[go: up one dir, main page]

CN110603261A - 具有新型键结构的肽衍生物 - Google Patents

具有新型键结构的肽衍生物 Download PDF

Info

Publication number
CN110603261A
CN110603261A CN201780086922.0A CN201780086922A CN110603261A CN 110603261 A CN110603261 A CN 110603261A CN 201780086922 A CN201780086922 A CN 201780086922A CN 110603261 A CN110603261 A CN 110603261A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide
scaffold
bond
compound
alkylamino
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780086922.0A
Other languages
English (en)
Inventor
D·德斐尔
G·马德
S·帕万
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BicycleTx Ltd
Original Assignee
Bass Adi Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB1622140.0A external-priority patent/GB201622140D0/en
Priority claimed from GBGB1713561.7A external-priority patent/GB201713561D0/en
Application filed by Bass Adi Ltd filed Critical Bass Adi Ltd
Publication of CN110603261A publication Critical patent/CN110603261A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

一种化合物，其包含经由至少一个烷基氨基键与支架连接的至少一个环状肽结构。优选地，环状肽结构为双环结构，其包含经由两个烷基氨基键和一个硫醚键与支架连接的两个肽环，键之一对于两个环是共同的。还提供一种制备化合物的方法，所述化合物包含经由至少一个烷基氨基键与支架连接的至少一个环状肽结构，所述方法包括：提供肽，所述肽具有至少两个选自半胱氨酸、二氨基丙酸、β‑N‑烷基二氨基丙酸和β‑N‑烷基二氨基丙酸的残基，条件是所述残基中的至少一个为二氨基丙酸、β‑N‑烷基二氨基丙酸和β‑N‑烷基二氨基丙酸；提供支架分子，所述支架分子具有至少两个反应位点用于与所述至少两个残基形成烷基氨基键或硫醚键；和在肽与支架分子之间形成所述键。

