CN107022563A - 转基因植物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及表达编码作为移动信号起作用的蛋白的核酸构建体的具有增加的氮代谢的转基因植物。

Description

转基因植物

发明领域

本发明涉及具有改善的特性，例如生长，和改善的氮代谢的表达移动信号HY5的转基因植物，制备这样的植物的方法和用于改善氮代谢和生长的方法。

背景技术

氮(N)对作物发育是根本的，因为它形成很多有机分子、核酸和蛋白的基础成分。N营养影响所有水平的植物功能，从代谢到资源分配，生长和发育。由于施用的有机和肥料N的强烈的硝化，对于植物根的N获取的最丰富的来源是天然有氧土壤中的硝酸根(NO3^-)。

在过去的五十年期间，全球作物生产能力品著增加，这主要是由于改良的作物品种和化肥、特别是氮的大量投入。然而，对于很多作物，肥料N利用效率仅为约30-50％，大部分损失到环境中，导致各种有害影响，如空气和水质的恶化以及生物多样性的丧失(Ju，X.T.等人Proc Natl AcadSci USA.106，3041-3046(2009))。此外，氮是供应的最昂贵的营养物之一并且商购肥料代表了植物生产中的主要成本。据估计，环境中多余的N目前每年花费欧盟700亿欧元到3200亿欧元(Sutton等人，Nature 472，159-61(2011)。在中国，过去30年间谷物产量的增加伴随着N利用效率(NUE)从55急剧减少到20kg谷物/kg施用的肥料N(Guo，等人Science 327，1008-1010(2010))。增加NUE和限制氮肥料使用都是保护环境和改善可持续和多产的农业的重要挑战。该挑战特别与需要大量N肥以获得最大产量并且估计NUE远小于50％的谷类作物相关(Hirel等人，Journal ofExperimental Botany，Vol.58，No.9，pp.2369-2387(2007))。

因此重要的是鉴别控制植物N代谢(包括N利用效率(NUE)和N摄取)的关键步骤。对于大多数植物物种，NUE主要取决于植物怎样从土壤提取无机氮，吸收硝酸盐和铵，以及循环有机氮。NUE可以定义为每单位的土壤中可获得的N(包括土壤和肥料中存在的残留N)的谷物产率，即产出(总植物N、谷物N、生物量产率、谷物产率)和投入(施用的总N、土壤N或N-肥)的比率。因此，NUE可以分为两个过程：摄取效率(NupE；植物从土壤以硝酸根和铵离子去除N的能力)和利用效率(NutE；使用N产生谷物产量的能力)。

植物对氮的利用涉及多个步骤，包括摄取、吸收、迁移，和当植物衰老时，再循环和再活化。为了控制土壤中改变的硝酸根浓度，植物根发展出至少三种硝酸根摄取体系，两个高亲和力转运体系(HATS)和一个低亲和力转运体系(LATS)，负责硝酸根的获得(Crawfordand Glass Trends Plant Sci3：389-395(1998))。组成型HATS(cHATS)和硝酸根诱导型HATS(iHATS)操作从而在外部介质中以低的硝酸根浓度摄取硝酸根，饱和范围是0.2-0.5mM。相比之前，LATS在硝酸根获得中以较高外部硝酸根浓度起作用。通过LATS和HATS的摄取由分别属于NRT1和NRT2家族的硝酸根转运蛋白介导。经由根的摄取通过负反馈调节，将硝酸根摄取的表达和活性与植物的N状态相关联。

拟南芥(At)蛋白HY5，是一种碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子，已知其整合多种植物激素的(例如，生长素和脱落酸)和环境的(例如，低温)信号，并且在控制植物光敏形态发生的发育(photomorphogenic development)中发挥作用(18，28-30)。还已知侧根形成在丧失hy5功能的突变体中增加(18，28)。

已经确立，嫩芽到根的长距离信号传导诱导根生长和N摄取(26，27)。本发明人首次鉴别了该信号的分子基础并且表明HY5是介导植物中N代谢的嫩芽到根移动信号。这提供了用于改善作物中营养利用效率的备选策略。

多产的农业需要大量昂贵的含氮肥料。改善作物植物的NUE因此至关重要。需要为作物植物提供更多地营养有效基因型以保证用于全球食品安全的可持续作物生产，并且减少化肥投入的成本和消极环境效应，如对空气和水质量的消极环境效应，和生物多样性的丧失。本发明旨在解决该需求。

发明概述

本发明人出人意料地发现，HY5参与N代谢。如本文中所述的实例中表明的，在转基因植物中表达AtHY5导致根中硝酸根摄取的增加。此外，本发明人表明，HY5作为响应光从嫩芽移动到根的移动信号起作用并且介导根生长和硝酸根摄取。因此，尽管HY5在根中产生，仅当由于光感在嫩芽/叶中产生的HY5蛋白移动到根时，其积累至有效水平，并且诱导根发育和NO3^-摄取。

HY5是调节光响应的碳和氮代谢、使得植物能够在对环境光改变的整个生物响应中协调嫩芽和根生长的嫩芽-根移动蛋白的出人意料的发现，打开了增强作物营养利用、生长和生产率的生物技术途径的方法，特别是使用组织特异性启动子以提升HY5水平用于有利的效应。

在第一个方面，本发明涉及用于增加植物中氮代谢的方法，其包括在植物中引入并表达包含HY5核酸序列的核酸构建体。

在另一方面，本发明涉及转基因植物，其包含含有HY5核酸序列和组织特异性调节序列的核酸构建体。

在另一方面，本发明涉及转基因植物，其包含含有HY5核酸序列的核酸构建体，其中所述植物不是拟南芥。

在另一方面，本发明涉及包含HY5核酸序列和组织特异性启动子的核酸构建体。

在进一步的方面，本发明涉及包含如本文中所述的核酸构建体的载体。

在另一方面，本发明涉及宿主细胞，其包含如本文中所述的核酸构建体或如本文中所述的载体。

在进一步的方面，本发明涉及用于产生具有增加的氮摄取的植物的方法，其包括在植物中引入并表达包含HY5核酸序列和组织特异性启动子的核酸构建体。

在另一方面，本发明涉及用于增加植物根中HY5蛋白的存在的方法，其包括在植物中引入并表达包含与绿色组织特异性启动子可操作连接的HY5核酸序列的核酸构建体。

在另一方面，本发明涉及用于调节植物中C和N代谢平衡的方法，其包括在植物中引入并表达包含HY5核酸序列的核酸构建体。

在另一方面，本发明涉及用于增加植物根中HY5蛋白的存在的方法，其包括在植物的绿色组织中引入并表达包含HY5核酸序列的核酸构建体。

在最后的方面，本发明涉及遗传改变的植物，其中所述植物在内源性HY5核酸序列或内源性HY5启动子中携带突变，或其中所述突变向植物基因组中引入至少一个额外拷贝的HY5核酸。

综上所述，本发明提供下述技术方案：

1.用于增加植物中氮代谢的方法，所述方法包括在植物中引入并表达包含HY5核酸序列的核酸构建体。

2.根据第1项所述的方法，其中所述核酸构建体包含编码SEQ ID NO：3所限定的AtHY5蛋白或其功能变体的SEQ ID NO：1或2或编码SEQ IDNO：3的同系物的核酸序列。

3.根据第2项所述的方法，其中所述同系物与SEQ ID NO：3具有至少30％的序列同一性。

4.根据第2或3项所述的方法，其中所述同系物选自SEQ ID NOs：4至29。

5.根据前述各项所述的方法，其中所述植物选自玉米、水稻、小麦、欧洲油菜/加拿大油菜、高粱、大豆、向日葵、苜蓿、马铃薯、番茄、烟草、葡萄、大麦、豌豆、豆、蚕豆、莴苣、棉花、甘蔗、糖用甜菜、西兰花或其他芸苔属蔬菜或杨树。

6.根据前述各项所述的方法，其中所述核酸构建体包含调节序列。

7.根据第6项所述的方法，其中所述调节序列选自组成型启动子或组织特异性启动子。

8.根据第7项所述的方法，其中所述组织特异性启动子是绿色组织特异性启动子。

9.转基因植物，其包含含有HY5核酸序列和组织特异性调节序列的核酸构建体。

10.根据第9项所述的转基因植物，其中所述组织特异性启动子是绿色组织特异性启动子。

11.根据第10项所述的转基因植物，其中所述核酸构建体包含编码SEQ ID NO：3限定的AtHY5蛋白的SEQ ID NO：1或2或编码SEQ ID NO：3的同系物的核酸序列。

12.根据第11项所述的转基因植物，其中所述同系物与SEQ ID NO：3具有至少30％的序列同一性。

13.根据第11或12项所述的转基因植物，其中所述同系物来自SEQID NOs：4至29。

14.根据第9-13项中任一项所述的转基因植物，其中所述植物选自玉米、水稻、小麦、欧洲油菜/加拿大油菜、高粱、大豆、向日葵、苜蓿、马铃薯、番茄、烟草、葡萄、大麦、豌豆、豆、蚕豆、莴苣、棉花、甘蔗、糖用甜菜、西兰花或其他芸苔属蔬菜或杨树。

15.转基因植物，其包含含有HY5核酸序列的核酸构建体，其中所述植物不是拟南芥。

16.核酸构建体，其包含HY5核酸序列和组织特异性启动子。

17.根据第16项所述的核酸构建体，其中所述组织特异性启动子是绿色组织特异性启动子。

18.根据第16或17项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含编码SEQ IDNO：3所限定的AtHY5蛋白的SEQ ID NO：1或2或编码SEQID NO：3的同系物的核酸序列。

19.根据第18项所述的核酸构建体，其中所述同系物与SEQ ID NO：3具有至少30％的序列同一性。

20.根据第18项所述的核酸构建体，其中所述同系物选自SEQ IDNOs：4至29。

21.根据第16至20项中任一项所述的核酸构建体，其中所述植物选自玉米、水稻、小麦、欧洲油菜/加拿大油菜、高粱、大豆、向日葵、苜蓿、马铃薯、番茄、烟草、葡萄、大麦、豌豆、豆、蚕豆、莴苣、棉花、甘蔗、糖用甜菜、西兰花或其他芸苔属蔬菜或杨树。

22.载体，其包含根据第16至21项中任一项所述的核酸构建体。

23.宿主细胞，其包含根据第16至21项中任一项所述的核酸构建体或根据第22项所述的载体。

24.用于产生具有增加的氮摄取的植物的方法，其包括向植物中引入并表达包含HY5核酸序列和组织特异性启动子的核酸构建体。

25.用于增加植物根中HY5蛋白的存在的方法，其包括在植物中引入并表达包含与绿色组织特异性启动子可操作连接的HY5核酸序列的核酸构建体。

26.用于调节植物中C和N代谢之间的平衡的方法，其包括在植物中引入并表达包含HY5核酸序列的核酸构建体。

27.用于增加植物根中HY5蛋白的存在的方法，其包括在植物的绿色组织中引入并表达包含HY5核酸序列的核酸构建体。

28.遗传改变的植物，其中所述植物在内源性HY5核酸序列或内源性HY5启动子携带突变或其中所述突变将至少一个额外拷贝的HY5核酸引入植物基因组。

本发明在以下非限制性附图中进一步描述。

附图

图1.HY5调控根生长和NRT2.1-依赖性的NO3^-摄取的嫩芽-照射促进。(A)差别性嫩芽/根照射条件的图示。将5-日龄幼苗暴露于3天差别性光处理(100μmol.s^-1.m^-2)：照射的(S(L))或暗生的(S(D))嫩芽，照射的(R(L))或暗生的(R(D))根。(B)对WT和hy5-526初生根生长的差别性嫩芽/根照射效应。箭头表明实验开始时的根尖位置。比例尺，1cm。(C)对WT、hy5-526、hy5和cop1-4幼苗初生根延伸长度的差别性嫩芽/根照射影响。(D)对幼苗根的¹⁵NO3^-摄取的差别性嫩芽/根照射影响。(E)对10-日龄嫁接的植物的初生根延伸长度的差别性嫩芽/根照射影响。嫁接物表示为接穗/砧木(例如，HY5/hy5-526具有HY5接穗和hy5-526砧木)。(F)对如(E)中嫁接的植物的根的¹⁵NO3^-摄取的差别性嫩芽/根照射影响。(C-F)数据表示为平均值±s.e.m.(n＝30)。相同的小写字母表示平均值之间不显著的差异(P＜0.05)。

图2.HY5从嫩芽到根迁移调节根生长和NO3^-摄取。

(A)对转基因植物的初生根延伸生长的差别性嫩芽/根照射影响。(B)HY5-GFP在pHY5；HY5-GFP hy5根中的分布。(C)在pCAB3：HY5-GFP hy5根中可检测的HY5-GFP的分布。(D)14-日龄植物中的相对myc-HY5转录物丰度，相对于pCAB3：myc-HY5hy5植物的水平的转录设为1。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝3)。(E)嫩芽(S)和根(R)中myc-HY5的免疫学检测，HSP90上样对照。(F)嫩芽-照射的pCAB3：HY5-GFP hy5/hy5嫁接物的根中HY5-GFP的分布。(G)嫩芽-照射的表达TEV蛋白酶的pCAB3：2×GUS TEV^re-HY5-GFP hy5植物的根中HY5-GFP的检测。(H)对表达TEV蛋白酶的植物的初生根延伸生长的差别性嫩芽/根照射影响。(I)对表达TEV蛋白酶的植物的根¹⁵NO3^-摄取的差别性嫩芽/根照射影响。(J)对根中pHY5：GFP转基因的表达的差别性嫩芽/根照射影响。(K)幼苗根(如所示嫁接的)中HY5-GFP的分布。(B，C，F，G，J，K)比例尺，50μm。(A，D，H，I)数据表示为平均值±s.e.m.(n＝30)。相同的小写字母表示平均值之间不显著的差异(P＜0.05)。

图3.HY5协调N和C代谢。(A)初生幼苗根(如所示的基因型/嫁接嵌合体)中的NRT2.1转录物水平，相对于WT根的水平的转录设为1。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝3)。(B)嫁接嵌合体的根NO3^-摄取。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝30)。(C)显示用于来自14-日龄pHY5：myc-HY5hy5植物的提取物的ChIP分析的NRT2.1启动子片段。数据显示为平均值±s.e.m(n＝3)。箭头表示C/G盒序列基序。(D)将来自(C)的片段3与MBP-HY5孵育。用10，20，50或100-倍过量的未标记的探针进行竞争。(E)7-日龄幼苗中PSY、TPS1、SWEET11和SWEET12转录物的相对丰度。值相对于WT水平表示，数据为平均值±s.e.m.(n＝3)。(F)ChIP测定。在TPS1，SWEET11和SWEET12启动子中含有G-盒基序的片段用于来自14-日龄pHY5：myc-HY5hy5植物的提取物的ChIP分析。数据显示为平均值±s.e.m(n＝3)。(G)蔗糖影响NRT2.1转录物丰度。相对于WT S(L)/R(D)幼苗的水平的转录设为1。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝3)。(H)蔗糖影响根¹⁵NO3^-摄取。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝30)。(I)HY5对NRT2.1启动子的体内结合。使用10-日龄pHY5：myc-HY5hy5植物进行ChIP-PCR分析。数据显示为平均值±s.e.m(n＝3)。相同的小写字母表示平均值之间不显著的差异(P＜0.05)。

