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CN111505316A - 一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试剂盒的生产方法 - Google Patents

一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试剂盒的生产方法 Download PDF

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CN111505316A
CN111505316A CN202010442384.8A CN202010442384A CN111505316A CN 111505316 A CN111505316 A CN 111505316A CN 202010442384 A CN202010442384 A CN 202010442384A CN 111505316 A CN111505316 A CN 111505316A
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recombinant
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吴玉章
吴长龙
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Original Assignee
Wuxi Fuwei Biomedical Technology Co ltd
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Abstract

本发明涉及一种新型冠状病毒2019‑nCoV抗体谱检测试剂盒的生产方法，属于新型冠状病毒2019‑nCoV检测技术领域。利用本发明提供的生产方法得到的检测试剂盒包括桶装试纸条、瓶装样本稀释液、瓶装洗脱液、瓶装检测抗体、瓶装底物A、瓶装底物B、孵育槽、镊子、说明书、自封袋。本发明提供的生产方法中运用重组免疫印迹法制备检测试纸条，不同于传统的免疫印迹法，无需进行蛋白凝胶电泳和转膜，直接在硝酸纤维素膜上进行划线处理，大大简化了检测试剂盒的生产方法，缩短了制备时间，可在短时间内大批量生产检测试剂盒。

Description

一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试剂盒的生产方法
技术领域
本发明涉及一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试剂盒的生产方法，属于新型冠状病毒2019-nCoV检测技术领域。
背景技术
免疫印迹法(Western blotting)是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，用于组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。
传统免疫印迹法分三个阶段进行。第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向原理阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见(只有在染色后才显出电泳区带)。第二阶段为电转移：将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压和大电流，通电45min转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。第三阶段为酶免疫定位：将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP底物为3,3'-二氨基联苯胺(呈棕色)和4-氯-1-萘酚(呈蓝紫色)。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。传统免疫印迹法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。但是该方法操作繁琐、步骤多，生产工艺复杂，不易形成商品化的产品。
目前，血清抗体检测主要是免疫层析法，该方法操作简单，对设备要求低，甚至无需检测设备；检测时间短；对于检测环境要求不高，一般15分钟左右即可出结果。该方法的缺点是侧向层析方法使用1种最多2种蛋白进行检测，没有清洗过程，由于个别患者血液中含有类风湿因子、异嗜性抗体、自身抗体，以及药物和肿瘤细胞等，易造成试验的交叉反应，出现假阳性的结果。也有少部分的免疫印迹法，但是试纸条制备需要通过电泳和转膜操作，仪器和操作要求高。
因此，急需一种生产和使用方便、适合大规模的人群筛查、能避免假阴性和假阳性问题、灵敏度和特异性高、可以用于病程监控和疫苗效果评价的新型冠状病毒检测试剂盒。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试剂盒的生产方法。本发明提供的生产方法中运用重组免疫印迹法制备检测试纸条，不同于传统的免疫印迹法，无需进行蛋白凝胶电泳和转膜，直接在硝酸纤维素膜上进行划线处理，大大简化了检测试剂盒的生产方法，缩短了制备时间，同时，通过完成对各液体组分的配制、分装，包装等工艺流程完成检测试剂盒的生产。
本发明提供了一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试剂盒的生产方法，技术方案如下：
一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试剂盒的生产方法，所述生产方法是分别制备检测试纸条、样本稀释液、洗脱液、检测抗体和底物，将制备完成的检测试纸条、样本稀释液、洗脱液、检测抗体和底物，通过分装、组合、包装后形成检测试剂盒；其中，所述检测试纸条的制备方法包括以下步骤：
