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CN116348476A - 基于肽的接头 - Google Patents

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CN116348476A
CN116348476A CN202180067973.5A CN202180067973A CN116348476A CN 116348476 A CN116348476 A CN 116348476A CN 202180067973 A CN202180067973 A CN 202180067973A CN 116348476 A CN116348476 A CN 116348476A
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glu
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K·麦克道尔
P·贝斯维克
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Abstract

本发明涉及新型接头，其包含两个或三个碱性、酸性或疏水性天然氨基酸或非天然氨基酸。本发明还涉及包含所述接头的药物缀合物，包含所述药物缀合物的药物组合物，以及所述药物缀合物在预防、抑制或治疗癌症中的用途。

Description

基于肽的接头
技术领域
本发明涉及新型接头，其包含两个或三个碱性、酸性或疏水性天然氨基酸或非天然氨基酸。本发明还涉及包含所述接头的药物缀合物，包含所述药物缀合物的药物组合物，以及所述药物缀合物在预防、抑制或治疗癌症中的用途。
背景技术
含有结合剂(即肽、抗体等)缀合物和细胞毒性剂的癌症治疗复合物已经评估了多年。该概念涉及将结合剂配置为与靶标(通常是癌细胞上的表位)结合，并且细胞毒性剂的存在旨在作为破坏癌细胞的有效载荷(payload)。然而，这些药物缀合物的合成通常涉及在结合剂和细胞毒性剂之间并入接头，并且在施用于受试者后，经常对该接头进行成熟前切割，即由识别接头序列的其它蛋白酶进行切割。这种切割导致细胞毒性剂在与癌症靶标结合之前释放，并增加不良副作用的风险。
许多研究小组试图解决该问题。例如，WO 98/19705描述了支链肽接头的存在，所述支链肽接头含有两个或更多个提供酶切割位点的氨基酸部分。US 2017/360952描述了一种接头，所述接头在细胞结合剂和细胞毒性剂之间具有含叠氮化物的非天然氨基酸。US2016/046721描述了包含Val-Cit接头的抗体-药物缀合物。US 2015/087810描述了抗体和毒素的缀合物，其具有含有1至20个氨基酸的接头。
因此，需要提供可选的接头，其允许细胞毒性剂在与靶标结合的部位处或附近选择性切割，并导致所得缀合物的稳定性增加。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种包含-P1-P2-P3-部分的接头，其中：
P1表示碱性非天然氨基酸或其衍生物；
P2表示疏水性氨基酸或疏水性非天然氨基酸；并且
P3不存在或表示酸性氨基酸或酸性非天然氨基酸，使得当P1表示Cit且P2表示Val时，P3必须表示酸性非天然氨基酸。
根据本发明的进一步的方面，提供了一种药物缀合物，其包含与靶标结合的结合剂和细胞毒性剂，其中所述结合剂通过如本文所述的接头与所述细胞毒性剂连接。
根据本发明的进一步的方面，提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的药物缀合物，与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合。
根据本发明的进一步的方面，提供了如本文所述的药物缀合物用于预防、抑制或治疗癌症的用途。
附图说明
图1：BCY7761在小鼠血浆中的药代动力学分析。
图2：BCY10980在小鼠血浆中的药代动力学分析。
图3：BCY10981在小鼠血浆中的药代动力学分析。
图4：BCY10989在小鼠血浆中的药代动力学分析。
图5：BCY10984在小鼠血浆中的药代动力学分析。
图6：BCY10985在小鼠血浆中的药代动力学分析。
图7：BCY10984在大鼠血浆中的药代动力学分析。
图8：BCY7761在大鼠血浆中的药代动力学分析。
图9：BCY10984的肿瘤减少效力。
图10：BCY7761的肿瘤减少效力。
图11至图15：BCY10984和BCY7761的毒素水平分析。
图16：将BCY10984和BCY12951施用于荷有HT1080肿瘤的雌性BALB/c裸鼠后的肿瘤体积跟踪。误差棒表示平均值的标准误(SEM)。
图17：来自实施例6的结果显示，来自第5组和第6组的小鼠(用45μMBCY10984给药)表现出对肿瘤生长的强效抑制。
具体实施方式
接头
根据本发明的第一方面，提供了一种包含-P1-P2-P3-部分的接头，其中：
P1表示碱性非天然氨基酸或其衍生物；
P2表示疏水性氨基酸或疏水性非天然氨基酸；并且
P3不存在或表示酸性氨基酸或酸性非天然氨基酸，使得当P1表示Cit且P2表示Val时，P3必须表示酸性非天然氨基酸。
因此，本发明涉及含有2个或3个氨基酸的接头分子，其需要存在至少一个非天然氨基酸，以及-碱性-疏水性-基序或-碱性-疏水性-酸性-基序之一。
与Cit-Val对照接头相比，如实施例1中表现出延长的半衰期所证明的那样，本发明的接头分子提供了增加血浆稳定性的优点。此外，本发明的接头分子提供了根据需求将CatB切割速率调整至所需水平的能力(参见实施例2)。此外，如实施例3所证明的那样，本发明的接头分子提供了调节双环肽毒素缀合物的血浆蛋白结合能力的能力。此外，如实施例4所示的小鼠和大鼠的药代动力学研究所证明的那样，本发明的接头分子表现出延长的半衰期和血浆中较低的游离毒素的相对水平。此外，与Cit-Val参考双环肽毒素缀合物(BTC)相比，本发明的一个示例接头分子(BCY10984)在肿瘤体积减少方面表现出更高的效力(参见图9和图10以及实施例5)。此外，与Cit-Val参考双环肽毒素缀合物(BTC)相比，使用本发明的一个示例接头分子(BCY10984)时，观察到肿瘤中的毒素水平更高(参见图11至图15和实施例5)。
本文所提及的“碱性非天然氨基酸或其衍生物”是指除了20种标准天然氨基酸以外的具有碱性特性的任何氨基酸。在中性pH下含有碱性侧链的非天然氨基酸在术语“碱性”的范围内。此类碱性非天然氨基酸通常是极性的，并且在pH值低于其pKa时带正电，并且非常亲水。
在一个实施方案中，P1表示选自以下的碱性非天然氨基酸：2-氨基-4-胍基丁酸(Agb)；2-氨基-4-(3-甲基胍基)丁酸(Agb(Me))；2,4-二氨基丁酸(Dab)；2,3-二氨基丙酸(Dap)；2-氨基-3-胍基丙酸(Dap(CNNH2))；和瓜氨酸(Cit)。在进一步的实施方案中，P1表示瓜氨酸(Cit)。
本文中提及的术语“疏水性氨基酸或疏水性非天然氨基酸”包括任何氨基酸，包括具有疏水性特性的20种标准天然氨基酸和任何非天然氨基酸。天然氨基酸和含有疏水性侧链的非天然氨基酸(即那些不喜欢存在于水的(即水)环境中的氨基酸)两者均在术语“疏水性”的范围内。
在一个实施方案中，P2表示选自以下的疏水性氨基酸：Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp和Val，或选自环丁基、二苯丙氨酸(Dpa)、1-萘基丙氨酸(1Nal)、2-萘基丙氨酸(2Nal)和甲基色氨酸(Trp(Me))的疏水性非天然氨基酸，如选自Val的疏水性氨基酸或选自环丁基、Dpa、1Nal和2Nal的非天然氨基酸。在进一步的实施方案中，P2表示1-萘基丙氨酸(1Nal)。
本文中提及的术语“酸性氨基酸或酸性非天然氨基酸”包括任何氨基酸，其包括具有酸性特性的20种标准天然氨基酸和任何非天然氨基酸。在中性pH下含有酸性侧链的天然氨基酸和非天然氨基酸两者在术语“酸性”的范围内。通常，它们的侧链具有羧酸基团，其pKa足够低以失去质子，在此过程中带负电。
在一个实施方案中，P3不存在。在替代实施方案中，P3表示选自Asp和Glu的酸性氨基酸。在进一步的实施方案中，P3表示Glu。
在一个实施方案中，-P1-P2-P3-部分表示：
Figure BDA0004159193090000031
Figure BDA0004159193090000041
在进一步的实施方案中，-P1-P2-P3-部分表示：Cit-1Nal-Glu(BCY10984)。
药物缀合物
根据本发明的进一步的方面，提供了一种药物缀合物，其包含与靶标结合的结合剂和细胞毒性剂，其中所述结合剂通过如本文所定义的接头与所述细胞毒性剂连接。
在一个实施方案中，所述结合剂是肽，如抗体或双环肽，特别是双环肽。
双环肽
对于本领域技术人员将显而易见的是，肽和抗体是本领域公认的术语，然而，本文中提及的双环肽(或双环(Bicycle))旨在指通过三个反应性氨基酸基团(即半胱氨酸残基)的环化而具有两个环的肽序列。在2009年通过基于噬菌体展示的组合方法鉴定了这些双环肽，以生成和筛选针对感兴趣的靶标的双环肽的大型文库(Heinis等人(2009)，Nat ChemBiol 5(7)，502-7和WO 2009/098450)。期望地，双环肽将被配置为与抗癌靶标结合。结合癌细胞的双环肽的合适示例包括描述于以下的那些双环肽：WO 2016/067035(结合MT1-MMP的双环肽)、WO 2017/191460(结合MT1-MMP的双环肽)、WO 2019/025811(结合CD137的双环肽)、PCT/GB2018/053675(结合EphA2的双环肽)、PCT/GB2018/053676(结合EphA2的双环肽)、PCT/GB2018/053678(结合EphA2的双环肽)、PCT/GB2019/050485(结合CD137的双环肽)、PCT/GB2019/051740(结合粘连蛋白-4(Nectin-4)的双环肽)和PCT/GB2019/051741(结合粘连蛋白-4的双环肽)，通过引用将所述文献中公开的双环肽并入本文。
如本文所提及的双环肽是指与分子支架共价结合的肽。通常，这样的肽包含两个或更多个能够与支架形成共价键的反应性基团(即半胱氨酸残基)，和在所述反应性基团之间对向(subtend)存在的序列，所述序列因为当肽与支架结合时形成环而被称为环序列。在当前的情况下，肽包含至少三个半胱氨酸残基并在支架上形成至少两个环。
分子支架
在一个实施方案中，双环肽与非芳香族分子支架共价结合。本文提及的术语“非芳香族分子支架”是指不包含芳香族(即不饱和)碳环或杂环系统的如本文所定义的任何分子支架。
非芳香族分子支架的合适示例描述于Heinis等人(2014)，Angewandte Chemie,International Edition 53(6)，1602-1606中。
如前述文档中所提及的，分子支架可以是小分子，如有机小分子。
在一个实施方案中，分子支架可以是大分子。在一个实施方案中，分子支架是由氨基酸、核苷酸或碳水化合物组成的大分子。
在一个实施方案中，分子支架包含能够与多肽的官能团反应以形成共价键的反应性基团。
分子支架可以包含与肽形成键的化学基团，如胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、烯烃、炔烃、叠氮化物、酸酐、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、烷基卤和酰基卤。
含有αβ-不饱和羰基的化合物的示例是1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)(Angewandte Chemie,International Edition(2014)，53(6)，1602-1606)。
在可选的实施方案中，双环肽与芳香族分子支架共价结合。本文提及的术语“芳香族分子支架”是指包含芳香族碳环或杂环系统的如本文所定义的任何分子支架。
将理解的是，芳香族分子支架可以包含芳香族部分。芳香族支架内合适的芳香族部分的示例包括联苯撑、三苯撑、萘或蒽。
还将理解的是，芳香族分子支架可以包含杂芳族部分。芳香族支架内合适的杂芳族部分的示例包括吡啶、嘧啶、吡咯、呋喃和噻吩。
还将理解的是，芳香族分子支架可以包含卤甲基芳烃部分，如双(溴甲基)苯、三(溴甲基)苯、四(溴甲基)苯或其衍生物。
