CN111254117B - 一种突变型egfr高表达的重组mhcc97-l肝癌细胞及构建 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于外源重组质粒pCDH‑puro‑EGFR(I645L)构建的稳定高表达突变型EGFR的重组MHCC97‑L肝癌细胞。具体经过EGFR‑I645L基因全长的获得，pCDH‑puro‑EGFR(I645L)质粒构建、包装病毒，然后对病毒感染后的细胞进行嘌呤霉素筛选，传代，建立稳定表达MHCC97‑L细胞。此细胞的建立可以为以肝癌肿瘤的EGFR通路相关药物筛选及耐药研究提供细胞模型，提高筛选的特异性及灵敏性；也可应用于EGFR影响的相关通路蛋白的差异性比较研究。

Description

一种突变型EGFR高表达的重组MHCC97-L肝癌细胞及构建

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种突变型EGFR表达质粒的构建以及突变型EGFR高表达的肝癌细胞的构建。

技术背景

肝癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一,具有恶性程度高、浸润和转移性强、先天性耐药等特点,位居癌症发病之第6位，死亡率之第3位。目前全球估计的每年新病例发生数约74.83万人，我国是全球肝癌发病率最高和病死数最多的国家，肝癌患者占全球的55％。最近有研究表明，在原发性肝癌患者的肝癌组织和癌旁肝组织常有EGFR的高表达，而EGFR及其下游信号转导通路关键蛋白，如MAPK/ERK、AKT的激活与肝癌的生物学行为及预后关系更为密切。

EGFR，人表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor)是由原癌基因HER1编码的上皮生长因子(EGF)的受体。EGFR由1186个氨基酸组成，相对分子量为170KD。EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，在许多上皮来源的恶性肿瘤中，如乳腺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、头颈鳞癌等细胞表面都有异常过表达。EGFR一种具有酪氨酸蛋白激酶(TPK)活性的细胞膜表面糖蛋白受体，能结合具有激动功能的多种配体，EGFR与其相应配体EGF、TGF-α等结合后，可诱导受体自身二聚体化，同时其胞内TPK结构域发生磷酸化而活化，继而介导MAPK、PI3K等多种信号通路的激活，促进转录因子、蛋白激酶等的活化。EGFR信号通路对恶性肿瘤的生长、增殖、侵袭、转移和分化等生理过程发挥重要的作用。且已经证明EGFR与肿瘤的分化程度、恶性程度及浸润程度、放化疗敏感性、肿瘤耐药性及预后等密切相关。因此，EGFR家族被认为是抗肿瘤治疗的理想分子靶点之一。目前，针对EGFR的肿瘤分子靶向药物，主要有西妥昔单抗、帕尼单抗、吉非替尼、厄洛替尼等。

在恶性肿瘤中，EGFR是突变率较高的基因之一。突变型EGFR受体或配体表达的增加导致EGFR的持续活化，同时启动不同的信号转导途径。EGFR突变不仅造成了肿瘤对靶向药物的耐药性，也是的EGFR的靶向特异性药物的脱靶，严重影响治疗的效果。因此，寻找新的靶向药物，能够抑制恶性肿瘤EGFR高表达或者抑制EGFR突变引起的信号通路的激活，对肿瘤的治疗有主要的意义。

发明内容

本发明解决的问题是构建一种基于外源重组质粒pCDH-puro-EGFR(I645L)构建的稳定高表达突变型EGFR的重组MHCC97-L肝癌细胞。在经过EGFR-I645L基因全长的获得，pCDH-puro-EGFR(I645L)质粒构建的基础上，通过包装病毒，然后对病毒感染后的细胞进行嘌呤霉素筛选，传代，建立EGFR(I645L)稳定表达MHCC97-L细胞株。

本发明通过下述技术方案实现：

(一).pCDH-puro-EGFR(I645L)真核表达载体构建，通过多克隆位点将EGFR-I645L全长基因构建于真核质粒pCDH-EF1-MCS-puro(如图1)，使用的克隆酶切位点为XbaI和NotI。这种突变型EGFR真核表达载体，其能高效表达功能突变型EGFR，此EGFR蛋白第645位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸，其序列见附件一。

