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CN119300867A - 连接子、药物连接子及其偶联物及其使用方法 - Google Patents

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CN119300867A
CN119300867A CN202280048422.9A CN202280048422A CN119300867A CN 119300867 A CN119300867 A CN 119300867A CN 202280048422 A CN202280048422 A CN 202280048422A CN 119300867 A CN119300867 A CN 119300867A
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CN
China
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linker
unit
alkylene
subunit
group
Prior art date
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Pending
Application number
CN202280048422.9A
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English (en)
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尚晓
刘海东
朱莉娅·加夫里尤克
赵柏腾
韩泰熙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jian Mabao
Original Assignee
Pufang Biopharmaceutical Usa
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Publication date
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    • C07C237/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C237/08—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
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Abstract

本发明提供了极性单元、连接子中间体、连接子、药物连接子及其偶联物。

Description

连接子、药物连接子及其偶联物及其使用方法
背景技术
关于序列表的声明电子序列表(760270_40201WO_SEQUENCE_LISTING.xml；大小：40657字节；和创建日期：2022年6月30日)的内容在此全文引用。
连接子、药物连接子及其偶联物及其使用方法将单克隆抗体(mAbs)用于将细胞毒性剂以抗体药物偶联物(或ADC)的形式靶向递送至与疾病相关的细胞，例如癌细胞及其他细胞，引起了极大的兴趣。借由将细胞毒性剂、免疫调节剂或其他试剂(统称为“药物”)连接至抗体(通常经由连接子)来设计抗体药物偶联物需要考虑许多因素。这些因素包括用于连接药物的化学基团的身分及位置，药物释放的机制，提供药物释放的结构元件(若有的话)，以及释放的游离药物(若有的话)的结构修饰。若药物在细胞外环境中释放，药物的释放形式必须能够达到其目标。若药物在抗体内化之后被释放，则药物释放的结构元件及机制必须与偶联物的细胞内运输相一致。
在抗体药物偶联物的设计中的另一个重要因素为各靶向剂可以递送的药物的量(亦即，连接至各靶向剂(例如，抗体)的药物的数量，称为药物负载或载药量)。在历史上，假定较高的药物负载优于较低的药物负载(例如，8个负载与4个负载)。根本逻辑为较高负载的偶联物将向目标细胞递送更多的药物(例如，细胞毒性剂)。这一根本逻辑得到以下观测结果的支援：具有较高载药量的偶联物在体外对细胞系更具活性。然而，某些后来的研究表明，这种假设在动物模型中无法得到证实。在小鼠模型中观测到某些奥瑞他汀的药物负载为4或8的偶联物具有类似的活性。参见，例如Hamblett等，Clinical Cancer Res.10:7063-70(2004)。Hamblett等人也报导了在动物模型中较高负载的ADC更快地自循环中清除。这种更快的清除表明与较低负载的物质相比，较高负载的物质具有PK倾向。参见Hamblett等人。此外，较高负载的偶联物在小鼠中具有较低的最大耐受剂量(MTD)，并且因此具有较窄的报导的治疗指数。参见同上。相比的下，据报导，在单克隆抗体中的工程化位点处载药量为2的ADC与某些4-负载的ADC相比具有相同或更佳的PK及治疗指数。例如，参见Junutula等人，Clinical Cancer Res.16:4769(2010)。因此，最近的趋势为开发具有低载药量的ADC。
因此，需要抗体药物偶联物形式(并且更一般地，其他偶联物的形式)，其允许更高的载药量，但保持较低负载的偶联物的其他特性，例如有利的PK性质。令人惊奇地，本发明解决了这些需要。
发明内容
本文提供了具有亲水特性的连接子，其保持了与连接子及药物结合的抗体的固有性质。特别地，当以较高的载药量结合和/或与疏水药物及其他试剂结合时，该连接子有助于保持抗体的亲水性。还提供了包含该连接子的药物-连接子及偶联物，以及使用此类偶联物治疗癌症及其他疾病的方法。
在一些实施例中，提供了具有以下式(V)的连接子中间体：
～(AA)s-[L2]≈
(V)
或其盐，其中：
AA为具有1个至12个氨基酸亚单元的氨基酸单元；
s为0或1；
L2为具有1个至4个用于药物单元的连接位点的连接子亚单元；以及
各波浪(～)线表示用于扩展单元的连接位点，以及双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点，其中至少一个极性单元存在于氨基酸单元、连接子亚单元或两者中，并且其中极性单元选自糖单元、PEG单元、羧基单元及其组合。
在一些实施例中，提供了具有以下式(I)的连接子：
～L1-(AA)s-L2≈
(I)
或其盐，其中：
L1为具有用于靶向单元的连接位点的扩展单元；
AA为具有1个至12个亚单元的氨基酸单元；
s为0或1；
L2为具有1个至4个用于药物单元的连接位点的连接子亚单元；
波浪(～)线表示用于靶向单元的连接位点，以及双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点；
其中至少一个极性单元存在于氨基酸单元、连接子亚单元或两者中，并且其中极性单元选自糖单元、
PEG单元、羧基单元及其组合。
在一些实施例中，提供了具有以下式(I)的连接子：
～L1-(AA)s-L2≈
(I)
或其盐，其中：
L1为具有用于靶向单元的连接位点的扩展单元；
AA为具有1个至12个亚单元的氨基酸单元；
s为0或1；
L2为具有1个至4个用于药物单元的连接位点的连接子亚单元；
波浪(～)线表示用于靶向单元的连接位点，以及双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点；
其中至少一个极性单元存在于氨基酸单元、连接子亚单元、扩展单元或其组合中，并且其中极性单元选自糖单元、PEG单元、羧基单元及其组合。
糖单元
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中糖单元具有下式：
L3-**N(CH2-(CH(XR))k-X1(X2))2
(X)
或其盐，其中：
各X独立地选自NH或O；
各R独立地选自氢、乙酰基、单糖、二糖及多糖；
各X1独立地选自CH2及C(O)；
各X2独立地选自H、OH及OR；
k为1至10；以及
L3具有以下通式(XI)：
或其盐，其中：
L3a选自C1-C10伸烷基及具有1个至24个乙二醇亚单元的聚乙二醇；
p及o独立地为0至2；
各*及各#表示用于氨基酸单元(AA)的其他亚单元、连接子亚单元L2或扩展单元(L1)的连接位点；
以及
L3a共价结合至式(X)中用**标记的N原子。
在一些实施例中，连接子中间体或连接子包括具有选自以下的式的糖单元：
或其盐，其中：
各R独立地选自氢、单糖、二糖及多糖；
p及o独立地为0至2；
m为1至8；
n为0至4；以及
各*及各#表示用于氨基酸单元(AA)的其他亚单元、连接子亚单元L2或扩展单元(L1)的连接位点。
PEG单元
在一些实施例中，连接子中间体或连接子包括具有选自以下的式的PEG单元：
(a)
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-NR24R25
(XX)
或其盐，其中：
R20为用于连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R21及R22各自独立地为视情况选用的C1-C3伸烷基；
R24及R25各自独立地选自H；多羟基基团；经取代的多羟基基团；-C(O)-多羟基基团；经取代的-C(O)-多羟基基团；视情况经取代的C3-C10碳环；视情况经取代的C1-C3伸烷基C3-C10碳环；视情况经取代的杂芳基；视情况经取代的碳环；经取代的-C1-C8烷基；经取代的-C(O)-C1-C8烷基；螯合物；-C(O)-R28，其中R28为式(XII)或式(XIII)的糖单元；或与-NR24R25一起形成C3-C8杂环；
波浪线(～)表示与R20的连接位点；以及
n20为1至26；
或
(b)
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-NR24R25
(XX)
或其盐，其中：
R20为用于连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R21及R22各自独立地为视情况选用的C1-C3伸烷基；
R24及R25中的一者选自H；多羟基基团；经取代的多羟基基团；-C(O)-多羟基基团；经取代的-
C(O)-多羟基基团；视情况经取代的C3-C10碳环；视情况经取代的C1-C3伸烷基C3-C10碳环；视情况经取代的杂芳基；视情况经取代的碳环；经取代的-C1-C8烷基；经取代的-C(O)-C1-C8烷基；螯合物；-C(O)-R28，其中R28为式(XII)或式(XIII)的糖单元；并且R24及R25中的另一者为聚乙二醇，视情况具有1个至24个乙二醇亚单元；
波浪线(～)表示与R20的连接位点；以及
n20为1至26；
或
(c)
～R20-[-R26-[R29-[O-CH2-CH2-]n20R29]n21-R27-]n27-NR24R25
(XXI)
或其盐，其中：
R20为用于连接至氨基酸单元的亚单元和/或该连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R26及R27各自视情况且独立地选自C1-C12伸烷基、-NH-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-NH-、-
C(O)-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-C(O)-、-NH-C1-C12伸烷基-C(O)-及-C(O)-C1-C12伸烷基-NH-；
R24及R25中的一者选自H；多羟基基团；经取代的多羟基基团；-C(O)-多羟基基团；经取代的-
C(O)-多羟基基团；视情况经取代的C3-C10碳环；视情况经取代的C1-C3伸烷基C3-C10碳环；视情况经取代的杂芳基；视情况经取代的碳环；经取代的-C1-C8烷基；经取代的-C(O)-C1-C8烷基；螯合物；-C(O)-R28，其中R28为式(XII)或式(XIII)的糖单元；并且R24及R25中的另一者选自H；多羟基基团；经取代的多羟基基团；-C(O)-多羟基基团；经取代的-C(O)-多羟基基团；视情况经取代的C3-C10碳环；视情况经取代的C1-C3伸烷基C3-C10碳环；视情况经取代的杂芳基；视情况经取代的碳环；经取代的-C1-C8烷基；经取代的-C(O)-C1-C8烷基；螯合物；-C(O)-R28，其中R28为式(XII)或式(XIII)的糖单元；及聚乙二醇，视情况具有1个至24个乙二醇亚单元；或与-NR24R25一起形成C3-C8杂环；
各R29为视情况且独立地选自-C(O)-、-NH-、-C(O)-C1-C6伸烯基-、-NH-C1-C6伸烯基-、-C1-C6伸烯基-NH-、-C1-C6伸烯基-C(O)-、-NH(CO)NH-及三唑；
波浪线(～)表示与R20的连接位点；
n20为1至26；
n21为1至4；以及
n27为1至4。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元的R24及R25均不为H。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元的R24及R25各自独立地选自H及多羟基基团，其限制条件为R24及R25不都为H。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中多羟基基团为线性单糖，视情况选自C6或C5糖、糖酸或氨基糖。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中：
C6或C5糖选自葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脱氧葡萄糖、甘油醛、赤藓糖、苏糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、醛糖及酮糖；
糖酸选自葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸及酮糖酸；或
氨基糖选自葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、半乳糖胺及N-乙酰半乳糖胺。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下，或其盐：
其中R39选自H、直链单糖及聚乙二醇，视情况具有1个至24个乙二醇亚单元；并且左侧的波浪线表示与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元的一部分的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元的R24及R25中的一者为线性单糖并且另一者为环状单糖。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下，或其盐：
其中R41为环状单糖；并且左侧的波浪线表示与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元的一部分的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元的R24及R25独立地选自环状单糖、二糖及多糖。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下，或其盐：
其中各R45选自H及单糖、二糖或多糖；并且R46选自环状单糖、二糖或多糖；并且右侧的波浪线表示与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元的一部分的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元的R24及R25独立地选自线性单糖及经取代的线性单糖，其中该经取代的线性单糖被单糖、二糖或多糖取代。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下，或其盐：
其中R47为线性单糖；并且各R49选自单糖、二糖及多糖；并且左侧的波浪线表示与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元的一部分的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元的R24及R25独立地选自线性单糖及经取代的单糖，其中该经取代的线性单糖被一个或多个选自烷基、O-烷基、芳基、O-芳基、羧基、酯或酰胺的取代基取代，并且视情况进一步被单糖、二糖或多糖取代。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下，或其盐：
其中各R42独立地选自线性单糖及经取代的线性单糖；各R43独立地选自烷基、O-烷基、芳基、O-芳基、羧基、酯及酰胺；并且左侧的波浪线表示与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元的一部分的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元的R24及R25中的一者为-C(O)-多羟基基团或经取代的-C(O)-多羟基基团，并且R24及R25中的另一者为H、-C(O)-多羟基基团、经取代的-C(O)-多羟基基团、多羟基基团或经取代的多羟基基团；其中该经取代的-C(O)-多羟基基团及多羟基基团被单糖、二糖、多糖、烷基、-O-烷基、芳基、羧基、酯或酰胺取代。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下，或其盐：
其中左侧的波浪线表示与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元的一部分的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元的R24及R25独立地选自H、经取代的-C1-C8烷基、经取代的-C1-C4烷基或经取代的-C1-C3烷基；其限制条件为R24及R25均不为H；其中经取代的-C1-C8烷基、-C1-C4烷基及-C1-C3烷基被羟基和/或羧基取代。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下，或其盐：
其中R48选自H、OH、CH2OH、COOH或被羟基或羧基取代的-C1-C6烷基；并且左侧的波浪线表示与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元的一部分的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元的R24及R25中的一者选自H、经取代的-C(O)-C1-C8烷基、经取代的-C(O)-C1-C4烷基及经取代的-C(O)-C1-C3烷基，并且R24及R25中的另一者选自经取代的-C(O)-C1-C8烷基、经取代的-C(O)-C1-C4烷基、经取代的-C(O)-C1-C3烷基、经取代的-C1-C8烷基、经取代的-C1-C4烷基及经取代的-C1-C3烷基，其中经取代的-C(O)-C1-C8烷基、经取代的-C(O)-C1-C4烷基、经取代的-C(O)-C1-C3烷基、经取代的-C1-C8烷基、-C1-C4烷基及-C1-C3烷基被羟基和/或羧基取代。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下，或其盐：
其中左侧的波浪线表示与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元的一部分的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元的R24及R25选自H及视情况经取代的芳基；其限制条件为R24及R25均不为H，其中视情况选用的取代基如本文定义，例如在一些实施例中，视情况选用的取代基为卤素，例如F、Cl或Br。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下，或其盐：
其中左侧的波浪线表示与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元的一部分的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中R24及R25一起形成视情况经取代的C3-C8杂环或杂芳基，其中在一些实施例中，C3-C8杂环或杂芳基为未取代的。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元为：
或其盐。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元的R24及R25独立地选自H及螯合物，其中该螯合物视情况借由伸烷基、伸芳基、碳环、杂伸芳基或杂碳环连接至-NR24R25的氮；其限制条件为R24及R25均不为H。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中螯合物选自乙二胺四乙酸(EDTA)、二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)、三伸乙基四胺六乙酸(TTHA)、苄基-DTPA、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N”,N”'-四乙酸(DOTA)、苄基-DOTA、1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N',N”-三乙酸(NOTA)、苄基-NOTA、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)及N,N'-二烷基取代的哌嗪。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下，或其盐：
其中左侧的波浪线表示与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元的一部分的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中糖单元或PEG单元的各单糖独立地选自：
C5或C6糖，该C5或C6糖选自葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脱氧葡萄糖、甘油醛、赤藓糖、苏糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、醛糖、酮糖、葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、半乳糖胺及N-乙酰半乳糖胺；
糖酸，该糖酸选自葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸及酮糖酸；或
氨基糖，该氨基糖选自葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、半乳糖胺及N-乙酰半乳糖胺。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中R20选自羧基、氨基、炔基、叠氮基、羟基、羰基、氨基甲酸酯、脲、硫代氨基甲酸酯、硫脲、磺酰胺、酰基磺酰胺、烷基磺酸酯或其受保护的形式。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中R20选自卤基、醛、羧基、氨基、炔基、叠氮基、羟基、羰基、氨基甲酸酯、硫醇、脲、硫代氨基甲酸酯、硫脲、磺酰胺、酰基磺酰胺、烷基磺酸酯、三唑、氮杂二苯并环辛炔、肼、羰基烷基杂芳基或其受保护的形式。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元具有选自以下的式：
(a)
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-R30
(XXX)
或其盐，其中：
R20为用于连接至氨基酸单元的亚单元(若存在)和/或连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R21及R22各自视情况且，若存在，独立地为C1-C3伸烷基基团；
R30选自视情况经取代的C3-C10碳环；硫脲；视情况经取代的硫脲；脲；视情况经取代的脲；磺酰胺；烷基磺酰胺；酰基磺酰胺、视情况经取代的烷基磺酰胺；视情况经取代的酰基磺酰胺；磺酰胺；视情况经取代的磺酰胺；胍，包括烷基胍及芳基胍；磷酰胺；或视情况经取代的磷酰胺；或
R30选自叠氮基、炔基、经取代的炔基、-NH-C(O)-炔基、-NH-C(O)-炔基-R65；环辛炔；-NH-环辛炔、-NH-C(O)-环辛炔或-NH-(环辛炔)2；其中R65选自视情况经取代的烷基、视情况经取代的烯基、视情况经取代的炔基、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基、视情况经取代的杂碳环或视情况经取代的杂芳基；
波浪线(～)表示与R20的连接位点；以及
n20为1至26；
(b)
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-NH-C(O)-R31
(XXXI)
或其盐，其中：
R20为用于连接至氨基酸单元的亚单元(若存在)或连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R21及R22各自独立地为视情况选用的C1-C3伸烷基基团；
R31为支链聚乙二醇链，各支链具有1个至26个乙二醇亚单元，并且各支链在其末端具有R35；
R35为叠氮基、炔基、炔基-R65、环辛炔或环辛炔-R65，其中R65选自视情况经取代的烷基、视情况经取代的烯基、视情况经取代的炔基、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基、视情况经取代的杂碳环或视情况经取代的杂芳基；
波浪线(～)表示与R20的连接位点；以及
n20为1至26；
(c)
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-C(O)NH-R31
(XXXII)
或其盐，其中：
R20为用于连接至氨基酸单元的亚单元(若存在)或连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R21及R22各自视情况且独立地为C1-C3伸烷基基团；
R31为支链聚乙二醇链，各支链独立地具有1个至26个乙二醇亚单元，并且各支链在其末端具有
R35；
R35为叠氮基、炔基、炔基-R65、环辛炔或环辛炔-R65，其中R65选自视情况经取代的烷基、视情况经取代的烯基、视情况经取代的炔基、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基、视情况经取代的杂碳环及视情况经取代的杂芳基；
波浪线(～)表示与R20的连接位点；以及
n20为1至26；以及
(d)
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-N-(R33-R31)2
(XXXIII)
或其盐，其中：
R20为用于连接至氨基酸单元的亚单元(若存在)或连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R21及R22各自视情况且为C1-C3伸烷基基团；
R31为支链聚乙二醇链，各支链具有1个至26个乙二醇亚单元，并且各支链在其末端具有R35；
R33为C1-C3伸烷基、-C1-C3伸烷基-C(O)、-C(O)-C1-C3伸烷基或-C(O)-C1-C3伸烷基-C(O)；
R35为叠氮基、炔基、炔基-R65、环辛炔或环辛炔-R65，其中R65选自视情况经取代的烷基、视情况经取代的烯基、视情况经取代的炔基、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基、视情况经取代的杂碳环或视情况经取代的杂芳基；
波浪线(～)表示与R20的连接位点；以及
n20为1至26。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下的式，或其盐：
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-NH-C(O)-R31
(XXXI)，
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-C(O)NH-R31
(XXXII)，
或
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-N-(R33-R31)2
(XXXIII)；
其中R20为用于连接至氨基酸单元的亚单元(若存在)或连接子亚单元L2的一部分的官能基；R21及R22各自视情况且为C1-C3伸烷基基团；R31为支链聚乙二醇链，各支链具有1个至26个乙二醇亚单元，并且各支链在其末端具有R35；R33为C1-C3伸烷基、-C1-C3伸烷基-C(O)、-C(O)-C1-C3伸烷基或-C(O)-C1-C3伸烷基-C(O)；R35为叠氮基、炔基、炔基-R65、环辛炔或环辛炔-R65，其中R65选自视情况经取代的烷基、视情况经取代的烯基、视情况经取代的炔基、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基、视情况经取代的杂碳环或视情况经取代的杂芳基；该波浪(～)线表示与R20的连接位点；以及n20为1至26。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下：
其中R65选自视情况经取代的烷基、视情况经取代的烯基、视情况经取代的炔基、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基、视情况经取代的杂碳环或视情况经取代的杂芳基；并且左侧的波浪线表示与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元的一部分的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中R20选自羧基、氨基、炔基、叠氮基、羟基、羰基、氨基甲酸酯、脲、硫代氨基甲酸酯、硫脲、磺酰胺、酰基磺酰胺、烷基磺酸酯或其受保护的形式。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中R20选自卤基、醛、羧基、氨基、炔基、叠氮基、羟基、羰基、氨基甲酸酯、硫醇、脲、硫代氨基甲酸酯、硫脲、磺酰胺、酰基磺酰胺、烷基磺酸酯、三唑、氮杂二苯并环辛炔、肼、羰基烷基杂芳基或其受保护的形式。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其包含具有选自以下的式的PEG单元：
～R40-(R43-R41-[O-CH2-CH2]n40-R42-R43-(NR44R45)n41)n42
(XL)
或其盐，其中：
R40为用于连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R41及R42不存在或各自独立地为C1-C6伸烷基；
各R43独立地不存在或选自C1-C12伸烷基、-NH-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-NH-、-C(O)-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-C(O)-、-NH-C1-C12伸烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C12伸烷基-NH-、-NH-C(O)-
NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-C1-C12伸烷基、-C(O)-NH-C1-C12伸烷基、-杂伸芳基、杂芳基-C1-C12伸烷基、杂芳基-C1-C12伸烷基-C(O)-或-C(O)NR46R47，其中R46及R47中的一者为H或C1-C12伸烷基并且另一者为C1-C12伸烷基；
R44及R45各自独立地为H、多羟基基团、经取代的多羟基基团、-C(O)-多羟基基团或经取代的-
C(O)-多羟基基团，其中视情况选用的取代基选自硫酸酯、磷酸酯、烷基硫酸酯及烷基磷酸酯；
波浪线(～)表示与R40的连接位点；
n40为1至26；
n41为1至6；以及
n42为1至6。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其包含具有选自以下的式的PEG单元：
～R40-(R41-[O-CH2-CH2]n40-R42-R43-(NR44R45)n41)n42
(XLI)
或其盐，其中：
R40为用于连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R41及R42不存在或各自独立地为C1-C6伸烷基；
R43不存在或选自C1-C12伸烷基、-NH-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-NH-、-C(O)-C1-C12伸烷基、
-C1-C12伸烷基-C(O)-、-NH-C1-C12伸烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C12伸烷基-NH-、-NH-C(O)-NH-、-NH-
C(O)-、-NH-C(O)-C1-C12伸烷基、C(O)-NH-C1-C12伸烷基、-杂伸芳基、杂芳基-C1-C12伸烷基、杂芳基-C1-C12伸烷基-C(O)-或-C(O)NR46R47，其中R46及R47中的一者为H或C1-C12伸烷基，并且另一者为C1-C12伸烷基；
R44及R45各自独立地为H、多羟基基团、经取代的多羟基基团、-C(O)-多羟基基团或经取代的-
C(O)-多羟基基团，其中视情况选用的取代基选自硫酸酯、磷酸酯、烷基硫酸酯及烷基磷酸酯；
波浪线(～)表示与R40的连接位点；
n40为1至26；
n41为1至6；以及
n42为1至6。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其包含具有选自以下的式的PEG单元：
～R40-(R41-[O-CH2-CH2]n40-R42-R43-(NR44R45)n41)n42
(XLII)
或其盐，其中：
R40为用于连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R41及R42不存在或各自独立地为C1-C3伸烷基；
R43不存在或选自C1-C6伸烷基、-NH-C1-C12伸烷基、-C1-C6伸烷基-NH-、-C(O)-C1-C6伸烷基、-
C1-C6伸烷基-C(O)-、-NH-C1-C6伸烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C6伸烷基-NH-、-NH-C(O)-NH-、-NH-
C(O)-、-NH-C(O)-C1-C6伸烷基、-C(O)-NH-C1-C12伸烷基、-杂伸芳基、杂芳基-C1-C6伸烷基、杂芳基-C1-C6伸烷基-C(O)-或-C(O)NR46R47，其中R46及R47中的一者为H或C1-C6伸烷基，并且另一者为C1-C12伸烷基；
R44及R45各自独立地为H、多羟基基团、经取代的多羟基基团、-C(O)-多羟基基团或经取代的-
C(O)-多羟基基团，其中视情况选用的取代基选自硫酸酯、磷酸酯、烷基硫酸酯及烷基磷酸酯；
波浪线(～)表示与R40的连接位点；
n40为1至16；
n41为1至4；以及
n42为1至4。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中R40选自卤素、醛、羧基、氨基、炔基、叠氮基、羟基、羰基、氨基甲酸酯、硫醇、脲、硫代氨基甲酸酯、硫脲、磺酰胺、酰基磺酰胺、烷基磺酸酯、三唑、氮杂二苯并环辛炔、肼、羰基烷基杂芳基或其受保护的形式。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中R40具有以下结构中的一种：
其中R＝H或C1-6烷基；以及
n＝0至12
或其立体异构体，其中(*)表示R40与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分的连接位点，并且表示R40与PEG单元的其余部分的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中R40具有以下结构中的一种：
其中n＝0至12
或其立体异构体，其中(*)表示R40与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分的连接位点，并且表示R40与PEG单元的其余部分的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中R43-(NR44R45)n41当存在R43时具有以下结构中的一种：
其中R＝H、C1-6烷基、多羟基或经取代的多羟基或其立体异构体，其中表示R43与PEG单元的其余部分的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中R43-(NR44R45)n41当存在R43时具有以下结构中的一种：
或其立体异构体，其中表示R43与PEG单元的其余部分的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中-NR44R45具有以下结构中的一种：
或其立体异构体，其中表示-NR44R45与PEG单元的其余部分的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元在连接至氨基酸单元或连接子亚单元L2的一部分之前具有以下结构中的一种：
其中R为H或烷基，并且n为1至12。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其包含具有选自以下的式的PEG单元：
～R40-(R43-R41--[O-CH2-CH2]n40-R46-[O-CH2-CH2]n40-R42-R43-(NR44R45)n41)n42
(XLIII)
或其盐，其中：
R40为用于连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R41及R42不存在或各自独立地为C1-C6伸烷基；
各R43独立地不存在或选自C1-C12伸烷基、-NH-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-NH-、-C(O)-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-C(O)-、-NH-C1-C12伸烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C12伸烷基-NH-、-NH-C(O)-
NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-C1-C12伸烷基、-C(O)-NH-C1-C12伸烷基、-杂伸芳基、杂芳基-C1-C12伸烷基、杂芳基-C1-C12伸烷基-C(O)-或-C(O)NR46R47，其中R46及R47中的一者为H或C1-C12伸烷基并且另一者为C1-C12伸烷基；
R44及R45各自独立地为H、多羟基基团、经取代的多羟基基团、-C(O)-多羟基基团或经取代的-
C(O)-多羟基基团，其中视情况选用的取代基选自硫酸酯、磷酸酯、烷基硫酸酯及烷基磷酸酯；R46选自氨基、氨基-烷基-氨基或-NH-C(O)-NH-S(O)2-NH-；
波浪线(～)表示与R40的连接位点；
n40为1至26；
n41为1至6；以及
n42为1至6。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元在连接至氨基酸单元或连接子亚单元L2的一部分之前具有以下结构中的一种：
其中R为H或烷基，并且n为1至12。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其包含具有选自以下的式的PEG单元：
或其盐，其中：
各Y独立地为R76或
各R76独立地为H、乙酰基、-P(＝O)(OH)2或-(CH2)v-O-S(＝O)2(OH)；
各Ra及Rb独立地为H，或者Ra及Rb与其所连接的碳一起形成侧氧基基团；
各q独立地为1至26；
各m独立地为1至4；
各n独立地为1至4；
各v独立地为1至6；以及
各*表示用于氨基酸单元(AA)的亚单元、连接子亚单元L2或扩展单元(L1)的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其包含具有选自以下的式的PEG单元：
或其盐，其中：
各R76独立地为H、乙酰基、-P(＝O)(OH)2或-(CH2)vS(＝O)2(OH)；
各q独立地为1至26；
各m独立地为1至4；
各n独立地为1至4；
各v独立地为1至6；以及
各*表示用于氨基酸单元(AA)的亚单元、连接子亚单元L2或扩展单元(L1)的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其包含具有选自以下的式的PEG单元：
或其盐，其中：
各q独立地为1至26；
各m独立地为1至4；
各n独立地为1至4；以及
各*表示用于氨基酸单元(AA)的亚单元、连接子亚单元L2或扩展单元(L1)的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中Y为R76。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中Y为
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中各Ra及Rb独立地为H。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中Ra及Rb与其所连接的碳一起形成侧氧基基团。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中q为10至20。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中q为12。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下，或其盐：
以及
其中各Z在*处连接并且分别选自：
以及
其中各表示用于氨基酸单元(AA)的其他亚单元、连接子亚单元L2或扩展单元(L1)的连接位点。
羧基单元
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中羧基单元具有下式：
或其盐，其中：
(a)
L70选自C1-C8伸烷基、C1-C8伸烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C8伸烷基-及-C(O)-C1-C8伸烷基-C(O)-；
R70为～NR71(R72-R73)，其中R71选自H、C1-C12烷基、经取代的C1-C12烷基或聚乙二醇(视情况具有1个至12个乙二醇亚单元)，R72不存在或选自视情况经取代的C1-C3伸烷基、视情况经取代的醚、视情况经取代的硫醚、视情况经取代的酮、视情况经取代的酰胺、聚乙二醇(视情况具有1个至12个乙二醇亚单元)、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基或视情况经取代的杂芳基，并且R73为羧基或多羧基，其中多羧基包含1至10、或1至6、或1至4个羧基基团，其中这些羧基基团借由烷基、伸烷基、经取代的烷基、经取代的伸烷基、杂烷基、杂伸烷基、氨基和/或酰胺相互连接；
各波浪线(～)表示用于氨基酸单元(AA)的其他亚单元、连接子亚单元L2或扩展单元(L1)的连接位点；以及
p1及o1分别独立地选自0至2；
或
(b)
L70选自C1-C8伸烷基、C1-C8伸烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C8伸烷基-及-C(O)-C1-C8伸烷基-C(O)-；
R70为～NR71(R75-(R73)2)，其中R71选自H、C1-C12烷基、经取代的C1-C12烷基或聚乙二醇(视情况具有1个至12个乙二醇亚单元)，R75为支链的视情况经取代的C1-C3伸烷基、视情况经取代的醚、视情况经取代的硫醚、视情况经取代的酮、视情况经取代的酰胺、聚乙二醇(视情况具有1个至12个乙二醇亚单元)、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基或视情况经取代的杂芳基，并且各R73独立地为羧基或多羧基，其中多羧基包含1至10、或1至6、或1至4个羧基基团，其中这些羧基基团借由烷基、伸烷基、经取代的烷基、经取代的伸烷基、杂烷基、杂伸烷基、氨基和/或酰胺相互连接；
各波浪线(～)表示用于氨基酸单元(AA)的其他亚单元、连接子亚单元L2或扩展单元(L1)的连接位点；以及
p1及o1分别独立地选自0至2；
或
(c)
L70选自C1-C8伸烷基、C1-C8伸烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C8伸烷基-及-C(O)-C1-C8伸烷基-C(O)-；
R70为～N(R74-R73)(R72-R73)，其中R72及R74各自独立地选自视情况经取代的C1-C3伸烷基、视情况经取代的醚、视情况经取代的硫醚、视情况经取代的酮、视情况经取代的酰胺、聚乙二醇(视情况具有1个至12个乙二醇亚单元)、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基或视情况经取代的杂芳基，并且各R73独立地为羧基或多羧基，其中多羧基包含1至10、或1至6、或1至4个羧基基团，其中这些羧基基团借由烷基、伸烷基、经取代的烷基、经取代的伸烷基、杂烷基、杂伸烷基、氨基和/或酰胺相互连接；
各波浪线(～)表示用于氨基酸单元(AA)的其他亚单元、连接子亚单元L2或扩展单元(L1)的连接位点；以及
p1及o1分别独立地选自0至2。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其包含至少一个糖单元。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其包含至少一个PEG单元。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其包含至少一个羧基单元。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其包含至少两个极性单元，各极性单元选自糖单元、PEG单元及羧基单元。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其包含至少一个糖单元及PEG单元或羧基单元。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其包含至少一个羧基单元及PEG单元。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中存在氨基酸单元(AA)(s＝1)。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中氨基酸单元包含至少一个极性单元。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中L2或AA-L2具有以下结构中的一种：
其中氨基基团上的波浪线表示用于扩展单元的连接位点，并且药物单元连接至苄醇。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中～AA-L2～具有选自以下的式：
～[SU-aa]-L2≈，
～[aa1(PEG)-aa]-L2≈，或
～[CU-aa]-L2≈
其中中括号表示氨基酸单元，各aa为AA的视情况选用的亚单元，L2为连接子亚单元，各波浪线(～)表示用于扩展单元的连接位点；aa1(PEG)为连接至AA的氨基酸亚单元的PEG单元，SU为连接至AA的亚单元或连接至L2的糖单元，并且CU为连接至AA的亚单元或连接至L2的羧基单元；并且双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点，其中aa及aa1独立地选自α、β及γ氨基酸及其衍生物。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中～AA-L2～具有选自以下的式：
其中中括号表示氨基酸单元，各aa为AA的氨基酸亚单元，L2为连接至aa的侧链的连接子亚单元，波浪线(～)表示用于扩展单元的连接位点；aa1(P EG)为连接至aa的PEG单元，SU为连接至aa的糖单元，CU为连接至aa的羧基单元，并且双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点；其中aa及aa1独立地选自α、β及γ氨基酸及其衍生物。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中氨基酸单元包括至少两个极性单元。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中～AA-L2～具有选自以下的式：
～[SU-aa-SU]-L2≈，
～[aa1(PEG)-aa-aa2(PEG)]-L2≈，或
～[CU-aa-CU]-L2≈
其中中括号表示氨基酸单元，aa为AA的视情况选用的亚单元，L2为连接子亚单元，波浪线(～)表示用于扩展单元的连接位点；aa1(PEG)及aa2(PEG)分别为连接至aa的PEG单元或连接至其他PEG单元的PEG单元；各SU为连接至aa的糖单元或连接至其他糖单元的糖单元，各CU为连接至aa的羧基单元或连接至其他羧基单元的羧基单元，并且双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点；其中aa、aa1及aa2独立地选自α、β及γ氨基酸及其衍生物。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中～AA-L2～具有选自以下的式：
其中中括号表示氨基酸单元，aa为AA的氨基酸亚单元，L2为连接至aa的侧链的连接子亚单元，各波浪线(～)表示用于扩展单元的连接位点；aa1(PEG)及aa2(PEG)分别为连接至aa的PEG单元，各SU为连接至aa的糖单元；各CU为连接至aa的羧基单元；并且双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点；其中aa、aa1及aa2分别独立地选自α、β及γ氨基酸及其衍生物。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中连接子亚单元L2为可裂解的连接子单元。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中连接子亚单元L2包括可被细胞内蛋白酶裂解的肽。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中可裂解的肽包括缬氨酸-瓜氨酸肽、缬氨酸-丙氨酸肽、缬氨酸-赖氨酸肽、苯丙氨酸-赖氨酸肽或甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸肽。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中连接子亚单元L2包含至少一个极性单元。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中极性单元为糖单元(SU)。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中可裂解的肽包括SU-缬氨酸-瓜氨酸肽、SU-缬氨酸-赖氨酸肽、SU-缬氨酸-丙氨酸肽、SU-苯丙氨酸-赖氨酸肽或SU-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸肽。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中极性单元为羧基单元(CU)。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中可裂解的肽包括CU-缬氨酸-瓜氨酸肽、CU-缬氨酸-赖氨酸肽、缬氨酸-(CU-赖氨酸)肽、CU-缬氨酸-丙氨酸肽、CU-苯丙氨酸-赖氨酸肽、苯丙氨酸-(CU-赖氨酸)肽或CU-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸肽，其中CU-赖氨酸为包含赖氨酸残基的羧基单元。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中极性单元为PEG单元(PEG)。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中可裂解的肽包括Lys(PEG)-缬氨酸-瓜氨酸肽、缬氨酸-Cit(PEG)肽、Lys(PEG)-缬氨酸-赖氨酸肽、缬氨酸-赖氨酸(PEG)肽、Lys(PEG)-缬氨酸-丙氨酸肽、Lys(PEG)-苯丙氨酸-赖氨酸肽、苯丙氨酸-Lys(PEG))肽或Lys(PEG)-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸肽，其中Lys(PEG)及Cit(PEG)分别包含连接至赖氨酸残基或瓜氨酸残基的PEG单元。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中可裂解的肽连接至对氨基苄醇自分解基团(PABA)。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中～AA-L2～具有以下结构中的一种：
其中各Z在*处连接并且分别选自：
以及
其中氨基基团上的波浪线表示用于扩展单元的连接位点，并且药物单元连接至苄醇(亦即，苄醇的H被与药物单元的键替代)。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中L2连接至AA的亚单元的侧链。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中～AA-L2≈具有以下结构中的一种：
其中氨基基团上的波浪线表示用于扩展单元的连接位点，并且药物单元连接至末端酸基团或苄醇(亦即，酸或苄醇的H被与药物单元的键替代)，或者其中波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中氨基酸单元借由非肽连接基团连接至连接子亚单元L2。在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中非肽连接基团选自C1-C10伸烷基、C2-C10伸烯基、C2-C10亚炔基或聚乙二醇。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，也包括扩展单元以形成连接子。在一些实施例中，提供了连接子，其中扩展单元选自以下：
其中R17为-C1-C10伸烷基-、-C1-C10杂伸烷基-、-C3-C8碳环-、-O-(C1-C8伸烷基)-、-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-(其中b为1至26)、-伸芳基-、-C1-C10伸烷基-伸芳基-、-伸芳基-C1-C10伸烷基-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8碳环)-、-(C3-C8碳环)-C1-C10伸烷基-、-C3-C8杂环-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8杂环)-、-(C3-C8杂环)-C1-C10伸烷基-、-C1-C10伸烷基-C(＝O)-、C1-C10杂伸烷基-C(＝O)-、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-C(＝O)-(其中b为1至26)、-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-C(＝O)-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-C(＝O)-(其中b为1至26)、-C3-C8碳环-C(＝O)-、-O-(C1-C8烷基)-C(＝O)-、-伸芳基-C(＝O)-、-C1-C10伸烷基-伸芳基-C(＝O)-、-伸芳基-C1-C10伸烷基-C(＝O)-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8碳环)-C(＝O)-、-(C3-C8碳环)-C1-C10伸烷基-C(＝O)-、-C3-C8杂环-C(＝O)-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8杂环)-C(＝O)-、-(C3-C8杂环)-C1-C10伸烷基-C(＝O)-、-C1-C10伸烷基-NH-、-C1-C10杂伸烷基-NH-、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-NH-(其中b为1至26)、-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-NH-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-NH-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(C(＝O))-NH-(CH2-O-CH2)b-C(＝O)-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(C(＝O))-NH-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-C(＝O)-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-NH-(C(＝O))-(CH2-O-CH2)b-NH-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-NH-(C(＝O))-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-NH-(其中b为1至26)、-C3-C8碳环-NH-、-O-(C1-C8烷基)-NH-、-伸芳基-NH-、-C1-C10伸烷基-伸芳基-NH-、-伸芳基-C1-C10伸烷基-NH-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8碳环)-NH-、-(C3-C8碳环)-C1-C10伸烷基-NH-、-C3-C8杂环-NH-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8杂环)-NH-、-(C3-C8杂环)-C1-C10伸烷基-NH-、-C1-C10伸烷基-S-、C1-C10杂伸烷基-S-、-C3-C8碳环-S-、-O-(C1-C8烷基)-S-、-伸芳基-S-、-C1-C10伸烷基-伸芳基-S-、-伸芳基-C1-C10伸烷基-S-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8碳环)-S-、-(C3-C8碳环)-C1-C10伸烷基-S-、-C3-C8杂环-S-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8杂环)-S-或-(C3-C8杂环)-C1-C10伸烷基-S-；或其中扩展单元包括顺丁烯二酰亚胺基(C1-C10伸烷基-C(O)-、顺丁烯二酰亚胺基(CH2OCH2)p2(C1-C10伸烷基)C(O)-、顺丁烯二酰亚胺基(C1-C10伸烷基)(CH2OCH2)p2C(O)-或其开环形式，其中p2为1至26。
在一些实施例中，提供了连接子，其中扩展单元选自以下：
以及
其中波浪线表示扩展单元与氨基酸单元的连接位点，并且与靶向单元的连接位点在顺丁烯二酰亚胺、伯胺或炔官能基上。
在一些实施例中，提供了连接子，该连接子具有以下结构中的一种：
其中各Z在*处连接并且分别选自：
以及
其中药物单元视情况连接至末端酸基团或苄醇，或者其中波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子，进一步包含连接至连接子亚单元L2以形成药物-连接子的至少一个药物单元。在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中药物单元选自细胞毒性剂、免疫调节剂、核酸、生长抑制剂、PROTAC、毒素、放射性同位素及螯合配体。在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中药物单元为细胞毒性剂。在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中细胞毒性剂选自奥瑞他汀、美登素类化合物、喜树碱、倍癌霉素及卡奇霉素。在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中细胞毒性剂为奥瑞他汀。在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中细胞毒性剂为MMAE或MMAF。在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中细胞毒性剂为喜树碱。在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中细胞毒性剂为依喜替康或SN-38。在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中细胞毒性剂为依喜替康。在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中细胞毒性剂为卡奇霉素。在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中细胞毒性剂为美登素类化合物。在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中美登素类化合物为美登素、美登醇或安沙霉素-2。
在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中细胞毒性剂为卡奇霉素。在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中细胞毒性剂为美登素类化合物。在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中美登素类化合物为美登素、美登醇或安沙霉素-2。
在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中药物单元为免疫调节剂。在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中免疫调节剂选自TRL7促效剂、TLR8促效剂、STING促效剂或RIG-I促效剂。在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中免疫调节剂为TLR7促效剂。在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中TLR7促效剂为咪唑并喹啉、咪唑并喹啉胺、噻唑并喹啉、氨基喹啉、氨基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-氨基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺、四氢吡啶并嘧啶、杂芳并噻二嗪-2,2-二氧化物、苯并萘啶、鸟苷类似物、腺苷类似物、胸苷均聚物、ssRNA、CpG-A、PolyG10或PolyG3。在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中免疫调节剂为TLR8促效剂。在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中TLR8促效剂选自咪唑并喹啉、噻唑并喹啉、氨基喹啉、氨基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-氨基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺、四氢吡啶并嘧啶或ssRNA。在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中免疫调节剂为STING促效剂。在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中免疫调节剂为RIG-I促效剂。在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中RIG-I促效剂选自KIN1148、SB-9200、KIN700、KIN600、KIN500、KIN100、KIN101、KIN400及KIN2000。
在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中药物单元为螯合配体。在一些实施例中，提供了药物-连接子，其中螯合配体选自铂(Pt)、钌(Ru)、铑(Rh)、金(Au)、银(Ag)、铜(Cu)、钼(Mo)、钛(Ti)或铱(Ir)；放射性同位素，例如钇-88、钇-90、锝-99、铜-67、铼-188、铼-186、镓-66、镓-67、铟-111、铟-114、铟-115、镥-177、锶-89、钐-153及铅-212。
在一些实施例中，提供了药物-连接子，具有以下结构：
其中各Z在*处连接并且分别选自：
以及
其中各Z在*处连接并且分别选自：
以及
在一些实施例中，提供了偶联物，包含连接至本文所描述的任何药物-连接子的靶向单元。在一些实施例中，提供了偶联物，其中靶向单元选自抗体或其抗原结合部分。在一些实施例中，提供了偶联物，其中靶向单元为单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')、Fv、二硫键连接的Fc、scFv、单域抗体、双抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。在一些实施例中，提供了偶联物，其中靶向单元为双抗体、DART、抗运载蛋白、亲合体、阿维默、DARPin或阿德内丁蛋白。在一些实施例中，提供了偶联物，其中靶向单元为单特异性的。在一些实施例中，提供了偶联物，其中靶向单元为二价的。在一些实施例中，提供了偶联物，其中靶向单元为双特异性的。在一些实施例中，提供了偶联物，其中偶联物的平均载药量(pload)为约1至约8、约2、约4、约6、约8、约10、约12、约14、约16、约3至约5、约6至约8或约8至约16。
在一些实施例中，提供了选自以下的偶联物：
其中各Z在*处连接并且分别选自：
以及
其中各Z在*处连接并且分别选自：
以及
其中Ab为靶向单元并且n为pload。
在一些实施例中，提供了如以上所描述的偶联物，其中靶向单元结合诸如CD19、CD20、CD30、CD33、CD70、LIV-1或EGFRv3的目标分子。
在一些实施例中，提供了如以上所描述的偶联物，其中靶向单元选自：scFv1-ScFv2、ScFv12-Fc-scFv22、IgG-scFv、DVD-Ig、triomab/quadroma、二合一IgG、scFv2-Fc、TandAb及scFv-HSA-scFv。
在一些实施例中，提供了如以上所描述的偶联物，其中靶向单元为癌症相关抗原，例如CD19、CD20、CD30、CD33、CD38、CA125、MUC-1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD44表面黏附分子、间皮素(MLSN)、癌胚抗原(CEA)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFRvIII、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、MAGE-A1、IL-13R-a2、GD2、1p19q、ABL1、AKT1、ALK、APC、AR、ATM、BRAF、BRCA1、BRCA2、cKIT、cMET、CSF1R、CTNNB1、FGFR1、FGFR2、FLT3、GNA11、GNAQ、GNAS、HRAS、IDH1、IDH2、JAK2、KDR(VEGFR2)、KRAS、MGMT、MGMT-Me、MLH1、MPL、NOTCH1、NRAS、PDGFRA、Pgp、PIK3CA、PR、PTEN、RET、RRM1、SMO、SPARC、TLE3、TOP2A、TOPO1、TP53、TS、TUBB3、VHL、CDH1、ERBB4、FBXW7、HNF1A、JAK3、NPM1、PTPN11、RB1、SMAD4、SMARCB1、STK1、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、ROS1、ERCC1、5T4(TPBG)、B7-H3、CCR7、CD105、CD22、CD46、CD47、CD56、CD70、CD71、CD79b、CDH6、CLDN6、CLDN18.2、CLEC12A、DLL3、DR5、ERBB3(HER3)、EPCAM、FOLR1、IGF1R、IL2RA(CD25)、IL3RA、ITGB6、LIV-1、LRRC15、间皮素(MSLN)、NaPi2b(SLC34A2)、黏连蛋白-4、PTK7、ROR1、SEZ6、SLC44A4、SLITRK6、组织因子(TF)、TROP2或B7-H4。
在一些实施例中，提供了如以上所描述的偶联物，其中靶向单元为抗体或其片段，包括利妥昔单抗曲妥单抗帕妥珠单抗)、贝伐单抗兰尼单抗西妥昔单抗阿仑单抗帕尼单抗替伊莫单抗托西莫单抗伊匹单抗、扎芦木单抗、达雷妥尤单抗、芬妥木单抗、雷莫芦单抗、加利昔单抗、法妥组单抗、奥瑞组单抗、奥法木单抗替妥木单抗(tositumumab)、替伊莫单抗、CD20抗体2F2(HuMax-CD20)、7D8、IgM2C6、IgG1 2C6、11B8、B1、2H7、LT20、1FS或AT80、达利珠单抗或抗-LHRH受体抗体，例如克隆A9E4、F1G4、AT2G7、GNRH03或GNRHR2。
在一些实施例中，提供了如以上所描述的偶联物，其中靶向单元为抗体F131并且药物-连接子为LD038。在具体实施例中，靶向单元为抗体F131(VH SEQ ID NO：26及VL SEQID NO：27)。
在一些实施例中，提供了如以上所描述的偶联物，其中靶向单元为抗体，该抗体包含重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，该VH区包含位于重链可变区框架区中的互补决定区HCDR1、HCDR2及HCDR3，并且该VL区包含位于轻链可变区框架区中的LCDR1、LCDR及LCDR3，该VH及VL CDR具有选自以下列出的氨基酸序列组中的氨基酸序列：(a)分别为SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34及SEQ ID No:35；以及(b)分别为SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39及SEQ IDNO:40。在某些实施例中，VH及VL区具有选自以下列出的氨基酸序列对中的氨基酸序列：分别为SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27；以及其中重链及轻链框架区视情况经由框架区中的1个至8个氨基酸取代、缺失或插入而修饰。在具体实施例中，抗体为F131，并且药物-连接子为LD038。
在一些实施例中，提供了包含本文所描述的任何偶联物及医药学上可接受的载体的药物组合物。
在一些实施例中，提供了治疗有需要的受试者的方法，该方法包含向受试者给药本文所描述的任何偶联物或本文所描述的任何药物组合物，其中受试者患有癌症或自身免疫性疾病，并且偶联物结合与癌症或自身免疫性疾病相关的目标抗原。
借由参考以下详细描述，具体实施方案的非限制性实例及附图，可以更全面地理解本发明的这些和其他方面。
附图说明
图1A.抗-huFOLR-1偶联物对OV90细胞的体外细胞毒性。
图1B.抗-huFOLR-1偶联物对OVCAR-3细胞的体外细胞毒性。
图1C.抗-huFOLR-1偶联物对NCI-H292细胞的体外细胞毒性。
图2.测试人类抗-huFOLR1抗体的PA038偶联物的体内活性。在肿瘤细胞接种后第8天开始，借由静脉内注射5mg/kg的偶联物或PBS，在2周内对具有约117mm3的已建立OV90异种移植物的小鼠给药4次。绘制细胞接种后以mm3计的平均肿瘤体积与时间(以天计)的图。(N＝6，平均值±SEM)
图3.测试人类抗-huFOLR1抗体的PA038偶联物的体内活性。在细胞接种后第11天开始，借由静脉内注射5mg/kg的偶联物或PBS，在2周内对具有约123mm3的已建立NCI-H292异种移植物的小鼠给药4次。绘制细胞接种后以mm3计的平均肿瘤体积与时间(以天计)的图。(N＝6，平均值±SEM)
图4.测试人类抗-huFOLR1抗体的PA038偶联物的体内活性。在细胞接种后第13天开始，借由静脉内注射5mg/kg的偶联物或PBS，在2周内对具有约110mm3的已建立OV90异种移植物的小鼠给药4次。绘制细胞接种后以mm3计的平均肿瘤体积与时间(以天计)的图。(N＝6，平均值±SEM)
图5.在3mg/kg(N＝3；平均值±SD)下评估抗-huFOLR-1偶联物F131-LD038及裸AbF131的PK分布。
图6.抗-FOLR1抗体结合Hela细胞的比较。
图7.抗-FOLR1抗体与RPTEC/TERT1细胞的结合能力的比较。
图8.抗-FOLR1抗体与Hela细胞的剂量依赖性结合。
图9.抗-FOLR1抗体与RPTEC/TERT1细胞的剂量依赖性结合。
图10.抗-FOLR1抗体内化至Hela细胞中。
图11.抗体-FOLR1抗体内化至RPTEC/TERT1细胞中。
图12A.F131内化至肿瘤细胞系中。
图12B.F131-LD038内化至肿瘤细胞系中。
图13A.对KB的体外细胞毒性。
图13B.对OVCAR3的体外细胞毒性。
图13C.对JEG-3的体外细胞毒性。
图14A.F131及F131-LD038在CDX中对OVCAR-3的体内功效。
图14B.F131及F131-LD038在CDX中对KB的体内效力。
图14C.F131及F131-LD038在CDX中对HCC827的体内功效。
图14D.F131及F131-LD038在CDX中对H441的体内功效。
图14E.F131及F131-LD038在CDX中对OV90的体内功效。
图15A.F131-038及其他偶联物在CDX中对KB的体内效力。
图15B.F131偶联物在CDX中对KB的体内效力。
图16A.F131及偶联物的大鼠模型的PK研究。
图16B.F131及偶联物的大鼠模型的PK研究。
图16C.F131及偶联物的大鼠模型的PK研究。
图17A.小规模猕猴毒性研究中的F131-德卢替康(deruxtecan)及F131-LD038耐受性。
图17B.小规模猕猴毒性研究中的F131-德卢替康及F131-LD038耐受性。
图18.小规模猕猴毒性研究中的F131-德卢替康及F131-LD038 PK。
具体实施方式
定义
为了方便，本说明书、实施例及申请专利范围中的某些术语在本文中定义。除非另外说明或者自上下文中暗示，以下术语及短语具有以下提供的含义。提供这些定义是为了帮助描述具体实施方案，而非为了限制所要求保护的发明，因为本发明的范围仅由申请专利范围限定。除非另外定义，本文使用的所有技术术语及科学术语具有与本发明此项技术的普通技术人员通常理解的相同含义。
除非另外说明，本文使用的术语“一”是指“一个”、“至少一个”或“一个或多个”。除非上下文另外要求，本文使用的单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。
除非上下文另外要求，在整个说明书及申请专利范围中，词语“包含”、“包括”等旨在解释为与排它性或穷尽性含义相反的包含性含义，亦即“包括但不限于”的含义。
术语“减少的”、“降低”、“降低的”、“缩减”、“减少”及“抑制”在本文一般均用于意指相对于参考的统计学上显著量的减少。
术语“增加的”、“增加”或“增强”或“活化”在本文一般均用于意指相对于参考的统计学上显著量的增加。
如本文所用，术语“蛋白质”及“多肽”在本文可互换使用来表示一系列氨基酸残基，各氨基酸残基借由相邻残基的α-氨基及羧基基团之间的肽键彼此连接。术语“蛋白质”及“多肽”也指氨基酸的聚合物，包括修饰的氨基酸(例如，磷酸化的、糖化的、糖基化的等)及氨基酸类似物，而不管其大小或功能。“蛋白质”及“多肽”常用于指相对大的多肽，而术语“肽”常用于指小的多肽，但这些术语在本领域中的使用有重叠。术语“蛋白质”及“多肽”在本文当涉及编码的基因产物及其片段时可互换使用。因此，示例性多肽或蛋白质包括基因产物、天然存在的蛋白质、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段及前述的其他等同物、变体、片段及类似物。
如本文所用，“表位”是指通常由免疫球蛋白VH/VL对结合的氨基酸，例如本文所描述的抗体、其抗原结合部分及其他结合剂。其他结合剂包括非抗体支架。表位可在多肽上由连续氨基酸或借由蛋白质的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而借由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包含至少3个，更通常至少5个，约9个或约8至10个独特空间构象的氨基酸。表位限定抗体、其抗原结合部分及其他结合剂的最小结合位点，因此代表抗体、其抗原结合部分或其他基于免疫球蛋白的结合剂的特异性目标。在单域抗体的情况下，表位代表由分离的可变域结合的结构单元。