芳香族分子支架的非限制性示例包括：双-、三-或四(卤甲基)苯；双-、三-或四(卤甲基)吡啶；双-、三-或四(卤甲基)哒嗪；双-、三-或四(卤甲基)嘧啶；双-、三-或四(卤甲基)吡嗪；双-、三-或四(卤甲基)-1,2,3-三嗪；双-、三-或四-(卤甲基)-1,2,4-三嗪；双-、三-或四(卤甲基)吡咯、-呋喃、-噻吩；双-、三-或四(卤甲基)咪唑、-噁唑、-噻唑；双-、三-或四(卤甲基)-3H-吡唑、-异噁唑、-异噻唑；双-、三-或四(卤甲基)联苯撑；双-、三-或四(卤甲基)三苯撑；1,8-双(卤甲基)萘；双-、三-或四(卤甲基)蒽；以及双-、三-或四(2-卤甲基苯基)甲烷。
芳香族分子支架的更具体的示例包括：1,2-双(卤甲基)苯；3,4-双(卤甲基)吡啶；3,4-双(卤甲基)哒嗪；4,5-双(卤甲基)嘧啶；4,5-双(卤甲基)吡嗪；4,5-双(卤甲基)-1,2,3-三嗪；5,6-双(卤甲基)-1,2,4-三嗪；3,4-双(卤甲基)吡咯、-呋喃、-噻吩和其它区域异构体；4,5-双(卤甲基)咪唑、-噁唑、-噻唑；4,5-双(卤甲基)-3H-吡唑、-异噁唑、-异噻唑；2,2'-双(卤甲基)联苯撑；2,2"-双(卤甲基)三苯撑；1,8-双(卤甲基)萘；1,10-双(卤甲基)蒽；双(2-卤甲基苯基)甲烷；1,2,3-三(卤甲基)苯；2,3,4-三(卤甲基)吡啶；2,3,4-三(卤甲基)哒嗪；3,4,5-三(卤甲基)嘧啶；4,5,6-三(卤甲基)-1,2,3-三嗪；2,3,4-三(卤甲基)吡咯、-呋喃、-噻吩；2,4,5-双(卤甲基)咪唑、-噁唑、-噻唑；3,4,5-双(卤甲基)-1H-吡唑、-异噁唑、-异噻唑；2,4,2'-三(卤甲基)联苯撑；2,3',2"-三(卤甲基)三苯撑；1,3,8-三(卤甲基)萘；1,3,10-三(卤甲基)蒽；双(2-卤甲基苯基)甲烷；1,2,4,5-四(卤甲基)苯；1,2,4,5-四(卤甲基)吡啶；2,4,5,6-四(卤甲基)嘧啶；2,3,4,5-四(卤甲基)吡咯、-呋喃、-噻吩；2,2',6,6'-四(卤甲基)联苯撑；2,2",6,6"-四(卤甲基)三苯撑；2,3,5,6-四(卤甲基)萘和2,3,7,8-四(卤甲基)蒽；以及双(2,4-双(卤甲基)苯基)甲烷。
在一个实施方案中，分子支架可以包含三(溴甲基)苯(尤其是1,3,5-三(溴甲基)苯(“TBMB”))或其衍生物，或可以由以上组成。
在一个实施方案中，分子支架是2,4,6-三(溴甲基)均三甲苯。该分子类似于1,3,5-三(溴甲基)苯，但含有三个附接于苯环的额外的甲基。这具有的优点是，额外的甲基可以与多肽形成进一步接触并因此增加额外的结构约束。
本发明的分子支架含有允许本发明编码文库的多肽的官能团与分子支架形成共价键的化学基团。所述化学基团选自范围广泛的官能团，包括胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、烯烃、炔烃、酸酐、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、叠氮化物、烷基卤和酰基卤。
可以用于分子支架以与半胱氨酸的硫醇基团反应的支架反应性基团是烷基卤(或者也称为卤代烃或卤代烷)。
示例包括溴甲基苯(以TBMB为例的支架反应性基团)或碘乙酰胺。用于选择性地将化合物与蛋白质中的半胱氨酸偶联的其它支架反应性基团是马来酰亚胺、含有αβ-不饱和羰基的化合物和含有α-卤甲基羰基的化合物。可以用作本发明的分子支架的马来酰亚胺的示例包括：三-(2-马来酰亚胺乙基)胺、三-(2-马来酰亚胺乙基)苯、三-(马来酰亚胺)苯。含有α-卤甲基羰基化合物的示例是N,N',N”-(苯-1,3,5-三基)三(2-溴乙酰胺)。硒代半胱氨酸也是天然氨基酸，其与半胱氨酸具有相似的反应性并且可以用于相同的反应。因此，无论在何处提及半胱氨酸，除非上下文另有说明，否则通常可以接受取代硒代半胱氨酸。
合成
双环肽可以通过标准技术合成制造，然后与分子支架在体外反应。进行此过程时，可以使用标准化学方法。这使得能够快速大规模地制备可溶性材料，以用于进一步的下游实验或验证。可以使用如Timmerman等人(同上)中公开的常规化学方法来完成此类方法。
因此，本发明还涉及如本文所述的所选择的多肽的制造，其中所述制造包括如下所述的任选的进一步的步骤。在一个实施方案中，在通过化学合成制备的最终产物多肽上进行这些步骤。
也可以延伸肽，以并入例如另一个环并因此引入多种特异性。
为了延伸肽，可以使用标准固相或溶液相化学方法，使用正交保护的赖氨酸(和类似物)在肽的N-末端或C-末端或环内简单地进行化学延伸。可以使用标准(生物)缀合技术来引入活化的或可活化的N-末端或C-末端。可选地，例如，如(Dawson等人，1994，Synthesisof Proteins by Native Chemical Ligation，Science266:776-779)中所述的，可以通过片段缩合或天然化学连接进行添加；或者可以通过酶进行添加，例如使用如(Chang等人，Proc Natl Acad Sci U S A.1994年12月20日；91(26):12544-8或Hikari等人，Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters Volume 18，Issue 22，2008年11月15日，6000-6003页)中描述的变位酶(subtiligase)进行添加。
可选地，可以通过二硫键进行进一步缀合来延伸或修饰肽。这具有额外的优点，即允许第一肽和第二肽一旦在细胞的还原环境中即彼此解离。在这种情况下，可以在第一肽的化学合成过程中添加分子支架(例如TATA)以便与三个半胱氨酸基团反应；然后可以将进一步的半胱氨酸或硫醇附加至第一肽的N-末端或C-末端，使得该半胱氨酸或硫醇仅与第二肽的游离半胱氨酸或硫醇反应，形成二硫键连接的双环肽-肽缀合物。
类似的技术同等应用于两个双环且双特异性的大环的合成/偶联，潜在地产生四特异性分子。
此外，可以使用适当的化学方法，以相同的方式，在N-末端或C-末端或经由侧链进行偶联来添加其它官能团或效应子基团。在一个实施方案中，以不阻断两个实体任一个的活性的方式进行偶联。
细胞毒性剂
合适的“细胞毒性剂”的示例包括：烷基化剂，如顺铂和卡铂，以及奥沙利铂、二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺；抗代谢物，包括嘌呤类似物咪唑硫嘌呤和巯嘌呤或嘧啶类似物；植物生物碱和萜类化合物，包括长春花生物碱(如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨和长春地辛)；鬼臼毒素及其衍生物依托泊苷和替尼泊苷；紫杉烷类，包括紫杉醇(paclitaxel)，原名紫杉醇(Taxol)；拓扑异构酶抑制剂，包括喜树碱类(伊立替康和托泊替康)和II型抑制剂(包括安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷)。进一步的试剂可以包括抗肿瘤抗生素，其包括免疫抑制剂放线菌素D(其用于肾脏移植)、阿霉素、表柔比星、博来霉素、刺孢霉素(calicheamycin)及其它。
在一个实施方案中，所述细胞毒性剂选自美登素类化合物(maytansinoids)(如DM1)或单甲基澳瑞他汀类(auristatins)(如MMAE)。
DM1是一种细胞毒性剂，其为美登素的含硫醇衍生物并具有以下结构：
Figure BDA0004159193090000081
单甲基澳瑞他汀E(MMAE)是一种合成抗肿瘤剂并具有以下结构：
Figure BDA0004159193090000082
在进一步的实施方案中，所述细胞毒性剂是MMAE。
药物组合物
根据本发明的进一步的方面，提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的药物缀合物，与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合。
一般地，药物缀合物将以纯化形式与药理学上合适的赋形剂或载体(carrier)一起使用。通常，这些赋形剂或载体包括水性或醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和/或缓冲介质。肠胃外载剂(vehicle)包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠和乳酸林格氏液。如果需要使多肽复合物保持悬浮，则合适的生理学上可接受的佐剂可以选自增稠剂(如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐)。
静脉内载剂包括液体和营养补充剂和电解质补充剂，如基于林格氏右旋糖的那些。也可以存在防腐剂和其它添加剂(如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)(Mack(1982)，Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版)。
本发明的药物缀合物可以用作单独施用的组合物或与其它试剂组合。这些其它试剂可以包括抗体、抗体片段和各种免疫治疗药物(如环孢霉素、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂和免疫毒素)。药物组合物可以包括各种细胞毒性剂或其它试剂的“混合物(cocktail)”，与本发明的药物缀合物组合，或甚至与具有不同特异性的根据本发明所选择的药物缀合物(如使用不同靶标配体选择的多肽)组合，无论它们在施用前合并与否。
根据本发明的药物组合物的施用途径可以是本领域普通技术人员通常已知的任何途径。对于疗法，可以根据标准技术将本发明的药物缀合物施用于任何患者。可以通过任何合适的方式进行施用，包括肠胃外、静脉内、肌肉内、腹膜内、经皮、经由肺途径、或者适当地通过用导管直接输注进行施用。优选地，根据本发明的药物组合物将通过吸入施用。施用的剂量和频率将取决于患者的年龄、性别和状况、其它药物的同时施用、禁忌症以及临床医生要考虑的其它参数。
可以将本发明的药物缀合物冻干以储存，并在使用前在合适的载体中复溶。已经表明该技术是有效的，并且可以采用本领域已知的冻干和复溶技术。本领域技术人员将理解的是，冻干和复溶可以导致不同程度的活性损失，并且可能必须向上调节水平以进行补偿。
可以施用含有本发明的药物缀合物或其混合物的组合物以进行预防性和/或治疗性治疗。在某些治疗应用中，将足以完成所选择的细胞群体的至少部分抑制(inhibition)、抑制(suppression)、调节、杀伤或一些其它可测量参数的量定义为“治疗有效剂量”。达到该剂量所需的量将取决于疾病的严重程度和患者自身免疫系统的一般状态，但一般范围为每千克体重0.005mg至5.0mg所选择的药物缀合物，更常用的剂量为0.05mg/kg/剂至2.0mg/kg/剂。对于预防性应用，也可以以相似或稍低的剂量施用含有本发明的药物缀合物或其混合物的组合物。
含有根据本发明的药物缀合物的组合物可以用于预防性和治疗性设置，以协助改变、失活、杀伤或去除哺乳动物中所选择的靶细胞群体。另外，本文所述的药物缀合物可以在体外(extracorporeally)或体外(in vitro)选择性地用于从异质细胞集合中杀伤、消耗或以其它方式有效地去除靶细胞群体。可以将来自哺乳动物的血液与药物缀合物在体外组合，从而杀伤不期望的细胞或以其它方式将其从血液中去除，用于根据标准技术返回至哺乳动物。
治疗用途
根据本发明的进一步的方面，提供了如本文所述的药物缀合物用于预防、抑制或治疗癌症的用途。
