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CN111624348A - 一种多蛋白联检组合检测新型冠状病毒2019-nCoV的方法 - Google Patents

一种多蛋白联检组合检测新型冠状病毒2019-nCoV的方法 Download PDF

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CN111624348A
CN111624348A CN202010442399.4A CN202010442399A CN111624348A CN 111624348 A CN111624348 A CN 111624348A CN 202010442399 A CN202010442399 A CN 202010442399A CN 111624348 A CN111624348 A CN 111624348A
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CN
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protein
recombinant
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ser
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吴玉章
吴长龙
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Wuxi Fuwei Biomedical Technology Co ltd
Original Assignee
Wuxi Fuwei Biomedical Technology Co ltd
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Abstract

本发明涉及一种多蛋白联检组合检测新型冠状病毒2019‑nCoV的方法，属于新型冠状病毒2019‑nCoV检测技术领域。本发明提供了一种多蛋白联检组合检测新型冠状病毒2019‑nCoV的方法，是将高纯度的、特异性的新型冠状病毒抗原直接在硝酸纤维素膜上进行划线，制备用于检测新型冠状病毒2019‑nCoV抗体的检测试纸条，能利用多种抗原同时对样本中IgG、IgM和/或IgA抗体进行检测。本发明通过3种或4种特异性抗原联检，同时对抗原的蛋白序列也进行了优化设计，有效增加了灵敏度和特异性，有效避免了假阴性和假阳性的问题。

Description

一种多蛋白联检组合检测新型冠状病毒2019-nCoV的方法
技术领域
本发明涉及一种多蛋白联检组合检测新型冠状病毒2019-nCoV的方法，属于新型冠状病 毒2019-nCoV检测技术领域。
背景技术
冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重 急性呼吸综合征(SARS)等较严重的疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病 毒新毒株，世界卫生组织将这种冠状病毒引起的疾病命名为2019年冠状病毒病(COVID-19)， 致死性病毒严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)。
冠状病毒基因组依次编码棘突蛋白(spike protein)、包膜蛋白(Envelopeprotein，E蛋 白)、膜蛋白(Membrane protein)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N蛋白)。棘突蛋白(spike protein)是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，含有两个亚基(subunit)，S1和S2。其中S1主 要包含有受体结合区(receptorbinding domain，RBD蛋白)，负责识别细胞的受体。S2含有 膜融合过程所需的基元件。棘突蛋白承担病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合功能，是宿主 中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。SARS-CoV-2(2019-nCoV)的棘突蛋白 与人ACE2互作来感染人的呼吸道上皮细胞。核衣壳蛋白是冠状病毒中含量最丰富的蛋白。 在病毒体组装过程中，N蛋白与病毒RNA结合并导致螺旋核衣壳的形成。核衣壳蛋白是一种 高度免疫原性的磷蛋白，与病毒基因组复制和调节细胞信号通路有关。
目前，血清抗体检测主要是免疫层析法，该方法操作简单，对设备要求低，甚至无需检 测设备；检测时间短；对于检测环境要求不高，一般15分钟左右即可出结果。该方法的缺点 是侧向层析方法使用1种、最多2种蛋白进行检测，没有清洗过程，由于个别患者血液中含 有类风湿因子、异嗜性抗体、自身抗体，以及药物和肿瘤细胞等，易造成试验的交叉反应， 出现假阳性的结果。
因此，急需一种对检测环境要求不高、适合大规模的人群筛查、能基本避免假阴性和假 阳性问题、灵敏度和特异性高、可以用于病程监控和疫苗效果评价的新型冠状病毒检测方法。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种多蛋白联检组合检测新型冠状病毒 2019-nCoV的方法。本发明通过3种或4种特异性抗原联检，同时对抗原的蛋白序列也进行 了优化设计，多种蛋白相互验证、使用免疫印迹法改变抗体结合方式(增加清洗、改变抗体 标记物)有效增加了灵敏度和特异性，能同时检测病毒中多种特异性抗原，有效避免了假阴 性和假阳性的问题。
本发明的技术方案如下：