(二).一种突变型EGFR高表达的转化体，该转化体为MHCC97-L-EGFR(I645L)重组细胞，宿主细胞为肝癌MHCC97-L细胞系细胞系。转染宿主细胞的外源性表达载体是包含EGFR(I645L)全长基因的pCDH-puro-EGFR(I645L)质粒。

本发明基于外源重组质粒pCDH-puro-EGFR(I645L)构建的稳定高表达突变型EGFR的重组MHCC97-L肝癌细胞。具体经过EGFR-I645L基因全长的获得，pCDH-puro-EGFR(I645L)质粒构建、包装病毒，然后对病毒感染后的细胞进行嘌呤霉素筛选，传代，建立稳定表达MHCC97-L细胞。较转染前，重组MHCC97-L肝癌细胞能够5-7倍表达EGFR蛋白，并且其第645位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸，此突变能显著性激活EGFR的磷酸化，持续激活EGFR通路。此细胞的建立可以为以肝癌肿瘤的EGFR通路相关药物筛选及耐药研究提供细胞模型，提高筛选的特异性及灵敏性；也可应用于EGFR影响的相关通路蛋白的差异性比较研究。

附图说明

图1.pCDH-EF1-MCS-puro质粒图谱；

图2.酶切后纯化的pCDH-EF1-MCS-puro质粒和EGFR基因片段电泳检测图；

图3.pCDH-puro-EGFR(I645L)质粒酶切鉴定图谱；

图4.EGFR(I645L)稳定表达MHCC97-L细胞株蛋白western blot检测

附件一.EGFR基因序列

EGFR核酸序列

atgcgaccctccgggacggccggggcagcgctcctggcgctgctggctgcgctctgcccggcgagtcgggctctggaggaaaagaaagtttgccaaggcacgagtaacaagctcacgcagttgggcacttttgaagatcattttctcagcctccagaggatgttcaataactgtgaggtggtccttgggaatttggaaattacctatgtgcagaggaattatgatctttccttcttaaagaccatccaggaggtggctggttatgtcctcattgccctcaacacagtggagcgaattcctttggaaaacctgcagatcatcagaggaaatatgtactacgaaaattcctatgccttagcagtcttatctaactatgatgcaaataaaaccggactgaaggagctgcccatgagaaatttacaggaaatcctgcatggcgccgtgcggttcagcaacaaccctgccctgtgcaacgtggagagcatccagtggcgggacatagtcagcagtgactttctcagcaacatgtcgatggacttccagaaccacctgggcagctgccaaaagtgtgatccaagctgtcccaatgggagctgctggggtgcaggagaggagaactgccagaaactgaccaaaatcatctgtgcccagcagtgctccgggcgctgccgtggcaagtcccccagtgactgctgccacaaccagtgtgctgcaggctgcacaggcccccgggagagcgactgcctggtctgccgcaaattccgagacgaagccacgtgcaaggacacctgccccccactcatgctctacaaccccaccacgtaccagatggatgtgaaccccgagggcaaatacagctttggtgccacctgcgtgaagaagtgtccccgtaattatgtggtgacagatcacggctcgtgcgtccgagcctgtggggccgacagctatgagatggaggaagacggcgtccgcaagtgtaagaagtgcgaagggccttgccgcaaagtgtgtaacggaataggtattggtgaatttaaagactcactctccataaatgctacgaatattaaacacttcaaaaactgcacctccatcagtggcgatctccacatcctgccggtggcatttaggggtgactccttcacacatactcctcctctggatccacaggaactggatattctgaaaaccgtaaaggaaatcacagggtttttgctgattcaggcttggcctgaaaacaggacggacctccatgcctttgagaacctagaaatcatacgcggcaggaccaagcaacatggtcagttttctcttgcagtcgtcagcctgaacataacatccttgggattacgctccctcaaggagataagtgatggagatgtgataatttcaggaaacaaaaatttgtgctatgcaaatacaataaactggaaaaaactgtttgggacctccggtcagaaaaccaaaattataagcaacagaggtgaaaacagctgcaaggccacaggccaggtctgccatgccttgtgctcccccgagggctgctggggcccggagcccagggactgcgtctcttgccggaatgtcagccgaggcagggaatgcgtggacaagtgcaaccttctggagggtgagccaagggagtttgtggagaactctgagtgcatacagtgccacccagagtgcctgcctcaggccatgaacatcacctgcacaggacggggaccagacaactgtatccagtgtgcccactacattgacggcccccactgcgtcaagacctgcccggcaggagtcatgggagaaaacaacaccctggtctggaagtacgcagacgccggccatgtgtgccacctgtgccatccaaactgcacctacggatgcactgggccaggtcttgaaggctgtccaacgaatgggcctaagatcccgtccctcgccactgggatggtgggggccctcctcttgctgctggtggtggccctggggatcggcctcttcatgcgaaggcgccacatcgttcggaagcgcacgctgcggaggctgctgcaggagagggagcttgtggagcctcttacacccagtggagaagctcccaaccaagctctcttgaggatcttgaaggaaactgaattcaaaaagatcaaagtgctgggctccggtgcgttcggcacggtgtataagggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaattcccgtcgctatcaaggaattaagagaagcaacatctccgaaagccaacaaggaaatcctcgatgaagcctacgtgatggccagcgtggacaacccccacgtgtgccgcctgctgggcatctgcctcacctccaccgtgcagctcatcacgcagctcatgcccttcggctgcctcctggactatgtccgggaacacaaagacaatattggctcccagtacctgctcaactggtgtgtgcagatcgcaaagggcatgaactacttggaggaccgtcgcttggtgcaccgcgacctggcagccaggaacgtactggtgaaaacaccgcagcatgtcaagatcacagattttgggct ggccaaactgctgggtgcggaagagaaagaataccatgcagaaggaggcaaagtgcctatcaagtggatggcattggaatcaattttacacagaatctatacccaccagagtgatgtctggagctacggggtgaccgtttgggagttgatgacctttggatccaagccatatgacggaatccctgccagcgagatctcctccatcctggagaaaggagaacgcctccctcagccacccatatgtaccatcgatgtctacatgatcatggtcaagtgctggatgatagacgcagatagtcgcccaaagttccgtgagttgatcatcgaattctccaaaatggcccgagacccccagcgctaccttgtcattcagggggatgaaagaatgcatttgccaagtcctacagactccaacttctaccgtgccctgatggatgaagaagacatggacgacgtggtggatgccgacgagtacctcatcccacagcagggcttcttcagcagcccctccacgtcacggactcccctcctgagctctctgagtgcaaccagcaacaattccaccgtggcttgcattgatagaaatgggctgcaaagctgtcccatcaaggaagacagcttcttgcagcgatacagctcagaccccacaggcgccttgactgaggacagcatagacgacaccttcctcccagtgcctgaatacataaaccagtccgttcccaaaaggcccgctggctctgtgcagaatcctgtctatcacaatcagcctctgaaccccgcgcccagcagagacccacactaccaggacccccacagcactgcagtgggcaaccccgagtatctcaacactgtccagcccacctgtgtcaacagcacattcgacagccctgcccactgggcccagaaaggcagccaccaaattagcctggacaaccctgactaccagcaggacttctttcccaaggaagccaagccaaatggcatctttaagggctccacagctgaaaatgcagaatacctaagggtcgcgccacaaagcagtgaatttattggagcatga

具体实施方式

(a)EGFR(I645L)全长基因的扩增

·提取MHCC97-H细胞的总RNA，经反转录后获得cDNA，以此为模板，经PCR反应获得EGFR(I645L)基因全长，所述的引物为：

·上游引物：GCTCAGAATGCGACCCTCCGGGACG

下游引物：ATTTGCGGCCGCTCATGCTCCAATAAATTCACTGC

·将获得的EGFR(I645L)基因全长进行XbaI和NotI双酶切后回收(如图2)。

·pCDH-EF1-MCS-puro质粒进行XbaI和NotI双酶切后回收(如图2)。

·将酶切后质粒和PCR产物连接后转化DH5α感受态。挑取单克隆后测序。获得pCDH-puro-EGFR(I645L)真核表达载体(如图3)。

(b)病毒的构建及富集

·pCDH-puro-EGFR(I645L)质粒的病毒需要在293T细胞中获得，每种病毒由三种质粒构成，分别是包装质粒psPAX2，包膜质粒p VSV.G和慢病毒载体pCDH-puro-EGFR(I645L)。

·第一天：将2×106个HEK-293T细胞种在10cm皿中，使用7ml添加胎牛血清的DMEM培养基培养，此培养基中不含抗生素。置于37℃,5％CO2(CO2体积含量5％的空气)培养箱中培养。