图4.HY5响应波动的光环境协调植物生长和营养。(A)以如所示的注量率(fluencerate)生长的幼苗的初生根延伸长度。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝30)。(B)以如所示的注量率生长的幼苗的¹⁵NO3^-摄取。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝30)(C)不同注量率的幼苗嫩芽生物量。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝30)。(D)以不同光注量率在土壤生长21天(16h光周期)的植物的整个植物生物量。(E)D中所示植物的C含量。(F)D中所示植物的N含量。(G)以如所示的注量率生长的21-日龄植物的C/N含量比。(D-G)数据显示为平均值±s.e.m.(n＝16)。相同的小写字母表示平均值间不显著的差异(P＜0.05)。

图5.PpHY5在拟南芥中的表达和OsHY5在拟南芥中的表达。来自拟南芥、水稻(Oryza sativa)和小立碗藓(Physcomitrella patens)的HY5同源物的保守功能。(A-C)光生长的6-日龄拟南芥植物(如所示，WT、hy5和含有表达HY5-GFP的转基因的hy5)的下胚轴长度(A)、初生根分生组织细胞数(B)和根NRT2.1转录水平(C)。数据显示为平均值±s.e.m(n＝30)。(D)嫁接的植物的砧木部分(WT根)中与AtHY5、OsHY5或PpHY5融合的GFP的分布。

图6.a)AtHY5与同源物的比对；b)AtHY5与AtHYH序列的比对，c)同源物树。

图7.差别性嫩芽/根照射对侧根发育的影响。(A)差别性嫩芽/根照射对侧根发育的影响。将3-日龄WT幼苗转移至新的板，然后暴露于10d差别性光处理(100μmol.s^-1.m^-2)。比例尺，1cm。(B)不同处理中的侧根产生。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝30)。相同的小写字母表示平均值之间不显著的差异(P＜0.05)。

图8.HY5序列的等位基因变异。(A)hy5-526中的剪接位点突变。深灰色框表示外显子，黑线表示内含子，并且数字表示外显子大小(bp)。(B)HY5和突变的hy5-526之间的蛋白序列比较。右侧的数字表示全蛋白中的残基位置。相同的残基由深灰色框表示，并且变体残基由浅灰色框表示。

图9.光生长的6-日龄幼苗(如所示，WT、hy5和含有表达HY5-GFP或myc-HY5的转基因的hy5)的下胚轴长度。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝30)。相同的小写字母表示平均值之间不显著的差异(P＜0.05)。

图10.在嫁接的植物pCAB3：HY5-GFPhy5接穗中可检测的HY5-GFP的分布。(A)实验使用下胚轴嫁接嵌合体。(B)10-日龄嫁接的植物的接穗叶中的HY5-GFP分布。

图11.10-日龄嫁接的植物的根中HY5-GFP的分布。(A)在嫁接的植物的pHY5：HY5-GFPhy5砧木根中可检测的HY5-GFP的分布。比例尺，50μm。(B)嫁接的植物的嫩芽和根中的相对HY5-GFP转录物丰度，如(A)中表达的，相对于嫁接的植物的pHY5：myc-HY5hy5接穗叶的水平的转录设为1。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝3)。(C)接穗(嫩芽)和砧木(根)中HY5-GFP的免疫学检测，利用HSP90上样对照。

图12.差别性嫩芽/根照射对叶中的HY5-GFP的分布的影响。(A)嫩芽-照射的pCAB3：2×GUS-TEV^re-HY5-GFP hy5植物的叶中HY5-GFP的分布。(B)表达TEV蛋白酶的嫩芽-照射的pCAB3：2×GUS-TEV^re-HY5-GFP hy5植物的叶中HY5-GFP的分布。

图13.HYH不是调控根生长的光调节的嫩芽至根移动信号。(A)嫩芽-照射对6-日龄Ws、hyh-1和hy5hyh-1幼苗的初生根生长的影响。(B)对Ws、hyh-1和hy5hyh-1幼苗初生根延伸长度的差别性嫩芽/根照射影响。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝30)。相同的小写字母表示平均值之间不显著的差异(P＜0.05)。(C)HYH-GFP不可检测地从嫩芽移动到根。将由pSUC2：HYH-GFP hyh-1接穗和HYH(Ws)砧木构成的10-日龄嫁接的植物的接穗(叶)和砧木(根)中的HYH-GFP分布与由pSUC2：HY5-GFP hy5接穗和HY5(Col)砧木构成的10-日龄嫁接的植物的接穗(叶)和砧木(根)中的HY5-GFP分布相比较。

图14.HY5结合HY5启动子。(A)ChIP测定。该图表描绘推定的用于ChIP分析的HY5启动子和片段(1-7)。使用14-日龄pHY5：myc-HY5hy5植物进行ChIP-PCR。数据显示为平均值±s.e.m(n＝3)。(B)EMSA测定。将在A中显示的含T/G-盒-基序的HY5启动子片段与所示的MBP-HY5孵育。用于HY5结合的竞争分别利用含有T/G-盒基序的10×，20×，50×和100×未标记的探针进行。

图15.葡萄糖对根NRT2.1转录物丰度和¹⁵NO3^-摄取的影响。(A)WT和hy5幼苗的根中的NRT2.1转录物丰度。转录物水平相对拟南芥肌动蛋白2的丰度表示。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝3)。(B)7-日龄WT和hy5幼苗根的¹⁵NO3^-摄取。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝10)。

图16.蔗糖对HY5启动子活性、HY5转录物和HY5对HY5启动子的结合亲和力的影响。(A)蔗糖水平对根中HY5转录(如通过由pHY5：GFP转基因驱动的GFP表达可显现的)和HY5稳定性(从pHY5：HY5-GFP表达的HY5-GFP)的影响。比例尺，50μm。(B)蔗糖水平对根HY5转录物丰度的影响。转录物水平相对拟南芥肌动蛋白2的丰度表示。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝3)。(C)使用在含有1％或3％蔗糖的1/2MS培养基上生长的10-日龄pHY5：myc-HY5hy5植物进行的ChIP-PCR分析。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝3)。利用Student’s t-检验产生P值。

图17.myc-HY5的表达恢复对WT水平的hy5蔗糖敏感性。(A)蔗糖-处理的hy5和pHY5：myc-HY5hy5根中NRT2.1转录物的水平。转录物水平相对于拟南芥肌动蛋白2的丰度表示。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝3)。(B)蔗糖-处理的hy5和pHY5：myc-HY5hy5根中¹⁵NO3^-摄取率。数据显示为平均值±s.e.m(n＝30)。相同的小写字母的存在表示平均值之间不显著的差异(P＜0.05)。

图18.增加光注量率对植物生长的影响。以不同光注量率在土壤中生长21天(16h光周期)的WT植物的嫩芽(上图)和根(下图)系统。比例尺，1cm。

详述

现在将进一步描述本发明。在以下段落，更详细限定本发明的不同方面。可以将这样限定的各个方面与任何其他一个方面或多个方面组合，除非有明确相反指示。尤其是，指明为优选的或有利的任何特征可以与指明为优选或有利的任何其他一个特征或多个特征组合。

除非另有指示，本发明的实践将利用本领域技术内的植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术、生物信息学的常规技术。这样的技术在文献中充分解释。

如本文中使用的，术语″核酸″、″核酸序列″、″核苷酸″、″核酸分子″或″多核苷酸″意在包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、天然存在的、突变的、合成的DNA或RNA分子和使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。其可以是单链或双链的。这样的核酸或多核苷酸包括，但不限于，结构基因的编码序列，反义序列，和不编码mRNAs或蛋白产物的非编码调节序列。这些术语还包括基因。术语″基因″或“基因序列“广泛地用于指与生物功能相关的DNA核酸。因此，基因可以包括如基因组序列中的内含子和外显子，或可以仅包括如cDNA中的编码序列，和/或可以包括与调节序列组合的eDNA。

术语“肽”、″多肽″和″蛋白″在本文中可交替使用，并且指通过肽键连接在一起的以任何长度的多聚形式的氨基酸。

如本文中使用的，术语“遗传改变的”包括，但不限于，转基因植物和突变体植物。

为了本发明的目的，″转基因的″、“转基因”或″重组″意为关于例如核酸序列、表达盒、基因构建体或包含核酸序列的载体或转化有本发明所述的核酸序列、表达盒或载体的生物体，所有那些构建体通过重组方法产生，其中

(a)编码用于本发明的方法的蛋白的核酸序列，或

(b)与本发明所述的核酸序列可操作连接的遗传控制序列，例如启动子，或

(c)a)和b)不是处在它们的天然遗传环境或已经通过重组方法修饰，对于修饰，例如，可能采取一个或多个核苷酸残基的取代、添加、删除、倒位或插入的形式。天然遗传环境理解为意为原植物中的天然基因组或染色体基因座或基因组文库中的存在。在基因组文库的情况下，优选，至少部分保留核酸序列的天然遗传环境。环境在核酸序列至少一侧侧连并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，最优选至少5000bp的序列长度。当该表达盒被非天然、合成的(″人工″)方法如，例如，诱变处理修饰时，天然存在的表达盒-例如如上文定义的核酸序列的天然启动子与编码用于本发明的方法的多肽的相应核酸序列的天然存在的组合-变为转基因表达盒。合适的方法，例如，记述在US 5,565,350或WO 00/15815中，其通过参考结合。

在某些实施方案中，用于本发明的目的的转基因植物因此理解为意为，如上文所述的，用于本发明的方法的核酸不在所述植物的基因组中它们的天然基因座，对于核酸，可能同源或异源表达。因此，植物表达转基因。然而，如所述的，在某些实施方案中，转基因还意为，当本发明的不同实施方案所述的核酸在植物的基因组中其天然位置时，就天然序列而言，该序列已被修饰，和/或天然序列的调节序列被修饰，例如通过诱变进行修饰。

转基因优选理解为意为，本发明所述的核酸在基因组的非天然基因座的表达，即发生核酸的同源表达或优选地发生核酸的异源表达。根据本发明，转基因稳定整合入植物，并且植物优选对于转基因是纯合的。

本发明的方面涉及重组DNA技术，并且在优选的实施方案中排除仅基于通过常规育种方法产生植物的实施方案。

为了本发明的目的，“突变体”植物是与天然存在的野生型(WT)植物相比遗传改变的植物。在一个实施方案中，突变体植物是与天然存在的野生型(WT)植物相比，使用诱变方法，如本文中所述的诱变方法改变的植物。在一个实施方案中，诱变方法靶向基因组修饰或基因组编辑。在一个实施方案中，与野生型序列相比，使用诱变方法改变内源性HY5核酸或HY5启动子序列。与野生型植物相比，这些突变可以引起激活或另外增强HY5启动子或其功能同系物或变体的活性或可以增强HY5核酸或功能同系物或其变体的表达水平。与野生型植物相比，这样的植物具有如本文中所述的改变的表型，如增加的氮代谢。因此，在该实例中，植物基因组中存在突变的内源性HY5基因或HY5启动子序列赋予增加的氮代谢。在优选的实施方案中，使用靶向基因组修饰特异性靶向内源性HY5基因或HY5启动子序列，并且，存在在植物中表达的转基因不赋予突变的HY5基因或HY5启动子序列的存在。在备选的实施方案中，提供表达SEQ ID NO：1，2或3中限定的核酸、或其功能同系物或变体的突变体植物。此外，与野生型植物相比，这样的植物具有改变的表型并且显示增加的氮代谢。此外，再次，在一个实施方案中，这样的植物的表型不由一种或多种转基因的存在赋予。

本发明人发现，HY5是调节嫩芽生长和C吸收与根生长和N摄取的光调节的偶联的嫩芽至根移动信号。HY5从嫩芽转移到根并且然后通过自身调节反馈环激活根HY5表达。此外，如拟南芥中所示，AtHY5直接调节硝酸根转运蛋白AtNRT2.1的表达。因此，HY5的嫩芽-至-根迁移是光激活的AtNRT2.1转录和根中N摄取(以NO3^-的形式)所需要的。换句话说，尽管HY5在根中产生，但是，仅当由于光感而在嫩芽/叶中产生的HY5蛋白移动到根时，其积累有效的水平并且诱导根发育和N-摄取。

因此，在一个方面，本发明涉及用于增加植物中的硝酸根代谢的方法，其包括在植物中引入并表达包含植物HY5核酸序列的核酸构建体。

HY5在陆生植物中高度保守。保守的功能由本文中所述的实验证明，并且本发明人表明，水稻HY5、OsHY5在转基因拟南芥中表达时，可以诱导AtNRT2.1，并且来自苔藓、小立碗藓(Physcomitrella)的HY5也可以诱导AtNRT2.1(图5)。

根据本发明的各个方面，包括上述方法，植物HY5核酸编码的植物HY5蛋白特征在于COP1相互作用结构域和碱性亮氨酸拉链结构域的存在(Holme等人，EMBO journal，Vol.20，第118-127页，2001)。对于AtHY5的这些结构域的序列在下文显示。然而，这些序列在其他HY5蛋白中高度保守(参见例如图6)，并且技术人员因此将能够容易地鉴定除拟南芥之外的植物的HY5蛋白。

因此，根据本发明的各个方面的植物HY5蛋白包含一个或多个以下鉴别的保守的结构域或与下文显示的基序具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或至少99％的全序列同一性的结构域。

AtHY5蛋白包括以下COP1相互作用结构域：ESDEEIRRVPEF(SEQID NO：30，参见图6)。这包括推定的用于磷酸化的CKII位点(ESDEE SEQID NO：31)。该结构域(包括COP1相互作用结构域)的核心V-P-E/D-X-G基序(SEQ ID NO：32，X是疏水残基)是高度保守的结构基序，其对于与COP1的相互作用是必需的。

AtHY5蛋白还包括下文所示的碱性亮氨酸拉链结构域：

碱性基序：KRLKRLLRNRVSAQQARERKK(SEQ ID NO：33)

亮氨酸拉链：LENRVKDLENKNSELEERLSTLQNENQML(SEQ IDNO：34)

在一个实施方案中，HY5核酸构建体包含编码SEQ ID NO：3限定的AtHY5蛋白的SEQID NO：1或2或其功能变体或同系物。

如本文中使用的术语“核酸序列的功能变体”，就SEQ ID NO：1或另一序列而言是指保留完全非变体序列的生物功能的变体基因序列或基因序列的部分，例如当在转基因植物中表达时赋予增加的生长或产量。功能变体还包括研目的基因的变体，其具有不影响功能的序列改变，例如在非保守的残基中的改变。还包括的是与本文中所示的野生型序列相比，基本上相同，即仅具有相一些序列改变，例如在非保守的残基中的改变，并且是有生物活性的变体。

