 gacagtaata agtggcgsaa kcttctggcfc ggaggctaet gzstcgfegagg gtgaaateag 60 taccsctacc g O <2a0.> 56 <n> o <2O> 668 <213> Mesterséges sscekveacia <220 <223> A mesterséges szekvencia leirása:oligonakieotid 2755 6 <400 56 atttcgccao itat:tactgt eeecegfcate acefcetseee nctz a ez ·:·:;:; estesgggO 60 c 6 sságiege aatcaaacgt seggéé11e 6 5 <2.10 S'7 <211> 30 <2O> OS < 213> Me s t a rsége e s z ekve.ee le <220 <228> A mester séges sze kvencis 1 sírása: el 1 genukleöt i d F7 381 <400> 57 gaatfccaggg icaccatcac ttgtseegcc 50 <210 58 <210 86 <212> 553 <213 > Mests rségee szekvene i s <220 <225> A mesterséges szekvencia Xeirésascligenuklestig 27380 <400 58 geetteegte cgtttgaStt etsctfctagt 30 <21ö> SS <210 24 <212> O <2!3> Mesterséges szekvencia <220 <223> á mesterséges szekvencia leírása:eligoncklectid Ri053 <4 00 55 gctcacagec taacageetg ttcc 21
-70<210> év <211> 57 <2Ο> OS < 213 > He s t e r a é ge s a s e Kv e ne 1 a <22 O < 2 2 5 > A Kts s t e r s égé s s se k verse 1 a 1 e í r a s a: o ligána kiect i é R.5 3 5 ö <40ö> év tetagergge acaceacctg craagtttga ;:geggcatag gtcsggaget taggagc <21ö> él <210 59 <212> 322 <2 1 3> Mesterséges s rekvsecia <22é>
<223:· & mesterséges ssekreneis leírása :O ::goa;k leetid 25343 <4 0v> 61 gcegatggtg tgccaterag attcsgrggc agtggsfccag -geacagactt cassciase 33 <210 62 <210 16 <212> O <213> Mesterséges szekvencia <220 <223> A rseefcereéges szekvencia ieOásaoiigcns.kleotO 3693 <106:· 62 c a a ctg c fc c a t c a g a t 2.6 <210 63 <21O 65 <212> 999 <213> Mesterséges szekvencia <220 <223> A. eescerráges srekverssa leírása rprOer 97939 <300 63 gaagcsacag gcosOaac óetgctcct gactggaecs gctgcacetg agagocacg éé aatte 65 <210 64 <2x0 71 <212> O < 2.13> Mes fcer s é ge s a ze kvs neia <220>
<223> A ssséarségés szekvencia leírásaxprimer 97990 <400> 64 ggkfcaagaag eetggtgcfct ccgtcaaagt ttcgtgfcaag gccfccaggct acgtgttc.se 60 agaetatggt a 71
-71 <21ö> 65 <2Π> 71 <212.> DNS <213> Mesterséges szekvencia.
<220» <223> A mesterséges szekvencia leírása:primer P7991 <40ö> 65 ccaacccatc catttcaggc cttgtcccgg ggcctgcttg aeccasttea taccatagtc 60 tgtgascacg t 71 <210> 66 <211» 61 <2i2> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220 » <223> A mesterséges szekvencia leírása :prime.r 27995 <400> 66 ggcctgaaat ggatgggttg gattaacact tacattggag agcctattts tgttgacgac 60 ttcaagggca gatteaegtt c 81 <21ö> 67 <211> 56 <212 > DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223> A mesterséges szekvencia .leirása ;primer P7392 <400> 67 ccstgtatgc agtgcgt.tgt ggaggtgtct agagcgaacg tgaatctgcc ettgaa 56 <210» 68 <211» 62 <212> DNS <213» Mesterséges szekvencia <22 0>
<223> A mesterséges szekvencia leírása .'primer P7 993 <400> 68 ccacaagcac 'fcgcatacáfcg gagctgtcat etetgagate cgaggscacc gcagtgtaet 60 at 62 <210» 63 <2ll> 78 <212» DNS <213> Mesterséges s zekvencia < 2 2 0 >
<223> A mesterséges szekvencia leírása:primer P7994 <493» 69 gaatteggia ccctggcccc agtagtceat. -ggcataagat ctgtatcctc tagcacaata 60 gtacactgcg gtgtcctc 78
-72<2lO> 70 <211> .30 <212a 0:3 <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223> A. mesterséges szekvencia leírása jprimes: S70SS <400> 70 gsattcg::gc sctc::caggt gcsgctggtc 3ö <21ö> 71 <2lí> 30 <212> 000 <22 3> Mestetséges stekvencls <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása:primer P7987 < 10 0 . ·' ·' gsattcggts ccctggcccc agfcegtccat 30 <210> 73 <2ii> 05 <212> WS <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása;primer 27201 <400 72 gatccgccag gstgeaegsg accgcctcct gactcgaccs gctgssecfcc acagtgcacg 00 aatce 03 <210> 7 3 <2ii> 71 <212c 003 < 213 > Me s t er ség e a a se kvenc 1 a <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása<primer kOOOO <iü0> 73 tctcgtgeeg cctcccgcat cgccgagatt gtcrtgtgct gcetctggtt ecgncttcec 00 egsctatggs a 71 <210:·· 74 <21 í> 71 <212> DA3 <2T3> Mesterséges szekvencia <220c <223c A mesterséges szekvencia leírása;primer 23071 <4 00> 74 ecsacccatc catttcaggc ccttfccccgg ggectgetta sereset tea ttccatagtc 00 tgtgaagacg t 71 <210> 7c <2n> ss <2'12> lei <2'18> kíestéroégns; séekvencia
Cili.<223> & mesterséges szekvencia leírásasprimer 00097 <300> 75 ggaggtatgc tgttgacctg g&tgégfccta gagagaacgt gaafcctgccc itges 55 <210> 70 <211> 02 <212> SOS <213> Mesterséges szekvencia <220 <223> & jsestsr sé<jös szekvencia leiréea:primer 2’272 <400 77 ócasgtoaái:: agcéisontc eeaakgooata gootgagage onncgaiíá;:/:; gcagcgtant 00 at 02 <210 77 <21.0 78 <2;.2> DNS <213> Mesterséges szekvenciá <220 <223> A mester séges szekvencia leírása:primer P7333 <4SO 7 gsattcggts ceccggccce agraciccat ggcetaagat cigcatcotc tageacaata SS gOcac2.9295 gogtcctc 78 <2 10> 78 <211 > 30 <212> SOS <213> Mesterséges szekvencia <220 <222> A mesterséges szekvencia leirése:primer 27720 <400 78 gaattcgtgc actctgaggc tengetggtc 30 <210> 78 <210 74 <212> DNS < 2 2 3 > .Mes térségé s s z e k ve ne is <220>
<223> A msstezségas szekvencia leírása: 0- érire.
<903> 79 cgogcggcae ttgcagtggc ctfcggctggt ttegctaccg tagcgcaagc tgacattcaa 00 atgacccaga gccc 74 <210.> 80 <211> 20 <212> ΌΝΟ <213>· Mesterséges szekvencia <220>
<223> A mesterséges ssekeaccia ieirées; 3- primer <10v> 80 ttessctgct se tcagatgg 2 0 <218> 81 <Ai> 78 <212> DNS <213 > Me s í: e r s é g e a s s e k v «r · c i a <220>
<223> A. mesterséges szekvencia leírásai S¥ primer <400> 01 gctétcgcaa ttgcegtggc getegctggt ttcgccaceg· -tg-gcgcaage -tgeggtteeg 80 ctggtcgagt xsaggaggc 7 8 <2l0> 82 <211> 18 <212> DN3 <22 3> Mesterséges ssekv®ap.is <22 0>
<223> A mesterséges szekvencia leírásai 3' primer <<00> 82 gcctgagttc cacgecac 2 8 <210> 83 <211> 23 <212> PA?
< 213> Ma sterSága s sz«xvencia <82 V <223> A mesterségen szekvencia leírását Komán I ceopcrté köosssazor framewprk 11 <400> 83
Aép IIe Sir Met Thr ált Ser Frö Ser Sex Lee Ser Alá Ser Vei Gly 1 S 10 15
Asp Arg Val Dhr Ii;e The Cys 20 <210 84 <210 23 <212r IRT <210> Mastarséges s zé2 vec.cia <2 20 <223> A mesterséges szekvencia leírása:h?NF40 framswork 11 ~?s<400 84
Asp 1O Vai bet Thr Gin Ser Gin Lvs Ebe bat Ser Tht Sér Vsa. Giy 2 5 IQ 28
Asp Arg Vei Ser Eal Thr Gye 20 < 2O> 8 5 <2 ·.;·.> is <22 2> EEG <2I3> béétérségéé szakvéénré.
<220 <223> A rtésterrégsis szervénei® leírása-humán 1 csoportú konszantnn trítsework L2 <40ö> 88
Grp Gyr Gin Gin kys Pro Giy Lys Alá Erő kys Len. két 2le Tyr 1 ' 5 ' in 15 <220> SS <210 15 <2I2> EEG <223> baséétságes: ssekveroié <220:>
<220 A mesterséges szekvencia léirása:hGGE40 tramewerk L2 <40fe> 80
Grp Tvt Gin Gin Lys Ere Giy Gin Ser Ere Lys Alá Len lié Gyr 1 r ' iö IS <210 87 <210 32 <222:> EEG <'213> be e t e r séges o se k ven o i s <223> A mesterségéé szekvencia leírása: húsáén 1. ééopnrtQ konazanzés
o :aí&ework :o
OOO't 8 ; r
Giy Vas Pro Ser Atg Eke Ser Giy Sét Giv Sé r Gly GAt Asp Phé Thr
2 8 18 18
Lan TLr 11“ Gér Sár Léé .irt Ern Gin Asm Pha Aia Thr Gyr Tyr Cyí<
20 25 80
<220 88 <210 32 <212> PAG <213>'' Mester séges s se krands <22ö>
-76<223> A mesterséges szekvencia leírása»ηΤΟΌ framewerk 13 <430> 38
Gly Va.l Pro Tyr Arg Phe 20 Gly Se- Gly Sec: Giy Thr Ase rhe Thr
1 s 10 IS
tea 20 1 la Ser Thr vas Gin Ser GX iá Asn Les Aö Gi 01» Tyr 8 he Oys