(1)将新型冠状病毒抗原和羊抗鼠IgG分别在硝酸纤维素膜上进行划线；所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组N蛋白，或，所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组E蛋白，或，所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组N蛋白、重组E蛋白；
(2)35-39℃烘干处理1-3小时；
(3)将步骤(2)中烘干后的硝酸纤维素膜完全浸入封闭液中，15-25℃条件下，浸泡0.5-2小时；
(4)35-39℃烘干处理1-3小时；
(5)将步骤(4)中烘干后的硝酸纤维素膜固定在PVC胶板上，再在PVC胶板短边的一端贴上印有流水号的标签纸，切成3.5-4.0mm宽的试纸条，，即为新型冠状病毒2019-nCOV抗体谱检测试纸条。
进一步地，步骤(2)和步骤(4)所述烘干在湿度≤30％环境中进行。
进一步地，所述检测试纸条、样本稀释液、洗脱液、检测抗体和底物的制备过程均在10万级环境下进行。
进一步地，所述样本稀释液为pH为7-8的磷酸盐缓冲液，配制完在10万级环境下通过蠕动泵分装到样本稀释液瓶中。
进一步地，所述洗脱液为添加了吐温-20的pH为7-8的磷酸盐缓冲液，配制完在10万级环境下通过蠕动泵分装到洗脱液瓶中。
进一步地，所述检测抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体或IgM抗体或IgA抗体或IgE抗体，配制完在10万级环境下通过蠕动泵分装到检测抗体瓶中。
进一步地，步骤(1)划线前，利用蛋白稀释液对新型冠状病毒抗原和羊抗鼠IgG进行稀释，所述蛋白稀释液的制备方法是称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水999mL溶解，吸取1mL proClin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL，常温放置备用。
进一步地，步骤(3)所述封闭液的制备方法是称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；称取牛血清白蛋白10g，加纯水900mL溶解，加入NaOH溶液调整pH至7.4。吸取1mL proClin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。2-8℃条件下放置备用。
进一步地，所述样本稀释液的制备方法是称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水999mL溶解，吸取1mL proClin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL，常温放置备用。
进一步地，所述洗脱液的制备方法是称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水997.5mL溶解，分别吸取1mL proClin300和1.5mL吐温-20至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。常温放置备用。
进一步地，所述底物中含三羟甲基氨基甲烷、H2O2和3,3-二氨基联苯胺。
进一步地，所述底物的制备方法是将底物A和底物B等体积混合；所述底物A的配制方法是称取三羟甲基氨基甲烷1.21g，加纯水900mL溶解，加HCl调整pH至pH7.5。定容至1000mL，常温放置备用；所述底物B的配制方法是量取30％H2O20.1mL，称取3,3-二氨基联苯胺0.01g，定容至100mL。2-8℃条件放置备用。
进一步地，所述检测抗体的制备方法是将辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人IgG抗体使用抗体稀释液进行稀释，使其终浓度为0.5μg/mL，混匀，2-8℃条件下放置备用；所述抗体稀释液的制备方法是称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；称取牛血清白蛋白20g，加纯水900mL溶解，加NaOH溶液调整pH至pH7.5。吸取1mL proClin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。2-8℃条件下放置备用。
进一步地，所述检测试纸条的宽度为3.5-4.0mm。
进一步地，所述检测试纸条中，PVC胶板长度为5-6cm，印有流水号的标签纸长度为1.1-1.2cm，硝酸纤维素膜长度为4-5cm，交互重叠部分为0.1-0.2cm，重叠部分印有流水号的标签纸在上，硝酸纤维素膜在下，质控线与相邻的检测线间隔0.9-1.1cm，各检测线间隔0.4-0.6cm。
进一步地，所述检测试剂盒中还含有说明书、镊子、孵育槽、自封袋。
进一步地，所述重组S1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述重组RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述重组N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述重组E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步地，所述重组S1蛋白的制备方法为：通过合成编码新型冠状病毒2019-nCOVSpike蛋白的全长基因，并利用PCR的方法将合成的基因构建到小鼠IgG FC的表达载体pCMV6-c.mFC上，得到重组质粒；将重组质粒转染Hek293细胞分泌表达融合蛋白，并通过ProteinA进行亲和纯化而获取。理论Mw:76.5kD。
进一步地，所述重组RBD蛋白的制备方法为：通过合成编码新型冠状病毒2019-nCOV Spike蛋白的第319位Arg到541位Phe的基因，并利用PCR的方法将合成的基因构建到小鼠IgG FC的表达载体pCMV6-c.mFC上，得到重组质粒；将重组质粒转染Hek293细胞分泌表达融合蛋白，并通过ProteinA进行亲和纯化而获取。理论Mw:52kD。