因此，如本领域技术人员理解的，要理解，本发明的方面，包括方法和用途，不仅包括包含或由SEQ ID NO：1组成的核酸序列，而且还包括不影响所得到的蛋白的生物活性和功能的SEQ ID NO：1的功能变体或部分。导致在给定位点产生不同氨基酸的不影响编码的多肽的功能特性的核酸序列的改变是本领域中公知的。例如，用于氨基酸丙氨酸(一种疏水氨基酸)的密码子可以被编码另一较不疏水残基，如甘氨酸，或更疏水残基，如缬氨酸、亮氨酸、或异亮氨酸的密码子取代。类似地，导致一种带负电的残基替代另一种，如天冬氨酸替代谷氨酸，或一种带正电的残基替代另一种，如赖氨酸替代天冬酰胺的改变，也可以预期产生功能相当的产物。导致多肽分子的N-末端和C-末端部分的改变的核苷酸变化将不会预期改变多肽的活性。每种建议的修饰充分在本领域常规技术中，这是编码产物保留生物活性的决定因素。

功能变体与非变体氨基酸序列具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的全序列同一性。

技术人员将理解，本发明不限于使用AtHY5的方面。因此，在本发明的方面的一个实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO：3的同系物。

如本文中使用的术语同系物还意味着来自其他植物物种的AtHY5同源物。AtHY5多肽或AtHY5核酸序列的同系物分别以优先性增加的顺序与SEQ ID NO：3表示的氨基酸或与SEQ ID NO：1或2中所示的核酸序列具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的全序列同一性。在一个实施方案中，全序列同一性是至少37％。在一个实施方案中，全序列同一性是至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％，最优选90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少99％。

HY5同系物的功能变体也在本发明的范围内。

如果两个序列中的核苷酸或氨基酸残基序列分别在如下文所述对最大一致性进行比对时相同，两个核酸序列或多肽被称为″同一的″。在一个或两个核酸或多肽序列的情况下，术语″同一的″或百分数″同一性″是指当如使用以下序列比较算法之一或通过人工比对和肉眼检查测量，经比较窗口对最大一致性比较和比对时，相同的或具有相同的指定的氨基酸残基或核苷酸百分数的两个或更多个序列或子序列。当就蛋白或肽而言使用序列同一性的百分数时，认为不相同的残基位置常常差异在于保守氨基酸取代，其中氨基酸残基替代其他具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的氨基酸残基，并且因此不改变分子的功能特性。在序列差异在于保守取代时，百分数序列同一性可以上调以校正取代的保守性质。进行此调节的方式是本领域技术人员公知的。对于序列比较，通常一个序列用作参考序列，测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，指定随后的坐标，并且如果需要，指定序列算法程序参数。可以使用默认的程序参数，或可以指定替代的参数。然后基于程序参数，序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的百分数序列同一性。适于确定序列同一性和序列相似性的算法的非限制性实例是BLAST和BLAST 2.0算法。

同系物的实例在图6、表1和SEQ ID NOs：4-29中显示。本发明人表明，来自小立碗藓(Physcomitrella patens)的与AtHY5具有38.6％序列同一性的同系物和与AtHY5具有65.5％序列同一性的OsHY5当在拟南芥中表达时均诱导AtNRT2.1(图5)，并且挽救功能突变体的hy5损失。

合适的同系物可以通过序列比较和保守的结构域的鉴定来鉴别。本领域中存在可以用于鉴别这样的序列的预测器。同系物的功能可以如本文中所述的鉴别，并且例如在植物中过表达时或当通过挽救突变体表型在hy5功能缺失突变体中表达时，技术人员由此能够确认该功能。

因此，本发明和本文中所述的HY5核苷酸序列也可以用于从其他生物、特别是其他植物，例如作物植物分离相应序列。以这种方式，如PCR、杂交等方法可以用于基于它们与本文中所述的序列的序列同源性鉴别这样的序列。当鉴别和分离同系物时，也可以考虑序列的拓扑结构和特征结构域结构。可以基于它们与整个序列或与其片段的序列同一性分离序列。在杂交技术中，已知核苷酸序列的全部或部分用作探针，其与存在于来自选择的植物的克隆的基因组DNA片段或cDNA片段的群体(即，基因组或cDNA文库)中的其他相应核苷酸序列选择性杂交。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其他寡核苷酸，并且可以用可检测的基团，或任何其他可检测的标志物标记。用于杂交和用于构建cDNA和基因组文库的探针的制备方法一般在本领域中已知，并且在Sambrook，等人.，(1989)MolecularCloning：A Library Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)中描述。

这样的序列的杂交可以在严格条件下进行。″严格条件″或″严格杂交条件″意为这样的条件，在该条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度高于与其他序列的杂交程度(例如，高于背景至少2-倍)。严格条件是序列依赖性的并且在不同情况下将不同。通过控制杂交的严格性和/或洗涤条件，可以鉴别与探针100％互补的靶序列(同源探测)。备选地，可以调整严格性条件以允许序列中的一些错配，从而检测较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针长度小于约1000个核苷酸，优选长度小于500个核苷酸。

通常，严格条件将是这样的条件：其中在pH 7.0至8.3盐浓度小于约1.5M Na离子，通常约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如，10至50个核苷酸)，温度是至少约30℃，并且对于长探针(例如，大于50个核苷酸)，温度是至少约60℃。杂交持续时间通常小于约24小时，通常约4至12小时。还可以通过加入去稳定剂如甲酰胺来获得严格条件。

根据本发明，优选的AtHY5同系物选自玉米、水稻、小麦、欧洲油菜/加拿大油菜、高粱、大豆、向日葵、苜蓿、马铃薯、番茄、烟草、葡萄、大麦、豌豆、豆、蚕豆、莴苣、棉花、甘蔗、糖用甜菜、西兰花或其他芸苔属蔬菜或杨树。

根据本文中所述的方法，植物表达对于个体植物是″外源的″多核苷酸，所述″外源的″多核苷酸是通过除有性杂交之外的任何方式引入植物的多核苷酸。下文描述了通过其可以实现这点的方式的实例。在方法的一个实施方案中，外源的核酸是在转基因植物中表达的，其对于所述植物不是内源的，而是源自另一植物物种的植物HY5核酸序列。例如，AtHY5可以在不是拟南芥(Arabidopsis)的另一植物中表达。在方法的一个实施方案中，内源性核酸在转基因植物中表达，其是包含内源性HY5核酸或源自其的序列的核酸构建体。例如，OsHY5可以在水稻中表达。

根据本发明的各个方面、本文所述的方法和应用的植物，包括转基因植物，可以是单子叶或双子叶植物。

双子叶植物可以选自包括但不限于以下各项的科：菊科(Asteraceae)，十字花科(Brassicaceae)(例如欧洲油菜(Brassica napus))，藜科(Chenopodiaceae)，葫芦科(Cucurbitaceae)，豆科(Leguminosae)(苏木科(Caesalpiniaceae)，Aesalpiniaceae，含羞草科(Mimosaceae)，Papilionaceae或豆科(Fabaceae))，锦葵科(Malvaceae)，蔷薇科(Rosaceae)或茄科(Solanaceae)。例如，植物可以选自莴苣、向日葵、拟南芥、西兰花、菠菜、西瓜、笋瓜、甘蓝、番茄、马铃薯、山药、辣椒、烟草、棉花、秋葵、苹果、玫瑰、草莓、苜蓿、豆、大豆、蚕豆、豌豆、扁豆、花生、鹰嘴豆、杏、梨、桃、葡萄藤、甜椒、辣椒或柑橘物种。

单子叶植物可以是，例如，选自科槟榔科(Arecaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)或禾本科(Poaceae)。例如，植物可以是谷类作物，如玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、高粱、黑麦、粟、荞麦、或饲料作物如黑麦草属(Lolium species)或羊茅属(Festuca species)，或作物如甘蔗、洋葱、韭菜、山药或香蕉。

还包括的是生物燃料和生物能源作物如油菜/加拿大油菜、甘蔗、甜高粱、柳枝稷(Panicum virgatum)(柳枝稷(switchgrass))、亚麻籽、羽扇豆和柳树、杨树、杨树杂交种、芒草(Miscanthus)或裸子植物，如火炬松。还包括的是用于用于青贮饲料(玉米)、放牧或草料(草、三叶草、sanfoin、苜蓿)、纤维(例如棉花、亚麻)、建筑材料(例如松树、橡树)、制浆(例如杨树)、用于化学工业的进料储备(例如高芥酸油料种子油菜、亚麻籽)和用于舒适目的(例如用于高尔夫球场的草皮草)、公共和私人花园的观赏植物(例如金鱼草、矮牵牛、玫瑰、天竺葵、烟草属)和家用的植物和切花(非洲堇(African violets)、秋海棠(Begonias)、菊花(chrysanthemums)、天竺葵、毛蜘蛛植物(Coleus spider plants)、龙血树(Dracaena)、橡胶植物)的作物。

优选，植物是作物植物。作物植物意为以商业规模的种植的用于人或动物消耗或使用的任何植物。在优选的实施方案中，植物是谷物。

最优选的植物是玉米、水稻、小麦、欧洲油菜/加拿大油菜、高粱、大豆、向日葵、苜蓿、马铃薯、番茄、烟草、葡萄、大麦、豌豆、豆、蚕豆、莴苣、棉花、甘蔗、糖用甜菜、西兰花或其他芸苔属蔬菜或杨树。

如本文中使用的术语″植物″包括完整的植物、植物的祖先和后代和植物部分，包括种子、果实、嫩芽、茎、叶、根(包括块茎)、花、组织和器官，其中前述每一个包含如本文中所述的核酸构建体。术语″植物″还包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生区、配偶体、孢子体、花粉和小孢子，同样地，其中前述每一个包含如本文中所述的核酸构建体。

所述方法还可以包括从植物中筛选出包含本文所述的多核苷酸构建体和/或具有本文中所述的任何表型(如增加的氮代谢)的那些植物，并且选择具有所述表型(如增加的氮代谢)的植物。在另一实施方案中，进一步的步骤包括测量所述植物后代或其部分中的氮代谢，并且与对照植物比较氮代谢。优选地，将后代植物稳定转化，并且包含在植物细胞中遗传保持的外源的多核苷酸，并且所述方法可以包括验证构建体稳定整合的步骤。所述方法还可以包括从选择的后代植物收集种子的另外步骤。

本发明的方面还延伸至从该植物的可收获部分衍生的、优选直接衍生的产物，如干颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白。本发明还涉及包含本发明的植物或其部分的食品和食物补充物。

根据本发明的各个方面，与对照植物相比，转基因植物中的氮代谢增加。如本文中使用的根据本发明的所有方面的对照植物是未按照本发明的方法修饰的植物。因此，未将对照植物遗传修饰以表达编码HY5的核酸。在一个实施方案中，对照植物是野生型植物。对照植物通常是相同植物物种，优选与修饰的植物具有相同的遗传背景。

根据本发明的氮代谢包括根据本发明增加的NUE和氮获取(NO3^-的摄取)。根据本发明的各个方面使用的术语″增加″、″改善″或″增强″可交替使用。NUE可以定义为土壤中每单位的可获得的N(包括土壤和肥料中存在的残留N)的谷物产量。植物的总体N使用效率包含摄取和利用效率并且可以计算为UpE。在一个实施方案中，与对照植物相比，NUE增加5％-50％以上，例如至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％或50％。在另一实施方案中，与对照植物相比，氮摄取增加5％-50％以上，例如至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％或50％。

增加的氮代谢导致增加的产率。因此，本发明的方法可以用于增加的产率。术语“产率”包括以下特征的非限制性列表中的一种或多种：早期开花时间、生物量(植物的生物量(根和/或嫩芽生物量)或种子/谷物生物量)、种子/谷物产率、种子/谷物生存力和萌芽效率、种子/谷物尺寸、谷物淀粉含量、早期活力、绿度值、增加的生长率、绿色组织延迟的衰老。术语″产率″通常意为典型地与指定作物、区域和时期相关的经济值的可测量产生。个体植物部分基于其数量、尺寸和/或重量直接促进产率。实际产率是每年每平方米作物年的产率，其通过用总产量(包括收获和评估的产量)除以种植的平方米确定。

因此，根据本发明，产率包括以下各项的一种或多种，并且可以通过评价以下各项中的一种或多种测量：每株植物增加的种子产率，增加的种子饱满率，增加的饱满种子的数量，增加的收获指数，增加的生存力/萌发效率，增加的种子/蒴果(capsule)/荚/谷粒的数量或大小，增加的生长或增加的分枝，例如具有更多分枝的花序，增加的生物量或谷物填充。优选地，增加的产率包括增加的谷粒/种子/蒴果/荚数量，增加的生物量，增加的生长，增加的花器官和/或增加分枝的花的数量。相对于对照植物产率增加。例如，与对照植物相比，产率增加2％，3％，4％，5％-50％以上，例如，至少10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％或50％。

如上文所述的用于增加植物中氮代谢的方法(包括在植物中引入并表达包含植物HY5核酸序列的核酸构建体)可以包括进一步的步骤，所述步骤包括评估转基因植物的表型、测量NUE和/或NO3^-摄取、与对照植物比较NUE和/或NO3^-摄取、测量产率和与对照植物比较产率中的一个或多个。

用于产生本发明的转基因植物的转化方法是本领域中已知的。因此，根据本发明的各个方面，将包含HY5核酸的核酸，例如SEQ D NO.1，其功能变体或同系物引入植物并作为转基因表达。将核酸序列通过称为转化的过程引入所述植物。如本文所称的术语″引入″或″转化″包括将外源的多核苷酸转移入宿主细胞，而不论用于转移的方法。不论通过器官发生还是胚胎发生能够后续克隆繁殖的植物组织，可以用本发明的遗传构建体转化，并且从其产生整体植物。选择的特定组织将根据对于转化的特定物种可获得的、并且与其最佳适应的克隆繁殖体系变化。示例性的组织靶点包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子体、愈伤组织、现有的分生组织(例如，顶端分生组织、腋芽和根分生组织)，以及诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定引入宿主细胞，并且可以保持未整合，例如，作为质粒存在。备选地，其可以整合入宿主基因组。可以随后将得到的转化的植物细胞用于以本领域技术人员已知的方式再生转化的植物。

将外源基因转移到植物的基因组中称为转化。在很多物种中，植物的转化现在是常规技术。有利地，多种转化方法中的任一种可以用于将目的基因引入合适的祖细胞。对于从植物组织或植物细胞转化和再生植物所描述的方法可以用于瞬时或稳定转化。转化方法包括使用脂质体，电穿孔，增加游离DNA摄取的化学剂，将DNA直接注射入植物，粒子枪轰击，使用病毒或花粉和显微投影转化。方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法、电穿孔原生质体、显微注射入植物材料、DNA或RNA-包被的粒子轰击、用(非整合型)病毒感染等。转基因植物，包括转基因作物植物，优选通过根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化产生。