20 25 30
<230> OS <25 i> ü <212> PRT <2 5 3 > Ges t er séges s zekve ncS a <220 <220 A mesterséges szekvencia leírásaösmén 5 csoportú kosszenzus frassewtk L4 <400 88
Phe Giy Gin Gly 20 Lys Vsí Gin 55e Lys Arg 1 o ' io <210> 80 <210 35 <210 02 <213 > Ge se e r sé ge s s se kveO. a <220 <223> A mesterséges szekvencia leírása;is2GP40 Tramewnrk 3,4 <4 30 93
Phe Gly A3a Giy Thr lys les Glu hea Lys Arg 1 ' 5 ' 10 <210 95 <211> 30 <212> O <2 1 3 > Ge ster s eges éz s kveme sa.
<2202
<223> A mesterséges szekvencia le1rá aa:barnán 5 nnnp'crt.ú konszenzbs
framewerk 33
<400 93
Gin Vei Gin 3,ev Vai Gin Sex' Oly Alá Gin Vei lya Lys Pre Giy Alá
1 5 50 10
Ser Vas hys Vas Ser Cys Gye A,la Sor Gly 2yx Th::' Pia; 2hx'
20 23 30
<210> 32 <213> 30 <212> 882
- 77 < 213 > Me s t e.r s © g© © s z e k ve a c i a <220?
<223 ? A mesterséges nze kvennia .leírása: h?MF40 £rasíéaork 81
<403 ? 32
Gin lis Gin Len Val Gin Ser 31v Frc Gin Len Lys Lvs Pro Giy Gin
1 § 10 15
Tnr Vei Lys lse Ser Gye Lys Aia Ser Giy 2yr Vei Rhc T3.r
20 25 50
<210? 33 <;o> ο <212? 2RT <213? Mesterséges szekvencia <223?
<223? 2 meskersécss ssekveneia lei·:©;>©.:hnm.sc 1 cseportó kenszsrisos írasseecrk K2 <433? 35 rrp Va.i Arg Gin Aia Arc Giy Gin Giy Les Gin Trp Mer Giy 1 5 ' Hí <210? 34 <211? 14 <212? FAT <213? Mesterséges szekvencia <220?
<223? A mesterségen szekvencia leírása:h2AF43 framework H2 <400? 34
Trp Val lys Gin Alá kro Giy Lys Alá Phe Lys Trp Mer Giy 1 S 10 <210? 35 <211? 32 <212? Aki < 213 > Mestersege © szek ven cia <220?
<223? A mesterséges szekvencia leírásaxnemén 1 csoporté konszenzus trameoor k 321 <400? 35
Arg Vei 2Ar lis 23r Arg Asp Tor Ser Tér Ser Thr Alá Tyr Mer Gin
5 10 15
Len Ser Ser Lee Arg Ser Gin Asp 23r Ais Vei Tyr Tor- Cys Alá Arc ' 23 30 <210? 50 <211? 32
78<210 PR?
< 2a3 > Me a t e r s ég e s s zeh'es c i &
<220>
<220 A mester séges szekvencia I sírása OTRFiö rraceccrk 23 <4 00 35
Arg Pa© Alá Pa© Ser te© Siu Thr Ser Alá. Ser The Alá phe Len Gin i $ 10 1©
He Asn Aon Lee Lys Aen Sin Aep Tar Alá. ?hr Tyr Phe Gye éle Arc ' 25 30 <210.> 57 <210 11 <212 > .O <213> Mesterséges ssekvenci® <220 <223> A siesterséges szekvencia leírása táncán 1 csoporti kcnszenzns fracewerk 21 <400 57
Trp Giy Sin Giy aér len Vai ?nr Var Ser Ser i ' ' 5 1.0 <210 55 <2ΐο 11.
<21.0 PR1 < 213 > Me s t e reá qés s r e k ve nei a <220 <223> A mesterséges szekvencia isirása OTGrlű rzeceeork 24 <400> OS ?rp Giy Gin Giy Tor Tar Len ?nr vei Ser Ser 1 3 10 <210 33 <210 324 <210 ÖRS
OiO patkány <220>
<220 CDS <222 < (11,0324) <220 egér h?GP40 könnyű ránc variábilis cocán <40ö> 55
gsc att Asp lis 1 óig d atg Met sec ?d s '.cg ter caa Gin a® a Lys ·. io Paa 10 atg Met Ü O : Md . Thr tea Ser cta vai 15 gga Giy 4 b
Gin Ser
©gg gtc ago etc sec tge <5. <5 '-p geo a gr cső aat óo ggt act aat δ 6
Asp Arc Var Ser var Thr Gys Lys Aia Ser Gin Asn 7 a 1 Gay ?hr Asn
7θ
•.i- 'sl 25 30
gtr gee tgg tat: caa eag aaa cca ága cár t et cet 333 gea ctg a t i: 144
V.-::1 Ai a Trp lyr Gin Gin L gá- Pro Giy Ha Ser Pro Lys ára l,e a :Hti
3 S 40 45
trc O:.g gca Lee ttc cta tat agt OH gte cet tat ege ttc 3 03 ggc
Tyr Ser Ara Ser Phe Lee Tyr Ser Hy Var Őre Tyr Arg Phe Ηχ- Giy
50 55 €0
agt gga tét svv aca gat ttc aet ctc acc atc ege aet He ο 3 <í tét ;> Π
Ser Giy Ser Hy Thr Lap Phe Thr Lee Thr He Ser Tar Var Ha Ser
55 7 g 75 50
gaa gac i ;; g gcr C3G tat. ttc tgt eag ea a tat 33 0 a te 131 Síit ctc H
Gin Aap Lee Air G1 e. Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Aea He Tyr Prc- Írás
35 90 SS
aeg ttc VG'· get SOS aee >:i et.g VHí ctg ara égi: •V V .·'
Thr He Giy Air Giy Tar A? 98 tea G.Po tea Lya Arg
100 105 <2lö> 100
Hi> 354 <Π2> 0SS <2r3> patkány «220» <221» COS <222» US .. (3545 <223» egér <15040 nehéc lánc variábilis Ocaá·· <400» 100
eag atc ara ttg Gin tea gtc Var a eag tat gga cet aag ctg aag aag tys cet Pro 1» G ΐγ 15 SAS Sic
Ha X 1 re Ha Ser Hy Pro Ha H tea Lys
eea gtc aag atc tea ege aag gcr. tat gga rét get ttc aaa gac tat
Tar Vei Lys He ··:'<·' Ser Gye Lys Al a Ser ·*?*; Hy Tyr Vei. Phe Tar 30 Aep Tyr
VGA atg aat rag gtg aaa eag gcr tea VG» aag get áré aag tgg atg
Giy Mát Asa Trb Vei Lya Ha Ai3 Prö Hy Lys Alá The Sva Trb Aet
55 40 45
ege tgg ata aaa acc tac arr. gga gag cca ata tat gtt gat gac ttc
Hy 1 Í.'P i le Aae Tar Hr He Hy Gie Pro He Tyr Vas. Aep Asp The
55 55 s 0
aaa i5ö aga ttl: gac ttc :tt:t ttg gaa aaa tét rác aet gcc Hit
ays G1 y ara Phe Air Pice Ser Laa He Tar Sex Ser Tar Air Phe
65 70 7 5 80
ttg cég <3.\. ere aaa ctc 333 art gsg gae acg get aca tar t . tgt
Lat Gin Ha Arc Asn tea Lys Asa Gi b Aag Ths: Alá Tar Tyr Phe Gys
05 50 SS
-SO-
gca Alá aga Arg ggt oly tae ΟΙ 00 agg Ara tat O get Alá a tg Ma fc. 105 gae Ase tac Ty.r tag Crp 20 Sly Cgg. T5 íj ·;; G CC G!;< Sly Sár 11 0 ·.< -3 \>
tea gt a gt a fcct te·* 3S4
Ser kai Thx: kai Ser Öe ?;
xis <2lO> 101 <2 0 84 <212> DNS <215:··· Mesterséges stekvancla <220 <220 COS <222> (2(0,(0} <220 A. wstarségys yróretárá Orré :Ca;sA eligariakkíOfcig assaptgr <400> 101 fcagagttafca gatasegagg égtetana atg sas aag «ca gat eta gaa att Net: tys Oys Ό?: Al.a II® Alá Hé '' 8 gas gtg gaa ttg gafc atgscgtaag agttagg
Alá kel Alá Lee Alá 10 <210 102 <20 O <210 05 <210 Mesterséges sttOa te la <220 <220 COS <220 (2(.,(48} <220 <221> COS '·..·? .2 .-<<· : 4 ·< : · · .:«: <<«··· <22O A ::;estaraágsé sátkvaégla leírása;IGS kazetta-l <400 102 g age tea ess gta ess aaa agt ttt aat aga aga geg tgt te stg aeg 48
Ser Ser Őre kel: Sár Sys Sár éhe Aat Arg Sly Sin Cys Cet Lys
5 10 15
a.ag act gcfc sta gat att g O
Lys Tht Als 21« éle 21e <210 103 <2.Π> Só <212» DNS <213» Masi: özaég&s ssekv«r><5la <220» <231» COS <222» (25..(43;
<220 <221» COS <222» (455..(SS;
<220» <223» A mesterséges ssekvemzie leírása;TGS kazetta-2 «00» 103 g ege tea cce gta aea aaa agt aat aga ggg gég tgt tea a. atg 43
Ser Ser Pro Val Thr Óva Sex: Phe Asm Arg Oly Gla Cys Met
3 10 ' IS aag aag aei get ale gca alt g SS
I.-ys Lya 11.8 Alá He Alá Ha <210» 104 <211» 31 <212» DNS <213» Mesterséges szekvencia <220» <221» COS <222» (2; > , (435 <220» <221» COS <222» :525..(00:
<220» <223» A mesterséges szekvencia leírása;IGS kazelia-3 «00» 104 g agn tea eea gta eca aaa ege ttt áat aga gga gag tgt tga Ser Ser Ozo kel Thr Lys Ser She Ase Arc Oly Sin Cys
1 5 10
gcaggaaaaa aaa ara aag aaa act get ata gca art
Met Lya Lys Thr Alá He Alá He
15 20
<210» 105 <211» 31 <212» DNS <213» Mea1ezséges a sekvs íyi\j
<£20> ·Λ COS
·< £ £2 > (25 ... (43:
·>·>
COS
<222» ;3'G . . (30;
<220»
<223» A mesterséget szekvencia leírása ; IGS k&zetta—S
<400» 108
g ego tea ccs gta ács sas. agt ttt svat scs gga geg let iga
Ser Ser Prc val Thr Lye Ser Phe Aan Arg Oly Gin Cys
1 5 20
cgaggattet ata atg aag áss ser get sra ges sor g Met Lys Lys Túr. Alá Ils AX.a Re.
' 28 <210» 108 <0» 30 <212» 007' <213» Mesr errégea s zekver-c1 a <220» <223» A mesterséges szekvencia le írása: humán 3 cscpcrtú konsaensas
frsmemork Hl
<400 O· lön
S.tíl· vei Gin Len Val Gin O ki ' G.i.y Gly G1 y L-en Vei Gin Pro GXy Gly
1 5 10 re
Ser Len Arg Len Ser Cys Ai a Ars Ser :-1.: y PAe Tér POe Ser
20 25 30