一种多蛋白联检组合检测新型冠状病毒2019-nCoV的方法，所述方法是利用检测试纸条 对人血浆或血清样本进行检测，检测时，将检测试纸条浸入人血浆或血清样本中进行一次孵 育；清洗；再加入检测抗体进行二次孵育；再清洗；进行显色反应；所述检测试纸条联合使 用3种或4种新型冠状病毒抗原对样本中的IgG、IgM和/或IgA抗体进行定性检测；所述检 测试纸条是以硝酸纤维素膜为固相载体，在硝酸纤维素膜上划3条或4条检测线(T线)和1 条质控线(C线)制得的；所述检测线上固定有新型冠状病毒抗原；所述新型冠状病毒抗原 为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组N蛋白，或，所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、 重组RBD蛋白、重组E蛋白，或，所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、 重组N蛋白、重组E蛋白；所述检测抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体或IgM抗 体或IgA抗体或IgE抗体。
进一步地，所述重组S1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述重组RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述重组N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述重组E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步地，所述质控线上固定有羊抗鼠IgG。
进一步地，所述方法具体包括以下步骤：
(1)润湿：在反应槽中放入检测试纸条，加入样本稀释液，15-25℃条件下，混匀1-2min； 所述样本稀释液为pH为7-8的磷酸盐缓冲液；
(2)一次孵育：加入人血清或血浆样本，15-25℃条件下进行孵育30-60min；
(3)清洗：倒掉反应槽内液体，在反应槽中加入洗脱液，15-25℃条件下进行孵育4-6min； 重复清洗一次；
(4)二次孵育：倒掉反应槽内液体，在反应槽中加入检测抗体，15-25℃条件下进行孵 育30-60min；所述检测抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体或IgM抗体或IgA抗体或IgE抗体；
(5)清洗：倒掉反应槽内液体，在反应槽中加入洗脱液，15-25℃条件下进行孵育4-6min；
(6)清洗：倒掉反应槽内液体，重复清洗一次；
(7)显色：倒掉反应槽内液体，将反应槽进行控干，在反应槽中加入底物，避光反应2-10min；若有两条以上的条带显色，则新型冠状病毒抗体检测结果为阳性；若无条带显色，则新型冠状病毒抗体检测结果为阴性。
进一步地，所述重组抗原S1蛋白、重组抗原RBD蛋白、重组抗原N蛋白、重组抗原E蛋白的划线浓度分别为0.2-0.5mg/mL(1μL/cm)、0.2-0.5mg/mL(1μL/cm)、0.1-0.2mg/mL (1μL/cm)、0.1-0.2mg/mL(1μL/cm)。
进一步地，所述羊抗鼠IgG的划线浓度为0.2-1mg/mL(1μL/cm)。
本发明有益的技术效果在于：
本发明通过3种或4种特异性抗原联检，同时对抗原的蛋白序列也进行了优化设计，有 效增加了灵敏度和特异性，能同时检测病毒中多种特异性抗原，有效避免了假阴性和假阳性 的问题。
附图说明
图1为本发明中利用多蛋白联检制备的检测试纸条的侧面示意图，其中，T1、T2、T3、 T4分别表示不同的检测线，不同的检测线上划有不同的新型冠状病毒抗原条带。
图2为本发明实施例1中多蛋白联检制备的检测试纸条的示意图。
图3为本发明实施例2中多蛋白联检制备的检测试纸条的示意图。
图4为本发明实施例3中多蛋白联检制备的检测试纸条的示意图。
具体实施方式
样本稀释液的配制：0.1M、pH7.4磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g， 氯化钠9g；加纯水999mL溶解，吸取1mL proClin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。 常温放置备用。
洗脱液的配制：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水997.5mL 溶解，分别吸取1mL proClin300和1.5mL吐温-20至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。常 温放置备用。
底物A的配制：称取三羟甲基氨基甲烷1.21g，加纯水900mL溶解，加HCl调整pH至pH7.5。定容至1000mL。常温放置备用。
底物B的配制：量取30％H2O20.1mL，称取3,3-二氨基联苯胺0.01g，定容至100mL。2-8℃ 条件放置备用。
底物制备：将底物A和底物B等体积混合。现配现用。
抗体稀释液制备：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；称取牛血清白 蛋白20g，加纯水900mL溶解，加NaOH溶液调整pH至pH7.5。吸取1mL proClin300至溶 液中，搅拌混匀，定容至1000mL。2-8℃条件下放置备用。
检测抗体制备方法：
将辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人IgG抗体使用抗体稀释液进行稀释，使其终浓 度为0.5μg/mL，混匀，2-8℃条件下放置备用。
重组S1蛋白制备：通过合成编码新型冠状病毒2019-nCOVSpike蛋白的全长基因，并利 用PCR的方法将合成的基因构建到小鼠IgG FC的表达载体pCMV6-c.mFC上，得到重组质 粒；将重组质粒转染Hek293细胞分泌表达融合蛋白，并通过ProteinA进行亲和纯化而获取。 理论Mw:76.5kD。
重组RBD蛋白制备：通过合成编码新型冠状病毒2019-nCOV Spike蛋白的第319位Arg 到541位Phe的基因，并利用PCR的方法将合成的基因构建到小鼠IgG FC的表达载体pCMV6-c.mFC上，得到重组质粒；将重组质粒转染Hek293细胞分泌表达融合蛋白，并通过ProteinA进行亲和纯化而获取。理论Mw:52kD。
