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CN118812716B - Ck-mb的单克隆抗体、制备方法及应用 - Google Patents

Ck-mb的单克隆抗体、制备方法及应用 Download PDF

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CN118812716B CN202411310439.4A CN202411310439A CN118812716B CN 118812716 B CN118812716 B CN 118812716B CN 202411310439 A CN202411310439 A CN 202411310439A CN 118812716 B CN118812716 B CN 118812716B
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Abstract

本发明公开了一种CK‑MB的单克隆抗体、制备方法及应用，涉及单克隆抗体技术领域，提出的单克隆抗体，与抗原结合的EC50达到ng/ml级别，KD均达到10‑11M。如前文所提到的，对于IgG抗体而言，本领域通常认为，当与抗原结合的KD值达到10‑9M时即被认为具有高亲和性，而本发明的2株单克隆抗体与抗原结合的KD值均达到了10‑11M之多，为上述定义值的100倍，从而使得本申请提出的单克隆抗体具有极强的抗原结合活性和亲和力；本发明简单有效，且易于实用。

Description

CK-MB的单克隆抗体、制备方法及应用
技术领域
本发明属于单克隆抗体技术领域，具体是CK-MB的单克隆抗体的制备方法和应用。
背景技术
公开号为CN108333357A的专利公开了一种磁珠时间分辨荧光免疫定量检测CK-MB试剂盒，包括包被CK-MB单克隆抗体的免疫磁珠、CK-MB校准品溶液、铕标记的CK-MB单克隆抗体溶液、清洗液和增强液。所述的包被CK-MB单克隆抗体的免疫磁珠为带有官能团修饰的直径1-3μm的超顺磁珠分别与CK-MB单克隆抗体共价偶联物。本发明的灵敏度高，CK-MB的灵敏度为1ng/ml，血清(浆)样本不需要稀释；检测时间短，30min出报告；样品需求量少，一次上样只需50μl；配套全自动时间分辨免疫分析仪，操作简单，无人为误差并节省人力。本试剂盒合理利用了试剂条的空间，使得试剂条结构更加紧凑，更加易于运输，方便使用，而且操作简单、稳定性好。
但是，针对CK-MB单克隆抗体，如何使其具备极强的抗原结合活性和亲和力的抗体，这是一个问题；基于此，提供一种解决方案。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一；为此，本发明提出了CK-MB的单克隆抗体；
CK-MB的单克隆抗体，包括：
轻链氨基酸序列：SEQ ID NO：7；
重链氨基酸序列：SEQ ID NO：6；
其中，轻链可变区，具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、RAS和SEQ ID NO：5所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；重链可变区，具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提出的单克隆抗体，与抗原结合的EC50达到ng/ml级别，KD均达到10-11M。如前文所提到的，对于IgG抗体而言，本领域通常认为，当与抗原结合的KD值达到10-9M时即被认为具有高亲和性，而本发明的2株单克隆抗体与抗原结合的KD值均达到了10-11M之多，为上述定义值的100倍，从而使得本申请提出的单克隆抗体具有极强的抗原结合活性和亲和力；本发明简单有效，且易于实用。
附图说明
图1A为本发明SDS-PAGE检测结果示意图；
图1B为本发明SDS-PAGE检测结果示意图；
图2A为本发明抗体与抗原的结合活性曲线示意图；
图2B为本发明抗体与抗原的结合活性曲线示意图；
图3为本发明胶体金免疫层析检测试纸条结构示意图；
图4为本发明试纸条检测结果与罗氏检测结果的符合率曲线示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1A、图1B、图2A、图2B、图3、图4；
本申请提供了CK-MB的单克隆抗体及制备方法及应用；
针对CK-MB的单克隆抗体的制备，具体方法如下：
（1）CK-MB/CKMM/CKBB蛋白的表达与纯化：
在UniProt网站上分别找到CreatinekinaseM-type（P06732）和CreatinekinaseB-type（P12277）的氨基酸序列，利用软件推导出对应的基因序列，并进行合成。将获得的DNA序列分别克隆至PCDNA3.4载体中，然后进行转化涂板，挑取克隆、提取质粒；将重组质粒转染N293细胞，转染条件为：PEI/质粒的质量比为3:1，按照2μg质粒/1mlN293细胞的比例转染；转染后5-7天，收集细胞上清；用镍柱进行纯化，获得高纯度的CKMM蛋白和CKBB蛋白，并通过透析将洗脱缓冲液置换成PBS，利用Bradford法测定抗体浓度。
CK-MB
将CK-M蛋白和CK-B蛋白的基因序列用Loop的核苷酸碱基偶联在一起，克隆到表达载体pET28a的多克隆位点BamH I/Xho I中，得到表达质pET28a-CKMB；将表达质粒pET28a-CKMB转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达；培养结束后培养液用Tris-盐酸缓冲液搅拌振荡使细菌沉淀重悬，超声波破壁，离心取上清，依次过镍柱、强阴离子交换柱Q柱和Superdex G200分子筛层析柱，得到纯化的CK-MB蛋白，CK-MB蛋白的表达参照专利CN107698683A1。
（2）动物免疫：
以表达获得的CK-MB蛋白，具体浓度0.5mg/ml作为免疫原，取200ug抗原即400ul将其与400ul的弗氏完全佐剂充分乳化后，经皮下注射以免疫兔子，兔子品种为：新西兰大白兔，雌性，6-8周龄，以两周时间间隔进行加强免疫，共免疫3次，末次加强免疫后5-8天，经兔子静脉取血，用ELISA法检测血清效价，具体实验信息如下表1所示；
表1：实验信息
ELISA法检测血清效价数据如表2所示；
表2：ELIAS法检测血清效价数据
稀释倍数/K R0007
阴性对照 0.0606
阴性对照 0.0577
1 1.7550
2 1.3826
4 1.0542
8 0.7110
16 0.4707
32 0.2925
64 0.1879
128 0.1267
256 0.0980
512 0.0795
兔子血清效价为64K，进行外周血单个核细胞（PBMC）悬液的制备。
（3）PBMC制备：
在离心管中加入淋巴细胞分离液Ficoll，取抗凝外周血（全血）与无菌PBS按照1:1-1:5充分混匀，用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，水平离心400g×30分钟，离心后去除部分上层液体，余下约1ml，用移液器插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5倍以上体积的PBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。末次离心后，弃上清，加入红细胞裂解液，室温孵育2分钟，裂解红细胞，加入10mlPBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。弃上清，加入含有10%FBS的RPMI1640，重悬细胞，计数；
（4）获取单个B细胞：
利用制备好的脾脏单细胞悬液，通过对抗原标记，使用单细胞筛选平台进行细胞筛选，以获得具有抗原特异性的B细胞。
通过上述步骤，共获得37株针对CK-MB蛋白的单克隆抗体，经鉴定，其均为IgG抗体，命名如表3。以下实施例中，检测了单克隆抗体的轻、重链基因序列，并进行了表达，表达后的细胞上清的克隆按表3的布局放置于96孔板中进行结合活性检测；
表3：37株抗体克隆号
1 2 3 4 5
A 1M7A7 1M3C3 1M3G7 1M4A1 1M4D4