<210> 107 <211> 14 <212» 027 <213» Ne s t e r s éger s v,e k ven c 1 a <220» <223» A mesterséges szekvencia leírása:humán 3 csoportú konszenzus framework H2 <40Ö> 107
Trp VaX Arg Gin Alá Pro Oly Gye GXy Lee Gin Trp 7aX Ser 1 0 ' 10 <2X0» '188 <2X1» 32 <212» PPT <213» Mesterséges szekvencia <220» <223» A mesterséges szekvencia leírása:lsemén 3 eseperi:0 kensverses framework 03 <4·3δ> 103
Atg 3ho 50 o Rio Ser Arg &sp Asn Ser i.yn Ayr. Int Lea Tyr Lee Gin ΐ :i 10 15
Rét Asn Rét Len Arg Alá GXu Asp lét Alá VaX Tyr Tyr Cys Alá Arg
OS 30 <2105- 103 <2115- II <2125- SRT < 213 > Mo s t« r y égór r z e k ve ne: l a <2205<220 A mesterséges stsíkvoncla leírása íhusián 3 csoportú konszenzus i'tamswor k 514 <4 é 05- 135
5rp Oly Gin Gly Ttr i..o·.. <1 5bt y®i Rét Ser 1 5 1.0 <210 110 <211> 045 <212> ÖRS < 213 > Ré s t er y y g e s s z e k ve go te <223> Béül teteit nehéz lánc Rab számára <400> 110 goggt5:oyg< tcglogngto aggaggeggt oicgtgcago tnntgtgotg éaéctggtta cgtcttcaea gactatggas oogggaaagg gectggoarg gatgggttgg attaataett gctgacagcg tcaagggcag attcscgttc tetetagaca ctccsaatga aéagcctgsg agcagaggac accgnagtgt agatottatg ccatggaeta ctggggccag ggtaecctny yeeaágyync cstcggéctt cccccfcggcá ccctcctcca goygcnetgg gntgeotgyt caaggactac tfcccocgaac kcaggegccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tactcccfcoa gcagcgtggt gascgtgccc tenugeagot tgcaacgtgs atoaceagcc cagcaacacc aaggtcgaca ctggcggatc tgy.y.ttgggt aoatlqgsga oa.tocaagtc actattgtgo koaoagtctc agagcaccfcc cggtgacggt tcctacagtc tg gye aorta agaaagtt actgagattg t Ο p::' ·. 5 :.- g Ο O goetsttta1 aacagcatao tagaggatao otcagcfctoc tyggggcara gtcgtggaac ctcaggactc g a *..5 * .· t - - o-:i Λ, o
120 1R0 240 305 360 425 4 Sí) 54 0 $00 640
<215> 111
<21 i> 216
<212> RRT
<213> Re ó t a r s é go e s xe-k vetsz is
<2205-
<2235- 8e0.1tetett nehéz lánc Rab ok ámára
<400> 11.1
Gin VyX Gin Lén 7a1 ölé Ser Gly \<y Giy Ion
I 5 10
Ser Lan Arg Len Ser Cys Alá Alá Ser Giy Tyr
:-<7 : ·,' t·, i,s·’
Vili Glo Pro
Vai Pia Thr Abp Tyr 35
Gly ily li
Giy Mát Aéri Trp Ver Ara Gin Alá One Gi y Lys Giy Len Gin Trp Mer
35 n H
«:, y np He Asn Tér Ivr He eiy Gi n ere He Tyr A la Asp Ser Val
SS η n SS
Lys Giy Arg One Tér One Ser Lén Asp Tar Se r Lys Ser Tar Alá Tyr
05 7Ö ? 5 80
San Gin Mer. Ara Ser Len Ara Al a Gin Asp Tér Alá Val Tyr Tyr Lys
SS SS 21
2.,.·': Arg Hy eyr Ara Ser Tyr Ara Mer Asp Tyr Trp Giy Ha Giy Thr
122 ISO 1 IS
Leu Vei Tar Vei Ser Ser Alá Ser: Ter- Lys Giy Prc Ser Val OLe Őre
in 122 12S
Len .41 a Prs Ser Ser Gye Ser Hr se r Giy Gr y Thr Al a Alt Len G.ly
no n 140
Cys Len var Lys Asp Tyr One Őre Otm Őre val Thr Val Ser Trp Aan
14 S ISO 155 102
Ser Ή. y Alá Les Thr Ser Oly Vél Sir Tér One Oro Alá Vei Len Ólra
105 170 17 S
Ser Ser Giy Len lyr Ser Len A? <> v •s·· Ser Var var Tér Val Őre Ser Ser
1» SOS no
Ser Lee Giy Tar Sin Thr Tyr He Gye Asé Val As a Ars Gye Prs Se r
nn 200 IS®
Asn Tar Lyn Vai Asp Lys L ye Val
',rz:e 2 IS
n in- 112
ni n 042
nn> SAS
nn> Maste ménes esekennelé
Π2Η nőse SeülLetett könnyű lánc Fab és siódéért: efck Fab számára
<V;OS> 112
gacalteeea tgaeeeagag eeeeteeage etganegsat etet: anyaga ccgggtcscc 00
a tea ér tata segcsagtea gée.r:at:agg·· est aaesma ceéggtátcs gnee.eaacca 120
ngtsaagcsc ca a se,gépet catetscagr gectctrfcec teta kagtgg ég i secat .s e ISO
agat: magén gatnagntag kantsárgát kkaaéPékaa enatésgtsn Célsesgccá 240
gaegaktkáa ecset tat:?, a algtesacag tstsaeakak s esen -r attnagtcag 300
gataetaasa tagaastcaa aagtseggta gcgaeencat ctgtettnst ettencaeea 300
tetgatgage agttgasatc í -'Ή ictgr? ketattgkgt a n e : gc k g a a fcaacttetat 420
eeeagegsga cosssgtaca gkggaaggrg gataacgess tccáétegga taastcccag 4 80
yágsgtgtsa eagegeaeea eágcaaggee ageaPétása dcctcágeád eaceetgaeg 540
etnagéaaag ca gaetaege geaaeaeeas gtctacgeet gcgasgtean eeatesggge 000
ntgsg emse cagraaeaa-a aagctttaat; agangagsgt gt OH
mo> no <210 214 <212> 60Τ <213> Mesterséges srekvenaia <r 2 O' <220 Beültetett könnyű lánc Seb és isödösitott láb ssAisáre
<4Ö0> Aep lie 1 113 Gin Met. The s Gin Ser Őre Ser Ser 13 ben Ser· .éle Ser Vei 15 Gly
Aep Arg Vei Tét lle Thr Cys bys Alá Ser GO Asn Vei Gly Thr Asn
20 25 3θ'
Val Alá Trp Tyr Gin Gin bys Pro Gly bys Alá Örs bys; Ara ben lie
35 40 45
Tyr Ser Alá Get Ohe ben Tyr Ser Gly Val. Gte Tyr Ara Ohe Ser Gly
SO 55 00
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ohe Thr ben Tar lie Ser Ge r ben Gin Őre
65 70 75 50
Gin Asp Oh® Ai a Tar Tyr Tyr Gys Gin nm Tyr Asr· lie Tyr ere ben
65 60 35
Tér Ohe Oly Gin Gly Tér bys Val Gin lie l.ys Ara Tar Vei Alá Alá
100 105 110
Mse Mer öl One lie One Őre Őre Ser Asp Gin Gin ben bys; Ser Gly
115 120 125
Thr Alá Get Vai Vei Cys bee ben Asr Asn Ohe Tyr Őre Atg Gin Als
130 135 140
bys Vai GO Trp bys Val Asp Asn A. le ben Gin Ser Gry Asn Ser Gin
05 150 165 150
Gin Ser Val Thr Sin Glt; Asp Ser bys Aep Sert Thr Tyr Ser ben Se r
163 170 175
Ser Thr ben Thr ben Ger bys Alá Asp Tyr Gin bys Hl s bys Vsi Tyr
.150 165 100
Aia Gys GO Val ihr «Is no Gly ben Ser Ser Óta Val. Thr bys Get
05 200 205
Phe Asa Arg Gly Sin Gys 210 <210® Ili <211> §27 <212> Ül <210 Mesterséges szekvencia <220 <320 beültetett sebes lene módosított bab számára <iöO> Ili geggttcage tggtegegte eggeggeggr cteytgcegc etggaggetc eetgegett:g tectgtgstg catergytta cgtcttcaca geeterggee tgaattgggs í.egsieagpée ccgggaaagg geefcggeerg getgggtfcgg ettagtactt acatiggaga gcctatfetat gctgacageg tcaagggcag attcacgfcte tcfccfcagaca catccaagtc aséagcahac ctccaaatga atagcctgag ageegegget eeegcagtgr ectattglgc tsgeggetae sgaecttotg ccatggacca etggggccsg ggiaoeotsq rgaesqteLc ctcagcfchcc aecaagggee catcggtctfc ccccetggce ccctcctcca agagcacctc igggggcaca geggerctgg getgeetggt ceeggaetsc tfcceecgaac cggigacggt gicgfcggaaC teeggegoee tgaccagegg cgtgcacacc 11 cccqgctg rccteeegtc ctcaggactc tactccctca gcaeegtggt gaccgfegeec tccagcsget hgggeeccca gecctseate tgcaacgfcga atcacsegec cegcaarKoc oegyrcgaos agaaagfctga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacaeatg cgccgcg <21,65 115 <210 228 <210 SRT <213v Mesterséges seehea-'iois <2ιο g <220 Leóinehéz. lánc OdoeOcct :·<··::· e/ée.ára <4 30 .11S
120
120
240
300
360
420
400
340
600
660
607
G1 c 1 Val 81 j· Len Vei 3 61 u Ser Gly TILT Gly 10 1.<:O Vei Gin Őre Gly 15 Gly
Ser Lan Arg La a 20 Se r Cys Aló Ale Ser «. Gly Tyr Vei rhe Thr 30 Asp Tyr
8.1 y Met Asc 35 Trp Vei. Arg Gin Alá 4 0 6 re 61 y Lys 61y Lee 4 5 Glo Trp Met
Gly Trp 50 He Ase Thr •r le 55 ery 61 e Px'O 11a Tyr 66 Alá Asp Sár Vei
Lys 65 61 y Arg One Thr The 70 Ser Leó Aee Thr Sár 75 Lys Ser Thr Alá Tyr 80
Leó 610. Mer Asn Ser 85 Lee Arg Alá Slo Asp 00' Thr Alá Vei Tyr Tyr 65 Gye
Ale Arg 61 y Tyr 100 Arg Ser Tyr Alá Mer 103 Asp Tyr Trp Gly :6l:il 118 Giy Thr
Lee Vei Thr 115 Vei Ser Ser Alá Ser 120 Thr Lys 61 y 6 re Ser 125 Vei Ohe Sre
Lee Mlát 156 Pro Ser Ser Lys Ser 135 Thr Ser 61 y Gly Thr 148 Alá Alá Leó 61 y
Gye 145 Len ÖL. Lys Aeg rO ISO The Arc 6 le Arc Vei 155 Thr Vei Ser Trp Asn 166
Ser Gly Alá Leó Thr 165 Ser Oly Vei Sls Thr 176 Oha Sre Ale Vei Lee 175 Gin
Ser Ser Gly Leó 166 Tyr Ser Lee Ser Ser 125 Ver Vei Thr Val Sre ISO Sár Ser
Ser Leó CL Tor Gin Thr Tyr Ue Gye Asn Vei Aers Hí a Lys V r o Ser