进一步地，所述重组N蛋白的制备方法为：通过合成编码新型冠状病毒2019-nCOV核衣壳蛋白完整的基因，并利用PCR的方法将合成的基因构建到pET28A-N-His的表达载体上得到重组质粒；将重组质粒转大肠杆菌，表达重组蛋白，并通过镍柱进行亲和纯化而获取。理论Mw:46.5kD。
进一步地，所述重组E蛋白的制备方法为：通过合成编码新型冠状病毒2019-nCOV包膜蛋白完整的基因，并利用PCR的方法将合成的基因构建到HIS-C-pET28A-N-GST的表达载体上。测序正确的质粒制备后转大肠杆菌，表达重组蛋白，并通过镍柱进行亲和纯化而获取。理论Mw:36.8kD。
进一步地，所述重组抗原S1蛋白、重组抗原RBD蛋白、重组抗原N蛋白、重组抗原E蛋白的划线浓度分别为0.2-0.5mg/mL(1μL/cm)、0.2-0.5mg/mL(1μL/cm)、0.1-0.2mg/mL(1μL/cm)、0.1-0.2mg/mL(1μL/cm)。
进一步地，所述羊抗鼠IgG的划线浓度为0.2-1mg/mL(1μL/cm)。
本发明有益的技术效果在于：
本发明提供的生产方法中运用重组免疫印迹法制备检测试纸条，不同于传统的免疫印迹法，无需进行蛋白凝胶电泳和转膜，直接在硝酸纤维素膜上进行划线处理，大大简化了检测试剂盒的生产方法，缩短了制备时间，可在短时间内大批量生产检测试剂盒。利用本发明提供的生产方法生产的检测试剂盒通过多种新型冠状病毒特异性重组抗原联合检测血清或血浆样本中的抗体，可用于体外定性检测人血清或血浆样本中的新型冠状病毒抗体，有效增加灵敏度和特异性，及时发现早期感染者，同时可以用于康复患者体内抗体的评价诊断进行病程监控，未来更可广泛用于疫苗人体效果的评估。本发明提供的试剂盒组分少，生产过程简单，生产成本降低，易于放大生产；检测过程便捷，易于实现全自动化。
附图说明
图1为本发明的一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试纸条的侧面示意图，其中，T1、T2、T3、T4分别表示不同的检测线，不同的检测线上划有不同的新型冠状病毒抗原条带。
图2为本发明实施例1中的一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试纸条示意图。
图3为本发明实施例2中一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试纸条示意图。
图4为本发明实施例3中一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试纸条示意图。
图5为本发明中的一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试剂盒的生产工艺流程图。
具体实施方式
检测试纸条蛋白划线浓度选择：显色深度以“+”表示；“+++”代表最强。
检测方法：蛋白划线制成检测试纸条后，加入胶体金平台假阳样本和阳性样本、检测抗体和底物，观察条带显色强度。如表1-5所示。
表1不同羊抗鼠IgG抗体划线浓度对颜色的影响；单位：mg/mL(1μL/cm)
阳性样本 假阳样本1# 假阳样本2# 假阳样本3#
1mg/mL +++ +++ +++ +++
0.5mg/mL +++ +++ +++ +++
0.2mg/mL ++ ++ ++ ++
0.1mg/mL + + + +
表2不同重组S1蛋白划线浓度对颜色的影响；单位：mg/mL(1μL/cm)
阳性样本 假阳样本1# 假阳样本2# 假阳样本3#
1mg/mL +++ + - -
0.5mg/mL +++ - - -
0.2mg/mL ++ - - -
0.1mg/mL - - - -
表3不同重组RBD蛋白划线浓度对颜色的影响；单位：mg/mL(1μL/cm)
Figure BDA0002504643040000051
Figure BDA0002504643040000061
表4不同重组N蛋白划线浓度对颜色的影响；单位：mg/mL(1μL/cm)
阳性样本 假阳样本1# 假阳样本2# 假阳样本3#
1mg/mL +++ - - +
0.5mg/mL +++ - - +
0.2mg/mL +++ - - -
0.1mg/mL ++ - - -
表5不同重组E蛋白划线浓度对颜色的影响；单位：mg/mL(1μL/cm)
阳性样本 假阳样本1# 假阳样本2# 假阳样本3#
1mg/mL +++ + - -
0.5mg/mL +++ - - -
0.2mg/mL +++ - - -
0.1mg/mL ++ - - -
确定划线浓度如下：
0.2-1mg/mL(1μL/cm)的羊抗鼠IgG抗体；
0.2-0.5mg/mL(1μL/cm)的重组S1蛋白；
0.2-0.5mg/mL(1μL/cm)的重组RBD蛋白；
0.1-0.2mg/mL(1μL/cm)的重组N蛋白；
0.1-0.2mg/mL(1μL/cm)的重组E蛋白。
检测时间和温度的选择：
室温下，样本孵育时间设置为30min、40min、1h；检测抗体孵育时间设置为30min、40min、1h；
根据不同孵育时间，检测试纸条对阳性样本的检测显色强度，确定检测孵育的适宜时间为：样本：40min、检测抗体：40min。
温度设置为4℃、22℃、37℃，孵育时间设置为样本：40min、检测抗体：40min；
根据不同温度下，检测试纸条对阳性样本的检测显色强度，确定检测孵育的适宜温度为：室温(15-25℃)。
以48人份的试剂盒为例，试剂盒中包含的试剂、耗材如表6所示。
表6.新型冠状病毒(2019-nCOV)抗体谱检测试剂盒
Figure BDA0002504643040000071
下面结合实施例，对本发明进行具体描述。
下述实施例中的检测试纸条宽度为3.5-4.0mm，PVC胶板长度为5-6cm，印有流水号的标签纸长度为1.1-1.2cm，硝酸纤维素膜长度为4-5cm，交互重叠部分为0.1-0.2cm，重叠部分印有流水号的标签纸在上，硝酸纤维素膜在下，质控线与相邻的检测线间隔0.9-1.1cm，各检测线间隔0.4-0.6cm。
实施例1
1.检测试纸条的制备：
1.1配制蛋白稀释液和封闭液
