CN119654406A

CN119654406A - 具有降低的基因表达以减轻免疫细胞识别的经工程化的细胞

Info

Publication number: CN119654406A
Application number: CN202380057346.2A
Authority: CN
Inventors: C·A·索默; 郑心远; B·J·萨苏
Original assignee: Allogene Therapeutics Inc
Current assignee: Allogene Therapeutics Inc
Priority date: 2022-07-29
Filing date: 2023-07-28
Publication date: 2025-03-18
Also published as: AU2023312973A1; CA3261440A1; JP2025525779A; MX2025001237A; EP4562134A1; US20240042030A1; WO2024026445A1

Abstract

本文提供了用于施用给受试者以治疗癌症(例如，实体瘤或液体瘤)和其他病状的经工程化的免疫细胞及其群体。所述细胞经工程化以功能性地表达降低水平的CD48、CD58、ICAM‑1、RFX5、NLRC5、TAP2、β2m、TRAC、RFXAP、CIITA和RFXANK中的一者或多者。所述细胞任选地经进一步工程化以表达一种或多于一种另外的蛋白质，诸如抗原结合蛋白(例如，嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体)和/或CD70结合蛋白，以靶向所述受试者中的肿瘤细胞或其他受损细胞，和/或以降低的水平表达其他基因。还提供了制备和使用所述经工程化的细胞的方法、包含所述经工程化的细胞的组合物和试剂盒，以及通过施用所述细胞和所述组合物进行治疗的方法。

Description

具有降低的基因表达以减轻免疫细胞识别的经工程化的细胞

相关申请的交叉引用

本申请要求于2022年7月29日提交的美国临时申请第63/393,350号和于2023年6月20日提交的美国临时申请第63/509,136号的优先权权益，这两件申请的内容据此以引用的方式整体并入。

对序列表的引用

本申请含有序列表，该序列表以XML文件格式通过电子方式提交并且据此以引用的方式整体并入。所述XML副本创建于2023年7月13日，命名为AT-053_03WO_SL.xml，大小为98,186字节。

技术领域

本公开总体上涉及用于治疗应用的经工程化的免疫细胞(例如，T细胞)的用途。

背景技术

经基因修饰以识别恶性肿瘤相关抗原的免疫细胞的过继转移显示出有望作为治疗癌症的新方法(参见例如，Brenner等人,《免疫学新见(Current Opinion inImmunology)》,22(2):251-257(2010)；Rosenberg等人,《自然综述：癌症(Nature ReviewsCancer)》,8(4):299-308(2008))。免疫细胞可以被基因修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，即包含抗原识别部分和T细胞活化结构域的融合蛋白(参见例如，Eshhar等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,90(2):720-724(1993))。含有CAR的免疫细胞，例如CAR-T细胞(CAR-T)被工程化以赋予其抗原特异性，同时保持或增强其识别和杀伤靶细胞的能力。

然而，经CAR修饰的自体细胞疗法的产生是昂贵的，需要数周的过程和质量测试，并且根据所采用的患者特异性T细胞的初始质量和数量产生不同效力的产物。同种异体CAR修饰的细胞疗法—其中将来自健康供体的细胞修饰以表达CAR，然后施用给多个患者—有望成为比自体疗法更便宜和更稳健的产品，可在需要时立即递送(参见，例如，Graham等人,《细胞(Cells)》2018,7,155；doi:10.3390/cells7100155)。此外，同种异体疗法能够基于期望的产品特征(例如，基因编辑效率、整合位点、没有有害的脱靶基因编辑、单体型等)进行选择，并且促进更复杂的细胞工程化(例如，多基因编辑提高效力、持久性、归巢等)。实现同种异体CAR修饰的细胞疗法的主要障碍是患者(宿主)的免疫系统对该产品(基于供体细胞)的潜在排斥。

杀伤淋巴细胞如CD8+T细胞和自然杀伤(NK)细胞鉴定并杀死癌细胞、病毒感染细胞和与自身不同的外来细胞(包含同种异体细胞)。自我辨别和非自我辨别的主要决定因素是所有有核细胞的表面上表达的主要组织相容性复合体(MHC)分子。每个MHC I类分子是高度多等位基因MHC I类重链(其中最常见的是HLA-A2)、不变β2微球蛋白(β2m)和呈递肽的非共价三聚体复合物，所述呈递肽通过蛋白水解从内部表达的蛋白质衍生而来。总的来说，MHC I分子装载有表示细胞内表达的整个蛋白质多样性的肽，使癌细胞和受感染细胞能够向免疫系统‘宣布’其困境。CD8+T细胞通过每个新生T细胞特有的T细胞受体(TCR)识别这些非自身肽，并且根据非自身肽-MHC的识别启动杀伤(参见例如，Z.等人《自然(Nature)》320,232–238(1986))。T细胞对非自身的识别通过NK细胞对“失去自我”的识别来补充：NK细胞表面上的抑制性受体能够在没有MHC的情况下实现NK细胞介导的杀伤(参见，例如，K.等人,《自然(Nature)》319,675–678(1986)；参见PCT/US2022/14393的图1和图3，其以引用的方式整体并入本文)。MHC I类呈递的实验性消除-通过CRISPR/Cas9介导的编码MHC I类通用β2m组分的β2m基因的基因组敲除(KO)实现-导致在自体和同种异体反应背景下缺乏MHC的T细胞的有效NK活化和选择性杀伤(参见PCT/US2022/14393的图2，其以引用的方式整体并入本文)。

虽然同种异体细胞疗法比自体细胞疗法有优势，但是同种异体细胞面临宿主或接受者免疫系统细胞的潜在排斥，这些宿主或接受者免疫系统细胞与不同于宿主的同种异体细胞产物表面上的T和NK表位决定簇具有反应性。已经描述了通过下调或消除同种异体细胞表面HLA分子的表达来避免同种异体治疗性细胞排斥的方法(参见，例如,Lanza,R.等人，工程改造逃避免疫检测的通用细胞(Engineering universal cells that evade immunedetection).《自然综述-免疫学(Nat.Rev.Immunol.)》2019年12月；19(12):723-733，2019年8月15日电子出版)。

MHC I类分子的废除，例如通过使β-2微球蛋白基因(β2m)缺失废除，可以防止CD8T细胞的识别和排斥，但是MHC I的缺乏是NK细胞反应性的强信号，这可能导致这些细胞的急性排斥。通过敲低β2m表达或灭活参与抗原加工和呈递的基因来下调MHC分子可以潜在地避免NK细胞反应性，并减少但不完全消除细胞毒性CD8 T细胞的排斥。通常通过使用基因编辑工具或shRNA技术实现的这些修饰，可以与NK细胞和/或T细胞抑制蛋白(例如，CD47或PDL1)的外源性过表达结合，所述外源性过表达可以进一步降低排斥程度，但并不完全有效(Deuse等人，NK细胞中的SIRPα–CD47免疫检查点(The SIRPα–CD47 immune checkpoint inNK cells).《实验医学杂志(J Exp Med)》(2021)218(3):e20200839；Han等人，低免疫原性人多能干细胞的产生(Generation of hypoimmunogenic human pluripotent stemcells).《美国国家科学院院刊(PNAS)》，2019年4月30日，116(21)10441-10446)。

本公开提供了改进的同种异体疗法的优点，其提供了所施用细胞的增加的持久性，而不管接受者的天然防御。

发明内容

本文提供了已经工程化，例如基因工程化的免疫细胞，这些免疫细胞已经工程化以减轻已经将这些细胞引入其中的宿主或接受者的排斥，本文提供了减轻宿主或接受者的免疫系统例如T细胞和/或NK细胞的排斥和/或识别的方法，包含这些经工程化的细胞的组合物和群体，以及使用这些经工程化的细胞治疗患者癌症的方法。

在一个方面，本公开提供了一种经工程化的免疫细胞，例如CAR T细胞，或包含经工程化的免疫细胞的经工程化的免疫细胞群体，这些经工程化的免疫细胞包含一个或多个功能性地削弱或降低本文所述的一种或多种靶标的表达的基因组修饰。在一个实施方案中，该经工程化的免疫细胞包含基因组修饰，该基因组修饰相对于没有该基因组修饰的细胞，功能性地削弱或降低(i)RFX5和/或NLRC5和(ii)CD58的表达。在另一个实施方案中，该基因组修饰包含(i)RFX5和/或NLRC5和/或(ii)CD58的敲低和/或敲除。在一个其他实施方案中，该基因组修饰包含在(i)RFX5和/或NLRC5和(ii)CD58的基因座处的一个或多个修饰。在一个实施方案中，该基因组修饰包含在(i)RFX5和/或NLRC5和(ii)CD58的基因座处的缺失或插入。在其他实施方案中，该基因组修饰选自由以下项组成的组：(i)一个或多个核苷酸的插入，(ii)编码蛋白质的多核苷酸序列的插入，(iii)一个或多个核苷酸的缺失，和(iv)一个或多个核苷酸的取代。在另外的实施方案中，该基因组修饰通过选自TALEN、锌指、Cas-CLOVER和CRISPR/Cas系统的基因编辑技术引入。

在一个实施方案中，该一个或多个基因组修饰处于一个或多个基因(对应于如本文所述的一个或多个靶标)的基因组位置，或者处于基因组内的其他位置，而不在该一个或多个基因(对应于如本文所述的一个或多个靶标)的位置，使得这些修饰功能性地削弱或降低该一个或多个基因(对应于如本文所述的一个或多个靶标)的表达。

在一个实施方案中，该基因组修饰包含RNA干扰序列的插入。在另一个实施方案中，RNA干扰序列是shRNA序列、siRNA序列或miRNA序列。在其他实施方案中，RNA干扰序列包含与(i)RFX5和/或NLRC5和/或(ii)CD58基因序列互补的序列。

在另一个实施方案中，该经工程化的免疫细胞还包含编码抗原结合蛋白和/或CD70结合蛋白的多核苷酸序列。在一个实施方案中，抗原结合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。在另一个实施方案中，该细胞被进一步经工程化以包含一个或多个基因组修饰，这些基因组修饰相对于未经工程化的细胞功能性地削弱或降低TAP2、β2m、TRAC、CIITA、RFXAP、RFXANK、ICAM-1和CD48中的一者或多者的表达。

在另外的实施方案中，与不包含该基因组修饰的免疫细胞相比，该经工程化的免疫细胞或包含该经工程化的免疫细胞的经工程化的免疫细胞群体具有改善的持久性和/或改善的针对同种异体反应性免疫细胞排斥的抗性。在一个实施方案中，同种异体反应性免疫细胞排斥包括同种异体反应性T细胞介导的排斥和/或同种异体反应性自然杀伤(NK)细胞介导的排斥。在其他实施方案中，增加的持久性是通过混合淋巴细胞反应(MLR)测定能够确定的和/或确定的。在一个实施方案中，改善的针对同种异体反应性免疫细胞排斥的抗性是通过MLR测定能够确定的和/或确定的。

在其他实施方案中，该经工程化的免疫细胞包含一个或多个功能性地削弱或降低RFX5和CD58表达的基因组修饰。在一个实施方案中，该经工程化的免疫细胞包含一个或多个功能性地削弱或降低NLRC5和CD58表达的基因组修饰。在另一个实施方案中，该经工程化的免疫细胞包含一个或多个功能性地削弱或降低RFX5、NLRC5和CD58表达的基因组修饰。在其他实施方案中，β2m在该经工程化的免疫细胞中以降低的水平功能性地表达。在另外的实施方案中，该经工程化的免疫细胞包含未修饰的β2m基因，和/或其中β2m在该经工程化的免疫细胞中不以降低的水平功能性地表达。

在另一个实施方案中，该经工程化的免疫细胞表现出：(i)在细胞表面处降低水平的MHC I类蛋白或复合物表达，和/或(ii)在细胞表面处降低水平的MHC II类蛋白或复合物表达。

在一个实施方案中，抗原结合蛋白是CAR。在其他实施方案中，该经工程化的免疫细胞表达抗原结合蛋白和/或CD70结合蛋白。在另一个实施方案中，编码抗原结合蛋白和/或CD70结合蛋白的多核苷酸序列位于被破坏的CD58、RFX5、NLRC5、ICAM-1、CD48、TAP2、β2m、TRAC、CIITA、RFXAP或RFXANK基因座内。

在其他实施方案中，该经工程化的免疫细胞还包含内源TCRa基因的一个或多个基因组修饰。在一个实施方案中，该经工程化的免疫细胞还包含内源CD52基因的一个或多个基因组修饰。

在一个其他实施方案中，该经工程化的免疫细胞是或获自健康志愿者的免疫细胞，获自患者，或获自诱导多能干细胞(iPSC)。在其他实施方案中，该经工程化的免疫细胞不是自然杀伤(NK)细胞，或者不是获自健康志愿者或患者的NK细胞。在另一个实施方案中，该经工程化的免疫细胞不是获自iPSC。

在一个实施方案中，该经工程化的免疫细胞或经工程化的免疫细胞群体中的一个或多个经工程化的免疫细胞表达或功能性地表达CD70结合蛋白。在其他实施方案中，该经工程化的免疫细胞包含编码CD70结合蛋白的多核苷酸序列。在另一个实施方案中，CD70结合蛋白包含CD70结合结构域和跨膜结构域。在一个实施方案中，CD70结合结构域构成CD70抗体、或CD70受体或其CD70结合片段。在其他实施方案中，CD70结合结构域构成抗CD70抗体，任选地抗CD70抗体是scFv。在另一个实施方案中，CD70结合蛋白还包含铰链结构域，任选地该铰链结构域包含CD8铰链。在一个实施方案中，该CD70结合蛋白还包含一个或多个选自由以下项组成的组的细胞内信号传导结构域：CD3z信号传导结构域、CD3d信号传导结构域、CD3g信号传导结构域、CD3e信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD2信号传导结构域、OX40信号传导结构域和4-1BB信号传导结构域或它们的变体。在另一个实施方案中，该CD70结合蛋白包含CD3z或CD3g信号传导结构域，并且不包含共刺激结构域。在其他实施方案中，该CD70结合蛋白包含4-1BB信号传导结构域，并且不包含CD3z信号传导结构域。在另一个实施方案中，该CD70结合蛋白包4-1BB信号传导结构域和CD3z信号传导结构域。在其他实施方案中，该一个或多个细胞内结构域包含SEQ ID NO:1、7-14、17-31、32-58、59-70或89-90中的一者或多者的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述CD70结合蛋白不包括胞内信号传导结构域。

在一个其他实施方案中，该经工程化的免疫细胞或经工程化的免疫细胞群体中的一个或多个经工程化的免疫细胞包含未修饰的β2m、RFX5、NLRC5、CIITA和TAP2基因。在另一个实施方案中，β2m、RFX5、NLRC5、CIITA和TAP2中的一者或多者的表达在该经工程化的免疫细胞或经工程化的免疫细胞群体中的一个或多个经工程化的免疫细胞中没有功能性受损或降低。在一个实施方案中，该一个或多个基因组修饰不包含β2m、RFX5、NLRC5、CIITA和TAP2中的一者或多者的基因组修饰。

在一个方面，本公开提供了一种包含一个或多个本文所述的经工程化的免疫细胞的经工程化的免疫细胞群体。在一个实施方案中，该群体被表征为具有不超过50％的功能性地表达(i)RFX5和/或NLRC5和(ii)CD58的经工程化的免疫细胞。在其他实施方案中，不超过50％的经工程化的免疫细胞功能性地表达RFX5和CD58；或不超过50％的经工程化的免疫细胞功能性地表达NLRC5和CD58；或不超过50％的经工程化的免疫细胞功能性地表达RFX5、NLRC5和CD58。在其他实施方案中，不超过50％的经工程化的免疫细胞也功能性地表达a)CD48、ICAM-1、TAP2、β2m、TRAC、CIITA、RFXAP和RFXANK中的任何一者或多者；或b)CD48和ICAM-1中的仅一者；或c)CD48和ICAM-1两者。

在一个实施方案中，该经工程化的免疫细胞群体包含经工程化的免疫细胞，其中至少1％的经工程化的免疫细胞以不大于未经工程化的免疫细胞中的表达水平的50％的水平功能性地表达(i)RFX5和/或NLRC5和(ii)CD58。在另一个实施方案中，至少1％的经工程化的免疫细胞以不大于未经工程化的免疫细胞中的表达水平的50％的水平功能性地表达RFX5和CD58。在一个实施方案中，至少1％的经工程化的免疫细胞以不大于未经工程化的免疫细胞中的表达水平的50％的水平功能性地表达NLRC5和CD58。在另一个实施方案中，至少1％的经工程化的免疫细胞以不大于未经工程化的免疫细胞中的表达水平的50％的水平功能性地表达RFX5、NLRC5和CD58。在另外的实施方案中，至少1％的经工程化的免疫细胞功能性地表达a)CD48、ICAM-1、TAP2、β2m、TRAC、CIITA、RFXAP和RFXANK中的任何一者或多者；或b)CD48和ICAM-1中的仅一者；或c)CD48和ICAM-1两者，表达水平不大于未经工程化的免疫细胞中的表达水平的50％。

在另一个实施方案中，该群体包含与未经工程化的免疫细胞相比具有改善的持久性和/或改善的针对同种异体反应性免疫细胞排斥的抗性的细胞。在另一个实施方案中，改善的抗性是针对同种异体反应性T细胞介导的排斥和/或同种异体反应性自然杀伤细胞(NK)介导的排斥。在一个实施方案中，增加的持久性是通过混合淋巴细胞反应(MLR)测定能够确定的和/或确定的，和/或其中改善的针对同种异体反应性免疫细胞排斥的抗性是通过MLR测定能够确定的和/或确定的。

在另一个实施方案中，该经工程化的免疫细胞群体包含经工程化的免疫细胞，其中至少50％的经工程化的免疫细胞表现出在细胞表面处降低水平的MHC I类蛋白或复合物表达。在另一个实施方案中，该经工程化的免疫细胞群体包含至少10％经工程化的T细胞、至少20％经工程化的T细胞、至少30％经工程化的T细胞、至少40％经工程化的T细胞、至少50％经工程化的T细胞、至少75％经工程化的T细胞或至少90％经工程化的T细胞。在另一个实施方案中，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％或至少90％的经工程化的免疫细胞进一步表达抗原结合蛋白或CD70结合蛋白。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白是CAR或TCR。

在其他实施方案中，将编码抗原结合蛋白(例如，CAR或TCR)和/或CD70结合蛋白的核酸插入被破坏的CD58、RFX5、NLRC5、CD48、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、RFX5、RFXAP、CIITA和RFXANK基因座中。在另一个实施方案中，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％或至少90％的经工程化的细胞还包括内源性TCRa基因和内源性CD52基因中的一个或多个的一种或多种基因组修饰。在一个其他实施方案中，至少10％、20％、30％、40％、50％、75％或90％的经工程化的免疫细胞进一步表达一种或多种选自由以下项组成的组的蛋白质：HLA-E、HLA-E单链三聚体、HLA-G或HLA-G单链三聚体、UL18或UL18单链三聚体、HLA-A2和HLA-A2单链三聚体。

在其他实施方案中，TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、RFX5、RFXAP、CIITA和RFXANK中的一者或多者的功能性表达水平通过确定经工程化的免疫细胞的表面上HLA、β2微球蛋白(B2M)或HLA和B2M两者的表面表达水平来测量，或通过流式细胞术来测量。在一个实施方案中，CD48、CD58和ICAM-1中的一者或多者的功能性表达水平通过确定经工程化的免疫细胞的表面上CD48、CD58和ICAM-1中的一者或多者的表面表达水平来测量，或通过流式细胞术来测量。

在一个其他方面，本公开提供了制备本文所述的经工程化的免疫细胞或经工程化的免疫细胞群体的方法。在一个实施方案中，该方法包括修饰经工程化的免疫细胞的基因组的步骤。在另一个实施方案中，该方法还包括产生包含基因组修饰的经工程化的免疫细胞。在另一个实施方案中，使用TALEN、锌指、Cas-CLOVER或CRISPR/Cas系统来修饰经工程化的免疫细胞的基因组。

在另一个方面，本公开提供了包含经工程化的免疫细胞或包含经工程化的免疫细胞的细胞群体的药物组合物。在一个实施方案中，该药物组合物还包含至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。在另一个实施方案中，该经工程化的免疫细胞或该细胞群体的一个或多个经工程化的免疫细胞(i)进一步表达一种或多种选自由以下项组成的组的蛋白质：HLA-E、HLA-E单链三聚体、HLA-G、HLA-G单链三聚体、UL18、UL18单链三聚体、HLA-A2、HLA-A2单链三聚体和人巨细胞病毒(HCMV)US11，和/或(ii)被进一步经工程化为不表达或以降低的水平表达TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFXANK、RFXAP和RFX5中的任何一者或多者。

在另一个方面，本公开提供了治疗患者病状或病症的方法。在一个实施方案中，该方法包括向受试者施用经工程化的免疫细胞、包含该经工程化的免疫细胞的细胞群体、或包含该经工程化的免疫细胞或包含该经工程化的免疫细胞的细胞群体的药物组合物。在另一个实施方案中，该病状是实体瘤或液体瘤。在其他实施方案中，该病症是癌症、自身免疫性病症或感染，如本文进一步描述的。

在另一个方面，本公开提供了改善本文所述的经工程化的免疫细胞的(i)持久性或(ii)针对同种异体反应性免疫细胞排斥的抗性的方法。在一个实施方案中，经工程化的免疫细胞是同种异体经工程化的免疫细胞。在其他实施方案中，该方法包括修饰同种异体免疫细胞以引入一个或多个基因组修饰以提供同种异体经工程化的免疫细胞的步骤，该基因组修饰功能性地削弱或降低(i)RFX5和/或NLRC5和(ii)CD58的表达。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用同种异体经工程化的免疫细胞的步骤。在一个实施方案中，基因组修饰包含(i)RFX5和/或NLRC5和(ii)CD58的敲低和/或敲除。在其他实施方案中，基因组修饰包含在(i)RFX5和/或NLRC5和(ii)CD58的基因座处的一个或多个修饰。在另一个实施方案中，基因组修饰包含在(i)RFX5和/或NLRC5和(ii)CD58的基因座处的缺失或插入。在其他实施方案中，基因组修饰选自由以下项组成的组：(i)一个或多个核苷酸的插入，(ii)编码蛋白质的序列的插入，(iii)一个或多个核苷酸的缺失，和(iv)一个或多个核苷酸的取代。在一个实施方案中，基因组修饰通过选自TALEN、锌指、Cas-CLOVER和CRISPR/Cas系统的基因编辑技术引入。

在另一个实施方案中，基因组修饰包含RNA干扰序列的插入。在另一个实施方案中，干扰序列是shRNA序列、siRNA序列或miRNA序列。在其他实施方案中，干扰序列包含与(i)RFX5和/或NLRC5和(ii)CD58基因序列互补的序列。在一些实施方案中，同种异体经工程化的免疫细胞还包含编码抗原结合蛋白(例如，CAR或TCR)和/或CD70结合蛋白的多核苷酸序列。在另一个实施方案中，同种异体经工程化的免疫细胞被进一步经工程化以包含一个或多个基因组修饰，这些基因组修饰相对于没有修饰的细胞功能性地削弱或降低TAP2、β2m、TRAC、CIITA、RFXAP、RFXANK、ICAM-1和CD48中的一者或多者的表达。在其他实施方案中，基因组修饰功能性地削弱或降低表达至没有基因组修饰的细胞中的相应水平的约50％或更少。在一个实施方案中，与同种异体未经工程化的免疫细胞相比，同种异体经工程化的免疫细胞具有改善的持久性和/或改善的针对同种异体反应性免疫细胞排斥的抗性。在其他实施方案中，改善的抗性是针对同种异体反应性T细胞介导的排斥和/或同种异体反应性自然杀伤细胞(NK)介导的排斥。在一个实施方案中，增加的持久性是通过混合淋巴细胞反应(MLR)测定能够确定的和/或确定的，和/或其中改善的针对同种异体反应性免疫细胞排斥的抗性是通过MLR测定能够确定的和/或确定的。

在另一个实施方案中，该方法包括功能性地削弱或降低RFX5和CD58、或NLRC5和CD58、或RFX5、NLRC5和CD58的表达。在另一个实施方案中，(i)RFX5和/或NLRC5和(ii)CD58的表达水平的降低程度是分别相对于尚未经修饰的相同类型的细胞中(i)RFX5和/或NLRC5和(ii)CD58的表达水平确定的。

在另一个实施方案中，CD48、CD58和ICAM-1中的一者或多者的功能性表达水平通过确定经工程化的免疫细胞的表面上CD48蛋白、CD58蛋白或ICAM-1蛋白的表面表达水平来测量。在另一个实施方案中，RFX5和/或NLRC5的功能性表达水平通过确定经工程化的免疫细胞的表面上HLA、β2微球蛋白(B2M)或HLA和B2M两者的表面表达水平来测量。在一个实施方案中，表面表达水平通过流式细胞术测量。在其他实施方案中，该方法还包括引入TCRa基因和CD52基因中的一者或多者的一个或多个基因组修饰。在一个实施方案中，同种异体经工程化的免疫细胞包含未修饰的β2m基因，或其中β2m在同种异体经工程化的免疫细胞中不以降低的水平功能性地表达。

在其他实施方案中，本公开的免疫细胞经工程化，以相对于尚未经如此工程化的相应细胞，功能性地表达降低水平的

·CD48、CD58、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK中的任何一者或多者；

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

·(i)NLRC5和RFX5中的一者或两者，和(ii)CD58、CD48和ICAM-1中的一者或多者；

·NLRC5和CD58两者，RFX5和CD58两者，RFX5和CD48两者，NLRC5和CD48两者，RFX5和ICAM-1两者，NLRC5和ICAM-1两者，CD58和ICAM-1两者，CD58和CD48两者，或CD48和ICAM-1两者；

·(i)CD58、NLRC5和RFX5；(ii)CD48、NLRC5和RFX5；(iii)ICAM-1、NLRC5和RFX5；(iv)CD58、ICAM-1和RFX5；(v)CD48、ICAM-1和RFX5；(vi)CD58、CD48和RFX5；(vii)CD58、ICAM-1和NLRC5；(viii)CD48、ICAM-1和NLRC5；或(ix)CD58、CD48和NLRC5；(x)CD48、CD58和ICAM-1；或

·(i)CD58、ICAM-1、RFX5和NLRC5；(ii)CD48、ICAM-1、RFX5、NLRC5；(iii)CD48、CD58、RFX5和NLRC5；(iv)CD48、CD58、ICAM-1和RFX5；(v)CD48、CD58、ICAM-1和NLRC5；(vi)β2m、CD58、CD48和ICAM-1；或(vii)CD48、CD58、ICAM-1、RFX5和NLRC5。

在另一个实施方案中，经工程化以相对于尚未如此工程化的相应细胞以降低的水平功能性地表达如本文所述的一种或多种靶标的免疫细胞包含一个或多个基因组修饰，该基因组修饰相对于没有该一个或多个基因组修饰的细胞功能性地削弱或降低该一种或多种靶标的表达。

在另一个实施方案中，经工程化的细胞(i)具有未修饰的β2m基因，(ii)功能性地表达正常水平的β2m和/或(iii)未经工程化以功能性地表达降低水平的β2m。

经工程化的细胞可被进一步经工程化以增强对排斥的抗性和/或提供治疗效果，例如，这些细胞可经工程化以包含或表达另外的蛋白质，例如抗原结合蛋白，诸如嵌合抗原受体(CAR)和/或T细胞受体，其中该抗原结合蛋白或T细胞受体使经工程化的免疫细胞靶向表达同源抗原的肿瘤细胞和/或其他不期望的(例如疾病状态)细胞。

因此，本公开提供了一种增加同种异体细胞在接受者中的持久性的方法，该方法包括将细胞工程化以相对于未经工程化的细胞功能性地表达降低水平的

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

在另一个实施方案中，将细胞工程化以相对于尚未如此工程化的相应细胞以降低的水平功能性地表达如本文所述的一种或多种靶标的方法包括向这些细胞中引入一个或多个基因组修饰，该基因组修饰相对于没有该一个或多个基因组修饰的细胞功能性地削弱或降低该一种或多种靶标的表达。

在另一个实施方案中，该方法不包括将细胞工程化以功能性地表达降低水平的β2m。

在一个方面，本公开提供了一种经工程化的免疫细胞，该经工程化的免疫细胞相对于未经工程化的细胞以降低的水平功能性地表达

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

在另一个实施方案中，相对于尚未如此工程化的相应细胞以降低的水平功能性地表达如本文所述的一种或多种靶标的经工程化的免疫细胞包含一个或多个基因组修饰，该基因组修饰相对于没有该一个或多个基因组修饰的细胞功能性地削弱或降低该一种或多种靶标的表达。

在另一个实施方案中，该经工程化的细胞(i)具有未修饰的β2m基因，(ii)功能性地表达正常水平的β2m和/或(iii)未经工程化以功能性地表达降低水平的β2m。在一些实施方案中，相对于对应但未经工程化的免疫细胞的表达水平而言，表达水平的降低为0％，例如当基因的两个染色体拷贝均被敲除时，或50％(即未经工程化的对照免疫细胞中的水平的50％)，例如当基因的两个染色体拷贝中的一个被敲除并且所述基因的另一个染色体拷贝的表达未被补偿性增加时。在一些实施方案中，该细胞表达

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

·(i)CD58、ICAM-1、RFX5和NLRC5；(ii)CD48、ICAM-1、RFX5、NLRC5；(iii)CD48、CD58、RFX5和NLRC5；(iv)CD48、CD58、ICAM-1和RFX5；(v)CD48、CD58、ICAM-1和NLRC5；(vi)β2m、CD58、CD48和ICAM-1；或(vii)CD48、CD58、ICAM-1、RFX5和NLRC5

表达水平不大于未经工程化的免疫细胞中表达水平的90％、不大于75％、不大于50％、不大于25％或不大于10％。

在另一个实施方案中，以不大于未经工程化的免疫细胞中表达水平的90％、不大于75％、不大于50％、不大于25％或不大于10％的水平表达一种或多种靶标的细胞包含一个或多个基因组修饰，该基因组修饰相对于没有该一个或多个基因组修饰的细胞功能性地削弱或降低如本文所述的该一种或多种靶标的表达。

在另一个实施方案中，该细胞(i)具有未修饰的β2m基因，(ii)功能性地表达正常水平的β2m和/或(iii)未经工程化以功能性地表达降低水平的β2m。

在一些实施方案中，在经工程化的免疫细胞中

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

的表达水平是关于相应基因没有相应工程化的对照细胞中的水平的0％至90％之间的任何值。在一些实施方案中，经工程化的细胞中的表达水平是例如对照细胞中的水平的10％至90％、25％至90％、25％至75％、10％至50％、25％至50％、50％至90％或50％至75％。在一些实施方案中，当例如基因的仅一个染色体拷贝被敲除并且补偿机制导致剩余染色体拷贝的表达水平增加时，获得除0％或50％之外的降低的表达水平，或者通过除基因敲除之外的方法实现表达的降低，诸如已知的敲低方法，例如那些采用各种基于RNA的技术中的任一种的方法(例如，反义RNA、miRNA、siRNA；参见例如，Lam等人，《分子疗法-核酸(Mol.Ther.-Nucleic Acids)》4:e252(2015),doi:10.1038/mtna.2015.23；Sridharan和Gogtay，《英国临床药理学杂志(Brit.J.Clin.Pharmacol)》.82:659-72(2016))。在另一个实施方案中，如本文所述的一种或多种靶标的表达水平在尚未相应工程化的对照细胞中的水平的0％至90％之间的经工程化的免疫细胞包含一个或多个基因组修饰，该基因组修饰相对于没有该一个或多个基因组修饰的免疫细胞功能性地削弱或降低该一种或多种靶标的表达。