B 1M7C9 1M3D3 1M3D8 1M4B1 1M4F4
C 1M7C10 1M3G3 1M3G8 1M4A2 1M4B5
D 1M3E1 1M3C4 1M3E9 1M4C2 1M4F5
E 1M3C2 1M3D4 1M3G9 1M4E2 1M4A6
F 1M3E2 1M3E5 1M3D11 1M4F2 阴性对照
G 1M3G2 1M3C6 1M3E12 1M4G2 阴性对照
H 1M3A3 1M3E7 1M3G12 1M4C4
二、针对CK-MB蛋白的单克隆抗体的特异性检测；
对实施例1中细胞克隆的上清用ELISA的方法进行抗原特异性检测：
①抗原包被：将CK-MB/CK-MM/CKBB蛋白分别稀释至2µg/ml，然后按100μl/孔的量加入空的酶标板中，将酶标板放置4℃冰箱，过夜孵育；
②封闭：用洗板机洗板5次，扣干，将封闭液加入酶标板，每孔150μl，置于37℃恒温箱中，封闭1h；用洗板机洗板5次，扣干；
③孵育一抗：将96孔板培养上清加入酶标板的孔中，每孔100μl，37℃孵育1h；用洗板机洗板5次，扣干；
④孵育二抗：将HRP标记的羊抗兔二抗按1：10000稀释，然后加入酶标板中，每孔100μl，37℃孵育30min；用洗板机洗板5次，扣干；
⑤显色：将显色液加入酶标板，每孔100μl，反应时间：37℃/15min；
⑥终止、读数：添加终止液，体积100μl/孔；检测波长设置：检测波长450nm，参比波长620nm，检测结果如表4-表6。
表4：CK-MB包板特异性检测结果
CKMB 1 2 3 4 5
A 2.6959 0.9491 1.2852 0.1698 0.1667
B 1.0982 0.8581 2.1397 2.5481 0.4724
C 0.0831 0.1373 0.2215 0.4832 0.3783
D 0.1240 1.7838 1.8155 0.0978 0.4253
E 0.3977 0.7336 1.1408 0.3477 0.0598
F 0.6091 2.0104 1.9866 1.5410 0.0559
G 0.2744 0.4594 1.6568 2.0098 0.0540
H 1.9767 0.1264 0.8094 0.2113
表5：CK-MM包板特异性检测结果
CKMM 1 2 3 4 5
A 3.2253 0.1272 0.0913 1.8276 0.1477
B 0.0690 0.0699 0.0719 2.2278 0.0938
C 0.1114 0.0576 0.0777 0.3617 0.0585
D 0.1299 0.0624 0.0705 0.0833 0.1561
E 0.0967 0.0611 0.0721 0.2407 0.0723
F 1.9607 0.2511 0.0720 0.0800 0.0516
G 0.4098 0.0661 0.0661 0.2682 0.0524
H 0.0540 0.1148 0.1134 0.1343
表6：CK-BB包板特异性检测结果
CKBB 1 2 3 4 5
A 1.5214 0.2188 0.2068 0.0885 0.0943
B 0.2765 0.1391 0.0720 2.1170 0.1600
C 0.1138 0.0723 0.1115 0.3835 0.0763
D 0.1301 0.3356 0.2892 0.0895 0.1316
E 0.1300 0.0850 0.1429 0.2383 0.0576
F 0.1077 0.3442 0.3494 0.2187 0.0527
G 0.2986 1.2453 0.2627 0.5459 0.0523
H 0.0823 0.1276 0.1639 0.1047
⑦数据分析：对比信号强弱，最终选取与CK-MB反应信号较强且与CK-MM及CK-BB不结合的2株克隆（即CK-MB mAb1克隆号为：1M3A3；CK-MB mAb2克隆号为1M3D8）进行后续的放大表达及纯化。
三、针对CK-MB蛋白的单克隆抗体的轻、重链氨基酸序列的获得
（1）cDNA制备：
将实施例2中确定的2株克隆对应的细胞分别进行RNA提取，以RNA为模板进行反转录获得cDNA；