Description

具有新型键结构的肽衍生物
技术领域
本发明涉及肽，所述肽的结构通过共价连接到支架(scaffold)部分来约束，所述支架部分提供更有组织的(structured)骨架(backbone)，赋予肽构象。特别地，本发明涉及用于在肽和支架分子之间形成两个或更多个键的新化学反应。
背景技术
不同的研究团队先前通过在肽的半胱氨酸残基和支架分子的合适官能团之间形成两个或更多个硫醚键来将肽连接到支架部分。例如，WO 2004/077062和WO 2006/078161中公开了通过将含半胱氨酸的肽与分子支架(例如三(溴甲基)苯)连接来产生候选药物化合物的方法。
利用半胱氨酸硫醇生成共价硫醚键(linkage)以实现环化的优势在于它们的选择性和双正交反应性。可以用硫醇反应性支架化合物如1,3,5-三溴甲苯(TBMB)，使含硫醇的直链肽环化以形成双环肽，并且所得的产物在苄基位置含有三个硫醚。图1显示了直链肽与TBMB形成具有硫醚键的环状双环肽的整体反应。
需要替代的化学反应用于将肽偶联到支架部分以形成环状肽结构，所述化学反应采用硫醚部分的合适替代物，从而实现与不同肽的相容性、物理化学性质的改变(如溶解度改善)、替代的生物分布和其他优势。
WO2011/018227描述了一种用于改变第一肽衍生物或肽衍生物组的构象的方法，每个肽衍生物包含至少两个反应基团，所述反应基团被与分子支架共价连接的环序列分开，所述分子支架与所述反应基团形成共价键，以产生第二肽衍生物或肽衍生物组，所述方法包括由所述第一衍生物或衍生物组的肽和支架组装所述第二衍生物或衍生物组，合并以下之一：(a)改变至少一个反应基团；或(b)改变分子支架的性质；或(c)改变至少一个反应基团与分子支架之间的键；或(a)、(b)或(c)的任何组合。
发明内容
本发明人已经发现，用具有侧链氨基的肽替代环状肽中的一个或多个半胱氨酸残基提供了产生环状肽衍生物的机会，所述环状肽衍生物具有替代现有技术的硫醚键的烷基氨基键。用烷基氨基键替代硫醚键预期将改善根据本发明的环状肽衍生物的溶解度和/或氧化稳定性。令人惊讶的是，本发明人已经发现，在用烷基氨基键替代硫醚键后，衍生物对感兴趣的靶分子的亲和力可以保留。
因此，在第一方面，本发明提供一种化合物，其包含经由至少一个N-烷基氨基键与支架连接的至少一个环状肽结构。
术语“烷基氨基键”合适地是指以下通式的键
S–R1–N(R3)–R2–P
其中：
S表示支架核心，例如如下面进一步解释的(杂)芳香族环或(杂)脂肪族环；
R1和R2独立地为C1至C3亚烷基，其任选地被例如0至2个C1-C3烷基取代；R1和R2合适地独立地为亚甲基或亚乙基，R1和R2最合适地均为亚甲基(CH2)；
R3为C1-4烷基(包括支链烷基和环烷基，例如甲基)或H，其任选被一个或多个卤素原子取代；和
P表示肽骨架，即，上述键的R2部分连接至与肽骨架的羧基碳相邻的碳原子。
在实施方案中，环状肽结构经由至少一个硫醚键进一步连接至支架。如下面进一步解释，硫醚键在形成环状肽期间提供锚。在这些实施方案中，优选仅有一个这样的硫醚键。在这些实施方案中，合适地有一个这样的硫醚键和两个烷基氨基键。合适地，硫醚键为双环或多环肽衍生物的中心键，即，在肽序列中，在肽中形成烷基氨基键的两个残基(例如二氨基丙酸残基)被形成硫醚键的氨基酸残基(例如半胱氨酸)隔开，并位于其任一侧。合适地，环状肽结构因此为双环肽化合物，其具有中心硫醚键和两个外周烷基氨基键。在包含硫醚键的其他实施方案中，硫醚键可以位于两个相邻的N-烷基氨基键的N末端或C末端。
在其他合适的实施方案中，环状肽结构不包含任何肽与支架之间的硫醚键。合适地，在这些实施方案中，肽仅通过烷基氨基键与支架连接。合适地，沿肽链间隔有三个烷基氨基键，其中环状肽结构为双环肽化合物，其具有中心烷基氨基键和两个外周烷基氨基键。在这些实施方案中，烷基氨基键合适地与上式中的R3＝烷基或卤代烷基形成，因为形成的这些键的反应动力学比与R3＝H形成的键的反应动力学更好。
合适地，支架包含(杂)芳香族或(杂)脂环族部分。合适地，支架包含三取代的(杂)芳香族或(杂)脂环族部分，例如三亚甲基取代的(杂)芳香族或(杂)脂环族部分。(杂)芳香族或(杂)脂环族部分合适地为六元环结构，优选为三取代的，使得支架具有3重对称轴。因此，在某些优选的实施方案中，支架为1,3,5-三甲基苯。在其他优选的实施方案中，支架分子为1,3,5-三-(乙酰氨基)苯，例如来源于肽与(溴乙酰胺基)苯(TBAB)的反应。
合适地，烷基氨基键通过肽的氨基酸残基形成，所述肽在其侧链中具有至少一个-NH2或-NHR3基团。这些氨基酸残基可以是天然存在的氨基酸或非天然氨基酸。特别地，非天然氨基酸可以选自2,3-二氨基丙酸(Dap)、β-N-烷基-2,3-二氨基丙酸(N-AlkDap)和β-N-卤代烷基-2,3-二氨基丙酸(N-AlkDap)。在这种情况下，“烷基”是指C1-C4烷基，并且合适地为甲基。
在第二方面，本发明提供一种制备化合物的方法，所述化合物包含经由至少一个烷基氨基键与支架连接的至少一个环状肽结构，所述方法包括：提供肽，所述肽具有至少一个选自二氨基丙酸和β-N-(卤代)烷基二氨基丙酸的氨基酸残基；提供支架分子，所述支架分子具有至少两个反应位点，所述反应位点与所述二氨基丙酸或β-N-(卤代)烷基二氨基丙酸残基的侧链氨基形成烷基氨基键；和在肽与支架分子之间形成所述烷基氨基键。
在实施方案中，肽进一步包含至少一个半胱氨酸残基，用于与支架形成硫醚键。在这些实施方案中，肽合适地仅具有一个这样的半胱氨酸残基。合适地，半胱氨酸残基位于肽上的两个二氨基丙酸或β-N-烷基二氨基丙酸残基中间，由此其在衍生物的两个肽环之间形成中心键。半胱氨酸的-SH基团是高度亲核的，并且预期首先与支架分子的亲电子中心反应，以将肽锚定到支架分子上，然后氨基与支架分子的剩余亲电子中心反应，以形成环状肽衍生物。在其他实施方案中，中心键由二氨基丙酸或β-N-(卤代)烷基二氨基丙酸残基形成，并且外周键分别由半胱氨酸与二氨基丙酸或β-N-(卤代)烷基二氨基丙酸残基形成。
在其他实施方案中，起始肽不包含半胱氨酸残基。在这些实施方案中，肽合适地具有沿链间隔的三个氨基酸残基，所述氨基酸残基选自二氨基丙酸或β-N-(卤代)烷基二氨基丙酸，用于通过与支架分子的反应形成双环结构。在这些实施方案中，由于上面给出的原因，三个氨基酸残基合适地选自-(卤代)烷基二氨基丙酸残基。
在实施方案中，起始肽在除用于形成烷基氨基键的氨基以外的亲核基团上具有保护基。
合适地，本发明的方法包括在亲核取代反应中，使具有二氨基丙酸或β-N-(卤代)烷基二氨基丙酸残基的肽与具有两个或更多个离去基的支架分子反应。
亲核取代反应可以在碱的存在下进行，例如其中离去基为常规的阴离子离去基。本发明人已经发现，通过适当选择用于亲核取代反应的溶剂和碱，可以大大提高本发明的环化肽衍生物的产率，此外优选的溶剂和碱不同于现有技术中仅涉及形成硫醚键的溶剂和碱组合。特别地，本发明人已经发现，当使用碱三烷基胺，即式NR1R2R3的碱时，实现了产率的改善，其中R1、R2和R3独立地为C1-C5烷基，合适地为C2-C4烷基，特别地为C2-C3烷基。尤其合适的碱为三乙胺和二异丙基乙胺(DIPEA)。这些碱仅具有弱亲核性的性质，并且认为该性质导致了用这些碱所观察到的较少的副反应和较高的产率。本发明人进一步发现，用于亲核取代反应的优选溶剂为极性和质子性溶剂，特别是MeCN/H2O(50:50)。
在实施方案中，本发明的化合物为药物缀合物，其包含与一种或多种效应物和/或官能团(如细胞毒性剂或金属螯合剂)缀合的环状肽结构。
合适地，缀合物具有通过可裂解键(例如二硫键)与环状肽结构连接的细胞毒性剂。合适地，细胞毒性剂选自DM1或MMAE。
在实施方案中，药物缀合物具有以下结构：
其中：R1、R2、R3和R4表示氢或C1-C6烷基；
毒素是指任何合适的细胞毒性剂；
双环表示环状肽结构；
n表示选自1至10的整数；和
m表示选自0至10的整数。
合适地，R1、R2、R3和R4均为H；或者R1、R2、R3均为H且R4＝甲基；或者R1、R2＝甲基且R3、R4＝H；或者R1、R3＝甲基且R2、R4＝H；或者R1、R2＝H且R3、R4＝C1-C6烷基。
毒素与双环肽之间的接头可以包含三唑基团，所述三唑基团通过叠氮官能化的毒素与炔官能化的双环肽结构(或反之亦然)之间的链接反应(click-reaction)形成。在其他实施方案中，双环肽可以含有酰胺键，所述酰胺键通过羧酸酯官能化的毒素与双环肽的N-末端氨基之间的反应形成。
毒素与双环肽之间的接头可以包含可用组织蛋白酶裂解的基团，以提供毒素在靶细胞内的选择性释放。合适的可用组织蛋白酶裂解的基团为缬氨酸-瓜氨酸。
毒素与双环肽之间的接头可以包含一个或多个间隔基团以提供期望的功能，例如，对缀合物的结合亲和力或组织蛋白酶可裂解性。合适的间隔基团为对氨基苄基氨基甲酸酯(PABC)，其可以位于缬氨酸-瓜氨酸基团和毒素部分的中间。
因此，在实施方案中，双环肽-药物缀合物可以具有由毒素-PABC-cit-val-三唑-双环组成的以下结构：
在另一个实施方案中，双环肽-药物缀合物可以具有由毒素-PABC-cit-val-二羧酸酯-双环组成的以下结构：
其中(alk)为式CnH2n的亚烷基(其中n为1至10)，其可以为直链的或支链的，合适的(alk)为正丙亚烷基或正丁亚烷基。
在另一个方面，本发明提供一种库，其包含多种不同的根据本发明的化合物。不同的化合物可以包含不同的肽序列和/或不同的支架。可以筛选所述库以确定具有期望的生物活性的化合物。
在另一个方面，本发明提供一种用于选择候选药物化合物的方法，其包括：提供根据本发明第一方面的化合物的库，确定靶分子与所述化合物的结合，并确定最大限度地结合所述靶分子的化合物。
可以通过单个分子的分析来进行筛选。在WO 2004/077062、WO 2006/078161和WO2011/018227中提供了这种方法。
在另一个方面，本发明进一步提供一种试剂盒，其至少包含根据本发明的肽衍生物。
在另一个方面，本发明提供一种组合物，其包含本发明的肽衍生物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
此外，本发明提供一种使用根据本发明的肽衍生物或组合物用于治疗疾病的方法。
在另一个方面，本发明提供一种使用根据本发明的肽衍生物或组合物用于诊断，包括疾病诊断的方法。因此，通常可以利用分析物与肽衍生物的结合来置换试剂，这导致在置换时产生信号。例如，分析物(第二靶标)的结合可以置换与肽衍生物结合的酶(第一靶标)，为结合分析提供基础，尤其是如果酶通过其活性位点保持在肽衍生物上。
附图说明
图1显示根据现有技术用于制备硫醚连接的双环肽配体的反应方案；
图2显示根据现有技术的硫醚连接的双环肽配体；命名为17-69-07-N241
图3显示根据本发明的第一仲氨基连接的双环肽配体；
图4显示根据本发明的叔N-甲基氨基连接的双环肽配体；
图5显示根据本发明的第三仲氨基连接的双环肽配体，其为17-69-07-N241的Dap类似物；
图6显示用TBAB支架环化的根据本发明的第四仲氨基连接的双环肽配体；
图7显示图3的衍生物针对MT1-MMP的竞争性亲和结合分析数据；
图8显示图4的衍生物针对MT1-MMP的竞争性亲和结合分析数据；和
图9显示根据本发明的另一种衍生物针对MT1-MMP的竞争性亲和结合分析数据。
图10显示根据本发明的某些双环肽-TBMB衍生物的示意结构；
图11显示根据本发明的另一些双环肽-TBMB衍生物的示意结构；
图12显示根据本发明的另一些双环肽-TBMB衍生物的示意结构；
图13显示根据本发明的另一些双环肽-TBMB衍生物的示意结构；
图14显示用于通过链接反应以形成三唑键来制备根据本发明的双环肽-药物缀合物的反应方案；
图15显示用于通过具有酰氨键来制备根据本发明的双环肽-药物缀合物的反应方案；
图16显示用根据本发明的双环肽-药物缀合物处理后，具有HT1020肿瘤细胞肿瘤的Balb/c裸小鼠的随着时间的肿瘤体积和体重；
图17显示用根据本发明的另一种双环肽-药物缀合物处理后，具有HT1020肿瘤细胞肿瘤的Balb/c裸小鼠的随着时间的肿瘤体积和体重；
图18显示用根据本发明的另一种双环肽-药物缀合物处理后，具有HT1020肿瘤细胞肿瘤的Balb/c裸小鼠的随着时间的肿瘤体积和体重；
图19显示用根据本发明的另一种双环肽-药物缀合物处理后，具有HT1020肿瘤细胞肿瘤的Balb/c裸小鼠的随着时间的肿瘤体积和体重；
图20显示用根据本发明的另一种双环肽-药物缀合物处理后，具有HT1020肿瘤细胞肿瘤的Balb/c裸小鼠的随着时间的肿瘤体积和体重；
具体实施方式
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义，如在肽化学、细胞培养和噬菌体展示、核酸化学和生物化学领域。对于分子生物学、遗传学和生物化学方法使用标准技术(参见Sambrook等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual,第三版,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology(1999)第四版,John Wiley&Sons,Inc.)，其通过引用并入本文。
本发明提供一种化合物，其包含经由至少一个，优选至少两个烷基氨基键与支架连接的至少一个环状肽结构。
环状肽结构包含至少一个位于分子支架上的两个键之间的肽环。合适地，环状肽结构为双环结构，即，它包含或由位于分子支架上的三个键之间的两个肽环组成，中心键对于两个环是共同的。
在实施方案中，环状肽结构经由硫醚键进一步连接至支架。合适地，存在不超过一个这样的硫醚键。合适地，环状肽结构为所述双环结构，其形成两个环，所述两个环位于三个键之间，其中中心的共同键合适地为硫醚键，外侧键(outer linkage)为烷基氨基键。然而，设想在其他实施方案中，硫醚键可以为外侧键之一。
在其他实施方案中，环状肽结构可以不含肽和支架结构之间的硫醚键。在这些实施方案中，肽可以仅通过烷基氨基键与支架连接。在这些实施方案中，环状肽结构合适地为所述双环结构，其形成两个环，所述两个环位于三个键之间，每个键为烷基氨基键。在这些实施方案中，烷基氨基键合适地由(卤代)烷基Dap形成。
因此，本发明的化合物包含与分子支架共价结合的肽、基本上由与分子支架共价结合的肽组成或者由与分子支架共价结合的肽组成。术语“支架”或“分子支架”在本文中是指化学部分，其在本发明化合物中的两个或更多个烷基氨基键处与肽键合。术语“支架分子”或“分子支架分子”在本文中是指分子，其能够与肽或肽衍生物反应，以形成具有烷基氨基键的缀合物。因此，支架分子具有与支架部分相同的结构，除了分子的各个反应基团(例如离去基)被支架部分中与肽键合的烷基氨基键和任选的硫醚键取代。
分子支架分子是能够在多个点连接至肽以与肽形成两个或更多个烷基氨基键的任何分子。它不是交联剂，因为它通常不连接两个肽；相反，它为单个肽提供两个或更多个连接点。优选地，分子支架分子包含至少三个用于肽的连接位点，被称为支架反应基团。这些基团能够与肽上的氨基反应以形成烷基氨基键。因此，分子支架表示直至但不包括本发明缀合物中的烷基氨基键的支架部分。支架分子具有支架的结构，但在本发明缀合物中的烷基氨基键的位置具有反应基团。支架和/或支架分子合适地具有小于约1000道尔顿，在一些情况下小于约500道尔顿，例如小于约300道尔顿的分子量。
合适地，支架包含(杂)芳香族或(杂)脂环族部分、基本上由(杂)芳香族或(杂)脂环族部分组成或者由(杂)芳香族或(杂)脂环族部分组成。
如本文所使用，“(杂)芳基”意指包括芳香环，例如，具有4至12元的芳香环，如苯环。这些芳香环可以任选地含有一个或多个杂原子(例如N、O、S和P中的一个或多个)，如噻吩基环、吡啶基环和呋喃基环。芳香环可以是任选被取代的。“(杂)芳基”还意指包括与一个或多个其他芳香环或非芳香环稠合的芳香环。例如，出于本申请的目的，萘基、吲哚基、噻吩并噻吩基、二噻吩并噻吩基和5,6,7,8-四氢-2-萘基(各自可以为任选被取代的)为芳基。如上所述，芳基环可以是任选被取代的。合适的取代基包括烷基(可以是任选被取代的)、其他芳基(其本身可以是被取代的)、杂环(饱和的或不饱和的)、烷氧基(意指包括芳氧基(例如苯氧基))、羟基、醛基、硝基、胺基(例如，未取代的，或被芳基或烷基单-取代或二-取代的)、羧酸基、羧酸衍生物(例如羧酸酯、酰胺等)、卤素原子(例如Cl、Br和I)等。
如本文所使用，“(杂)脂环族”是指均环或杂环饱和环。环可以是未取代的，或者其可以被一个或多个取代基取代。取代基可以是饱和的或不饱和的，芳香族的或非芳香族的，合适的取代基的示例包括在上面与烷基和芳基上的取代基有关的讨论中列举的那些。此外，两个或更多个环取代基可以结合以形成另一个环，因此如本文所使用，“环”意指包括稠环系统。
合适地，支架包含三取代的(杂)芳香族或(杂)脂环族部分，例如三亚甲基取代的(杂)芳香族或(杂)脂环族部分。(杂)芳香族或(杂)脂环族部分合适地为六元环结构，优选为三取代的，使得支架具有3重对称轴。
在实施方案中，支架为三-亚甲基(杂)芳基部分，例如1,3,5-三亚甲基苯部分。在这些实施方案中，相应的支架分子合适地具有亚甲基碳上的离去基。然后，亚甲基形成如本文所定义的烷基氨基键的R1部分。在这些亚甲基取代的(杂)芳香族化合物中，芳香环的电子可以在亲核取代期间稳定过渡态。因此，例如，苄基卤化物对亲核取代的反应性比没有与(杂)芳香族基团连接的烷基卤化物的反应性高100至1000倍。
在这些实施方案中，支架和支架分子具有通式：
其中LG表示如下文针对支架分子所进一步描述的离去基，或者LG(包括形成烷基氨基的R1部分的相邻亚甲基)表示本发明的缀合物中肽的烷基氨基键。
在实施方案中，上面的基团LG可以为卤素，例如但不限于溴原子，在这种情况下，支架分子为1,3,5-三(溴甲基)苯(TBMB)。另一种合适的分子支架分子为2,4,6-三(溴甲基)均三甲苯。它类似于1,3,5-三(溴甲基)苯，但另外含有三个与苯环相连接的甲基。在这种支架的情况下，另外的甲基可以与肽形成进一步的接触，从而增加额外的结构约束。因此，与1,3,5-三(溴甲基)苯相比，实现了不同的多样性范围。
用于通过亲核取代与肽反应形成支架的另一种优选的分子为1,3,5-三(溴乙酰氨基)苯(TBAB)：
在其他实施方案中，分子支架可以具有四面体几何形状，使得编码肽的四个官能团与分子支架的反应产生不超过两种产物异构体。其他几何形状也是可能的；实际上，几乎无限数量的支架几何形状都是可能的，导致肽衍生物多样化的更大可能性。
通常，形成烷基氨基键的基团存在于肽的氨基酸侧链上。这些基团合适地为伯胺或仲胺基团。合适的人工氨基酸的伯-CH2NH2基团(如二氨基丙酸(DAP))或仲-CH2NHR3氨基(如β-N-烷基二氨基丙酸(N-AlkDap)或β-N-卤代烷基二氨基丙酸(N-HAlkDap))是优选的。二氨基丙酸的结构类似于现有技术中用于与支架形成硫醚键的半胱氨酸的结构，其中用-NH2取代半胱氨酸的末端-SH基团：
术语“烷基氨基”在本文中以其通常的化学意义使用，表示由与两个碳原子键合的NH或N(R3)组成的键，其中碳原子独立地选自烷基、亚烷基和芳基碳原子，并且R3为烷基或卤代烷基，合适地含有1至4个碳原子。合适地，本发明的烷基氨基键包含与两个饱和碳原子(最合适的是亚甲基(-CH2-)碳原子)键合的NH部分。在实施方案中，本发明的烷基氨基键具有通式：
S–R1–N(R3)–R2–P
其中：
S表示支架核心，例如如下面进一步解释的(杂)芳香族环或(杂)脂肪族环；
R1和R2独立地为C1至C3亚烷基，其任选地被例如0至2个C1-C3烷基取代；R1和R2合适地独立地为亚甲基或亚乙基，R1和R2最合适地均为亚甲基(CH2)；
R3为H或C1-4烷基(包括支链烷基和环烷基，例如甲基)，其任选被一个或多个卤素原子取代；和
P表示肽骨架，即，上述键的R2部分连接至与肽骨架的羧基碳相邻的肽骨架中的碳原子。
本发明的肽缀合物的肽元件包含两个或更多个反应基团，优选三个或更多个反应基团，其负责与支架结合；和反应基团之间的环氨基酸序列。与现有技术相同地，可以通过改变环的序列获得多样性。
本发明的肽衍生物的特别的优势在于它们小于例如现有技术的免疫结合剂。通常，本发明化合物的分子量小于约5000道尔顿，优选小于约4000道尔顿，优选小于约3000道尔顿。应理解，用从环的任一端或两端延伸的其他肽序列构建的衍生物可以具有在这些范围以外的更高的分子量。此外，与分子(如细胞毒性剂或治疗剂，HSA或聚乙二醇(PEG)聚合物)结合的肽衍生物将具有高得多的分子量。
本发明化合物的小尺寸源于小分子支架的使用，通常质量至多约500道尔顿。肽本身的长度优选小于约27个氨基酸，如在将肽连接到分子支架上的N-末端和C-末端连接点之间所测量的。当然，其他肽可以存在或连接在连接点之外，从而延长肽结构。在相邻的连接点之间所测量的，肽的每个环的长度优选为0至9个氨基酸。有利地，任何肽衍生物中环的长度独立地为3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。
多个环状肽可以一起掺入根据本发明的同一分子中。例如，可以经由分子支架将具有相同特异性的两种环状肽连接在一起，增加衍生物对其靶标的亲合力。可替代地，在另一个实施方案中，将多个环状肽组合以形成多聚体。例如，将两种不同的环状肽组合以产生多特异性分子。可替代地，可以将三种或更多种相同或不同的环状肽组合以形成多特异性衍生物。在一个实施方案中，可以通过将分子支架连接在一起来构建多价络合物，所述分子支架可以是相同的或不同的。
肽包含分子支架结合片段。这是分子支架所连接的区域。合适地，关于肽上的反应基团的评论适用于该结合片段。合适地，靶肽的分子支架结合片段包含1至27个氨基酸残基，合适地5至20个氨基酸残基。合适地，靶肽的分子支架结合片段包含少于15个氨基酸。其优势在于当肽片段连接到分子支架上时对肽片段施加进一步的构象约束。
靶肽合适地包含序列(X)lA1(X)mA2(X)nA3(X)o，其中：A1、A2和A3选自半胱氨酸、Dap、N-AlkDap和N-HAlkDap，条件是A1、A2和A3中至少一个为Dap、N-AlkDap或N-HAlkDap；X表示随机氨基酸；m和n为1至20的数字，优选4至10，定义了插入肽片段的长度；l和o为0至20的数字，定义了侧翼(flanking)肽片段的长度。在某些实施方案中，肽可以合适地包含序列(X)1A1(X)m)A2(X)nA3(X)o或(X)1A1(X)m)A2(X)nA3(X)o。如前面所讨论，合适地A1、A2和A3中至少两个为Dap、N-AlkDap或N-HAlkDap。在实施方案中，A1、A2和A3之一为半胱氨酸，其他的为Dap、N-AlkDap或N-HAlkDap。
在某些实施方案中，其中环状双环配体以高亲和力结合细胞表面金属蛋白酶MT1-MMP，肽包含式(II)的氨基酸序列：
-A1-X1-U/O2-X3-X4-G5-A2-E6-D7-F8-Y9-X10-X11-A2-(SEQ ID NO:1)
(II)
或其药学上可接受的盐；