如本文所用，“特异性结合”是指本文所描述的结合剂(例如抗体或其抗原结合部分)结合目标的能力，其中KD为10-5M(10000nM)或更少，例如，10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10- 10M、10-11M、10-12M或更少。如本文所描述的“特异性结合”也指本文所描述的分子(例如抗体或其抗原结合部分或非抗体支架)结合目标的能力，其中KD为10-5M(10000nM)或更少，例如，10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M或更少。特异性结合可能受到例如抗体、抗原结合部分或其他结合剂的亲和力(affinity)及亲合力(avidity)以及目标多肽的浓度的影响。本领域普通技术人员可确定合适的条件，在该条件下，本文所描述的抗体、抗原结合部分及其他结合剂使用任何合适的方法选择性地结合目标分子，例如在合适的细胞结合测定中滴定抗体或结合剂。与目标分子特异性结合的结合剂不被不相似的竞争剂取代。在某些实施例中，当抗体或其抗原结合部分或其他结合剂优先识别其在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的目标分子时则被称为特异性结合目标分子。特异性结合可能受到例如抗体、抗原结合部分或非抗体支架的亲和力及亲合力以及目标多肽的浓度的影响。本领域普通技术人员可确定合适的条件，在该条件下，本文所描述的抗体、抗原结合部分及非抗体支架使用任何合适的方法选择性地结合目标分子，例如在合适的细胞结合测定中滴定抗体或或非抗体。与目标分子特异性结合的分子不被不相似的竞争剂取代。在某些实施例中，当抗体或其抗原结合部分或非抗体支架优先识别其在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的目标分子时则被称为特异性结合目标分子。
除非另外说明，术语“烷基”本身或作为其他术语的一部分是指具有指定数量的碳原子的取代或未取代的直链或支链饱和烃(例如，“-C1-C5烷基”、“-C1-C8烷基”或“-C1-C10烷基”分别是指具有1至5个、1至8个或1至10个碳原子的烷基基团)。实例包括甲基(Me、-CH3)、乙基(Et、-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr、n-丙基、-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr、i-丙基、-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu、n-丁基、-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu、i-丁基、-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu、s-丁基、-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu、t-丁基、-C(CH3)3)、1-戊基(n-戊基、-CH2CH2CH2CH2 CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(--CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2 CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)及3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3。
除非另外说明，“烯基”本身或作为其他术语的一部分是指具有至少一个不饱和位点(亦即，碳-碳sp2双键)的C2-C8取代或未取代的直链或支链烃。实例包括但不限于：乙烯或乙烯基(-CH＝CH2)、烯丙基(-CH2CH＝CH2)、环戊烯基(-C5H7)及5-己烯基(-CH2CH2CH2CH2CH＝CH2)。
除非另外说明，“炔基”本身或作为其他术语的一部分是指具有至少一个不饱和位点(亦即，碳-碳sp三键)的C2-C8取代或未取代的直链或支链烃。实例包括但不限于：乙炔及炔丙基。
除非另外说明，“伸烷基”是指具有1至8个碳原子并且具有借由自母体烷烃的相同或两个不同碳原子上移除两个氢原子而衍生的两个单价基团中心的饱和支链或直链烃基。典型的伸烷基基团包括但不限于：亚甲基(-CH2-)、1,2-乙基(-CH2CH2-)、1,3-丙基(-CH2CH2CH2-)、1,4-丁基(-CH2CH2CH2CH2-)等。
除非另外说明，“伸烯基”是指具有2至8个碳原子并且具有借由自母体烯烃的相同或两个不同碳原子上移除两个氢原子而衍生的两个单价基团中心的不饱和支链或直链烃基。典型的伸烯基基团包括但不限于：1,2-乙烯(-CH＝CH-)。
除非另外说明，“亚炔基”是指具有2至8个碳原子并且具有借由自母体炔烃的相同或两个不同碳原子上移除两个氢原子而衍生的两个单价基团中心的不饱和支链或直链或环状烃基。典型的亚炔基基团包括但不限于：乙炔、炔丙基及4-戊炔基。
除非另外说明，术语“杂烷基”本身或与其他术语组合为取代或未取代的稳定的直链或支链烃，或其组合，其是指饱和的并且有1至10个、较佳1至3个选自O、N、Si及S的杂原子，并且其中氮及硫原子可视情况被氧化并且氮杂原子可视情况被四级铵化。杂原子O、N及S可位于杂烷基基团的任何内部位置(亦即作为主链的一部分)处或烷基基团与分子的其余部分连接的位置处。杂原子Si可位于杂烷基基团的任何位置处，包括烷基基团连接至分子的其余部分的位置处。杂烷基的实例包括以下：-CH2CH2OCH3、-CH2CH2NHCH3、-CH2 CH2N(CH3)CH3、-CH2SCH2CH3、CH2CH2S(O)CH3、-CH2CH2S(O)2CH3及-Si(CH3)3-。至多两个杂原子可为连续的，例如-CH2NHOCH3及CH2OSi(CH3)3。在一些实施例中，C1至C4杂烷基具有1至4个碳原子及1或2个杂原子，并且C1至C3杂烷基具有1至3个碳原子及1或2个杂原子。
除非另外说明，术语“杂烯基”及“杂炔基”本身或与其他术语组合是指具有1至10个、较佳1至3个选自O、N、Si及S的杂原子的取代或未取代的稳定的直链或支链烯基或炔基，并且其中氮及硫原子可视情况被氧化并且氮杂原子可视情况被四级铵化。杂原子O、N及S可位于杂烯基或杂炔基基团的任何内部位置(亦即作为主链的一部分)处或烷基基团与分子的其余部分连接的位置处。杂原子Si可位于杂烯基或杂炔基基团的任何位置处，包括烷基基团连接至分子的其余部分的位置处。
除非另外说明，“杂伸烷基”本身或作为其他取代基的一部分是指衍生自杂烷基(如上所描述)的取代或未取代的二价基团，例如-CH2CH2SCH2CH2-及-CH2SCH2CH2NHCH2-。在一些实施例中，C1至C4杂伸烷基具有1至4个碳原子及1或2个杂原子，并且C1至C3杂伸烷基具有1至3个碳原子及1或2个杂原子。对于杂伸烷基基团，杂原子也可占据链末端中的一者或两者。此外，对于伸烷基及杂伸烷基连接基团，未指明连接基团的取向。
除非另外说明，术语“亚杂烯基”及“亚杂炔基”本身或作为其他取代基的一部分是指衍生自杂烯基或杂炔基(如上所描述)的取代或未取代的二价基团。在一些实施例中，C2至C4亚杂烯基或亚杂炔基具有1至4个碳原子。对于亚杂烯基及亚杂炔基基团，杂原子也可占据链末端中的一者或两者。此外，对于亚杂烯基及亚杂炔基基团，未指明连接基团的取向。
除非另外说明，“C3-C8碳环”本身或作为其他术语的一部分是指借由自母体环是的环原子中移除一个氢原子而衍生的取代或未取代的3、4、5、6、7或8元单价、取代或未取代的、饱和或不饱和的非芳族单环或双环的碳环。代表性-C3-C8碳环包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环戊二烯基、环己基、环己烯基、1,3-环己二烯基、1,4-环己二烯基、环庚基、1,3-环庚二烯基、1,3,5-环庚三烯基、环辛基及环辛二烯基。
除非另外说明，“C3-C8碳环基”本身或作为其他术语的一部分是指上文定义的取代或未取代的C3-C8碳环基团，其中另一个碳环基团的氢原子被键替代(亦即，其为二价的)。
除非另外说明，“C3-C10碳环”本身或作为其他术语的一部分是指借由自母体环系的环原子中移除一个氢原子而衍生的取代或未取代的3、4、5、6、7、8、9或10元单价、取代或未取代的、饱和或不饱和的非芳族单环、双环或三环的碳环。代表性-C3-C10碳环包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环戊二烯基、环己基、环己烯基、1,3-环己二烯基、1,4-环己二烯基、环庚基、1,3-环庚二烯基、1,3,5-环庚三烯基、环辛基及环辛二烯基。-C3-C10碳环可也包括稠合的环辛炔碳环，例如在国际公开号WO2011/136645(其公开内容借由引用并入本文)中公开的稠合的环辛炔化合物，包括BCN(双环[6.1.0]壬炔)及DBCO(二苯并环辛炔)。
除非另外说明，“C3-C8杂环”本身或作为其他术语的一部分是指具有3至8个碳原子(也称为环成员)及1至4个独立地选自N、O、P或S的杂原子环成员并且借由自母体环系的环原子中移除一个氢原子而衍生的取代或未取代的单价取代或未取代的芳族或非芳族单环或双环的环系。杂环中的一者或多个N、C或S原子可被氧化。包含杂原子的环可为芳族或非芳族的。除非另外说明，杂环在产生稳定结构的任何杂原子或碳原子处连接至其侧基。C3-C8杂环的代表性实例包括但不限于吡咯啶基、氮杂环丁烷基、哌嗪啶基、啉基、四氢呋喃基、四氢哌嗪喃基、苯并呋喃基、苯并噻吩、吲哚基、苯并吡唑基、吡咯基、噻吩基(噻吩)、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、嘧啶基、吡啶基、吡基、哒基、异噻唑基及异噁唑基。除非另外说明，术语“杂碳环”与如本文所描述的“杂环”或“杂环基”同义。
除非另外说明，“C3-C8杂环基”本身或作为其他术语的一部分是指上文定义的取代或未取代的C3-C8杂环基团，其中一个杂环基团的氢原子被键替代(亦即，其为二价的)。
除非另外说明，“芳基”本身或作为其他术语的一部分是指借由自母体芳香环系的单个碳原子中移除一个氢原子而衍生的具有6至20个碳(较佳6至14个碳)原子的取代或未取代的单价碳环芳族烃基。一些芳基基团在示例性结构中表示为“AR”。典型的芳基包括但不限于衍生自苯、经取代的苯、萘、蒽、联苯等的基团。示例性芳基基团为苯基基团。
除非另外说明，“伸芳基”本身或作为其他术语的一部分为如上定义的未取代或经取代的芳基基团，其中一个芳基基团的氢原子被键替代(亦即，其为二价的)，并且可处于邻位、间位或对位取向。
除非另外说明，“杂芳基”及“杂环”是指其中一个或多个环原子为杂原子，例如氮、氧及硫的环系。杂环基团包含1至20个碳原子及1至3个选自N、O、P及S的杂原子。杂环可为具有3至7个环成员(2至6个碳原子及1至3个选自N、O、P及S的杂原子)的单环或具有7至10个环成员(4至9个碳原子及1至3个选自N、O、P及S的杂原子)的双环，例如：双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]体系。
除非另外说明，“亚杂芳基”本身或作为其他术语的一部分为如上定义的未取代或经取代的杂芳基基团，其中一个杂芳基基团的氢原子被键替代(亦即，其为二价的)。
除非另外说明，“羧基”是指COOH或COO-M+，其中M+为阳离子。
除非另外说明，“侧氧基”是指(C＝O)。
除非另外说明，“取代的烷基”及“取代的芳基”分别是指其中一个或多个氢原子各自独立地被取代基替代的烷基及芳基。典型的取代基包括但不限于-X、-R10、-O-、-OR10、-SR10、-S-、-NR10 2、-NR10 3、＝NR10、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-NR10C(＝O)R10、-C(＝O)R10、-C(＝O)NR10 2、-SO3-、-SO3H、-S(＝O)2R10、-OS(＝O)2OR10、-S(＝O)2NR10、-S(＝O)R10、-OP(＝O)(OR1 0)2、-P(＝O)(OR10)2、-PO- 3、-PO3H2、-AsO2H2、-C(＝O)R10、-C(＝O)X、-C(＝S)R10、-CO2R10、-CO2-、-C(＝S)OR10、C(＝O)SR10、C(＝S)SR10、C(＝O)NR10 2、C(＝S)NR10 2或C(＝NR10)NR10 2，其中各X独立地为卤素：-F、-Cl、-Br或-I；并且各R10独立地-H、-C1-C20烷基、-C6-C20芳基、-C3-C14杂环、保护基团或前药部分。典型的取代基也包括(＝O)。如以上描述的伸烷基、碳环、碳环基、伸芳基、杂烷基、杂伸烷基、杂环及杂环基基团也可被类似地取代。
除非另外说明，“多羟基基团”是指碳链的碳原子上的氢被两个以上或三个以上的羟基基团取代的烷基、伸烷基、碳环或碳环基基团。在一些实施例中，多羟基基团包含至少三个羟基基团。在一些实施例中，多羟基基团包含各碳原子仅含有一个羟基基团的碳原子。多羟基基团可含有一个或多个未被羟基取代的碳原子。多羟基基团的各碳原子可均被羟基基团取代。多羟基基团的实例包括线性(非环状)或环状形式的单糖，例如C6或C5糖，例如葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脱氧葡萄糖、甘油醛、赤藓糖、苏糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、醛糖及酮糖；糖酸，例如葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸或酮糖酸；以及氨基糖，例如葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、半乳糖胺及N-乙酰半乳糖胺。在一些实施例中，多羟基基团包括线性或环状形式的二糖及多糖。
除非上下文另外说明，“视情况经取代的”是指烷基、烯基、炔基、烷基芳基、芳基烷基杂环、芳基、杂芳基、烷基杂芳基、杂芳基烷基或如本文所定义或公开的其他取代基、部分或基团，其中该取代基、部分或基团的氢原子视情况被不同的部分或基团替代，或者其中包含这些取代基、部分或基团的一的脂环族碳链借由用不同的部分或基团替代该链的碳原子而中断。在一些方面，烯烃官能基替代烷基取代基的两个连续的sp3碳原子，其限制条件为烷基部分的碳基不被替代，使得视情况经取代的烷基为不饱和的烷基取代基。
在前述取代基、部分或基团的任一个中替代氢的视情况选用的取代基独立地选自芳基、杂芳基、羟基、烷氧基、芳氧基、氰基、卤素、硝基、氟代烷氧基及氨基(包括单取代、二取代及三取代的氨基基团)及其受保护的衍生物，或选自-X、-OR'、-SR'、-NH2、-N(R')(R”)、-N(R”)3、＝NR、-CX3、-CN、-NO2、-NR'C(＝O)H、-NR'C(＝O)R、-NR'C(＝O)R”、-C(＝O)R'、-C(＝O)NH2、-C(＝O)N(R')R”、-S(＝O)2R”、-S(＝O)2NH2、-S(＝O)2N(R')R”、-S(＝O)2NH2、-S(＝O)2N(R')R”、-S(＝O)2OR'、-S(＝O)R”、-OP(＝O)(OR')(OR”)、-OP(OH)3、-P(＝O)(OR')(OR”)、-PO3H2、-C(＝O)R'、-C(＝S)R”、-CO2R'、-C(＝S)OR”、-C(＝O)SR'、-C(＝S)SR'、-C(＝S)NH2、-C(＝S)N(R')(R”)2、-C(＝NR')NH2、-C(＝NR')N(R')R”及其盐，其中各X独立地选自卤素：-F、-CI、-Br及-I；并且其中各R”独立地选自C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、C6-C24芳基、C3-C24杂环基(包括C5-C24杂芳基)、保护基团及前药部分，或者R”中的两个与其所连接的杂原子一起限定杂环基；并且R'为氢或R”，其中R”选自C1-C20烷基、C6-C24芳基、C3-C24杂环基(包括C5-C24杂芳基)及保护基团。
典型地，视情况选用的取代基选自-X、-OH、-OR”、-SH、-SR”、-NH2、-NH(R”)、-NR'(R”)2、-N(R”)3、＝NH、＝NR”、-CX3、-CN、-NO2、-NR'C(＝O)H、NR'C(＝O)R”、-CO2H、-C(＝O)H、-C(＝O)R”、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NR'R”--S(＝O)2R”、-S(＝O)2NH2、-S(＝O)2N(R')R”、-S(＝O)2NH2、-S(＝O)2N(R')(R”)、-S(＝O)2OR'、-S(＝O)R”、-C(＝S)R”、-C(＝S)NH2、-C(＝S)N(R')R”、-C(＝NR')N(R”)2及其盐，其中各X独立地选自-F及-Cl，R”典型地选自C1-C6烷基、C6-C10芳基、C3-C10杂环基(包括C5-C10杂芳基)及保护基团；并且R'独立地为氢、C1-C6烷基、C6-C10芳基、C3-C10杂环基(包括C5-C10杂芳基)及保护基团(独立地选自R”)。更典型地，取代基选自-X、-R”、-OH、-OR”、-NH2、-NH(R”)、-N(R”)2、-N(R”)3、-CX3、-NO2、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)R”、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NHR”、-C(＝O)N(R”)2、-CO2H、-CO2R”、-C(＝O)H、-C(＝O)R”、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NH(R”)、-C(＝O)N(R”)2、-C(＝NR')NH2、-C(＝NR')NH(R”)、-C(＝NR')N(R”)2、保护基团及其盐，其中各X为-F，R”独立地选自C1-C6烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基及保护基团；并且R'选自氢、C1-C6烷基及保护基团(独立地选自R”)。
如本文所用，短语“医药学上可接受的盐”是指化合物(例如，连接子、药物连接子或偶联物)的医药学上可接受的有机或无机盐。化合物通常含有至少一个氨基基团，因此可与该氨基基团形成酸加成盐。示例性盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异菸酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、亚麻油酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐及双羟萘酸盐(亦即，1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸)盐)。医药学上可接受的盐可包括其他分子，例如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其他抗衡离子。抗衡离子可为稳定母体化合物上的电荷的任何有机或无机部分。此外，医药学上可接受的盐可在其结构中具有多于一个的带电原子。其中多个带电原子为医药学上可接受的盐的一部分的情况可具有多个抗衡离子。因此，医药学上可接受的盐可具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。
如本文所用，术语“基本上由……组成”是指给定实施例所需的那些要素。该术语允许存在不会实质上影响该实施例的基本及新颖或功能特性的要素的存在。
如本文所用，术语“由……组成”是指如本文所描述的组合物、方法及其各自的组成部分，其排除在实施方案的该描述中未列出的任何要素。
除了在实施例中或在另外指出的情况下，本文使用的表示成分或反应条件的量的所有数位应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。术语“约”当与百分比一起使用时可指+/-1％。
术语“统计学上显著的”或“显著地”是指统计学显著性，并且通常是指高于或低于参考值的两个标准偏差(2SD)的差异。
在本发明的各个方面的描述中定义了其他术语。
详细描述
本文提供了连接子，该连接子包括极性单元，例如糖单元、PEG单元和/或羧基单元。本文还提供了靶向单元-连接子、药物连接子及其偶联物，其包含药物单元，例如细胞毒性剂或免疫调节剂，如本文进一步描述。
在一些实施例中，连接子具有通式(I)，包括直接连接或经由视情况选用的氨基酸单元(AA)连接至连接子亚单元(L2)的扩展单元(L1)，如以下式(I)中所示：
～L1-AAs-L2≈
(I)
或其盐，其中s为0或1，并且波浪(≈)线表示用于靶向单元(L)或药物单元(D)的连接位点。连接子在氨基酸单元、连接子亚单元L2或两者中包含至少一个极性单元。各极性单元可为糖单元、PEG单元或羧基单元。连接子可包含至少一个糖单元、至少一个PEG单元、至少一个羧基单元或其组合。连接子亚单元L2可具有1至4个用于药物单元的连接位点。在一些实施例中，连接子亚单元L2具有一个用于药物单元的连接位点。在一些实施例中，连接子亚单元L2具有两个用于药物单元的连接位点。
本文还提供了连接子的偶联物，包含连接至至少一个连接子的靶向单元(L)，各连接子连接至至少一个药物单元(D)，如以下式(II)中所示：
L-[[L1-AAs-L2]-Dt]pload
(II)
其中L1、AA及L2构成连接子并且如以上关于式(I)所示，s为0或1，t为1至4，并且pload为1至20。连接子在氨基酸单元、连接子亚单元L2或两者中包含至少一个极性单元。各极性单元可为糖单元、PEG单元或羧基单元。连接子可包含至少一个糖单元、至少一个PEG单元、至少一个羧基单元或其组合。连接子亚单元L2可具有1至4个用于药物单元的连接位点。在一些实施例中，连接子亚单元L2具有一个用于药物单元的连接位点。在一些实施例中，连接子亚单元L2具有两个用于药物单元的连接位点。
本文还提供了药物-连接子，如以下式(III)中所示。
～[L1-AAs-L2]-Dt
(III)
或其盐，其中L1、AA、L2及D构成连接子并且如以上关于式(II)所示，s为0或1，t为1至4，并且波浪线表示用于靶向单元的连接位点。连接子在氨基酸单元、连接子亚单元L2或两者中包含至少一个极性单元。各极性单元可为糖单元、PEG单元或羧基单元。连接子可包含至少一个糖单元、至少一个PEG单元、至少一个羧基单元或其组合。连接子亚单元L2可具有1至4个用于药物单元的连接位点。在一些实施例中，连接子亚单元L2具有一个用于药物单元的连接位点。在一些实施例中，连接子亚单元L2具有两个用于药物单元的连接位点。
本文还提供了靶向单元-连接子的中间体，如以下式(IV)中所示：
L-[[L1-AAs-L2≈]]d
(IV)
或其盐，其中L1、AA及L2构成连接子，L、L1、AA及L2如以上关于式(I)所描述，s为0或1，d为1至20，并且双波浪线(≈)表示用于药物单元的连接位点。连接子在氨基酸单元、连接子亚单元L2或两者中包含至少一个极性单元。各极性单元可为糖单元、PEG单元或羧基单元。连接子可包含至少一个糖单元、至少一个PEG单元、至少一个羧基单元或其组合。连接子亚单元L2可具有1至4个用于药物单元的连接位点。在一些实施例中，连接子亚单元L2具有一个用于药物单元的连接位点。在一些实施例中，连接子亚单元L2具有两个用于药物单元的连接位点。
极性单元
本文提供的极性单元(PU)包括糖单元、PEG单元及羧基单元，如本文进一步描述。
糖单元(SU)
在一些实施例中，糖单元(SU)具有通式(X)：
L3-**N(CH2-(CH(XR))k-X1(X2))2
(X)
或其盐，其中各X独立地选自NH或O，各R独立地选自氢、乙酰基、单糖、二糖及多糖，各X1独立地选自CH2及C(O)，各X2独立地选自H、OH及OR，并且k为1至10。在一些实施例中，各(CH2-(CH(XR))k-X1(X2))为单糖。在一些实施例中，单糖为C6或C5糖，例如葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脱氧葡萄糖、甘油醛、赤藓糖、苏糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、醛糖、酮糖；糖酸，例如葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸或酮糖酸；或氨基糖，例如葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、半乳糖胺及N-乙酰半乳糖胺。合适的二糖包括蔗糖、乳糖及麦芽糖。合适的多糖包括麦芽三糖、棉子糖、蔗果三糖、淀粉、纤维素及糖原。在端基异构C-1位置处的立体化学可为α或β。
L3具有以下通式(XI)：
其中L3a选自C1-C10伸烷基及聚乙二醇(具有1至26个乙二醇单元)，并且p及o独立地为0至2，其中L3a共价结合至式(X)中用**标记的N原子。各*及各#表示用于氨基酸单元(AA)的其他亚单元或连接子亚单元L2、扩展单元(L1)或如本文所描述的连接子的其他组分的连接位点。
在一些实施例中，糖单元具有以下式(XII)：
其中R、p及o如上所描述，n为0至4，并且各m独立地为1至4。
在一些实施例中，糖单元具有以下式(XIII)：
其中n式0至4，并且各m独立地为1至4。
PEG单元
在一些实施例中，连接子包含PEG单元。PEG单元可连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分。氨基酸单元的亚单元可为，例如，α、β或γ氨基酸，或其衍生物。在一些实施例中，PEG单元可连接至扩展单元。
在一些实施例中，PEG单元具有以下通式-(CH2CH2O)n20-R24，其中R24为H或C1-C6烷基，并且n20为1至26。在一些实施例中，n20为12并且R24为甲基。
在一些实施例中，PEG单元具有以下通式(XX)：
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-NR24R25
(XX)
或其盐，其中R20为用于连接至氨基酸单元的亚单元和/或连接子亚单元L2的一部分的官能基；R21及R22各自独立地为视情况选用的C1-C3伸烷基；R24及R25如以下所描述；波浪线(～)表示连接位点；并且n20为1至26。在一些实施例中，R20选自羧基、氨基、炔基、叠氮基、羟基、羰基、氨基甲酸酯、脲、硫代氨基甲酸酯、硫脲、磺酰胺、酰基磺酰胺、烷基磺酸酯或其受保护的形式。合适的保护基团包括本领域通常使用的羧酸保护基团、胺保护基团及磺酰基保护基团。
在一些实施例中，PEG单元具有以下通式(XX)：
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-NR24R25
(XX)
或其盐，其中R20为用于连接至氨基酸单元的亚单元和/或连接子亚单元L2的一部分的官能基；R21及R22各自独立地为视情况选用的C1-C3伸烷基；R24及R25如以下所描述；波浪线(～)表示连接位点；并且n20为1至26。在一些实施例中，R20选自卤基、醛、羧基、氨基、炔基、叠氮基、羟基、羰基、氨基甲酸酯、硫醇、脲、硫代氨基甲酸酯、硫脲、磺酰胺、酰基磺酰胺、烷基磺酸酯、三唑、氮杂二苯并环辛炔、肼、羰基烷基杂芳基或其受保护的形式。合适的保护基团包括本领域通常使用的羧酸保护基团、胺保护基团及磺酰基保护基团。
在一些实施例中，PEG单元具有以下通式(XXI)：
～R20-[-R26-[R29-[O-CH2-CH2-]n20R29]n21-R27-]n27-NR24R25
(XXI)
或其盐，其中R20为用于连接至氨基酸单元的亚单元和/或连接子亚单元L2的一部分的官能基；R26及R27各自为视情况选用的C1-C12伸烷基、-NH-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-NH-、-C(O)-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-C(O)-、-NH-C1-C12伸烷基-C(O)-或-C(O)-C1-C12伸烷基-NH-；R24及R25如以下所描述；各R29为视情况且独立地选自-C(O)-、-NH-、-C(O)-C1-C6伸烯基-、-NH-C1-C6伸烯基-、-C1-C6伸烯基-NH-及-C1-C6伸烯基-C(O)-；波浪线(～)表示连接位点；n20为1至26；n21为1至4；并且n27为1至3。在一些实施例中，R20选自羧基、氨基、炔基、叠氮基、羟基、羰基、氨基甲酸酯、脲、硫代氨基甲酸酯、硫脲、磺酰胺、酰基磺酰胺、烷基磺酸酯或其受保护的形式。合适的保护基团包括本领域通常使用的羧酸保护基团、胺保护基团及磺酰基保护基团。
在一些实施例中，PEG单元具有以下通式(XXI)：
～R20-[-R26-[R29-[O-CH2-CH2-]n20R29]n21-R27-]n27-NR24R25
(XXI)
或其盐，其中R20为用于连接至氨基酸单元的亚单元和/或连接子亚单元L2的一部分的官能基；R26及R27各自为视情况选用的C1-C12伸烷基、-NH-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-NH-、-C(O)-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-C(O)-、-NH-C1-C12伸烷基-C(O)-或-C(O)-C1-C12伸烷基-NH-；R24及R25如以下所描述；各R29为视情况且独立地选自-C(O)-、-NH-、-C(O)-C1-C6伸烯基-、-NH-C1-C6伸烯基-、-C1-C6伸烯基-NH-、-C1-C6伸烯基-C(O)-、-NH(CO)NH-及三唑；波浪线(～)表示连接位点；n20为1至26；n21为1至4；并且n27为1至3。在一些实施例中，R20选自羧基、氨基、炔基、叠氮基、羟基、羰基、氨基甲酸酯、脲、硫代氨基甲酸酯、硫脲、磺酰胺、酰基磺酰胺、烷基磺酸酯或其受保护的形式。合适的保护基团包括本领域通常使用的羧酸保护基团、胺保护基团及磺酰基保护基团。
在PEG单元具有式(XX)及式(XXI)的一些实施例中，R24及R25各自独立地选自H及多羟基基团；经取代的多羟基基团；-C(O)-多羟基基团；经取代的-C(O)-多羟基基团；视情况经取代的C3-C10碳环；视情况经取代的C1-C3伸烷基C3-C10碳环；视情况经取代的杂芳基；视情况经取代的碳环；经取代的-C1-C8烷基；经取代的-C(O)-C1-C8烷基；螯合物；-C(O)-R28，其中R28为式(XII)或式(XIII)的糖单元；或与-NR24R25一起形成C3-C8杂环。
在PEG单元具有式(XX)及式(XXI)的一些实施例中，R24及R25中的一者选自H及多羟基基团；经取代的多羟基基团；-C(O)-多羟基基团；经取代的-C(O)-多羟基基团；视情况经取代的C3-C10碳环；视情况经取代的C1-C3伸烷基C3-C10碳环；视情况经取代的杂芳基；视情况经取代的碳环；经取代的-C1-C8烷基；经取代的-C(O)-C1-C8烷基；螯合物；-C(O)-R28，其中R28为式(XII)或式(XIII)的糖单元；并且R24及R25中的另一者为聚乙二醇，视情况具有1个至24个乙二醇亚单元。
在PEG单元具有式(XX)或式(XXI)的一些实施例中，R24及R25均不为H。在PEG单元具有式(XX)及式(XXI)的一些实施例中，R24及R25中的一者为H。
在PEG单元具有式(XX)及式(XXI)的一些实施例中，R24及R25各自独立地选自H及多羟基基团，其限制条件为R24及R25不都为H。多羟基基团可为直链或支链的。在一些实施例中，多羟基基团包含至少三个羟基基团。在一些实施例中，多羟基基团为线性单糖。如本文所用，线性单糖是指单糖的开环形式。在一些实施例中，线性单糖为C6或C5糖的线性形式，C6或C5糖例如葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脱氧葡萄糖、甘油醛、赤藓糖、苏糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、醛糖及酮糖。在一些实施例中，线性单糖可也包括糖酸，例如葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸或酮糖酸。在一些实施例中，线性单糖可也包括氨基糖，例如葡糖胺、N-乙酰基葡糖胺、半乳糖胺及N-乙酰基半乳糖胺。
具有线性单糖的PEG单元的实例包括以下：
其中R39选自H、线性单糖及聚乙二醇。在这些示例性实施例中，当PEG单元连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分时，根据需要将其去保护，并且在PEG单元的左端的羧基或羟基基团与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分上的反应性基团之间形成键。
在PEG单元具有式(XX)及式(XXI)的一些实施例中，R24及R25各自独立地选自H及多羟基基团，其限制条件为R24及R25不都为H。在PEG单元具有式(XX)及式(XXI)的一些实施例中，R24及R25中的一者选自多羟基基团，并且另一者为聚乙二醇。在一些实施例中，各多羟基基团包含至少三个羟基基团。多羟基基团可为直链或支链或环状的。在一些实施例中，R24及R25中的一者为线性单糖，并且另一者为环状单糖。在一些实施例中，R24及R25中的一者为环状单糖，并且另一者为线性或环状单糖。在一些实施例中，线性单糖为C6或C5糖的线性(非环状)形式，C6或C5糖例如葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脱氧葡萄糖、甘油醛、赤藓糖、苏糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、醛糖及酮糖。在一些实施例中，线性单糖可也包括糖酸，例如葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸或酮糖酸。在一些实施例中，线性单糖可也包括氨基糖，例如葡糖胺、N-乙酰基葡糖胺、半乳糖胺及N-乙酰基半乳糖胺。在一些实施例中，环状单糖为C6或C5糖的环状形式，C6或C5糖例如葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脱氧葡萄糖、甘油醛、赤藓糖、苏糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、醛糖及酮糖。在一些实施例中，环状单糖可也包括糖酸，例如葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸或酮糖酸。在一些实施例中，环状单糖可也包括氨基糖，例如葡糖胺、N-乙酰基葡糖胺、半乳糖胺及N-乙酰基半乳糖胺。在端基异构C-1位置处的立体化学可为α或β。
PEG单元的实例包括以下：
其中R41为线性单糖、环状单糖或聚乙二醇。在这些示例性实施例中，当PEG单元连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分时，根据需要将其去保护，并且在PEG单元的左端的羧基或羟基基团与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分上的反应性基团之间形成键。
在PEG单元具有式(XX)及式(XXI)的一些实施例中，R24及R25各自独立地选自H及多羟基基团，其限制条件为R24及R25不都为H。在一些实施例中，R24及R25分别为环状单糖、二糖或多糖。在PEG单元具有式(XX)及式(XXI)的一些实施例中，R24及R25中的一者选自环状单糖、二糖或多糖，并且R24及R25中的另一者为聚乙二醇。在一些实施例中，环状单糖为C6或C5糖的环状形式，C6或C5糖例如葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脱氧葡萄糖、甘油醛、赤藓糖、苏糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、醛糖及酮糖。在一些实施例中，环状单糖可也包括糖酸，例如葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸或酮糖酸。在一些实施例中，环状单糖可也包括氨基糖，例如葡糖胺、N-乙酰基葡糖胺、半乳糖胺及N-乙酰基半乳糖胺。在端基异构C-1位置处的立体化学可为α或β。
在一些实施例中，二糖包括含有任何上述单糖的二糖。术语二糖可包括二糖的线性形式、环状形式及线性-环状形式。示例性二糖包括但不限于蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖及纤维二糖。在一些实施例中，多糖包括含有任何上述单糖的多糖。术语多糖可包括多糖的线性形式、环状形式及线性-环状形式。示例性多糖包括但不限于麦芽三糖、棉子糖、蔗果三糖、淀粉、纤维素及糖原。
在示例性实施例中，具有环状单糖、二糖或多糖的PEG单元包括以下：
在上述各实例中，各R45选自H、或者单糖、二糖或多糖，包括其中任一种的氨基糖；并且R46选自H、或者单糖、二糖或多糖，包括其中任一种的氨基糖，以及聚乙二醇。在这些示例性实施例中，当PEG单元连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分时，根据需要将其去保护，并且在PEG单元的右端(前四个实例)或左端(最后一个实例)的羧基基团与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分上的反应性基团之间形成键。
在PEG单元具有式(XX)及式(XXI)的一些实施例中，R24及R25各自独立地选自多羟基基团，该多羟基基团为线性单糖或经取代的线性单糖。在PEG单元具有式(XX)及式(XXI)的一些实施例中，R24及R25中的一者选自多羟基基团，该多羟基基团为线性单糖或经取代的线性单糖，并且R24及R25中的另一者为聚乙二醇。在一些实施例中，线性单糖为C6或C5糖的线性形式，C6或C5糖例如葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脱氧葡萄糖、甘油醛、赤藓糖、苏糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、醛糖及酮糖。在一些实施例中，线性单糖可也包括糖酸，例如葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸或酮糖酸。在一些实施例中，线性单糖可也包括氨基糖，例如葡糖胺、N-乙酰基葡糖胺、半乳糖胺及N-乙酰基半乳糖胺。
在一些实施例中，经取代的线性单糖可被单糖、二糖或多糖取代，在各情况下均为线性或环状的。在一些实施例中，二糖包括含有任何上述单糖的二糖。术语二糖可包括二糖的线性形式、环状形式及线性-环状形式。示例性二糖包括但不限于蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖及纤维二糖。在一些实施例中，多糖包括含有任何上述单糖的多糖。术语多糖可包括多糖的线性形式、环状形式及线性-环状形式。示例性多糖包括但不限于麦芽三糖、棉子糖、蔗果三糖、淀粉、纤维素及糖原。
视情况被糖取代的含有线性单糖的PEG单元的实例包括以下：
其中R47选自H、线性单糖及聚乙二醇；并且各R49选自单糖、二糖及多糖。在这些示例性实施例中，当PEG单元连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分时，根据需要将其去保护，并且在PEG单元的左端的羧基或羟基基团与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分上的反应性基团之间形成键。
在PEG单元具有式(XX)及式(XXI)的一些实施例中，R24及R25各自独立地选自多羟基基团，该多羟基基团为线性单糖或经取代的线性单糖，其中经取代的线性单糖被一个或多个诸如烷基、O-烷基、芳基、O-芳基、羧基、酯或酰胺的取代基取代。在PEG单元具有式(XX)及式(XXI)的一些实施例中，R24及R25中的一者选自多羟基基团，该多羟基基团为线性单糖或经取代的线性单糖，其中经取代的线性单糖被一个或多个诸如烷基、O-烷基、芳基、O-芳基、羧基、酯或酰胺的取代基取代；并且R24及R25中的另一者为聚乙二醇。这种取代的多羟基基团可视情况进一步被单糖、二糖或多糖取代。
在示例性实施例中，具有包括线性单糖或经取代的线性单糖的多羟基基团的PEG单元包括以下：
在上述各实例中，各R42独立地选自H、单糖、二糖或多糖(如以上所描述)、或聚乙二醇；并且各R43选自烷基、O-烷基、芳基、O-芳基、羧基、酯或酰胺。在这些示例性实施例中，当PEG单元连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分时，将其去保护并且在PEG单元的左端的羧基基团与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分上的反应性基团之间形成键。
在PEG单元具有式(XX)及式(XXI)的一些实施例中，R24及R25中的至少一者为-C(O)-多羟基基团或经取代的-C(O)-多羟基基团，并且R24及R25中的另一者为-C(O)-多羟基基团；经取代的-C(O)-多羟基基团、多羟基基团或经取代的多羟基基团。在一些实施例中，经取代的-C(O)-多羟基基团及多羟基基团可被单糖、二糖或多糖(在各情况下为线性或环状的)；烷基；O-烷基；芳基；羧基；酯或酰胺取代。在一些实施例中，二糖包括含有任何上述单糖的二糖。术语二糖可包括二糖的线性形式、环状形式及线性-环状形式。示例性二糖包括但不限于蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖及纤维二糖。在一些实施例中，多糖包括含有任何上述单糖的多糖。术语多糖可包括多糖的线性形式、环状形式及线性-环状形式。示例性多糖包括但不限于麦芽三糖、棉子糖、蔗果三糖、淀粉、纤维素及糖原。
在示例性实施例中，具有-C(O)-多羟基基团或经取代的-C(O)-多羟基基团的PEG单元包括以下：
在这些示例性实施例中，当PEG单元连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分时，将其去保护并且在PEG单元的左端的羧基基团与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分上的反应性基团之间形成键。
在PEG单元具有式(XX)及式(XXI)的一些实施例中，R24及R25独立地选自H及经取代的-C1-C8烷基；其限制条件为R24及R25均不为H。在一些实施例中，R24及R25独立地选自H及经取代的-C1-C4烷基；其限制条件为R24及R25均不为H。在一些实施例中，R24及R25独立地选自H及经取代的-C1-C3烷基；其限制条件为R24及R25均不为H。经取代的-C1-C8、-C1-C4及-C1-C3烷基的烷基部分可为直链或支链的。
经取代的-C1-C8、-C1-C4或-C1-C3烷基可被羟基或羧基取代。在一些实施例中，经取代的-C1-C8、-C1-C4或-C1-C3烷基的各碳原子被羟基或羧基取代。在一些实施例中，经取代的-C1-C8、-C1-C4或-C1-C3烷基的各碳原子被羧基取代。在一些实施例中，经取代的-C1-C8、-C1-C4或-C1-C3烷基的一个或两个碳原子被羟基或羧基取代。在一些实施例中，经取代的-C1-C8、-C1-C4或-C1-C3烷基的一个或两个碳原子被羧基取代。在一些实施例中，经取代的-C1-C8、-C1-C4或-C1-C3烷基的末端碳原子被羧基取代。在一些实施例中，经取代的-C1-C8、-C1-C4或-C1-C3烷基的末端碳原子被羟基取代。
具有经取代的-C1-C8、-C1-C4或-C1-C3烷基的PEG单元的示例性实施例如下：
其中R48可为H、OH、CH2OH、COOH或被羟基和/或羧基取代的-C1-C6烷基。在这些示例性实施例中，当PEG单元连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分时，将其去保护并且在PEG单元的左端的羧基基团与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分上的反应性基团之间形成键。
在PEG单元具有式(XX)及式(XXI)的一些实施例中，R24及R25中的一者选自H及经取代的-C(O)-C1-C8烷基，并且R24及R25中的另一者选自经取代的-C(O)-C1-C8烷基、-C(O)-C1-C4烷基及-C(O)-C1-C3烷基及经取代的-C1-C8烷基、-C1-C4烷基及-C1-C3烷基(如上所描述)。在一些实施例中，R24及R25中的一者独立地选自H及经取代的-C(O)-C1-C4烷基，并且R24及R25中的另一者选自经取代的-C(O)-C1-C8烷基、-C(O)-C1-C4烷基及-C(O)-C1-C3烷基以及经取代的-C1-C8烷基、-C1-C4烷基及-C1-C3烷基(如上所描述)。在一些实施例中，R24及R25中的一者选自H及经取代的-C(O)-C1-C3烷基，R24及R25中的另一者选自经取代的-C(O)-C1-C8烷基、-C(O)-C1-C4烷基及-C(O)-C1-C3烷基以及经取代的-C1-C8烷基、-C1-C4烷基及-C1-C3烷基(如上所描述)。经取代的-C(O)-C1-C8烷基、-C(O)-C1-C8烷基及-C(O)-C1-C8烷基的烷基可为直链或支链的。经取代的-C1-C8、-C1-C4及-C1-C3烷基的烷基部分可为直链或支链的。
经取代的-C(O)-C1-C8烷基、-C(O)-C1-C4烷基及-C(O)-C1-C3烷基可被羟基或羧基取代。在一些实施例中，经取代的-C(O)-C1-C8烷基、-C(O)-C1-C4烷基及-C(O)-C1-C4烷基的各碳原子被羟基或羧基取代。在一些实施例中，经取代的-C(O)-C1-C8烷基、-C(O)-C1-C4烷基及-C(O)-C1-C3烷基的一个或两个碳原子被羟基或羧基取代。在一些实施例中，经取代的-C(O)-C1-C8烷基、-C(O)-C1-C4烷基及-C(O)-C1-C3烷基的一个或两个碳原子被羧基取代。在一些实施例中，经取代的-C(O)-C1-C8烷基、-C(O)-C1-C4烷基及-C(O)-C1-C3烷基的末端碳原子被羧基取代。在一些实施例中，经取代的-C(O)-C1-C8烷基、-C(O)-C1-C4烷基及-C(O)-C1-C3烷基的末端碳原子被羟基取代。
这种PEG单元的示例性实施例包括以下：
在这些示例性实施例中，当PEG单元连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分时，将其去保护并且在PEG单元的左端的羧基基团与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分上的反应性基团之间形成键。
在PEG单元具有式(XX)及式(XXI)的一些实施例中，R24及R25选自H及视情况经取代的芳基；其限制条件为R24及R25均不为H。在一些实施例中，经取代的芳基包括被卤素(例如氯、氟及溴)取代的芳基。
在示例性实施例中，包含取代的芳基的PEG单元包括以下：
在这些示例性实施例中，当PEG单元连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分时，将其去保护并且在PEG单元的左端的羧基基团与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分上的反应性基团之间形成键。
在PEG单元具有式(XX)及式(XXI)的一些实施例中，R24及R25一起形成视情况经取代的C3-C8杂环或杂芳基。在一些实施例中，视情况选用的取代基包括被卤素(例如氯、氟及溴)取代的杂环或芳基。
在示例性实施例中，包含视情况经取代的C3-C8杂环的PEG单元包括以下：
在该示例性实施例中，当PEG单元连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分时，将其去保护并且在PEG单元的左端的羧基基团与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分上的反应性基团之间形成键。
在PEG单元具有式(XX)及式(XXI)的一些实施例中，R24及R25独立地选自H及螯合物；其限制条件为R24及R25均不为H。在一些实施例中，螯合物选自乙二胺四乙酸(EDTA)、二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)、三伸乙基四胺六乙酸(TTHA)、苄基-DTPA、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N”,N”'-四乙酸(DOTA)、苄基-DOTA、1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N',N”-三乙酸(NOTA)、苄基-NOTA、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)及N,N'-二烷基取代的哌嗪。在一些实施例中，螯合物直接连接至-NR24R25的氮。在一些实施例中，螯合物经由伸烷基、伸芳基、碳环、杂伸芳基或杂碳环(在各情况下为取代或未取代的)连接。
在一些示例性实施例中，包含螯合物的PEG单元包括以下：
在这些示例性实施例中，当PEG单元连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分时，将其去保护并且在PEG单元的左端的羧基基团与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分上的反应性基团之间形成键。
在PEG单元具有式(XX)、(XXI)、(XXX)、(XXXI)、(XXXII)及(XXXIII)的一些实施例中，螯合物可附接至本文所描述的R24、R25和/或R30基团中的任一个。在一些实施例中，螯合物选自乙二胺四乙酸(EDTA)、二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)、三伸乙基四胺六乙酸(TTHA)、苄基-DTPA、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N”,N”'-四乙酸(DOTA)、苄基-DOTA、1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N',N”-三乙酸(NOTA)、苄基-NOTA、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)及N,N'-二烷基取代的哌嗪。在一些实施例中，螯合物直接连接至本文所描述的R24、R25或R30基团。在一些实施例中，螯合物经由伸烷基、伸芳基、碳环、杂芳基或杂碳环(在各情况下为取代或未取代的)连接。
在一些实施例中，PEG单元具有以下通式(XXX)：
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-R30
(XXX)
其中R20为用于连接氨基酸单元的亚单元和/或连接子亚单元L2的一部分的官能基；R21及R22各自为视情况选用的C1-C3伸烷基基团；R30选自视情况经取代的C3-C10碳环；硫脲；视情况经取代的硫脲；脲；视情况经取代的脲；磺酰胺；烷基磺酰胺；酰基磺酰胺、视情况经取代的烷基磺酰胺；视情况经取代的酰基磺酰胺；磺酰胺；视情况经取代的磺酰胺；胍，包括烷基胍及芳基胍；磷酰胺；或视情况经取代的磷酰胺；波浪线(～)表示连接位点；并且n20为1至26。在一些实施例中，R20选自羧基、氨基、炔基、叠氮基、羟基、羰基、氨基甲酸酯、脲、硫代氨基甲酸酯、硫脲、磺酰胺、酰基磺酰胺、烷基磺酸酯或其受保护的形式。合适的保护基团包括本领域通常使用的羧酸保护基团、胺保护基团及磺酰基保护基团。
在一些实施例中，PEG单元具有以下通式(XXX)：
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-R30
(XXX)
其中R20为用于连接氨基酸单元的亚单元和/或连接子亚单元L2的一部分的官能基；R21及R22各自为视情况选用的C1-C3伸烷基基团；R30选自视情况经取代的C3-C10碳环；硫脲；视情况经取代的硫脲；脲；视情况经取代的脲；磺酰胺；烷基磺酰胺；酰基磺酰胺、视情况经取代的烷基磺酰胺；视情况经取代的酰基磺酰胺；磺酰胺；视情况经取代的磺酰胺；胍，包括烷基胍及芳基胍；磷酰胺；或视情况经取代的磷酰胺；波浪线(～)表示连接位点；并且n20为1至26。在一些实施例中，R20选自卤基、醛、羧基、氨基、炔基、叠氮基、羟基、羰基、氨基甲酸酯、硫醇、脲、硫代氨基甲酸酯、硫脲、磺酰胺、酰基磺酰胺、烷基磺酸酯、三唑、氮杂二苯并环辛炔或其受保护的形式。合适的保护基团包括本领域通常使用的羧酸保护基团、胺保护基团及磺酰基保护基团。
在PEG单元具有式(XXX)的一些实施例中，R30为视情况经取代的C3-C10碳环。在一些实施例中，视情况经取代的C3-C10碳环为如国际公开号WO2011/136645(其公开内容借由引用并入本文)中所公开的稠合环辛炔化合物。具有稠合环辛炔的示例性PEG单元如下所示。
在这些示例性实施例中，当PEG单元连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分时，根据需要将其去保护，并且在PEG单元的左端的羧基或氨基基团与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分上的反应性基团之间形成键。
如本领域技术人员将理解的，以上化合物以及国际公开号WO2011/136645中公开的其他化合物可用作用于连接附加化合物的点击化学的中间体。在一些实施例中，附加化合物为药物单元。在一些实施例中，附加化合物为如本文所描述的连接子亚单元L2。
在PEG单元具有式(XXX)的一些实施例中，R30为硫脲、经取代的硫脲、脲或经取代的脲。硫脲及脲基团可被例如视情况经取代的烷基、视情况经取代的碳环或视情况经取代的芳基取代。
包含硫脲；经取代的硫脲；脲；或经取代的脲的示例性PEG单元包括以下：
在这些示例性实施例中，当PEG单元连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分时，将其去保护并且在PEG单元的左端的羧基基团与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分上的反应性基团之间形成键。
在PEG单元具有式(XXX)的一些实施例中，R30为磺酰胺；烷基磺酰胺；酰基磺酰胺、视情况经取代的烷基磺酰胺；视情况经取代的酰基磺酰胺；磺酰胺或视情况经取代的磺酰胺。视情况经取代的烷基磺酰胺；视情况经取代的酰基磺酰胺及视情况经取代的磺酰胺可被增加溶解度，或者在其他实施例中，用于连接附加基团(例如连接子、药物或其他化合物)的基团取代。
包含磺酰胺；烷基磺酰胺；酰基磺酰胺、视情况经取代的烷基磺酰胺；视情况经取代的酰基磺酰胺；磺酰胺或视情况经取代的磺酰胺的示例性PEG单元包括以下：
在这些实例中，R50可为例如视情况经取代的烷基、烯基、炔基、碳环、芳基、杂碳环或杂芳基。在这些示例性实施例中，当PEG单元连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分时，将其去保护并且在PEG单元的左端的羧基基团与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分上的反应性基团之间形成键。
在PEG单元具有式(XXX)的一些实施例中，R30为胍或视情况经取代的胍。视情况经取代的胍可被视情况经取代的烷基、烯基、炔基、碳环、芳基、杂碳环或杂芳基取代。
包含胍或视情况经取代的胍的示例性PEG单元包括以下：
在这些实例中，R55可为例如视情况经取代的烷基、烯基、炔基、碳环、芳基、杂碳环或杂芳基。在这些示例性实施例中，当PEG单元连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分时，根据需要将其去保护，并且在PEG单元的左端的羧基基团与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分上的反应性基团之间形成键。
在PEG单元具有式(XXX)的一些实施例中，R30为磷酰胺或视情况经取代的磷酰胺。视情况经取代的磷酰胺可被视情况经取代的烷基、烯基、炔基、碳环、芳基、杂碳环或杂芳基取代。
包含磷酰胺或视情况经取代的磷酰胺的示例性PEG单元包括以下：
在这些实例中，R60可为例如视情况经取代的烷基、烯基、炔基、碳环、芳基、杂碳环或杂芳基。R61可为例如视情况经取代的烷基、烯基、炔基、碳环、芳基、杂碳环或杂芳基。在这些示例性实施例中，当PEG单元连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分时，将其去保护并且在PEG单元的左端的羧基基团与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分上的反应性基团之间形成键。
在PEG单元具有式(XXX)的一些实施例中，PEG单元用于连接附加部分的官能基。在PEG单元具有式(XXX)的一些实施例中，R30选自叠氮基、炔基、经取代的炔基、-NH-C(O)-炔基、-NH-C(O)-炔基-R65；环辛炔；-NH-环辛炔、-NH-C(O)-环辛炔或-NH-(环辛炔)2；其中R65选自视情况经取代的烷基、视情况经取代的烯基、视情况经取代的炔基、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基、视情况经取代的杂碳环或视情况经取代的杂芳基。在一些实施例中，此类PEG单元可用作用于连接附加化合物的点击化学的中间体。在一些实施例中，附加化合物为药物单元。在一些实施例中，附加化合物为如本文所描述的连接子亚单元L2。在一些实施例中，附加化合物为其他连接子或药物连接子。
包含叠氮基、炔基或环辛炔基团的示例性PEG单元包括以下：
在这些示例性实施例中，当PEG单元连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分时，将其去保护并且在PEG单元的左端的羧基基团与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分上的反应性基团之间形成键。
在一些实施例中，PEG单元具有下式：
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-NH-C(O)-R31
(XXXI)
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-C(O)NH-R31
(XXXII)
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-N-(R33-R31)2
(XXXIII)
～R20-[-R26-[R29-[O-CH2-CH2-]n20R29]n21-R27-]n27-N-C(O)-R31
(XXXIV)
～R20-[-R26-[R29-[O-CH2-CH2-]n20R29]n21-R27-]n27-C(O)NH-R31
(XXXV)
或
～R20-[-R26-[R29-[O-CH2-CH2-]n20R29]n21-R27-]n27-NR24R25
(XXXVI)
或其盐，其中R20为用于连接氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分的官能基；R21及R22各自为视情况选用的C1-C3伸烷基基团；R26及R27各自为视情况选用的C1-C12伸烷基、-NH-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-NH-、-C(O)-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-C(O)-、-NH-C1-C12伸烷基-C(O)-或-C(O)-C1-C12伸烷基-NH-；R31为支链聚乙二醇链，各支链具有1至26个乙二醇亚单元并且各支链在其末端处具有R35；R33为C1-C3伸烷基、-C1-C3伸烷基-C(O)、-C(O)-C1-C3伸烷基或-C(O)-C1-C3伸烷基-C(O)；各R29为视情况且独立地选自-C(O)-、-NH-、-C(O)-C1-C6伸烯基-、-NH-C1-C6伸烯基-、-C1-C6伸烯基-NH-及-C1-C6伸烯基-C(O)-；R35为叠氮基、炔基、炔基-R65、环辛炔或环辛炔-R65，其中R65选自视情况经取代的烷基、视情况经取代的烯基、视情况经取代的炔基、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基、视情况经取代的杂碳环或视情况经取代的杂芳基；波浪线(～)表示连接位点；n20为1至26；n21为1至4；并且n27为1至4。在一些实施例中，R20选自羧基、氨基、炔基、叠氮基、羟基、羰基、氨基甲酸酯、脲、硫代氨基甲酸酯、硫脲、磺酰胺、酰基磺酰胺、烷基磺酸酯或其受保护的形式。合适的保护基团包括本领域通常使用的羧酸保护基团、胺保护基团及磺酰基保护基团。
在一些实施例中，PEG单元具有下式：
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-NH-C(O)-R31
(XXXI)
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-C(O)NH-R31
(XXXII)
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-N-(R33-R31)2
(XXXIII)
～R20-[-R26-[R29-[O-CH2-CH2-]n20R29]n21-R27-]n27-N-C(O)-R31
(XXXIV)
～R20-[-R26-[R29-[O-CH2-CH2-]n20R29]n21-R27-]n27-C(O)NH-R31
(XXXV)
或
～R20-[-R26-[R29-[O-CH2-CH2-]n20R29]n21-R27-]n27-NR24R25
(XXXVI)
或其盐，其中R20为用于连接氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分的官能基；R21及R22各自为视情况选用的C1-C3伸烷基基团；R26及R27各自为视情况选用的C1-C12伸烷基、-NH-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-NH-、-C(O)-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-C(O)-、-NH-C1-C12伸烷基-C(O)-或-C(O)-C1-C12伸烷基-NH-；R31为支链聚乙二醇链，各支链具有1至26个乙二醇亚单元并且各支链在其末端处具有R35；R33为C1-C3伸烷基、-C1-C3伸烷基-C(O)、-C(O)-C1-C3伸烷基或-C(O)-C1-C3伸烷基-C(O)；各R29为视情况且独立地选自-C(O)-、-NH-、-C(O)-C1-C6伸烯基-、-NH-C1-C6伸烯基-、-C1-C6伸烯基-NH-、-C1-C6伸烯基-C(O)-、-NH(CO)NH-及三唑；R35为叠氮基、炔基、炔基-R65、环辛炔或环辛炔-R65，其中R65选自视情况经取代的烷基、视情况经取代的烯基、视情况经取代的炔基、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基、视情况经取代的杂碳环或视情况经取代的杂芳基；波浪线(～)表示连接位点；n20为1至26；n21为1至4；并且n27为1至4。在一些实施例中，R20选自卤基、醛、羧基、氨基、炔基、叠氮基、羟基、羰基、氨基甲酸酯、硫醇、脲、硫代氨基甲酸酯、硫脲、磺酰胺、酰基磺酰胺、烷基磺酸酯、三唑、氮杂二苯并环辛炔、肼、羰基烷基杂芳基或其受保护的形式。合适的保护基团包括本领域通常使用的羧酸保护基团、胺保护基团及磺酰基保护基团。
如本领域技术人员将理解的，此类PEG单元可用于连接附加化合物。在一些实施例中，附加化合物为药物单元。在一些实施例中，附加化合物为如本文所描述的连接子亚单元L2。在一些实施例中，附加化合物为连接子或药物连接子。
包含支链聚乙二醇链的示例性PEG单元包括以下：
在这些示例性实施例中，当PEG单元连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分时，将其去保护并且在PEG单元的左端的羧基基团与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分上的反应性基团之间形成键。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其包含具有选自以下的式的PEG单元：
～R40-(R43-R41-[O-CH2-CH2]n40-R42-R43-(NR44R4 5)n41)n42
(XL)
或其盐，其中：
R40为用于连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R41及R42不存在或各自独立地为C1-C6伸烷基；
各R43独立地不存在或选自C1-C12伸烷基、-NH-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-NH-、-C(O)-C1-
C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-C(O)-、-NH-C1-C12伸烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C12伸烷基-NH-、-NH-C(O)-
NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-C1-C12伸烷基、-C(O)-NH-C1-C12伸烷基、-杂伸芳基、杂芳基-C1-C12伸烷基、杂芳基-C1-C12伸烷基-C(O)-或-C(O)NR46R47，其中R46及R47中的一者为H或C1-C12伸烷基并且另一者为C1-C12伸烷基；
R44及R45各自独立地为H、多羟基基团、经取代的多羟基基团、-C(O)-多羟基基团或经取代的-
C(O)-多羟基基团，其中视情况选用的取代基选自硫酸酯、磷酸酯、烷基硫酸酯及烷基磷酸酯；
波浪线(～)表示与R40的连接位点；
n40为1至26；
n41为1至6；以及
n42为1至6。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其包含具有选自以下的式的PEG单元：
～R40-(R41-[O-CH2-CH2]n40-R42-R43-(NR44R45)n41)n42
(XLI)
或其盐，其中：
R40为用于连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R41及R42不存在或各自独立地为C1-C6伸烷基；
R43不存在或选自C1-C12伸烷基、-NH-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-NH-、-C(O)-C1-C12伸烷基、
-C1-C12伸烷基-C(O)-、-NH-C1-C12伸烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C12伸烷基-NH-、-NH-C(O)-NH-、-NH-
C(O)-、-NH-C(O)-C1-C12伸烷基、C(O)-NH-C1-C12伸烷基、-杂伸芳基、杂芳基-C1-C12伸烷基、杂芳基-C1-C12伸烷基-C(O)-或-C(O)NR46R47，其中R46及R47中的一者为H或C1-C12伸烷基，并且另一者为C1-C12伸烷基；
R44及R45各自独立地为H、多羟基基团、经取代的多羟基基团、-C(O)-多羟基基团或经取代的-
C(O)-多羟基基团，其中视情况选用的取代基选自硫酸酯、磷酸酯、烷基硫酸酯及烷基磷酸酯；
波浪线(～)表示与R40的连接位点；
n40为1至26；
n41为1至6；以及
n42为1至6。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其包含具有选自以下的式的PEG单元：
～R40-(R41-[O-CH2-CH2]n40-R42-R43-(NR44R45)n41)n42
(XLII)
或其盐，其中：
R40为用于连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R41及R42不存在或各自独立地为C1-C3伸烷基；
R43不存在或选自C1-C6伸烷基、-NH-C1-C12伸烷基、-C1-C6伸烷基-NH-、-C(O)-C1-C6伸烷基、-
C1-C6伸烷基-C(O)-、-NH-C1-C6伸烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C6伸烷基-NH-、-NH-C(O)-NH-、-NH-
C(O)-、-NH-C(O)-C1-C6伸烷基、-C(O)-NH-C1-C12伸烷基、-杂伸芳基、杂芳基-C1-C6伸烷基、杂芳基-C1-C6伸烷基-C(O)-或-C(O)NR46R47，其中R46及R47中的一者为H或C1-C6伸烷基，并且另一者为C1-C12伸烷基；
R44及R45各自独立地为H、多羟基基团、经取代的多羟基基团、-C(O)-多羟基基团或经取代的-
C(O)-多羟基基团，其中视情况选用的取代基选自硫酸酯、磷酸酯、烷基硫酸酯及烷基磷酸酯；
波浪线(～)表示与R40的连接位点；
n40为1至16；
n41为1至4；以及
n42为1至4。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中R40选自卤素、醛、羧基、氨基、炔基、叠氮基、羟基、羰基、氨基甲酸酯、硫醇、脲、硫代氨基甲酸酯、硫脲、磺酰胺、酰基磺酰胺、烷基磺酸酯、三唑、氮杂二苯并环辛炔、肼、羰基烷基杂芳基或其受保护的形式。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中R40具有以下结构中的一种：
其中R＝H或C1-6烷基；以及
n＝0至12
或其立体异构体，其中(*)表示R40与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分的连接位点，并且表示R40与PEG单元的其余部分的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中R40具有以下结构中的一种：
其中n＝0至12
或其立体异构体，其中(*)表示R40与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分的连接位点，并且表示R40与PEG单元的其余部分的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中R43-(NR44R45)n41当存在R43时具有以下结构中的一种：
其中R＝H、C1-6烷基、多羟基或经取代的多羟基
或其立体异构体，其中表示R43与PEG单元的其余部分的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中R43-(NR44R45)n41当存在R43时具有以下结构中的一种：
或其立体异构体，其中表示R43与PEG单元的其余部分的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中-NR44R45具有以下结构中的一种：
或其立体异构体，其中表示-NR44R45与PEG单元的其余部分的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元在连接至氨基酸单元或连接子亚单元L2的一部分之前具有以下结构中的一种：
其中R为H或烷基，并且n为1至12。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其包含具有选自以下的式的PEG单元：
～R40-(R43-R41--[O-CH2-CH2]n40-R46-[O-CH2-CH2]n40-R42-R43-(NR44R45)n41)n42
(XLIII)
或其盐，其中：
R40为用于连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R41及R42不存在或各自独立地为C1-C6伸烷基；
各R43独立地不存在或选自C1-C12伸烷基、-NH-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-NH-、-C(O)-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-C(O)-、-NH-C1-C12伸烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C12伸烷基-NH-、-NH-C(O)-
NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-C1-C12伸烷基、-C(O)-NH-C1-C12伸烷基、-杂伸芳基、杂芳基-C1-C12伸烷基、杂芳基-C1-C12伸烷基-C(O)-或-C(O)NR46R47，其中R46及R47中的一者为H或C1-C12伸烷基并且另一者为C1-C12伸烷基；
R44及R45各自独立地为H、多羟基基团、经取代的多羟基基团、-C(O)-多羟基基团或经取代的-
C(O)-多羟基基团，其中视情况选用的取代基选自硫酸酯、磷酸酯、烷基硫酸酯及烷基磷酸酯；R46选自氨基、氨基-烷基-氨基或-NH-C(O)-NH-S(O)2-NH-；
波浪线(～)表示与R40的连接位点；
n40为1至26；n41为1至6；以及
n42为1至6。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元在连接至氨基酸单元或连接子亚单元L2的一部分之前具有以下结构中的一种：
其中R为H或烷基，并且n为1至12。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其包含具有选自以下的式的PEG单元：
或其盐，其中：
各Y独立地为R76或
各R76独立地为H、乙酰基、-P(＝O)(OH)2或-(CH2)v-O-S(＝O)2(OH)；
各Ra及Rb独立地为H，或者Ra及Rb与其所连接的碳一起形成侧氧基基团；
各q独立地为1至26；
各m独立地为1至4；
各n独立地为1至4；
各v独立地为1至6；以及
各*表示用于氨基酸单元(AA)的亚单元、连接子亚单元L2或扩展单元(L1)的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其包含具有选自以下的式的PEG单元：
或其盐，其中：
各R76独立地为H、乙酰基、-P(＝O)(OH)2或-(CH2)vS(＝O)2(OH)；
各q独立地为1至26；
各m独立地为1至4；
各n独立地为1至4；
各v独立地为1至6；以及
各*表示用于氨基酸单元(AA)的亚单元、连接子亚单元L2或扩展单元(L1)的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其包含具有选自以下的式的PEG单元：
或其盐，其中：
各q独立地为1至26；
各m独立地为1至4；
各n独立地为1至4；以及
各*表示用于氨基酸单元(AA)的亚单元、连接子亚单元L2或扩展单元(L1)的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中Y为R76。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中Y为
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中各Ra及Rb独立地为H。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中Ra及Rb与其所连接的碳一起形成侧氧基基团。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中q为10至20。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中q为12。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下，或其盐：
以及
其中各Z在*处连接并且分别选自：
以及
其中各表示与氨基酸单元(AA)的亚单元、连接子亚单元L2的一部分或扩展单元(L1)的连接位点。
羧基单元
在一些实施例中，连接子包含羧基单元。羧基单元可为氨基酸单元的亚单元或连接至连接子亚单元L2的一部分。在一些实施例中，羧基单元具有以下通式(XXXX)：
或其盐，其中L70选自C1-C8伸烷基、C1-C8伸烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C8伸烷基-及-C(O)-C1-C8伸烷基-C(O)-；R70为～NR71(R72R73)，其中R71选自H、C1-C12烷基、经取代的C1-C12烷基或聚乙二醇(视情况具有1个至12个乙二醇亚单元)；R72不存在或选自视情况经取代的C1-C3伸烷基、视情况经取代的醚、视情况经取代的硫醚、视情况经取代的酮、视情况经取代的酰胺、聚乙二醇(视情况具有1个至12个乙二醇亚单元)、视情况经取代的碳环、视情况经取代的伸芳基或视情况经取代的杂伸芳基；R73为羧基或多羧基；并且p1及o1分别独立地选自0至2。如本文所用，术语“多羧基”是指含有1至10个、或1至6个、或1至4个羧基基团的基团，其中羧基基团借由烷基、伸烷基、经取代的烷基、经取代的伸烷基、杂烷基、杂伸烷基、氨基和/或酰胺相互连接。如本文所用，多羧基包括羧基盐形式。