（2）轻、重链基因的获取：
利用特异性的引物进行扩增，分别将扩增到的DNA序列克隆至PCDNA3.4载体中，然后进行转化涂板，挑取克隆、提取质粒。将质粒送样测序，获得2株单克隆抗体的基因序列，并推导这2株单克隆抗体的重、轻链氨基酸序列，CK-MB mAb1和CK-MB mAb2的重链氨基酸序列分别如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：17所示，其轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：18所示；
CK-MB mAb1：
重链全长具体为：SEQ ID NO：8；
轻链全长具体为：SEQ ID NO：9；
CK-MB mAb2：
重链全长具体为：SEQ ID NO：17；
轻链全长具体为：SEQ ID NO：18；
再根据测序结果对这2株单克隆抗体的重链可变区（FV）和轻链可变区（FV）进行分析，最终获得它们的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列，分别如下所示，其中下划线为其CDR区。
CK-MB mAb1：
重链FV具体为：SEQ ID NO：6；
轻链FV具体为：SEQ ID NO：7；
即：重链可变区，具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链可变区，具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、RAS和SEQID NO：5所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
CK-MB mAb2：
重链FV具体为：SEQ ID NO：15；
轻链FV具体为：SEQ ID NO：16；
即：重链可变区，具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链可变区，具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO：13、RAS和SEQ ID NO：14所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
四、针对CK-MB蛋白的单克隆抗体的表达和纯化
（1）培养N293悬浮细胞，当密度达到（1-3）×106个细胞/ml且成活率＞80-90％时，进行细胞转染；
（2）按照实施例3中获得的2株单克隆抗体CK-MB mAb1和CK-MB mAb2的轻、重链基因分别构建入pcDNA3.4质粒；然后，将含抗体轻、重链基因的重组质粒转染N293细胞，转染条件为：PEI/质粒的质量比为3:1，按照2μg质粒/1mlN293细胞的比例转染；
（3）转染后5-7天，收集细胞上清，用Protein A树脂进行亲和纯化，获得高纯度的单克隆抗体，并通过透析将洗脱缓冲液置换成PBS，利用Nanodrop测定抗体浓度；
接下来，通过SDS-PAGE检测抗体的纯度，具体方法如下：
SDS-PAGE检测：
取2μg待测抗体，加入适量的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，使总体积为20μl；同时制备还原性SDS-PAGE样品及非还原性SDS-PAGE样品，然后进行上样；首先，在80V下电泳30min，然后在120V下电泳直至条带分隔清晰；将电泳后的PAGE胶取下，进行考马斯亮蓝染色，15min之后将染色液去掉，用清水冲洗干净，然后加入脱色液进行脱色，直至看到清晰的条带为止。结果如图1A、图1B显示：在还原条件下，这两株单克隆抗体CK-MB mAb1和CK-MBmAb2具有两条电泳条带，并且这两条电泳条带的对应分子量与其各自的轻、重链大小一致；在非还原条件下，单克隆抗体CK-MB mAb1和CK-MB mAb2具有单一条带，并且该电泳条带的对应分子量与其各自的完整抗体的大小一致；这些结果说明，这株单克隆抗体的表达准确。
此外，所有电泳条带均边缘清晰、无杂带，说明将上述表达和纯化步骤所得的单克隆抗体的纯度较高。
