TW201903143A - 改良之ｔ細胞組成物及方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供向下調節第I類主要組織相容性分子細胞表面表現之組成物及方法，及此等組成物及方法用於改良單離之T細胞(例如經基因修飾之抗原特異性T細胞，諸如嵌合性抗原受體T(CAR-T)細胞)的功能活性之用途。本發明特別提供用於增強CAR-T細胞的治療功效之方法及組成物。

Description

改良之Ｔ細胞組成物及方法

本發明一般關於經工程化以表現嵌合性抗原受體(CAR)之免疫細胞(例如T細胞)治療疾病之用途。

嵌合性抗原受體T(CAR-T)細胞已進入臨床且證實非常有希望的結果(Maus, M.等人之2014, Blood 123, 2625-35)。儘管大多數的個體已經個體自身的T細胞衍生之自體CAR-T細胞治療，但是自健康的給予體衍生之同種異體CAR-T細胞提供更有商業可行性的現成選擇，具有治療更廣泛的個體之可能性。 　　同種異體CAR-T細胞係藉由以腫瘤相關抗原特異性活化之CAR賦予來自健康的給予體之T細胞而產生。給予體不相容性可能導致移植物對抗宿主(GvH)疾病或通過宿主對抗移植物(HvG)排斥而消除CAR-T細胞，如已以同種異體移植物的觀察。以個體免疫系統的同種異體T細胞排斥可能限制同種異體CAR-T細胞的持續性，且與自體CAR-T細胞相比，導致降低的功效(Berger, C.等人，2015, Cancer Immunol Res 3, 206-16；Kochenderfer, J.等人，2013, Blood 122, 4129-39)。這在長期CAR-T持續性對持久反應可能重要的情況下(諸如實體腫瘤)可能特別重要。 　　因此，對具有改良之持續性的同種異體CAR-T細胞仍有需求。

本發明提供向下調節第I類主要組織相容性(第I類MHC)細胞表面表現之組成物及方法，及此等組成物及方法用於改良經基因修飾之T細胞(例如經基因修飾之抗原特異性T細胞，諸如嵌合性抗原受體T(CAR-T)細胞)的功能活性之用途。本發明特別提供用於增強CAR-T細胞的治療功效之方法及組成物。雖然不受理論的束縛，但是病毒蛋白質的表現導致降低之第I類MHC細胞表面表現，造成降低之T細胞識別，其導致增加之活體內持續性及因此改良之CAR-T細胞功效。 　　在一個態樣中，本發明提供單離之T細胞，其包含病毒蛋白質，其降低第I類主要組織相容性複合體(MHC)之細胞表面表現量，該降低係與不包含病毒蛋白質的單離之T細胞的第I類MHC之細胞表面表現量相比，及包含嵌合性抗原受體(CAR)，其包含細胞外配體結合域、跨膜域和細胞內傳訊域。 　　在一些實施態樣中，病毒蛋白質可為人類巨細胞病毒(hCMV)蛋白質、腺病毒蛋白質、疱疹病毒蛋白質或人類免疫缺乏病毒蛋白質。在一些實施態樣中，病毒蛋白質可為BFP、ICP47、K3、K5、E19、US3、US6、US2、U21、Nef、US10或U21。在一些實施態樣中，病毒蛋白質可為K5。在一些實施態樣中，單離之T細胞不表現任何在其表面上可偵測的第I類MHC分子。在一些實施態樣中，本發明的單離之T細胞表現CAR及向下調節第I類MHC細胞表面表現之病毒蛋白質。 　　在一些實施態樣中，病毒蛋白質未顯著地降低CAR之細胞表面表現，該降低係與包含CAR但不包含病毒蛋白質的單離之T細胞的CAR之細胞表面表現量。 　　在一些實施態樣中，單離之T細胞可另外包含NK細胞拮抗劑。在一些實施態樣中，NK細胞拮抗劑可為抗NK細胞抑制性受體抗體。在一些實施態樣中，抗NK細胞抑制性受體抗體包含單鏈可變片段(scFv)。在一些實施態樣中，抗NK細胞抑制性受體抗體特異性結合殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)、CD94–NKG2A/C/E異二聚體、2B4(CD244)受體或殺手細胞凝集素樣受體G1(KLRG1)受體。在一些實施態樣中，KIR可為KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B或KIR2DL4。 　　在一些實施態樣中，單離之T細胞展現改良之活體內持續性，其係與包含CAR但不包含病毒蛋白質的單離之T細胞的活體內持續性相比。 　　在一些實施態樣中，單離之T細胞在組織不相容的接受者中不誘出或誘出降低之移植物對抗宿主疾病(GVHD)反應，其係與由包含CAR但不包含病毒蛋白質的單離之T細胞所誘出之GVHD反應相比。在一些實施態樣中，接受者為人類或猴子。 　　在另一態樣中，本發明提供包含複數個單離之T細胞的CAR-T細胞群，該單離之T細胞包含病毒蛋白質，其降低第I類主要組織相容性複合體(MHC)之細胞表面表現量，該降低係與不包含病毒蛋白質的單離之T細胞的第I類MHC之細胞表面表現量相比，及包含嵌合性抗原受體(CAR)，其包含細胞外配體結合域、跨膜域和細胞內傳訊域。 　　在一些實施態樣中，第I類MHC之細胞表面表現量與在不包含病毒蛋白質之T細胞上的第I類MHC之細胞表面表現量相比，降低至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%。在一些實施態樣中，第I類MHC之細胞表面表現量可以流動式細胞測量術測量。 　　在一些實施態樣中，投予包含CAR及所選擇之病毒蛋白質的本發明之T細胞與投予不表現病毒蛋白質之T細胞相比，降低至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%之排斥。在一些實施態樣中，病毒蛋白質係選自表1。 　　在一些實施態樣中，投予包含CAR及病毒蛋白質的本發明之T細胞與投予不表現病毒蛋白質之T細胞相比，增加至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%之反應持續期。在一些實施態樣中，病毒蛋白質係選自表1。 　　在一些實施態樣中，投予包含CAR及病毒蛋白質的本發明之T細胞與投予不表現病毒蛋白質之T細胞相比，改良至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%之持續性。在一些實施態樣中，病毒蛋白質係選自表1。 　　在一些實施態樣中，投予包含CAR及病毒蛋白質的本發明之T細胞與投予不表現病毒蛋白質之T細胞相比，降低至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%之GVHD之發病率。在一些實施態樣中，病毒蛋白質係選自表1。 　　在另一態樣中，本發明提供產生單離之T細胞的方法，其中該方法包含修飾表現CAR之T細胞以表現病毒蛋白質，其中CAR包含細胞外配體結合域、跨膜域和細胞內傳訊域。在一些實施態樣中，該方法可另外包含修飾T細胞以表現抗NK細胞拮抗劑的步驟。 　　在一些實施態樣中，編碼病毒蛋白質之多核苷酸可藉由例如而非限制的電穿孔而引入細胞中。 　　在一些實施態樣中，編碼嵌合性抗原受體之多核苷酸可藉由轉位子/轉位酶系統、基於病毒之基因轉移系統或電穿孔而引入細胞中。 　　在一些實施態樣中，基於病毒之基因轉移系統包含重組的反轉錄病毒或慢病毒。 　　在一些實施態樣中，修飾T細胞以表現抗NK細胞拮抗劑的步驟包含藉由例如而非限制的電穿孔而引入編碼NK細胞拮抗劑之多核苷酸至細胞中。 　　在另一態樣中，本發明提供用於治療病症之醫藥組成物，其中組成物包含單離之T細胞，該單離之T細胞包含病毒蛋白質，其降低第I類主要組織相容性複合體(MHC)之細胞表面表現量，其係與不包含病毒蛋白質的單離之T細胞的第I類MHC之細胞表面表現量相比，及包含嵌合性抗原受體(CAR)，其包含細胞外配體結合域、跨膜域和細胞內傳訊域。在一些實施態樣中，組成物另外包含NK細胞拮抗劑。 　　在一些實施態樣中，病症可為癌症、自體免疫疾病或感染。在一些實施態樣中，細胞可供給一次以上。在一些實施態樣中，細胞可以相隔至少約1、2、3、4、5、6、7或更多天供給個體。在一些實施態樣中，病症可為病毒性疾病、細菌性疾病、癌症、發炎性疾病、免疫性疾病或老化相關性疾病。 　　在另一態樣中，本發明提供治療個體的病症之方法，其中該方法包含投予單離之T細胞，該單離之T細胞包含病毒蛋白質，其降低第I類主要組織相容性複合體(MHC)之細胞表面表現量，其係與不包含病毒蛋白質的單離之T細胞的第I類MHC之細胞表面表現量相比，及包含嵌合性抗原受體(CAR)，其包含細胞外配體結合域、跨膜域和細胞內傳訊域。在一些實施態樣中，該方法另外包含投予NK細胞拮抗劑。在另一態樣中，本發明提供降低接受個體的GVHD之方法，其包含對該個體投予表現CAR及病毒蛋白質之T細胞群。在另一態樣中，本發明提供改良接受個體的持續性之方法，其包含對該個體投予表現CAR及病毒蛋白質之T細胞群。在另一態樣中，本發明提供延長接受個體的持續反應時間之方法，其包含對該個體投予表現CAR及病毒蛋白質之T細胞群。在一些實施態樣中，病毒蛋白質係選自表1。 　　在方法的一些實施態樣中，單離之T細胞可另外包含NK細胞拮抗劑。 　　在方法的一些實施態樣中，NK細胞拮抗劑可為抗NK細胞抑制劑受體抗體。在一些實施態樣中，抗NK細胞抑制性受體抗體可為抗KIR抗體。 　　在一些實施態樣中，細胞可供給個體一次以上。在方法的一些實施態樣中，個體可在投予單離之T細胞前事先經治療劑治療。在一些實施態樣中，治療劑可為抗體或化學治療劑。在一些實施態樣中，病症可為病毒性疾病、細菌性疾病、癌症、發炎性疾病、免疫性疾病或老化相關性疾病。 　　在一些實施態樣中，癌症可為血液惡性腫瘤或實體癌症。在一些實施態樣中，血液惡性腫瘤可選自急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性嗜酸性球性白血病(CEL)、骨髓發育不良症候群(MDS)、非霍奇金(Hodgkin)氏淋巴瘤(NHL)或多發性骨髓瘤(MM)。在一些實施態樣中，實體癌症可選自膽管癌、膀胱癌、骨骼及軟組織癌、腦腫瘤、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸腺癌、結腸直腸癌、硬纖維瘤、胚胎癌、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、胃腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、婦科腫瘤、頭及頸部鱗狀細胞癌、肝癌、肺癌、惡性黑色瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、胰臟導管腺癌、原發性星形細胞瘤、原發性甲狀腺癌、前列腺癌、腎癌、腎細胞癌、橫紋肌肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、睪丸生殖細胞腫瘤、泌尿上皮癌、子宮肉瘤或子宮癌。 　　在一些實施態樣中，該方法可包含對個體投予一或多種額外的治療劑。在一些實施態樣中，額外的治療劑可為抗體或化學治療劑。 　　在另一態樣中，本發明提供編碼下列的多核苷酸：(i)病毒蛋白質，其降低第I類主要組織相容性複合體(MHC)分子之細胞表面表現量，其係與不包含病毒蛋白質的單離之T細胞的第I類MHC分子之細胞表面表現量相比，及(ii)嵌合性抗原受體(CAR)，其中共同表現(i)與(ii)。在一些實施態樣中，(i)及(ii)之編碼序列可操作地連結相同的啟動子。在一些實施態樣中，多核苷酸另外編碼(iii)NK細胞拮抗劑。 　　在另一態樣中，本發明提供包含編碼下列的多核苷酸之載體：(i)病毒蛋白質，其降低第I類主要組織相容性複合體(MHC)分子之細胞表面表現量，其係與不包含病毒蛋白質的單離之T細胞的第I類MHC分子之細胞表面表現量相比，及(ii)嵌合性抗原受體(CAR)，其中共同表現(i)與(ii)。在一些實施態樣中，載體可為病毒載體。