为了选择转化的植物，将转化中获得的植物材料进行选择性条件，从而可以将转化的植物与未转化的植物相区分。例如，可以种植以上述方式获得的种子，并且，在起始生长期之后，通过喷雾进行合适的选择。其他可能性是，如果合适，在灭菌后在使用合适的选择剂的琼脂板上种植种子，从而只有转化的种子可以生长为植物。备选地，对转化的植物筛选选择性标志物的存在。DNA转移和再生后，还可以例如使用DNA分析评价推定的转化的植物中目的基因的存在、拷贝数和/或基因组组成。备选地或另外地，可以使用RNA印迹和/或蛋白质印迹分析监测新引入的DNA的表达水平，这两种技术都是本领域普通技术人员公知的。

产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如通过克隆繁殖或经典育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可以自交并选择纯合的第二代(或T2)转化子，并且T2植物可以随后进一步通过经典育种技术繁殖。产生的转化的生物可以是多种形式。例如，它们可以是转化的细胞和未转化的细胞的嵌合体；克隆转化子(例如，转化所有的细胞以含有表达盒)；转化的和未转化的组织的嫁接物(例如，在植物中，嫁接到未转化的接穗的转化根茎)。

本发明用于增加植物中氮代谢的方法包括引入并表达包含植物HY5核酸序列的核酸构建体。所述核酸构建体优选包含与植物HY5核酸序列可操作连接的调节元件。

根据本发明的所有方面，包括上述方法并且包括如本文中所述的植物、方法和用途，术语″调节元件″在本文中与″控制序列″和″启动子″交替使用，并且所有术语以宽的范围考虑，指能够影响与它们连接的序列的表达的调节核酸序列。

术语″启动子″通常是指位于基因的转录起始的上游的核酸控制序列，其参与RNA聚合酶和其他蛋白的结合，从而指导可操作连接的核酸的转录。上述术语包括的是源自经典真核基因组基因(包括精确转录起始所需的TATA盒，有或没有CCAAT盒序列)和另外的调节元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)的转录调节序列，其响应发育和/或外部刺激或以组织特异的方式改变基因表达。该术语内还包括的是经典的原核基因的转录调节序列，在该情况下，其可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调节序列。

术语″调节元件″还包括赋予、激活或增强细胞、组织或器官中核酸分子的表达的合成的融合分子或衍生物。

″植物启动子″包含调控植物细胞中编码序列片段的表达的调节元件。因此，植物启动子不必须是植物来源，而是可以源自病毒或微生物，例如来自攻击植物细胞的病毒。″植物启动子″也可以源自植物细胞，例如源自用本发明的方法中要表达的和本文中所述的核酸序列转化的植物。这也适用于其他″植物″调节信号，如″植物″终止子。用于本发明的方法的核苷酸序列上游的启动子可以由一个或多个核苷酸取代、插入和/或删除修饰，而不干扰启动子、开放阅读框(ORF)或3′-调节区如终止子或远离ORF的其他3′调节区任一个的功能或活性。还可能的是，启动子的活性通过修饰它们序列增加，或它们完全被更有活性的启动子替代，甚至被来自异源生物的启动子替代。对于植物中的表达，如上文所述的核酸分子，优选与合适的启动子可操作连接或包含合适的启动子，所述启动子在正确的时间点并且以所需的空间表达模式表达所述基因。

为了鉴别功能等价的启动子，候选启动子的启动子强度和/或表达模式可以例如通过将启动子与报告基因可操作连接并且测定报告基因在植物的不同组织中的表达水平和模式来分析。合适的公知报告基因是技术人员已知的，并且包括例如β-葡糖苷酸酶或β-半乳糖苷酶。

如本文中使用的术语″可操作连接的″是指启动子序列和目的基因之间的功能连接，从而所述启动子序列能够起始目的基因的转录。

例如，核酸序列可以使用驱动过表达的启动子表达。根据本发明的过表意为转基因以高于由其内源性启动子驱动的内源性对应物的表达的水平表达。例如，过表达可以使用强启动子，如组成型启动子进行。“组成型启动子”是指在生长和发育的大多数、但不必要所有阶段期间和在多数环境条件下，在至少一种细胞、组织或器官中有转录活性的启动子。组成型启动子的实例包括花椰菜花叶病毒启动子(CaMV35S或19S)、水稻肌动蛋白启动子、玉米泛素启动子、核酮糖二磷酸羟化酶(rubisco)小亚基、玉米或苜蓿H3组蛋白、OCS、SAD1或2、GOS2或产生增强的表达的任何启动子。备选地，增强的或增加的表达可以通过使用转录或翻译增强子或激活剂实现，并且可以将增强子结合入基因以进一步增加表达。

在一个实施方案中，启动子是组成型或强启动子。在优选的实施方案中，调节序列是诱导型启动子或应激诱导型启动子。应激诱导型启动子选自以下非限制性列表：HaHB1启动子、RD29A(其驱动DREB1A的干旱诱导性表达)，玉米rabl7干旱诱导型启动子、P5CS1(其驱动脯氨酸生物合成酶P5CS1的干旱诱导型表达)，拟南芥进化枝A PP2C的ABA-和干旱诱导型启动子(ABI1，ABI2，HAB1，PP2CA，HAI1，HAI2和HAI3)或它们相应的作物同源物。

启动子还可以是组织特异的。这些类型的启动子在现有技术中描述，但非限制性实例在下文列出。其他合适的启动子也是技术人员已知的。

组织特异性启动子是在植物发育期间的特定时间仅在特定细胞或组织(如在营养组织或生殖组织)中有活性的转录控制元件。在发育控制下的组织-特异性启动子的实例包括仅(或主要仅)在特定组织(如营养组织，例如，根或叶，或生殖组织，如果实、胚珠、种子、花粉、雌蕊(pistols)、花)或任何胚组织或表皮或叶肉中起始转录的启动子。生殖组织特异的启动子可以是，例如，胚珠-特异的，胚-特异的，胚乳-特异的，珠被-特异的，种子和种皮-特异的，花粉-特异的，花瓣-特异的，萼片-特异的，或它们的一些组合。在一些实施方案中，启动子是细胞类型特异的，例如，保卫细胞-特异的。

在一个实施方案中，可以使用绿色组织-特异的启动子。绿色组织包括叶和嫩芽。例如，绿色组织-特异的启动子可以选自玉米正磷酸激酶启动子、玉米磷酸烯醇丙酮酸盐羧化酶启动子、水稻磷酸烯醇丙酮酸盐羧化酶启动子、水稻小亚基核酮糖二磷酸羟化酶(rubisco)启动子、水稻β扩张蛋白EXBP9启动子、木豆小亚基核酮糖二磷酸羟化酶(rubisco)启动子、叶肉特异性启动子CAB3(Warnasooriya，S.N.，和Montgomery，B.L.(2009)，Plant Physiol 149，424-433)或豌豆RBS3A启动子。

叶-特异的启动子的实例还包括二磷酸核酮糖羧化酶(RBCS)启动子。例如，番茄RBCS1、RBCS2和RBCS3A基因在叶和光生长的幼苗中表达，仅RBCS1和RBCS2在发育中的番茄果实中表达(Meier FEBS Lett.415：91-95，1997)。可以使用由Matsuoka Plant J.6：311-319，1194描述的几乎仅在叶片和叶鞘中的叶肉细胞中高水平表达的二磷酸核酮糖羧化酶启动子。另一叶-特异的启动子是捕光叶绿素a/b结合蛋白基因启动子，参见，例如，ShiinaPlant Physiol.115：477-483，1997；Casal Plant Physiol.116：1533-1538，1998。Li FEBSLett.379：1 17-121，1996描述的拟南芥myb-相关基因启动子(Atmyb5)也是叶-特异的。Atmyb5启动子在幼花环和茎生叶边缘上的发育中的叶表皮毛(leaf trichomes)、托叶和表皮细胞，和未成熟种子中表达。Atmyb5mR A在受精和胚发育的16细胞阶段出现，并且存留超过胚期(heart stage)。

另一类型的有用的营养组织-特异的启动子是分生组织的启动子，其驱动嫩芽尖端中的表达。例如，可以使用″SHOOTMERISTEMLESS″和″SCARECROW″启动子，它们在发育中的嫩芽或根顶端分生组织中有活性，由Di Laurenzio，Cell 86：423-433，1996；和Long，Nature 379：66-69，1996描述。另一有用的启动子是这样的启动子，其控制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶HMG2基因的表达，其表达限于分生组织和花(柱头的分泌区、成熟花粉粒、雌蕊群脉管组织和受精的胚珠)组织(参见，例如，Enjuto Plant Cell.7：517-527，1995)。还可用的是来自玉米和其他物种的knl-相关基因，其表现分生组织-特异的表达，参见，例如，Granger Plant Mol.Biol.31：373-378，1996；Kerstetter Plant Cell 6：1877-1887，1994；Hake Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.350：45-51，1995。

本发明还涉及遗传改变的植物，其包含HY5核酸序列和组织特异性调节序列。

在一个方面，本发明涉及转基因植物包含含有HY5核酸序列和组织特异性调节序列的核酸构建体。

术语HY5核酸序列和组织特异性调节序列在本文中其他地方描述。优选地，组织特异性调节序列是叶或嫩芽特异性的启动子。在一个实施方案中，所述植物不是拟南芥。

本发明还延伸至转基因植物，其包含含有HY5核酸序列的核酸构建体，其中所述植物不是拟南芥。

本发明还涉及核酸构建体，其包含与组织特异性启动子可操作连接的植物HY5核酸序列。组织特异性启动子可以选自如上文所述的绿色组织特异性启动子。本发明还涉及表达载体，其包含含有与组织特异性启动子可操作连接的植物HY5核酸序列的核酸构建体。

在另一方面，本发明涉及分离的宿主细胞，其转化有如上文所述的核酸构建体或载体。宿主细胞可以是细菌细胞，如根癌土壤杆菌，或分离的植物细胞。本发明还涉及培养基或试剂盒，所述试剂盒包含培养基和如上文所述的分离的宿主细胞。

上文所述的核酸构建体或载体可以用于使用本领域中已知的转化方法产生转基因植物。因此，在另一方面，本发明涉及上述核酸构建体或载体在增加植物中氮代谢方面的用途。在另一方面，本发明涉及包含HY5核酸序列和组织特异性启动子的核酸构建体或载体在增加植物根中HY5水平方面的用途。

本发明还涉及产生具有增加的氮代谢的植物的方法，其包括在植物中引入并表达包含与绿色组织特异性启动子可操作连接的HY5核酸序列的核酸构建体。

在另一方面，本发明涉及用于增加植物根中HY5蛋白的存在的方法，其包括在植物引入并表达包含与绿色组织特异性启动子可操作连接的HY5核酸序列的核酸构建体。

本发明人还证明了HY5调节C和N代谢之间的平衡。编码与蔗糖形式的固定碳的利用度相关的蛋白(例如TPS1)或编码蔗糖外排转运体(例如SWEET11和12)的基因转录物的相对丰度在hy5幼苗(缺少HY5)中强烈降低，提示HY5调节蔗糖合成和C代谢的迁移方面二者。他们还发现，蔗糖或葡萄糖基本上增强WT植物中的AtNRT2.1转录物丰度和NO3^-摄取，但在hy5突变体中，这些效应基本上降低。高亲和力硝酸根转运子表达和N-摄取的HY5-依赖性的蔗糖诱导促进C和N代谢的协调的稳态平衡。因此，本发明还涉及在植物中调节C和N代谢之间的平衡的方法，其包括在植物中引入并表达包含HY5核酸序列的核酸构建体。在一个实施方案中，HY5核酸序列与绿色组织特异性启动子可操作连接。

本发明还涉及增加植物根中HY5水平的方法，其包括在植物中引入并表达包含与绿色组织特异性启动子可操作连接的HY5核酸序列的核酸构建体。

本发明还延伸至通过如本文中所述的方法，例如增加硝酸根代谢的方法获得或可获得的植物。

在另一方面，本发明涉及突变体植物，即具有增加的内源性HY5核酸表达的植物，其中内源性HY5启动子携带通过诱变或靶向的基因组编辑引入的突变，并且所述突变导致增加的内源性HY5核酸表达。在该实施方案中，表达的增加是相对于对照或野生型植物中的水平而言的，如本文中其他地方所述。在一个实施方案中，靶向的基因组编辑用于修饰(例如，插入或改变)HY5启动子、或其功能同系物或变体的核酸序列中的至少一种核酸。在优选的实施方案中，该突变增强内源性启动子的活性。例如，靶向的基因组修饰可以用于插入至少一个增强子或启动子位点，如TATA盒(TATAAA)，GC盒(GGGCGG)或CAAT(GGCCAATCT)盒，或其功能变体。在另一方面，本发明涉及具有增加的内源性HY5核酸表达的植物，其中内源性HY5核酸携带通过诱变或靶向的基因组编辑引入的突变，其导致所述核酸的增加的表达。在另一方面，本发明涉及具有增加的HY5核酸表达的植物，其中HY5表达通过将一个以上额外拷贝的HY5核酸结合入植物基因组而增加。在优选的实施方案中，所述结合基因组编辑实现。

在一个实施方案中，HY5核酸是SEQ ID NO：1或2或其功能同系物或变体。在一个实施方案中，内源性启动子是SEQ ID NO：35或其功能同系物或变体。

在本发明的另一方面中，提供增加植物中氮代谢的方法，所述方法包括将至少一种突变引入内源性HY5序列或其调节序列中以增强内源性HY5核酸的表达。还提供的是产生具有增加的氮摄取的植物的方法，增加植物根中HY5蛋白的存在的方法，调节植物中C和N代谢之间平衡的方法和增加植物根中HY5蛋白的存在的方法，其中所述方法包括将至少一种突变引入内源性(即天然或天生的)HY5序列或其调节序列以增强内源性HY5核酸的表达。

在一个实施方案中，所述至少一个突变使用靶向的基因组编辑引入。在一个实施方案中，靶向的基因组编辑用于修饰(例如，插入或改变)HY5启动子、或其功能同系物或变体的核酸序列中的至少一个核酸。在优选的实施方案中，该突变增强内源性启动子的活性。例如，靶向的基因组修饰可以用于插入至少一个增强子或启动子位点，如TATA盒(TATAAA)、GC盒(GGGCGG)或CAAT(GGCCAATCT)盒，或其功能变体。在另一实施方案中，靶向的基因组编辑用于将一个以上另外拷贝的HY5核酸结合入植物基因组。