五、针对CK-MB蛋白的单克隆抗体的抗原结合活性和亲和力检测
本实施例中，分别对实施例4中表达和纯化的单克隆抗体CK-MB mAb1和CK-MBmAb2进行抗原活性和亲和力检测。
①抗原包被：将抗原（即，前述CK-MB蛋白）稀释至合适的浓度，然后加入空的酶标板中，体积100μl/孔；将酶标板放置4℃冰箱，过夜孵育；
②封闭：用洗板机洗板5次，扣干，将封闭液加入酶标板，每孔150μl，置于37℃恒温箱中，封闭1h；用洗板机洗板5次，扣干；
③孵育一抗：用1×PBS将待测抗体稀释至合适的浓度梯度；将稀释后的待测抗体加入酶标板，每孔100μl，反应时间：37℃/1h；用洗板机洗板5次，扣干；
④孵育二抗：将酶标二抗按合适比例稀释，然后加入酶标板中，每孔100μl，反应时间：37℃/30min；用洗板机洗板5次，扣干；
⑤显色：将显色液加入酶标板，每孔100μl，反应时间：37℃/15min；
⑥终止、读数：添加终止液，体积100μl/孔；检测波长设置：检测波长450nm，参比波长620nm，将检测结果导出成Excel表格。
⑦数据分析：利用软件进行数据分析及作图，拟合EC50，并推导得出其KD。
检测数据如表7所示。
表7：各浓度的待测抗体的OD450值
浓度（ng/ml） CK-MBmAb1 CK-MBmAb2
4000 2.2972 2.4206
1333.333 2.2758 2.3954
444.444 2.2071 2.3105
148.148 2.0874 2.1859
49.383 1.7653 1.9835
16.461 1.3186 1.5722
5.487 0.9445 0.9223
1.829 0.6006 0.6242
0.610 0.4806 0.4318
0.203 0.3867 0.357
0.068 0.3379 0.282
0 0.0691 0.0644
根据表7，制作抗体与抗原的结合活性曲线，结果如图2A、图2B所示，利用“ELISAcalc”软件，对表7数据进行四参数曲线拟合，从而得出2株抗体的EC50值，并由其推导的KD值，数据如表8所示。
表8：一株抗体的EC50值和KD值
抗体编号 EC50（ng/ml） KD
CK-MBmAb1 13.51 9*10-11M
CK-MBmAb2 10.4 6.9*10-11M
如图2A、图2B显示：单克隆抗体CK-MB mAb与抗原结合的EC50达到ng/ml级别，KD均达到10-11M。如前文所提到的，对于IgG抗体而言，本领域通常认为，当与抗原结合的KD值达到10-9M时即被认为具有高亲和性，而本发明的2株单克隆抗体与抗原结合的KD值均达到了10-11M之多，为上述定义值的100倍，由此可以得出：本发明的单克隆抗体具有极强的抗原结合活性和亲和力。
六、基于抗CK-MB的单克隆抗体的胶体金免疫层析试纸条的制备；
本步骤中，步骤四中表达和纯化的CK-MB mAb1、CK-MB mAb2进行配对，制备一种基于双抗体夹心法原理检测CK-MB的胶体金免疫层析检测试纸条，试纸条的构造示意图如图3所示；试纸条的制备方法如下：
（1）Au-抗CK-MB单克隆抗体复合物的制备
①取3ml胶体金颗粒（胶体金粒径：20nm，最大吸收峰波长为529nm，吸光度为2.0A），加入18μl的0.1MK2CO3，混匀，加入10µg检测抗体（CK-MB mAb1），常温反应1h；
②向步骤①体系中加入100μl5%BSA封闭液，常温封闭30min；
③封闭完成后，以11000rpm在10℃下离心15min，弃上清，沉淀用50μl金标稀释液进行复溶（即浓缩60倍，60×），获得Au-抗CK-MB单克隆抗体复合物；所述金标稀释液含有pH7.5-8.5的100mMTris缓冲液、5%蔗糖、1%海藻糖、5%BSA。
（2）划金
①划封闭线：取5%BSA溶液，将仪器出水量设置为3μl/cm，将划好的底板置于37℃烘箱内干燥2小时；
②将Au-抗CK-MB单克隆抗体复合物终浓度稀释至50×，出水量设置为2μl/cm，在封闭线位置进行划线，然后将底板置于37℃烘箱内干燥2小时，然后在不高于36%的湿度下将标记垫放入预先加入干燥剂的铝箔袋中封口保存备用；
（3）包被质控线C、检测线T
