CN118599895A - 一种调控水稻垩白的LOC_Os11g10170基因及其编码蛋白和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种调控水稻垩白的LOC_Os11g10170基因及其编码蛋白和应用。本发明公开LOC_Os11g10170基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ ID NO.2所示。本发明利用CRISPR/Cas9创制的水稻与阴性对照相比，发现敲除水稻中的LOC_Os11g10170基因，会导致水稻垩白粒率和垩白度的增加，而植株的生长发育和基本农艺性状方面则没有显著性差异。说明该基因及其编码蛋白参与稻米垩白调控，从而影响稻米品质。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种调控水稻垩白的LOC_Os11g10170基因及其编码蛋白和应用。
背景技术
水稻是我国重要的粮食作物之一，有60％以上人口以大米为主食。近年来，我国水稻单产和总产量均呈增加趋势，然而优质稻米的培育进展相对较慢，这导致我国优质米的市场占有率较低。稻米的品质性状涉及多个方面，包括外观、食味和营养等，其中稻米外观品质直接决定稻米的商品价值，是稻米品质评价的关键指标之一。垩白是影响稻米外观品质的最重要因素，同时，其也对稻米的外观品质和食味品质有一定的影响。因此，稻米垩白水平的高低直接影响稻米的商业价值，如何快速改良垩白性状已成为目前我国水稻育种界亟需解决的难题。
在水稻籽粒的发育进程中，胚乳的灌浆是大量淀粉与蛋白质等储藏物物质积累的过程。期间淀粉或蛋白等物质的填充水平不仅影响水稻的产量还影响稻米的外观，尤其是储藏物填充不足时，容易造成淀粉粒间空腔的出现，并因此形成垩白表型。已有的研究表明，除遗传因素外，灌浆时期的温度、湿度、光照、水肥条件等许多因素都会显著影响垩白的产生。
有关稻米垩白的遗传调控已有很多研究，如参与稻米胚乳糖转运、能量代谢和抗逆响应等途径的一些基因都有可能影响到稻米垩白(Zhao et al.Genetic control ofgrain appearance quality in rice[J].Biotechnology advances,2022,60,108014.)。尽管如此，关于垩白的相关研究仍然存在大量空白，目前针对在育种中较为实用的垩白性状克隆的基因较少，如Chalk 5是少有的较适用于垩白性状改良育种的基因(Li YB,etal.Chalk5encodes a vacuolar H(+)-translocating pyrophosphatase influencinggrain chalkiness in rice[J].Nature genetics,2014,46(4):398-404.)。因此，发现并克隆一些新的垩白调控基因，进一步发掘其育种应用潜力，对当前稻米品质育种研究具有重要理论和现实意义。
发明内容
为解决现有稻米外观品质改良过程中存在的问题，本发明提供一种调控水稻垩白的LOC_Os11g10170基因及其编码蛋白和应用，为稻米品质的遗传改良提供了新的基因资源。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
本发明公开了一种调控水稻垩白的LOC_Os11g10170基因在降低水稻籽粒垩白、改良稻米品质及其培育垩白低的水稻品种中的应用，将LOC_Os11g10170基因在水稻中过表达，能够降低水稻籽粒垩白、改良稻米品质及其培育垩白低的水稻品种；所述LOC_Os11g10170基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者所述LOC_Os11g10170基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示序列至少90％同源。
SEQ ID NO.1
ATGAATGCTATGGAGGACGTGGTTGTTCTCATCGTTGGTGCGGGGCCAGCAGGCCTAGCAACGGCGGCGTGCCTTGCACAGCGGCATGTGCCATACATCATTGTCGAGCGTGAGTCCAGCACCGCATCGTTGTGGCGCCACCGTGCCTACGACCGCCTCAAGCTACACCTCGCCAAGGAGTTCTGCGAGCTGCCACACATGGCGTATCCGGCGGGCACGCCGACGTACGTTCCTAGGGATATGTTTGTGGAGTACCTAGATAGCTATGCTAACCAGTTTGGGATACGGCCGAGGTACCACACTGCTGTTGAGTCAGCAATACATGATAAAGGTAAGAACCAATGGGTCGTGCTAGTACGAGACATGGACACTAGTGTTGTGGCAAGGCTTGCTACACAGTTCCTTGTTGTGGCCGCTGGCGAGAACAGTGCGGCAAACATTCCACCAATTCCTGGCCTCAGTAGGTTCGAGGGAGAAGCCATTCACTCGTCAGCTTACAAGTCCGGGAGAGCCTATACCGGGAAGAGTGTGCTTGTGGTAGGTGCCGGGAATTCTGGCATGGAGATCGCTTATGACCTTGCCACGCATGGAGCCCACACCTCCATAGTTGTTCGTAGCCCGGTATGTACAACATATTTGTTTATCTTGCATTACACTCCATTATGTGTTCAAACCTATATATGTTTCTTGTTTATTGTTCAAGCAATGATGGAATACATTAATTCCATTATTGATTCGTAATTAGAATTTATTCATGTAGTATTTTATCTTTGGTTCTACATTTGCATGTAGATACTATAAATGAGGAATGTGATTATATCTAAATGTTTATCCGAAATTGTCATGTTGTATCTTTCTATAGATAAAAACTTTTTCCTAATATAATGGTCATCTAATGGTTTTGTGGCACCTAAATACAGGTACACATAATGACCAAAGAACTAATATGGTATGGGATGACAATGGTGCAAAATTTAGGGCTAAATGTGACAGCAGTGGACTCTCTTCTTGTAATGGCGGCAAATTTCTATTTCGGAGACTTGTCAAAACATGGTATTATGAGGCCTAAAATGGGTCCTCTCTTACTCAAGTCACAAACAGGCCGGTCTGCCGTTATTGATGTTGGCACTGCAAGATTAATCAAAGGAGGAGTTATCAAAGTAATCATGCATCTACACTCTTTAGATACAAAATTAAGTTGGTAGTGCTTGTGAAGTTTCTAGCCTCAATTGATGTTCAGACTTTACACCATTTCTTTTCATATCTCTATTAGGTGTTCCAAGGAATATCAAAGATAAATACAAACAGTGTTGAATTTCATGGTGGGAGGCAAAATTCATTTGACGCCATTGTATTTGCGACAGGTTACAAAAGCACAGTTAATGCATGGCTAAAGGTACAAAGAATATGGATATTGCTTTAAACTCTTCTCTCTTCTTTTTTAATTCTATTTGTTTACACAATAATATATTTTGTTGCATTATGCATGATTTTGTTTCATTATTACAAAAGGATAATCCTTTTTTATCGGTTGCAGAATGGTGAAAGCATGTTTAAAGACGATGGTTTCCCTAAAAATTATTTTCCAAATCATTGGAGAGGTGAAAATGGGTTGTATTGTGCTGGGTTTGCTAGGAGAGGATTGGCCGGTATTGCCATGGATGCGAAAAATATTGCAAATGACATCGTGGCCGCCATGGATAAAATGTCATGTTAA
本发明还公开了一种LOC_Os11g10170基因编码的LOC_Os11g10170蛋白在降低水稻籽粒垩白、改良稻米品质及其培育垩白低的水稻品种中的应用，将LOC_Os11g10170蛋白在水稻中过表达，能够降低水稻籽粒垩白、改良稻米品质及其培育垩白低的水稻品种；所述LOC_Os11g10170蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或者所述LOC_Os11g10170蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO.2所述序列至少90％同源。
SEQ ID NO.2
MNAMEDVVVLIVGAGPAGLATAACLAQRHVPYIIVERESSTASLWRHRAYDRLKLHLAKEFCELPHMAYPAGTPTYVPRDMFVEYLDSYANQFGIRPRYHTAVESAIHDKGKNQWVVLVRDMDTSVVARLATQFLVVAAGENSAANIPPIPGLSRFEGEAIHSSAYKSGRAYTGKSVLVVGAGNSGMEIAYDLATHGAHTSIVVRSPVHIMTKELIWYGMTMVQNLGLNVTAVDSLLVMAANFYFGDLSKHGIMRPKMGPLLLKSQTGRSAVIDVGTARLIKGGVIKVFQGISKINTNSVEFHGGRQNSFDAIVFATGYKSTVNAWLKNGESMFKDDGFPKNYFPNHWRGENGLYCAGFARRGLAGIAMDAKNIANDIVAAMDKMSC
优选地，所述将LOC_Os11g10170基因在水稻中过表达的方法包括以下步骤：将LOC_Os11g10170基因与过表达载体进行同源重组连接成pBWA(V)HS-D170，再将所述pBWA(V)HS-D170转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，最后将所述大肠杆菌DH5α感受态细胞利用农杆菌介导法，转化水稻。
优选地，所述过表达载体为携带有Actin启动子的pBWA(V)HS载体。
优选地，将LOC_Os11g10170蛋白在水稻中过表达的方法包括以下步骤：将将编码LOC_Os11g10170蛋白的LOC_Os11g10170基因与过表达载体进行同源重组连接成pBWA(V)HS-D170，再将所述pBWA(V)HS-D170转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，最后将所述大肠杆菌DH5α感受态细胞利用农杆菌介导法，转化水稻。
