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CN119776403A - TST3b蛋白质及其相关生物材料在调控番茄可溶性糖含量中的应用 - Google Patents

TST3b蛋白质及其相关生物材料在调控番茄可溶性糖含量中的应用 Download PDF

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CN119776403A
CN119776403A CN202311294131.0A CN202311294131A CN119776403A CN 119776403 A CN119776403 A CN 119776403A CN 202311294131 A CN202311294131 A CN 202311294131A CN 119776403 A CN119776403 A CN 119776403A
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王海敬
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Abstract

本发明公开了降低蛋白质TST3b活性或含量的物质，或抑制或降低所述蛋白质TST3b的编码基因表达物质的应用，所述TST3b蛋白质具体可为如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.2的蛋白质；A2)将A1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同活性的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。TST3b蛋白质及其相关生物材料可用于调控番茄可溶性糖含量和单果重。

Description

TST3b蛋白质及其相关生物材料在调控番茄可溶性糖含量中 的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及TST3b蛋白质及其相关生物材料在调控番茄可溶性糖含量中的应用。
背景技术
可溶性糖是影响番茄甜度和口感的主要成分，在果实风味品质的形成中具有重要作用，是评价番茄果实品质重要的指标。然而，目前关于调控番茄果实可溶性糖含量的研究仍然有限，已经克隆的参与糖含量调控的基因极少，缺乏有效的分子标记辅助育种选择。因此，挖掘新的调控番茄番茄果实可溶性糖含量的基因并加以利用，是解决这一问题的基础和关键，对番茄高产优质育种具有重要的意义。
番茄果实是一种典型的库器官，果实内的可溶性糖80％由叶片等源器官产生的光合产物同化运输而来，20％来自果实自身的光合作用。蔗糖是番茄光合作用的主要同化产物，也是长距离运输的主要形式。在番茄果实的发育期，光合产物以蔗糖形式，从成熟叶片等源器官经韧皮部长距离运输到果实，通过共质体和质外体途径进行卸载。MYB类转录因子SlGLK2调控番茄的果实在靠近番茄果柄的部分(果肩)叶绿体和叶绿素积累，使果肩呈深绿色，同时提高果实光合作用，增加未成熟果实中的淀粉含量，进而使成熟果实中可溶性糖含量提高。SlLIN5编码细胞壁蔗糖转化酶，参与番茄果实蔗糖卸载途径中的质外体途径，该基因的一个SNP导致了编码氨基酸的非同义替换，影响了酶的活性，降低了番茄果实蔗糖的转化效率，进而降低果实可溶性糖含量。
番茄果实可溶性糖含量是一个复杂的过程，受外界环境和内在基因的协同调控。虽然前人对番茄果实可溶性糖含量已经有了一定的研究，但这些基因在番茄果实可溶性糖含量改良中会带来其它不利性状，利用存在瓶颈。因此，挖掘和克隆番茄果实可溶性糖含量调控基因并加以利用，是解决这一问题的有效途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高番茄可溶性糖含量、单果重，从而提高番茄品质和产量。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了降低蛋白质TST3b活性或含量的物质，或抑制或降低所述蛋白质TST3b的编码基因表达物质的应用，所述应用为下述任一种：
P1、在提高番茄可溶性糖含量中的应用；
P2、在提高番茄甜度中的应用；
P3、在提高番茄口感中的应用；
P4、在提高番茄品质中的应用；
P5、在提高番茄单果重中的应用；
P6、在提高番茄产量中的应用；
P7、在番茄育种中的应用；
所述蛋白质TST3b可为如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
A2)将A1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由A1)衍生的或与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)、A2)或A3)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