本發明提供改良CAR-T細胞的活體內持續性及治療功效之方法及組成物。本文提供向下調節第I類主要組織相容性(MHC)細胞表面表現之組成物及方法。亦提供此等組成物及方法用於改良單離之T細胞(諸如CAR-T細胞)的功能活性之用途。本文亦提供具有改良之持續性的CAR-T細胞及使用此等CAR-T細胞治療病症之方法。 [一般技術] 　　除非另有其他指示，否則本發明之實施係使用在本技術範圍內的分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學的習知技術。此等技術於文獻中完整地解釋，諸如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait編輯，1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E. Cellis編輯，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I. Freshney編輯，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P. Mather及P.E. Roberts, 1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A. Doyle, J.B. Griffiths及D.G. Newell編輯，1993-1998)J. Wiley and Sons；Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M. Weir and C.C. Blackwell編輯)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M. Miller及M.P. Calos編輯，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel等人編輯，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction, (Mullis等人編輯，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E. Coligan等人編輯，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology(C.A. Janeway及P. Travers, 1997)；Antibodies(P. Finch, 1997)；Antibodies：a practical approach(D. Catty.編輯，IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal antibodies：a practical approach(P. Shepherd及C. Dean編輯，Oxford University Press, 2000)；Using antibodies：a laboratory manual(E. Harlow及D. Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies(M. Zanetti及J.D. Capra編輯，Harwood Academic Publishers, 1995)。 定義 　　如本文所使用的〝自體〞意指用於治療個體的細胞、細胞系或細胞群源自於該個體。 　　如本文所使用的〝同種異體〞意指用於治療個體的細胞或細胞群不源自於該個體，但源自於給予體。 　　如本文所使用的術語〝內源性〞係指來自有機體、細胞、組織或系統內部或於該等內部生產之任何材料。 　　如本文所使用的術語〝外源性〞係指自有機體、細胞、組織或系統外部引入或於該等外部生產之任何材料。 　　如本文所使用的〝免疫細胞〞係指在功能上涉及先天性及/或後天性免疫反應引發及/或執行之造血起源的細胞。免疫細胞的實例包括T細胞(例如α/βT細胞和γ/δT細胞)、B細胞、自然殺手(NK)細胞、自然殺手T(NKT)細胞、肥胖細胞及骨髓衍生性吞噬細胞。 　　如本文所使用的術語〝表現〞係指由啟動子驅動之特定的核苷酸序列轉錄及/或轉譯。 　　如本文所使用的〝表現載體〞係指包含重組多核苷酸的載體，其包含可操作地連結欲表現之核苷酸序列的表現控制序列。表現載體包括那些在本技術中已知併入重組多核苷酸的所有該載體，包括黏質體、質體(例如裸出或內含在脂質體中)及病毒(例如慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)。 　　如本文所使用的〝可操作地連結〞係指核酸序列締合在單一核酸片段上，使得一者的功能受另一者的影響。例如，當啟動子能夠影響編碼序列的表現時(亦即編碼序列係在啟動子的轉錄控制下)，該啟動子與該編碼序列可操作地連結。 　　如本文所使用的〝表現控制序列〞意指引導核酸轉錄之核酸序列。表現控制序列可為啟動子，諸如組成性或可誘導性啟動子或增強子。表現控制序列可操作地連結欲轉錄之核酸序列。 　　〝啟動子〞及〝啟動子序列〞可交換使用且係指能夠控制編碼序列或功能性RNA的表現之DNA序列。編碼序列通常係位於相對啟動子序列的3’。那些熟習本技術領域者應瞭解不同的啟動子可引導基因在不同的組織或細胞類型中，或在不同的發育階段，或因應不同的環境或生理狀條件之表現。 　　在本發明之載體的任一者中，載體隨意地包含本文所揭示之啟動子。 　　〝宿主細胞〞包括可為或已為用於併入多核苷酸插入物的載體之接受者的個別細胞或細胞培養物。宿主細胞包括單一宿主細胞之子代且子代可由於天然、偶然或故意突變而不一定與原始親代細胞完全相同(在形態學或基因組DNA互補方面)。宿主細胞包括以本發明之多核苷酸的活體內轉染之細胞。 　　如本文所使用的術語〝細胞外配體結合域〞係指能夠結合配體之寡肽或多肽。該域較佳地能夠與細胞表面分子交互作用。例如，可選擇細胞外配體結合域以識別作為與特定的疾病狀態相關聯之標靶細胞上的細胞表面標誌起作用之配體。 　　本文所使用的術語〝莖域(stalk domain)〞係指以連結跨膜域至細胞外配體結合域為功能之寡肽或多肽。特別使用莖域對細胞外配體結合域提供更可撓性及可親性。 　　術語〝細胞內傳訊域〞係指轉導效應子信號功能信號且引導細胞執行特殊化功能之蛋白質的一部分。 　　如本文所使用的〝共刺激分子〞係指在T細胞上與共刺激配體特異性結合之同源結合伙伴，從而調介以細胞之共刺激反應，諸如但不限於增生。共刺激分子包括但不限於第I類MHC分子、BTLA及Toll配體受體。共刺激分子的實例包括CD27、CD28、CD8、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原 -1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和與CD83特異性結合之配體及類似者。 　　〝共刺激配體〞係指在抗原呈現細胞上特異性結合在T細胞上的同源共刺激信號分子之分子，從而提供除了由例如TCR/CD3複合體與裝載肽之MHC分子結合所提供的主要信號以外用於調介T細胞反應(包括但不限於增生、活化、分化及類似者)的信號。共刺激配體可包括但不限於CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可誘導的共刺激配體(ICOS-L)、細胞間黏附分子(ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、淋巴毒素β受體、3/TR6、ILT3、ILT4、結合Toll配體受體之促效劑或抗體及與B7-H3特異性結合之配體。共刺激配體尤其亦包含與存在於T細胞上的共刺激分子特異性結合之抗體，諸如但不限於CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、與CD83特異性結合之配體。 　　〝抗體〞為能夠通過至少一個位於免疫球蛋白分子之可變區的抗原識別位點特異性結合標靶(諸如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等)之免疫球蛋白分子。如本文所使用的術語不僅包含完整的多株或單株抗體，並亦包含其抗原結合片段(諸如Fab、Fab’、F(ab’)₂ 和Fv)及包含抗原識別位點(包括例如而不限於單鏈(scFv)和單域抗體(包括例如鯊魚和駱駝科抗體))之免疫球蛋白分子和包含抗體之融合蛋白質的任何其他經修飾之組態。抗體包括任何類別的抗體，諸如IgG、IgA或IgM(或其次類別)且抗體不必具有任何特定的類別。免疫球蛋白可取決於其重鏈恆定區的抗體胺基酸序列而分配成不同的類別。有五種主要的免疫球蛋白類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等中有幾種可進一步區分成次類別(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別的免疫球蛋白之重鏈恆定區分別被稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類別的免疫球蛋白之次單元結構及三維組態為眾所周知。 　　如本文所使用的術語抗體之〝抗原結合片段〞或〝抗原結合部分〞係指保留特異結合給出之抗原的能力之完整抗體的一或多個片段。抗體之抗原結合功能可由完整抗體的片段執行。涵蓋在術語抗體之〝抗原結合片段〞內的結合片段的實例包括Fab、Fab’、F(ab’)₂ 、由VH及CH1域所組成之Fd片段、由抗體之單臂的VL和VH域所組成之Fv片段、單域抗體(dAb)片段(Ward等人之Nature 341：544-546, 1989)及單離之互補決定區(CDR)。 　　〝特異性結合〞標靶之抗體、抗體共軛物或多肽為本技術中充分瞭解的術語，且測定此特異性結合之方法亦為本技術中所熟知。若分子與特定的細胞或物質比其與替代的細胞或物質更頻繁地、更快速地、更長的持續時間及/或更高的親和性反應或締合，則聲稱該分子展現〝特異性結合〞。若抗體與標靶比其與其他的物質以更高的親和性、親合力(avidity)、更容易及/或更長的持續時間結合，則抗體〝特異性結合〞標靶。藉由閱讀此定義亦應瞭解例如特異性結合第一標靶之抗體(或部分或表位)可能或可能不特異性結合第二標靶。確切而言，〝特異性結合〞不一定需要(儘管其可包括)排他性結合。 　　抗體之〝可變區〞係指單獨或組合的抗體輕鏈之可變區或抗體重鏈之可變區。如本技術已知，重鏈及輕鏈之可變區分別由四個以3個互補決定區(CDR)(亦稱為高度可變區)連接的框架區(FR)所組成。在各鏈中的CDR係以FR緊接固定在一起且以來自其他鏈的CDR促成抗體之抗原結合位點的形成。有至少兩種測定CDR的技術：(1)基於跨物種序列變異性之方法(亦即Kabat等人之Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版，1991, National Institutes of Health, Bethesda MD))；及(2)基於抗原-抗體複合體的晶體學研究之方法(Al-lazikani等人之1997, J. Molec. Biol. 273：927-948)。如本文所使用的CDR可指以任一方法或兩種方法的組合所定義之CDR。 　　可變域之〝CDR〞為依照Kabat、Chothia之定義；Kabat與Chothia二者之累積；AbM、接觸及/或構形定義或本技術中熟知的任何CDR測定方法鑑定之可變區內的胺基酸殘基。抗體CDR可經鑑定為Kabat等人最初定義之高度可變區。參見例如Kabat等人之1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest第5版，Public Health Service, NIH, Washington D.C。