重组N蛋白制备：通过合成编码新型冠状病毒2019-nCOV核衣壳蛋白完整的基因，并 利用PCR的方法将合成的基因构建到pET28A-N-His的表达载体上得到重组质粒；将重组质 粒转大肠杆菌，表达重组蛋白，并通过镍柱进行亲和纯化而获取。理论Mw:46.5kD。
重组E蛋白制备：通过合成编码新型冠状病毒2019-nCOV包膜蛋白完整的基因，并利 用PCR的方法将合成的基因构建到HIS-C-pET28A-N-GST的表达载体上。测序正确的质粒制备后转大肠杆菌，表达重组蛋白，并通过镍柱进行亲和纯化而获取。理论Mw:36.8kD。
检测试纸条上蛋白划线浓度选择：显色深度以“+”表示；“+++”代表最强。
检测方法：蛋白划线制成检测试纸条后，加入胶体金平台假阳样本和阳性样本、检测抗 体和底物，观察条带显色强度。如表1-5所示。
表1不同羊抗鼠IgG抗体划线浓度对颜色的影响；单位：mg/mL(1μL/cm)
阳性样本 假阳样本1# 假阳样本2# 假阳样本3#
1mg/mL +++ +++ +++ +++
0.5mg/mL +++ +++ +++ +++
0.2mg/mL ++ ++ ++ ++
0.1mg/mL + + + +
表2不同重组S1蛋白划线浓度对颜色的影响；单位：mg/mL(1μL/cm)
Figure BDA0002504643730000041
Figure BDA0002504643730000051
表3不同重组RBD蛋白划线浓度对颜色的影响；单位：mg/mL(1μL/cm)
阳性样本 假阳样本1# 假阳样本2# 假阳样本3#
1mg/mL +++ - - +
0.5mg/mL +++ - - -
0.2mg/mL ++ - - -
0.1mg/mL - - - -
表4不同重组N蛋白划线浓度对颜色的影响；单位：mg/mL(1μL/cm)
阳性样本 假阳样本1# 假阳样本2# 假阳样本3#
1mg/mL +++ - - +
0.5mg/mL +++ - - +
0.2mg/mL +++ - - -
0.1mg/mL ++ - - -
表5不同重组E蛋白划线浓度对颜色的影响；单位：mg/mL(1μL/cm)
阳性样本 假阳样本1# 假阳样本2# 假阳样本3#
1mg/mL +++ + - -
0.5mg/mL +++ - - -
0.2mg/mL +++ - - -
0.1mg/mL ++ - - -
确定划线浓度如下：
0.2-1mg/mL(1μL/cm)的羊抗鼠IgG抗体；
0.2-0.5mg/mL(1μL/cm)的重组S1蛋白；
0.2-0.5mg/mL(1μL/cm)的重组RBD蛋白；
0.1-0.2mg/mL(1μL/cm)的重组N蛋白；
0.1-0.2mg/mL(1μL/cm)的重组E蛋白。
检测时间和温度的选择：
室温下，样本孵育时间设置为30min、40min、1h；检测抗体孵育时间设置为30min、40min、1h；
根据不同孵育时间，检测试纸条对阳性样本的检测显色强度，确定检测孵育的适宜时间 为：样本：40min、检测抗体：40min。
温度设置为4℃、22℃、37℃，孵育时间设置为样本：40min、检测抗体：40min；
根据不同温度下，检测试纸条对阳性样本的检测显色强度，确定检测孵育的适宜温度为： 室温(15-25℃)。
下面结合实施例，对本发明进行具体描述。
下述实施例中使用的检测试纸条宽度为3.5-4.0mm，PVC胶板长度为5-6cm，印有流水 号的标签纸长度为1.1-1.2cm，硝酸纤维素膜长度为4-5cm，交互重叠部分为0.1-0.2cm，重 叠部分印有流水号的标签纸在上，硝酸纤维素膜在下，质控线与相邻的检测线间隔0.9-1.1cm， 各检测线间隔0.4-0.6cm。
实施例1
检测试纸条的制备：
1、试剂制备：
1.1蛋白稀释液：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水999mL溶解，吸取1mL proClin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。常温放置备用。
1.2封闭液的配制：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g，牛血清白蛋白 10g，加纯水900mL溶解，加入NaOH溶液调整pH至7.4。吸取1mL proClin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。2-8℃条件下放置备用。
2、制备步骤：
2.1硝酸纤维素膜裁成长宽为31cm×5cm大小，将4种高纯度的特异性的重组S1蛋白、 重组RBD蛋白、重组N蛋白、重组E蛋白分别在硝酸纤维素膜上进行划线，得到4条检测线(划线浓度分别为0.2mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.1mg/mL，划线量均为1μL/cm)， 如图1和图2所示(各检测线在硝酸纤维素膜上的分布次序对检测结果不产生显著影响)；
2.2将羊抗鼠IgG在硝酸纤维素膜上进行划线(质控线，C线；划线浓度为0.5mg/mL，划线量为1μL/cm)；
2.3 37℃进行烘干2小时；
2.4将烘干后的硝酸纤维素膜完全浸入封闭液中，室温(15-25℃)条件下，完全浸泡1 小时；
2.5 37℃进行烘干2小时；
2.6将第二次烘干后的硝酸纤维素膜和印有流水号的合成纸依次粘贴在PVC胶板上，切 成3.5-4.0mm宽度，即为新型冠状病毒2019-nCOV抗体谱检测试纸条。
利用上述新型冠状病毒2019-nCOV抗体谱检测试纸条检测新型冠状病毒2019-nCoV抗 体的方法：
(1)润湿：在反应槽中放入检测试纸条，加入样本稀释液1mL，室温(15-25℃)条件下，混匀1min；
(2)一次孵育：加入样本(人血浆或血清)1mL，室温(15-25℃)条件下进行孵育40min；
(3)清洗：倒掉反应槽内液体，在反应槽中加入1mL洗脱液，室温(15-25℃)条件下进行孵育5min；重复清洗一次；
(4)二次孵育：倒掉反应槽内液体，在反应槽中加入1mL检测抗体，室温(15-25℃)条件下进行孵育40min；
(5)清洗：倒掉反应槽内液体，在反应槽中加入1mL洗脱液，室温(15-25℃)条件下进行孵育5min；