在一些实施方案中，相对于合适的对照，本文所公开的经工程化的免疫细胞表现出在细胞表面处降低水平的MHC I类蛋白或复合物表达。在各种实施方案中，该细胞是T细胞，例如人T细胞。在一些实施方案中，该细胞包含TAP2、NLRC5、β2m、CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK基因座或基因中的突变和/或TAP2、NLRC5、β2m、CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK基因座或基因中的破坏，该突变和/或破坏导致被破坏的基因座或基因的功能性表达降低。在其他实施方案中，该细胞可包含CD48、CD58和ICAM-1基因座或基因中一者或多者中的附加突变和/或CD48、CD58和ICAM-1基因座或基因中一者或多者中的破坏，该突变和/或破坏导致被破坏的基因座或基因的功能性表达降低。在另一个实施方案中，该细胞可以包含以下基因座或基因中的突变

·NLRC5和CD58两者，RFX5和CD58两者，RFX5和CD48两者，NLRC5和CD48两者，RFX5和ICAM-1两者，NLRC5和ICAM-1两者；

·(i)CD58、NLRC5和RFX5；(ii)CD48、NLRC5和RFX5；(iii)ICAM-1、NLRC5和RFX5；(iv)CD58、ICAM-1和RFX5；(v)CD48、ICAM-1和RFX5；(vi)CD58、CD48和RFX5；(vii)CD58、ICAM-1和NLRC5；(viii)CD48、ICAM-1和NLRC5；或(ix)CD58、CD48和NLRC5；或

·(i)CD58、ICAM-1、RFX5和NLRC5；(ii)CD48、ICAM-1、RFX5、NLRC5；(iii)CD48、CD58、RFX5和NLRC5；(iv)CD48、CD58、ICAM-1和RFX5；(v)CD48、CD58、ICAM-1和NLRC5；或(vi)CD48、CD58、ICAM-1、RFX5和NLRC5，

这些突变导致被破坏的基因座或基因的功能表达降低。在另一个实施方案中，该细胞(i)不包含在β2m基因座或基因中的突变，(ii)具有未修饰的β2m基因，(iii)功能性地表达正常水平的β2m和/或(iv)未经工程化以功能性地表达降低水平的β2m。

在另一个实施方案中，包含在如本文所述的一种或多种靶标的基因座或基因中导致被破坏的基因座或基因的功能性表达降低的突变的细胞包含一个或多个基因组修饰，该基因组修饰相对于没有该一个或多个基因组修饰的细胞功能性地削弱或降低该一种或多种靶标的表达。

在一个实施方案中，该突变或破坏通过基因突变或基因编辑技术中的任何一种或组合引入，这些技术包括但不限于已知的同源重组技术和采用大范围核酸酶、TALEN、锌指、shRNA、Cas-CLOVER和CRISPR/Cas系统(例如，Cas9、Cas12和MAD7)或其他系统诸如碱基编辑系统或引物编辑系统中的任何一种或多种的技术。在一些实施方案中，该细胞是非人细胞，例如灵长类动物细胞或非灵长类哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是人类细胞。

在各个实施方案中，所述经工程化的免疫细胞进一步表达抗原结合蛋白，例如，经工程化的免疫细胞包括编码抗原结合蛋白的核酸。在一实施方案中，所述抗原结合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)。在一个实施方案中，将编码抗原结合蛋白(例如CAR)的核酸插入被破坏的CD48、CD58、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP或RFXANK基因座中，或插入该基因座中，从而破坏该基因座。在各个实施方案中，所述抗原结合蛋白是T细胞受体(TCR)。在一个实施方案中，将编码TCR的核酸插入被破坏的CD48、CD58、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP或RFXANK基因座中，或插入该基因座中，从而破坏该基因座。在一个实施方案中，经工程化的免疫细胞还包含一个或多个基因组修饰，例如内源基因座的修饰，例如以下一者或多者的修饰：内源CD70基因、内源TCRa基因和内源CD52基因。在各种实施方案中，所述一种或多种基因组修饰导致含有所述修饰的基因的功能性表达的减少或缺失。

在另一个实施方案中，进一步表达抗原结合蛋白(例如CAR)的经工程化的免疫细胞包含一个或多个基因组修饰，该基因组修饰相对于没有该一个或多个基因组修饰的免疫细胞功能性地削弱或降低该一种或多种靶标的表达。

所述经工程化的免疫细胞可以源自来自各个来源中的任一个来源的细胞。所述经工程化的免疫细胞可以制备自或源自细胞，例如干细胞或来自除了将施用所述经工程化的免疫细胞的人以外的人的免疫细胞，例如除了接受者以外的供体(例如，健康志愿者)，或者可以制备自或源自细胞，例如来自将施用所述经工程化的免疫细胞的人(接受者)的干细胞或免疫细胞，或者可以源自一种或多种诱导多能干细胞(iPSC)。在一实施方案中，所述免疫细胞是从健康志愿者获得的免疫细胞、从患者获得或源自iPSC。

在另一个方面，经工程化的细胞可还包含编码CD70结合蛋白的多核苷酸和/或可功能性地表达CD70结合蛋白。在一个实施方案中，CD70结合蛋白包含CD70结合结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，CD70结合结构域构成CD70抗体、或CD70受体或其CD70结合片段。在其他实施方案中，CD70结合结构域构成抗CD70抗体，任选地抗CD70抗体是scFv。在一个实施方案中，CD70结合蛋白还包含铰链结构域，任选地该铰链结构域包含CD8铰链。在一个其他实施方案中，该CD70结合蛋白还包含一个或多个选自由以下项组成的组的细胞内信号传导结构域：CD3z信号传导结构域、CD3d信号传导结构域、CD3g信号传导结构域、CD3e信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD2信号传导结构域、OX40信号传导结构域和4-1BB信号传导结构域或它们的变体。在另一个实施方案中，该CD70结合蛋白包含CD3z或CD3g信号传导结构域，并且不包含共刺激结构域。在另外的实施方案中，该CD70结合蛋白包含4-1BB信号传导结构域，并且不包含CD3z信号传导结构域。在其他实施方案中，所述CD70结合蛋白包括4-1BB信号传导结构域和CD3z信号传导结构域。在一个实施方案中，该一个或多个细胞内结构域包含SEQ ID NO:1、7-14、17-70或89-90中的一者或多者的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述CD70结合蛋白不包括胞内信号传导结构域。

另一方面，本公开提供了一种制备本文所公开的经工程化的免疫细胞的方法。在一个实施方案中，该方法包括使用任何基因编辑技术，诸如TALEN、锌指、Cas-CLOVER和CRISPR/Cas系统，和/或使用任何已知的基因敲低方法，例如那些采用各种基于RNA的技术中的任一种的方法(例如，shRNA/反义RNA、miRNA、siRNA；参见例如，Lam等人，《分子疗法-核酸(Mol.Ther.Nucleic Acids)》4:e252(2015),doi:10.1038/mtna.2015.23；Sridharan和Gogtay，《英国临床药理学杂志(Brit.J.Clin.Pharmacol)》.82:659-72(2016))，以相对于未经工程化的免疫细胞降低以下的功能性表达：

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

·(i)CD58、ICAM-1、RFX5和NLRC5；(ii)CD48、ICAM-1、RFX5、NLRC5；(iii)CD48、CD58、RFX5和NLRC5；(iv)CD48、CD58、ICAM-1和RFX5；(v)CD48、CD58、ICAM-1和NLRC5；(vi)β2m、CD58、CD48和ICAM-1；或(vii)CD48、CD58、ICAM-1、RFX5和NLRC5。在另一个实施方案中，方法不包括对细胞进行基因编辑以功能性地表达降低水平的β2m。

在另一个实施方案中，使用基因编辑技术制备经工程化的免疫细胞以相对于尚未如此工程化的相应免疫细胞降低如本文所述的一种或多种靶标的功能性表达的方法包括向免疫细胞中引入一个或多个基因组修饰，该基因组修饰相对于没有该一个或多个基因组修饰的免疫细胞功能性地削弱或降低该一种或多种靶标的表达。

在一个实施方案中，该方法包括或还包括将编码抗原结合蛋白(例如，CAR或TCR)的核酸引入经工程化的免疫细胞。在实施方案中，所述方法包括或还包括将内源性TCRa基因和内源性CD52基因中的一个或多个的一种或多种基因组修饰引入到所述经工程化的免疫细胞的基因组中。在实施方案中，所述一种或多种基因组修饰全部或部分地破坏和/或阻止内源性TCRa基因和内源性CD52基因中的一个或多个的功能性表达。

在本公开的各种实施方案中，TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK中的任何一者或多者的功能性表达水平通过确定经工程化的免疫细胞的表面上一种或多种HLA蛋白(诸如HLA-A或HLA-B蛋白)或β2微球蛋白(β2M)或一种或多种HLA蛋白和β2M两者的表面表达水平来测量，或者通过流式细胞术来测量。在本公开的各个实施方案中，CD48、CD58和ICAM-1中的任何一者或多者的功能性表达水平通过确定经工程化的免疫细胞的表面上每种细胞表面蛋白，诸如CD48、CD58或ICAM-1蛋白中的一者或多者的表面表达水平来测量，或通过流式细胞术来测量。在一些实施方案中，通过与未经相应工程化的但在其他方面可比较(例如相同)的免疫细胞在相同条件下存活的程度相比，测量经工程化的免疫细胞在存在效应细胞(例如T细胞)的情况下存活的程度来测定本公开的经工程化的免疫细胞中CD48、CD58、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK中任何一者或多者的表达。

在一些实施方案中，已经被工程化为相对于尚未如此工程化的相应细胞功能性地表达降低水平的以下各项的免疫细胞

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

经进一步工程化(a)以表达一种或多种选自由以下各项组成的组的蛋白质：HLA-E、HLA-E单链三聚体、HLA-G、HLA-G单链三聚体、UL18、UL18单链三聚体、HLA-A2、HLA-A2单链三聚体、人巨细胞病毒(HCMV)US11，和/或(b)以表达降低水平的

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

·(i)CD58、ICAM-1、RFX5和NLRC5；(ii)CD48、ICAM-1、RFX5、NLRC5；(iii)CD48、CD58、RFX5和NLRC5；(iv)CD48、CD58、ICAM-1和RFX5；(v)CD48、CD58、ICAM-1和NLRC5；(vi)β2m、CD58、CD48和ICAM-1；或(vii)CD48、CD58、ICAM-1、RFX5和NLRC5，

如本文所述通过敲除或敲低实现。

在另一个实施方案中，已经工程化以相对于尚未如此工程化的相应细胞以降低的水平功能性地表达如本文所述的一种或多种靶标的免疫细胞包含一个或多个基因组修饰，该基因组修饰相对于没有该一个或多个基因组修饰的细胞功能性地削弱或降低该一种或多种靶标的表达。

另一方面，本公开提供了一种经工程化的免疫细胞群体，其包括本文所提供的经工程化的免疫细胞。在一实施方案中，所述经工程化的免疫细胞群体包括10⁴至10¹⁰个本文所提供的经工程化的免疫细胞。在各个实施方案中，所述经工程化的免疫细胞群体包括10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹或10¹⁰个本文所提供的经工程化的免疫细胞。

在另一个方面，本公开提供了经工程化的免疫细胞群体，其中不超过例如75％的细胞功能性地表达

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

在另一个实施方案中，该群体的细胞以正常水平功能性地表达β2m，或者不以降低的水平表达β2m。

在另一个实施方案中，包含10⁴至10¹⁰个经工程化的免疫细胞的经工程化的免疫细胞群体包含含有一个或多个基因组修饰的经工程化的免疫细胞，该基因组修饰相对于没有该一个或多个基因组修饰的免疫细胞功能性地削弱或降低该一种或多种靶标的表达。

在另一个方面，本公开提供了经工程化的免疫细胞群体，其中至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、90％、95％或100％的经工程化的免疫细胞以降低的水平功能性地表达

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

降低的水平可以是不大于未经工程化的免疫细胞中表达水平的90％、不大于75％、不大于50％、不大于25％或不大于10％的水平。具体而言，降低的水平可以是不大于未经工程化的免疫细胞中表达水平的50％的水平。在另一个实施方案中，经工程化的免疫细胞群体以正常水平功能性地表达β2m或不以降低的水平功能性地表达β2m。

在另一个实施方案中，其中至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、90％、95％或100％的经工程化的免疫细胞以降低的水平功能性地表达如本文所述的一种或多种靶标的经工程化的免疫细胞群体包含含有一个或多个基因组修饰的经工程化的免疫细胞，该基因组修饰相对于没有该一个或多个基因组修饰的免疫细胞功能性地削弱或降低该一种或多种靶标的表达。

在一些实施方案中，相对于适当的对照(例如，未进行相应工程化的相应免疫细胞中的表达水平)而言，降低的表达水平为0％，例如当基因的两个染色体拷贝均被敲除时(例如，通过采用TALEN、锌指、Cas-CLOVER和/或CRISPR/Cas系统的方法)，或为50％，例如当基因的两个染色体拷贝中的一个染色体拷贝被敲除且该基因的另一个染色体拷贝的表达没有补偿性增加时。在一些实施方案中，相对于未经工程化的免疫细胞的表达水平而言，降低的表达水平介于0％与90％之间，或者介于0％与90％之间的任何两个中间值之间，例如介于10％与90％之间、介于25％与90％之间、介于25％与75％之间、介于10％与50％之间、介于25％与50％之间、介于50％与90％之间以及介于50％与75％之间。当例如基因的仅一个染色体拷贝被敲除并且补偿机制导致剩余染色体拷贝的表达水平增加时，可以获得在此类中间范围中一个或多个范围内的值，或者通过除基因敲除之外的方法实现表达的降低，诸如已知的敲低方法，例如那些采用各种基于RNA的技术中的任一种的方法(例如，shRNA反义RNA、miRNA、siRNA；参见例如，Lam等人，《分子疗法-核酸(Mol.Ther.-Nucleic Acids)》4:e252(2015),doi:10.1038/mtna.2015.23；Sridharan和Gogtay，《英国临床药理学杂志(Brit.J.Clin.Pharmacol)》.82:659-72(2016))。在本文公开的经工程化的免疫细胞群体的一些实施方案中，一些或所有经工程化的细胞，例如5％-10％、10％-25％、25％-50％、50％-90％或90％-100％，相对于合适的对照，表现出在细胞表面处降低水平的MHC I类蛋白和/或MHC II类蛋白或复合物表达。

在各个实施方案中，如本文所公开的经工程化的免疫细胞群体或包括经工程化的免疫细胞的免疫细胞群体包括至少10％经工程化的T细胞、至少20％经工程化的T细胞、至少30％经工程化的T细胞、至少40％经工程化的T细胞、至少50％经工程化的T细胞、至少75％经工程化的T细胞、至少90％经工程化的T细胞或100％经工程化的T细胞。本文还提供了细胞群体，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少90％或100％是经工程化的免疫细胞，例如本文公开的经工程化的T细胞。

在一些实施方案中，所述群体中的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％或至少90％的所述经工程化的细胞进一步表达抗原结合蛋白。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，将编码CAR的核酸插入被破坏的CD48、CD58、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP或RFXANK基因座中，和/或此类插入会破坏该基因座。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白是T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，将编码TCR的核酸插入被破坏的CD48、CD58、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP或RFXANK基因座中，和/或此类插入会破坏该基因座。

在本文所公开的经工程化的免疫细胞群体的某些实施方案中，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％或至少90％的所述经工程化的细胞还包括内源性TCRa基因和内源性CD52基因中的一个或多个的一种或多种基因组修饰。

在一个实施方案中，经工程化的免疫细胞群体源自一种或多种获自人，例如获自除将会向其施用所述细胞的人以外的人，例如获自除接受者之外的供体或获自健康志愿者的免疫细胞，或源自一种或多种获自患者(例如，将会向其施用所述细胞的人)的免疫细胞，或源自一种或多种iPSC。

在另一个方面，经工程化的细胞群体可还包含编码CD70结合蛋白的多核苷酸和/或可功能性地表达CD70结合蛋白。在一个实施方案中，CD70结合蛋白包含CD70结合结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，CD70结合结构域构成CD70抗体、或CD70受体或其CD70结合片段。在其他实施方案中，CD70结合结构域构成抗CD70抗体，任选地抗CD70抗体是scFv。在一个实施方案中，CD70结合蛋白还包含铰链结构域，任选地该铰链结构域包含CD8铰链。在一个其他实施方案中，该CD70结合蛋白还包含一个或多个选自由以下项组成的组的细胞内信号传导结构域：CD3z信号传导结构域、CD3d信号传导结构域、CD3g信号传导结构域、CD3e信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD2信号传导结构域、OX40信号传导结构域和4-1BB信号传导结构域或它们的变体。在另一个实施方案中，该CD70结合蛋白包含CD3z或CD3g信号传导结构域，并且不包含共刺激结构域。在另外的实施方案中，该CD70结合蛋白包含4-1BB信号传导结构域，并且不包含CD3z信号传导结构域。在其他实施方案中，所述CD70结合蛋白包括4-1BB信号传导结构域和CD3z信号传导结构域。在一个实施方案中，该一个或多个细胞内结构域包含SEQ ID NO:1、7-14、17-70或89-90中的一者或多者的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述CD70结合蛋白不包括胞内信号传导结构域。

在另一个方面，本公开提供了一种制备本文所述的经工程化的免疫细胞群体的方法，其中该方法包括使用基因编辑技术，例如选自由TALEN、锌指、Cas-CLOVER和CRISPR/Cas系统组成的组的基因编辑技术，降低以下各项的功能性表达

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

在一个实施方案中，该方法不包括使用基因编辑技术，例如降低β2m的功能性表达的基因编辑技术。

在另一个实施方案中，使用基因编辑技术制备如本文所述的经工程化的免疫细胞群体以相对于尚未如此工程化的相应免疫细胞降低如本文所述的一种或多种靶标的功能性表达的方法包括向免疫细胞中引入一个或多个基因组修饰，该基因组修饰相对于没有该一个或多个基因组修饰的免疫细胞功能性地削弱或降低该一种或多种靶标的表达。

在另一个方面，本公开提供了一种确定或测量本文公开的经工程化的免疫细胞群体的细胞中TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP和/或RFXANK的功能性表达水平的方法，其中功能性表达水平通过确定经工程化的免疫细胞表面上的HLA蛋白、β2微球蛋白(Β2M)或HLA蛋白和Β2M两者的表面表达水平来测量，和/或通过流式细胞术来测量。在本公开的各个实施方案中，经工程化的免疫细胞群体的细胞中CD48、CD58和ICAM-1中的任何一者或多者的功能性表达水平，其中功能性表达水平通过确定经工程化的免疫细胞的表面上每种细胞表面蛋白，诸如CD48、CD58或ICAM-1蛋白中的一者或多者的表面表达水平来测量，或通过流式细胞术来测量。

在本文所述的经工程化的免疫细胞和本文所公开的经工程化的免疫细胞群体的各个实施方案中，经工程化的免疫细胞是，或该群体的一个或多个经工程化的免疫细胞，例如该群体的至少10％、20％、30％、40％、50％、75％、90％或100％的经工程化的免疫细胞通过本文所述的任何方法或通过本领域普通技术人员已知的任何其他方法进一步工程化(例如，通过本文公开的任何方法或通过本领域普通技术人员已知的任何其他方法进一步工程化)以表达一种或多种选自由以下项组成的组的蛋白质：HLA-E、HLA-E单链三聚体、HLA-G、HLA-G单链三聚体、UL18、UL18单链三聚体、HLA-A2、HLA-A2单链三聚体和人巨细胞病毒(HCMV)US11。

在另一个方面，治疗患者病状的方法包括向该患者施用：经工程化的免疫细胞、经工程化的免疫细胞群体、或包含经工程化的细胞或经工程化的免疫细胞群体的药物组合物，其中经工程化的细胞和/或该群体的经工程化的细胞还包含编码CD70结合蛋白的多核苷酸和/或功能性地表达CD70结合蛋白。在一个实施方案中，CD70结合蛋白包含CD70结合结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，CD70结合结构域构成CD70抗体、或CD70受体或其CD70结合片段。在其他实施方案中，CD70结合结构域构成抗CD70抗体，任选地抗CD70抗体是scFv。在一个实施方案中，CD70结合蛋白还包含铰链结构域，任选地该铰链结构域包含CD8铰链。在一个其他实施方案中，该CD70结合蛋白还包含一个或多个选自由以下项组成的组的细胞内信号传导结构域：CD3z信号传导结构域、CD3d信号传导结构域、CD3g信号传导结构域、CD3e信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD2信号传导结构域、OX40信号传导结构域和4-1BB信号传导结构域或它们的变体。在另一个实施方案中，该CD70结合蛋白包含CD3z或CD3g信号传导结构域，并且不包含共刺激结构域。在另外的实施方案中，该CD70结合蛋白包含4-1BB信号传导结构域，并且不包含CD3z信号传导结构域。在其他实施方案中，所述CD70结合蛋白包括4-1BB信号传导结构域和CD3z信号传导结构域。在一个实施方案中，该一个或多个细胞内结构域包含SEQ ID NO:1、7-14、17-70或89-90中的一者或多者的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述CD70结合蛋白不包括胞内信号传导结构域。

另一方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如本文所公开的经工程化的免疫细胞，其中所述组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。另一方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如本文所公开的经工程化的免疫细胞群体，其中所述组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。在该组合物的各个实施方案中，经工程化的免疫细胞或该群体的一个或多个经工程化的免疫细胞，例如该群体的至少10％、20％、30％、40％、50％、75％、90％或100％的经工程化的免疫细胞，表达一种或多种选自由以下项组成的组的蛋白质：HLA-E、HLA-E单链三聚体、HLA-G、HLA-G单链三聚体、UL18、UL18单链三聚体、HLA-A2、HLA-A2单链三聚体和人巨细胞病毒(HCMV)US11，和/或不表达或以降低的水平表达CIITA、RFXANK、RFXAP和RFX5中的任何一者或多者，如本文所述通过敲除或敲低实现。

在另一个方面，该药物组合物的经工程化的细胞还包含编码CD70结合蛋白的多核苷酸和/或功能性地表达CD70结合蛋白。在一个实施方案中，CD70结合蛋白包含CD70结合结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，CD70结合结构域构成CD70抗体、或CD70受体或其CD70结合片段。在其他实施方案中，CD70结合结构域构成抗CD70抗体，任选地抗CD70抗体是scFv。在一个实施方案中，CD70结合蛋白还包含铰链结构域，任选地该铰链结构域包含CD8铰链。在一个其他实施方案中，该CD70结合蛋白还包含一个或多个选自由以下项组成的组的细胞内信号传导结构域：CD3z信号传导结构域、CD3d信号传导结构域、CD3g信号传导结构域、CD3e信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD2信号传导结构域、OX40信号传导结构域和4-1BB信号传导结构域或它们的变体。在另一个实施方案中，该CD70结合蛋白包含CD3z或CD3g信号传导结构域，并且不包含共刺激结构域。在另外的实施方案中，该CD70结合蛋白包含4-1BB信号传导结构域，并且不包含CD3z信号传导结构域。在其他实施方案中，所述CD70结合蛋白包括4-1BB信号传导结构域和CD3z信号传导结构域。在一个实施方案中，该一个或多个细胞内结构域包含SEQ ID NO:1、7-14、17-70或89-90中的一者或多者的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述CD70结合蛋白不包括胞内信号传导结构域。

在另一个实施方案中，所述药物组合物包含一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂和经工程化的细胞，例如如本文所述的经工程化的免疫细胞，其中经工程化的细胞包含一个或多个基因组修饰，该基因组修饰相对于没有该一个或多个基因组修饰的细胞，功能性地削弱或降低如本文所述的一种或多种靶标的表达。

在一个方面，提供了如本文公开的经工程化的免疫细胞、如本文公开的经工程化的免疫细胞群体或用作药物的药物组合物。

另一方面，本公开提供了一种治疗患者的病状的方法，所述方法包括向所述患者施用如本文所公开的经工程化的免疫细胞、如本文所公开的经工程化的免疫细胞群体或如本文所公开的药物组合物。在一实施方案中，所述病状选自由实体瘤和液体瘤组成的组。

在另一个方面，本公开提供了一种将经工程化的免疫细胞中MHC I类蛋白的表面表达水平减少至未经工程化的免疫细胞中MHC I类蛋白的表达水平的约75％或更低的方法，该方法降低包括将TAP2、NLRC5、β2m、CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK的功能性表达水平，例如降低至未经工程化的免疫细胞中表达水平的约75％或更低。在另一个实施方案中，该方法还包括降低CD48、CD58和ICAM-1中一者或多者的功能性表达水平，例如降低至未经工程化的免疫细胞中表达水平的约75％或更低。在另一个实施方案中，该方法包括降低以下各项的功能性表达水平

例如降低至未经工程化的免疫细胞中表达水平的约75％或更低。

在另一个实施方案中，通过降低如本文所述的一种或多种靶标的功能性表达将经工程化的免疫细胞中MHC I类蛋白的表面表达水平减少，在一些实施方案中减少至未经工程化的免疫细胞中MHC I类蛋白的表达水平的约75％或更低的方法包括向免疫细胞中引入一个或多个基因组修饰，该基因组修饰相对于没有该一个或多个基因组修饰的免疫细胞功能性地削弱或降低该一种或多种靶标的表达。

在另一个实施方案中，经工程化的免疫细胞以正常水平功能性地表达β2m或不以降低的水平功能性地表达β2m。在另一个实施方案中，经工程化的免疫细胞还包含编码CD70结合蛋白的多核苷酸和/或功能性地表达CD70结合蛋白，如本文所述。

在一实施方案中，相对于合适的对照，本文所公开的经工程化的免疫细胞表现出在细胞表面处降低水平的MHC I类蛋白或复合物表达。

在一实施方案中，本文所公开的经工程化的免疫细胞是经工程化的T细胞。在某些实施方案中，本文所述公开的经工程化的免疫细胞，例如本文所公开的经工程化的T细胞，进一步表达另外的蛋白质，例如由外源DNA编码的蛋白质或其表达由该细胞的进一步工程化引起的蛋白质。在一些实施方案中，另外的蛋白质是抗原结合蛋白和/或CD70结合蛋白。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，通过本文所述的方法将编码另外的蛋白质，例如抗原结合蛋白(例如，CAR)和/或CD70结合蛋白的核酸引入细胞。在一些实施方案中，将核酸引入被破坏的CD48、CD58、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP或RFXANK基因座，或者CD48、CD58、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP或RFXANK基因座通过插入编码另外的蛋白质，例如抗原结合蛋白(例如，CAR)和/或CD70结合蛋白的核酸而被破坏。

在本文所公开的方法的一个实施方案中，抗原结合蛋白是T细胞受体(TCR)组分，例如TCRα(TCR alpha)、TCRβ(TCR beta)、TCRγ(TCR gamma)或TCRδ(TCR delta)。在一个实施方案中，将编码TCR组分的核酸插入被破坏的CD48、CD58、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP或RFXANK基因座，或者CD48、CD58、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP或RFXANK基因座通过插入编码TCR组分的核酸而被破坏。

在本文所公开的方法的另一个实施方案中，经工程化的免疫细胞还包含内源TCRα基因和内源CD52基因中的一者或多者的一个或多个基因组修饰(例如，敲除、缺失、敲低、插入)。在一些实施方案中，所述基因组修饰部分或全部消除了经修饰的基因的功能性表达。在本文所公开的方法的另一个实施方案中，免疫细胞是获自人，例如获自除将会向其施用所述细胞的人以外的供体，例如获自健康志愿者的免疫细胞，或者获自患者(例如，将会向其施用所述细胞的人)的免疫细胞，或源自iPSC。

在另一个方面，本公开提供了一种制备本文所公开的经工程化的免疫细胞群体的方法，其中该方法包括使用基因编辑技术，例如选自由TALEN、锌指、shRNA、Cas-CLOVER和CRISPR/Cas系统组成的组的基因编辑技术，降低在细胞中，例如在免疫细胞中以下各项的功能性表达

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

在另一个实施方案中，免疫细胞(基因编辑之前或之后)还包含编码CD70结合蛋白的多核苷酸和/或功能性地表达CD70结合蛋白，如本文所述。在另一个实施方案中，该方法不包括细胞(例如，免疫细胞)中β2m的基因编辑。

在另一个实施方案中，该基因编辑技术将突变引入以下基因座

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

在另一个实施方案中，使用基因编辑技术，通过向基因座或该一种或多种靶标中引入突变来制备如本文所述的经工程化的免疫细胞群体以相对于尚未如此工程化的相应免疫细胞降低如本文所述的一种或多种靶标的功能性表达的方法包括向免疫细胞中引入一个或多个基因组修饰，该基因组修饰相对于没有该一个或多个基因组修饰的免疫细胞功能性地削弱或降低该一种或多种靶标的表达。

在另一个实施方案中，该基因编辑技术不将突变引入β2m基因座中。在一个实施方案中，突变是以下的任何一种或多种：插入，例如一个或多个核苷酸或碱基对的插入，例如编码蛋白质的序列的插入；一个或多个核苷酸或碱基对的缺失；以及一个或多个核苷酸或碱基对的取代。

在本文所公开的方法的一个实施方案中，TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK中任何一者或多者的功能性表达水平通过确定经工程化的免疫细胞的表面上HLA蛋白、β2微球蛋白(Β2M)或HLA和Β2M两者的表面表达水平来测量，或通过流式细胞术来测量。在本公开的各个实施方案中，CD48、CD58和ICAM-1中的任何一者或多者的功能性表达水平通过确定经工程化的免疫细胞的表面上每种细胞表面蛋白，诸如CD48、CD58或ICAM-1蛋白中的一者或多者的表面表达水平来测量，或通过流式细胞术来测量。在一个实施方案中，以下各项的表面表达水平的降低程度

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

是相对于尚未经基因编辑的相同类型的细胞中的相应表达水平确定的。

在本文所公开的方法的实施方案中，经工程化的免疫细胞表达另外的蛋白质，其可以是任何期望的蛋白质，包括抗原结合蛋白或CD70结合蛋白(如本文进一步描述的)。在一实施方案中，所述抗原结合蛋白包括CAR。在一些实施方案中，将编码CAR(和任选地CD70结合蛋白)的核酸插入被破坏的CD58、CD48、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP或RFXANK基因座中，或此类插入会破坏该基因座。在另一个实施方案中，所述抗原结合蛋白是T细胞受体(TCR)组分。在一个实施方案中，将编码TCR的核酸插入被破坏的CD48、CD58、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP或RFXANK基因座中，或此类插入会破坏该基因座。

在一实施方案中，所述方法包括降低被破坏的基因座的功能性表达水平。在一个实施方案中，该方法包括降低以下各项的功能性表达水平

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

在另一个实施方案中，通过降低如本文所述的一种或多种靶标的功能性表达水平来降低被破坏的基因座的功能性表达的方法包括向这些免疫细胞中引入一个或多个基因组修饰，该基因组修饰相对于没有该一个或多个基因组修饰的免疫细胞功能性地削弱或降低该一种或多种靶标的表达。

在另一个实施方案中，该方法不包括降低β2m的功能性表达水平。

在某些实施方案中，该方法还包括将编码TCR组分的基因(例如，TCRa基因)和CD52基因中的一者或多者的一个或多个基因组修饰引入经工程化的免疫细胞。

在另一个方面，本公开提供了一种降低例如MHC I类在细胞表面呈现的肽多样性的方法，该方法包括降低TAP2、NLRC5、β2m、CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK中的任何一者或多者的功能表达水平，在一些实施方案中，将该水平降低至尚未相应改变的可比较的细胞的约90％或更低(换句话说，降低至少约10％，例如，与对照水平100相比降低至约90或更低的水平)或降低至约75％或更低。除了降低肽多样性之外，本文所公开的方法还可以包括同时下调或消除某些细胞表面受体，已知这些受体在免疫突触，例如CD48、CD58和ICAM-1中的一者或多者的免疫细胞粘附和活化中起作用。在各种实施方案中，如本文所述，降低一个或多个基因的功能性表达水平包括使用选自由TALEN、锌指、Cas-CLOVER和CRISPR/Cas系统(包括例如Cas9、Cas12和MAD7)组成的组的基因编辑技术。在另一个实施方案中，该方法包括降低以下各项的功能性表达水平

·(i)CD58、ICAM-1、RFX5和NLRC5；(ii)CD48、ICAM-1、RFX5、NLRC5；(iii)CD48、CD58、RFX5和NLRC5；(iv)CD48、CD58、ICAM-1和RFX5；(v)CD48、CD58、ICAM-1和NLRC5；或(vii)CD48、CD58、ICAM-1、RFX5和NLRC5。