其中：
A1、A2和A3如上面所描述；X表示任何氨基酸残基；
U表示选自N、C、Q、M、S和T的极性不带电荷的氨基酸残基；和
O表示选自G、A、I、L、P和V的非极性脂肪族氨基酸残基。
可见，本发明的这些衍生物包含通过与Dap或N-AlkDap或N-HAlkDap残基的两个烷基氨基键和第三键偶联至支架的肽环，所述第三键选自与半胱氨酸的硫醚键或与Dap或N-AlkDap的烷基氨基键。如下面进一步所解释，当存在时，硫醚键可以在形成环肽期间提供锚。当存在时，硫醚键可以为双环肽缀合物的中心键，即，在肽序列中，在肽中形成烷基氨基键的两个残基被形成硫醚键的半胱氨酸残基隔开，并位于其任一侧。因此如在本申请实施例中所阐明，环状肽结构为具有中心硫醚或烷基氨基键和外周烷基氨基或硫醚键的双环肽缀合物。
合适地，X1选自下列氨基酸中的任何一种：Y、M、F或V，如Y、M或F，特别是Y或M，更特别是Y。
合适地，U/O2选自U(如N)和O(如G)。
合适地，X3选自U或Z，其中U表示选自N、C、Q、M、S和T的极性不带电荷的氨基酸残基，并且Z表示选自D或E的极性带负电荷的氨基酸残基，特别地3位的U选自Q，或者3位的Z选自E。
合适地，X4选自J，其中J表示选自F、W和Y的非极性芳香族氨基酸残基。
合适地，X10选自Z，其中Z表示选自D或E(如D)的极性带负电荷的氨基酸残基。
合适地，X11选自O，其中O表示选自G、A、I、L、P和V(如I)的非极性脂肪族氨基酸残基。
合适地，式(II)的双环为式(IIa)化合物：
-A1-Y/M/F/V-U/O-U/Z-J-G-A2-E-D-F-Y-Z-O-A3-(SEQ ID NO:6)
(IIa)
其中U、O、J和Z如上文所定义；或
式(IIb)化合物：
-A1-Y/M/F/V-N/G-E/Q-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3-(SEQ ID NO:7)
(IIb)；或
式(IIc)化合物：
-A1-Y/M/F-N/G-E/Q-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3-(SEQ ID NO:8)
(IIc)；或
式(IId)化合物：
-A1-Y/M-N-E/Q-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3-(SEQ ID NO:9)
(IId)；或
式(IIe)化合物：
-A1-Y-N-E-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3-(17-69-07)(SEQ ID NO:2)
(IIe)。
合适地，式(II)的双环包含选自以下的序列：
-A1-Y-N-E-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3-(17-69-07)(SEQ ID NO:2)；
-A1-M-N-Q-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3-(17-69-12)(SEQ ID NO:10)；
-A1-F-G-E-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3-(17-69-02)(SEQ ID NO:11)；
-A1-V-N-E-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3-(17-69-03)(SEQ ID NO:12)；
-A1-F-N-E-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3-(17-69-04)(SEQ ID NO:13)；
-A1-Y-N-E-Y-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3-(17-69-07-N057)(SEQ ID NO:14)；和
-A1-Y-N-E-W-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3-(17-69-44-N002)(SEQ ID NO:15)，
如：
-A1-Y-N-E-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3-(17-69-07)(SEQ ID NO:2)；和
-A1-M-N-Q-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3-(17-69-12)(SEQ ID NO:10)，
特别是：
-A1-Y-N-E-F-G-A2-E-D-F-Y-D-I-A3-(17-69-07)(SEQ ID NO:2)，
最特别是：
17-69-07-N241的Dap同源物，指定为SEQ ID 16：((bAla)-Sar10-AA1(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)A2EDFYD(tBuGly)A3；
和17-69-07-N268的Dap同源物，指定为SEQ ID 17：AA1(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)A2EDFYD(tBuGly)A3。
在所有上述序列中，A1、A2和A3如上文所定义。A1、A2和A3的合适且优选的类型和位置如上文所定义。
在本发明的这些和其他实施方案中，肽配体可以另外包含选自以下的一种或多种修饰：N-末端和/或C-末端修饰；用一个或多个非天然氨基酸残基替代一个或多个氨基酸残基(如用一个或多个等排或等电子氨基酸替代一个或多个极性氨基酸残基，用其他非天然等排或等电子氨基酸替代一个或多个疏水氨基酸残基)；间隔基团的加入；用一个或多个抗氧化氨基酸残基替代一个或多个氧化敏感氨基酸残基；用丙氨酸替代一个或多个氨基酸残基，用一个或多个D-氨基酸残基替代一个或多个L-氨基酸残基；双环肽配体内的一个或多个酰胺键的N-烷基化；用替代键替代一个或多个肽键；肽骨架长度修饰；用另一种化学基团取代一个或多个氨基酸残基的α-碳上的氢，和用合适的胺、硫醇、羧酸和苯酚反应性试剂对氨基酸(如半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸和酪氨酸)进行合成后生物正交修饰。
合适地，这些实施方案可以包含使用合适的氨基反应性化学的N-末端修饰，和/或使用合适的羧基反应性化学的C-末端修饰。例如，N-末端修饰可以包含分子间隔基团的加入，其促进效应基团的缀合和双环肽对其靶标的效力的保持。间隔基团合适地为含有约5至约30个氨基酸的寡肽基团，例如Ala、G-Sar10-A基团或bAla-Sar10-A基团。可替代地或另外地，N-末端和/或C-末端修饰包含细胞毒性剂的加入。
这些MT1-MMP结合肽的其他细节可以在我们于2016年5月4日提交的共同未结案的已公开申请WO2016/067035和未结案申请GB1607827.1中找到。这些申请的全部公开内容通过引用明确地并入本文。
在第二方面，本发明提供一种制备化合物的方法，所述化合物包含经由至少一个，例如至少两个烷基氨基键与支架连接的至少一个环状肽结构，所述方法包括：提供肽，所述肽具有至少一个二氨基丙酸或β-N-(卤代)烷基二氨基丙酸残基；提供支架分子，所述支架分子具有至少两个反应位点，所述反应位点与二氨基丙酸或β-N-烷基二氨基丙酸残基的氨基形成烷基氨基键；和在肽与支架分子之间形成所述烷基氨基键。
合适地，根据本发明该方面的方法涉及制备根据本发明第一方面的化合物。因此，支架分子和肽的细节合适地如上面关于本发明的第一方面所描述。
可以使用常规的固相合成由氨基酸起始材料来制备在本发明的方法中使用的肽，所述氨基酸起始材料可以包括如本文所描述的适当保护基。这些用于制备肽的方法是本领域熟知的。
在实施方案中，肽在除用于形成烷基氨基键或硫醚键(如果存在)的胺基或-SH基以外的亲核基团上具有保护基。对氨基酸侧链的亲核性已经进行了多项研究，并按降序列出：半胱氨酸中的硫醇、赖氨酸中的胺、组氨酸和色氨酸中的仲胺、精氨酸中的胍基胺、丝氨酸/苏氨酸中的羟基，最后是天冬氨酸和谷氨酸中的羧酸。因此，必须将保护基应用于肽上的更加亲核的基团，以防止与这些基团的不期望的副反应。
合适地，本发明的方法包括在亲核取代反应中，使具有两个或更多个反应性侧链胺基的肽与具有两个或更多个离去基的支架分子反应。
本文的术语“离去基”以其通常的化学意义使用，意指能够通过胺基进行亲核取代的部分。此处可以使用任何这样的离去基，条件是它易于通过胺的亲核取代去除。合适的离去基为酸的共轭碱，其pKa小于约5。可以用于本发明的离去基的非限制性示例包括卤素(如溴、氯、碘)、O-甲苯磺酸酯(OTos)、O-甲磺酸酯(OMes)、O-三氟甲磺酸酯(OTf)或O-三甲基甲硅烷基(OTMS)。
亲核取代反应可以在碱的存在下进行，例如其中离去基为常规的阴离子离去基。本发明人已经发现，通过适当选择用于亲核取代反应的溶剂和碱，可以大大提高环化肽衍生物的产率，此外优选的溶剂和碱不同于现有技术中仅涉及形成硫醚键的溶剂和碱组合。特别地，本发明人已经发现，当使用碱三烷基胺，即式NR1R2R3的碱时，实现了产率的改善，其中R1、R2和R3独立地为C1-C5烷基，合适地为C2-C4烷基，特别地为C2-C3烷基。尤其合适的碱为三乙胺和二异丙基乙胺(DIPEA)。这些碱仅具有弱亲核性的性质，并且认为该性质导致了用这些碱所观察到的较少的副反应和较高的产率。本发明人进一步发现，用于亲核取代反应的优选溶剂为极性和质子性溶剂，特别是MeCN/H2O，其含有体积比为1:10至10:1，合适地2:10至10:2，更合适地3:10至10:3，特别地4:10至10:4的MeCN和H2O。
在另一个方面，本发明提供一种库，其包含多种不同的根据本发明的化合物。不同的化合物可以包含不同的肽序列和/或不同的支架。可以筛选所述库以确定具有期望的生物活性的化合物。
库可以包含或者由例如至少约10、100或1000种根据本发明的不同肽缀合物组成。合适地，库可以由肽缀合物组成，所述肽缀合物每个具有相同的支架结构但连接有不同的肽。
在另一个方面，本发明提供一种用于选择候选药物化合物的方法，其包括：提供根据本发明上述方面的化合物的化学库，确定靶分子与所述化合物的结合，并确定最大限度地结合所述靶分子的化合物。
靶标为与肽衍生物结合的分子或其部分。合适地，本发明的化合物选择性地结合生物学靶标。例如，如通过本文所描述的方法所测定，它可以以大于约Kd＝1000，合适地大于约Kd＝100，例如大于约Kd＝10的亲和力结合。通常，靶标将类似于表位。本领域技术人员将理解，靶分子的选择是大的且多变的。它们可以为例如人或动物蛋白质、细胞因子、细胞因子受体、酶的酶辅因子或DNA结合蛋白。合适的细胞因子和生长因子包括但不限于：ApoE、Apo-SAA、BDNF、心肌营养素-1、EGF、EGF受体、ENA78、嗜酸性粒细胞趋化因子、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、Exodus-2、FGF-酸性、FGF-碱性、成纤维细胞生长因子-10(30)、FLT3衍生物、曲动蛋白(Fractalkine,CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-l、胰岛素、IFNy、IGF-I、IGF-II、IL-la、IL-1(3、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72a.a.)、IL-8(77a.a.)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-17a、IL-17c、IL-17d、IL-17e、IL-17f、IL-18(IGIF)、IL-21、IL-22、IL-23、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、抑制素α、抑制素β、IP-10、角质形成细胞生长因子-2(KGF-2)、KGF、瘦素、LIF、淋巴细胞趋化因子、缪勒抑制物质、单核细胞集落抑制因子、单核细胞引诱蛋白(30ibid)、M-CSF、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MIG、MIP-la、MIP-1p、MIP-3a、MIP3(3、MIP-4、骨髓祖细胞抑制因子-1(MPIF-1)、NAP-2、Neurturin、神经生长因子、P-NGF、NT-3、NT-4、制瘤素M、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDFla、SDFlp、SCF、SCGF、干细胞因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-2、TGF-3、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNF受体I、TNF受体II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF受体1、VEGF受体2、VEGF受体3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-□、GRO-□、HCC1、1-309、HER 1、HER 2、HER 3和HER 4。细胞因子受体包括前述细胞因子的受体。趋化因子靶标包括CC趋化因子衍生物CCL21/6Ckine、CCL12/MCP-5、CCL6/C10、CCL22/MDC、CCL14/HCC-1/HCC-3、CCL3L1/MIP-1α同种型LD78β、CCL23/Ckβ8-1、CCL3/MIP-1α、CCL28、CCL4L1/LAG-1、CCL27/CTACK、CCL4/MIP-1β、CCL24/嗜酸性粒细胞趋化因子-2/MPIF-2、CCL15/MIP-1Δ、CCL26样/嗜酸性粒细胞趋化因子-3样、CCL9/10/MIP-1γ、CCL26/嗜酸性粒细胞趋化因子-3、CCL19/MIP-3β、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、CCL20/MIP-3α、CCL14a/HCC-1、CCL23/MPIF-1、CCL14b/HCC-3、CCL18/PARC、CCL16/HCC-4、CCL5/RANTES、CCL1/I-309/TCA-3、TAFA1/FAM19A1、MCK-2、TAFA5/FAM19A5、CCL2/JE/MCP-1、TAFA3/FAM19A3、CCL8/MCP-2、TAFA4/FAM19A4、CCL7/MCP-3/MARC、CCL17/TARC、CCL13/MCP-4和CCL25/TECK；趋化因子受体包括CCR1、CCR7、CCR2、CCR8、CCR3、CCR9、CCR4、CCR10、CCR5、CCRL2/LCCR/CRAM-A/B和CCR6；CXC趋化因子衍生物包括CXCL13/BLC/BCA-1、CXCL10/IP-10/CRG-2、CXCL14/BRAK、LIX、CXCL16、CXCL15/Lungkine、CXCL5/ENA-78、CXCL9/MIG、CXCL6/GCP-2、CXCL7/NAP-2、CXCL1/2/3/GRO、CXCL4/PF4、CXCL1/GROα/KC/CINC-1、CXCL12/SDF-1α、CXCL2/GROβ/MIP-2/CINC-3、CXCL12/SDF-1β、CXCL3/GROγ/CINC-2/DCIP-1、CXCL12/SDF-1、CXCL11/I-TAC、CXCL7/胸腺趋化因子-1和CXCL8/IL-8；CXC趋化因子受体包括CXCR3、CXCR7/RDC-1、CXCR4、CXCR1/IL-8RA、CXCR5、CXCR2/IL-8RB和CXCR6；TNF超家族衍生物包括4-1BB衍生物/TNFSF9、LIGHT/TNFSF14、APRIL/TNFSF13、淋巴毒素、BAFF/BLyS/TNFSF13B、淋巴毒素β/TNFSF3、CD27衍生物/TNFSF7、OX40衍生物/TNFSF4、CD30衍生物/TNFSF8、TL1A/TNFSF15、CD40衍生物/TNFSF5、TNF-α/TNFSF1A、EDA(pan)、TNF-β/TNFSF1B、EDA-A1/EctodysplasinA1、TRAIL/TNFSF10、EDA-A2、TRANCE/TNFSF11、Fas衍生物/TNFSF6、TWEAK/TNFSF12和GITR衍生物/TNFSF18；TNF超家族受体包括4-1BB/TNFRSF9/CD137、NGF R/TNFRSF16、BAFF R/TNFRSF13C、骨保护素/TNFRSF11B、BCMA/TNFRSF17、OX40/TNFRSF4、CD27/TNFRSF7、RANK/TNFRSF11A、CD30/TNFRSF8、RELT/TNFRSF19L、CD40/TNFRSF5、TACI/TNFRSF13B、DcR3/TNFRSF6B、TNFRH3/TNFRSF26、DcTRAIL R1/TNFRSF23、TNF RI/TNFRSF1A、DcTRAIL R2/TNFRSF22、TNFRII/TNFRSF1B、DR3/TNFRSF25、TRAIL R1/TNFRSF10A、DR6/TNFRSF21、TRAILR2/TNFRSF10B、EDAR、TRAIL R3/TNFRSF10C、Fas/TNFRSF6/CD95、TRAILR4/TNFRSF10D、GITR/TNFRSF18、TROY/TNFRSF19、HVEM/TNFRSF14、TWEAKR/TNFRSF12、淋巴毒素βR/TNFRSF3和XEDAR；Toll样受体包括TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-7、TLR-8和TLR-9；酶，包括组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶F、MMP 1、MMP2、MMP 3、MMP 7、MMP 8、MMP 9、MMP 10、MMP 11、MMP 12、MMP 13、MMP 14、MMP15、MMP 16、MMP 17、MMP 19、MMP 20、MMP 21、MMP 23A、MMP 23B、MMP 26、MMP 27、MMP 28、尿激酶、激肽释放酶，包括KLK1、KLK2、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK9、KLK10、KLK11、KLK12、KLK13、KLK14和KLK15；补体系统的组分；细胞内信号分子和转录因子；p53；和MDM2。如下所述，靶标也可以为大的血浆蛋白质，如血清白蛋白。
应理解，该列表并非详尽无遗。
另外的结合或功能活性可以被连接到肽的N或C末端，所述肽与分子支架共价连接。例如，官能团可以选自：能够与在体内延长肽衍生物半衰期的分子结合的基团，和在体内延长肽衍生物半衰期的分子。这样的分子可以为例如HSA或细胞基质蛋白，并且能够与在体内延长肽衍生物半衰期的分子结合的基团为特异于HSA或细胞基质蛋白的抗体或抗体片段。这种分子也可以为与高分子量PEG的缀合物。
在一个实施方案中，官能团为结合分子，其选自第二肽衍生物，所述第二肽衍生物包含与分子支架共价连接的肽和抗体或抗体片段。可以将2、3、4、5或更多种肽衍生物连接在一起。这些衍生物中任何两种或更多种的特异性可以相同或不同；如果它们相同，将形成多价结合结构，与单价结合分子相比，其对靶标的亲合力增加。此外，分子支架可以是相同的或不同的，并且可与相同或不同数量的环相对(subtend)。
此外，官能团可以为效应基团，例如抗体Fc区。
可以在肽与分子支架结合之前或之后进行N或C末端的连接。因此，肽可以(通过合成，或通过生物学衍生的表达系统)产生，其中已经存在N或C末端肽基团。然而，优选地，在肽与分子骨架结合以形成缀合物之后进行向N或C末端的加入。例如，芴基甲氧基羰基氯可以用于在肽的N末端引入Fmoc保护基。Fmoc以高亲和力结合血清白蛋白(包括HSA)，并且Fmoc-Trp或Fmoc-Lys以增加的亲和力结合。可以在保留Fmoc保护基的情况下合成肽，然后通过烷基氨基与支架偶联。替代方案为棕榈酰基部分，其也结合HAS，并且例如已经用于利拉鲁肽(Liraglutide)以延长该GLP-1类似物的半衰期。
可替代地，可以制备肽与支架的缀合物，然后在N末端修饰，例如用胺和巯基反应性接头N-e-马来酰亚胺基己酰氧基)琥珀酰亚胺酯(EMCS)修饰。经由该接头，肽缀合物可以与其他肽连接，例如抗体Fc片段。
结合官能团可以为与分子支架结合产生多聚体的另一种肽；另一种结合蛋白，包括抗体或抗体片段；或任何其他期望的实体，包括血清白蛋白或效应基团，如抗体Fc区。
此外，另外的结合或功能活性可以直接与分子支架结合。在实施方案中，支架可以进一步包含反应基团，额外活性可以结合至其上。优选地，该基团相对于分子支架上的其他反应基团是正交的，以避免与肽的相互作用。在一个实施方案中，可以保护反应基团，并在必要时脱保护以缀合另外的活性。因此，在本发明的另一个方面，提供一种药物缀合物，其包含与一种或多种效应和/或官能团缀合的如本文所定义的肽配体。
效应和/或官能团可以连接到例如多肽的N或C末端，或连接到分子支架上。
合适的效应基团包括抗体及其部分或片段。例如，效应基团可以包括抗体轻链恒定区(CL)、抗体CH1重链结构域、抗体CH2重链结构域、抗体CH3重链结构域或其任何组合，以及一个或多个恒定区结构域。效应基团还可以包含抗体的铰链区(该区通常在IgG分子的CH1和CH2结构域之间存在)。
在本发明该方面的另一个实施方案中，根据本发明的效应基团为IgG分子的Fc区。有利地，根据本发明的肽配体-效应基团包含或由肽配体Fc融合体组成，所述肽配体Fc融合体具有1天或更长，2天或更长，3天或更长，4天或更长，5天或更长，6天或更长或7天或更长的tβ半衰期。最有利地，根据本发明的肽配体包含或由具有1天或更长的tβ半衰期的肽配体Fc融合体组成。
官能团通常包括结合基团、药物、用于连接其他实体的反应基团、有助于将大环肽摄取到细胞中的官能团等。