①质控线C、检测线T线包被液的制备：取羊抗兔抗体，用pH7.4的10mMPBS缓冲液稀释成1.0mg/ml的抗体溶液；取捕获抗体（CK-MB mAb2），用pH7.4的10mMPBS缓冲液稀释成1.0mg/ml的抗体溶液；
②包被：将质控线C、检测线T线包被液分别包被至硝酸纤维素膜的质控线和检测线位置，C、T线间隔8mm，包被量均为为1μl/cm；将包被后的PVC底板置于37℃烘箱中，烘16小时，然后在不高于36%的湿度下将PVC底板放入预先加入干燥剂的铝箔袋中封口保存备用；
（4）样品垫的预处理
清洗烘网，将样品垫用样品垫预处理液浸泡润湿后，旋转沥干至没有水滴滴下即可，然后置于37℃烘箱内干燥4小时，然后在不高于36%的湿度下将其放入预先加入干燥剂的铝箔袋中封口保存备用；
所述样品垫预处理液含有pH8.5的10mMTris缓冲液、0.1%PVP10、0.1%PEG20000、0.1%Tween20和0.5%酪蛋白钠；
（5）膜材的组装与切割
在不高于36%的湿度下，取出吸水垫、已处理的样品垫，按照10mm×300mm尺寸进行切割，取出包被的PVC底板，按以下流程进行组装：先在PVC底板上贴上样品垫，使样品垫部分压着硝酸纤维素膜2mm，最后贴上吸水垫，吸水垫压着硝酸纤维素膜2mm；将组装好的PVC底板切割成4mm，即为用于检测CK-MB的胶体金免疫层析试纸条。
七：基于抗CK-MB的单克隆抗体的胶体金免疫层析试纸条的性能检测
本步骤中，对步骤六所制备的胶体金免疫层析试纸条进行了临床血清样本中的CK-MB检测以及CK-MM、CK-BB等干扰物的检测，该临床样本为罗氏检测试剂赋值样本。
（1）测试临床血清样本
具体地，对于步骤六所制备的胶体金免疫层析试纸条，直接吸取75μl临床血清样本，进行加样，15分钟后用胶体金免疫分析仪进行检测，读取检测信号值，并处理数据，将试纸条所检测的信号值与罗氏试剂赋值的浓度相比较，制作临床相关性曲线。
具体结果如下：
表9是胶体金免疫层析试纸条的检测结果，表中第一栏代表临床样本用罗氏试剂检测的浓度（单位ng/ml），第二栏代表本发明的胶体金免疫层析试纸条检测对应临床样本的信号值；
表9
浓度(ng/ml) T/C
0.8 0.48
1.2 0.67
2.8 0.87
4.6 1.07
6.2 1.58
9.5 2.01
12.7 2.14
18.3 2.54
22.3 3.11
27.6 3.31
36.5 4.37
40.7 4.26
44.8 4.71
52.6 5.13
59.3 5.61
66.3 5.21
67.2 5.96
81.6 6.82
84.6 6.57
89.6 7.29
92.1 8.61
97.8 8.04
111.5 9.36
127.6 9.31
135.8 9.98
175.4 13.28
180.3 13.64
192.5 15.27
根据表9检测结果，制作胶体金免疫层析试纸条检测血清样本中CK-MB的临床相关性，即胶体金免疫层析试纸条检测结果与罗氏检测结果的符合率曲线，结果如图4所示；结果显示：本发明的胶体金免疫层析试纸条对于检测血清样本中CK-MB的临床相关性R2均＞0.98。
上述结果显示，基于本发明抗体所制备的CK-MB胶体金免疫层析试纸条与罗氏检测结果具有很高的符合率，R2在0.98以上，因此具有很好的临床相关性。
（2）测试CK-MM、CK-BB干扰物；
具体地，用PBS缓冲液稀释CK-MB抗原至200、50、20、5、1、0ng/ml6个浓度梯度，加样75μl至胶体金免疫层析试纸条上，15分钟后用胶体金免疫分析仪进行检测，读取检测值，并处理数据，获得CK-MB检测的标准曲线；然后用PBS缓冲液分别稀释CK-MM和CK-BB抗原至10000、5000ng/ml两个浓度，加样75μl至胶体金免疫层析试纸条上，15分钟后用胶体金免疫分析仪进行检测，读取检测值，将检测的T/C值带入曲线回算CK-MB的浓度值，进而求得相应的交叉反应率，结果如表10所示。结果显示：基于本发明开发的CK-MB单克隆抗体制备的胶体金免疫层析试纸条对于CK-MM和CK-BB的交叉反应性均＜0.01%左右，显示无交叉反应。
表10