CDR的位置亦可經鑑定為Chothia及其他人最初說明之結構性環結構。參見例如Chothia等人之Nature 342：877-883, 1989。CDR鑑定之其他方法包括〝AbM定義〞(其為Kabat與Chothia達成的折衷且使用Oxford Molecular's AbM抗體建模軟體(現為Accelrys®)導出)或基於所觀察之抗原接觸的CDR之〝接觸定義〞(在MacCallum等人之J. Mol. Biol., 262：732-745, 1996提出)。在本文稱為CDR之〝構形定義〞的另一方法中，CDR之位置可經鑑定為對抗原結合有焓貢獻的殘基。參見例如Makabe等人之Journal of Biological Chemistry, 283：1156-1166, 2008。還有其他的CDR邊界定義可能未嚴格地遵循上述方法之一，但仍與至少一部分的Kabat CDR重疊，儘管該等可鑑於預測或實驗發現而縮短或加長，使特定的殘基或殘基群或甚至整個CDR未顯著地衝擊抗原結合。如本文所使用的CDR可指以本技術中已知的任何方法(包括方法的組合)所定義之CDR。本文所使用的方法可利用根據該等方法中任一者所定義之CDR。就任何所給出之含有超過一個以上的CDR之實施態樣而言，CDR可依照Kabat、Chothia、延伸型、AbM、接觸及/或構象定義中任一者定義。 　　本發明之抗體可使用本技術中熟知的技術生產，例如重組技術、噬菌體展示技術、合成技術或該等技術之組合或本技術中輕易地已知的其他技術(參見例如Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45：1628-50, 1999；及Fellouse, F.A.等人之J. MoI. Biol., 373(4)：924-40, 2007)。 　　如本技術中已知，如本文可交換使用的〝多核苷酸〞或〝核酸〞係指任何長度的核苷酸鏈，且包括DNA及RNA。核苷酸可為脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或彼之類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶併入鏈中的任何受質。多核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及彼之類似物。若有核苷酸結構的修飾，則該修飾可在組裝鏈之前或之後賦予。核苷酸序列可以非核苷酸組份中斷。多核苷酸可在聚合後進一步修飾，諸如藉由與標籤化組份共軛。其他類型的修飾包括例如〝端帽(cap)〞、以類似物取代天然生成核苷酸中之一或多者、核苷酸間修飾(諸如那些下列修飾：具有不帶電之鍵聯(例如膦酸甲基、磷酸三酯、磷醯胺酯、胺甲酸酯等)及具有帶電荷之鍵聯(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、含有側鏈部分(諸如蛋白質，例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-離胺酸等)、具有嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等)、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)、含有烷基化劑、具有經修飾之鍵聯(例如α變旋異構核酸等))以及多核苷酸的未修飾形式。再者，一般存在於糖中的羥基中任一者可經例如膦酸基團、磷酸基團取代，經標準的保護基團保護，或活化以製備至額外的核苷酸之額外的鍵聯，或可與固體撐體共軛。5’及3’端OH可經磷酸化或經胺或1至20個碳原子的有機封端基團部分取代。其他的羥基亦可衍生成標準的保護基團。多核苷酸亦可含有本技術中一般已知的核糖或脫氧核糖的類似物形式(包括例如2’-O-甲基-、2’-O-烯丙基、2’-氟-或2’-疊氮基核糖)、碳環糖類似物、α-或β-變旋異構糖、差向異構糖(諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、非環類似物及去鹼基核苷類似物(諸如甲基核糖苷)。一或多個磷酸二酯鍵聯可經替代的連結基團置換。該等替代的連結基團包括但不限於下列實施態樣：其中磷酸酯經P(O)S(〝硫酸酯〞)、P(S)S(〝二硫酸酯〞)、(O)NR₂₍ 〝醯胺酸酯〞)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH₂ (〝甲縮醛〞)置換，其中各R或R’獨立為H或隨意地含有醚(-O-)鍵聯、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基的經取代或未經取代之烷基(1至20個C)。在多核苷酸中所有的鍵聯沒必要都相同。先前的說明適用於本文所述及之所有的多核苷酸，包括RNA及DNA。 　　如本文所使用的〝轉染〞係指由細胞攝取外源性或異源性RNA或DNA。當此等RNA或DNA已被引入細胞內部時，則細胞已經外源性或異源性RNA或DNA〝轉染〞。當經轉染之RNA或DNA達成表型變化時，則細胞已經外源性或異源性RNA或DNA〝轉形〞。轉形RNA或DNA可整合(共價連結)至構成細胞基因組之染色體DNA中。 　　如本文所使用的〝轉形〞係指核酸片段轉移至宿主有機體的基因組中，導致基因穩定的遺傳。含有經轉形之核酸片段的宿主有機體被稱為〝基因轉殖〞或〝重組〞或〝經轉形之〞有機體。 　　如本文所使用的〝實質上純質〞係指至少50%純質之材料(亦即沒有污染物)，更佳為至少90%純質，更佳為至少95%純質，又更佳為至少98%純質，且最佳為至少99%純質。 　　如本文關於抗體所使用的術語〝競爭〞意指第一抗體或其抗原結合片段(或部分)以充分類似於第二抗體或其抗原結合部分結合的方式結合表位，使得第一抗體與其同源表位在第二抗體存在下結合與該第一抗體在該第二抗體不存在下結合的結果相比，可檢測出降低。其中第二抗體與其表位在第一抗體存在下結合亦可檢測出降低的替代方案可為但未必是此情況。亦即，第一抗體可抑制第二抗體與其表位結合，而非第二抗體抑制第一抗體與其各自的表位結合。然而，在各抗體可檢測出抑制其他的抗體與其同源表位或配體結合的情況下，不論是至相同、更大或更小的程度，聲稱該等抗體互相〝交叉競爭〞結合彼等各自的表位。競爭及交叉競爭抗體二者皆由本發明所涵蓋。無關於此等競爭及交叉競爭發生的機制(例如位阻、構形變化或結合共同的表位或其部分)，熟練的技術者能基於本文所提供的指導而理解此等競爭及/或交叉競爭抗體係由本發明所涵蓋且可用於本文所揭示之方法。 　　如本文所使用的〝治療〞為獲得有利或期望的臨床結果之方法。出於本發明之目的，有利或期望的臨床結果包括但不限於下列中之一或多者：減少腫瘤或癌細胞增生(或破壞腫瘤或癌細胞)、抑制腫瘤細胞移轉、縮小或減小腫瘤大小、緩解疾病(例如癌症)、減少起因於疾病(例如癌症)的症狀、增加那些罹患疾病(例如癌症)者的生活品質、減少治療疾病(例如癌症)之其他藥劑的所需劑量、延遲疾病(例如癌症)的進展、治癒疾病(例如癌症)及/或延長患有疾病(例如癌症)之個體的生存。 　　〝改善〞意指與未投予治療相比而減輕或改進一或多種症狀。〝改善〞亦包括縮短或減少症狀持續期間。 　　如本文所使用的藥物、化合物或醫藥組成物的〝有效劑量〞或〝有效量〞為足以達成任何一或多個有利或期望的結果之量。出於預防性用途，有利或期望的結果包括消除或降低疾病的風險、減輕疾病的嚴重性或延遲疾病的發作，該疾病包括疾病的生物化學、組織學及/或行為症狀、其併發症及在疾病發展期間呈現的中間病理學表型。出於治療性用途，有利或期望的結果包括臨床結果，諸如降低各種疾病或病況(諸如癌症)的一或多種症狀之發生率或改善該症狀、減少治療疾病之其他藥劑的所需劑量、增強另一種藥劑的效應及/或延遲疾病的進展。有效劑量可在一或多次投予中投予。出於本發明之目的，藥物、化合物或醫藥組成物的有效劑量為直接或間接充分實現預防性或治療性治療的量。如以臨床背景的瞭解，藥物、化合物或醫藥組成物的有效劑量可連同或可不連同另一藥物、化合物或醫藥組成物而達成。因此，在投予一或多種治療劑的背景下可考慮〝有效劑量〞，且若期望的結果係連同一或多種其他的劑可達成或達成，則可考慮以有效量給出單一劑。 　　如本文所使用的〝個體〞為任何哺乳動物，例如人類或猴子。哺乳動物包括但不限於農場動物、競賽動物、寵物、靈長類動物、馬、狗、貓、小鼠和大鼠。在例示性實施態樣中，個體為人類。在例示性實施態樣中，個體為猴子，例如食蟹獼猴。 　　如本文所使用的〝載體〞意指能夠遞送且較佳地表現一或多種在宿主細胞中關注之基因或序列的構築體。載體的實例包括但不限於病毒載體、裸出之DNA或RNA表現載體、質體、黏質體或噬菌體載體、與陽離子縮合劑締合之DNA或RNA表現載體、包封在脂質體內之DNA或RNA表現載體及特定的真核細胞，諸如載體生產細胞。 　　如本文所使用的〝醫藥上可接受之載劑〞或〝醫藥上可接受之賦形劑〞包括當與活性成分組合時容許成分保留生物活性且不與個體之免疫系統反應的任何材料。實例包括但不限於標準的醫藥載劑中任一者，諸如磷酸鹽緩衝之食鹽水溶液、水、乳劑(諸如油/水乳劑)和各種類型之潤濕劑。用於氣霧劑或經腸胃外投予之較佳的稀釋劑為磷酸鹽緩衝之食鹽水(PBS)或生理(0.9%)食鹽水。包含此等載劑的組成物係以熟知的慣例方法調配(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences第18版，A. Gennaro編輯，Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990；及Remington, The Science and Practice of Pharmacy第21版，Mack Publishing, 2005)。 　　如本文所使用的〝同種異體反應性(alloreactivity)〞係指T細胞識別在胸腺發育期間未遭遇的MHC複合體之能力。同種異體反應性本身在臨床上以宿主對抗移植物排斥及移植物對抗宿主疾病出現。 　　本文述及之〝約〞數值或參數包括(及說明)指示數值或參數本身的實施態樣。例如，述及之〝約X〞的說明包括〝X〞的說明。數字範圍內含定義該範圍之數字。 　　應瞭解在本文以語意〝包含〞說明實施態樣的任何情況下，亦提供根據〝由…所組成〞及/或〝基本上由…所組成〞所說明之另外其他類似的實施態樣。 　　在本發明之態樣或實施態樣係根據馬庫西(Markush)群組或其他的分組替代物說明時，本發明不僅包含以整體列示的整個群組，並個別地包含群組的各成員及主要群組之所有可能的次群組，並亦包含缺少一或多個群組成員的主要群組。本發明亦設想明確排除在所請求之本發明中的任何群組成員中之一或多者。 　　除非另有其他的定義，否則本文所使用的所有技術及科學術語具有與一般熟習屬於本發明之技術領域者共同瞭解的相同意義。在衝突的情況下，將以本說明書(包括定義)為主。應瞭解在整個說明書及申請專利範圍內的用字〝包含(comprise)〞或變體(諸如〝包含(comprises)〞或〝包含(comprising)〞意味著內含所陳述之整數或整數群組，但不排除任何其他的整數或整數群組。除非上下文另有其他的要求，否則單數術語應包括複數及複數術語應包括單數。 　　本文說明例示性方法及材料，但是類似或等同於那些本文所述者之方法及材料亦可用於實施或測試本發明。材料、方法和實施例僅為例證並不意欲為限制。 改良的單離之T細胞 　　本文提供向下調節第I類主要組織相容性(MHC)細胞表面表現之組成物及方法。本文亦提供此等組成物及方法用於改良單離之T細胞(諸如CAR-T細胞)的功能活性之用途。本文所提供之方法及組成物有用於改良CAR-T細胞之活體內持續性及治療功效。 　　