优选地，所述过表达载体为携带有Actin启动子的pBWA(V)HS载体。
本发明具有以下有益效果：
本发明发现破坏LOC_Os11g10170基因编码蛋白的生物学功能能够显著影响稻米的外观品质，表现为籽粒垩白增加，说明该基因对改良稻米品质具有重要的作用。本发明为水稻外观品质的遗传改良提供了有用的基因资源和技术路线。
附图说明
图1为本发明实施例一中水稻中LOC_Os11g10170基因的表达模式分析；
图2为本发明实施例二中LOC_Os11g10170基因编辑靶位点和突变类型示意图；
图3为本发明实施例三中LOC_Os11g10170基因敲除株系稻米垩白分析；“**”表示极显著差异；
图4为本发明实施例四中LOC_Os11g10170基因过量表达株系目标基因表达量分析；“**”表示极显著差异；
图5为本发明实施例四中LOC_Os11g10170基因过量表达株系稻米垩白分析；“**”表示极显著差异。
具体实施方式
以下是对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明。应理解本发明不限于具体实施方式的范围，在不背离本发明的精神和范围的情况下，任何基于本发明技术方案的等效变换、简单替换等显而易见的改变，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。
下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。
实施例一：水稻中LOC_Os11g10170基因的表达模式分析
1.LOC_Os11g10170基因序列获得
本发明专注胚乳优势表达基因对稻米品质的影响，鉴定了一个胚乳优势表达LOC_Os11g10170基因，其编码蛋白由387个氨基酸组成(SEQ ID NO.2)，对应基因包含了1717个核苷酸(SEQ ID NO.1)。上述基因和氨基酸序列均来源于水稻品种Sihao 4031基因组(http://rice.plantbiology.msu.edu)。
2.LOC_Os11g10170基因表达模式验证
为了验证LOC_Os11g10170基因的胚乳优势表达特性，在LOC_Os11g10170基因外显子区，利用在线软件QuantPrime(https://quantprime.mpimp-golm.mpg.de/)设计了一对跨外显子的定量分析引物，引物序列如下：
| 序列名称 | 序列 | 序列编号 |
| Primer l | 5'AGGGCTAAATGTGACAGCAG3' | SEQ ID NO.3 |
| Primer 2 | 5'GTGCCAACATCAATAACGGC3' | SEQ ID NO.4 |
以粳稻Sihao 4031为材料，取水稻不同组织(根、茎、叶、叶鞘和幼穗)和开花后不同天数(7、14、21、28、35和42天)的籽粒，利用植物快速RNA提取试剂盒(诺唯赞，FastPureUniversal Plant Total RNA Isolation Kit)提取植物总RNA，并利用反转录试剂盒(诺唯赞，HiScript III RTSuperMix for qPCR)进行第一链cDNA的合成。利用定量PCR试剂盒(诺唯赞，ChamQ Universal SYBR qPCR Mas ter Mix)和上述定量PCR引物(SEQ ID NO.3和SEQID NO.4)检测LOC_Os11g10170基因在不同组织中的表达水平。检测结果如图1所示，该基因只在水稻灌浆期间有表达，尤其在花后28天时籽粒中表达量最高，是胚乳特异性基因，说明该基因在胚乳发育中可能具有十分重要的生物学意义。
实施例二:水稻中LOC_Os11g10170基因敲除载体的构建和转基因检测
1.基因编辑位点设计
本发明根据现有CRISPR/Cas9相关实验方法，
在LOC_Os11g10170基因第1外显子上选择AGTCCAGCACCGCATCGTTG序列作为敲除靶位点(如图2所示)，利用在线工具targetDesign软件(http://skl.scau.edu.cn/targetdesign/)设计了引物Primer 3和引物Primer 4(SEQ ID No 5和SEQ ID No.6)，用于基因编辑载体构建。
CRISPR引物序列如下：
| 序列名 | 序列 | 序列编号 |
| 称Primer 3 | 5'ggcaAGTCCAGCACCGCATCGTTG 3' | SEQ ID NO.5 |
| Primer 4 | 5'aaacCAACGATGCGGTGCTGGAC 3' | SEQ ID NO.6 |
2.CRISPR/Cas9载体构建与遗传转化方法
本发明所使用的CRISPR/Csa9载体系统中包含中间载体SK-gRNA和最终载体pC1300-Cas9，其DNA骨架分别来源于pBlueScript(SK+)载体和pCAMBLA1300载体。