肽穿透到细胞中的能力将使肽有效针对细胞内靶标。具有穿透到细胞中的能力的肽可以接近的靶标包括转录因子、细胞内信号分子(如酪氨酸激酶)和涉及凋亡通路的分子。能够使细胞的穿透实现的官能团包括加入到肽或分子支架中的肽或化学基团。肽，如来源于如VP22、HIV-Tat、果蝇的同源框蛋白(Antennapedia)的那些，例如如Chen和Harrison,Biochemical Society Transactions(2007)卷35,第4部,821页、Gupta等人在AdvancedDrug Discovery Reviews(2004)卷57 9637中所描述。已显示有效通过质膜易位的短肽的示例包括来自果蝇触角(Antennapedia)蛋白的16个氨基酸的穿透肽(Derossi等人(1994)JBiol.Chem.卷269，10444页)、18个氨基酸的‘模型两亲性肽’(Oehlke等人(1998)BiochimBiophys Acts卷1414，127页)和HIV TAT蛋白的富含精氨酸的区域。非肽方法包括使用可以容易地附着于生物分子的小分子模拟物或SMOC(Okuyama等人(2007)Nature Methods卷4，153页)。将胍基加入到分子中的其他化学策略也增强细胞穿透(Elson-Scwab等人(2007)JBiol Chem卷282，13585页)。可以将小分子量分子(如类固醇)加入到分子支架中，以增强进入细胞的摄取。
可以与肽配体连接的一类官能团包括抗体及其结合片段，如Fab、Fv或单结构域片段。特别地，可以使用与能够在体内增加肽配体的半衰期的蛋白质结合的抗体。
还可以并入RGD肽，其与存在于许多细胞上的整合蛋白结合。
在一个实施方案中，根据本发明的肽配体-效应基团具有选自下组的tβ半衰期：12小时或更长、24小时或更长、2天或更长、3天或更长、4天或更长、5天或更长、6天或更长、7天或更长、8天或更长、9天或更长、10天或更长、11天或更长、12天或更长、13天或更长、14天或更长、15天或更长或者20天或更长。有利地，根据本发明的肽配体-效应基团或组合物的tβ半衰期为12至60小时。在另一个实施方案中，它具有一天或更长的tβ半衰期。在另一个实施方案中，其将为12至26小时。
在本发明的一个具体实施方案中，与环状肽缀合的官能团选自金属螯合剂，其适合于络合药物相关的金属放射性同位素。当与所述放射性同位素络合时，这些效应物可以作为用于癌症治疗的有用试剂。合适的示例包括DOTA、NOTA、EDTA、DTPA、HEHA、SarAr等(Targeted Radionuclide therapy,Tod Speer,Wolters/Kluver Lippincott Williams&Wilkins,2011)。
可能的效应基团还包括酶，例如在酶/前药治疗中使用的羧肽酶G2，其中肽配体替代ADEPT中的抗体。
在本发明该方面的一个特定实施方案中，官能团选自药物，如用于癌症治疗的细胞毒性剂。合适的示例包括：烷化剂，如顺铂和卡铂，以及奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺；抗代谢物，包括嘌呤类似物硫唑嘌呤和巯嘌呤或嘧啶类似物；植物生物碱和萜类，包括长春花生物碱，如长春新碱、长春碱、长春瑞滨和长春地辛；鬼臼毒素及其衍生物依托泊苷和替尼泊苷；紫杉烷，包括紫杉醇，最初称为紫杉醇(Taxol)；拓扑异构酶抑制剂包括喜树碱：伊立替康和托泊替康，以及II型抑制剂，包括安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷。另外的试剂可以包括抗肿瘤抗生素，其包括免疫抑制剂放线菌素D(用于肾移植)、多柔比星、表柔比星、博来霉素等。
在根据该方面的本发明的另一个具体实施方案中，细胞毒性剂选自DM1或MMAE。
DM1为一种细胞毒性剂，为美登素(maytansine)的含巯基衍生物，具有以下结构：
单甲基瑞奥西汀E(monomethyl auristatin E，MMAE)为一种合成的抗肿瘤剂，具有以下结构：
在一个实施方案中，细胞毒性剂通过可裂解的键(如二硫键)与双环肽连接。在另一个实施方案中，修饰与二硫键相邻的基团，以控制二硫键的位阻，并由此控制细胞毒性剂的裂解和随后释放的速率。
已发表的工作确定了通过在二硫键两侧引入空间位阻来改变二硫键对还原的敏感性的潜力(Kellogg等人(2011)Bioconjugate Chemistry,22,717)。更大程度的空间位阻降低了细胞内谷胱甘肽和细胞外(全身)还原剂的还原速率，从而降低了毒素在细胞内外释放的难易程度。因此，可以通过仔细选择二硫键两侧的位阻程度，来实现选择最佳的二硫化物的循环稳定性(其使得毒素的不良副作用最小化)以及在细胞内环境中的有效释放(其使得治疗作用最大化)。
通过在分子构建体的靶向实体(此处指双环肽)或毒素侧引入一个或多个甲基，来调节二硫键两侧的位阻。
因此，在一个实施方案中，细胞毒性剂选自下式的化合物：
其中n表示选自1至10的整数；和
R1和R2独立地表示氢或甲基。
在上式化合物的一个实施方案中，n表示1，R1和R2均表示氢(即美登素衍生物DM1)。
在上式化合物的一个替代实施方案中，n表示2，R1表示氢，R2表示甲基(即美登素衍生物DM3)。
在化合物的一个实施方案中，n表示2，R1和R2均表示甲基(即美登素衍生物DM4)。
应理解，细胞毒性剂可以与缀合物结构中的双环肽形成二硫键，通过多种可能的合成方案引入硫醇-毒素和硫醇-双环肽之间的二硫化物连接。
在一个实施方案中，缀合物的双环肽组分具有以下结构：
其中m表示选自0至10的整数，
双环表示如本文所描述的任何合适的环状肽结构；和
R3和R4独立地表示氢或甲基。
R3和R4均为氢的上式的化合物被认为是无位阻的，R3和R4中的一个或全部表示甲基的上式的化合物被认为是有位阻的。
应理解，上式的双环肽可以与上面所描述的缀合物结构中的细胞毒性剂形成二硫键，通过多种可能的合成方案引入硫醇-毒素和硫醇-双环肽之间的二硫化物连接。
在一个实施方案中，细胞毒性剂通过以下接头与双环肽连接：
其中R1、R2、R3和R4表示氢或C1-C6烷基；
毒素是指本文所定义的任何合适的细胞毒性剂；
双环表示如本文所描述的任何合适的环状肽结构；
n表示选自1至10的整数；和
m表示选自0至10的整数。
当R1、R2、R3和R4各自为氢时，二硫键位阻最小且最易于还原。当R1、R2、R3和R4各自为烷基时，二硫键位阻最大且最不易于还原。氢和烷基的部分取代产生逐渐增加的对还原的抗性，以及随后的裂解和毒素的释放。优选的实施方案包括：R1、R2、R3和R4均为H；R1、R2、R3均为H且R4＝甲基；R1、R2＝甲基且R3、R4＝H；R1、R3＝甲基且R2、R4＝H；和R1、R2＝H，R3、R4＝C1-C6烷基。
在一个实施方案中，化合物的毒素为美登素，并且缀合物包含下式的化合物：
其中R1、R2、R3和R4如上文所定义；
双环表示如本文所定义的任何合适的环状肽结构；
n表示选自1至10的整数；和
m表示选自0至10的整数。
其他制备上面描述的双环肽配体与毒素的缀合物的细节和方法在我们于2016年5月4日提交的已公开申请WO2016/067035和未结案申请GB1607827.1中详细地描述。这些申请的全部公开内容通过引用明确地并入本文。
毒素与双环肽之间的接头可以包含三唑基团，所述三唑基团通过叠氮官能化的毒素与炔官能化的双环肽结构(或反之亦然)之间的链接反应形成。在其他实施方案中，双环肽可以含有酰胺键，所述酰胺键通过羧酸官能化的毒素与双环肽的N末端氨基之间的反应形成。
毒素与双环肽之间的接头可以包含可用组织蛋白酶裂解的基团，以提供毒素在靶细胞内的选择性释放。合适的可用组织蛋白酶裂解的基团为缬氨酸-瓜氨酸。
毒素与双环肽之间的接头可以包含一个或多个间隔基团以提供期望的功能，例如，对缀合物的结合亲和力或组织蛋白酶可裂解性。合适的间隔基团为对氨基苄基氨基甲酸酯(PABC)，其可以位于缬氨酸-瓜氨酸基团和毒素部分的中间。
因此，在实施方案中，双环肽-药物缀合物可以具有由毒素-PABC-cit-val-三唑-双环组成的以下结构：
在另一个实施方案中，双环肽-药物缀合物可以具有由毒素-PABC-cit-val-二羧酸酯-双环组成的以下结构：
其中(alk)为式CnH2n的亚烷基(其中n为1至10)，其可以为直链的或支链的，合适的(alk)为正丙亚烷基或正丁亚烷基。
根据本发明的肽衍生物可以用于体内治疗和预防应用、体外和体内诊断应用、体外分析和试剂应用等。
通常，肽衍生物的用途可以替代抗体的用途。根据本发明选择的衍生物在通过标准免疫组织化学方法的Western分析和原位蛋白质检测中作诊断使用；为了在这些应用中使用，可以根据本领域已知的技术标记所选库的衍生物。此外，当与色谱载体(如树脂)络合时，这些肽衍生物可以在亲和色谱法中作制备使用。所有这些技术都是本领域技术人员所熟知的。根据本发明的肽衍生物具有与抗体相似的结合能力，并且可以在这种分析中替代抗体。
诊断用途包括通常使用抗体的任何用途，包括测试条分析、实验室分析和免疫诊断分析。
根据本发明制备的肽衍生物的治疗和预防用途涉及将根据本发明选择的衍生物施用至接受者哺乳动物，如人。对于施用至哺乳动物，具有至少90至95％一致性的基本上纯的肽衍生物是优选的，对于药物用途，98至99％或更高的一致性是最优选的，尤其是当哺乳动物为人时。当部分地纯化或纯化至期望的一致性后，所选择的肽可以作诊断或治疗(包括体外)使用，或用于开发和进行分析程序、免疫荧光染色等(Lefkovite和Pernis,(1979和1981)Immunological Methods,卷I和II,Academic Press,NY)。
本发明的肽衍生物将典型地用于预防、抑制或治疗炎症状态、过敏性超敏反应、癌症、细菌或病毒感染和自身免疫疾病(包括但不限于I型糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、克罗恩病和重症肌无力)。
在本申请中，术语“预防”涉及在疾病诱发之前施用保护性的组合物。“抑制”是指在诱发事件后，临床出现疾病之前施用组合物。“治疗”涉及在疾病症状变得明显后施用保护性的组合物。
可以使用动物模型系统来筛选肽衍生物在保护或治疗疾病中的有效性。
用于在易感小鼠中测试系统性红斑狼疮(SLE)的方法是本领域已知的(Knight等人.(1978)J Exp.Med.,147:1653；Reinersten等人.(1978)New Eng.J.Med.,299:515)。通过用来自另一物种的可溶性AchR蛋白诱导疾病，在SJL/J雌性小鼠中测试重症肌无力(MG)(Lindstrom等人.(1988)Adv.Immunol.,42:233)。通过注射II型胶原蛋白在敏感的小鼠品系中诱导关节炎(Stuart等人.(1984)Ann.Rev.Immunol.,42:233)。已经描述了通过注射分枝杆菌热休克蛋白在易感大鼠中诱导佐剂性关节炎的模型(Van Eden等人.(1988)Nature,331:171)。如所描述，通过施用甲状腺球蛋白在小鼠中诱导甲状腺炎(Maron等人.(1980)J.Exp.Med.,152:1115)。胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)天然存在于或可以在某些小鼠品系中诱导，例如Kanasawa等人.(1984)Diabetologia,27:113描述的那些。小鼠和大鼠中的EAE被用作人类中的MS的模型。在该模型中，通过施用髓磷脂碱性蛋白诱导脱髓鞘疾病(参见Paterson(1986)Textbook of Immunopathology,Mischer等人,eds,Grune和Stratton,NewYork,179-213页；McFarlin等人.(1973)Science,179:478:和Satoh等人.(1987)J.Immunol.,138:179)。
通常，本发明的肽衍生物将与药理学上合适的载体一起以纯化的形式使用。典型地，这些载体包括含水的或醇/水性溶液、乳液或混悬液、包括盐水和/或缓冲介质中的任意。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠以及乳酸林格氏液。如果需要将肽络合物维持在混悬液中，则合适的生理学上可接受的佐剂可以选自增稠剂，如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐。
静脉内载体包括液体和营养补充剂和电解质补充剂，如基于林格氏葡萄糖的那些。还可以存在防腐剂和其他添加剂，如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体(Mack(1982)Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版)。
本发明的肽衍生物可以作为单独施用的组合物使用，或与其他试剂联合使用。这些可以包括抗体、抗体片段和各种免疫治疗药物，如环孢菌素、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂以及免疫毒素。药物组合物可以包括各种细胞毒性剂或其他试剂组合本发明的所选抗体、其受体或结合蛋白、或甚至具有不同特异性的本发明所选肽(如使用不同的靶点衍生物选择的肽)的组合的“混合物(cocktails)”，无论它们是否在施用前汇集。
根据本发明的药物组合物的施用途径可以为本领域普通技术人员公知的任何一种。对于治疗，包括但不限于免疫疗法，可以根据标准技术将本发明的所选抗体、其受体或结合蛋白施用至任何患者。施用可以通过任何合适的方式进行，包括肠胃外、静脉内、肌肉内、腹膜内、经皮、经由肺部途径，或者合适地，通过用导管直接输注。施用的剂量和频率将取决于患者的年龄、性别和状况、其他药物的同时施用、禁忌和临床医生应考虑的其他参数。
可以将本发明的肽衍生物冻干用于储存，并在使用前在合适的载体中重构。已经证明该技术是有效的，并且可以采用本领域已知的冻干和重构技术。本领域技术人员将理解，冻干和重构可以导致不同程度的活性损失，并且可能需要上调使用水平以进行补偿。
可以施用含有本发明的肽衍生物或其混合物的组合物用于预防和/或治疗处理。在某些治疗应用中，实现选定细胞群的至少部分抑制、遏制、调节、杀伤或一些其它可测量参数的足够量定义为“治疗有效剂量”。实现该剂量所需的量将取决于疾病的严重程度和患者自身免疫系统的一般状态，但通常为每千克体重0.005至5.0mg选定的肽衍生物，更常用的剂量为0.05至2.0mg/kg/剂。对于预防应用，也可以以相似或稍低的剂量施用含有本发明肽衍生物或其混合物的组合物。
含有根据本发明的肽衍生物的组合物可以用于预防和治疗环境，以帮助改变、灭活、杀死或去除哺乳动物中所选择的靶细胞群。此外，本文所描述的肽的所选库可以在体外使用，或在体外选择性地用于从细胞的异源集合中杀死、消耗或以其他方式有效地去除靶细胞群。可以将来自哺乳动物的血液与所选的肽衍生物在体外组合，从而根据标准技术将不期望的细胞杀死或以其他方式从血液中去除以输送回哺乳动物。
参考以下实施例进一步描述本发明。
实施例
材料和方法
蛋白质表达
MT1-MMP血红素结合蛋白(hemopexin)样重复序列(也被称为MT1-MMP血红素结合蛋白结构域)，来自人类基因的残基Cys319-Gly511，使用pEXPR-IBA42(IBA)表达载体在HEK293细胞中作为分泌的N末端His6标记的可溶性蛋白瞬时表达。表达后，先后通过镍-NTA亲和色谱法和凝胶过滤纯化蛋白质，并通过SDS-PAGE检查纯度。在存在/不存在血红素结合蛋白结构域结合双环的情况下，还通过荧光热移位实验监测批次间变异性。
肽合成
肽合成基于Fmoc化学，使用Peptide Instruments制造的Symphony肽合成仪和MultiSynTech的Syro II合成仪。使用标准Fmoc-氨基酸(Sigma，Merck)，其具有以下侧链保护基：Arg(Pbf)、Asn(Trt)、Asp(OtBu)、Cys(Trt)、GIu(OtBu)、Gln(Trt)、His(Trt)、Lys(Boc)、Ser(tBu)、Thr(tBu)、Trp(Boc)和Tyr(tBu)(Sigma)。偶联剂为HCTU(Pepceuticals)，二异丙基乙胺(DIPEA，Sigma)用作碱，并用在20％哌啶的DMF中(AGTC)实现脱保护。使用0.37mmol/g Fmoc-Rink酰胺AM树脂(AGTC)进行合成，Fmoc-氨基酸以四倍过量使用，碱相对于氨基酸过量四倍。将氨基酸以0.2M溶解于DMSO中，HCTU以0.4M溶解于DMF中，DIPEA以1.6M溶解于N-甲基吡咯烷酮(Alfa Aesar)中。条件为偶联反应，含有20至50％DMSO的DMF，这减少了固相合成期间的聚集和缺失，并提高了产率。偶联时间通常为30分钟，脱保护时间为2×5分钟。将Fmoc-N-甲基甘氨酸(Fmoc-Sar-OH，Merck)偶联1小时，后续残基的脱保护和偶联时间分别为20分钟和1小时。合成后，将树脂用二氯甲烷洗涤，并干燥。使用10mL 95:2.5:2.5:2.5v/v/v/w TFA/H2O/iPr3SiH/二硫苏糖醇进行侧链保护基从载体上的裂解持续3小时。裂解后，通过过滤去除废树脂，将滤液加入已冷却至-80℃的35mL二乙醚中。将肽沉淀离心，弃去乙醚上清液，用冷乙醚将肽沉淀再洗涤两次。然后，将肽再溶解于5-10mL乙腈-水中并冻干。取出少量样品，用于通过质谱(MALDI-TOF，来自Applied Biosystems的VoyagerDE)分析粗产物的纯度。冻干后，将肽粉末溶解于10mL 6M盐酸胍的H2O中，补充0.5mL的1M二硫苏糖醇，并加载到C8Luna制备型HPLC柱(Phenomenex)上。用0.1％七氟丁酸将溶剂(H2O，乙腈)酸化。使用Gilson制备型HPLC系统，梯度范围为在15分钟内30-70％乙腈，流速为15-20mL/min。含有纯直链肽材料的级分(如通过MALDI所鉴定)用于通过偶联至如下文进一步描述的支架分子来制备双环衍生物。
除非另有说明，所有氨基酸均以L构型使用。使用上面描述的一般方法将非天然氨基酸掺入肽序列中。本文采用的非天然氨基酸前体的列表总结在下表中：
此外，以下非天然氨基酸前体用于制备DAP和N-AlkDap修饰的肽：
化合物 CAS Mw 供应商 订单号
Fmoc-L-Dap(Boc,Me)-OH 446847-80-9 440.49 Iris Biotech GMBH FAA4195
Fmoc-Dap(Boc)-OH 162558-25-0 426.46 Sigma Aldrich 47551
与MT1-MMP的结合亲和力
使用荧光偏振(各向异性)使用竞争试验测量结合亲和力。
本文提及的荧光示踪剂为双环肽，所述双环肽使用5,6-羧基荧光素进行荧光素化(fluoresceinate)。可以在肽的N末端氨基上进行荧光素化，其通过肌氨酸间隔子(通常为Sar5)与双环核心序列分隔开。这可以在Fmoc固相合成期间进行，或者在合成后(在用TBMB环化和纯化后)进行(如果N末端氨基对于肽是独特的(unique))。荧光素化也可以在C末端进行，通常在作为第一个C末端残基引入的赖氨酸上进行，然后通过肌氨酸间隔子(通常为Sar6)将其与双环核心序列分隔开。因此，N末端示踪剂可以具有描述为Fluo-Gly-Sar5-A(双环核心序列)的分子形式，并且对于C末端荧光化构建体为(双环核心序列)-A-Sar6-K(Fluo)。实施例中使用的荧光示踪剂为A-(17-69)-A-Sar6-K(Fluo)、A-(17-69-07)-A-Sar6-K(Fluo)和A-(17-69-12)-A-Sar6-K(Fluo)。由于17-69荧光肽的酸性，它们通常被制备成浓缩的DMSO储备液，用100mM Tris pH 8缓冲液由所述储备液制备稀释液。
由于其对MT1-MMP血红素结合蛋白结构域(PEX)的高亲和力，本文的荧光素化衍生物可以用于竞争实验(使用FP进行检测)。在此处，用游离的非荧光素化的双环肽滴定预先形成的PEX与荧光PEX结合示踪剂的络合物。由于预期所有基于17-69的肽都结合于同一位点，因此滴定剂将替代PEX中的荧光示踪剂。可以定量地测量络合物的解离，并确定竞争者(滴定剂)对靶蛋白的Kd。竞争方法的优点在于可以准确且快速地确定非荧光素化的双环肽的亲和力。
示踪剂的浓度通常为Kd或更低(此处为1nM)，并且结合蛋白(此处为MT1-MMP的血红素结合蛋白)为15倍过量，从而使得>90％的示踪剂被结合。随后，滴定非荧光竞争双环肽(通常仅为双环核心序列)，使其从靶蛋白质中替换荧光示踪剂。测量示踪剂的替换，并将其与荧光偏振的下降相关联。荧光偏振的下降与用非荧光滴定剂结合的靶蛋白的分数成比例，因此是滴定剂对靶蛋白的亲和力的量度。
将原始数据拟合为三次方程的解析解，所述三次方程描述了荧光示踪剂、滴定剂和结合蛋白之间的平衡。拟合需要荧光示踪剂对靶蛋白的亲和力值，其可以通过直接结合FP实验单独地确定(参见前一部分)。使用Sigmaplot 12.0进行曲线拟合，并使用由Zhi-XinWang(FEBS Letters 360(1995)111-114)描述的等式的改编版本。
参考实施例1
将选择用于比较硫醚与烷基氨基支架连接的双环肽命名为17-69-07-N241。其为硫醚形成的(thioether-forming)肽与三亚甲基苯支架的双环缀合物。该双环衍生物的结构如图2所示。缀合前的直链肽具有序列：
H-(β-Ala)-Sar10-Ala-Cys-(D-Ala)-Asn-Glu-(1Nal)-(D-Ala)-Cys-Glu-Asp-Phe-Tyr-Asp-(tBuGly)-Cys-NH2
与1,3,5-三(溴甲基)苯(TBMB，Sigma)的缀合如下进行。将直链肽用H2O稀释至～35mL，加入～500μL 100mM TBMB的乙腈溶液，并用5mL 1M NH4HCO3的H2O溶液引发反应。使反应在室温下进行约30-60分钟，并在反应完成(通过MALDI判断)后冻干。冻干后，如上所述将修饰的肽纯化，同时用Gemini C18柱(Phenomenex)替换Luna C8，并将酸改变为0.1％三氟乙酸。将含有正确TMB修饰的材料的纯级分合并，冻干并维持在-20℃储存。
所得的命名为17-69-07-N241的双环衍生物显示出对MT1-MMP的高亲和力。测得的衍生物对MT1-MMP的亲和力(Kd)为0.23nM。因此，该衍生物被认为是靶向表达细胞表面金属蛋白酶MT1-MMP的肿瘤细胞的有希望的候选物。
实施例1
制备了命名为17-69-07-N385的双环肽，其对应于参考实施例1的肽衍生物的双环区域，没有b-Ala-Sar10尾部，并且通过DAP残基替换第一和第三半胱氨酸残基，以形成与TBMB支架的烷基氨基键。该衍生物的结构如图3所示。
用于形成该双环的直链肽如下：
Ac-A(Dap)(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)CEDFYD(tBuGly)(Dap)
直链肽和双环肽具有以下LCMS特征：
保留时间 显示的m/z
直链肽 4.17min 886.1,1771.7
环化肽 4.39min 942.7
如下所述尝试用于环化步骤的各种试剂。在所选溶剂中将试剂补充至下表中所示的浓度。向一定体积的肽溶液中加入该体积一半的TBMB溶液，将混合物充分搅拌，然后加入该体积一半的碱溶液。将反应混合，并定时取样用于LCMS分析。
试剂 初始溶液浓度 加入反应的体积当量 最终反应浓度
肽 1.0mM 1.0 0.5mM
TBMB 2.6mM 0.5 0.65mM
碱 200mM 0.5 50mM