可以治疗(或抑制)的癌症(及其良性对应物)的示例包括但不限于：上皮起源的肿瘤(腺瘤和各种类型的癌，包括腺癌、鳞状癌、移行细胞癌和其它癌)如膀胱和泌尿道癌、乳腺癌、胃肠道癌(包括食道癌、胃(胃部)癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌和肛门癌)、肝癌(肝细胞癌)、胆囊和胆道系统癌、胰腺外分泌癌、肾癌、肺癌(例如腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、支气管肺泡癌和间皮瘤)、头颈癌(例如舌癌、颊腔癌、喉癌、咽癌、鼻咽癌、扁桃体癌、唾液腺癌、鼻腔癌和鼻旁窦癌)、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、宫颈癌、子宫肌层癌、子宫内膜癌、甲状腺癌(例如甲状腺滤泡癌)、肾上腺癌、前列腺癌、皮肤和附件癌(例如黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、角膜棘皮瘤、增生性痣)；血液系统恶性肿瘤(即白血病、淋巴瘤)和血液系统癌前疾患以及边缘恶性肿瘤，包括淋巴系的血液系统恶性肿瘤和相关病症(例如急性淋巴细胞性白血病[ALL]、慢性淋巴细胞性白血病[CLL]、B细胞淋巴瘤如弥漫性大B细胞淋巴瘤[DLBCL]、滤泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和白血病、自然杀伤性[NK]细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、原因不明的单克隆免疫球蛋白增多症、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤和移植后的淋巴增生性疾患)和骨髓系的血液系统恶性肿瘤和相关病症(例如急性骨髓性白血病[AML]、慢性粒细胞性白血病[CML]、慢性骨髓单核细胞性白血病[CMML]、高嗜酸性粒细胞增多症、骨髓增生性疾患如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化、骨髓增生综合征、骨髓增生异常综合征和早幼粒细胞白血病)；间充质起源的肿瘤，例如软组织、骨或软骨的肉瘤(如骨肉瘤、纤维肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、尤因氏肉瘤、滑膜肉瘤、上皮样肉瘤、胃肠道间质瘤、良性和恶性组织细胞瘤和隆突性皮肤纤维肉瘤)；中枢或周围神经系统的肿瘤(例如星形细胞瘤、神经胶质瘤和成胶质细胞瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、松果体瘤和神经鞘瘤)；内分泌肿瘤(例如垂体瘤、肾上腺瘤、胰岛细胞瘤、甲状旁腺肿瘤、类癌瘤和甲状腺髓样癌)；眼部和附属器肿瘤(例如视网膜母细胞瘤)；生殖细胞和滋养细胞肿瘤(例如畸胎瘤、精原细胞瘤、无性细胞瘤、葡萄胎和绒毛膜癌)；以及小儿和胚胎肿瘤(例如髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、维尔姆斯瘤和原始神经外胚层肿瘤)；或先天性或其它形式的综合征，其使患者容易患恶性肿瘤(例如着色性干皮病)。
在进一步的实施方案中，癌症选自造血系统恶性肿瘤，如选自：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、伯基特淋巴瘤(BL)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性B淋巴细胞性白血病(B-CLL)、B和T急性淋巴细胞性白血病(ALL)、T细胞淋巴瘤(TCL)、急性骨髓性白血病(AML)、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤(HL)和慢性骨髓性白血病(CML)。
本文提及的术语“预防”涉及在诱导疾病之前施用保护性组合物。“抑制”是指在诱导事件之后但在疾病的临床表现之前施用组合物。“治疗”涉及在疾病症状变得明显之后施用保护性组合物。
已有可以用于筛选药物缀合物在预防或治疗疾病中的有效性的动物模型系统。本发明促进动物模型系统的使用，其允许开发可以与人和动物靶标交叉反应的药物缀合物，从而允许使用动物模型。
以下参考下列实施例进一步描述本发明。
实施例
材料与方法
肽的合成
肽的合成基于Fmoc化学方法，使用Peptide Instruments制造的Symphony肽合成仪和MultiSynTech制造的Syro II合成仪进行。使用标准的Fmoc-氨基酸(Sigma，Merck)，其带有适当的侧链保护基团：在每种情况下均使用适用的标准偶联条件，然后使用标准方法进行脱保护。使用HPLC纯化肽，并在分离后用1,3,5-三(溴甲基)苯(TBMB，Sigma)修饰所述肽。为此，将线性肽用H2O稀释至约35mL，加入约500μL的100mM TBMB的乙腈溶液，然后用5mL的1MNH4HCO3的H2O溶液引发反应。使反应在室温进行约30至60min，一旦反应完成即进行冻干(通过MALDI判断)。冻干后，如上纯化修饰的肽，同时用Gemini C18柱(Phenomenex)替换Luna C8，并将酸改为0.1％三氟乙酸。合并含有正确的TMB修饰材料的纯级分，将其冻干并在-20℃进行保存。
除非另有说明，否则所有氨基酸均以L-构型使用。
在一些情况下，在使用以下方法与毒素的游离硫醇基团偶联之前，先将肽转化为活化的二硫化物；将4-甲基(琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯)(100mM)的干燥DMSO溶液(1.25mol eq)加入肽(20mM)的干燥DMSO溶液(1mol eq)中。充分混合反应并加入DIPEA(20mol eq)。通过LC/MS监测反应直至完成。
双环缀合物的合成
一般方法
Figure BDA0004159193090000111
Figure BDA0004159193090000121
步骤(a)：肽接头化合物的固相合成
Figure BDA0004159193090000122
使用标准Fmoc化学在氯三苯甲基树脂(2mmol)上合成肽。通过将第一氨基酸与Fmoc-AA-OH(1eq)和DIEA(4eq)在DMF中的混合物孵育2小时，将所述第一氨基酸加载到树脂上。将树脂排干并洗涤，然后用MeOH处理30min。使用标准SPPS方法，用Fmoc-AA-OH(或酸性封端基团，例如叠氮乙酸)(3eq)、HBTU(2.85eq)和DIEA(6eq)建立序列的其余部分。偶联反应进行1小时。使用20％哌啶/DMF进行Fmoc脱保护30min。通过使用HFIP/DCM(20:80)孵育30min从树脂中切割肽。将粗肽干燥，不经纯化直接用于下一步。
步骤(b)：将(4-氨基苯基)甲醇加成至肽接头化合物
Figure BDA0004159193090000123
向化合物2(1.0eq)的MeOH溶液(100mg/mL)中加入EEDQ(2.0eq)和(4-氨基苯基)甲醇(2.0eq)的DCM溶液。在35℃搅拌混合物16小时。一旦完成，则减压浓缩反应混合物，并通过制备型HPLC纯化残余物。
步骤(c)：双(2,4-二硝基苯基)碳酸酯与肽接头-(4-氨基苯基)甲醇的反应
Figure BDA0004159193090000124
向化合物3(1.0eq)的DMF溶液(50mg/mL)中加入DIEA(5.0eq)和双(4-硝基苯基)碳酸酯(4.0eq)，并在25℃搅拌混合物1小时(或直至化合物3被消耗)。直接通过制备型HPLC纯化反应混合物。
步骤(d)：MMAE与肽接头化合物的缀合
Figure BDA0004159193090000131
向化合物4(1.5 eq)的DMF溶液(10 mg/mL)中加入HOBt(1.5 eq)、DIEA(5.0 eq)和MMAE(1.0 eq)。在40℃搅拌混合物16小时，直至化合物4被完全消耗。直接通过制备型HPLC纯化反应混合物。
步骤(e)：Boc保护基团的去除
Figure BDA0004159193090000132
(对于使用带有Boc保护的侧链的氨基酸合成的接头)
将含有Boc保护的胺的接头(1.0 eq)加入10％TFA/DCM(30 mg/mL)的混合物中。在0℃搅拌混合物1小时，然后减压浓缩以除去DCM。粗产物不经纯化直接用于下一步。
步骤(f)：铜催化的叠氮化物官能化毒素-接头与炔烃官能化双环的环加成反应
Figure BDA0004159193090000133
向化合物5(1.0 eq)的t-BuOH/H2O溶液(1:1，6.5 mg/mL)中加入CuSO4(0.4 M，2.0eq)、THPTA(1.0 eq)、BCY3900(0.9 eq)和VcNa(2.0 eq)。将混合物调节至pH约为7，然后在40℃搅拌2小时(或直至化合物5被消耗)。减压浓缩反应混合物以除去t-BuOH。如果化合物中存在DMAB或甲酯保护基团，则对粗材料进行脱保护(一般方法F或一般方法G)。否则，使用制备型HPLC纯化粗残余物以得到最终缀合物。
步骤(g)：DMAB保护基团的去除
Figure BDA0004159193090000141
(对于使用带有DMAB保护的侧链的氨基酸合成的接头)
向DMAB保护的接头化合物(1.0eq)的DMF溶液(36mg/mL)中加入N2H4-H2O(75eq)。在25℃搅拌混合物0.5小时，然后通过制备型HPLC直接纯化反应混合物以得到最终缀合物。
步骤(h)：甲酯保护基团的去除
Figure BDA0004159193090000142
(对于使用带有甲酯保护的侧链的氨基酸合成的接头)
向甲酯保护的接头化合物(1.0eq)的H2O溶液(100mg/mL)中加入NaOH(20.0eq)。在25℃搅拌混合物2小时。直接用制备型HPLC纯化反应混合物以得到最终缀合物。
上述一般方法用于制备以下双环缀合物：
Figure BDA0004159193090000143
BCY10989–(Dab-Val)
Figure BDA0004159193090000151
遵循一般方法以产生BCY10989。期望MW＝3882.4，观测m/z：1294[M+3H]3+，971[M+4H]4+。
BCY10988–(Dab-cBu-Glu)
Figure BDA0004159193090000152
遵循一般方法以产生BCY10988。期望MW＝4009.5，观测m/z：1337[M+3H]3+，1003[M+4H]4+。
BCY10986–(Dab-2Nal-Glu)
Figure BDA0004159193090000161
遵循一般方法以产生BCY10986。期望MW＝4109.6，观测m/z：1370[M+3H]3+，1028[M+4H]4+。
BCY10987–(Dab-DPA-Glu)
Figure BDA0004159193090000162
遵循一般方法以产生BCY10987。期望MW＝4135.7，观测m/z：1379[M+3H]3+，1034[M+4H]4+。
BCY10983–(Agp-Val-Glu)
Figure BDA0004159193090000171
如在BCY10982的合成中所描述的，制备MMAE-PAB-Dap-Val-Glu(OMe)-AcAz中间体。然后将Dap的侧链胺转化为相应的胍。在DMF中搅拌MMAE-PAB-Dap-Val-Glu(OMe)-AcAz(1eq)，并向其加入DIEA(9eq)和1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐(24eq)。在45℃搅拌混合物24小时，然后稀释混合物并用制备型HPLC纯化。使用一般方法进行剩余合成步骤以产生BCY10983。期望MW＝4039.5，观测m/z：1346[M+3H]3+，1010[M+4H]4+。
BCY10980–(Cit-Val-Glu)
Figure BDA0004159193090000172
遵循一般方法以产生BCY10980。期望MW＝4068.6，观测m/z：1356[M+3H]3+，1017[M+4H]4+。
BCY10981–(Dab-Val-Glu)
Figure BDA0004159193090000181
遵循一般方法以产生BCY10981。期望MW＝4011.5，观测m/z：1338[M+3H]3+，1003[M+4H]4+。
BCY10982–(Dap-Val-Glu)
Figure BDA0004159193090000182
遵循一般方法以产生BCY10982。期望MW＝3997.5，观测m/z：1333[M+3H]3+，1000[M+4H]4+。
BCY10984–(Cit-1Nal-Glu)
Figure BDA0004159193090000191
遵循一般方法以产生BCY10984。期望MW＝4166.7，观测m/z：1388[M+3H]3+，1042[M+4H]4+。
BCY10985–(Dab-1Nal-Glu)
Figure BDA0004159193090000192
遵循一般方法以产生BCY10985。期望MW＝4109.6，观测m/z：1370[M+3H]3+，1028[M+4H]4+。
BCY10298–(Dap-Val)
化合物1的制备