(6)清洗：倒掉反应槽内液体，重复清洗一次；
(7)显色：倒掉反应槽内液体，将反应槽进行控干，在反应槽中加入200μL底物，避光 反映5min。
观察条带是否显色以及条带深浅。当两个及两个以上条带显色时，新型冠状病毒抗体检 测结果为阳性，显色越深，抗体含量越高；当所有条带均不显色时，新型冠状病毒抗体检测 结果为阴性。
实施例2
检测试纸条的制备：
1、试剂制备：
1.1蛋白稀释液：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水999mL溶解，吸取1mL proClin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。常温放置备用。
1.2封闭液的配制：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；称取牛血清白 蛋白10g，加纯水900mL溶解，加入NaOH溶液调整pH至7.4。吸取1mL proClin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。2-8℃条件下放置备用。
2、制备步骤：
2.1硝酸纤维素膜裁成长宽为31cm×5cm大小，将3种高纯度的特异性的重组S1蛋白、 重组RBD蛋白、重组N蛋白分别在硝酸纤维素膜上进行划线，得到3条检测线(划线浓度分别为0.3mg/mL、0.3mg/mL、0.2mg/mL，划线量均为1μL/cm)，如图3所示(各检测线在 硝酸纤维素膜上的分布次序对检测结果不产生显著影响)；
2.2将羊抗鼠IgG在硝酸纤维素膜上进行划线(质控线，C线；划线浓度为0.2mg/mL，划线量为1μL/cm)；
2.3 37℃进行烘干2小时；
2.4将烘干后的硝酸纤维素膜完全浸入封闭液中，室温(15-25℃)条件下，完全浸泡1 小时；
2.5 37℃进行烘干2小时；
2.6将第二次烘干后的硝酸纤维素膜和印有流水号的合成纸依次粘贴在PVC胶板上，切 成3.5-4.0mm宽度，即为新型冠状病毒2019-nCOV抗体谱检测试纸条。
利用上述新型冠状病毒2019-nCOV抗体谱检测试纸条检测新型冠状病毒2019-nCoV抗 体的方法：
(1)润湿：在反应槽中放入检测试纸条，加入样本稀释液1mL，室温(15-25℃)条件下，混匀90s；
(2)一次孵育：加入样本1mL，室温(15-25℃)条件下进行孵育50min；
(3)清洗：倒掉反应槽内液体，在反应槽中加入1mL洗脱液，室温(15-25℃)条件下进行孵育4min；重复清洗一次；
(4)二次孵育：倒掉反应槽内液体，在反应槽中加入1mL检测抗体，室温(15-25℃)条件下进行孵育50min；
(5)清洗：倒掉反应槽内液体，在反应槽中加入1mL洗脱液，室温(15-25℃)条件下进行孵育4min；
(6)清洗：倒掉反应槽内液体，重复清洗一次；
(7)显色：倒掉反应槽内液体，将反应槽进行控干，在反应槽中加入200μL底物，避光反应4min。
观察条带是否显色以及条带深浅。当两个及两个以上条带显色时，新型冠状病毒抗体检 测结果为阳性，显色越深，抗体含量越高；当所有条带均不显色时，新型冠状病毒抗体检测 结果为阴性。
实施例3
检测试纸条的制备：
1、试剂制备：
1.1蛋白稀释液：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水999mL溶解，吸取1mL proClin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。常温放置备用。
1.2封闭液的配制：称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；称取牛血清白 蛋白10g，加纯水900mL溶解，加入NaOH溶液调整pH至7.4。吸取1mL proClin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。2-8℃条件下放置备用。
2、制备步骤：
2.1硝酸纤维素膜裁成长宽为31cm×5cm大小，将3种高纯度的特异性的重组S1蛋白、 重组RBD蛋白、重组E蛋白分别在硝酸纤维素膜上进行划线，得到3条检测线(划线浓度分别为0.5mg/mL、0.5mg/mL、0.5mg/mL，划线量均为1μL/cm)，如图4所示(各检测线 在硝酸纤维素膜上的分布次序对检测结果不产生显著影响)；
2.2将羊抗鼠IgG在硝酸纤维素膜上进行划线(质控线，C线；划线浓度为1mg/mL，划线量为1μL/cm)；
2.3 37℃进行烘干2小时；
2.4将烘干后的硝酸纤维素膜完全浸入封闭液中，室温(15-25℃)条件下，完全浸泡1 小时；
2.5 37℃进行烘干2小时；
2.6将第二次烘干后的硝酸纤维素膜和印有流水号的合成纸依次粘贴在PVC胶板上，切 成3.5-4.0mm宽度，即为新型冠状病毒2019-nCOV抗体谱检测试纸条。
利用上述新型冠状病毒2019-nCOV抗体谱检测试纸条检测新型冠状病毒2019-nCoV抗 体的方法：
(1)润湿：在反应槽中放入检测试纸条，加入样本稀释液1mL，室温(15-25℃)条件下，混匀2min；
(2)一次孵育：加入人血清或血浆样本1mL，室温(15-25℃)条件下进行孵育60min；
(3)清洗：倒掉反应槽内液体，在反应槽中加入1mL洗脱液，室温(15-25℃)条件下进行孵育6min；重复清洗一次；
(4)二次孵育：倒掉反应槽内液体，在反应槽中加入1mL检测抗体，室温(15-25℃)条件下进行孵育60min；
(5)清洗：倒掉反应槽内液体，在反应槽中加入1mL洗脱液，室温(15-25℃)条件下进行孵育6min；
(6)清洗：倒掉反应槽内液体，重复清洗一次；
(7)显色：倒掉反应槽内液体，将反应槽进行控干，在反应槽中加入200μL底物，避光反应6min。
观察条带是否显色以及条带深浅。当两个及两个以上条带显色时，新型冠状病毒抗体检 测结果为阳性，显色越深，抗体含量越高；当所有条带均不显色时，新型冠状病毒抗体检测 结果为阴性。
测试例