上述应用中，所述蛋白质TST3b可来源于番茄。
上述应用中，所述番茄育种为选育可溶性糖含量高、和/或甜度高、和/或品质优、和/或单果重高、和/或产量高的品种。
上述应用中，序列表中SEQ ID No.2由725个氨基酸残基组成。
上文所述一个以上氨基酸残基具体可为十个以内的氨基酸残基。
上述应用中，所述蛋白质TST3b的编码基因可为如下a1)或a2)或a3)所示的DNA分子：
a1)编码序列是序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子；
a2)与a1)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码上文所述蛋白质TST3b的DNA分子；
a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上文所述蛋白质TST3b的DNA分子。
上述应用中，所述调控所述蛋白质TST3b的编码基因可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
上述应用中，降低蛋白质TST3b活性或含量的物质可为敲除所述蛋白质TST3b的编码基因的物质，和/或抑制或降低所述蛋白质TST3b的编码基因表达的物质。
上述应用中，抑制或降低所述蛋白质TST3b的编码基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。
所述基因敲除(geneknockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。
所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默,另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。
上述应用中，所述抑制或降低所述蛋白质TST3b的编码基因表达可为抑制或降低所述基因表达的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可为敲除所述基因的试剂，如通过同源重组敲除所述基因的试剂，或通过CRISPR-Cas9敲除所述基因的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
上述应用中，降低蛋白质TST3b活性或含量的物质，或抑制或降低所述蛋白质TST3b的编码基因表达物质，可为如下c1)-c4)任一种物质：
c1)抑制或降低所述蛋白质TST3b编码基因表达的核酸分子；
c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；
c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物。
c1)所述的核酸分子可为表达靶向上文所述所述蛋白质TST3b编码基因和/或蛋白质B编码基因表达的sgRNA或表达所述sgRNA的DNA分子。
所述sgRNA为名称为sgRNA1的sgRNA和名称为sgRNA2的sgRNA，所述sgRNA1的靶序列为SEQ ID No.1的第59-77位，所述sgRNA2的靶序列为SEQ ID No.1的第117-135位。
术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。所述具有90％或90％以上同一性可为至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％的同一性。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种提高番茄可溶性糖含量、和/或甜度、和/或品质、和/或单果重、和/或产量的方法，包括通过抑制或降低番茄基因组中所述蛋白质TST3b的编码基因的表达量来提高番茄可溶性糖含量、和/或甜度、和/或品质、和/或单果重、和/或产量。
上述抑制或降低番茄基因组中所述蛋白质TST3b的编码基因的表达量可采用现有技术中的任何方式实现，以使基因产生缺失突变、插入突变或碱基变换突变，进而实现基因功能降低或丧失，具体可为化学诱变、物理诱变、RNAi、基因组定点编辑或同源重组等。
上述基因组定点编辑方法中，可采用锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)技术或成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/CRISPR associated，CRISPR/Cas9 system)技术，以及其它能实现基因组定点编辑的技术。无论采取哪种方法，既可对上文所述蛋白的整个编码基因作为靶标，又可将调控上文所述蛋白编码基因表达的各个元件作为靶标，只要能实现基因功能丧失或降低即可。如可以将上文所述蛋白的编码基因的外显子或5’UTR等作为靶标。