Figure BDA0004159193090000201
将DCM加入容纳有CTC树脂(5mmol，4.50g，1.10mmol/g)的容器中，然后在N2鼓泡下加入Fmoc-Dap(Boc)-OH(2.13g，5mmol，1.0eq)。滴加DIEA(4.0eq)并混合树脂2小时。加入甲醇(4.5mL)，再次混合树脂30min。然后将树脂排干并用DMF洗涤5次。
通过加入20％哌啶/DMF除去Fmoc基团并使其反应30min，然后将树脂排干并用DMF洗涤5次。
为了偶联后续氨基酸，将Fmoc-氨基酸的DMF溶液加入树脂中并混合30秒，然后加入活化剂和碱。在连续N2鼓泡下使偶联反应1小时。使用以下氨基酸重复数轮偶联和Fmoc脱保护：
# 材料 偶联试剂/碱
1 Fmoc-Dap(Boc)-OH(1.0eq) DIEA(4.0eq)
2 Fmoc-Val-OH(3.0eq) HBTU(2.85eq)和DIEA(6.0eq)
3 戊二酸酐(3.0eq) DIEA(6.0eq)
4 二甲胺HCl(3.0eq) HBTU(2.85eq)和DIEA(6.0eq)
在最终偶联后，用MeOH洗涤树脂3次，然后真空干燥。通过在室温向含有侧链受保护的肽的烧瓶中加入20％HFIP/80％DCM从树脂进行切割。然后在连续N2鼓泡下重复切割(每次1小时)。过滤树脂并收集滤液，然后浓缩以除去溶剂。将粗肽冻干以得到化合物1(1.64g，94.1％纯度，73.7％产率)。期望MW＝444.53，观测m/z：445.12[M+H]+。
化合物2的制备
Figure BDA0004159193090000202
避光向化合物1(800mg，1.80mmol，1.0eq)的DCM(16.0mL)和甲醇(8.00mL)溶液中加入(4-氨基苯基)甲醇(266mg，2.16mmol，1.2eq)和EEDQ(890mg，3.60mmol，2.0eq)。在25℃搅拌混合物16小时。TLC(DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.46)表明化合物1被完全消耗。LC-MS显示化合物1被完全消耗并检测到一个具有所需m/z的主峰。减压浓缩反应混合物以得到残余物。通过快速硅胶色谱法(
Figure BDA0004159193090000203
40g
Figure BDA0004159193090000204
硅胶快速柱，洗脱液为0～20％MeOH/DCM，60mL/min)纯化残余物以得到浅棕色固体状的化合物2(550mg，1.00mmol，55.6％产率)。期望MW＝549.66，观测m/z：450.04[(M-Boc)+H]+和550.08[M+H]+。
化合物3的制备
Figure BDA0004159193090000211
在N2气氛下向化合物2(550mg，1.00mmol，1.0eq)的DMF溶液(7.00mL)中加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(913mg，3.00mmol，3.0eq)和DIEA(517mg，4.00mmol，697μL，4.0eq)。在25℃搅拌混合物2小时。LC-MS显示化合物2被完全消耗并检测到一个具有所需m/z的主峰。通过制备型HPLC(中性条件)纯化反应混合物以得到浅黄色固体状的化合物3(560mg，783μmol，78.30％产率)。期望MW＝714.76，观测m/z：614.96[(M-Boc)+H]+和715.01[M+H]+。
化合物4的制备
Figure BDA0004159193090000212
在N2气氛下向化合物3(550mg，769μmol，1.0eq)的DMF(6.00mL)溶液中加入DIEA(398mg，3.08mmol，536μL，4.0eq)并搅拌10min。然后将1-乙基-6-氟-4-氧代-7-哌嗪-1-基喹啉-3-羧酸(491mg，1.54mmol，2.0eq)和HOBt(208mg，1.54mmol，2.0eq)加入混合物中。在25℃搅拌混合物2小时。LC-MS显示化合物3被完全消耗并检测到一个具有所需m/z的主峰。通过在25℃加入H2O(250mL)洗涤反应混合物，过滤并减压浓缩以得到黄色固体状的粗产物化合物4(580mg，粗品)，不经进一步纯化即用于下一步。期望MW＝894.98，观测m/z：398.04[(M-Boc)/2+H]+，895.06[M+H]+。
BCY10298的制备
Figure BDA0004159193090000213
向化合物4(250mg，279μmol，1.0eq)的DCM溶液(2.40mL)中加入TFA(924mg，8.10mmol，0.60mL，29.0eq)。在25℃搅拌混合物2小时。LC-MS显示化合物4被完全消耗并检测到一个具有所需m/z的主峰。减压浓缩反应混合物以得到残余物。通过制备型HPLC(A：0.075％TFA的H2O溶液，B：ACN)纯化残余物以得到白色固体状的BCY10298(160mg，194μmol，69.6％产率)。期望MW＝794.87，观测m/z：398.06[M/2+H]+，795.02[M+H]+。
BCY10300–(Dap(CNNH2)-Val)
Figure BDA0004159193090000221
在N2气氛下向BCY10298(85.0mg，107μmol，1.0eq)的DMF溶液(1.00mL)中加入氯(吡唑-1-甲酰亚胺基)铵(15.6mg，107μmol，1.0eq)和DIEA(41.5mg，321μmol，60.0μL，3.0eq)。在25℃搅拌混合物16小时。LC-MS显示化合物5被完全消耗并检测到一个具有所需m/z的主峰。通过制备型HPLC(A：0.075％TFA的H2O溶液，B：ACN)纯化反应混合物以得到白色固体状的BCY10300(39.3mg，46.2μmol，43.1％产率，93％纯度)。期望MW＝836.91，观测m/z：419.11[M/2+H]+和836.95[M+H]+。
BCY9474–(Dab-Val)
化合物2的制备
Figure BDA0004159193090000222
将DCM加入容纳有CTC树脂(10mmol，9.10g，1.10mmol/g)的容器中，然后在N2鼓泡下加入Fmoc-Dab(Boc)-OH(4.40g，10mmol，1.0eq)。滴加DIEA(4.0eq)并混合树脂2小时。加入甲醇(9.1mL)，再次混合树脂30min。然后将树脂排干并用DMF洗涤5次。
通过加入20％哌啶/DMF除去Fmoc基团并使其反应30min，然后将树脂排干并用DMF洗涤5次。
为了偶联后续氨基酸，将Fmoc-氨基酸的DMF溶液加入树脂中并混合30秒，然后加入活化剂和碱。在连续N2鼓泡下使偶联反应1小时。使用以下氨基酸重复数轮偶联和Fmoc脱保护：
# 材料 偶联试剂
1 Fmoc-Dab(Boc)-OH(1.0eq) DIEA(4.0eq)
2 Fmoc-Val-OH(3.0eq) HBTU(2.85eq)和DIEA(6.0eq)
3 四氢吡喃-2,6-二酮(3.0eq) HBTU(2.85eq)和DIEA(6.0eq)
4 二甲胺HCl(3.0eq) HBTU(2.85eq)和DIEA(6.0eq)
在最终偶联后，用MeOH洗涤树脂3次，然后真空干燥。通过在室温向含有侧链受保护的肽的烧瓶中加入20％HFIP/80％DCM从树脂进行切割。然后在连续N2鼓泡下重复切割(每次1小时)。过滤树脂并收集滤液，然后浓缩以除去溶剂。将粗肽冻干以得到化合物2(2.50g，96.6％纯度，54.40％产率)。期望MW＝458.56，观测m/z：459.4[M+H]+。
化合物3的制备
Figure BDA0004159193090000231
向化合物2(2.50g，5.45mmol，1.0eq)的DCM(50.0mL)和MeOH(25.0mL)溶液中避光加入(4-氨基苯基)甲醇(806mg，6.54mmol，1.2eq)和EEDQ(2.70g，10.9mmol，2.0eq)。在25℃避光搅拌混合物16小时。TLC(DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.35)表明化合物2被完全消耗。LC-MS显示大部分化合物2被消耗并检测到化合物3的一个具有所需m/z的主峰。减压浓缩反应混合物以得到残余物。通过快速硅胶色谱法(
Figure BDA0004159193090000232
80g
Figure BDA0004159193090000233
硅胶快速柱，洗脱液为0～20％MeOH/DCM，60mL/min)纯化残余物以得到浅黄色固体状的化合物3(1.65g，2.93mmol，53.7％产率)。期望MW＝563.69，观测m/z：464.3[(M-Boc)+H]+和564.3[M+H]+。
化合物4的制备
Figure BDA0004159193090000234
在N2气氛下向化合物3(1.65g，2.93mmol，1.0eq)的DMF溶液(10.0mL)中加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(2.67g，8.78mmol，3.0eq)和DIEA(1.51g，11.7mmol，2.04mL，4.0eq)。在25℃搅拌混合物2小时。LC-MS显示检测到化合物4的一个具有所需m/z的主峰。通过制备型HPLC(中性条件)纯化反应混合物以得到浅黄色固体状化合物4(1.56g，1.33mmol，45.3％产率，62.0％纯度)。期望MW＝728.79，观测m/z：729.3[M+H]+。
化合物5的制备
Figure BDA0004159193090000235
向化合物4(1.56g，2.14mmol，1.0eq)的DMF溶液(10.0mL)中加入DIEA(1.38g，10.7mmol，1.86mL，5.0eq)并搅拌10min。然后在N2气氛下将1-乙基-6-氟-4-氧代-7-哌嗪-1-基喹啉-3-羧酸(1.37g，4.28mmol，2.0eq)和HOBt(578mg，4.28mmol，2.0eq)加入混合物中。在35℃搅拌混合物2小时。LC-MS显示检测到化合物5的一个具有所需m/z的主峰。通过制备型HPLC(中性条件)纯化反应混合物以得到浅黄色固体状的化合物5(1.45g，1.60mmol，74.5％产率)。期望MW＝909.01，观测m/z：909.3[M+H]+。
BCY9474的制备
Figure BDA0004159193090000241
向化合物5(1.45g，1.60mmol，1.0eq)的DCM溶液(9.00mL)中加入TFA(1.54g，13.5mmol，1.00mL，8.47eq)。在25℃搅拌混合物1小时。LC-MS显示化合物5被完全消耗并检测到一个具有所需m/z的主峰。减压浓缩反应混合物以得到残余物。通过制备型HPLC(中性条件)纯化残余物以得到浅黄色固体状的BCY9474(850mg，1.05mmol，65.9％产率，98.74％纯度)。期望MW＝808.90，观测m/z：405.3[M/2+H]+和809.3[M+H]+。
BCY9423–(Agb-Val)
Figure BDA0004159193090000242
向BCY9474(150mg，185μmol，1.0eq)的DMF溶液(2.00mL)中加入叔丁基(NZ)-N-[(叔丁氧羰基氨基)-吡唑-1-亚甲基]氨基甲酸酯(86.3mg，278μmol，1.5eq)和DIEA(47.9mg，371μmol，64.6μL，2.0eq)。在25℃搅拌混合物16小时。LC-MS显示大部分BCY9474被消耗并检测到化合物2的一个具有所需m/z的主峰。通过制备型HPLC(中性条件)纯化反应混合物以得到白色固体状的化合物2(110mg，105μmol，56.4％产率)。期望MW＝1050.52，观测m/z：525.70[M/2+H]+和1050.82[M+H]+。
Figure BDA0004159193090000243
向化合物2(110mg，105μmol，1.0eq)的DCM溶液(2.00mL)中加入TFA(770mg，6.75mmol，500μL，64.5eq)。在25℃搅拌混合物0.5小时。LC-MS显示化合物2被完全消耗并检测到一个具有所需m/z的主峰。减压浓缩反应混合物以得到残余物。通过制备型HPLC(中性条件)纯化残余物以得到白色固体状的BCY9423(20.8mg，24.2μmol，23.1％产率，98.8％纯度)。期望MW＝850.94，观测m/z：425.72[M/2+H]+，850.67[M+H]+。