在另一个实施方案中，通过降低如本文所述的一种或多种基因/靶标的功能性表达水平来降低细胞表面呈现的肽多样性并同时下调或消除已知在免疫突触的免疫细胞粘附和活化中起作用的某些细胞表面受体的方法包括向免疫细胞中引入一个或多个基因组修饰，该基因组修饰相对于没有该一个或多个基因组修饰的免疫细胞功能性地削弱或降低该一种或多种靶标的表达。

在另一个实施方案中，该方法不包括降低β2m的功能性表达。

在一个实施方案中，CD48、CD58、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK中的一者或多者的表达水平的降低程度是相对于尚未经基因编辑的相同类型的细胞中的相应表达水平确定的。在一个实施方案中，TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK中的一者或多者的功能性表达水平通过确定经工程化的免疫细胞的表面上HLA、β2微球蛋白(Β2M)或HLA和Β2M两者的表面表达水平来测量。在本公开的各个实施方案中，CD48、CD58和ICAM-1中的任何一者或多者的表达水平的降低程度通过确定经工程化的免疫细胞的表面上每种细胞表面蛋白，诸如CD48、CD58或ICAM-1蛋白中的一者或多者的表面表达水平来测量，或通过流式细胞术来测量。

在另一个方面，本公开提供了一种减少T细胞介导的同种异体细胞杀伤的方法，该方法包括降低在经工程化的免疫细胞诸如经工程化的T细胞中以下各项的功能性表达水平

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

。在另一个实施方案中，减少T细胞介导的同种异体细胞杀伤的方法不包括降低β2m的功能性表达水平。

在另一个实施方案中，通过降低如本文所述的一种或多种靶标在经工程化的免疫细胞(诸如经工程化的T细胞)中的功能性表达水平来减少T细胞介导的同种异体细胞杀伤的方法，包括向免疫细胞(诸如T细胞)中引入一个或多个基因组修饰，该基因组修饰相对于没有该一个或多个基因组修饰的免疫细胞功能性地削弱或降低该一种或多种靶标的表达。

在一些实施方案中，所述方法使得表达水平降低，相对于未经工程化的免疫细胞的表达水平而言，例如当基因的两个染色体拷贝均被敲除时，降低的表达水平为0％，或者例如当基因的两个染色体拷贝中的一个染色体拷贝被敲除并且所述基因的另一个染色体拷贝的表达没有补偿性增加时，降低的表达水平为50％。在一些实施方案中，所述方法使得表达水平降低，相对于未经工程化的免疫细胞的表达水平而言，降低的表达水平介于0％与90％之间，或者介于0％与90％之间的任何两个中间值之间，例如介于10％与90％之间、介于25％与90％之间、介于25％与75％之间、介于10％与50％之间、介于25％与50％之间、介于50％与90％之间以及介于50％与75％之间。

在一些实施方案中，降低以下各项的功能性表达水平

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

包括使用基因编辑技术，例如TALEN、锌指、Cas-CLOVER和/或CRISPR/Cas系统中的任何一种或多种，和/或任何一种或多种已知的敲除方法，例如采用各种基于RNA的技术(例如，shRNA、反义RNA、miRNA、siRNA)中的任何一种的那些方法。

在另一个实施方案中，该方法包括降低以下各项的功能性表达水平

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

·CD58、ICAM-1、RFX5和NLRC5；(ii)CD48、ICAM-1、RFX5、NLRC5；(iii)CD48、CD58、RFX5和NLRC5；(iv)CD48、CD58、ICAM-1和RFX5；(v)CD48、CD58、ICAM-1和NLRC5；(vi)β2m、CD58、CD48和ICAM-1；或(vii)CD48、CD58、ICAM-1、RFX5和NLRC5。

在另一个实施方案中，通过使用基因编辑技术和/或任何一种或多种已知的敲低方法降低免疫细胞中如本文所述的一种或多种靶标的功能性表达水平的方法包括向免疫细胞中引入一个或多个基因组修饰，该基因组修饰相对于没有该一个或多个基因组修饰的免疫细胞功能性地削弱或降低该一种或多种靶标的表达。

在一个实施方案中，CD48、CD58、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK中的一者或多者的表达水平的降低程度是相对于尚未如此改变和/或操纵的相同类型的细胞中的相应表达水平确定的。

在本文公开的减少T细胞介导的同种异体细胞杀伤的方法的一个实施方案中，TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK中的一者或多者的功能性表达水平通过确定经工程化的免疫细胞的表面上HLA、β2微球蛋白(Β2M)或HLA和Β2M两者的表面表达水平来测量。在一实施方案中，TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK中的一个或多个的表面表达水平通过流式细胞术测量。在本公开的各个实施方案中，CD48、CD58和ICAM-1中的任何一者或多者的功能性表达水平通过确定经工程化的免疫细胞的表面上每种细胞表面蛋白，诸如CD48、CD58或ICAM-1蛋白中的一者或多者的表面表达水平来测量，或通过流式细胞术来测量。在一个实施方案中，该方法包括引入编码TCR组分的基因(例如，TCRa基因)和CD52基因中的一者或多者的一个或多个基因组修饰。在另一个实施方案中，经工程化的免疫细胞还包含编码CD70结合蛋白的多核苷酸和/或功能性地表达CD70结合蛋白，如本文所述。

在本文公开的减少T细胞介导的同种异体细胞杀伤的方法的一些实施方案中，在本公开的经工程化的免疫细胞中以下各项的功能性表达水平

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

通过与未未经工程化的但在其他方面可比较(例如相同)的免疫细胞在相同条件下存活的程度相比，测量经工程化的免疫细胞在存在效应细胞(例如T细胞)的情况下存活的程度来测定。在另一个实施方案中，经工程化的免疫细胞还包含编码CD70结合蛋白的多核苷酸和/或功能性地表达CD70结合蛋白，如本文所述。

在一个方面，本公开提供了一种经工程化的免疫细胞，该经工程化的免疫细胞以降低的水平功能性地表达

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

在另一个实施方案中，以降低的水平功能性地表达如本文所述的一种或多种靶标的经工程化的细胞包含一个或多个基因组修饰，该基因组修饰相对于没有该一个或多个基因组修饰的免疫细胞功能性地削弱或降低该一种或多种靶标的表达。

在另一个实施方案中，经工程化的免疫细胞不以降低的水平功能性地表达β2m。在各个实施方案中，所述细胞表现出在细胞表面处降低水平的MHC I类蛋白或复合物表达、在细胞表面处降低水平的MHC II类蛋白或复合物表达，或在细胞表面处降低水平的MHC I类蛋白或复合物表达和在细胞表面处降低水平的MHC II类蛋白或复合物表达。在各个实施方案中，所述细胞是T细胞。在另一个实施方案中，经工程化的免疫细胞还包含编码CD70结合蛋白的多核苷酸和/或功能性地表达CD70结合蛋白，如本文所述。

在各个实施方案中，本文所公开的经工程化的免疫细胞进一步表达另外的蛋白质。在一些实施方案中，另外的蛋白质是抗原结合蛋白和/或CD70结合蛋白。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白是T细胞受体(TCR)。在某些实施方案中，所述经工程化的免疫细胞包括编码另外的蛋白质的核酸。在一些实施方案中，编码另外的蛋白质的核酸位于被破坏的CD48、CD58、ICAM-1、TAP2、NLRC5、CIITA、RFX5、RFXANK、β2m或RFXAP基因座内，和/或在此类基因座中引起或产生破坏。在另一个实施方案中，编码另外的蛋白质的核酸不位于被破坏的β2m基因座内和/或不在此类基因座中引起或产生破坏。

在各个实施方案中，本文所公开的经工程化的免疫细胞包括或还包括内源性TCRa(TCRα或TCR alpha)基因和内源性CD52基因中的一个或多个的一种或多种基因组修饰。

在各个实施方案中，本文所公开的经工程化的免疫细胞是或源自从健康志愿者或患者获得的免疫细胞，或者源自iPSC。

在一个方面，本公开提供了一种制备本文所公开的经工程化的免疫细胞的方法，该方法包括使用选自由TALEN、锌指、Cas-CLOVER和CRISPR/Cas系统组成的组的基因编辑技术来降低以下各项的功能性表达

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

在另一个实施方案中，使用基因编辑技术制备经工程化的免疫细胞以降低如本文所述的一种或多种靶标的功能性表达的方法包括向免疫细胞中引入一个或多个基因组修饰，该基因组修饰相对于没有该一个或多个基因组修饰的免疫细胞功能性地削弱或降低该一种或多种靶标的表达。

在另一个实施方案中，该方法不包括使用基因编辑技术来降低β2m的功能性表达。

附图说明

图1A描绘了免疫突触的不同组分(改编自Huppa,J.,Davis,M.T细胞抗原识别和免疫突触(T-cell-antigen recognition and the immunological synapse)，《自然-免疫学综述(Nat Rev Immunol)》3,973–983(2003))。

图1B描绘了CD58缺陷型肿瘤细胞的免疫逃避模型(参见Challa-Malladi,M.等人，β2微球蛋白和CD58的联合基因失活揭弥漫性大B细胞淋巴瘤中免疫识别的频繁逃逸(Combined genetic inactivation ofβ2-Microglobulin and CD58 reveals frequentescape from immune recognition in diffuse large B cell lymphoma)的图8，《癌细胞(Cancer Cell)》.2011年12月13日；20(6):728-40，2011年12月1日电子出版)

图1C描绘了MHC-I表达如何控制T细胞和NK细胞排斥之间的平衡。正常的MHC-1表达触发T细胞排斥(左图)，而MHC-1的缺乏经由“失去自我”的消除触发NK细胞排斥(右图)。

图1D描绘在CAR T细胞上表达的CD70结合蛋白对抗同种异体反应性宿主(例如，患者)免疫细胞的用途。CD70结合蛋白(也称为dagger蛋白)与宿主免疫细胞上表达的CD70多肽结合，导致它们消除。与未经工程化的细胞相比，CAR T细胞以降低的水平表达另一种分子，例如CD58，从而为CAR T细胞提供针对宿主免疫应答的进一步保护。

图1E-图1F示出了使用具有某些敲除的细胞群体的T细胞MLR(E)和NK细胞MLR(F)测定的结果。

图2示出了具有某些敲除的细胞群体的基因编辑效率。

图3示出了使用具有某些敲除的细胞群体的T细胞MLR测定的结果。

图4示出了使用具有某些敲除的细胞群体的PMBC MLR测定的结果。

图5A-图5B示出了为测试CAR T细胞对抗同种异体T细胞排斥的有效性而进行的致敏T MLR测定的结果。图5C-图5D示出了进一步致敏的T MLR测定(C)和NK细胞MLR测定(D)的结果。图5E示出了PBMC MLR测定的结果。图5F示出了一些具有各种敲除的CAR T细胞能够减少宿主免疫细胞的扩增(左图：宿主CD8+T细胞；右图：宿主CD4+T细胞)。图5G示出了一些具有各种敲除的CAR T细胞能够减少宿主NK细胞的扩增。图5H示出了具有不同敲除的CAR T细胞的细胞毒性。

图6A-图6B示出了为测试CAR T细胞对同种异体NK细胞排斥的易感性而进行的NK细胞MLR测定的结果。图6C证明CAR T细胞未表现出IL-2非依赖性生长。

图7示出了不同CAR T细胞群体的基因编辑效率。

图8示出了具有不同敲除的不同CAR T细胞群体的扩增。

图9示出了具有某些敲除的不同CAR T细胞的细胞毒性测定的结果。

图10示出了不同的经工程化(例如经基因编辑)的CAR T细胞的致敏T细胞MLR测定的结果。

图11示出了不同的经工程化(例如经基因编辑)的CAR T细胞的PBMC MLR测定的结果。

图12A-图12B示出了在用不同的经工程化(例如经基因编辑)的CAR T细胞进行的MLR测定中宿主免疫细胞扩增的结果(A：宿主CD8+T细胞和CD4+T细胞；B：NK细胞)。

图13A-图13D示出了使用CD19 CAR/CD70结合蛋白/CD58敲除细胞的不同测定的结果。图13A示出了PBMC MLR测定的结果。图13B-图13C示出了MLR测定中宿主细胞扩增测定的结果(B：宿主CD4+和CD8+T细胞；C：宿主NK细胞)。图13D示出了细胞毒性测定的结果。

具体实施方式

本公开提供了一种用于提供治疗性同种异体细胞产物的基因编辑策略，所述产物不会引起或在降低的程度上引起接受者的免疫系统的排斥。这允许细胞产物在接受者体内持续更长时间，并且因此促进和/或改善治疗效果。本发明策略涉及下调或消除某些细胞表面受体，已知这些受体在免疫突触，例如CD48、CD58和ICAM-1中的一者或多者的免疫细胞粘附和活化中起作用。这种策略可以通过进一步下调或消除编码在HLA表达中涉及的分子的基因来进一步补充，这样可以最大限度地减少同种异体细胞产物呈递的肽的多样性。这通过引入TAP2、NLRC5、β2m、CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK中的一者或多者的一个或多个基因组修饰(例如基因组敲除或敲除低)来实现，这些基因的产物在细胞的肽呈递中起作用。在一个实施方案中，基因组修饰(例如基因组敲除或敲低)针对

·(i)CD58、ICAM-1、RFX5和NLRC5；(ii)CD48、ICAM-1、RFX5、NLRC5；(iii)CD48、CD58、RFX5和NLRC5；(iv)CD48、CD58、ICAM-1和RFX5；(v)CD48、CD58、ICAM-1和NLRC5；或(vi)CD48、CD58、ICAM-1、RFX5和NLRC5。

当免疫细胞包含至少一个修饰时，其可被称为经工程化的免疫细胞。因此，本公开的经工程化的免疫细胞可被称为包含基因组修饰的免疫细胞。

在一个方面，经工程化的免疫细胞以及包含经工程化的免疫细胞的群体展示出抵抗同种异体反应性免疫细胞消除的能力改善。在一个实施方案中，通过在同种异体反应性免疫细胞诸如PBMC、T细胞和/或自然杀伤(NK)细胞的存在下存活能力的改善证明抵抗消除的能力改善。例如，存活能力的改善可以经由如本文(包括在实施例部分中)所述的一种或多种混合淋巴细胞(MLR)测定来显示。

在另一个方面，经工程化的免疫细胞以及包含经工程化的免疫细胞的群体在同种异体受试者或HLA错配受试者中展示出改善的持久性。在一个实施方案中，通过在过继转移到同种异体受试者或HLA错配受试者中后保持有活力的能力改善，证明所述细胞或群体的持久性改善。如本文所述，所述细胞和包含所述细胞的群体的特征在于抵抗同种异体反应性免疫细胞消除的能力改善。不受理论的束缚，在施用给同种异体受试者或HLA错配受试者后，预期具有这种改善的能力的细胞和群体也将展示出改善的持久性。

本发明的一个方面涉及编码可被接受者(宿主)免疫细胞识别并随后杀伤的细胞表面分子的基因的表达功能性降低(或不表达)的经工程化的细胞(例如，经工程化的免疫细胞，诸如CAR T细胞)，以及制备和使用此类经工程化的细胞的方法。某些细胞表面分子，包括但不限于CD58和CD2、CD48和CD2和/或ICAM-1和LFA-1，相互作用以提供免疫细胞的适当细胞粘附和活化(Dustin,M.L.免疫突触(The immunological synapse)，《癌症免疫学研究(Cancer Immunol Res)》.2014年11月；2(11):1023-33)。此外，CD58的损失已经与肿瘤细胞对T细胞介导的杀伤和免疫逃避的抗性相关联(Frangieh,C.J.等人，患者模型中的多模态混合Perturb-CITE测序筛选定义了癌症免疫逃避的机制(Multimodal pooled Perturb-CITE-seq screens in patient models define mechanisms of cancer immuneevasion).《自然-遗传学(Nat Genet)》.2021年3月；53(3):332-341，2021年3月1日电子出版；Challa-Malladi,M.等人，β2微球蛋白和CD58的联合基因失活揭弥漫性大B细胞淋巴瘤中免疫识别的频繁逃逸(Combined genetic inactivation ofβ2-Microglobulin andCD58reveals frequent escape from immune recognition in diffuse large B celllymphoma).《癌细胞(Cancer Cell)》.2011年12月13日；20(6):728-40，2011年12月1日电子出版)。例如，在HLA I类分子上呈递肿瘤相关抗原的B细胞淋巴瘤细胞可以被CD8 T细胞识别并随后杀伤(参见图1B上图-来自Challa-Malladi,M.等人的图8)。肿瘤细胞常常下调HLAI类的表达。然而，HLA I类是自然杀伤(NK)细胞抑制应答诸如KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)的配体，KIR转导信号以平衡来自受体诸如CD2的活化信号(参见，例如，Jaeger,B.N.,Vivier,E.，自然杀伤细胞耐受性：自我控制还是自体控制？(Natural Killer CellTolerance:Control by Self or Self-Control？)冷泉港生物学观点(Cold Spring HarbPerspect Biol).2012年3月；4(3):a007229–a007229)。因此，HLA I类的细胞表面表达的损失致使肿瘤细胞易受NK细胞杀伤，这是经由肿瘤细胞上表达的配体CD58活化CD2实现的(参见图1B中间图-来自Challa-Malladi,M.等人的图8)。HLA I类和CD58的同时损失可给予T细胞和NK细胞杀伤保护，从而导致肿瘤细胞的免疫逃避(参见图1B下图-来自Challa-Malladi,M.等人的图8)。在来自供体细胞群体的经工程化的细胞(例如，同种异体经工程化的免疫细胞，诸如CAR T细胞)中，某些细胞表面分子，例如CD58、CD48和ICAM-1的表达功能性降低(或不表达)是在将经工程化的细胞输注到患者(即不是供体细胞群体来源的个体)体内后减少宿主T细胞和NK细胞对经工程化的细胞的识别和后续杀伤的潜在方式。

本发明提供了编码在免疫突触处起作用的细胞表面分子的某些基因的功能性表达降低(或无功能性表达)的经工程化的细胞(例如，经工程化的免疫细胞，诸如CAR T细胞)，其中经工程化的细胞可以是施用给有需要的患者(即，移植物的宿主或接受者)的同种异体细胞移植物的一部分，其避免或能够避免受患者免疫细胞的排斥。产生某些基因的功能性表达降低(或不表达)的经工程化的细胞的修饰，例如基因编辑修饰，不需要蛋白质的外源表达，这是有利的。例如，由于基因递送载体(例如，用于递送CAR T和其他CAR T细胞增强物诸如细胞因子的载体)的容量有限，专注于将一个或多个外源基因引入经工程化的细胞的基因编辑方法可能具有挑战性。相反，本发明的公开内容包括在制造过程中，如本文所述使用基因编辑技术，例如CRISPR-Cas9、TALEN等修饰经工程化的细胞，以灭活或下调一个或多个编码细胞表面受体的基因(例如，CD48、CD58和ICAM-1中的一者或多者)的方法。如本文所述，此类修饰还可包括基因编辑，以下调或消除HLA分子中涉及的基因的表达。在另一个实施方案中，如本文所述，经工程化的细胞(例如，经工程化的免疫细胞，诸如CAR T细胞)还包含编码CD70结合蛋白的多核苷酸和/或功能性地表达CD70结合蛋白。

在本公开的一个其他方面，基因编辑靶标是CD48(也称为淋巴细胞活化分子2或SLAMF2)，一种与CD2相互作用以有助于T细胞和抗原呈递细胞之间免疫突触的形成的免疫球蛋白样受体。在其他方面，基因编辑靶标是CD58(也称为淋巴细胞功能抗原3或LFA-3)，一种与其天然配体CD2相互作用，也有助于免疫突触的形成的的共刺激受体。在另一个方面，基因编辑靶标是细胞间粘附分子1或ICAM-1(也称为CD54)，其(i)是一种因其在稳定细胞-细胞相互作用中的作用而已知的细胞表面糖蛋白，(ii)在免疫细胞中表达，并且(iii)是白细胞上LFA-1受体的配体。

在本公开的一个其他方面，基因编辑靶标是与抗原加工相关的转运蛋白(TAP)的TAP2组分。MHC I类分子装载肽的主要通路是TAP依赖性的：蛋白酶体(或IFN-γ诱导型免疫蛋白酶体)产生的肽通过TAP输入到内质网(ER)并且然后装载在MHC I类上。少数肽——主要源自信号肽——在信号序列被ER信号肽肽酶(SPP)切割后，通过替代性TAP和蛋白酶体非依赖性通路装载。与β2m KO细胞中表面β2m的显著(10至100倍)减少相比，敲除TAP2适度减少表面β2m(KO细胞选择后减少2倍)(参见PCT/US2022/14393的图4A，其通过引用整体并入本文)。

在本公开的另一个方面，基因编辑粑粑可以是HLA-I和HLA-II分子转录调控中涉及的分子。HLA-I和HLA-II分子在转录水平上受到相似的关键顺式调控元件的严格调控：W/S、X1、X2和Y盒基序。调控因子X(RFX)杂合物由RFX5、RFXAP和RFXANK组成，并与X1盒结合。X2盒由CREB/ATF1家族转录因子占据，并且Y盒由NF-Y蛋白结合。另外，含有核苷酸结合结构域和富亮氨酸重复序列的受体(NLR)家族的两个成员NLRC5和CIITA是形成HLA增强体复合物以分别促进HLA-I和HLA-II转录所必需的。NLRC5和CIITA不直接与DNA结合，而是需要增强体的其他亚基的帮助才能对接(Meissner,T.B.等人，NLR家族成员NLRC5是MHC I类基因的转录调控因子(NLR family member NLRC5 is atranscriptional regulator of MHCclass I genes).《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》107,13794–13799(2010)；Meissner,T.B.等人，NLRC5与RFX转录因子复合物协同诱导MHC I类基因表达(NLRC5 Cooperates with the RFX Transcription Factor Complex To Induce MHCClass I Gene Expression).《免疫学杂志(J.Immunol.)》188,4951–4958(2012))。具体来说，NLRC5通过其锚蛋白重复序列与RFXANK缔合。

在一个实施方案中，基因编辑靶标是含有核苷酸结合结构域和富亮氨酸重复序列的受体(NLR)家族的成员，称为含NLR半胱天冬酶募集结构域的蛋白5(NLRC5)。CRISPR/Cas9介导的NLRC5敲除引起表面β2m水平的2.5倍降低(参见PCT/US2022/14393的图4B，其通过引用整体并入本文)。在另一个实施方案中，基因编辑靶标是RFX5，它与RFXAP和RFXANK/B一起是与X1盒基序缔合的RFX复合物的一部分，如本文所述。

本文所公开的基因编辑策略令人惊讶地充分减少了肽展示，从而减少了接受者的T细胞应答引起的细胞死亡，同时没有过多地减少肽展示，从而引起接受者的NK细胞的杀伤。因此，本文所提供的策略代表了同种异体CAR-T疗法和其它同种异体细胞疗法的显著进步。本文所提供的基因编辑策略赋予了另外的优势，即抑制MHC I类呈递的NLRC5敲除效应应当在存在或不存在IFN-γ的情况下发生。IFN-γ诱导的MHC I类上调依赖于NLRC5，这一发现支持了这一结论。

在本发明的一个其他方面，经工程化的细胞的基因编辑靶标可以是一个或多个编码一种或多种分子的基因，该一种或多种分子在与宿主或接受者免疫细胞的排斥相关的一种或多种细胞通路中具有作用，这些免疫细胞与不同于宿主的同种异体细胞产物表面上的T细胞和NK细胞表位决定簇具有反应性。在一个实施方案中，经工程化的细胞的基因编辑靶标可以是一个或多个编码以下物质的基因：i)已知在免疫突触的免疫细胞粘附和活化中起作用的细胞表面受体(例如，CD48、CD58和ICAM-1中的一者或多者)和/或ii)HLA-I和HLA-II分子的转录因子或调控因子(例如，RFX5、NLRC5、CIITA、RFXAP和RFXANK)。本文所述的产生一个或多个基因的表达降低或消除的经工程化的细胞的方法可仅专注于编码在免疫突触处具有作用的分子的基因，但也可以通过减少或消除编码主要作用是作为HLA-I和/或HLA-II分子的转录因子的分子的基因的表达补充。

通用技术

除非另有指示，否则本公开的实践将采用在本领域的技术范围内的分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。此类技术在以下文献中充分地解释，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》,第二版(Sambrook等人,1989)冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait,编辑,1984)；《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》,胡马纳出版社(Humana Press)；《细胞生物学：实验室手册(Cell Biology:A Laboratory Notebook)》(J.E.Cellis,编辑,1998)学术出版社(Academic Press)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney,编辑,1987)；《细胞和组织培养概论(Introduction to Cell and Tissue Culture)》(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)普莱纽姆出版社(Plenum Press)；《细胞和组织培养：实验室程序(Celland Tissue Culture:Laboratory Procedures)》(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell,编辑,1993-1998)约翰·威利父子出版公司(J.Wiley and Sons)；《酶学方法(Methods inEnzymology)》(学术出版社公司)；《实验免疫学手册(Handbook of ExperimentalImmunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell,编辑)；《哺乳动物细胞的基因转移载体(GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos,编辑,1987)；《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人,编辑,1987)；《PCR：聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》,(Mullis等人,编辑,1994)；《当代免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人,编辑,1991)；《精编分子生物学实验指南(Short Protocols in MolecularBiology)》(约翰威利父子出版公司,1999)；《免疫生物学(Immunobiology)》(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；《抗体(Antibodies)》(P.Finch,1997)：《抗体：实用方法(Antibodies:a practical approach)》(D.Catty.,编辑,IRL出版社(IRL Press),1988-1989)；《单克隆抗体：实用方法(Monoclonal antibodies:a practical approach)》(P.Shepherd和C.Dean,编辑,牛津大学出版社(Oxford University Press),2000)；《使用抗体：实验室手册(Using antibodies:a laboratory manual)》(E.Harlow和D.Lane(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),1999)；《抗体(The Antibodies)》(M.Zanetti和J.D.Capra,编辑,哈伍德学术出版社(Harwood Academic Publishers),1995)。例如，使用TALEN、CRISPR/Cas9和megaTAL核酸酶的基因编辑技术在本领域的技术范围内，并且在文献中充分地解释，如T.Gaj等人,《基因组编辑技术：原理和应用(Genome-EditingTechnologies:Principles and Applications)》,冷泉港生物学展望(Cold Spring HarbPerspect Biol)2016；8:a023754和其中的引文。

定义

如本文所使用的，“自体”意指从受试者获得的用于治疗所述受试者的细胞、细胞系或细胞群体。

如本文所用，“同种异体”意指不是从受试者获得而是从供体获得的用于治疗所述受试者的细胞或细胞群体。

如本文所用，术语“内源性”是指来自或产生自生物体、细胞、组织或系统内部的任何材料。

如本文所用，术语“外源性”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或产生的任何材料。

如本文所用，“免疫细胞”是指功能性地参与先天性和/或适应性免疫应答的启动和/或执行的具有造血来源的细胞。免疫细胞的实例包含T细胞，例如α/βT细胞和γ/δT细胞、调节性T(Treg)细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓源性吞噬细胞。

如本文所用，术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

如本文所使用的，“表达载体”是指包括重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括与要表达的核苷酸序列操作性地连接的表达控制序列。表达载体包括本领域已知的所有载体，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸的或包含在脂质体中的)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

如本文所述，本公开的经工程化的免疫细胞以降低的水平表达，例如功能性地表达CD48、CD58、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK中的一者或多者，并且任选地还包含另外的特征。例如，它们可以从通过本文所述的技术引入细胞中的编码抗原结合蛋白的外源核酸功能性地表达抗原结合蛋白。在一个实施方案中，本公开的经工程化的免疫细胞功能性地表达第一抗原结合蛋白例如CAR，和/或第二蛋白例如CD70结合蛋白。经工程化的细胞还可以包含减少或消除基因的功能性表达的基因组修饰，例如内源基因诸如TCRa和/或CD52处的突变，和/或它们可以从通过本文所述的技术引入细胞中的编码抗原结合蛋白的外源核酸表达一种或多种另外的蛋白质。如本文所描述，本公开的经工程化的免疫细胞可以源自细胞，例如从各种来源获得的免疫细胞，例如由所述细胞制备。

如本文所用，“功能性地表达”基因意指基因被表达，并且表达产生功能性基因最终产物。例如，如果基因编码蛋白质，那么如果所述基因的表达最终产生功能正常的蛋白质，则细胞功能性地表达所述基因。因此，例如，如果基因未被转录，或者基因的表达最终产生未经翻译的RNA，或者翻译仅产生非功能性蛋白质，例如蛋白质没有正确折叠或者没有被运输到其作用位点(例如，对于膜结合蛋白而言的膜)，则所述基因未被功能性地表达。功能性表达可以被直接(例如，通过测定基因产物本身)或间接(例如，通过测定基因产物的效果)测量。

如本文所用，“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的缔合，使得一个核酸序列的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时(即，编码序列在启动子的转录控制之下)，所述启动子与所述编码序列可操作地连接。

如本文所用，“表达控制序列”意指指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，如组成型或诱导型启动子或者增强子。表达控制序列与要转录的核酸序列可操作地连接。

“启动子”和“启动子序列”可互换使用，并且是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的DNA序列。通常，编码序列位于启动子序列的3'。本领域技术人员应理解，不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或响应于不同环境或生理条件的表达。

在本公开的任何载体中，载体任选地包括本文所公开的启动子。

“宿主细胞”包含可以是或已经是用于掺入多核苷酸插入物的载体的接受者的单个细胞或细胞培养物。宿主细胞包含单个宿主细胞的后代，并且由于自然、意外或有意突变，后代可能不一定与原始亲代细胞完全相同(在形态学上或在基因组DNA互补方面)。宿主细胞包含用本公开的多核苷酸在体内转染的细胞。

如本文所使用的术语“胞外配体结合结构域”是指能够结合配体的寡肽或多肽。优选地，所述结构域将能够与细胞表面分子相互作用。例如，可以选择胞外配体结合结构域以识别充当与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物的配体。术语“茎结构域”在本文中用于指起作用以将跨膜结构域连接到胞外配体结合结构域的任何寡肽或多肽。具体地，茎结构域被用于为胞外配体结合结构域提供更大的灵活性和可及性。

术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应子信号功能信号并指导细胞执行专门功能的蛋白质的一部分。

如本文所使用的“共刺激分子”是指T细胞上的与共刺激配体特异性结合的同源结合配偶体，从而介导细胞的共刺激应答，如但不限于增殖。共刺激分子包含但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。共刺激分子的实例包含CD27、CD28、CD8、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及与CD83特异性结合的配体等。

“共刺激配体”是指抗原呈递细胞上的分子，所述分子与T细胞上的同源共刺激信号分子特异性结合，从而提供了除了通过例如TCR/CD3复合物与装载有肽的MHC分子的结合所提供的初级信号外的信号，所述信号介导T细胞应答，包含但不限于增殖激活、分化等。共刺激配体可以包含但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1 CB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、与Toll配体受体结合的激动剂或抗体以及与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体还特别涵盖与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的抗体，如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体。

“抗体”是能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点来与靶标(如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)特异性结合的免疫球蛋白分子。如本文所使用的，所述术语不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，还涵盖其抗原结合片段(如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv)，以及包括抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰的构型，例如包含但不限于单链(scFv)和结构域抗体(例如包含鲨鱼和骆驼抗体)，以及包括抗体的融合蛋白。抗体包含任何类别的抗体，如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不需要具有任何特定类别。免疫球蛋白根据其重链的恒定区的抗体氨基酸序列，可以被分配为不同类别。有五种主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的若干种可以被进一步划分为亚类(同种型)，例如，lgG1、lgG2、lgG3、lgG4、lgA1和lgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单元结构和三维构型是众所周知的。

如本文所使用的术语抗体的“抗原结合片段”或“抗原结合部分”是指保留与给定抗原特异性结合的能力的完整抗体的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可以通过完整抗体的片段来执行。术语抗体的“抗原结合片段”中涵盖的结合片段的实例包含Fab；Fab'；F(ab')2；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；单个结构域抗体(dAb)片段(参见例如，Ward等人,《自然(Nature)》341:544-546,1989)以及单独的互补决定区(CDR)。