·第二天：在HEK-293T细胞长至覆盖率达到80％汇合时，使用lipofectamine2000做细胞转染。

·7.2ug psPAX2包装质粒；0.8ug p VSV.G包膜质粒；8ug慢病毒载体pCDH-puro-EGFR(I645L)与30ul lipofectamine 2000混合加入到293T细胞中。

·置于37℃,5％CO2培养箱中强制转染6-8小时。之后添加9ml含有体积浓度10％胎牛血清的DMEM培养基。

·培养72小时后收取培养基，1000rpm离心5min，取上清，得病毒培养液。

(c)MHCC97-L细胞感染

·在六孔板中种2*105/孔的MHCC97-L细胞使用2ml添加含有体积浓度10％胎牛血清的DMEM培养基培养，此培养基中不含抗生素置于37℃,5％CO2培养箱中培养。

·第二天将培养基全部抽走，将3ml新鲜的病毒培养液添加到MHCC97-L培养皿种，强制转染24小时。

·第三天将培养液吸走2ml,并添加2ml的DMEM+10％FBS(体积)培养2-3天。

·镜检有一部分荧光细胞后，将细胞传代到10cm皿中，传代第二天开始嘌呤霉素的筛选，浓度为到2ug/ml.一直持续筛选，出现克隆后，挑取单克隆进行培养。提取细胞蛋白，通过western蛋白检测筛选后扩大培养，得到目标细胞株(如图4)。

序列表

<110> 中国科学院大连化学物理研究所

<120> 一种突变型EGFR高表达的重组MHCC97-L肝癌细胞及构建

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3633

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcgaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg 60

gcgagtcggg ctctggagga aaagaaagtt tgccaaggca cgagtaacaa gctcacgcag 120

ttgggcactt ttgaagatca ttttctcagc ctccagagga tgttcaataa ctgtgaggtg 180

gtccttggga atttggaaat tacctatgtg cagaggaatt atgatctttc cttcttaaag 240

accatccagg aggtggctgg ttatgtcctc attgccctca acacagtgga gcgaattcct 300

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agcatccagt ggcgggacat agtcagcagt gactttctca gcaacatgtc gatggacttc 540

cagaaccacc tgggcagctg ccaaaagtgt gatccaagct gtcccaatgg gagctgctgg 600

ggtgcaggag aggagaactg ccagaaactg accaaaatca tctgtgccca gcagtgctcc 660

gggcgctgcc gtggcaagtc ccccagtgac tgctgccaca accagtgtgc tgcaggctgc 720

acaggccccc gggagagcga ctgcctggtc tgccgcaaat tccgagacga agccacgtgc 780

aaggacacct gccccccact catgctctac aaccccacca cgtaccagat ggatgtgaac 840

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gtgacagatc acggctcgtg cgtccgagcc tgtggggccg acagctatga gatggaggaa 960

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ggtattggtg aatttaaaga ctcactctcc ataaatgcta cgaatattaa acacttcaaa 1080

aactgcacct ccatcagtgg cgatctccac atcctgccgg tggcatttag gggtgactcc 1140

ttcacacata ctcctcctct ggatccacag gaactggata ttctgaaaac cgtaaaggaa 1200

atcacagggt ttttgctgat tcaggcttgg cctgaaaaca ggacggacct ccatgccttt 1260

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gtcagcctga acataacatc cttgggatta cgctccctca aggagataag tgatggagat 1380