示例：向50μL肽溶液中加入25μL TBMB溶液。将溶液充分混合，然后加入25μL碱溶液。
在所使用的溶剂为DMF的情况下，所有试剂均在DMF中配制。在所使用的溶剂为DMSO的情况下，所有试剂均在DMSO中配制。在所使用的溶剂为MeCN/H2O的情况下，肽溶液在50％MeCN/H2O中配制，TBMB溶液在MeCN中配制，碱溶液在H2O中配制，除非碱为DIPEA，在这种情况下，碱溶液在MeCN中配制。所有环化均在室温进行。结果如下(光谱范围设定为3.5-5.5分钟。在220nm处积分的光谱和取得的主要峰的总和)：
可以看出环化后的纯度高度依赖于碱的选择。产物纯度范围为2至66％，其中后者涉及在DIPEA的存在下的乙腈/水混合物。与参考实施例1的环化不同，当使用常规的NaHCO3作为碱时，产率相对较低。使用三烷基胺即三乙胺和二异丙基乙胺(DIPEA)实现最佳产率。
与MT1-MMP的比较结合数据显示在图7中。测得的Kd为0.45nM，其表明相对于参考实施例1的硫醚连接的衍生物，该实施例中烷基氨基键的变化导致了非常小的结合亲和力变化。
实施例2
制备了命名为17-69-07-N426的双环肽，其对应于实施例1的双环肽，其中用N-MeDAP残基替代DAP残基。该衍生物的结构如图4所示。用于形成该双环的直链肽如下：
Ac-A(Dap(Me))(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)CEDFYD(tBuGly)(Dap(Me))
直链肽和双环肽具有以下LCMS特征：
保留时间 显示的m/z
直链肽 4.19min 900.1,1799.1
环化肽 4.38min 956.0,1913.7
将各种不同的反应条件、溶剂和碱用于如实施例1中所描述的环化步骤，具有以下结果(所有环化均在室温进行)：
溶剂 碱 总积分 产物积分 产物％ 时间
MeCN/H<sub>2</sub>O Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub> 21659.8 12714.5 59％ 1h
MeCN/H<sub>2</sub>O DIPEA 10547.7 9841.3 93％ 16h
环化后的纯度再次取决于碱的性质。如所预期的，用Na2CO3作为碱时的纯度低(参见实施例1)。使用在DIPEA的存在下乙腈/水的最佳条件，环化后的纯度非常高(93％)，证明Dap的N-甲基化降低了副反应的水平。
与MT1-MMP的比较结合数据显示在图8中。测得的Kd为0.36nM，与参考实施例1的硫醚键的衍生物相比几乎没有变化。尽管在键中存在两个N-甲基化，但仍保留了这种效力，因此本实施例的衍生物是非常令人感兴趣的。
实施例3
制备了命名为17-69-07-N428的双环肽，其对应于实施例1的双环肽，其中用Phe9替代Tyr9(去除Tyr羟基)。用于形成该双环的直链肽如下：
Ac-A(Dap)(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)CEDFF9D(tBuGly)(Dap)
直链肽和双环肽具有以下LCMS特征：
保留时间 显示的m/z
直链肽 4.51min 876.5,1755.4
环化肽 4.80min 935.3
将各种不同的反应条件、溶剂和碱用于如实施例1中所描述的环化步骤，具有以下结果(光谱的LCMS范围设定为4-6分钟。在220nm处积分的光谱和取得的主要峰的总和)：
可见产物纯度范围为2至71％，其中后者涉及在DIPEA的存在下的乙腈/水混合物。相对于用含酪氨酸的肽在MeCN/H2O/TMG/室温或MeCN/H2O/K2CO3/室温条件下的相同反应，Tyr-OH的去除(Tyr→Phe9)显著提高了产物产率。使用DMSO作为溶剂会产生非常混乱的色谱图，无法轻易分析。
该17-69-07-N428衍生物与MT1-MMP的比较结合数据显示在图9中。测得的Kd为3.5nM。相对于参考实施例1的硫醚连接的衍生物，结合亲和力的轻微降低似乎主要归因于用Phe9替代Tyr9。
实施例4
制备了命名为17-69-07-N434的双环肽，其对应于实施例1的双环肽，具有与参考实施例1类似的N末端Sar10间隔子，和缀合基团PYA(戊炔酸，用于与毒素“链接(click)”衍生化)。该衍生物的结构如图5所示。用于形成该双环的直链肽如下：
(PYA)-(B-Ala)-Sar10-A(Dap)(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)CEDFYD(tBuGly)(Dap)
直链肽和双环肽具有以下LCMS特征：
保留时间 显示的m/z
直链肽 4.18 863.7,1294.8
环化肽 4.37 902.6,1353.0
如下所述进行环化：
溶剂 碱 温度 总积分 产物积分 产物％ 时间
MeCN/H<sub>2</sub>O DIPEA 室温 4445.6 2666.5 60％ 4h
所得的衍生物17-69-07-N434为N241(参考实施例1)的Dap1/3等同物，其具有效应物(即，毒素)衍生化所需的N末端炔基。该肽可以以60％的纯度用TBMB环化。用MT1-MMP测量的kd为1.52nM，使得该双环肽非常适合于靶向MT1-MMP。
实施例5
如下所述用TBAB替代实施例1至3中使用的TBMB支架分子。
以与TBMB所使用的相同浓度和当量，用TBAB将用于在实施例1至3中形成17-69-07-N385、17-69-07-N426和17-69-07-N428的直链肽环化。具有N385肽的TBAB衍生物的结构如图6所示。
在室温下，选择使用DIPEA作为MeCN/H2O的溶剂混合物的碱。获得以下结果。
肽 产物保留时间 总积分 产物积分 产物％ 时间
17-69-07-N385 4.28min 9399.8 8830.0 94％ 16h
17-69-07-N426 4.47min 11941.6 11485.1 96％ 16h
17-69-07-N428 4.70min 8321.8 7941.5 95％ 16h
这些结果表明TBAB(卤代乙酰基)化学反应提供比TBMB更高的环化速率和更高的选择性，如产物％列中所示。
实施例6
制备了命名为17-69-07-N474的双环肽，其对应于实施例1的双环肽，其中用Dap(Me)替代Cys6。用于形成该双环的直链肽如下：Ac-A(Dap(Me))(D-Ala)NE(1Nal)(D-Ala)(Dap(Me))EDFYD(tBuGly)(Dap(Me))。
具有N385肽的TBMB衍生物的结构如图10所示。
直链肽和双环肽具有以下LCMS特征：
根据以下程序进行环化：将50μL1mM肽的MeCN/H2O(1:1)溶液与25μL 2.6mM TBMB的MeCN溶液混合，然后加入25μL 200mM DIPEA的MeCN/H2O溶液(用乙酸将pH调节至10)并将溶液混合。(相对于反应中存在的肽，1.3当量TBMB和100当量碱)。在反应进行4小时和过夜后取LCMS样品，如下表所示。
总积分 产物积分 产物％ 时间
3120 1248 40 4h
3784 3632 96 18h(过夜)
以与其他实施例相同的方式评估与MT1-MMP的结合。测得的Kd为8.0nM，与参考实施例1的硫醚连接的衍生物相比更小。尽管在键中存在三个N-甲基Dap，但该化合物仍以高亲和力结合，因此本实施例的衍生物是非常令人感兴趣的。
实施例7
制备以下根据本发明的其他双环肽，并使用上面描述的方法测试与MT1-MMP的结合亲和力。这些双环肽化合物的结构示意图如图10-13所示。
可以看出，使用根据本发明的这些烷基氨基键的双环化合物实现了对MT1-MMP的高亲和力。进一步的研究表明，根据本发明的双环肽与狗、小鼠/大鼠和人MT1-MMP完全交叉反应。进一步的研究表明，根据本发明的双环肽具有高度特异性，其与MMP1胞外域、MMP2胞外域、MMP15胞外域(血红素结合蛋白结构域)或MMP16血红素结合蛋白结构域没有显著的交叉反应性。还确定了根据本发明的双环肽的药代动力学类似于相应的具有与支架的三个硫醚键的双环肽，但对本发明的双环肽的血清测量中具有稍长的半衰期。
实施例8
根据图14中所示的反应方案制备双环肽-药物缀合物(BCD)，其中根据本发明的双环肽通过三唑环化反应与单甲基瑞奥西汀E(MMAE)偶联。除三唑基以外，缀合物中的接头基团包括缬氨酸-瓜氨酸(可用组织蛋白酶裂解的基团)和对氨基苄基氨基甲酸酯(PABC，一种间隔子)。反应方案的步骤如下进行。
用于制备化合物3的一般程序
在黑暗中，向化合物2(30g，80mmol)的DCM(300mL)和MeOH(150mL)溶液中加入4-氨基苯基甲醇(11g，88mmol)和EEDQ(40g，160mmol)。将混合物在30℃搅拌16小时。TLC(DCM:MeOH＝10/1,Rf＝0.43)表明化合物2被完全消耗，并且形成许多新的点。根据TLC，反应完全(clean)。将所得的反应混合物浓缩以得到残余物，其通过快速硅胶色谱法纯化(330g x 3硅胶快速柱，洗脱剂：0～20％MeOH/二氯甲烷@100mL/min)。得到作为白色固体的化合物3(20g，产率52％)。
用于制备化合物4的一般程序
向化合物3(5.0g，10.4mmol)的DMF(40mL)溶液中加入DIEA(5.4g，7.26mL，41.7mmol)和双(4-硝基苯基)碳酸酯(12.7g，41.7mmol)。将混合物在氮气中在0℃搅拌1小时。TLC(DCM:MeOH＝10/1,Rf＝0.66)表明化合物3被完全消耗，并且形成一个新的点。根据TLC，反应完全，并且LCMS(ES8241-10-P1A，产物：RT＝1.15min)显示形成了期望的产物。在中性条件下，通过制备型HPLC直接纯化所得的反应混合物。得到作为白色固体的化合物4(12g，产率60％)。
用于制备化合物5的一般程序
一批反应如下进行：在氮气氛下，向化合物4(1.2g，1.68mmol)的DMF(10mL)溶液中加入DIEA(1.22mL，6.98mmol)，将溶液在0℃搅拌10分钟，然后向其中加入HOBt(226mg，1.68mmol)和MMAE(1.00g，1.40mmol)，将混合物脱气并用N2吹扫3次，将其在35℃搅拌16小时。LC-MS(ES8396-1-P1A1，产物：RT＝1.19分钟)显示化合物4被完全消耗，并且检测到一个具有期望的质量的主峰。将所得的五批反应混合物合并在1L烧杯中，加入500mL水，然后形成沉淀物并过滤收集。将沉淀物用EtOAc研磨过夜。得到作为白色固体的化合物5(5g，产率59％)。
用于制备化合物6的一般程序
在TFA(44mmol，3.5mL)的存在下，将化合物5(3.3g，2.7mmol)溶解在DCM(18mL)中，然后将溶液在25℃搅拌3小时。随后，将反应混合物减压浓缩以去除DCM和TFA，得到残余物。将残余物溶解于THF(20mL)中，用K2CO3(1.8g，13mmol)处理，并将混合物在25℃再搅拌12小时。LC-MS(ES8396-2-P1B1，产物：RT＝1.04min)显示检测到一个具有期望的质量的主峰。将反应混合物过滤并减压浓缩，以得到残余物。将残余物溶解于10mL DMF中，并通过制备型HPLC(中性条件)纯化。得到作为白色固体的化合物6(1.6g，产率53％)。
用于制备化合物7-1的一般程序
将化合物6(1.2g，1.1mmol)和2-叠氮基乙酸(162mg，1.6mmol)溶解在DMF(10mL)中。在氮气中，将TEA(450uL，3.2mmol)、HOBt(217mg，1.6mmol)和EDCI(307mg，1.6mmol)加入到溶液中，并将混合物在0℃搅拌30分钟，然后将混合物缓慢加热至25℃，并进一步搅拌15.5小时。LC-MS(ES8396-3-P1A，产物：RT＝1.04分钟)显示化合物6被完全消耗，并且检测到一个具有期望的质量的主峰。向反应混合物中加入2mL水，以形成澄清溶液。然后，在中性条件下通过制备型HPLC直接纯化溶液。得到作为白色固体的化合物7-1(0.9g，产率70％)。
用于制备BT17BDC-53的一般程序
向(2-叠氮基乙酸)-Val-Cit-PABC-MMAE(16mg，13.26umol，1当量)和双环炔烃(17-69-07-N434，30mg，11.09umol，0.8当量)在DMF(3mL)和H2O(2mL)的混合物中加入CuI(1.26mg，6.63umol，0.5当量)。将混合物在N2中在25℃搅拌20小时。LC-MS显示(2-叠氮基乙酸)-Val-Cit-PABC-MMAE被完全消耗，并且检测到一个具有期望的MS的主峰。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化所得的反应混合物。得到作为白色固体的化合物BT17BDC-53(23.7mg，6.06umol，产率54.64％)。
用于制备BT17BDC-59的一般程序
在氮气下，向(2-叠氮基乙酸)-Val-Cit-PABC-MMAE(31mg，25.69umol，1.2当量)和(17-69-07-N438，40mg，20.8umol，1当量)在DMF(3mL)中的混合物中加入CuSO4(10.25mg，64.24umol，3当量)的水(0.4mL)溶液和抗坏血酸(37.71mg，214.12umol，10当量)的水(0.4mL)溶液。然后，将混合物在25℃搅拌1小时。LC-MS显示(2-叠氮基乙酸)-Val-Cit-PABC-MMAE被完全消耗，并且检测到一个具有期望的MS的主峰。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化所得的反应混合物。得到作为白色固体的BT17BDC-59(26.7mg，8.53umol，产率41.02％)。
用于制备BT17BDC61的一般程序
将化合物7-1(250mg，207umol)和BICY-炔烃17-69-07-N450(515mg，188umol)置于50mL圆底烧瓶中，加入DMF(5mL)，然后在氮气氛下加入抗坏血酸水溶液(1M，1.88mL)和CuSO4水溶液(1M，570uL)，然后将混合物在25℃搅拌1小时。LC-MS(ES8396-8-P1A，产物：RT＝1.03分钟)显示BICY-炔烃被完全消耗，并且检测到一个具有期望的质量的主峰。将反应混合物过滤以去除不溶解的物质，将滤液通过制备型HPLC(TFA条件)直接纯化。得到作为白色固体的BT17BDC61(262mg，产率35％)。
用于制备BT17BDC62的一般程序
将化合物7-1(250mg，207umol)和BICY-炔烃17-69-07-N443(368mg，188umol)置于50mL圆底烧瓶中。加入DMF(5mL)，然后加入抗坏血酸水溶液(1M，1.88mL)和CuSO4水溶液(1M，570uL)。然后，将混合物在25℃搅拌1小时。LC-MS(ES8396-9-P1A，产物：RT＝1.07分钟)显示BICY-炔烃被完全消耗，并且检测到一个具有期望的质量的主峰。将反应混合物过滤以去除不溶解的物质，将所得的滤液通过制备型HPLC(TFA条件)直接纯化。得到作为白色固体的BT17BDC62(253mg，产率42％)。
实施例9
根据图15中所示的反应方案制备双环-药物缀合物(BCD)，其中根据本发明的双环肽通过接头的末端戊二酰基与肽的末端氨基之间形成酰胺而与单甲基瑞奥西汀E(MMAE)偶联。反应方案的步骤如下进行。
用于制备化合物3的一般程序
在黑暗中，向化合物2(7.00g，18.70mmol，1.00当量)的DCM(80.00mL)和MeOH(40.00mL)溶液中加入(4-氨基苯基)甲醇(2.53g，20.56mmol，1.10当量)和EEDQ(9.25g，37.39mmol，2.00当量)。将混合物在25℃搅拌8小时。LC-MS显示化合物2被完全消耗，并且检测到一个具有期望的MS的主峰。将所得的反应混合物减压浓缩以去除溶剂，得到残余物。将残余物通过快速硅胶色谱法纯化(120g硅胶快速柱，洗脱剂：0～10％MeOH/DCM@85mL/min)。得到作为白色固体的化合物3(7.00g，14.60mmol，产率78.06％)。
用于制备化合物4的一般程序
向化合物3(4.00g，8.34mmol，1.00当量)和氯甲酸4-硝基苯酯(6.72g，33.36mmol，4.00当量)在THF(20.00mL)和DCM(10.00mL)中的溶液中加入吡啶(2.64g，33.36mmol，2.69mL，4.00当量)。将反应混合物在25℃搅拌5小时。LC-MS显示化合物3被完全消耗，并且检测到一个具有期望的MS的主峰。将反应混合物减压浓缩以得到残余物，其通过快速硅胶色谱法纯化(120g硅胶快速柱，洗脱剂：0～20％DM/MeOH@85mL/min)。得到作为白色固体的化合物4(2.20g，3.41mmol，产率40.92％)。
用于制备化合物5的一般程序
将化合物4(500.00mg，775.59umol，1.00当量)和DIEA(1.00g，7.76mmol，1.35mL，10.00当量)在DMF(10.00mL)中的混合物在氮气中在0℃搅拌30分钟。将MMAE(445.49mg，620.47umol，0.80当量)和HOBt(104.80mg，775.59umol，1.00当量)加入到上述混合物中。将反应混合物在氮气中在0℃搅拌10分钟，并在30℃再搅拌18小时。LC-MS显示化合物4被完全消耗，并且检测到一个具有期望的MS的主峰。将所得的反应混合物直接通过快速C18凝胶色谱法纯化(330gC18快速柱，洗脱剂：0～50％MeCN/H2O@85mL/min)。得到作为白色固体的化合物5(400.00mg，326.92umol，产率42.15％)。
用于制备化合物6的一般程序
向化合物5(430.00mg，351.44umol，1.00当量)的DCM(36.00mL)溶液中加入TFA(6.16g，54.03mmol，4.00mL，153.73当量)，并将混合物在25℃搅拌2小时。然后，将混合物减压浓缩以得到残余物，将其溶解于THF(10.00mL)中，并向混合物中加入K2CO3(1.21g，8.79mmol，25.00当量)。将反应在25℃搅拌12小时。LC-MS显示化合物5被完全消耗，并且检测到一个具有期望的MS的主峰。将所得的反应混合物过滤，将滤液减压浓缩以得到残余物，其通过快速C18凝胶色谱法纯化(120gC18快速柱，洗脱剂：0～50％MeCN/H2O@85mL/min)。得到作为白色固体的化合物6(290.00mg，258.14umol，产率73.45％)。
用于制备化合物7的一般程序
使用氮气球吹扫含有(400mg，356umol)的小瓶。在搅拌下加入无水DMA(5mL)，并将溶液在冰水浴中冷却至0℃。然后加入DIEA(130uL，712umol)，并将反应在0℃搅拌10分钟。加入四氢吡喃-2,6-二酮(81mg，712umol)，然后去除冰浴。将反应在25℃搅拌1小时。LC-MS(ES8396-4-P1A，产物：RT＝1.08分钟)显示化合物6被完全消耗，并且检测到一个具有期望的质量的主峰。将混合物用5mL水稀释，然后通过制备型HPLC(中性条件)纯化。得到作为白色固体的化合物7-2(330mg，产率75％)。
用于制备化合物8的一般程序
在氮气中，向在无水DMA(4.5mL)和DCM(1.5mL)中的化合物7-2(330mg，267umol)中加入HOSu(92mg，800umol)，并在0℃(使用冰浴)搅拌10分钟。然后，将EDCI(154mg，800umol)加入到混合物中，并在25℃再搅拌16小时。LC-MS(ES8396-5-P1A，产物：RT＝1.15分钟)显示化合物7-2被完全消耗，并且检测到一个具有期望的质量的主峰。将所得的反应混合物用5mL水稀释，然后通过制备型HPLC(中性条件)纯化。得到作为白色固体的化合物8(250mg，产率70％)。
用于制备化合物BT17BDC68的一般程序
使用氮气球吹扫50mL圆底烧瓶，其中含有BICY-NH2 17-69-07-N451(80.0mg，30umol)的DMA(4mL)溶液。然后，加入DIEA(20uL，114umol)并在25℃搅拌10分钟。然后加入化合物8(40mg，30umol)，并将反应在正(positive)氮气氛中在25℃搅拌18小时。LC-MS(ES6635-127-P1A1，产物：RT＝1.06分钟)显示化合物8被完全消耗，并且检测到一个具有期望的MS的主峰。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化所得的反应混合物。得到作为白色固体的BT17BDC68(33.9mg，产率29％)。
实施例10
如本文之前所描述，测量上面制备的双环肽-药物缀合物对MT1-MMP的体外结合亲和力。结果如下。
可以看出，在所有情况下，双环肽的结合亲和力在与MMAE缀合后得到保留。
实施例11
研究了BT17BDC-53在小鼠和人血清中的血浆稳定性。在小鼠和人血清中，发现缀合物是稳定的(在4μm浓度，T1/2大于50小时)。稳定性似乎略大于肽通过三个硫醚键与支架连接的相应缀合物的稳定性。
实施例12
如下评价上面制备的双环肽药物缀合物针对肿瘤的体内功效。
在37℃，在5％CO2和空气的气氛中，在补充有10％热灭活的胎牛血清的EMEM介质中，将HT1080肿瘤细胞在体外维持为单层培养物。通过胰蛋白酶-EDTA处理每周两次对肿瘤细胞进行常规继代培养。采集处于指数生长期生长的细胞，并将其计数用于肿瘤接种。
将BALB/c裸鼠在右侧肋下接种在0.2ml PBS中的HT1080肿瘤细胞(％×106)，用于肿瘤形成。当平均肿瘤体积达到134mm2时，将39只动物随机分配。
将BDC化合物在含有25mM组氨酸和10％蔗糖的载体缓冲液中配制成0.03mg/ml。每周两次(biw)以0.3、1、3和10mg/kg施用制剂。从第一次施用开始测量肿瘤体积和体重直至第14天。结果显示在图16-20中。
结果显示，所测试的所有五种缀合物表现出强烈的剂量依赖性肿瘤抑制。在3mg/kg和10mg/kg的剂量，肿瘤似乎被完全根除。BT17BDC53、61和68在高达10mg/kg的剂量耐受良好。BT17BDC62在高达约5mg/kg的剂量内耐受。BT17BDC59在高达3mg/kg的剂量耐受。这表明，在BT17BDC53、61和68中N末端Sar10间隔子的存在降低了缀合物的全身毒性。
上面说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文中。在不脱离本发明的范围的情况下，本发明所描述的方面和实施方案的各种修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。尽管已经结合特定的优选实施方案描述了本发明，但是应该理解，要求保护的发明不应该被不适当地限制于这些特定的实施方案。事实上，对于本领域技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改旨在落入所附权利要求的范围内。