本文所提供的單離之T細胞表現：(i)病毒蛋白質，其向下調節第I類MHC細胞表面表現，及(ii)嵌合性抗原受體(CAR)。本文所提供的單離之T細胞與不表現病毒蛋白質之細胞相比，有利地展現改良之活體內持續性。病毒蛋白質較佳地不降低單離之T細胞的CAR細胞表面表現。 　　在一些實施態樣中，本文所提供的單離之T細胞另外包含(iii)抑制NK細胞活性之蛋白質。例如，單離之T細胞可表現NK細胞拮抗劑，包括例如抗NK細胞抑制性受體抗體。在一些實施態樣中，抗NK細胞抑制性受體抗體特異性結合殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)、CD94–NKG2A/C/E異二聚體、2B4(CD244)受體、殺手細胞凝集素樣受體G1(KLRG1)受體，{Tom：請列示任何其他的可能性}。KIR可為例如而不限於KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B及KIR2DL4。本發明有用的抗NK細胞抑制性受體抗體較佳地(a)靶定產生強的抑制信號之受體，(b)主要地表現在NK細胞中，及/或(c)靶定特異性及保守性表位，所以其適用於具有廣泛的對偶基因變異性範圍之患者。 　　病毒蛋白質可為干擾第I類MHC分子之細胞表面表現的任何病毒蛋白質。本發明有用的例示性病毒蛋白質包括而不限於BFP、ICP47、K3、K5、E19、U3、US6、US2、US11、Nef、U21、EBNA1、UL49.5、BNLF2a、CPXV203及US10。在一些實施態樣中，病毒蛋白質可為巨細胞病毒(CMV)蛋白質、腺病毒蛋白質、疱疹病毒蛋白質或人類免疫缺乏病毒蛋白質。為了測定病毒蛋白質是否向下調節第I類MHC分子之細胞表面表現，第I類MHC之表面表現量可在表現病毒蛋白質之細胞中檢定且與不表現病毒蛋白質之細胞上的表現量相比。用於測定第I類MHC之表面表現量的檢定法為本技術中已知。例如，可將用於第I類MHC之表面表現的細胞以對抗HLA-A、B、C之抗體染色，隨後以流動式細胞測量術(FACS)分析。 　　在一些實施態樣中，在表現病毒蛋白質之T細胞上的第I類MHC之細胞表面表現量與在不包含病毒蛋白質之T細胞上的第I類MHC之細胞表面表現量相比，可降低至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%。 　　在一些實施態樣中，本發明的單離之T細胞包含(例如表現)如表1中所列示之病毒蛋白質序列或具有病毒序列之病毒序列。 在一些實施態樣中，本發明的單離之T細胞包含(例如表現)ICP47。在一些實施態樣中，本發明的單離之T細胞包含(例如表現)例如K3。在一些實施態樣中，本發明的單離之T細胞包含(例如表現)K5。在一些實施態樣中，本發明的單離之T細胞包含(例如表現)E19。在一些實施態樣中，本發明的單離之T細胞包含(例如表現)US3。在一些實施態樣中，本發明的單離之T細胞包含(例如表現)US6。在一些實施態樣中，本發明的單離之T細胞包含(例如表現)US2。在一些實施態樣中，本發明的單離之T細胞包含(例如表現)US11。在一些實施態樣中，本發明的單離之T細胞包含(例如表現)Nef。在一些實施態樣中，本發明的單離之T細胞包含(例如表現)U21。在一些實施態樣中，本發明的單離之T細胞包含(例如表現)US10。在一些實施態樣中，本發明的單離之T細胞包含(例如表現)EBNA-1。在一些實施態樣中，本發明的單離之T細胞包含(例如表現)BNLF2a。在一些實施態樣中，本發明的單離之T細胞包含(例如表現)UL49.5。在一些實施態樣中，本發明的單離之T細胞包含(例如表現)CPXV203。 　　本發明包含表1中所示之本發明實施態樣的蛋白質之修飾，包括具有未顯著地影響彼等性質之修飾的功能上同等的蛋白質及增強或降低活性及/或親和性之變異體。多肽之修飾為本技術中例行的實施且沒必要在本文詳細說明。經修飾之多肽的實例包括具有保守性胺基酸殘基取代之多肽、缺失或加入一或多個未顯著有害地改變功能活性或熟化(增強)多肽對其配體之親和性的胺基酸之多肽、或使用化學類似物。 　　胺基酸序列插入物包括長度範圍從一個殘基至含有一百個或更多個殘基之多肽的胺基及/或羧基末端融合物，以及單一或多個胺基酸殘基之序列內插入物。末端插入物的實例包括具有N末端甲硫胺醯基殘基之抗體或與表位標記融合之抗體。 　　取代變異體具有至少一個胺基酸殘基於病毒蛋白質中移除且在其位置上插入不同的殘基。保守性取代係以〝保守性取代〞的標題顯示於表2中。若此等取代導致生物學活性改變，則可引入在表2中以〝例示性取代〞為標題或於下文參考胺基酸類別進一步說明的更多實質改變，且篩選產物。病毒蛋白質可在編碼病毒蛋白質之多核苷酸引入細胞中之後於細胞中就地合成。另一選擇地，病毒蛋白質可於細胞外部生產且接著引入細胞中。用於引入多核苷酸構築體至細胞中之方法為本技術中已知。在一些實施態樣中，可使用穩定的轉形方法整合多核苷酸構築體至細胞之基因組中。在其他的實施態樣中，可使用暫時的轉形方法暫時地表現多核苷酸構築體且多核苷酸構築體未整合至細胞之基因組中。在其他的實施態樣中，可使用經病毒調介之方法。多核苷酸可以任何適合的方式引入細胞中，諸如重組的病毒載體(例如反轉錄病毒、腺病毒)、脂質體及類似者。暫時的轉形方法包括例如而不限於微注射、電穿孔或粒子轟擊。多核苷酸可包括在載體中，諸如質體載體或病毒載體。 　　在一些實施態樣中，本發明的單離之T細胞可包含至少一種病毒蛋白質及至少一種CAR。在一些實施態樣中，單離之T細胞可包含至少一群不同的病毒蛋白質及至少一種CAR。在一些實施態樣中，單離之T細胞可包含至少一種病毒蛋白質及一群CAR，各CAR包含不同的細胞外配體結合域。 　　在本文所提供的單離之T細胞的一些實施態樣中，CAR可包含細胞外配體結合域(例如單鏈可變片段(scFv))、跨膜域和細胞內傳訊域。在一些實施態樣中，細胞外配體結合域、跨膜域和細胞內傳訊域係於一種多肽中，亦即在單鏈中。在本文亦提供多鏈CAR及多肽。在一些實施態樣中，多鏈CAR包含：第一多肽，其包含跨膜域和至少一種細胞外配體結合域，及第二多肽，其包含跨膜域和至少一種細胞內傳訊域，其中多肽組裝在一起形成多鏈CAR。 　　細胞外配體結合域特異性結合關注之標靶。關注之標靶可為關注之任何分子，包括例如而不限於BCMA、EGFRvIII、Flt-3、WT-1、CD20、CD23、CD30、CD38、CD70、CD33、CD133、MHC-WT1、TSPAN10、MHC-PRAME、Liv1、ADAM10、CHRNA2、LeY、NKG2D、CS1、CD44v6、ROR1、CD19、密連蛋白-18.2(密連蛋白-18A2或密連蛋白18同型異構體2)、DLL3(δ樣蛋白質(Delta-like protein)3、果蠅δ同系物3、δ3)、Muc17(黏蛋白17、Muc3、Muc3)、FAP α(纖維母細胞活化蛋白質α)、Ly6G6D(淋巴細胞抗原6複合基因座蛋白質(complex locus protein)G6d、c6orf23、G6D、MEGT1、NG25)、RNF43(E3泛素蛋白連接酶RNF43、RING指蛋白質(finger protein)43)。 　　在一些實施態樣中，細胞外配體結合域包含scFv，其包含以可撓性連結子接合之標靶抗原特異性單株抗體的輕鏈可變(VL)區及重鏈可變(VH)區。單鏈可變區片段係藉由使用短連結肽連結輕鏈及/或重鏈可變區而構成(Bird等人之Science 242：423-426, 1988)。連結肽的實例為具有胺基酸序列(GGGGS)₃ (SEQ ID NO：16)之GS連結子，其橋連在一個可變區的羧基末端與其他可變區的胺基末端之間約3.5奈米。已設計及使用其他序列的連結子(Bird等人之1988，同上)。連結子通常可為短的可撓性多肽且較佳地由約20個或更少的胺基酸殘基所組成。連結子可依次經修飾而得到額外的功能，諸如藥物的附著或附著至固態撐體。單鏈變異體可經重組或合成方式生產。關於scFv之合成生產，可使用自動化合成器。關於scFv之重組生產，可將含有編碼scFv的多核苷酸之適合的質體引入適合的宿主細胞中，真核細胞(諸如酵母、植物、昆蟲或哺乳動物細胞)或原核細胞(諸如大腸桿菌)。多核苷酸編碼關注之scFv可藉由例行的操作而達成，諸如多核苷酸之接合。所得scFv可使用本技術中已知的標準蛋白質純化技術分離。 　　根據本發明之CAR的細胞內傳訊域係負責在細胞外配體結合域結合標靶之後的細胞內傳訊，導致免疫細胞活化及免疫反應。細胞內傳訊域具有活化其中表現CAR之免疫細胞的正常效應子功能中之至少一者的能力。例如，T細胞的效應子功能可為細胞裂解活性或輔助子活性(包括細胞介素的分泌)。 　　在一些實施態樣中，用於CAR之細胞內傳訊域可為例如而不限於T細胞受體及一起作用而在抗原受體接合之後引發信號轉導的共同受體之細胞質序列，以及該等序列的任何衍生物或變異體及具有相同的功能能力的任何合成序列。細胞內傳訊域包含二種不同類別的細胞質傳訊序列：那些引發抗原依賴性初級活化之該序列及那些以抗原非依賴性方式起作用以提供次級或共刺激信號之該序列。初級細胞質傳訊序列可包含稱為ITAM的基於免疫受體酪胺酸之活化基序的傳訊基序。ITAM為明確定義之傳訊基序，其係在各種充當為syk/zap70類別酪胺酸激酶之結合位點的受體之細胞質內尾端中發現。本發明所使用之ITAM的實例可包括作為非限制性實例的那些自下列所衍生者：TCRζ, FcRγ, FcRβ, FcRε, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b及CD66d。在一些實施態樣中，CAR之細胞內傳訊域可包含CD3ζ傳訊域。在一些實施態樣中，本發明的CAR之細胞內傳訊域包含共刺激分子域。 　　在一些實施態樣中，本發明的CAR之細胞內傳訊域包含選自由下列所組成之群組的共刺激分子的一部分：41BB(GenBank：AAA53133)及CD28(NP_006130.1)之片段。 　　CAR係表現在細胞的表面膜上。因此，CAR可包含跨膜域。適合於本文所揭示的CAR之跨膜域具有下列能力：(a)表現在細胞(較佳為免疫細胞，諸如而不限於淋巴細胞或自然殺手(NK)細胞)表面上，及(b)與配體結合域和細胞內傳訊域交互作用以引導免疫細胞對抗預界定之標靶細胞的細胞反應。跨膜域可衍生自天然或合成來源。跨膜域可衍生自任何經膜結合之蛋白質或跨膜蛋白質。跨膜多肽可為作為非限制性實例的T細胞受體之次單位(諸如α、β、γ或δ)、多肽構成之CD3複合體、IL-2受體p55(α鏈)、p75(β鏈)或γ鏈、Fc受體之次單元鏈(特別為Fcγ受體III)或CD蛋白質。另一選擇地，跨膜域可為合成的且可包含優勢的疏水性殘基，諸如白胺酸和纈胺酸。在一些實施態樣中，該跨膜域係衍生自人類CD8α鏈(例如NP_001139345.1)。跨膜域可另外包含介於細胞外配體結合域與該跨膜域之間的莖域。莖域可包含至多300個胺基酸，較佳為10至100個胺基酸，且最佳為25至50個胺基酸。莖域可衍生自全部或一部分的天然生成分子，諸如衍生自CD8、CD4或CD28之全部或一部分的細胞外區域或衍生自全部或一部分的抗體恆定區。另一選擇地，莖域可為相應於天然生成莖序列之合成序列或可為完全合成的莖序列。在一些實施態樣中，該莖域為人類CD8α鏈(例如NP_001139345.1)的一部分。在另一特定的實施態樣中，該跨膜包含人類CD8α鏈的一部分。在一些實施態樣中，本文所揭示之CAR可包含特異性結合BCMA之細胞外配體結合域、CD8α人類莖域和跨膜域、CD3ζ傳訊域及4-1BB傳訊域。在一些實施態樣中，CAR可作為轉基因經由質體載體引入免疫細胞中。在一些實施態樣中，質體載體亦可含有例如提供用於鑑定及/或選擇接收載體的細胞之選擇標誌。 　　CAR多肽可在編碼CAR多肽之多核苷酸引入細胞中之後於細胞中就地合成。另一選擇地，CAR多肽可於細胞外部生產且接著引入細胞中。