上文所述方法可包括向所述番茄中导入降低或抑制上文所述的蛋白质TST3b的活性的物质，或导入降低或抑制所述蛋白质TST3b编码基因表达的物质。所述降低或抑制上文所述的蛋白质TST3b的活性的物质，或降低或抑制所述蛋白质TST3b编码基因表达的物质可为如下c1)-c4)任一种物质：
c1)抑制或降低上文所述蛋白质TST3b编码基因表达的核酸分子；
c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；
c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物。
c1)所述的核酸分子为靶向上文所述蛋白质TST3b编码基因的sgRNA或表达所述sgRNA的DNA分子。
所述sgRNA为名称为sgRNA1的sgRNA和名称为sgRNA2的sgRNA，所述sgRNA1的靶序列为SEQ ID No.1的第59-77位，所述sgRNA2的靶序列为SEQ ID No.1的第117-135位。
上文所述降低或抑制所述蛋白质TST3b编码基因表达为将番茄基因组中的SEQ IDNo.1所示的所述蛋白质TST3b编码基因替换为TST3b-1基因或TST3b-2基因，所述TST3b-1基因是序列表SEQ ID No.1的第132位缺失了核苷酸G，保持SEQ ID No.1的其它核苷酸不变得到的DNA分子；所述TST3b-2基因是将序列表SEQ ID No.1的第131-132位缺失了核苷酸TG，保持SEQ ID No.1的其它核苷酸不变得到的DNA分子。
本发明还保护上述蛋白质TST3b。
本发明还保护与蛋白质TST3b相关的生物材料，所述与蛋白质TST3b相关的生物材料，为下述B1)至B5)中的任一种：
B1)编码TST3b的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子为编码序列是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子。
其中，序列表中SEQ ID No.1由2178个核苷酸组成，编码SEQ ID No.2所示的蛋白质。
上述生物材料中，B2)所述的含有所述核酸分子的表达盒(TST3b基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达TST3b的核酸分子，该核酸分子不但可包括启动TST3b基因转录的启动子，还可包括终止TST3b转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiology 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白质酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利20071 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白质、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。
本发明公开了对番茄TST3b基因进行敲除，提高番茄可溶性糖含量、和/或甜度、和/或品质、和/或单果重、和/或产量的方法。具体利用CRISPR/Cas9系统对出发番茄中TST3b基因进行编辑，且使所述TST3b基因发生突变导致翻译蛋白提前终止，得到转基因番茄，实现出发番茄中TST3b基因编辑。本发明利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对番茄TST3b基因进行特定靶点的定点敲除，获得可溶性糖含量和单果重均显著提高的番茄突变体材料，为番茄品种选育提供新材料。
附图说明
图1为本发明实施例1中TST3b基因表达模式。
图2为本发明实施例1中TST3b基因的编辑载体。
图3为本发明实施例1中TST3b基因编辑植株突变类型。
图4为本发明实施例1中tst3b-cr突变体果实可溶性糖含量表型。
图5为本发明实施例1中tst3b-cr突变体果实重量表型。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。
1载体与菌株
下述实施例中根癌农杆菌EHA105为北京全式金生物技术有限公司产品。
下述实施例中农杆菌AGL1为北京全式金生物技术有限公司产品。
2植物品系
下述实施例中，野生醋栗番茄(Solanum pimpinellifolium)，简称为PP。公众可在美国加州大学戴维斯分校番茄遗传资源中心(Tomato Genetics Resource Center，网址为：https://tgrc.ucdavis.edu/)获得。Accession号为PI365967。
下述实施例中所述含50mg/L的卡那霉素的LB固体培养基的配方为：卡那霉素50mg/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5。
下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