Claims (3)

Szabadalmi igénypontok
1, ábra
A hTNF4ö antitest könnyű lánc és a humán 1 csoportú konszenzus szekvenciák framework régióinak összehasonlítása
Hu Ί csoportú konszenzus ; DÍQMTQSPSSLSASVGDRVTÍTC <S3.sz. szekv.) hTNF40 : DiVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTC (84. sz. szekv.)
Hu 1 csoportú konszenzus: WYQQKPGKAPKLUY (85. számú szekvencia) hTNF40 : WYQQKPGQSPKALiY (88, számú szekvencia)
Hu 1 csoportú konszenzus: GVPSRFSGSGSGTDFTLTiSSLQPEDFATYYC (87.sz,szekv.) hTNF40 : GVPYRFTGSGSGTDFTLTiSTVQSEDLAEYFC (88. sz. szekv.)
Hu 1 csoportú konszenzus: FGGGTKVFIKR (89. számú szekvencia)
PTNF40 : FGAGTKLELKR (90. számú szekvencia)
1. Humán~TNFö~specít'icstással rendelkező antitest molekula, amely rendelkezik könnyű lánccal és nehéz lánccal, ahol a könnyű lánc tartalmazza a 8. számú szekvenciaként megadott h'TNF4ö~gL1 könnyű lánc variábilis régiót és a nehéz lánc tartalmazza a 11, számú szekvenciaként megadott gh3hTNF40.4 nehéz lánc variábilis régiét,
2. Humán-TIMFo-speciticítássaí rendelkező antitest molekula, amely rendelkezik a 113. számú szekvenciában megadott szekvenciáié könnyű lánccal és a 115. számú szekvenciában megadott szekvenciájú nehéz lánccal.
3. Vegyület, amely tartalmaz olyan humán-TNFo-specificitással rendelkező antitest molekulát, amely rendelkezik a 113. számú szekvenciában megadott szekvenciájú könnyű lánccal és a 115, számú szekvenciában megadott szekvenciájú nehéz lánccal, és amelyben á nehéz lánc C~fermináiís végén lévő egyik eisziein csoporthoz egy Hzil-maleínsavlmidtozármazék csoport kapcsolódik, ahoi a lizil csoport két aminocsoportjának mindegyikéhez kovalensen kapcsolódik egy-ögy kb, 20 000 Da molekulatömegű metoxipoli(etilénglíkol) csoport, így a metoxipoii(etilénglikoi) csoportok átlagos összmolekulatömege kb. 40 000 Da.
4. A 3, igénypont szerinti vegyület, amelyben a lizil-maleinsavimidszármazék csoport [14[[2-[[3-(2(5’díoxo-1-pírroíidinil)-1--oxopropil]amíno]etil]aminö] -karbonilt-1 «S-pentándiillbiszrtmsnokarbönih.
5. Vegyület, amely tartalmazza a 2. igénypont szerinti antitest molekulát, és amelynek a képlete a következő:
6. DNS szekvencia, amely kódolja az 1-3. igénypontokbármelyike szerinti antitest molekula nehéz és/vagy könnyű láncát.
7. Klónozó vagy expressziős vektor, amely tartalmazza a 6. igénypont
8, Gazdasejt, amelyet a 7. igénypont szerinti vektorral transzformáltunk.
9. Eljárás az 1-3. Igénypontok bármelyike szerinti antitest molekula előállítására, amely eljárás tartalmazza a 8, igénypont szerinti gazdasejt ét és az antitest molekula izolálását.
19. Terápiás vagy diagnosztikai készítmény, amely tartalmazza az 1, vagy 2- igénypont szerinti antitest molekulát vagy a 3-5. igénypontok bármelyike szerinti vegyületet győgyászatiíag elfogadható vivőanyagboz társítva.
11, Az 1. vagy 2. Igénypont szerinti antitest molekula vagy a 3-6. igénypontok bármelyike szerinti vegyűlet terápiában való alkalmazásra.
12. Az 1. vagy 2, igénypont szerinti antitest molekula vagy a 3-6 igénypontok bármelyike szerinti vegyűlet alkalmazása rheumatoid arthritis, osteoarthnth, Crohn-omtmf eíőá«niss vagy psonasss kezeiswe gyógyszer meghatalmazott ?'»»©<· MniyOs í.ágy xwsaossaíi ögjnpíé
X «
ΡΟ
3 ábra AhTNF40 CDR-ek szekvenciái
H1 DYGMN (1. számú szekvencia)
H2 WINTYIGEPIYVDDFKG (7. számú szekvencia)
H2’ WINTYIGEPIYADSVKG (2. számú szekvencia)
H3 GYRSYAMDY (3, számú szekvencia)
L1 KASON VGTNVA (4, számú szekvencia)
L2 SASFLYS (5. számú szekvencia)
L.3 QQYNIYPLT (8. számú szekvencia) * «♦
Φ # X Φ * χ « * * X χ «» ♦ ♦♦X ♦ » *χ * « « * X »« ψ * * * X * * X β t
A hTNF4ö antitest nehéz lánc és a humán 1 csoportú és 3 csoportú konszenzus szekvenciák framework régióinak összehasonlítása
Hu 1 csoportú konszenzus : GVGLVQSGAEVKKRGASVKVSCKASGYTFT (91.sz,szekv.) PTNF40 ; QIQLVQSGPELKKPGETVKiSCKASGYVFT (92.sz. szekv.)
Hu 1 csoportú konszenzus : VWRQAPGQGLEWMG (93. számú szekvencia) PTNF40 ; WVKQAPGKAFKWT4G (94. számú szekvencia)
Hu 1 csoportú konszenzus : RVTiTRDTSTGTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR (SS.sz.szekv.) n’NF40
RFAFSlETSASTAFLQiNNLKNEDTÁTYFCÁR (96.SZ. szekv,)
Hu 1 csoportú konszenzus
KTNF40
WGQGTLVTVSS (97. számú szekvencia) WGGGTTLTVSS (98. számú szekvencia)
Hu 3 csoportú konszenzus ; EVQLVESGGGLVGPGGSLRLSCAASGFTFS (1O6.sz,szekv.) hTNF40 : GiGLVGSGPELKKPGETVKiSCKÁSGWFT (92. sz. szekv.)
Hu 3 csoportú konszenzus : WVRQAPGKGLEWVS (107. számú szekvencia) PTNF40 : WVKQAPGKAPKWMQ (94. számú szekvencia;
Hu 3 csoportú konszenzus : RF7ISRDNSKNTLYLÖMNSLRAEDTAVYYCAR (108.SZ, szekv.) 9TNF40 : RFAPSLETSASTAPEGiNNLKNEOTATYFCAR (98. sz. szekv.)
Hu 3 csoportú konszenzus : WGQGTLVTVSS (109, számú szekvencia) hTNF40 : WGGGTTLTVSS (93, sz. szekvencia)
HU0202346A 2000-06-06 2001-06-05 Humán tumor nekrózis faktor-alfa specifikus antitest molekulák és alkalmazásuk HU230561B1 (hu)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HUS1700013C HUS1700013I1 (hu) 2000-06-06 2017-04-06 Humán tumor nekrózis faktor-alfa specifikus antitest molekulák és alkalmazásuk