蛋白稀释液：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水999mL溶解，吸取1mL proClin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。常温放置备用。
封闭液：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g，牛血清白蛋白10g，加纯水900mL溶解，加入NaOH溶液调整pH至7.4。吸取1mL proClin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。2-8℃条件下放置备用。
1.2制备检测试纸条
(1)配制质控线溶液C：将羊抗鼠IgG抗体用蛋白稀释液稀释成0.5mg/mL；
(2)配制检测线溶液T1:将重组S1蛋白用蛋白稀释液稀释成0.2mg/mL；
(3)配制检测线溶液T2:将重组RBD蛋白用蛋白稀释液稀释成0.2mg/mL；
(4)配制检测线溶液T3:将重组N蛋白用蛋白稀释液稀释成0.1mg/mL；
(5)配制检测线溶液T4:将重组E蛋白用蛋白稀释液稀释成0.1mg/mL；
(6)裁膜：将硝酸纤维素膜裁切成310mm±5mm长的膜；
(7)划线：用喷金划线仪进行划线包被，如图2所示，检测线和质控线包被的线浓度均为1μL/cm；
(8)干燥:对已包被好的硝酸纤维素膜进行烘干，温度37℃±2℃，时间120min(烘干过程在湿度≤30％环境中进行)；
(9)封闭：对已干燥好的硝酸纤维素膜用封闭液进行浸泡30min；
(10)干燥:对已封闭好的硝酸纤维素膜进行再烘干，温度37℃±2℃，时间120min(烘干过程在湿度≤30％环境中进行)；
(11)贴膜：将PVC胶板中间部分的表面贴膜撕掉，并贴上已经制备好的硝酸纤维素膜；
(12)利用裁切机将印有流水号的标签纸裁切成30cm×1.1cm；
(13)按图1所示，在PVC胶板短边的一端贴印有流水号的标签纸，组合好；
(14)利用斩切机将组合好的试纸板条竖切成宽度为3.5mm的试纸条。
2.样本稀释液的制备：
0.1M、pH7.4磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水999mL溶解，吸取1mL proClin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。常温放置备用。
3.洗脱液的制备：
称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水997.5mL溶解，分别吸取1mL proClin300和1.5mL吐温-20至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。常温放置备用。
4.检测抗体的制备：
将辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人IgG抗体使用抗体稀释液进行稀释，使其终浓度为0.5μg/mL，混匀，2-8℃条件下放置备用。
5.底物的制备：
底物A的配制：称取三羟甲基氨基甲烷1.21g，加纯水900mL溶解，加HCl调整pH至pH7.5。定容至1000mL。常温放置备用。
底物B的配制：量取30％H2O20.1mL，称取3,3-二氨基联苯胺0.01g，定容至100mL。2-8℃条件放置备用。
底物制备：将底物A和底物B等体积混合。现配现用。
以上制备过程均在十万级环境下进行。
将检测试纸条、样本稀释液、检测抗体、洗脱液、底物A、底物B、孵育槽、自封袋分别按不小于某一检测次数的用量组合、包装，形成试剂盒，将镊子、说明书一同放入试剂盒中。其中，检测试纸条使用白色聚丙烯材质的桶装；所述样本稀释液、底物A和洗脱液使用白色聚丙烯材质的瓶装；所述检测抗体和底物B使用棕色聚丙烯材质的瓶装；所述说明书为纸质；所述镊子和孵育槽为聚丙烯材质；所述自封袋为聚乙烯材质。
实施例2
1.检测试纸条的制备：
1.1配制蛋白稀释液和封闭液
蛋白稀释液：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水999mL溶解，吸取1mL proClin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。常温放置备用。
封闭液：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g，牛血清白蛋白10g，加纯水900mL溶解，加入NaOH溶液调整pH至7.4。吸取1mL proClin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。2-8℃条件下放置备用。
1.2制备检测试纸条
(1)配制质控线溶液C：将羊抗鼠IgG抗体用蛋白稀释液稀释成0.2mg/mL；
(2)配制检测线溶液T1:将重组S1蛋白用蛋白稀释液稀释成0.3mg/mL；
(3)配制检测线溶液T2:将重组RBD蛋白用蛋白稀释液稀释成0.3mg/mL；
(4)配制检测线溶液T3:将重组N蛋白用蛋白稀释液稀释成0.2mg/mL；
(5)裁膜：将硝酸纤维素膜裁切成310mm±5mm长的膜；
(6)划线：用喷金划线仪进行划线包被，如图3所示，检测线和质控线包被的线浓度均为1μL/cm；
(7)干燥:对已包被好的硝酸纤维素膜进行烘干，温度37℃±2℃，时间90min(烘干过程在湿度≤30％环境中进行)；
(8)封闭：对已干燥好的硝酸纤维素膜用封闭液进行浸泡40min；
(9)干燥:对已封闭好的硝酸纤维素膜进行再烘干，温度37℃±2℃，时间90min。(烘干过程在湿度≤30％环境中进行)；
(10)贴膜：将PVC胶板中间部分的表面贴膜撕掉，并贴上已经制备好的硝酸纤维素膜；
(11)利用裁切机将印有流水号的标签纸裁切成30cm×1.1cm；
(12)在PVC胶板短边的一端贴印有流水号的标签纸，组合好；
(13)利用斩切机将组合好的试纸板条竖切成宽度为3.6mm的试纸条。
2.样本稀释液的制备：
0.1M、pH 7.4磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水999mL溶解，吸取1mL proClin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。常温放置备用。