在一些实施例中，R70为～NR71(R75_(R73)2)，其中R71选自H、C1-C12烷基、经取代的C1-C12烷基或聚乙二醇(视情况具有1个至12个乙二醇亚单元)；R75为支链的视情况经取代的C1-C3伸烷基、视情况经取代的醚、视情况经取代的硫醚、视情况经取代的酮、视情况经取代的酰胺、聚乙二醇(视情况具有1个至12个乙二醇亚单元)、视情况经取代的碳环、视情况经取代的伸芳基或视情况经取代的杂伸芳基；各R73为羧基或多羧基；并且p1及o1分别独立地选自0至2。
在一些实施例中，R70为～N(R74-R73)(R72-R73)，其中R72及R74各自独立地选自视情况经取代的C1-C3伸烷基、视情况经取代的醚、视情况经取代的硫醚、视情况经取代的酮、视情况经取代的酰胺、聚乙二醇(视情况具有1个至12个乙二醇亚单元)、视情况经取代的碳环、视情况经取代的伸芳基或视情况经取代的杂伸芳基；各R73独立地为羧基或多羧基；并且p1及o1分别独立地选自0至2。
在以上实施例的一些中，R73可选自：
及～COOH；
其中波浪线表示与R72、R74或R75的键。
连接子亚单元L2
L2连接子包含至少一个连接子亚单元L2，各连接子亚单元L2具有用于至少一个药物单元(D)的连接位点，如本文进一步所描述。在一些实施例中，药物单元(D)连接至连接子亚单元L2上的各用于药物单元的连接位点。在各种实施例中，连接子亚单元L2可为可裂解连接子亚单元或不可裂解连接子亚单元。连接子亚单元L2也具有用于氨基酸单元(AA)或扩展单元(L1)的连接位点。
在一些实施例中，连接子亚单元L2包括极性单元，例如糖单元、PEG单元或羧基单元。在一些实施例中，连接子亚单元L2不包括极性单元，其中氨基酸单元包括极性单元。在一些实施例中，连接子亚单元L2及氨基酸单元(若存在)均包括极性单元。
在一些实施例中，连接子亚单元L2为可裂解连接子亚单元。如本文所用，术语“可裂解的”是指细胞内或细胞外环境中的代谢过程或反应，由此药物单元(例如，细胞毒性剂)与连接子亚单元L2或其部分之间的共价连接被破坏，导致游离药物单元或连接子亚单元L2-药物单元的其他代谢物与连接子亚单元L2的其余部分解离。
在一些实施例中，连接子亚单元L2包括可蛋白酶裂解的连接子亚单元、可酸裂解的连接子亚单元、二硫键连接子亚单元、含二硫键的连接子亚单元或在二硫键附近具有二甲基基团的含二硫键的连接子亚单元(例如，SPDB连接子)(参见，例如，Jain等人，Pharm.Res.32:3526-3540(2015)；Chari等人，Cancer Res.52:127-131(1992)；U.S专利号5,208,020)、可裂解的自稳定连接子(参见，例如，WO2018/031690及WO2015/095755及Jain等人，Pharm.Res.32:3526-3540(2015))和/或可裂解的亲水连接子(参见，例如，W02015/123679)。在一些实施例中，连接子亚单元L2包括光不稳定的连接子亚单元。在一些实施例中，连接子亚单元L2具有不可裂解连接子单元(参见，例如，WO2007/008603)。
在一些实施例中，连接子亚单元L2为在细胞内环境下可裂解的可裂解连接子，使得在细胞内环境下连接子亚单元L2的裂解或连接子亚单元L2内的裂解自连接子亚单元L2或连接子亚单元L2的其余部分释放药物单元。例如，在一些实施例中，连接子亚单元L2可被存在于细胞内环境中(例如，在溶酶体或内体或小窝内)的裂解剂裂解。如本文所用，术语“在细胞内环境下可裂解的”、“细胞内裂解的”及“细胞内裂解”是指细胞内的代谢过程或反应，由此药物单元(例如，细胞毒性剂)与连接子亚单元L2或其部分之间的共价连接被破坏，导致在细胞内游离药物单元或连接子亚单元L2-药物单元的其他代谢物与连接子亚单元L2的其余部分解离。偶联物的裂解部分因此为细胞内代谢物。
在一些实施例中，连接子亚单元L2与药物单元之间的连接可借由一种或多种的酶(包括肿瘤相关蛋白酶)酶促裂解以释放药物单元(D)。连接子亚单元L2可为，例如，被细胞内肽酶或蛋白酶裂解的肽基连接子，其包含但不限于溶酶体或内体蛋白酶(参见，例如，WO2004/010957、US20150297748、US2008/0166363、US20120328564及US20200347075)。细胞内裂解剂可包括组织蛋白酶B、C及D及纤溶酶，已知所有这些均水解二肽药物衍生物，导致活性药物在目标细胞内的释放(参见，例如，Dubowchik及Walker，1999，Pharm.Therapeutics 83:67-123)。肽基连接子可被存在于目标抗原表达细胞内的酶裂解。例如，可使用可被在癌组织中高度表达的硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶-B裂解的肽基连接子亚单元(例如，具有Phe-Leu、Val-Ala、Val-Cit或Gly-Phe-Leu-Gly肽)。
通常，肽基连接子为至少一个氨基酸长或至少两个氨基酸长。在某些实施例中，肽基连接子二肽、三肽、四肽或五肽。在某些实施例中，肽基连接子亚单元可仅包含天然氨基酸。在一些实施例中，例如，肽基连接子亚单元可具有Phe-Leu、Val-Ala、Val-Cit或Gly-Phe-Leu-Gly肽。其他此类可裂解连接子描述于例如美国专利号6,214,345中。在具体实施例中，可被细胞内蛋白酶裂解的肽基连接子包括Val-Cit肽或Phe-Lys肽(参见，例如，美国专利号6,214,345)或Gly-Gly-Phe-Gly连接子(参见，例如，美国公开申请号2015/0297748)。使用药物单元的细胞内蛋白水解释放的一个优点在于药物单元的活性在结合时通常减弱并且偶联物的血清稳定性通常很高。还可参见美国专利9,345,785。
在一些实施例中，肽基连接子亚单元可仅包含非天然氨基酸。在一些实施例中，肽基连接子亚单元可包含连接至非天然氨基酸的天然氨基酸。在一些实施例中，肽基连接子亚单元可包含连接至天然氨基酸的D-异构体的天然氨基酸。在一些实施例中，肽基连接子亚单元的至少一个氨基酸为L-氨基酸。在一些实施例中，至少氨基酸为D-氨基酸。
在一些实施例中，肽基连接子亚单元含有以下中的一种或多种：甘氨酸和/或L-氨基酸，例如精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸及缬氨酸，以及极性单元(包括连接甘氨酸或L-氨基酸的PEG单元)。在一些实施例中，肽基连接子亚单元含有以下中的一种或多种：甘氨酸和/或D-氨基酸，例如精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸及缬氨酸，以及极性单元(包括连接至甘氨酸或D-氨基酸的PEG单元)。在一些实施例中，肽基连接子亚单元含有以下中的一种或多种：甘氨酸和/或L-氨基酸及D-氨基酸的混合物，例如精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸及缬氨酸，以及极性单元(包括连接至甘氨酸或氨基酸的PEG单元)。
在一些实施例中，肽基连接子亚单元含有以下中的一种或多种：甘氨酸和/或天然L-氨基酸，例如精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸及缬氨酸，以及至少一个极性单元，例如连接至甘氨酸或L-氨基酸的糖单元或羧基单元或PEG单元。在一些实施例中，肽基连接子亚单元含有以下中的一种或多种：甘氨酸和/或D-氨基酸，例如精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸及缬氨酸，以及至少一个极性单元，例如连接至甘氨酸或D-氨基酸的糖单元或羧基单元或PEG单元。
在一些实施例中，肽基连接子亚单元的氨基酸具有以下中括号中所示的式：
其中R190为氢、甲基、异丙基、异丁基、第二丁基、苄基、对羟基苄基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(＝NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、苯基、环己基。
在一些实施例中，肽基连接子亚单元包括以下L-(天然)氨基酸中的一种或多种：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、色氨酸及缬氨酸；以及至少一个极性单元，例如连接至甘氨酸或天然氨基酸的糖单元或羧基单元或PEG单元。
在一些实施例中，肽基连接子亚单元不包含半胱氨酸。在一些实施例中，肽基连接子不包含脯氨酸。
在一些实施例中，肽基连接子亚单元包含以下这些天然氨基酸的D-异构体中的一种或多种：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、色氨酸及缬氨酸；以及至少一个极性单元，例如连接至甘氨酸或D-氨基酸的糖单元或羧基单元或PEG单元。
在一些实施例中，肽基连接子亚单元包含以下氨基酸中的一种或多种：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、鸟氨酸、青霉胺、β-丙氨酸、氨基烷酸、氨基炔酸、氨基烷二酸、氨基苯甲酸、氨基-杂环-烷酸、杂环-羧酸、瓜氨酸、他汀(statine)、二氨基烷酸及其衍生物；以及至少一个极性单元，例如连接至氨基酸的糖单元或羧基单元或PEG单元。此类氨基酸衍生物的示例性实例在下文描述氨基酸亚单元的章节中阐述。
在一些实施例中，肽基连接子亚单元含有糖单元作为肽可裂解的一部分。例如，含有赖氨酸或瓜氨酸的糖单元作为可裂解的肽的一部分。在一些实施例中，肽基连接子亚单元含有羧基单元作为肽可裂解的一部分。例如，含有赖氨酸或瓜氨酸的羧基单元作为可裂解的肽的一部分。
在一些实施例中，可裂解连接子亚单元为pH-敏感的，亦即，敏感于特定pH值下的水解。通常，pH-敏感的连接子亚单元在酸性条件下可水解。例如，可使用在溶酶体中可水解的酸不稳定的连接子亚单元(例如，腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺式乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等)。(参见，例如，美国专利号5,122,368；5,824,805；及5,622,929；Dubowchik及Walker，1999，Pharm.Therapeutics 83:67-123；Neville等人，1989，Biol.Chem.264：14653-14661。)此类连接子亚单元在中性pH条件下(例如血液中的pH)相对稳定，但在低于pH 5.5或5.0(溶酶体的近似pH)时不稳定。在某些实施例中，可水解连接子单元为硫醚连接子(例如，经由酰基腙键连接至药物单元的硫醚(参见，例如，美国专利No.5,622,929))。
在一些实施例中，连接子亚单元L2在还原条件下可裂解(例如，二硫键连接子亚单元)。已知各种二硫键连接子，其包含例如，可使用SATA(N-琥珀酰亚氨基-5-乙酰基硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)及SMPT(N-琥珀酰亚氨基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)-、SPDB及SMPT形成的二硫键连接子(参见，例如，Thorpe等人，1987，Cancer Res.47:5924-5931；Wawrzynczak等人，In lmmunoconjugates：Antibody Conjugates inRadioimagery and Therapy of Cancer(C.W.Vogel编辑，Oxford U.Press，1987，也可参见美国专利号4,880,935.)。
在一些实施例中，连接子亚单元L2为丙二酸酯连接子(Johnson等人，1995，Anticancer Res.15:1387-93)、顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基连接子(Lau等人，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10):1299-1304)或3'-N-酰胺类似物(Lau等人，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10):1305-12)。在一些实施例中，连接子亚单元L2不可裂解，例如顺丁烯二酰亚胺基己酰基连接子，并且药物单元借由药物-连接子的代谢性降解而释放。(参见，例如，美国公开号2005/0238649。)
在一些实施例中，连接子亚单元L2对细胞外环境基本上不敏感。如本文所用，在连接子亚单元L2的上下文中的“对细胞外环境基本上不敏感”意指当偶联物存在于细胞外环境(例如，血浆)中时，在偶联物的样品中连接子亚单元L2的不超过约20％、通常不超过约15％、更通常不超过约10％、甚至更通常不超过约5％、不超过约3％或不超过约1％被裂解。连接子亚单元L2为否对细胞外环境基本上不敏感可以例如借由以下方法判定：将(a)偶联物(“偶联物样品”)及(b)等莫耳量的未结合的靶向单元或药物单元(“对照样品”)与血浆独立地培育预定的时间段(例如，2、4、8、16或24小时)，随后将存在于偶联物样品中的未结合的靶向单元或药物单元的量与存在于对照样品中的未结合的靶向单元或药物单元的量进行比较，例如借由高效液相层析法测量。
在一些实施例中，连接子或连接子亚单元L2促进细胞内化。在一些实施例中，连接子或连接子亚单元L2当与诸如细胞毒性剂的药物单元结合时促进细胞内化(亦即，在如本文所描述的偶联物的连接子-药物单元部分的环境中)。在又一些其他实施例中，连接子或连接子亚单元L2当与药物单元及靶向单元二者结合时促进细胞内化(亦即，在如本文所描述的偶联物的背景中)。
可用于本发明组合物及方法的各种连接子亚单元L2描述于例如WO2004010957中。在一些实施例中，连接子亚单元L2包含包括硫醇-反应性间隔基及二肽的可蛋白酶裂解的连接子(例如，顺丁烯二酰亚胺基己酰基缬氨酸丙氨酸)。在一些实施例中，连接子亚单元L2包括包含硫醇-反应性顺丁烯二酰亚胺基己酰基间隔基、氨基酸或肽及自分解基团的可蛋白酶裂解的连接子。在一些实施例中，连接子亚单元L2包括包含硫醇-反应性顺丁烯二酰亚胺基己酰基间隔基、缬氨酸-瓜氨酸二肽及对氨基苄氧基羰基自分解基团的可蛋白酶裂解的连接子。
在一些实施例中，连接子亚单元L2包括可酸裂解的连接子，例如肼连接子或四级铵连接子(参见，例如，WO2017/096311及WO2016/040684)。
在一些实施例中，连接子亚单元L2包括包含顺丁烯二酰亚胺基团的自稳定部分，如WO2013/173337中所描述。
在一些实施例中，连接子亚单元L2包括亲水连接子，例如，W02015/123679中的亲水肽以及WO2013/012961及WO2019/213046中公开的基于糖醇聚合物的连接子。
在其他实施例中，连接子亚单元L2可使用各种双官能蛋白质结合剂制备，例如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(例如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(例如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如双(对重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)及双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。在例如WO94/11026中已经描述了用于结合放射性核苷酸的螯合剂。
在一些实施例中，连接子亚单元L2可用交联剂制备，包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB及SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，其为可商购的(例如，来自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)。
氨基酸单元(AA)
连接子视情况包含氨基酸单元(AA)。当存在于连接子中时，氨基酸单元将扩展单元(L1)连接至连接子亚单元L2。当AA的s为0时，氨基酸单元不存在(例如，在式I至式IV中的任一个中)。在一些实施例中，氨基酸单元包含0至12个亚单元。氨基酸单元的各亚单元选自天然或非天然的α、β或γ氨基酸或极性单元，例如连接至氨基酸单元的亚单元的糖单元(SU)或羧基单元或PEG单元。
在一些实施例中，氨基酸单元为氨基酸或二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽，其中一个或多个亚单元视情况被修饰以形成极性单元，例如糖单元、PEG单元或羧基单元。
在一些实施例中，氨基酸单元的亚单元选自甘氨酸和/或L-氨基酸，例如精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸及缬氨酸，以及极性单元(包括连接至甘氨酸或L-氨基酸的PEG单元)。在一些实施例中，氨基酸单元的亚单元选自甘氨酸和/或D-氨基酸，例如精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸及缬氨酸，以及极性单元。在一些实施例中，氨基酸单元的亚单元选自甘氨酸和/或L-氨基酸及D-氨基酸的混合物，例如精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸及缬氨酸，以及极性单元(包括连接至甘氨酸或D-氨基酸的PEG单元)。
在一些实施例中，氨基酸单元的亚单元选自甘氨酸和/或天然L-氨基酸，例如精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸及缬氨酸，以及至少一个极性单元，例如连接至甘氨酸或L-氨基酸的糖单元、或羧基单元或PEG单元。在一些实施例中，氨基酸单元的亚单元选自甘氨酸和/或D-氨基酸，例如精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸及缬氨酸，以及至少一个极性单元，例如连接至甘氨酸或D-氨基酸的糖单元、或羧基单元或PEG单元。
在一些实施例中，氨基酸单元的亚单元独立地具有以下中括号中所示的式：
其中R190为氢、甲基、异丙基、异丁基、第二丁基、苄基、对羟基苄基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(＝NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、苯基、环己基。
在一些实施例中，氨基酸单元的各亚单元独立地选自以下L-(天然)氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、色氨酸及缬氨酸；以及至少一个极性单元，例如连接至天然氨基酸的糖单元、或羧基单元或PEG单元。
在一些实施例中，氨基酸单元的亚单元不为半胱氨酸。在一些实施例中，氨基酸单元的亚单元不为脯氨酸。
在一些实施例中，氨基酸单元的各亚单元独立地选自以下这些天然氨基酸的D-异构体：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、色氨酸及缬氨酸；以及至少一个极性单元，例如连接至甘氨酸或L-氨基酸的糖单元、或羧基单元或PEG单元。
在一些实施例中，氨基酸单元的各亚单元独立地选自丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、鸟氨酸、青霉胺、β-丙氨酸、氨基烷酸、氨基炔酸、氨基烷二酸、氨基苯甲酸、氨基-杂环-烷酸、杂环-羧酸、瓜氨酸、他汀、二氨基烷酸及其衍生物；以及至少一个极性单元，例如连接至一个亚单元的糖单元、或羧基单元或PEG单元。
丙氨酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：丙氨酸(Ala)、N-烷基-丙氨酸、脱氢-丙氨酸、4-噻唑基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、β-(l-萘基)-丙氨酸、β-(2-萘基)-丙氨酸、α-氨基丁酸、β-氯-丙氨酸、β-氰基-丙氨酸、β-环戊基-丙氨酸、β-环己基-丙氨酸、β-碘-丙氨酸、β-环戊烯基-丙氨酸、β-tBu-丙氨酸、β-环丙基-丙氨酸、β-二苯基-丙氨酸、β-氟-丙氨酸、哌嗪环受保护的或未受保护的β-哌嗪基-丙氨酸、β-(2-喹啉基)-丙氨酸、β-(l,2,4-三唑-1-基)-丙氨酸、β-脲基-丙氨酸、H-β-(3-苯并噻吩基)-Ala-OH及H-β-(2-噻吩基)～Ala-OH。
精氨酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：精氨酸(Arg)、N-烷基-精氨酸、H-Arg(Me)-OH、H-Arg(NH2)-OH、H-Arg(NO2)-OH、H-Arg(Ac)2-OH、H-Arg(Me)2-OH(不对称的)、H-Arg(Me)2-OH(对称的)、2-氨基-4-(2'-羟基胍基)-丁酸(N-ω-羟基-正精氨酸)及高精氨酸。
天冬氨酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：天冬氨酸(Asp)、N-烷基-天冬氨酸及H-Asp(OtBu)-OH。
天冬酰胺及其衍生物的示例性实例包括但不限于：天冬酰胺(Asn)、N-烷基-天冬酰胺及异天冬酰胺(H-Asp-NH2)。
半胱氨酸(Cys)及其衍生物(不含游离的SH基团)的示例性实例包括但不限于：H-Cys(Acm)-OH、H-Cys(Trt)-OH、H-Cys(tBu)-OH、H-Cys(Bzl)-OH、H-Cys(Et)-OH、H-Cys(SO3H)-OH、H-Cys(氨基乙基)-OH、H-Cys(氨基甲酰基)-OH、H-Cys(苯基)-OH、H-Cys(Boc)-OH及H-Cys(羟基乙基)-OH。
组氨酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：组氨酸(His)、N-烷基-组氨酸、H-His(Boc)-OH、H-His(Bzl)-OH、H-HBs(I-Me)-OH、H-His(l-Tos)-OH、H-2,5-二碘-His-OH及H-His(3-Me)-OH。
甘氨酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：甘氨酸(GIy)、N-烷基-甘氨酸、H-炔丙基甘氨酸(CH)；α-氨基甘氨酸(受保护的或未受保护的)、β-环丙基-甘氨酸、环戊基-甘氨酸、环己基-甘氨酸、α-烯丙基甘氨酸、三级丁基-甘氨酸、新戊基甘氨酸及苯基甘氨酸。
谷氨酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：谷氨酸(GIu)、N-烷基-谷氨酸、H-GIu(OtBu)-OH、H-γ-羟基-Glu-OH、H-γ-亚甲基-Glu-OH、H-γ-羧基-Glu(OtBu)2-OH及焦谷氨酸。
谷氨酰胺及其衍生物的示例性实例包括但不限于：谷氨酰胺(GIn)、N-烷基-谷氨酰胺、异谷氨酰胺(H-GIu-NH2)、H-GIn(Trt)-OH及H-Gln(异丙基)-OH。
苯丙氨酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：苯丙氨酸(Phe)、N-烷基-苯丙氨酸、H-对氨基-Phe-OH、H-对氨基-Phe(Z)-OH、H-对溴-Phe-OH、H-对苄基-Phe-OH、H-p-tBu-Phe-OH、H-对羧基-Phe(OtBu)-OH、H-对羧基-Phe-OH、H-对氰基-Phe-OH、H-对氟-Phe-OH、H-3,4-二氯-Phe-OH、H-对碘-Phe-OH、H-对硝基-Phe-OH、H-对甲基-Phe-OH、H-五氟-Phe-OH、H-m-氟-Phe-OH、H-α-Me-Phe-OH、H-4-苯基-Phe-OH、高苯丙氨酸、氯-苯丙氨酸及β-高苯丙氨酸。
赖氨酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：赖氨酸(Lys)、N-烷基-赖氨酸、H-Lys(Boc)-OH、H-Lys(Ac)-OH、H-Lys(甲酰基)-OH、H-Lys(Me)2-OH、H-Lys(菸酰基)-OH、H-Lys(Me)3-OH、H-反式-4,5-脱氢-Lys-OH、H-Lys(Aloc)-OH、H-H-δ-羟基-Lys-OH、H-δ-羟基-Lys(Boc)-OH、H-Lys(乙酰氨基)-OH及H-Lys(异丙基)-OH。亮氨酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：亮氨酸(Leu)、N-烷基-亮氨酸、4,5-脱氢亮氨酸、H-α-Me-Leu-OH、高亮氨酸、正亮氨酸及t-亮氨酸。
甲硫氨酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：甲硫氨酸(Met)、H-Met(O)-OH及H-Met(O)2-OH。
丝氨酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：丝氨酸(Ser)、N-烷基-丝氨酸、H-Ser(Ac)-OH、H-Ser(tBu)-OH、H-Ser(Bzl)-OH、H-Ser(ρ-氯-Bzl)-OH、H-β-(3,4-二羟基苯基)-Ser-OH、H-β-(2-噻吩基)-Ser-OH、异丝氨酸、N-烷基-异丝氨酸及3-苯基异丝氨酸。
酪氨酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：酪氨酸(Tyr)、N-烷基-酪氨酸、H-3,5-二硝基-Tyr-OH、H-3-氨基-Tyr-OH、H-3,5-二溴-Tyr-OH、H-3,5-二碘-Tyr-OH、H-Tyr(Me)-OH、H-Tyr(tBu)-OH、H-Tyr(Boc)-OH、H-Tyr(Bzl)-OH、H-Tyr(Et)-OH、H-3-碘-Tyr-OH及H-3-硝基-Tyr-OH。
苏氨酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：苏氨酸(Thr)、N-烷基-苏氨酸、别位苏氨酸、H-Thr(Ac)-OH、H-Thr(tBu)-OH及H-Thr(Bzl)-OH。
异亮氨酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：异亮氨酸(He)、N-烷基-异亮氨酸、别位异亮氨酸及正亮氨酸。
色氨酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：色氨酸(Trp)、N-烷基-色氨酸、H-5-Me-Trp-OH、H-5-羟基-Trp-OH、H-4-Me-Trp-OH、H-α-Me-Trp-OH、H-Trp(Boc)-OH、H-Trp(甲酰基)-OH及H-Trp(均三甲苯基-2-磺酰基)-OH。
脯氨酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：脯氨酸(Pro)、N-烷基-脯氨酸、高脯氨酸、硫代脯氨酸、羟基脯氨酸(H-Hyp-OH)、H-Hyp(tBu)-OH、H-Hyp(Bzl)-OH、H-3,4-脱氢-Pro-OH、4-酮基-脯氨酸、α-Me-Pro-OH及H-4-氟-Pro-OH。
缬氨酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：缬氨酸(VaI)、N-烷基-缬氨酸、H-α-Me-Val-OH及正缬氨酸。
鸟氨酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：鸟氨酸、N-烷基-鸟氨酸、H-Orn(Boc)-OH、H-Om(Z)-OH、H-α-二氟-Me-Orn-OH(依氟鸟氨酸)及H-Orn(Aloc)-OH。
青霉胺及其衍生物的示例性实例包括但不限于：青霉胺、H-青霉胺(Acm)-OH(H-β,β-二甲基半胱氨酸(Acm)-OH)及N-烷基-青霉胺。
β-丙氨酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：β-丙氨酸、N-烷基-β-丙氨酸及脱氢-丙氨酸。
氨基烷酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：N-烷基氨基烷酸、氨基丁酸、4-(新戊基氧基磺酰基)-氨基丁酸、ε-氨基己酸、α-氨基异丁酸、哌嗪啶基乙酸、3-氨基丙酸、3-氨基-3-(3-吡啶基)-丙酸及5-氨基戊酸(氨基戊酸)。
氨基炔酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：N-烷基氨基炔酸、6-氨基-4-己炔酸、6-(Boc-氨基)-4-己炔酸。
氨基烷二酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：N-烷基氨基烷二酸、2-氨基己二酸、2-氨基庚二酸、2-氨基辛二酸(H-Asu-OH)。
氨基苯甲酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：N-烷基氨基苯甲酸、2-氨基苯甲酸、3-氨基苯甲酸及4-氨基苯甲酸。
氨基-杂环-烷酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：N-烷基氨基-杂环-烷酸、4-氨基-1-甲基-1H-咪唑-2-羧酸、4-氨基-l-甲基-lH-吡咯-2-羧酸、4-氨基-哌嗪啶-4-羧酸(H-Pip-OH；1-受保护的或未受保护的)、3-氨基-3-(3-吡啶基)-丙酸。
杂环-羧酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：氮杂环丁烷-2-羧酸、氮杂环丁烷-3-羧酸、哌嗪啶-4-羧酸及噻唑烷-4-羧酸。
瓜氨酸及其衍生物的示例性实例包括但不限于：瓜氨酸(cit)、N-烷基-瓜氨酸、硫代瓜氨酸、S-甲基-硫代瓜氨酸及高瓜氨酸。
他汀及其衍生物的示例性实例包括但不限于：他汀、N-烷基-他汀、环己基他汀及苯基他汀。
二氨基烷酸(Dab)及其衍生物的示例性实例包括但不限于：N-烷基-二氨基-烷酸、N,N-二烷基氨基-烷酸、α,γ-二氨基丁酸(H-Dab-OH)、H-Dab(Aloc)-OH、H-Dab(Boc)-OH、H-Dab(Z)-OH、α,β-二氨基丙酸及其侧链受保护的形式。
在一些实施例中，氨基酸单元可用封端基团终止，例如直链或支链的烷基基团、或聚乙烯链(1至30个亚单元)或PEG单元。
氨基酸单元的示例性实施例包括以下，其中SU为糖单元，PEG为PEG单元并且CU为羧基单元：
在一些实施例中，氨基酸单元包含SU。
在一些实施例中，氨基酸单元包含SU-Lys-SU。
在一些实施例中，氨基酸单元包含SU-Lys-SU-三级丁基。
在一些实施例中，氨基酸单元包含SU-Lys。
在一些实施例中，氨基酸单元包含Lys-SU。
在一些实施例中，氨基酸单元包含Lys-SU-Lys(PEG)。
在一些实施例中，氨基酸单元包括SU-Lys(PEG)-SU。
在一些实施例中，氨基酸单元包含SU-Glu-SU。
在一些实施例中，氨基酸单元包含Lys(PEG)。
在一些实施例中，氨基酸单元包含Lys(PEG)-Lys(PEG)。
在一些实施例中，氨基酸单元包含CU。
在一些实施例中，氨基酸单元包含CU-CU。
在一些实施例中，氨基酸单元存在并经由肽键连接至连接子亚单元L2的肽。在一些实施例中，此类氨基酸单元-连接子亚单元L2包含SU-Val-Cit～，其中波浪线表示与连接子亚单元L2的其余部分或与药物单元的键。在一些实施例中，此类氨基酸单元-连接子亚单元L2包含SU-Val-Ala～，其中波浪线表示与连接子亚单元L2的其余部分或与药物单元的键。在一些实施例中，此类氨基酸单元-连接子亚单元L2包含SU-Val-Lys～，其中波浪线表示与连接子亚单元L2的其余部分或与药物单元的键。在一些实施例中，此类氨基酸单元-连接子亚单元L2包含SU-Gly-Gly-Phe-Gly～，其中波浪线表示与连接子亚单元L2的其余部分或与药物单元的键。
在一些实施例中，此类氨基酸单元-连接子亚单元L2包含Val-Lys(PEG)～，其中波浪线表示与连接子亚单元L2的其余部分或与药物单元的键。在一些实施例中，此类氨基酸单元-连接子亚单元L2包含Val-Cit(PEG)～，其中波浪线表示与连接子亚单元L2的其余部分或与药物单元的键。在一些实施例中，此类氨基酸单元-连接子亚单元L2包含Lys(PEG)-Val-Cit～，其中波浪线表示与连接子亚单元L2的其余部分或与药物单元的键。在一些实施例中，此类氨基酸单元-连接子亚单元L2包含Lys(PEG)-Gly-Gly-Phe-Gly～，其中波浪线表示与连接子亚单元L2的其余部分或与药物单元的键。
在一些实施例中，此类氨基酸单元-连接子亚单元L2包含CU-Val-Cit～，其中波浪线表示与连接子亚单元L2的其余部分或与药物单元的键。在一些实施例中，此类氨基酸单元-连接子亚单元L2包含CU-Val-Lys～，其中波浪线表示与连接子亚单元L2的其余部分或与药物单元的键。在一些实施例中，此类氨基酸单元-连接子亚单元L2包含CU-Val-Ala～，其中波浪线表示与连接子亚单元L2的其余部分或与药物单元的键。在一些实施例中，此类氨基酸单元-连接子亚单元L2包含Val-CU～，其中波浪线表示与连接子亚单元L2的其余部分或与药物单元的键，并且其中CU包含赖氨酸残基。在一些实施例中，此类氨基酸单元-连接子亚单元L2包含CU-Gly-Gly-Phe-Gly～，其中波浪线表示与连接子亚单元L2的其余部分或与药物单元的键。
在一些实施例中，氨基酸单元存在并借由非肽键连接至连接子亚单元L2。在一些实施例中，氨基酸单元借由诸如C1-C10伸烷基、C2-C10伸烯基、C2-C10亚炔基或聚乙二醇的肽连接基团连接至连接子亚单元L2。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中L2或AA-L2具有以下结构中的一种：
其中氨基基团上的波浪线表示用于扩展单元的连接位点，并且药物单元连接至苄醇。
扩展单元(L1)
扩展单元(L1)能够将靶向单元连接至氨基酸单元(AA)或连接子亚单元L2。扩展单元具有可与靶向单元的官能基形成键的官能基。在连接子的一些实施例中，扩展单元连接至与连接子亚单元L2连接的氨基酸单元(亦即，当AA的s为1时；参见例如，式(I)至式(IV))。在一些实施例中，扩展单元连接至连接子亚单元L2(亦即，当AA的s为0时；参见例如，式(I)至式(IV))。在一些实施例中，在形成氨基酸单元-连接子亚单元L2之后，扩展单元连接至氨基酸单元-连接子亚单元L2。在一些实施例中，在形成氨基酸单元-连接子亚单元L2-药物单元之后，扩展单元连接至氨基酸单元-连接子亚单元L2-药物单元。在一些实施例中，在形成连接子亚单元L2-药物单元之后，扩展单元连接至连接子亚单元L2-药物单元。
用于连接至靶向单元的扩展单元的官能基可包括，例如，顺丁烯二酰亚胺、卤代乙酰胺、巯基、NHS酯、醛、酮、羰基、酰肼、羟胺、胺、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧基或芳酰肼。
可天然地或借由化学操作存在于靶向单元上的官能基包括但不限于巯基(-SH)、氨基、羟基、羧基、碳水化合物的异头羟基，以及羧基。在一个方面，靶向单元的官能基为巯基及氨基。巯基基团可借由还原靶向单元的分子内二硫键来产生。或者，可借由使用2-亚氨基硫杂环戊烷(Traut试剂)或其他产生巯基的试剂使靶向单元的赖氨酸部分的氨基基团反应来产生巯基基团。
在一些实施例中，扩展单元经由扩展单元的顺丁烯二酰亚胺基团与靶向单元的硫原子形成键。硫原子可衍生自例如靶向单元的巯基基团(例如，链间二硫键的硫醇基团)。该实施例的代表性扩展单元描述于以下式100及式101中，其中L为靶向单元，并且波浪线表示用于氨基酸单元或连接子亚单元L2的连接位点：
在一些实施例中，提供了连接子，其中扩展单元选自以下：
以及
其中波浪线表示扩展单元与氨基酸单元的连接位点。
在式100及式101中，R17为-C1-C10伸烷基-、-C1-C10杂伸烷基-、-C3-C8碳环-、-O-(C1-C8伸烷基)-、-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-(其中b为1至26)、-伸芳基-、-C1-C10伸烷基-伸芳基-、-伸芳基-C1-C10伸烷基-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8碳环)-、-(C3-C8碳环)-C1-C10伸烷基-、-C3-C8杂环-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8杂环)-、-(C3-C8杂环)-C1-C10伸烷基-、-C1-C10伸烷基-C(＝O)-、C1-C10杂伸烷基-C(＝O)-、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-C(＝O)-(其中b为1至26)、-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-C(＝O)-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-C(＝O)-(其中b为1至26)、-C3-C8碳环-C(＝O)-、-O-(C1-C8烷基)-C(＝O)-、-伸芳基-C(＝O)-、-C1-C10伸烷基-伸芳基-C(＝O)-、-伸芳基-C1-C10伸烷基-C(＝O)-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8碳环)-C(＝O)-、-(C3-C8碳环)-C1-C10伸烷基-C(＝O)-、-C3-C8杂环-C(＝O)-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8杂环)-C(＝O)-、-(C3-C8杂环)-C1-C10伸烷基-C(＝O)-、-C1-C10伸烷基-NH-、-C1-C10杂伸烷基-NH-、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-NH-(其中b为1至26)、-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-NH-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-NH-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(C(＝O))-NH-(CH2-O-CH2)b-C(＝O)-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(C(＝O))-NH-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-C(＝O)-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-NH-(C(＝O))-(CH2-O-CH2)b-NH-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-NH-(C(＝O))-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-NH-(其中b为1至26)、-C3-C8碳环-NH-、-O-(C1-C8烷基)-NH-、-伸芳基-NH-、-C1-C10伸烷基-伸芳基-NH-、-伸芳基-C1-C10伸烷基-NH-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8碳环)-NH-、-(C3-C8碳环)-C1-C10伸烷基-NH-、-C3-C8杂环-NH-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8杂环)-NH-、-(C3-C8杂环)-C1-C10伸烷基-NH-、-C1-C10伸烷基-S-、-C1-C10杂伸烷基-S-、-C3-C8碳环-S-、-O-(C1-C8烷基)-S-、-伸芳基-S-、-C1-C10伸烷基-伸芳基-S-、-伸芳基-C1-C10伸烷基-S-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8碳环)-S-、-(C3-C8碳环)-C1-C10伸烷基-S-、-C3-C8杂环-S-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8杂环)-S-或-(C3-C8杂环)-C1-C10伸烷基-S-。R17取代基中的任一个可为取代或未取代的(也被称为非取代的)。在一些方面，R17取代基为未取代的。在一些方面，R17取代基为视情况经取代的。在一些方面，R17基团(参见，例如，WO2013/173337)例如，-(CH2)xNH2、-(CH2)xNHRa及-(CH2)xNRa 2，其中x为1至4的整数，并且各Ra独立地选自C1-C6烷基及C1-C6卤代烷基，或者两个Ra基团与其所连接的氮组合以形成氮杂环丁烷基、吡咯啶基或哌嗪啶基基团。
在式100的一些实施例中，R17为-C1-C6伸烷基-C＝O)-。在一些实施例中，R17为-C1伸烷基-C(＝O)-。
在式100的一些实施例中，R17为-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-C(＝O)-(其中b为1至26)、-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-C(＝O)-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-C(＝O)-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-NH-(其中b为1至26)、-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-NH-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-NH-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(C(＝O))-NH-(CH2-O-CH2)b-C(＝O)-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(C(＝O))-NH-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-C(＝O)-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-NH-(C(＝O))-(CH2-O-CH2)b-NH-(其中b为1至26)或-C1-C8伸烷基-NH-(C(＝O))-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-NH-(其中b为1至26)。
在其他实施例中，扩展单元经由扩展单元的硫原子与靶向单元的硫原子之间的二硫键连接至靶向单元。该实施例的代表性扩展单元描述于以下式102中，其中L为靶向单元，波浪线表示用于氨基酸单元或连接子亚单元L2的连接位点，并且R17如以上对于式100及式101所描述。
在又一个实施例中，扩展单元的反应性基团含有可与靶向单元的一级氨基或二级氨基形成键的反应性位点。这些反应性位点的实例包括但不限于活性酯，例如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酸酐、酰氯、磺酰氯、异氰酸酯及异硫氰酸酯。该实施例的代表性扩展单元描述于式103、式104及式105中，其中L为靶向单元，波浪线表示用于氨基酸单元或连接子亚单元L2的连接位点，并且R17如以上对于式100及式101所描述。
在又一个实施例中，扩展单元的反应性基团含有对可存在于靶向单元上的修饰碳水化合物的(-CHO)基团有反应性的反应性位点。例如，碳水化合物可使用诸如高碘酸钠的试剂温和地氧化，并且氧化的碳水化合物的所得(-CHO)单元可与含有诸如酰肼、肟、伯胺或仲胺、肼、缩氨基硫脲、肼羧基或芳基酰肼的官能基的扩展单元(例如，由Kaneko，T等人，(1991)Bioconjugate Chem.2:133-41所描述的那些)缩合。该实施例的代表性扩展单元描述于以下式106、式107及式108中，其中L为靶向单元，波浪线表示用于氨基酸单元或连接子亚单元L2的连接位点，并且R17如以上对于式100及式101所描述。
在一些实施例中，期望延长扩展单元的长度。因此，扩展单元可包含附加组分。该实施例的代表性扩展单元描述于以下式109中，其中L为靶向单元，波浪线表示用于氨基酸单元或连接子亚单元L2的连接位点，并且R17如以上对于式100及式101所描述：
在该实施例的一些方面，R17为-C1-C5伸烷基-C(＝O)-。R13为-C1-C6伸烷基-、-(CH2-O-CH2)b-(其中b为1至26)、-C3-C8碳环-、-伸芳基-、-C1-C10杂伸烷基-、-C3-C8杂环-、-C1-C10伸烷基-伸芳基-、-伸芳基-C1-C10伸烷基-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8碳环)-、-(C3-C8碳环)-C1-C10伸烷基-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8杂环)-或-(C3-C8杂环)-C1-C10伸烷基-。在较佳实施例中，R13为-(CH2-O-CH2)b-，其中b为1至26。
靶向单元
在一些实施例中，连接子连接至靶向单元以形成靶向单元-连接子。在一些实施例中，连接子经由扩展单元(L1)连接至靶向单元且经由连接子亚单元L2连接至药物单元以形成偶联物。在一些实施例中，连接子经由扩展单元(L1)连接至靶向单元且经由连接子亚单元L2连接至药物单元以形成偶联物。靶向单元可为抗体、其抗原结合部分或非抗体靶向单元。非抗体靶向单元也可称为非抗体支架。
在一些实施例中，靶向单元特异性结合目标分子。如本文所用，“特异性结合”是指本文所描述的靶向单元(例如，抗体或其部分)结合目标的能力，其中KD为10 -5M(10000nM)或更少，例如，10 -6M、10 -7M、10 -8M、10 -9M、10 -10M、10 -11M、10 -12M或更少。特异性结合可能受到例如靶向单元的亲和力及亲合力以及目标多肽的浓度的影响。本领域普通技术人员可确定合适的条件，在该条件下，本文所描述的抗体、抗体结合部分及非抗体支架使用任何合适的方法(例如在合适的细胞结合测定中滴定结合剂)选择性地结合目标。特异性结合其目标的靶向单元不被不相似的竞争剂取代。在某些实施例中，当靶向单元优先识别其在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的目标时则被称为特异性结合其目标。
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子的免疫活性部分，亦即含有特异性结合目标抗原的抗原结合位点的分子。该术语通常是指由两个免疫球蛋白重链可变区及两个免疫球蛋白轻链可变区构成的抗体，包括全长抗体(具有重链及轻链恒定区)。
各重链通常由可变区(缩写为VH区)及恒定区构成。重链恒定区可包括三个域CH1、CH2及CH3以及视情况选用的第四域CH4。各条轻链由可变区(缩写为VL区)及恒定区构成。轻链恒定区为CL域。VH及VL区可进一步分成称为互补决定区(CDR)的高变区，并散布有称为框架区(FR)的保守区。因此，各VH及VL区包括三个CDR及四个FR，其按照以下顺序自N末端至C末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。这种结构为本领域技术人员公知的。
如本文所用，抗体的“抗原结合部分”是指具有抗体的VH和/或VL序列或抗体的CDR并且特异性结合目标抗原的抗体部分。抗原结合部分的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、二硫键连接的Fv、单域抗体(也称为VHH、VNAR、sdAb或奈米抗体)或双抗体(参见，例如，Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85，5879-5883(1988)及Bird等人，Science242，423-426(1988)，其借由引用并入本文)。如本文所用，术语Fab、F(ab')2及Fv是指以下：(i)FAb为由VL、VH、CL及CH1域构成的单价片段；(ii)F(ab')2为包含两个Fab片段的二价片段，该两个Fab片段在铰链区中借由二硫键彼此连接；及(iii)由VL及VH域构成的Fv。尽管Fv片段的两个域(亦即VL及VH)由单独的编码区编码，但其也可使用合成连接子彼此连接，例如，聚-G4S氨基酸序列(`(G4S)n`公开为SEQ ID NO：1，其中n＝1至5)，使得可将其制备成单个蛋白质链，其中VL及VH区域结合以形成单价分子(称为单链Fv或scFv)。术语抗体的“抗原结合部分”也包括这种单链抗体。其他形式的单链抗体如“双抗体”也同样包括在本文中。双抗体为二价双特异性抗体，其中VH及VL区在单个多肽链上表达，但用于连接VH及VL区的连接子太短，以致两个区不能在同一链上结合，从而迫使VH及VL区与不同链的互补区配对(分别为VL及VH)，并形成两个抗原结合位点(参见，例如，Holliger，R等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:64446448；Poljak，R.J等人，(1994)Structure2:1121-1123)。
单域抗体为包含单个单体可变抗体区的抗体的抗原结合部分。单域抗体可衍生自骆驼科动物的抗体重链的可变区(例如，奈米抗体或VHH部分)。此外，术语单域抗体包括自主人类重链可变域(AVH)或衍生自鲨鱼的VNAR部分(参见，例如，Hasler等人，Mol.Immunol.75:28-37，2016)。
用于产生单域抗体(例如，DAB或VHH)的技术为本领域已知的，例如Cossins等人(2006，Prot Express Purif 51:253-259)及Li等人(Immunol.Lett.188:89-95，2017)所公开。单域抗体可借由标准免疫技术自例如骆驼、羊驼或美洲驼获得。(参见，例如，Muyldermans等人，TIBS26:230-235，2001；Yau等人，J Immunol Methods 281:161-75，2003；及Maass等人，J Immunol Methods 324:13-25，2007。)VHH可具有有效的抗原结合能力，并且可与常规VH-VL对不能接近的新表位相互作用(参见，例如，Muyldermans等人，2001)。羊驼血清IgG仅含有约50％的骆驼科动物重链唯一IgG抗体(HCAb)(参见，例如，Maass等人，2007)。可用抗原免疫羊驼，并且可以分离与目标抗原结合并中和目标抗原的VHH(参见，例如，Maass等人，2007)。已经鉴定了扩增羊驼VHH编码序列的PCR引子，并且可用于构筑羊驼VHH噬菌体展示文库，其可用于借由本领域熟知的标准生物淘选技术分离抗体片段(参见，例如，Maass等人，2007)。
在一些实施例中，靶向单元为抗体或其抗原结合部分为双特异性或多特异性结合剂。双特异性及多特异性抗体包括以下：scFv1-ScFv2、ScFv12-Fc-scFv22、IgG-scFv、DVD-Ig、triomab/quadroma、二合一IgG、scFv2-Fc、TandAb及scFv-HSA-scFv。在一些实施例中，IgG-scFv为IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、svFc-(L)IgG、2scFV-IgG或IgG-2scFv。参见，例如，Brinkmann and Kontermann，MAbs 9(2):182-212(2017)；Wang等人，Antibodies，2019，8，43；Dong等人，2011，MAbs 3:273-88；Natsume等人，J.Biochem.140(3):359-368，2006；Cheal等人，Mol.Cancer Ther.13(7):1803-1812，2014；及Bates andPower，Antibodies，2019，8，28。
在一些实施例中，靶向单元为癌症相关抗原，例如CD19、CD20、CD30、CD33、CD38、CA125、MUC-1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD44表面黏附分子、间皮素(MLSN)、癌胚抗原(CEA)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFRvIII、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、MAGE-A1、IL-13R-a2、GD2、1p19q、ABL1、AKT1、ALK、APC、AR、ATM、BRAF、BRCA1、BRCA2、cKIT、cMET、CSF1R、CTNNB1、FGFR1、FGFR2、FLT3、GNA11、GNAQ、GNAS、HRAS、IDH1、IDH2、JAK2、KDR(VEGFR2)、KRAS、MGMT、MGMT-Me、MLH1、MPL、NOTCH1、NRAS、PDGFRA、Pgp、PIK3CA、PR、PTEN、RET、RRM1、SMO、SPARC、TLE3、TOP2A、TOPO1、TP53、TS、TUBB3、VHL、CDH1、ERBB4、FBXW7、HNF1A、JAK3、NPM1、PTPN11、RB1、SMAD4、SMARCB1、STK1、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、ROS1、ERCC1、5T4(TPBG)、B7-H3、CCR7、CD105、CD22、CD46、CD47、CD56、CD70、CD71、CD79b、CDH6、CLDN6、CLDN18.2、CLEC12A、DLL3、DR5、ERBB3(HER3)、EPCAM、FOLR1、IGF1R、IL2RA(CD25)、IL3RA、ITGB6、LIV-1、LRRC15、间皮素(MSLN)、NaPi2b(SLC34A2)、黏连蛋白-4、PTK7、ROR1、SEZ6、SLC44A4、SLITRK6、组织因子(TF)、TROP2或B7-H4。根据本发明，术语“癌症相关抗原”、“肿瘤抗原”、“肿瘤表达抗原”、“癌症抗原”、“癌症相关抗原”及“癌症表达抗原”为等同的，并且在本文中可互换使用。
在一些实施例中，靶向单元特异性结合目标，例如CD19、CD20、CD30、CD33、CD70、LIV-1或EGFRv3。
在一些实施例中，靶向单元为结合具有如Leuschner等人，US2022/0048951和/或Lerchen等人中所公开的序列的目标的抗体(或其片段)。单克隆抗体的非限制性实例包括利妥昔单抗曲妥单抗帕妥珠单抗贝伐单抗兰尼单抗西妥昔单抗阿仑单抗帕尼单抗替伊莫单抗托西莫单抗伊匹单抗、扎芦木单抗、达雷妥尤单抗、芬妥木单抗、雷莫芦单抗、加利昔单抗、法妥组单抗、奥瑞组单抗、奥法木单抗CD抗体2F2(HuMax-CD20)、7D8、IgM2C6、IgG1 2C6、11B8、B1、2H7、LT20、1FS或AT80(参见Teeling等人，J.Immunol.177:362-371(2006))、达利珠单抗及抗-LHRH受体抗体，例如克隆A9E4、F1G4、AT2G7、GNRH03、GNRHR2等，其尤其可与根据本发明的偶联物联用。
在一些实施例中，提供了FOLR1抗体、其抗原结合部分及其他结合剂以及这些抗体、抗原结合部分及其他结合剂的偶联物。还提供了使用FOLR1抗体、抗原结合部分及其他结合剂及其偶联物治疗癌症及其他疾病的方法。本文公开的发明部分地基于特异性结合FOLR1并表现出改善的性质的FOLR1抗体、其抗原结合部分及其他结合剂以及偶联物。FOLR1为用于治疗某些癌症的重要且有利的治疗目标。FOLR1抗体、其抗原结合部分、其他结合剂及其偶联物提供了基于在治疗FOLR1+癌症及其他疾病中使用这些抗体、抗原结合部分及相关结合剂及其偶联物的组合物及方法。
在一些实施例中，靶向单元为非抗体支架。在一些实施例中，靶向单元为非抗体蛋白质支架。此类非抗体支架包括，例如，亲合体(Affibodies)、Affilins、抗运载蛋白(Anticalins)、Atrimers、阿维默(Avimers)、双环肽、Cys-knots、DARPins、FN3支架(例如，阿德内丁蛋白(Adnectins)、Centyrins、Pronectins及Tn3)、Fynomers、Kunitz域及OBodies。(参见，例如，Vazquez-Lombardi等人，Drug Discovery Today 20(10):1271(2015)及其中引用的参考文献。)此类非抗体蛋白质支架包括，例如，亲合体、Affilins、抗运载蛋白、Atrimers、阿维默、双环肽、Cys-knots、DARPins、FN3支架(例如，阿德内丁蛋白、Centyrins、Pronectins及Tn3)、Fynomers、Kunitz域及OBodies。(参见，例如，Vazquez-Lombardi等人，Drug Discovery Today 20(10):1271(2015)及其中引用的参考文献。)非抗体支架可被认为属于两个结构类别，域大小的构筑体(6至20kDa的范围内)及限制性肽(2至4kDa的范围内)。域大小的非抗体支架包括，但不限于，亲合体、affilins、抗运载蛋白、atrimers、DARPins、FN3支架(例如阿德内丁蛋白及centyrins)、fynomers、Kunitz域、pronectins及OBodies。肽大小的非抗体支架包括，例如，Avimers、双环肽及半胱氨酸结。非抗体蛋白质支架可被认为属于两个结构类别，域大小的构筑体(6至20kDa的范围内)及限制性肽(2至4kDa的范围内)。域大小的非抗体支架包括，但不限于，亲合体、affilins、抗运载蛋白、atrimers、DARPins、FN3支架(例如阿德内丁蛋白及centyrins)、fynomers、Kunitz域、pronectins及OBodies。肽大小的非抗体支架包括，例如，Avimers、双环肽及半胱氨酸结。这些非抗体支架及其所基于的或其所衍生的基础蛋白质或肽综述于例如Simeon及Chen，Protein Cell 9(1)：3-14(2018)；Vazquez-Lombardi等人，Drug Discovery Today 20：1271-1283(2015)及Binz等人，Nature Biotechnol.23：1257-1268(2005)，其各自的内容借由引用整体并入本文。
使用非抗体支架的优点包括增加的亲和力、目标中和及稳定性。各种非抗体支架也可以克服抗体支架的一些侷限性，例如在组织渗透、较小的尺寸及热稳定性方面。一些非抗体支架也可以更容易构筑，例如，当需要双特异性构筑体时，不受潜在的轻链结合问题的阻碍。在非抗体支架上构筑构筑体的方法为本领域普通技术人员已知的。
因此，在一些实施例中，靶向单元可包括非抗体支架。因此，在一些实施例中，靶向单元可包含非抗体支架蛋白质。本领域技术人员将理解，在一些实施例中，靶向单元可包括例如阿德内丁蛋白(adnectin)支架或衍生自人第十纤连蛋白III型域(10Fn3)的部分；衍生自人脂质运载蛋白的抗运载蛋白支架(例如，如在例如WO2015/104406中所描述的那些)；衍生自低密度相关蛋白(LRP)和/或极低密度脂蛋白受体(VLDLR)的A域的avimer支架或蛋白片段；FYN酪氨酸激酶的SH3域的fynomer支架或部分；kunitz域支架或Kunitz型蛋白酶抑制剂的部分，例如人胰蛋白酶抑制剂、抑肽酶(牛胰胰蛋白酶抑制剂)、阿兹海默氏淀粉样前躯体蛋白及组织因子途径抑制剂；knottin支架(半胱氨酸结微蛋白)，例如基于来自大肠杆菌的胰蛋白酶抑制剂的支架；金黄色葡萄球菌蛋白A的亲合体支架或Z域的全部或部分；β-Hairpin类比支架；基于锚蛋白重复(AR)蛋白的设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)支架或人工蛋白支架；或衍生自或基于人转铁蛋白、人CTLA-4、人晶体蛋白及人泛素的任何支架。例如，人转铁蛋白对人转铁蛋白受体的结合位点可被多样化以产生转铁蛋白变体的多样化文库，其中一些转铁蛋白变体对不同抗原具有获得的亲和力。参见，例如，Ali等人，(1999)J.Biol.Chem.274：24066-24073。不涉及结合受体的人转铁蛋白部分保持不变，并且用作支架，如抗体的框架区，以提供变体结合位点。随后根据本文所描述的方法针对目标目标抗原筛选文库(如抗体文库一样)，以鉴定对目标抗原具有最佳选择性及亲和力的那些变体。参见，例如，Hey等人，(2005)TRENDS Biotechnol.23(10):514-522。
FOLR1靶向单元
在一些实施例中，靶向剂为特异性结合FOLR1的抗FOLR1抗体或其抗原结合部分。在一些实施例中，提供了此类抗体及其抗原结合部分的偶联物。包含特异性结合FOLR1的靶向剂的偶联物可用于癌症及其他疾病的治疗方法。当连接于本文所描述的连接物-药物时，与其他FOLR1偶联物相比，FOLR1抗体及其抗原结合部分的此类偶联物表现出改善的性质。FOLR1为用于治疗某些癌症的重要且有利的治疗目标。其FOLR1偶联物提供了基于在治疗FOLR1+癌症及其他疾病中使用此类偶联物的组合物及方法。
在一些实施例中，FOLR1靶向剂包括重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)，VH区包含位于重链可变区框架区中的互补决定区HCDR1、HCDR2及HCDR3，VL区包含位于轻链可变区框架区中的LCDR1、LCDR及LCDR3，VH及VL CDR具有选自以下列出的氨基酸序列组中的氨基酸序列：分别为SEQ ID NO:30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34及SEQ ID NO:35；以及分别为SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39及SEQ ID NO:40。在一些实施例中，VH及VL CDR具有分别在SEQ ID NO：30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34及SEQ ID NO:35中列出的氨基酸序列。在一些实施例中，框架区为人框架区。
在一些实施例中，VH及VL区具有选自以下列出的氨基酸序列对中的氨基酸序列：分别为SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7；分别为SEQ ID NO:8及SEQ ID NO：9；分别为SEQ IDNO:10及SEQ ID NO:11；分别为SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:13；分别为SEQ ID NO:14及SEQID NO:15；分别为SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17；分别为SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:19；分别为SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21；分别为SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:23；分别为SEQ IDNO:24及SEQ ID NO:25；分别为SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27；以及分别为SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:29；其中重链及轻链框架区视情况经由框架区中的1至8个氨基酸取代、缺失或插入进行修饰。
在一些实施例中，VH及VL区具有选自以下列出的氨基酸序列对中的氨基酸序列：分别为SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7；分别为SEQ ID NO:8及SEQ ID NO：9；分别为SEQ IDNO:10及SEQ ID NO:11；分别为SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:13；分别为SEQ ID NO:14及SEQID NO:15；分别为SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17；分别为SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:19；分别为SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21；分别为SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:23；分别为SEQ IDNO:24及SEQ ID NO:25；分别为SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27；以及分别为SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:29。
在一些实施例中，VH及VL区具有选自以下列出的氨基酸序列对中的氨基酸序列：分别为SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9；分别为SEQ ID NO:12及SEQ ID NO：13；分别为SEQ IDNO:14及SEQ ID NO:15；分别为SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17；分别为SEQ ID NO:20及SEQID NO:21；分别为SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:23；分别为SEQ ID NO:24及SEQ ID NO:25；以及分别为SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27。
在一些实施例中，VH及VL区具有选自以下列出的氨基酸序列对中的氨基酸序列：分别为SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9；分别为SEQ ID NO:12及SEQ ID NO：13；以及分别为SEQID NO:26及SEQ ID NO:27。在一些实施例中，VH及VL区具有分别在SEQ ID NO:8及SEQ IDNO:9中列出的氨基酸序列。在一些实施例中，VH及VL区具有分别在SEQ ID NO:12及SEQ IDNO:13中列出的氨基酸序列。在一些实施例中，VH及VL区具有分别在SEQ ID NO:26及SEQ IDNO:27中列出的氨基酸序列。
在一些实施例中，重链可变区也包含重链恒定区。在一些实施例中，重链恒定区为IgG同种型。在一些实施例中，重链恒定区为IgG1恒定区。在一些实施例中，IgG1恒定区具有在SEQ ID NO：41中列出的氨基酸序列。在一些实施例中，重链恒定区为IgG4恒定区。在一些实施例中，重链恒定区也至少包含降低对人FcγRIII的结合亲和力的氨基酸修饰。在一些实施例中，轻链可变区也包含轻链恒定区。在一些实施例中，轻链恒定区为κ同种型。在一些实施例中，轻链恒定区具有在SEQ ID NO:42中列出的氨基酸序列。
在一些实施例中，FOLR1偶联物为单特异性的。在一些实施例中，FOLR1偶联物为二价的。在一些实施例中，FOLR1偶联物为双特异性的。
在一些实施例中，FOLR1偶联物包括作为抗体的靶向单元，该抗体包括重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)，VH区包含位于重链可变区框架区中的互补决定区HCDR1、HCDR2及HCDR3，VL区包含位于轻链可变区框架区中的LCDR1、LCDR及LCDR3，VH及VL CDR具有选自以下列出的氨基酸序列组中的氨基酸序列：(a)分别为SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34及SEQ ID No:35；以及(b)分别为SEQ ID NO:36、SEQID NO：31、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39及SEQ ID NO:40。在某些实施例中，VH及VL区具有选自以下列出的氨基酸序列对中的氨基酸序列：分别为SEQ ID NO:26及SEQID NO:27；以及其中重链及轻链框架区视情况用框架区中的1个至8个氨基酸取代、缺失或插入修饰。在具体实施例中，靶向单元为抗体F131(VH SEQ ID NO：26及VL SEQ ID NO：27)。在具体实施例中，抗体为F131，并且药物-连接子为LD038。
恒定区
在一些实施例中，靶向单元，例如抗体或其抗原结合部分或其他靶向单元具有抗体恒定区。在一些实施例中，恒定区为完全人类恒定区。在一些实施例中，恒定区为人源化恒定区。在一些实施例中，恒定区为非人类恒定区。免疫球蛋白恒定区是指重链或轻链恒定区。人类重链及轻链恒定区氨基酸序列为本领域已知的。恒定区可为任何合适的类型，其可选自免疫球蛋白、IgA、IgD、IgE、IgG及IgM的类别。几种免疫球蛋白类可进一步分成同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgA1及IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区(Fc)可分别为α、δ、ε、γ及μ。轻链可为κ(或κ)及λ(或λ)中的一种。
在一些实施例中，恒定区可具有IgG同种型。在一些实施例中，恒定区可具有IgG1同种型。在一些实施例中，恒定区可具有IgG2同种型。在一些实施例中，恒定区可具有IgG3同种型。在一些实施例中，恒定区可具有IgG4同种型。在一些实施例中，恒定区可具有包含来自两种或更多种同种型的恒定区的杂合同种型。在一些实施例中，免疫球蛋白恒定区可为IgG1或IgG4恒定区。在一些实施例中，恒定区具有IgG1同种型并且具有在SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。在一些实施例中，恒定区具有κ同种型并且具有在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列。
此外，包含抗体或其抗原结合部分或非抗体支架的靶向单元可为借由抗体或抗原结合部分与一种或多种其他蛋白或肽共价或非共价结合而形成的较大分子的一部分。与此类靶向单元相关的为使用例如链霉亲和素核心区域来制备四聚体scFv分子(Kipriyanov，S.M.等人，(1995)，Human Antibodies and Hybridomas6:93-101)以及使用半胱氨酸残基、标志物肽及C-末端多聚组氨酸肽(例如六组氨酸标签)(“六组氨酸标签”公开为SEQ ID NO：4)来制备二价且生物素化的scFv分子(Kipriyanov，S.M.等人，(1994)Mol.Immunol.31:10471058)。
Fc域修饰以改变效应子功能
在一些实施例中，靶向单元(例如抗体或其抗原结合部分或非抗体支架)的Fc区或Fc域基本上不结合选自FcyRI(CD64)、FcyRIIA(CD32a)、FcyRIIB(CD32b)、FcyRIIIA(CD16a)及FcyRIIIB(CD16b)中的至少一种Fc受体。在一些实施例中，Fc区或域基本上不与选自FcyRI(CD64)、FcyRIIA(CD32a)、FcyRIIB(CD32b)、FcyRIIIA(CD16a)及FcyRIIIB(CD16b)中的任一种Fc受体结合。如本文所用，“基本上不结合”是指与所选Fcγ受体结合弱至不结合。在一些实施例中，“基本上不结合”是指对Fcγ受体的结合亲和力降低(亦即，Kd增加)至少1000倍。在一些实施例中，Fc域或区为Fc无效的。如本文所用，“Fc无效的”是指Fc区或Fc域表现出与任一种Fcγ受体结合弱至不结合。在一些实施例中，Fc无效域或区表现出对Fcγ受体的结合亲和力降低(亦即，Kd增加)至少1000倍。
在一些实施例中，Fc域具有降低的或基本上无效应子功能活性。如本文所用，“效应子功能活性”是指抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施例中，与野生型Fc域相比，Fc域表现出降低的ADCC、ADCP或CDC活性。在一些实施例中，与野生型Fc域相比，Fc域表现出ADCC、ADCP及CDC的降低。在一些实施例中，Fc域基本上不显示效应子功能(亦即，刺激或影响ADCC、ADCP或CDC的能力)。如本文所用，“基本上无效应子功能”是指与野生型或参比Fc域相比，效应子功能活性降低至少1000倍。
在一些实施例中，Fc域具有降低的或无ADCC活性。如本文所用，降低的或无ADCC活性是指Fc域的ADCC活性降低至少10、至少20、至少30、至少50、至少100或至少500倍。
在一些实施例中，Fc域具有降低的或无CDC活性。如本文所用，降低的或无CDC活性是指Fc域的CDC活性降低至少10、至少20、至少30、至少50、至少100或至少500倍。
可进行体外和/或体内细胞毒性测定以证实ADCC和/或CDC活性的降低/耗尽。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏Fcγ受体结合(因此可能缺乏ADCC活性)。介导ADCC的原代细胞，NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核球表达FcγRI、FcγRII及FcγRIII。在RavetcH及Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页的表3中总结了造血细胞上的FCR表达。用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见，例如，Hellstrom，I等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))及Hellstrom，I等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337(参见Bruggemann，M.等人，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。替代地，可使用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.Mountain View，Calif；及CytoTox 96TM非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，Wis.)。用于这种测定的有用的效应细胞包括外周血单核球(PBMC)及自然杀伤(NK)细胞。替代地或另外地，目标分子的ADCC活性可在体内评估，例如在动物模型中，如Clynes等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)所公开。
还可进行C1q结合测定以证实抗体或Fc域或区不能结合C1q，因此缺乏CDC活性或具有降低的CDC活性。参见，例如，WO2006/029879及WO2005/100402中的C1q及C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可进行CDC测定(参见，例如，Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg，M.S.等人，Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg，M.S.and M.J.Glennie，Blood 103：2738-2743(2004))。
在一些实施例中，Fc域具有降低的或无ADCP活性。如本文所用，降低的或无ADCP活性是指Fc域的ADCP活性降低至少10、至少20、至少30、至少50、至少100或至少500倍。
还可进行ADCP结合测定以证实抗体或Fc域或区缺乏ADCP活性或具有降低的ADCP活性。参见，例如，US20190079077及US20190048078以及其中公开的参考文献。
具有降低的效应子功能活性的靶向单元，例如抗体或其抗原结合部分或非抗体支架，包括具有一个或多个Fc区残基(例如，根据Kabat的EU编号的238、265、269、270、297、327及329)的取代的那些(参见，例如，美国专利号6,737,056)。根据Kabat的EU编号，此类Fc突变体包括在两个或更多个氨基酸位置265、269、270、297及327处具有经取代的Fc突变体，包括将残基265及297取代为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(参见美国专利号7,332,581)。与FcR结合减弱的某些抗体变体也是已知的。(参见，例如，美国专利号6,737,056；WO2004/056312及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001).)可制备与FcR结合减弱的靶向单元(例如抗体或其抗原结合部分或非抗体支架)，其含有此类氨基酸修饰。
在一些实施例中，靶向单元(例如抗体或其抗原结合部分或非抗体支架)包含具有一个或多个氨基酸取代的Fc域或区，该氨基酸取代减少FcγR结合，例如在Fc区的位置234及235处的取代(残基的EU编号)。在一些实施例中，根据Kabat的EU编号，取代为L234A及L235A(LALA)。在一些实施例中，根据Kabat的EU编号，Fc域在衍生自人类IgG1 Fc区的Fc区中包含D265A和/或P329G。在一些实施例中，根据Kabat的EU编号，取代为衍生自人类IgG1 Fc区的Fc区中的L234A、L235A及P329G(LALA-PG)。(参见，例如，WO2012/130831)。在一些实施例中，根据Kabat的EU编号，取代在衍生自人类IgG1 Fc区的Fc区中的L234A、L235A及D265A(LALA-DA)。