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0013810.7 2000-06-06
GBGB0013810.7A GB0013810D0 (en) 2000-06-06 2000-06-06 Biological products
PCT/GB2001/002477 WO2001094585A1 (en) 2000-06-06 2001-06-05 Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0202346A2 HUP0202346A2 (en) 2002-10-28
HUP0202346A3 HUP0202346A3 (en) 2004-11-29
HU230561B1 true HU230561B1 (hu) 2016-12-28

Family

ID=9893121

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU1600016A HU230553B1 (hu) 2000-06-06 2001-06-05 Humán tumor nekrózis faktor alfa specifikus antitest molekulák és alkalmazásuk
HUP1600483A HU230669B1 (hu) 2000-06-06 2001-06-05 Humán tumor nekrózis faktor alfa specifikus antitest molekulák és alkalmazásuk
HU0202346A HU230561B1 (hu) 2000-06-06 2001-06-05 Humán tumor nekrózis faktor-alfa specifikus antitest molekulák és alkalmazásuk
HUS1700013C HUS1700013I1 (hu) 2000-06-06 2017-04-06 Humán tumor nekrózis faktor-alfa specifikus antitest molekulák és alkalmazásuk

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU1600016A HU230553B1 (hu) 2000-06-06 2001-06-05 Humán tumor nekrózis faktor alfa specifikus antitest molekulák és alkalmazásuk
HUP1600483A HU230669B1 (hu) 2000-06-06 2001-06-05 Humán tumor nekrózis faktor alfa specifikus antitest molekulák és alkalmazásuk

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HUS1700013C HUS1700013I1 (hu) 2000-06-06 2017-04-06 Humán tumor nekrózis faktor-alfa specifikus antitest molekulák és alkalmazásuk