在一个实施方案中，HY5核酸是SEQ ID NO：1或2或其功能同系物或变体。在一个实施方案中，内源性启动子是SEQ ID NO：35或其功能同系物或变体。

在上述实施方案中，‘内源性’核酸可以指植物基因组中天生的或天然的序列。

靶向的基因组修饰或靶向的基因组编辑是通过同源重组(HR)-介导的重组事件使用靶向的DNA双链断裂(DSBs)刺激基因组编辑的基因组工程技术。为了通过引入位点-特异的DNADSB实现有效的基因组编辑，可以使用四种主要类型的可定制DNA结合蛋白：来源于微生物移动遗传元件的大范围核酸酶(meganucleases)，基于真核转录因子的ZF核酶，来自黄单胞菌属细菌(Xanthomonas bacteria)的转录激活剂样效应子(TALEs)，和来自II型细菌适应性免疫系统CRISPR(规律成簇间隔短回文重复)的RNA-引导的DNA核酸内切酶Cas9。大范围核酸酶、ZF和TALE蛋白均通过蛋白-DNA相互作用识别特定的DNA序列。尽管大范围核酸酶整合核酸酶和DNA-结合结构域，ZF和TALE蛋白分别由靶向DNA的3或1个核苷酸(nt)的个体模块组成。ZF和TALE可以以所需的组合组装并且连接于FokI的核酸酶结构域以引导针对特定基因组基因座的溶核活性。

在通过细菌III型分泌体系递送到宿主细胞中时，TAL效应子进入核，结合宿主基因启动子中的效应子-特异的序列并激活转录。它们的靶向特异性由串联的33-35个氨基酸重复的中央结构域决定。这接着单个截短的20个氨基酸的重复。大多数检查的天然存在的TAL效应子具有12和27个完全重复。

这些重复彼此仅区别于两个相邻的氨基酸，它们的重复-可变二残基(RVD)。决定TAL效应子将识别哪个单个核苷酸的RVD：一个RVD对应于一个核苷酸，四种最常见的RVD各自优选与四种碱基之一相关联。天然存在的识别位点一致地在TAL效应子活性所需的T之后。TAL效应子可以融合于FokI核酸酶的催化结构域以产生TAL效应子核酸酶(TALEN)，其在体内产生靶向的DNA双链断裂(DSBs)用于基因组编辑。该技术在基因组编辑中的使用在本领域中得到充分的描述，例如在US 8,440,431，US 8,440,432和US 8,450,471中描述。参考文献38描述了一组定制的质粒，其可以与Golden Gate克隆方法一起使用以组装多个DNA片段。如其中所述的，Golden Gate方法使用IIS型限制性核酸内切酶，其在其识别位点外侧切割产生独特的4bp突出。克隆通过在同一反应混合物中消化和连接来加速，原因在于正确组装消除了酶识别位点。定制的TALEN或TAL效应子构建体的组装涉及两个步骤：(i)将重复模块组装为1-10个重复的中间阵列，和(ii)将中间阵列连接为骨架以制备最终的构建体。

可以根据本发明的各个方面使用的另一基因组编辑方法是CRISPR。该技术在基因组编辑中的使用在本领域中得到充分描述，例如在US 8,697,359和本文引用的参考文献中充分描述。简言之，CRISPR是参与抵御入侵的噬菌体和质粒的微生物核酸酶体系。微生物宿主中的CRISPR基因座含有CRISPR-相关(Cas)基因以及能够编程CRISPR-介导的核酸切割(sgRNA)的特异性的非编码RNA元件的组合。在宽范围的细菌宿主中鉴定了三种类型的(I-III)CRISPR体系。各个CRISPR基因座的一个关键特征是由短的非重复序列区段(间隔臂)间隔的重复序列(同向重复(direct repeats))阵列的存在。非编码CRISPR阵列被转录，并且在同向重复内切割为含有个体间隔臂序列的短的crRNA，其引导Cas核酸酶至靶位点(原间隔(protospacer))。II型CRISPR是最充分表征的体系之一，并且在四个顺序步骤中携带靶向的DNA双链断裂。第一，两个非编码RNA，即前-crRNA阵列和tracrRNA，从CRISPR基因座转录。第二，tracrRNA与前-crRNA的重复区杂交，并且介导前-crRNA加工为含有个体间隔臂序列的成熟crRNA。第三，成熟crRNA：tracrRNA复合体通过通过crRNA上的间隔臂和与原间隔相邻基序(PAM)相邻的靶DNA上的原间隔之间的沃森克里克碱基配对将Cas9引导至靶DNA，这是对于靶标识别另外所需的。最后，Cas9调控靶DNA的切割以在原间隔内产生双链断裂。

因此，Cas9是II型CRISPR-Cas体系的标志蛋白，并且是大的单体DNA核酸酶，其被两个非编码RNA(CRISPR RNA(crRNA)和反激活crRNA(tracrRNA))的复合体被引导至与PAM(原间隔相邻基序)序列基序相邻的DNA靶序列。Cas9蛋白含有两个与RuvC和HNH核酸酶同源的核酸酶结构域。HNH核酸酶结构域切割互补DNA链，而RuvC-样结构域切割非互补链，并且由此在靶DNA中引入钝性切割。Cas9连同sgRNA的异源表达可以将位点-特异的双链断裂(DSBs)引入来自各种生物的活细胞的基因组DNA。为了应用于真核生物，使用Cas9的密码子优化版本，其初始来自细菌酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。

单个引导RNA(sgRNA)是CRISPR/Cas体系的第二组分，其与Cas9核酸酶形成复合体。sgRNA是通过将crRNA与tracrRNA融合产生的合成的RNA嵌合体。位于其5′末端的sgRNA引导序列赋予DNA靶标特异性。因此，通过修饰引导序列，可能产生具有不同靶标特异性的sgRNA。引导序列的典型长度是20bp。在植物中，已经使用植物RNA聚合酶III启动子(如U6和U3)来表达sgRNA。

本发明的方法中使用的Cas9表达质粒可以如本领域中描述进行构建。

因此，本发明的方面涉及靶向的诱变方法，特别是基因组编辑，并且在优选的实施方案中，排除仅基于通过传统育种方法产生植物的实施方案。

在本发明另一方面，提供检测具有增加的或高的HY5表达水平和/或增加的或高的氮代谢水平的植物品种的筛选方法，所述方法包括在至少一种植物中检测HY5表达水平，并且选择具有最高或较高HY5表达水平所述一种或多种植物。在优选的实施方案中，选择的植物还通过多种方式，如上文所述的那些繁殖。

术语HY5和植物在上文定义。

前述公开内容提供包括在本发明的范围内的主题的一般描述，包括制备和使用本发明的方法，以及其最佳方式，提供以下实例以进一步使得本领域技术人员实践本发明，并提供其完整的书面描述。然而，本领域技术人员将理解，这些实例的具体内容不应该理解为限制本发明，其范围应该从本公开所附的权利要求和其等价物理解。根据本公开内容，本发明的各种其他方面和实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。

″和/或″在本文中使用的情况下要认为是两个指定特征或成分的每一个与或不与另一个的具体公开。例如″A和/或B″要理解为(i)A，(ii)B以及(iii)A和B中的每个的具体公开，就像每个在本文中单独列出。

除非上下文另有指示，上述特征的描述的定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且等效应用于描述的所有方面和实施方案。

前述申请，和其中或它们的审查过程中引用的所有文献和序列登记号(″申请引用的文献″)和以及申请引用的文献中引用或参考的所有文献，和本文中引用或参考的所有文献(″本文引用的文献″)，和本文引用的文献中引用或参考的所有文献，连同对于本文中或本文中通过参考结合的任何文献中所述的任何产品的任何制造商的使用说明、说明书、产品说明书和产品小册，在此通过参考结合于本文，并且可以用于本发明的实践。更具体地，所有参考的文献通过参考结合至与好像指明各个个体文献具体和分别通过参考结合相同的程度。

实施例

材料和方法

植物材料和生长条件。将拟南芥种子在4℃吸胀三天，然后置于1/2MS培养基上。将漏出的幼苗在22℃暴露于16h光周期。涉及幼苗嫁接的实验如之前所述进行(17)。

质粒构建体。扩增HY5cDNA并亚克隆入pCaMV35S：nos载体(32)。将HY5、SUC2和CAB3启动子的序列扩增并亚克隆入pCaMV35S：nos载体，HY5启动子和GFP编码序列二者也是这样以产生pHY5：GFP表达盒。将HY5编码序列克隆入pSK-N-Tagged-myc载体(33)，并且然后亚克隆入pCaMV35S：nos载体。为了制备pCAB3：2×GUS-TEVrs-HY5-GFP融合构建体，通过PCR将TEV识别位点(TEV^rs)融合于2×GUS编码序列的3′-末端，并且将PCR产物引入pCAB3：HY5-GFP载体。将TEV蛋白酶扩增和克隆入pCaMV35S：nos载体(32)。为了构建pHY5：HY5-GFP转基因，将HY5编码序列克隆入pHY5：GFP构建体。用于PCR扩增的引物序列在表2中给出。

转录物分析。使用TRIzol试剂(Invitrogen，New York，USA)提取总RNA，并且使用M-MLV反转录酶试剂盒(Promega，Wisconsin，USA)反转录。如前所述进行qRT-PCR分析(34)。由三次生物学重复代表各个实验，每个生物学重复至少三次技术重复。拟南芥肌动蛋白2用作参比基因。相关引物在表3中给出。

免疫印迹分析。粗制蛋白的制备通过在50mM Tris-HCl(pH 7.5)，150mM KCl，10mMMgCl2，1mM EDTA，10％甘油，0.1％NP-40，1×完全蛋白酶抑制剂(Roche)中提取获得。将等分试样经10％(w/v)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移到Hybond ECL硝酸纤维素膜上。随后按照已建立的方案(35)操作膜。分别使用抗-myc抗体(Santa Cruz Biotechnology，SantaCruz，USA)和抗-GFP抗体(Roche Diagnostics GmbH，德国)检测myc-HY5和HY5-GFP融合蛋白，并且使用uperSignal West Pico化学发光底物(Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA)显现信号。

总碳和氮含量的测量。将脱水的植物组织研磨，并且使用ElementarVario PYROCube分析仪(Elementar Analysensysteme GmbH，Frankfurt，德国)，使用高温燃烧过程(36)以确定粉末化材料的总碳和氮含量。

¹⁵NO3-摄取活性测定。如其他地方所述(3)测定根¹⁵NO3^-流入。将根在80℃干燥过夜，并且使用ANCA-MS体系(PDZ Europa Ltd)测量¹⁵N含量。

ChIP-PCR测定。将hy5和pHY5：myc-HY5hy5幼苗在1/2MS板上生长14天。然后将植物组织的2g等分试样通过甲醛交联固定。如之前所述(37)，ChIP测定使用抗-myc抗体(SantaCruz Biotechnology，Santa Cruz，USA)。DNA片段的富集通过qRT-PCR分析确定。进行三次独立的生物学重复。相关引物序列在表4中给出。

EMSA测定。将HY5cDNA扩增并克隆入pMAL^TM-c2X载体(New England Biolabs，Ipswich，USA)。根据制造商的说明，纯化MBP和MBP-HY5融合蛋白。扩增DNA探针并使用生物素标记试剂盒(Invitrogen，New York，USA)用生物素在其3-末端标记。使用LightShift化学发光EMSA试剂盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA)进行DNA凝胶迁移测定。使用的引物序列在表5中给出。

结果

尽管植物嫩芽和根按照不同的发育轨迹，但是协调其生物学以在波动的环境中优化整体植物性能。代谢吸收的协调至关重要：嫩芽固定大气中的碳(C；CO₂)，根获取土壤离子氮(N；主要是硝酸根(NO3^-))(1)。因为N是必需的，土壤NO3^-水平常常限制天然和农业环境中的生产率(2，3)。已知N和C获取率的调节是紧密关联的(4，5)，利用光调节这两个过程(6)。然而，潜在的调节长距离嫩芽-根通讯的分子机制尚是未知的。

作为调节嫩芽-根通讯的明显报告子，并且因为根通常不暴露于光，我们因此确定分开的嫩芽或根照射对根生长的影响(图1A)。我们发现，野生型(WT)拟南芥(Col-0实验株)幼苗(其嫩芽(仅)暴露于光(S(L)/R(D))的初生根与完全暴露于光(S(L)/R(L)的WT幼苗的初生根具有相似长度(图1A-C)。相比之下，WT S(D)/R(L)幼苗的根比S(L)/R(D)幼苗的短，并且与S(D)/R(D)幼苗具有相似长度(图1B，C)。此外，S(L)/R(D)幼苗的侧根增殖类似于S(L)/R(L)的，而S(D)/R(L)幼苗的侧根增殖少得多，类似于S(D)/R(D)的侧根增殖(图7)。因此，嫩芽照射最可能通过嫩芽-至-根信号传导促进根生长。

我们接着筛选在嫩芽-照射促进的根生长方面被特异性破坏的拟南芥突变体，并且发现，它们之一含有新的HY5功能缺失等位基因(hy5-526；图1B；图8)。进一步分析表明，hy5无效等位基因(7；图8)也消除嫩芽-照射促进的根生长(图1C)。HY5编码光敏形态发生的bZIP转录因子HY5(8)。HY5由COP1泛素连接酶调节，所述泛素连接酶靶向HY5，用于在黑暗中的蛋白质降解(9，10)。因此，我们发现，功能缺失copl-4突变体模拟暗生幼苗中根生长的嫩芽-照射促进(图1C)。这些结果提示，HY5调控根生长的嫩芽-照射促进。

我们接着发现，WT根NO3^-摄取由嫩芽的照射促进，但不由根的照射促进(图1D)。NO3^-由植物经由双重低亲和力/高亲和力CHL1/NRT1.1/NPF6.3和高亲和力NRT2.1转运子摄取(11-15)。嫩芽-照射促进的NO3^-摄取在缺乏NRT2.1的nrt2.1-2突变体中大量减少，但在缺乏CHL1/NRT1.1/NPF6.3的chl1-5突变体中相对不受影响(图1D)，表明根NO3^-摄取的嫩芽-照射促进是显著NRT2.1-依赖性的。此外，嫩芽-照射促进的根NO3^-摄取在hy5和hy5-526二者中大量消除(图1D)，这提示HY5调节NRT2.1-依赖性的对根NO3^-摄取的嫩芽-照射促进。

随后的实验使用下胚轴移植嵌合体，并且发现HY5接穗允许根生长和NO3^-摄取的嫩芽-照射促进(相对于hy5-526接穗；图1E，F)，这提示HY5-依赖性的嫩芽-衍生的信号调节根NO3^-摄取。为了确定HY5是否是该信号(的部分)，我们接着使用非组织特异性pHY5(8)、光合组织-特异的pCAB3(16，17)或韧皮部伴细胞-特异的pSUC2启动子(18)在hy5中表达编码HY5-GFP或myc-HY5融合蛋白的转基因，发现HY5-GFP和myc-HY5二者补充hy5表型(图9)，并且因此保留HY5活性。我们还发现pHY5：HY5-GFP、pCAB3：HY5-GFP和pSUC2：HY5-GFP全部恢复hy5的初生根生长的嫩芽照射调节(图2A)。因为pCAB3-驱动的表达是光合组织-特异性的，这些观察结果提示HY5转录物、HY5、或HY5-依赖性的信号从嫩芽移动到根。