BCY9477–(Agb(Me)-Val)
Figure BDA0004159193090000251
在N2气氛下向BCY9474(100mg，124μmol，1.0eq)的DMF溶液(3mL)中加入N-甲基吡唑-1-甲脒(59.6mg，371μmol，3.0eq，HCl盐形式)和DIEA(95.9mg，742μmol，129μL，6.0eq)。在60℃搅拌混合物16小时。LC-MS显示检测到一个具有所需m/z的主峰。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化反应混合物以获得白色固体状的BCY9477(40.9mg，46.9μmol，37.9％产率，99.2％纯度)。期望MW＝864.96，观测m/z：432.68[M/2+H]+和864.62[M+H]+。
BCY9696–(Cit-Val-Glu)
化合物2的制备
Figure BDA0004159193090000252
将DCM加入容纳有CTC树脂(5mmol，4.50g，1.10mmol/g)的容器中，然后在N2鼓泡下加入Fmoc-Cit-OH(1.98g，5mmol，1.0eq)。滴加DIEA(4.0eq)并混合树脂2小时。加入甲醇(4.5mL)，再次混合树脂30min。然后将树脂排干并用DMF洗涤5次。
通过加入20％哌啶/DMF除去Fmoc基团并使其反应30min，然后将树脂排干并用DMF洗涤5次。
为了偶联后续氨基酸，将Fmoc-氨基酸的DMF溶液加入树脂中并混合30秒，然后加入活化剂和碱。在连续N2鼓泡下使偶联反应1小时。使用以下氨基酸重复数轮偶联和Fmoc脱保护：
# 材料 偶联试剂
1 Fmoc-Cit-OH(1.0eq) DIEA(4.0eq)
2 Fmoc-Val-OH(3.0eq) HBTU(2.85eq)和DIEA(6.0eq)
3 Fmoc-Glu(OtBu)-OH(3.0eq) HBTU(2.85eq)和DIEA(6.0eq)
4 四氢吡喃-2,6-二酮(3.0eq) HBTU(2.85eq)和DIEA(6.0eq)
5 二甲胺HCl(3.0eq) HBTU(2.85eq)和DIEA(6.0eq)
在最终偶联后，用MeOH洗涤树脂3次，然后真空干燥。通过在室温向含有侧链受保护的肽的烧瓶中加入20％HFIP/80％DCM从树脂进行切割。然后在连续N2鼓泡下重复切割(每次1小时)。过滤树脂并收集滤液，然后浓缩以除去溶剂。将粗肽冻干以得到化合物2(1.9g，100％纯度，63.3％产率)。期望MW＝600.71，观测m/z：601.3[M+H]+。
化合物3的制备
Figure BDA0004159193090000261
向化合物2(500mg，832μmol，1.0eq)的DCM(10mL)和MeOH(5mL)溶液中避光加入(4-氨基苯基)甲醇(123mg，999μmol，1.2eq)和EEDQ(412mg，1.66mmol，2.0eq)。在25℃搅拌混合物12小时。TLC(DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.23)表明化合物2被完全消耗并形成许多新斑点。LC-MS显示化合物2被完全消耗并检测到化合物3的一个具有所需m/z的主峰。减压浓缩反应混合物以得到残余物。通过快速硅胶色谱法(
Figure BDA0004159193090000262
40g
Figure BDA0004159193090000263
硅胶快速柱，洗脱液为0～20％MeOH/DCM，40mL/min)纯化残余物以得到浅黄色固体状的化合物3(350mg，496μmol，59.6％产率)。期望MW＝705.84，观测m/z：706.3[M+H]+。
化合物4的制备
Figure BDA0004159193090000264
在N2气氛下向化合物3(350mg，496μmol，1.0eq)的DMF溶液(4mL)中加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(453mg，1.49mmol，3.0eq)和DIEA(256mg，1.98mmol，345μL，4.0eq)。在25℃搅拌混合物2小时。LC-MS显示化合物3被完全消耗并检测到一个具有所需m/z的主峰。通过制备型HPLC(中性条件)纯化反应混合物以得到白色固体状的化合物4(370mg，425μmol，85.7％产率)。期望MW＝870.41，观测m/z：870.66[M+H]+。
化合物5的制备
Figure BDA0004159193090000265
在N2气氛下向化合物4(360mg，413μmol，1.0eq)的DMF溶液(4mL)中加入DIEA(267mg，2.07mmol，360μL，5.0eq)并搅拌10min。然后将1-乙基-6-氟-4-氧代-7-哌嗪-1-基喹啉-3-羧酸(264mg，827μmol，2.0eq)和HOBt(112mg，827μmol，2.0eq)加入混合物中。在35℃搅拌混合物2小时。LC-MS显示化合物4被完全消耗并检测到一个具有所需m/z的主峰。通过制备型HPLC(中性条件)纯化反应混合物以得到白色固体状的化合物5(390mg，371μmol，89.8％产率)。
BCY9696的制备
Figure BDA0004159193090000271
向化合物5(150mg，143μmol，1.0eq)的DCM溶液(5mL)中加入TFA(1.93g，16.9mmol，1.25mL，118.0eq)。在25℃搅拌混合物0.5小时。LC-MS显示化合物5被完全消耗并检测到一个具有所需m/z的主峰。减压浓缩反应混合物以得到残余物。通过制备型HPLC(A：0.075％TFA的H2O溶液，B：ACN)纯化残余物以得到白色固体状的化合物BCY9696(66.5mg，65.8μmol，46.1％产率，98.4％纯度)。期望MW＝994.46，观测m/z：497.68[M/2+H]+和994.64[M+H]+。
BCY10299–(Dap(CNNH2)-Val-Glu)
化合物5的制备
Figure BDA0004159193090000272
在0℃向化合物4(其可以如BCY10297中所述制备；150mg，139μmol，1.0eq)的DCM溶液(1.9mL)中加入TFA(150mg，1.32mmol，0.10mL，9.5eq)并搅拌1小时。LC-MS(ES10336-123-P1A3)显示化合物4被完全消耗并形成两个主峰，其中一个是BCY10297(完全脱保护的材料)，另一个是所需的化合物5。减压浓缩反应混合物以得到残余物。通过制备型HPLC(中性条件)纯化残余物以得到白色固体状的化合物5(50.0mg，51.0μmol，36.7％产率)。期望MW＝980.09，观测m/z：490.67[M/2+H]+和980.07[M+H]+。
化合物6的制备
Figure BDA0004159193090000273
在N2气氛下向化合物5(92.0mg，93.9μmol，1.0eq)的DMF溶液(2mL)中加入DIEA(48.5mg，375μmol，65.4μL，4.0eq)和吡唑-1-甲脒(13.8mg，93.9μmol，1.0eq)。在25℃搅拌混合物16小时。LC-MS显示大部分化合物5已被消耗并检测到化合物6的一个具有所需m/z的主峰。通过制备型HPLC(中性条件)纯化反应混合物以得到白色固体状的化合物6(72.0mg，70.4μmol，75.0％产率)。期望MW＝1222.36，观测m/z：512.1[(M-2*Boc)/2+H]+，1022.7[(M-2*Boc)+H]+。
BCY10299的制备
Figure BDA0004159193090000281
向化合物6(72.0mg，70.4μmol，1.0eq)的DCM溶液(2.4mL)中加入TFA(900mg，8.00mmol，0.60mL，114.0eq)并在25℃搅拌2小时。LC-MS显示化合物6被完全消耗并检测到一个具有所需m/z的主峰。减压浓缩反应混合物以除去溶剂。通过制备型HPLC(A：0.075％TFA的H2O溶液，B：ACN)纯化残余物以得到白色固体状的BCY10299(15.2mg，14.0μmol，96.0％纯度和1.1mg，1.09μmol，97.1％纯度；总产率21.4％)。期望MW＝966.02，观测m/z：483.65[M/2+H]+和966.12[M+H]+。
BCY10297–(Dap-Val-Glu)
化合物1的制备
Figure BDA0004159193090000282
将DCM加入容纳有CTC树脂(5mmol，4.50g，1.10mmol/g)的容器中，然后在N2鼓泡下加入Fmoc-Dap(Boc)-OH(2.13g，5mmol，1.0eq)。滴加DIEA(4.0eq)并混合树脂2小时。加入甲醇(4.5mL)，再次混合树脂30min。然后将树脂排干并用DMF洗涤5次。
通过加入20％哌啶/DMF除去Fmoc基团并使其反应30min，然后将树脂排干并用DMF洗涤5次。
为了偶联后续氨基酸，将Fmoc-氨基酸的DMF溶液加入树脂中并混合30秒，然后加入活化剂和碱。在连续N2鼓泡下使偶联反应1小时。使用以下氨基酸重复数轮偶联和Fmoc脱保护：
# 材料 偶联试剂
1 Fmoc-Dap(Boc)-OH(1.0eq) DIEA(4.0eq)
2 Fmoc-Val-OH(3.0eq) HBTU(2.85eq)和DIEA(6.0eq)
3 Fmoc-Glu(OtBu)-OH(3.0eq) HBTU(2.85eq)和DIEA(6.0eq)
4 戊二酸酐(3.0eq) HBTU(2.85eq)和DIEA(6.0eq)
5 二甲胺HCl(3.0eq) HBTU(2.85eq)和DIEA(6.0eq)
在最终偶联后，用MeOH洗涤树脂3次，然后真空干燥。通过在室温向含有侧链受保护的肽的烧瓶中加入20％HFIP/80％DCM从树脂进行切割。然后在连续N2鼓泡下重复切割(每次1小时)。过滤树脂并收集滤液，然后浓缩以除去溶剂。将粗肽冻干以得到化合物2(2.27g，93.4％纯度，69.1％产率)。期望MW＝629.75，观测m/z：630.10[(M-Boc)+H]+，630.10[M+H]+。
化合物2的制备
Figure BDA0004159193090000291
避光向化合物1(800mg，1.27mmol，1.0eq)的DCM(16.0mL)和MeOH(8.00mL)溶液中加入(4-氨基苯基)甲醇(188mg，1.52mmol，1.2eq)和EEDQ(628mg，2.54mmol，2.0eq)。在25℃搅拌混合物16小时。TLC(DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.46)表明化合物1被完全消耗。LC-MS显示化合物1被完全消耗并检测到一个具有所需m/z的主峰。减压浓缩反应混合物以得到残余物。然后通过快速硅胶色谱法(
Figure BDA0004159193090000294
40g
Figure BDA0004159193090000295
硅胶快速柱，洗脱液为0～20％MeOH/DCM，60mL/min)纯化残余物以得到浅棕色固体状的化合物2(600mg，816μmol，64.3％产率)。期望MW＝734.88，观测m/z：635.09[(M-Boc)+H]+和735.10[M+H]+。
化合物3的制备
Figure BDA0004159193090000292
在N2气氛下向化合物2(600mg，816μmol，1.0eq)的DMF溶液(8.00mL)中加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(745mg，2.45mmol，3.0eq)和DIEA(422mg，3.27mmol，569μL，4.0eq)。在25℃搅拌混合物2小时。LC-MS显示化合物2被完全消耗并检测到一个具有所需m/z的主峰。通过制备型HPLC(中性条件)纯化反应混合物以得到浅黄色固体状的化合物3(630mg，700μmol，85.7％产率)。期望MW＝899.98，观测m/z：799.99[(M-Boc)+H]+和900.02[M+H]+。
化合物4的制备
Figure BDA0004159193090000293