与靶标“特异性结合”的抗体、抗体缀合物或多肽是本领域中所熟知的术语，并且确定此类特异性结合的方法也是本领域中所众所周知的。如果与替代细胞或物质相比，分子与特定细胞或物质发生反应或缔合更频繁、更快速、持续时间更长和/或具有更大的亲和力，则所述分子被称为表现出“特异性结合”。如果抗体以比其结合至其它物质更大的亲和力、亲合力、更容易地和/或以更长的持续时间结合靶标，则所述抗体“特异性结合”至靶标。通过阅读此定义还应理解，例如，与第一靶标特异性结合的抗体(或部分或表位)可以或可以不与第二靶标特异性结合。因此，“特异性结合”并不一定需要(尽管其可以包括)排他性结合。

抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，单独的或组合的。如本领域中已知的，重链和轻链的可变区各自由通过三个互补决定区(CDR)(也被称为高变区)连接的四个框架区(FR)组成。每条链中的CDR通过FR紧密结合在一起，并且与另一条链中的CDR一起有助于形成抗体的抗原结合位点。存在若干种用于确定CDR的技术，例如基于跨物种序列可变性的方法(即，Kabat等人《具有免疫学意义的蛋白质的序列(Sequences ofProteins of Immunological Interest)》,(第5版,1991,马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(National Institutes of Health,Bethesda,MD)))；基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(an approach based on crystallographic studies of antigen-antibodycomplexes)(Al-lazikani等人,1997,《分子生物学杂志(J.Molec.Biol.)》273:927-948)，Chothia系统(即，Chothia和Lesk,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》(1987)196(4):901-917)。如本文所用，CDR可以指通过任一方法或通过两种方法的组合所定义的CDR。

可变结构域的“CDR”是可变区内的氨基酸残基，其根据Kabat、Chothia的定义、Kabat和Chothia两者的积累、AbM、接触和/或构象定义或本领域众所周知的任何CDR确定方法来鉴定。抗体CDR可以被鉴定为最初由Kabat等人定义的高变区。参见例如Kabat等人,1992,《具有免疫学意义的蛋白质序列》,第5版,华盛顿特区的国立卫生研究院公共卫生局(Public Health Service,NIH,Washington D.C.)。CDR的位置也可以被鉴定为Chothia等人最初描述的结构环结构。参见例如，Chothia等人,《自然》342:877-883,1989。CDR鉴定的其它方法包含“AbM定义”，所述定义是Kabat与Chothia之间的折衷方案，并且使用牛津分子(Oxford Molecular)的AbM抗体建模软件(现为)衍生，或者基于观察到的抗原接触的CDR的“接触定义”，所述定义在MacCallum等人,《分子生物学杂志》,262:732-745,1996中阐述。在本文中被称为CDR的“构象定义”的另一种方法中，CDR的位置可以被鉴定为对抗原结合做出焓贡献(enthalpic contribution)的残基。参见例如，Makabe等人,《生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)》,283:1 156-1 166,2008。其它CDR边界定义仍可能不严格遵循上述方法中的一种，但尽管如此将与Kabat CDR的至少一部分重叠，但是鉴于特定残基或残基组或甚至整体CDR不显著影响抗原结合的预测或实验发现，所述边界定义可以被缩短或加长。如本文所用，CDR可以指通过本领域已知的任何方法，包含方法的组合所定义的CDR。本文所使用的方法可以利用根据这些方法中的任一种方法所定义的CDR。对于含有多于一个CDR的任何给定实施方案，可以根据Kabat、Chothia、延伸、AbM、接触、AHo和/或构象定义中的任何一者来定义CDR。

本公开的抗体可以使用本领域众所周知的技术产生，例如重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或此类技术的组合或本领域熟知的其它技术(参见例如Jayasena,S.D.,《临床化学(Clin.Chem.)》,45:1628-50,1999以及Fellouse,F.A.等人,《分子生物学杂志》,373(4):924-40,2007)。

如本领域已知的，如在本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸链，并且包含DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物或可以通过DNA或RNA聚合酶并入到链中的任何底物。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸，如经甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在，则可以在组装链之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，如通过与标记组分结合。其它类型的修饰包含例如“封端”、用以下取代天然存在的核苷酸中的一种或多种：类似物；核苷酸间修饰，如具有不带电的键(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)和具有带电的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些核苷酸间修饰、含有侧基部分，如蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)的那些核苷酸间修饰、具有嵌入剂(例如，吖啶(acridine)、补骨脂素(psoralen)等)的那些核苷酸间修饰、含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些核苷酸间修饰、含有烷基化剂的那些核苷酸间修饰、具有经修饰的键(例如，α异头核酸等)的那些核苷酸间修饰以及多核苷酸的未经修饰的形式。此外，通常存在于糖中的任何羟基可以例如被膦酸酯基、磷酸酯基替换，被标准保护基团保护或者被活化以制备相对于另外的核苷酸的另外的键，或者可以缀合到固相载体。5'和3'末端OH可以用具有1至20个碳原子的胺或有机封端基团部分磷酸化或取代。其它羟基也可以衍生成标准保护基团。多核苷酸还可以含有本领域中通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包含例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟基-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α异头糖或β异头糖、差向异构糖(如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、哌喃醣、呋喃糖、景天庚酮糖、非环状类似物和无碱基核苷类似物(如甲基核糖苷)。一个或多个磷酸二酯键可以被可替代的连接基团替换。这些可替代的连接基团包含但不限于其中磷酸盐被P(O)S(“硫代化物”)、P(S)S(“二硫代化物”)、(O)NR2(“酰胺化物”、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲缩醛化物”)替代的实施方案，其中每个R或R'独立地为H或任选地含有醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基的经取代的或未经取代的烷基(1-20个C)。多核苷酸中的所有键并非都需要是相同的。上述描述适用于本文中所提及的所有多核苷酸，包含RNA和DNA。

如本文所用，“转染”指细胞摄取外源性或异源性RNA或DNA。当外源性或异源性RNA或DNA已被引入细胞内时，细胞已被此类RNA或DNA“转染”。当经转染的RNA或DNA影响表型变化时，细胞已被外源性或异源性RNA或DNA“转化”。转化RNA或DNA可以被整合(共价连接)到构成细胞的基因组的染色体DNA中。

如本文所用，“转化”是指将核酸片段转移到宿主生物体的基因组中，从而使得基因稳定遗传。含有经转化的核酸片段的宿主生物体被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。

如本文所用，“基本上纯的”是指至少50％纯(即，不含污染物)、更优选地至少90％纯、更优选地至少95％纯、又更优选地至少98％纯以及最优选地至少99％纯的材料。如本文关于抗体所使用的术语“竞争”意指第一抗体或其抗原结合片段(或部分)以与第二抗体或其抗原结合部分的结合十分类似的方式与表位结合，使得与在不存在第二抗体的情况下第一抗体的结合相比，在存在第二抗体的情况下第一抗体与其同源表位的结合结果可检测地降低。替代方案，其中第二抗体与其表位的结合在存在第一抗体的情况下也可检测地降低，可以但不一定是这种情况。也就是说，第一抗体可以抑制第二抗体与其表位的结合，而第二抗体不抑制第一抗体与其相应表位的结合。然而，在每种抗体可检测地抑制其它抗体与其同源表位或配体的结合的情况下，无论是在相同、更大还是更小的程度上，所述抗体被认为彼此“交叉竞争”以与其相应的表位结合。本公开涵盖竞争抗体和交叉竞争抗体。无论此类竞争或交叉竞争发生的机制如何(例如，空间位阻、构象变化或与共同表位或其部分的结合)，技术人员将理解，基于本文所提供的教导，此类竞争和/或交叉竞争抗体被涵盖在内并且可以用于本文所公开的方法。

如本文所用，“治疗”是用于获得有益或期望的临床结果的方法。出于本公开的目的，有益或期望的临床结果包含但不限于以下中的一项或多项：减少(或破坏)肿瘤或癌细胞的增殖，抑制肿瘤细胞的转移，缩小或减小肿瘤的大小，缓解疾病(例如癌症)，减轻由疾病(例如，癌症)引起的症状，提高患有疾病(例如，癌症)的人的生活质量，减少治疗疾病(例如，癌症)所需的其它药物的剂量，延缓疾病(例如，癌症)的进展、治愈疾病(例如，癌症)和/或延长患有疾病(例如，癌症)的受试者的生存期。

“改善”是指与未施用治疗相比，一种或多种症状的减轻或改善。“改善”还包含症状持续时间的缩短或减少。如本文所用，药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是足以实现任何一种或多种有益或期望结果的量。对于预防用途，有益或期望的结果包括消除或降低疾病(包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、疾病的并发症和疾病发展期间出现的中间病理表型)的风险、减轻其严重性或延迟其发作。对于治疗性用途，有益或期望的结果包含临床结果，如各种疾病或病症(如癌症)的一种或多种症状的发生率降低或改善，减少治疗疾病所需的其它药物的剂量，增强另一种药物的效果和/或延迟疾病的进展。有效剂量可以一次或多次施用进行施用。出于本公开的目的，有效剂量的药物、化合物或药物组合物是足以直接或间接完成预防性或治疗性治疗的量。正如在临床背景下所理解的，有效剂量的药物、化合物或药物组合物可能会或可能不会与另一种药物、化合物或药物组合物联合实现。因此，在施用一种或多种治疗剂的背景下可以考虑“有效剂量”，并且如果结合一种或多种其它药剂可以实现或实现期望的结果，则可以考虑将单个药剂以有效量给予。

如本文所用，“受试者”是任何哺乳动物，例如人或猴子。哺乳动物包含但不限于农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。在示例性实施方案中，受试者是人。在示例性实施方案中，受试者是猴子，例如食蟹猴。

如本文所用，“载体”意指能够在宿主细胞中递送并且优选地表达一个或多个所关注的基因或序列的构建体。载体的实例包含但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞，如生产细胞。

如本文所用，“药学上可接受的载剂”或“药学上可接受的赋形剂”包含当与活性成分组合时允许所述成分保留生物活性并且与受试者的免疫系统无反应性的任何材料。实例包含但不限于任何标准药物载剂，如磷酸盐缓冲盐溶液、水、如油/水乳液等乳液以及各种类型的润湿剂。用于气溶胶或肠胃外施用的优选的稀释剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或生理(0.9％)盐水。包括此类载剂的本公开的组合物通过众所周知的常规方法调配(参见例如，《雷明顿氏药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)》,第18版,A.Gennaro编辑,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Publishing Co.,Easton,PA),1990；以及《雷明顿药学科学与实践(Remington,The Science and Practice of Pharmacy)》第21版马克出版公司,2005)。

如本文所用，“同种异体反应性”指T细胞识别胸腺发育期间未遇到的MHC复合物的能力。同种异体反应性在临床上表现为宿主抗移植物排斥和移植物抗宿主病。

本文中对“约”某个值或参数的提及包含(并且描述)指向所述值或参数本身加或减1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％的实施方案。例如，提及“约X”的描述包含“X”的描述。数字范围包括定义所述范围的数字。

应理解的是，当在本文中无论何处用语言“包括”来描述实施方案时，还提供了根据“由…组成”和/或“主要由…组成”描述的在其它方面类似实施方案。

在根据马库什(Markush)组或其它替代方案分组来描述本公开的方面或实施方案的情况下，本公开不仅涵盖整体列出的整个组，而且还涵盖所述组的单独的每个成员和主组的所有可能子组，也涵盖缺少组成员中的一个或多个组成员的主组。本公开还设想明确地排除所公开和/或所要求保护的实施方案中的组成员中的任何组成员中的一者或多者。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在发生冲突的情况下，以本说明书(包含定义)为准。贯穿本说明书和权利要求书，词语“包括(comprise)”或如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”等变体应当被理解为暗示包含所陈述整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。除非上下文另外要求，否则单数术语应包含复数并且复数术语应包含单数。

本文描述了示例性方法和材料，但是与本文所描述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料也可以用于本公开的实践或测试。所述材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在是限制性的。

“抗原结合蛋白”包括一个或多个抗原结合结构域。如本文所使用的“抗原结合结构域”意指结合指定靶抗原的任何多肽。在一些实施方案中，抗原结合结构域与肿瘤细胞上的抗原结合。在一些实施方案中，抗原结合结构域与涉及过度增殖性疾病或涉及病毒或细菌抗原的细胞上的抗原结合。

抗原结合结构域包含但不限于作为免疫功能片段的抗体结合区。抗原结合结构域的术语“免疫功能片段”(或“片段”)是抗原结合结构域的物种，所述抗原结合结构域的物种包括缺少全长链中存在的氨基酸中的至少一些，但仍能够与靶抗原特异性结合的抗体的一部分(无论如何获得或合成所述部分)。此类片段具有生物活性，因为所述片段与靶抗原结合，并且可以与包含完整抗体的其它抗原结合结构域竞争与给定表位结合。

免疫功能性免疫球蛋白片段包含但不限于scFv片段、Fab片段(Fab'、F(ab')2等)、一个或多个互补决定区(“CDR”)、双抗体(重链可变结构域与轻链可变结构域位于同一多肽上，通过太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对的短肽接头连接)、结构域抗体、二价抗原结合结构域(包括两个抗原结合位点)、多特异性抗原结合结构域以及单链抗体。这些片段可以源自任何哺乳动物来源，包含但不限于人、小鼠、大鼠、骆驼或兔。如所属领域的技术人员将了解，抗原结合结构域可以包含非蛋白质组分。

可变区通常展现由3个高变区(CDR)接合的相对保守框架区(FR)的相同通式结构。来自每对的两条链的CDR通常由框架区比对，所述框架区可以与特定表位结合。从N末端到C末端，轻链可变区和重链可变区两者通常均包括结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。按照惯例，重链中的CDR区通常被称为HC CDR1、CDR2和CDR3。轻链中的CDR区通常被称为LC CDR1、CDR2和CDR3。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包括存在于抗体的全长轻链或重链中的一个或多个互补结合区(CDR)，并且在一些实施方案中包括单个重链和/或轻链或其部分。这些片段可以通过重组DNA技术产生或可以通过抗原结合结构域(包含完整抗体)的酶或化学裂解产生。

在一些实施方案中，抗原结合结构域是抗体或其片段，包含其互补决定区(CDR)中的一个或多个。在一些实施方案中，抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)，包括轻链CDR：CDR1、CDR2和CDR3，以及重链CDR：CDR1、CDR2和CDR3。

将氨基酸分配到框架、CDR和可变结构域中的每一个通常是根据以下编号方案进行的：Kabat编号(参见例如，Kabat等人《具有免疫学意义的蛋白质的序列》,第5版,NIH公开号91-3242,马里兰州贝塞斯达1991)、Chothia编号(参见例如，Chothia和Lesk,(1987),《分子生物学杂志》196:901-917；Al-Lazikani等人,(1997)《分子生物学杂志》273:927-948；Chothia等人,(1992)《分子生物学杂志》227:799-817；Tramontano等人,(1990)《分子生物学杂志》215(1):175-82；以及美国专利第7,709,226号)、接触编号、AbM方案(抗体建模程序，牛津分子公司(Oxford Molecular))或AHo系统(Honneger和Pluckthun,《分子生物学杂志》(2001)309(3):657-70)。

在一些实施方案中，抗原结合结构域是重组抗原受体。如本文所使用的术语“重组抗原受体”泛指非天然存在的表面受体，其包含胞外抗原结合结构域或胞外配体结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域。在一些实施方案中，重组抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)。嵌合抗原受体(CAR)是本领域熟知的。CAR是包括抗原识别部分、跨膜结构域和T细胞活化结构域的融合蛋白(参见例如，Eshhar等人,《美国国家科学院院刊》,90(2):720-724(1993))。

在一些实施方案中，重组抗原受体的胞内结构域包括共刺激结构域和含ITAM的结构域。在一些实施方案中，重组抗原受体的细胞内结构域包括细胞内蛋白或其功能变体(例如，截短、插入、缺失或取代)。

如本文所使用的术语“胞外配体结合结构域”或“胞外抗原结合结构域”是指能够结合配体或抗原或能够与细胞表面分子，如配体或表面抗原相互作用的多肽。例如，可以选择胞外配体结合结构域或抗原结合结构域以识别充当与特定疾病状态(例如，肿瘤特异性抗原)相关的靶细胞上的细胞表面标志物的配体。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括抗体或抗体的抗原结合片段或抗原结合部分。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括Fv或scFv、Fab或scFab、F(ab')2或scF(ab')2、Fd、单体、亲和体、骆驼抗体、VHH抗体、单结构域抗体或darpin。在一些实施方案中，配体结合结构域包括结合对的配偶体，如与表面受体结合的配体、或与配体结合的表面受体的胞外域。

术语“茎结构域”或“铰链结构域”在本文中可互换使用以指起作用以将跨膜结构域与胞外配体结合结构域连接的任何多肽。具体地，茎结构域通常用于为胞外配体结合结构域提供更大的灵活性和可及性。

载体

用于施用多核苷酸组合物的表达载体和方法是本领域已知的，并在本文中进一步描述。

另一方面，本公开提供了一种制备本文所描述的多核苷酸中的任何一者的方法。

本公开还涵盖与任何此类序列互补的多核苷酸。多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链的，并且可以是DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包含含有内含子并以一对一方式对应于DNA分子的HnRNA分子，以及不含有内含子的mRNA分子。另外的编码或非编码序列可以但不必存在于本公开的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不必连接到其它分子和/或载体材料。

多核苷酸可以包括天然序列(即，编码抗体或其部分的内源性序列)，或者可以包括此类序列的变体。多核苷酸变体含有一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，使得经编码的多肽的免疫反应性相对于天然免疫反应性分子没有减弱。通常可以如本文所描述地评估对经编码的多肽的免疫反应性的效果。变体优选地表现出与编码天然抗体或其部分的多核苷酸序列至少约70％同一性，更优选地至少约80％同一性，又更优选地至少约90％同一性，以及最优选地至少约95％同一性。如果两个序列中的核苷酸或氨基酸的序列在如下文所述比对最大对应性时是相同的，则两个多核苷酸或多肽序列被称为“相同”。通常通过在比较窗口上比较序列来进行两个序列之间的比较，以鉴定和比较序列相似性的局部区。如本文所使用的“比较窗口”是指至少约20个、通常约30到约75个或约40到约50个连续位置的区段，其中在两个序列最佳比对后，序列可以与具有相同数量的连续位置的参考序列进行比较。

使用默认参数，可以使用Lasergene生物信息学软件套件(威斯康星州麦迪逊市DNASTAR公司)中的Megalign程序对序列进行最佳比对以进行比较。此程序体现了以下参考文献中所描述的若干比对方案：Dayhoff,M.O.,1978,“蛋白质中演化变化的模型-用于检测远距离关系的矩阵”Dayhoff,M.O.(编辑)《蛋白质序列和结构图谱》,华盛顿特区全国生物医学研究基金会第5卷,增刊3，第345-358页；Hein J.,1990《比对和发生学的统一方法(Unified Approach to Alignment and Phylogenes)》第626-645页《酶学方法(Methodsin Enzymology)》第183卷,加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社公司(Academic Press,Inc.,San Diego,CA)；Higgins,D.G.和Sharp,P.M.,1989,《计算机在生物科学中的应用(CABIOS)》5:151-153；Myers,E.W.和Muller W.,1988,《计算机在生物科学中的应用》4:11-17；Robinson,E.D.,1971,《组合理论(Comb.Theor.)》1 1:105；Santou,N.,Nes,M.,1987,《分子生物学进化(Mol.Biol.进化》4:406-425；Sneath,P.H.A.和Sokal,R.R.,1973,《数值分类法-数值分类法的原理与实践》,加利福尼亚州圣弗朗西斯市的弗里曼出版社；Wilbur,W.J.和Lipman,D.J.,1983,《美国国家科学院院刊》80:726-730。

在一些实施方案中，“序列同一性的百分比”通过在具有至少20个位置的比较窗口上比较两个最佳比对序列来确定，其中比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可以包括与参考序列(所述参考序列不包括添加或缺失)相比添加或缺失(即，空位)20百分比或更少、通常5至15百分比或10至12百分比以进行两个序列的最佳比对。百分比通过以下计算：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量，以得出匹配的位置的数量；将匹配的位置的数量除以参考序列(即窗口尺寸)中的位置的总数量；并且将结果乘以100，以得出序列同一性的百分比。

变体还可以或可替代地，与天然基因或其部分或补体基本上同源。此类多核苷酸变体能够在中等严格条件下与天然存在的编码天然抗体的DNA序列(或互补序列)杂交。

合适的“中等严格条件”包含在5倍SSC、0.5％ SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中预洗涤；在50℃-65℃、5倍SSC下杂交过夜；随后在65℃下用含0.1％ SDS的2倍、0.5倍和0.2倍SSC中的每一者洗涤两次持续20分钟。

如本文所用，“高度严格条件”或“高严格性条件”是指以下中的那些：(1)采用用于洗涤的低离子强度和高温，例如在50℃下0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠：(2)在42℃下在杂交期间采用变性剂，如甲酰胺，例如，pH 6.5下的具有0.1％牛血清白蛋白/0.1％聚蔗糖/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液的50％(v/v)甲酰胺与750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠；或(3)在42℃下采用50％甲酰胺、5倍SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5倍Denhardt溶液、经超声处理的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1％ SDS和10％硫酸葡聚糖，在42℃下在0.2倍SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中以及在55℃下在50％甲酰胺中洗涤，随后在55℃下进行由含有EDTA的0.1倍SSC组成的高严格性洗涤。技术人员将认识到如何根据需要调节温度、离子强度等以适应如探针长度等因素。

本领域的普通技术人员应理解，由于遗传密码的简并性，存在编码如本文所述的多肽的许多核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。然而，本公开具体考虑了由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸。进一步地，包括本文所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本公开的范围内。等位基因是由于核苷酸的一个或多个突变，如缺失、添加和/或取代而改变的内源性基因。所得mRNA和蛋白质可能但不必具有改变的结构或功能。可以使用标准技术(如杂交、扩增和/或数据库序列比较)来识别等位基因。

可以使用化学合成、重组方法或PCR来获得本公开的多核苷酸。化学多核苷酸合成的方法是本领域众所周知的并且不需要在本文中详细描述。本领域技术人员可以使用本文所提供的序列和商业DNA合成仪来产生期望的DNA序列。

为了使用重组方法制备多核苷酸，可以将包括期望的序列的多核苷酸插入到合适的载体中，并且进而可以将所述载体引入到合适的宿主细胞中用于复制和扩增，如本文进一步描述的。可以通过本领域已知的任何方式将多核苷酸插入到宿主细胞中。通过直接摄取、胞吞作用、转染、F-交配或电穿孔引入外源性多核苷酸来转化细胞。一旦引入，外源性多核苷酸可以作为非整合载体(如质粒)维持在细胞内或整合到宿主细胞基因组中。如此扩增的多核苷酸可以通过本领域众所周知的方法从宿主细胞中分离出来。参见例如，Sambrook等人,1989。

可替代地，PCR允许复制DNA序列。PCR技术在本领域中是众所周知的并且描述于例如美国专利第4,683,195号、第4,800,159号、第4,754,065号和第4,683,202号以及《PCR：聚合酶链反应》,Mullis等人编辑,波士顿的博克豪斯出版社(Birkauswer Press,Boston),1994。

可以通过在合适的载体中使用分离的DNA并且将其插入到合适的宿主细胞来获得RNA。当细胞复制并且DNA转录到RNA中时，然后可以使用本领域技术人员众所周知的方法分离RNA，例如，如Sambrook等人,1989，同上所述。

合适的克隆载体可以根据标准技术构建或可以选自本领域可用的大量克隆载体。虽然选择的克隆载体可能会根据要使用的宿主细胞而有所不同，但有用的克隆载体通常将具有自我复制的能力，可以具有针对特定限制性核酸内切酶的单一靶标和/或可以携带可以用于选择含有载体的克隆的标志物的基因。合适的实例包含质粒和细菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如，pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA以及穿梭载体，如pSA3和pAT28。这些和许多其它克隆载体可从商业供应商处获得，如伯乐公司(BioRad)、Strategene公司(Strategene)和英杰公司(Invitrogen)。

表达载体通常是含有根据本公开的多核苷酸的可复制多核苷酸构建体。这意味着表达载体必须在宿主细胞中作为附加体或作为染色体DNA的组成部分是可复制的。合适的表达载体包含但不限于质粒、病毒载体，包含腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、粘粒和PCT公开第WO 87/04462号中所公开的表达载体。载体组分通常可以包含但不限于以下中的一者或多者：信号序列；复制起点；一种或多种标志物基因；合适的转录控制元件(如启动子、增强子和终止子)。对于表达(即，翻译)，通常还需要一种或多种翻译控制元件，如核糖体结合位点、翻译起始位点和终止密码子。

含有所关注的多核苷酸的载体可以通过多种适当方式中的任何方式被引入到宿主细胞中，所述适当方法包含电穿孔；采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质进行转染；微粒轰击；脂质转染；以及感染(例如，其中载体是如牛痘病毒等感染原)。引入载体或多核苷酸的选择通常将取决于宿主细胞的特征。

编码抗原结合蛋白(例如，CAR)的多核苷酸可以存在于表达盒或表达载体(例如，用于引入细菌宿主细胞的质粒、或用于转染昆虫宿主细胞的病毒载体诸如杆状病毒载体、或用于转染哺乳动物宿主细胞的质粒或病毒载体诸如慢病毒)中。在一些实施方案中，多核苷酸或载体可以包含编码核糖体跳跃序列的核酸序列，如但不限于编码2A肽的序列。在由密码子编码的两个氨基酸之间没有形成肽键的情况下，在小核糖核酸病毒的口疮病毒亚群中鉴定的2A肽使核糖体从一个密码子“跳跃”到下一个密码子(参见例如，Donnelly和Elliott 2001；Atkins,Wills等人2007；Doronina,Wu等人2008)。“密码子”意指mRNA上(或DNA分子的有义链上)的三个核苷酸，所述核苷酸被核糖体翻译成一个氨基酸残基。因此，当多肽被框内的2A寡肽序列分开时，两个多肽可以从mRNA内的单个连续开放阅读框合成。此类核糖体跳跃机制在本领域中是众所周知的，并且已知被若干种载体用于表达由单个信使RNA编码的若干种蛋白质。

为了将跨膜多肽引导到宿主细胞的分泌途径中，在一些实施方案中，在多核苷酸序列或载体序列中提供分泌信号序列(也称为前导序列、前原序列或前序列)。分泌信号序列与跨膜核酸序列可操作地连接，即，这两个序列在正确的阅读框中被连接并且被定位以将新合成的多肽引导到宿主细胞的分泌途径中。分泌信号序列通常定位于编码所关注的多肽的核酸序列的5'，但是某些分泌信号序列可能定位于所关注的核酸序列的其它地方(参见例如，Welch等人,美国专利第5,037,743号；Holland等人,美国专利第5,143,830号)。本领域技术人员将认识到，鉴于遗传密码的简并性，在这些多核苷酸分子中可能存在相当大的序列变异。在一些实施方案中，本公开的核酸序列针对在哺乳动物细胞中的表达，优选地针对在人细胞中的表达进行了密码子优化。密码子优化是指在所关注的序列中，将给定物种的高表达基因中通常罕见的密码子与此类物种的高表达基因中通常常见的密码子进行交换，编码相同氨基酸的此类密码子作为正在被交换的密码子。

制备经工程化的细胞的方法

本文提供了制备用于免疫疗法的经工程化的细胞，例如经工程化的免疫细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将抗原结合蛋白(例如，CAR)引入一种或多种免疫细胞中，或引入编码抗原结合蛋白(例如，CAR)的多核苷酸，并扩增细胞。在一些实施方案中，本公开涉及一种工程化免疫细胞的方法，该方法包括：提供免疫细胞，以及在细胞表面表达至少一种抗原结合蛋白(例如，CAR)。在一些实施方案中，该方法包括：用至少一种编码抗原结合蛋白(例如，CAR)的多核苷酸转染细胞，并且在细胞中表达该至少一种多核苷酸。

在一些实施方案中，编码抗原结合蛋白(例如，CAR)的多核苷酸存在于一个或多个表达载体中，用于在细胞中稳定表达。在一些实施方案中，多核苷酸存在于病毒载体中，以在细胞中稳定表达。在一些实施方案中，病毒载体可以是例如慢病毒载体或腺病毒载体。

在一些实施方案中，编码根据本公开的多肽的多核苷酸可以是例如通过电穿孔被直接引入到细胞中的mRNA。在一些实施方案中，CytoPulse技术可以用于瞬时透化活细胞以将材料递送到细胞中。可以修改参数以确定高转染效率和最低死亡率的条件。

本文还提供了转染免疫细胞(例如T细胞)的方法。通常，可以使用本领域普通技术人员已知的任何常规方法，如通过电穿孔将RNA、DNA或蛋白质中的任何一者引入到细胞中。参见例如，Luft和Ketteler,《生物分子筛选杂志(J.Biomolec Screening)》20(8):932(2015)(DOI:10.1177/1087057115579638)。在一些实施方案中，所述方法包括：使T细胞与RNA接触以及向T细胞施加敏捷脉冲序列，所述敏捷脉冲序列由以下组成：(a)电压范围为每厘米约2250至3000V的电脉冲；(b)0.1ms的脉冲宽度；(c)步骤(a)和(b)的电脉冲之间约0.2至10ms的脉冲间隔；(d)电压范围为每厘米约2250至3000V的电脉冲，以及约100ms的脉冲宽度和步骤(b)的电脉冲与步骤(c)的第一电脉冲之间约100ms的脉冲间隔；以及(e)电压为约325V的四个电脉冲，以及约0.2ms的脉冲宽度和4个电脉冲中的每个电脉冲之间2ms的脉冲间隔。在一些实施方案中，一种转染T细胞的方法包括使所述T细胞与RNA接触以及向T细胞施加敏捷脉冲序列，所述敏捷脉冲序列包括：(a)电压为每厘米约1600、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000V的电脉冲；(b)0.1ms的脉冲宽度；(c)以及步骤(a)和(b)的电脉冲之间约0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10ms的脉冲间隔；(d)电压范围为每厘米约2250至3000V，例如每厘米2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000V的一个电脉冲，以及100ms的脉冲宽度和步骤(b)的电脉冲与步骤(c)的第一电脉冲之间100ms的脉冲间隔；以及(e)电压为约325V的4个电脉冲，以及约0.2ms的脉冲宽度和4个电脉冲中的每个电脉冲之间约2ms的脉冲间隔。在本申请中公开了包含在上文所描述的值范围内的任何值。电穿孔介质可以是本领域已知的任何合适的介质。在一些实施方案中，电穿孔介质的电导率范围为约0.01至约1.0毫西门子。

在一些实施方案中，所述方法还可以包括以下步骤：通过使表达例如但不限于TAP2、NLRC5、β2m、CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK、TCR的组分、免疫抑制剂的靶标、HLA基因和/或免疫检查点蛋白(如例如PDCD1或CTLA-4)的至少一个基因灭活或降低所述至少一个基因的表达水平来对细胞进行基因工程化。使基因灭活旨在使所关注的基因不以功能性蛋白质形式表达。在一些实施方案中，待灭活的基因是选自由以下组成的组的基因中的一者或多者，例如但不限于NLRC5、TAP2、TCRα、TCRβ、β2-微球蛋白(“β2m”或β2m)、CD52、CIITA、RFX5、RFXAP、RFXANK、GR、脱氧胞苷激酶(DCK)、PD-1和CTLA-4。在一些实施方案中，所述方法包括通过将能够通过选择性DNA切割来选择性灭活基因的稀切核酸内切酶引入细胞来使一个或多个基因灭活或降低其表达水平。在一些实施方案中，稀切核酸内切酶可以是例如转录活化因子样效应子核酸酶(TALE-核酸酶或)、megaTAL核酸酶或Cas9核酸内切酶。