在一些实施例中，在Fc区中进行改变，导致改变(亦即，减少)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利号6,194,551、WO99/51642及Idusogie等人J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所描述。
制备抗体及抗原结合部分以及其他靶向单元的方法
在各种实施例中，靶向单位如抗体及其抗原结合部分可在人类、鼠或其他动物来源的细胞系中产生。重组DNA表达可用于产生抗体及其抗原结合部分。这允许在所选择的宿主物种中产生抗体以及一系列抗原结合部分(包括融合蛋白)。在细菌、酵母、转基因动物及鸡蛋中产生抗体及其抗原结合部分也是基于细胞的生产系统的替代方案。转基因动物的主要优点在于来自可再生资源的潜在高产率。
可借由本领域已知的多种方法制备编码靶向单元(例如抗体或其抗原结合部分)的氨基酸序列的核酸分子。这些方法包括但不限于制备编码抗体或抗原结合部分的合成核苷酸序列。此外，寡核苷酸介导的(或定点的)诱变、PCR介导的诱变及盒式诱变可用于制备编码抗体或抗原结合部分的核苷酸序列。如本文所描述，编码至少一种抗体或其抗原结合部分或其多肽的核酸序列可根据常规技术与载体DNA重组，该常规技术例如钝端或错开端用于连接，限制性酶消化以提供适当的末端，酌情填充内聚端，碱性磷酸酶处理以避免不希望的连接，以及用适当的连接酶连接或本领域已知的其他技术。用于这种操作的技术例如由Maniatis等人，Molecular Cloning，Lab.Manual(Cold Spring Harbor Lab.Press，NY，1982and 1989),及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley&Sons)，1987-1993公开的，并且可用于构筑编码抗体或其抗原结合部分或其VH或VL多肽的核酸序列及载体。
如本文所用，术语“核酸”或“核酸序列”或“多核苷酸序列”或“核苷酸”是指结合了核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物的单元的聚合分子。核酸可为单链或双链的。单链核酸可为变性双链DNA的一条链核酸。在一些实施例中，核酸可为cDNA，例如缺乏内含子的核酸。
若核酸分子(例如DNA)包含含有转录及翻译调节信息的核苷酸序列，并且这种序列与编码多肽的核苷酸序列“可操作地连接”，则认为其“能够表达”多肽。可操作的连接为其中调节DNA序列及寻求表达的DNA序列(例如，抗体或其抗原结合部分)以允许可回收量的多肽或抗原结合部分的基因表达的方式连接的连接。基因表达所需的调节区的精确性质可以因生物体而异，这在类似技术中为众所周知的。参见，例如，Sambrook等人，1989；Ausubel等人，1987-1993。
因此，靶向单元(例如，抗体或其抗原结合部分)的表达可在原核或真核细胞中发生。合适的宿主包括细菌或真核宿主，包括体内或原位的酵母、昆虫、真菌、鸟及哺乳动物细胞，或哺乳动物、昆虫、鸟或酵母来源的宿主细胞。哺乳动物细胞或组织可为人类、灵长类动物、仓鼠、兔、啮齿类动物、牛、猪、绵羊、马、山羊、狗或猫来源的，但也可使用其他哺乳动物细胞。此外，借由使用例如酵母泛素水解酶系统，可以实现泛素-跨膜多肽融合蛋白的体内合成。如此产生的融合蛋白可在体内加工或纯化及在体外加工，允许合成如本文所描述的具有特定氨基末端序列的抗体或其抗原结合部分。此外，可以避免与在直接酵母(或细菌)表达中保留起始密码子衍生的甲硫氨酸残基相关的问题。(参见，例如，Sabin等人，7Bio/Technol.705(1989)；Miller等人，7Bio/Technol.698(1989)。)当酵母在富含葡萄糖的培养基中生长时，可利用包含来自编码大量产生的糖酵解酶的活性表达基因的启动子及终止元件的一系列酵母基因表达系统中的任一个来获得重组抗体或其抗原结合部分。已知的糖酵解基因也可以提供非常有效的转录控制信号。例如，可利用磷酸甘油酸激酶基因的启动子及终止子信号。
在昆虫中产生抗体或抗原结合部分可借由，例如，用本领域普通技术人员已知的方法用工程化以表达多肽的杆状病毒感染昆虫宿主来实现。参见Ausubel等人，1987-1993。
在一些实施例中，将引入的核酸序列(编码抗体或其抗原结合部分或其多肽)结合至能够在受体宿主细胞中自主复制的质粒或病毒载体中。为此目的可使用多种载体中的任一种，并且为本领域普通技术人员已知的且可获得的。参见，例如，Ausubel等人，1987-1993。选择特定质粒或病毒载体的重要因素包括：含有载体的受体细胞可以自不含载体的那些受体细胞中被识别及选择的容易程度；特定宿主中所需的载体拷贝数；以及是否需要能够在不同物种的宿主细胞之间“穿梭”载体。
本领域已知的示例性原核载体包括质粒，例如能够在大肠杆菌中复制的质粒。用于表达编码抗体或其抗原结合部分的DNA的其他基因表达元件包括但不限于(a)病毒转录启动子及其增强子元件，例如SV40早期启动子(Okayama等人，3Mol.Cell.Biol.280(1983))、劳斯肉瘤病毒LTR(Gorman等人，79PNAS 6777(1982))及莫洛尼白血病病毒LTR(Grosschedl等人，41Cell 885(1985))；(b)剪接区及多聚腺苷酸化位点，例如源自SV40晚期区的那些(Okayarea等人，1983)，以及(c)多聚腺苷酸化位点，例如SV40(Okayama等人，1983)。编码免疫球蛋白的DNA基因可以如下文Liu等人类及Weidle等人，51Gene 21(1987)所描述的那样来表达，使用SV40早期启动子及其增强子、小鼠免疫球蛋白H链启动子增强子、SV40晚期区mRNA剪接、兔S-珠蛋白插入序列、免疫球蛋白及兔S-珠蛋白聚腺苷酸化位点及SV40聚腺苷酸化元件作为表达元件。
对于编码免疫球蛋白的核苷酸序列，转录启动子可为例如人类巨细胞病毒，启动子增强子可为巨细胞病毒及小鼠/人类免疫球蛋白。
在一些实施例中，为了在啮齿动物细胞中表达DNA编码区，转录启动子可为病毒LTR序列，转录启动子增强子可为小鼠免疫球蛋白重链增强子及病毒LTR增强子的一或两者，以及聚腺苷酸化及转录终止区。在其他实施例中，编码其他蛋白质的DNA序列与上述表达元件组合以在哺乳动物细胞中实现蛋白质的表达。
各编码区或基因融合体被组装或插入在表达载体中。随后用编码抗体或抗体多肽或其抗原结合部分的核苷酸单独转染能够表达可变区或其抗原结合部分的受体细胞，或者用编码VH及VL链编码区的多核苷酸共转染。在允许结合的编码区表达的条件下培养转染的受体细胞，并自培养物中回收表达的抗体链或完整的抗体或抗原结合部分。
在一些实施例中，将含有编码抗体或其抗原结合部分的编码区的核酸组装在单独的表达载体中，随后用于共转染受体宿主细胞。各载体可含有一个或多个可选择基因。例如，在一些实施例中，使用两个可选择基因，设计用于在细菌系统中选择的第一可选择基因及设计用于在真核系统中选择的第二可选择基因，其中各载体具有一组编码区。该策略导致首先指导细菌系统中核苷酸序列的产生并允许扩增的载体。随后将在细菌宿主中如此产生及扩增的DNA载体用于共转染真核细胞，并允许选择携带所需转染核酸(例如，含有抗体重链及轻链)的共转染细胞。用于细菌系统的可选择基因的非限制性实例为赋予氨苄青霉素抗性的基因及赋予氯霉素抗性的基因。用于真核转染子的可选择基因包括黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(命名为gpt)及来自Tn5的磷酸转移酶基因(命名为neo)。替代地，编码VH及VL链的融合核苷酸序列可以组装在同一表达载体上。
为了转染表达载体及产生抗体或其抗原结合部分，受体细胞系可为中国仓鼠卵巢细胞系(例如，DG44)或骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞可以合成、组装及分泌由转染的免疫球蛋白基因编码的免疫球蛋白，并且具有免疫球蛋白糖基化的机制。例如，在一些实施例中，受体细胞为产生重组Ig的骨髓瘤细胞SP2/0。Sp2/0细胞仅产生由转染基因编码的免疫球蛋白。骨髓瘤细胞可在培养物或小鼠的腹膜腔中生长，其中分泌的免疫球蛋白可以自腹水中获得。
编码抗体或其抗原结合部分的表达载体可借由多种合适的方法中的任一种引入至合适的宿主细胞中，包括生物化学方法如转化、转染、原生质粒融合、磷酸钙沉淀及应用聚阳离子如二乙基氨基乙基(DEAE)葡聚糖，以及机械方法如电穿孔、直接显微注射及微粒轰击，如本领域普通技术人员已知的。(参见，例如，Johnston等人，240Science 1538(1988))。
酵母为免疫球蛋白重链及轻链的产生提供了优于细菌的某些优点。酵母进行翻译后肽修饰，包括糖基化。存在许多利用强启动子序列及高拷贝数质粒的重组DNA策略，其可用于在酵母中生产所需的蛋白质。酵母识别克隆的哺乳动物基因产物的前导序列并分泌带有前导序列的多肽(亦即，前多肽)。参见，例如，Hitzman等人，11th Intl.Conf.Yeast，Genetics&Molec.Biol.(Montpelier，France，1982)。
酵母基因表达系统可以常规地评价抗体及组装的抗体及其抗原结合部分的生产、分泌及稳定性的含量。当酵母在富含葡萄糖的培养基中生长时，可利用包含来自编码大量产生的糖酵解酶的活性表达基因的启动子及终止元件的各种酵母基因表达系统。已知的糖酵解基因也可以提供非常有效的转录控制信号。例如，可利用磷酸甘油酸激酶(PGK)基因的启动子及终止子信号。另一个实例为翻译延伸因子1α启动子，例如来自中国仓鼠细胞的启动子。可以采用多种方法来评价用于在酵母中表达免疫球蛋白的最佳表达质粒。参见IIDNACloning 45，(Glover编辑IRL Press，1985)及例如美国公开号US2006/0270045A1。
细菌菌株也可用作产生如本文所描述的抗体分子或其抗原结合部分的宿主。可使用诸如大肠杆菌W3110的大肠杆菌K12菌株、芽孢杆菌属、诸如鼠伤寒沙门氏菌或黏质沙雷氏菌的肠细菌，以及各种假单胞菌属。含有来自与宿主细胞相容的物种的复制子及控制序列的质粒载体与这些细菌宿主结合使用。载体携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的特定基因。可以采用多种方法来评价表达质粒以在细菌中产生抗体及其抗原结合部分(参见Glover，1985；Ausubel，1987，1993；Sambrook，1989；Colligan，1992-1996)。
宿主哺乳动物细胞可在体外或体内生长。哺乳动物细胞对免疫球蛋白分子提供翻译后修饰，包括前导肽移除、VH及VL链的折叠及组装、抗体分子的糖基化以及功能性抗体和/或其抗原结合部分的分泌。
除了上述淋巴来源的细胞之外，可用作产生抗体蛋白的宿主的哺乳动物细胞包括纤维母细胞来源的细胞，如Vero或CHO-K1细胞。可用于表达免疫球蛋白多肽的示例性真核细胞包括但不限于COS细胞，包括COS7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO--S及DG44细胞；PERC6TM细胞(Crucell)；及NSO细胞。在一些实施例中，基于特定真核宿主细胞对重链和/或轻链进行所需的翻译后修饰的能力来选择特定的真核宿主细胞。例如，在一些实施例中，CHO细胞产生的多肽具有比293细胞中产生的相同多肽更高含量的唾液酸化。
在一些实施例中，一种或多种抗体或其抗原结合部分可以根据任何合适的方法在已经用一种或多种编码多肽的核酸分子工程化或转染的动物体内产生。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合部分在无细胞系统中产生。非限制性的示例性无细胞系统描述于，例如，Sitaraman等人，Methods Mol.Biol.498：229-44(2009)；Spirin，Trends Biotechnol.22：538-45(2004)；及Endo等人，Biotechnol.Adv.21：695-713(2003)。
许多载体系统可用于在哺乳动物细胞中表达VH及VL链(参见Glover，1985)。可以遵循各种方法获得完整的抗体。如上所描述，可在相同细胞中共表达VH及VL链以及视情况选用的相关恒定区，以实现VH及VL链在细胞内结合及连接成完整的四聚体H2L2抗体或其抗原结合部分。共表达可借由在相同的宿主中使用相同或不同的质粒来进行。可将编码VH及VL链的核酸或其抗原结合部分置于同一质粒中，随后转染至细胞中，从而直接选择表达两条链的细胞。替代地，可首先用编码一条链，例如VL链的质粒转染细胞，随后用含有第二可选择标志物的VH链质粒转染所得细胞系。借由任一途径产生抗体或其抗原结合部分的细胞系可用编码额外拷贝的肽、VH、VL或VH加VL链的质粒连同额外的可选择标志物一起转染，以产生具有增强特性的细胞系，该特性例如组装的抗体或其抗原结合部分的更高的产量或转染的细胞系的增强的稳定性。
另外，植物已经作为基于微生物或动物细胞的大规模培养的重组抗体生产的方便、安全且经济的替代表达系统而出现。抗体或其抗原结合部分可在植物细胞培养物或常规种植的植物中表达。植物中的表达可为系统性的、限于亚细胞质粒或限于种子(胚乳)。参见，例如，美国专利公开号2003/0167531；美国专利号6,080,560；美国专利号6,512,162；及WO0129242。几种植物来源的抗体已经达到了开发的进阶阶段，包括临床试验(参见，例如，Biolex，N.C.)。
对于完整抗体，抗体的可变区(VH及VL区)通常与免疫球蛋白恒定区(Fc)或域(通常为人类免疫球蛋白的)的至少一部分连接。人类恒定区DNA序列可以按照众所周知的方法自多种人细胞，如永生化的B细胞中分离(WO87/02671)。抗体可包含轻链及重链恒定区二者。重链恒定区可包括CH1、铰链区、CH2、CH3，以及视情况选用的CH4区。在一些实施例中，CH2域可以缺失或省略。
描述用于生产单链抗体的技术(参见，例如，美国专利号4,946,778；Bird，Science242:423-42(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；及Ward等人，Nature 334:544-54(1989)；其借由引用整体并入本文)可以适于产生特异性结合目标抗原的单链抗体。单链抗体借由经由氨基酸桥连接Fv区的重链及轻链可变区形成，产生单链多肽。还可使用在大肠杆菌中组装功能性Fv部分的技术(参见，例如Skerra等人，Science 242:1038-1041(1988)；其借由引用整体并入本文)。
在一些实施例中，抗原结合部分包含一个或多个scFv。scFv可为，例如，抗体的重链(VH)及轻链(VL)可变区的可变区的融合蛋白，其与10至约25个氨基酸的短连接子肽连接。连接子通常富含甘氨酸以获得灵活性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性，并且可将VH的N-末端与VL的C-末端连接，反之亦然。尽管移除了恒定区并且引入了连接子，但该蛋白质仍保留了原始抗体的特异性。scFv抗体例如描述于Houston，J.S.，Methods inEnzymol.203(1991)46-96。用于制备scFv分子及设计合适的肽连接子的方法描述于，例如，美国专利号4,704,692；美国专利号4,946,778；Raag及Whitlow，FASEB 9:73-80(1995)以及Bird及Walker，TIBTECH，9：132-137(1991)。ScFv-Fc已经由Sokolowska-Wedzina等人，Mol.Cancer Res.15(8):1040-1050，2017描述。
在一些实施例中，抗原结合部分为单域抗体，为由单一单体可变抗体域组成的抗体部分。单域抗体可衍生自骆驼科动物的抗体重链的可变域(例如，奈米抗体或VHH部分)。此外，单域抗体可为自主人类重链可变域(AVH)或衍生自鲨鱼的VNAR部分(参见，例如，Hasler等人，Mol.Immunol.75:28-37，2016)。
用于产生单域抗体(DAB或VHH)的技术为本领域已知的，例如Cossins等人(2006，Prot Express Purif51:253-259)及Li等人(Immunol.Lett.188：89-95，2017)所公开。单域抗体可借由标准免疫技术自例如骆驼、羊驼或美洲驼获得。(参见，例如，Muyldermans等人，TIBS26:230-235，2001；Yau等人，J Immunol Methods281:161-75，2003；及Maass等人，JImmunol Methods 324:13-25，2007。)VHH可具有有效的抗原结合能力，并且可与常规VH-VL对不能接近的表位相互作用(参见，例如，Muyldermans等人，2001)。羊驼血清IgG仅含有约50％的骆驼科动物重链唯一IgG抗体(HCAb)(参见，例如，Maass等人，2007)。可用抗原免疫羊驼，并且可以分离与目标抗原结合并中和目标抗原的VHH(参见，例如，Maass等人，2007)。已经鉴定了扩增羊驼VHH编码序列的PCR引子，并且可用于构筑羊驼VHH噬菌体展示文库，其可用于借由本领域熟知的标准生物淘选技术分离抗体片段(参见，例如，Maass等人，2007)。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见，例如，Milstein及Cuello，Nature 305：537(1983))，WO93/08829及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))以及“knob-in-hole”工程化(参见，例如，美国专利号5,731,168；Carter(2001)，J Immunol Methods 248，7-15)。多特异性抗体也可借由以下方法制备：工程化用于制备抗体Fc-异二聚体分子的静电转向效应(参见，例如，WO2009/089004A1)；两种或更多种抗体或其抗原结合部分的交联(参见，例如，美国专利号4,676,980及Brennan等人，Science，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等人，J.Immunol.，148(5):1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术制备双特异性抗体部分(参见，例如，Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(scFv)二聚体(参见，例如，Gruber等人，J.Immunol.，152:5368(1994))；以及制备三特异性抗体，如例如Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)所描述。
具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体”，也可为靶向单元(参见，例如，US2006/0025576A1)。
在一些实施例中，靶向单元包含与Fc域的两个亚单元中的一者或另一个融合的不同的抗原结合位点；因此，Fc域的两个亚单位可包含在两个不同的多肽链中。这些多肽的重组共表达及随后的二聚化导致两种多肽的几种可能的组合。为了提高重组生产中双特异性分子的产率及纯度，因此在靶向单元的Fc域中引入促进所需多肽结合的修饰为有利的。
通常，该方法包括用带电荷的氨基酸残基替换两个Fc域的界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同源二聚体形成变得静电不利，但异源二聚体静电有利。
在一些实施例中，靶向单元为“双特异性T细胞接合子”或BiTE(参见，例如，WO2004/106381、WO2005/061547、WO2007/042261及WO2008/119567)。该方法利用排列在单个多肽上的两个抗体可变域。例如，单条多肽链可包括两条单链Fv(scFv)部分，各条单链Fv(scFv)部分具有由多肽连接子分开的可变重链(VH)及可变轻链(VL)域，该多肽连接子的长度足以允许两个域之间的分子内结合。该单个多肽也包括在两个scFv之间的多肽间隔序列。各scFv识别不同的表位，并且这些表位可以对不同的蛋白质为特异性的，使得两种蛋白质均被BiTE结合。
因为其为单个多肽，所以可使用本领域已知的任何原核或真核细胞表达系统、例如CHO细胞系表达双特异性T细胞接合子。然而，特定的纯化技术(参见，例如，EP1691833)可能为必需的，以将单体双特异性T细胞接合子与其他多聚体物质分离，该多聚体物质可能具有不同于单体的预期活性的生物活性。在一个示例性纯化方案中，首先对含有分泌多肽的溶液进行金属亲和层析，并用咪唑浓度的梯度洗脱多肽。使用阴离子交换层析进一步纯化该洗脱液，并使用氯化钠浓度的梯度洗脱多肽。最后，对该洗脱液进行尺寸排阻层析，以自多聚体物质中分离单体。在一些实施例中，靶向单元为由包含借由肽连接子彼此融合的两个单链FV部分(scFV)的单个多肽链组成的双特异性抗体。
在一些实施例中，靶向单元为多特异性的，例如IgG-scFV。IgG-scFv格式包括IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、svFc-(L)IgG、2scFV-IgG及IgG-2scFv。这些和其他双特异性抗体格式及其制备方法已经描述于，例如，Brinkmann and Kontermann，MAbs 9(2):182-212(2017)；Wang等人，Antibodies，2019，8，43；Dong等人，2011，MAbs 3:273-88；Natsume等人，J.Biochem.140(3):359-368，2006；Cheal等人，Mol.Cancer Ther.13(7):1803-1812，2014；及Bates and Power，Antibodies，2019，8，28。
IgG样双可变域抗体(DVD-Ig)已经描述于Wu等人，2007，Nat Biotechnol 25：1290-97；Hasler等人，Mol.Immunol.75:28-37，2016以及WO08/024188及WO07/024715中。Triomabs已经描述于Chelius等人，MAbs 2(3):309-319，2010。2-in-1-IgG已经描述于Kontermann等人，Drug Discovery Today 20(7):838-847，2015。Tanden抗体或TandAb已经描述于Kontermann等人，参见上文。ScFv-HSA-scFv抗体也已经描述于Kontermann等人(参见上文)。
完整的(例如，全部的)抗体、其的二聚体、单独的轻链及重链、或其抗原结合部分可借由已知技术回收及纯化，例如免疫吸附或免疫亲和层析、层析方法如HPLC(高效液相层析)、硫酸铵沉淀、凝胶电泳或其任意组合。一般参见Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag，N.Y.，1982)。至少约90％至95％均一性的基本上纯的抗体或其抗原结合部分为有利的，如具有98％至99％或更高均一性的那些抗体或其抗原结合部分，特别为对于药物用途。一旦根据需要部分纯化或纯化至均一化，完整的抗体或其抗原结合部分就可用于治疗或开发及进行分析程式、免疫荧光染色等。一般参见，Vols.I&IIImmunol.Meth.(Lefkovits&Pernis编辑，Acad.Press，NY，1979及1981)。
药物单元
在一些实施例中，连接子连接至药物单元、靶向单元和/或连接至靶向单元及药物单元(后者也称为偶联物、ADC或抗体药物偶联物)。在一些实施例中，连接子经由连接子亚单元L2连接至至少一个药物单元。如本文所用，在偶联物的上下文中，术语“药物单元”或药物是指细胞毒性剂(例如，化学治疗剂或药物)、免疫调节剂、核酸(包括siRNA)、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白质毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)、放射性同位素、PROTAC及当递送至目标细胞时对目标细胞具有活性的其他化合物。
细胞毒性剂
在一些实施例中，药物单元为细胞毒性剂。“细胞毒性剂”是指对细胞具有细胞毒性作用的试剂。“细胞毒性效应”是指目标细胞的消耗、消除和/或杀死。细胞毒性剂包括，例如，微管蛋白破坏剂、拓朴异构酶抑制剂、DNA小沟结合剂及DNA烷化剂。
微管蛋白破坏剂包括，例如，奥瑞他汀、海兔毒素、微管蛋白抑制剂(tubulysins)、秋水仙碱、长春花生物碱、紫杉烷、念珠藻素(cryptophycins)、美登素类化合物、哈米特林(hemiasterlins)、以及其他微管蛋白破坏剂。奥瑞他汀为天然产物海兔毒素10的衍生物。示例性奥瑞他汀包括MMAE(N-甲基缬氨酸-缬氨酸-海兔异亮氨酸-海兔脯氨酸-去甲麻黄碱)、MMAF(N-甲基缬氨酸-缬氨酸-海兔异亮氨酸-海兔脯氨酸-苯丙氨酸)及AFP(参见WO2004/010957及WO2007/008603)。其他奥瑞他汀类化合物公开于，例如，公布的美国申请号US2021/0008099、US2017/0121282、US2013/0309192及US2013/0157960中。海兔毒素包括，例如，海兔毒素10及海兔毒素15(参见，例如，Pettit等人，J.Am.Chem.Soc.，1987，109，6883-6885；Pettit等人，Anti-Cancer Drug Des.，1998，13，243-277；及公布的美国申请US2001/0018422)。预期本文使用的其他海兔毒素衍生物公开于美国专利9,345,785，其借由引用并入本文。
微管蛋白抑制剂包括但不限于微管蛋白抑制剂D、微管蛋白抑制剂M、布他苯丙氨酸(tubuphenylalanine)及微管酪氨酸。WO2017/096311及WO/2016040684描述了包括微管蛋白抑制剂M的微管蛋白抑制剂类似物。
秋水仙碱包括但不限于秋水仙碱及CA-4。
长春花生物碱包括但不限于长春碱(VBL)、长春瑞滨(VRL)、长春新碱(VCR)及长春地辛(VOS)。
紫杉烷包括但不限于紫杉醇及多西他赛。
念珠藻素包括但不限于念珠藻素1及念珠藻素52。
美登素类化合物包括但不限于美登素，美登醇，DM1、DM3及DM4的美登素类似物以及安沙霉素-2。示例性美登素类化合物药物部分包括具有以下经修饰的芳环的分子，例如：C-19-脱氯(美国专利号4,256,746)(借由氢化铝锂还原安沙霉素P2制备)；C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利号4,361,650及4,307,016)(借由使用链霉菌或放线菌的脱甲基化或使用LAH的脱氯制备)；及C-20-脱甲氧基、C-20-酰氧基(--OCOR)、+/-脱氯(美国专利号4,294,757)(借由使用酰氯的酰化制备)以及在其他位置具有修饰的那些物质。
美登素类化合物药物部分也包括具有以下修饰的分子，例如：C-9-SH(美国专利号4,424,219)(借由美登醇与H2S或P2S5的反应制备)；C-14-烷氧基甲基(脱甲氧基/CH2OR)(参见美国专利号4,331,598)；C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(参见美国专利号4,450,254)(由诺卡菌制备)；C-15-羟基/酰氧基(参见美国专利号4,364,866)(借由链霉菌属转化美登醇制备)；C-15-甲氧基(参见，美国专利号4,313,946及4,315,929)(分离自滑桃(Trewia nudiflora))；C-18-N-去甲基(参见美国专利号4,362,663及4,322,348)(借由链霉菌属使美登醇去甲基化制备)；及4,5-脱氧(参见美国专利号4,371,533)(借由三氯化钛/美登醇的LAH还原制备)。
哈米特林包括但不限于哈米特林及HTl-286。
其他的微管蛋白破坏剂包括根薯酮内酯A、根薯酮内酯B、根薯酮内酯AF、根薯酮内酯AJ、根薯酮内酯Al-环氧化物、圆皮海绵内酯(discodermolide)、埃博霉素A、埃博霉素B及莱利霉素。
在一些实施例中，细胞毒性剂可为拓朴异构酶抑制剂，例如喜树碱。示例性喜树碱包括，例如，喜树碱、伊立替康(也称为CPT-11)、贝洛替康、(7-(2-(N-异丙基氨基)乙基)喜树碱)、拓朴替康、10-羟基-CPT、SN-38、依喜替康及依喜替康类似物DXd(参见，US20150297748)。其他喜树碱公开于WO1996/021666、WO00/08033、US2016/0229862及WO2020/156189。
在一些实施例中，细胞毒性剂为倍癌霉素，包括合成类似物KW-2189及CBI-TMI。
免疫调节剂
在一些实施例中，药物单元为免疫调节剂。免疫调节剂可为，例如，TLR7和/或TLR8促效剂、STING促效剂、RIG-I促效剂或其他免疫调节剂。
在一些实施例中，药物单元为免疫调节剂，例如TLR7和/或TLR8促效剂。在一些实施例中，TLR7促效剂选自咪唑并喹啉、咪唑并喹啉胺、噻唑并喹啉、氨基喹啉、氨基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-氨基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺、四氢吡啶并嘧啶、杂芳并噻二嗪-2,2-二氧化物、苯并萘啶、鸟苷类似物、腺苷类似物、胸苷均聚物、ssRNA、CpG-A、PolyG10及PolyG3。在一些实施例中，TLR7促效剂选自咪唑并喹啉、咪唑并喹啉胺、噻唑并喹啉、氨基喹啉、氨基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-氨基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺、四氢吡啶并嘧啶、杂芳基并噻二嗪-2,2-二氧化物或ssRNA。在一些实施例中，TLR7促效剂为非天然存在的化合物。TLR7调节剂的实例包括GS-9620、GSK-2245035、咪喹莫特、瑞喹莫特、DSR-6434、DSP-3025、IMO-4200、MCT-465、MEDI-9197、3M-051、SB-9922、3M-052、Limtop、TMX-30X、TMX-202、RG-7863、RG-7795及公开于US20160168164、US20150299194、US20110098248、US20100143301及US20090047249中的化合物。
在一些实施例中，TLR8促效剂选自苯并吖庚因、咪唑并喹啉、噻唑并喹啉、氨基喹啉、氨基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-氨基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺、四氢吡啶并嘧啶或ssRNA。在一些实施例中，TLR8促效剂选自苯并吖庚因、咪唑并喹啉、噻唑并喹啉、氨基喹啉、氨基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-氨基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺及四氢吡啶并嘧啶。在一些实施例中，TLR8促效剂为非天然存在的化合物。TLR8促效剂的实例包括莫托莫特、瑞喹莫特、3M-051、3M-052、MCT-465、IMO-4200、VTX-763、VTX-1463。
在一些实施例中，TLR8促效剂可为公开于WO2018/170179、WO2020/056198及WO2020056194中的化合物的任一种。
其他TLR7及TLR8促效剂公开于，例如，WO2016142250、WO2017046112、WO2007024612、WO2011022508、WO2011022509、WO2012045090、WO2012097173、WO2012097177、WO2017079283、US20160008374、US20160194350、US20160289229、美国专利号6043238、US20180086755、WO2017216054、WO2017190669、WO2017202704、WO2017202703、WO20170071944、US20140045849、US20140073642、WO2014056953、WO2014076221、WO2014128189、US20140350031、WO2014023813、US20080234251、US20080306050、US20100029585、US20110092485、US20110118235、US20120082658、US20120219615、US20140066432、US20140088085、US20140275167及US20130251673、WO2018198091及US20170131421。
在一些实施例中，免疫调节剂为STING促效剂。STING促效剂的实例包括，例如，WO2020059895、WO2015077354、WO2020227159、WO2020075790、WO2018200812及WO2020074004中公开的那些。
在一些实施例中，免疫调节剂为RIG-I促效剂。RIG-I促效剂的实例包括KIN1148、SB-9200、KIN700、KIN600、KIN500、KIN100、KIN101、KIN400及KIN2000。
毒素
在一些实施例中，药物单元为酶活性毒素或其片段，包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思子毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝裂吉霉素(mitogellin)、侷限曲霉素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)及单端孢霉烯族化合物(tricoenotes)。
放射性同位素
在一些实施例中，药物单元为放射性同位素。有多种放射性同位素可用于生产放射性偶联物。实例包括钇-88、钇-90、锝-99、铜-67、铼-188、铼-186、镓-66、镓-67、铟-111、铟-114、铟-115、镥-177、锶-89、钐-153及铅-212。
PROTAC
在一些实施例中，药物单元为蛋白质水解靶向嵌合体(PROTAC)。PROTACs描述于，例如，公开的US申请号20210015942、20210015929、20200392131、20200216507、US20200199247及US20190175612；其公开内容借由援引并入本文。
配体
在一些实施例中，药物单元包含可借由羧基单元结合的配体，该配体例如铂(Pt)、钌(Ru)、铑(Rh)、金(Au)、银(Ag)、铜(Cu)、钼(Mo)、钛(Ti)或铱(Ir)；放射性同位素，例如钇-88、钇-90、锝-99、铜-67、铼-188、铼-186、镓-66、镓-67、铟-111、铟-114、铟-115、镥-177、锶-89、钐-153及铅-212。
载药量
偶联物可含有一个或多个药物单元/靶向单元。各靶向单元的药物单元的数量被称为载药量。偶联物的载药量由pload表示，pload为偶联物中各靶向单位(例如，抗体或抗原结合部分或非抗体支架或非抗体蛋白)的药物单位(药物分子(例如，细胞毒性剂))的平均数。例如，若pload为约4，则考虑至组合物中存在的所有靶向单元(例如，抗体或抗原结合部分或非抗体支架或非抗体蛋白)的平均载药量为约4。在一些实施例中，pload为约3至约5、约3.6至约4.4或约3.8至约4.2。在一些实施例中，pload可为约3、约4或约5。在一些实施例中，pload为约6至约8、更佳约7.5至约8.4。在一些实施例中，pload可为约6、约7或约8。在一些实施例中，pload为约8至约16。
制剂中各靶向单元(例如，抗体或抗原结合部分或非抗体支架)的药物单元的平均数可借由常规方法如UV、质谱、毛细管电泳(CE)及HPLC来表征。还可确定偶联物在pload方面的定量分布。在一些情况下，均相偶联物的分离、纯化及表征可借由诸如反相HPLC或疏水相互作用层析(HIC)HPLC的方式实现，其中pload为来自具有其他载药量的偶联物的特定值。
示例性连接子及连接子单元-药物单元组合
在一些实施例中，连接子中间体～L1-AA≈具有以下通式：
～L1-AA≈
[190]
或其盐，其中AA为具有1至12个亚单元的氨基酸单元，该亚单元选自α、β及γ氨基酸及其衍生物、糖单元、羧基单元及氨基酸亚单元(视情况被至少一个PEG单元取代)，其限制条件为氨基酸单元包含至少一个糖单元、PEG单元或羧基单元；L1为扩展单元；并且波浪线(～)表示用于靶向单元的连接位点，以及双波浪(≈)线表示用于连接子亚单元L2的连接位点。在一些实施例中，氨基酸单元包含至少一个糖单元、PEG单元、羧基单元或其组合；
在一些实施例中，连接子中间体～AA-L2≈具有以下通式：
～AA-L2≈
[191]
或其盐，其中AA为具有1至12个亚单元的氨基酸单元，该亚单元选自α、β及γ氨基酸及其衍生物、糖单元、羧基单元及氨基酸亚单元(视情况被至少一个PEG单元取代)；L2为视情况被至少一个糖单元、PEG单元、羧基单元或其组合取代的连接子亚单元；波浪线(～)表示用于扩展单元的连接位点；以及双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点；其限制条件为～AA-L2≈包含至少一个糖单元、PEG单元、羧基单元或其组合。
在一些实施例中，药物连接子中间体～AA-L2-D具有以下通式：
～AA-L2-D
[192]
或其盐，其中AA为具有1至12个亚单元的氨基酸单元，该亚单元选自α、β及γ氨基酸及其衍生物、糖单元、羧基单元及氨基酸亚单元(视情况被至少一个PEG单元取代)；L2为视情况被至少一个糖单元、PEG单元、羧基单元或其组合取代的连接子亚单元；D为药物单元；并且波浪线(～)表示用于扩展单元的连接位点，其限制条件为-AA-L2-包含至少一个糖单元、PEG单元、羧基单元或其组合。
在一些实施例中，连接子～-L1-AA-L2≈具有以下通式：
～L1-AA-L2≈
[193]
或其盐，其中L1为扩展单元；AA为具有1至12个亚单元的氨基酸单元，该亚单元选自α、β及γ氨基酸及其衍生物、糖单元、羧基单元及氨基酸亚单元(视情况被至少一个PEG单元取代)；L2为视情况被至少一个糖单元、PEG单元、羧基单元或其组合取代的连接子亚单元；波浪线(～)表示用于靶向单元的连接位点，双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点；其限制条件为-AA-L2≈包含至少一个糖单元、PEG单元、羧基单元或其组合。在一些实施例中，L2连接至AA的亚单元的侧链。
在一些实施例中，药物连接子～-L1-AA-L2-D具有以下通式：
～L1-AA-L2–D
[194]
或其盐，其中L1为扩展单元；AA为具有1至12个亚单元的氨基酸单元，该亚单元选自α、β及γ氨基酸及其衍生物、糖单元、羧基单元及氨基酸亚单元(视情况被至少一个PEG单元取代)；L2为视情况被至少一个糖单元、PEG单元、羧基单元或其组合取代的连接子亚单元；D为药物单元；并且波浪线(～)表示用于靶向单元的连接位点；其限制条件为-AA-L2-包含至少一个糖单元、PEG单元、羧基单元或其组合。在一些实施例中，L2连接至AA的亚单元的侧链。
在一些实施例中，连接子中间体～L1-AA≈具有以下通式：
～L1-[SU]≈
[200]
或其盐，其中[SU]为氨基酸单元，其中各SU为糖单元，L1为扩展单元，波浪线(～)表示用于靶向单元的连接位点及双波浪(≈)线表示用于连接子亚单元L2的连接位点。
这种连接子中间体的示例性实施例包括以下：
或其盐，其中糖单元的右侧的羧基基团为用于连接子亚单元L2的连接位点。
在一些实施例中，连接子中间体～L1-AA≈具有以下通式：
～L1-[SU-aa]≈
[202]
或其盐，其中[SU-aa-]为氨基酸单元，其中各SU为糖单元并且aa为选自α、β及γ氨基酸及其衍生物的AA的视情况亚单元，L1为扩展单元、波浪线(～)表示用于靶向单元的连接位点；并且双波浪(≈)线表示用于连接子亚单元L2的连接位点。在一些实施例中，aa为选自甘氨酸、赖氨酸及谷氨酸的氨基酸。在一些实施例中，[SU-aa]为[SU-Lys-]。
这种连接子中间体的示例性实施例包括以下：
或其盐，其中赖氨酸的右侧的羧基基团为用于连接子亚单元L2的连接位点。
在一些实施例中，连接子中间体～L1-AA≈具有以下通式：
～L1-[SU-aa-SU]≈
[204]
或其盐，其中[SU-aa-SU]为氨基酸单元，其中各SU为糖单元并且aa为选自α、β及γ氨基酸及其衍生物的AA的亚单元，L1为扩展单元、波浪线(～)表示用于靶向单元的连接位点，并且双波浪(≈)线表示用于连接子亚单元L2的连接位点。在一些实施例中，aa为选自甘氨酸、赖氨酸及谷氨酸的氨基酸。在一些实施例中，[SU-aa-SU]为[SU-Lys-SU]。
这种连接子中间体的示例性实施例包括以下：
或其盐，其中糖单元的右侧的受保护的羧基基团为用于连接子亚单元L2的连接位点。
在一些实施例中，连接子中间体～AA-L2≈具有以下通式：
～[SU-aa]-L2≈
[206]
或其盐，其中[SU-aa]为氨基酸单元，其中各SU为糖单元并且aa为选自α、β及γ氨基酸及其衍生物的AA的视情况亚单元，L2为视情况被至少一个糖单元、PEG单元、羧基单元或其组合取代的连接子亚单元，波浪线(～)表示用于扩展单元的连接位点，并且双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点。在一些实施例中，aa为选自甘氨酸、赖氨酸及谷氨酸的氨基酸。在一些实施例中，aa为赖氨酸。在一些实施例中，[Su-aa]为[Su-Lys]。在一些实施例中，连接子亚单元L2为可裂解连接子亚单元。
这种连接子的示例性实施例包括以下：
或其盐，其中糖单元的左侧的氨基基团为用于扩展单元的连接位点，并且右侧的苄醇基团为用于药物单元的连接位点。
在一些实施例中，连接子中间体～AA-L2≈具有以下通式：
或其盐，其中[SU-aa-SU]为氨基酸单元，其中各SU为糖单元并且aa为选自α、β及γ氨基酸及其衍生物的AA的亚单元，L2为视情况被至少一个糖单元、PEG单元、羧基单元或其组合取代的连接子亚单元，并且L2连接至aa的位点，波浪线(～)表示用于扩展单元的连接位点，并且双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点。在一些实施例中，aa为选自甘氨酸、赖氨酸及谷氨酸的氨基酸。在一些实施例中，aa为赖氨酸。在一些实施例中，[Su-aa-Su]为[Su-Lys-Su]。在一些实施例中，连接子亚单元L2为可裂解连接子亚单元。
这种连接子中间体的示例性实施例包括以下：
或其盐，其中糖单元的左侧的氨基基团为用于扩展单元的连接位点，并且药物单元连接至末端酸基团或苄醇(亦即，H自苄醇中移除，并且在苄氧与药物单元之间形成键)。
在一些实施例中，连接子具有以下通式：
～L1-[SU-aa]-L2≈
[210]
或其盐，其中[SU-aa-SU]为氨基酸单元，其中各SU为糖单元并且aa为选自α、β及γ氨基酸及其衍生物的AA的视情况亚单元，L1为扩展单元，L2为视情况被至少一个糖单元、PEG单元、羧基单元或其组合取代的连接子亚单元，并且L2连接至aa的位点或者连接至SU，波浪线(～)表示用于靶向单元的连接位点，双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点。在一些实施例中，aa为选自甘氨酸、赖氨酸及谷氨酸的氨基酸。在一些实施例中，aa存在并且为赖氨酸。
这种连接子的示例性实施例包括以下：
或其盐，其中糖单元的左侧的顺丁烯二酰亚胺基团为用于靶向单元的连接位点，并且药物单元连接至苄醇(亦即，H自苄醇中移除，并且在苄氧与药物单元之间形成键)。
在一些实施例中，连接子具有以下通式：
～L1-[SU-aa-SU]-L2≈
[212]
或其盐，其中[SU-aa-SU]为氨基酸单元，其中各SU为糖单元并且aa为选自α、β及γ氨基酸及其衍生物的AA的视情况亚单元，L1为扩展单元，L2为视情况被至少一个糖单元、PEG单元、羧基单元或其组合取代的连接子亚单元，并且L2连接至AA，波浪线(～)表示用于靶向单元的连接位点，并且双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点。在一些实施例中，aa为选自甘氨酸、赖氨酸及谷氨酸的氨基酸。在一些实施例中，aa存在并且为赖氨酸。
这种连接子的示例性实施例包括以下：
或其盐，其中糖单元的左侧的顺丁烯二酰亚胺基团为用于靶向单元的连接位点，并且药物单元连接至苄醇(亦即，H自苄醇中移除，并且在苄氧与药物单元之间形成键)。
在一些实施例中，连接子具有以下通式：
或其盐，其中[SU-aa-SU]为氨基酸单元，其中各SU为糖单元并且aa为选自α、β及γ氨基酸及其衍生物的AA的亚单元，L1为扩展单元，L2为视情况被至少一个糖单元、PEG单元、羧基单元或其组合取代的连接子亚单元，L2连接至aa的位点，波浪线(～)表示用于靶向单元的连接位点，并且双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点。在一些实施例中，aa为选自甘氨酸、赖氨酸及谷氨酸的氨基酸。在一些实施例中，aa存在并且为赖氨酸。
这种连接子的示例性实施例包括以下：
或其盐，其中糖单元的左侧的顺丁烯二酰亚胺或溴代乙酰胺基团为用于靶向单元的连接位点，并且药物单元连接至末端酸基团或苄醇(亦即，H自苄醇中移除，并且在苄氧与药物单元之间形成键)。
在一些实施例中，药物-连接子中间体～AA-L2-D具有以下通式：
～[SU-aa]-L2-D
[216]
或其盐，其中[SU-aa]为氨基酸单元，其中各SU为糖单元并且aa为选自α、β及γ氨基酸及其衍生物的AA的视情况亚单元，L2为视情况被至少一个糖单元、PEG单元、羧基单元或其组合取代的连接子亚单元，D为药物单元，并且波浪线(～)表示用于扩展单元的连接位点。在一些实施例中，aa为选自甘氨酸、赖氨酸及谷氨酸的氨基酸。在一些实施例中，aa为赖氨酸。在一些实施例中，[Su-aa]为[Su-Lys]。在一些实施例中，连接子亚单元L2为可裂解连接子亚单元。
这种药物-连接子的示例性实施例包括以下：
或其盐，其中糖单元的左侧的氨基基团为用于扩展单元的连接位点。
在一些实施例中，药物-连接子中间体～AA-L2-D具有以下通式：
或其盐，其中[SU-aa-SU]为氨基酸单元，其中各SU为糖单元并且aa为选自α、β及γ氨基酸及其衍生物的AA的亚单元，L2为视情况被至少一个糖单元、PEG单元、羧基单元或其组合取代的连接子亚单元，并且L2连接至aa的位点，D为药物单元，并且波浪线(～)表示用于扩展单元的连接位点。在一些实施例中，aa为选自甘氨酸、赖氨酸及谷氨酸的氨基酸。在一些实施例中，aa为赖氨酸。在一些实施例中，[Su-aa-Su]为[Su-Lys-Su]。在一些实施例中，连接子亚单元L2为可裂解连接子亚单元。
这种药物-连接子中间体的示例性实施例包括以下：
或其盐，其中糖单元的左侧的氨基基团为用于扩展单元的连接位点。
在一些实施例中，连接子中间体～AA-L2～具有以下通式：
～[SU-aa(PEG)-SU]-L2≈
[220]
或其盐，其中[SU-aa(PEG)-SU]为氨基酸单元，其中各SU为糖单元并且aa为选自α、β及γ氨基酸及其衍生物的AA的亚单元，PEG为连接至aa的PEG单元，L2为视情况被至少一个糖单元、PEG单元、羧基单元或其组合取代的连接子亚单元，L2连接至AA，波浪线(～)表示用于扩展单元的连接位点，并且双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点。在一些实施例中，aa为选自甘氨酸、赖氨酸及谷氨酸的氨基酸。在一些实施例中，aa为赖氨酸。在一些实施例中，连接子亚单元L2为可裂解连接子亚单元。
这种连接子中间体的示例性实施例包括以下：
或其盐，其中糖单元的左侧的氨基基团为用于扩展向单元的连接位点，并且药物单元连接至苄醇(亦即，H自苄醇中移除，并且在苄氧与药物单元之间形成键)。
在一些实施例中，药物-连接子中间体～AA-L2-D具有以下通式：
～[SU-aa(PEG)-SU]-L2-D
[222]
或其盐，其中[SU-aa(PEG)-SU]为氨基酸单元，其中各SU为糖单元，aa为选自α、β及γ氨基酸及其衍生物的AA的亚单元，PEG为连接至aa的PEG单元，L2为视情况被至少一个糖单元、PEG单元、羧基单元或其组合取代的连接子亚单元，L2连接至AA，D为药物单元，并且波浪线(～)表示用于扩展单元的连接位点。在一些实施例中，aa为选自甘氨酸、赖氨酸及谷氨酸的氨基酸。在一些实施例中，aa为赖氨酸。在一些实施例中，连接子亚单元L2为可裂解连接子亚单元。
这种药物-连接子中间体的示例性实施例包括以下：
或其盐，其中糖单元的左侧的氨基基团为用于扩展单元的连接位点。
在一些实施例中，连接子中间体～AA-L2≈具有以下通式：
～[aa(PEG)]-L2≈
[224]
或其盐，其中[aa(PEG)]为氨基酸单元，其中aa为选自α、β及γ氨基酸及其衍生物的AA的亚单元，PEG为连接至aa的PEG单元，L2为视情况被至少一个糖单元、PEG单元、羧基单元或其组合取代的连接子亚单元，L2连接至AA，波浪线(～)表示用于扩展单元的连接位点，并且双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点。在一些实施例中，aa为选自甘氨酸、赖氨酸及谷氨酸的氨基酸。在一些实施例中，aa为赖氨酸。在一些实施例中，连接子亚单元L2为可裂解连接子亚单元。
这种连接子中间体的示例性实施例包括以下：
或其盐，其中分子的左侧的氨基基团为用于扩展单元的连接位点。
在一些实施例中，提供了连接子中间体或连接子，其中～AA-L2～具有以下结构中的一种：
其中各Z在*处连接并且分别选自：
以及
或其盐，其中氨基基团上的波浪线表示用于扩展单元的连接位点，并且药物单元连接至苄醇(亦即，苄醇的H被与药物单元的键替代)。
在一些实施例中，药物-连接子中间体～AA-L2-D具有以下通式：
～[aa(PEG)]-L2-D
[226]
或其盐，其中[aa(PEG)]为氨基酸单元，其中aa为选自α、β及γ氨基酸及其衍生物的AA的亚单元，PEG为连接至aa的PEG单元，L2为视情况被至少一个糖单元、PEG单元、羧基单元或其组合取代的连接子亚单元，L2连接至AA，D为药物单元，并且波浪线(～)表示用于扩展单元的连接位点。在一些实施例中，aa为选自甘氨酸、赖氨酸及谷氨酸的氨基酸。在一些实施例中，aa为赖氨酸。在一些实施例中，连接子亚单元L2为可裂解连接子亚单元。
这种药物-连接子中间体的示例性实施例包括以下：
或其盐，其中分子的左侧的氨基基团为用于扩展单元的连接位点。
在一些实施例中，连接子中间体～L2≈具有以下通式：
或其盐，其中氨基酸单元不存在，L2为连接子亚单元，PEG为连接至L2的PEG单元，波浪(～)线表示用于扩展单元的连接位点，并且双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点。在一些实施例中，PEG单元连接至选自赖氨酸、谷氨酸及瓜氨酸的氨基酸。在一些实施例中，连接子亚单元L2为可裂解连接子亚单元。
这种连接子中间体的示例性实施例包括以下：
或其盐，其中分子的左侧的氨基基团为用于扩展单元的连接位点。
在一些实施例中，药物-连接子中间体～L2-D具有以下通式：
或其盐，其中氨基酸单元不存在，L2为连接子亚单元，D为药物单元，PEG为连接至L2的PEG单元，波浪线(～)表示用于扩展单元或氨基酸单元的连接位点。在一些实施例中，PEG单元连接至选自赖氨酸、谷氨酸及瓜氨酸的氨基酸。在一些实施例中，连接子亚单元L2为可裂解连接子亚单元。
这种药物-连接子中间体的示例性实施例包括以下：
或其盐，其中分子的左侧的氨基基团为用于扩展单元的连接位点。
在一些实施例中，连接子中间体～AA-L2≈具有以下通式：
～[CU]-L2≈
[232]
或其盐，其中[CU]为氨基酸单元，其中CU为羧基单元，L2为视情况被至少一个糖单元、PEG单元、羧基单元或其组合取代的连接子亚单元，L2连接至AA，并且波浪(～)线表示用于扩展单元的连接位点，并且双波浪线(≈)表示用于药物单元的连接位点。在一些实施例中，连接子亚单元L2为可裂解连接子亚单元。
这种连接子中间体的示例性实施例包括以下：
或其盐，其中分子的左侧的氨基基团为用于扩展向单元的连接位点，并且药物单元连接至苄醇(亦即，H自苄醇中移除，并且在苄氧与药物单元之间形成键)。
在一些实施例中，药物-连接子中间体～AA-L2-D具有以下通式：
～[CU]-L2-D
[234]
或其盐，其中[CU]为氨基酸单元，其中CU为羧基单元，L2为视情况被至少一个糖单元、PEG单元、羧基单元或其组合取代的连接子亚单元，L2连接至AA，D为药物单元，并且波浪线(～)表示用于扩展单元的连接位点。在一些实施例中，连接子亚单元L2为可裂解连接子亚单元。
这种药物-连接子中间体的示例性实施例包括以下：
或其盐，其中分子的左侧的氨基基团为用于扩展单元的连接位点。
在一些实施例中，药物-连接子中间体～L2-D具有以下通式：
～L2[CU]-D
[236]
或其盐，其中L2为包含羧基单元[CU]的连接子亚单元，D为药物单元，并且波浪线(～)表示用于氨基酸单元或扩展单元的连接位点。在一些实施例中，连接子亚单元L2为可裂解连接子亚单元。
这种药物-连接子中间体的示例性实施例包括以下
或其盐，其中分子的左侧的氨基基团为用于氨基酸单元或扩展单元的连接位点。
在连接子或连接子中间体具有前述式[190]至式[236]的一些实施例中，连接子亚单元L2为可裂解连接子亚单元。
在连接子或连接子中间体具有前述式[190]至式[236]的一些实施例中，连接子亚单元L2为具有肽的可裂解连接子亚单元，该肽选自缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、丙氨酸-赖氨酸及甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸。
药物-连接子与抗体、抗原结合部分及其他结合剂(包括非抗体支架)的连接
用于借由连接子将药物单元连接至靶向单元(例如，抗体或其抗原结合部分或非抗体支架)的技术为本领域熟知的。参见，例如，Alley等人，Current Opinion in ChemicalBiology 201014:1-9；Senter，Cancer J.，2008，14(3):154-169。在一些实施例中，连接子首先连接至药物单元(例如，细胞毒性剂、免疫调节剂或其他试剂)，随后药物-连接子连接至靶向单元(例如，抗体或其抗原结合部分或非抗体蛋白支架)。在一些实施例中，连接子首先连接至靶向单元(例如，抗体或其抗原结合部分或非抗体蛋白支架)，随后药物单元连接至连接子。在以下讨论中，术语药物-连接子用于举例说明连接子或药物-连接子与靶向单元的连接；本领域技术人员将理解，所选择的连接方法可根据连接子及药物单元来判定。在一些实施例中，药物单元借由连接子以降低药物单元的活性直至其自偶联物中释放(例如，借由水解、借由蛋白水解降解或借由裂解剂)的方式连接至靶向单元。
通常，偶联物可借由使用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件及试剂的几种途径制备，包括：(1)使靶向单元(例如，抗体或其抗原结合部分或非抗体蛋白支架)的亲核基团与二价连接子反应以经由共价键形成靶向单元-连接子中间体，随后与药物单元反应；以及(2)使药物单元的亲核基团与二价连接子反应，以经由共价键形成药物-连接子，随后与靶向单元的亲核基团反应。借由后一种途径制备偶联物的示例性方法描述于美国专利号7,498,298中，其借由引用明确地并入本文。
靶向单元(例如，抗体、抗原结合部分及其他结合剂(包括非抗体支架))上的亲核基团包括但不限于：(i)N-末端胺基团，(ii)侧链胺基团，例如赖氨酸，(iii)侧链硫醇基团，例如半胱氨酸，以及(iv)糖羟基或氨基基团，其中抗体被糖基化。胺、硫醇及羟基基团为亲核的，并且能够与连接子上的亲电基团反应形成共价键，该亲电基团包括：(i)活性酯，例如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯及酰基卤；(ii)烷基卤化物及苄基卤化物，例如卤代乙酰胺；及(iii)醛、酮、羧基及顺丁烯二酰亚胺基团。某些靶向单元(例如抗体(以及抗原结合部分及其他结合剂(包括非抗体支架)))具有可还原的链间二硫键，亦即半胱氨酸桥。借由用还原剂如DTT(二硫苏糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)处理使得抗体被完全或部分还原，可使抗体(以及抗原结合部分及其他结合剂(包括非抗体支架))具有与连接子结合的反应性。因此，理论上，各半胱氨酸桥将形成两个反应性硫醇亲核体。另外的亲核基团可借由赖氨酸残基的修饰，例如借由赖氨酸残基与2-亚氨基硫杂环戊烷(Traut试剂)反应，导致胺转化成硫醇而引入至靶向单元(例如，抗体(以及抗原结合部分及其他结合剂(包括非抗体支架)))中。借由引入一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基(例如，借由制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的抗体、抗原结合部分及其他结合剂(包括非抗体支架))，亦可将反应性硫醇基团引入靶向单元(例如，抗体及抗原结合部分以及其他结合剂(包括非抗体支架))。
偶联物亦可借由靶向单元上的亲电基团(例如，醛或酮羰基)与连接子试剂上的亲核基团之间的反应来产生。连接子试剂上有用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧基及芳酰肼。在实施例中，修饰抗体(或其抗原结合部分或其他结合剂(包括非抗体支架))以引入能够与连接子上的亲核取代基反应的亲电部分。在另一个实施例中，糖基化抗体的糖可被氧化，例如用高碘酸盐氧化试剂，以形成醛基或酮基，其可与连接子的胺基团反应。所得亚胺席夫碱基团可形成稳定的键，或者可以例如借由硼氢化物试剂还原以形成稳定的胺键。在一个实施例中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在抗体(或其抗原结合部分或其他结合剂(包括非抗体支架))中产生羰基(醛及酮)基团，其可与连接子上的适当基团反应(参见，例如，Hermanson，Bioconjugate Techniques)。在另一个实施例中，靶向单元(例如，含有N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的抗体)可与偏高碘酸钠反应，导致产生醛代替第一个氨基酸(Geoghegan&Stroh，(1992)Bioconjugate Chem.3:138-146；US5362852)。这种醛可与连接子反应。
药物单元(例如，细胞毒性剂)上的示例性亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧基及芳酰肼基团，其能够与连接子上的亲电基团反应以形成共价键，该亲电基团包括：(i)活性酯，例如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯及酰基卤；(ii)烷基卤化物及苄基卤化物，例如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基及顺丁烯二酰亚胺基团。
在一些实施例中，药物-连接子连接至抗体(或其抗原结合部分或其他结合剂(包括非抗体支架))的链间半胱氨酸残基。参见，例如，WO2004/010957及WO2005/081711。在此类实施例中，连接子通常包含用于连接链间二硫键的半胱氨酸残基的顺丁烯二酰亚胺基团。在一些实施例中，连接子或药物-连接子连接至抗体或其抗原结合部分的半胱氨酸残基，如美国专利号7,585,491或8,080,250中所描述。所得偶联物的载药量通常为1至8或1至16。
在一些实施例中，连接子或药物-连接子连接至抗体(或其抗原结合部分或其他结合剂的赖氨酸或半胱氨酸残基)，如WO2005/037992或WO2010/141566中所描述。所得偶联物的载药量通常为1至8。
在一些实施例中，工程化的半胱氨酸残基、聚组氨酸序列、糖工程化标签或转谷氨酰胺酶识别序列可用于连接子或药物-连接子与抗体或其抗原结合部分或其他结合剂(包括非抗体支架)的位点特异性连接。
在一些实施例中，药物-连接子在Fc残基处连接至工程化的半胱氨酸残基，而非链间二硫键。在一些实施例中，药物-连接子与在重链的位置118、221、224、227、228、230、231、223、233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、247、249、250、258、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、275、276、278、280、281、283、285、286、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、302、305、313、318、323、324、325、327、328、329、330、331、332、333、335、336、396和/或428处和/或轻链的位置106、108、142(轻链)、149(轻链)和/或位置V205处引入至IgG(通常为IgG1)的工程化半胱氨酸连接，根据Kabat的EU编号。使用工程化半胱氨酸的位点特异性结合的示例性替代为S239C(参见，例如，US20100158909；Fc区的编号根据EU索引)。
在一些实施例中，连接子或药物-连接子连接至抗体(或其抗原结合部分或其他结合剂(包括非抗体支架))的一个或多个引入的半胱氨酸残基，如WO2006/034488、WO2011/156328和/或WO2016040856中所描述。
在一些实施例中，使用细菌转谷氨酰胺酶的位点特异性结合的示例性替代为Fc区的N297S或N297Q。在一些实施例中，连接子或药物-连接子连接至抗体或其抗原结合部分或糖工程化抗体(包括非抗体支架)的聚糖或修饰的聚糖。参见，例如，WO2017/147542、WO2020/123425、WO2020/245229、WO2014/072482；WO2014//065661、WO2015/057066及WO2016/022027；其公开内容借由引用并入本文。
在一些实施例中，连接子或药物-连接子经由分选酶A连接子连接至抗体、抗原结合部分或其他结合剂(包括非抗体支架)。分选酶A连接子可借由分选酶A酶将LPXTG识别基序(SEQ ID NO：5)与N-末端GGG基序融合以再生天然酰胺键来产生。
在一些实施例中，使用SMARTag技术将连接子或药物-连接子连接至抗体、抗原结合部分或其他结合剂(包括非抗体支架)上，其中借由包埋在特定肽序列(CxPxR)中的半胱氨酸残基的氧化将生物正交醛柄引入至携带醛的甲酰基甘氨酸(fGly)中。这种酶促修饰借由产生甲酰基甘氨酸的酶(FGE)进行。参见，例如，Liu等人，Methods Mol.Biol.2033:131-147(2019)。
在一些实施例中，使用半胱氨酸与四级铵化乙烯基吡啶及炔基吡啶结合，将连接子或药物-连接子连接至抗体、抗原结合部分或其他结合剂(包括非抗体支架)。参见，例如，Matos等人，Angew Chem.Int.Ed.Engl.58:6640-6644(2019)。
在其他实施例中，使用双顺丁烯二酰亚胺、C-lock或K-lock方法，将连接子或药物-连接子连接至抗体、抗原结合部分或其他结合剂(包括非抗体支架)。
药物制剂
偶联物的其他方面涉及包含活性成分的组合物，该活性成分包括本文所描述的任何偶联物。在一些实施例中，组合物为药物组合物。如本文所用，术语“药物组合物”是指活性剂与被接收用于制药工业的医药学上可接受的载体的组合。本文使用的短语“医药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适合与人类及动物的组织接触而无过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，符合合理的收益/风险比的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
含有溶解或分散于其中的活性成分的药物组合物的制备为本领域熟知的，并且不需要基于任何特定的制剂来限制。典型地，这种组合物被制备为可注射的液体溶液或悬浮液；然而，也可制备适于在使用前在液体中再水合的固体形式或悬浮液。制剂也可被乳化或作为脂质粒组合物提供。偶联物可与医药学上可接受的且与活性成分相容的赋形剂混合，其量适合用于本文所描述的治疗方法。合适的赋形剂为，例如，水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，若需要，药物组合物可含有少量的辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂等，其增强或维持活性成分(例如，偶联物)的有效性。如本文所描述的药物组合物可包含其中组分的医药学上可接受的盐。医药学上可接受的盐包括与无机酸(例如，盐酸或磷酸)或有机酸(例如，乙酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的酸加成盐(与多肽的游离氨基基团形成)。与游离羧基基团形成的盐也可衍生自无机碱(例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)及有机碱(例如，异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等)。生理学上可耐受的载体为本领域熟知的。示例性液体载体为无菌水溶液，其含有活性成分(例如，偶联物)及水，并且可含有缓冲剂，例如在生理pH值的磷酸钠、生理盐水或两者，例如磷酸盐缓冲盐水。此外，水性载体可含有一种以上的缓冲盐，以及诸如氯化钠及氯化钾的盐、右旋糖、聚乙二醇及其他溶质。除了水之外，液体组合物也可包含液相。这种附加液相的实例为甘油、诸如棉籽油的植物油及水-油乳液。将有效治疗特定病症或病症的活性剂的量将取决于疾患或病症的性质，并且可借由标准临床技术来判定。
在一些实施例中，包含偶联物的药物组合物可为冻干物。
在一些实施例中，提供了包含治疗有效量的偶联物的注射器。
癌症治疗
在一些实施例中，如本文所描述的偶联物可用于包括向有需要的受试者(例如，患有癌症的受试者)给药如本文所描述的偶联物的方法。
在一些实施例中，提供了治疗癌症的方法，其包括给药偶联物。在一些实施例中，受试者需要治疗癌症和/或恶性肿瘤。在一些实施例中，该方法用于治疗患有癌症或恶性肿瘤的受试者。
本文所描述的方法包括向患有癌症或恶性肿瘤的受试者给药治疗有效量的偶联物。如本文所用，短语“治疗有效量”、“有效量”或“有效剂量”是指在癌症或恶性肿瘤的治疗、控制或复发预防中提供治疗益处的偶联物的量，例如提供肿瘤或恶性肿瘤的至少一种症状、体征或标志物的统计学上显著降低的量。治疗有效量的判定完全在本领域技术人员的能力范围内。通常，治疗有效量可随受试者的病史、年龄、病症、性别以及受试者的医学病症的严重程度及类型以及其他药物活性剂的给药而变化。
术语“癌症”及“恶性肿瘤”是指干扰身体器官及系统的正常功能的细胞的不受控制的生长。癌症或恶性肿瘤可为原发性的或转移性的，亦即其已经变成侵入性的，在远离原始肿瘤部位的组织中播种肿瘤生长。“肿瘤”是指干扰身体器官及系统的正常功能的细胞的不受控制的生长。患有癌症的受试者为具有存在于受试者体内的可客观测量的癌细胞的受试者。在该定义中包括良性肿瘤及恶性癌症，以及潜在的休眠肿瘤及微转移。自其的原始位置迁移并播种其他重要器官的癌症最终可借由受影响器官的功能退化而导致受试者的死亡。血液系统恶性肿瘤(造血系统癌症)，例如白血病及淋巴瘤，能够例如使受试者中的正常造血区室失去竞争力，从而导致造血功能衰竭(以贫血、血小板减少症及中性粒细胞减少症的形式)，最终导致死亡。
癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤及白血病。此类癌症的更具体的实例包括但不限于基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑及CNS癌、乳癌(例如，三阴性乳癌)、腹膜癌、宫颈癌；胆管癌、绒毛膜癌、软骨肉瘤、结肠及直肠癌(大肠直肠癌)、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈癌、胃癌(包括胃肠癌及胃癌)、成胶质细胞瘤(GBM)、肝癌、肝细胞瘤、上皮内肿瘤、肾或肾脏癌(例如，透明细胞癌)、喉癌、白血病、肝癌、肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌及肺鳞状细胞癌)、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤及非霍奇金淋巴瘤)、黑色素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、口腔癌(例如，唇癌、舌癌、嘴癌及咽癌)、卵巢癌、胰脏癌、前列腺癌、视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、呼吸系统癌、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫或子宫内膜癌、严重子宫癌、泌尿系统癌、外阴癌；以及其他癌及肉瘤，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、进阶免疫母细胞NHL、进阶淋巴母细胞NHL、进阶小非裂解细胞NHL、大包块疾病NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤及瓦登斯特陆巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、毛细胞白血病、慢性成髓细胞白血病及移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)，以及与母斑细胞病相关的异常血管增殖、水肿(例如与脑肿瘤相关的水肿)及梅格斯症候群。
预期本文的方法减少受试者中的肿瘤大小或肿瘤负荷，和/或减少受试者中的转移。在各种实施例中，受试者中的肿瘤大小降低约25至50％、约40至70％或约50至90％或更多。在各种实施例中，该方法将肿瘤大小减小10％、20％、30％或更多。在各种实施例中，该方法将肿瘤大小减小10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
在一些实施例中，受试者需要用抗-FOLRI偶联物治疗癌症和/或恶性肿瘤。在具体实施例中，抗-FOLRI偶联物包含抗体F131(VH SEQ ID NO：26及VL SEQ ID NO：27)。在具体实施例中，抗-FOLR1偶联物包含F131抗体及LD038连接子-药物。在一些实施例中，受试者需要治疗FOLR1+癌症或FOLR1+恶性肿瘤，例如肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、乳癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胰脏癌及肾细胞癌。在一些实施例中，该方法用于治疗患有FOLR1+癌症或恶性肿瘤的受试者。在一些实施例中，该方法用于治疗受试者的肺癌。在一些实施例中，该方法用于治疗受试者的非小细胞肺癌。在一些实施例中，该方法用于治疗受试者的乳癌。在一些实施例中，该方法用于治疗受试者的卵巢癌。在一些实施例中，该方法用于治疗受试者的宫颈癌。在一些实施例中，该方法用于治疗受试者的子宫内膜癌。在一些实施例中，该方法用于治疗受试者的肾细胞癌。在一些实施例中，该方法用于治疗受试者的子宫癌。在一些实施例中，该方法用于治疗受试者的胰脏癌。
如本文所用，“受试者”是指人或动物。通常，该动物为脊椎动物，例如灵长类动物、啮齿类动物、家畜或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴及猕猴，例如恒河猴。啮齿类动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔及仓鼠。家畜及狩猎动物包括牛、马、猪、鹿、野牛、水牛，猫科动物(例如家猫)、犬科动物(例如狗、狐、狼)、鸟类(例如鸡、鸸鹋、鸵鸟)及鱼类(例如鳟鱼、鲶鱼及鲑鱼)。在某些实施例中，受试者为哺乳动物，例如灵长类动物，例如人类。术语“患者”、“个体”及“受试者”在本文中可互换使用。
较佳地，受试者为哺乳动物。哺乳动物可为人类、非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人类以外的哺乳动物可有利地用作例如代表例如各种癌症的动物模型的受试者。此外，本文所描述的方法可用于治疗驯养的动物和/或宠物。受试者可为男性或女性。在某些实施例中，受试者为人类。
在一些实施例中，受试者可为先前已诊断患有或鉴定为患有癌症且需要治疗的受试者，但不必已经经历癌症的治疗。在一些实施例中，受试者也可为先前未被诊断为患有需要治疗的癌症的受试者。在一些实施例中，受试者可为表现出病症的一种或多种风险因素或者与癌症相关的一种或多种并发症的受试者，或者未表现出风险因素的受试者。“需要”治疗癌症的“受试者”特别可为患有该病症或被诊断为患有该病症的受试者。在其他实施例中，“有风险罹患”癌症的受试者是指被诊断为有风险罹患病症或有风险再次患有病症的受试者。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”、“治疗(treatment)”或“改善”当用于提及疾病、疾患或医学病症时，是指对病症的治疗性治疗，其中该目的在于逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止症状或病症的进展或严重程度。术语“治疗”包括减少或减轻病症的至少一种副作用或症状。若一种或多种症状或临床标志物减少，治疗通常为“有效的”。替代地，若病症的进展减少或停止，则治疗为“有效的”。换而言的，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，还包括停止或至少减缓在未治疗的情况下预期的症状的进展或恶化。有益的或期望的临床结果包括但不限于受试者的癌细胞的减少、一种或多种症状的减轻、缺陷程度的减少、癌症或恶性肿瘤的稳定(亦即，不恶化)状态、肿瘤生长和/或转移的延迟或减慢、以及与未治疗的情况下所预期的相比寿命增加。如本文所用，术语“给药”是指借由导致偶联物与癌细胞或恶性细胞结合的方法或途径向受试者提供如本文所描述的偶联物。类似地，包含如本文所描述的偶联物的药物组合物可借由产生受试者的有效治疗的任何合适的途径给药。
偶联物的用量范围取决于效力，并且涵盖足够大以产生所需效果(例如，肿瘤生长减慢或肿瘤大小减小)的量。用量不应大到引起不可接受的不良副作用。通常，用量将随受试者的年龄、病症及性别而变化，并且可由本领域技术人员判定。在任何并发症的情况下，用量也可由单独的医师调节。在一些实施例中，用量为0.1mg/kg体重至10mg/kg体重。在一些实施例中，用量为0.5mg/kg体重至15mg/kg体重。在一些实施例中，用量为0.5mg/kg体重至5mg/kg体重。替代地，可滴定以维持血清含量的剂量范围为1μg/mL至1000μg/mL。为了全身给药，可向受试者给药，例如，0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、12mg/kg或更多的治疗量。
可重复上述剂量的给药。在较佳实施例中，上述剂量可每周、每两周、每三周或每月给药，持续数周或数月。治疗的持续时间取决于受试者的临床进展及对治疗的回应。
在一些实施例中，剂量可为约0.1mg/kg至约100mg/kg。在一些实施例中，剂量可为约0.1mg/kg至约25mg/kg。在一些实施例中，剂量可为约0.1mg/kg至约20mg/kg。在一些实施例中，剂量可为约0.1mg/kg至约15mg/kg。在一些实施例中，剂量可为约0.1mg/kg至约12mg/kg。在一些实施例中，剂量可为约1mg/kg至约100mg/kg。在一些实施例中，剂量可为约1mg/kg至约25mg/kg。在一些实施例中，剂量可为约1mg/kg至约20mg/kg。在一些实施例中，剂量可为约1mg/kg至约15mg/kg。在一些实施例中，剂量可为约1mg/kg至约12mg/kg。在一些实施例中，剂量可为约1mg/kg至约10mg/kg。
在一些实施例中，可静脉内给药剂量。在一些实施例中，静脉内给药可为在约10分钟至约4小时的时间段内进行的输注。在一些实施例中，静脉内给药可为在约30分钟至约90分钟的时间段内进行的输注。
在一些实施例中，可每周给药一剂量。在一些实施例中，可每两周给药一剂量。在一些实施例中，可约每两周给药一剂量。在一些实施例中，可约每三周给药一剂量。在一些实施例中，可每四周给药一剂量。
在一些实施例中，向受试者给药总共约2至约10个剂量。在一些实施例中，给药总共4个剂量。在一些实施例中，给药总共5个剂量。在一些实施例中，给药总共6个剂量。在一些实施例中，给药总共7个剂量。在一些实施例中，给药总共8个剂量。在一些实施例中，给药总共9个剂量。在一些实施例中，给药总共10个剂量。在一些实施例中，给药总共大于10个剂量。
含有偶联物的药物组合物可以以单位剂量给药。术语“单位剂量”当使用涉及药物组合物时是指适于作为受试者的单位用量的实体上离散的单位，各单位含有预定量的活性物质(例如，偶联物)，其经计算与所需生理学上可接受的稀释剂(亦即，载体或载剂)结合产生所需的治疗效果。
自身免疫性疾病的治疗
在一些实施例中，如本文所描述的偶联物可用于包括向有需要的受试者(例如，患有自身免疫性疾病的受试者)给药偶联物的方法。
在一些实施例中，提供了治疗自身免疫性疾病的方法，包括给药如本文所描述的偶联物。在一些实施例中，受试者需要治疗自身免疫性疾病。本文所描述的方法包括向患有自身免疫性疾病的受试者给药治疗有效量的偶联物。如本文所用，短语“治疗有效量”、“有效量”或“有效剂量”是指在自身免疫性疾病的治疗、控制或复发预防中提供治疗益处的如本文所描述的偶联物的量，例如提供自身免疫性疾病的至少一种症状、体征或标志物的统计学上显著降低的量。治疗有效量的判定完全在本领域技术人员的能力范围内。通常，治疗有效量可随受试者的病史、年龄、病症、性别以及受试者的医学病症的严重程度及类型以及其他药物活性剂的给药而变化。