在N2气氛下向化合物3(630mg，700μmol，1.0eq)的DMF溶液(8.00mL)中加入DIEA(362mg，2.80mmol，488μL，4.0eq)并搅拌10min。然后将1-乙基-6-氟-4-氧代-7-哌嗪-1-基喹啉-3-羧酸(447mg，1.40mmol，2.0eq)和HOBt(189mg，1.40mmol，2.0eq)加入混合物中。在25℃搅拌混合物2小时。LC-MS显示化合物3被完全消耗并检测到一个具有所需m/z的主峰。通过在25℃加入250mL H2O洗涤反应混合物，过滤并减压浓缩以得到黄色固体状的粗化合物4(630mg，粗品)，不经进一步纯化即用于下一步。期望MW＝1080.20，观测m/z：490.63[(M-Boc)/2+H]+和1080.09[M+H]+。
BCY10297的制备
Figure BDA0004159193090000301
向化合物4(130mg，120μmol，1.0eq)的DCM溶液(1.60mL)中加入TFA(596mg，5.23mmol，400μL，43.6eq)。在25℃搅拌混合物0.5小时。LC-MS显示化合物4被完全消耗并检测到一个具有所需m/z的主峰。减压浓缩反应混合物以得到残余物。通过制备型HPLC(A：0.075％TFA的H2O溶液，B：ACN)纯化残余物以得到白色固体状的BCY10297(45.3mg，46.6μmol，38.7％产率，95.0％纯度)。期望MW＝923.68，观测m/z：462.58[M/2+H]+和924.07[M+H]+。
BCY9695–(Agb-Val-Glu)
化合物2的制备
Figure BDA0004159193090000302
将DCM加入容纳有CTC树脂(5mmol，4.50g，1.10mmol//g)的容器中，然后在N2鼓泡下加入Fmoc-Dab(Boc)-OH(2.20g，5mmol，1.0eq)。滴加DIEA(4.0eq)并混合树脂2小时。加入甲醇(4.5mL)，再次混合树脂30min。然后将树脂排干并用DMF洗涤5次。
通过加入20％哌啶/DMF除去Fmoc基团并使其反应30min，然后将树脂排干并用DMF洗涤5次。
为了偶联后续氨基酸，将Fmoc-氨基酸的DMF溶液加入树脂中并混合30秒，然后加入活化剂和碱。在连续N2鼓泡下使偶联反应1小时。使用以下氨基酸重复数轮偶联和Fmoc脱保护：
Figure BDA0004159193090000303
Figure BDA0004159193090000311
在最终偶联后，用MeOH洗涤树脂3次，然后真空干燥。通过在室温向含有侧链受保护的肽的烧瓶中加入20％HFIP/80％DCM从树脂进行切割。然后在连续N2鼓泡下重复切割(每次1小时)。过滤树脂并收集滤液，然后浓缩以除去溶剂。将粗肽冻干以得到化合物2(2.60g，90.0％纯度，72.6％产率)。期望MW＝643.78，观测m/z：644.4[M+H]+。
化合物3的制备
Figure BDA0004159193090000312
向化合物2(500mg，777μmol，1.0eq)的DCM(10mL)和MeOH(5mL)溶液中避光加入(4-氨基苯基)甲醇(115mg，932μmol，1.2eq)和EEDQ(384mg，1.55mmol，2.0eq)。在25℃搅拌混合物12小时。TLC(DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.38)表明化合物2被完全消耗并形成数个新斑点。LC-MS显示化合物2被完全消耗并检测到一个具有所需m/z的主峰。减压浓缩反应混合物以得到残余物。然后通过快速硅胶色谱法(
Figure BDA0004159193090000315
40g
Figure BDA0004159193090000316
硅胶快速柱，洗脱液为0～20％MeOH/DCM，40mL/min)纯化残余物以得到浅黄色固体状的化合物3(390mg，521μmol，67.1％产率)。期望MW＝748.44，观测m/z：749.4[M+H]+。
化合物4的制备
Figure BDA0004159193090000313
在N2气氛下向化合物3(390mg，521μmol，1.0eq)的DMF溶液(4mL)中加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(475mg，1.56mmol，3.0eq)和DIEA(269mg，2.08mmol，363μL，4.0eq)。在25℃搅拌混合物2小时。LC-MS显示化合物3被完全消耗并检测到化合物4的一个具有所需m/z的主峰。通过制备型HPLC(中性条件)纯化残余物以得到白色固体状的化合物4(400mg，438μmol，84.0％产率)。期望MW＝913.44，观测m/z：913.60[M+H]+。
化合物5的制备
Figure BDA0004159193090000314
向化合物4(400mg，438μmol，1.0eq)的DMF溶液(5mL)中加入DIEA(283mg，2.19mmol，381μL，5.0eq)并搅拌10min。然后在N2气氛下将1-乙基-6-氟-4-氧代-7-哌嗪-1-基喹啉-3-羧酸(280mg，875μmol，2.0eq)和HOBt(118mg，875μmol，2.0eq)加入混合物中。在35℃搅拌混合物2小时。LC-MS显示化合物4被完全消耗并检测到化合物5的一个具有所需m/z的主峰。通过制备型HPLC(中性条件)纯化残余物以得到白色固体状的化合物5(310mg，283μmol，64.7％产率)。期望MW＝1093.55，观测m/z：1093.77[M+H]+和547.18[M/2+H]+。
化合物6的制备
Figure BDA0004159193090000321
向化合物5(305mg，279μmol，1.0eq)的DCM溶液(5.70mL)中加入TFA(462mg，4.05mmol，0.30mL，14.5eq)。在0℃搅拌混合物1小时。LC-MS显示化合物5被完全消耗并形成两个主峰，其中一个是所需的化合物6，另一个对应于完全脱保护的材料。减压浓缩反应混合物以得到残余物。用制备型HPLC(中性条件)纯化残余物以得到白色固体状的化合物6(205mg，206μmol，74.0％产率)。期望MW＝993.50，观测m/z：993.72[M+H]+和497.26[M/2+H]+。
化合物7的制备
Figure BDA0004159193090000322
在N2气氛下向化合物6(205mg，206μmol，1.0eq)的DMF溶液(3mL)中加入叔丁基(NZ)-N-[(叔丁氧羰基氨基)-吡唑-1-基亚甲基]氨基甲酸酯(96.0mg，309μmol，1.5eq)和DIEA(53.3mg，412μmol，71.8μL，2.0eq)。在25℃搅拌混合物16小时。LC-MS显示化合物6被完全消耗并检测到化合物7的一个具有所需m/z的主峰。通过制备型HPLC(中性条件)纯化残余物以得到白色固体状的化合物7(70.0mg，56.6μmol，27.5％产率)。期望MW＝1235.62，观测m/z：1257.66[M+Na]+和618.21[M/2+H]+。
BCY9695的制备
Figure BDA0004159193090000323
向化合物7(70.0mg，56.6μmol，1.0eq)的DCM溶液(0.90mL)中加入TFA(154mg，1.35mmol，100μL，23.8eq)。在25℃搅拌混合物0.5小时。LC-MS显示化合物7被完全消耗并检测到一个具有所需m/z的主峰。减压浓缩反应混合物以得到残余物。然后通过制备型HPLC(A：0.075％TFA的H2O溶液，B：ACN)纯化残余物以得到白色固体状的化合物BCY9695(21.9mg，22.1μmol，39.0％产率，98.9％纯度)。期望MW＝979.46，观测m/z：979.60[M+H]+和490.18[M/2+H]+。
BCY10122–(Dab-Val-Glu)
BCY10122的制备
Figure BDA0004159193090000331
向化合物5(305mg，279μmol，1.0eq)的DCM溶液(5.70mL)中加入TFA(462mg，4.05mmol，0.30mL，14.5eq)。在0℃搅拌混合物1小时。LC-MS显示化合物5被完全消耗并检测到一个具有所需m/z(计算MW：，观测m/z：)的主峰。减压浓缩反应混合物以得到残余物。通过制备型HPLC(中性条件)纯化残余物以得到白色固体状的BCY10122(50.2mg，52.0μmol，18.6％产率，97.1％纯度)。期望MW＝937.43，观测m/z：469.24[M/2+H]+，937.65[M+H]+。
BCY7761–(Cit–Val)
化合物2的制备
Figure BDA0004159193090000332
在N2气氛下向化合物1(1.50g，3.24mmol，1.0eq)的DMF溶液(20mL)中加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(2.96g，9.73mmol，3.0eq)和DIEA(1.68g，13.0mmol，2.26mL，4.0eq)。在15℃搅拌混合物2小时。LC-MS显示化合物1被完全消耗并检测到一个具有所需m/z的峰。通过制备型HPLC(中性条件)纯化反应混合物以得到浅黄色固体状的化合物2(1.20g，1.91mmol，58.9％产率)。期望MW＝627.61，观测m/z：627.94[M+H]+。
化合物3的制备
Figure BDA0004159193090000333
向化合物2(905mg，1.44mmol，1.15eq)的DMF溶液(10mL)中加入DIEA(486mg，3.76mmol，655μL，3.0eq)并搅拌10min。然后将HOBt(195mg，1.44mmol，1.15eq)和MMAE(900mg，1.25mmol，1.0eq)加入混合物中。在35℃搅拌混合物16小时。LC-MS显示化合物2被完全消耗并检测到一个具有所需m/z的主峰。通过制备型HPLC(中性条件)纯化反应混合物以得到浅黄色固体状的化合物3(1.08g，895μmol，71.6％产率)。期望MW＝1206.48，观测m/z：1206.25[M+H]+。
BCY7761的制备
Figure BDA0004159193090000341
向化合物3(971mg，805μmol，1.1eq)和BCY3900(2.00g，732μmol，1.0eq)的t-BuOH(10mL)和H2O(10mL)溶液中加入CuSO4(0.4M，1.83mL，1.0eq)和三(3-羟丙基-三唑甲基)胺(THPTA，318mg，732μmol，1.0eq)。然后在N2气氛下将VcNa(0.4M，3.66mL，2.0eq)加入混合物中。在15℃搅拌混合物2小时。LC-MS显示化合物3被完全消耗并检测到一个具有所需m/z的主峰。将EDTA(0.5M，1.5mL)加入反应混合物中以淬灭反应。然后用制备型HPLC(A：0.075％TFA的H2O溶液，B：ACN)纯化反应混合物以得到白色固体状的BCY7761(2.20g，539μmol，73.4％产率，96.5％纯度)。期望MW＝3939.45，观测m/z：985.47[M/4+H]+和1313.56[M/3+H]+。
BCY9422–(Cit-Val)
化合物2的制备
Figure BDA0004159193090000342
将DCM加入容纳有CTC树脂(10mmol，9.10g，1.10mmol/g)的容器中，然后在N2鼓泡下加入Fmoc-Cit-OH(3.98g，10mmol，1.0eq)。滴加DIEA(4.0eq)并混合树脂2小时。加入甲醇(9.1mL)，再次混合树脂30min。然后将树脂排干并用DMF洗涤5次。
通过加入20％哌啶/DMF除去Fmoc基团并使其反应30min，然后将树脂排干并用DMF洗涤5次。
为了偶联后续氨基酸，将Fmoc-氨基酸的DMF溶液加入树脂中并混合30秒，然后加入活化剂和碱。在连续N2鼓泡下使偶联反应1小时。使用以下氨基酸重复数轮偶联和Fmoc脱保护：
# 材料 偶联试剂
1 Fmoc-Cit-OH(1.0eq) DIEA(4.0eq)
2 Fmoc-Val-OH(3.0eq) HBTU(2.85eq)和DIEA(6.0eq)
3 四氢吡喃-2,6-二酮(3.0eq) HBTU(2.85eq)和DIEA(6.0eq)
4 二甲胺HCl(3.0eq) HBTU(2.85eq)和DIEA(6.0eq)