下述实施例采用Excel表格对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用Student’s t检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异。以下实施例中的定量试验，如无特别说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、TST3b基因在番茄不同组织和器官中的时空表达
来自野生醋栗番茄PP的TST3b基因(Solyc03g032040)cDNA的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，其编码的蛋白质TST3b的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
SEQ ID No.1：
ATGAGAGGAGCTGTGCTAATTGCACTTGCTGCTGCCATTGGCAACATGTTGCAAGGATGGGACAATGCGACGATAGCAGGATCTGTTCTTTACATCAAGAAGGAATTTAATTTACAAACACAGCCAACCATGGAAGGGCTAATTGTTGCGATGTCTCTAATTGGAGCGACAGTGATCACGACATTCTCGGGACCTGTATCGGACATGCTTGGGAGACGTCCAATGCTTATAATTTCATCAGTACTTTATTTCCTCAGTGGATTAGTGATGTTATGGGCTCCAAATGTTTATGTGTTGCTTTTAGCAAGGCTCTTAGATGGATTTGGAATTGGTCTTGCGGTGACACTTGTTCCTGTCTATATATCCGAGACTGCCCCACCAGAAATAAGAGGGCAATTGAATACATTTCCACAGTTCACCGGTTCCCTTGGAATGTTTTTGTCATACTGCATGGTTTTTGGAATGTCACTGACACAAGCACCAAGTTGGAGGTTAATGCTTGGGGTTCTATCAATTCCTTCTCTTGCTTACTTCTTTCTTGCATTGTTTTACTTGCCTGAATCTCCAAGGTGGCTGGTCAGTAAAGGTCGAATGAAGGAGGCTAAACAAGTTTTACAGAGACTACGTGGCAGGGAAGATGTCTCAGGTGAAATGGCATTGTTGATGGAAGGTTTAGGTGTTGGAGGTGAAGTATCTATAGAAGAGTATATAATTGGTCCGGACAATGAACTTGCTGACAACCATGATGAGAAAGATCAGATCAAGTTATATGGAGCTGAAGAGGGTCTTTCATGGATAGCAAAACCTGTCACTGGACAAAGTACTCTAGGCCTGGTCTCCCGTCATGGGAGTATGGCAAACCAAAGCATGCCTCTTATGGATCCGTTGGTTACTCTGTTTGGCAGTGTTCATGAGAAGATGCCGGAGATGGGAAGCATGCGAAGCATGCTCTTTTCTAATGTTGGCAGCATGTTCAATATCACAGAGAATCAAGGAAAAACTGATAATTGGGATGAAGAAAGCCAAAAGGATGAGGAAAATCATATGTCTGATGGTTCTGGGGCAGAATCTGATGATAATCTGAGAAGCCCGCTGCTCTCACGTCAAGGTACAAATGCAGAAGGAAATATGGGACCTCCAACATCGTTAAGCATGAGGCAAGGCAGCAATTTCATGCAGGCAAATGGTGTCGGTGAGCAAGCCAGCATGGGTATTGGTGGTGGTTGGCAGCTAGCATACAGAAAAGATGAGAAAAAGGAGGGAGCACTCAAAAGGATCTATTTACATGAAGAAGGAGGCAGTGGATCACGACGGGGGTCCATTATTTCTCTTCCAGGAGATGCTCATGCAGATCAAGCTGAGTTCATTCATGCTGCTGCTTTAGTGAGTCAGTCTGTTCTTCGTGCTGAGAGCGTCTTGGGTCAACAGTCTATAGAAGAAGCAATCGAGACACAATCTGAAACTGTTACAAAGAAGTCAGTCTGGAAAGCACTTCTTGAGCCAGGAGTCAAGCATGCACTGATTGTTGGAGTTGGACTCCAAATACTTCAGCAGTTTTCCGGAATCAACGGGGTTCTTTATTACACTCCTCAAATTCTTGAACAAGCAGGCGTTGGAGTTCTCCTATCGAATATGGGCATTGGTTCAGACTCTGCGTCTTTCCTCATAAGTGCTGTTACAACTTTGTTAATGCTTCCCACCATTGGTGTTGCAATGAGATTAATGGACTTGGCTGGCAGAAGGTGGCTTTTGCTGGCTACATTGCCCGTCTTGTTATCGTCACTTATTGTACTAGTCCTTGGCAATGTTATTAACATGGGTGAGGTCATGCATGCTGTGATCTCCACCGCTAGTGTTGTGGTATACTTCTGCACCTTTGTTATGGGCTTTGGTCCAATCCCAAATATCCTCTGCTCTGAGATATTTCCCACCAGCGTTCGTGGAATCTGTATTGCTATATGTGCTCTTACTTTTTGGATCGGAGACATCATTGTCACCTACTCGCTCCCTGTCATGCTCAACTCCATTGGACTTGGAGGTGTCTTCGCCATCTATGCTGTCGTGTGTGCTGTGGCTTGGGTATTCGTTTTCTTGAAAGTTCCTGAAACAAAGGGCATGCCCCTTGAAGTCATTACAGAGTTCTTCGCCGTTGGAGCTAAGAAAGCTGCCACAGAATAA
SEQ ID No.2：
MRGAVLIALAAAIGNMLQGWDNATIAGSVLYIKKEFNLQTQPTMEGLIVAMSLIGATVITTFSGPVSDMLGRRPMLIISSVLYFLSGLVMLWAPNVYVLLLARLLDGFGIGLAVTLVPVYISETAPPEIRGQLNTFPQFTGSLGMFLSYCMVFGMSLTQAPSWRLMLGVLSIPSLAYFFLALFYLPESPRWLVSKGRMKEAKQVLQRLRGREDVSGEMALLMEGLGVGGEVSIEEYIIGPDNELADNHDEKDQIKLYGAEEGLSWIAKPVTGQSTLGLVSRHGSMANQSMPLMDPLVTLFGSVHEKMPEMGSMRSMLFSNVGSMFNITENQGKTDNWDEESQKDEENHMSDGSGAESDDNLRSPLLSRQGTNAEGNMGPPTSLSMRQGSNFMQANGVGEQASMGIGGGWQLAYRKDEKKEGALKRIYLHEEGGSGSRRGSIISLPGDAHADQAEFIHAAALVSQSVLRAESVLGQQSIEEAIETQSETVTKKSVWKALLEPGVKHALIVGVGLQILQQFSGINGVLYYTPQILEQAGVGVLLSNMGIGSDSASFLISAVTTLLMLPTIGVAMRLMDLAGRRWLLLATLPVLLSSLIVLVLGNVINMGEVMHAVISTASVVVYFCTFVMGFGPIPNILCSEIFPTSVRGICIAICALTFWIGDIIVTYSLPVMLNSIGLGGVFAIYAVVCAVAWVFVFLKVPETKGMPLEVITEFFAVGAKKAATE
为明确TST3b在番茄果实发育过程中的作用，以番茄材料野生醋栗番茄(Solanumpimpinellifolium，简称为PP)开花当天，开花后2、5、10、20天以及绿熟期、转色期、橙熟期、红熟期的果实cDNA为模板，利用qRT-PCR技术检测TST3b的表达量变化。引物序列如下：
TST3b-F：ACAAGCAGGCGTTGGAGTTC(与SEQ ID No.1第1602-1621位序列相同)；
TST3b-R：AGCGGTGGAGATCACAGCAT(与SEQ ID No.1第1832-1851位序列反向互补)。
选用番茄基因SlUBI3作为内参基因，所用引物如下：
Actin-F:TCTTCCGACACCATCGACAA；
Actin-R:AGAACTGCAACACAGTGAGC。
结果如图1所示，TST3b基因在果实发育过程中表达量较高，在果实成熟后表达量较低，表明TST3b基因可能在果实发育中发挥作用。
实施例2、CRISPR/Cas9编辑验证TST3b基因的功能
1、构建TST3b基因的CRISPR/Cas9编辑载体
根据TST3b基因的编码序列(如SEQ ID No.1所示)，通过CRISPR-P(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR/)设计了两个CRISPR/Cas9编辑的靶点序列，具体靶点序列分别命名为靶点1和靶点2，具体为:
靶点1：5’-GGGACAATGCGACGATAGC-3’(对应SEQ ID No.1的第59-77位)；
靶点2：5’-AACACAGCCAACCATGGAA-3’(对应SEQ ID No.1的第117-135位)。
将CRISPR/Cas9方法中靶向靶点1的sgRNA记为sgRNA1，将靶向靶点2的sgRNA记为sgRNA2。
TST3b-CR-F1：ATATATGGTCTCGTTTGGGGACAATGCGACGATAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(斜体指示的序列为与靶点1结合的序列)；
TST3b-CR-R1：ATTATTGGTCTCGAAACTTCCATGGTTGGCTGTGTTCTGCACCAGCCGGGAATCGAA(斜体指示的序列为靶点2结合的序列)。