我们接着发现HY5-GFP可在S(L)/R(D)pHY5：HY5-GFP hy5幼苗的整个根中检测，但在S(D)/R(D)中不被检测到(图2B)，这提示HY5在暗生根中相对稳定，并且特别是根HY5丰度受嫩芽照射调节。我们此外在S(L)/R(D)pCAB3：HY5-GFP hy5幼苗的根中检测到HY5-GFP，但在S(D)/R(D)对照中没有检测到(图2C)，这暗示HY5转录物、或HY5(或二者)从嫩芽移动到根。我们接着比较pCAB3：myc-HY5hy5幼苗中myc-HY5转录物和myc-HY5的分布(图2D，E)。尽管myc-HY3转录物仅可在S(L)/R(D)嫩芽中检测到(图2D)，myc-HY5在S(L)/R(D)嫩芽和根中检测到(图2E)。该结果通过检测S(L)/R(D)-生长的pCAB3：HY5-GFP hy5/hy5嫁接嵌合体的根中的HY5-GFP确认(图2F；图10)。利用pHY3：HY5-GFP hy5幼苗的进一步实验在嫁接的植物的S(L)/R(D)砧木根中检测HY5-GFP(图11)，这提示在韧皮部脉管中HY5从嫩芽移动到根。

我们接着从pCAB3表达融合的HY5-GFP、TEVrs(TEV蛋白酶识别位点)和双β-葡糖苷酸酶(2×GUS)(2×GUS-TEVrs-HY5-GFP)蛋白。在嫩芽中检测到该蛋白，但在S(L)/R(D)植物的根中没有检测到，可能因为其相对大的尺寸阻止嫩芽-根移动(图2G；图12)。然而，35S：TEVP(表达TEV蛋白酶)的共表达使得能够在TEV^rs切割(19)，这导致在嫩芽和根中检测到HY5-GFP(图2G；图12)。HY5-GFP移动性的这些变化平行地反映了对嫩芽-照射促进的初生根生长(图2H)和NO3^-摄取(图2I)的影响。这些结果表明，HY5的嫩芽-根移动是嫩芽-照射促进的根生长和NO3^-摄取所必需的。有趣的是，HYH，即一种与HY5密切相关的转录调节剂(20)，不是嫩芽-根移动型的(图13)。因此，HY5(但不是HY5mRNA)是调控根生长和NO3^-摄取的光调节的嫩芽-根移动信号。

由pHY5：HY5-GFP(图2B)、pCAB3：HY5-GFP(图2C)和pHY5：HY5-GFP hy5/hy5嫁接嵌合体(图11)赋予hy5根的HY5-GFP分布不同。pHY5：HY5-GFP导致HY5-GFP在整个根中检测到，而pCAB3：HY5-GFP和pHY5：HY5-GFP hy5/hy5幼苗赋予与根脉管系统更密切相关的HY5-GFP位置。该差异可能是因为HY5激活根HY5表达。首先，在hy5中，pHY5：GFP转基因(报告pHY5活性)的根表达的嫩芽-照射诱导降低(图2J)，这提示源自嫩芽的HY5通常激活根pHY5。第二，HY5-GFP可在嫩芽-照射的pCAB3：myc-HY5hy5/pHY5：HY5-GFP hy5嫁接物的根中检测到，但在嫩芽-照射的hy5/pHY5：HY5-GFP hy5嫁接物的根中不能检测到(图2K)。第三，使用pHY5：myc-HY5hy5幼苗的根的EMSA测定和ChIP分析确认HY5对pHY5的结合(21；图14)。这些观察结果表明，嫩芽-根转移的HY5通过自调节反馈环路激活根HY5。

我们接着发现，根NRT2.1转录物水平的嫩芽-照射促进在hy5中大量消除(图3A)。进一步实验表明，HY5接穗/pHY5：HY5-GFP hy5砧木或pCAB3：HY5-GFP hy5接穗/HY5砧木允许根NR72.1转录物水平的嫩芽-照射-依赖性升高到与在HY5植物中观察到的相似的程度，但pCAB3：HY5-GFP hy5接穗/hy5砧木的水平相对于在HY5植物中观察到的降低(图3A)。这些差别效应平行反映对嫩芽-照射和NRT2.1-依赖性的NO3^-摄取的影响(图3B)，并且涉及根中对功能性HY5的需要。ChIP和EMSA测定表明HY5对NRT2.1启动子的体内和体外结合(图3C，D)，这表明HY5直接调节NRT2.1表达。综上，这些结果提示嫩芽-根移动性的HY5通过由根HY5的自活化放大的机制激活根NRT2.1，由此增加NO3^-摄取。

近期的研究表明HY5部分通过控制叶绿素生物合成和光合成相关的基因(例如八氢番茄红素合酶(PHYTOENE SYNTHASE)(PSY，图3E))的表达调整光合成能力(22，23)。固定的C以蔗糖的形式经韧皮部主要转运到下沉组织(sink tissues)(例如，根)(24)，并且海藻糖前体海藻糖-6-磷酸盐(T6P)用作光合成的碳水化合物状态的代替物(25)。我们还发现，HY5通过促进TPS1(编码海藻糖-6-磷酸盐合酶的基因(25))以及SWEET11和SWEET12(编码蔗糖流出转运体的基因)的表达水平(24)影响蔗糖代谢和嫩芽-根转运(图3E)。进一步的ChIP实验确认HY5对TPS1、SWEET11和SWEET12启动子的结合(图3F)。因此，HY5调节C固定和输入韧皮部细胞，用于嫩芽-根迁移。

因为C-状态调节N-状态(4，5)，我们接着确定糖水平是否影响根NRT2.1转录物水平和光-调节的NRT2.1-依赖性的NO3^-摄取。我们发现糖(蔗糖或葡萄糖)增强NRT2.1表达和NO3^-摄取的嫩芽-照射促进(在hy5中大量消除的作用)(图3G，H；图15)。此外，ChIP测定表明，蔗糖促进光激活的myc-HY5对NRT2.1启动子的体内结合，并且该效应在糖不敏感型突变体sis4中消除(图3I)。因为HY5启动子活性和HY5-GFP丰度都不由蔗糖增加(图16)，增加的HY5水平不可能促进蔗糖诱导的myc-HY5对NRT2.1启动子结合亲和力的增加。不论何种机制，NRT2.1表达和NO3^-摄取的蔗糖诱导依赖于HY5(图17)。综上，HY5蛋白移动促进C和N代谢的协调的稳态平衡。

因为入射光能量密度(incident light fluence)的天然波动影响C-固定(26)和HY5丰度(27)二者，我们因此确定增加能量密度(5-100μmol.s^-1.m^-2)对根生长和NO3^-摄取的影响。我们发现增加能量密度促进WT初生根延伸长度(图4A)和NO3^-摄取(图4B)，这引起生物量积累的能量密度-依赖性的增加(图4C)。然而，这些能量密度-依赖性效应在hy5中大量消除(图4A-C)。我们接着确定HY5是否在更成熟的植物中继续协调生长、C和N代谢。首先，我们发现，缺少HY5降低21-日龄土壤-生长的植物的生物量，随增加的能量密度增加的效应(图4D，图18)。接着，我们发现21-日龄WT和hy5完整植物的C含量随着增加的能量密度相对不变(图4E)。相比之下，尽管WT完整植物的N含量保持相对不变，但是hy5的N含量随能量密度增加显著下降(图4F)。结果，缺少HY5引起C/N含量比的能量密度-依赖性的增加(其在WT中保持相对不变；图4G)。这些结果提示，移动HY5调节嫩芽和根生长、C和N获取的协调。尤其是，HY5在改变的光能量密度维持C和N代谢的稳态平衡。

尽管之前的研究表明，在拟南芥的早期幼苗发育期间韧皮部-移动的蔗糖作为来源于子叶的信号以控制初生根延伸(28)，调节侧根生长和N摄取的嫩芽-根长距离信号传导的分子机制仍然不清楚(29)。这里，我们表明HY5是调控嫩芽生长和C吸收与根生长和N摄取的光调节的关联的嫩芽-根移动信号。该关联通过嫩芽中C固定的HY5-调节以及通过根中HY5-依赖性的N-摄取的蔗糖-增强的促进来实现。结果，HY5调控完整植物C相对于完整植物N状态的稳态调节。已经已知在植物生长和发育的控制中，HY5整合多种植物激素(例如，脱落酸)和环境(例如，低温)信号传导输入(30，31)。

我们关于HY5是移动信号的发现对该知识增加另外的维度。我们的关于HY5移动调控C和N代谢的稳态协调的发现增强对如何在波动的环境中维持植物C和N营养平衡的理解，并且提示改善作物种营养使用效率的新策略。

HY5同源物的鉴别

两个蛋白序列之间同一性的百分数通过将匹配数除以总位置(包括缺口位置)来获得。

表1：HY5同源物同一性(基于蛋白序列)

At：拟南芥(Arabidopsis thaliana)；Bn：欧洲油菜(Brassica napus)；Gb：海岛棉(Gossypium barbadense)；Gm：大豆(Glycine max)；Hv：大麦(Hordeum vulgare)；Ta：普通小麦(Triticum astivum)；Os：水稻(Oryza sativa)；So：甘蔗(Saccharum officinarum)；Zm：玉米(Zea mays)；Sm：江南卷柏(Selaginella moellendo rffii)；Pp：小立碗藓(Physcomitrella patens)。

拟南芥中的PpHY5的表达和拟南芥中OsHY5的表达(图5)

为了研究是否存在HY5功能的进化保守性，我们接着产生在hy5中使用拟南芥HY5基因的启动子表达OsHY5-GFP和PpHY5-GFP融合蛋白的转基因植物。我们发现pAtHY5：OsHY5-GFP和pAtHY5：PpHY5-GFP补充hy5下胚轴延伸表型(图5a)。我们还发现，pAtHY3：OsHY5-GFP和pAtHY5：PpHY5-GFP二者恢复hy5的根分生组织大小和NRT2.1表达的嫩芽-照射调节(图5b，c)。接着的实验使用下胚轴嫁接嵌合体，并且发现，OsHY5-GFP和PpHY5-GFP的分布可以在嫁接的植物的砧木根中检测，这提示PpHY5-GFP和OsHY5-GFP融合蛋白二者都是移动的(图5d)。

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序列信息

拟南芥

SEQ ID NO：1用于构建体的AtHY5CDS：

atgcaggaacaagcgactagctctttagctgcaagctctttaccatcaagcagcgagaggtcatcaagctctgctccacatttggagatcaaagaaggaattgaaagcgatgaggagatacggcgagtgccggagtttggaggagaagctgtcggaaaagaaacttccggtagagaatctggatcggcgaccggtcaggagcggacacaggcgactgtcggagaaagtcaaaggaagcgagggaggacaccggcggagaaagagaacaagcggctgaagaggttgttgaggaacagagtttcagctcagcaagcaagagagaggaaaaaggcttacttgagcgagttggaaaacagagtgaaagacttggagaacaaaaactctgaacttgaagagcgactctctactcttcagaacgagaaccagatgcttagacatattctgaagaacacaacaggaaacaagagaggaggtggtggtggttctaatgctgatgcaagcctttga

SEQ ID NO：2AtHY5mRNA(NM_121164)

cagagatctgacggcggtagccagagtaatctattccttcccaaaatgtctcgcaattagattctttccaagttcttctgtaaatcccaagtcccgctcttttcctctttatccttttcaccagcttcgctactaagacaacaaatctttccctctctctctcgcctgatcgatcttcaaagagtaagaaaaatgcaggaacaagcgactagctctttagctgcaagctctttaccatcaagcagcgagaggtcatcaagctctgctccacatttggagatcaaagaaggaattgaaagcgatgaggagatacggcgagtgccggagtttggaggagaagctgtcggaaaagaaacttccggtagagaatctggatcggcgaccggtcaggagcggacacaggcgactgtcggagaaagtcaaaggaagcgagggaggacaccggcggagaaagagaacaagcggctgaagaggttgttgaggaacagagtttcagctcagcaagcaagagagaggaaaaaggcttacttgagcgagttggaaaacagagtgaaagacttggagaacaaaaactctgaacttgaagagcgactctctactcttcagaacgagaaccagatgcttagacatattctgaagaacacaacaggaaacaagagaggaggtggtggtggttctaatgctgatgcaagcctttgatctccttcttcttcttgtgttatatttttgtggataaaatttacagagaattgtatcaataattatcatgttaaaattatatgggatgtgagagctaatattgcaattgtagaccaagttctcttattgtagtcttagatttctcttaattgaaacataatgttgttttataacaaaaataagctaatttttgttctatgata

SEQ ID No：3AtHY5蛋白

mqeqatsslaasslpssserssssaphleikegiesdeeirrvpefggeavgketsgresgsatgqertqatvgesqrkrgrtpaekenkrlkrllrnrvsaqqarerkkaylselenrvkdlenknseleerlstlqnenqmlrhilknttgnkrgggggsnadasl

水稻(Oryza sativa)

SEQ ID NO：4用于构建体的OsHY5CDS：

atgcaggagcaggcgacgagctcgcggccgtccagctccgagaggtcgtccagctccggcggccaccacatggagatcaaggaaggaatggagagcgacgaggagatagggagagtgccggagctggggctggagccgggcggcgcttcgacgtcggggagggcggccggcggcggcggcggcggggcggagcgcgcgcagtcgtcgacggcgcaggccagcgcgcgccgccgcgggcgcagccccgcggataaggagcacaagcgcctcaaaaggttgctgaggaaccgggtatcagcgcagcaggcaagggagagaaagaaggcatacttgaatgatcttgaggtgaaggtgaaggacttggagaagaagaactcagagttggaagaaagattctccaccctacagaatgagaaccagatgctcagacagatactgaagaatacaactgtgagcagaagagggccaggtagcactgctagtggagagggtcaatag

SEQ ID NO：5OsHY5mRNA

atgcaggagcaggcgacgagctcgcggccgtccagctccgagaggtcgtccagctccggcggccaccacatggagatcaaggaaggaatggagagcgacgaggagatagggagagtgccggagctggggctggagccgggcggcgcttcgacgtcggggagggcggccggcggcggcggcggcggggcggagcgcgcgcagtcgtcgacggcgcaggccagcgcgcgccgccgcgggcgcagccccgcggataaggagcacaagcgcctcaaaaggttgctgaggaaccgggtatcagcgcagcaggcaagggagagaaagaaggcatacttgaatgatcttgaggtgaaggtgaaggacttggagaagaagaactcagagttggaagaaagattctccaccctacagaatgagaaccagatgctcagacagatactgaagaatacaactgtgagcagaagagggccaggtagcactgctagtggagagggtcaatag

SEQ ID NO：6OsHY5蛋白

mqeqatssrpssserssssgghhmeikegmesdeeigrvpelglepggastsgraaggggggaeraqsstaqasarrrgrspadkehkrlkrllrnrvsaqqarerkkaylndlevkvkdlekknseleerfstlqnenqmlrqilknttvsrrgpgstasgegq