术语“自身免疫性疾病”是指以干扰身体器官及系统的正常功能的免疫细胞(例如，淋巴细胞或树突细胞)的不适当活化为特征的免疫疾病。自身免疫性疾病的实例包括但不限于类风湿性关节炎、银屑病关节炎、自身免疫性脱髓鞘疾病(例如，多发性硬化症、过敏性脑脊髓炎)、内分泌性眼病、葡萄膜视网膜炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力、格雷夫斯病、肾小球肾炎、自身免疫性肝病、炎性肠病(例如，克罗恩病)、过敏反应、变态反应、干燥症候群、I型糖尿病、原发性胆汁性肝硬化、韦格纳氏肉芽肿病、纤维肌痛、多肌炎、皮肌炎、多发性内分泌衰竭、施密特氏症候群、自身免疫性葡萄膜炎、艾迪生病、肾上腺炎、甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性甲状腺疾病、恶性贫血、胃萎缩、慢性肝炎、狼疮性肝炎、动脉粥样硬化、亚急性皮肤红斑狼疮、甲状旁腺功能减退症、德雷斯勒症候群、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血、寻常型天疱疮、天疱疮、疱疹样皮炎、斑秃、类天疱疮、硬皮病、进行性系统性硬化症、CREST症候群(钙质沉着症、雷诺氏现象、食管运动障碍、硬皮病)及毛细血管扩张症)、男性及女性自身免疫性不孕不育症、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎、混合性结缔组织疾病、结节性多动脉炎、系统性坏死性脉管炎、特应性皮炎、特应性鼻炎、古德帕斯丘症候群、恰加斯病、结节病、风湿热、哮喘、反复流产、抗磷脂症候群、农民肺、多形性红斑、心切开术后症候群、库欣症候群、自身免疫性慢性活动性肝炎、鸟类爱好者肺、中毒性表皮坏死松解症、阿尔波特症候群、肺泡炎、过敏性肺泡炎、纤维化肺泡炎、间质性肺病、结节性红斑、坏疽性脓皮病、输血反应、高安氏动脉炎、风湿性多肌痛、颞动脉炎、血吸虫病、巨细胞性动脉炎、蛔虫病、曲霉病、萨姆特症候群、湿疹、淋巴瘤样肉芽肿病、白塞病、卡普兰症候群、川崎病、登革热、脑脊髓炎、心内膜炎、心内膜纤维化、眼内炎、隆起性红斑、银屑病、胎儿成红细胞增多症、嗜酸性筋膜炎、舒尔曼症候群、费尔蒂症候群、丝虫病、睫状体炎、慢性睫状体炎、异慢性睫状体炎、富赫氏睫状体炎、IgA肾病、亨-舍二氏紫癜、移植物抗宿主病、移植排斥、心肌病、伊顿-兰伯特症候群、复发性多软骨炎、冷球蛋白血症、瓦登斯特陆巨球蛋白血症、伊文症候群及自身免疫性性腺功能衰竭。
在一些实施例中，本文所描述的方法包括治疗B淋巴细胞病症(例如，系统性红斑狼疮、古德帕斯丘症候群、类风湿性关节炎及I型糖尿病)、Th1淋巴细胞病症(例如，类风湿性关节炎、多发性硬化、银屑病、干燥症候群、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯病、原发性胆汁性肝硬化、韦格纳氏肉芽肿病、结核病或移植物抗宿主病)或Th2淋巴细胞病症(例如，特应性皮炎、系统性红斑狼疮、特应性哮喘、鼻结膜炎、过敏性鼻炎、欧门氏症候群、系统性硬化症或慢性移植物抗宿主病)。通常，涉及树突细胞的疾病涉及Th1淋巴细胞或Th2淋巴细胞的疾病。
如本文所用，“受试者”是指人或动物。通常，该动物为脊椎动物，例如灵长类动物、啮齿类动物、家畜或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴及猕猴，例如恒河猴。啮齿类动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔及仓鼠。家畜及狩猎动物包括牛、马、猪、鹿、野牛、水牛，猫科动物(例如家猫)、犬科动物(例如狗、狐、狼)、鸟类(例如鸡、鸸鹋、鸵鸟)及鱼类(例如鳟鱼、鲶鱼及鲑鱼)。在某些实施例中，受试者为哺乳动物，例如灵长类动物，例如人类。术语“患者”、“个体”及“受试者”在本文中可互换使用。
较佳地，受试者为哺乳动物。哺乳动物可为人类、非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人类以外的哺乳动物可有利地用作例如代表例如各种自身免疫性疾病的动物模型的受试者。此外，本文所描述的方法可用于治疗驯养的动物和/或宠物。受试者可为男性或女性。在某些实施例中，受试者为人类。
在一些实施例中，受试者可为先前已诊断患有或鉴定为患有自身免疫性疾病且需要治疗的受试者，但不必已经经历自身免疫性疾病的治疗。在一些实施例中，受试者也可为先前未被诊断为患有需要治疗的自身免疫性疾病的受试者。在一些实施例中，受试者可为表现出病症的一种或多种风险因素或者与自身免疫性疾病相关的一种或多种并发症的受试者，或者未表现出风险因素的受试者。“需要”治疗自身免疫性疾病的“受试者”特别可为患有该病症或被诊断为患有该病症的受试者。在其他实施例中，“有风险罹患”癌症的受试者是指被诊断为有风险罹患病症或有风险再次患有病症(例如，自身免疫性疾病)的受试者。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“改善”当用于提及疾病、疾患或医学病症时，是指对病症的治疗性治疗，其中该目的在于逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止症状或病症的进展或严重程度。术语“治疗”包括减少或减轻病症的至少一种副作用或症状。若一种或多种症状或临床标志物减少，治疗通常为“有效的”。替代地，若病症的进展减少或停止，则治疗为“有效的”。换而言的，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，还包括停止或至少减缓在未治疗的情况下预期的症状的进展或恶化。有益的或期望的临床结果包括但不限于受试者的自身免疫性细胞的减少、一种或多种症状的减轻、缺陷程度的减少、自身免疫性疾病的稳定(亦即，不恶化)状态、自身免疫性疾病的进展的延迟或减慢、以及与未治疗的情况下所预期的相比寿命增加。如本文所用，术语“给药”是指借由导致偶联物与目标自身免疫性细胞结合的方法或途径向受试者提供如本文所描述的偶联物。类似地，包含如本文所描述的偶联物的药物组合物可借由产生受试者的有效治疗的任何合适的途径给药。
偶联物的用量范围取决于效力，并且涵盖足够大以产生所需效果(例如，自身免疫性疾病的进展减慢或症状的减少)的量。用量不应大到引起不可接受的不良副作用。通常，用量将随受试者的年龄、病症及性别而变化，并且可由本领域技术人员判定。在任何并发症的情况下，用量也可由单独的医师调节。在一些实施例中，用量为0.1mg/kg体重至10mg/kg体重。在一些实施例中，用量为0.5mg/kg体重至15mg/kg体重。在一些实施例中，用量为0.5mg/kg体重至5mg/kg体重。替代地，可滴定以维持血清含量的剂量范围为1μg/mL至1000μg/mL。为了全身给药，可向受试者给药，例如，0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、12mg/kg或更多的治疗量。
可重复上述剂量的给药。在较佳实施例中，上述剂量可每周、每两周、每三周或每月给药，持续数周或数月。治疗的持续时间取决于受试者的临床进展及对治疗的回应。
在一些实施例中，剂量可为约0.1mg/kg至约100mg/kg。在一些实施例中，剂量可为约0.1mg/kg至约25mg/kg。在一些实施例中，剂量可为约0.1mg/kg至约20mg/kg。在一些实施例中，剂量可为约0.1mg/kg至约15mg/kg。在一些实施例中，剂量可为约0.1mg/kg至约12mg/kg。在一些实施例中，剂量可为约1mg/kg至约100mg/kg。在一些实施例中，剂量可为约1mg/kg至约25mg/kg。在一些实施例中，剂量可为约1mg/kg至约20mg/kg。在一些实施例中，剂量可为约1mg/kg至约15mg/kg。在一些实施例中，剂量可为约1mg/kg至约12mg/kg。在一些实施例中，剂量可为约1mg/kg至约10mg/kg。
在一些实施例中，可静脉内给药剂量。在一些实施例中，静脉内给药可为在约10分钟至约4小时的时间段内进行的输注。在一些实施例中，静脉内给药可为在约30分钟至约90分钟的时间段内进行的输注。
在一些实施例中，可每周给药一剂量。在一些实施例中，可每两周给药一剂量。在一些实施例中，可约每两周给药一剂量。在一些实施例中，可约每三周给药一剂量。在一些实施例中，可每四周给药一剂量。
在一些实施例中，向受试者给药总共约2至约10个剂量。在一些实施例中，给药总共4个剂量。在一些实施例中，给药总共5个剂量。在一些实施例中，给药总共6个剂量。在一些实施例中，给药总共7个剂量。在一些实施例中，给药总共8个剂量。在一些实施例中，给药总共9个剂量。在一些实施例中，给药总共10个剂量。在一些实施例中，给药总共大于10个剂量。
含有偶联物的药物组合物可以以单位剂量给药。术语“单位剂量”当使用涉及药物组合物时是指适于作为受试者的单位用量的实体上离散的单位，各单位含有预定量的活性物质(例如，偶联物)，其经计算与所需生理学上可接受的稀释剂(亦即，载体或载剂)结合产生所需的治疗效果。
在一些实施例中，偶联物或其中任何一种的药物组合物与免疫抑制疗法一起给药。在一些实施例中，提供了在接受免疫抑制疗法的受试者中改善治疗结果的方法。该方法通常包括向患有自身免疫性疾病的受试者给药有效量的免疫抑制疗法；以及向受试者给药治疗有效量的偶联物或其药物组合物，其中该偶联物特异性结合目标自身免疫性细胞；其中与单独给药免疫疗法相比，受试者的治疗结果得到改善。在一些实施例中，其偶联物如本文所描述。在一些实施例中，改善的治疗结果为疾病进展的降低、一种或多种症状的缓解等。
借由以下实施例进一步说明本发明，但其不应被解释为限制。
1.一种具有以下式(V)的连接子中间体：
～(AA)s-[L2]≈
(V)
或其盐，其中：
AA为具有1个至12个氨基酸亚单元的氨基酸单元；
s为0或1；
L2为具有1个至4个用于药物单元的连接位点的连接子亚单元；以及
各波浪(～)线表示用于扩展单元的连接位点，以及双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点，
其中至少一个极性单元存在于氨基酸单元、连接子亚单元或两者中，并且其中极性单元选自糖单元、PEG单元、羧基单元及其组合。
2.一种具有以下式(I)的连接子：
～L1-(AA)s-L2≈
(I)
或其盐，其中：
L1为具有用于靶向单元的连接位点的扩展单元；
AA为具有1个至12个亚单元的氨基酸单元；
s为0或1；
L2为具有1个至4个用于药物单元的连接位点的连接子亚单元；
波浪(～)线表示用于靶向单元的连接位点，以及双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点；
其中至少一个极性单元存在于氨基酸单元、连接子亚单元或两者中，并且其中极性单元选自糖单元、PEG单元、羧基单元及其组合。
3.根据前述实施例的连接子中间体或连接子，其中糖单元具有下式：
L3-**N(CH2-(CH(XR))k-X1(X2))2
(X)
或其盐，其中：
各X独立地选自NH或O；
各R独立地选自氢、乙酰基、单糖、二糖及多糖；
各X1独立地选自CH2及C(O)；
各X2独立地选自H、OH及OR；
k为1至10；以及
L3具有以下通式(XI)：
或其盐，其中：
L3a选自C1-C10伸烷基及具有1个至24个乙二醇亚单元的聚乙二醇；
p及o独立地为0至2；
各*及各#表示用于氨基酸单元(AA)的其他亚单元、连接子亚单元L2或扩展单元(L1)的连接位点；
以及
L3a共价结合至式(X)中用**标记的N原子。
4.根据前述实施例中任一项的连接子中间体或连接子，其中糖单元具有选自以下的式：
或其盐，其中：
各R独立地选自氢、单糖、二糖及多糖；
p及o独立地为0至2；
m为1至8；
n为0至4；以及
各*及各#表示用于氨基酸单元(AA)的其他亚单元、连接子亚单元L2或扩展单元(L1)的连接位点。5.根据前述实施例中任一项的连接子中间体或连接子，其中PEG单元具有选自以下的式：
(a)
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-NR24R25
(XX)
或其盐，其中：
R20为用于连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R21及R22各自独立地为视情况选用的C1-C3伸烷基；
R24及R25各自独立地选自H；多羟基基团；经取代的多羟基基团；-C(O)-多羟基基团；经取代的-C(O)-多羟基基团；视情况经取代的C3-C10碳环；视情况经取代的C1-C3伸烷基C3-C10碳环；视情况经取代的杂芳基；视情况经取代的碳环；经取代的-C1-C8烷基；经取代的-C(O)-C1-C8烷基；
螯合物；-C(O)-R28，其中R28为式(XII)或式(XIII)的糖单元；或与-NR24R25一起形成C3-C8杂环；
波浪线(～)表示与R20的连接位点；以及
n20为1至26；
或
(b)
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-NR24R25
(XX)
或其盐，其中：
R20为用于连接至氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R21及R22各自独立地为视情况选用的C1-C3伸烷基；
R24及R25中的一者选自H；多羟基基团；经取代的多羟基基团；-C(O)-多羟基基团；经取代的-
C(O)-多羟基基团；视情况经取代的C3-C10碳环；视情况经取代的C1-C3伸烷基C3-C10碳环；视情况经取代的杂芳基；视情况经取代的碳环；经取代的-C1-C8烷基；经取代的-C(O)-C1-C8烷基；螯合物；-C(O)-R28，其中R28为式(XII)或式(XIII)的糖单元；并且R24及R25中的另一者为聚乙二醇，视情况具有1个至24个乙二醇亚单元；
波浪线(～)表示与R20的连接位点；以及
n20为1至26；
或
(c)
～R20-[-R26-[R29-[O-CH2-CH2-]n20R29]n21-R27-]n27-NR24R25
(XXI)
或其盐，其中：
R20为用于连接至氨基酸单元的亚单元和/或该连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R26及R27各自视情况且独立地选自C1-C12伸烷基、-NH-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-NH-、-
C(O)-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-C(O)-、-NH-C1-C12伸烷基-C(O)-及-C(O)-C1-C12伸烷基-NH-；
R24及R25中的一者选自H；多羟基基团；经取代的多羟基基团；-C(O)-多羟基基团；经取代的-
C(O)-多羟基基团；视情况经取代的C3-C10碳环；视情况经取代的C1-C3伸烷基C3-C10碳环；视情况经取代的杂芳基；视情况经取代的碳环；经取代的-C1-C8烷基；经取代的-C(O)-C1-C8烷基；螯合物；-C(O)-R28，其中R28为式(XII)或式(XIII)的糖单元；并且R24及R25中的另一者选自H；多羟基基团；经取代的多羟基基团；-C(O)-多羟基基团；经取代的-C(O)-多羟基基团；视情况经取代的C3-C10碳环；视情况经取代的C1-C3伸烷基C3-C10碳环；视情况经取代的杂芳基；视情况经取代的碳环；经取代的-C1-C8烷基；经取代的-C(O)-C1-C8烷基；螯合物；-C(O)-R28，其中R28为式(XII)或式(XIII)的糖单元；及聚乙二醇，视情况具有1个至24个乙二醇亚单元；或与-NR24R25一起形成C3-C8杂环；
波浪线(～)表示与R20的连接位点；
n20为1至26；
n21为1至4；以及
n27为1至4。
6.根据实施例5的连接子中间体或连接子，其中R24及R25均不为H。
7.根据实施例5至6中任一项的连接子中间体或连接子，其中R24及R25各自独立地选自H及多羟基基团，其限制条件为R24及R25不都为H。
8.根据实施例5至7中任一项的连接子中间体或连接子，其中多羟基基团为线性单糖，视情况选自C6或C5糖、糖酸或氨基糖。
9.根据实施例方案8的连接子中间体或连接子，其中:
C6或C5糖选自葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脱氧葡萄糖、甘油醛、赤藓糖、苏糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、醛糖及酮糖；糖酸选自葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸及酮糖酸；或
氨基糖选自葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、半乳糖胺及N-乙酰半乳糖胺。
10.根据实施例5至9中任一项的连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下，或其盐：
其中R39选自H、直链单糖及聚乙二醇，视情况具有1个至24个乙二醇亚单元；并且左侧的波浪线表示与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元的一部分的连接位点。
11.根据实施例5至6中任一项的连接子中间体或连接子，其中R24及R25中的一者为线性单糖，并且另一者为环状单糖。
12.根据实施例11的连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下，或其盐：
其中R41为环状单糖；并且左侧的波浪线表示与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元的一部分的连接位点。
13.根据实施例5至6中任一项的连接子中间体或连接子，其中R24及R25独立地选自环状单糖、二糖及多糖。
14.根据实施例13的连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下，或其盐：
其中各R45选自H及单糖、二糖或多糖；并且R46选自环状单糖、二糖或多糖；并且右侧的波浪线表示与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元的一部分的连接位点。
15.根据实施例5至6中任一项的连接子中间体或连接子，其中R24及R25独立地选自线性单糖及经取代的线性单糖，其中该经取代的线性单糖被单糖、二糖或多糖取代。
16.根据实施例15的连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下，或其盐：
其中R47为线性单糖；并且各R49选自单糖、二糖及多糖；并且左侧的波浪线表示与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元的一部分的连接位点。
17.根据实施例5至6中任一项的连接子中间体或连接子，其中R24及R25独立地选自线性单糖及经取代的单糖，其中该经取代的线性单糖被一个或多个选自烷基、O-烷基、芳基、O-芳基、羧基、酯或酰胺的取代基取代，并且视情况进一步被单糖、二糖或多糖取代。
18.根据实施例17的连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下，或其盐：
其中各R42独立地选自线性单糖及经取代的线性单糖；各R43独立地选自烷基、O-烷基、芳基、O-芳基、羧基、酯及酰胺；并且左侧的波浪线表示与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元的一部分的连接位点。
19.根据实施例5至6中任一项的连接子中间体或连接子，其中R24及R25中的为-C(O)-多羟基基团或经取代的-C(O)-多羟基基团，并且R24及R25中的另一个H、-C(O)-多羟基基团、经取代的-C(O)-多羟基基团、多羟基基团或经取代的多羟基基团；其中该经取代的-C(O)-多羟基基团及多羟基基团被单糖、二糖、多糖、烷基、-O-烷基、芳基、羧基、酯或酰胺取代。
20.根据实施例19的连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下，或其盐：
其中左侧的波浪线表示与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元的一部分的连接位点。
21.根据实施例5至6中任一项的连接子中间体或连接子，其中R24及R25独立地选自H、经取代的-C1-C8烷基、经取代的-C1-C4烷基或经取代的-C1-C3烷基；其限制条件为R24及R25均不为H；其中经取代的-C1-C8烷基、-C1-C4烷基及-C1-C3烷基被羟基和/或羧基取代。
22.根据实施例21的连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下，或其盐：
其中R48选自H、OH、CH2OH、COOH或被羟基或羧基取代的-C1-C6烷基；并且左侧的波浪线表示与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元的一部分的连接位点。
23.根据实施例5至6中任一项的连接子中间体或连接子，其中R24及R25中的一者选自H、经取代的-C(O)-C1-C8烷基、经取代的-C(O)-C1-C4及经取代的-C(O)-C1-C3烷基，并且R24及R25中的另一者选自经取代的-C(O)-C1-C8烷基、经取代的-C(O)-C1-C4烷基、经取代的-C(O)-C1-C3烷基、经取代的-C1-C8烷基、经取代的-C1-C4烷基及经取代的-C1-C3烷基，其中经取代的-C(O)-C1-C8烷基、经取代的-C(O)-C1-C4烷基、经取代的-C(O)-C1-C3烷基、经取代的-C1-C8烷基、-C1-C4烷基及-C1-C3烷基被羟基和/或羧基取代。
24.根据实施例23的连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下，或其盐：
其中左侧的波浪线表示与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元的一部分的连接位点。
25.根据实施例5至6中任一项的连接子中间体或连接子，其中R24及R25选自H及视情况经取代的芳基；其限制条件为R24及R25均不为H。
26.根据实施例25的连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下，或其盐：
其中左侧的波浪线表示与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元的一部分的连接位点。
27.根据实施例5至6中任一项的连接子中间体或连接子，其中R24及R25一起形成视情况经取代的C3-C8杂环或杂芳基。
28.根据实施例27的连接子中间体或连接子，其中PEG单元为：
29.根据实施例5至6中任一项的连接子中间体或连接子，其中R24及R25独立地选自H及螯合物，其中该螯合物视情况借由伸烷基、伸芳基、碳环、杂伸芳基或杂碳环连接至-NR24R25的氮；其限制条件为R24及R25均不为H。
30.根据实施例29的连接子中间体或连接子，其中螯合物选自乙二胺四乙酸(EDTA)、二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)、三伸乙基四胺六乙酸(TTHA)、苄基-DTPA、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N”,N”'-四乙酸(DOTA)、苄基-DOTA、1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N',N”-三乙酸(NOTA)、苄基-NOTA、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)及N,N'-二烷基取代的哌嗪。
31.根据实施例30的连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下，或其盐：
其中左侧的波浪线表示与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元的一部分的连接位点。
32.根据实施例5至19中任一项的连接子中间体或连接子，其中各单糖独立地选自：
C5或C6糖，该C5或C6糖选自葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脱氧葡萄糖、甘油醛、赤藓糖、苏糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、醛糖、酮糖、葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、半乳糖胺及N-乙酰半乳糖胺；
糖酸，该糖酸选自葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸及酮糖酸；或
氨基糖，该氨基糖选自葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、半乳糖胺及N-乙酰半乳糖胺。
33.根据实施例5至32中任一项的连接子中间体或连接子，其中R20选自羧基、氨基、炔基、叠氮基、羟基、羰基、氨基甲酸酯、脲、硫代氨基甲酸酯、硫脲、磺酰胺、酰基磺酰胺、烷基磺酸酯或其受保护的形式。
34.根据实施例1至4中任一项的连接子中间体或连接子，其中PEG单元具有选自以下的式：
(a)
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-R30
(XXX)
或其盐，其中：
R20为用于连接至氨基酸单元的亚单元(若存在)和/或连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R21及R22各自视情况且，若存在，独立地为C1-C3伸烷基基团；
R30选自视情况经取代的C3-C10碳环；硫脲；视情况经取代的硫脲；脲；视情况经取代的脲；磺酰胺；烷基磺酰胺；酰基磺酰胺、视情况经取代的烷基磺酰胺；视情况经取代的酰基磺酰胺；磺酰胺；视情况经取代的磺酰胺；胍，包括烷基胍及芳基胍；磷酰胺；或视情况经取代的磷酰胺；或
R30选自叠氮基、炔基、经取代的炔基、-NH-C(O)-炔基、-NH-C(O)-炔基-R65；环辛炔；-NH-环辛炔、-NH-C(O)-环辛炔或-NH-(环辛炔)2；其中R65选自视情况经取代的烷基、视情况经取代的烯基、视情况经取代的炔基、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基、视情况经取代的杂碳环或视情况经取代的杂芳基；
波浪线(～)表示与R20的连接位点；以及
n20为1至26；
(b)
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-NH-C(O)-R31
(XXXI)
或其盐，其中：
R20为用于连接至氨基酸单元的亚单元(若存在)或连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R21及R22各自独立地为视情况选用的C1-C3伸烷基基团；
R31为支链聚乙二醇链，各支链具有1个至26个乙二醇亚单元，并且各支链在其末端具有R35；
R35为叠氮基、炔基、炔基-R65、环辛炔或环辛炔-R65，其中R65选自视情况经取代的烷基、视情况经取代的烯基、视情况经取代的炔基、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基、视情况经取代的杂碳环或视情况经取代的杂芳基；
波浪线(～)表示与R20的连接位点；以及
n20为1至26；
(c)
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-C(O)NH-R31
(XXXII)
或其盐，其中：
R20为用于连接至氨基酸单元的亚单元(若存在)或连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R21及R22各自视情况且独立地为C1-C3伸烷基基团；
R31为支链聚乙二醇链，各支链独立地具有1个至26个乙二醇亚单元，并且各支链在其末端具有
R35；
R35为叠氮基、炔基、炔基-R65、环辛炔或环辛炔-R65，其中R65选自视情况经取代的烷基、视情况经取代的烯基、视情况经取代的炔基、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基、视情况经取代的杂碳环及视情况经取代的杂芳基；
波浪线(～)表示与R20的连接位点；以及
n20为1至26；以及
(d)
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-N-(R33-R31)2
(XXXIII)
或其盐，其中：
R20为用于连接至氨基酸单元的亚单元(若存在)或连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R21及R22各自视情况且为C1-C3伸烷基基团；
R31为支链聚乙二醇链，各支链具有1个至26个乙二醇亚单元，并且各支链在其末端具有R35；
R33为C1-C3伸烷基、-C1-C3伸烷基-C(O)、-C(O)-C1-C3伸烷基或-C(O)-C1-C3伸烷基-C(O)；
R35为叠氮基、炔基、炔基-R65、环辛炔或环辛炔-R65，其中R65选自视情况经取代的烷基、视情况经取代的烯基、视情况经取代的炔基、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基、视情况经取代的杂碳环或视情况经取代的杂芳基；
波浪线(～)表示与R20的连接位点；以及
n20为1至26。
35.根据实施例1至4中任一项的连接子中间体或连接子，其中PEG单元具有选自以下式，或其盐：
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-NH-C(O)-R31
(XXXI)，
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-C(O)NH-R31
(XXXII)，
或
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-N-(R33-R31)2
(XXXIII)；
其中R20为用于连接至氨基酸单元的亚单元(若存在)或连接子亚单元L2的一部分的官能基；R21及R22各自视情况且为C1-C3伸烷基基团；R31为支链聚乙二醇链，各支链具有1个至26个乙二醇亚单元，并且各支链在其末端具有R35；R33为C1-C3伸烷基、-C1-C3伸烷基-C(O)、-C(O)-C1-C3伸烷基或-C(O)-C1-C3伸烷基-C(O)；R35为叠氮基、炔基、炔基-R65、环辛炔或环辛炔-R65，其中R65选自视情况经取代的烷基、视情况经取代的烯基、视情况经取代的炔基、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基、视情况经取代的杂碳环或视情况经取代的杂芳基；该波浪(～)线表示与R20的连接位点；以及n20为1至26。
36.根据实施例35的连接子中间体或连接子，其中PEG单元选自以下：
其中R65选自视情况经取代的烷基、视情况经取代的烯基、视情况经取代的炔基、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基、视情况经取代的杂碳环或视情况经取代的杂芳基；并且左侧的波浪线表示与氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元的一部分的连接位点。
37.根据实施例34至37中任一项的连接子中间体或连接子，其中R20选自羧基、氨基、炔基、叠氮基、羟基、羰基、氨基甲酸酯、脲、硫代氨基甲酸酯、硫脲、磺酰胺、酰基磺酰胺、烷基磺酸酯或其受保护的形式。
38.根据实施例1至4中任一项的连接子中间体或连接子，其中羧基单元具有下式：
或其盐，其中：
(a)
L70选自C1-C8伸烷基、C1-C8伸烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C8伸烷基-及-C(O)-C1-C8伸烷基-C(O)-；
R70为～NR71(R72-R73)，其中R71选自H、C1-C12烷基、经取代的C1-C12烷基或聚乙二醇(视情况具有1个至12个乙二醇亚单元)，R72不存在或选自视情况经取代的C1-C3伸烷基、视情况经取代的醚、视情况经取代的硫醚、视情况经取代的酮、视情况经取代的酰胺、聚乙二醇(视情况具有1个至12个乙二醇亚单元)、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基或视情况经取代的杂芳基，并且R73为羧基或多羧基，其中多羧基包含1至10、或1至6、或1至4个羧基基团，其中这些羧基基团借由烷基、伸烷基、经取代的烷基、经取代的伸烷基、杂烷基、杂伸烷基、氨基和/或酰胺相互连接；
各波浪线(～)表示用于氨基酸单元(AA)的其他亚单元、连接子亚单元L2或扩展单元(L1)的连接位点；以及
p1及o1分别独立地选自0至2；
或
(b)
L70选自C1-C8伸烷基、C1-C8伸烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C8伸烷基-及-C(O)-C1-C8伸烷基-C(O)-；
R70为～NR71(R75-(R73)2)，其中R71选自H、C1-C12烷基、经取代的C1-C12烷基或聚乙二醇(视情况具有1个至12个乙二醇亚单元)，R75为支链的视情况经取代的C1-C3伸烷基、视情况经取代的醚、视情况经取代的硫醚、视情况经取代的酮、视情况经取代的酰胺、聚乙二醇(视情况具有1个至12个乙二醇亚单元)、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基或视情况经取代的杂芳基，并且各R73独立地为羧基或多羧基，其中多羧基包含1至10、或1至6、或1至4个羧基基团，其中这些羧基基团借由烷基、伸烷基、经取代的烷基、经取代的伸烷基、杂烷基、杂伸烷基、氨基和/或酰胺相互连接；
各波浪线(～)表示用于氨基酸单元(AA)的其他亚单元、连接子亚单元L2或扩展单元(L1)的连接位点；以及
p1及o1分别独立地选自0至2；
或
(c)
L70选自C1-C8伸烷基、C1-C8伸烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C8伸烷基-及-C(O)-C1-C8伸烷基-C(O)-；
R70为～N(R74-R73)(R72-R73)，其中R72及R74各自独立地选自视情况经取代的C1-C3伸烷基、视情况经取代的醚、视情况经取代的硫醚、视情况经取代的酮、视情况经取代的酰胺、聚乙二醇(视情况具有1个至12个乙二醇亚单元)、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基或视情况经取代的杂芳基，并且各R73独立地为羧基或多羧基，其中多羧基包含1至10、或1至6、或1至4个羧基基团，其中这些羧基基团借由烷基、伸烷基、经取代的烷基、经取代的伸烷基、杂烷基、杂伸烷基、氨基和/或酰胺相互连接；
各波浪线(～)表示用于氨基酸单元(AA)的其他亚单元、连接子亚单元L2或扩展单元(L1)的连接位点；以及
p1及o1分别独立地选自0至2。
39.根据实施例1至38中任一项的连接子中间体或连接子，其包含至少一个糖单元。
40.根据实施例1至38中任一项的连接子中间体或连接子，其包含至少一个PEG单元。
41.根据实施例1至38中任一项的连接子中间体或连接子，其包含至少一个羧基单元。
42.根据实施例1至38中任一项的连接子中间体或连接子，其包含至少两个极性单元，各极性单元选自糖单元、PEG单元及羧基单元。
43.根据实施例1至38中任一项的连接子中间体或连接子，其包含至少一个糖单元及PEG单元或羧基单元。
44.根据实施例1至38中任一项的连接子中间体或连接子，其包含至少一个羧基单元及PEG单元。
45.根据实施例1至44中任一项的连接子中间体或连接子，其中存在该氨基酸单元(AA)(s＝1)。
46.根据实施例1至45中任一项的连接子中间体或连接子，其中该氨基酸单元包含至少一个极性单元。
47.根据实施例1至45中任一项的连接子中间体或连接子，其中～AA-L2～具有选自以下的式：
～[SU-aa]-L2≈，
～[aa1(PEG)-aa]-L2≈，或
～[CU-aa]-L2≈
其中中括号表示氨基酸单元，各aa为AA的视情况选用的亚单元，L2为连接子亚单元，各波浪线(～)表示用于扩展单元的连接位点；aa1(PEG)为连接至AA的氨基酸亚单元的PEG单元，SU为连接至AA的亚单元的糖单元或连接至L2的糖单元，并且CU为连接至AA的亚单元的羧基单元或连接至L2的羧基单元；并且双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点，其中aa及aa1独立地选自α、β及γ氨基酸及其衍生物。
48.根据实施例1至45中任一项的连接子中间体或连接子，其中～AA-L2～具有选自以下的式：
其中中括号表示氨基酸单元，各aa为AA的氨基酸亚单元，L2为连接至aa的侧链的连接子亚单元，波浪线(～)表示用于扩展单元的连接位点；aa1(PEG)为连接至aa的PEG单元，SU为连接至aa的糖单元，CU为连接至aa的羧基单元，并且双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点；其中aa及aa1独立地选自α、β及γ氨基酸及其衍生物。
49.根据实施例1至46中任一项的连接子中间体或连接子，其中氨基酸单元包括至少两个极性单元。
50.根据实施例49的连接子中间体或连接子，其中～AA-L2～具有选自以下的式：
～[SU-aa-SU]-L2≈，
～[aa1(PEG)-aa-aa2(PEG)]-L2≈，或
～[CU-aa-CU]-L2≈
其中中括号表示氨基酸单元，aa为AA的视情况选用的亚单元，L2为连接子亚单元，波浪线(～)表示用于扩展单元的连接位点；aa1(PEG)及aa2(PE G)分别为连接至aa的PEG单元或连接至其他PEG单元的PEG单元；各SU为连接至aa的糖单元或连接至其他糖单元的糖单元，各CU为连接至aa的羧基单元或连接至其他羧基单元的羧基单元，并且双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点；其中aa、aa1及aa2独立地选自α、β及γ氨基酸及其衍生物。
51.根据实施例49的连接子中间体或连接子，其中～AA-L2～具有选自以下的式：
其中中括号表示氨基酸单元，aa为AA的氨基酸亚单元，L2为连接至aa的侧链的连接子亚单元，各波浪线(～)表示用于扩展单元的连接位点；aa1(PEG)及aa2(PEG)分别为连接至aa的PEG单元，各SU为连接至aa的糖单元；各CU为连接至aa的羧基单元；并且双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点；其中aa、aa1及aa2分别独立地选自α、β及γ氨基酸及其衍生物。
52.根据前述实施例中任一项的连接子中间体或连接子，其中连接子亚单元L2为可裂解的连接子单元。
53.根据实施例52的连接子中间体或连接子，其中连接子亚单元L2包括可被细胞内蛋白酶裂解的肽。
54.根据实施例53的连接子中间体或连接子，其中可裂解的肽包括缬氨酸-瓜氨酸肽、缬氨酸-丙氨酸肽、缬氨酸-赖氨酸肽、苯丙氨酸-赖氨酸肽或甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸肽。
55.根据前述实施例中任一项的连接子中间体或连接子，其中连接子亚单元L2包含至少一个极性单元。
56.根据前述实施例中任一项的连接子中间体或连接子，其中该极性单元为糖单元(SU)。
57.根据实施例56的连接子中间体或连接子，其中可裂解的肽包括SU-缬氨酸-瓜氨酸肽、SU-缬氨酸-赖氨酸肽、SU-缬氨酸-丙氨酸肽、SU-苯丙氨酸-赖氨酸肽或SU-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸肽。
58.根据实施例55的连接子中间体或连接子，其中极性单元为羧基单元(CU)。
59.根据实施例58的连接子中间体或连接子，其中可裂解的肽包括CU-缬氨酸-瓜氨酸肽、CU-缬氨酸-赖氨酸肽、缬氨酸-(CU-赖氨酸)肽、CU-缬氨酸-丙氨酸肽、CU-苯丙氨酸-赖氨酸肽、苯丙氨酸-(CU-赖氨酸)肽或CU-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸肽，其中CU-赖氨酸为包含赖氨酸残基的羧基单元。
60.根据实施例55的连接子中间体或连接子，其中极性单元为PEG单元(PEG)。
61.根据实施例60的连接子中间体或连接子，其中可裂解的肽包括Lys(PEG)-缬氨酸-瓜氨酸肽、缬氨酸-Cit(PEG)肽、Lys(PEG)-缬氨酸-赖氨酸肽、缬氨酸-赖氨酸(PEG)肽、Lys(PEG)-缬氨酸-丙氨酸肽、Lys(PEG)-苯丙氨酸-赖氨酸肽、苯丙氨酸-Lys(PEG)肽或Lys(PEG)-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸肽，其中Lys(PEG)及Cit(PEG)分别包含连接至赖氨酸残基或瓜氨酸残基的PEG单元。
62.根据实施例52至61中任一项的连接子中间体或连接子，其中可裂解的肽连接至对氨基苄醇自分解基团(PABA)。
63.根据实施例62的连接子中间体或连接子，其中～AA-L2～具有以下结构中的一种：
其中氨基基团上的波浪线表示用于扩展单元的连接位点。
64.根据实施例52至62中任一项的连接子中间体或连接子，其中L2连接至AA的亚单元的侧链。
65.根据实施例64的连接子中间体或连接子，其中～AA-L2～具有以下结构中的一种：
其中氨基基团上的波浪线表示用于扩展单元的连接位点。
66.根据实施例1至62中任一项的连接子中间体或连接子，其中氨基酸单元借由非肽连接基团连接至连接子亚单元L2。
67.根据实施例66的连接子，其中非肽连接基团选自C1-C10伸烷基、C2-C10伸烯基、C2-C10亚炔基或聚乙二醇。
68.根据前述实施例中任一项的连接子中间体，进一步包含扩展单元。
69.根据实施例68的连接子，其中扩展单元选自以下：
其中R17为-C1-C10伸烷基-、-C1-C10杂伸烷基-、-C3-C8碳环-、-O-(C1-C8伸烷基)-、-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-(其中b为1至26)、-伸芳基-、-C1-C10伸烷基-伸芳基-、-伸芳基-C1-C10伸烷基-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8碳环)-、-(C3-C8碳环)-C1-C10伸烷基-、-C3-C8杂环-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8杂环)-、-(C3-C8杂环)-C1-C10伸烷基-、-C1-C10伸烷基-C(＝O)-、C1-C10杂伸烷基-C(＝O)-、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-C(＝O)-(其中b为1至26)、-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-C(＝O)-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-C(＝O)-(其中b为1至26)、-C3-C8碳环-C(＝O)-、-O-(C1-C8烷基)-C(＝O)-、-伸芳基-C(＝O)-、-C1-C10伸烷基-伸芳基-C(＝O)-、-伸芳基-C1-C10伸烷基-C(＝O)-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8碳环)-C(＝O)-、-(C3-C8碳环)-C1-C10伸烷基-C(＝O)-、-C3-C8杂环-C(＝O)-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8杂环)-C(＝O)-、-(C3-C8杂环)-C1-C10伸烷基-C(＝O)-、-C1-C10伸烷基-NH-、-C1-C10杂伸烷基-NH-、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-NH-(其中b为1至26)、-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-NH-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-NH-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(C(＝O))-NH-(CH2-O-CH2)b-C(＝O)-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(C(＝O))-NH-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-C(＝O)-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-NH-(C(＝O))-(CH2-O-CH2)b-NH-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-NH-(C(＝O))-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-NH-(其中b为1至26)、-C3-C8碳环-NH-、-O-(C1-C8烷基)-NH-、-伸芳基-NH-、-C1-C10伸烷基-伸芳基-NH-、-伸芳基-C1-C10伸烷基-NH-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8碳环)-NH-、-(C3-C8碳环)-C1-C10伸烷基-NH-、-C3-C8杂环-NH-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8杂环)-NH-、-(C3-C8杂环)-C1-C10伸烷基-NH-、-C1-C10伸烷基-S-、C1-C10杂伸烷基-S-、-C3-C8碳环-S-、-O-(C1-C8烷基)-S-、-伸芳基-S-、-C1-C10伸烷基-伸芳基-S-、-伸芳基-C1-C10伸烷基-S-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8碳环)-S-、-(C3-C8碳环)-C1-C10伸烷基-S-、-C3-C8杂环-S-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8杂环)-S-或-(C3-C8杂环)-C1-C10伸烷基-S-；或
其中扩展单元包括顺丁烯二酰亚胺基(C1-C10伸烷基-C(O)-、顺丁烯二酰亚胺基(CH2OCH2)p2(C1-C10伸烷基)C(O)-、顺丁烯二酰亚胺基(C1-C10伸烷基)(CH2OCH2)p2C(O)-或其开环形式，其中p2为1至26。
70.根据实施例69的连接子，该连接子具有以下结构中的一种：
71.根据前述实施例中任一项的连接子，进一步包含连接至连接子亚单元L2以形成药物-连接子的至少一个药物单元。
72.根据实施例71的药物-连接子，其中药物单元选自细胞毒性剂、免疫调节剂、核酸、生长抑制剂、PROTAC、毒素、放射性同位素及螯合配体。
73.根据实施例72的药物-连接子，其中药物单元为细胞毒性剂。
74.根据实施例73的药物-连接子，其中细胞毒性剂选自奥瑞他汀、美登素类化合物、喜树碱、倍癌霉素及卡奇霉素。
75.根据实施例74的药物-连接子，其中细胞毒性剂为奥瑞他汀。
76.根据实施例75的药物-连接子，其中细胞毒性剂为MMAE或MMAF。
77.根据实施例74的药物-连接子，其中细胞毒性剂为喜树碱。
78.根据实施例77的药物-连接子，其中细胞毒性剂为依喜替康或SN-38。
79.根据实施例73的药物-连接子，其中细胞毒性剂为卡奇霉素。
80.根据实施例73的药物-连接子，其中细胞毒性剂为美登素类化合物。
81.根据实施例80的药物-连接子，其中美登素类化合物为美登素、美登醇或安沙霉素-2。
82.根据实施例72的药物-连接子，其中药物单元为免疫调节剂。
83.根据实施例82的药物-连接子，其中免疫调节剂选自TRL7促效剂、TLR8促效剂、STING促效剂或RIG-I促效剂。
84.根据实施例83的药物-连接子，其中免疫调节剂为TLR7促效剂。
85.根据实施例84的药物-连接子，其中TLR7促效剂为咪唑并喹啉、咪唑并喹啉胺、噻唑并喹啉、氨基喹啉、氨基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-氨基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺、四氢吡啶并嘧啶、杂芳并噻二嗪-2,2-二氧化物、苯并萘啶、鸟苷类似物、腺苷类似物、胸苷均聚物、ssRNA、CpG-A、PolyG10或PolyG3。
86.根据实施例83的药物-连接子，其中免疫调节剂为TLR8促效剂。
87.根据实施例86的药物-连接子，其中TLR8促效剂选自咪唑并喹啉、噻唑并喹啉、氨基喹啉、氨基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-氨基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺、四氢吡啶并嘧啶或ssRNA。
88.根据实施例83的药物-连接子，其中免疫调节剂为STING促效剂。
89.根据实施例83的药物-连接子，其中免疫调节剂为RIG-I促效剂。
90.根据实施例89的药物-连接子，其中RIG-I促效剂选自KIN1148、SB-9200、KIN700、KIN600、KIN500、KIN100、KIN101、KIN400及KIN2000。
91.根据实施例72的药物-连接子，其中药物单元为螯合配体。
92.根据实施例91的药物-连接子，其中螯合配体选自铂(Pt)、钌(Ru)、铑(Rh)、金(Au)、银(Ag)、铜(Cu)、钼(Mo)、钛(Ti)或铱(Ir)；放射性同位素，例如钇-88、钇-90、锝-99、铜-67、铼-188、铼-186、镓-66、镓-67、铟-111、铟-114、铟-115、镥-177、锶-89、钐-153及铅-212。
93.偶联物，其包含连接至实施例72至92中任一项的药物-连接子的靶向单元。
94.根据实施例93的偶联物，其中靶向单元选自抗体或其抗原结合部分。
95.根据实施例94的药物-连接子，其中靶向单元为单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')、Fv、二硫键连接的Fc、scFv、单域抗体、双抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
96.根据实施例93的偶联物，其中靶向单元为双抗体、DART、抗运载蛋白、亲合体、阿维默、DARPin或阿德内丁蛋白。
97.根据实施例93至96中任一项的偶联物，其中靶向单元为单特异性的。
98.根据实施例93至97中任一项的偶联物，其中靶向单元为二价的。
99.根据实施例93至96中任一项的偶联物，其中靶向单元为双特异性的。
100.根据实施例93至99中任一项的偶联物，其中该偶联物的平均载药量(pload)为约1至约8、约2、约4、约6、约8、约10、约12、约14、约16、约3至约5、约6至约8或约8至约16。
101.根据实施例93至100中任一项的偶联物，其选自以下：
其中Ab为靶向单元并且n为pload。
102.一种药物组合物，其包含实施例93至101中任一项的偶联物及医药学上可接受的载体。
103.一种治疗有需要的受试者的方法，包括向受试者给药实施例93至101中任一项的偶联物或实施例102的药物组合物，其中受试者患有癌症或自身免疫性疾病，并且偶联物结合与癌症或自身免疫性疾病相关的目标抗原。
本公开内容的实施方案的描述并非旨在穷举或将本公开内容限制于所公开的精确形式。虽然本文出于说明目的描述了本公开内容的具体实施方案及实施例，但如相关领域技术人员将认识到的，在本公开内容的范围内，各种等同的修改为可行的。视情况而定，本文提供的本公开内容的教导可以适用于其他程式或方法。可将本文描述的各种实施例组合以提供其他实施例。若需要，可以修改本公开内容的方面，以采用上述参考文献及申请的组成、功能及构思来提供本公开内容的其他实施例。可根据具体实施方式对本公开内容进行这些和其他的改变。
任何前述实施例的具体要素可以组合或替代其他实施例中的要素。此外，虽然已经在这些实施方案的上下文中描述了与本公开内容的某些实施例相关的优点，但其他实施例也可以呈现这些优点，并且并非所有实施方案均必须呈现落入本公开内容的范围内的这些优点。
为了描述及公开例如在可能与本发明结合使用的此类出版物中描述的方法，将所标识的所有专利及其他出版物明确地借由引入并入本文。提供这些出版物仅由于其的公开内容在本申请的申请日之前。在这点上，不应将其解释为承认本发明人无权由于先前发明或出于任何其他原因而先于这些公开内容。关于这些文献的日期或内容的描述的所有陈述均基于申请人可获得的信息，且不构成对这些档案的日期或内容的正确性的任何认可。
实例
一般方法
在Bruker AVIII 400或Bruker AVIII 500上记录1HNMR及其他NMR光谱。用Nuts软件或MestReNova软件处理数据，测量自内标四甲基矽烷低场的以百万分率(ppm)计的质子位移。
HPLC-MS测量在Agilent 1200HPLC/6100SQ系统上使用以下条件进行：
方法A：流动相：A：水(0.01％TFA)B：乙腈(0.01％TFA)；梯度相：在15分钟内5％的B增加至95％的B；流速：1.0mL/min；管柱：XBridge C18、4.6*150mm，3.5um；管柱温度：40℃。检测器：ADC ELSD、DAD(214nm及254nm)、ES-API。
方法B：流动相：A：水(0.01％TFA)B：乙腈(0.01％TFA)；梯度相：在15分钟内5％的B增加至95％的B；流速：1.0mL/min；管柱：SunFire C18、4.6*150mm、3.5μm；管柱温度：45℃。检测器：ADC ELSD、DAD(214nm及254nm)、ES-API。
方法C：流动相：A：水(10mM NH4HCO3)B：乙腈；梯度相：在15分钟内5％的B至95％的B；流速：1.0mL/min；管柱：XBridge C18、4.6*150mm、3.5μm；管柱温度：40℃。检测器：ADCELSD、DAD(214nm及254nm)、MSD(ES-API)。
LCMS测量在Agilent 1200HPLC/6100SQ系统上使用以下条件进行：
方法A：流动相：A：水(0.01％TFA)B：乙腈(0.01％TFA)；梯度相：在3分钟内5％的B增加至95％的B；流速：1.8至2.3mL/min；管柱：SunFire C18、4.6*50mm、3.5μm；管柱温度：50℃。检测器：ADC ELSD、DAD(214nm及254nm)、ES-API。
方法B：流动相：A：水(10mM NH4HCO3)B：乙腈；梯度相：在3分钟内5％的B至95％的B；流速：1.8至2.3mL/min；管柱：XBridge C18、4.6*50mm、3.5μm；管柱温度：50℃。检测器：ADCELSD、DAD(214nm及254nm)、MSD(ES-API)。
制备型高压液相层析(Prep-HPLC)在Gilson 281上使用以下条件进行：
方法A：Waters SunFire 10μm C18管柱(250x19mm)。溶剂A为水/0.01％三氟乙酸(TFA)，并且溶剂B为乙腈。洗脱条件为溶剂B在20分钟的时间内以30mL/min的流速自5％线性梯度增加至100％。
方法B：Waters SunFire 10μm C18管柱(250x19mm)。溶剂A为水/0.05％甲酸(FA)，并且溶剂B为乙腈。洗脱条件为溶剂B在20分钟的时间内以30mL/min的流速自5％线性梯度增加至100％。
方法C：Waters Xbridge 10μm C18管柱(250x19mm)。溶剂A为水/10mM碳酸氢铵(NH4HCO3)，并且溶剂B为乙腈。洗脱条件为溶剂B在20分钟的时间内以30mL/min的流速自5％线性梯度增加至100％。
在Biotage的仪器上进行快速层析，使用Agela快速管柱二氧化矽-CS；在Biotage的仪器上进行反相快速层析，使用Boston ODS或Agela C18。
实例1：糖单元的制备
如下制备糖单元：
步骤1
将化合物L1(5g，10.846mmol)、D-葡萄糖(19.54g，108.460mmol)、NaBH3CN(5.45g，86.768mmol)及磷酸二氢钾(0.379mL，6.508mmol)的水(40mL)及乙醇(65mL)反应混合物在50℃下在N2下搅拌36小时，直至借由LCMS指示反应完成。蒸发溶剂，并且将残余物借由C18反相层析纯化，得到所需产物L2(3.5g，4.649mmol，42.86％)。LCMS(M+H)+＝753.0；
1H NMR(400MHz，DMSO)δ7.90(d，J＝7.5Hz，2H)，7.74-7.64(m，2H)，7.44-7.32(m，4H)，4.58-4.21(m，8H)，4.14-3.74(m，4H)，3.68-3.41(m，8H)，2.85-2.56(m，2H)，1.69-1.28(m，15H)。13C NMR(100MHz，DMSO)δ171.53，156.10，143.77，140.70，127.62，127.04，125.24，120.10，80.47，80.42，71.66，71.58，71.34，70.18，65.53，63.51，63.36，54.48，54.41，46.63，27.65，23.14，22.38。
步骤2
向L2(200mg，0.266mmol)的THF(2mL)溶液中添加二乙胺(38.86mg，0.531mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。自反应混合物中取样品，并且LCMS结果指示发现所需产物并且起始材料完全消耗。蒸发溶剂，并且将残余物借由C18反相层析纯化，得到所需产物L3(120mg)，LCMS(M+H)+＝531.1。
实例2：PEG单元的制备
如下制备含有线性单糖的PEG单元：
步骤1
将化合物38-1(260mg，0.31mmol)的乙腈(3.0mL)溶液在室温下搅拌，并且添加无水二乙胺(0.2mL，1.941mmol)。将所得溶液在室温下搅拌2小时，直至溶液的LCMS显示大部分起始材料被消耗。随后将溶液浓缩至干燥，并且将残余物借由反相管柱层析纯化(12gC18管柱，用含0.01％ TFA的0至50％的乙腈水溶液洗脱)，得到为淡黄色油状物的化合物39-1的预期级分(170mg，0.28mmol)。LCMS，ESI m/z＝618.4(M+H)+；
步骤2
将化合物39-1(170mg，0.28mmol)、39-2(217.08mg，1.206mmol)及乙酸(1.21mg，0.020mmol)的甲醇(5mL)澄清反应溶液在50℃下加热30分钟，随后添加NaCNBH3(75.98mg，1.206mmol)。将反应溶液在50℃下在N2下搅拌4小时。随后添加额外的NaCNBH3(75.98mg，1.206mmol)及化合物39-2(217.08mg，1.206mmol)，并在50℃下保持搅拌隔夜。搅拌20小时后，LCMS显示反应完成。蒸发溶剂，并且将残余物借由C18反相层析纯化，得到所需产物39-3(265mg，0.24mmol)。LCMS，ESI m/z＝1122.6(M+H)+。
步骤3
将化合物39-3(265mg，0.24mmol)的6N HCl/THF水溶液混合物在室温下搅拌3小时，直至LCMS指示反应完成。将溶剂用NaHCO3水溶液中和，蒸发，并且将残余物借由C18反相层析纯化，得到所需产物39-4(160mg，0.17mmol)。LCMS，ESI m/z＝946.5(M+H)+。
实例3：含有MMAE的药物连接子(PB003)的制备
含有两个糖单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物连接子(PB003)制备如下：
步骤1
将化合物8-3(30mg，0.027mmol)、DIPEA(10.45mg，0.081mmol)的无水DMF(2mL)溶液在室温下搅拌，随后添加氧杂环戊烷-2,5-二酮(5.40mg，0.054mmol)。将所得溶液在室温(r.t.)下再搅拌1小时，直至液相层析质谱(LCMS)指示反应完成。将混合物直接借由反相液相层析(40g C18管柱，用含0.01％ TFA的0至50％的乙腈水溶液经15分钟洗脱)纯化，得到为白色固体的化合物8-3A(25.8mg，0.021mmol，78.97％)。LCMS：产物(M/2+H)+＝612.5；
步骤2
将化合物3-1(20.00g，44.198mmol)、2-甲基丙-2-醇(12.600mL，132.594mmol)、DCC(13.68g，66.297mmol)及DMAP(1.62g，13.259mmol)的DCM(150mL)溶液在室温(r.t.)下在氮气(N2)下搅拌12小时。借由LCMS判断反应完成后，借由矽藻土(Celite)垫过滤反应混合物，并且减压浓缩滤液，得到残余物，随后借由矽胶快速层析(石油醚：EtOAc＝10:1)纯化，得到为无色油状物的化合物3-2(11.80g，23.200mmol，52.49％)。
LCMS(M-56+H)+＝453.1；
1H NMR(400MHz，DMSO)δ＝7.89(d，J＝7.5，2H)，7.72(d，J＝7.5，2H)，7.65(d，J＝7.8，1H)，7.44(t，J＝7.4，2H)，7.35(d，J＝7.1，2H)，7.20(t，J＝5.3，1H)，5.94-5.76(m，1H)，5.27(dd，J＝17.2，1.6，1H)，5.16(dd，J＝10.5，1.4，1H)，4.45(d，J＝5.3，2H)，4.32(dd，J＝12.3，4.8，2H)，4.26-4.20(m，1H)，3.84(d，J＝4.9，1H)，2.97(dd，J＝12.6，6.4，2H)，1.66-1.53(m，2H)，1.38(s,9H),1.33-1.29(m,2H)，1.28-1.23(m，2H)。
步骤3
向化合物3-2(5g，9.837mmol)的DCM(20mL)溶液中添加Et2NH(4mL，38.693mmol)。将反应物在室温下搅拌2小时。将混合物浓缩并将粗化合物3-3(2.84g，9.921mmol，100％)直接用于下一步骤。ESI m/z：287.3(M+H)+。
步骤4
向化合物3-3(2.84g，9.917mmol)的DMF(15mL)溶液中添加化合物3-4(5.58g，11.901mmol)、DIPEA(2.56g，19.834mmol)及HATU(3.77g，9.917mmol)。将反应物在室温下搅拌1小时。随后将混合物浓缩并借由反相分离(C18管柱，用含TFA的0至87％的乙腈水溶液洗脱)纯化，得到为白色固体的化合物3-5(5.2g，7.056mmol，71.15％)。ESI m/z：759.4(M+Na)+。
步骤5
向化合物3-5(5.2g，7.056mmol)的DCM(12mL)溶液中添加TFA(12mL，1199.474mmol)。将反应物在室温下搅拌4小时。随后将混合物浓缩并借由反相管柱分离(C18管柱，用含TFA的0至44％的乙腈水溶液洗脱)纯化，得到为白色固体的化合物3-6(2.4g，4.133mmol，58.57％)。ESI m/z：581.3(M+H)+。
步骤6
向化合物3-6(2.40g，4.133mmol)的EtOH(35mL)及H2O(5mL)溶液中添加D-葡萄糖(5.93g，32.919mmol)、KH2PO4(0.020mL，0.344mmol)及NaBH3CN(2.08g，33.099mmol)。将反应物在50℃下搅拌18小时。将反应物在室温下搅拌4小时。随后将混合物浓缩并借由反相管柱分离(C18管柱，用含TFA的0至44％的乙腈水溶液洗脱)纯化，得到为白色固体的化合物3-7(2.0g，2.200mmol，53.48％)。ESI m/z：910.4(M+H)+。
步骤7
向化合物3-7(1.00g，1.100mmol)的DMF(15mL)溶液中添加HATU(0.50g，1.320mmol)及DIPEA(0.43g，3.300mmol)。将混合物搅拌10分钟，随后添加化合物3-8(0.58g，1.099mmol)。将反应物在室温下搅拌1小时。随后将混合物浓缩并借由反相管柱分离(C18管柱，用含TFA的0至34％的乙腈水溶液洗脱)纯化，得到化合物3-9(0.47g，0.334mmol，30.37％)。ESI m/z：711.5(M/2+H)+。
步骤8
将化合物3-9(10mg，0.007mmol)、Pd(PPh3)4(0.41mg，0.000mmol)及无水二乙胺(0.001mL，0.014mmol)的MeCN(0.5mL)及水(0.1mL)的澄清溶液在室温下在N2下搅拌2小时。LCMS指示所有起始材料被耗尽，并且检测到所需质量的产物(LCMS中的片段质量669)。将混合物借由反相液相层析(12g C18管柱，用含0.01％ TFA的0至35％的乙腈水溶液洗脱)纯化，得到为白色固体的产物3-10。LCMS：产物(M/2+H)+＝669.5；纯度65％(214nm)。
步骤9
将化合物3-10(27mg，0.024mmol)、8-3A(54.67mg，0.048mmol)及DIPEA(3.10mg，0.024mmol)的无水DMF(1.8mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加HATU(9.14mg，0.024mmol)的无水DMF(0.2mL)溶液。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示反应完成。将反应混合物直接借由反相液相层析(40g C18管柱，用含0.01％ TFA的0至70％的乙腈水溶液经15分钟洗脱)纯化，得到为白色固体的产物3-11(40.5mg，0.016mmol)。LCMS(M/3+H)+＝848.5；
步骤10
将化合物3-11(45mg，0.018mmol)的DMF(0.95mL)溶液在室温下搅拌，并且添加无水二乙胺(0.05mL，0.485mmol)。添加后，将所得溶液在室温下再保持搅拌1小时，直至LCMS指示反应完成。蒸发挥发物(特别为DEA)以得到粗产物，将其直接借由反相液相层析(12gC18管柱，用含0.01％ TFA的0至50％的乙腈水溶液经15分钟洗脱)纯化，得到预期级分，将其冻干以得到为白色固体的产物3-12(30mg，0.013mmol，73.05％)。LCMS(M/3+H)+＝774.4；
步骤11
将化合物3-12(20mg，0.009mmol)及DIPEA(3.34mg，0.026mmol)的无水DMF(0.8mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后逐滴添加2-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(4.35mg，0.017mmol)的无水DMF(0.2mL)溶液，历时2分钟。将所得溶液在室温下再搅拌2小时，随后借由LCMS监测；所需产物形成为反应产物的大部分。用一滴水淬灭反应，随后直接借由制备型HPLC纯化(流动相：A：水(0.01％TFA)B：乙腈(0.01％TFA)；梯度相：在15分钟内5％的B增加至95％的B；流速：1.0mL/min；管柱：SunFireC18、4.6*50mm、3.5μm；柱温：50℃。检测器：ADC ELSD、DAD(214nm及254nm)，得到为白色固体的产物PB003(7mg，0.003mmol)。LCMS(M/3+H)+＝820.1
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.86-9.78(m，1H)，8.49-8.31(m，3H)，8.26-8.06(m，3H)，8.01-7.83(m,3H)，7.66-7.59(m，2H)，7.32-7.25(m，6H)，7.20-7.15(m，1H),7.09(s，1H)，6.05-5.98(m，1H)，5.45-5.35(m,6H)，5.13-4.95(m，2H)，4.87-4.71(m，4H)，4.71-4.41(m，13H)，4.35-4.13(m，7H)，4.10-4.04(m，2H)，3.99-3.94(m，6H)，3.80-3.77(m，1H)，3.73-3.69(m，4H)，3.67-3.43(m，21H)，3.24-3.17(m，17H)，3.12-2.97(m，7H)，2.89-2.83(m，3H)，2.44-2.24(m，7H)，2.16-1.91(m，5H)，1.84-1.42(m，19H)，1.38(s，9H)，1.34-1.24(m，9H)，1.06-0.98(m，6H)，0.89-0.75(m，26H)ppm。包括两个TFA分子的质子信号。
实例4：具有两个糖单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物-连接子(PB004)的制备
含有糖单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物连接子(PB004)制备如下：
步骤1
将化合物8-3A(50mg，0.041mmol)及HOSu(7.05mg，0.061mmol)的无水DCM(5mL)溶液在室温下搅拌，随后添加EDCI(11.75mg，0.061mmol)溶液。将所得溶液在室温下再搅拌1.5小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液用更多的DCM(10mL)稀释并用水洗涤。收集有机层，经硫酸钠干燥，随后浓缩至干燥，得到为白色固体的粗NHS酯4-1(50mg，0.038mmol，92.65％)，其直接用于下一步骤(参见N200897-071)。LCMS(M/2+H)+＝661.0；纯度＝96％(254nm)。
步骤2
将来自上一步骤的粗化合物4-1(50mg，0.038mmol)溶解于无水DMF(2mL)，随后添加DIPEA(14.65mg，0.114mmol)及化合物4-2(48.52mg，0.038mmol)。将所得溶液在室温下搅拌2小时，直至LCMS指示所有起始胺被耗尽。将反应溶液直接借由反相液相层析(40g C18管柱，用含0.01％ TFA的0至70％的乙腈水溶液经15分钟洗脱)纯化，得到为白色固体的化合物4-3(50mg，0.020mmol，53.10％)。LCMS：m/z＝829.8(M/3+H)+；
步骤3
将化合物4-3(50mg，0.022mmol)的乙腈(2mL)悬浮液在室温下搅拌，并且添加水(0.5mL)已改善溶解度。将该物质溶解于澄清溶液中。随后添加无水二乙胺(0.2mL，1.941mmol)。将所得溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS显示反应完成。随后将溶液浓缩至干燥以移除大部分二乙胺，随后再溶解於乙腈及水中并冻乾，得到为白色固体的粗产物4-4(48mg，0.021mmol，96.94％％)，其直接用于下一步骤。LCMS：m/z＝739.0(预期包括片段(2263/3)+H＝755)；
步骤4
将化合物4-4(47mg，0.021mmol)及DIPEA(8.03mg，0.062mmol)的无水DMF(0.8mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加2-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(5.23mg，0.021mmol)的无水DMF(0.2mL)溶液。将所得溶液在室温下再搅拌0.5小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物的质量。将所得溶液在室温下搅拌2小时，直至LCMS指示所有起始胺被耗尽。将反应溶液直接借由制备型HPLC(用含0.01％ TFA的梯度经20分钟洗脱)纯化，得到为白色固体的产物PB004(10mg，0.004mmol，20.06％)。LCMS：m/z＝801.4(M/3+H)+；
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.56(s，1H)，9.77(s，1H)，8.52-8.23(m，3H)，8.19-7.84(m，6H)，7.67-7.61(m，2H)，7.35-7.24(m，6H)，7.19-7.13(m，1H)，7.09(s，2H)，6.05-6.02(m，1H)，5.52-5.36(m，6H)，5.13-4.94(m,2H)，4.89-4.73(m，4H)，4.69-4.36(m，13H)，4.29-4.23(m，6H)，4.14-4.09(m，2H)，4.05-3.93(m，6H)，3.79-3.76(m，1H)，3.72-3.68(m，4H)，3.65-3.43(m，21H)，3.24-3.05(m，17H)，3.01-2.91(m，7H)，2.89-2.83(m，3H)，2.44-2.23(m，7H)，2.14-1.94(m，5H)，1.86-1.41(m，19H)，1.37-1.20(m，9H)，1.05-0.97(m，6H)，0.88-0.75(m，26H)ppm。包括两个TFA分子的质子信号。
实例5：具有一个糖单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物-连接子(PB008)的制备
具有一个糖单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物-连接子(PB008)制备如下：
步骤1
在0℃下，向化合物8-1(155.50mg，0.203mmol)的DMF(10mL)溶液中添加HOBt(26.35mg，0.195mmol)及MMAE(140mg，0.195mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌15分钟，在0℃下添加吡啶(3mL)及DIEA乙基二异丙胺(0.039mL，0.234mmol)，并且将反应混合物在0℃下搅拌30分钟。使反应混合物温热至室温。将反应混合物在室温下搅拌36小时。在移除DIEA及吡啶之后，将残余物借由制备型HPLC纯化，得到所需产物8-2(62mg，0.045mmol)。LCMS((M+2H)/2)+＝673.4；
步骤2
向化合物8-2(60mg，0.045mmol)的DMF(0.95mL)溶液中添加无水二乙胺(0.05mL，0.485mmol)。将所得反应溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示完全去保护。将完成的反应溶液借由反相管柱相层析(C18管柱，用含0.01％ TFA的0至70％的乙腈水溶液洗脱)纯化，得到含有化合物8-3的所需级分，将其冻干以得到为白色固体的化合物8-3的TFA盐(40mg，0.036mmol，79.85％)。LCMS(M/2+H)+＝562.5；
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.20(s，1H)，8.69(d，J＝7.6Hz，1H)，8.30(brs，2H)，8.17-8.07(m，3H)，7.90(d，J＝8.4Hz，0.5H)，7.64(d，J＝8.4Hz，0.5H)，7.59-7.57(m，2H)，7.37-7.24(m，6H)，7.20-7.13(m，1H)，6.05-6.02(m，1H)，5.48(s，2H)，5.43-5.34(m，1H)，5.12-4.97(m，2H)，4.78-4.23(m，4H)，4.04-3.93(m，2H)，3.80-3.52(m，2H)，3.25-3.06(m，7H)，2.98-2.83(m，10H)，2.43-2.39(m，1H)，2.26-2.22(m，1H)，2.14-1.99(m，3H)，1.99-1.85(m，1H)，1.85-1.67(m，4H)，1.67-1.37(m，5H)，1.37-1.25(m，1H)，1.16(t，J＝7.2Hz，3H)，1.05-1.00(m，6H)，0.98-0.93(m，6H)，0.86-0.73(m，17H)ppm。
步骤3
将化合物8-3(17.96mg，0.026mmol)、化合物8-4及DIPEA(9.99mg，0.077mmol)的无水DMF(0.8mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加HATU(14.71mg，0.039mmol)的无水DMF(0.2mL)溶液。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析(C18管柱，用含0.01％ TFA的0至70％的乙腈水溶液经15分钟洗脱)纯化，得到为白色固体的化合物8-5(36.2mg，0.020mmol，77.26％)。LCMS(M/2+H)+＝902.1；1HNMR(400MHz，DMSO-d6)
步骤4
将化合物8-5(50mg，0.028mmol)的DMF(0.95mL)溶液在室温下搅拌，并且添加DEA(0.05mL，0.313mmol)。将所得溶液在室温下搅拌2小时。溶液的LCMS显示反应完成。将完成的反应溶液直接借由反相液相层析(12g C18管柱，用含0.01％ TFA的0至60％的乙腈水溶液经15分钟洗脱)纯化，得到所需级分，将其冻干以得到为白色固体的产物8-6(35mg，0.022mmol，79.85％)。LCMS(M/2+H)+＝790.6；步骤5
将化合物8-6(30mg，0.019mmol)、DIPEA(7.35mg，0.057mmol)的无水DMF(2mL)溶液在室温下搅拌，随后添加化合物8-7，亦即2-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(9.58mg，0.038mmol)。将所得溶液再搅拌1小时以实现完全转化。将完成的反应溶液借由制备型HPLC纯化，流动相：A：水(0.01％TFA)B：乙腈(0.01％TFA)；梯度相：在15分钟内5％的B增加至95％的B；流速：1.0mL/min；管柱：SunFire C18、4.6*50mm、3.5μm；管柱温度：50℃。检测器：ADC ELSD、DAD(214nm及254nm)，得到为白色固体的PB008的TFA盐(20mg，0.012mmol，61.34％)。LCMS(M/2+H)+＝859.0；