Country Status (42)

Country Link
US (4) US7012135B2 (hu)
EP (4) EP2308975B1 (hu)
JP (3) JP4064812B2 (hu)
KR (1) KR20020047097A (hu)
CN (1) CN1289671C (hu)
AP (1) AP2092A (hu)
AR (1) AR033978A1 (hu)
AT (1) ATE451460T1 (hu)
AU (1) AU783756B2 (hu)
BE (1) BE2010C019I2 (hu)
BG (1) BG66072B1 (hu)
BR (2) BR0106682A (hu)
CA (2) CA2707766C (hu)
CY (6) CY1109889T1 (hu)
CZ (1) CZ300737B6 (hu)
DE (3) DE122010000027I1 (hu)
DK (4) DK3059314T3 (hu)
EC (1) ECSP024210A (hu)
ES (5) ES2600080T3 (hu)
FR (1) FR10C0015I2 (hu)
GB (2) GB0013810D0 (hu)
HU (4) HU230553B1 (hu)
IL (3) IL147992A0 (hu)
IS (2) IS2808B (hu)
LT (1) LT2308975T (hu)
LU (1) LU91674I2 (hu)
MX (1) MXPA01013440A (hu)
MY (1) MY136603A (hu)
NL (1) NL300982I9 (hu)
NO (4) NO334808B1 (hu)
NZ (1) NZ516596A (hu)
OA (1) OA12282A (hu)
PE (1) PE20020292A1 (hu)
PL (2) PL212738B1 (hu)
PT (4) PT2230308E (hu)
RU (1) RU2303604C2 (hu)
SI (3) SI2230308T1 (hu)
SK (1) SK288343B6 (hu)
TR (1) TR201900227T4 (hu)
TW (2) TWI353358B (hu)
WO (1) WO2001094585A1 (hu)
ZA (1) ZA200200097B (hu)