具体步骤：取引物primer 3和primer 4分别稀释到100μM浓度，各取10μL上述引物混合后100℃变性5分钟，随后自然冷却获得含敲除靶位点的双链序列；取7μL退火后的引物与用Aar I限制性内切酶切割后的线性中间载体SK-gRNA(100ng)混合，并用T4 DNA连接酶连接；将大肠杆菌DH5α感受态细胞(南京诺唯赞公司)从-80℃取出后置于冰上解冻，待细胞溶解后迅速加入上一步连接产物，用移液器轻轻混匀后冰上静置30min，随后42℃热激30s，再次冰上静置2min，接着向转化产物中加入10倍体积LB无抗培养液，37℃200rpm培养50min；取出活化好的菌液，4000rpm离心后去掉大部分上清，将悬浮后剩余液体(约100μL)涂板(LB+氨苄青霉素抗性)，37℃过夜静置培养；次日，挑取单克隆菌落扩大培养3mL(LB+氨苄青霉素抗性)，利用载体构建专用测序引物测序验证靶位点序列，选取阳性克隆并提取SK-gRNA-D170质粒待用。
利用限制性内切酶Kpn I和Bgl II切割SK-gRNA-D170质粒，回收300bp片段并与经过Kpn I和BamH I双酶切过的pC1300-Cas9载体混合，利用并用T4 DNA连接酶连接。与上一步方法一致转化至大肠杆菌，并挑选克隆进行测序，将测序正确的质粒命名为pC1300-Cas9-D170。将农杆菌EHA105细胞感受态(擎科生物公司)从-80C取出后置于冰上解冻，加入备好的阳性克隆质粒1μL，轻轻混匀后置于冰上30min，随后液氮中冻2min，迅速取出置于37℃水浴中将细胞溶解2min，接着向转化产物中加入10倍体积LB无抗培养液，28℃250rpm培养2-3h；取出活化好的菌液，5000rp m离心后去掉大部分上清，用剩余液体(约100μL)将菌体重悬后涂板(LB+卡那霉素)，28℃过夜静置培养36-48h；挑取单克隆菌落进行测序，得到阳性菌株命名为Cas9-D170。
将上述阳性Cas9-D170农杆菌菌株，利用农杆菌介导的水稻成熟胚转化方法(刘巧泉等，植物生理学报，1998)转化水稻Sihao 4031愈伤组织，通过潮霉素抗性筛选得到成功转入的愈伤组织细胞，经再分化后形成阳性的转基因水稻幼苗。待苗高约10cm时，检测鉴定后移栽，获得T0代水稻植株。
实施例三：LOC_Os11g10170基因敲除株系表型分析
1.转基因苗检测
农杆菌侵染转化共获得38株苗，首先用潮霉素检测引物筛选获得阳性苗，接着，在靶位点基因组序列上下游设计测序引物primer 5和primer 6(SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8)，用于检测靶点附近突变情况。基于靶位点的序列扩增并测序分析后，共获得2种基因突变类型CR-1和CR-2(如图2所示)。
测序引物序列如下：
LOC_Os11g10170基因敲除株系表型分析
在T0和T1代种植中，对不同株系农艺性状进行了调查发现，发现与野生型Sihao4031相比，敲除突变系除稻米垩白外，其它农艺性状无显著差异。随后，在T2代获得了稳定遗传的突变系，田间种植三次重复，每个重复种植2行，进一步考察了稻米的垩白性状。结果显示，与野生型Sihao 4031相比，敲除突变体CR-1和CR-2籽粒垩白粒率和垩白度均极显著增加。由此说明，LOC_Os11g10170是一个稻米垩白调控基因(如图3所示)。
实施例四：LOC_Os11g10170基因的过量表达株系构建与表型分析
1.LOC_Os11g10170过量表达载体构建与转基因植株的获得
本研究所使用的植物表达载体为pBWA(V)HS(购自上海联迈公司)，其中包括水稻自身组成性高表达基因Actin的启动子。
LOC_Os11g10170编码序列扩增引物序列如下：
| 序列名称 | 序列 | 序列编号 |
| Primer 7 | 5'ATGAATGCTATGGAGGACGTGG 3' | SEQ ID NO.9 |
| Primer 8 | 5'ACATGACATTTTATCCATGGCG 3' | SEQ ID NO.10 |
具体步骤：包括以Sihao 4031cDNA为模板，以引物primer 7和primer 8扩增LOC_Os11g10170的编码区序列(不带终止密码子)，利用高保真DNA聚合酶Phanta Master(诺唯赞公司)在PCR仪上进行基因扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，并切下含有目标基因片段的凝胶，用胶回收试剂盒(DP209天根)回收目的片段。随后将回收产物与经限制性内切酶Bsa I和Eco31 I切割线性化的携带有Actin启动子的pBWA(V)HS载体与包含LOC_Os11g10170的PCR扩增产物进行混合，用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit进行同源重组连接。利用热激法将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞(南京诺唯赞公司)。将转化细胞涂布在含有100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基上进行培养，并挑选克隆进行测序，将测序正确的质粒命名为pBWA(V)HS-D170。利用农杆菌介导法，将所述载体pBWA(V)HS-D170转化粳稻Sihao4031，并获得转基因苗。其中农杆菌的转化和水稻遗传转化方法均如实施例二和三所述。