在另一个方面，对免疫细胞(例如T细胞)进行基因修饰或工程化的步骤可以包括：通过使表达免疫抑制剂靶标的至少一个基因失活来修饰免疫细胞(例如T细胞)，和任选地在免疫抑制剂的存在下扩增细胞。免疫抑制剂是通过若干种作用机制中的一种抑制免疫功能的药剂。免疫抑制剂可以降低免疫应答的程度和/或强度。免疫抑制剂的非限制性实例包含钙调神经磷酸酶抑制剂、雷帕霉素(rapamycin)靶标、白细胞介素-2α-链阻断剂、肌苷单磷酸脱氢酶抑制剂、二氢叶酸还原酶抑制剂、皮质类固醇和免疫抑制性抗代谢物。一些细胞毒性免疫抑制剂通过抑制DNA合成起作用。其它细胞毒性免疫抑制剂可以通过活化T细胞或通过抑制辅助细胞的活化来起作用。根据本公开的方法允许通过使T细胞中的免疫抑制剂的靶标灭活来赋予例如T细胞免疫抑制抗性以进行免疫疗法。作为非限制性实例，免疫抑制剂的靶标可以是免疫抑制剂的受体，如但不限于CD52、糖皮质激素受体(GR)、FKBP家族基因成员和亲环蛋白家族基因成员。

本文提供了用于表达抗原结合蛋白(例如，CAR)和/或CD70结合蛋白(如本文所述)以及下调CD48、CD58、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、RFX5、RFXAP、CIITA和RFXANK中的一者或多者的功能性表达的组合物和方法。在其他实施方案中，功能性表达的下调是(i)NLRC5和RFX5中的一者或两者，和(ii)CD58、CD48和ICAM-1中的一者或多者。在另一个实施方案中，功能性表达的下调是NLRC5和CD58两者，RFX5和CD58两者，RFX5和CD48两者，NLRC5和CD48两者，RFX5和ICAM-1两者，或NLRC5和ICAM-1两者。在另一个实施方案中，功能性表达的下调仅是CD48、CD58和ICAM-1中的一者。在另一个实施方案中，功能性表达的下调是(i)CD58、NLRC5和RFX5，(ii)CD48、NLRC5和RFX5，(iii)ICAM-1、NLRC5和RFX5，(iv)CD58、ICAM-1和RFX5，(v)CD48、ICAM-1和RFX5，(vi)CD58、CD48和RFX5，(vii)CD58、ICAM-1和NLRC5，(viii)CD48、ICAM-1和NLRC5，或(ix)CD58、CD48和NLRC5。还提供了此类组合物用于改善免疫细胞(例如T细胞，诸如CAR-T细胞)的功能活性的用途和用于改善免疫细胞(例如T细胞，诸如CAR-T细胞)的功能活性的方法。本文所提供的方法和组合物可用于改善经工程化的免疫细胞(例如，经工程化的T细胞，诸如CAR-T细胞)的体内持久性和治疗功效。

经工程化的细胞

经工程化的细胞，诸如经工程化的免疫细胞，例如本文提供的经工程化的T细胞可表达抗原结合蛋白，例如嵌合抗原受体(CAR)，和/或CD70结合蛋白，并以不大于未经工程化的免疫细胞中表达水平的75％、不大于50％、不大于25％或不大于10％的水平表达CD48、CD58、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK中的任何一者或多者。有利地，相对于未经工程化的细胞，本文所提供的经工程化的免疫细胞表现出改善的体内持久性和/或增加的对接受者的免疫系统的排斥的抗性。

在一些实施方案中，经工程化的细胞，例如经工程化的免疫细胞包含CAR群体，每个CAR包含不同的细胞外抗原结合结构域。在一些实施方案中，经工程化的细胞，例如经工程化的免疫细胞包含CAR群体，每个CAR包含相同的细胞外抗原结合结构域。

在一个实施方案中，经工程化的细胞，例如经工程化的免疫细胞，是T细胞(例如发炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节T淋巴细胞(Treg)、辅助T淋巴细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))、自然杀伤T细胞(NKT)、TCR表达细胞、树突状细胞、杀伤树突状细胞、肥大细胞或B细胞。在一些实施方案中，经工程化的细胞，例如经工程化的免疫细胞，可以源自CD4+T淋巴细胞或CD8+T淋巴细胞。在另一个实施方案中，经工程化的细胞可以源自含有CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的T淋巴细胞群体。在一些示范性实施方案中，经工程化的免疫细胞为T细胞。在一些示范性实施方案中，经工程化的免疫细胞为为γδT细胞。在一些示范性实施方案中，经工程化的免疫细胞为巨噬细胞。在一些示范性实施方案中，经工程化的免疫细胞为自然杀伤(NK)细胞。

在一些实施方案中，经工程化的细胞，例如经工程化的免疫细胞可以源自，例如但不限于，干细胞。干细胞可以是成体干细胞、非人胚胎干细胞，更具体地非人干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。

在一些实施例中，经工程化的细胞，例如经工程化的免疫细胞获自外周血或从外周血制备。在一些实施方案中，经工程化的细胞获自外周血单核细胞(PBMC)或由其制备。在一些实施方案中，经工程化的细胞获自骨髓或由其制备。在一些实施方案中，经工程化的细胞获自脐血或由其制备。在一些实施方案中，细胞是人类细胞。代表性的人细胞是CD34+细胞。

在一些实施方案中，使用选自由以下各项组成的组的方法通过核酸载体来转染或转导细胞：电穿孔、声孔效应、生物射弹(例如，基因枪)、脂质转染、聚合物转染、纳米颗粒、病毒转染(例如，逆转录病毒、慢病毒、AAV)或聚合复合物(polyplex)。

能够表达异源DNA的任何免疫细胞都可以用于表达抗原结合蛋白，例如所关注的CAR的目的，并且进一步用于工程化以表达降低水平的CD48、CD58、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK中的一者或多者。

在一些实施方案中，本文提供的免疫细胞例如T细胞被进一步修饰，例如基因修饰，以相对于尚未经如此修饰的可比较的细胞以降低的水平表达CD48、CD58、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK中的一者或多者。例如，免疫细胞可以进行基因修饰，以敲除CD48、CD58、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK基因座中的一者或多者的全部或一部分，使得相应的功能蛋白不在细胞表面表达，例如通过使包含该基因座的完整编码序列的一部分或全部的基因组DNA和/或包含该基因座的转录控制元件和/或启动子和/或活化元件的基因组DNA缺失和/或通过引入防止产生功能蛋白的插入、缺失或取代。此外，免疫细胞可以进行基因修饰，以敲除以下基因座的全部或一部分

·NLRC5和CD58两者，RFX5和CD58两者，RFX5和CD48两者，NLRC5和CD48两者，RFX5和ICAM-1两者，或NLRC5和ICAM-1两者；

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；或

·(i)CD58、NLRC5和RFX5，(ii)CD48、NLRC5和RFX5，(iii)ICAM-1、NLRC5和RFX5，(iv)CD58、ICAM-1和RFX5，(v)CD48、ICAM-1和RFX5，(vi)CD58、CD48和RFX5，(vii)CD58、ICAM-1和NLRC5，(viii)CD48、ICAM-1和NLRC5，或(ix)CD58、CD48和NLRC5，

使得相应的功能蛋白不在细胞表面表达，例如通过使包含该基因座的完整编码序列的一部分或全部的基因组DNA和/或包含该基因座的转录控制元件和/或启动子和/或活化元件的基因组DNA缺失和/或通过引入防止产生功能蛋白的插入、缺失或取代。

在另一个实施方案中，经工程化的免疫细胞还包含编码CD70结合蛋白的多核苷酸和/或功能性地表达CD70结合蛋白。在一些实施方案中，本文提供的CD70结合蛋白包含细胞外结构域(例如，单链可变片段(scFv))和跨膜结构域。在一些实施方案中，本文提供的CD70结合蛋白包含细胞外配体结合结构域(例如，scFv)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述CD70结合蛋白包括一个或多个选自由以下组成的组的胞内信号传导结构域：CD3ζ信号传导结构域、CD3δ信号传导结构域、CD3γ信号传导结构域、CD3ε信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD2信号传导结构域、OX40信号传导结构域和4-1BB信号传导结构域或其变体。在另一个实施方案中，CD70结合蛋白包含细胞内信号传导结构域，其包含CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD70结合蛋白是CAR。

在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:1、7-14、17-70或89-90中一者或多者的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ IDNO:7、89、8、90、12、11、61、62、64或65中一者或多者的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD70结合蛋白包括CD3ζ或CD3γ信号传导结构域或其变体，并且不包括共刺激结构域。在一些实施方案中，所述CD70结合蛋白包括4-1BB信号传导结构域或其变体，并且不包括CD3信号传导结构域。在一些实施方案中，所述CD70结合蛋白包括4-1BB信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，所述CD70结合蛋白不包括胞内信号传导结构域。不同的胞内信号传导结构域或其组合可以赋予不同的信号传导强度，这可以有助于T细胞增殖、效力、存活率、持久性和/或对宿主免疫细胞排斥的抗性。本文描述了不包含至包含一个或多个细胞内信号传导结构域的CD70结合蛋白。在另一个实施方案中，CD70结合蛋白包含具有如SEQ ID NO:82或85所示的氨基酸序列的scFv。在另一个实施方案中，CD70结合蛋白包含如SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列。SEQ ID NO:1、7-14、17-70或89-90中任一者可以包含一个或多个取代、插入或缺失。这些序列可以含有5、4、3、2个或更少的取代、插入或缺失。包括此类取代、插入或缺失的多肽可以保持其活性。例如，细胞内信号传导结构域保持转导相关信号的能力，并且CD70结合蛋白保持特异性结合CD70的能力。

在一些实施方案中，已被工程化以功能性地表达降低水平(相对于尚未如此工程化的相应细胞)的本文所述的一种或多种靶标并已被进一步工程化以表达CD70结合蛋白的经工程化的免疫细胞可以表现出不同水平的持久性和/或对宿主免疫细胞排斥的抗性，并且当施用给患者时，可适用于体内淋巴细胞清除。在一些实施方案中，功能性地表达本文所述的CD70结合蛋白的经工程化的免疫细胞当施用给患者时可在不同程度上抑制宿主免疫细胞的增殖和/或活性，这可允许对体内淋巴细胞清除深度的微调。例如，在例如MLR测定中展示出长期的扩增和/或对宿主免疫细胞增殖或活性的抑制的功能性地表达CD70结合蛋白的经工程化的免疫细胞可用于长期淋巴细胞清除。相反，当期望不太完全或不太彻底的淋巴细胞清除时，可以使用在相同或相似的测定中展示出不太长期的扩增和/或对宿主免疫细胞的抑制的功能性地表达CD70结合蛋白的经工程化的免疫细胞。

在一个方面，相对于尚未经修饰的可比较的细胞，表达水平的降低可以是表达的敲除或敲低。不同的敲低方法可能是合适的，诸如采用各种基于RNA的技术中的任一种的那些方法(例如，短发夹RNA(shRNA)、反义RNA、微RNA(miRNA)、小(或短)干扰RNA(siRNA)；参见，例如，Van Hoeck等人，生物材料(Biomaterials)，第286卷，2022年7月，121510，ISSN0142-9612；Lam等人，《分子疗法-核酸(Mol.Ther.-Nucleic Acids)》4:e252(2015),doi:10.1038/mtna.2015.23；Sridharan和Gogtay，《英国临床药理学杂志(Brit.J.Clin.Pharmacol)》.82:659-72(2016)，以及Krause等人的美国专利第9556433号，其通过引用整体并入本文)。基于RNA的试剂，例如RNA干扰分子，可递送至细胞，例如免疫细胞，使得一个或多个基因被敲低。在一个实施方案中，基于RNA的试剂可以配置成靶向该一个或多个基因或者靶向该一个或多个基因。在一个其他实施方案中，RNA干扰分子包含RNA干扰序列，其包含与一个或多个靶基因互补的一个或多个序列。可替代地，可将包含一个或多个针对一个或多个靶基因的RNA干扰序列的多核苷酸插入基因组。在一个实施方案中，插入可以发生在基因组中不是该一个或多个靶基因的位置的位置。在一个实施方案中，基于RNA的试剂配置成靶向或者靶向

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

在另一个实施方案中，基于RNA的试剂不配置成靶向β2m或者不靶向β2m。

在一些实施方案中，在免疫细胞，例如本公开的T细胞中以下各项的功能性表达水平

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

可以相对于尚未工程化以降低相应表达水平的可比较的细胞中的功能性表达水平减少至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。在另一个实施方案中，β2m的功能性表达水平不降低。

一种或多种抗原结合蛋白(例如，一种或多种CAR)和/或CD70结合蛋白可在将编码这些蛋白质的多核苷酸构建体引入细胞后在细胞中原位合成。可替代地，抗原结合蛋白(例如，CAR)和/或CD70结合蛋白可以在细胞外产生，然后引入细胞。将多核苷酸构建体引入细胞中的方法为所属领域中已知的。在一些实施方案中，稳定的转化方法可以用于将多核苷酸构建体整合到细胞的基因组中。在其它实施方案中，可使用瞬时转化方法来瞬时表达多核苷酸构建体和未整合到细胞的基因组中的多核苷酸构建体。在其它实施方案中，可使用病毒介导方法。可以通过任何合适的方式将多核苷酸引入到细胞中，例如重组病毒载体(例如逆转录病毒，包含慢病毒、腺病毒)、脂质体等。瞬时转化方法包含例如但不限于微注射、电穿孔或粒子轰击。多核苷酸可以包含于载体中，如质粒载体或病毒载体中。

在一些实施方案中，本公开的经工程化的免疫细胞(例如，T细胞)可包含至少一种抗原结合蛋白(例如，CAR)和/或CD70结合蛋白。经工程化的免疫细胞(例如，T细胞)经进一步修饰，例如经基因工程化以表达降低水平的

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

·(i)CD58、NLRC5和RFX5；(ii)CD48、NLRC5和RFX5；(iii)ICAM-1、NLRC5和RFX5；(iv)CD58、ICAM-1和RFX5；(v)CD48、ICAM-1和RFX5；(vi)CD58、CD48和RFX5；(vii)CD58、ICAM-1和NLRC5；

(viii)CD48、ICAM-1和NLRC5；或(ix)CD58、CD48和NLRC5；(x)CD48、CD58和ICAM-1；或

在一个实施方案中，经工程化的免疫细胞(例如，T细胞)，不进一步修饰以表达降低水平的β2m。在另一个实施方案中，如本文所述，经工程化的免疫细胞(诸如CAR T细胞)还包含编码CD70结合蛋白的多核苷酸和/或功能性地表达CD70结合蛋白。

在一个其他实施方案中，本公开提供了一种经工程化的免疫细胞，例如CAR T细胞，或包含经工程化的免疫细胞的经工程化的免疫细胞群体，这些经工程化的免疫细胞包含一个或多个功能性地削弱或降低本文所述的一种或多种靶标的表达的基因组修饰。在一个实施方案中，该一个或多个基因组修饰处于一个或多个基因(对应于如本文所述的一个或多个靶标)的基因组位置，或者处于基因组内的其他位置，而不在该一个或多个基因(对应于如本文所述的一个或多个靶标)的位置，使得这些修饰功能性地削弱或降低该一个或多个基因(对应于如本文所述的一个或多个靶标)的表达。

在一些实施方案中，经工程化的免疫细胞(例如，经工程化的T细胞)可以包含两种或更多种不同的抗原结合蛋白(例如两种或更多种不同的CAR)和/或CD70结合蛋白，每种CAR包含不同的细胞外配体结合结构域。

在本文所提供的经工程化的免疫细胞例如T细胞的一些实施方案中，细胞表达的CAR可以包括细胞外配体结合结构域(例如，单链可变片段(scFv))、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域在一个多肽中，即在单链中。本文还提供了多链CAR和多肽。在一些实施方案中，多链CAR包括：含有跨膜结构域和至少一个胞外配体结合结构域的第一多肽，和含有跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域的第二多肽，其中所述多肽组装在一起形成多链CAR。在另一个实施方案中，经工程化的免疫细胞还包含或功能性地表达CD70结合蛋白，如本文所述。

细胞外配体结合结构域与所关注的靶标特异性结合。细胞外配体结合结构域可以特异性结合肿瘤抗原。例如，细胞外配体结合结构域可以特异性结合选自癌胚抗原、过表达抗原、组织限制性抗原、睾丸癌抗原或肿瘤病毒抗原的肿瘤抗原。肿瘤抗原可与液体肿瘤相关。在一些实施方案中，所关注的靶标可以是任何所关注的分子，包含例如但不限于BCMA、EGFRvIII、Flt-3、WT-1、CD20、CD23、CD30、CD38、CD70、CD33、CD133、WT1、TSPAN10、MHC-PRAME、Liv1、ADAM10、CHRNA2、LeY、NKG2D、CS1、CD44v6、ROR1、CD19、密封蛋白-18.2(密封蛋白-18A2或密封蛋白18同种型2)、DLL3(δ样蛋白3、果蝇δ同源物3、δ3)、Muc17、Muc3、Muc3、Muc16、FAPα(成纤维细胞激活蛋白α)、Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合基因座蛋白G6d、c6orf23、G6D、MEGT1、NG25)、RNF43(E3泛素蛋白连接酶RNF43、环指蛋白43)，具体地包含所列出的示例性靶标中的任何一者的人形式。

在一些实施方案中，抗原结合结构域特异性地结合BCMA、MUC16(也称为CA125)、EGFR、EGFRvIII、MUC1、Flt-3、WT-1、CD20、CD23、CD30、CD38、CD70、CD33、CD133、MHC-WT1、TSPAN10、MHC-PRAME、MHC-NY-ESO1、HER2(ERBB2)、CAIX(碳酸酐酶IX)、LIV1、ADAM10、CHRNA2、LeY、NKG2D、CS1、CD44v6、ROR1、CD19、封闭蛋白-18.2(封闭蛋白-18A2或封闭蛋白18亚型2)、PSCA、DLL3(δ样蛋白3、果蝇δ同源物3、δ3)、Mud 7(粘蛋白17、Muc3、Muc3)、FAPα(成纤维细胞活化蛋白α)、Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合位点蛋白G6d、c6orf23、G6D、MEGT1、NG25)、PSMA、MSLN或RNF43(E3泛素-蛋白连接酶RNF43、环指蛋白43)。靶向抗原的CAR和/或抗体在例如以下中公开：BCMA-WO201616630、WO 2020150339、WO 2019196713、WO2016014565、WO 2017025038；MUC16：US9,169,328、WO 2016149368、WO 2020023888；EGFRvIII：WO 2017125830、WO 2016016341；Flt3：WO 2018222935、WO 2020010284、WO2017173410；CD20：WO 2018145649、WO 2020010235、WO 2020123691；CD38：WO 2017025323；CD70：WO 2019152742、WO 2018152181；CD33：WO 2016014576；CD133：WO 2018072025；CS1：WO 2019030240；ROR1：WO 2016115559；CD19：WO 2002077029、US11,077,144；密封蛋白：WO2018006882、WO 2021008463；DLL3：WO 2020180591；WT1：US20160152725A1、US7622119B2；CD23：US6011138A、CN1568198A；CD30：US10815301B2、US10808035B2；PRAME：US20180148503A1、WO 2020186204A1；LIV1：US20200231699A1；NKG2D：WO 2021179353A1、US20210269501A1；FAPα：US20200246383A1、US20210115102A1；PSMA：US20210277141A1、WO2020108646A1；MSLN：CN109680002A、CN109628492A。

在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域包括scFv，所述scFv包括通过柔性连接子连接的靶抗原特异性单克隆抗体的轻链可变(VL)区和重链可变(VH)区。单链可变区片段是通过使用短连接肽(Bird等人,《科学(Science)》242:423-426,1988)连接轻链和/或重链可变区来制备的。连接肽的实例是具有氨基酸序列(GGGGS)3(SEQ ID NO:72)的GS接头，其在一个可变区的羧基末端和另一个可变区的氨基末端之间桥接大约3.5nm。已经设计并使用其它序列的连接子(Bird等人,1988，同上)。通常，接头可以是短的柔性多肽并且优选地包含约20个或更少的氨基酸残基。进而接头可以被修饰用于另外的功能，如附着药物或附着在固相载体上。单链变体可以通过重组或合成产生。对于scFv的合成生产，可以使用自动合成仪。对于scFv的重组产生，可以将含有编码scFv的多核苷酸的合适质粒或其它载体引入到合适的宿主细胞(如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞等真核细胞或如大肠杆菌等原核细胞)中。编码所关注的scFv的多核苷酸可以通过如多核苷酸的连接等常规操作来制备。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得scFv。

根据本公开的CAR的细胞内信号传导结构域负责在细胞外配体结合结构域与靶标结合之后产生细胞内信号传导，从而导致免疫细胞的激活和免疫应答。细胞内信号传导结构域能够激活表达CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性(包含细胞因子的分泌)。

在一些实施方案中，用于CAR中的胞内信号传导结构域可以是例如但不限于T细胞受体和共受体的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体以及具有相同功能能力的任何合成序列，所述T细胞受体和共受体在抗原受体接合后协同作用以启动信号转导。胞内信号传导结构域包括两种不同类型的胞质信号传导序列：启动抗原依赖性主要活化的胞质信号传导序列，以及以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的胞质信号传导序列。主要胞质信号传导序列可以包括被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。ITAM是在充当syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点的各种受体的胞质内尾区发现的明确定义的信号传导基序。本公开中使用的ITAM的实例可以包含作为非限制性实例的源自ΤCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在一些实施方案中，CAR的细胞内信号传导结构域可以包括CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，本公开的CAR的细胞内信号传导结构域包括共刺激分子的结构域。

在一些实施方案中，本公开的CAR的细胞内信号传导结构域包括选自由4-1BB(GenBank:AAA53133)和CD28(NP_006130和其同种型)的片段组成的组的共刺激分子的一部分。

CAR在细胞的表面膜上表达。因此，CAR可以包括跨膜结构域。本文所公开的CAR的合适跨膜结构域具有以下能力：(a)在细胞表面表达，例如在免疫细胞表面表达，所述免疫细胞如例如但不限于淋巴细胞(例如，T细胞)或自然杀伤(NK)细胞；以及(b)与配体结合结构域和细胞内信号传导结构域相互作用，以指导免疫细胞对预定靶细胞的细胞应答。跨膜结构域可以源自天然或合成来源。跨膜结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。作为非限制性实例，跨膜多肽可以是T细胞受体的结构域，如α、β、γ或δ；构成CD3复合物的多肽；IL-2受体例如p55(α链)、p75(β链或γ链)；Fc受体，具体地Fcγ受体III的亚基链；或CD蛋白。可替代地，跨膜结构域可以是合成的并且可以主要包括疏水残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，所述跨膜结构域源自人CD8α链(例如，NP_001139345.1)。跨膜结构域还可以包括位于细胞外配体结合结构域和所述跨膜结构域之间的茎结构域。茎结构域可以包括至多300个氨基酸，例如10至100个氨基酸或25至50个氨基酸。茎区可以源自天然存在的分子的全部或部分，如源自CD8、CD4或CD28的胞外区的全部或部分，或源自抗体恒定区的全部或部分。可替代地，茎结构域可以是对应于天然存在的茎序列的合成序列，或者可以是完全合成的茎序列。在一些实施方案中，所述茎结构域是人CD8α链(例如，NP_001139345以及其同种型)的一部分。在另一个特定的实施方案中，跨膜结构域包括人CD8α链的一部分。在一些实施方案中，本文所公开的CAR可以包括与BCMA、CD8α人茎结构域以及跨膜结构域特异性结合的胞外配体结合结构域、CD3ζ信号传导结构域和4-1BB信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR可以作为转基因通过载体例如质粒载体被引入到免疫细胞中。在一些实施方案中，载体例如质粒载体还可以含有，例如，提供用于鉴定和/或选择接受载体的细胞的选择标志物。

在将编码CAR和/或CD70结合蛋白多肽的多核苷酸引入细胞中之后，可在细胞中原位合成CAR和/或CD70结合蛋白多肽。可替代地，CAR和/或CD70结合蛋白多肽可以在细胞外产生，并且然后引入到细胞中。将多核苷酸构建体引入细胞中的方法为所属领域中已知的。在一些实施方案中，稳定的转化方法可以用于将多核苷酸构建体整合到细胞的基因组中。在其它实施方案中，可使用瞬时转化方法来瞬时表达多核苷酸构建体和未整合到细胞的基因组中的多核苷酸构建体。在其它实施方案中，可使用病毒介导方法。可以通过任何合适的方式将多核苷酸引入到细胞中，例如重组病毒载体(例如逆转录病毒(例如，慢病毒)、腺病毒)、脂质体等。瞬时转化方法包含例如但不限于微注射、电穿孔或粒子轰击。多核苷酸可以包含于载体中，如质粒载体或病毒载体中。

本文还提供了免疫细胞，例如T细胞，如根据本文所描述的任一种方法获得的分离的T细胞。能够表达异源DNA的任何免疫细胞都可以用于表达抗原结合蛋白(例如，所关注的CAR)和/或CD70结合蛋白的目的，并进一步用于工程化以表达降低水平的

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞可以源自例如但不限于干细胞。干细胞可以是成体干细胞、非人胚胎干细胞，更具体地非人干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。代表性的人细胞是CD34+细胞。分离的细胞也可以是树突细胞、杀伤树突细胞、肥大细胞、NK细胞、B细胞或选自由以下组成的组的T细胞：炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助T淋巴细胞。在一些实施方案中，细胞可以源自由CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞组成的组。在另一个实施方案中，经工程化的细胞可以源自含有CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的T淋巴细胞群体。

在一些实施方案中，免疫细胞(例如T细胞，诸如分离的T细胞)被进一步修饰，例如通过本文所述的方法进行基因工程化(例如，采用例如TALEN、CRISPR/Cas9或megaTAL核酸酶以部分或完全缺失或破坏

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

基因座的已知基因编辑技术)，使得它们相对于未经工程化成表达降低或改变水平的相应蛋白质的可比较的细胞，表达降低水平的相应蛋白质。在另一个实施方案中，免疫细胞不进一步修饰，例如通过本文所述的方法进行基因工程化(例如，采用例如TALEN、CRISPR/Cas9或megaTAL核酸酶以部分或完全缺失或破坏β2m基因座的已知基因编辑技术)。在另一个实施方案中，如本文所述，免疫细胞(例如，经工程化的免疫细胞，诸如CAR T细胞)还包含编码CD70结合蛋白的多核苷酸和/或功能性地表达CD70结合蛋白。

在另一个实施方案中，本公开提供了包含一个或多个基因组修饰的经修饰的或经工程化的免疫细胞，所述基因组修饰功能性地削弱或降低本文所述的一种或多种靶标的表达。在一个实施方案中，该一个或多个基因组修饰处于一个或多个基因(对应于如本文所述的一个或多个靶标)的基因组位置，或者处于基因组内的其他位置，而不在该一个或多个基因(对应于如本文所述的一个或多个靶标)的位置，使得这些修饰功能性地削弱或降低该一个或多个基因(对应于如本文所述的一个或多个靶标)的表达。

本文所提供的经工程化的免疫细胞可以包括一个或多个模拟表位序列，所述一个或多个模拟表位序列能够分选细胞以富集如本文所描述的经工程化的细胞，例如表达抗原结合蛋白，和/或提供安全开关机制以在将细胞施用于患者或接受者之后灭活免疫细胞，例如以限制副作用的细胞群体。此类模拟表位序列以及其在细胞分选中和作为安全开关的应用在本领域中是已知的，并且在例如US2018/0002435中所描述，所述文献通过引用整体并入本文。

在扩增和基因修饰之前，可以通过多种非限制性方法从受试者获得细胞来源。细胞可以从多个非限制性来源获得，所述非限制性来源包含外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一些实施方案中，可以使用本领域技术人员可得并且已知的任何数量的T细胞系。在一些实施方案中，细胞可以源自健康的供体、源自诊断患有癌症的受试者或源自诊断患有感染的受试者。在一些实施方案中，细胞可以是呈现不同表型特征的混合的细胞群体的一部分。

PBMC可直接用于使用如本文所述的方法用免疫细胞(例如CAR或TCR)进行基因修饰。在某些实施方案中，在分离PBMC之后，可进一步分离T淋巴细胞，并且在基因修饰和/或扩增之前或之后，可将细胞毒性和辅助T淋巴细胞两者分选为原生、记忆和效应T细胞亚群。

在一些实施方案中，CD8+细胞通过鉴别与这些类型的CD8+细胞中的每一种相关的特有细胞表面抗原而进一步分选成原初细胞、干细胞记忆细胞、中央记忆细胞和效应细胞。在一些实施方案中，中央记忆T细胞的表型标记的表达包括CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和CD127并且对于粒酶B是阴性的。在一些实施方案中，干细胞记忆T细胞为CD45RO-、CD62L+、CD8+T细胞。在一些实施方案中，中央记忆T细胞是CD45RO+、CD62L+、CD8+T细胞。在一些实施方案中，效应T细胞对于CD62L、CCR7、CD28和CD127是阴性的，并且对于颗粒酶B和穿孔素是阳性的。

在某些实施方案中，CD4+T细胞进一步分选成亚群。例如，通过鉴定具有特有细胞表面抗原的细胞群体，CD4+T辅助性细胞可以分选为原初细胞、中央记忆细胞和效应细胞。

本文还提供了根据本文所描述的任何方法从经修饰的，例如经转化的或经工程化的免疫细胞，例如经工程化的T细胞获得的细胞系。在一些实施方案中，根据本公开的经工程化的免疫细胞(例如，经工程化的T细胞)包含编码抗原结合蛋白(例如，CAR)和/或CD70结合蛋白的多核苷酸，并且经进一步修饰或工程化(例如基因修饰)以降低的水平表达(例如功能性地表达)

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

·(i)CD58、ICAM-1、RFX5和NLRC5；(ii)CD48、ICAM-1、RFX5、NLRC5；(iii)CD48、CD58、RFX5和NLRC5；(iv)CD48、CD58、ICAM-1和RFX5；(v)CD48、CD58、ICAM-1和NLRC5；(vi)β2m、CD58、CD48和ICAM-1；或(vii)CD48、CD58、ICAM-1、RFX5和NLRC5。在另一个实施方案中，经工程化的免疫细胞不进一步修饰或工程化(例如，基因修饰)以表达(例如，功能性地表达)β2m。在另一个实施方案中，经工程化的免疫细胞还包含编码CD70结合蛋白的多核苷酸和/或功能性地表达CD70结合蛋白，如本文所述。

在一个特定实施方案中，提供了包含基因组修饰的T细胞，该基因组修饰相对于没有基因组修饰的T细胞，功能性地削弱或降低RFX5和CD58的表达，其中该T细胞还包含：能够与肿瘤抗原特异性结合的CAR，任选CD70特异性CAR，任选降低或消除CD52表达，和降低或消除内源TCR表达。T细胞可以是与待治疗受试者相关的同种异体T细胞。T细胞可以源自健康供体。T细胞可以源自由PBMC、CD4+T淋巴细胞或CD8+T淋巴细胞组成的组。

在另一个特定实施方案中，提供了包含基因组修饰的T细胞，该基因组修饰相对于没有基因组修饰的T细胞，功能性地削弱或降低NLRC5和CD58的表达，其中该T细胞还包含：能够与肿瘤抗原特异性结合的CAR，任选CD70特异性CAR，任选降低或消除CD52表达，和降低或消除内源TCR表达。T细胞可以是与待治疗受试者相关的同种异体T细胞。T细胞可以源自健康供体。T细胞可以源自由PBMC、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞组成的组。

在一个其他特定实施方案中，提供了包含基因组修饰的T细胞，该基因组修饰相对于没有基因组修饰的T细胞，功能性地削弱或降低RFX5和ICAM-1的表达，其中该T细胞还包含：能够与肿瘤抗原特异性结合的CAR，任选CD70特异性CAR，任选降低或消除CD52表达，和降低或消除内源TCR表达。T细胞可以是与待治疗受试者相关的同种异体T细胞。T细胞可以源自健康供体。T细胞可以源自由PBMC、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞组成的组。