用於引入多核苷酸構築體至細胞中之方法為本技術中已知。在一些實施態樣中，可使用穩定的轉形方法整合多核苷酸構築體至細胞之基因組中。在其他的實施態樣中，可使用暫時的轉形方法暫時地表現多核苷酸構築體且多核苷酸構築體未整合至細胞之基因組中。在其他的實施態樣中，可使用經病毒調介之方法。多核苷酸可以任何適合的方式引入細胞中，諸如重組的病毒載體(例如反轉錄病毒、腺病毒)、脂質體及類似者。暫時的轉形方法包括例如而不限於微注射、電穿孔或粒子轟擊。多核苷酸可包括在載體中，諸如質體載體或病毒載體。 　　本文亦提供根據本文所述之方法中任一者所獲得的單離之T細胞。能夠表現異源性DNA的任何免疫細胞可用於表現關注之病毒蛋白質及CAR的目的。在一些實施態樣中，免疫細胞為T細胞。在一些實施態樣中，免疫細胞可衍生自例如而不限於幹細胞。幹細胞可為成年幹細胞、非人類胚胎幹細胞(更特別為非人類幹細胞)、臍帶血幹細胞、祖細胞、骨髓幹細胞、誘導性多功能幹細胞、全能性幹細胞或造血幹細胞。代表性人類細胞為CD34+細胞。單離之細胞亦可為樹狀細胞、殺手樹狀細胞、肥胖細胞、NK細胞、B細胞或選自由下列所組成之群組的T細胞：發炎性T淋巴細胞、細胞毒性T淋巴細胞、調節性T淋巴細胞或輔助T淋巴細胞。在一些實施態樣中，細胞可衍生自由下列所組成之群組：CD4+T淋巴細胞及CD8+T淋巴細胞。 　　在擴增及基因修飾之前，細胞來源可通過各種非限制性方法自個體獲得。細胞可自許多非限制性來源獲得，包括周邊血液單核細胞、骨髓、淋巴節組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染位點的組織、腹水、胸膜滲出液、脾臟組織和腫瘤。在一些實施態樣中，可使用那些熟習本技術領域者可取得且已知的任何數量的T細胞系。在一些實施態樣中，細胞可衍生自健康的給予體、經診斷患有癌症的個體或經診斷患有感染的個體。在一些實施態樣中，細胞可為呈現不同的表型特徵之混合細胞群的一部分。 　　本文亦提供根據本文所述之方法中任一者自轉形之T細胞所獲得的細胞系。在一些實施態樣中，根據本發明的單離之T細胞包含編碼病毒蛋白質之多核苷酸。在一些實施態樣中，根據本發明的單離之T細胞包含編碼病毒蛋白質之多核苷酸及編碼CAR之多核苷酸。在一些實施態樣中，根據本發明的單離之T細胞包含編碼病毒蛋白質之多核苷酸、編碼CAR之多核苷酸及編碼NK細胞拮抗劑之多核苷酸。 　　本發明的單離之T細胞可在T細胞的基因修飾之前或之後使用如例如而不限於下文中概括說明之方法活化及擴增：美國專利6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041；及美國專利申請公開案號20060121005。T細胞可於試管內或活體內擴增。本發明之T細胞通常可例如藉由在T細胞表面上與刺激CD3 TCR複合體之劑及共刺激分子接觸以產生用於T細胞的活化信號而擴增。例如，可使用化學品(諸如鈣離子載體A23187、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate)(PMA)或促有絲分裂凝集素(lectin)樣植物血球凝集素(PHA)以產生用於T細胞的活化信號。 　　在一些實施態樣中，T細胞群可於試管內藉由與例如固定在表面上的抗CD3抗體或其抗原結合片段或抗CD2抗體接觸，或藉由與蛋白激酶C活化劑(例如苔蘚抑素(bryostatin))連同鈣離子載體一起接觸而刺激。使用結合輔助分子之配體在T細胞表面上共刺激輔助分子。例如，T細胞群可與抗CD3抗體及抗CD28抗體在適合於刺激T細胞增生的條件下接觸。適合於T細胞培養的條件包括適當的培養基(例如最低必需培養基或RPMI培養基1640或X-vivo 5(Lonza))，其可含有用於增生及存活必要的因子，包括血清(例如胎牛或人類血清)、介白素-2(IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-2、IL-15、TGFp和TNF或熟習本技術領域者已知用於細胞生長的任何其他添加劑。用於細胞生長的其他添加劑包括但不限於界面活性劑、人血漿蛋白粉(plasmanate)及還原劑，諸如N-乙醯基半胱胺酸和2-巰基乙醇。培養基可包括具有添加之胺基酸、丙酮酸鈉及維生素的RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、a- MEM、F-12、X-Vivo 1和X-Vivo 20、Optimizer，其不含血清或以適量的血清(或血漿)或限定之激素組及/或足以使T細胞生長及擴增之細胞介素量補充。抗生素(例如青黴素和鏈黴素)僅包括在實驗培養物中，不包括在欲輸注於個體的細胞培養物中。標靶細胞係維持在支持生長的必要條件下，例如適當的溫度(例如37℃)及大氣(例如空氣加5% CO₂ )。已暴露於不同的刺激時間之T細胞可展現不同的特徵。 　　在一些實施態樣中，本發明之細胞可藉由與組織或細胞共同培養而擴增。細胞亦可於活體內擴增，例如在細胞投予個體之後於個體血液內。 　　在另一態樣中，本發明提供包含本發明之細胞中任一者之組成物(諸如醫藥組成物)。在一些實施態樣中，組成物包含單離之T細胞，其包含編碼本文所述之病毒蛋白質中任一者之多核苷酸及編碼CAR之多核苷酸。在一些實施態樣中，細胞另外包含編碼NK細胞拮抗劑之多核苷酸。在一些實施態樣中，NK細胞拮抗劑為抗NK細胞抑制性受體抗體。 　　表現載體及多核苷酸組成物之投予於本文進一步說明。 　　在另一態樣中，本發明提供製造本文所述之多核苷酸中任一者之方法。 　　與任何此等序列互補之多核苷酸亦包含於本發明中。多核苷酸可為單股(編碼或反義)或雙股且可為DNA(基因組、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子(其含有內含子且以一對一的方式相應於DNA分子)及mRNA分子(其不含有內含子)。額外的編碼或非編碼序列可能但非必要存在於本發明之多核苷酸內，且多核苷酸可能但非必要連結其他的分子及/或擔體材料。 　　多核苷酸可包含原生序列(亦即編碼抗體或其部分的內源性序列)或可包含此等序列之變異體。多核苷酸變異體含有一或多個取代、加入、缺失及/或插入，使得編碼之多肽與原生免疫反應性分子相比，其免疫反應性未減少。對編碼之多肽的免疫反應之影響通常可如本文所述方式評定。變異體較佳地展現與編碼原生抗體或其部分之多核苷酸序列至少約70%之同一性，更佳為至少約80%之同一性，又更佳為至少約90%之同一性，且最佳為至少約95%之同一性。 　　若核苷酸或胺基酸之序列以兩個序列在如下述以最大的對應性排列時為相同的，則聲稱兩個多核苷酸或多肽之序列具有〝同一性〞。兩個序列之間的比較通常係藉由比較在比較窗內的序列來進行，以鑑定及比較局部區域的序列相似性。如本文所使用的〝比較窗〞係指至少約20個，通常為30至約75個，或40至約50個相鄰位置的區段，其中序列可在兩個序列最優化排列之後與相同數量的相鄰位置之參考序列比較。 　　用於比較之序列的最優化排列可使用生物資訊軟體的Lasergene套件中的Megalign程式(DNASTAR, Inc., Madison, WI)使用預設參數進行。此程式體現數種於下列參考文獻中所述之排列方案：Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O.(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358；Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA；Higgins, D.G.及Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5：151-153；Myers, E.W.及Muller W., 1988, CABIOS 4：11-17；Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11：105；Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4：406-425；Sneath, P.H.A.及Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA；Wilbur, W.J.及Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80：726-730。 　　〝序列同一性百分比〞較佳地藉由比較在至少20個位置之比較窗內的兩個最優化排列之序列而測定，其中在比較窗中的多核苷酸或多肽序列部分與兩個序列的最優化排列之參考序列(其不包含加入或缺失)相比，可包含20%或更少，通常為5至15%，或10至12%之加入或缺失(亦即間隙)。百分比係藉由以下方式計算：測定在兩個序列中出現相同的核酸鹼基或胺基酸殘基的位置數量以得到匹配之位置數量，以匹配之位置數量除以參考序列中的位置總數量(亦即窗大小)且將結果乘以100，得到序列同一性百分比。 　　變異體亦可或另一選擇地與原生基因或其部分或補體實質上為同源的。此等多核苷酸變異體能夠在中度嚴格的條件下與編碼原生抗體之天然生成DNA序列(或互補序列)雜交。 　　適合的〝中度嚴格的條件〞包括在5 X SSC、0.5% SDS、1.0 mM EDTA(pH 8.0)之溶液中預清洗；在50℃至65℃下於5 X SSC中雜交隔夜；繼而在65℃下以含有0.1% SDS之2X、0.5X及0.2X SSC之各者經20分鐘清洗兩次。 　　如本文所使用的〝高度嚴格的條件〞或〝高嚴格性條件〞為那些下列者：(1)使用低離子強度及高溫清洗，例如在50℃下以 0.015 M氯化鈉/0.0015 M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉；(2)在雜交期間於42℃下使用變性劑，諸如甲醯胺，例如具有0.1%胎牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯基吡咯啶酮/具有750 mM氯化鈉、75 mM檸檬酸鈉之50 mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.5)之50%(v/v)甲醯胺；或(3)使用在42℃下於0.2 x SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中及在55℃下於50%甲醯胺中的50%甲醯胺、5 x SSC(0.75 M NaCl、0.075 M檸檬酸鈉)、50 mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5 x 登哈特(Denhardt)氏溶液、經超音波處理之鮭魚精子DNA(50微克/毫升)、0.1% SDS及10%葡聚醣硫酸鹽之洗液，繼而在55℃下以含有EDTA之0.1 x SSC所組成之高嚴格性洗液。熟習本技術領域者應識別在必要時如何調整溫度、離子強度等以適應諸如探針長度及類似者之因子。 　　那些一般熟習本技術領域者應理解由於基因密碼的簡併性而有許多編碼如本文所述之多肽的核苷酸序列。一些該等多核苷酸攜有與任何原生基因之核苷酸序列最小的同源性。雖然如此，本發明特別涵蓋由於密碼子用法的差別而不同的多核苷酸。再者，包含本文所提供的多核苷酸序列之基因的對偶基因係在本發明之範圍內。對偶基因為內源性基因，其係由於核苷酸的一或多個突變(諸如缺失、加入及/或取代)而改變。所得mRNA及蛋白質可能但未必具有改變的結構或功能。對偶基因可使用標準的技術(諸如雜交、擴增及/或數據庫序列比較)鑑定。 　　本發明之多核苷酸可使用化學合成、重組方法或PCR獲得。化學多核苷酸合成之方法為本技術中所熟知且不必於本文詳細說明。