3.洗脱液的制备：
称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水997.5mL溶解，分别吸取1mL proClin300和1.5mL吐温-20至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。常温放置备用。
4.检测抗体的制备：
将辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人IgG抗体使用抗体稀释液进行稀释，使其终浓度为0.5μg/mL，混匀，2-8℃条件下放置备用。
5.底物的制备：
底物A的配制：称取三羟甲基氨基甲烷1.21g，加纯水900mL溶解，加HCl调整pH至pH7.5。定容至1000mL。常温放置备用。
底物B的配制：量取30％H2O2 0.1mL，称取3,3-二氨基联苯胺0.01g，定容至100mL。2-8℃条件放置备用。
底物制备：将底物A和底物B等体积混合。现配现用。
以上制备过程均在十万级环境下进行。
将检测试纸条、样本稀释液、检测抗体、洗脱液、底物A、底物B、孵育槽、自封袋分别按不小于某一检测次数的用量组合、包装，形成试剂盒，将镊子、说明书一同放入试剂盒中。其中，检测试纸条使用白色聚丙烯材质的桶装；所述样本稀释液、底物A和洗脱液使用白色聚丙烯材质的瓶装；所述检测抗体和底物B使用棕色聚丙烯材质的瓶装；所述说明书为纸质；所述镊子和孵育槽为聚丙烯材质；所述自封袋为聚乙烯材质。
实施例3
1.检测试纸条的制备：
1.1配制蛋白稀释液和封闭液
蛋白稀释液：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水999mL溶解，吸取1mL proClin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。常温放置备用。
封闭液：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g，牛血清白蛋白10g，加纯水900mL溶解，加入NaOH溶液调整pH至7.4。吸取1mL proClin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。2-8℃条件下放置备用。
1.2制备检测试纸条
(1)配制质控线溶液C：将羊抗鼠IgG抗体用蛋白稀释液稀释成1mg/mL；
(2)配制检测线溶液T1:将重组S1蛋白用蛋白稀释液稀释成0.5mg/mL；
(3)配制检测线溶液T2:将重组RBD蛋白用蛋白稀释液稀释成0.5mg/mL；
(4)配制检测线溶液T3:将重组E蛋白用蛋白稀释液稀释成0.1mg/mL；
(5)裁膜：将硝酸纤维素膜裁切成310mm±5mm长的膜；
(6)划线：用喷金划线仪进行划线包被，如图4所示，检测线和质控线包被的线浓度均为1μL/cm；
(7)干燥:对已包被好的硝酸纤维素膜进行烘干，温度37℃±2℃，时间100min(烘干过程在湿度≤30％环境中进行)；
(8)封闭：对已干燥好的硝酸纤维素膜用封闭液进行浸泡50min；
(9)干燥:对已封闭好的硝酸纤维素膜进行再烘干，温度37℃±2℃，时间100min。(烘干过程在湿度≤30％环境中进行)；
(10)贴膜：将PVC胶板中间部分的表面贴膜撕掉，并贴上已经制备好的硝酸纤维素膜；
(11)利用裁切机将印有流水号的标签纸裁切成30cm×1.1cm；
(12)在PVC胶板短边的一端贴印有流水号的标签纸，组合好；
(13)利用斩切机将组合好的试纸板条竖切成宽度为4.0mm的试纸条。
2.样本稀释液的制备：
0.1M、pH 7.4磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水999mL溶解，吸取1mL proClin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。常温放置备用。
3.洗脱液的制备：
称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水997.5mL溶解，分别吸取1mL proClin300和1.5mL吐温-20至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。常温放置备用。
4.检测抗体的制备：
将辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人IgG抗体使用抗体稀释液进行稀释，使其终浓度为0.5μg/mL，混匀，2-8℃条件下放置备用。
5.底物的制备：
底物A的配制：称取三羟甲基氨基甲烷1.21g，加纯水900mL溶解，加HCl调整pH至pH7.5。定容至1000mL。常温放置备用。
底物B的配制：量取30％H2O2 0.1mL，称取3,3-二氨基联苯胺0.01g，定容至100mL。2-8℃条件放置备用。
底物制备：将底物A和底物B等体积混合。现配现用。
以上制备过程均在十万级环境下进行。
将检测试纸条、样本稀释液、检测抗体、洗脱液、底物A、底物B、孵育槽、自封袋分别按不小于某一检测次数的用量组合、包装，形成试剂盒，将镊子、说明书一同放入试剂盒中。其中，检测试纸条使用白色聚丙烯材质的桶装；所述样本稀释液、底物A和洗脱液使用白色聚丙烯材质的瓶装；所述检测抗体和底物B使用棕色聚丙烯材质的瓶装；所述说明书为纸质；所述镊子和孵育槽为聚丙烯材质；所述自封袋为聚乙烯材质。
本发明中的一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试剂盒的生产工艺流程图如图5所示。
测试例
利用本发明提供的检测试剂盒检测新型冠状病毒2019-nCoV抗体的方法：
(1)润湿：在反应槽中放入检测试纸条，加入样本稀释液1mL，室温(15-25℃)条件下，混匀1min；
(2)一次孵育：加入样本(人血浆或血清)1mL，室温(15-25℃)条件下进行孵育40min；
(3)清洗：倒掉反应槽内液体，在反应槽中加入1mL洗脱液，室温(15-25℃)条件下进行孵育5min；重复清洗一次；