最后一次氨基酸偶联后，用MeOH洗涤树脂3次，然后真空干燥。通过在室温向含有侧链受保护的肽的烧瓶中加入20％HFIP/80％DCM从树脂进行切割。然后在连续N2鼓泡下重复切割(每次1小时)。过滤树脂并收集滤液，然后浓缩以除去溶剂。将粗肽冻干以得到化合物2(粗品，1.80g，91.82％纯度，39.7％产率)。期望MW＝415.49，观测m/z：416.2[M+H]+。
化合物3的制备
Figure BDA0004159193090000351
向化合物2(500mg，1.20mmol，1.0eq)的DCM(10mL)和MeOH(5mL)溶液中避光加入(4-氨基苯基)甲醇(178mg，1.44mmol，1.2eq)和EEDQ(595mg，2.41mmol，2.0eq)。在25℃搅拌混合物12小时。TLC(DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.53)表明化合物2被完全消耗。减压浓缩反应混合物以得到残余物。通过快速硅胶色谱法(
Figure BDA0004159193090000352
40g
Figure BDA0004159193090000353
硅胶快速柱，洗脱液为0～25％MeOH/DCM，40mL/min)纯化残余物以得到浅黄色固体状的化合物3(380mg，730μmol，60.7％产率)。1H NMR:ES8396-320-P1D1(400MHz,DMSO-d6)δppm9.87-9.91(m,1H),8.09(brd,J＝7.53Hz,1H),7.86(d,J＝8.53Hz,1H),7.49-7.57(m,2H),7.18-7.26(m,2H),5.97(brt,J＝5.52Hz,1H),5.41(s,2H),5.06-5.12(m,1H),4.34-4.44(m,3H),4.14-4.22(m,1H),3.33(s,6H),2.91(s,3H),2.79(s,2H),2.16-2.32(m,4H),1.97(dq,J＝13.52,6.70Hz,1H),1.63-1.76(m,3H),0.85(dd,J＝11.17,6.90Hz,6H)。
化合物4的制备
Figure BDA0004159193090000361
向化合物3(380mg，730μmol，1.0eq)的DMF溶液(8mL)中加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(666mg，2.19mmol，3.0eq)和DIEA(377mg，2.92mmol，509μL，4.0eq)。在25℃搅拌混合物2小时。LC-MS显示化合物3被完全消耗并检测到化合物4的一个具有所需m/z的主峰。通过制备型HPLC(中性条件)纯化反应混合物以得到白色固体状的化合物4(368mg，537μmol，73.5％产率)。期望MW＝685.32，观测m/z：686.1[M+H]+。
BCY9422的制备
Figure BDA0004159193090000362
在25℃向化合物4(150mg，219μmol，1.0eq)的DMF溶液(3mL)中加入DIEA(141mg，1.09mmol，191μL，5.0eq)并搅拌10min。然后将1-乙基-6-氟-4-氧代-7-哌嗪-1-基喹啉-3-羧酸(105mg，328μmol，1.5eq)和HOBt(29.6mg，219μmol，1.0eq)加入混合物中。在35℃搅拌混合物16小时。LC-MS显示检测到一个具有所需m/z的主峰。通过制备型HPLC(A：0.075％TFA的H2O溶液，B：ACN)纯化反应混合物以得到白色固体状的BCY9422(107.8mg，119μmol，54.6％产率，95.9％纯度)。期望MW＝865.95，观测m/z：433.7[M/2+H]+和866.2[M+H]+。
血浆稳定性分析
在37℃水浴中解冻合并的冷冻血浆。以4000rpm离心血浆5min，如果有凝块则将其去除。如果需要，则会将pH值调节至7.4±0.1。用DMSO制备1mM储备溶液。通过用495μL超纯水稀释5μL储备溶液(10mM)制成100μM工作溶液来制备丙胺太林(阳性对照)。通过用90μLDMSO稀释10μL储备溶液(1mM)制成测试化合物的100μM工作溶液。向98μL空白血浆中掺入(spike)2μL给药溶液(100μM)以达到2μM的终浓度，一式两份，并在37℃水浴中孵育样品。在每个时间点(0、1、2、4、6和24小时)，加入400μL的200ng/mL甲苯磺丁脲和拉贝洛尔的100％MeOH溶液并充分混合以沉淀蛋白质。以4000rpm离心样品板15min。从每个孔中转移上清液的等分试样(150μL)，然后提交LC-MS/MS分析。
使用以下公式计算在血浆中孵育后的剩余测试化合物％：
剩余％＝100×(指定孵育时间的PAR/T0时间的PAR)
其中PAR是分析物与内标(IS)的峰面积比。
指定的孵育时间点为T0(0小时)、Tn(n＝0、1、2、4、6、24小时)。由浓度随时间变化的对数线性图计算半衰期(T1/2)。
当最大孵育时间(在本研究中为24小时)时的剩余％值高于75％时，认为它在可接受的实验变化范围内。因此，报告相应的t1/2为>57.8小时。
组织蛋白酶B(CatB)测定
将15μL测试化合物溶液(2mM，DMSO溶液)加入孵育板中，一式两份。在室温用1500μL活化缓冲液预活化30μL组织蛋白酶B储备溶液(16μM)10min。将组织蛋白酶B溶液稀释于13.17mL水中，然后将735μL活化酶混合物加入孵育板中。在37℃水浴中孵育混合物。在不同的时间点(例如0h、1h、2h、4h、6h、24h)，通过取100μL等分试样并用400μL冷的IS强化淬灭溶液淬灭来终止反应。将样品混合并以4000rpm离心20min。取50μL上清液放入容纳有150μL超纯水的新板中并充分混合样品，然后提交LC-MS/MS分析。
异种移植模型
对于细胞来源异种移植(CDX)模型，对小鼠(balb/c裸鼠，雌性，研究开始时18-23g)接种HT1080细胞(0.2ml PBS中的5.0×106个细胞/小鼠，在右胁腹部接种)。当平均肿瘤体积达到预先指定的起始大小时，将动物随机分组。组的大小为n＝4。所有研究均包括载剂处理对照。
通过静脉推注进行给药。使用卡尺以两个维度测量肿瘤体积，并使用下式表示体积，单位为mm3：V＝0.5a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长直径和短直径。所有异种移植研究均在药明康德(Wuxi AppTec)(上海)有限公司进行。
CD-1小鼠中双环缀合物的血浆药代动力学和释放的有效载荷
通过尾静脉注射，用在25mM组氨酸HCl，10％蔗糖，pH 7中配制的每种双环缀合物对雄性CD-1小鼠进行给药。在每个时间点，通过下颌下静脉或大隐静脉进行系列采血(约80μL血液/时间点)。立即将所有血液样品转移到预冷的含有2μL K2-EDTA(0.5M)作为抗凝剂的微量离心管中，并置于湿冰上。通过在大约4℃以3000g离心立即处理血液样品以获得血浆。立即将包含内标的沉淀剂(350μL)加入35μL血浆样品中，充分混合并在4℃以3220g离心15分钟。将上清液转移至预先标记的聚丙烯微量离心管中，然后在干冰上快速冷冻。根据需要将样品储存在70℃或更低的温度直至分析。将上清液样品与50μL水混合，充分涡旋并在4℃以3220g离心15分钟。使用带有AB Sciex 6500+Triple Quad MS的Acquity UPLC，在正离子模式下进样上清液样品以进行LC-MS/MS分析，以确定双环缀合物的浓度和释放的有效载荷。使用Phoenix WinNonlin 6.3软件程序，通过非房室方法分析血浆浓度对时间数据。报告了C0、Cl、Vdss、T1/2、AUC(0-末点)、AUC(0-无限)、MRT(0-末点)、MRT(0-无限)和血浆浓度对时间谱(profile)的曲线图。
测量血浆、肌肉和肿瘤样本中的MMAE
对来自体内异种移植研究的肿瘤样品进行称重，进行均质化(在包含蛋白酶抑制剂的匀浆缓冲液中10×稀释)。然后根据标准程序通过LC-MS/MS分析肿瘤匀浆和血浆。
经过测试的化合物
如上文所述构建用于以下研究的化合物，诺氟沙星用作替代有效载荷，通过PAB自牺牲基团(self-immolating group)与本发明的二/三肽接头缀合。在N-末端用5-(二甲氨基)-5-氧代戊酸对肽接头进行封端，示意图如下：
Figure BDA0004159193090000381
双环毒素缀合物(BTC)
通过制备带有叠氮化物的毒素/接头序列合成并入本发明的二/三肽接头的BTC。在此，MMAE细胞毒素通过PAB自牺牲基团与肽可切割接头连接，所述PAB自牺牲基团使用铜催化的叠氮化物-炔烃环加成与双环肽MT1-MMP结合剂(BCY3900；如WO 2016/067035中所述，为SEQ ID NO：5)缀合。
Figure BDA0004159193090000382
实施例1：使用本发明的接头的血浆稳定性分析
显示了用碱性非天然氨基酸替换CatB敏感的二肽接头Cit-Val中的瓜氨酸残基增加了接头与小鼠血浆体外孵育时对非特异性切割的稳定性。这是通过以下显示的：在表1中，当与Cit-Val接头(BCY9422)相比时，经过测试的化合物的半衰期延长。
表1：在二肽接头中用碱性非天然氨基酸替换P1位的CitCit-Val→BAA-Val(BAA＝碱性非天然氨基酸)
Figure BDA0004159193090000391
Figure BDA0004159193090000392
在一些情况下(如使用Agb和Dab)，当含有Cit-Val-Glu基序(据报道具有比Cit-Val更高的小鼠血浆稳定性)的接头内瓜氨酸被替换时，可以看到加和作用，其中并入碱性残基的类似接头表现出比Cit-Val-Glu进一步增加的小鼠血浆稳定性，如表2所示。
表2：在三肽接头中用碱性非天然氨基酸替换P1位的CitCit-Val-Glu→BAA-Val-Glu(BAA＝碱性非天然氨基酸)
Figure BDA0004159193090000393
Figure BDA0004159193090000394
并入在P1位置具有碱性非天然氨基酸的接头的BTC显示出增加的小鼠血浆稳定性，例如具有Dab-Val可切割接头的BTC(参见表3中的BCY10989)在小鼠血浆(EDTA抗凝剂)中的半衰期为30.8小时，而Cit-Val的半衰期为6.8小时(参见表3中的BCY7761)。
当P3位置并入Glu时，与其Cit对应物相比，在P1位置具有Dab的接头显示出增强的血浆稳定性(参见人血浆中Cit-Val-Glu与Dab-Val-Glu相比，大鼠和小鼠EDTA抗凝剂血浆中Cit-1Nal-Glu与Dab-1Nal-Glu相比)。
表3：BTC的血浆稳定性
Figure BDA0004159193090000401
Figure BDA0004159193090000402
实施例2：使用本发明的接头的CatB切割速率分析
用碱性非天然氨基酸替换CatB敏感的二肽接头Cit-Val中的瓜氨酸残基还调节接头的组织蛋白酶B切割速率。例如，与Cit-Val相比，Dab、Agb和Agb(Me)各个在体外增加组织蛋白酶B的切割速率(参见表4)。Dap和Dap(CNNH2)降低切割速率(参见表4)。
表4：在二肽接头中用碱性非天然氨基酸替换P1位的Cit
Figure BDA0004159193090000403
Figure BDA0004159193090000404
用碱性非天然氨基酸替换CatB敏感的三肽接头Cit-Val-Glu中的瓜氨酸残基调节了接头的组织蛋白酶B切割速率。例如，Dab和Agb在体外显示出与Cit-Val相似的组织蛋白酶B切割速率(参见表5)。用Dap和Dap(CNNH2)替换则降低切割速率(参见表5)。
表5：在三肽接头中用碱性非天然氨基酸替换P1位的Cit
Figure BDA0004159193090000411
Figure BDA0004159193090000412
可以通过在P1和P2位置引入不同的非天然氨基酸来调节接头的组织蛋白酶B切割速率。BTC的CatB切割分析结果可见于表6，其中在Cit-Val接头中用Dab替换Cit得到切割更慢的接头。当在P3位置将Glu引入这些序列时，两种接头之间的切割速率相当。用Dap替换P1位置显著减慢接头的CatB切割。用1Nal替换P2位置的Val显著减慢CatB切割，而其区域异构体2Nal仅略微降低切割动力学。在P2并入Dpa大幅降低CatB切割速率，cBu完全抑制切割。
表6：BTC的CatB切割
Figure BDA0004159193090000413