Claims (23)

1.一种化合物，其包含经由至少一个烷基氨基键与支架连接的至少一个环状肽结构。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述环状肽结构经由至少一个硫醚键进一步连接至支架。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中所述环状肽结构通过两个或更多个烷基氨基键与支架连接。
4.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述环状肽结构为双环结构，所述双环结构包含两个位于支架上的三个键之间的肽环，中心键对于两个肽环是共同的。
5.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述支架包含(杂)芳香族部分或(杂)脂环族部分。
6.根据权利要求5所述的化合物，其中所述支架包含三取代的六元环结构，优选地其中所述支架具有3重对称轴。
7.根据权利要求5或6所述的化合物，其中所述支架包含在(杂)芳基支架的苄基位置的烷基氨基键。
8.根据权利要求5或6所述的化合物，其中所述支架包含位于(杂)芳基支架或(杂)脂环支架上相对于羰基的α或β-碳位置的烷基氨基键。
9.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述烷基氨基键通过肽的氨基酸残基形成，所述肽在其侧链中具有至少一个胺基团，优选地其中所述烷基氨基键通过残基的侧链胺基团形成，所述残基选自2,3-二氨基丙酸(Dap)、β-N-烷基-2,3-二氨基丙酸(N-AlkDap)或β-N-卤代烷基-2,3-二氨基丙酸(N-AlkDap)，其中“烷基”是指C1-C4烷基，并且合适地为甲基。
10.一种制备化合物的方法，所述化合物包含经由至少两个键与支架连接的至少一个环状肽结构，其中所述至少两个键中至少一个为烷基氨基键，所述方法包括：
提供肽，所述肽具有至少两个选自半胱氨酸、二氨基丙酸、β-N-烷基二氨基丙酸和β-N-卤代烷基二氨基丙酸的氨基酸残基，条件是所述残基中的至少一个选自二氨基丙酸、β-N-烷基二氨基丙酸和β-N-卤代烷基二氨基丙酸；
提供支架分子，所述支架分子具有至少两个反应位点用于与所述至少两个氨基酸残基的侧链基团形成烷基氨基键或硫醚键；和
在肽与支架分子之间形成所述键。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述肽在除用于形成烷基氨基键的氨基以外的亲核基团上具有保护基。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述方法包括在亲核取代反应中，使肽的胺基与具有两个或更多个离去基的支架分子反应。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中肽具有至少三个选自半胱氨酸、二氨基丙酸、β-N-烷基二氨基丙酸和β-N-卤代烷基二氨基丙酸的氨基酸残基，所述残基中的至少两个选自二氨基丙酸、β-N-烷基二氨基丙酸和β-N-卤代烷基二氨基丙酸。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述反应在式NR1R2R3的叔烷基胺非亲核碱中进行，其中R1、R2和R3独立地为C1-C5烷基。
15.根据权利要求12或14所述的方法，其中所述亲核取代反应在极性质子溶剂中进行，优选MeCN/H2O。
16.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物，其中所述化合物为药物缀合物，所述药物缀合物包含与一种或多种效应物和/或官能团缀合的环状肽结构。
17.根据权利要求16所述的化合物，其中所述效应物和/或官能团包含细胞毒性剂或金属螯合剂。
18.根据权利要求17所述的药物缀合物，其中所述细胞毒性剂通过可裂解键如二硫键与环状肽结构连接。
19.根据权利要求17或18所述的药物缀合物，其中所述细胞毒性剂选自DM1或MMAE。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的药物缀合物，其中所述药物缀合物具有以下结构：
其中：R1、R2、R3和R4表示氢或C1-C6烷基；
毒素是指任何合适的细胞毒性剂；
双环表示环状肽结构；
n表示选自1至10的整数；和
m表示选自0至10的整数。
21.根据权利要求20所述的药物缀合物，其中：R1、R2、R3和R4均为H；或者R1、R2、R3均为H且R4＝甲基；或者R1、R2＝甲基且R3、R4＝H；或者R1、R3＝甲基且R2、R4＝H；或者R1、R2＝H且R3、R4＝C1-C6烷基。
22.根据权利要求17至19中任一项所述的药物缀合物，其中所述药物缀合物具有以下结构：
23.根据权利要求17至19中任一项所述的药物缀合物，其中所述药物缀合物具有以下结构：
其中(alk)为式CnH2n的直链或支链亚烷基，其中n为1至10。
CN201780086922.0A 2016-12-23 2017-12-20 具有新型键结构的肽衍生物 Pending CN110603261A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1622140.0A GB201622140D0 (en) 2016-12-23 2016-12-23 Peptide derivatives having novel linkage structures
GB1622140.0 2016-12-23
GBGB1713561.7A GB201713561D0 (en) 2017-08-23 2017-08-23 Peptide derivatives having novel linkage structures
GB1713561.7 2017-08-23
PCT/EP2017/083953 WO2018115203A1 (en) 2016-12-23 2017-12-20 Peptide derivatives having novel linkage structures