(4)二次孵育：倒掉反应槽内液体，在反应槽中加入1mL检测抗体，室温(15-25℃)条件下进行孵育40min；
(5)清洗：倒掉反应槽内液体，在反应槽中加入1mL洗脱液，室温(15-25℃)条件下进行孵育5min；
(6)清洗：倒掉反应槽内液体，重复清洗一次；
(7)显色：倒掉反应槽内液体，将反应槽进行控干，在反应槽中加入200μL底物，避光反应5min。
观察条带是否显色以及条带深浅。当两个及两个以上条带显色时，新型冠状病毒抗体检测结果为阳性，显色越深，抗体含量越高；当所有条带均不显色时，新型冠状病毒抗体检测结果为阴性。
对200例阴性血清样本(包含9例胶体金试剂盒检测出来的假阳性样本；包含5个乙肝，甲、乙流抗体阳性和2个乙肝抗原阳性样本等)和20例阳性血清样本进行检测，实施例1制得的检测试剂盒的预测灵敏度和特异性分别为100％、100％；使用全自动免疫分析仪在2h内就能得到200例样本的检测结果。操作过程方便、快捷、检测结果准确。实施例2和实施例3制得的检测试剂盒也能实现这些检测效果。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 无锡市孚维尔生物医疗科技有限公司
<120> 一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试剂盒的生产方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 681
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val
20 25 30
Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr
35 40 45
Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe
50 55 60
Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr
65 70 75 80
Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp
85 90 95
Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val
100 105 110
Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
115 120 125
Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val
130 135 140
Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe
145 150 155 160
Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu
165 170 175
Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu
195 200 205
Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln
210 215 220
Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser
225 230 235 240
Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln
245 250 255
Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp
260 265 270
Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu
275 280 285
Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg
290 295 300
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
305 310 315 320
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
325 330 335
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
340 345 350
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
355 360 365
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
370 375 380
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
385 390 395 400
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
405 410 415
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
420 425 430
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
435 440 445
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
450 455 460
Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
465 470 475 480
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
485 490 495
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
500 505 510
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe
515 520 525
Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe
530 535 540
Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala
545 550 555 560
Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser
565 570 575
Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln
580 585 590
Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala
595 600 605
Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly
610 615 620
Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His
625 630 635 640
Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys
645 650 655
Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ala His
660 665 670
His His His His His His His His His
675 680
<210> 2
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Ala
210 215 220
Asp Asp Asp Asp Lys Ala Val Pro Arg Asp Ser Gly Cys Lys Pro Cys
225 230 235 240
Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
245 250 255
Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val
260 265 270
Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe
275 280 285
Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu
290 295 300
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His
305 310 315 320
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala
325 330 335
Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg
340 345 350
Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met
355 360 365
Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro
370 375 380
Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn
385 390 395 400
Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val
405 410 415
Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr
420 425 430
Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu
435 440 445
Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 3
<211> 425
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met His His His His His His Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg
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Asn Ala Pro Arg Ile Thr Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser
20 25 30
Asn Gln Asn Gly Glu Arg Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro
100 105 110
Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro
115 120 125
Tyr Gly Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala
130 135 140
Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn
145 150 155 160
Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly
165 170 175
Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser
180 185 190
Ser Ser Arg Ser Arg Asn Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser
195 200 205
Arg Gly Thr Ser Pro Ala Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala
210 215 220
Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met
225 230 235 240
Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser
245 250 255
Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys
260 265 270
Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr
275 280 285
Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr
290 295 300
Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe
305 310 315 320
Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp
325 330 335
Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe
340 345 350
Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr
355 360 365
Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu
370 375 380
Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu
385 390 395 400
Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser
405 410 415
Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr Gln Ala
420 425
<210> 4
<211> 81
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser
1 5 10 15
Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala
20 25 30
Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn
35 40 45
Val Ser Leu Val Lys Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn
50 55 60
Leu Asn Ser Ser Arg Val Pro Asp Leu Leu Val His His His His His
65 70 75 80
His

Claims (9)

1.一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试剂盒的生产方法，其特征在于，所述生产方法是分别制备检测试纸条、样本稀释液、洗脱液、检测抗体和底物，将制备完成的检测试纸条、样本稀释液、洗脱液、检测抗体和底物通过分装、组合、包装后形成检测试剂盒；其中，所述检测试纸条的制备方法包括以下步骤：
(1)将新型冠状病毒抗原和羊抗鼠IgG分别在硝酸纤维素膜上进行划线；所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组N蛋白，或，所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组E蛋白，或，所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组N蛋白、重组E蛋白；
(2)35-39℃烘干处理1-3小时；
(3)将步骤(2)中烘干后的硝酸纤维素膜完全浸入封闭液中，15-25℃条件下，浸泡0.5-2小时；
(4)35-39℃烘干处理1-3小时；
(5)将步骤(4)中烘干后的硝酸纤维素膜固定在PVC胶板上，再在PVC胶板短边的一端贴上印有流水号的标签纸，切成3.5-4.0mm宽的试纸条，即为新型冠状病毒2019-nCOV抗体谱检测试纸条。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(4)所述烘干在湿度≤30％环境中进行。
3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述检测试纸条、样本稀释液、洗脱液、检测抗体和底物的制备过程均在10万级环境下进行。
4.根据权利要求1或3所述的生产方法，其特征在于，所述样本稀释液为pH为7-8的磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1或3所述的生产方法，其特征在于，所述洗脱液为添加了吐温-20的pH为7-8的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1或3所述的生产方法，其特征在于，所述检测抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体或IgM抗体或IgA抗体或IgE抗体。
7.根据权利要求1或3所述的生产方法，其特征在于，所述底物中含三羟甲基氨基甲烷、H2O2和3,3-二氨基联苯胺。
8.根据权利要求1或3所述的生产方法，其特征在于，所述检测试纸条的宽度为3.5-4.0mm。
9.根据权利要求1或3所述的生产方法，其特征在于，步骤(1)中，所述重组抗原S1蛋白、重组抗原RBD蛋白、重组抗原N蛋白、重组抗原E蛋白的划线浓度分别为0.2-0.5mg/mL、0.2-0.5mg/mL、0.1-0.2mg/mL、0.1-0.2mg/mL，所述羊抗鼠IgG的划线浓度为0.2-1mg/mL。
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