Families Citing this family (111)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0013810D0 (en) 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
CA2385745C (en) 2001-06-08 2015-02-17 Abbott Laboratories (Bermuda) Ltd. Methods of administering anti-tnf.alpha. antibodies
US20060073141A1 (en) * 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
GB0129105D0 (en) * 2001-12-05 2002-01-23 Celltech R&D Ltd Expression control using variable intergenic sequences
EP1495056B1 (en) * 2002-03-20 2011-03-02 UCB Pharma, S.A. Methods of analyzing antibody disulfide isomers
US20040009172A1 (en) * 2002-04-26 2004-01-15 Steven Fischkoff Use of anti-TNFalpha antibodies and another drug
GB0210121D0 (en) 2002-05-02 2002-06-12 Celltech R&D Ltd Biological products
ES2916174T3 (es) * 2002-05-02 2022-06-28 Wyeth Holdings Llc Conjugados de transportador derivado de caliqueamicina
AU2003240790A1 (en) * 2002-05-28 2003-12-12 Pharmacia Corporation Antibody peg positional isomers, compositions comprising same, and use thereof
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
BR0312785A (pt) * 2002-07-19 2005-08-30 Abbott Biotech Ltd Tratamento de desordens relacionadas a tnf(alfa)
AU2003276844A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-19 Pharmacia Corporation Formulations of modified antibodies and methods of making the same
WO2004019861A2 (en) * 2002-08-28 2004-03-11 Pharmacia Corporation Stable ph optimized formulation of a modified antibody
US20040105858A1 (en) * 2002-08-29 2004-06-03 Kim Joanne Young Hee Kwak Diagnosis and treatment of infertility
MY150740A (en) 2002-10-24 2014-02-28 Abbvie Biotechnology Ltd Low dose methods for treating disorders in which tnf? activity is detrimental
CA2503697A1 (en) 2002-10-29 2004-05-13 Borean Pharma A/S Trimeric binding proteins for trimeric cytokines
EP1578799B8 (en) 2002-12-02 2011-03-23 Amgen Fremont Inc. Antibodies directed to tumor necrosis factor and uses thereof
US7101978B2 (en) 2003-01-08 2006-09-05 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules
US7575893B2 (en) * 2003-01-23 2009-08-18 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
GB0303337D0 (en) * 2003-02-13 2003-03-19 Celltech R&D Ltd Biological products
WO2004074345A2 (en) * 2003-02-19 2004-09-02 Pharmacia Corporation Carbonate esters of polyethylene glycol activated by means of oxalate esters
WO2004098578A2 (en) * 2003-05-12 2004-11-18 Altana Pharma Ag Composition comprising a pde4 inhibitor and a tnf-alfa antagonist selected from infliximab, adalimumab, cdp870 and cdp517
AU2004220325B2 (en) * 2003-06-30 2011-05-12 Domantis Limited Polypeptides
WO2005014649A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Pharmacia Corporation Method for the preparation of molecules having antibody activity
SI1656455T1 (sl) * 2003-08-13 2012-12-31 Sandoz Ag Postopek za čiščenje rekombinantnih polipeptidov
US7785830B2 (en) * 2003-08-13 2010-08-31 Sandoz Ag Expression vectors, transformed host cells and fermentation process for the production of recombinant polypeptides
GB0319601D0 (en) 2003-08-20 2003-09-24 Sandoz Ag Production process
KR100570422B1 (ko) * 2003-10-16 2006-04-11 한미약품 주식회사 대장균 분비서열을 이용하여 항체 단편을 분비·생산하는 발현벡터 및 이를 이용하여 항체 단편을 대량 생산하는 방법
CN100393748C (zh) * 2003-11-06 2008-06-11 上海中信国健药业有限公司 全人源肿瘤坏死因子抗体，其制备方法以及药物组合物
KR100772800B1 (ko) * 2003-11-17 2007-11-01 주식회사유한양행 인간 종양괴사인자 α를 인식하는 단일클론항체의가변영역 및 이를 코딩하는 유전자
US7435799B2 (en) 2004-01-08 2008-10-14 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules
CN100427504C (zh) * 2004-06-02 2008-10-22 北京天广实生物技术有限公司 TNFα高亲和力嵌合抗体及其用途
JP2008504356A (ja) * 2004-06-30 2008-02-14 ドマンティス リミテッド 炎症性疾患を治療するための組成物及び方法
GB0425972D0 (en) * 2004-11-25 2004-12-29 Celltech R&D Ltd Biological products
US8022040B2 (en) * 2004-11-29 2011-09-20 The Regents Of The University Of California Hydroxyapatite-binding peptides for bone growth and inhibition
ATE499385T1 (de) * 2004-12-29 2011-03-15 Yuhan Corp Tumornekrosefaktor-alpha spezifische humanisierte antikörper
MX2007014440A (es) 2005-05-16 2008-02-11 Abbott Biotech Ltd Uso de inhibidor de tnf para tratamiento de poliartritis erosiva.
CN101189265B (zh) * 2005-06-01 2012-07-04 米克罗麦特股份公司 抗il2抗体
EP3260465A1 (en) 2005-06-07 2017-12-27 ESBATech, an Alcon Biomedical Research Unit LLC Stable and soluble antibodies inhibiting tnf-alpha
GB0520169D0 (en) * 2005-10-04 2005-11-09 Celltech R&D Ltd Biological products
CA2648582C (en) 2006-04-07 2016-12-06 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates of an anti-tnf-alpha antibody
US9605064B2 (en) 2006-04-10 2017-03-28 Abbvie Biotechnology Ltd Methods and compositions for treatment of skin disorders
EP2007426A4 (en) * 2006-04-10 2010-06-16 Abbott Biotech Ltd COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF PSORIASTIC POLYARTHRITIS AND THEIR APPLICATIONS
EP2010214A4 (en) 2006-04-10 2010-06-16 Abbott Biotech Ltd USES AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF RHEUMATOID ARTHRITIS
US20080131374A1 (en) * 2006-04-19 2008-06-05 Medich John R Uses and compositions for treatment of rheumatoid arthritis
CA2656347A1 (en) 2006-07-03 2008-01-10 Charles David Adair Composition for modulating the expression of cell adhesion molecules
EP1914242A1 (en) * 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
ES2350029T3 (es) * 2007-03-02 2011-01-17 Farnam Companies, Inc. Pellets de liberación sostenida que comprenden un material tipo cera.
US20080305115A1 (en) * 2007-06-07 2008-12-11 Tice Thomas R Reduced-mass, long-acting dosage forms
EP2171451A4 (en) 2007-06-11 2011-12-07 Abbott Biotech Ltd METHOD FOR TREATING JUVENILIAN IDIOPATHIC ARTHRITIS
US8865875B2 (en) 2007-08-22 2014-10-21 Medarex, L.L.C. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with C-terminal extensions
WO2015164330A1 (en) 2014-04-21 2015-10-29 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-psyk antibody molecules and use of same for syk-targeted therapy
US20110002927A1 (en) * 2008-02-05 2011-01-06 Delenex Therapeutics Ag Antigen-binding polypeptides against cartilage degeneration
EP2279207B1 (en) * 2008-05-07 2015-09-09 Argos Therapeutics, Inc. Humanized antibodies against human interferon-alpha
ES2677003T3 (es) 2008-06-25 2018-07-27 Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc Humanización de anticuerpos de conejo utilizando un marco universal de anticuerpos
ES2890405T3 (es) 2008-06-25 2022-01-19 Novartis Ag Humanización de anticuerpos de conejo usando un armazón de anticuerpo universal
CN102076716A (zh) * 2008-06-25 2011-05-25 艾斯巴技术,爱尔康生物医药研究装置有限责任公司 抑制TNFα的稳定和可溶的抗体
DK2307454T3 (en) 2008-06-25 2017-04-24 Esbatech Alcon Biomed Res Unit Stable and soluble antibodies that inhibit VEGF
CN101684156B (zh) * 2008-09-27 2011-12-28 苏州工业园区晨健抗体组药物开发有限公司 人TNFα单克隆抗体、其PEG化纳米颗粒及其应用
RU2011135768A (ru) * 2009-01-29 2013-03-10 Эбботт Лэборетриз Белки, связывающие il-1
US20110165063A1 (en) * 2009-01-29 2011-07-07 Abbott Laboratories Il-1 binding proteins
US9150640B2 (en) 2009-07-10 2015-10-06 Ablynx N.V. Method for the production of variable domains
LT2993231T (lt) 2009-09-24 2018-11-12 Ucb Biopharma Sprl Rekombinantinio baltymo raiškai skirtas bakterijų kamienas, turintis proteazės negaminantį degp su išlaikytų šaperoniniu aktyvumu ir išveiklintus tsp ir ptr genus
CA3031851C (en) 2009-10-23 2020-07-07 Amgen British Columbia Anti-gcc antibody molecules and related compositions and methods
GB201000591D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial hoist strain
GB201000590D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial host strain
GB201000588D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial host strain
GB201000587D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial hoist strain
GB201001791D0 (en) * 2010-02-03 2010-03-24 Ucb Pharma Sa Process for obtaining antibodies
BR112012022342A2 (pt) 2010-03-04 2017-02-14 Vet Therapeutics Inc anticorpos monoclonais dirigidos a cd52
US9616120B2 (en) 2010-03-04 2017-04-11 Vet Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies directed to CD20
PH12012501991A1 (en) 2010-04-07 2017-07-26 Abbvie Inc Tnf-alpha binding proteins
GB201012603D0 (en) * 2010-07-27 2010-09-08 Ucb Pharma Sa Protein purification
GB201012599D0 (en) 2010-07-27 2010-09-08 Ucb Pharma Sa Process for purifying proteins
GB201012784D0 (en) * 2010-07-29 2010-09-15 Ucb Pharma Sa Method
TWI538918B (zh) 2010-10-20 2016-06-21 財團法人工業技術研究院 人源化之單株抗體、其核苷酸序列與其用途
UY33679A (es) 2010-10-22 2012-03-30 Esbatech Anticuerpos estables y solubles
WO2012164083A1 (en) 2011-06-01 2012-12-06 Actogenix N.V. Polycistronic expression system for bacteria
EP2546267A1 (en) 2011-07-13 2013-01-16 UCB Pharma S.A. Bacterial host strain expressing recombinant DsbC
EP2731973B1 (en) 2011-07-13 2017-11-15 UCB Biopharma SPRL Bacterial host strain expressing recombinant dsbc
EP2758513B1 (en) 2011-09-23 2018-05-16 Intrexon Actobiotics NV Modified gram positive bacteria and uses thereof
WO2013041672A1 (en) 2011-09-23 2013-03-28 Actogenix Nv Modified gram positive bacteria and uses thereof
WO2013087914A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Synthon Biopharmaceuticals B.V. EXPRESSION OF SECRETORY IgA ANTIBODIES IN DUCKWEED
US9156915B2 (en) 2012-04-26 2015-10-13 Thomas Jefferson University Anti-GCC antibody molecules
GB201208367D0 (en) 2012-05-14 2012-06-27 Ucb Pharma Sa Biological product
KR102193080B1 (ko) 2012-08-13 2020-12-18 제넨테크, 인크. 항-jagged 항체 및 사용 방법
WO2016065042A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin d conjugates
WO2016065052A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin d conjugates
SI3237433T1 (sl) 2014-12-22 2025-11-28 UCB Biopharma SRL Postopek za proizvodnjo proteinov
US11091559B2 (en) 2015-08-27 2021-08-17 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-ALK antibodies and methods for use thereof
GB201522394D0 (en) 2015-12-18 2016-02-03 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
CN108883140A (zh) 2016-01-14 2018-11-23 英特瑞克斯顿阿克图比奥帝克斯有限公司 治疗1型糖尿病的组合物和方法
RU2680011C2 (ru) * 2016-04-29 2019-02-14 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Триспецифические антитела против il-17a, il-17f и другой провоспалительной молекулы
PE20190622A1 (es) * 2016-06-02 2019-04-26 Abbvie Inc Agonista del receptor de glucocorticoides e inmunoconjugados del mismo
EP3824906A1 (en) 2016-12-21 2021-05-26 Amgen Inc. Anti-tnf alpha antibody formulations
HUE054428T2 (hu) 2017-12-01 2021-09-28 Abbvie Inc Glükokortikoid receptor agonista és annak immunkonjugátumai
SG11202107995SA (en) 2019-01-31 2021-08-30 Numab Therapeutics AG Multispecific antibodies having specificity for tnfa and il-17a, antibodies targeting il-17a, and methods of use thereof
KR102323342B1 (ko) 2019-04-26 2021-11-08 주식회사 와이바이오로직스 IL-17A 및 TNF-α에 특이적으로 결합하는 이중표적 항체
CN111909268B (zh) * 2019-05-07 2022-04-19 北京天成新脉生物技术有限公司 低免疫原性低ADCC/CDC功能抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060及其应用
TW202237639A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 鳥苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
TW202237638A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 烏苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
MX2023009497A (es) 2021-02-15 2023-08-23 Takeda Pharmaceuticals Co Composiciones y metodos de terapia celular para modular la se?alizacion del factor de crecimiento transformador-beta (tgf-beta).
CN120463762A (zh) 2021-08-26 2025-08-12 映恩生物科技(上海)有限公司 一种甾体化合物及其缀合物
EP4405473A1 (en) 2021-09-24 2024-07-31 Xbrane Biopharma AB Dna constructs and host cells for expressing recombinant protein
SE545694C2 (en) * 2021-09-24 2023-12-05 Xbrane Biopharma Ab Dna construct comprising nucleotide sequences encoding amino acid sequences of certolizumab and pelb signal peptides
SE545714C2 (en) * 2021-09-24 2023-12-19 Xbrane Biopharma Ab Dna contructs for producing a pelb signal peptide
WO2023154799A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Combination immunotherapy for treating cancer
AU2023353057A1 (en) 2022-09-30 2025-05-01 Extend Biosciences, Inc. Long-acting parathyroid hormone
EP4673455A1 (en) * 2023-03-01 2026-01-07 Lupin Limited Process for manufacturing antibody fragment protein
WO2025049345A1 (en) 2023-08-25 2025-03-06 Proteologix Us Inc. Anti-il-13 multispecific antibody constructs and uses thereof
WO2025099576A1 (en) 2023-11-06 2025-05-15 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating rheumatoid arthritis