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110603261A true CN110603261A (zh) 2019-12-20

Family

ID=61007653

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780086922.0A Pending CN110603261A (zh) 2016-12-23 2017-12-20 具有新型键结构的肽衍生物

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11730819B2 (zh)
EP (1) EP3559018A1 (zh)
JP (2) JP2020502238A (zh)
CN (1) CN110603261A (zh)
WO (1) WO2018115203A1 (zh)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS61853B1 (sr) 2014-10-29 2021-06-30 Bicyclerd Ltd Biciklični peptidni ligandi specifični za mt1-mmp
GB201607827D0 (en) 2016-05-04 2016-06-15 Bicycle Therapeutics Ltd Bicyclic peptide-toxin conjugates specific for MT1-MMP
EP3559018A1 (en) 2016-12-23 2019-10-30 Bicyclerd Limited Peptide derivatives having novel linkage structures
EP3615550A1 (en) 2017-04-27 2020-03-04 BicycleTx Limited Bicyclic peptide ligands and uses thereof
JP7301757B2 (ja) 2017-06-26 2023-07-03 バイスクルアールディー・リミテッド 検出可能部分を持つ二環式ペプチドリガンドおよびその使用
CN111183147B (zh) 2017-08-04 2024-07-05 拜斯科技术开发有限公司 Cd137特异性的双环肽配体
TWI825046B (zh) 2017-12-19 2023-12-11 英商拜西可泰克斯有限公司 Epha2特用之雙環胜肽配位基
GB201721265D0 (en) 2017-12-19 2018-01-31 Bicyclerd Ltd Bicyclic peptide ligands specific for EphA2
CA3091775A1 (en) 2018-02-23 2019-08-29 Bicycletx Limited Multimeric bicyclic peptide ligands
US11180531B2 (en) 2018-06-22 2021-11-23 Bicycletx Limited Bicyclic peptide ligands specific for Nectin-4
GB201810329D0 (en) * 2018-06-22 2018-08-08 Bicycletx Ltd Peptide ligands for binding to integrin avB3
GB201810327D0 (en) * 2018-06-22 2018-08-08 Bicycletx Ltd Peptide ligands for binding to IL-17
GB201810316D0 (en) 2018-06-22 2018-08-08 Bicyclerd Ltd Peptide ligands for binding to EphA2
GB201810325D0 (en) * 2018-06-22 2018-08-08 Bicycletx Ltd Peptide ligands for binding to PSMA
GB201810320D0 (en) * 2018-06-22 2018-08-08 Bicycletx Ltd Peptide ligands for binding to CD38
CN112955459A (zh) * 2018-10-23 2021-06-11 拜斯科技术开发有限公司 双环肽配体和其用途
GB201820295D0 (en) 2018-12-13 2019-01-30 Bicyclerd Ltd Bicyclic peptide ligands specific for MT1-MMP
GB201820325D0 (en) 2018-12-13 2019-01-30 Bicyclerd Ltd Bicyclic peptide ligands specific for psma
GB201820288D0 (en) 2018-12-13 2019-01-30 Bicycle Tx Ltd Bicycle peptide ligaands specific for MT1-MMP
JP2022514618A (ja) 2018-12-21 2022-02-14 バイスクルテクス・リミテッド Ｐｄ－ｌ１に特異的な二環式ペプチドリガンド
GB201900529D0 (en) 2019-01-15 2019-03-06 Bicycletx Ltd Bicyclic peptide ligands specific for CD38
US11613560B2 (en) 2019-05-09 2023-03-28 Bicycletx Limited Bicyclic peptide ligands specific for OX40
TWI869398B (zh) 2019-05-10 2025-01-11 英商拜西克爾德有限公司 治療癌症之方法
EP3967704A4 (en) * 2019-06-11 2022-08-31 FUJIFILM Corporation CYCLIC PEPTIDE, CELLULAR SCAFFOLDING MATERIAL, CELL SEPARATION MATERIAL AND CULTURE MEDIUM
TWI862640B (zh) 2019-07-30 2024-11-21 英商拜西可泰克斯有限公司 異質雙環肽複合物
CN116348476A (zh) 2020-08-03 2023-06-27 拜斯科技术开发有限公司 基于肽的接头
CN117062842A (zh) * 2021-01-19 2023-11-14 昆士兰医学研究所理事会 新型双环肽
CA3229976A1 (en) * 2021-09-03 2023-03-09 Bicycletx Limited Synthesis of bicycle toxin conjugates, and intermediates thereof
GB202114282D0 (en) * 2021-10-06 2021-11-17 Bicyclerd Ltd Bicyclic peptide ligand drug conjugates
WO2025046244A1 (en) * 2023-09-01 2025-03-06 Bicycletx Limited Tlr3 binding bicyclic peptide ligands
GB202313403D0 (en) 2023-09-01 2023-10-18 Bicycletx Ltd Polypeptide screening