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.03(s，1H)，8.42-8.40(m，2H)，8.33-8.31(m，0.5H)，8.20-8.18(m，1H),8.11-8.09(m，0.5H)，7.92-7.84(m,1.5H),7.66-7.63(m，0.5H)，7.59-7.56(m，2H)，7.36-7.24(m，6H)，7.20-7.14(m,1H),7.10(s，2H)，6.06-6.01(m，1H)，5.54-5.33(m，4H)，5.13-4.95(m，2H)，4.87-4.34(m，10H)，4.30-4.17(m,2H)，4.09(s，2H)，4.04-3.92(m，4H)，3.80-3.77(m，0.5H)，3.70-3.65(m，2H)，3.61-3.58(m，9.5H)，3.33-3.24(m,2H)，3.23-3.07(m，13H)，3.03-2.89(m，5H)，2.89-2.83(m，3H)，2.44-2.39(m，1H)，2.30-2.21(m，1H)，2.16-2.05(m，2H)，1.99-1.91(m，2H)，1.84-1.22(m，18H)，1.06-0.97(m，6H)，0.89-0.75(m，26H)ppm。包括一个TFA分子的质子信号。
实例6：具有两个糖单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB026)的制备
具有两个糖单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB026)制备如下：
步骤1
将化合物26-1(475mg，0.447mmol)的DMF(3.6mL)溶液在室温下搅拌，并且添加无水二乙胺(0.4mL，3.883mmol)。将所得溶液在室温下搅拌1小时。随后溶液的LCMS显示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析(120g C18管柱，用含0.01％ TFA的0至80％的乙腈水溶液经15分钟洗脱)纯化，得到为白色固体的产物26-2(260mg，0.309mmol，69.24％)。LCMS：m/z＝841.1(M+H)+
步骤2
将化合物26-2(150mg，0.178mmol)及氧杂环戊烷-2,5-二酮(35.70mg，0.357mmol)的无水DMF(2mL)溶液在室温下搅拌，随后添加DIPEA(69.03mg，0.535mmol)。将所得溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺被耗尽。将完成的反应溶液直接借由反相液相层析(40g C18管柱，用含0.01％ TFA的0至70％的乙腈水溶液经15分钟洗脱)纯化，得到为白色固体的化合物26-3(140mg，0.149mmol，83.41％)。LCMS：m/z＝963.5(M+Na)+
步骤3
将化合物26-3(100mg，0.106mmol)、DIPEA(41.02mg，0.318mmol)及HATU(40.30mg，0.106mmol)的无水DMF(1mL)溶液在室温下搅拌10分钟，随后借由注射器逐滴添加化合物4-2(271.57mg，0.212mmol)的无水DMF(1mL)溶液。添加后，将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示起始酸几乎耗尽且反应完成。将反应溶液借由反相液相层析(40g C18管柱，用含0.01％ TFA的0至70％的乙腈水溶液洗脱)纯化，得到为白色固体的产物26-4(100mg，0.045mmol，42.64％)。LCMS：ESI m/z＝735.8(M/2+H)+；步骤4
向化合物26-4(100mg，0.045mmol)的乙腈(0.9mL)悬浮液中添加水(0.9mL)以帮助溶解大部分物质。随后向溶液中添加无水二乙胺(0.2mL，1.941mmol)，并且在室温下搅拌2小时。在该过程中，黏稠的油状物沉淀在烧瓶的底部。借由LCMS监测反应，起始材料耗尽并且检测到所需产物为主峰。将溶液浓缩至干燥，将残余物用石油醚洗涤以移除大部分非极性杂质。过滤并收集未溶解的固体，随后溶解於乙腈及水(1:1)中并在冷冻干燥器中冻乾，得到为白色固体的化合物26-5(60mg，0.030mmol，66.72％)，其直接用于下一步骤。
LCMS：ESI m/z＝661.5(M/3+H)+；
步骤5
将化合物26-5(30mg，0.015mmol)及DIPEA(5.86mg，0.045mmol)的无水DMF(1mL)混合物在室温下搅拌20分钟，并且观测到固体悬浮于溶液中，随后添加额外的DMF(1mL)，随后添加化合物26-6(7.77mg，0.015mmol)。将所得溶液在室温下搅拌24小时，直至LCMS及HPLC指示起始胺几乎耗尽。将反应溶液直接借由制备型HPLC纯化，(流动相：A：水(0.01％FA)B：乙腈(0.01％FA)；梯度相：在15分钟内5％的B增加至95％的B；流速：1.0mL/min；管柱：SunFire C18、4.6*50mm、3.5μm；管柱温度：50℃。检测器：DAD(214nm及254nm)，以得到为白色固体的产物PB026(9.1mg，0.004mmol，25.26％)。LCMS：ESI m/z＝794.3(M/3+H)+；
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.73(s，1H)，8.38-8.31(m，1H)，8.20-8.16(m，2H)，8.08-8.00(m，4H)，7.89-7.82(m，1H)，7.78(d，J＝11.2Hz，1H)，7.65(d，J＝8.0Hz，2H)，7.41-7.35(m，2.6H)，7.31(s，1H)，7.01-7.00(m，1.4H)，6.52(brs，1H)，6.09-6.01(m，1H)，5.45(s，4H)，5.29(s，4H)，5.08(s，2H)，4.36-4.27(m，2H)，4.15-4.12(m，1H)，4.09-4.03(m，0.5H),3.96-3.88(m，1H)，3.88-3.82(m，0.5H),3.77-3.70(m，1H),3.64-3.57(m,12H),3.50-3.47(m，17H)，3.43-3.40(m，10H),3.40-3.22(m，11H)，3.16-3.12(m，4H),3.05-2.90(m，11H)，2.72-2.50(m，3H)，2.38-2.31(m，11H)，2.24-2.12(m，5H)，2.08-1.98(m，2H)，1.93-1.87(m，2H)，1.84-1.55(m，8H)，1.55-1.23(m，18H)，1.13-1.07(m，2H)，1.01-0.96(m，3H)，0.89-0.85(m，9H)ppm。
实例7：含有两个糖单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物连接子(PB037)的制备
含有两个糖单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB037)制备如下：
步骤1
将化合物37-1(200mg，0.141mmol)的TFA(2mL)溶液在室温下搅拌2小时。混合物的LCMS显示反应完成并且所有起始材料被耗尽，形成所需产物(质量640＝1280/2)。将完成的反应溶液浓缩至干燥，随后再溶解于THF(4mL)及水(1mL)中，并且用饱和碳酸钠水溶液处理以调节pH至8-9。将所得溶液在室温下搅拌1小时以实现完成。随后将溶液用稀释的TFA中和并浓缩，并将残余物借由反相液相层析(C18管柱，用含有0.01％ TFA的0至30％的乙腈水溶液洗脱15分钟)纯化，以在冻干后得到为白色固体的所需产物37-2(180mg，0.132mmol，93.70％)。LCMS，ESI m/z＝683.4(M/2+H)+；
步骤2
将化合物37-2(180mg，0.132mmol)、HATU(75.27mg，0.198mmol)及DIPEA(51.07mg，0.396mmol)的无水DMF(2mL)溶液在室温下搅拌5分钟，并且添加化合物37-3(73.86mg，0.132mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析(40g C18管柱，用含0.01％ TFA的0至70％的乙腈水溶液经15分钟洗脱)纯化，得到为白色固体的化合物37-3(220mg，0.118mmol，89.48％)。LCMS，ESI m/z＝954.5(M/2+Na)+；
步骤3
将化合物37-3(220mg，0.115mmol)及Pd(PPh3)4(133.30mg，0.115mmol)的无水乙腈(1mL)及水(1mL)的溶液在室温下搅拌，随后立即添加无水二乙胺(0.024mL，0.231mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌2小时，直至LCMS指示所有起始材料已耗尽并且检测到所需产物的质量。将所得溶液减压浓缩以移除溶剂及二乙胺。将残余物直接借由制备型HPLC(用含0.01％ TFA的梯度经20分钟洗脱)纯化，得到为白色固体的化合物37-4(160mg，0.088mmol，76.08％)。LCMS，m/z＝608.6(M/3+H)，912.2(M/2+H)+；
步骤4
将化合物37-4(30.97mg，0.033mmol)、HATU(12.51mg，0.033mmol)及DIPEA(4.25mg，0.033mmol)的无水溶剂的溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加化合物26-1(60mg，0.033mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌2小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析(40g C18管柱，用含0.01％ TFA的0至70％的乙腈水溶液经15分钟洗脱)纯化，得到为白色固体的化合物37-5(40mg，0.015mmol，44.26％)。LCMS，ESI m/z＝916.4(M/3+H)+；
步骤5
将化合物37-5(40mg，0.015mmol)的CH3CN(1.2mL)及水(0.6mL)的溶液在室温下搅拌，随后添加无水二乙胺(0.2mL，0.015mmol)。将所得溶液在室温下搅拌隔夜，直至LCMS显示反应完成。蒸发溶剂及大部分二乙胺，随后将残余物借由反相液相层析(12g C18管柱，用含有0.01％ TFA的乙腈水溶液洗脱)纯化，得到为白色固体的所需产物37-6(20mg，0.008mmol，54.41％)。LCMS，ESI m/z＝631.8(M/4+H)+，842.1(M/3+H)+；2524
步骤6
将化合物37-6(20mg，0.008mmol)及DIPEA(5.03mg，0.039mmol)的无水DMF(0.4mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(5.83mg，0.019mmol)的无水DMF(0.1mL)溶液，历时2分钟。将所得溶液在室温下再搅拌8小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物的质量。用稀释的甲酸的乙腈溶液将反应溶液调节至pH6-7，随后直接借由制备型HPLC(用含有0.01％ FA的梯度经20分钟洗脱)纯化，得到为白色固体的PB037(4.8mg，0.002mmol)。LCMS，m/z＝725.8(M/3+H)+；
实例8：含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物连接子(PB038)的制备
含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB038或LD038)制备如下：
步骤1：
将化合物38-1(650mg，0.774mmol)及N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)(177.98mg，1.548mmol)的无水DCM(8mL)溶液在室温下搅拌，随后添加EDCI(296.69mg，1.548mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物。用水洗涤所得溶液，收集有机层，随后用DCM(10mL*2)萃取水相。将合并的有机层经硫酸钠干燥并过滤，浓缩至干燥，得到为无色油状物的化合物38-2(552mg，0.589mmol，76.12％)，将其原样用于下一步骤(参见N200897-136)。LCMS：m/z＝959.4(M+Na)+；
步骤2：
将化合物38-2(300mg，0.357mmol)及DIPEA(138.22mg，1.071mmol)的无水DMF(2mL)溶液在室温下搅拌，随后添加化合物38-3(87.97mg，0.357mmol)，并且起始胺悬浮于溶液中。将该混合物在室温下保持再搅拌6小时。在此期间，起始胺逐渐溶解，并且悬浮液变成澄清的浅黄色溶液。将反应溶液终止并直接借由反相液相层析(40g C18管柱，用含有0.01％ TFA的0至100％的乙腈水溶液经15分钟洗脱)纯化，得到为淡黄色油状物的化合物38-4(260mg，0.243mmol，68.14％)，LCMS((M-100)/2+H)+＝484.9；步骤3：
将化合物38-4(260mg，0.243mmol)的乙腈(1.8mL)溶液在室温下搅拌，并且添加无水二乙胺(0.2mL，1.941mmol)。将所得溶液在室温下搅拌2小时，直至溶液的LCMS显示大部分起始材料被消耗。随后将溶液浓缩至干燥，并且将残余物借由反相管柱层析纯化(12gC18管柱，用含0.01％ TFA的0至50％的乙腈水溶液洗脱)，得到为淡黄色油状物的化合物38-5的预期级分(170mg，0.201mmol，82.54％)。LCMS，ESI m/z＝846.6(M+H)+；保留时间(0.01％ TFA)＝1.451分钟；无UV。
步骤4：
将38-5(170mg，0.201mmol)、D-葡萄糖(217.08mg，1.206mmol)及乙酸(1.21mg，0.020mmol)的甲醇(5mL)澄清反应溶液在50℃下加热30分钟，随后添加NaCNBH3(75.98mg，1.206mmol)。将反应溶液在50℃下在N2下搅拌4小时。随后添加额外的NaCNBH3(75.98mg，1.206mmol)及D-葡萄糖(217.08mg，1.206mmol)，并在50℃下保持搅拌隔夜。搅拌20小时后，LCMS指示反应完成。蒸发溶剂，并且将残余物借由C18反相层析纯化，得到所需产物38-6(106mg，0.090mmol，44.92％)。LCMS，ESI m/z＝537.9((M-100)/2+H)+；
步骤5：
将化合物38-6(250mg，0.213mmol)、HATU(121.45mg，0.319mmol)及DIPEA(82.41mg，0.639mmol)的无水DMF(2mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加化合物38-7(178.88mg，0.213mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌2小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析(40g C18管柱，用含0.01％ TFA的0至70％的乙腈水溶液经15分钟洗脱)纯化，得到为白色固体的化合物38-8(270mg，0.135mmol，63.48％)。LCMS，ESIm/z＝666.6(M/3+H)+，999.2(M/2+H)+；
步骤6：
将化合物38-8(120mg，0.060mmol)的TFA(2mL)溶液在室温下搅拌1小时。混合物的LCMS显示反应完成，消耗了所有原料，并且形成了所需产物(m/z＝633＝1896/3+H，R.T.1.501分钟)与糖酯化产物(TFA与糖单元中的羟基基团缩合，单酯，m/z＝(1896+96)/2+H＝665，R.T.1.58分钟)。将完成的反应溶液浓缩至干燥，随后再溶解于THF(4mL)及水(2mL)中，并且用饱和碳酸钠水溶液处理以调节pH至8-9。将所得溶液在室温下搅拌1小时以实现完全水解。随后将溶液用稀释的TFA中和并浓缩。将残余物借由反相液相层析(C18管柱，用含有0.01％ TFA的0至25％的乙腈水溶液洗脱15分钟)纯化，以在冻干后得到为白色固体的所需产物38-9(80mg，0.042mmol，70.19％)。LCMS，ESI m/z＝633.2(M/3+H)+，949.2(M/2+H)；步骤7：
将化合物38-9(20mg，0.011mmol)及DIPEA(4.08mg，0.032mmol)的无水DMF(1mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加化合物38-10(4.88mg，0.016mmol)的无水DMF(1mL)溶液，历时2分钟。将所得溶液在室温下再搅拌4小时，直至所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物的质量。用甲酸中和所得溶液以调节pH6-7。将反应溶液借由制备型HPLC(用含0.01％ TFA的梯度经20分钟洗脱)纯化，得到为白色固体的PB038(11mg，0.005mmol，49.91％)。LCMS，m/z＝697.7(M/3+H)+；
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.03(s，1H)，8.19-8.11(m，2H)，8.07(d，J＝8.8Hz，1H)，7.96(d，J＝7.6Hz，1H)，7.82-7.77(m，2H)，7.66(d，J＝8.4Hz，1H)，7.60(d，J＝8.4Hz，2H)，7.36(d，J＝8.0Hz，2H)，7.32(s，1H),7.00(s，2H)，6.53(s，1H)，5.99(t，J＝5.6Hz，1H)，5.45-5.43(m，6H)，5.30-5.24(m，3H)，5.08(s,2H)，4.84-4.74(m，2H)，4.65-4.49(m，4H)，4.45-4.35(m，3H)，4.27-4.17(m，2H)，4.04-3.95(m，2H)，3.80-3.77(m，2H)，3.71-3.67(m，2H)，3.62-3.55(m，9H)，3.53-3.43(m，44H)，3.27-3.21(m，2H)，3.16-3.07(m,2H)，3.07-2.93(m，6H)，2.38(s，3H)，2.29(t，J＝6.4Hz，2H)，2.23-2.13(m，2H),2.13-2.08(m，2H)，2.00-1.82(m，4H)，1.73-1.54(m，4H)，1.54-1.40(m，7H)，1.40-1.30(m，4H)，1.30-1.14(m，5H)，0.90-0.81(m，9H)ppm。
实例9：含有连接至可裂解连接子及依喜替康的PEG单元的药物-连接子(PB0039)的制备
含有连接至可裂解连接子及依喜替康的PEG单元的药物-连接子(PB0039)制备如下：
步骤1
将化合物38-1(260mg，0.31mmol)的乙腈(3.0mL)溶液在室温下搅拌，并且添加无水二乙胺(0.2mL，1.941mmol)。将所得溶液在室温下搅拌2小时，直至溶液的LCMS显示大部分起始材料被消耗。随后将溶液浓缩至干燥，并且将残余物借由反相管柱层析纯化(12gC18管柱，用含0.01％ TFA的0至50％乙腈水溶液洗脱)，得到为淡黄色油状物的化合物39-1的预期级分(170mg，0.28mmol)。LCMS，ESI m/z＝618.4(M+H)+；
步骤2
将化合物39-1(170mg，0.28mmol)、39-2(217.08mg，1.206mmol)及乙酸(1.21mg，0.020mmol)的甲醇(5mL)澄清反应溶液在50℃下加热30分钟，随后添加NaCNBH3(75.98mg，1.206mmol)。将反应溶液在50℃下在N2下搅拌4小时。随后添加额外的NaCNBH3(75.98mg，1.206mmol)及化合物39-2(217.08mg，1.206mmol)，并在50℃下保持搅拌隔夜。搅拌20小时后，LCMS显示反应完成。蒸发溶剂，并且将残余物借由C18反相层析纯化，得到所需产物39-3(265mg，0.24mmol)。LCMS，ESI m/z＝1122.6(M+H)+。
步骤3
将化合物39-3(265mg，0.24mmol)的6N HCl/THF水溶液混合物在室温下搅拌3小时，直至LCMS指示反应完成。将溶剂用NaHCO3水溶液中和，蒸发，并且将残余物借由C18反相层析纯化，得到所需产物39-4(160mg，0.17mmol)。LCMS，ESI m/z＝946.5(M+H)+。
步骤4
将化合物39-5(3.3g，4.905mmol)及DIPEA(1.90g，14.714mmol)的无水DMF(10mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加PNPC(4.47g，14.714mmol)。将所得亮黄色溶液在室温下再搅拌1.5小时以实现完成。将所得溶液用水淬灭，并将溶液直接借由反相管柱层析法(用0至100％的乙腈水溶液洗脱)纯化，得到为黄色固体的化合物39-6(1950mg，2.327mmol)。LCMS，m/z＝860.4(M+Na)+，738.4(M-100+H)+；步骤5
向化合物39-6(1.2g，1.432mmol)的DMF(12mL)溶液中添加DIPEA(0.56g，4.296mmol)、HOBt(0.10g，0.716mmol)及依喜替康(0.69g，1.575mmol)。将混合物在室温下搅拌3小时。将所得溶液借由反相分离(C18管柱，用含TFA的0至100％甲醇水溶液洗脱)纯化，得到化合物39-7(1.2g，1.058mmol)，ESI，m/z：1135.5(M+H)+
步骤6
向化合物39-7(620mg，0.547mmol)的DCM(20mL)溶液中添加TFA(2mL，0.555mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时。将所得溶液浓缩并借由反相分离(C18管柱，用含TFA的0至50％的乙腈水溶液洗脱)纯化，得到产物化合物39-8(409mg，0.395mmol)。ESI，m/z：517.9(M/2+H)+。
步骤7
向化合物39-3(600mg，0.254mmol)的DMF(5mL)溶液中添加HATU(97.65mg，0.254mmol)及DIPEA(66.26mg，0.502mmol)。将反应混合物在室温下搅拌10分钟。随后将混合物与化合物39-8(550mg，0.232mmol)合并。将反应混合物在室温下搅拌2小时。将所得溶液浓缩并借由反相分离(C18管柱，用含TFA的0至50％的乙腈水溶液洗脱)纯化，得到为白色固体的产物39-9(500mg)。ESI，m/z：713.5(M/2+H)+。
步骤8
向化合物39-9(150mg，0.070mmol)的THF(2mL)溶液中添加HCl(2mol/L，2mL)。将反应混合物在室温下搅拌3小时。将所得溶液浓缩并借由反相分离(C18管柱，用含TFA的0至50％的乙腈水溶液洗脱)纯化，得到为白色固体的产物39-10(100mg，51mmol)。产率65.69％，纯度＝90％。ESI，m/z：655.1(M/3+H)+。
步骤9
向化合物39-10(350mg，0.178mmol)的DMF(2mL)溶液中添加哌嗪啶(76mg，0.896mmol)。随后将混合物在室温下搅拌2小时。将所得溶液浓缩并借由反相分离(C18管柱，用含TFA的0至50％的乙腈水溶液洗脱)纯化，得到为白色固体的产物39-11(160mg，0.092mmol)，产率＝51.55％。ESI，m/z：871.0(M/2+H)+。
步骤10
向化合物39-11(160mg，0.092mmol)的DMF(2mL)溶液中添加DIEA(24mg，0.184mmol)及MC-OSu(56.64mg，0.184mmol)。将反应混合物在室温搅拌4小时。将所得溶液浓缩并借由反相分离(C18管柱，用含TFA的0至50％的乙腈水溶液洗脱)纯化，得到为白色固体的产物PB039(62mg)，产率＝34.88％。LCMS，m/z＝967.2(M/2+H)+；
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ9.96(s，1H)，8.04-8.07(m，2H)，7.75-7.83(m，3H)，7.3(m，3H)，6.99(s，1H)，6.54(m，2H)，5.66(s，1H)，5.08-5.28(m，3H)，4.51(m，2H)，4.14-4.50(m，9H)，3.45-3.67(m，64H)，1.75-2.75(m，19H)，1.73-1.30(m，12H)，1.40-1.30(m，4H)，1.30-1.14(m，5H)，0.90-0.81(m，9H)ppm。
实例10：含有连接至可裂解连接子及依喜替康的EDTA的药物-连接子(PB040)的制备
含有连接至可裂解连接子的赖氨酸残基的EDTA的药物-连接子制备如下：
步骤1
向化合物40-1(31mg，0.034mmol)的DMF(5mL)溶液中添加DIPEA(13.18mg，0.102mmol)及6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(20.96mg，0.068mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时。将所得溶液调节至pH 6并借由反相分离(C18管柱，用含TFA的0至60％的乙腈水溶液洗脱)纯化，得到产物40-2(25.4mg，0.023mmol，67.61％)，m/z：1106.4(M+H)+。
步骤2
向化合物40-2(83mg，0.075mmol)的DCM(7mL)溶液中添加TFA(0.5mL，0.031mmol)。将混合物在室温下搅拌1小时。将所得溶液浓缩并借由反相分离(C18管柱，用含TFA的0至30％的乙腈水溶液洗脱)纯化，得到化合物40-3(34mg，0.034mmol，45.04％)。m/z：503.4(M/2+H)+。
步骤3
向4-[2-(2,6-二氧杂啉-4-基)乙基]啉-2,6-二酮(0.037mL，0.209mmol)的DMF(3mL)溶液中添加化合物40-3(21mg，0.021mmol)及DIPEA(5.40mg，0.042mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时。将所得溶液借由反相分离(C18管柱，用含TFA的0至45％的乙腈水溶液洗脱)纯化，得到产物PB040(10.8mg，0.008mmol，40.40％)。m/z：640.4(M/2+H)+。
实例11：含有两个糖单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB041)制备如下：
顺丁烯二酰亚胺基己酰基扩展单元连接至药物-连接子中间体，如下：
将化合物26-5(25mg，0.013mmol)及DIPEA(5.03mg，0.039mmol)的无水DMF(0.4mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加化合物41-1(6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯)(5.83mg，0.019mmol)的无水DMF(0.1mL)溶液，历时2分钟。将所得溶液在室温下再搅拌8小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物的质量。用稀释的甲酸的乙腈溶液将反应溶液调节至pH6-7，随后直接借由制备型HPLC(用含有0.01％ FA的梯度经20分钟洗脱)纯化，得到为白色固体的PB041(5.8mg，0.003mmol，21.14％)。
LCMS，m/z＝725.8(M/3+H)+；
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ9.72(s，1H)，8.31-8.15(m，3H)，8.09-8.04(m，2H)，7.98-7.96(m，1H),7.96-7.86(m，1H)，7.78(d，J＝11.2Hz，1H)，7.65(d，J＝7.2Hz，2H)，7.36(d，J＝8.0Hz，2H)，7.32(s，1H),7.00(s,2H)，6.54(s，1H)，6.09-6.02(m，1H)，5.47-5.45(m，4H)，5.30-5.29(m，3H)，5.08(s，2H)，4.36-4.23(m,3H)，4.18-4.13(m，1H)，4.13-4.08(m，0.5H)，3.92-3.80(m，1H)，3.74-3.69(m，1H)，3.67-3.56(m，10H)，3.05-2.88(m，15H)，2.64-2.59(m，1H)，2.36-2.33(m，12H)，2.24-1.97(m，14H)，1.91-1.82(m，5H)，1.78-1.61(m,14H)，1.53-1.34(m，15H)，1.34-1.11(m，17H)，0.89-0.86(m，11H)ppm。19F NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ-111ppm。
实例12：含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物连接子(PB050)的制备如下：
含有PEG连接子及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB050)制备如下：
步骤1
将化合物50-1(56.74mg，0.134mmol)、HATU(60.99mg，0.160mmol)及DIPEA(51.73mg，0.401mmol)的无水DMF(1.5mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加化合物39-2(150mg，0.134mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析(40g C18管柱，用含0.01％ TFA的0至70％的乙腈水溶液经15分钟洗脱)纯化，得到为白色固体的化合物50-2(130mg，0.085mmol，产率＝63.62％)。LCMS，ESI m/z＝763.8(M/2+H)+
步骤2
将化合物50-2(130mg，0.085mmol)的DCM(0.7mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加TFA(0.3mL，4.039mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌2小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液真空浓缩至干燥，并且将残余物直接借由反相管柱层析(用含有0.01％ FA的梯度经20分钟洗脱)纯化，得到为白色固体的化合物50-3(60mg，0.046mmol，54.43％)。LCMS，m/z＝725.8(M/3+H)+；
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ9.72(s，1H)，8.31-8.15(m，3H)，8.09-8.04(m，2H)，7.98-7.96(m，1H)，7.96-7.86(m，1H)，7.78(d，J＝11.2Hz，1H)，7.65(d，J＝7.2Hz，2H)，7.36(d，J＝8.0Hz，2H)，7.32(s，1H),7.00(s,2H)，6.54(s，1H)，6.09-6.02(m，1H)，5.47-5.45(m，4H)，5.30-5.29(m，3H)，5.08(s，2H)，4.36-4.23(m,3H)，4.18-4.13(m，1H)，4.13-4.08(m，0.5H)，3.92-3.80(m，1H)，3.74-3.69(m，1H)，3.67-3.56(m，10H)，3.05-2.88(m，15H)，2.64-2.59(m，1H)，2.36-2.33(m，12H)，2.24-1.97(m，14H)，1.91-1.82(m，5H)，1.78-1.61(m,14H)，1.53-1.34(m，15H)，1.34-1.11(m，17H)，0.89-0.86(m，11H)ppm。
步骤3
将化合物50-3(59mg，0.046mmol)、HATU(20.76mg，0.055mmol)及DIPEA(17.61mg，0.137mmol)的无水DMF(1mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加化合物50-4(41.51mg，0.046mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析(40g C18管柱，用含0.01％ TFA的0至50％的乙腈水溶液经15分钟洗脱)纯化，得到为白色固体的化合物50-5(40mg，0.018mmol，40.12％)。LCMS，m/z＝697.6((M-100)/2+H)+；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.02(s，1H)，8.20-8.14(m，1H)，8.14-7.98(m，2H)，7.88(d,J＝7.6Hz，2H)，7.82-7.70(m，5H)，7.64-7.52(m，4H)，7.43-7.31(m，7H)，6.78-6.72(m，1H)，6.53(s，1H)，5.45-5.44(m，4H)，5.34-5.23(m，3H)，5.08(s，2H)，4.82-4.77(m，2H)，4.62-4.36(m，6H)，4.36-4.16(m,6H)，4.05-3.95(m，3H)，3.81-3.73(m，2H)，3.73-3.66(m，2H)，3.62-3.56(m，9H)，3.56-3.34(m，50H)，3.05-3.01(m，2H)，2.95-2.84(m，2H)，2.38(s，3H)，2.29(t，J＝6.0Hz，2H)，2.19-2.10(m，2H)，2.01-1.93(m,1H)，1.90-1.83(m，2H)，1.71-1.48(m，4H)，1.40-1.23(m，18H)，0.90-0.81(m，9H)ppm。包括一个TFA质子信号。19FNMR(400MHz，DMSO-d6)，δTFA在-73ppm，Ar-F在-111ppm
步骤4
将化合物50-5(40mg，0.018mmol)的CH3CN(2mL)及水(1mL)溶液在室温下搅拌，并且添加无水二乙胺(0.002mL，0.018mmol)。将所得溶液在室温下搅拌2小时，直至LCMS显示反应完成。蒸发所有溶剂，得到粗固体，将其悬浮在另外的乙腈中，并再次蒸发以完全移除二乙胺。随后将残余物溶解於乙腈及水，用甲酸酸化至pH 2-3，静置1小时；LCMS指示所有内酯环都被关闭。随后将溶液冻干隔夜，得到为淡黄色固体的产物化合物50-6(36mg，0.018mmol，100.17％)。该化合物不经任何纯化原样用于下一步骤。LCMS：(粗物质，用甲酸处理，m/z＝656.9(M/3+H)+，984.6(M/2+H)+；
步骤5
将化合物50-6(35.43mg，0.018mmol)及DIPEA(6.97mg，0.054mmol)的无水DMF(0.8mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(8.32mg，0.027mmol)的无水DMF(0.2mL)溶液。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物的质量。将所得溶液用甲酸酸化至pH 3-4，随后直接借由反相快速层析(40g C18管柱，用含0.01％ TFA的0至70％的乙腈水溶液经20分钟洗脱)纯化，得到所需级分，将其冻干以得到为白色固体的化合物50-7(28mg，0.013mmol，71.96％)。LCMS，m/z＝687.9((M-100)/3+H)+；
步骤6
向化合物50-7(25mg，0.012mmol)的DCM(4mL)溶液中添加TFA(1mL，13.463mmol)，随后在室温下搅拌2小时，直至LCMS显示反应完成。减压蒸发TFA及DCM，随后借由制备型HPLC(用含0.01％TFA的0至100％的乙腈水溶液经15分钟洗脱)纯化，得到预期的级分，将其冻干以得到为白色固体的产物PB050。LCMS，ESI m/z＝516.3(M/4+H)+，687.9(M/3+H)+；1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：
δ10.06(s，1H)，8.16(d，J＝7.2Hz，1H)，8.07(d，J＝7.6Hz，1H)，7.99(d，J＝8.0Hz，1H)，7.84-7.80(m，2H)，7.77(brs，3H)，7.66-7.59(m，3H)，7.37(d，J＝8.8Hz，2H)，7.32(s，1H)，7.00(s，2H)，6.54(s，1H)，6.24(s,4H)，5.45(s，2H)，5.35-5.24(m，3H)，5.08(s，2H)，4.86-4.43(m，5H)，4.43-4.32(m，1H)，4.25-4.12(m,2H)，4.02-3.94(m，2H)，3.79-3.73(m，2H)，3.69-3.67(m，2H)，3.59-3.58(m，1H)，3.57-3.55(m，9H),3.55-3.47(m，52H)，3.04-2.95(m，2H)，2.81-2.73(m，2H)，2.38(s，3H)，2.29(t，J＝6.4Hz，2H)，2.23-2.02(m,5H)，2.03-1.93(m，2H)，1.93-1.83(m，3H)，1.76-1.67(m，1H)，1.59-1.43(m，10H)，1.39-1.24(m，6H)，1.24-1.15(m，5H)，0.90-0.81(m，9H)ppm。19F NMR(400MHz，DMSO-d6)：-111ppm
实例13：含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物连接子(PB082)的制备
含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB082)制备如下：
步骤1
将化合物82-1(173.53mg，0.242mmol)、HATU(110.30mg，0.290mmol)及DIPEA(93.55mg，0.725mmol)的无水DMF(3mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加化合物39-7(250mg，0.242mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌2小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析(40g C18管柱，用含0.01％ TFA的0至70％的乙腈水溶液经15分钟洗脱)纯化，得到为淡黄色固体的化合物82-2(270mg，0.156mmol，64.41％)。
步骤2
将化合物82-2(870mg，0.502mmol)的DCM(4mL)溶液在室温下搅拌，随后添加TFA(1mL，13.463mmol)，并且将浅黄色溶液搅拌1小时，直至溶液的LCMS显示完成去保护。蒸发溶剂及TFA，随后将残余物直接借由反相液相层析(40g C18管柱，用含0.01％ TFA的0至20％的乙腈水溶液经10分钟洗脱)纯化，得到所需级分，将其冷冻干燥以得到为白色固体的化合物82-3(650mg，0.398mmol，79.29％)。LCMS，m/z＝545.5(M/3+H)+，817.6(M/2+H)+；
步骤3
将化合物82-3(220mg，0.213mmol)及(2S,3S,4S,5R)-2,3,4,5-四羟基-6-氧杂己酸(123.90mg，0.638mmol)的甲醇(6mL)混合物在50℃加热8小时，以实现完成转化。随后将悬浮液浓缩以移除甲醇，将残余物溶解于DMF并借由反相管柱层析(40g C18管柱，用含10mM碳酸氢铵的0至50％的乙腈水溶液经15分钟洗脱)纯化，以收集所需级分，将其冷冻干燥以得到为白色固体的产物82-4。LCMS，m/z＝604.2(M/3+H)+，905.6(M/2+H)+,
步骤4
将化合物82-4(100mg，0.055mmol)的DMF(0.9mL)溶液在室温下搅拌，并且添加无水二乙胺(0.1mL，0.971mmol)。将所得溶液在室温下搅拌15分钟。反应混合物的LCMS显示反应完成。蒸发大部分二乙胺及其他挥发物，随后用甲酸将残余物酸化至pH3-4，随后借由反相快速层析(含有0.01％ TFA的0至40％的乙腈水溶液)纯化，得到为白色固体的预期化合物82-5(35mg，0.022mmol，39.90％)。LCMS，m/z＝794.5(M/2+H)+，530.2(M/2+H)+；
步骤5
将化合物82-5(150mg，0.083mmol)及DIPEA(8.53mg，0.066mmol)的无水DMF(1mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加MC-OSu(10.20mg，0.033mmol)的无水DMF(1mL)溶液。将所得溶液在室温下再搅拌6小时，直至检测到所需产物为主要的新峰，以及少量副产物P2。将反应溶液借由甲酸酸化至pH3-4，随后直接借由制备型HPLC(用含0.01％ TFA的梯度经20分钟洗脱)纯化，得到为白色固体的产物PB082(10mg，0.006mmol，25.52％)。
LCMS，m/z＝594.5(M/3+H)+,891.3(M/2+H)+891.3(M/2+H)+
1H NMR：(500MHz，DMSO-d6)δ9.96(s，1H)，8.07-8.02(m，2H)，7.83-7.81(m，2H)，7.77(d,J＝10.5Hz，1H)，7.59(d，J＝8.0Hz，2H)，7.36(d，J＝8.5Hz，2H)，7.31(s，1H)，6.99(s，2H)，6.67(s，1H)，6.53(s，1H)，5.84-5.79(m，1H)，5.45(s，2H)，5.33-5.23(m，3H)，5.08(s，2H)，4.35-4.24(m,2H)，4.18-4.13(m，1H)，4.10-4.04(m，1H)，3.92-3.91(m，1H)，3.73-3.67(m，2H)，3.58-3.54(m，6H)，3.52-3.45(m，44H)，3.21-3.09(m，6H)，3.03-2.99(m，2H)，2.38(s，3H)，2.28(t，J＝6.5Hz，2H)，2.21-2.08(m，4H)，2.00-1.90(m，1H),1.90-1.82(m，2H),1.74-1.65(m，1H),1.65-1.57(m,1H),1.52-1.45(m，4H)，1.45-1.27(m，5H)，1.24-1.15(m，2H)，0.90-0.81(m，9H)ppm。
实例14：含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物连接子(PB083)的制备
含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB083)制备如下：
步骤1
将化合物38-3(0.190mL，0.499mmol)、HATU(284.86mg，0.749mmol)及DIPEA(193.29mg，1.498mmol)的无水DMF(3mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加化合物38-7(420mg，0.499mmol)的无水DMF(2mL)溶液。将所得溶液在室温下再搅拌1.5小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析(40g C18管柱，用含0.01％ TFA的0至100％的乙腈水溶液经15分钟，随后甲醇经5分钟洗脱)纯化，得到为淡黄色固体的化合物83-1(330mg，0.256mmol，51.16％)。LCMS，m/z＝596.4((M-100)/2+H。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.05(s，1H)，8.14(d，J＝7.6Hz，1H)，8.06(d，J＝9.2Hz，1H)，7.89(d，J＝7.6Hz，2H)，7.78(d，J＝11.2Hz，1H)，7.73-7.71(m，3H)，7.60(d，J＝8.4Hz，2H)，7.53(d，J＝8.4Hz,1H)，7.43-7.31(m，8H)，6.81-6.73(m，1H)，6.03-5.93(m，1H)，5.54-5.37(m，3H)，5.37-5.24(m，3H)，5.08(s,2H)，4.44-4.34(m，1H)，4.34-4.23(m，4H)，4.06-3.97(m，1H)，3.29-3.13(m，1H)，3.13-2.98(m，2H)，2.98-2.81(m，3H)，2.38(s，3H)，2.26-2.17(m，2H)，2.09-1.96(m，1H)，1.96-1.73(m，2H)，1.67-1.54(m，3H)，1.45-1.23(m,17H)，0.89-0.81(m，9H)ppm。
步骤2
向化合物83-1(330mg，0.256mmol)的DCM(4mL)溶液中添加TFA(1mL，6.228mmol)，并且将溶液在室温下搅拌1小时，直至溶液的LCMS显示反应完成。减压蒸发溶剂，随后将残余物借由反相液相层析(40g C18管柱，用含0.01％ TFA的0至40％的乙腈水溶液经10分钟洗脱)纯化，得到为淡黄色固体的产物化合物83-2(300mg，0.252mmol，98.55％)。LCMS，m/z＝596.3(M/2+H)+；
步骤3
将化合物82-1(180.77mg，0.252mmol)、HATU(114.90mg，0.302mmol)及DIPEA(97.45mg，0.755mmol)的无水DMF(1.5mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加化合物83-2(300mg，0.252mmol)的无水DMF(0.5mL)溶液。将所得溶液在室温下再搅拌2小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析(40g C18管柱，用含0.01％ TFA的0至80％的乙腈水溶液经15分钟洗脱)纯化，得到为白色固体的化合物83-3(270mg，0.143mmol，56.70％)。LCMS：m/z＝946.1(M/2+H)+；
步骤4
将化合物83-3(450mg，0.238mmol)的DCM(8mL)溶液在室温下搅拌，随后向溶液中添加TFA(2mL，26.925mmol)。将所得黄色溶液搅拌1小时以实现完全去保护。将完成的溶液浓缩以移除DCM及TFA，随后将棕色残余物借由反相液相层析(40g C18管柱，用含有0.01％TFA的0至50％的乙腈水溶液洗脱15分钟)纯化，以得到为白色固体的所需产物化合物83-4。LCMS，m/z＝597.8(M/3+H)+，896.6(M/2+H)+；步骤5
将化合物83-4(250mg，0.140mmol)、化合物83-5(81.30mg，0.419mmol)、HOAc(0.025mL，0.140mmol)的甲醇(5mL)反应混合物在50℃下在N2下搅拌18小时。随后LCMS指示大部分化合物83-5被消耗并且检测到所需产物。蒸发溶剂，并且将残余物借由C18反相层析纯化，得到所需83-6(100mg，0.051mmol，36.42％)。LCMS，m/z＝656.3(M/3+H)+，983.8(M/2+H)+；
步骤6
将化合物83-6(100mg，0.051mmol)的DMF(0.9mL)溶液在室温下搅拌，并且添加无水二乙胺(0.1mL，0.971mmol)。将所得溶液在室温下搅拌15分钟，直至LCMS显示反应完成并且检测到所需产物的质量。随后将粗产物借由反相液相层析(40g C18管柱，用含0.01％TFA的0至50％的乙腈水溶液洗脱)纯化，得到为白色固体的产物化合物83-7。LCMS，m/z＝582.5(M/3+H)+；
步骤7
将化合物83-7(50mg，0.029mmol)及DIPEA(11.09mg，0.086mmol)的无水DMF(2mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加MC-OSu(13.25mg，0.043mmol)的无水DMF(2mL)溶液。将所得溶液在室温下再搅拌6小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物。将反应溶液借由添加甲酸酸化至pH3-4，随后直接借由制备型HPLC(用含0.01％ TFA的梯度经20分钟洗脱)纯化，得到为白色固体的产物PB083(21mg，0.011mmol，37.81％)。LCMS，m/z＝485.7(M/4+H)+，646.9(M/3+H)+
1H NMR：δ10.04(s，1H)，8.14-8.05(m，2H)，7.96(d，J＝7.6Hz，1H)，7.83-7.76(m，2H)，7.67(d，J＝7.6Hz，1H)，7.60(d，J＝8.4Hz，2H)，7.36(d，J＝8.4Hz，2H)，7.31(s，1H)，6.99(s，2H)，6.53(brs，1H)，6.05-5.97(m，1H)，5.45-5.43(m，4H)，5.34-5.24(m，3H)，5.08(s，2H)，4.43-4.32(m，1H)，4.27-4.17(m，3H)，4.05-4.02(m，1H)，3.87-3.80(m，1H)，3.71-3.64(m，2H)，3.57-3.47(m，53H)，3.16-3.06(m，2H)，3.06-2.92(m，6H)，2.38(s，3H)，2.29(t，J＝6.4Hz，2H)，2.24-2.11(m，4H)，2.03-1.83(m，4H),1.74-1.56(m，3H),1.50-1.35(m，9H)，1.35-1.14(m，5H)，0.89-0.81(m，9H)ppm。
实例15：含有PEG单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物连接子(PB084)的制备
含有PEG单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物-连接子(PB084)制备如下：
步骤1
将化合物84-1(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(84-1，500mg，0.445mmol))、化合物84-2((2S)-2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己酸(84-2，522.71mg，0.445mmol))及DIPEA(172.31mg，1.336mmol)的无水DMF(1mL)溶液在室温下搅拌，随后借由注射器逐滴添加HATU(169.29mg，0.445mmol)的无水DMF(1mL)，历时5分钟。添加后，将所得溶液再搅拌2小时，直至LCMS指示反应完成。随后将完成的反应溶液直接借由反相管柱层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的化合物84-3(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(84-3，600mg，0.263mmol，59.11％))。ESI m/z：760.8(M/3+H)+。
步骤2
向化合物84-3(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(84-3，580mg，0.254mmol))的乙醇(3mL)溶液中添加2M HCl的乙醇(3mL，0.254mmol)。随后将所得淡黄色溶液在室温下搅拌4小时，直至LCMS显示起始材料几乎耗尽。将完成的溶液在冰水中冷却并用碳酸氢钠水溶液中和。减压移除溶剂，并且将水层中的残余物借由反相快速层析(0.01％TFA)纯化，得到为白色固体的产物84-4N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(84-4，300mg，0.138mmol，54.20％)。ESI m/z：727.3(M/3+H)+，718.3(片段，MMAE)，473.5(连接子片段，((2178-717-28-18)/3+H)+).1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.11(s，1H)，8.97-8.80(m，1H)，8.43(d，J＝8.8Hz，1H)，8.32(d，J＝7.2Hz，1H)，8.24-8.06(m，4H)，7.96-7.86(m，1.5H)，7.66(d，J＝8.8Hz，0.5H)，7.58(d，J＝7.6Hz，2H)，7.35-7.24(m，6H)，7.18-7.16(m，1H)，6.07(s，1H)，5.55-5.32(m，4H)，5.12-4.95(m，2H)，4.87-4.37(m，9H)，4.29-4.23(m，2H)，4.04-3.93(m，4H)，3.88-3.84(m，1H)，3.82-3.77(m，2H)，3.69-3.67(m，2H)，3.62-3.56(m，8H)，3.53-3.46(m，44H)，3.30-3.12(m，14H)，3.03-2.83(m，10H)，2.46-2.39(m，1H)，2.32-2.23(m，3H)，2.15-1.85(m，5H)，1.85-1.55(m，6H)，1.55-1.24(m，11H)，1.06-0.97(m，8H)，0.92-0.75(m，29H)ppm。揭示了TFA上的两个羧基质子。
步骤3
将化合物84-4N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(84-4，200mg，0.092mmol)及化合物84-5(6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(84-5，42.39mg，0.138mmol))的无水DMF(4mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加DIPEA(23.67mg，0.184mmol)的DMF(1mL)溶液，历时5分钟。添加后，将所得溶液再搅拌4小时，直至LCMS指示起始胺几乎耗尽。随后将反应溶液借由制备型HPLC(0.01％ FA)纯化，得到所需级分，将其冷冻干燥以得到为白色固体的PB084(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰氨基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]戊烷酰氨基]苯基}甲酯(PB084，120mg，0.051mmol，55.11％))。ESI m/z：1187.2(M/3+H)+，791.7(M/3+H)+，718.5(片段，MMAE)，538.2(连接子片段，(M-717-28-18)/3+H)+)。保留时间6.558分钟(HPLC)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.04(s，1H)，8.36-8.28(m，0.5H)，8.13(d，J＝6.8Hz，1H)，8.13-8.06(m，0.5H)，7.96(d，J＝8.0Hz，1H)，7.91(d，J＝8.4Hz，0.5H)，7.84-7.80(m，1H)，7.68-7.65(m，1.5H)，7.59-7.56(m，2H)，7.34-7.24(m，6H)，7.20-7.16(m，1H)，6.99(s，2H)，5.99(d，J＝5.6Hz，1H)，5.44-5.43(m，3H)，5.37(d，J＝4.8Hz，0.5H)，5.12-4.95(m，2H)，4.78-4.40(m，12H)，4.35-4.17(m，3.5H)，4.04-3.91(m，3H)，3.79-3.55(m，12H)，3.54-3.46(m，48H)，3.35-3.11(m，14H)，3.06-2.83(m，10H)，2.43-2.39(m，1H)，2.31-2.22(m，3H)，2.14-1.16(m，30H)，1.05-0.97(m，6H)，0.89-0.75(m，27H)ppm。
实例16：含有PEG单元及连接至SN-38的可裂解连接子的药物连接子(PB085)的制备
含有PEG单元及连接至SN-38的可裂解连接子的药物-连接子(PB085)制备如下：
步骤1
将化合物85-1((19S)-10,19-二乙基-7,19-二羟基-17-氧杂-3,13-二氮杂五环[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-14,18-二酮(SN-38)(85-1，460mg，1.173mmol))及DIPEA(302.76mg，2.347mmol)的无水DMF(4mL)的淡黄色混合物在室温下搅拌，并且逐滴添加碳酸双(4-硝基苯基)酯(PNPC，356.73mg，1.173mmol)的无水DMF(2mL)，历时10分钟。添加后，淡黄色混合物变成浅黄色混合物，随着反应的进行，物质缓慢溶解。添加后，将所得黄色澄清溶液在室温下再搅拌30分钟，随后借由LCMS监测。光谱显示起始材料SN-38的完全消耗，期望的苯酚活化的产物作为主要的新峰与副产物醇活化的碳酸酯一起形成。反应溶液直接用于下一步骤。ESI m/z＝558.2(M+H)+。
步骤2
用化合物85-3(N-甲基-N-[2-(甲基氨基)乙基]氨基甲酸三级丁酯(85-3、264.63mg，1.408mmol))及DIPEA(302.63mg，2.346mmol)处理来自上一步骤的粗活性碳酸酯的DMF溶液(85-2A、85-2B、85-2C的混合物)。将反应溶液搅拌1小时后，LCMS指示完全转化。检测到所需产物85-4及SN-38。将反应溶液借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为淡黄色固体的所需产物85-4(N-(2-{[(三级丁氧基)羰基](甲基)氨基}乙基)-N-甲基氨基甲酸(19S)-10,19-二乙基-19-羟基-14,18-二氧杂-17-氧杂-3,13-二氮杂五环[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-7-基酯(85-4，467mg，0.771mmol，65.70％))。ESI m/z：607.3(M+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ10.10-10.01(m，1H)，8.18(d，J＝9.2Hz，1H)，8.10(d，J＝7.2Hz，1H)，7.93-7.86(m，3H)，7.73(t，J＝8.0Hz，2H)，7.62-7.52(m,3H)，7.43-7.26(m,8H)，6.52(s，1H)，5.97(s，1H)，5.45-5.34(m，5H)，5.09-5.00(m，2H)，4.44-4.40(m，1H)，4.32-4.22(m，3H)，3.93(t，J＝7.6Hz，1H)，3.65-3.50(m，7H)，3.19-3.12(m，2H)，3.04-2.89(m，7H)，2.02-1.914(m，1H)，1.91-1.74(m，2H)，1.74-1.52(m，2H)，1.52-1.36(m，2H)，1.36-1.26(m，2H)，0.91-0.84(m，9H)ppm。
步骤3
将化合物85-4(N-(2-{[(三级丁氧基)羰基](甲基)氨基}乙基)-N-甲基氨基甲酸(19S)-10,19-二乙基-19-羟基-14,18-二氧杂-17-氧杂-3,13-二氮杂五环[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-7-基酯(85-4，600mg，0.990mmol))的DCM(1.8mL)溶液在室温下搅拌，随后添加TFA(0.2mL，2.693mmol)。将所得溶液在搅拌1小时，直至LCMS显示反应完成。用旋转蒸发仪蒸发掉所有溶剂及TFA，随后将残余物借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到预期级分，将其冻干以得到为淡黄色固体的产物85-5(N-甲基-N-[2-(甲基氨基)乙基]氨基甲酸(19S)-10,19-二乙基-19-羟基-14,18-二氧杂-17-氧杂-3,13-二氮杂五环[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-7-基酯(85-5，550mg，0.889mmol，89.75％))的TFA盐。ESIm/z：254.3(M/2+H)+，507.3(M+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ9.25(s，1H)，9.16(s，1H)，8.19(d，J＝9.2Hz，1H)，8.13(s，1H)，7.84-7.80(m，1H)，7.35(s，1H)，5.45(s，2H)，5.35(s，2H)，3.84-3.82(m，1H)，3.67-3.64(m，1H)，3.25-3.17(m，6H)，3.01(s，1H)，2.64-2.57(m，3H)，1.92-1.84(m，2H)，1.31(t，J＝7.2Hz，3H)，0.89(t，J＝7.2Hz，3H)ppm。揭示了TFA上的一个羧基质子。
步骤4
将HOBt(78.39mg，0.581mmol)及化合物85-6(4-硝基苯基碳酸{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3-甲基丁酰氨基]戊烷酰氨基]苯基}甲酯(85-6，444.77mg，0.581mmol))的无水DMF(2mL)的黄色溶液在室温下搅拌，随后借由注射器逐滴添加DIPEA(224.71mg，1.742mmol)的无水DMF(2mL)溶液。在加入碱时，反应溶液的颜色变成棕色。添加后，将所得棕色溶液再搅拌1小时，直至所有起始胺耗尽(借由LCMS监测)。将反应溶液直接借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为黄色固体的化合物85-7(N-{2-[({[(19S)-10,19-二乙基-19-羟基-14,18-二氧杂-17-氧杂-3,13-二氮杂五环[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-7-基]氧基}羰基)(甲基)氨基]乙基}-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3-甲基丁酰氨基]戊烷酰氨基]苯基}甲酯(85-7，450mg，0.397mmol，68.33％))。ESI m/z：568.4(M/2+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ10.10-10.01(m，1H)，8.18(d，J＝9.2Hz，1H)，8.10(d，J＝7.2Hz，1H)，7.93-7.86(m，3H)，7.73(t，J＝8.0Hz，2H)，7.62-7.52(m,3H)，7.43-7.26(m,8H)，6.52(s，1H)，5.97(s，1H)，5.45-5.34(m，5H)，5.09-5.00(m，2H)，4.44-4.40(m，1H)，4.32-4.22(m，3H)，3.93(t，J＝7.6Hz，1H)，3.65-3.50(m，7H)，3.19-3.12(m，2H)，3.04-2.89(m，7H)，2.02-1.914(m，1H)，1.91-1.74(m，2H)，1.74-1.52(m，2H)，1.52-1.36(m，2H)，1.36-1.26(m，2H)，0.91-0.84(m，9H)ppm。
步骤5
向化合物85-7(N-{2-[({[(19S)-10,19-二乙基-19-羟基-14,18-二氧杂-17-氧杂-3,13-二氮杂五环[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-7-基]氧基}羰基)(甲基)氨基]乙基}-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3-甲基丁酰氨基]戊烷酰氨基]苯基}甲酯(85-7，450mg，0.397mmol))的无水DMF(1.8mL)黄色溶液中添加二乙胺(0.2mL，1.941mmol)。将溶液再搅拌1小时，直至所有起始材料耗尽(借由LCMS监测)。随后用旋转蒸发仪蒸发反应溶液以移除大部二乙胺，并且将残余物借由反相快速层析(0.01％TFA)纯化，得到为黄色固体的化合物85-8，VC-PAB-SN-38TFA盐(N-{2-[({[(19S)-10,19-二乙基-19-羟基-14,18-二氧杂-17-氧杂-3,13-二氮杂五环[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-7-基]氧基}羰基)(甲基)氨基]乙基}-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(85-8，VC-PAB-SN-38TFA盐，310mg，0.340mmol，85.62％))。ESI m/z：456.9(M/2+H)+，912.4(M+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ10.18(s，0.6H)，10.14(s，0.4H)，8.67(d，J＝8.0Hz，1H)，8.18(d，J＝7.6Hz，1H)，8.08(brs，3H)，7.94(d J＝7.6Hz，1H)，7.58-7.50(m，3H)，7.34-7.27(m,3H)，6.54(s，1H)，6.04(t，J＝5.6Hz，1H)，5.53-5.34(m，6H)，5.06-5.00(m，2H)，4.55-4.45(m，1H)，3.70-3.60(m，2H)，3.60-3.50(m，1H)，3.50-3.46(m，2H)，3.21-3.12(m，3H)，3.05-2.89(m，8H)，1.93-1.82(m，2H)，1.77-1.55(m，2H)，1.55-1.38(m，2H)，1.38-1.22(m，3H)，0.95-0.87(m，9H)ppm。TFA上的一个羧基质子与8.08ppm处的氨基重叠。
步骤6
将化合物85-8(N-{2-[({[(19S)-10,19-二乙基-19-羟基-14,18-二氧杂-17-氧杂-3,13-二氮杂五环[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-7-基]氧基}羰基)(甲基)氨基]乙基}-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(85-8，VC-PAB-SN-38，240mg，0.263mmol))、化合物85-9((2S)-2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己酸(85-9，308.95mg，0.263mmol))及DIPEA(67.89mg，0.526mmol)的无水DMF(3mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加HATU(100.06mg，0.263mmol)的无水DMF(3mL)溶液。将所得黄色溶液再搅拌2小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析(0.01％ TFA)纯化，得到为淡黄色固体的化合物85-10(N-{2-[({[(19S)-10,19-二乙基-19-羟基-14,18-二氧杂-17-氧杂-3,13-二氮杂五环[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-7-基]氧基}羰基)(甲基)氨基]乙基}-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(85-10，340mg，0.164mmol，62.48％))。ESI m/z：690.3(M/3+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ10.03(s，1H)，8.20-8.10(m，3H)，7.94-7.90(m，1H)，7.80(t，J＝13.2Hz，1H)，7.59-7.53(m，4H)，7.34-7.27(m,3H)，7.01(d，J＝8.0Hz，1H)，6.53(s，1H)，5.99(t，J＝5.2Hz，1H)，5.45-5.35(m，7H)，5.05-5.00(m，2H)，4.84-4.37(m，8H)，4.25(t，J＝7.6Hz，1H)，4.04-3.96(m，2H)，3.92-3.85(m，1H)，3.80-3.77(m，2H)，3.70-3.67(m，3H)，3.63-3.53(m，18H)，3.50-3.40(m，36H)，3.36-3.27(m，11H)，3.09-3.12(m，3H)，3.04-2.89(m，9H)，2.29(t，J＝6.0Hz，2H)，1.99-1.83(m，3H)，1.69-1.53(m，3H)，1.53-1.26(m，19H)，0.91-0.81(m，9H)ppm。TFA上的一个羧基质子出现在8.20-8.10ppm之间。
步骤7
向化合物85-10(N-{2-[({[(19S)-10,19-二乙基-19-羟基-14,18-二氧杂-17-氧杂-3,13-二氮杂五环[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-7-基]氧基}羰基)(甲基)氨基]乙基}-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(85-10，100mg，0.048mmol))的甲醇(3mL)溶液中缓慢添加2M HCl的甲醇(1mL)，同时在室温下搅拌。添加后，澄清溶液变成亮黄色。将溶液保持搅拌2小时，直至LCMS指示完全去保护。随后将溶液冷却至-20℃并用DIPEA中和，由此，黄色反应溶液变成无色溶液。随后用旋转蒸发仪在30℃以下蒸发有机溶剂，得到淡黄色残余物，将其溶解于水并借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到所需级分(pH3-4，LCMS显示级分纯度为约60％至58％)。冻干后，获得黄色固体(～100mg)，纯度为63％至64％。随后借由反相快速层析(中性洗脱剂)再次纯化固体，得到具有约48％至51％的纯度的所需级分(pH6-7)。将收集的级分冻乾，得到为淡黄色固体的化合物85-11(N-{2-[({[(19S)-10,19-二乙基-19-羟基-14,18-二氧杂-17-氧杂-3,13-二氮杂五环[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-7-基]氧基}羰基)(甲基)氨基]乙基}-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(85-11，80mg，0.041mmol，84.07％))。产物直接作为不纯的材料用于下一步骤。ESI m/z：657.0(M/3+H)+，985.2(M/2+H)+。
步骤8
向50mL圆底烧瓶中添加化合物85-11(N-{2-[({[(19S)-10,19-二乙基-19-羟基-14,18-二侧氧基-17-氧杂-3,13-二氮杂五环[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-7-基]氧基}羰基)(甲基)氨基]乙基}-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(85-11，80mg粗物质，纯度45％，0.041mmol))、化合物85-12(6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(85-12，12.52mg，0.041mmol))及无水DMF(2mL)。将溶液在室温下搅拌并借由注射器逐滴添加DIPEA(7.87mg，0.061mmol)的无水DMF(2mL)溶液，历时5分钟。添加后，将溶液再搅拌4小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽。随后将完成的反应溶液用TFA中和，并且直接借由制备型HPLC(0.01％TFA)纯化，得到所需级分，将其冷冻干燥以得到为白色固体的化合物PB085(N-{2-[({[(19S)-10,19-二乙基-19-羟基-14,18-二侧氧基-17-氧杂-3,13-二氮杂五环[11.8.0.0^{2,11}.0^{4,9}.0^{15,20}]二十一-1(21),2,4,6,8,10,15(20)-庚烯-7-基]氧基}羰基)(甲基)氨基]乙基}-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰氨基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]戊烷酰氨基]苯基}甲酯(PB085，13mg，0.006mmol，基于起始胺含量计算产率32％))的TFA盐。ESI m/z：1081.3(M/2+H)+，721.3(M/3+H)+，541.5(M/4+H)+，保留时间5.819分钟(HPLC)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.00(s，0.6H)，9.98(s，0.4H)，8.20-8.08(m，3H)，7.94(d，J＝8.0Hz，2H)，7.79(t，J＝5.6Hz，1H)，7.66-7.52(m，4H),7.34-7.26(m，3H)，6.99(s，2H)，6.53(s，1H)，5.98(t，J＝5.6Hz，1H)，5.45-5.41(m，5H)，5.35(s，2H)，5.05-4.99(m，2H)，4.82-4.73(m，2H)，4.59-4.49(m，4H)，4.49-4.32(m，3H)，4.27-4.15(m，2H)，4.04-3.95(m，2H)，3.82-3.75(m，2H)，3.69-3.44(m，65H)，3.19-3.12(m，3H)，3.03-2.89(m，11H)，2.29(t，J＝6.4Hz，2H)，2.14-2.08(m，2H)，2.02-1.84(m，3H)，1.72-1.60(m，3H)，1.55-1.15(m，18H)，0.90-0.80(m，9H)ppm。TFA上的一个羧基质子出现在8.20-8.08ppm之间。
实例17：含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物连接子(PB086)的制备
含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB086)制备如下：
步骤1
将化合物86-1(1-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸(86-1，500mg，0.697mmol))及HOSu(160.39mg，1.395mmol)的无水DCM(14mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加EDCI(267.36mg，1.395mmol)。将所得溶液再搅拌1小时，随后用更多的DCM(20mL)稀释，并用水(20mL)洗涤。收集有机层，并且用更多的DCM(20mL)萃取水层。将合并的DCM层经硫酸钠干燥，随后过滤并浓缩，得到为无色油状物的粗物质2,2-二甲基-4-侧氧基-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-十三氧杂-5-氮杂四十四烷-44-酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(800mg，定量产率)。ESI m/z：715.5(M-100+H)+；837.5(M+Na)+。
将得到的活性酯(800mg粗物质，0.697mmol)溶解于无水DMF(4mL)，随后添加化合物86-2((2S)-6-氨基-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸、TFA盐(86-2，503.93mg，1.045mmol))及DIPEA(179.83mg，1.394mmol)。将反应溶液在室温下搅拌1小时，直至所有活性酯被耗尽(借由LCMS监测)。随后将所得溶液直接借由反相快速层析(0.01％TFA)纯化，得到为淡黄色油状物的化合物86-3((2S)-6-(1-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(86-3，600mg，0.562mmol，80.58％))。ESI m/z：484.9((M-100)/2+H)+，968.7(M-100+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.64(s，1H)，7.90(d，J＝7.2Hz，2H)，7.82(t，J＝5.6Hz，1H)，7.73(d，J＝7.2Hz，2H)，7.62(d，J＝8.0Hz，1H)，7.45-7.40(m，2H)，7.36-7.31(m，2H)，7.76(t，J＝5.6Hz，1H)，4.29-4.21(m，3H)，3.94-3.88(m，1H)，3.68-3.56(m，4H)，3.51-3.47(m，44H)，3.07-3.00(m，4H)，2.29(t，J＝6.4Hz，2H)，1.73-1.60(m，2H)，1.52-1.29(m，13H)ppm.