对200例阴性血清样本(包含9例胶体金试剂盒检测出来的假阳性样本；包含5个乙肝， 甲、乙流抗体阳性和2个乙肝抗原阳性样本等)和20例阳性血清样本进行检测，实施例1制 得的检测试纸条的预测灵敏度和特异性分别为100％、100％；使用全自动免疫分析仪在2h 内就能得到200例样本的检测结果。操作过程方便、快捷、检测结果准确。实施例2和实施例3制得的检测试纸条也能实现这些检测效果。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 无锡市孚维尔生物医疗科技有限公司
<120> 一种多蛋白联检组合检测新型冠状病毒2019-nCoV的方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 681
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val
20 25 30
Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr
35 40 45
Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe
50 55 60
Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr
65 70 75 80
Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp
85 90 95
Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val
100 105 110
Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
115 120 125
Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val
130 135 140
Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe
145 150 155 160
Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu
165 170 175
Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu
195 200 205
Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln
210 215 220
Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser
225 230 235 240
Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln
245 250 255
Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp
260 265 270
Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu
275 280 285
Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg
290 295 300
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
305 310 315 320
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325 330 335
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
340 345 350
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
355 360 365
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
370 375 380
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
385 390 395 400
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
405 410 415
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
420 425 430
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
435 440 445
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
450 455 460
Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
465 470 475 480
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
485 490 495
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
500 505 510
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe
515 520 525
Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe
530 535 540
Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala
545 550 555 560
Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser
565 570 575
Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln
580 585 590
Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala
595 600 605
Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly
610 615 620
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625 630 635 640
Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys
645 650 655
Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ala His
660 665 670
His His His His His His His His His
675 680
<210> 2
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
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1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Ala
210 215 220
Asp Asp Asp Asp Lys Ala Val Pro Arg Asp Ser Gly Cys Lys Pro Cys
225 230 235 240
Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
245 250 255
Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val
260 265 270
Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe
275 280 285
Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu
290 295 300
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His
305 310 315 320
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala
325 330 335
Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg
340 345 350
Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met
355 360 365
Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro
370 375 380
Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn
385 390 395 400
Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val
405 410 415
Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr
420 425 430
Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu
435 440 445
Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 3
<211> 425
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met His His His His His His Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg
1 5 10 15
Asn Ala Pro Arg Ile Thr Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser
20 25 30
Asn Gln Asn Gly Glu Arg Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro
35 40 45
Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln
50 55 60
His Gly Lys Glu Asp Leu Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile
65 70 75 80
Asn Thr Asn Ser Ser Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala
85 90 95
Thr Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro
100 105 110
Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro
115 120 125
Tyr Gly Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala
130 135 140
Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn
145 150 155 160
Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly
165 170 175
Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser
180 185 190
Ser Ser Arg Ser Arg Asn Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser
195 200 205
Arg Gly Thr Ser Pro Ala Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala
210 215 220
Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met
225 230 235 240
Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser
245 250 255
Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys
260 265 270
Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr
275 280 285
Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr
290 295 300
Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe
305 310 315 320
Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp
325 330 335
Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe
340 345 350
Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr
355 360 365
Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu
370 375 380
Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu
385 390 395 400
Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser
405 410 415
Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr Gln Ala
420 425
<210> 4
<211> 81
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser
1 5 10 15
Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala
20 25 30
Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn
35 40 45
Val Ser Leu Val Lys Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn
50 55 60
Leu Asn Ser Ser Arg Val Pro Asp Leu Leu Val His His His His His
65 70 75 80
His

Claims (7)

1.一种多蛋白联检组合检测新型冠状病毒2019-nCoV的方法，其特征在于，所述方法是利用检测试纸条对人血浆或血清样本进行检测，检测时，将检测试纸条浸入人血浆或血清样本中进行一次孵育；清洗；再加入检测抗体进行二次孵育；再清洗；进行显色反应；所述检测试纸条联合使用3种或4种新型冠状病毒抗原对样本中的IgG、IgM和/或IgA抗体进行定性检测；所述检测试纸条是以硝酸纤维素膜为固相载体，在硝酸纤维素膜上划3条或4条检测线和1条质控线制得的；所述检测线上固定有新型冠状病毒抗原；所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组N蛋白，或，所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组E蛋白，或，所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组N蛋白、重组E蛋白；所述检测抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体或IgM抗体或IgA抗体或IgE抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组S1蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组N蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组E蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质控线上固定有羊抗鼠IgG。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
(1)润湿：在反应槽中放入检测试纸条，加入样本稀释液，15-25℃条件下，混匀1-2min；所述样本稀释液为pH为7-8的磷酸盐缓冲液；
(2)一次孵育：加入人血清或血浆样本，15-25℃条件下进行孵育30-60min；
(3)清洗：倒掉反应槽内液体，在反应槽中加入洗脱液，15-25℃条件下进行孵育4-6min；重复清洗一次；
(4)二次孵育：倒掉反应槽内液体，在反应槽中加入检测抗体，15-25℃条件下进行孵育30-60min；所述检测抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体或IgM抗体或IgA抗体或IgE抗体；
(5)清洗：倒掉反应槽内液体，在反应槽中加入洗脱液，15-25℃条件下进行孵育4-6min；
(6)清洗：倒掉反应槽内液体，重复清洗一次；
(7)显色：倒掉反应槽内液体，将反应槽进行控干，在反应槽中加入底物，避光反应2-10min；若有两条以上的条带显色，则新型冠状病毒抗体检测结果为阳性；若无条带显色，则新型冠状病毒抗体检测结果为阴性。
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