在一个其他特定实施方案中，提供了包含基因组修饰的T细胞，该基因组修饰相对于没有基因组修饰的T细胞，功能性地削弱或降低NLRC5和ICAM-1的表达，其中该T细胞还包含：能够与肿瘤抗原特异性结合的CAR，任选CD70特异性CAR，任选降低或消除CD52表达，和降低或消除内源TCR表达。T细胞可以是与待治疗受试者相关的同种异体T细胞。T细胞可以源自健康供体。T细胞可以源自由PBMC、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞组成的组。

在一个其他特定实施方案中，提供了包含基因组修饰的T细胞，该基因组修饰相对于没有基因组修饰的T细胞，功能性地削弱或降低CD58和ICAM-1的表达，其中该T细胞还包含：能够与肿瘤抗原特异性结合的CAR，任选CD70特异性CAR，任选降低或消除CD52表达，和降低或消除内源TCR表达。T细胞可以是与待治疗受试者相关的同种异体T细胞。T细胞可以源自健康供体。T细胞可以源自由PBMC、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞组成的组。

在一个其他特定实施方案中，提供了包含基因组修饰的T细胞，该基因组修饰相对于没有基因组修饰的T细胞，功能性地削弱或降低RFX5、NLRC5和CD58的表达，其中该T细胞还包含：能够与肿瘤抗原特异性结合的CAR，任选CD70特异性CAR，任选降低或消除CD52表达，和降低或消除内源TCR表达。T细胞可以是与待治疗受试者相关的同种异体T细胞。T细胞可以源自健康供体。T细胞可以源自由PBMC、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞组成的组。

在一个其他特定实施方案中，提供了包含基因组修饰的T细胞，该基因组修饰相对于没有基因组修饰的T细胞，功能性地削弱或降低RFX5、NLRC5和ICAM-1的表达，其中该T细胞还包含：能够与肿瘤抗原特异性结合的CAR，任选CD70特异性CAR，任选降低或消除CD52表达，和降低或消除内源TCR表达。T细胞可以是与待治疗受试者相关的同种异体T细胞。T细胞可以源自健康供体。T细胞可以源自由PBMC、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞组成的组。

在一个其他特定实施方案中，提供了包含基因组修饰的T细胞，该基因组修饰相对于没有基因组修饰的T细胞，功能性地削弱或降低RFX5、CD58和ICAM-1的表达，其中该T细胞还包含：能够与肿瘤抗原特异性结合的CAR，任选CD70特异性CAR，任选降低或消除CD52表达，和降低或消除内源TCR表达。T细胞可以是与待治疗受试者相关的同种异体T细胞。T细胞可以源自健康供体。T细胞可以源自由PBMC、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞组成的组。

在一个其他特定实施方案中，提供了包含基因组修饰的T细胞，该基因组修饰相对于没有基因组修饰的T细胞，功能性地削弱或降低NLRC5、CD58和ICAM-1的表达，其中该T细胞还包含：能够与肿瘤抗原特异性结合的CAR，任选CD70特异性CAR，任选降低或消除CD52表达，和降低或消除内源TCR表达。T细胞可以是与待治疗受试者相关的同种异体T细胞。T细胞可以源自健康供体。T细胞可以源自由PBMC、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞组成的组。

涉及经工程化的免疫细胞的方法

本公开的免疫细胞(例如T细胞)可以使用如通常描述的以下方法在细胞修饰之前或之后被活化和扩增：例如但不限于，美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041和美国专利申请公开第20060121005号中的方法。免疫细胞(例如T细胞)可以在体外或体内扩增。通常，本公开的免疫细胞可以例如通过与刺激免疫细胞的表面上的CD3 TCR复合物和共刺激分子的药剂接触以产生细胞的活化信号而扩增。例如，如钙离子载体A23187、佛波醇(phorbol)12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)或促有丝分裂凝集素样植物血凝素(PHA)等化学品可用于产生免疫细胞(例如T细胞)的活化信号。

在一些实施方案中，T细胞群体可以通过以下被体外刺激：与例如抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触或与和钙离子载体接合的蛋白激酶C活化剂(例如，苔藓抑素(bryostatin))接触。为了在T细胞的表面上共刺激辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，在适于刺激T细胞的增殖的条件下，可以使T细胞群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。适于T细胞培养的条件包含适当的培养基(例如，最小必需培养基、RPMI培养基1640或X-VIVO^TM5(龙沙公司(Lonza)))，所述培养基可以含有增殖和活力所必需的因子，包含血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-2、IL-15、TGFβ和TNF或本领域的技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包含但不限于表面活性剂、和如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇等还原剂。培养基可以包含RPMI 1640(如本文所述)、AIM V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-VIVO^TM10、X-VIVO^TM15和X-VIVO^TM20、OpTmizer^TM，并且添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适量血清(或血浆)或一组限定的激素和/或足以使T细胞生长和扩增的量的细胞因子。抗生素(例如青霉素和链霉素)仅包括于实验培养物中，不包括于待输注到个体中的细胞培养物中。靶细胞维持在支持生长所需的条件下，例如适当温度(例如37℃)和大气(例如空气加5％CO₂)。暴露于不同刺激时间的免疫细胞(例如T细胞)可能展现出不同的。

在一些实施方案中，可以通过与组织或细胞共培养来扩增本公开的细胞。细胞也可以在体内扩增，例如在将所述细胞施用于受试者后在受试者的血液中扩增。

包含经工程化的免疫细胞的组合物和群体

另一方面，本公开提供了包括本公开的任何细胞的组合物(如药物组合物)。在一些实施方案中，该组合物包含含有编码抗原结合蛋白(例如CAR)和/或CD70结合蛋白的多核苷酸的T细胞。该细胞经进一步工程化以表达降低水平的

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

其水平相对于未被工程化以功能性地表达降低或改变水平的相应蛋白质的可比较的细胞降低，或者该组合物包含含有本公开的经工程化的免疫细胞(例如T细胞)的细胞群体，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。在另一个实施方案中，该细胞不经进一步工程化以表达降低水平的β2m。在另一个实施方案中，经工程化的免疫细胞还包含编码CD70结合蛋白的多核苷酸和/或功能性地表达CD70结合蛋白，如本文所述。

在一个实施方案中，本文所述的经工程化的细胞，诸如经工程化的免疫细胞，例如CAR T细胞，包含一个或多个功能性地削弱或降低本文所述的一种或多种靶标的表达的基因组修饰。在一个实施方案中，该一个或多个基因组修饰处于一个或多个基因的基因组位置，或者处于基因组内的其他位置，而不在该一个或多个基因的位置，使得这些修饰功能性地削弱或降低该一个或多个基因的表达。

在一些实施方案中，从供体中分离的原代细胞如本文所述进行工程化以提供细胞群体，其中所得细胞的亚群(例如，比例小于100％，如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)包括所有期望的修饰。包括包含所有修饰的细胞和不包含所有修饰的细胞的混合物的此类所得群体可以用于本公开的治疗方法中并且用于制备本公开的组合物。可替代地，该细胞群体(“起始群体”)可以通过已知方法(例如，细胞分选和/或扩增具有期望的修饰的细胞)操纵，以提供富集包含一种或多种期望的修饰的那些细胞(例如，富集表达期望的抗原结合蛋白的细胞，和/或富集就相应蛋白质的表达水平而言相对于未经工程化的可比较的细胞以降低的水平表达以下的细胞

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

·(i)CD58、ICAM-1、RFX5和NLRC5；(ii)CD48、ICAM-1、RFX5、NLRC5；(iii)CD48、CD58、RFX5和NLRC5；(iv)CD48、CD58、ICAM-1和RFX5；(v)CD48、CD58、ICAM-1和NLRC5；(vi)β2m、CD58、CD48和ICAM-1；或(vii)CD48、CD58、ICAM-1、RFX5和NLRC5)，即与起始群体相比，包含更高百分比的此类经修饰的或经工程化的细胞的细胞群体。与起始群体相比，富集的细胞群体可包含更高百分比的此类经修饰的或经工程化的细胞。在另一个实施方案中，富集的群体不包含以降低的水平表达β2m的细胞。在另一个实施方案中，富集的群体包含一种或多种经工程化的免疫细胞，这些经工程化的免疫细胞还包含编码CD70结合蛋白的多核苷酸和/或功能性地表达CD70结合蛋白，如本文所述。

然后，富集经修饰的细胞群体可以用于本公开的治疗方法中，并且用于制备例如本公开的组合物。在一些实施方案中，富集的细胞群体含有或含有至少例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％具有修饰中的一种或多种的细胞。在其它实施方案中，包括一种或多种修饰的富集的细胞群体中的细胞比例比包括期望的修饰的起始细胞群体中的细胞比例高至少30％。

治疗方法

在一个方面，本公开提供了在免疫细胞疗法过程中逃避受试者的免疫应答的方法。在一个实施方案中，免疫细胞疗法包括向受试者施用同种异体免疫细胞，其中同种异体免疫细胞是经工程化的免疫细胞。在其他实施方案中，经工程化的免疫细胞被工程化以功能性地表达降低水平的

CD48、CD58、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK中的任何一者或多者；

CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

(i)NLRC5和RFX5中的一者或两者，和(ii)CD58、CD48和ICAM-1中的一者或多者；

NLRC5和CD58两者，RFX5和CD58两者，RFX5和CD48两者，NLRC5和CD48两者，RFX5和ICAM-1两者，NLRC5和ICAM-1两者，CD58和ICAM-1两者，CD58和CD48两者，或CD48和ICAM-1两者；

(i)CD58、NLRC5和RFX5；(ii)CD48、NLRC5和RFX5；(iii)ICAM-1、NLRC5和RFX5；(iv)CD58、ICAM-1和RFX5；(v)CD48、ICAM-1和RFX5；(vi)CD58、CD48和RFX5；(vii)CD58、ICAM-1和NLRC5；(viii)CD48、ICAM-1和NLRC5；或(ix)CD58、CD48和NLRC5；(x)CD48、CD58和ICAM-1；或

(i)CD58、ICAM-1、RFX5和NLRC5；(ii)CD48、ICAM-1、RFX5、NLRC5；(iii)CD48、CD58、RFX5和NLRC5；(iv)CD48、CD58、ICAM-1和RFX5；(v)CD48、CD58、ICAM-1和NLRC5；(vi)β2m、CD58、CD48和ICAM-1；或(vii)CD48、CD58、ICAM-1、RFX5和NLRC5，其中与未经工程化的免疫细胞相比，这些经工程化的免疫细胞(i)不太易受到经由受试者的同种异体反应性免疫应答的排斥，(ii)不太易受到经由受试者的CD8+和/或CD4+T细胞的同种异体反应性免疫应答的排斥，和/或(iii)具有改善的与受试者免疫细胞共存的能力。在另一个实施方案中，经工程化的免疫细胞进一步表征为同时具有体内CAR T功效以及(i)、(ii)和(iii)中的一种或多种。在另一个实施方案中，经工程化的免疫细胞还包含编码CD70结合蛋白的多核苷酸和/或功能性地表达CD70结合蛋白，如本文所述。

免疫细胞，例如经工程化的免疫细胞，诸如通过上述方法获得的T细胞，或源自此类免疫细胞或T细胞的细胞系，可用于治疗受试者的病状或病症，或者可用作药物。在一些实施方案中，此类方法和/或药物可用于治疗病状或病症，如病毒性疾病、细菌性疾病、癌症、炎性疾病、免疫疾病或衰老相关疾病。在一些实施方案中，所述癌症可以选自由以下组成的组：胃癌(gastric cancer)、肉瘤、淋巴瘤(包含非霍奇金氏淋巴瘤)、白血病、头颈癌、胸腺癌、上皮癌、唾液癌、肝癌、胃癌(stomach cancer)、甲状腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、胰腺癌、神经胶质瘤、白血病、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、口腔癌、皮肤癌和黑色素瘤。在一些实施方案中，受试者是先前治疗的患有局部晚期或转移性黑色素瘤、鳞状细胞头颈癌(SCHNC)、卵巢癌、肉瘤或复发性或难治性经典霍奇金氏淋巴瘤(cHL)的成年受试者。

在一些实施方案中，免疫细胞(例如，根据本公开的T细胞)或源自免疫细胞(例如，经工程化的T细胞)的细胞系可以用于制造用于治疗有需要的受试者的病状或病症的药物。在一些实施方案中，该病状或病症可以是例如癌症、自身免疫性病症或感染。

本文还提供了治疗受试者的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向有需要的受试者施用或提供本公开的免疫细胞(例如，经工程化的T细胞)。在一些实施方案中，所述方法包括向有需要的受试者施用本公开的免疫细胞(例如T细胞)的步骤。

在一些实施方案中，本公开的免疫细胞，例如经工程化的T细胞可以经历强劲的体内细胞扩增并且可以持续延长的时间量。本公开的治疗方法可以是改善、治愈或预防。本公开的方法可以是自体免疫疗法的一部分或同种异体免疫疗法治疗的一部分。本公开特别适用于同种异体免疫疗法。可以使用标准方案将供体提供的免疫细胞(例如，经工程化的T细胞)转化为非同种异体反应性细胞，并且根据需要进行繁殖，从而产生例如可以施用于一个或几个受试者的CAR-T细胞。此类CAR-T细胞疗法可以作为同种异体ALLO CAR T^TM治疗产物可得进行制备。

另一方面，本公开提供了一种抑制患有肿瘤的受试者的肿瘤生长或进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所描述的经工程化的免疫细胞，例如经工程化的T细胞。另一方面，本公开提供了一种抑制或预防受试者中的癌细胞的转移的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的如本文所描述的经工程化的免疫细胞，例如经工程化的T细胞。另一方面，本公开提供了一种诱导患有肿瘤的受试者的肿瘤消退的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所描述的经工程化的免疫细胞，例如经工程化的T细胞。

在一些实施方案中，本文所提供的免疫细胞(例如T细胞)可以经肠胃外施用于受试者。在一些实施方案中，所述受试者是人。

在一些实施方案中，所述方法还可以包括施用有效量的第二治疗剂。在一些实施方案中，所述第二治疗剂是例如克唑替尼(crizotinib)、帕博西尼(palbociclib)、抗CTLA4抗体、抗4-1BB抗体、PD-1抗体或PD-L1抗体。

本文还提供了任何本文所提供的免疫细胞(例如T细胞)在制备用于治疗有需要的受试者的癌症或抑制肿瘤生长或进展的药物中的用途。

在某些实施方案中，在本公开的经工程化的免疫细胞中以下各项的功能性表达水平

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

或根据本公开被敲低或敲除的任何其他基因的功能性表达水平，相对于可比较的但未经如此基因修饰的经工程化的免疫细胞中的相应表达水平，降低或至少降低约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。

在另一个实施方案中，在本公开的经工程化的免疫细胞中β2m的功能性表达水平未降低。在另一个实施方案中，经工程化的免疫细胞还包含编码CD70结合蛋白的多核苷酸和/或功能性地表达CD70结合蛋白，如本文所述。

表达水平可以通过如FACS或MAC等任何已知方法确定。在一些实施方案中，本文公开的经工程化的免疫细胞功能性地表达

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

或根据本公开被敲低或敲除的任何其他基因，表达水平不大于未经工程化的免疫细胞(在其他方面与经工程化的免疫细胞相同，例如包含与经工程化的免疫细胞相同的组分)的表达水平的75％、不大于50％、不大于25％、不大于10％或其水平为未经工程化的免疫细胞的表达水平的0％。在另一个实施方案中，相对于未经工程化的免疫细胞(与经工程化的免疫细胞相同，例如包含与经工程化的免疫细胞相同的组分)中β2m的表达水平，经工程化的免疫细胞不以降低的水平功能性地表达β2m。在另一个实施方案中，经工程化的免疫细胞还包含编码CD70结合蛋白的多核苷酸和/或功能性地表达CD70结合蛋白，如本文所述。

在一些实施方案中，一个基因的两个等位基因都被敲除，使得本文所公开的经工程化的免疫细胞的基因表达水平是对应的未经工程化的细胞的基因表达水平的0％。在一些实施方案中，基因的两个等位基因之一被敲除，使得本文公开的经工程化的免疫细胞的基因表达水平为对应的未经工程化的细胞的基因表达水平的50％或约50％(例如，如果补偿机制导致剩余等位基因的表达高于正常水平)。如本文所描述，如果例如通过除敲除之外的一些手段降低表达，可以观察到中等表达水平。

在一些实施方案中，本公开的经工程化的细胞中CD48,CD58,ICAM-1,TAP2,NLRC5,β2m,TRAC,RFX5,RFXAP,CIITA and RFXANK中的一者或多者，或根据本公开操纵其表达水平的任何其他基因的表达水平可以通过使用本领域技术人员已知的标准技术(例如，RT-qPCR、核酸测序、抗体染色或一些技术组合)测定细胞的基因产物及其特性来直接测量。在一些实施方案中，TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK中的一者或多者的功能性表达水平通过用本领域已知的标准技术(例如，流式细胞术)确定经工程化的免疫细胞的表面上一种或多种HLA蛋白(诸如HLA-A或HLA-B蛋白)或β2微球蛋白(Β2M)或Β2M和一种或多种HLA蛋白两者的表面表达水平来测量。在本公开的各个实施方案中，CD48、CD58和ICAM-1中的任何一者或多者的功能性表达水平通过确定经工程化的免疫细胞的表面上每种细胞表面蛋白，诸如CD48、CD58或ICAM-1蛋白中的一者或多者的表面表达水平来测量，或通过流式细胞术来测量。可以将这些测量与在没有被工程化以降低对应的功能性表达水平的可比细胞上进行的对应测量进行比较。在包括本发明的经工程化的细胞(例如，经工程化的免疫细胞)的细胞群体中，被测量的材料(例如，RNA或蛋白质或细胞)的合并样品将反映这样的事实，即一些细胞不表达所关注基因，已经敲除了两个等位基因，例如，一些细胞表达50％或约50％的所关注基因，仅敲除了一个等位基因，并且如果所述群体包括未经工程化的细胞，则一些细胞表达正常水平的所关注基因。

还可以例如通过与未经工程化的但在其他方面可比较(例如相同)的免疫细胞在相同条件下存活的程度相比，测量经工程化的免疫细胞在存在效应细胞(例如T细胞或NK细胞)的情况下存活的程度来测定本公开的经工程化的免疫细胞中CD48、CD58、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFX5、RFXAP和RFXANK表达中的一种或多种的功能表达水平。参见例如图1D-图1E和实施例1。

在一些实施方案中，施用本文公开的经工程化的免疫细胞(例如，经工程化的T细胞)，或施用包含此类经工程化的免疫细胞(例如，经工程化的T细胞)的细胞群体，相对于不包含此类经工程化的细胞的可比较但未经工程化的细胞或可比较的群体，降低了所施用的细胞或细胞群体的宿主排斥。在一些实施方案中，施用本公开的经工程化的免疫细胞(例如，经工程化的T细胞)，其包含抗原结合蛋白(例如，CAR)和/或CD70结合蛋白并且其中以下各项的表达水平(例如，功能性表达水平)降低：

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

(viii)CD48、ICAM-1和NLRC5；或(ix)CD58、CD48和NLRC5；或

或施用包含此类经工程化的免疫细胞(例如，经工程化的T细胞)的细胞群体，其中相对于可比较但未经工程化的细胞或不包含此类经工程化的细胞的群体，施用降低了所施用的细胞或细胞群体的宿主排斥。在另一个实施方案中，β2m的表达水平(例如，功能性表达水平)未降低。在另一个实施方案中，经工程化的免疫细胞还包含编码CD70结合蛋白的多核苷酸和/或功能性地表达CD70结合蛋白，如本文所述。

例如，与相同但未经工程化成以降低的水平表达相应蛋白质的细胞的宿主排斥相比，此类施用将宿主排斥降低1％至99％，例如5％至95％、10％至90％、50％至90％，例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施方案中，宿主排斥降低了超过90％。

在一些实施方案中，施用本公开的经工程化的免疫细胞(例如，T细胞)，其包含抗原结合蛋白(例如，CAR)和/或CD70结合蛋白并且其中以下各项的功能性表达水平降低：

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

(viii)CD48、ICAM-1和NLRC5；或(ix)CD58、CD48和NLRC5；或

或施用包含此类免疫细胞(例如，T细胞)的细胞群体，其中与相同但未经工程化以表达降低水平的相应蛋白质的细胞的持久性相比，施用增强或改善细胞的持久性和/或增加细胞的持久性。在另一个实施方案中，β2m的功能性表达水平未降低。在另一个实施方案中，免疫细胞还包含编码CD70结合蛋白的多核苷酸和/或功能性地表达CD70结合蛋白，如本文所述。

在一些实施方案中，持久性增加例如1至7天，1至12周(例如1至4周、4至8周或8至12周)，或增加1至12个月，或增加落在这些范围内的特定时间长度。在一些实施方案中，持久性的差异通过比较群体或组合物中所施用的细胞的半衰期来测量，其中，例如，半衰期增加例如1至7天、1至12周(例如，1至4周、4至8周或8至12周)，或增加1至12个月，或增加落在这些范围内的特定时间长度。在一些实施方案中，持久性的差异通过比较施用之后可以检测到的所施用细胞的时间长度来测量。在一些实施方案中，通过比较经工程化的细胞和未经工程化的细胞在存在例如免疫细胞诸如T细胞或NK细胞的情况下，例如在混合后约72小时、5天、7天或13天的存活率，在体外测量持久性的改善。在一些实施方案中，在此类体外测定中，在测量时，存活的经工程化的细胞是未经工程化的细胞的约1.5至10倍。在一些实施方案中，在此类体外测定中，在测量时，存活的经工程化的免疫细胞是未经工程化的免疫细胞的约1.5至10倍。本文所述的经工程化的免疫细胞的持久性或存活率的改善程度部分取决于一种或多种靶标的功能性表达水平降低的程度，并且另外但任选地取决于共温育(例如“攻击”或宿主)免疫细胞中CD70的表达水平。

在一些实施方案中，通过本领域普通技术人员已知的各种技术中的任一种来确定宿主排斥的减少和/或所施用的如本文所公开的细胞的持久性的增加。在一些实施方案中，使用以下的任何一种或组合：流式细胞术、PCR(例如，定量PCR)以及与患者肿瘤材料或表达CAR-T细胞靶向的抗原的模型肿瘤细胞系的离体共温育。在一些实施方案中，qPCR用于评估具有和不具有所关注敲除的CAR T细胞的数量，以确定敲除提供存活率优势的程度。

在一些实施方案中，治疗可以与针对癌症的一种或多种疗法组合，所述疗法选自由以下组成的组：抗体疗法、化学疗法、细胞因子疗法、树突细胞疗法、基因疗法、激素疗法、激光疗法和放射疗法。

在一些实施方案中，治疗可以施用于经历免疫抑制性治疗的受试者。实际上，本公开可以依赖于由于编码此类免疫抑制剂的受体的基因失活而对至少一种免疫抑制剂产生抗性的细胞或细胞群。在这个方面，免疫抑制性治疗可以有助于对受试者体内根据本公开的T细胞的选择和扩增。

根据本公开的细胞或细胞群体的施用可以任何方便的方式进行，所述方式包含通过气溶胶吸入、注射、摄取、输血、植入或移植。本文所描述的组合物可以经皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内或淋巴管内注射或腹膜内施用于受试者。在一个实施方案中，本公开的细胞组合物通过静脉内注射施用。

在一些实施方案中，根据本公开的细胞或细胞群体的施用可以包括施用，例如，每kg体重约10³或10⁴至约10⁹个细胞，包含这些范围内的细胞数的所有整数值。在一些实施方案中，细胞或细胞群体的施用可以包括施用每kg体重约10⁵至约10⁶个细胞，包含这些范围内的细胞数的所有整数值，或施用每kg体重0.1×10⁶至5×10⁶个本发明的经工程化的免疫细胞，或总共0.1×10⁸至5×10⁸个经工程化的免疫细胞。可以按一个或多个剂量施用细胞或细胞群体。在一些实施方案中，有效量的细胞可以作为单剂量施用。在一些实施方案中，有效量的细胞可以在一段时间内作为多于一个剂量施用。施用时间在主治医师的判断范围内并且取决于受试者的临床状况。细胞或细胞群体可以从任何来源，如血库或供体获得。虽然个体需求不同，但对于特定疾病或病症的给定细胞类型的有效量的最佳范围的确定在本领域的技术范围内。有效量意指提供治疗性或预防性益处的量。施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重、同期治疗(如果有的话)的种类、治疗频率和期望的效果的性质。在一些实施方案中，有效量的细胞或包括那些细胞的组合物经肠胃外施用。在一些实施方案中，施用可以是静脉内施用。在一些实施方案中，施用可以通过注射到肿瘤内直接进行。

在本公开的一些实施方案中，结合任何数量的相关治疗方式(例如，在其之前、同时或之后)向受试者施用细胞，所述相关治疗方式包括但不限于用药剂进行的治疗，诸如单克隆抗体疗法、CCR2拮抗剂(例如，INC-8761)、抗病毒疗法、西多福韦和白介素2、阿糖胞苷(也称为ARA-C)或用于MS受试者的那他珠单抗(nataliziimab)治疗或用于银屑病受试者的依法珠单抗(efaliztimab)治疗或用于PML受试者的其他治疗。在一些实施方案中，将BCMA特异性CAR-T细胞与以下中的一种或多种联合施用于受试者：抗PD-1抗体(例如，纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、抗PD-L1抗体(例如，阿维单抗(avelumab)、阿特朱单抗(atezolizumab)或德瓦鲁单抗(durvalumab))、抗OX40抗体、抗4-1BB抗体(例如，乌托鲁单抗(Utolimumab))、抗MCSF抗体、抗GITR抗体和/或抗TIGIT抗体。在另外的实施方案中，本公开的免疫细胞(例如T细胞)可以与化学疗法、放射、免疫抑制剂(诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、抗体或其他免疫清除剂(诸如CAMPATH(阿仑单抗)、抗CD3抗体或其他抗体疗法、环磷酰胺(cytoxan)、氟达瑞滨、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和/或放射)联合使用。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Henderson,Naya等人《免疫学(Immunology.)》1991年7月；73(3):316–321；Liu,Albers等人《生物化学(Biochemistry)》1992年4月28日；31(16):3896-901；Bierer,Hollander等人《当代免疫学观点(Curr OpinImmunol.)》1993年10月；5(5):763-73)。在一个实施方案中，本公开的免疫细胞(例如，T细胞)可以施用给先前已经施用免疫抑制剂的受试者，其中免疫抑制剂使受试者淋巴细胞清除，从而允许免疫细胞的移植。然而，随着时间的推移，受试者的免疫系统将重建并从淋巴细胞清除中恢复(参见例如，Tees等人，抗CD52抗体ALLO-647与氟达拉滨(Flu)/环磷酰胺(Cy)在同种异体CAR-T细胞疗法背景下用于淋巴细胞清除的安全性和PK/PD(Safety andPK/PD of ALLO-647,an anti-CD52antibody,with fludarabine(Flu)/cyclophosphamide(Cy)for lymphodepletion in the setting of allogeneic CAR-T cell therapy).J.Clin.Oncology，第39卷，第15期_增刊2021)。因此，本公开的经工程化的免疫细胞在治疗方案的不同时间提供针对受试者免疫系统的进一步保护。在一个实施方案中，经工程化的免疫细胞与受试者的免疫系统共存并主动接合受试者的免疫系统，同时避免排斥。

在另外的实施方案中，本公开的细胞组合物与骨髓移植、使用如氟达拉滨等化疗药剂的T细胞消融疗法、外束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或如CAMPATH等抗体联合(例如，之前、同时或之后)施用于受试者。在一些实施方案中，在B细胞消融疗法(如与CD20反应的药剂，例如美罗华(Rituxan)后，施用本公开的细胞组合物。例如，在一个实施方案中，受试者可以经历标准治疗，其中高剂量化疗之后是外周血干细胞移植。在某些实施方案中，在移植后，受试者接受本公开的扩增的免疫细胞的输注。在一些实施方案中，在外科手术之前或之后施用扩增的细胞。

试剂盒

本公开还提供了用于本发明方法的试剂盒。本公开的试剂盒包含一个或多个容器，所述一个或多个容器包括本公开的组合物或本公开的免疫细胞，例如T细胞或包括本公开的免疫细胞(例如，经工程化的T细胞)的细胞群体。在各种实施方案中，免疫细胞(例如，T细胞)包含一种或多种编码如本文所述的抗原结合蛋白(例如，CAR)的多核苷酸，并且被进一步经工程化以表达降低水平的如本文所述的CD48、CD58、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、RFX5、RFXAP、CIITA和RFXANK中的一者或多者。在另一个实施方案中，免疫细胞被进一步经工程化以表达降低水平的

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

如本文所述。在另一个实施方案中，免疫细胞不经进一步工程化以表达降低水平的β2m。

所述试剂盒进一步包括根据本文所描述的本公开的任何方法的使用说明。通常，这些说明书包括对用于上文所描述的治疗性处理的组合物、免疫细胞(例如，T细胞)或细胞群体的施用的描述。

与试剂盒组分的使用有关的说明书通常包含关于用于预期治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本公开的试剂盒中提供的说明书通常是在标签或包装插页(例如，包含在试剂盒中的纸张)上的书面说明，但机器可读说明书(例如，磁性或光学存储盘上携带的说明书)也是可接受的。

本公开的试剂盒采用适合的包装。适合的包装包含但不限于小瓶、瓶、广口瓶、软包装(例如，密封的密拉(Mylar)或塑料袋)等。还考虑了与具体装置(如吸入器、鼻腔施用装置(例如，雾化器)或输注装置(如微型泵))组合使用的包装。试剂盒可以具有无菌进入端口(例如，容器可以是静脉输液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。容器也可以具有无菌进口端(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。根据本公开，组合物中的至少一种活性剂是免疫细胞(例如，T细胞)。容器还可以包括第二药物活性剂。

试剂盒可以任选地提供如缓冲液等另外的组分以及解释性信息。通常，试剂盒包含容器和位于容器上或与容器相关的标签或包装说明书。

分选和清除的方法

在一些实施方案中，提供了用于免疫细胞群体的体外分选的方法，其中免疫细胞群体的亚群包含如本文所述经工程化以降低的水平表达以下基因

·CD48、CD58和ICAM-1中的仅一者；

和/或表达抗原结合蛋白，例如CAR的免疫细胞。

在各个实施方案中，所述方法包括使所述免疫细胞群体与对经工程化的细胞独特的表位(例如，模拟表位，如US2018/0002435中提供的那些模拟表位)(例如抗原结合蛋白的表位或掺入到抗原结合蛋白中的模拟表位)具有特异性的单克隆抗体接触，并且选择与单克隆抗体结合的免疫细胞，以获得在表达抗原结合蛋白的经工程化的免疫细胞中富集的细胞群体。

在一些实施方案中，对所述表位具有特异性的所述单克隆抗体任选地与荧光团缀合。在此实施方案中，所述选择与单克隆抗体结合的细胞的步骤可以通过荧光活化细胞分选(FACS)来完成。

在一些实施方案中，对所述表位具有特异性的所述单克隆抗体任选地与磁颗粒缀合。在此实施方案中，所述选择与单克隆抗体结合的细胞的步骤可以通过磁活化细胞分选(MACS)来完成。

在一些实施方案中，对表达抗原结合蛋白(例如CAR)的免疫细胞进行分选的方法中所使用的mAb选自阿仑单抗、替伊莫单抗、莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3)、托西莫单抗、阿昔单抗、巴利昔单抗(basiliximab)、本妥昔单抗、西妥昔单抗、英利昔单抗、利妥昔单抗、贝伐单抗、聚乙二醇化赛妥珠单抗、达利珠单抗、艾库组单抗(eculizumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、那他珠单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗(palivizumab)、兰比珠单抗(ranibizumab)、托西利单抗、曲妥珠单抗、维多珠单抗(vedolizumab)、阿达木单抗、贝利单抗、卡那单抗、地诺单抗(denosumab)、戈利木单抗(golimumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、奥法木单抗、帕尼单抗、QBEND-10和/或优特克单抗(ustekinumab)。在一些实施方案中，所述mAb是利妥昔单抗。在另一个实施方案中，所述mAb是QBEND-10。