熟習本技術領域者可使用本文所提供的序列及市場上的DNA合成器生產所欲DNA序列。 　　關於使用重組方法製備多核苷酸，可將包含所欲序列之多核苷酸插入適合的載體中，且可將載體依次引入用於複製及擴增之適合的宿主細胞中，如本文進一步的討論。多核苷酸可以本技術中已知的任何方式插入宿主細胞中。細胞係藉由直接攝取、內攝作用、轉染、F-配對或電穿孔引入外源性多核苷酸而轉形。一旦引入時，外源性多核苷酸可維持在細胞內作為未經整合之載體(諸如質體)或整合至宿主細胞基因組中。如此擴增之多核苷酸可以本技術內熟知的方法與宿主細胞單離。參見例如Sambrook等人之1989。 　　另一選擇地，PCR容許DNA序列重現。PCR技術為本技術中所熟知且說明於美國專利案號4,683,195、4,800,159、4,754,065和4,683,202，以及Mullis等人編輯之PCR：The Polymerase Chain Reaction，Birkauswer Press, Boston, 1994中。 　　RNA可藉由在適當載體中使用單離之DNA且將其插入適合的宿主細胞中而獲得。當細胞複製及DNA轉錄成RNA時，接著RNA可使用那些熟習本技術領域者熟知的方法單離，如例如同上由Sambrook等人於1989年所提出。 　　適合的選殖載體可根據標準的技術構築或可選自在本技術中可取得的大量選殖載體。雖然所選擇之選殖載體可根據欲使用之宿主細胞而不同，但是有用的選殖載體通常具有自行複製的能力，可具有用於特定的限制性核酸內切酶之單一標靶，及/或可攜帶可用於選擇含有載體之選殖株的標誌之基因。適合的實例包括質體及細菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)和其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體 DNA及穿梭載體(諸如pSA3和pAT28)。該等及許多其他的選殖載體係自市場供應商取得，諸如BioRad、Strategene及Invitrogen。 　　表現載體通常為含有根據本發明之多核苷酸的可複製的多核苷酸構築體。此意味著表現載體必須在宿主細胞中可複製作為游離基因組(episome)或染色體DNA之整體部分。適合的表現載體包括但不限於質體、病毒載體(包括腺病毒、腺相關病毒、反轉錄病毒)、黏質體及在PCT公開案號WO 87/04462號中所揭示之表現載體。載體組份通常可包括但不限於下列中之一或多者：信號序列、複製起始序列(origin of replication)、一或多個標誌基因、適合的轉錄控制元件(諸如啟動子、增強子和終止子)。通常亦需要一或多個轉譯控制元件用於表現(亦即轉譯)，諸如核糖體結合位點、轉譯起點及終止密碼子。 　　含有關注之多核苷酸的載體可以許多適當的方式中任一者引入宿主細胞中，包括電穿孔；使用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚醣或其他物質之轉染；微彈丸轟擊(microprojectile bombardment)；脂質體轉染；及感染(例如其中載體為感染劑，諸如牛痘病毒)。引入載體或多核苷酸之選擇時常取決於宿主細胞的特性而定。 　　編碼本文所揭示之病毒蛋白質或CAR之多核苷酸可存在於表現組合體(expression cassette)或表現載體中(例如用於引入細菌至宿主細胞中之質體或病毒載體，諸如用於轉染昆蟲宿主細胞之桿狀病毒載體，或用於轉染哺乳動物宿主細胞之質體或病毒載體，諸如慢病毒)。在一些實施態樣中，多核苷酸或載體可包括編碼核糖體跳躍序列(skip sequence)之核酸序列，諸如而不限於編碼2A肽之序列。2A肽(其係在微小核糖核酸病毒之鵝口瘡病毒(Aphthovirus)亞群中鑑定出)引起自一個密碼子至下一個密碼子的核糖體〝跳躍〞，而未在以密碼子編碼的兩個胺基酸之間形成肽鍵(參見(Donnelly及Elliott 2001；Atkins, Wills等人，2007；Doronina, Wu等人，2008))。〝密碼子〞意指三個在mRNA上(或在DNA分子之正義股上)以核糖體轉譯成一個胺基酸殘基之核苷酸。因此，當多肽以開讀框內的2A寡肽序列分開時，則兩個多肽可自imRNA內的單一相鄰的開讀框合成。該等核糖體跳躍機制為本技術中所熟知且已知由數種載體用於表現由單一信使RNA編碼之數種蛋白質。 　　在一些實施態樣中，分泌信號序列(亦稱為前導序列、前原序列(prepro sequence)或前序列)係提供在多核苷酸序列或載體序列中，以引導跨膜多肽至宿主細胞之分泌途徑中。分泌信號序列可操作地連結跨膜核酸序列，亦即兩個序列係在正確的讀框內接合且定位以引導新合成之多肽至宿主細胞之分泌途徑中。分泌信號序列通常定位於相對編碼關注之多肽的核酸序列之5'，儘管特定的分泌信號序列可能定位在關注之核酸序列中的其他位置(參見例如Welch等人之美國專利案號5,037,743；Holland等人之美國專利案號5,143,830)。鑑於基因密碼之簡併性，那些熟習本技術領域者應識別在該等多核苷酸分子之中可能有相當大的序列變異。在一些實施態樣中，本發明之核酸序列經密碼子優化而表現於哺乳動物細胞中，較佳地表現於人類細胞中。密碼子優化係指在給出之物種的高度表現基因中通常罕見的密碼子經此等物種的高度表現基因中通常頻繁的密碼子於關注之序列中交換，此等密碼子編碼作為交換的密碼子之胺基酸。 　　本文提供製備用於免疫療法的免疫細胞之方法。在一些實施態樣中，該方法將病毒蛋白質及CAR引入免疫細胞中且擴增細胞。在一些實施態樣中，本發明關於使免疫細胞工程化之方法，其包含：提供細胞且表現向下調節MHC細胞表面表現之病毒蛋白質及在細胞表面上表現至少一種CAR。在一些實施態樣中，該方法包含：以至少一種編碼病毒蛋白質之多核苷酸及至少一種編碼CAR之多核苷酸轉染細胞且在細胞中表現多核苷酸。在一些實施態樣中，該方法包含：以至少一種編碼病毒蛋白質之多核苷酸、至少一種編碼CAR之多核苷酸及至少一種編碼NK細胞拮抗劑之多核苷酸轉染細胞且在細胞中表現多核苷酸。 　　在一些實施態樣中，編碼病毒蛋白質及CAR之多核苷酸係存在於一或多個表現載體中以穩定表現於細胞中。在一些實施態樣中，多核苷酸係存在於病毒載體中以穩定表現於細胞中。在一些實施態樣中，病毒載體可為例如慢病毒載體或腺病毒載體。 　　在一些實施態樣中，根據本發明的編碼多肽之多核苷酸可為mRNA，其以例如電穿孔直接引入細胞中。在一些實施態樣中，可使用細胞脈衝(cytoPulse)技術暫時地滲透活細胞以遞送材料至細胞中。可修改參數以決定具有最小的死亡率之高轉染效率的條件。 　　在本文亦提供轉染T細胞之方法。在一些實施態樣中，該方法包含：將T細胞與RNA接觸及對T細胞施予由下列所組成之靈活的脈衝序列：(a)具有每公分約2250至3000 V之電壓範圍的電脈衝；(b)0.1 ms之脈衝寬度；(c)在步驟(a)與(b)的電脈衝之間約0.2至10 ms的脈衝間隔；(d)具有約2250至3000 V之電壓範圍與約100 ms之脈衝寬度的電脈衝及在步驟(b)的電脈衝與步驟(c)的第一電脈衝之間約100 ms之脈衝間隔；及(e)四個具有約325 V之電壓與約0.2 ms之脈衝寬度的電脈衝及在4個電脈衝之各者之間2 ms之脈衝間隔。在一些實施態樣中，轉染T細胞之方法包含將該T細胞與RNA接觸及對T細胞施予包含下列之靈活的脈衝序列：(a)具有每公分約2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000V之電壓的電脈衝；(b)0.1 ms之脈衝寬度；(c)在步驟(a)與(b)的電脈衝之間約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 ms之脈衝間隔；(d)一個具有約2250、of 2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000V之電壓範圍與約100 ms之脈衝寬度的電脈衝及在步驟(b)的電脈衝與步驟(c)的第一個電脈衝之間約100 ms之脈衝間隔；及(e)四個具有約325 V之電壓與約0.2 ms之脈衝寬度的電脈衝及在四個電脈衝之各者之間約2 ms之脈衝間隔。包括在上述數值範圍內的任何數值揭示於本申請案中。電穿孔介質可為本技術中已知的任何適合的介質。在一些實施態樣中，電穿孔介質具有跨越約0.01至約1.0毫西門子(milliSiemens)之範圍的導電性。 　　在一些實施態樣中，該方法可另外包含基因修飾細胞的步驟，其係藉由使至少一種表現例如而不限於TCR之組份、免疫抑制劑之標靶、HLA基因及/或免疫檢查點蛋白質(諸如PDCD1或CTLA-4)之基因失活。藉由使基因失活而意欲使關注之基因不以功能性蛋白質的形式表現。在一些實施態樣中，欲失活之基因係選自由下列所組成之群組：例如而不限於TCRα、TCRβ、CD52、GR、脫氧胞核苷激酶(DCK)、PD-1及CTLA-4。在一些實施態樣中，該方法包含使一或多種基因失活，其係藉由將能夠以選擇性DNA裂解使基因選擇性失活的稀切核酸內切酶引入細胞中。在一些實施態樣中，稀切核酸內切酶可為例如類轉錄活化子效應子核酸酶(TALE核酸酶)或Cas9核酸內切酶。 　　在另一態樣中，基因修飾細胞的步驟可包含：藉由使至少一種表現免疫抑制劑標靶之基因失活而修飾T細胞；及隨意地在免疫抑制劑的存在下擴增細胞。免疫抑制劑為藉由數種作用機制中之一者抑制免疫功能之劑。免疫抑制劑可減低免疫反應的程度及/或強度。免疫抑制劑的非限制性實例包括鈣調磷酸酶(calcineurin)抑制劑、雷帕黴素(rapamycin)標靶、介白素-2α鏈阻斷劑、肌苷單磷酸去氫酶抑制劑、二氫葉酸還原酶抑制劑、皮質類固醇及免疫抑制抗代謝物。一些細胞毒性免疫抑制劑係藉由抑制DNA合成而起作用。其他的抑制劑可通過T細胞活化或藉由抑制輔助細胞活化而起作用。根據本發明之方法容許藉由使T細胞中的免疫抑制劑之標靶去活化而對免疫療法之T細胞賦予免疫抑制抗性。免疫抑制劑之標靶可為作為非限制性實例的免疫抑制劑之受體，諸如而不限於CD52、糖皮質激素受體(GR)、FKBP家族基因成員及親環素家族基因成員。 治療方法 　　以上述方法所獲得的單離之T細胞或衍生自此等單離之T細胞的細胞系可用作為藥劑。在一些實施態樣中，此等藥劑可用於治療病症，諸如病毒性疾病、細菌性疾病、癌症、發炎性疾病、免疫性疾病或老化相關性疾病。在一些實施態樣中，癌症可選自由下列所組成之群組：胃癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、頭及頸部癌、胸腺癌、上皮癌、唾液癌、肝癌、胃癌、甲狀腺癌、肺癌、卵巢癌、乳癌、前列腺癌、食道癌、胰臟癌、膠質瘤、白血病、多發性骨髓瘤、腎細胞癌、膀胱癌、子宮頸癌、絨毛膜癌、結腸癌、口腔癌、皮膚癌及黑色素瘤。在一些實施態樣中，個體為患有局部晚期或轉移性黑色素瘤、鱗狀細胞頭及頸部癌(SCHNC)、卵巢癌、肉瘤或復發/難治的經典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)之先前治療過的成年個體。 　　在一些實施態樣中，根據本發明的單離之T細胞或衍生自單離之T細胞的細胞系可用於製造供治療有需要之個體的病症之藥劑。在一些實施態樣中，病症可為例如癌症、自體免疫病症或感染。 　　本文亦提供治療個體之方法。在一些實施態樣中，該方法包含對有需要之個體提供本發明的單離之T細胞。在一些實施態樣中，該方法包含對有需要之個體投予本發明的單離之T細胞的步驟。 　　在一些實施態樣中，本發明的單離之T細胞可經歷穩健的活體內T細胞擴增且可持續延長的時間量。 　　本發明之治療方法可為改善、治癒或預防。本發明之方法可為自體免疫療法的一部分或為同種異體免疫療法的一部分。本發明特別適合於同種異體免疫療法。