以pCBC_DT1T2_SlU6p载体(该载体记载在如下文献中：Li R,Sun S,Wang HJ,WangKT,Yu H,Zhou Z,Xin PY,Chu JF,Zhao TM,Wang HZ,Li JY,Cui X.2020.FIS1 encodes aGA2-oxidase that regulates fruit firmness in tomato.Nature Communications11.)为模板，利用引物TST3b-CR-F1和TST3b-CR-R1进行PCR扩增，获得sgRNA1_gRNAscaffold_sgRNA2片段，该片段同时含有sgRNA1和sgRNA2的编码序列。
随后用BsaI酶切sgRNA1_gRNA scaffold_sgRNA2片段和pCAMBIA2300_35S_Cas9_SlU6p_sgRNA载体(该载体记载在如下文献中：Song,J.,Zhang,S.,Wang,X.,Sun,S.,Liu,Z.,Wang,K.,Wan,H.,Zhou,G.,Li,R.,Yu,H.,and Cui,X.(2020).Variations in BothFTL1 and SP5G,Two Tomato FT Paralogs,Control Day-Neutral Flowering.Molecularplant.)，最后利用T4 DNA连接酶进行连接，获得连接产物。在含卡那霉素的LB固体培养基中培养，菌落PCR进行阳性克隆筛选，测序验证序列的正确性，提取质粒待用，即为TST3b基因的CRISPR/Cas9载体，命名为TST3b_CRISPR。图2所示为TST3b_CRISPR结构。
2、获得CRISPR/Cas9编辑突变体
将步骤1构建成功的CRISPR载体TST3b_CRISPR转入农杆菌AGL1中，以野生醋栗番茄(PP)为受体进行农杆菌介导的遗传转化。
获得的8株再生植株，对其中的Cas 9基因进行PCR检测，检测引物为Cas 9-F和Cas9-R：
Cas 9-F:CACTATCCTTCGCAAGACCC；
Cas9-R：GAGATTCCCGAACAAGCCG。
对PCR产物进行凝胶电泳检测，有6株植物检测到Cas9基因。
对TST3b基因的编辑位点进行PCR扩增，扩增引物为CR-TST3b-F和CR-TST3b-R组成的引物对：
CR-TST3b-F：AACATGTTGCAAGGATGGG；
CR-TST3b-R：TGACAAAAACATTCCAAGGGA。
PCR产物测序，最终获得2株纯合突变植株。
将上述T0代纯合突变植株单株留种获得T1代种子播种，选取不含Cas9基因(检测引物为Cas 9-F和Cas9-R)的T1代植株，自交留种后，获得两个独立的TST3b突变类型不同的CRISPR株系，分别命名为tst3b-cr1和tst3b-cr2。其基因编辑位点序列如图3所示：
与野生型(WT)相比，tst3b-cr1(图3中标为tst3bcr1)基因组中，TST3b基因发生了突变：在靶点2(Target2)上，在SEQ ID No.1的第132位缺失了核苷酸G，共缺失1bp，导致TST3b基因移码突变，得到TST3b-1基因，无法编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质TST3b，最终致使TST3b功能丧失，从而将TST3b基因敲除。
与野生型(WT)相比，tst3b-cr2(图3中标为tst3bcr2)基因组中，TST3b基因发生了突变：靶点2(Target2)上，在SEQ ID No.1的第131-132位缺失了核苷酸TG，共缺失2bp，导致TST3b基因移码突变，得到TST3b-2基因，无法编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质TST3b，最终致使TST3b功能丧失，从而将TST3b基因敲除。
3、调查CRISPR突变体可溶性糖含量表型
为了鉴定CRISPR材料的表型，将纯合突变且无Cas 9的CRISPR材料(tst3b-cr1和tst3b-cr2)和野生型PP(WT)种植于日光温室，设置3个重复，每个株系每重复种植5株。
分别取第2-第4穗红熟果实的果皮，液氮冷冻研磨后混合，液相质谱联用，进行可溶性糖含量检测。
结果如图4所示，与野生型对照相比，CRISPR突变体植株(tst3b-cr1和tst3b-cr2)均表现为可溶性糖含量显著增加。该结果证明TST3b是番茄果实可溶性糖含量重要调控基因。
4、调查CRISPR突变体果实重量表型
为了鉴定CRISPR材料的表型，将纯合突变且无Cas 9的CRISPR材料(tst3b-cr1和tst3b-cr2)和野生型PP(WT)种植于日光温室，设置3个重复，每个株系每重复种植5株。
果实红熟后，统计第2-4穗每穗果实的总重量和果实数量，并计算平均果实重量。