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1997402A (zh) * 2004-05-19 2007-07-11 梅达莱克斯公司 化学连接基团及其缀合物
WO2009098450A2 (en) * 2008-02-05 2009-08-13 Medical Research Council Methods and compositions
WO2014190257A2 (en) * 2013-05-23 2014-11-27 Ohio State Innovation Foundation Chemical synthesis and screening of bicyclic peptide libraries
WO2015179691A2 (en) * 2014-05-21 2015-11-26 Ohio State Innovation Foundation Cell penetrating peptides and methods of making and using thereof
WO2016067035A1 (en) * 2014-10-29 2016-05-06 Bicycle Therapeutics Limited Bicyclic peptide ligands specific for mt1-mmp

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4709016A (en) 1982-02-01 1987-11-24 Northeastern University Molecular analytical release tags and their use in chemical analysis
US4650750A (en) 1982-02-01 1987-03-17 Giese Roger W Method of chemical analysis employing molecular release tag compounds
US5516931A (en) 1982-02-01 1996-05-14 Northeastern University Release tag compounds producing ketone signal groups
US5650270A (en) 1982-02-01 1997-07-22 Northeastern University Molecular analytical release tags and their use in chemical analysis
DE60037345T2 (de) 1999-12-10 2008-11-13 Pfizer Products Inc., Groton Pyrrolo(2,3-d)pyrimidin-Verbindungen
PE20020354A1 (es) 2000-09-01 2002-06-12 Novartis Ag Compuestos de hidroxamato como inhibidores de histona-desacetilasa (hda)
ES2280530T3 (es) 2001-04-27 2007-09-16 Zenyaku Kogyo Kabushiki Kaisha Compuesto heterociclico y agente antitumoral que contiene el mismo como principio activo.
TWI329105B (en) 2002-02-01 2010-08-21 Rigel Pharmaceuticals Inc 2,4-pyrimidinediamine compounds and their uses
HUE026218T2 (en) 2002-02-21 2016-05-30 Inst Virology MN / CA IX-Specific Monoclonal Antibodies and Methods for MN / CA IX Deficient Mice
ES2319894T3 (es) 2002-08-14 2009-05-14 Silence Therapeutics Aktiengesellschaft Uso de la proteina quinasa-n-beta.
JP2006514104A (ja) * 2002-12-12 2006-04-27 テル アヴィヴ ユニヴァーシティ フューチャー テクノロジー ディヴェロップメント エル．ピー． グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３阻害剤
EP1452868A2 (en) 2003-02-27 2004-09-01 Pepscan Systems B.V. Method for selecting a candidate drug compound
JP2006523237A (ja) 2003-04-03 2006-10-12 セマフォア ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｐｉ−３キナーゼインヒビタープロドラッグ
EP2371835A1 (en) 2003-07-03 2011-10-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Inhibition of syk kinase expression
LT2612862T (lt) 2004-05-13 2017-01-25 Icos Corporation Chinazolinonai kaip žmogaus fosfatidilinozitol-3-kinazės delta inhibitoriai
US7449458B2 (en) 2005-01-19 2008-11-11 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Prodrugs of 2,4-pyrimidinediamine compounds and their uses
PT1844337E (pt) 2005-01-24 2014-04-03 Pepscan Systems Bv Compostos ligantes, compostos imunogénicos e peptidomiméticos
GB0510390D0 (en) 2005-05-20 2005-06-29 Novartis Ag Organic compounds
US7402325B2 (en) 2005-07-28 2008-07-22 Phoenix Biotechnology, Inc. Supercritical carbon dioxide extract of pharmacologically active components from Nerium oleander
NZ594630A (en) 2005-10-07 2013-04-26 Exelixis Inc N-(3-amino-quinoxalin-2-yl)-sulfonamide derivatives and their use as phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors
AU2006309013B2 (en) 2005-11-01 2012-06-28 Impact Biomedicines, Inc. Bi-aryl meta-pyrimidine inhibitors of kinases
HUE025173T2 (hu) 2005-12-13 2016-01-28 Incyte Corp Heteroaril-szubsztituált pirrollo[2,3-b]piridinek és pirrolo[2,3-b]pirimidinek mint Janus-kináz inhibitorok
JO2660B1 (en) 2006-01-20 2012-06-17 نوفارتيس ايه جي Pi-3 inhibitors and methods of use
WO2007093836A1 (en) 2006-02-13 2007-08-23 Cellectis Meganuclease variants cleaving a dna target sequence from a xp gene and uses thereof
PT2024372E (pt) 2006-04-26 2010-09-16 Hoffmann La Roche Derivado de tieno[3,2-d]pirimidina útil como inibidor de pi3k
EP2526934B1 (en) 2006-09-22 2015-12-09 Pharmacyclics LLC Inhibitors of bruton's tyrosine kinase
CN101232326B (zh) 2007-01-22 2012-01-11 中兴通讯股份有限公司 用于无源光网络系统的动态带宽分配装置及其实现方法
KR101737753B1 (ko) 2007-03-12 2017-05-18 와이엠 바이오사이언시즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 페닐 아미노 피리미딘 화합물 및 이의 용도
PE20090717A1 (es) 2007-05-18 2009-07-18 Smithkline Beecham Corp Derivados de quinolina como inhibidores de la pi3 quinasa
CN101497878B (zh) 2008-01-30 2012-11-07 房学迅 特异性高效亲和膜ⅰ型基质金属蛋白酶(mt1-mmp)的多肽、蛋白及其应用
KR101595138B1 (ko) * 2008-02-27 2016-02-18 예다 리서치 앤드 디벨럽먼트 캄파니 리미티드 괴사종양의 광역학요법 및 영상용 알지디(박테리오)클로로필 컨쥬게이트
HUE029767T2 (en) 2008-03-11 2017-04-28 Incyte Holdings Corp JAK inhibitor azetidine and cyclobutane derivatives
US8293714B2 (en) * 2008-05-05 2012-10-23 Covx Technology Ireland, Ltd. Anti-angiogenic compounds
FR2932189A1 (fr) 2008-06-10 2009-12-11 Commissariat Energie Atomique Biopuces pour la detection de l'activite enzymatique d'une enzyme protease
US8338439B2 (en) 2008-06-27 2012-12-25 Celgene Avilomics Research, Inc. 2,4-disubstituted pyrimidines useful as kinase inhibitors
GB0913775D0 (en) 2009-08-06 2009-09-16 Medical Res Council Multispecific peptides
GB0914110D0 (en) 2009-08-12 2009-09-16 Medical Res Council Peptide libraries
AU2012320407B2 (en) 2011-10-07 2017-04-20 Bicyclerd Limited Modulation of structured polypeptide specificity
EP2897935B1 (en) * 2012-09-24 2019-02-27 MedImmune Limited Amino acid derivatives
US20140274759A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Bicycle Therapeutics Limited Modification of polypeptides
GB201306623D0 (en) 2013-04-11 2013-05-29 Bicycle Therapeutics Ltd Modulation of structured polypeptide specificity
CA2927554C (en) 2013-10-28 2022-11-29 Bicycle Therapeutics Limited Novel polypeptides
CN105940002B (zh) 2014-02-03 2018-09-25 生命医药公司 ROR-γ的二氢吡咯并吡啶抑制剂
GB201600911D0 (en) 2016-01-18 2016-03-02 Bicycle Therapeutics Ltd Stabilized peptide derivatives
GB201607827D0 (en) 2016-05-04 2016-06-15 Bicycle Therapeutics Ltd Bicyclic peptide-toxin conjugates specific for MT1-MMP
US10441663B2 (en) 2016-11-27 2019-10-15 Bicyclerd Limited Methods for treating cancer
EP3559018A1 (en) 2016-12-23 2019-10-30 Bicyclerd Limited Peptide derivatives having novel linkage structures
AU2017383008B2 (en) 2016-12-23 2022-02-17 Bicycletx Limited Peptide ligands for binding to MT1-MMP
US10624968B2 (en) 2017-01-06 2020-04-21 Bicyclerd Limited Compounds for treating cancer
GB201706477D0 (en) 2017-04-24 2017-06-07 Bicycle Therapeutics Ltd Modification of polypeptides
EP3615550A1 (en) 2017-04-27 2020-03-04 BicycleTx Limited Bicyclic peptide ligands and uses thereof
JP7301757B2 (ja) 2017-06-26 2023-07-03 バイスクルアールディー・リミテッド 検出可能部分を持つ二環式ペプチドリガンドおよびその使用
WO2019034868A1 (en) 2017-08-14 2019-02-21 Bicyclerd Limited CONJUGATES PEPTIDE BICYCLIC-LIGAND PPR-A AND USES THEREOF
EP3668887A1 (en) 2017-08-14 2020-06-24 Bicyclerd Limited Bicyclic peptide ligand sting conjugates and uses thereof
TWI825046B (zh) 2017-12-19 2023-12-11 英商拜西可泰克斯有限公司 Epha2特用之雙環胜肽配位基
CA3091775A1 (en) 2018-02-23 2019-08-29 Bicycletx Limited Multimeric bicyclic peptide ligands
JP7551500B2 (ja) 2018-04-04 2024-09-17 バイスクルテクス・リミテッド ヘテロタンデム二環式ペプチド複合体
GB201810327D0 (en) 2018-06-22 2018-08-08 Bicycletx Ltd Peptide ligands for binding to IL-17
GB201810320D0 (en) 2018-06-22 2018-08-08 Bicycletx Ltd Peptide ligands for binding to CD38
GB201810316D0 (en) 2018-06-22 2018-08-08 Bicyclerd Ltd Peptide ligands for binding to EphA2
GB201810325D0 (en) 2018-06-22 2018-08-08 Bicycletx Ltd Peptide ligands for binding to PSMA
GB201810329D0 (en) 2018-06-22 2018-08-08 Bicycletx Ltd Peptide ligands for binding to integrin avB3
CN112955459A (zh) 2018-10-23 2021-06-11 拜斯科技术开发有限公司 双环肽配体和其用途
AU2019370807A1 (en) 2018-10-30 2021-05-20 Bicyclerd Limited BT1718 for use in treating cancer
KR20210123295A (ko) 2018-12-13 2021-10-13 바이사이클티엑스 리미티드 Mt1-mmp에 특이적인 이환식 펩티드 리간드
GB201820295D0 (en) 2018-12-13 2019-01-30 Bicyclerd Ltd Bicyclic peptide ligands specific for MT1-MMP
GB201820288D0 (en) 2018-12-13 2019-01-30 Bicycle Tx Ltd Bicycle peptide ligaands specific for MT1-MMP
WO2020165600A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Bicycletx Limited Bicyclic peptide ligand sting conjugates and uses thereof
EP3935069A1 (en) 2019-03-04 2022-01-12 Bicyclerd Limited Synthesis of bicycle toxin conjugates, and intermediates thereof
TWI869398B (zh) 2019-05-10 2025-01-11 英商拜西克爾德有限公司 治療癌症之方法
EP4045075A1 (en) 2019-10-16 2022-08-24 Bicyclerd Limited Methods for treating cancer
CN116348476A (zh) 2020-08-03 2023-06-27 拜斯科技术开发有限公司 基于肽的接头

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1997402A (zh) * 2004-05-19 2007-07-11 梅达莱克斯公司 化学连接基团及其缀合物
WO2009098450A2 (en) * 2008-02-05 2009-08-13 Medical Research Council Methods and compositions
US20100317547A1 (en) * 2008-02-05 2010-12-16 Medical Research Council Methods and compositions
WO2014190257A2 (en) * 2013-05-23 2014-11-27 Ohio State Innovation Foundation Chemical synthesis and screening of bicyclic peptide libraries
WO2015179691A2 (en) * 2014-05-21 2015-11-26 Ohio State Innovation Foundation Cell penetrating peptides and methods of making and using thereof
WO2016067035A1 (en) * 2014-10-29 2016-05-06 Bicycle Therapeutics Limited Bicyclic peptide ligands specific for mt1-mmp

Also Published As

Publication number Publication date
US11730819B2 (en) 2023-08-22
WO2018115203A8 (en) 2022-04-07
JP2020502238A (ja) 2020-01-23
EP3559018A1 (en) 2019-10-30
US20200316209A1 (en) 2020-10-08
JP2023156340A (ja) 2023-10-24
WO2018115203A1 (en) 2018-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11730819B2 (en) Peptide derivatives having novel linkage structures
EP3192802A1 (en) Stabilized peptide derivatives
US9670482B2 (en) Multispecific peptides
DK2464727T3 (en) PEPTIDE LIBRARIES
US11946041B2 (en) Modification of polypeptides
US20140274759A1 (en) Modification of polypeptides
JP2013518807A (ja) 多重特異性ペプチド
JP2013518558A (ja) 構造化されたペプチドプロセシング
US12351619B2 (en) Serum albumin-binding fibronectin type III domains and uses thereof
EP3192801A1 (en) Peptides derivatives
JP2015214568A (ja) 多重特異性ペプチド

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20220524

Address after: Britain Camb

Applicant after: Bicycletx Ltd.

Address before: Britain Camb

Applicant before: BICYCLE THERAPEUTICS LTD.

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20191220