來自給予體之T細胞可使用標準的程序轉形成非同種異體反應性細胞且在需要時復產，由此生產可投予一或多位個體之CAR-T細胞。此等CAR-T細胞療法可取得成為〝現成的〞治療產品進行。 　　在另一態樣中，本發明提供抑制有腫瘤之個體的腫瘤生長或進展之方法，其包含對個體投予有效量的如本文所述的單離之T細胞。在另一態樣中，本發明提供抑制或預防個體的癌細胞移轉之方法，其包含對有需要之個體投予有效量的如本文所述的單離之T細胞。在另一態樣中，本發明提供誘導有腫瘤之個體的腫瘤消退之方法，其包含對個體投予有效量的如本文所述的單離之T細胞。 　　在一些實施態樣中，本文的單離之T細胞可經腸胃外投予個體。在一些實施態樣中，個體為人類。 　　在一些實施態樣中，該方法可另外包含投予有效量的第二治療劑。在一些實施態樣中，第二治療劑為例如克里唑替尼(crizotinib)、帕博西尼(palbociclib)、抗CTLA4抗體、抗4-1BB抗體、PD-1抗體或PD-L1抗體。 　　亦提供本文所提供的單離之T細胞中任一者製造藥劑之用途，該藥劑係用於治療有需要之個體的癌症或抑制該個體的腫瘤生長或進展。 　　在一些實施態樣中，第I類MHC之細胞表面表現量與在不包含病毒蛋白質之T細胞上的第I類MHC之細胞表面表現量相比，降低至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%。在一些實施態樣中，第I類MHC之細胞表面表現量可以流動式細胞測量術測量。 　　在一些實施態樣中，投予包含CAR及選自表1之病毒蛋白質的本發明之T細胞與投予不表現選自表1之病毒蛋白質之T細胞相比，降低至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%之排斥。 　　在一些實施態樣中，投予包含CAR及選自表1之病毒蛋白質的本發明之T細胞與投予不表現選自表1之病毒蛋白質之T細胞相比，增加至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%之反應持續期。 　　在一些實施態樣中，投予包含CAR及選自表1之病毒蛋白質的本發明之T細胞與投予不表現選自表1之病毒蛋白質之T細胞相比，改良至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%之持續性。 　　在一些實施態樣中，投予包含CAR及選自表1之病毒蛋白質的本發明之T細胞與投予不表現選自表1之病毒蛋白質之T細胞相比，降低至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%之GVHD之發病率。 　　在一些實施態樣中，治療可與一或多種對抗癌症的選自下列群組之療法組合：抗體療法、化學療法、細胞介素療法、樹狀細胞療法、基因療法、激素療法、雷射光療法及放射療法。 　　在一些實施態樣中，治療可投予正經歷免疫抑制治療之個體。事實上，本發明較佳地依賴由於編碼此等免疫抑制劑之受體的基因失活而對至少一種免疫抑制劑已具有抗性之細胞或細胞群。在此態樣中，免疫抑制治療應有助於根據本發明於個體內選擇及擴增T細胞。根據本發明之細胞或細胞群的投予可以任何方便的方式進行，包括以氣霧劑吸入、注射、攝入、輸液、植入或移植。本文所述之組成物可經皮下、皮內、腫瘤內、節點內、髓內、肌肉內、經靜脈內或淋巴內注射或經腹膜內投予個體。在一個實施態樣中，本發明之細胞組成物較佳地經靜脈內注射投予。 　　在一些實施態樣中，細胞或細胞群之投予可包含例如每公斤體重投予約10⁴ 至約10⁹ 個細胞，包括在該等範圍內所有的整數值之細胞數量。在一些實施態樣中，細胞或細胞群之投予可包含每公斤體重投予約10⁵ 至約10⁶ 個細胞，包括在該等範圍內所有的整數值之細胞數量。細胞或細胞群可以一或多個劑量投予。在一些實施態樣中，該有效量的細胞可以單一劑量投予。在一些實施態樣中，該有效量的細胞可以一個以上的劑量經一段時間投予。投予時機係在管理醫師的判斷範圍內且取決於個體的臨床病況而定。細胞或細胞群可自任何來源獲得，諸如血庫或給予體。雖然個別的需求不同，但是對特定的疾病或病況給出之細胞類型的有效量之最優範圍的決定係在本技術的技能範圍內。有效量意指提供治療或預防效益的量。所投予之劑量係取決於接受者的年齡、健康和體重、並行治療(若有的話)的種類、治療頻率及所欲效應的性質而定。在一些實施態樣中，有效量的細胞或包含該等細胞之組成物係經腸胃外投予。在一些實施態樣中，投予可經靜脈內投予。在一些實施態樣中，投予可於腫瘤內注射而直接完成。 　　在本發明之一些實施態樣中，細胞可連同(例如之前、同時或之後)任何數量的相關治療模式一起投予個體，該模式包括但不限於以下列的劑治療：諸如單株抗體療法、CCR2拮抗劑(例如INC-8761)、抗病毒療法、西多福韋(cidofovir)和介白素-2、阿糖胞苷(Cytarabine)(亦稱為ARA-C)、或用於MS個體之那他珠單抗(nataliziimab)治療、或用於牛皮癬個體之伊法利珠單抗(efaliztimab)治療、或用於PML個體之其他治療。在一些實施態樣中，BCMA特異性CAR-T細胞係連同下列中之一或多者投予個體：抗PD-1抗體(例如尼渥魯單抗(nivolumab)、沛洛珠單抗(pembrolizumab)或PF-06801591)、抗PD-L1抗體(例如艾維魯單抗(avelumab)、阿特柔珠單抗(atezolizumab)或德瓦魯單抗(durvalumab))、抗OX40抗體(例如PF-04518600)、抗4-1BB抗體(例如PF-05082566)、抗MCSF抗體(例如PD-0360324)、抗GITR抗體及/或抗TIGIT抗體。在進一步的實施態樣中，本發明的單離之T細胞可與化學療法、放射療法、免疫抑制劑(諸如環孢素(cyclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲胺喋呤(methotrexate)、黴酚酸酯(mycophenolate)和FK506)、抗體或其他的免疫剝除劑，諸如CAMPATH、抗CD3抗體或其他的抗體療法、細胞毒素、氟達拉濱(fludaribine)、環孢素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸(mycoplienolic acid)、類固醇、FR901228、細胞介素及/或照射療法組合使用。該等藥物抑制鈣依賴性磷酸酶鈣調磷酸酶(環孢素和FK506)或抑制對生長因子誘導之傳訊重要的p70S6激酶(雷帕黴素)(Henderson, Naya等人，1991；Liu, Albers等人，1992；Bierer, Hollander等人，1993)。在進一步的實施態樣中，本發明之細胞組成物係連同(例如之前、同時或之後)骨髓移植，使用化學療劑(諸如氟達拉濱)、外部光束放射療法(XRT)、環磷醯胺或抗體(諸如OKT3或CAMPATH)之T細胞剝除療法一起投予個體。在一些實施態樣中，本發明之細胞組成物係在B細胞剝除療法(諸如與CD20反應之劑，例如利妥昔單抗(Rituxan))之後投予。例如，在一個實施態樣中，個體可經歷以高劑量化學療法，繼而以周邊血液幹細胞移植的標準治療。在特定的實施態樣中，在移植之後，個體接受本發明的擴增之免疫細胞輸液。在一些實施態樣中，擴增之細胞係在手術之前或之後投予。 套組 　　本發明亦提供用於本方法之套組。本發明之套組包括一或多個容器及依照本文所述的本發明之方法中任一者使用的用法說明書，該容器包含如本文所述之包含一或多種編碼病毒蛋白質及CAR之多核苷酸的單離之T細胞。該等用法說明書通常包含投予用於上述之治療性治療的單離之T細胞的說明。 　　與使用如本文所述的單離之T細胞有關的用法說明通常包括用於意欲治療之劑量、給藥時間表及投予途徑的資訊。容器可為單位劑量、散裝包裝(例如多劑量包裝)或次單元劑量。以本發明之套組所供給的用法說明通常為書寫在標籤或包裝仿單上的用法說明(例如包括在套組中的紙張)，但亦可接受機器可讀的用法說明(例如以儲存磁碟或光碟傳達的用法說明)。 　　本發明之套組係在適合的包裝中。適合的包裝包括但不限於小瓶、瓶、罐、軟包裝(例如密封之邁拉(Mylar)或塑料袋)及類似物。亦涵蓋與特定的裝置組合使用的包裝，諸如吸入器、經鼻投予裝置(例如霧化器)或輸液裝置，諸如微型泵。套組可具有無菌存取口(例如容器可為靜脈內注射溶液袋或具有以皮下注射針可刺穿的塞子之小瓶)。容器亦可具有無菌存取口(例如該容器可為靜脈內注射溶液袋或具有可以皮下注射針可刺穿的塞子之小瓶)。組成物中至少一種活性劑為包含病毒蛋白質及CAR的單離之T細胞。容器可另外包含第二醫藥活性劑。 　　套組可隨意地提供額外的組份，諸如緩衝液及解說資訊。套組正常地包含容器及在容器上或聯合容器的標籤或包裝仿單。 　　下列的實施例僅以例證為目的而提供，且不意欲以任何方式限制本發明之範圍。事實上，除了那些本文所示及說明者以外，本發明之各種修改係自前述的說明而為那些熟習本技術領域者所明白且落在附屬之申請專利範圍內。 實施例 　　實施例1：向下調節在T細胞上的第I類MHC分子細胞表面表現 　　此實施例係例證病毒蛋白質向下調節在表現CAR的單離之T細胞上的第I類MHC之細胞表面表現的用途。 　　在宿主對抗移植物(HvG)排斥中，在給予體細胞上的MHC係經宿主T細胞識別，其接著消除表現MHC之給予體細胞。因此，希望降低來自同種異體CAR-T細胞的第I類MHC之細胞表面表現以改良CAR-T細胞持續性及/或改善HvG排斥。 　　為了測定各種病毒蛋白質向下調節在單離之T細胞上第I類MHC的細胞表面表現之能力，將Jurkat細胞及初級人類T細胞以編碼抗BCMA CAR與或不與不同的CMV蛋白質共同表現之構築體轉導，如表3中所示。使用BFP作為陰性對照蛋白質。僅CAR+細胞能夠基於表現構築體設計而共同表現CMV蛋白質。功能性第I類MHC複合體係在轉導之細胞上使用對HLA A/B/C特異性之抗體檢測及抗BCMA CAR表面表現係使用生物素化BCMA檢測。將結果總結於表4和5及圖1和2中。 在CAR陽性T細胞中觀察到不同等級的經病毒蛋白質調介之第I類MHC向下調節。在表現CAR及ICP47、K3、K5、E19、US3、US6或US2之T細胞中觀察到經病毒蛋白質調介之第I類MHC向下調節(表4和5)。例如，K5之表現導致伴隨(圖1，右邊；表4)在CAR+Jurkat細胞中的第I類MHC降低之細胞表面表現。未觀察到隨著此降低的第I類MHC細胞表面表現而降低的CAR表現(圖1)。相對地，US11之表現未降低在CAR+Jurkat細胞中的第I類MHC細胞表面表現(圖1，左邊；表4)。在一些情況中，第I類MHC向下調節伴隨較低的CAR表面表現(未顯示出數據)。 　　病毒蛋白質ICP47、K3、K5、E19、U3、US6及US2之各者與CAR的共同表現導致第I類MHC細胞表面表現降低至各種的程度(圖2；表4和5)。在圖2中，左列(-)代表不表現CAR或病毒蛋白質之細胞，及右列(+)代表表現CAR及指出之病毒蛋白質的細胞。僅CAR+細胞能夠基於表現構築體設計而共同表現CMV蛋白質。 　　該等結果證明病毒蛋白質可降低在CAR-T細胞表面上的第I類MHC呈現。 實施例2： 　　此實施例例證在試管內及活體內二者共同表現病毒蛋白質對CAR-T細胞活性及經T細胞調介之同種異體反應性的效應。在此研究中，共同表現各種CMV蛋白質之CAR-T細胞係使用試管內經T細胞調介之同種異體反應性檢定法評定。測量第I類MHC細胞表面表現以測定在第I類MHC細胞表面表現與同種異體反應性之間的相關性。 　　為了測定同種異體反應性，利用混合型淋巴細胞反應(MLR)檢定法。檢定法包含培育來自兩種對偶基因不匹配之給予體的T細胞，接著監測增生及細胞介素釋放。在檢定法中，具有不匹配之MHC/TCR對的給予體與具有匹配之MHC/TCR對的給予體相比，反應出增加之增殖及細胞介素生產。 　　