在一些实施方案中，当使用上文所描述的用于体外分选表达CAR的免疫细胞的方法时获得的表达CAR的免疫细胞群体包括至少70％、75％、80％、85％、90％、95％的CAR表达性免疫细胞。在一些实施方案中，当使用用于体外分选表达CAR的免疫细胞的方法时获得的表达CAR的免疫细胞群体包括至少85％的表达CAR的免疫细胞。

在一些实施方案中，当使用上文所描述的用于体外分选表达CAR的免疫细胞的方法时获得的表达CAR的免疫细胞群体与初始(未分选的)细胞群体相比，显示出增强的体外细胞毒性活性。在一些实施方案中，所述体外细胞毒性活性增加了10％、20％、30％或50％。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞。

将施用于接受者的表达CAR的免疫细胞可以由来源群体在体外富集。扩大来源群体的方法可以包含使用密度离心、免疫磁珠纯化、亲和色谱法和荧光活化细胞分选的组合来选择表达如CD34抗原等抗原的细胞。

流式细胞术可以用于对细胞群体内的特定细胞类型进行定量。通常，流式细胞术是用于主要通过光学手段对细胞的组分或结构特征进行定量的方法。由于可以通过定量结构特征来区分不同的细胞类型，流式细胞术和细胞分选可以用于对混合物中不同表型的细胞进行计数和分选。

流式细胞术分析涉及两个主要步骤：1)用一种或多种标记的标志物来标记所选细胞类型，以及2)确定标记的细胞相对于群体中细胞的总数的数量。在一些实施方案中，标记细胞类型的方法包含将经标记的抗体与由特定细胞类型表达的标志物结合。抗体可以直接用荧光化合物标记或使用例如识别第一抗体的荧光标记的第二抗体间接标记。

在一些实施方案中，用于分选表达CAR的T细胞的方法是磁激活细胞分选(MACS)。磁激活细胞分选(MACS)是一种用于通过使用超顺磁纳米颗粒和柱、根据各种细胞群的表面抗原(CD分子)来分离各种细胞群的方法。MACS可以用于获得纯的细胞群体。单细胞悬浮液中的细胞可以用微珠磁性标记。将样品施加于由铁磁性球体构成的柱，所述柱覆盖有允许快速和平缓分离细胞的细胞友好型涂层。未经标记的细胞通过而磁标记的细胞保留在柱中。流出物可被收集作为未标记的细胞级分。在洗涤步骤后，将柱从分离器中取出，并且经磁标记的细胞从柱中洗脱。

用于纯化特定细胞群体(如T细胞)的详细方案可以在Basu S等人(2010)中找到。(Basu S,Campbell HM,Dittel BN,Ray A.《通过荧光活化细胞分选(FACS)纯化特定细胞群体(Purification of specific cell population by fluorescence activated cellsorting)》《可视化实验期刊(J.Vis.Exp.)》(41):1546)。

表1：其他示例性序列

实施例

实施例1：CD58敲除(KO)+RFX5或NLRC5 KO在非CAR T细胞中的保护作用。

使用致敏T和自然杀伤(NK)混合淋巴细胞反应(MLR)测定测试CD58 KO作为单一修饰(单一KO)增强存活或提供RFX5 KO或NLRC5 KO抵抗宿主排斥的进一步存活益处的保护作用。

来自表达HLA-A2的(HLA-A2+)健康人供体的PBMC用作同种异体效应物(宿主)，并且来自不表达HLA-A2的(HLA-A2-)健康供体的PBMC用于产生靶细胞(移植物)。进行基因编辑以经由CRISPR/Cas9产生具有以下KO的移植物T细胞：TRAC KO、TRAC/CD58 KO、TRAC/β2mKO、TRAC/RFX5 KO、TRAC/NLRC5 KO、TRAC/β2m/CD58 KO、TRAC/RFX5/CD58KO和TRAC/NLRC5/CD58 KO。体外扩增1周后，再纯化靶细胞以去除任何表达TCRα/β的细胞。经由FACS评价特定基因敲除或MHC-I和MHC-II敲低的水平。

同种异体反应性T细胞被认为是同种异体排斥的主要介质。因此，使用经基因编辑的细胞作为靶细胞进行致敏同种异体反应性T细胞混合淋巴细胞反应(MLR)，以评价不同敲除对抵抗致敏同种异体反应性T细胞存活的保护作用。为了产生致敏效应T细胞，将来自HLA-A2+供体的同种异体PBMC与从移植物供体分离的经辐射的PBMC或pan T细胞共培养1周，以促进同种异体反应性T细胞的生长和扩增。然后纯化出效应pan T细胞，并与经基因编辑的移植物T细胞以1:1的比率在R10+20IU/mL IL-2中共温育2天。通过门控活的HLA-A2-TCRαβ-CD4+CD8+和期望的基因编辑(例如，CD58 KO)来分析存活的移植物T细胞的绝对数目，确定杀伤程度(图1E)。

如图1E所示，与单一RFX5 KO或单一NLRC5 KO相比，CD58 KO增强了RFX5 KO细胞或NLRC5 KO细胞的存活。

在NK MLR测定中，经由MACS纯化(美天旎公司(Miltenyi)，人pan NK细胞分离试剂盒，目录号130-092-657)从新鲜分离的HLA-A2+人PBMC中分离出人NK细胞。在96孔板中，用20,000或100,000个宿主NK细胞接种20,000个移植物T细胞，并在R10+1000IU/mL IL-2中培养2天。通过流式细胞术，通过门控活的HLA-A2-TCRαβ-CD56-CD4+CD8+和期望的基因编辑(例如，CD58 KO)使用绝对计数来确定移植物T细胞的存活。

如图1F所示，与单一RFX5 KO细胞或单一NLRC5 KO细胞相比，CD58 KO增强了RFX5KO细胞或NLRC5 KO细胞的存活。单一CD58 KO不影响NK MLR中的移植物细胞存活。对于效应细胞:靶细胞比率(E:T)为1:1和E:T＝5:1，观察到类似的趋势。

实施例2：CD48 KO或ICAM-1KO+RFX5 KO在非CAR T细胞移植物中的保护作用

来自HLA-A2供体的pan T细胞用于靶细胞的产生。进行基因编辑以经由CRISPR/Cas9产生具有以下KO的靶细胞：TRAC KO、TRAC/RFX5 KO、TRAC/CD48 KO、TRAC/ICAM-1KO、TRAC/RFX5/CD48 KO和TRAC/RFX5/ICAM-1KO。体外扩增2周后，再纯化靶标以去除任何表达TCRα/β的细胞。经由FACS评价特定基因敲除或MHC-I和MHC-II敲低的水平。

如图2所示，对于所有组都观察到高基因编辑效率(基于两个供体的平均值)。在产生的第13天，超过80％的细胞具有期望的基因编辑。虽然在这组测试中使用RFX5 KO，但是没有使用NLRC5 KO和β2m KO。

使用如实施例1中所述的致敏T细胞MLR测定，测试了ICAM-1或CD48 KO对增强RFX5KO抵抗同种异体T细胞排斥的存活的保护作用。如图3所示，与CD48 KO相比，如在致敏T细胞MLR测定中所示，ICAM-1KO可略微增强RFX5 KO的存活率。作为单一KO，与对照移植物(TRACKO)相比，ICAM-1KO增强靶细胞存活率。CD48 KO的存活率与对照移植物相似。

在PBMC MLR测定中测试了与CD48 KO相比，ICAM-1KO进一步增强RFX5 KO抵抗宿主PBMC排斥的存活的保护作用。评估了经基因编辑的移植物细胞在同种异体PBMC供体(n＝3)存在下的存活率。所用的效应物:靶标(E:T)比率为10:1。共培养9天后，通过FACS对移植物细胞的存活率进行定量。如图4所示，与CD48 KO相比，如在PBMC MLR测定中所示，ICAM-1KO进一步增强RFX5 KO的存活率。

实施例3：使用CAR T细胞移植物的CD58 KO或ICAM-1KO+RFX5KO的保护作用

使用致敏T MLR测定测试CD58 KO作为单一修饰(单一KO)增强CAR T细胞存活或提供RFX5 KO或NLRC5 KO抵抗T细胞排斥的进一步存活益处的保护作用。由健康供体细胞工程化表达涡轮结构域(turbodomain)的CD19 CAR T细胞(CD19 FMC63)，涡轮结构域是一种组成型活性嵌合细胞因子受体(CACCR)，包括TpoR结构域变体(478-582；H499L；S505N；W515K)和细胞内IL2Rb结构域(339-379,393-433,518-551)(参见Lin等人，US US2021-0260118A1，其通过引用整体并入本文)。在本实施例中，这些CAR T细胞将在下文中称为CD19 CAR T细胞。如下所述，CAR和涡轮结构域的表达受EF1α或PGK启动子的控制。

修饰CD19 CAR T细胞以引入一个或多个敲除，然后将其用作靶细胞。具体来说，经由CRISPR/Cas9对CD19 CAR T细胞进行基因编辑以提供以下敲除：TRAC KO、TRAC/β2m KO、TRAC/CD58 KO、TRAC/RFX5 KO、TRAC/NLRC5 KO、TRAC/β2m/CD58 KO、TRAC/CD58/RFX5 KO和TRAC/CD58/NLRC5 KO。

对于图5A-图5J中呈现的实验数据，CD19 CAR T细胞经工程化为具有用于控制CAR和涡轮结构域表达的EF1α启动子。

进行致敏T MLR测定以测试经基因编辑的CD19 CAR T细胞(作为靶细胞)抵抗同种异体T细胞排斥的有效性。数据合并自4个移植物/宿主供体对：1个移植物和4个宿主。在20IU/mL的IL-2的存在下，以效应物:靶标(E:T)＝1:1的比率培养细胞2天。在一些情况下，使用表达GFP的β2m KO Raji肿瘤细胞活化CAR T细胞。通过FACS评估移植物CAR T细胞的存活率，并作为活的GFP-HLA-A2-TCRαβ-CD4+CD8+CAR+和期望的基因编辑(例如，CD58 KO)进行门控。

如图5A所示，与对照CAR T移植物(TRAC KO)相比，单一β2mKO、单一CD58 KO、单一NLRC5 KO和单一RFX5 KO全部增强移植物细胞存活。此外，当CD19 CAR T细胞未活化(没有Raji肿瘤细胞)时，与单一NLRC5 KO或单一RFX5 KO CAR T细胞相比，CD58 KO进一步增强存活。活化的CD19 CAR T细胞(在Raji肿瘤细胞的存在下)比未活化的CAR T细胞(无Raji肿瘤细胞)存活情况更佳。所有隐匿性KO移植物细胞，例如CD58 KO，存活情况相对可比，并且全部存活情况显著好于对照移植物(TRAC KO)。

使用致敏T MLR测定测试CD58 KO或ICAM-1KO作为单一修饰(单一KO)增强CAR T细胞存活或提供RFX5 KO抵抗T细胞排斥的进一步存活益处的保护作用。

对CD19 CAR T细胞进行基因编辑，以提供以下敲除：TRAC KO、TRAC/β2m KO、TRAC/RFX5 KO、TRAC/CD58 KO、TRAC/ICAM-1KO、TRAC/β2m/CD58 KO、TRAC/β2m/ICAM-1KO、TRAC/RFX5/CD58 KO和TRAC/RFX5/ICAM-1KO。

进行致敏T MLR测定以测试经基因编辑的CD19 CAR T细胞抵抗同种异体T细胞排斥的有效性。显示的数据是来自3个独特对的一个代表性移植物/宿主对的三份技术重复的平均值。在20IU/mL的IL-2的存在下，以效应物:靶标＝1:1的比率培养细胞2天。使用表达GFP的β2m KO Raji肿瘤细胞活化CAR T细胞。通过FACS评估移植物CAR T细胞的存活率，并作为活的GFP-HLA-A2-TCRαβ-CD4+CD8+CAR+和期望的基因编辑(例如，CD58 KO)进行门控。

如图5B所示，与对照(TRAC KO)相比，单一β2m KO、单一RFX5KO、单一CD58 KO和单一ICAM-1KO全部增强移植物CAR T细胞存活。CD58 KO对β2m KO的存活提供略微增加的益处，而ICAM-1KO则没有。与RFX5单一KO移植物相比，CD58 KO和ICAM-1KO两者为RFX5 KO CART细胞提供大幅增加的存活益处。

对CD19 CAR T细胞(表达如上所述的涡轮结构域)进行工程化以引入B2M、RFX5、CD58和NLRC5的不同敲除组合，然后在致敏T MLR测定、NK细胞MLR测定和PBMC MLR测定中用作移植物细胞。具体来说，经由CRISPR/Cas9对CD19 CAR T细胞进行基因编辑以提供以下敲除：TRACKO、TRAC/CD58 KO、TRAC/ICAM-1KO、TRAC/β2m KO、TRAC/β2m/CD58KO、TRAC/β2m/ICAM-1KO、TRAC/RFX5 KO、TRAC/RFX5/CD58 KO和TRAC/RFX5/ICAM-1KO。

对于致敏T MLR测定，宿主:移植物:Raji肿瘤细胞(具有B2M敲除的WT Raj i细胞)的比率为1:1:0.25。使用Miltenyi Pan T分离试剂盒将致敏宿主T细胞富集2倍。2天后进行读数。如图5C所示，CD58KO和ICAM-1KO作为单一修饰或与RFX5敲除组合，在T细胞MLR测定中引起CAR T细胞存活率改善(每个点代表一个独特的同种异体宿主/移植物对)。发现RFX5、CD58和ICAM-1的组合与单独敲除RFX5相比，显著减轻T细胞排斥。此外，发现CD58/RFX5双重敲除特异性减轻T细胞排斥，其程度几乎与B2M单独敲除(KO)细胞相同。

对于致敏NK MLR测定，使用10:1:0.25的NK细胞:移植物:Raji肿瘤细胞(WT Raj i细胞)比率。将冷冻的NK细胞解冻以供使用。2天后进行读数(1,000IU/ml IL-2)。如图5D所示，正如预期的，发现B2M敲除细胞对NK细胞杀伤敏感(每个点代表一个移植物/NK对)。与B2M敲除相比，CD58和ICAM-1敲除细胞，单独的或与其他敲除靶标即B2M和RFX5组合，没有表现出任何另外的NK细胞排斥。这些结果表明，RFX/CD58或ICAM-1双重敲除可能与B2M KO在相同程度上减轻T细胞排斥，但不会引起相同幅度的NK细胞排斥，可能减轻T细胞和NK细胞的排斥。

这些测定分析了与致敏T细胞或致敏NK细胞共培养后的移植物存活。发现CD58和ICAM 1敲除作为单一敲除和在RFX5 KO背景下都降低T细胞介导的排斥。在NK MLR中，未发现CD58和ICAM-1敲除对移植物存活有有害影响(图5C-图5D)。

对于PBMC MLR测定，使用10:1的宿主:移植细胞比率进行10天的共培养。在共培养之前，耗竭来自3个不同供体的PBMC中的B细胞。10天后进行读数。如图5E所示，CD58敲除和ICAM-1敲除作为单一修饰或与RFX5敲除组合会改善移植物存活(每个点代表一个独特的同种异体宿主/移植物对-移植物，3个宿主供体)。如图5F所示，发现添加CD58敲除与B2M敲除或RFX5敲除会降低3个供体中2个供体的宿主免疫细胞扩增(左图-宿主CD8+细胞；右图-宿主CD4+细胞)。如图5G所示，当与具有单独的或与其他敲除组合的B2M敲除的移植物细胞共培养时，宿主NK细胞扩增到更高的程度。发现单独添加CD58敲除或与RFX5敲除组合会降低扩增。

在另一个使用CD19 CAR T细胞的PBMC MLR测定中，评价不同敲除对不同免疫细胞亚群的影响。在共培养之前，耗竭来自3个不同供体的PBMC中的B细胞。使用10:1的宿主:移植物细胞比率进行10天的培养。10天后进行读数。在单独的板上测量TRAC/CD58 KO和TRAC/ICAM-1KO结果(为了便于目视观察，去除误差线)。

如图5H所示，当与具有不同敲除和敲除组合的移植物细胞共培养时，宿主CD8+细胞扩增程度较低。例如，与对照(FMC63；TRAC KO移植物)相比，添加RFX5/CD58组合敲除降低扩增。如图5I所示，当与具有不同敲除和敲除组合的移植物细胞共培养时，宿主CD4+细胞扩增程度较低。例如，与对照(FMC63；TRAC KO移植物)相比，添加RFX5/CD58组合敲除降低扩增。

使用CD19 CAR T细胞针对靶细胞，例如Raji WT细胞或Raji CD19^低细胞，以8:1的E:T比率进行体外长期杀伤测定。如图5J所示，含有不同敲除的CD19 CAR T细胞展示出针对Raji WT靶细胞的细胞毒性活性。与具有另外的敲除的大多数其他CAR T细胞相比，具有单独的TRAC敲除的对照CAR T细胞展示出有效杀伤。令人惊讶的是，与对照CAR T细胞相比，具有TRAC/CD58敲除的CAR T细胞赋予相似或稍好的杀伤。当Raji CD19^低细胞用作靶细胞时，获得类似结果。

实施例4：CD58 KO或ICAM-1KO+RFX5 KO抵抗NK细胞排斥的保护作用

修饰实施例3中描述的CD19 CAR T细胞(表达涡轮结构域)以引入一个或多个敲除，然后将其用作靶细胞。如下所述，CAR和涡轮结构域的表达受EF1α或PGK启动子的控制。

具体来说，经由CRISPR/Cas9对CD19 CAR T细胞进行基因编辑以提供以下敲除：TRAC KO、TRAC/β2m KO、TRAC/RFX5 KO、TRAC/CD58 KO、TRAC/ICAM-1KO、β2m/CD58 KO、β2m/ICAM-1KO、RFX5/CD58 KO和RFX5/ICAM-1KO。

对于图6A呈现的实验，使用EF1α启动子来控制CAR和涡轮结构域的表达。对于图6B呈现的实验，使用PGK启动子来控制CAR和涡轮结构域的表达。

NK MLR测定用于测试经基因编辑的CD19 CAR T细胞移植物抵抗同种异体NK排斥的存活率。数据合并自3个移植物/宿主供体对：1个移植物和3个宿主。在1,000IU/mL IL-2的存在下，将从冷冻PBMC中分离的NK细胞与经基因编辑的CD19 CAR T细胞共培养2天。使用表达GFP的Raji肿瘤细胞活化CD19 CAR T细胞。NK细胞:移植物:Raji细胞的比率为10:1:0.25。通过FACS评估移植物CAR T细胞的存活率，并作为活的GFP-HLA-A2-TCRαβ-CD56-CD4+CD8+CAR+和期望的基因编辑(例如，CD58 KO)进行门控。

如图6A所示，单一β2m KO招致大幅NK排斥，导致低存活率，而RFX5单一KO招致一些NK排斥，但程度较轻。与对照移植物(TRAC KO)相比，单一CD58 KO或ICAM-1KO具有相似存活率。CD58 KO略微挽救β2m KO免于NK排斥。CD58 KO或ICAM-1并未显示出对RFX5 KO抵抗NK排斥存活的实质性挽救。

在另一个NK细胞MLR中，使用新鲜的NK细胞。NK细胞:移植物:Raji靶细胞的比率为1:1:0.25。在1,000IU/ml IL-2的存在下，将NK细胞与经基因编辑的CD19 CAR T细胞共培养2天。如图6B所示，CD58敲除和ICAM-1敲除不会招致NK细胞排斥(每个点代表一个移植物/NK对)。此外，未发现CAR T敲除细胞表现出IL-2非依赖性生长(图6C)。

表4.1：sgRNA序列表

实施例4.1–CAR T细胞敲除的细胞毒性特性

修饰实施例3中描述的CD19 CAR T细胞(表达涡轮结构域)以引入一个或多个敲除。CD19 CAR T细胞是从来自两个HLA-A2供体的pan T细胞工程改造的。如下所述，CAR和涡轮结构域的表达受EF1α或PGK启动子的控制。

具体来说，经由CRISPR/Cas9对CD19 CAR T细胞进行基因编辑以提供以下敲除：TRAC KO、TRAC/β2m KO、TRAC/RFX5 KO、TRAC/CD58 KO、TRAC/ICAM-1KO、TRAC/RFX5/CD58KO、TRAC/RFX5/ICAM-1KO和TRAC/CD58/ICAM-1KO。

对于图7-图12中呈现的实验数据，CD19 CAR T细胞经工程化为具有用于控制CAR和涡轮结构域表达的PGK启动子。

TRAC敲除对所有经编辑的细胞是共同的。体外扩增16天后，再纯化经基因编辑的细胞以去除任何表达TCRα/β的细胞。经由流式细胞术评价特定基因敲除或MHC-I和MHC-II敲低的水平。

如图7所示，对于所有组都观察到高基因编辑效率(基于两个供体的平均值)。在产生的第16天，超过50％的细胞具有期望的基因编辑。对于上面列出的所有敲除条件，编辑1×10⁶个细胞，然后进行扩增。如图8所示，与TRAC敲除对照相比，经编辑的细胞的扩增不受任何各种敲除的影响。

使用具有各种敲除的CD19 CAR T细胞针对靶细胞，例如Raji WT细胞或Raji CD19^低细胞，以8:1的E:T比率进行体外长期杀伤测定。如图9所示，含有不同敲除的各种CAR T细胞展示出针对Raji WT靶细胞的细胞毒性活性。发现所有CAR T敲除细胞与对照CAR T细胞(仅TRAC敲除)相比展示出相等或更高的细胞毒性。将CAR T细胞与表达荧光素酶-GFP的Raji细胞以8:1的效应物:靶标比率共培养。每隔2-3天，将一半的细胞传代至新鲜的Raji细胞。然后使用Bright-glo试剂(Promega)将剩余的一半细胞用于确定靶细胞杀伤。

用几个具有各种敲除的经基因编辑的CD19 CAR T细胞进行一系列致敏T MLR测定。在与具有B2M敲除辐射的移植物pan T细胞的WT Raji细胞共培养7天后，用MiltenyiPan T分离试剂盒分离致敏宿主T细胞2次。使用1:1:0.25的T细胞宿主:移植物:Raji(B2M敲除)比率并在第2天获得读数。如图10所示，发现CD58敲除作为单一敲除或与其他敲除组合有效减轻T细胞排斥(每个点代表一个移植物/宿主对)。

还进行了PBMC MLR测定。使用10:1的宿主:移植物细胞比率进行10天的培养。在共培养之前，耗竭来自供体的PBMC中的B细胞。在第3、7和9天进行读数。如图11所示，在第7天，具有各种敲除的移植物CAR T细胞展示出优于对照和B2M敲除的存活优势。组合敲除(例如，RFX5/CD58、RFX5/ICAM-1和CD58/ICAM-1)比单一敲除(例如，RFX5、CD58和ICAM-1)展示出更好的抗排斥存活率。在单一敲除移植物细胞中CD58敲除细胞展示出最好的存活率。CD58敲除与RFX5敲除或ICAM-1敲除的组合在第9天展示出最佳的抗排斥存活率(数据未示出)。此外，与其他单一敲除相比，单一CD58敲除在第9天显示出最佳存活率(数据未示出)。

评价不同的经基因编辑的CAR T细胞影响宿主免疫细胞扩增的能力。如图12A-图12B所示，发现CAR T细胞会降低宿主CD8+和宿主CD4+细胞的扩增(A)。发现B2M敲除CAR T细胞与其他敲除细胞相比，在降低宿主NK细胞扩增方面效果最差(B)。

此外，CD19 CAR T细胞经工程化为具有用于控制CAR和涡轮结构域表达的EF1α启动子。还测试了这些细胞的细胞毒性能力并且发现展示出相似的细胞毒性能力(数据未示出)。"

实施例4.2-具有CD58敲除的CD19 CAR/CD70结合蛋白T细胞

将LVV构建体转导到PBMC中产生在宿主细胞基因组中具有随机整合的转基因的经工程化的细胞。转基因可以通过位点特异性整合(SSI)到预先确定的基因座中而引入细胞中，以确保转基因在基因组中插入位点的一致性，并限制整合事件的数目。例如腺相关病毒载体(AAV)辅助的位点特异性整合也能够表达一个以上的基因，同时保持高转导效率。

使用AAV辅助的SSI方法递送三种不同的构建体，以产生用于这些实验的三种不同类型的经工程化的细胞：1)CD19 CAR构建体，2)CD19CAR/CD70结合蛋白构建体，和3)CD70CAR构建体。对于构建体2)，CD70结合蛋白(或结构域)以scFv和CD3ζ信号传导结构域(4F11z)的形式源自抗CD70抗体克隆4F11。在每种情况下，靶向TRAC基因座进行构建体的整合。使用三种不同的PBMC供体。每个构建体的表达受PGK启动子驱动。在1)和2)中经由CRISPR/Cas9进行进一步的基因编辑，以产生具有某些敲除的移植物CAR T细胞：仅TRAC敲除、TRAC/B2M敲除、TRAC/CD58敲除。体外扩增1周后，再纯化靶细胞以去除任何表达TCRα/β的细胞。通过流式细胞术评价特定基因敲除或MHC-I和MHC-II敲低的水平。来自表达HLA-A2(HLA-A2+)的健康人供体的PBMC用作同种异体效应物(宿主)，而经工程化的细胞用作移植物CAR T细胞。

进行了PBMC MLR测定。使用10:1的宿主:移植物细胞比率进行13天的培养。在共培养之前，耗竭来自3个不同供体的PBMC中的B细胞。在第13天进行读数。如图13A所示，发现CD58敲除会增强CD19CAR/CD70结合蛋白CAR T细胞的存活(每个符号代表9个独特移植物/宿主对中的1对；每个符号形状代表一种独特的移植物)。

在共培养9天后，评价经工程化的CAR T细胞影响宿主免疫细胞扩增的能力。如图13B所示，发现CD19 CAR/CD70结合蛋白CAR T细胞降低宿主CD8+T细胞的扩增或耗竭宿主CD8+T细胞。对宿主CD4+T细胞观察到类似结果。如图13C所示，观察到CD19 CAR/CD70结合蛋白CAR T细胞阻止宿主NK细胞扩增。

使用各种CAR T敲除细胞针对靶Raji WT细胞，以4:1的E:T比率进行体外长期杀伤测定。如图13D所示，CD58敲除的引入并未降低CAR T细胞的细胞毒性活性。将CAR T细胞与表达荧光素酶-GFP的Raji细胞以8:1的效应物:靶标比率共培养。每隔2-3天，将一半的细胞传代至新鲜的Raji细胞。然后使用Bright-glo试剂(Promega)将剩余的一半细胞用于确定靶细胞杀伤。

通用方案

靶细胞的产生(图1)使用磁活化细胞分选(MACS)阴性选择(美天旎公司，人pan T细胞分离试剂盒，目录号130-096-535)从冷冻的健康供体外周血单核细胞(PBMC)中分离原代人T细胞，并且在R10(RPMI-1640+10％ FBS+25mM HEPES+丙酮酸钠+非必需氨基酸)中用1:100(v:v)T细胞TransAct(美天旎公司，目录号130-111-160)+100IU/mL IL-2(美天旎公司，目录号130-097-746)活化。2天之后，使用Neon转染系统(英杰公司(Invitrogen))对T细胞进行基因编辑。简言之，核糖核蛋白(RNP)复合物通过将cas9酶(IDT，目录号1081059)和sgRNA以2:1摩尔比在室温下混合10分钟而产生。如果使用两个sgRNA，则以1:1:1比率(sgRNA1:sgRNA2:cas9)用cas9进行温育。如果使用三个sgRNA，则以0.67:0.67:0.67:1比率(sgRNA1:sgRNA2:sgRNA3:cas9)用cas9进行温育。细胞在1600V、10ms宽度下进行总共3次脉冲，并且立即在补充有100IU/mL IL-2+10ng/mL IL-7(美天旎公司，目录号130-095-363)的R10培养基中回收。将经编辑的T细胞在37℃、5％ CO₂下温育。第二天向细胞中添加含有100IU/mL IL-2的新鲜R10。基因编辑后5-7天，通过流式细胞仪评估KO效率。KO效率通过多种方式进行评估：对于TRAC，评估CD3/TCRab表达；对于β2m、NLRC5和RFX5，使用抗β2m或抗HLA抗体。抗CD58抗体用于评估CD58表达。根据制造商的建议，使用MACS阴性选择(干细胞科技公司(Stem Cell Technologies)，EasySep人TCRα/β耗竭试剂盒，目录号17847)纯化TRACKO细胞。立即使用纯化的T细胞，或在90％ FBS+10％ DMSO中以5e6个细胞等份冷冻。

靶细胞的产生(除图1E-图1F外的所有图)使用EasySep人T细胞分离试剂盒(干细胞科技公司，目录号17951)从冷冻的健康供体外周血单核细胞(PBMC)中分离原代人T细胞。在X-Vivo 15培养基(龙沙公司，目录号04-418Q)+5％人AB血清(吉迷尼公司(Gemini)，目录号100-318)中，用1:100(v:v)T细胞TransAct(美天旎公司，目录号130-111-160)+100IU/mLIL-2(美天旎公司，目录号130-097-746)活化分离的T细胞。2天后，使用Nucleofector 4D系统(龙沙公司)对T细胞进行基因编辑。简言之，核糖核蛋白(RNP)复合物通过将cas9酶(IDT，目录号1081059)和sgRNA以1:1摩尔比在室温下混合10分钟而产生。如果使用两个sgRNA，则以0.5:0.5:1比率(sgRNA1:sgRNA2:cas9)用cas9进行温育。如果使用三个sgRNA，则以0.3:0.3:0.3:1比率(sgRNA1:sgRNA2:sgRNA3:cas9)用cas9进行温育。电穿孔后，立即在X-Vivo15培养基+5％人AB血清和100IU/mL IL-2中回收细胞。在一些情况下(图5-图6)，用腺病毒转导电穿孔的T细胞以表达CD19 CAR(FMC63 TurboCAR)。TCR耗竭(干细胞技术公司，EasySep人类TCRα/β耗竭试剂盒，目录号17847)通常在第14天至第16天进行。将耗竭TCR的T细胞冷冻保存并解冻，用于以后的另外的分析。通过用Vi-CELL计数器(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))对活细胞进行计数来跟踪生产期间的细胞扩增。通过比较到第2天(基因编辑时间)的不同时间点的活细胞计数来计算扩增倍数。通过抗独特型抗体(百普赛斯生物科技公司(Acro Biosystems)，目录号FM3HPY53)鉴定CD19 CAR T细胞。还经由流式细胞仪在整个细胞产生过程的多个时间点评估KO效率。以多种方式评估KO效率：对于TRAC，评估CD3/TCRab表达；对于β2m、NLRC5和RFX5，使用抗HLA-ABC抗体。抗CD58、抗CD48和抗ICAM-1抗体分别用于评估CD58、CD48和ICAM-1KO效率。根据制造商的建议，使用MACS阴性选择(干细胞科技公司，EasySep人TCRα/β耗竭试剂盒，目录号17847)纯化TRAC KO细胞。将纯化的T细胞以5e6个细胞的等份试样冷冻在CryoStor CS5培养基(干细胞科技公司，目录号07933)中。

致敏T MLR(图1E-图1F、图3和图5)HLA-A2+人PBMC针对源自用于制备上述靶T细胞的供体的经辐射的PBMC或pan T细胞(HLA-A2-)致敏，以促进同种异体反应性T细胞克隆的扩增。简言之，以30Gy辐射靶PBMC并与宿主PBMC以1:1比率在R10+20IU/mL IL-2+10ng/mLIL-7+10ng/mL IL-15(美天旎公司，目录号130-095-765)中共培养4天。将培养基换成不含细胞因子的R10，并将细胞继续培养3天以上。之后，按照制造商的建议，使用MACS阴性选择(美天旎公司，人pan T细胞分离试剂盒，目录号130-096-535)分离pan T细胞。在96孔板中，用20,000个致敏宿主T细胞接种20,000个靶T细胞，并在R10+20IU/mL IL-2中在37℃、5％CO₂下培养2天。在一些情况下(图5)，向共培养物中添加5,000个表达GFP的β2m KO Raji肿瘤细胞，以活化CD19 CAR T移植物细胞。通过流式细胞术，通过门控活的GFP-HLA-A2-TCRαβ-CD4+CD8+(CAR+)和期望的基因编辑(例如，CD58 KO)使用绝对计数来确定移植物T细胞的存活。