步骤2
将化合物86-3((2S)-6-(1-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(86-3，600mg，0.562mmol))、HATU(256.43mg，0.674mmol)及DIPEA(145.00mg，1.124mmol)的无水DMF(4mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加化合物86-4(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(86-4，471.91mg，0.562mmol))。将所得溶液再搅拌1小时，直至LCMS指示反应完成。随后将溶液直接借由反相快速层析(0.01％TFA)纯化，得到为灰白色固体的化合物86-5(N-(38-{[(5S)-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷-1-基)氨基甲酸三级丁酯(86-5，750mg，0.397mmol，70.60％))。ESI m/z：597.9((M-100)/3+H)+，896.1((M-100)/2+H)+，946.7(M/2+H)+。
步骤3
向化合物86-5(N-(38-{[(5S)-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷-1-基)氨基甲酸三级丁酯(86-5、700mg，0.370mmol))的DCM(8mL)溶液中缓慢添加TFA(2mL，26.925mmol)。将所得黄色溶液在室温下搅拌1小时至完成。用旋转蒸发仪蒸发TFA及溶剂，并且将残余物借由反相快速层析(0.01％TFA)纯化，得到期望级分，将其冻干以得到为白色固体的产物86-6(N-[(1S)-5-(1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(86-6，460mg，0.257mmol，69.38％))。ESI m/z：896.6(M/2+H)+，597.9(M/3+H)+。
步骤4
向CDI(0.029mL，0.234mmol)的无水DMF(4mL)溶液中借由注射器逐滴添加化合物86-6(N-[(1S)-5-(1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30，33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(86-6，350mg，0.195mmol))的无水DMF(4mL)溶液，历时5分钟。添加后，将淡黄色溶液在室温下再搅拌1小时以完成(借由LCMS监测)。检测到活性中间体N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-{1-[(1H-咪唑-1-羰基)氨基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基}戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯为主峰。ESI m/z：629.3(M/3+H)+，943.3(M/2+H)+。
向以上活性中间体(0.195mmol)的DMF(4mL)反应溶液中添加化合物86-7((2R,3R,4R,5S)-6-氨基己烷-1,2,3,4,5-五醇(86-7，70.59mg，0.390mmol))及DIPEA(50.31mg，0.390mmol)。将所得溶液在室温下搅拌2小时，直至所有物质耗尽。随后将溶液直接借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为淡黄色固体的化合物86-8(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-[1-({[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]氨基甲酰基}氨基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基]戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(86-8，200mg，0.100mmol，51.33％))。ESI m/z：999.8(M/2+H)+，666.9(M/3+H)+。
步骤5
将化合物86-8(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-[1-({[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]氨基甲酰基}氨基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基]戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(86-8，200mg，0.100mmol))的DMF(3.6mL)溶液在室温下搅拌，并且添加二乙胺(0.4mL，3.883mmol)。将所得溶液搅拌30分钟。随后真空蒸发二乙胺，用甲酸中和DMF中的残余物并借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为淡黄色固体的所需产物86-9(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[1-({[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]氨基甲酰基}氨基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(86-9，130mg，0.073mmol，73.14％))。ESI m/z：592.9(M/3+H)+，889.0(M/2+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.09(s，1H)，8.42(d，J＝8.4Hz，1H)，8.31(d，J＝6.8Hz，1H)，8.12-8.04(m，4H)，7.85(t，J＝5.6Hz，1H)，7.78(d，J＝10.8Hz，1H)，7.60(d，J＝7.6Hz，2H)，7.37(d，J＝8.8Hz，2H)，7.32(s，1H)，6.54(brs，1H)，6.12(t，J＝5.6Hz，1H)，6.04(t，J＝5.6Hz，1H)，5.97(t，J＝5.6Hz，1H)，5.54-5.45(m，3H)，5.40-5.23(m，3H)，5.09(s，2H)，4.44-4.38(m，2H)，4.30-4.27(m，1H)，3.89-3.81(m，1H)，3.69-3.54(m，6H)，3.54-3.45(m，48H)，3.26-3.13(m，6H)，3.13-3.05(m，4H)，3.05-2.98(m，3H)，2.98-2.89(m，2H)，2.37(s，3H)，2.29(t，J＝6.4Hz，2H)，2.24-2.10(m，2H)，2.04-1.93(m，1H)，1.93-1.82(m，2H)，1.72-1.54(m，4H)，1.45-1.23(m，6H)，0.92-0.86(m，9H)ppm。TFA上的一个羧基质子出现在8.12-8.04ppm之间。
步骤6
将化合物86-9(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[1-({[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]氨基甲酰基}氨基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(86-9，60mg，0.034mmol))及化合物86-10(6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(86-10，12.50mg，0.041mmol))的无水DMF(1.5mL)溶液在室温下搅拌，随后添加DIPEA(6.54mg，0.051mmol)。将反应溶液再搅拌2小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽。将所得溶液用甲酸中和，随后借由制备型HPLC(0.01％ TFA)纯化，得到所需级分，将其冷冻干燥以得到为白色固体的PB086(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰氨基]-6-[1-({[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]氨基甲酰基}氨基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]戊烷酰氨基]苯基}甲酯(PB086，30mg，0.015mmol，45.09％))。ESI m/z：985.1(M/2+H)+，657.3(M/3+H)+，493.3(M/4+H)+，保留时间6.424分钟(HPLC)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.03(s，1H)，8.11(d，J＝7.2Hz，1H)，8.06(d，J＝8.8Hz，1H)，7.96(d，J＝8.0Hz，1H)，7.82-7.76(m，2H)，7.66(d，J＝8.8Hz，1H)，7.60(d，J＝8.4Hz，2H)，7.36(d，J＝8.4Hz，2H)，7.32(s，1H)，6.99(s，2H)，6.50(brs，1H)，6.11(t，J＝5.6Hz，1H)，6.00-5.94(m，2H)，5.45-5.38(m，3H)，5.35-5.24(m，3H)，5.08(s，2H)，4.40-4.17(m，4H)，3.59-3.45(m，54H)，3.24-3.16(m，4H)，3.16-3.09(m，4H)，3.04-2.90(m，7H)，2.38(s，3H)，2.29(t，J＝6.4Hz，2H)，2.23-2.13(m，2H)，2.13-2.06(m，2H)，2.01-1.96(m，1H)，1.96-1.81(m，2H)，1.73-1.54(m，4H)，1.48-1.29(m，10H)，1.24-1.14(m，4H)，0.90-0.81(m，9H)ppm。
实例18：含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物连接子(PB087)的制备
含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB087)制备如下：
步骤1及步骤2
将化合物87-1(1-叠氮基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸(87-1，300mg，0.466mmol))及HOSu(80.39mg，0.699mmol)的无水DCM(10mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后在室温下添加EDCI(134.01mg，0.699mmol)。将所得溶液再搅拌1小时，随后用更多的DCM(20mL)稀释并用水(20mL)洗涤，分离有机层，并用更多的DCM(20mL*2)萃取水层。将合并的DCM层经硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到为无色油状物的粗物质活性酯(345mg，定量产率)。ESI m/z：741.5(M+H)+，763.4(M+Na)+。将得到的酯溶解于无水DMF(4mL)，随后添加化合物87-3((2S)-6-氨基-2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}己酸(87-3，114.78mg，0.466mmol))及DIPEA(120.23mg，0.932mmol)。将所得混合物在室温下搅拌隔夜，直至所有起始胺耗尽，并将混合物变成澄清浅黄色溶液。随后将完成的反应溶液直接借由反相快速层析(0.01％TFA)纯化，得到为无色油状物的化合物87-4((S)-1-叠氮基-45-((三级丁氧基羰基)氨基)-39-侧氧基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂-40-氮杂四十六烷-46-酸(87-4，350mg，0.401mmol，86.13％))。ESI m/z：386.8((M-100)/2+H)+，872.6(M+H)+。
步骤3
将化合物87-4((S)-1-叠氮基-45-((三级丁氧基羰基)氨基)-39-侧氧基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂-40-氮杂四十六烷-46-酸(87-4，350mg，0.401mmol))及化合物87-5(2-(丙-2-炔-1-基)丙二酸1,3-二乙酯(87-5，158.94mg，0.803mmol))的DCM(8mL)溶液在室温下搅拌，随后添加Cu(CN)4PF 6(447.94mg，1.204mmol)。将所得溶液再搅拌4小时，直至反应完成(借由LCMS监测)。随后将反应溶液浓缩并溶解於乙腈，过滤以移除铜催化剂。将滤液借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的1,4-二取代的三唑异构体(2S)-2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-6-(1-{4-[3-乙氧基-2-(乙氧基羰基)-3-侧氧基丙基]-1H-1,2,3-三唑-1-基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)己酸及1,5-二取代的三唑异构体(2S)-2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-6-(1-{5-[3-乙氧基-2-(乙氧基羰基)-3-侧氧基丙基]-1H-1,2,3-三唑-1-基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)己酸的混合物(化合物87-6a/87-6b，350mg，0.327mmol，81.57％)。ESI m/z：485.9((M-100)/2+H)+，两种区域选择性异构体在LCMS中重叠。
步骤4
将化合物87-6a/87-6b的混合物(350mg，0.327mmol的(2S)-2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-6-(1-{5-[3-乙氧基-2-(乙氧基羰基)-3-侧氧基丁基]-1H-1,2,3-三唑-1-基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)己酸及(2S)-2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-6-(1-{4-[3-乙氧基-2-(乙氧基羰基)-3-侧氧基丙基]-1H-1,2,3-三唑-1-基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)己酸)、HATU(149.25mg，0.393mmol)及DIPEA(23.99mg，0.186mmol)的无水DMF(2mL)在室温下搅拌5分钟，随后添加化合物87-7(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(87-7，275.06mg，0.327mmol))。将所得溶液再搅拌1小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相快速层析(0.01％TFA)纯化，得到为白色固体的化合物87-8a/87-8b的混合物(380mg，0.201mmol，61.36％的2-{[1-(38-{[(5S)-5-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷-1-基)-1H-1,2,3-三唑-5-基]甲基}丙二酸1,3-二乙酯及其区域选择性异构体2-{[1-(38-{[(5S)-5-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷-1-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲基}丙二酸1,3-二乙酯)。ESI m/z：449.4((M-100)/4+H)+，632.1(M/3+H)+，947.7(M/2+H)+，保留时间8.205分钟(HPLC)。两种异构体在LCMS中重叠为一个峰。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.06(s，1H)，8.20(d，J＝7.2Hz，1H)，8.07(d，J＝8.0Hz，1H)，7.84-7.76(m，3H)，7.61(d，J＝8.4Hz，2H)，7.55(d，J＝8.4Hz，1H)，7.36(d，J＝8.8Hz，2H)，7.31(s，1H)，7.02(d，J＝8.0Hz，1H)，6.63-6.43(m，1H)，5.99(s，1H)，5.50-5.40(m，3H)，5.34-5.23(m，3H)，5.08(s，2H)，4.48-4.45(m，2H)，4.42-4.36(m，1H)，4.27-4.23(m，1H)，4.13-4.08(m，4H)，3.93-3.86(m，1H)，3.82(t，J＝7.6Hz，1H)，3.77(t，J＝4.2Hz，2H)，3.58-3.55(m，2H)，3.50-3.45(m，44H)，3.32-3.21(m，2H)，3.13(d，J＝8.0Hz，2H)，3.04-2.92(m，5H)，2.38(s，3H)，2.29(d，J＝6.4Hz，2H)，2.23-2.10(m，2H)，1.99-1.71(m，3H)，1.71-1.48(m，3H)，1.48-1.21(m，16H)，1.15(t，J＝6.8Hz，6H)，0.90-0.81(m，9H)ppm。
步骤5
将化合物87-8a/87-8b(2-{[1-(38-{[(5S)-5-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷-1-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲基}丙二酸1,3-二乙酯及2-{[1-(38-{[(5S)-5-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷-1-基)-1H-1,2,3-三唑-5-基]甲基}丙二酸1,3-二乙酯)的混合物(87-8a/87-8b，380mg，0.201mmol)的THF(6mL)在室温下搅拌，随后添加氢氧化锂一水合物(8.87mg，0.211mmol)的水(3mL)。反应溶液变成黄色并保持再搅拌2小时以实现完全水解。用TFA将溶液酸化至pH 6.0，随后减压浓缩以移除THF，将水中的残余物借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的化合物87-9a/87-9b的混合物(250mg，0.136mmol，67.80％的1,4-二取代的三唑异构体2-{[1-(38-{[(5S)-5-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷-1-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲基}丙二酸及1,5-二取代的三唑异构体2-{[1-(38-{[(5S)-5-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷-1-基)-1H-1,2,3-三唑-5-基]甲基}丙二酸)。在保留时间1.792分钟下，约30％至44％异构体1，在保留时间1.811分钟下，40％至52％异构体2，ESI m/z＝613.3(M/3+H)+；919.1(M/2+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.05(s，1H)，8.19(d，J＝7.2Hz，1H)，8.07-8.03(m，1H)，7.82-7.76(m，3H)，7.61(d，J＝7.2Hz，2H)，7.54(d，J＝8.8Hz，1H)，7.37(d，J＝8.8Hz，2H)，7.33(s，0.5H)，7.32(s，0.5H)，7.01(d，J＝8.0Hz，1H)，6.54-6.53(m，1H)，5.99(s，1H)，5.46-5.39(m，3H)，5.34-5.23(m，3H)，5.09(s，2H)，4.48-4.46(m，2H)，4.43-4.37(m，1H)，4.28-4.23(m，1H)，3.91-3.86(m，1H)，3.78(t，J＝5.6Hz，1H)，3.65-3.56(m，4H)，3.51-3.45(m，46H)，3.15-2.90(m，8H)，2.38(s，3H)，2.29(d，J＝6.4Hz，2H)，2.23-2.11(m，2H)，1.99-1.82(m，3H)，1.72-1.49(m，3H)，1.49-1.22(m，17H)，0.90-0.81(m，9H)ppm。
步骤6
向圆底烧瓶中添加化合物87-9a/87-9b的混合物(240mg，0.131mmol的2-{[1-(38-{[(5S)-5-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷-1-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲基}丙二酸及2-{[1-(38-{[(5S)-5-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十八烷-1-基)-1H-1,2,3-三唑-5-基]甲基}丙二酸)，随后添加化合物87-10((2R,3R,4R,5S)-6-氨基己烷-1,2,3,4,5-五醇(87-10，94.69mg，0.523mmol))及DIPEA(50.56mg，0.392mmol)的无水DMF(1.5mL)溶液。将棕色溶液在室温下搅拌5分钟，随后逐滴添加HATU(99.35mg，0.261mmol)的无水DMF(1.5mL)溶液。添加后，将所得溶液再搅拌2小时，直至LCMS指示转换完成。将反应溶液直接借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到1,4-二取代的三唑及1,5-二取代的三唑的混合物，将其借由制备型HPLC(0.01％ TFA)进一步纯化，得到为淡黄色固体的化合物87-11a(1,4-二取代的异构体N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-{1-[4-(2-{[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]氨基甲酰基}乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基}戊基]氨基甲酸三级丁酯(87-11a，65mg，0.033mmol，25.43％))及为淡黄色固体的化合物87-11b(1,5-二取代的异构体N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-{1-[5-(2-{[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]氨基甲酰基}乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基}戊基]氨基甲酸三级丁酯(87-11b，35mg，0.018mmol，13.66％))。
87-11a(多数)：ESI m/z：653.0(M/3+H)+，979.2(M/2+H)+。1H NMR：(400MHz，DMSO-d6)δ10.04(s，1H)，8.19(d，J＝6.8Hz，1H)，8.06(d，J＝7.6Hz，1H)，7.86-7.77(m，4H)，7.60(d，J＝8.8Hz，2H)，7.54(d，J＝8.4Hz，1H)，7.36(d，J＝8.4Hz，2H)，7.32(s，1H)，7.00(d，J＝8.0Hz，1H)，6.53(s，1H)，5.99(s，1H)，5.45-5.35(m，3H)，5.35-5.24(m，3H)，5.08(s，2H)，4.47-4.44(m，2H)，4.41-4.36(m，1H)，4.27-4.23(m，1H)，3.93-3.86(m，1H)，3.79(t，J＝4.2Hz，2H)，3.67-3.56(m，8H)，3.56-3.46(m，44H)，3.16-2.90(m，12H)，2.83(t，J＝7.6Hz，2H)，2.43(t，J＝8.0Hz，2H)，2.38(s，3H)，2.29(t，J＝6.4Hz，2H)，2.23-2.11(m，2H)，2.00-1.82(m，4H)，1.73-1.57(m，3H)，1.50-1.24(m，18H)，0.90-0.81(m，9H)ppm。揭示了TFA上的一个羧基质子。
87-11b(少数)：
ESI m/z：653.0(M/3+H)+；979.1(M/2+H)+。1H NMR：(400MHz，DMSO-d6)δ10.04(s，1H)，8.18(d，J＝7.6Hz，1H)，8.04(d，J＝8.8Hz，1H)，7.83-7.75(m，4H)，7.61(d，J＝8.8Hz，2H)，7.54(d，J＝8.8Hz，1H)，7.36(d，J＝8.8Hz，2H)，7.33(s，1H)，7.00(d，J＝8.4Hz，1H)，6.53(s，1H)，5.99(s，1H)，5.45-5.39(m，3H)，5.34-5.23(m，3H)，5.09(s，2H)，4.46(t，J＝4.2Hz，2H)，4.41-4.36(m，1H)，4.27-4.23(m，1H)，3.93-3.88(m，1H)，3.79(t，J＝4.6Hz，2H)，3.67-3.56(m，8H)，3.56-3.47(m，44H)，3.13-2.90(m，12H)，2.83(t，J＝7.6Hz，2H)，2.43(t，J＝7.6Hz，2H)，2.38(s，3H)，2.29(t，J＝6.4Hz，2H)，2.22-2.10(m，2H)，2.00-1.85(m，4H)，1.73-1.55(m，3H)，1.48-1.24(m，18H)，0.90-0.81(m，9H)ppm。揭示了TFA上的一个羧基质子。
步骤7
将化合物87-11a(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-{1-[4-(2-{[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]氨基甲酰基}乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基}戊基]氨基甲酸三级丁酯(87-11a，60mg，0.031mmol))的甲醇(2mL)在室温下搅拌，随后添加2M HCl的甲醇(1mL)。将溶液搅拌1小时，直至LCMS显示所有起始材料耗尽。随后将反应溶液用碳酸氢钠水溶液中和，用旋转蒸发仪蒸发掉溶剂甲醇，将残余物溶解于水并借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，收集所需级分，将其冷冻干燥以得到为白色固体的产物87-12a(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-{1-[5-(2-{[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]氨基甲酰基}乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30，33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基}己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲基酯(87-12a，20mg，0.011mmol))。ESI m/z：928.7(M/2+H)+，619.5(M/3+H)+。1H NMR：(400MHz，DMSO-d6)δ10.09(s，1H)，8.41(d，J＝8.4Hz，1H)，8.31(d，J＝8.0Hz，1H)，8.08-8.02(m，4H)，7.85-7.80(m，3H)，7.79(s，1H)，7.60(d，J＝8.8Hz，2H)，7.37(d，J＝8.4Hz，2H)，7.32(s，1H)，6.54(s，1H)，6.00(t，J＝4.0Hz，1H)，5.46(brs，4H)，5.34-5.25(m，3H)，5.09(s，2H)，4.47-4.26(m，7H)，3.89-3.84(m，1H)，3.80-3.76(m，2H)，3.60-3.56(m，5H)，3.50-3.47(m，44H)，3.29-3.22(m，2H)，3.16-2.94(m，9H)，2.85-2.81(m，1H)，2.45-2.41(m，1H)，2.39(s，3H)，2.31(t，J＝6.4Hz，2H)，2.24-2.11(m，4H)，2.02-1.98(m，1H)，1.90-1.82(m，3H)，1.69-1.64(m，3H)，1.60-1.55(m，1H)，1.46-1.23(m，7H)，0.92-0.86(m，9H)ppm。揭示了TFA上的一个羧基质子。
步骤8
将化合物87-12a(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-{1-[4-(2-{[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]氨基甲酰基}乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基}己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(87-12a，20mg，0.011mmol))及DIPEA(1.94mg，0.015mmol)的无水DMF(1mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加化合物87-13(6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(87-13，3.08mg，0.010mmol))的无水DMF(1mL)溶液。将所得溶液再搅拌4小时，直至LCMS指示所有起始活性酯耗尽并且几乎无起始胺残留。随后用TFA将所得溶液酸化至pH4-5，借由制备型HPLC(0.01％ TFA)纯化，得到所需级分，将其冷冻干燥以得到为白色固体的PB087(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰氨基]-6-{1-[4-(2-{[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]氨基甲酰基}乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基}己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]戊烷酰氨基]苯基}甲酯(PB087，12mg，0.006mmol，58.56％))。ESI m/z：1047.7(M/2+Na)+，684.1(M/3+H)+，513.4(M/4+H)+，保留时间6.372分钟(HPLC)。1H NMR：(400MHz，DMSO-d6)δ10.04(s，1H)，8.13(d，J＝6.8Hz，1H)，8.09-8.05(m，1H)，7.97(d，J＝8.0Hz，1H)，7.86-7.76(m，4H)，7.69-7.66(m，1H)，7.60(d，J＝8.4Hz，2H)，7.36(d，J＝8.4Hz，2H)，7.32(s，1H)，6.99(s，2H)，6.55(s，1H)，6.05-5.95(m，1H)，5.45(s，4H)，5.33-5.24(m，3H)，5.08(s，2H)，4.47-4.33(m，4H)，4.27-4.16(m，3H)，3.80-3.75(m，2H)，3.67-3.55(m，12H)，3.50-3.48(m，44H)，3.37-3.34(m，2H)，3.29-3.22(m，2H)，3.13-2.90(m，8H)，2.83(t，J＝7.6Hz，1H)，2.43(d，J＝7.60Hz，1H)，2.38(s，3H)，2.29(t，J＝6.4Hz，2H)，2.22-2.05(m，4H)，2.00-1.83(m，3H)，1.73-1.57(m，3H)，1.51-1.32(m，9H)，1.24-1.14(m，4H)，0.90-0.81(m，9H)ppm。揭示了TFA上的一个羧基质子。
实例19：含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物连接子(PB088)的制备
含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB088)制备如下：
步骤1
向化合物88-1(1-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸(88-1、500mg，0.697mmol))的DCM(4mL)溶液中添加TFA(1mL，13.463mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时。随后将溶液浓缩，并将粗物质混合物借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为无色油状物的化合物88-2(1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸(88-2，420mg，0.680mmol，97.59％))。ESI m/z：618.4(M+H)+。
步骤2
将化合物88-3(N-(2-氨基乙基)氨基甲酸三级丁酯(88-3，0.335mL，2.122mmol))及CDI(0.264mL，2.121mmol)的DMF(3mL)溶液在室温下搅拌1小时，以制备活性中间体，随后添加化合物88-2(1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸(88-2，236mg，0.382mmol))及DIPEA(197.48mg，1.528mmol)。将所得溶液再搅拌1小时，直至所有物质耗尽。将反应混合物借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到所需级分，将其冷冻干燥以得到为无色油状物的化合物88-4(1-{[(2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}乙基)氨基甲酰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸(88-4，230mg，0.286mmol，74.89％))。ESI m/z：＝804.5(M+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO)δ12.17(s，1H)，6.78(t，J＝4.8Hz，1H)，6.08-5.81(m，2H)，3.60(t，J＝6.4Hz，2H)，3.54-3.48(m，44H)，3.37(t，J＝5.6Hz，3H)，3.17-3.12(m，2H)，3.05-2.96(m，2H)，2.93-2.87(m，2H)，2.44(t，J＝6.4Hz，2H)，1.37(s，9H)ppm。
步骤3
向化合物88-4(1-{[(2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}乙基)氨基甲酰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸(88-4，430mg，0.535mmol))的DCM(5mL)溶液中添加TFA(1mL，13.463mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时。随后将溶液浓缩，并将粗物质借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为无色油状物的化合物88-5(1-{[(2-氨基乙基)氨基甲酰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸(88-5，320mg，0.455mmol，85.00％))的TFA盐。ESI m/z：＝704.5(M+H)+。
步骤4
向化合物88-5(1-{[(2-氨基乙基)氨基甲酰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸(88-5，163mg，0.232mmol))的MeOH(20mL)溶液中分批添加D-葡萄糖(166.90mg，0.926mmol)，将混合物加热至85℃，同时在N2氛围下搅拌30分钟。随后添加NaCNBH3(58.21mg，0.926mmol)。将反应混合物在加热下搅拌18小时至完成。随后将反应溶液浓缩至干燥，并借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到所需级分，将其冷冻干燥以得到为无色油状物的化合物88-6(1-{[(2-{双[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]氨基}乙基)氨基甲酰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸(88-6，200mg，0.194mmol，83.52％))。ESI m/z：1032.5(M+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO)δ6.40-6.38(m，2H)，4.67(brs，8H)，3.70-3.63(m，2H)，3.61-3.39(m，54H)，3.38-3.37(m，6H)，3.22-2.91(m，6H)，2.49-2.35(m，4H)，2.31(t，J＝6.4Hz，2H)ppm。未显示羧基的质子。
步骤5
将化合物88-6(1-{[(2-{双[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]氨基}乙基)氨基甲酰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸(88-6，138.45mg，0.134mmol))、HATU(50.95mg，0.134mmol)及DIPEA(34.61mg，0.268mmol)的DMF(3mL)混合物在室温下在N2下搅拌15分钟。随后缓慢添加化合物88-7(N-[(1S)-5-氨基-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(88-7，160mg，0.134mmol))，并将反应混合物搅拌2小时。反应完成后(借由LCMS检测)，将反应溶液借由制备型-HPLC(0.01％ TFA)纯化，得到为淡黄色固体的化合物88-8(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-(1-{[(2-{双[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]氨基}乙基)氨基甲酰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(88-8，220mg，0.100mmol，74.27％))。ESI m/z：1103.6(M/2+H)+。
步骤6
向化合物88-8(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-(1-{[(2-{双[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]氨基}乙基)氨基甲酰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(88-8，230mg，0.104mmol))的DMF(2mL)溶液中添加二乙胺(30.51mg，0.417mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时，随后将溶液真空浓缩以移除大部分的二乙胺，将粗物质借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为淡黄色固体的化合物88-9(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-(1-{[(2-{双[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]氨基}乙基)氨基甲酰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(88-9，150mg，0.076mmol，72.53％))的TFA盐。ESI m/z：992.6(M/2+H)+。
步骤7
在室温下，向化合物88-9(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-(1-{[(2-{双[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]氨基}乙基)氨基甲酰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(88-9，TFA盐、52mg，0.026mmol))的DMF(2mL)溶液中添加化合物88-10(6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(88-10，16.17mg，0.052mmol))及DIPEA(6.78mg，0.052mmol)。添加后，将溶液搅拌2小时，直至LCMS显示反应完成。随后将反应溶液借由制备型HPLC(0.01％ TFA)纯化，得到所需级分，将其冷冻干燥以得到为淡黄色固体的PB088(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-(1-{[(2-{双[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]氨基}乙基)氨基甲酰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)-2-[6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(PB088，40mg，0.018mmol，70.09％))。ESI m/z：1089.6(M/2+H)+，726.3(M/3+H)+，保留时间6.007分钟(HPLC)。1H NMR(400MHz，DMSO)δ10.02(s，1H),8.67(s，1H)，8.11(d，J＝7.2Hz，1H)，8.06(d，J＝8.4Hz，1H)，7.95(d，J＝8.0Hz，1H)，7.79(dd，J＝11.0，5.7Hz，2H)，7.66(d，J＝8.9Hz，1H)，7.60(d，J＝8.4Hz，2H)，7.36(d，J＝8.4Hz，2H)，7.31(s，1H)，7.00(s，2H)，6.53(s，1H)，6.-6.23(m，2H)，5.99(dd，J＝9.8，4.1Hz，1H)，5.43(d，J＝12.1Hz，4H)，5.35(s，2H)，5.29(s，3H)，5.07(s，2H)，4.75-4.37(m，8H)，4.25-4.17(m，2H)，4.00(d，J＝7.6Hz，2H)，3.69-3.66(m，2H)，3.59-3.54(m，5H)，3.52-3.45(m，54H)，3.23-3.11(m，5H)，3.09-2.85(m，5H)，2.38(s，3H)，2.35-1.79(m，11H)，1.72-1.55(m，3H)，1.51-1.42(m，6H)，1.42-1.10(m，9H)，0.89-0.80(m，9H)ppm。
实例20：含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物连接子(PB089)的制备
含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB089)制备如下：
步骤1
将化合物89-1(1-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(89-1，1.83g，2.405mmol))、化合物89-2((2S)-6-氨基-2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}己酸(89-2，0.59g，2.405mmol))及DIPEA(0.62g，4.811mmol)的DMF(10mL)溶液在室温下搅拌18小时，直至LCMS指示完全转化。随后将反应溶液借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到所需级分，将其冷冻干燥以得到为白色固体的化合物89-3((2S)-2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-6-[1-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酰氨基]己酸(89-3，1.54g，1.726mmol，71.77％))。ESI m/z：914.5(M+Na)+，396.8(M-100)/2+H)+。
步骤2
向化合物89-3((2S)-2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-6-[1-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酰氨基]己酸(89-3，1.14g，1.278mmol))的DCM(10mL)溶液中添加二乙胺(0.401mL，5.112mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时至完成。随后将混合物借由反相快速层析纯化，得到为无色油状物的化合物89-4((2S)-6-(1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酰氨基)-2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}己酸(89-4，800mg，1.194mmol，93.46％))。ESI m/z＝670.5(M+H)+，285.8((M-100)/2+H)+。
步骤3
向化合物89-4((2S)-6-(1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酰氨基)-2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}己酸(89-4，800mg，1.194mmol))的MeOH(50mL)溶液中分批添加D-葡萄糖(860.80mg，4.778mmol)，并且将混合物加热至85℃，同时在N2氛围下搅拌30分钟。随后添加NaCNBH3(300.12mg，4.776mmol)。添加后，将反应混合物在加热回流18小时。随后将反应溶液浓缩，并借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到所需级分，将其冷冻干燥以得到为无色油状物的化合物89-5((2S)-2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-6-[(30S,31R,32R,33R)-30,31,32,33,34-五羟基-28-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十四烷酰氨基]己酸(89-5，966mg，0.968mmol，81.06％))。ESI m/z：998.5(M+H)+，449.8(M/2+H)+。
步骤4
将化合物89-5((2S)-2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-6-[(30S,31R,32R,33R)-30,31,32,33,34-五羟基-28-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十四烷酰氨基]己酸(89-5，275mg，0.276mmol))、HATU(91.67mg，0.241mmol)及DIPEA(59.33mg，0.459mmol)的DMF(5mL)混合物在室温下搅拌15分钟。随后缓慢添加化合物89-6(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(89-6，193.07mg，0.230mmol))，并且将反应混合物搅拌2小时。将反应溶液借由制备型-HPLC(0.01％ TFA)纯化，得到为淡黄色固体的化合物89-7(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-6-[(30S,31R,32R,33R)-30,31,32,33,34-五羟基-28-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十四烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(89-7，347mg，0.191mmol，82.99％))。ESI m/z：911.0(M/2+H)+，607.9(M/3+H)+。
步骤5
将化合物89-7(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-6-[(30S,31R,32R,33R)-30,31,32,33,34-五羟基-28-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十四烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(89-7，347mg，0.191mmol))的1M HCl的乙酸乙酯(219mg，6.007mmol)溶液在室温下搅拌2小时，直至LCMS显示反应完成。随后用旋转蒸发仪蒸发溶剂，并且将残余物借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的化合物89-8(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[(30S,31R,32R,33R)-30,31,32,33,34-五羟基-28-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十四烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(89-8，93mg，0.054mmol，28.36％))。ESI＝574.5(M/3+H)+，861.2(M/2+H)+。
步骤6
向化合物89-8(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[(30S,31R,32R,33R)-30,31,32,33,34-五羟基-28-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十四烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(89-8，93mg，0.054mmol))的DMF(2mL)溶液中添加DIPEA(10.48mg，0.081mmol)及化合物89-9(6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(89-9，24.99mg，0.081mmol))。添加后，将溶液在室温下搅拌1小时，直至所有起始胺耗尽(借由LCMS监测)。随后将所得溶液调节至pH6，并且借由制备型HPLC(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的产物PB089(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰氨基]-6-[(30S,31R,32R,33R)-30,31,32,33,34-五羟基-28-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十四烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]戊烷酰氨基]苯基}甲酯(PB089，55mg，0.029mmol，53.17％))的TFA盐。ESI m/z：639.1(M/3+H)+，保留时间5.799分钟(HPLC)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.04(s,1H)，8.14-8.12(m，2H)，8.07(d，J＝8.4Hz，1H)，7.97(d，J＝7.6Hz，1H)，7.83(t，J＝5.6Hz,1H)，7.76(d，J＝11.2Hz，1H)，7.67(d，J＝8.8Hz，1H)，7.60(d，J＝8.4Hz，2H)，7.36(d，J＝8.4Hz，2H)，7.31(s，1H)，6.99(s，2H)，6.548(s，1H)，6.02(t，J＝5.6Hz，1H)，5.45(brs，6H)，5.33-5.21(m，3H)，5.08(s，2H)，4.82(brs，2H)，4.56(brs，4H)，4.40-4.17(m,5H)，3.99(brs，2H)，3.80-3.76(m，2H)，3.69-3.67(m，2H)，3.62-3.56(m，8H)，3.49-3.45(m，28H)，3.36-2.90(m，16H)，2.37(s，3H)，2.29(t，J＝6.4Hz，2H)，2.24-2.08(m，4H)，2.00-1.81(m，3H)，1.69-1.57(m，3H)，1.52-1.42(m，6H)，1.36-1.29(m，3H)，1.22-1.14(m，4H)，0.89-0.81(m，9H)ppm。
实例21：含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物连接子(PB090)的制备
含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB090)制备如下：
步骤1
向化合物90-1(1-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸(90-1，3.737mL，11.494mmol))的DCM(15mL)溶液中添加HOSu(1.98g，17.240mmol)及EDCI(3.30g，17.240mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时。随后将所得溶液用盐水(20mL)洗涤并用DCM(20mL)萃取。将收集的有机层用Na2SO4干燥、过滤并蒸发至干燥，得到产物90-2(2,2-二甲基-4-侧氧基-3,8,11,14,17-五氧杂-5-氮杂二十烷-20-酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(90-2，5.32g，11.503mmol，100％))。ESI m/z：485.3(M+H)+。
步骤2
向化合物90-2(2,2-二甲基-4-侧氧基-3,8,11,14,17-五氧杂-5-氮杂二十烷-20-酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(90-2，5.32g，11.503mmol))的DMF(20mL)溶液中添加化合物90-3((2S)-6-氨基-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(90-3，6.36g，17.254mmol))及DIPEA(2.97g，23.005mmol)。将混合物在室温下搅拌3小时。将所得溶液借由反相分离(0.01％ TFA)纯化，得到为无色油状物的产物90-4((2S)-6-(1-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(90-4，6.18g，8.637mmol，75.12％))。ESI m/z：716.5(M+H)+。
步骤3
向化合物90-4((2S)-6-(1-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(90-4，6.18g，8.633mmol))的DCM(20mL)溶液中添加TFA(4mL，53.850mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时。蒸发所得溶液，并且借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为无色油状物的产物90-5((2S)-6-(1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(90-5，4.2g，6.821mmol，79.01％))。ESI m/z：616.4(M+H)+。
步骤4
向化合物90-5((2S)-6-(1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(90-5，4.2g，6.821mmol))的MeOH(25mL)溶液中添加D-葡萄糖(7.37g，40.926mmol)及NaBH3CN(2.57g，40.926mmol)。将混合物在60℃下搅拌24小时。浓缩所得溶液，并且借由反相快速层析(0.01％TFA)纯化，得到为无色油状物的产物90-6((2S)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-6-[(18S,19R,20R,21R)-18,19,20,21,22-五羟基-16-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂二十二烷酰氨基]己酸(90-6，5.16g，5.466mmol，80.12％))。ESI m/z：945.6(M+H)+。
步骤5
向化合物90-6((2S)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-6-[(18S,19R,20R,21R)-18,19,20,21,22-五羟基-16-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂二十二烷酰氨基]己酸(90-6，168mg，0.178mmol))的DMF(5mL)溶液中添加化合物90-7(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18，20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(90-7，150mg，0.178mmol))、DIPEA(27.58mg，0.214mmol)及HATU(71.05mg，0.187mmol)。将混合物在室温下搅拌1.5小时。将所得溶液调节至pH 6，并且借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到产物90-8(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-[(18S,19R,20R,21R)-18,19,20,21,22-五羟基-16-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂二十二烷酰氨基]戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(90-8，217mg，0.123mmol，69.01％))。ESI m/z：884.1(M/2+H)+。
步骤6
向化合物90-8(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-[(18S,19R，20R,21R)-18,19,20,21,22-五羟基-16-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂二十二烷酰氨基]戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(90-8，217mg，0.123mmol))的DMF(2mL)溶液中添加二乙胺(0.4mL，2.501mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时。将所得溶液调节至pH 6，并且借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的产物90-9(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18，20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[(18S,19R,20R,21R)-18,19,20,21,22-五羟基-16-[(2S，3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂二十二烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(90-9，138mg，0.089mmol，72.74％))。ESI m/z：773.5(M/2+H)+。
步骤7
向化合物90-9(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[(18S,19R,20R,21R)-18,19,20,21,22-五羟基-16-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂二十二烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(90-9，138mg，0.089mmol))的DMF(2mL)溶液中添加DIPEA(17.32mg，0.134mmol)及化合物90-10(6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(90-10，41.31mg，0.134mmol))。将混合物在室温下搅拌2小时。将所得溶液调节至pH 6，并且借由制备型HPLC(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的产物PB090(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18，20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰氨基]-6-[(18S,19R,20R,21R)-18,19,20,21,22-五羟基-16-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂二十二烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]戊烷酰氨基]苯基}甲酯(PB090，32mg，0.018mmol，20.61％))的TFA盐。ESI m/z：580.5(M/3+H)+，保留时间6.558分钟(HPLC)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.03(s,1H)，8.14-8.12(d，J＝6.8Hz，2H)，8.08-8.05(d，J＝8.8Hz，1H)，7.98-7.96(d，J＝8.0Hz,1H)，7.83-7.81(t，J＝5.6Hz，1H)，7.78-7.76(d，J＝10.8Hz,1H)，7.67-7.64(d，J＝8.0Hz，1H)，7.61-7.59(d，J＝8.0Hz，2H)，7.37-7.35(d，J＝8.4Hz，2H)，7.31(s，1H)，7.00(s，2H)，6.54(s，1H)，6.01(t，J＝5.6Hz，1H)，5.45(brs，6H)，5.29-5.27(m，3H)，5.08(s，2H)，4.86-4.74(m，2H)，4.65-4.40(m，5H)，4.40-4.35(m，1H)，4.27-4.17(m，2H)，4.04-3.94(m，2H)，3.79-3.76(m，2H)，3.69-3.67(m，2H)，3.67-3.54(m，8H)，3.53-3.42(m，18H)，3.29-3.27(m，4H)，3.20-2.90(m，6H)，2.37(s，3H)，2.29(t，J＝6.4Hz，2H)，2.22-2.08(m，4H)，2.02-1.81(m，3H)，1.71-1.56(m，3H)，1.52-1.42(m，6H)，1.40-1.14(m，8H)，0.89-0.81(m，9H)ppm。揭示了TFA上的一个羧基质子。
实例22：含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物连接子(PB091)的制备
含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB091)制备如下：
步骤1
将化合物91-1(1-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸(91-1，560mg，0.781mmol))的DCM(10mL)溶液用TFA(2mL，26.925mmol)处理并在室温下搅拌1小时，直至LCMS显示反应完成。随后将溶液浓缩，并将残余物悬浮于DCM并再次浓缩，得到为白色固体的粗产物91-2(1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸、TFA盐(91-2，600mg，0.821mmol，105.09％))。产物原样用于下一步骤。ESI m/z＝618.5(M+H)+。
步骤2
将化合物91-2(1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸、TFA盐(91-2，570.91mg，0.781mmol))、化合物91-3((3R,4S)-3,4,5-三羟基戊醛(91-3，0.395mL，3.124mmol))及NaCNBH3(0.121mL，3.124mmol)的甲醇(16mL)反应溶液在N2下回流搅拌18小时，直至LCMS指示反应完成。蒸发溶剂，将残余物溶解于水，随后借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色泡沫的所需产物91-4((43R,44S)-43,44,45-三羟基-40-[(3R,4S)-3,4,5-三羟基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十五烷酸(91-4，700mg，0.821mmol，105.08％))，与过量核糖混合。ESI m/z：427.8(M/2+H)+，854.6(M+H)+。
步骤3
将化合物91-4((43R,44S)-43,44,45-三羟基-40-[(3R,4S)-3,4,5-三羟基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十五酸(91-4，214.68mg，0.252mmol))、化合物91-5(N-[(1S)-5-氨基-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(91-5，150mg，0.126mmol))及DIPEA(32.47mg，0.252mmol)的无水DMF(2.0mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后缓慢添加HATU(47.85mg，0.126mmol)的无水DMF(0.5mL)溶液。添加后，将所得溶液在室温下再搅拌2小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的化合物91-6(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-[(43R,44S)-43,44,45-三羟基-40-[(3R,4S)-3,4,5-三羟基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31，34,37-十二氧杂-40-氮杂四十五烷酰氨基]戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(91-6，160mg，0.079mmol，62.72％))。ESI m/z：507.8(M/4+H)+，676.7(M/3+H)+。
步骤4
将化合物91-6(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-[(43R,44S)-43,44,45-三羟基-40-[(3R,4S)-3,4,5-三羟基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25，28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十五烷酰氨基]戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(91-6，80mg，0.039mmol))的DMF(1.5mL)溶液在室温下搅拌，并且添加二乙胺(0.08mL，0.777mmol)。将所得溶液在再搅拌1小时，直至LCMS显示反应完成。真空移除二乙胺，并且将DMF中的残余物借由制备型HPLC(10mM碳酸氢铵)纯化，得到为白色固体的所需产物91-7(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[(43R,44S)-43,44,45-三羟基-40-[(3R,4S)-3,4,5-三羟基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十五烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(91-7，30mg，0.017mmol，42.12％))。ESI m/z：903.7(M/2+H)+，602.7(M/3+H)+。1H NMR：(400MHz，DMSO-d6)δ10.11(s，1H)，8.35-8.31(m，5H)，8.09-8.06(m，2H)，7.83-7.77(m，2H)，7.61(d，J＝8.8Hz，2H)，7.36(d，J＝8.4Hz，2H)，7.32(s，1H)，6.09(s，1H)，5.46(s，4H)，5.30-5.29(m，3H)，5.08(s，2H)，4.41-4.34(m，1H)，4.27-4.23(m，1H)，3.59-3.56(m，4H)，3.50-3.47(m，44H)，3.47-3.46(m，2H)，3.36-3.30(m，4H)，3.30-3.22(m，4H)，3.14-3.08(m，2H)，3.03-2.95(m，4H)，2.68-2.56(m，6H)，2.38(s，3H)，2.29(t，J＝6.4Hz，2H)，2.22-2.13(m，4H)，2.00-1.84(m，4H)，1.76-1.65(m，4H)，1.65-1.56(m，3H)，1.46-1.28(m，10H)，0.90-0.81(m，9H)ppm。TFA上的两个羧基质子出现在8.35-8.31ppm之间。
步骤5
向化合物91-7(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[(43R,44S)-43,44,45-三羟基-40-[(3R,4S)-3,4,5-三羟基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十五烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(91-7，30mg，0.017mmol))的DMF(2mL)溶液中添加DIPEA(3.30mg，0.026mmol)及化合物91-8(6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(91-8，7.86mg，0.026mmol))。将混合物在室温下搅拌2小时。将所得溶液借由制备型HPLC(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的产物PB091(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰氨基]-6-[(43R,44S)-43,44,45-三羟基-40-[(3R,4S)-3,4,5-三羟基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十五烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]戊烷酰氨基]苯基}甲酯(PB091，7.5mg，0.004mmol，22.58％))。ESI m/z：667.0(M/3+H)+，500.8(M/4+H)+，保留时间5.791分钟(HPLC)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.03(s，1H)，9.10(brs，1H)，8.13-8.10(d，J＝7.2Hz，1H)，8.07-8.05(d，J＝8.8Hz，1H)，7.98-7.96(d，J＝8.0Hz，1H)，7.83-7.80(t，J＝5.2Hz，1H)，7.77-7.74(d，J＝10.8Hz，1H)，7.68-7.65(d，J＝8.4Hz，1H)，7.61-7.59(d，J＝8.0Hz，2H)，7.38-7.35(d，J＝8.4Hz，2H)，7.31(s，1H)，6.99(s，2H)，6.54(s，1H)，6.02-6.01(m，1H)，5.45(brs，4H)，5.29-5.26(m，3H)，5.08(s，2H)，4.91(brs，2H)，4.76(brs，2H)，4.52(brs，2H)，4.38-4.36(m，1H)，4.25-4.17(m，2H)，3.75-3.74(m，2H)，3.58-3.52(m，6H)，3.51-3.46(m，44H)，3.37-2.91(m，16H)，2.20(s，3H)，2.29(t，J＝6.4Hz，2H)，2.21-2.08(m，4H)，2.01-1.83(m，6H)，1.75-1.59(m，6H)，1.48-1.36(m，6H)，1.29-1.24(m，3H)，1.23-1.16(m，4H)，0.89-0.81(m，9H)ppm。揭示了TFA上的一个羧基质子。
实例23：含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物连接子(PB092)的制备
含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB092)制备如下：
步骤1
将化合物92-1(1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸、TFA盐(92-1，570.91mg，0.781mmol))、化合物92-2((2S,3S,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己醛(92-2，562.32mg，3.124mmol))、Na(CN)BH3(193.69mg，3.124mmol)的甲醇(16mL)反应混合物在N2下加热回流18小时，直至LCMS指示反应完成。用旋转蒸发仪蒸发溶剂，并且将残余物溶解于水并借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色泡沫的所需产物92-3((42R,43R,44R，45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2R,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酸(92-3，650mg，0.687mmol，87.98％))。ESI m/z：473.9(M/2+H)+。946.6(M+H)+。
步骤2
将化合物92-3((42R,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2R,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酸(92-3，199.95mg，0.212mmol))、化合物92-4(N-[(1S)-5-氨基-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18，20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(92-4，210mg，0.176mmol))及DIPEA(8.02mg，0.062mmol)的无水DMF(4mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后逐滴添加HATU(67.04mg，0.176mmol)的无水DMF(4mL)溶液，历时5分钟。将所得溶液在室温下再搅拌2小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的化合物92-5(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-[(42R,43R,44R，45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2R,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(92-5，240mg，0.113mmol，64.22％))。ESI m/z＝707.2(M/2+H)+，530.9(M/3+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.06(s，1H)，8.16(d，J＝6.4Hz，1H)，8.07(d，J＝8.8Hz，1H)，7.95(brs，1H)，7.88(d，J＝7.6Hz，2H)，7.83-7.77(m，2H)，7.73-7.70(m，3H)，7.60(d，J＝8.0Hz，2H)，7.55(d，J＝3.6Hz，1H)，7.43-7.31(m，7H)，6.54(s，1H)，5.99(t，J＝5.6Hz，1H)，5.50-5.34(m，5H)，5.34-5.24(m，3H)，5.08(s，2H)，4.67-4.23(m，10H)，4.07-3.96(m，1H)，3.96-3.83(m，2H)，3.83-3.76(m，2H)，3.65-3.44(m，62H)，3.24-3.11(m，4H)，3.11-2.89(m，6H)，2.38(s，3H)，2.29(d，J＝6.4Hz，2H)，2.22-2.10(m，2H)，2.00-1.81(m，3H)，1.70-1.48(m，4H)，1.48-1.24(m，7H)，0.90-0.81(m，9H)ppm。揭示了TFA上的一个羧基质子。
步骤3
将化合物92-5(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-[(42R,43R，44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2R,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(92-5，230mg，0.109mmol))的DMF(1mL)溶液在室温下搅拌，并且添加二乙胺(0.11mL，1.068mmol)。将所得溶液搅拌30分钟以完成(借由LCMS监测)。随后蒸发掉二乙胺，并且将DMF中的残余物借由反相快速层析(0.01％TFA)纯化，得到为白色固体的所需产物92-6(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[(42R,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2R,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(92-6，130mg，0.069mmol，63.13％))。ESI m/z：949.6(M/2+H)+，633.2(M/3+H)+。
步骤4
将化合物92-6(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[(42R,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2R,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(92-6，50mg，0.026mmol))及化合物92-7(6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(92-7，9.74mg，0.032mmol))的无水DMF(1mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加DIPEA(5.10mg，0.040mmol)。将所得溶液再搅拌3小时，直至LCMS指示起始胺几乎耗尽。随后将所得溶液直接借由制备型HPLC(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的PB092(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰氨基]-6-[(42R,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2R,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]戊烷酰氨基]苯基}甲酯(PB092，20mg，0.010mmol，36.31％))的TFA盐。ESI m/z：697.5(M/3+H)+，保留时间5.759分钟(HPLC)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.03(s，1H)，8.12(d，J＝7.2Hz，1H)，8.06(d，J＝8.8Hz，1H)，7.96(d，J＝8.0Hz，2H)，7.82-7.77(m，2H)，7.66(d，J＝8.8Hz，1H)，7.60(d，J＝8.4Hz，2H)，7.36(d，J＝8.4Hz，2H)，7.32(s，1H)，7.00(s，2H)，6.54(s，1H)，5.99(t，J＝6.0Hz，1H)，5.49-5.34(m，5H)，5.34-5.24(m，3H)，5.08(s，2H)，4.72-4.31(m，7H)，4.31-4.17(m，2H)，3.95-3.87(m，2H)，3.81-3.76(m，2H)，3.65-3.46(m，6H)，3.26-3.16(m，4H)，3.11-2.92(m，6H)，2.38(s，3H)，2.29(d，J＝6.4Hz，2H)，2.24-2.07(m，4H)，2.00-1.83(m，3H)，1.72-1.56(m，3H)，1.48-1.41(m，6H)，1.36-1.13(m，8H)，0.90-0.81(m，9H)ppm。揭示了TFA上的一个羧基质子。
实例24：含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物连接子(PB093)的制备
含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB093)制备如下：
步骤1
将化合物93-1(1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸(93-1，TFA盐、500mg，0.684mmol))的MeOH(8mL)溶液用化合物93-2((2R,3S,4R)-2,3,4,5-四羟基戊醛(93-2，410.75mg，2.736mmol))处理并在室温下搅拌2小时。随后添加氰基硼氢化钠(171.93mg，2.736mmol)，并且将混合物温热至50℃，持续24小时。将溶液浓缩至半体积并借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的产物93-3((42S,43R,44R)-42,43,44,45-四羟基-40-[(2S,3R,4R)-2,3,4,5-四羟基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十五烷酸(93-3，417mg，0.471mmol，68.81％))。ESI m/z：886.6(M+H)+。
步骤2
向化合物93-3((42S,43R,44R)-42,43,44,45-四羟基-40-[(2S,3R,4R)-2,3,4,5-四羟基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十五烷酸(93-3，200mg，0.226mmol))的DMF(2mL)溶液中添加化合物93-4(N-[(1S)-5-氨基-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(93-4，228.59mg，0.192mmol))及DIPEA(43.76mg，0.339mmol)，随后缓慢添加HATU(85.83mg，0.226mmol)的DMF(0.5mL)。添加后，将反应物在室温下再搅拌1小时。将混合物浓缩并借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的化合物93-5(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-[(42S,43R,44R)-42,43,44,45-四羟基-40-[(2S,3R,4R)-2,3,4,5-四羟基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31，34,37-十二氧杂-40-氮杂四十五烷酰氨基]戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(93-5，290mg，0.141mmol，62.38％))。ESI m/z 1030.7(M/2+H)+。
步骤3
向化合物93-5(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-[(42S,43R,44R)-42,43,44,45-四羟基-40-[(2S,3R,4R)-2,3,4,5-四羟基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十五烷酰氨基]戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(93-5，290mg，0.141mmol))的DMF(2mL)溶液中添加二乙胺(0.2mL，1.250mmol)并在室温下搅拌1小时至完成(借由LCMS监测)。随后用旋转蒸发仪移除二乙胺，并且将残余物借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的产物93-6(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[(42S,43R,44R)-42,43,44,45-四羟基-40-[(2S,3R,4R)-2,3,4,5-四羟基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十五烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(93-6，100mg，0.054mmol，38.65％))。ESI m/z：919.7(M/2+H)+。