小立碗藓

SEQ ID NO：7用于构建体的PpHY5CDS：

atggcagacgcacaaaatggtaagggcttttcgcagttgacttcagttattggaaacatcaatagtgttgcaaatagtagcaggaggggtcccagagaagcggttgatattggccggaactggaaacctgtcaattttggtgagtaccaaggtttgggcgaaatcttgcccatgcaggcctctactgtgggtcccgcttcttctccgccctcttcgaagcagcagacgggcactgatatatcagtatcacctcctttggcgactgcagctgttgacaaactcatgaaagacggcaatgaaagcgactctgatgttaggagggttccagagctatctgcgaagactagtggaggggtttctgggtcgcatacacaagataaaggtctcactggatcttctcatcggaaaagagggggagcttctgctgataaagaacacaagcgtctgaagaggctgcttaggaaccgtgtttcagctcagcaagccagagaacgaaaaaaagcatatctcggtgaattggaagttagatcaaaggagttggagcatcgaaatgcagaattagaagaaagagtgtccaccctacaaagggagaaccagatgttgcgtcaaatcgtcaagaacactgctctgaagaagacttatagtggtggtaacgctgaggatggtgcgcaatga

SEQ ID NO：8：PpHY5mRNA

cagttttgttccattgtagtatgtactttgagccagtaatgcgttgtagttaaactgagagtcctgcactattatttagctaggtctgttcatgtttttcccattgcagtagggattgaagagtgttggaaacaacgacagtaaaactaaacgttcatatgggatggcagacgcacaaaatggtaagggcttttcgcagttgacttcagttattggaaacatcaatagtgttgcaaatagtagcaggaggggtcccagagaagcggtttgtgttggccggaactggaaacctgtcaattttggtgagtaccaaggtttgggcgaaatcttgcccatgcaggcctctactgtgggtcccgcgtcttctccgccctcttcgaagcagcagacgggcactgatatatcagtatcacctcctttggcgactgcagctgttgacaaactcatgaaagacggcaatgaaagcgactctgatgttaggagggttccagagctatctgcgaagactagtggaggggtttctgggtcgcatacacaagataaaggtctcactggatcttctcatcggaaaagagggggagcttctgctgataaagaacacaagcgtctgaagaggctgcttaggaaccgtgtttcagctcagcaagccagagaacgaaaaaaagcatatctcggtgaattggaagttagatcaaaggagttggagcatcgaaatgcagaattagaagaaagagtgtccaccctacaaagggagaaccagatgttgcgtcaaatcgtcaagaacactgctctgaagaagacttatagtggtggtaacgctgaggatggtgcgcaatgatggaatattcgagagatgtgtggcctaccgttttttgttattcataatcaaccatttagtatgtaatgcaggaagtttttatttcaagtatgccccgcttcacattaagttcaaaataagtttggtaatcgaaggtcagaattctctcagcgttgtccttcattccatcaacttccgttgttttatggaatgaccgttggatgctttgttgctgttacaatcgcaagaactatatttccattgaagtcatatttttgaagcaattctcaataactgtatgaaggccatggttcattataaccaagcgattcttgatagcat

SEQ ID NO：9PpHY5蛋白

Madaqngkgfsqltsvigninsvanssrrgpreavcvgrnwkpvnfgeyqglgeilpmqastvgpassppsskqqtgtdisvspplataavdklmkdgnesdsdvrrvpelsaktsggvsgshtqdkgltgsshrkrggasadkehkrlkrllrnrvsaqqarerkkaylgelevrskelehrnaeleervstlqrenqmlrqivkntalkktysggnaedgaq

江南卷柏(Selaginella moellendorffii)

SEQ ID NO：10SmHY5A mRNA(XM_002970018)

atagtcacgtgaaatatctttctctcttggcggagaagctgaaagcggtccaagagctttcggtgtccggatcgagctagtgcttgggggaggcggtgaattttggttccatcgcaatgcggtgactcgggggtgtgaggagtatctattcagtcatgcgatcggcgtccgcggtgaagaggccggttgcgagtttcaatcccggcagggtggagaatttgtcgcggaagaaaggctcgattggcggtgaagcagcggagaatgccgaggtcgtggatgatttgagcagcctcaaagctgagtgtgatatcgagtctgttggatacgagagccaggcggcggccagcattgcgaatttcggctgcaagtcgtttgcaggggcttggaagcccgtcatcgacggaaaaatccaacctttggagccaccaaacagcgccaccaacagcatcacctggaattggacgagcgagtccaacaggacgaattcgtcatcgaggcatggatcagacaggccctctgtttcgaacatctccggctcatcggatatgaagaaagacgacgaaggcaacgatagcgactcggacatcagacgagtgcccgagctgccagagaagagcagcaaaggtcgctctcagaagcttgtcggtggaagctcgtcgtcgagaaggcgatccggaggctcttccaatgacaaggaaggcaagcgactaaagaggttgctgaggaatcgcgtgtcggcacaacaggcccgagagcgcaaaaaggcttacttggtcgagctggagcaaaaggccaaggatctggaaactagaaacgctgagctggaggagaaaaacgcgacgcttcaaagagaaaactacatgctccgacagattgtcaagaacactaccatccggggcggtggcgattgataatccaaatcttccaagacgaaagaaacaggagtaaacaagatctttggccattttacaacatacattggctatataacaagagaagttatggtgttacaacaaaaataatttagctatgactaagat

SEQ ID NO：11SmHY5A蛋白

Mrsasavkrpvasfnpgrvenlsrkkgsiggeaaenaevvddlsslkaecdiesvgyesqaaasianfgcksfagawkpvidgkiqpleppnsatnsitwnwtsesnrtnsssrhgsdrpsvsnisgssdmkkddegndsdsdirrvpelpeksskgrsqklvggssssrrrsggssndkegkrlkrllrnrvsaqqarerkkaylveleqkakdletrnaeleeknatlqrenymlrqivknttirgggd

SEQ ID NO：12SmHY5BmRNA(XM_002973152)

Ggagttttcttggtgctggtgtttctcgcttccacagctcggcattgccccaatcgcgacgagaggacgcatccatagcaatcgacgcgatgattctgaggaacgattgctagaagttcctctctctctctctctgcctctccagccagctccagatttgttccaggatgcaagcagcggcatcagcgtcgccgacaatgcacaagcaattcagcgatttgatggctcttcccaacgccgagatgaaagtggacgaggattgggcaggaaatgagagtgactcggaagtaagaaaggtccccgacttacctggaggtaaaatcgtgactgcgttgccagagcaagacacggcagcatccaattctcgcaagaggggtgctgttcctgctgacaaagaacacaagcgattgaaaagacttttacgcaatcgagtctcggcacaacaagccagggagagaaaaaaggcttacgttgttgagctcgaagcaaaagcccgggatttggagctcaggaatgcggagctagaggaacgggtaaacacgttacaaaaggaaacattcatgctgcgacagattttgaagaacataaagaacaatggctccactgctggactagaacaagcacagtaaaaaaccaaaaactttacttgagggggccaacgtagcaacgaaagtcggccaccactgtaagattgtttctccacaatcagttttggtaaccatcttctcggc

SEQ ID NO：13SmHY5B蛋白

mqaaasasptmhkqfsdlmalpnaemkvdedwagnesdsevrkvpdlpggkivtalpeqdtaasnsrkrgavpadkehkrlkrllrnrvsaqqarerkkayvveleakardlelrnaeleervntlqketfmlrqilkniknngstagleqaq

大麦(Hordeum vulgare)

SEQ ID NO：14HvHY5mRNA(AK365526)

Ggttttcctcgggattgggagggacgagagaggcggggagagaatgcaggagcagggggagagctcgcggccttcgagcagcgagaggtcgtccagctccggcaaccacatggagcacaaggaagggatggagagcgacgacgaaatagggacggtgccggagctaggcctggggccaagcggcgcgtccacgtccggcaggagggaagccgacgggccggagcgtgcccagtcctccaacgcgcaaggcagcgcgcgccgccgcggacgcaccccggctgacaaggagcacaagcgcctcaagaggttgctgaggaaccgggtatcagcccagcaggcaagggagaggaagaaagcttatttgggcgatctggaggtgaaggtgaaggacctagagaagaagaattcggagctggaagagaggcattccaccctacagaatgagaaccagatgctccgacagatcctgaagaacaccactgtgagcagaagagggccaagtgagggtcaatagcacagaagttgtaagggtcgattcgcagaattttcacagcagaatcaaagaagccctaggatcgaatatagctgcgttgattgatcccaaaatacaccatgtctcgaacttaaaatggttggaagctttctgaccaatggataacctcaaaaactggggtcaaaaacctgtgtagatcttcagagatgtccccatcatactctatgaagttcagcactacgtgttgcacttcagtaataatttcagaaaattagttttgggtggtttaacatatgatctgtactatcatttttatgtatctacaagtacaatccaaacattttattgttggataatttactttctactattggaaaatgcgc

SEQ ID NO：15HvHY5蛋白(AK365526)

mqeqgessrpssserssssgnhmehkegmesddeigtvpelglgpsgastsgrreadgperaqssnaqgsarrrgrtpadkehkrlkrllrnrvsaqqarerkkaylgdlevkvkdlekknseleerhstlqnenqmlrqilknttvsrrgpsegq

普通小麦(Triticum astivum)

SEQ ID NO：16TaHY5mRNA

Gagtaagtagcagctgggaggaggagccgaggaagaggagcagaagataggaggagaggagcagcggtagcctcgtcttcctcgggattgggagggacgagagaggcggggggagaatgcaggagcagggggagagctcgcggccttcgagcagcgacaggtcgtccagctccggcaaccacatggggcacaaggaagggatggagagcgacgacgagatagggacggtgccggagctgggcctggggccaagcggcgcgtccacgtccggcaggagggaagccgacgggccggagcgtgcccagtcctccaccgcgcaaggcagcgcgcgccgccgcggacgcaccccggccgacaaggagcacaagcgcctcaagaggttgctgaggaaccgggtatcagcccagcaggcaagggagaggaagaaagcttatttgggcgatctggaggtgaaggtgaaggacctagagaagaagaattcggagctggaagagaggcattccaccctacagaatgagaaccagatgctccgacagatcctgaagaacaccactgtgagcagaagagggccaagtgagggtcaatagcacagaggttgtcagggttgattcacagaattttcacagcagacagttcaattccagtgaatcaaagaggccctaggatcgaatatagccgcgttgatcgatcccaaaacacaccatgtctggaacttaaactggttggaagctttctggccaaaggataacctcaaaaaccgggggcctaaacctgtgtagatcttcacagatgtccccatcatactctatgaagttcagcaccacgtgctgtgcttcgttaataatttcacaaaattagttttgggtgatttaacatatgatctgtatcattttttatgtatctacaagcacaatccaaacattttattgttgggcaatttactttgtactattggaaaatgcgcacgtccggtgtcggcaatgcagccctgtcatgttggctcttgcagaccagactatttgttttgttgaacttgcttcaataaagtggccgcatgcatctttccgatgcagaggccggggaagtcctccttttcaaaaaaaaaaaaaaaacga

SEQ ID NO：17TaHY5蛋白

mqeqgessrpsssdrssssgnhmghkegmesddeigtvpelglgpsgastsgrreadgperaqsstaqgsarrrgrtpadkehkrlkrllrnrvsaqqarerkkaylgdlevkvkdlekknseleerhstlqnenqmlrqilknttvsrrgpsegq

玉米(Zea mays)

SEQ ID NO：18ZmHY5/ZmbZIP61mRNA(KJ726945)

Atgcaggagcaggcggcgagctcgcggccttccagcagcgagaggtcgtccagctccgggcaccacgtggacatggaggtcaaggaagggatggagagcgacgatgagataaggagagtgccggagctgggcctggagttgccgggagcctccacgtcgggcagggaggctggccctggcgctgcgggcgcagaccgcgcccttgcccagtcgtccacggcgcaggccagcgcgcgccgccgcgtccgcagccacgccgacaaggagcacaagcgcctcaaaaggttactgaggaacagggtgtcagctcaacaggctagagagaggaagaaggcttatttaactgatctggaggtgaaggtgagagatctggagaagaagaactcggagatggaagagaggctctccaccctccagaacgagaaccagatgctccgacagatactgaagaacaccgctgtaaacagaagaggttcaggaagcactgctagtggagagggccacggccaa

SEQ ID NO：19ZmHY5/ZmbZIP61蛋白

mqeqaassrpssserssssghhvdmevkegmesddeirrvpelglelpgastsgreagpgaagadralaqsstaqasarrrvrshadkehkrlkrllrnrvsaqqarerkkayltdlevkvrdlekknsemeerlstlqnenqmlrqilkntavnrrgsgstasgeghgq

甘蔗(Saccharum officinarumL.)