gtgataattt caggaaacaa aaatttgtgc tatgcaaata caataaactg gaaaaaactg 1440

tttgggacct ccggtcagaa aaccaaaatt ataagcaaca gaggtgaaaa cagctgcaag 1500

gccacaggcc aggtctgcca tgccttgtgc tcccccgagg gctgctgggg cccggagccc 1560

agggactgcg tctcttgccg gaatgtcagc cgaggcaggg aatgcgtgga caagtgcaac 1620

cttctggagg gtgagccaag ggagtttgtg gagaactctg agtgcataca gtgccaccca 1680

gagtgcctgc ctcaggccat gaacatcacc tgcacaggac ggggaccaga caactgtatc 1740

cagtgtgccc actacattga cggcccccac tgcgtcaaga cctgcccggc aggagtcatg 1800

ggagaaaaca acaccctggt ctggaagtac gcagacgccg gccatgtgtg ccacctgtgc 1860

catccaaact gcacctacgg atgcactggg ccaggtcttg aaggctgtcc aacgaatggg 1920

cctaagatcc cgtccctcgc cactgggatg gtgggggccc tcctcttgct gctggtggtg 1980

gccctgggga tcggcctctt catgcgaagg cgccacatcg ttcggaagcg cacgctgcgg 2040

aggctgctgc aggagaggga gcttgtggag cctcttacac ccagtggaga agctcccaac 2100

caagctctct tgaggatctt gaaggaaact gaattcaaaa agatcaaagt gctgggctcc 2160

ggtgcgttcg gcacggtgta taagggactc tggatcccag aaggtgagaa agttaaaatt 2220

cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca acatctccga aagccaacaa ggaaatcctc 2280

gatgaagcct acgtgatggc cagcgtggac aacccccacg tgtgccgcct gctgggcatc 2340

tgcctcacct ccaccgtgca gctcatcacg cagctcatgc ccttcggctg cctcctggac 2400

tatgtccggg aacacaaaga caatattggc tcccagtacc tgctcaactg gtgtgtgcag 2460

atcgcaaagg gcatgaacta cttggaggac cgtcgcttgg tgcaccgcga cctggcagcc 2520

aggaacgtac tggtgaaaac accgcagcat gtcaagatca cagattttgg gctggccaaa 2580

ctgctgggtg cggaagagaa agaataccat gcagaaggag gcaaagtgcc tatcaagtgg 2640

atggcattgg aatcaatttt acacagaatc tatacccacc agagtgatgt ctggagctac 2700

ggggtgaccg tttgggagtt gatgaccttt ggatccaagc catatgacgg aatccctgcc 2760

agcgagatct cctccatcct ggagaaagga gaacgcctcc ctcagccacc catatgtacc 2820

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ttccgtgagt tgatcatcga attctccaaa atggcccgag acccccagcg ctaccttgtc 2940

attcaggggg atgaaagaat gcatttgcca agtcctacag actccaactt ctaccgtgcc 3000

ctgatggatg aagaagacat ggacgacgtg gtggatgccg acgagtacct catcccacag 3060

cagggcttct tcagcagccc ctccacgtca cggactcccc tcctgagctc tctgagtgca 3120

accagcaaca attccaccgt ggcttgcatt gatagaaatg ggctgcaaag ctgtcccatc 3180

aaggaagaca gcttcttgca gcgatacagc tcagacccca caggcgcctt gactgaggac 3240

agcatagacg acaccttcct cccagtgcct gaatacataa accagtccgt tcccaaaagg 3300

cccgctggct ctgtgcagaa tcctgtctat cacaatcagc ctctgaaccc cgcgcccagc 3360

agagacccac actaccagga cccccacagc actgcagtgg gcaaccccga gtatctcaac 3420

actgtccagc ccacctgtgt caacagcaca ttcgacagcc ctgcccactg ggcccagaaa 3480

ggcagccacc aaattagcct ggacaaccct gactaccagc aggacttctt tcccaaggaa 3540

gccaagccaa atggcatctt taagggctcc acagctgaaa atgcagaata cctaagggtc 3600

gcgccacaaa gcagtgaatt tattggagca tga 3633

Claims (2)

1.一种突变型EGFR高表达的重组MHCC97-L肝癌细胞，其特征在于：该肝癌MHCC97-L细胞系内感染有表达载体MHCC97-L- EGFR-I645L；

其能高效表达功能突变型EGFR，此EGFR蛋白第645位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸，其CDS序列具有如序列表1所示序列。

2.一种突变型EGFR高表达的重组MHCC97-L肝癌细胞的构建方法，

1）EGFR-I645L真核表达载体的构建，该载体为pCDH-puro-EGFR-I645L表达载体，通过多克隆位点将EGFR-I645L全长基因构建于真核质粒pCDH-EF1-MCS-puro，使用的克隆酶切位点为XbaI和NotI；其能高效表达功能突变型EGFR，此EGFR蛋白第645位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸，其CDS序列具有如序列表1所示序列；

2) 包装病毒，然后对病毒感染后的细胞进行嘌呤霉素筛选，传代，建立稳定表达MHCC97-L细胞。

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