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
DK336987D0 (da) 1987-07-01 1987-07-01 Novo Industri As Immobiliseringsmetode
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
GB8719042D0 (en) 1987-08-12 1987-09-16 Parker D Conjugate compounds
US5030570A (en) 1988-06-30 1991-07-09 The Eunice Kennedy Shriver Center For Mental Retardation DNA encoding and method of expressing human monoamine oxidase type A
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
PT92900A (pt) * 1989-01-24 1990-07-31 Sistema de vectores de expressao para a producao de anticorpos monoclonais quimericos
GB8907617D0 (en) 1989-04-05 1989-05-17 Celltech Ltd Drug delivery system
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
GB9109645D0 (en) * 1991-05-03 1991-06-26 Celltech Ltd Recombinant antibodies
US5919452A (en) 1991-03-18 1999-07-06 New York University Methods of treating TNFα-mediated disease using chimeric anti-TNF antibodies
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
GB9120467D0 (en) 1991-09-26 1991-11-06 Celltech Ltd Anti-hmfg antibodies and process for their production
DE69405102T2 (de) * 1993-06-03 1998-01-15 Therapeutic Antibodies, Inc., Nashville, Tenn. Antikoerperfragmente in therapie
NO309690B1 (no) 1995-01-23 2001-03-12 Western Atlas Int Inc Detonasjonsanordning av type eksploderende brotråd for bruk med et perforeringsverktöy i en brönn
AU2365795A (en) 1995-04-20 1996-11-07 Centocor Inc. Multiple administrations of anti-tnf antibody
US6258562B1 (en) 1996-02-09 2001-07-10 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
GB9625640D0 (en) * 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
WO1999009055A2 (en) * 1997-08-18 1999-02-25 Innogenetics N.V. Interferon-gamma-binding molecules for treating septic shock, cachexia, immune diseases and skin disorders
GB9720054D0 (en) * 1997-09-19 1997-11-19 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
ES2222689T3 (es) 1998-03-12 2005-02-01 Nektar Therapeutics Al, Corporation Derivados del polietilenglicol con grupos reactivos proximales.
GB9812545D0 (en) * 1998-06-10 1998-08-05 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
GB0013810D0 (en) * 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products

Also Published As

Publication number Publication date
GB0013810D0 (en) 2000-07-26
DK2230308T3 (da) 2013-05-06
DE10192353T1 (de) 2003-05-22
HUP1600016A2 (en) 2002-10-28
NO341218B1 (no) 2017-09-11
AP2092A (en) 2010-02-28
GB2366800B (en) 2005-01-19
DE60140738D1 (de) 2010-01-21
TWI353358B (en) 2011-12-01
LT2308975T (lt) 2016-11-10
CY1109889T1 (el) 2012-01-25
DK3059314T3 (en) 2019-02-18
CY1118220T1 (el) 2017-06-28
WO2001094585A1 (en) 2001-12-13
LU91674I2 (fr) 2010-05-31
ES2403217T3 (es) 2013-05-16
EP2230308B1 (en) 2013-01-23
NO2014026I2 (no) 2018-02-14
BG66072B1 (bg) 2011-01-31
PT2308975T (pt) 2016-11-14
MXPA01013440A (es) 2003-09-04
HU230669B1 (hu) 2017-07-28
IS2808B (is) 2012-09-15
ES2337763T3 (es) 2010-04-29
ZA200200097B (en) 2003-01-06
HUP0202346A2 (en) 2002-10-28
CY1114143T1 (el) 2016-07-27
US20060233800A1 (en) 2006-10-19
CY2019018I1 (el) 2020-05-29
SI1287140T1 (sl) 2010-04-30
CA2707766C (en) 2013-05-21
CZ2002837A3 (cs) 2002-05-15
IS3016B (is) 2019-10-15
HUP0202346A3 (en) 2004-11-29
BRPI0106682B1 (pt) 2020-10-13
JP4476989B2 (ja) 2010-06-09
EP2308975A1 (en) 2011-04-13
PL353960A1 (en) 2003-12-15
ES2707714T3 (es) 2019-04-04
DK1287140T3 (da) 2010-04-19
CN1383450A (zh) 2002-12-04
AR033978A1 (es) 2004-01-21
HU230553B1 (hu) 2016-11-28
PE20020292A1 (es) 2002-05-08
CA2707766A1 (en) 2001-12-13
ES2230975B2 (es) 2007-04-16
BR0106682A (pt) 2002-05-14
FR10C0015I1 (hu) 2010-04-16
PT3059314T (pt) 2019-02-01
US7402662B2 (en) 2008-07-22
US7186820B2 (en) 2007-03-06
JP2003535591A (ja) 2003-12-02
NO20020554L (no) 2002-04-08
SK3152002A3 (en) 2002-07-02
US7012135B2 (en) 2006-03-14
US20020151682A1 (en) 2002-10-17
OA12282A (en) 2006-05-11
LU91674I9 (hu) 2019-01-03
HK1051385A1 (en) 2003-08-01
BRPI0106682B8 (pt) 2021-05-25
NO20020554D0 (no) 2002-02-04
HK1148776A1 (en) 2011-09-16
CY2010011I1 (el) 2012-01-25
HUP1600483A2 (hu) 2002-10-28
IL147992A0 (en) 2002-09-12
NZ516596A (en) 2004-07-30
TR201900227T4 (tr) 2019-02-21
PL399351A1 (pl) 2012-12-17
ES2600080T3 (es) 2017-02-07
NL300982I1 (hu) 2019-05-01
AU6051101A (en) 2001-12-17
NO339282B1 (no) 2016-11-21
DK2308975T3 (da) 2016-10-31
CY2019018I2 (el) 2020-05-29
BE2010C019I2 (hu) 2020-08-20
JP5185143B2 (ja) 2013-04-17
NO20131316L (no) 2002-04-08
PL218516B1 (pl) 2014-12-31
EP2308975B1 (en) 2016-08-10
MY136603A (en) 2008-10-31
ES2230975A1 (es) 2005-05-01
SK288343B6 (sk) 2016-04-01
HUS1700013I1 (hu) 2017-08-28
TW200817430A (en) 2008-04-16
NL300982I9 (nl) 2019-05-06
JP2007105043A (ja) 2007-04-26
EP2230308A1 (en) 2010-09-22
IL147992A (en) 2009-06-15
IL195085A0 (en) 2009-08-03
AU783756B2 (en) 2005-12-01
GB2366800A (en) 2002-03-20
EP3059314B1 (en) 2018-10-24
JP2009171966A (ja) 2009-08-06
CA2380298C (en) 2010-09-28
CZ300737B6 (cs) 2009-07-29
EP1287140A1 (en) 2003-03-05
PT2230308E (pt) 2013-05-03
RU2303604C2 (ru) 2007-07-27
KR20020047097A (ko) 2002-06-21
CY1121173T1 (el) 2020-05-29
NO334808B1 (no) 2014-06-02
EP1287140B1 (en) 2009-12-09
NO20160694A1 (no) 2002-04-08
TWI316088B (en) 2009-10-21
EP3059314A1 (en) 2016-08-24
SI2308975T1 (sl) 2016-11-30
BG106278A (bg) 2002-12-29
CA2380298A1 (en) 2001-12-13
ECSP024210A (es) 2002-05-23
FR10C0015I2 (fr) 2011-12-30
GB0128386D0 (en) 2002-01-16
ATE451460T1 (de) 2009-12-15
CY2010011I2 (el) 2012-01-25
CN1289671C (zh) 2006-12-13
US20030026805A1 (en) 2003-02-06
US20080269465A1 (en) 2008-10-30
NO2014026I1 (no) 2014-10-23
JP4064812B2 (ja) 2008-03-19
DE122010000027I1 (de) 2010-08-12
US7977464B2 (en) 2011-07-12
SI2230308T1 (sl) 2013-06-28
PL212738B1 (pl) 2012-11-30
IS6217A (is) 2002-01-03
PT1287140E (pt) 2010-03-08
AP2002002690A0 (en) 2002-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU230561B1 (hu) Humán tumor nekrózis faktor-alfa specifikus antitest molekulák és alkalmazásuk
HK1228449A1 (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof
HK1228449B (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof
SK288706B6 (sk) Molekuly protilátky, ktoré sú špecifické pre humánny nádorový nekrotický faktor alfa a ich použitie
HK1148776B (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof
HK1051385B (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof
HK1156657A (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
GB9A Succession in title

Owner name: UCB PHARMA S.A., BE

Free format text: FORMER OWNER(S): CELLTECH R & LIMITED, GB; UCB, S.A., BE

AA1S Information on application for a supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: CERTOLIZUMAB PEGOL; REGISTRATION NO/DATE: EU/1/09/544/001-002 20091006

Spc suppl protection certif: S1700013

Filing date: 20170406

Expiry date: 20210605

FG4S Grant of supplementary protection certificate

Spc suppl protection certif: S1700013

Filing date: 20170406

Expiry date: 20210605