2.LOC_Os11g10170过量表达转基因植株的表型分析
对于所述携带pBWA(V)HS-D170构建的转基因水稻，在T2代转基因株系中，利用潮霉素抗性筛选获得纯合株系。随后，采集纯合株系花后15天的种子，提取种子总RNA并反转录成cDNA，用上述引物primer 1(SEQ ID NO.3)和primer 2(SEQ ID NO.4)对纯合株系中LOC_Os11g10170基因的表达水平进行分析，获得2个表达量显著上调的株系，用于后续植株表型分析(如图4所示)。基本农艺性状分析表明，LOC_Os11g10170过量表达转基因水稻在生长发育过程中，其株高、分蘖数、生育期、穗长和粒型等性状与亲本对照无明显差异，说明LOC_Os11g10170过量表达未对水稻的生长发育产生明显影响。重点分析了LOC_Os11g10170过量表达株系稻米的外观品质，与野生型相比，LOC_Os11g10170过量表达株系稻米的垩白度和垩白粒率均显著降低(如图5所示)。这表明利用过量表达LOC_Os11g10170的方式能够改良稻米的外观品质，其对于稻米品质性状的遗传改良具有重要的育种价值。
Claims (6)
1.调控水稻垩白的LOC_Os11g10170基因在降低水稻籽粒垩白、改良稻米品质及其培育垩白低的水稻品种中的应用，其特征在于，将LOC_Os11g10170基因在水稻中过表达，能够降低水稻籽粒垩白、改良稻米品质及其培育垩白低的水稻品种；所述LOC_Os11g10170基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者所述LOC_Os11g10170基因的核苷酸序列与SEQ IDNO.1所示序列至少90％同源。
2.由权利要求1所述的LOC_Os11g10170基因编码的LOC_Os11g10170蛋白在降低水稻籽粒垩白、改良稻米品质及其培育垩白低的水稻品种中的应用，其特征在于，将LOC_Os11g10170蛋白在水稻中过表达，能够降低水稻籽粒垩白、改良稻米品质及其培育垩白低的水稻品种；所述LOC_Os11g10170蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或者所述LOC_Os11g10170蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO.2所述序列至少90％同源。
3.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述将LOC_Os11g10170基因在水稻中过表达的方法包括以下步骤：将LOC_Os11g10170基因与过表达载体进行同源重组连接成pBWA(V)HS-D170，再将所述pBWA(V)HS-D170转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，最后将所述大肠杆菌DH5α感受态细胞利用农杆菌介导法，转化水稻中实现LOC_Os11g10170基因的过表达。
4.根据权利要求3的应用，其特征在于，所述过表达载体为携带有Actin启动子的pBWA(V)HS载体。
5.根据权利要求2的应用，其特征在于，将LOC_Os11g10170蛋白在水稻中过表达的方法包括以下步骤：将将编码LOC_Os11g10170蛋白的LOC_Os11g10170基因与过表达载体进行同源重组连接成pBWA(V)HS-D170，再将所述pBWA(V)HS-D170转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，最后将所述大肠杆菌DH5α感受态细胞利用农杆菌介导法，转化水稻中实现LOC_Os11g10170蛋白过表达。
6.根据权利要求5的应用，其特征在于，所述过表达载体为携带有Actin启动子的pBWA(V)HS载体。
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|---|---|---|---|---|
| CN119391749A (zh) * | 2024-09-19 | 2025-02-07 | 湖北省农业科学院粮食作物研究所 | 一种水稻垩白负调控基因cgr3的应用 |
| CN119432870A (zh) * | 2024-10-21 | 2025-02-14 | 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 | 一个调控水稻种子垩白的基因LOC_Os12g36880及其应用 |
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2024
- 2024-06-21 CN CN202410807675.0A patent/CN118599895A/zh active Pending
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