SEQ ID NO：20SoHY5mRNA(CA121289)

Agacaggaaggatcgcaggggaggaggagatagggaaggagaagcggagtgcgcgcgggcgactctgcagggcctcagtcggaggcggaggtggagagcgagccagaatgcaggagcaggcgacgagctcgcggccttccagcagcgagaggtcgtccagctccgcgcaccacatggacatggaggtcaaggaagggatggagagcgacgaggagataaggagagtgccggagctgggcctggagctgccgggcgcttccacgtcgggcagggaggctggcccgggcgccgccggcgcagaccgcgccttggcccagtcgtccacggcgcaggccagcgagcgccgccgcgtccgcagccccgccgacaaggagcacaagcgcctcaaaagattactgaggaaccgggtgtcagctcaacaggcaagagagaggaagaaggcttatttgactgatctggaggtgaaggtgaaacaccctgaagaagaagaacttcgaggttcgaagaagaggctctctacccttaaaaacgaagaaccagatgctccgggcagatacctgaagaatacccactgtaagcagaaagaggtttacggaagcactggttagtggaaaaaggccaattagttcaaaatgacaggaaaaatggtaatggcctatgcttaaatatatgtttatgggga

SEQ ID NO：21SoHY5蛋白

mqeqatssrpssserssssahhmdmevkegmesdeeirrvpelglelpgastsgreagpgaagadralaqsstaqaserrrvrspadkehkrlkrllrnrvsaqqarerkkayltdlevkvkhpeeeelrgskkrlstlkneepdapgrylknthckqkevygstg

欧洲油菜

SEQ ID NO：22BnHY5mRNA(EV071015)

gaaagtcccgctcttttccatctctatcttcatcaccagcttctgtaaatcccaatccatcttcaaaggagattcaaagagtaaggaaaaaaaaatgcaggagcaaacgactagctctttacctgcaagctctctaccatcaagcagcgagagatcctcaagctctgctcctcatttggagatcaaagaaggaattgaaagcgatgaagagatacggcgagttccggagtttggaggagaagctaccggaaaggaaatctctggatcggcgaccggtcaggaccagacacaagcaacggtcggaggagagggtcaaaggaagagagggaggactccggctgagaaagagaccaagcggcttaagaggttgttgaggaacagagtttcagcacagcaagcaagagagaggaagaaagcttacttgggtgagttggaaaacagagtgaaagacttggagaacagaaactctgaacttgaagagagactctctaccttgcagaacgagaaccagatgcttagacagattctgaagaacacaacaggaaacaagaggggaagcggtggttctaacgctgatgcaagcctatgatctccttgttcttgtattattatttacctggataaactttacaaggaattgtattaaataaatattttt

SEQ ID NO：23BnHY5蛋白

mqeqttsslpasslpssserssssaphleikegiesdeeirrvpefggeatgkeisgsatgqdqtqatvggegqrkrgrtpaeketkrlkrllrnrvsaqqarerkkaylgelenrvkdlenrnseleerlstlqnenqmlrqilknttgnkrgsggsnadasl

海岛棉(Gossypium barbadense)

SEQ ID NO：24GbHY5mRNA(JK803801)

Ccaaaaaattaattttattttgttttttctataacgaagaaatgcaagaacaaggaacgagttcaatagcagctagttccttaccttcaagcagtgaaagatcttcaagctctgctcttcaagttgaagtcaaggaaggcatggaaagtgatgaagagatccggagagtgcctgagataggaggtgaagcatcagcagctccggccgccggtcgtgaacccggttcactgacccgactggaccggcctcaaccatcgggtgaaggcggtcagagaaagagagggagaagcccaacggataaagaaaacaagcgcttaaagaggttgttgaggaacagagtatcagcgcaacaagcaagggaaaggaaaaaggcgtacttgaatgaaccggaaaccagagttagagacttggagaagaagaactctgaactagaagagaggctatccacgttgcacaatgagaatcagatgcttcgacaaatagtcaagaacacaactgctagcaggagaggtggaaatggcagttcaaatgcagctgatggaaccctttaaaggaaatgcatgggtataaaaaattataaagggattttttttaaaaaaatattaattttatgctttagggaaaaaaaaaccgctattagcaatgcaatgaagtagcaaaacatgacaattggaactttggttctctctaatcttaatcataaaagtaaattatc

SEQ ID NO：25GbHY5蛋白

mqeqgtssiaasslpssserssssalqvevkegmesdeeirrvpeiggeasaapaagrepgsltrldrpqpsgeggqrkrgrsptdkenkrlkrllrnrvsaqqarerkkaylnepetrvrdlekknseleerlstlhnenqmlrqivknttasrrggngssnaadgtl

大豆

SEQ ID NO：26GmHY5LmRNA(BT093548)

gggaagaaagagagagagagagagagagagaggtgtgaagttggtgaaggtttttgagaagaaagatggaacgaagtggcggaatggtaactgggtcgcatgaaaggaacgaacttgttagagttagacacggctctgatagtaggtctaaacccttgaagaatttgaatggtcagagttgtcaaatatgtggtgataccattggattaacggctactggtgatgtctttgtcgcttgtcatgagtgtggcttcccactttgtcattcttgttacgagtatgaactgaaacatatgagccagtcttgtccccagtgcaagactgcattcacaagtcaccaagagggtgctgaagtggagggagatgatgatgatgaagacgatgctgatgatctagataatgagatcaactatggccaaggaaacagttccaaggcggggatgctatgggaagaagatgctgacctctcttcatcttctggacatgatttctcaaataccaaacccccatctagcaaacgggcaaccgatgtctggtgagtttccatgtgctacttctgatgctcaatctatgcaaactacatctataggtcaatccgaaaaggttcactcactttcatatgctgatccaaagcaaccaggtcctgagagtgatgaagagataagaagagtgccagagattggaggtgaaagtgccggaacttcggcctctcagccagatgccggttcaaatgctggtacagagcgtgttcaggggacaggggagggtcagaagaagagagggagaagcccagctgataaagaaagtaaacggctaaagaggctactgaggaaccgagtttcagctcagcaagcaagggagaggaagaaggcatacttgattgatttggaaacaagagtcaaagacttagagaagaagaactcagagctcaaagaaagactttccactttgcagaatgagaaccaaatgcttagacaaatattgaagaacacaacagcaagcaggagagggagcaataatggtaccaataatgctgagtgaacataatgtcaaaagatggcagagaaaacttatagatggaatagatttagaaagagagaatacattagccagaaagagaaaaaaaaaattggacattagttgatgattctttctaggtgtgcgtttggaatacaatgaagtaaaggatgaaccttaagacatgctttatcctaaaatagtgtgatctgatattccattgttaatgagtaatgtaattatcatacaaacaatttgtagtctcattttaattaataattattaaactacttgattaaaaaaaaaaaaaaaaa

SEQ ID NO：27GmHY5L蛋白

mrstmaketvprrgcygkkmltslhlldmisqipnphlangqpmsgefpcatsdaqsmqttsigqsekvhslsyadpkqpgpesdeeirrvpeiggesagtsasqpdagsnagtervqgtgegqkkrgrspadkeskrlkrllrnrvsaqqarerkkaylidletrvkdlekknselkerlstlqnenqmlrqilknttasrrgsnngtnnae

SEQ ID NO：28GmbZIP36/STF1mRNA(NM_001250343.1)

actgaagtaagaaagagagagagagagagaaagagaagtgtgtagttggtgaagtttttgagaagaatatggaacgaagtggcggaatggtaacggggtcgcatgaaaggaacgaacttgttagagttagacacggttctgacagtgggatttgtcaaatatgtggtgacaccattggattaacggctactggtgacctctttgttgcttgtcatgagtgtggcttcccactttgtcattcttgttacgagtatgagctgaaaaatgtgagccaatcttgtccccagtgcaagactacattcacaagtcgccaagagggtgctgaagtggagggagatgatgatgacgaagacgatgctgatgatctagataatgggatcaactatggccaaggaaacaattccaagtcggggatgctgtgggaagaagatgctgacctctcttcatcttctggacatgattctcatataccaaacccccatctagtaaacgggcaaccgatgtctggtgagtttccatgtgctacttctgatgctcaatctatgcaaactacatcagatcctatgggtcaatccgaaaaggttcactcacttccatatgctgatccaaagcaaccaggtcctgagagtgatgaagagataagaagagtgccggagattggaggtgaaagcgctggaacttcagcctctcggccagatgccggttcaaatgctggtacagaacgtgctcaggggacaggggacagccagaagaagagagggagaagcccagctgataaagaaagcaagcggctaaagaggctactgaggaatagagtttcggctcagcaagcaagggagaggaagaaggcatatttgattgatttggaaacaagagtcaaagacttagagaagaagaactcagagctcaaagaaagactttccactttgcagaatgaaaaccaaatgcttagacaaatattgaagaacacaacagcaagcaggagagggagcaatagtggtaccaataatgctgagtaaacttatagatggagtagatatagagagagagaaagagaaaaaaattaaacattagttgatgattctttctaggtgtgcgtttggaatacaatgaagtaaaggatgaaccttaagacatgctttgtcctaaaatagtgtgatctgatgtaccattgttgatgagtaatgtaattatcatacacagttttttacagtctcattttaattaataattatcaaactacttgattacttatggttaa

SEQ ID NO：29GmbZIP36/STF1蛋白

Mersggmvtgshernelvrvrhgsdsgskplknlngqicqicgdtigltatgdlfvachecgfplchscyeyelknvsqscpqckttftsrqegaevegddddeddaddldnginygqgnnsksgmlweedadlssssghdshipnphlvngqpmsgefpcatsdaqsmqttsdpmgqsekvhslpyadpkqpgpesdeeirrvpeiggesagtsasrpdagsnagteraqgtgdsqkkrgrspadkeskrlkrllrnrvsaqqarerkkaylidletrvkdlekknselkerlstlqnenqmlrqilknttasrrgsnsgtnnav

SEQ ID NO：35：HY5启动子(2.2.kb)

cttcgtcgtcaggattatccgtcaacagagttctgtttcggaatcggaacgctagtccttgtggtctatctcttccaattctcaatccgtctcggtctgtacttgtttttgctcgtggcaagaatcgaaaaggattcgtgtcttcgtcttcttcgtctccgaagaaaaacaaaaaggtaagaaaatcagaatgagaatgatttatgttcgcaattgctcttacctgctgctttcgccgaatttgactagaatttggatacactaactaagtgagctattatcggttagaattggtgaatcctcgaattagactttggctctttttgattttgtatcagcctttgatttcatggtttgtggcagaaaagtttggatggagctgataatggaggaggtgaggaggaggaggatccatttgaggcattgtttaatcttttagaagaagatttgaagaatgataactcggatgatgaggagataagtgaggaagagttagaggcattagccgatgagttagctcgagcattgggtgttggtgacgatgttgatgacatcgacttgtttggttcagtcactggtgatgttgatgttgatgttgataatgatgatgatgataatgatgatgatgataatgatgatgatgatgatgacagcgaagaagatgaaagaccgactaagctgaagaattggcagcttaaaagactggcttatgcattgaaagctgggcgtcgtaaaactagtgtaagttttagttcagtgttgaagtgatgttgaatacattgtgtaaagcatagtgcttgagttagtgtctgctttggagattttgcttacgaattgtttaagagttgacaaagaacaagtagttctctggttttcaaatgcataattgataacggatggttttgttgtgatctgtagattaaaaatctggcagctgaggtttgtcttgacagggcttatgttcttgaattgcttcgtgacccgcctccaaagctgctaatgctaagtgctacactaccagatgaaaaaccgccagtagcagcacctgagaactcctcacctgatccaagtcctgtggaatcattatcagctgaagatgttgtggtcgaacctaaggaaaaagtaaaagatgaagcagttcatgtgatgcaacagagatggtctgctcagaaaagagtgaagaaagctcacattgaaacgctagagaaagtttacagaagatcaaaacgacccactgtaaggattctccttttacatttgaatcaatttctatgttacttgaatgctctatctcacatatgatcatgtttgatgatgctgtgaatagaatgctgtggttagcagcattgttcaagtgaccaatcttccaaggaagcgagttttgaagtggttcgaagataaaagagcagaagacggagttccagataagcgagctccatatcaagctccggtttgatctaatgttaacgttgagatggcaatgatttgtatacttgattctcagaaactcatcaacattgtcgtcaaggacaagtttttttggtgatacgaggagtgtttatagtagtagattctgtccaatggtgtggctggatatgttggactatgaaattttaggatatcttgtattcagtttttagttatttccttgctgagattgtgtcttgtagaaaaccgtttcaactttgtttggtttatggcggctataaagtttaattttaatgcatgacaaaaacaaatcaccaaaaataaaataaattactttcacgacacttttgaaagcactgccctaggcgtgggccatgtgacagaatgaaagaactcagaccaaacttttctgtccaaggacaggaatggggcccacccaattagctcccctatccattattcaccgtaagatgctaaccagatctaacggctaaaatccacccacgttccaatctcaattgcctttggatccttgtatttcctcaaggctcacctttctccacgattcactctcgatatccgttcgattcttcagagatctgacggcggtagccagagtaatctattccttcccaaaatgtctcgcaattagattctttccaagttcttctgtaaatcccaagtcccgctcttttcctctttatccttttcaccagcttcgctactaagacaacaaatctttccctctctctctcgcctgatcgatcttcaaagagtaagaaa

表2：用于产生DNA构建体的引物序列

表3：用于qRT-PCR分析的引物序列

引物名称	引物序列(5’至3′)	SEQ ID NO：
			q肌动蛋白2-F	CTGGATCGGTGGTTCCATTC	57
q肌动蛋白2-R	CCTGGACCTGCCTCATCATAC	58
			qHY5-F	GAACGAGAACCAGATGCTTAGAC	59
qHY5-R	TGCAATATTAGCTCTCACATCCC	60
			OCS-R	CATAGGCGTCTCGCATATCTC	61
qHY5-GFP-F	CAGAACGAGAACCAGATGCTTAG	62
			qHY5-GFP-R	CAGATGAACTTCAGGGTCAGC	63
qNRT1.1-F	TCTAAGACCGCTTCAACGGATCG	64
			qNRT1.1-R	ACTGTTGGACCATGAGCGTGTG	65
qNRT2.1-F	AACAAGGGCTAACGTGGATG	66
			qNRT2.1-R	CTGCTTCTCCTGCTCATTCC	67
qTPS1-F	GGTCATTTCTTGGGGAAGGA	68
			qTPS1-R	TCTCCTGATGATGACTTGGC	69
qSWEET11-F	GCGAACAAGTGTACCTGCGG	70
			qSWEET11-R	GGGTACACGTGGTGGTTGGT	71
qSWEET12-F	TCGTCCGATCGGTGAACACA	72
			qSWEET12-R	ACTAGTACACGTGGACAATGGTGA	73

表4：用于ChIP-PCR的引物序列

表5：用干EMSA测定的DNA探针

Claims (17)

1.用于增加植物中氮代谢的方法，所述方法包括在植物中引入并表达包含HY5核酸序列的核酸构建体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸构建体包含编码SEQ ID NO：3所限定的AtHY5蛋白或其功能变体的SEQ ID NO：1或2或编码SEQ ID NO：3的同系物的核酸序列。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述同系物选自SEQ ID NOs：4至29。

4.根据在前权利要求所述的方法，其中所述植物选自玉米、水稻、小麦、欧洲油菜/加拿大油菜、高粱、大豆、向日葵、苜蓿、马铃薯、番茄、烟草、葡萄、大麦、豌豆、豆、蚕豆、莴苣、棉花、甘蔗、糖用甜菜、西兰花或其他芸苔属蔬菜或杨树。

5.根据在前权利要求所述的方法，其中所述核酸构建体包含调节序列。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述调节序列选自组成型启动子或组织特异性启动子。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述组织特异性启动子是绿色组织特异性启动子。

8.核酸构建体，其包含HY5核酸序列和组织特异性启动子。

9.根据权利要求8所述的核酸构建体，其中所述组织特异性启动子是绿色组织特异性启动子。

10.根据权利要求8或9所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含编码SEQ ID NO：3所限定的AtHY5蛋白的SEQ ID NO：1或2或编码SEQ ID NO：3的同系物的核酸序列。

11.根据权利要求10所述的核酸构建体，其中所述同系物选自SEQ ID NOs：4至29。

12.重组载体，其包含根据权利要求8至11中任一项所述的核酸构建体。

13.宿主细胞，其包含根据权利要求8至11中任一项所述的核酸构建体或根据权利要求12所述的重组载体。

14.用于产生具有增加的氮摄取的植物的方法，其包括向植物中引入并表达包含HY5核酸序列和组织特异性启动子的核酸构建体。

15.用于增加植物根中HY5蛋白的存在的方法，其包括在植物中引入并表达包含与绿色组织特异性启动子可操作连接的HY5核酸序列的核酸构建体。

16.用于调节植物中C和N代谢之间的平衡的方法，其包括在植物中引入并表达包含HY5核酸序列的核酸构建体。

17.用于增加植物根中HY5蛋白的存在的方法，其包括在植物的绿色组织中引入并表达包含HY5核酸序列的核酸构建体。