使用試管內細胞毒性檢定法測試CAR-T細胞之標靶特異性活性。該等檢定法由將CAR-T細胞與不同比率之標靶細胞混合且使用標準的細胞毒性測量法測量殺死標靶細胞的程度所組成。在試管內顯示最大降低同種異體反應性且維持顯著的溶解活性之CAR-T細胞係使用NSG小鼠模式於活體內測試活性及持續性。簡言之，該等CAR-T細胞投予至攜腫瘤小鼠，且比較腫瘤生長與具有未經修飾之T細胞的小鼠中及具有不共同表現病毒蛋白質之CAR-T細胞的小鼠中之腫瘤生長。測量在周邊血液、腫瘤及脾臟中的T細胞之持續性。為了模擬HvG反應，該研究包括添加來自對偶基因不匹配之給予體的T細胞以誘導CAR-T細胞之同種異體排斥。 實施例3： 　　此實施例例證共同表現向下調節第I類MHC細胞表面表現的病毒蛋白質之CAR-T細胞的經NK細胞調介之HvG的評定。 　　缺乏對偶基因匹配之第I類MHC分子的細胞經NK細胞識別為非自身的且被消除(宿主對抗移植物排斥或HvG)。為了測定共同表現向下調節第I類MHC表面表現的病毒蛋白質之CAR-T細胞的經NK細胞調介之HvG的程度，使用試管內及活體內檢定法。 　　試管內檢定法。NK細胞係分別自對偶基因不匹配之給予體純化。經純化之NK細胞係使用MLR檢定法評定其誘導HvG反應的能力。檢定法包含培育來自兩種對偶基因不匹配之給予體的T細胞，接著監測增殖及細胞介素釋放。在檢定法中，具有不匹配之MHC/TCR對的給予體與具有匹配之MHC/TCR對的給予體相比，反應出增加之增殖及細胞介素生產。 實施例4： 　　此實施例例證使用抗NK細胞抑制性受體抗體減弱表現病毒蛋白質且具有降低的第I類MHC細胞表面表現之CAR-T細胞經NK細胞調介之消除。 　　產生特異性結合NK細胞抑制性受體(諸如KIR及凝集素樣分子)之抗體且測試其模擬第I類MHC抑制性傳訊的能力。抗體係使用生物檢定法及與上述相同的試管內檢定法評定其結合及動力性質。所選擇之抗NK細胞抑制性受體抗體係作為單鏈抗體(scFv)在共同表現病毒蛋白質之CAR-T細胞的表面上共同表現且使用先前所述之試管內檢定法測試。具有降低的經NK細胞調介之殺死的CAR-T細胞係使用先前所述之NSG小鼠模式於活體內評估CAR-T細胞活性、CAR-T細胞持續性及HvG排斥。 　　儘管所揭示之指導已參考各種申請案、方法、套組及組成物予以說明，但是應理解可在不偏離本文之指導及下列請求之發明而進行各種變化及修改。前述實施例對所揭示之指導提供更好的例證且不意欲限制本文所呈示之指導範圍。雖然本發明之指導已就該等例示性實施態樣予以說明，但是熟習本技術領域者可輕易地瞭解該等例示性實施態樣可能有許多變化及修改而無需過度實驗。所有此等變化及修改皆在本發明之指導範圍內。 　　將本文所引用之所有參考資料(包括專利、專利申請案、論文、教科書及類似者)及其中所引用之參考資料(包含彼等尚未完成的程度)以彼之全文特此併入以供參考。在併入之文獻及類似材料中之一或多者與本申請案不同或矛盾的情況下，包括但不限於定義之術語、術語用法、所說明之技術或類似者，應以本申請案為主。 　　前述說明和實施例詳述本發明之特定的具體實施態樣且說明由本發明者涵蓋之最佳模式。然而，應理解的是無論本文出現多麼詳盡的說明，本發明可以多種方式實施且本發明應依照所附之申請專利範圍及其任何同等物予以解釋。

圖1A及圖1B描述總結共同表現病毒蛋白質US11(FIG 1A)或K5(圖1B)之CAR+Jurkat細胞的細胞計數法分析結果之圖形。Y軸表示CAR表現及X軸表示第I類MHC表現。 　　圖2描述總結不表現CAR或病毒蛋白質的細胞(左列〝-〞)與表現CAR及指出之病毒蛋白質的細胞(右列〝+〞)相比的第I類MHC表面表現量之圖形。GMFI=幾何平均螢光強度。

Claims (45)

1. 一種單離之T細胞，其包含 　　(i)病毒蛋白質，其降低第I類主要組織相容性複合體(MHC)之細胞表面表現量，其係與不包含該病毒蛋白質的單離之T細胞的第I類MHC之細胞表面表現量相比，及 　　(ii)嵌合性抗原受體(CAR)，其包含細胞外配體結合域、跨膜域和細胞內傳訊域。
2. 根據申請專利範圍第1項之單離之T細胞，其中該病毒蛋白質為巨細胞病毒(CMV)蛋白質、腺病毒蛋白質、疱疹病毒蛋白質或人類免疫缺乏病毒蛋白質。
3. 根據申請專利範圍第1或2項之單離之T細胞，其中該病毒蛋白質為ICP47、K3、K5、E19、US3、US6、US2、U21、Nef、US10或U21。
4. 根據申請專利範圍第1至3項中任一項之單離之T細胞，其中該病毒蛋白質未顯著地降低該CAR之細胞表面表現量，其係與包含該CAR但不包含該病毒蛋白質的單離之T細胞的該CAR之細胞表面表現量相比。
5. 根據申請專利範圍第1至4項中任一項之單離之T細胞，其中該單離之T細胞另外包含NK細胞拮抗劑。
6. 根據申請專利範圍第5項之單離之T細胞，其中該NK細胞拮抗劑為抗NK細胞抑制性受體促效劑抗體或抗NK細胞活化受體拮抗劑抗體。
7. 根據申請專利範圍第6項之單離之T細胞，其中該抗NK細胞抑制性受體抗體包含單鏈可變片段(scFv)。
8. 根據申請專利範圍第6或7項之單離之T細胞，其中該抗NK細胞抑制性受體抗體特異性結合殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)、CD94–NKG2A/C/E異二聚體、2B4 (CD244)受體或殺手細胞凝集素樣受體G1(KLRG1)受體。
9. 根據申請專利範圍第8項之單離之T細胞，其中該KIR為KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B或KIR2DL4。
10. 根據申請專利範圍第1至9項中任一項之單離之T細胞，其中該單離之T細胞展現改良之活體內持續性，其係與第二單離之T細胞的活體內持續性相比，其中該第二單離之T細胞除了不包含該病毒蛋白質以外，包含該單離之T細胞的所有組份。
11. 根據申請專利範圍第1至10項中任一項之單離之T細胞，其中該單離之T細胞在組織不相容的接受者中不誘出或誘出降低之移植物對抗宿主疾病(GVHD)反應，其係與由第二單離之T細胞所誘出之該GVHD反應相比，其中該第二單離之T細胞除了不包含該病毒蛋白質以外，包含該單離之T細胞的所有組份。
12. 一種CAR-T細胞群，其包含：複數個根據申請專利範圍第1至11項中任一項之單離之T細胞。
13. 根據申請專利範圍第12項之CAR-T細胞群，其中第I類MHC之細胞表面表現量與在不包含病毒蛋白質之T細胞上的第I類MHC之細胞表面表現量相比，降低至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
14. 根據申請專利範圍第13項之CAR-T細胞群，其中第I類MHC之該細胞表面表現量係以流動式細胞測量術測量。
15. 一種產生單離之T細胞之方法，其中該方法包含修飾表現CAR之T細胞以表現病毒蛋白質，其中該CAR包含細胞外配體結合域、跨膜域和細胞內傳訊域。
16. 根據申請專利範圍第14或15項之方法，其另外包含修飾該T細胞以表現抗NK細胞拮抗劑。
17. 根據申請專利範圍第14至16項中任一項之方法，其中該病毒蛋白質被穩定地引入該細胞中。
18. 根據申請專利範圍第14至17項中任一項之方法，其中編碼該病毒蛋白質之多核苷酸係藉由轉位子/轉位酶系統、基於病毒之基因轉移系統或電穿孔而引入該細胞中。
19. 根據申請專利範圍第14至18項中任一項之方法，其中編碼該嵌合性抗原受體之多核苷酸係藉由轉位子/轉位酶系統、電穿孔或基於病毒之基因轉移系統而引入該細胞中。
20. 根據申請專利範圍第19項之方法，其中該基於病毒之基因轉移系統包含重組的反轉錄病毒或慢病毒。
21. 根據申請專利範圍第16至20項中任一項之方法，其中編碼該NK細胞拮抗劑之多核苷酸係藉由轉位子/轉位酶系統、基於病毒之基因轉移系統或電穿孔而引入該細胞中。
22. 一種醫藥組成物，包含根據申請專利範圍第1至11項中任一項之單離之T細胞，其係用於治療病症。
23. 根據申請專利範圍第22項之醫藥組成物，其中該病症為癌症、自體免疫疾病或感染。
24. 根據申請專利範圍第22或23項之醫藥組成物，其中供給一次以上的該細胞。
25. 根據申請專利範圍第24項之醫藥組成物，其中該細胞係以相隔至少約1、2、3、4、5、6、7或更多天供給該個體。
26. 根據申請專利範圍第25項之醫藥組成物，其中該病症為病毒性疾病、細菌性疾病、癌症、發炎性疾病、免疫性疾病或老化相關性疾病。
27. 一種治療個體的病症之方法，其包含對該個體投予根據申請專利範圍第1至14項中任一項之單離之T細胞。
28. 一種降低個體的GVHD之方法，其包含對該個體投予根據申請專利範圍第1至14項中任一項之單離之T細胞。
29. 一種改進個體的持續性之方法，其包含對該個體投予根據申請專利範圍第1至14項中任一項之單離之T細胞。
30. 一種延長個體的持續反應時間之方法，其包含對該個體投予根據申請專利範圍第1至14項中任一項之單離之T細胞。
31. 根據申請專利範圍第27至30項中任一項之方法，其中對該個體供給一次以上的該細胞。
32. 根據申請專利範圍第27至31項中任一項之方法，其中該個體在投予該單離之T細胞之前已事先以治療劑治療。
33. 根據申請專利範圍第32項之方法，其中該治療劑為抗體或化學治療劑。
34. 根據申請專利範圍第27至33項中任一項之方法，其另外包含投予NK細胞拮抗劑。
35. 根據申請專利範圍第34項之方法，其中該NK細胞拮抗劑為抗NK細胞抑制性受體抗體。
36. 根據申請專利範圍第35項之方法，其中該抗NK細胞抑制性受體抗體為抗KIR抗體。
37. 根據申請專利範圍第27至36項中任一項之方法，其中該病症為病毒性疾病、細菌性疾病、癌症、發炎性疾病、免疫性疾病或老化相關性疾病。
38. 根據申請專利範圍第37項之方法，其中該癌症為血液惡性腫瘤或實體癌症。
39. 根據申請專利範圍第38項之方法，其中該血液惡性腫瘤係選自急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性嗜酸性球性白血病(CEL)、骨髓發育不良症候群(MDS)、非霍奇金(Hodgkin)氏淋巴瘤(NHL)或多發性骨髓瘤(MM)。
40. 根據申請專利範圍第38項之方法，其中該實體癌症係選自膽管癌、膀胱癌、骨骼及軟組織癌、腦腫瘤、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸腺癌、結腸直腸癌、硬纖維瘤、胚胎癌、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、胃腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、婦科腫瘤、頭及頸部鱗狀細胞癌、肝癌、肺癌、惡性黑色瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、胰臟導管腺癌、原發性星形細胞瘤、原發性甲狀腺癌、前列腺癌、腎癌、腎細胞癌、橫紋肌肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、睪丸生殖細胞腫瘤、泌尿上皮癌、子宮肉瘤或子宮癌。
41. 根據申請專利範圍第27至40項中任一項之方法，其另外包含對該個體投予一或多種額外的治療劑。
42. 根據申請專利範圍第41項之方法，其中該額外的治療劑為抗體或化學治療劑。
43. 一種多核苷酸，其編碼(i)病毒蛋白質，其降低第I類主要組織相容性複合體(MHC)分子之細胞表面表現量，其係與不包含該病毒蛋白質的單離之T細胞的第I類MHC分子之細胞表面表現量相比，及(ii)嵌合性抗原受體(CAR)。
44. 一種載體，其包含根據申請專利範圍第43項之多核苷酸。
45. 根據申請專利範圍第44項之載體，其中該載體為病毒載體。