结果如图5所示，与野生型对照相比，CRISPR突变体植株(tst3b-cr1和tst3b-cr2)表现为果重显著增加。该结果证明TST3b敲除后，在提高番茄果实可溶性糖含量的同时，果重同时增加。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.降低蛋白质TST3b活性或含量的物质，或抑制或降低所述蛋白质TST3b的编码基因表达物质的应用，其特征在于：所述应用为下述任一种：
P1、在提高番茄可溶性糖含量中的应用；
P2、在提高番茄甜度中的应用；
P3、在提高番茄口感中的应用；
P4、在提高番茄品质中的应用；
P5、在提高番茄单果重中的应用；
P6、在提高番茄产量中的应用；
P7、在番茄育种中的应用；
所述蛋白质TST3b可为如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
A2)将A1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由A1)衍生的或与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)、A2)或A3)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白质TST3b来源于番茄。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述蛋白质TST3b的编码基因为如下a1)或a2)或a3)所示的DNA分子：
a1)编码序列是序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子；
a2)与a1)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码上文所述蛋白质TST3b的DNA分子；
a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上文所述蛋白质TST3b的DNA分子。
4.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的应用，其特征在于：降低蛋白质TST3b活性或含量的物质，或抑制或降低所述蛋白质TST3b的编码基因表达物质，为如下c1)-c4)任一种物质：
c1)抑制或降低所述蛋白质TST3b编码基因表达的核酸分子；
c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；
c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物。
5.根据权利要求1-4中任一权利要求所述的应用，其特征在于：c1)所述的核酸分子为靶向权利要求1-3任一所述蛋白质TST3b编码基因的sgRNA或表达所述sgRNA的DNA分子。
6.根据权利要5所述的应用，其特征在于：所述sgRNA为名称为sgRNA1的sgRNA和名称为sgRNA2的sgRNA，所述sgRNA1的靶序列为SEQ ID No.1的第59-77位，所述sgRNA2的靶序列为SEQ ID No.1的第117-135位。
7.一种提高番茄可溶性糖含量、和/或甜度、和/或品质、和/或单果重、和/或产量的方法，其特征在于，包括通过抑制或降低番茄基因组中权利要求1-3任一所述的蛋白质TST3b的编码基因的表达量来提高番茄可溶性糖含量、和/或甜度、和/或品质、和/或单果重、和/或产量。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法包括向所述番茄中导入降低权利要求1-3任一所述蛋白质TST3b活性或含量的物质，或导入降低权利要求1-3任一所述蛋白质TST3b的编码基因的表达的物质；所述降低权利要求1-3任一所述蛋白质TST3b活性或含量的物质，或导入降低权利要求1-3任一所述蛋白质TST3b的编码基因的表达的物质为如下c1)-c4)任一种物质：
c1)抑制或降低所述蛋白质TST3b编码基因表达的核酸分子；
c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；
c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：c1)所述的核酸分子为靶向权利要求1-3任一所述蛋白质TST3b编码基因的sgRNA或表达所述sgRNA的DNA分子。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述降低或抑制所述蛋白质TST3b编码基因表达为将番茄基因组中的SEQ ID No.1所示的所述蛋白质TST3b编码基因替换为TST3b-1基因或TST3b-2基因，所述TST3b-1基因是序列表SEQ ID No.1的第132位缺失了核苷酸G，保持SEQ ID No.1的其它核苷酸不变得到的DNA分子；所述TST3b-2基因是将序列表SEQ IDNo.1的第131-132位缺失了核苷酸TG，保持SEQ ID No.1的其它核苷酸不变得到的DNA分子。
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