以上实施例仅用以说明本发明的技术方法而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方法进行修改或等同替换，而不脱离本发明技术方法的精神和范围。

Claims (4)

1.CK-MB的单克隆抗体，其特征在于，包括：
轻链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO：7；
重链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO：6；
其中，轻链可变区，具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、RAS和SEQ ID NO：5所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；重链可变区，具有氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
2.抗CK-MB的单克隆抗体的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，包括如权利要求1所述的CK-MB的单克隆抗体。
3.一种如权利要求2所述的抗CK-MB的单克隆抗体的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，该方法具体包括下述步骤：
(1)Au-抗CK-MB单克隆抗体复合物的制备；
①取3ml胶体金颗粒，加入18μl的0.1M K2CO3，混匀，加入10μg如权利要求1所述的CK-MB的单克隆抗体，常温反应1h；
②向步骤①体系中加入100μl5％BSA封闭液，常温封闭30min；
③封闭完成后，以11000rpm在10℃下离心15min，弃上清，沉淀用50μl金标稀释液进行复溶即浓缩60倍，获得Au-抗CK-MB单克隆抗体复合物；所述金标稀释液含有pH7.5-8.5的100mM Tris缓冲液、5％蔗糖、1％海藻糖、5％BSA；
(2)划金；
①划封闭线：取5％BSA溶液，将仪器出水量设置为3μl/cm，将划好的底板置于37℃烘箱内干燥2小时；
②将Au-抗CK-MB单克隆抗体复合物终浓度稀释至50×，出水量设置为2μl/cm，在封闭线位置进行划线，然后将底板置于37℃烘箱内干燥2小时，然后在不高于36％的湿度下将标记垫放入预先加入干燥剂的铝箔袋中封口保存备用；
(3)包被质控线C、检测线T；
①质控线C、检测线T线包被液的制备：取羊抗兔抗体，用pH7.4的10mM PBS缓冲液稀释成1.0mg/ml的抗体溶液；取CK-MB的单克隆抗体，用pH7.4的10mM PBS缓冲液稀释成1.0mg/ml的抗体溶液；
②包被：将质控线C、检测线T线包被液分别包被至硝酸纤维素膜的质控线和检测线位置，C、T线间隔8mm，包被量均为为1μl/cm；将包被后的PVC底板置于37℃烘箱中，烘16小时，然后在不高于36％的湿度下将PVC底板放入预先加入干燥剂的铝箔袋中封口保存备用；
(4)样品垫的预处理；
清洗烘网，将样品垫用样品垫预处理液浸泡润湿后，旋转沥干至没有水滴滴下即可，然后置于37℃烘箱内干燥4小时，然后在不高于36％的湿度下将其放入预先加入干燥剂的铝箔袋中封口保存备用；
所述样品垫预处理液含有pH8.5的10mM Tris缓冲液、0.1％PVP10、0.1％PEG20000、0.1％Tween20和0.5％酪蛋白钠；
(5)膜材的组装与切割；
在不高于36％的湿度下，取出吸水垫、已处理的样品垫，按照10mm×300mm尺寸进行切割，取出包被的PVC底板，按以下流程进行组装：先在PVC底板上贴上样品垫，使样品垫部分压着硝酸纤维素膜2mm，最后贴上吸水垫，吸水垫压着硝酸纤维素膜2mm；将组装好的PVC底板切割成4mm，即为用于检测CK-MB的胶体金免疫层析试纸条。
4.根据权利要求3所述的抗CK-MB的单克隆抗体的胶体金免疫层析试纸
条的制备方法，其特征在于，胶体金粒径：20nm，最大吸收峰波长为529nm，
吸光度为2.0。
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