NK MLR(图1F和图6)。图1B：经由MACS纯化(美天旎公司，人pan NK细胞分离试剂盒，目录号130-092-657)从新鲜分离的人HLA-A2+PBMC中分离出人NK细胞。在96孔板中，用20,000或100,000个宿主NK细胞接种20,000个HLA-A2-移植物T细胞，效应物:靶标＝1:1或5:1，并在R10+1000IU/mL IL-2中在37℃、5％ CO₂下培养2天。通过流式细胞术，通过门控活的HLA-A2-TCRαβ-CD56-CD4+CD8+和期望的基因编辑(例如，CD58 KO)使用绝对计数来确定移植物T细胞的存活。

图6：经由MACS纯化(干细胞科技公司，EasySep人NK细胞分离试剂盒，目录号100-0960)从冷冻的人HLA-A2+PBMC中分离出人NK细胞。在96孔板中，用200,000个宿主NK细胞接种20,000个HLA-A2-移植物T细胞，效应物:靶标＝10:1，并在R10+1000IU/mL IL-2中在37℃、5％CO₂下培养2天。向共培养物中添加5,000个表达GFP的Raji肿瘤细胞，以刺激CD19CAR T移植物细胞。通过流式细胞术，通过门控活的GFP-HLA-A2-TCRαβ-CD56-CD4+CD8+(CAR+)和期望的基因编辑(例如，CD58 KO)使用绝对计数来确定移植物T细胞的存活。

PBMC MLR(图4)在96孔板中，用200,000个HLA-A2+宿主PBMC细胞接种20,000个HLA-A2-移植物T细胞(10:1效应物:靶标比率)，并在R10+20IU/mL IL-2中在37℃、5％ CO₂下培养9天。每3-4天向细胞供给新鲜的R10+IL-2。通过流式细胞术，通过门控活的HLA-A2-TCRαβ-CD56-CD4+CD8+和期望的基因编辑(例如，CD58 KO)来确定移植物T细胞的存活。

一般方法

KO T细胞的产生

使用磁激活细胞分选(MACS)阴性选择(美天旎公司(Miltenyi)，人pan T细胞分离试剂盒，目录号130-096-535)从冷冻的健康供体外周血单核细胞(PBMC)中分离原代人T细胞，并且在R10(RPMI-1640+10％ FBS+25mM HEPES+丙酮酸钠+非必需氨基酸)中用1:100(v:v)T细胞TransAct(美天旎公司，目录号130-111-160)+100IU/mL IL-2(美天旎公司，目录号130-097-746)激活。2天之后，使用Neon转染系统(英杰公司(Invitrogen))对T细胞进行基因编辑。简言之，核糖核蛋白(RNP)复合物通过将cas9酶(IDT，目录号1081059)和sgRNA以1:1摩尔比在室温下混合10分钟而产生。如果使用两个sgRNA，则以0.5:0.5:1比率(sgRNA1:sgRNA2:cas9)用cas9进行温育。细胞在1600V、10ms宽度下进行总共3次脉冲，并且立即在补充有100IU/mL IL-2+10ng/mL IL-7(美天旎公司，目录号130-095-363)的R10培养基中回收。将经编辑的T细胞在37℃、5％ CO₂下温育。第二天向细胞中添加含有100IU/mL IL-2的新鲜R10。基因编辑后5-7天，通过流式细胞仪评估KO效率。KO效率从大约50％至高达约100％的范围内。KO效率通过多种方式进行评估：对于TRAC，评估CD3/TCRab表达；对于β2m、NLRC5和RFX5，使用抗β2m或抗HLA抗体。较低的编辑效率是可接受的，因为经编辑的细胞如下文所描述被纯化。在约第22天检查了KO，并且发现其相对稳定。

根据制造商的建议，使用MACS阴性选择(干细胞科技公司(Stem CellTechnologies)，EasySep人TCRα/β耗竭试剂盒，目录号17847)纯化TRACKO细胞。立即使用纯化的T细胞，或在90％ FBS+10％ DMSO中以5e6个细胞等份冷冻。

表4.2：sgRNA序列表

实施例5-NSG小鼠模型中的T细胞排斥

具有各种基因敲除(KO)的CAR T细胞(例如，如本文所述的CD19CAR T细胞)的持久性和抗肿瘤功效可在体内同种异体T细胞排斥模型中进行评估。从杰克逊实验室(缅因州巴尔港(Bar Harbor,ME))获得合适的小鼠，例如8-12周龄的NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠。NSG小鼠接受辐射(例如，在第6天接受1Gy辐射)并接受适当数目的同种异体人T细胞，例如7×10⁶个源自HLA-A2+接受者的体外扩增的同种异体人T细胞。简言之，在从冷冻保存中恢复后，立即例如，使用T细胞TransAct^TM(美天旎生物科技公司(Miltenyi Biotec)，加利福尼亚州奥本(Auburn,CA)；1:100稀释)，在补充有5％人AB血清(吉迷尼生物制品公司(Gemini Bio-Products)，加利福尼亚州西萨克拉门托(WestSacramento,CA))和100IU/mL IL-2(美天旎生物科技公司，加利福尼亚州奥本)的X-Vivo15培养基(龙沙公司，瑞士巴塞尔(Basel,Switzerland))中活化同种异体T细胞。活化后两天，将T细胞离心以去除TransAct，然后重悬于例如补充有5％人AB血清和100IU/ml IL-2的新鲜XVivo-15培养基中6-8天，之后经由静脉注射进行动物给药。第4天，小鼠经由静脉注射接受表达CAR T靶标的细胞，例如1×10⁵个荧光素酶标记的Β2M KO Raj i肿瘤细胞。第-1天，基于全身生物发光对小鼠进行随机分组。第0天，从具有各种基因编辑修饰(例如，单独的TRAC KO或具有CD48、CD58、ICAM-1、β2m、NLRC5和RFX5中的一者或多者的KO)的HLA-A2-供体产生的CD19 CAR T细胞静脉注射适当数目的细胞，例如3×10⁶个CAR⁺细胞。通过用未转导的T细胞归一化，所有组中的总T细胞数保持恒定。在指定时间点通过全身生物发光跟踪Raji肿瘤的生长。为了跟踪体内CAR T细胞的持久性，获得外周血，例如，在CAR T给药后第2、9和16天通过面颊放血获得40μL外周血。红细胞裂解后，用抗体(例如，抗人CD45、HLA-A2和抗独特型抗体)对样品进行染色，以鉴定CD19 CAR T细胞。使用计数珠粒(123counteBeads，赛默飞世尔(Thermo Fisher))将CAR T细胞计数归一化。N＝8只小鼠/每组。

实施例6同基因小鼠模型中的NK排斥

基因编辑的小鼠T细胞的产生：收获具有CD45.2等位基因的C57BL/6小鼠的脾脏，并获得单细胞悬浮液，例如通过gentleMAC离解器(美天旎公司)获得。然后例如用小鼠T细胞分离试剂盒II纯化小鼠T细胞，随后用小鼠T细胞活化/扩增试剂盒活化按照制造商的方案(美天旎公司)活化。在活化后，例如，活化后一天，将小鼠T细胞进行基因编辑，例如，与人T细胞类似，用CRISPR/Cas9经由电穿孔(Nucleofector 4D，龙沙公司)进行。所用的示例性sgRNA序列列于上表4.1或4.2中。在动物给药前，在合适的条件下体外扩增经基因编辑的小鼠T细胞，例如在IL-2(40ng/ml)和IL-7(40ng/ml)存在下扩增6天。

移植物T细胞的过继转移：从杰克逊实验室(缅因州巴尔港)获得合适的小鼠，例如具有CD45.1或CD45.2等位基因的8-12周龄的C57BL/6小鼠。具有CD45.1等位基因的C59BL/6小鼠在第-3天接受例如2.5Gy的辐射，并在第0天经由静脉注射接受1×10⁷个来自C57BL/6小鼠的对照(非基因编辑的)或经基因编辑的(CD48、CD58、ICAM-1、β2m、NLRC5和RFX5中一者或多者的KO)体外扩增T细胞，例如具有CD45.2等位基因的扩增T细胞。一些具有CD45.1等位基因的C57BL/6小鼠也在第-3天和第0天经由腹膜内注射接受NK耗竭抗体(抗NK1.1抗体，生物细胞公司(BioXcell))，每次注射200ug/小鼠，并表示为“+NK耗竭”队列。通过流式细胞术跟踪外周血中宿主免疫细胞和移植物T细胞的细胞计数。在移植物T细胞给药后的指定时间点，通过面颊放血获得样品，例如40μL外周血。红细胞裂解后，对于CD45.1、CD45.2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD335、CD11b和H2-K^b用抗小鼠抗体对样品进行染色，以鉴定移植物T细胞和宿主免疫细胞亚群。使用计数珠粒(123count eBeads，赛默飞世尔(Thermo Fisher))将细胞计数归一化。N＝5只小鼠/每组。示出平均值±SEM。

在移植物给药前使用亚致死辐射暂时减少C57BL/6小鼠的宿主免疫细胞。一些小鼠还接受NK耗竭抗体以深度耗竭残留的NK细胞。然后将来自同基因小鼠的经基因编辑的(如本文所述的一种或多种KO)或未编辑的对照移植物T细胞过继转移至宿主。在不同的时间点通过流式细胞术跟踪过继转移的T细胞的植入。

本文所引用的所有参考文献，包含专利、专利申请、论文、教科书等，以及本文所引用的参考文献，就其尚未被引用的程度而言，在此通过引用整体并入。

尽管已经参考各种应用、方法、试剂盒和组合物描述了所公开的教导，但是应当理解，可以在不偏离本文教导和下文所要求保护的本发明的情况下进行各种改变和修改。提供前述实例是为了更好地说明所公开的教导，而不旨在限制本文所呈现的教导的范围。虽然已经根据这些示例性实施方案描述了本发明教导，但是本领域的技术人员将容易理解，这些示例性实施方案的许多变化和修改是可能的，而无需过度实验。所有此类变化和修改都处于本当前教导的范围内。

Claims

1.一种包含基因组修饰的经工程化的免疫细胞，所述基因组修饰相对于没有所述基因组修饰的细胞，功能性地削弱或降低(i)RFX5和/或NLRC5和(ii)CD58的表达。

2.如权利要求1所述的经工程化的免疫细胞，其中所述基因组修饰包含(i)RFX5和/或NLRC5和/或(ii)CD58的敲低和/或敲除。

3.如权利要求1或2所述的经工程化的免疫细胞，其中所述基因组修饰包含在(i)RFX5和/或NLRC5和(ii)CD58的基因座处的一个或多个修饰。

4.如权利要求1至3中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中所述基因组修饰包含在(i)RFX5和/或NLRC5和(ii)CD58的基因座处的缺失或插入。

5.如权利要求1至4中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中所述基因组修饰选自由以下项组成的组：(i)一个或多个核苷酸的插入，(ii)编码蛋白质的多核苷酸序列的插入，(iii)一个或多个核苷酸的缺失，和(iv)一个或多个核苷酸的取代。

6.如权利要求1至5中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中所述基因组修饰通过选自TALEN、锌指、Cas-CLOVER和CRISPR/Cas系统的基因编辑技术引入。

7.如权利要求1所述的经工程化的免疫细胞，其中所述基因组修饰包含RNA干扰序列的插入。

8.如权利要求7所述的经工程化的免疫细胞，其中所述RNA干扰序列是shRNA序列、siRNA序列或miRNA序列。

9.如权利要求7或8所述的经工程化的免疫细胞，其中所述RNA干扰序列包含与(i)RFX5和/或NLRC5和/或(ii)CD58基因序列互补的序列。

10.如权利要求1至9中任一项所述的经工程化的免疫细胞，所述经工程化的免疫细胞还包含编码抗原结合蛋白和/或CD70结合蛋白的多核苷酸序列。

11.如权利要求10所述的经工程化的免疫细胞，其中所述抗原结合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。

12.如权利要求1至11中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中所述细胞被进一步经工程化以包含一个或多个基因组修饰，所述一个或多个基因组修饰相对于未经工程化的细胞功能性地削弱或降低ICAM-1、TAP2、β2m、TRAC、CIITA、RFXAP、RFXANK和CD48中的一者或多者的表达。

13.如权利要求1至12中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中与不包含所述基因组修饰的免疫细胞相比，所述经工程化的免疫细胞具有改善的持久性和/或改善的针对同种异体反应性免疫细胞排斥的抗性。

14.如权利要求13所述的经工程化的免疫细胞，其中所述同种异体反应性免疫细胞排斥包括同种异体反应性T细胞介导的排斥和/或同种异体反应性自然杀伤(NK)细胞介导的排斥。

15.如权利要求1至14中任一项所述的经工程化的免疫细胞，所述经工程化的免疫细胞包含功能性地削弱或降低RFX5和CD58的表达的一个或多个基因组修饰。

16.如权利要求1至14中任一项所述的经工程化的免疫细胞，所述经工程化的免疫细胞包含功能性地削弱或降低NLRC5和CD58的表达的一个或多个基因组修饰。

17.如权利要求1至14中任一项所述的经工程化的免疫细胞，所述经工程化的免疫细胞包含功能性地削弱或降低RFX5、NLRC5和CD58的表达的一个或多个基因组修饰。

18.如权利要求1至17中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中β2m以降低的水平功能性地表达。

19.如权利要求1至17中任一项所述的经工程化的免疫细胞，所述经工程化的免疫细胞包含未修饰的β2m基因，或其中β2m不以降低的水平功能性地表达。

20.如权利要求13所述的经工程化的免疫细胞，其中所述增加的持久性是通过混合淋巴细胞反应(MLR)测定能够确定的和/或确定的。

21.如权利要求13所述的经工程化的免疫细胞，其中所述改善的针对同种异体反应性免疫细胞排斥的抗性是通过MLR测定能够确定的和/或确定的。

22.如权利要求1至21中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中所述经工程化的免疫细胞表现出：

(i)在细胞表面处降低水平的MHC I类蛋白或复合物表达，

(ii)在所述细胞表面处降低水平的MHC II类蛋白或复合物表达，或

(iii)在所述细胞表面处降低水平的MHC I类蛋白或复合物表达，和在所述细胞表面处降低水平的MHC II类蛋白或复合物表达。

23.如权利要求10或11所述的经工程化的免疫细胞，其中所述抗原结合蛋白是CAR。

24.如权利要求10或11所述的经工程化的免疫细胞，所述经工程化的免疫细胞表达所述抗原结合蛋白和/或所述CD70结合蛋白。

25.如权利要求10所述的经工程化的免疫细胞，其中编码所述抗原结合蛋白和/或所述CD70结合蛋白的所述多核苷酸序列位于被破坏的CD58、RFX5、NLRC5、ICAM-1、CD48、TAP2、β2m、TRAC、CIITA、RFXAP或RFXANK基因座内。

26.如权利要求1至25中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中所述经工程化的免疫细胞还包含内源TCRa基因的一个或多个基因组修饰。

27.如权利要求26所述的经工程化的免疫细胞，其中所述经工程化的免疫细胞还包含内源CD52基因的一个或多个基因组修饰。

28.如权利要求1至27中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中所述经工程化的免疫细胞是或获自健康志愿者的免疫细胞，获自患者，或获自诱导多能干细胞(iPSC)。

29.如权利要求1至27中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中所述经工程化的免疫细胞不是自然杀伤(NK)细胞，或者不是获自健康志愿者或患者的NK细胞。

30.如权利要求1至27中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中所述经工程化的免疫细胞不是获自iPSC。

31.一种经工程化的免疫细胞群体，所述经工程化的免疫细胞群体包含如权利要求1至30中任一项所述的经工程化的细胞，其中不超过50％的所述经工程化的免疫细胞功能性地表达(i)RFX5和/或NLRC5和(ii)CD58。

32.如权利要求31所述的群体，其中不超过50％的所述经工程化的免疫细胞功能性地表达RFX5和CD58。

33.如权利要求31所述的群体，其中不超过50％的所述经工程化的免疫细胞功能性地表达NLRC5和CD58。

34.如权利要求31所述的群体，其中不超过50％的所述经工程化的免疫细胞功能性地表达RFX5、NLRC5和CD58。

35.如权利要求31至34中任一项所述的群体，其中不超过50％的所述经工程化的免疫细胞还功能性地表达

a)ICAM-1、CD48、TAP2、β2m、TRAC、CIITA、RFXAP和RFXANK中的任何一者或多者；或

b)ICAM-1和CD48中的仅一者；或

c)CD48和ICAM-1两者。

36.如权利要求31至35中任一项所述的群体，其中与未经工程化的免疫细胞相比，所述经工程化的免疫细胞群体的经工程化的免疫细胞具有改善的持久性和/或改善的针对同种异体反应性免疫细胞排斥的抗性，

任选地其中所述改善的抗性是针对同种异体反应性T细胞介导的排斥和/或同种异体反应性自然杀伤细胞(NK)介导的排斥，并且

任选地其中所述增加的持久性是通过混合淋巴细胞反应(MLR)测定能够确定的和/或确定的，和/或其中所述改善的针对同种异体反应性免疫细胞排斥的抗性是通过MLR测定能够确定的和/或确定的。

37.一种经工程化的免疫细胞群体，所述经工程化的免疫细胞群体包含如权利要求1至30中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中至少1％的所述经工程化的免疫细胞以不大于未经工程化的免疫细胞中的所述表达水平的50％的水平功能性地表达(i)RFX5和/或NLRC5和(ii)CD58。

38.如权利要求37所述的群体，其中至少1％的所述经工程化的免疫细胞以不大于未经工程化的免疫细胞中的所述表达水平的50％的水平功能性地表达RFX5和CD58。

39.如权利要求37所述的群体，其中至少1％的所述经工程化的免疫细胞以不大于未经工程化的免疫细胞中的所述表达水平的50％的水平功能性地表达NLRC5和CD58。

40.如权利要求37所述的群体，其中至少1％的所述经工程化的免疫细胞以不大于未经工程化的免疫细胞中的所述表达水平的50％的水平功能性地表达RFX5、NLRC5和CD58。

41.如权利要求37所述的群体，其中至少1％的所述经工程化的免疫细胞功能性地表达a)ICAM-1、CD48、TAP2、β2m、TRAC、CIITA、RFXAP和RFXANK中的任何一者或多者；或

b)ICAM-1和CD48中的仅一者；或

c)CD48和ICAM-1两者，

表达水平不大于未经工程化的免疫细胞中的所述表达水平的50％。

42.如权利要求37至41中任一项所述的群体，其中与未经工程化的免疫细胞相比，所述经工程化的免疫细胞群体的经工程化的免疫细胞具有改善的持久性和/或改善的针对同种异体反应性免疫细胞排斥的抗性，

43.如权利要求31至42中任一项所述的经工程化的免疫细胞群体，其中至少50％的所述经工程化的免疫细胞表现出在所述细胞表面处降低水平的MHC I类蛋白或复合物表达。

44.如权利要求31至43中任一项所述的经工程化的免疫细胞群体，其中所述经工程化的免疫细胞群体包含至少10％经工程化的T细胞、至少20％经工程化的T细胞、至少30％经工程化的T细胞、至少40％经工程化的T细胞、至少50％经工程化的T细胞、至少75％经工程化的T细胞或至少90％经工程化的T细胞。

45.如权利要求31至44中任一项所述的经工程化的免疫细胞群体，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％或至少90％的所述经工程化的免疫细胞进一步表达抗原结合蛋白或CD70结合蛋白。

46.如权利要求45所述的经工程化的免疫细胞群体，其中所述抗原结合蛋白是CAR或TCR。

47.如权利要求45所述的经工程化的免疫细胞群体，其中将编码所述抗原结合蛋白和/或所述CD70结合蛋白的核酸插入被破坏的CD58、RFX5、NLRC5、CD48、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、RFX5、RFXAP、CIITA和RFXANK基因座中。

48.如权利要求46所述的经工程化的免疫细胞群体，其中将编码所述CAR的核酸插入被破坏的CD58、RFX5、NLRC5、CD48、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、RFX5、RFXAP、CIITA和RFXANK基因座中。

49.如权利要求46所述的经工程化的免疫细胞群体，其中将编码所述TCR的核酸插入被破坏的基因座中，所述被破坏的基因座不是被破坏的CD58、RFX5、NLRC5、CD48、ICAM-1、TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、RFX5、RFXAP、CIITA和RFXANK基因座。

50.如权利要求31至49中任一项所述的经工程化的免疫细胞群体，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％或至少90％的所述经工程化的细胞还包含内源TCRa基因和内源CD52基因中的一者或多者的一个或多个基因组修饰。

51.如权利要求31至50中任一项所述的经工程化的免疫细胞群体，其中至少10％、20％、30％、40％、50％、75％或90％的所述经工程化的免疫细胞进一步表达一种或多种选自由以下项组成的组的蛋白质：HLA-E、HLA-E单链三聚体、HLA-G或HLA-G单链三聚体、UL18或UL18单链三聚体、HLA-A2和HLA-A2单链三聚体。

52.如权利要求31至51中任一项所述的经工程化的免疫细胞群体，其中TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、RFX5、RFXAP、CIITA和RFXANK中的一者或多者的功能性表达水平通过确定所述经工程化的免疫细胞的表面上HLA、β2微球蛋白(B2M)或HLA和B2M两者的表面表达水平来测量，或通过流式细胞术来测量。

53.如权利要求31至51中任一项所述的经工程化的免疫细胞群体，其中CD48、CD58和ICAM-1中的一者或多者的功能性表达水平通过确定所述经工程化的免疫细胞的表面上CD48、CD58和ICAM-1中的一者或多者的表面表达水平来测量，或通过流式细胞术来测量。

54.一种制备如权利要求1至30中任一项所述的经工程化的免疫细胞或如权利要求31至53中任一项所述的群体的方法，所述方法包括

a)修饰经工程化的免疫细胞的基因组，并且

b)产生包含基因组修饰的所述经工程化的免疫细胞。

55.如权利要求54所述的方法，其中使用TALEN、锌指、Cas-CLOVER或CRISPR/Cas系统来修饰所述经工程化的免疫细胞的基因组。

56.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1至30中任一项所述的经工程化的免疫细胞、如权利要求31至53中任一项所述的经工程化的免疫细胞群体或通过如权利要求54或55所述的方法制备的经工程化的免疫细胞，并且还包含至少一种药学上可接受的载体或赋形剂，并且任选地

其中所述经工程化的免疫细胞或所述群体的一种或多种细胞(i)进一步表达一种或多种选自由以下项组成的组的蛋白质：HLA-E、HLA-E单链三聚体、HLA-G、HLA-G单链三聚体、UL18、UL18单链三聚体、HLA-A2、HLA-A2单链三聚体和人巨细胞病毒(HCMV)US11，和/或(ii)被进一步经工程化为不表达或以降低的水平表达TAP2、NLRC5、β2m、TRAC、CIITA、RFXANK、RFXAP和RFX5中的任何一者或多者。

57.一种治疗受试者病状的方法，所述方法包括向所述受试者施用：

如权利要求1至30中任一项所述的经工程化的免疫细胞、如权利要求31至53中任一项所述的经工程化的免疫细胞群体、通过如权利要求54或55所述的方法制备的经工程化的免疫细胞，或如权利要求56所述的药物组合物。

58.如权利要求57所述的方法，其中所述病状为实体瘤或液体瘤。

59.一种改善同种异体经工程化的免疫细胞的(i)持久性或(ii)针对同种异体反应性免疫细胞排斥的抗性的方法，所述方法包括

a)修饰同种异体免疫细胞以引入一个或多个基因组修饰以提供同种异体经工程化的免疫细胞，所述基因组修饰功能性地削弱或降低(i)RFX5和/或NLRC5和(ii)CD58的表达；并且

b)向受试者施用所述同种异体经工程化的免疫细胞。

60.如权利要求59所述的方法，其中所述基因组修饰包含(i)RFX5和/或NLRC5和/或(ii)CD58的敲低和/或敲除。

61.如权利要求59或60所述的方法，其中所述基因组修饰包含在(i)RFX5和/或NLRC5和(ii)CD58的基因座处的一个或多个修饰。

62.如权利要求59至61中任一项所述的方法，其中所述基因组修饰包含在(i)RFX5和/或NLRC5和(ii)CD58的基因座处的缺失或插入。

63.如权利要求59至62中任一项所述的方法，其中所述基因组修饰选自由以下项组成的组：(i)一个或多个核苷酸的插入，(ii)编码蛋白质的序列的插入，(iii)一个或多个核苷酸的缺失，和(iv)一个或多个核苷酸的取代。

64.如权利要求59至63中任一项所述的方法，其中所述基因组修饰通过选自TALEN、锌指、Cas-CLOVER和CRISPR/Cas系统的基因编辑技术引入。

65.如权利要求59所述的方法，其中所述基因组修饰包含RNA干扰序列的插入。

66.如权利要求65所述的方法，其中所述干扰序列是shRNA序列、siRNA序列或miRNA序列。

67.如权利要求65或66所述的方法，其中所述干扰序列包含与(i)RFX5和/或NLRC5和(ii)CD58基因序列互补的序列。

68.如权利要求59至67中任一项所述的方法，其中所述同种异体经工程化的免疫细胞还包含编码抗原结合蛋白和/或CD70结合蛋白的多核苷酸序列。

69.如权利要求68所述的方法，其中所述抗原结合蛋白是CAR或TCR。

70.如权利要求59至69中任一项所述的方法，其中所述同种异体经工程化的免疫细胞被进一步经工程化以包含一个或多个基因组修饰，所述一个或多个基因组修饰相对于没有所述修饰的细胞功能性地削弱或降低ICAM-1、TAP2、β2m、TRAC、CIITA、RFXAP、RFXANK和CD48中的一者或多者的表达。

71.如权利要求59至70中任一项所述的方法，其中所述基因组修饰功能性地削弱或降低表达至没有所述基因组修饰的细胞中的相应水平的约50％或更少。

72.如权利要求59至71中任一项所述的方法，其中与同种异体未经工程化的免疫细胞相比，所述同种异体经工程化的免疫细胞具有改善的持久性和/或改善的针对同种异体反应性免疫细胞排斥的抗性。

73.如权利要求59至72中任一项所述的方法，其中所述改善的抗性是针对同种异体反应性T细胞介导的排斥和/或同种异体反应性自然杀伤细胞(NK)介导的排斥。

74.如权利要求59至73中任一项所述的方法，其中所述增加的持久性是通过混合淋巴细胞反应(MLR)测定能够确定的和/或确定的，和/或其中所述改善的针对同种异体反应性免疫细胞排斥的抗性是通过MLR测定能够确定的和/或确定的。

75.如权利要求59至74中任一项所述的方法，其中所述方法包括功能性地削弱或降低RFX5和CD58的表达。

76.如权利要求59至74中任一项所述的方法，其中所述方法包括功能性地削弱或降低NLRC5和CD58的表达。

77.如权利要求59至74中任一项所述的方法，其中所述方法包括功能性地削弱或降低RFX5、NLRC5和CD58的表达。

78.如权利要求59至77中任一项所述的方法，其中(i)RFX5和/或NLRC5和(ii)CD58的表达水平的降低程度是分别相对于尚未经修饰的相同类型的细胞中(i)RFX5和/或NLRC5和(ii)CD58的表达水平确定的。

79.如权利要求59至78中任一项所述的方法，其中CD48、CD58和ICAM-1中的一者或多者的功能性表达水平通过确定所述经工程化的免疫细胞的表面上CD48蛋白、CD58蛋白或ICAM-1蛋白的表面表达水平来测量。

80.如权利要求59至79中任一项所述的方法，其中RFX5和/或NLRC5的功能性表达水平通过确定所述经工程化的免疫细胞的表面上HLA、β2微球蛋白(B2M)或HLA和B2M两者的表面表达水平来测量。

81.如权利要求79或80所述的方法，其中所述表面表达水平通过流式细胞术来测量。

82.如权利要求59至81中任一项所述的方法，其中所述方法还包括引入TCRa基因和CD52基因中的一者或多者的一个或多个基因组修饰。

83.如权利要求59至82中任一项所述的方法，其中所述同种异体经工程化的免疫细胞包含未修饰的β2m基因，或者其中β2m在所述同种异体经工程化的免疫细胞中不以降低的水平功能性地表达。

84.如权利要求20至30中任一项所述的经工程化的免疫细胞，所述经工程化的免疫细胞包含未修饰的β2m基因，或其中β2m在所述经工程化的免疫细胞中不以降低的水平功能性地表达。

85.如权利要求1至30中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中β2m、RFX5、NLRC5、CIITA和TAP2中一者或多者的表达未功能性受损或降低。

86.如权利要求31至53中任一项所述的经工程化的免疫细胞群体，所述经工程化的免疫细胞群体不包含β2m、RFX5、NLRC5、CIITA或TAP2基因中的一者或多者的基因组修饰。

87.如权利要求31至53中任一项所述的经工程化的免疫细胞群体，其中β2m、RFX5、NLRC5、CIITA或TAP2中一者或多者的表达未功能性受损或降低。

88.如权利要求54或55所述的方法，其中所述基因组修饰不包含β2m的基因组修饰。

89.如权利要求54或55所述的方法，其中所述基因组修饰不包含β2m、RFX5、NLRC5、CIITA和TAP2中的一者或多者的基因组修饰。

90.如权利要求59至83中任一项所述的方法，其中在所述经工程化的免疫细胞中β2m的表达未功能性受损或降低。

91.如权利要求59至83中任一项所述的方法，其中所述基因组修饰不包含β2m的基因组修饰。

92.如权利要求59至83中任一项所述的方法，其中所述基因组修饰不包含β2m、RFX5、NLRC5、CIITA和TAP2中的一者或多者的基因组修饰。

93.如权利要求68或69所述的经工程化的免疫细胞，所述经工程化的免疫细胞表达所述CD70结合蛋白。

94.如权利要求11至30中任一项所述的经工程化的免疫细胞，所述经工程化的免疫细胞还包含编码CD70结合蛋白的多核苷酸序列。

95.如权利要求94所述的经工程化的细胞，所述经工程化的细胞表达所述CD70结合蛋白。

96.如权利要求1至30和84至85中任一项所述的经工程化的细胞，或如权利要求31至53和86至87中任一项所述的群体，或如权利要求54至55、57至83和88至92中任一项所述的方法，其中所述CD70结合蛋白包含CD70结合结构域和跨膜结构域。

97.如权利要求96所述的经工程化的细胞、群体或方法，其中所述CD70结合结构域构成CD70抗体、或CD70受体或其CD70结合片段。

98.如权利要求96或97所述的经工程化的细胞、群体或方法，其中所述CD70结合结构域构成抗CD70抗体，任选地所述抗CD70抗体是scFv。

99.如权利要求96至98中任一项所述的经工程化的细胞、群体或方法，其中所述CD70结合蛋白还包含铰链结构域，任选地所述铰链结构域包含CD8铰链。

100.如权利要求96至99中任一项所述的经工程化的细胞、群体或方法，其中所述CD70结合蛋白还包含一个或多个选自由以下项组成的组的细胞内信号传导结构域：CD3z信号传导结构域、CD3d信号传导结构域、CD3g信号传导结构域、CD3e信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD2信号传导结构域、OX40信号传导结构域和4-1BB信号传导结构域或它们的变体。

101.如权利要求96至100中任一项所述的经工程化的细胞、群体或方法，其中所述CD70结合蛋白包含CD3z或CD3g信号传导结构域，并且不包含共刺激结构域。

102.如权利要求96至101中任一项所述的经工程化的细胞、群体或方法，其中所述CD70结合蛋白包含4-1BB信号传导结构域，并且不包含CD3z信号传导结构域。

103.如权利要求96至98中任一项所述的经工程化的细胞、群体或方法，其中所述CD70结合蛋白包含4-1BB信号传导结构域和CD3z信号传导结构域。

104.如权利要求109至101中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中所述一个或多个细胞内结构域包含SEQ ID NO:1、7-14、17-70或89-90中的一者或多者的氨基酸序列。

105.如权利要求96至102中任一项所述的经工程化的细胞、群体或方法，其中所述CD70结合蛋白不包含细胞内信号传导结构域。