Figure BDA0004159193090000414
实施例3：使用本发明的接头的血浆蛋白结合分析
改变P1和P2位置的氨基酸可以调节BTC的血浆蛋白结合。表7表明，将P1位置的Cit替换为Dab增加了未结合百分比。将P2位置的Val替换为1Nal降低了未结合百分比。
表7：BTC的血浆蛋白结合
Figure BDA0004159193090000421
Figure BDA0004159193090000422
实施例4：使用本发明的接头的药代动力学分析
替换二肽接头的氨基酸可以改变BTC的药代动力学(PK)谱。
小鼠
图1至图6和表8所示的结果表明，在小鼠PK研究中，P2位置含有1Nal的接头显示出延长的半衰期。具有增加的小鼠血浆稳定性的接头显示出血浆中游离MMAE的相对水平低于Cit-Val(相对于母体化合物)。
表8：小鼠药代动力学分析的概要
Figure BDA0004159193090000423
大鼠
图7和图8和表9所示的大鼠PK实验结果显示，与Cit-Val类似物BCY7761相比，BCY10984具有延长的半衰期。血浆中的游离MMAE毒素也较少(相对于完整的母体)。
表9：大鼠药代动力学分析的概要
化合物 接头 PPB(未结合％) t1/2(h) AUC比例
BCY7761 Cit-Val 11％ 0.49 0.00445
BCY10984 Cit-1Nal-Glu 4％ 1.83 0.0000936
实施例5：肿瘤减少效力和肿瘤中的毒素水平
图9和图10所示的结果表明，BCY10984(Cit-1Nal-Glu接头)在小鼠CDX模型(HT1080细胞)中显示出比BCY7761(BT1769–Cit-Val接头)更高的效力，以1mg/kg和3mg/kg给药一剂后表现出完全肿瘤清除。动物的体重在这些剂量下不受影响。
图11至图15所示的结果表明，与相同剂量的BT1769相比，当将BCY10984施用于荷有HT1080肿瘤的小鼠时，在肿瘤中观察到更高水平的MMAE毒素。血浆和肌肉组织中存在类似水平的MMAE。
实施例6：在BALB/c裸鼠的HT1080异种移植模型中使用本发明的接头的体内效力 研究
(a)研究目的
本研究的目的是评估BCY10984和BCY12951(含有与BCY10984相同的接头但与非结合双环肽配体缀合的药物缀合物，即具有以下组成：MMAE-PAB-(Dab-Val-Glu)-非结合双环肽)在BALB/c裸鼠的HT1080异种移植模型中的体内治疗效力。
(b)实验设计
组别 N 处理 剂量 给药体积 途径 方案
1 5 载剂 -- 10mL/kg iv qw×2
2 5 BCY10984 5μM 10mL/kg iv qw×3
3 5 BCY10984 15μM 10mL/kg iv qw×3
4 5 BCY10984 45μM 10mL/kg iv qw×3
5 5 BCY12951 5μM 10mL/kg iv qw×2
6 5 BCY12951 15μM 10mL/kg iv qw×2
7 5 BCY12951 45μM 10mL/kg iv qw×3
注：在2～3个给药周期后监测小鼠至第39天。
在第14天和第28天对来自第5组和第6组的小鼠给予45μM BCY10984。
(c)材料
(i)动物和饲养条件
动物
物种：小鼠(Mus Musculus)
品系：BALB/c裸鼠
年龄：6-8周
性别：雌性
体重：18-22g
动物数量：35只小鼠加备用
动物供应商：上海灵畅生物科技实验动物有限公司
饲养条件
将小鼠饲养在恒温恒湿的单独通风笼中，每笼5只动物。
·温度：20～26℃。
·湿度：40-70％。
笼：由聚碳酸酯制成。大小为375mm×215mm×180mm。垫料是玉米芯，每周更换两次。
饮食：在整个研究期间，动物可以自由获得辐照灭菌的干颗粒食物。
水：动物可以自由获得无菌饮用水。
笼的识别：每个笼的识别标签包含以下信息：动物数量、性别、品系、接收日期、处理、研究编号、组别编号和处理开始日期。
动物识别：使用耳号标记动物。
(d)实验方法和程序
(i)细胞培养
在37℃，在空气中5％CO2的气氛中，在补充有10％热灭活胎牛血清的EMEM培养基中维持HT1080细胞。常规传代培养肿瘤细胞，每周两次。收获生长在指数生长期的细胞并计数，用于肿瘤接种。
(ii)肿瘤接种
在每只小鼠右侧胁腹皮下接种0.2ml PBS中的HT1080肿瘤细胞(5×106)用于肿瘤发生。当平均肿瘤体积达到320mm3时，将动物随机分组用于效力研究。每组中的测试品施用和动物数量示于实验设计表中。
(iii)测试品制剂的制备
Figure BDA0004159193090000441
(iv)观察
研究中与动物操作、管理和处理相关的所有程序均按照药明康德(WuXi AppTec)动物管理和使用机构委员会(IACUC)批准的指南进行，并遵循实验动物管理评估和认证协会(AAALAC)的指导。在常规监测时，检查肿瘤生长和处理对动物的正常行为的任何影响，所述行为如活动能力、食物和水的消耗(仅通过观察)、体重增加/减少、眼睛/毛发无光泽和如方案中所述的任何其它异常影响。基于每个子集内的动物数量记录死亡和观察到的临床体征。
(v)肿瘤测量和终点
主要终点是看是否可以延迟肿瘤生长或是否可以治愈小鼠。使用卡尺以两个维度测量肿瘤体积，每周三次，并使用下式表示体积，单位为mm3：V＝0.5a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长直径和短直径。然后将肿瘤尺寸用于计算T/C值。T/C值(百分比)是抗肿瘤有效性的一个指征；T和C分别是处理组和对照组在给定日期的平均体积。
使用下式计算每组的TGI：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100；Ti是处理组在给定日期的平均肿瘤体积，T0是处理开始当天处理组的平均肿瘤体积，Vi是载剂对照组在与Ti同一天的平均肿瘤体积，V0是处理开始当天载剂组的平均肿瘤体积。
(vi)统计分析
在每个时间点为每组的肿瘤体积提供概括统计量，包括平均值和平均值的标准误(SEM)。
对最终给药后最佳治疗时间点获得的数据进行组间肿瘤体积差异的统计分析。
进行单因素方差分析以比较组间的肿瘤体积，当获得显著的F-统计量(处理方差与误差方差的比率)时，用Games-Howell检验进行组间比较。进行双尾T检验以比较两组之间的肿瘤体积。使用GraphPad 5.0分析所有数据。认为P<0.05为统计显著。
(e)结果
(i)肿瘤生长曲线
肿瘤生长曲线示于图16和图17中。
(ii)肿瘤体积跟踪
荷有HT1080肿瘤的雌性BALB/c裸鼠随时间推移的平均肿瘤体积示于表10：
表10：肿瘤体积随时间推移的跟踪
Figure BDA0004159193090000451
Figure BDA0004159193090000461
(iii)肿瘤生长抑制分析
基于处理开始后第11天的肿瘤体积测量值，计算HT1080异种移植模型中BCY10984和BCY12951的肿瘤生长抑制率。
表11：肿瘤生长抑制分析
Figure BDA0004159193090000462
a.平均值±SEM；
b.将处理组的组平均肿瘤体积除以对照组的组平均肿瘤体积(T/C)来计算肿瘤生长抑制。
(f)结果汇总和讨论
在本研究中，评估了BCY10984和BCY12951在HT1080异种移植模型中的治疗效力。在不同时间点测量的所有处理组的肿瘤体积示于图16和图17和表10和表11中。
载剂处理小鼠的平均肿瘤体积在处理开始后第11天达到1731mm3。5μM qw(TV＝1257mm3，TGI＝33.6％，p>0.05)、15μM qw(TV＝288mm3，TGI＝102.3％，p<0.001)和45μM qw(TV＝15mm3，TGI＝121.6％，p<0.001)的BCY10984显示出剂量依赖性抗肿瘤活性。其中，45μM qw的BCY10984在第16天完全根除肿瘤。5μM qw(TV＝1011mm3，TGI＝51.1％，p<0.01)和45μM qw(TV＝901mm3，TGI＝58.9％，p<0.001)的BCY12951显示出显著的抗肿瘤活性。
当比较两种测试品之间的抗肿瘤效力时，5μM的BCY10984显示出与5μMBCY12951相当的抗肿瘤效力(p>0.05)，15μM和45μM的BCY10984显示出比相同摩尔剂量的BCY12951更强效的效力(15μM BCY10984与15μM BCY12951相比，p<0.001；45μM BCY10984与45μMBCY12951相比，p<0.001)。
用45μM BCY10984处理第5组和第6组中的7只动物，平均起始肿瘤大小为1291mm3。所有小鼠在第一次给药后显示出突然的肿瘤消退，第二次给药后所有肿瘤均被完全根除。

Claims (13)

1.一种接头，其包含-P1-P2-P3-部分，其中：
P1表示碱性非天然氨基酸或其衍生物；
P2表示疏水性氨基酸或疏水性非天然氨基酸；并且
P3不存在或表示酸性氨基酸或酸性非天然氨基酸，使得当P1表示Cit且P2表示Val时，P3必须表示酸性非天然氨基酸。
2.根据权利要求1所述的接头，其中P1表示选自以下的碱性非天然氨基酸：2-氨基-4-胍基丁酸(Agb)；2-氨基-4-(3-甲基胍基)丁酸(Agb(Me))；2,4-二氨基丁酸(Dab)；2,3-二氨基丙酸(Dap)；2-氨基-3-胍基丙酸(Dap(CNNH2))；和瓜氨酸(Cit)，例如瓜氨酸(Cit)。
3.根据权利要求1或2所述的接头，其中P2表示选自以下的疏水性氨基酸：Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp和Val，或选自环丁基、二苯丙氨酸(Dpa)、1-萘基丙氨酸(1Nal)、2-萘基丙氨酸(2Nal)和甲基色氨酸(Trp(Me))的疏水性非天然氨基酸，如选自Val的疏水性氨基酸或选自环丁基、Dpa、1Nal和2Nal的非天然氨基酸，如1-萘基丙氨酸(1Nal)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的接头，其中P3表示选自Asp和Glu的酸性氨基酸，如选自Glu的酸性氨基酸。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的接头，其中所述-P1-P2-P3-部分表示：
P1 P2 P3 Agb Val 不存在 Agb(Me) Val 不存在 Dab Val 不存在 Dap Val 不存在 Dap(CNNH2) Val 不存在 Agb Val Glu Cit 1Nal Glu Dab cBu Glu Dab Dpa Glu Dab 1Nal Glu Dab 2Nal Glu Dab Val Glu Dap Val Glu Dap(CNNH2) Val Glu。
6.一种药物缀合物，其包含与靶标结合的结合剂和细胞毒性剂，其中所述结合剂通过根据权利要求1至5中任一项所述的接头与所述细胞毒性剂连接。
7.根据权利要求6所述的药物缀合物，其中所述结合剂是肽，如抗体或双环肽，特别是双环肽。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的药物缀合物，其中所述细胞毒性剂是DM1或MMAE，如MMAE。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的药物缀合物，当与没有所述接头的缀合物相比时，所述药物缀合物耐受蛋白酶，如耐受组织蛋白酶B的切割。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的药物缀合物，当与没有所述接头的缀合物相比时，所述药物缀合物在血浆中稳定。
11.根据权利要求6至10中任一项所述的药物缀合物，其选自：
BCY10989、BCY10980、BCY10982、BCY10983、BCY10984、BCY10981、BCY10985、BCY10986、BCY10987和BCY10988，如BCY10984。
12.一种药物组合物，其包含根据权利要求6至11中任一项所述的药物缀合物，与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合。
13.根据权利要求6至11中任一项所述的药物缀合物用于预防、抑制或治疗癌症的用途。
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