步骤4
将化合物93-6(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[(42S,43R,44R)-42,43,44,45-四羟基-40-[(2S,3R,4R)-2,3,4,5-四羟基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十五烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(93-6，110mg，0.060mmol))的DMF(1.5mL)溶液在室温下搅拌，随后依次添加DIPEA(0.015mL，0.090mmol)及化合物93-7(6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(93-7，20.14mg，0.065mmol))。将所得溶液在再搅拌1小时，直至LCMS显示反应完成。将完成的反应溶液直接借由制备型HPLC(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的产物PB093({N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰氨基]-6-[(42S,43R,44R)-42,43,44,45-四羟基-40-[(2S,3R,4R)-2,3,4,5-四羟基戊基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十五烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]戊烷酰氨基]苯基}甲酯(PB093，51.21mg，0.025mmol，42.12％))的TFA盐。ESI m/z：677.5(M/3+H)+，保留时间5.924分钟(HPLC)。1H NMR(400MHz，DMSO)δ10.02(s，1H)，8.19(brs，1H)，8.12(d，J＝7.2Hz，1H)，8.06(d，J＝8.8Hz，1H)，7.96(d，J＝8.0Hz，1H)，7.82-7.76(m，2H)，7.66(d，J＝8.8Hz，1H)，7.61(d，J＝8.4Hz，2H)，7.36(d，J＝8.4Hz，2H)，7.32(s，1H)，7.00(s，2H)，6.53(s，1H)，6.00(t，J＝5.6Hz，1H)，5.46-5.33(m，6H)，5.33-5.23(m，3H)，5.09(s，2H)，4.89-4.59(m，6H)，4.41-4.35(m，1H)，4.29-4.18(m，2H)，4.03-3.94(m，2H)，3.79-3.77(m，2H)，3.59-3.56(m，8H)，3.54-3.37(m，52H)，3.28-3.22(m，2H)，3.15-2.89(m，6H)，2.38(s，3H)，2.29(t，J＝6.4Hz，2H)，2.24-2.08(m，4H)，2.01-1.82(m，3H)，1.73-1.56(m，3H)，1.53-1.43(m，6H)，1.43-1.36(m，3H)，1.33-1.16(m，4H)，0.94-0.74(m，9H)。揭示了TFA中的一个羧基质子。
实例25：含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物连接子(PB094)的制备
含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB094)制备如下：
步骤1
向化合物94-2((2S)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)戊二酸(94-2，19.39mg，0.052mmol))的DMF(5mL)溶液中添加HATU(59.89mg，0.158mmol)及DIPEA(13.57mg，0.105mmol)，随后添加化合物94-1(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(94-1，200mg，0.105mmol))。将所得混合物在室温下搅拌1小时以完成(借由LCMS监测)随后将所得溶液借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的产物94-3(N-[(1S)-1,3-双({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊基]氨基甲酰基})丙基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(94-3，108mg，0.026mmol，49.84％))。ESI m/z：826.4(M/5+H)+。
步骤2
向化合物94-3(N-[(1S)-1,3-双({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊基]氨基甲酰基})丙基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(94-3，108mg，0.026mmol))的DMF(3mL)溶液中添加二乙胺(0.6mL，3.751mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时。用TFA将所得溶液调节至pH 6，随后借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的产物94-4(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-4-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-[(42S，43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22，25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊基]氨基甲酰基}丁酰氨基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(94-4，90mg，0.023mmol，88.08％))的TFA盐。ESI m/z：977.3(M/4+H)+。
步骤3
向化合物94-4(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-4-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊基]氨基甲酰基}丁酰氨基]-6-[(42S,43R,44R，45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(94-4，90mg，0.023mmol))的DMF(3mL)溶液中添加DIPEA(5.96mg，0.046mmol)及6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(14.21mg，0.046mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时。将所得溶液调节至pH 6并且借由制备型-HPLC(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的产物PB094(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-4-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊基]氨基甲酰基}-2-[6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰氨基]丁酰氨基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16，19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]戊烷酰氨基]苯基}甲酯(PB094，35mg，0.009mmol，37.06％))。ESI m/z：820.7(M+H)+，1025.5(M+H)+，保留时间5.452分钟(HPLC)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.04(s，2H)，8.19-8.15(m，4H)，8.14-8.12(m，4H)，8.07-8.05(m，1H)，7.97(d，J＝8.0Hz，1H)，7.89-7.82(m，3H)，7.76(d，J＝10.8Hz，2H)，7.62-7.60(m，4H)，7.37-7.35(m，4H)，7.31(s，2H)，7.00(s，2H)，6.53(s，2H)，6.00(t，J＝6.6Hz，2H)，5.51-5.44(m，12H)，5.34-5.21(m，6H)，5.08(s，4H)，4.88-4.70(m，4H)，4.55-4.43(m，8H)，4.38-4.33(m，3H)，4.29-4.25(m，2H)，4.20-4.14(m，3H)，4.01-3.99(m，4H)，3.79-3.78(m，4H)，3.69-3.66(m，4H)，3.62-3.56(m，18H)，3.53-3.48(m，88H)，3.46-3.42(m，10H)，3.27-3.12(m，7H)，3.12-2.90(m，12H)，2.37(s，6H)，2.31-2.27(m，4H)，2.21-2.01(m，8H)，1.95-1.79(m，8H)，1.73-1.55(m，8H)，1.49-1.40(m，8H)，1.40-1.31(m，6H)，1.31-1.14(m，6H)，0.89-0.82(m，18H)ppm。揭示了TFA上的两个羧基质子。
实例26：含有PEG单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物连接子(PB095)的制备
含有PEG单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物-连接子(PB095)制备如下：
步骤1
将化合物95-1((2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)戊酸(95-1，6.0g，15.097mmol))、化合物95-2((4-氨基苯基)甲醇(95-2，3.72g，30.195mmol))及EEDQ(14.93g，60.390mmol)的MeOH(25mL)及DCM(50mL)溶液在室温下搅拌18小时，并且LCMS显示反应完成。将反应溶液浓缩至干燥，随后借由反相快速层析(0.01％TFA)纯化，得到所需级分，将其冷冻干燥以得到为白色固体的化合物95-3(N-[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(95-3，6.45g，12.834mmol，85.01％))。ESI m/z：503.3(M+H)+。
步骤2
向化合物95-3(N-[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(95-3，6.45g，12.834mmol))的MeOH(20mL)溶液中添加二乙胺(5mL，31.260mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时以实现完全去保护。将溶液浓缩并且借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为淡黄色固体的产物95-4((2S)-2-氨基-5-(氨基甲酰基氨基)-N-[4-(羟基甲基)苯基]戊烷酰胺(95-4，3.25g，11.594mmol，90.34％))。ESI m/z：281.3(M+H)+。
步骤3
将化合物95-4((2S)-2-氨基-5-(氨基甲酰基氨基)-N-[4-(羟基甲基)苯基]戊烷酰胺(95-4，3.76g，13.413mmol))、化合物95-5((2S)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-4-甲基戊酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(95-5，6.65g，14.755mmol))及DIPEA(3.47g，26.826mmol)的DMF(10mL)溶液在室温下搅拌2小时至完成。将反应混合物借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到所需级分，将其冷冻干燥以得到为白色固体的化合物95-6(N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-3-甲基丁基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(95-6，4.8g，7.796mmol，58.12％))。ESIm/z：616.3(M+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO)δ9.97(s，1H)，8.05(d，J＝8.0Hz，1H)，7.89(d，J＝7.2Hz，2H)，7.74-7.70(m，2H)，7.55-7.51(m，3H)，7.44-7.39(m，2H)，7.34-7.30(m，2H)，7.23(d，J＝8.4Hz，2H)，5.97(t，J＝5.6Hz，1H)，5.41(s，2H)，5.10(t，J＝5.6Hz，1H)，4.43-4.39(m，3H)，4.32-4.20(m，3H)，4.15-4.05(m，1H)，3.07-2.89(m，2H)，1.74-1.55(m，3H)，1.51-1.32(m，4H)，0.90-0.83(m，6H)ppm。
步骤4
将化合物95-6(N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-(羟基甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-3-甲基丁基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(95-6，2.0g，3.248mmol))、碳酸双(4-硝基苯基)酯(3.95g，12.993mmol)及DMAP(0.40g，3.248mmol)的DMF(5mL)溶液在室温下搅拌2小时。随后将反应混合物用水滴淬灭，并借由反相快速层析(中性洗脱剂)纯化，得到所需级分，将其冷冻干燥以得到为淡黄色固体的化合物95-7(4-硝基苯基碳酸{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-4-甲基戊烷酰氨基]戊烷酰氨基]苯基}甲酯(95-7，1.33g，1.703mmol，52.44％))。ESIm/z：781.3(M+H)+。
步骤5
将化合物95-7(碳酸{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-4-甲基戊烷酰氨基]戊烷酰氨基]苯基}甲基4-硝基苯基酯(95-7，340mg，0.435mmol)、化合物9-58((2S)-N-[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺(95-8，312.63mg，0.435mmol))及HOBt(58.84mg，0.435mmol)的无水DMF(4mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加DIPEA(112.34mg，0.871mmol)。将所得黄色溶液搅拌隔夜，直至LCMS指示两种起始材料几乎耗尽。将所得溶液直接借由反相快速层析(0.01％TFA)纯化，得到为白色固体的化合物95-9(N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-3-甲基丁基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(95-9，320mg，0.235mmol，54.10％))。ESI m/z：680.6(M/2+H)+；718.7(MMAE的片段)；598.4(连接子Fmoc-Leu-Cit-PAB的片段)。
步骤6
将化合物95-9(N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-3-甲基丁基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(95-9，320mg，0.235mmol))的CH3CN(10mL)及水(5mL)溶液在室温下搅拌，并且添加二乙胺(0.8mL，7.766mmol)。将所得溶液搅拌4小时至完成。真空蒸发掉二乙胺，并且将残余物借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的产物95-10(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-4-甲基戊烷酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(95-10，220mg，0.193mmol，82.18％))的TFA盐，并且产物无需任何纯化用于下一步骤。ESI m/z：569.5(M/2+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.21(s，1H)，8.79(d，J＝7.6Hz，1H)，8.31-8.06(m，4H)，7.91(d，J＝8.8Hz，0.5H)，7.65(d，J＝8.4Hz，0.5H)，7.60-7.57(m，2H)，7.37-7.24(m，6H)，7.20-7.14(m，1H)，6.08(s，1H)，5.60-5.31(m，2H)，5.12-4.98(m，2H)，4.74-4.62(m，1H)，4.55-4.40(m，3H)，4.30-4.23(m，1H)，4.05-3.92(m，2H)，3.85-3.76(m，2H)，3.58-3.55(m，2H)，3.32-3.12(m，9H)，3.08-2.97(m，4H)，2.89-2.83(m，3H)，2.44-2.39(m，1H)，2.29-2.23(m，1H)，2.16-1.92(m，3H)，1.84-1.39(m，13H)，1.31-1.25(m，1H)，1.06-0.97(m，6H)，0.92-0.75(m，24H)ppm。揭示了TFA中的一个羧基质子。
步骤7
将化合物95-10(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-4-甲基戊烷酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(95-10，218mg，0.192mmol))、化合物95-11((2S)-2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34，37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己酸(95-11，247.57mg，0.211mmol))及DIPEA(49.45mg，0.383mmol)的无水DMF(3mL)溶液在室温下搅拌5分钟以确保起始酸完全溶解，随后缓慢添加HATU(80.16mg，0.211mmol)的无水DMF(1mL)溶液。将所得溶液再搅拌2小时，直至LCMS指示反应完成。随后将反应溶液直接借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的化合物95-12(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-4-甲基戊烷酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(95-12，280mg，0.122mmol，63.69％))。ESI m/z：765.5(M/3+H)+。
步骤8
将化合物95-12(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-4-甲基戊烷酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(95-12，260mg，0.113mmol))的甲醇溶液在室温下搅拌，并且缓慢添加3M HCl的MeOH(2mL)。将所得淡黄色溶液再保持搅拌4小时，直至实现完全去保护(借由LCMS监测)。随后将溶液用旋转蒸发仪浓缩以移除溶剂，将残余物用水溶解并借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的化合物95-13(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-4-甲基戊烷酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(95-13，160mg，0.073mmol，64.35％))。ESI m/z：732.2(M/3+H)+，718.6(片段MMAE)，478.2((连接子Boc-Lys(PEG12-糖)-Leu-Cit-pab-18)/3+H)+。
步骤9
将化合物95-13(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-4-甲基戊烷酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(95-13，80mg，0.036mmol))及DIPEA(7.06mg，0.055mmol)的无水DMF(1.5mL)溶液在室温下搅拌5分钟以溶解所有材料，随后借由注射器逐滴添加化合物95-14(6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(95-14，12.36mg，0.040mmol))的无水DMF(0.5mL)溶液，历时5分钟。添加后，将所得溶液再搅拌4小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽。随后将所得溶液直接借由制备型HPLC(0.01％TFA)纯化，得到所需级分，将其由LabConc冻干以得到为白色固体的PB095(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰氨基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-4-甲基戊烷酰氨基]戊烷酰氨基]苯基}甲酯(PB095，50mg，0.021mmol，57.44％))的TFA盐。ESI m/z：542.5((连接子片段，(M-717-26-18)3+H)+；796.6(M/3+H)+。保留时间6.250分钟(HPLC)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.00(s，1H)，8.34-8.07(m，1.5H)，8.00(d，J＝7.6Hz，1H)，7.93-7.88(m，2.5H)，7.82-7.79(m，1H)，7.65-7.57(m，2.5H)，7.35-7.23(m，6H)，7.18-7.10(m，1.5H)，7.00(s，2H)，5.99-5.98(m，1H)，5.53-5.25(m，4H)，5.14-4.95(m，2H)，4.83-4.17(m，11H)，4.04-3.92(m，4H)，3.79-3.77(m，2H)，3.70-3.66(m，2H)，3.61-3.56(m，8H)，3.53-3.45(m，44H)，3.25-3.12(m，14H)，3.05-2.83(m，14H)，2.44-2.39(m，1H)，2.31-2.14(m，4H)，2.14-1.96(m，6H)，1.85-1.44(m，18H)，1.36-1.16(m，10H)，1.06-0.97(m，6H)，0.89-0.75(m，27H)ppm。揭示了TFA中的一个羧基质子。
实例27：含有PEG单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物连接子(PB096)的制备
含有PEG单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物-连接子(PB096)制备如下：
步骤1
将化合物96-1(1-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸(96-1，5.00g，10.267mmol))及HOSu(1.77g，15.401mmol)的干DCM(40mL)的澄清溶液在室温下搅拌，并且添加EDCI(2.95g，15.401mmol)。将溶液保持搅拌1小时，直至实现完全转化。随后将溶液用更多的DCM(20mL)稀释并且用水(50mL)洗涤，分离有机层并用DCM(50mL*2)萃取水层。将合并的收集的DCM相经硫酸钠干燥并过滤，随后减压浓缩以得到为无色油状物的粗物质化合物96-2，将其原样用于下一步骤。ESI m/z＝585.3(M+H)+。
步骤2
将化合物96-3(N6-(三级丁氧基羰基)-L-赖氨酸(96-3，2.233mL，10.267mmol))的DMF(12mL)悬浮液在室温下搅拌(注：材料赖氨酸在DMF中溶解不良)，随后添加碳酸氢钠(0.86g，10.267mmol)的水(3mL)溶液。将悬浮液搅拌20分钟直至大部分起始酸溶解在溶剂中。随后添加化合物96-2(2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基1-(9H-茀-9-基)-3-侧氧基-2,7,10,13,16-五氧杂-4-氮杂十九烷-19-酸酯(96-2，6.00g，10.267mmol))。将所得溶液在室温下搅拌2小时。将完成的反应溶液直接借由反相管柱层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的化合物96-4(N2-(1-(9H-茀-9-基)-3-侧氧基-2,7,10,13,16-五氧杂-4-氮杂十九烷-19-酰基)-N6-(三级丁氧基羰基)-L-赖氨酸(96-4，5.40g，7.552mmol，73.56％))。ESI m/z：716.5(M+H)+，738.4(M+Na)+。1H NMR(400MHz，400MHz)δ7.89(d，J＝7.6Hz，2H)，7.86-7.77(m，1H)，7.69(d，J＝7.2Hz，2H)，7.44-7.38(m，2H)，7.37-7.31(m，2H),6.75(t，J＝5.6Hz，1H)，4.30-4.19(m，2H)，4.04-3.99(m，1H)，3.59-3.54(m，2H)，3.50-3.47(m，12H)，3.43-3.39(m，2H)，3.16-3.11(m，2H)，2.88-2.83(m，2H)，2.40-2.32(m，2H)，1.67-1.63(m，1H)，1.55-1.48(m，1H)，1.36(s，9H)，1.33-1.29(m，2H)，1.25-1.20(m，2H)，0.99(d，J＝6.4Hz，2H)ppm。未揭示羧基。
步骤3
将化合物96-4((2S)-6-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-2-[1-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基]己酸(96-4，5.4g，7.544mmol))的DCM(16mL)溶液在室温下搅拌，随后添加TFA(4mL，53.850mmol)。将所得黄色溶液再搅拌1小时。随后蒸发TFA及溶剂，将残余物再次溶解于DCM并浓缩至干燥。重复该过程三次，并且获得为白色固体的产物96-5((1-(9H-茀-9-基)-3-侧氧基-2,7,10,13,16-五氧杂-4-氮杂十九烷-19-酰基)-L-赖氨酸(96-5))的TFA盐。ESI m/z：616.4(M+H)+。
步骤4
将1-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸(1.58g，2.201mmol)及HOSu(0.53g，4.597mmol)的无水DCM(20mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加EDCI(0.63g，3.302mmol)。将所得溶液再搅拌1小时，随后用更多的DCM(20mL)稀释，并用水(20mL)洗涤。收集有机层并且用DCM(40mL*2)萃取水层。将合并的DCM层经硫酸钠干燥、过滤并浓缩滤液，得到为无色油状物的粗产物96-6(2,2-二甲基-4-侧氧基-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-十三氧杂-5-氮杂四十四烷-44-酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(96-6，2.5g，3.069mmol，100.15％))。ESI m/z：715.5(M-100+H)+，837.5(M+Na)+。
将化合物96-5((1-(9H-茀-9-基)-3-侧氧基-2,7,10,13,16-五氧杂-4-氮杂十九烷-19-酰基)-L-赖氨酸(96-5，1.55g，2.514mmol))及化合物96-6(2,2-二甲基-4-侧氧基-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-十三氧杂-5-氮杂四十四烷-44-酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(96-6，1.8g，2.211mmol))的无水DMF(22mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器缓慢添加DIPEA(0.57g，4.422mmol)。将反应溶液搅拌2小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽。将所得溶液减压浓缩并将残余物借由制备型HPLC(0.01％ TFA)纯化，得到为无色油状物的化合物96-7((2S)-6-(1-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)-2-[1-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基]己酸(96-7，2.3g，1.748mmol，79.04％))。ESI m/z：608.5((M-100)/2+H)+。
步骤5
将化合物96-7((2S)-6-(1-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)-2-[1-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基]己酸(96-7，2.3g，1.748mmol))的DCM(16mL)溶液在室温下搅拌，随后添加TFA(4mL，53.850mmol)。将所得溶液搅拌1小时以实现完全去保护。随后蒸发掉TFA及DCM，将残余物借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到所需级分，将其冻干以得到为无色油状物的产物96-8((2S)-6-(1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)-2-[1-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基]己酸(96-8，2.1g，1.728mmol，99.06％))。ESI m/z：608.5(M+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.89(d，J＝7.6Hz，2H)，7.86-7.80(m，2H)，7.71-7.61(m，1H)，7.44-7.40(m，2H)，7.37-7.33(m，2H)，6.29(s，1H)，4.30-4.21(m，1H)，4.06-3.95(m，2H)，3.68-3.55(m，12H)，3.55-3.47(m，48H)，3.42-3.38(m，2H)，3.38-3.21(m，4H)，3.16-3.05(m，2H)，3.00-2.94(m，4H)，2.43-2.37(m，2H)，2.33-2.27(m，2H)，1.70-1.57(m，1H)，1.58-1.44(m，1H)，1.38-1.18(m，4H)ppm。未显示氨基中的两个质子及羧基中的两个质子。
步骤6
将化合物96-8((2S)-6-(1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)-2-[1-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基]己酸(96-8，2.0g，1.645mmol))及D-葡萄糖(1.78g，9.873mmol)的甲醇(32mL)悬浮液在氮气氛围下加热至50℃，随后添加氰基硼氢化钠(0.62g，9.873mmol)。将所得混合物保持搅拌隔夜(16小时)，直至LCMS指示反应完成。随后将溶液浓缩至干燥，并且将残余物溶解于水并借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到所需级分，将其经LabConco冷冻干燥以得到为无色油状物的化合物96-9((2S)-2-[1-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己酸(96-9，2.0g，1.296mmol，78.74％))。ESI m/z：515.5(M/3+H)+，772.6(M/2+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.02(d，J＝7.2Hz，1H)，7.89(d，J＝7.2Hz，2H)，7.83(t，J＝5.6Hz，1H)，7.69(d，J＝7.2Hz，2H)，7.44-7.39(m，2H)，7.35-7.31(m，3H)，4.76-4.37(m，4H)，4.30-4.28(m，2H)，4.23-4.19(m，1H)，4.15-4.09(m，1H)，4.03-3.91(m，1H)，3.75-3.64(m，2H)，3.59-3.56(m，6H)，3.56-3.46(m，56H)，3.41-3.17(m，18H)，3.17-3.12(m，2H)，3.03-2.97(m，2H)，2.97-2.54(m，5H)，2.41-2.34(m，2H)，2.29(t，J＝6.4Hz，2H)，1.71-1.65(m，1H)，1.60-1.51(m，1H)，1.38-1.31(m，2H)，1.31-1.24(m，2H)ppm。未揭示一个羧基质子。
步骤7
将化合物96-9((2S)-2-[1-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己酸(96-9，125mg，0.081mmol))、化合物96-10(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(96-10，90.97mg，0.081mmol))及DIPEA(20.89mg，0.162mmol)的无水DMF(1.5mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加HATU(30.79mg，0.081mmol)的无水水溶液，例示5分钟。添加后，将所得溶液再搅拌1小时，直至所有起始胺被耗尽(借由LCMS监测)。随后将反应溶液直接借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的与起始酸混合的化合物96-11(N-(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(96-11，100mg，0.038mmol，46.62％))。ESI m/z：883.9(M/3+H)+，630.0(连接子片段，(M-717-26-18)/3+H)+，纯度60％-66％。杂质酸ESI m/z：515.5(M/3+H)+,772.6(M/2+H)+，含量35％-29％。
步骤8
将化合物96-11(N-(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(96-11，100mg，0.038mmol))的DMF(1.8mL)溶液在室温下搅拌，并且添加二乙胺(0.2mL，1.941mmol)。将所得溶液搅拌1小时至完成。真空蒸发掉挥发物，并且将DMF中的残余物借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到所需级分，将其借由LabConco冻干以得到为白色固体的产物96-12(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-(1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(96-12，75mg，0.031mmol，81.32％))。ESI m/z：809.9(M/3+H)+，718.6(片段，MMAE)，555.9(连接子片段，(M-717-26-18)/3+H)+。
步骤9
将4-{2-氮杂三环[10.4.0.0^{4,9}]十六烷-1(16),4(9),5,7,12,14-己-10-炔-2-基}-4-侧氧基丁酸(DBCO-酸、710mg，2.328mmol)及HOSu(401.56mg，3.492mmol)的无水DCM(23mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加EDCI(669.38mg，3.492mmol)。将所得溶液再搅拌1.5小时。随后将所得溶液用水(10mL)洗涤，分离DCM层并用更多的DCM(20mL*2)萃取水层。将合并的DCM相浓缩至干燥，并且将残余物借由反相快速层析(中性洗脱剂)纯化，得到为白色固体的化合物96-13(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0^{4,9}]十六烷-1(12),4(9),5,7,13,15-己-10-炔-2-基}-4-侧氧基丁酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(96-13，850mg，2.114mmol，90.83％))。ESI m/z：403.2(M+H)+，425.2(M+Na)+。
步骤10
将化合物96-12(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-(1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(96-12，65mg，0.027mmol))及DIPEA(6.91mg，0.054mmol)的无水DMF(2mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加DBCO NHS酯(化合物96-13，10.78mg，0.027mmol)的无水DMF(2mL)溶液。将反应溶液再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽。随后将所得溶液直接借由制备型HPLC(10mM碳酸氢铵)纯化，得到为白色固体的PB096(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0^{4,9}]十六烷-1(12),4(9),5,7,13,15-己-10-炔-2-基}-4-侧氧基丁酰氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(PB096，45mg，0.017mmol，61.90％))。ESI m/z：905.3(M/3+H)+，679.2(M/4+H)+，保留时间5.577分钟(HPLC)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.05(s，1H)，8.37-8.10(m，2H)，8.05-8.03(m，1H)，7.93-7.90(m，1H)，7.83-7.77(m，2H)，7.77-7.67(m，2H)，7.63-7.57(m，3H)，7.51-7.45(m，3H)，7.38-7.26(m，9H)，7.20-7.14(m，1H)，6.00-5.97(m，1H)，5.43-5.36(m，3H)，5.11-4.94(m，3H)，4.76-4.17(m，16H)，4.04-3.92(m，2H)，3.79-3.57(m，12H)，3.50-3.41(m，56H)，3.36-3.17(m，19H)，3.12-2.85(m，15H)，2.60-2.56(m，2H)，2.43-2.36(m，3H)，2.30-2.22(m，4H)，2.15-1.96(m，6H)，1.78-1.21(m，20H)，1.05-0.97(m，6H)，0.89-0.77(m，24H)ppm。
实例28：含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物连接子(PB097)的制备
含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB097)制备如下：
步骤1
将化合物97-1((2S)-2-(1-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]氨基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己酸(97-1，200mg，0.130mmol))、化合物97-2(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0 2，1 4.0 4，13.0 6，11.0 20，2 4]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(97-2，108.83mg，0.129mmol))及HATU(49.43mg，0.130mmol)、DIPEA(33.59mg，0.260mmol)的DMF(2mL)溶液在室温下搅拌2小时，并且LCMS显示反应完成。随后将反应混合物借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到所需级分，将其冷冻干燥以得到为淡黄色固体的化合物97-3(N-(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0 2，1 4.0 4，13.06，11.0 20，2 4]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-[(42S，43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸9H-茀-9-基甲酯(97-3，262mg，0.111mmol，85.16％))。ESI m/z：789.7(M/3+H)+。
步骤2
向化合物97-3(N-(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-[(42S，43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(97-3，162mg，0.068mmol))的DMF(2mL)溶液中添加二乙胺(0.2mL，0.2720mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时。随后将粗混合物借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到所需级分，将其冷冻干燥以得到为白色固体的化合物97-4(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-(1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(97-4，78mg，0.036mmol，53.49％))。ESI m/z：715.7(M/3+H)+。
步骤3
将化合物97-4(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-(1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(97-4，78mg，0.036mmol))、化合物97-5(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0 4，9]十六烷-1(12),4(9),5,7,13,15-己-10-炔-2-基}-4-侧氧基丁酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(97-5，29.27mg，0.073mmol))及DIPEA(9.40mg，0.073mmol)的DMF(2mL)溶液在室温下搅拌2小时以实现完全转化。随后将反应混合物借由制备型HPLC(10mMNH4HCO3)纯化，得到所需级分，将其借由LabConco冻干以得到为白色固体的PB097(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0^{4,9}]十六烷-1(12),4(9),5,7,13,15-己-10-炔-2-基}-4-侧氧基丁酰氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(PB097，55mg，0.023mmol，62.18％))。ESI m/z：811.5(M/3+H)+。[注：产物在酰胺键上部分裂解，在酸性LCMS中释放DBCO片段，因此用m/z 206检测DBCO单元，并用m/z749((M-205+17)/3+H)+检测到相应的对应物。在碱性LCMS的情况下，依喜替康内酯环部分打开，并且用m/z 817((M+18)/3+H)+]检测片段离子。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.04(s，1H)，8.13(d，J＝8.0Hz，1H)，8.09-8.02(m，2H)，7.84-7.76(m，3H)，7.74-7.66(m，2H)，7.62-7.59(m，3H)，7.52-7.42(m，3H)，7.40-7.27(m，6H)，6.54(s，1H)，5.99(t，J＝6.4Hz，1H)，5.45-5.43(m，4H)，5.34-5.23(m，3H)，5.08(s，2H)，5.02(d，J＝14.0Hz，1H)，4.60-4.15(m，12H)，3.71-3.67(m，1H)，3.64-3.55(m，9H)，3.50-3.40(m，62H)，3.40-3.39(m，4H)，3.32-3.18(m，4H)，3.18-2.90(m，8H)，2.60-2.51(m，1H)，2.42-2.36(m，6H)，2.29(t，J＝6.0Hz，2H)，2.24-2.09(m，4H)，2.03-1.93(m，2H)，1.91-1.80(m，2H)，1.80-1.52(m，5H)，1.49-1.19(m，8H)，0.89-0.80(m，9H)ppm。
实例29：含有PEG单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物连接子(PB098)的制备
含有PEG单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物-连接子(PB098)制备如下：
步骤1
向化合物98-1((2S)-2-[1-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己酸(98-1，3.0g，1.943mmol))的DMF(10mL)溶液中添加二乙胺(1.1mL，14.032mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时以实现完全去保护。随后将所得溶液直接借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的产物98-2((2S)-2-(1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己酸(98-2，2.1g，1.589mmol，81.71％))。ESI m/z：661.6(M/2+H)+。
步骤2
向化合物98-2((2S)-2-(1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己酸(98-2，2.1g，1.589mmol))的DMF(10mL)溶液中添加化合物98-3(2-{2-[2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)乙酰氨基]乙酰氨基}乙酸五氟苯基酯(98-3，0.92g，1.589mmol))及DIPEA(0.21g，1.589mmol)。将混合物在室温下搅拌1小时。将所得溶液借由反相快速层析(0.01％TFA)纯化，得到为白色固体的产物98-4((2S)-2-[1-(2-{2-[2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)乙酰氨基]乙酰氨基}乙酰氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己酸(98-4，2.2g，1.283mmol，80.59％))。ESI m/z：858.2(M/2+H)+。
步骤3
向化合物98-4((2S)-2-[1-(2-{2-[2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)乙酰氨基]乙酰氨基}乙酰氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基]-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己酸(98-4，2.2g，1.283mmol))的MeCN(10mL)及H2O(6mL)溶液中添加二乙胺(4mL，2.840mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时至完成。将所得溶液浓缩至干燥并借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色胶状物的产物98-5((2S)-2-(1-{2-[2-(2-氨基乙酰氨基)乙酰氨基]乙酰氨基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己酸(98-5，1.55g，1.038mmol，81.15％))。ESI m/z：747.1(M/2+H)+，498.5(M/3+H)+。
步骤4
向化合物98-5((2S)-2-(1-{2-[2-(2-氨基乙酰氨基)乙酰氨基]乙酰氨基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己酸(98-5，1.55g，1.038mmol))的DMF(10mL)溶液中添加化合物98-6(2-[2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)乙酰氨基]乙酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(98-6，0.47g，1.038mmol))及DIPEA(0.13g，1.038mmol)。将混合物在室温下搅拌1小时。将所得溶液借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的产物98-7((2S)-2-(1-{2-[2-(2-{2-[2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)乙酰氨基]乙酰氨基}乙酰氨基)乙酰氨基]乙酰氨基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己酸(98-7，1.4g，0.765mmol，73.68％))。ESI m/z：915.2(M/2+H)+，610.7(M/3+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.22-8.15(m，4H)，8.11-8.08(m，2H)，7.91-7.86(m，3H)，7.82(t，J＝5.6Hz，1H)，7.72(d，J＝7.6Hz，2H)，7.59(t，J＝6.0Hz，1H)，7.44-7.40(m，2H)，67.36-7.31(m，2H)，4.55-4.12(m，10H)，3.80-3.72(m，8H)，3.69-3.66(m，4H)，3.62-3.56(m，10H)，3.53-3.47(m，60H)，3.42-3.38(m，5H)，3.32-3.19(m，2H)，3.03-2.92(m，8H)，2.50-2.36(m，2H)，2.29(t，J＝6.4Hz，2H)，1.72-1.63(m，1H)，1.59-1.50(m，1H)，11.41-1.35(m，2H)，1.31-1.16(m，5H)ppm。
步骤5
向化合物98-7((2S)-2-(1-{2-[2-(2-{2-[2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)乙酰氨基]乙酰氨基}乙酰氨基)乙酰氨基]乙酰氨基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己酸(98-7，200mg，0.109mmol))及化合物98-8(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(98-8，122.85mg，0.109mmol))的干DMF(5mL)溶液中依次添加HATU(41.58mg，0.109mmol)及DIPEA(14.13mg，0.109mmol)。添加后，将混合物在室温下搅拌1小时，直至所有起始胺耗尽(借由LCMS监测)。随后将所得溶液借由反相快速层析(0.01％TFA)纯化，得到所需级分，将其冻干以得到为白色固体的产物98-9(N-[({[({[({[(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25，28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酰基]甲基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]甲基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(98-9，210mg，0.072mmol，65.65％))。ESI m/z：979.0(M/3+H)+。
步骤6
向化合物98-9(N-[({[({[({[(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-[(42S,43R，44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酰基]甲基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]甲基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(98-9，210mg，0.072mmol))的无水DMF(1.9mL)溶液中添加二乙胺(0.1mL，0.971mmol)。将溶液在室温下搅拌1小时至完成。将所得溶液直接借由制备型HPLC(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的产物PB098(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{1-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙酰氨基)乙酰氨基]乙酰氨基}乙酰氨基)乙酰氨基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(PB098，125mg，0.046mmol，64.40％))的TFA盐。ESI m/z：905.0(M/3+H)+，保留时间5.432分钟(HPLC)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.05(s，1H)，8.64(t，J＝5.6Hz，1H)，8.36-8.01(m，9H)，7.93-7.91(m，1.5H)，7.84-7.81(m，1H)，7.73(d，J＝8.4Hz，0.5H)，7.58(d，J＝7.6Hz，2H)，7.35-7.24(m，6H)，7.20-7.14(m，1H)，6.05-5.96(m，1H)，5.44(brs，4H)，5.13-4.94(m，2H)，4.82-4.38(m，10H)，4.30-4.17(m，4H)，4.04-3.93(m，4H)，3.86(d，J＝5.6Hz，2H)，3.78-3.74(m，7H)，3.69-3.67(m，5H)，3.62-3.55(m，14H)，3.55-3.39(m，56H)，3.39-3.30(m，5H)，3.25-3.04(m，11H)，3.05-2.83(m，10H)，2.41-2.36(m，3H)，2.33-2.27(m，3H)，2.16-1.93(m，4H)，1.81-1.21(m，18H)，1.05-0.97(m，6H)，0.89-0.73(m，27H)ppm。揭示了TFA上的一个羧基质子。
实例30：含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物连接子(PB099)的制备
含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB099)制备如下：
步骤1
向化合物99-1((2S)-2-(1-{2-[2-(2-{2-[2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)乙酰氨基]乙酰氨基}乙酰氨基)乙酰氨基]乙酰氨基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基)-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己酸(99-1，190mg，0.104mmol))的DMF(4mL)溶液中添加化合物99-2(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(99-2，88mg，0.105mmol))、HATU(41.47mg，0.109mmol)及DIPEA(0.207mL，0.156mmol)。将混合物在室温下搅拌1小时以完成(借由LCMS监测)。随后将所得溶液借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为黄色固体的产物99-3(N-[({[({[({[(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-[(42S，43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酰基]甲基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]甲基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(99-3，190mg，0.072mmol，68.97％))。ESI m/z：885.0(M/3+H)+,663.9(M/4+H)+。
步骤2
向化合物99-3(N-[({[({[({[(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊基]氨基甲酰基}-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酰基]甲基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]甲基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(99-3，102mg，0.038mmol))的DMF(1.9mL)溶液中添加二乙胺(0.1mL，0.971mmol)。将混合物在室温下搅拌1小时至完成。将所得溶液借由反相分离(0.01％ TFA)纯化，得到为黄色固体的产物PB099(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-{1-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙酰氨基)乙酰氨基]乙酰氨基}乙酰氨基)乙酰氨基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰氨基}-6-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(PB099，40mg，0.016mmol，42.80％))的TFA盐。ESI m/z：810.8(M/3+H)+，608.3(M/4+H)+，保留时间5.077分钟(HPLC)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.05(s，1H)，8.64(t，J＝5.6Hz，1H)，8.32(t，J＝5.6Hz，1H)，8.21-8.01(m，9H)，7.92(t，J＝5.6Hz，1H)，7.85-7.72(m，3H)，7.60(d，J＝8.4Hz，2H)，7.36(d，J＝8.4Hz，2H)，7.31(s，1H)，6.55(s，1H)，6.02(t，J＝5.6Hz，1H)，5.46(brs，6H)，5.34-5.23(m，3H)，5.08(s，2H)，4.83(brs，2H)，4.56(brs，4H)，4.41-4.25(m，3H)，4.21-4.17(m，1H)，3.99(brs，2H)，3.86(d，J＝5.2Hz，2H)，3.78-3.73(m，6H)，3.69-3.67(m，4H)，3.62-3.54(m，14H)，3.52-3.47(m，60H)，3.29-3.20(m，6H)，3.14-2.90(m，6H)，2.41-2.37(m，5H)，2.29(t，J＝6.4Hz，2H)，2.24-2.13(m，2H)，1.99-1.81(m，3H)，1.70-1.58(m，3H)，1.50-1.20(m，8H)，0.90-0.81(m，9H)ppm。揭示了TFA上的两个羧基质子。实例31：含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物连接子(PB100或“LD100”)的制备
含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB100或“LD100”)制备如下：步骤1
将化合物100-1(2,3-双({[(三级丁氧基)羰基]氨基})丙酸(100-1，1.52g，5.000mmol))及HOSu(0.86g，7.500mmol)的无水DCM(20mL)溶液在室温下搅拌，随后分批添加EDCI(1.44g，7.500mmol)，历时5分钟。将所得溶液再搅拌1小时，直至起始酸耗尽(借由LCMS监测)。随后将反应溶液用更多的DCM(20mL)稀释并且用水(40mL)洗涤，分离有机层并用DCM(2*40mL)萃取水层。将收集的DCM层经硫酸钠干燥、过滤并浓缩滤液，得到为白色泡沫的粗化合物100-2(2,3-双((三级丁氧基羰基)氨基)丙酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(100-2，2.0g，4.988mmol，99.75％))，在静置几分钟后变成无色油状物。化合物原样用于下一步骤。ESI m/z：424.2(M+Na)+。
步骤2
将化合物100-3((2S)-6-氨基-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(100-3，1.84g，4.988mmol))及DIPEA(0.64g，4.988mmol)的干DMF(10mL)溶液在室温下搅拌10分钟，随后缓慢添加化合物100-2(2,3-双({[(三级丁氧基)羰基]氨基})丙酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(100-2，2.0g，4.988mmol))的无水DMF(10mL)溶液，历时5分钟。添加后，将所得悬浮液搅拌2小时，直至所有起始材料耗尽。将所得溶液直接借由反相快速层析(0.01％TFA)纯化，得到为白色固体的化合物100-4(((2S)-6-[2,3-双({[(三级丁氧基)羰基]氨基})丙烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(100-4，2.0g，3.055mmol，61.16％))。ESI m/z：555.3(M-100+H)+，678.4(M+Na)+。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.55(s，1H)，7.90(d，J＝7.6Hz，2H)，7.84(t，J＝4.8Hz，1H)，7.73(d，J＝7.2Hz，2H)，7.62(d，J＝8.0Hz，1H)，7.44-7.40(m，2H)，7.36-7.31(m，2H)，6.73(m，1H)，6.61(d，J＝8.0Hz，1H)，4.29-4.21(m，3H)，3.98-3.87(m，2H)，3.21-3.16(m，2H)，3.11-2.94(m，2H)，1.74-1.55(m，2H)，1.39-1.26(m，22H)ppm。
步骤3
将化合物100-4((2S)-6-[2,3-双({[(三级丁氧基)羰基]氨基})丙烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(100-4，1.0g，1.527mmol))的DCM(8mL)溶液在室温下搅拌，随后缓慢添加TFA(2mL，26.925mmol)。将溶液再搅拌1小时，随后将溶液蒸发至干燥。将残余物再次用DCM(20mL)溶解并浓缩。重复该过程两次，得到为淡黄色油状物的粗产物100-5((2S)-6-(2,3-二氨基丙烷酰氨基)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(100-5，1.0g，2.200mmol，144.05％))，原样用于下一步骤。ESI m/z：455.3(M+H)+。
步骤4
将1-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸(2.2g，3.065mmol)及HOSu(0.53g，4.597mmol)的无水DCM(10mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加EDCI(0.88g，4.597mmol)。将所得溶液再搅拌1小时，直至所有酸消转化成活性酯。随后将溶液用更多的DCM(20mL)稀释并且用水(20mL)洗涤，收集有机层并用DCM(20mL*2)萃取水层。合并DCM层并经硫酸钠干燥，过滤并浓缩滤液，得到为无色油状物的粗活性酯。将活性酯溶解于无水DMF(5mL)，缓慢添加至化合物100-5((2S)-6-(2,3-二氨基丙烷酰氨基)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(100-5，0.63g，1.390mmol))及DIPEA(0.36g，2.780mmol)的无水DMF(5mL)溶液中。添加后，将所得淡黄色溶液在室温下搅拌2小时至完成。随后将反应溶液借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为无色油状物的化合物100-6((2S)-6-[2,3-双(1-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)丙烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(100-6))。ESI m/z：551.3((M-100)/3+H)+，827.7(M-100)/2+H)+。
步骤5
将化合物100-6((2S)-6-[2,3-双(1-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)丙烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(100-6，1.8g，0.971mmol))的DCM(8mL)溶液在室温下搅拌，随后添加TFA(2mL，26.925mmol)。将所得溶液搅拌1小时。随后将溶液浓缩至干燥，并且将残余物借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到所需级分，将其冻干以得到为无色油状物的产物100-7((2S)-6-[2,3-双(1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)丙烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(100-7，1.0g，0.605mmol，62.28％))。ESI m/z：552.3(M/3+H)+，828.1(M/2+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.95-7.89(m，3H)，7.85-7.72(m，9H)，7.63(d，J＝8.0Hz，1H)，7.45-7.41(m，2H)，7.36-7.31(m，2H)，4.29-4.20(m，4H)，3.94-3.88(m，1H)，3.68-3.66(m，1H)，3.61-3.57(m，18H)，3.57-3.47(m，76H)，3.34-3.29(m，2H)，3.26-3.21(m，1H)，3.05-2.97(m，6H)，2.39(t，J＝6.8Hz，2H)，2.31(t，J＝6.8Hz，2H)，1.74-1.55(m，2H)，1.44-1.25(m 4H)ppm。
步骤6
将化合物100-7((2S)-6-[2,3-双(1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)丙烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(100-7，850mg，0.514mmol))及D-葡萄糖(555.03mg，3.084mmol)的甲醇(20mL)悬浮液在氮气氛围下加热至50℃，随后添加氰基硼氢化钠(193.77mg，3.084mmol)。将所得混合物保持加热隔夜(18小时)并完成。随后将溶液浓缩至干燥，将残余物溶解于DMF并借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为无色油状物的化合物100-8((2S)-6-{2,3-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]丙烷酰氨基}-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(100-8，640mg，0.173mmol，53.9％))。ESI m/z＝771.0(M/3+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.47(s，1H)，8.16(brs，2H)，7.95-7.80(m，5H)，7.73(d，J＝7.6Hz，2H)，7.63(d，J＝8.0Hz，1H)，7.45-7.40(m，2H)，7.35-7.31(m，2H)，5.48-5.41(m，4H)，4.85-4.76(m，4H)，4.64-4.41(m，12H)，4.31-4.20(m，4H)，4.04-3.95(m，4H)，3.95-3.87(m，1H)，3.79-3.76(m，5H)，3.72-3.61(m，5H)，3.59-3.55(m，20H)，3.55-3.40(m，98H)，3.29-3.21(m，2H)，3.11-2.97(m，2H)，2.38(t，J＝6.4Hz，2H)，2.31(t，J＝6.4Hz，2H)，1.74-1.56(m，2H)，1.43-1.26(m，4H)ppm。还揭示了TFA上的两个羧基质子。
步骤7
将化合物100-8((2S)-6-{2,3-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]丙烷酰氨基}-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(100-8，150mg，0.065mmol))、化合物100-9(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(100-9，54.59mg，0.065mmol))及DIPEA(16.75mg，0.130mmol)的无水DMF(1.5mL)溶液在室温下搅拌5分钟以允许起始材料充分溶解于溶剂，随后添加HATU(24.68mg，0.065mmol)的无水DMF(0.5mL)溶液。将所得溶液再搅拌2小时，直至LCMS指示反应完成。将完成的反应溶液直接借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的化合物100-10(N-[(1S)-5-{2,3-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]丙烷酰氨基}-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11)，12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(100-10，103mg，0.033mmol，50.63％))。ESI m/z：784.2(M/4+H)+。
步骤8
将化合物100-10(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二侧氧基-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]哌嗪喃并[3',4':6,7]吲哚林并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酸4-((2S,5S,8S,59S,60R,61R,62R)-8-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-59,60,61,62,63-五羟基-5-异丙基-4,7,14,18-四氧杂-15-((42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基)-57-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基)-2-(3-脲基丙基)-21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54-十二氧杂-3,6,13,17,57-五氮杂六十三烷酰氨基)苄基酯(100-10，100mg，0.032mmol))的DMF(1.8mL)溶液在室温下搅拌，并且添加二乙胺(0.2mL，1.941mmol)。将反应溶液搅拌1小时并完成。用旋转蒸发仪蒸发大部分二乙胺，随后将残余物借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为淡黄色固体的所需产物100-11(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二侧氧基-2,3,9,10,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]哌嗪喃并[3',4':6,7]吲哚林并[1,2-b]喹啉-1-基)氨基甲酸4-((2S,5S,8S,59S,60R,61R,62R)-8-氨基-59,60,61,62,63-五羟基-5-异丙基-4,7,14,18-四氧杂-15-((42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基)-57-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基)-2-(3-脲基丙基)-21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54-十二氧杂-3,6,13,17,57-五氮杂六十三烷酰氨基)苄基酯(100-11，50mg，0.017mmol，53.82％))。ESI m/z：971.5(M/3+H)+，728.9(M/4+H)+。
步骤9
将化合物100-11(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-{2,3-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]丙烷酰氨基}己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(100-11，50mg，0.017mmol))及DIPEA(3.32mg，0.026mmol)的无水DMF(1.5mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加化合物100-12(6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(100-12，6.35mg，0.021mmol))的无水DMF(0.5mL)，历时5分钟。将反应溶液再搅拌4小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽。随后将反应溶液直接借由制备型HPLC(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的PB100(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-{2,3-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]丙烷酰氨基}-2-[6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(PB100，35mg，0.011mmol，65.64％))。ESI m/z：621.9(M/5+H)+，777.0(M/4+H)+，1035.7(M/3+H)+。保留时间5.642分钟(HPLC)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.04(s，1H)，8.15-8.13(m，3H)，8.07(d，J＝9.2Hz，1H)，7.99-7.91(m，2H)，7.86-7.77(m，3H)，7.64(d，J＝8.8Hz，1H)，7.60(d，J＝8.4Hz，2H)，7.36(d，J＝8.4Hz，2H)，7.32(s，1H)，7.00(s，2H)，6.54(s，1H)，6.01(t，J＝5.6Hz，1H)，5.49-5.39(m，7H)，5.39-5.24(m，3H)，5.08(s，2H)，4.83-4.79(m，4H)，4.65-4.46(m，11H)，4.40-4.35(m，1H)，4.30-4.18(m，3H)，4.03-3.94(m，4H)，3.81-3.74(m，4H)，3.74-3.61(m，4H)，3.61-3.52(m，16H)，3.52-3.40(m，98H)，3.29-3.13(m，8H)，3.13-2.90(m，7H)，2.40-2.36(m，5H)，2.30(t，J＝6.4Hz，2H)，2.24-2.08(m，4H)，2.00-1.71(m，4H)，1.71-1.51(m，3H)，1.51-1.14(m，15H)，0.90-0.80(m，9H)ppm。揭示了TFA中两个羧基质子信号。
实例32：含有PEG单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物-连接子(PB101或“LD101”)的制备
含有PEG单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物-连接子(PB101或“LD101”)制备如下：
步骤1
将化合物101-1(N-[(1S)-5-{2,3-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]丙烷酰氨基}-1-氨基甲酰基戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(101-1，250mg，0.108mmol))、化合物101-2(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(101-2，121.64mg，0.108mmol))及DIPEA(27.95mg，0.217mmol)的无水DMF(4mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加HATU(41.19mg，0.108mmol)的无水DMF(4mL)溶液。将所得溶液再搅拌2小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的化合物101-3(N-[(1S)-5-{2,3-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]丙烷酰氨基}-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(101-3，210mg，0.061mmol，56.75％))。ESI m/z：854.9(M/4+H)+。
步骤2
将化合物101-3(N-[(1S)-5-{2,3-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]丙烷酰氨基}-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(101-3，200mg，0.059mmol))的DMF(3.6mL)溶液在室温下搅拌，并且添加二乙胺(0.4mL，3.883mmol)。将所得溶液搅拌1小时至完成。随后用旋转蒸发仪蒸发二乙胺，并且将DMF中的残余物借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的所需产物化合物101-4(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-{2,3-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]丙烷酰氨基}己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(101-4，100mg，0.031mmol，53.48％))。ESI m/z：799.5(M/4+H)+。
步骤3
将化合物101-4(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-{3-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]-2-[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(3R,4S,5R)-3,4,5,6-四羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]丙烷酰氨基}己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(101-4，30mg，0.009mmol))及化合物101-5(6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(101-5，3.47mg，0.011mmol))的无水DMF(1.5mL)溶液在室温下搅拌，随后添加DIPEA(1.74mg，0.013mmol)。将所得溶液在室温下搅拌2小时以实现完全转化(借由LCMS监测)。随后将完成的反应溶液直接借由制备型HPLC(0.01％ TFA)纯化，得到所需级分，将其冻干以得到为白色固体的PB101(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-{2,3-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]丙烷酰氨基}-2-[6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(PB101，21mg，0.006mmol，66.02％))。ESI m/z：847.5(M/4+H)+，1129.6(M/3+H)+。保留时间6.016分钟(HPLC)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.03(s，1H)，8.34-8.10(m，4H)，8.06-7.89(m，2H)，7.89-7.79(m，2H)，7.66-7.62(m，1H)，7.59-7.57(m，2H)，7.34-7.24(m，6H)，7.20-7.13(m，1H)，7.00(s，2H)，6.02-5.98(m，1H)，5.50-5.35(m，7H)，5.13-4.78(m，8H)，4.70-4.34(m，15H)，4.34-4.18(m，5H)，4.05-3.93(m，6H)，3.83-3.74(m，6H)，3.74-3.68(m，7H)，3.61-3.40(m，116H)，3.26-3.12(m，11H)，3.12-2.80(m，10H)，2.43-2.36(m，3H)，2.32-2.26(m，3H)，2.15-1.84(m，6H)，1.84-1.45(m，15H)，1.45-1.16(m，8H)，1.06-0.97(m，6H)，0.89-0.73(m，24H)ppm。揭示了TFA中的一个羧基质子。实例33：含有PEG单元及连接至6-氨基-9-{[4-(氨基甲基)苯基]甲基}-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-8-醇的可裂解连接子的药物-连接子(PB102)的制备
含有PEG单元及连接至6-氨基-9-{[4-(氨基甲基)苯基]甲基}-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-8-醇的可裂解连接子的药物-连接子(PB102)制备如下：
步骤1
将化合物102-1(2-氯-9H-嘌呤-6-胺)(1当量)及K2CO3(3当量)溶解于DMSP并且搅拌反应混合物。添加4-(溴甲基)苄腈(1.4当量)，并且将反应混合物在室温下搅拌16小时。过滤反应混合物以移除不溶性盐并倒入水中。水相用EtOAc萃取。将合并的有机相经Mg2SO4干燥并真空浓缩，得到产物102-3(4-((6-氨基-2-氯-9H-嘌呤-9-基)甲基)苄腈(102-3))。
步骤2
向NaH(1.24g，51.631mmol)的2-甲氧基乙-1-醇(1.364mL，17.210mmol)溶液中添加化合物102-3(4-[(6-氨基-2-氯-9H-嘌呤-9-基)甲基]苄腈(102-3，4.9g，17.210mmol))。将混合物在80℃下搅拌2小时。将所得溶液浓缩并借由Biotage快速层析(矽胶，用0至10％MeOH/DCM洗脱)纯化，得到为淡黄色固体的产物102-4(4-{[6-氨基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苄腈(102-4，4.02g，12.394mmol，72.04％))。ESI m/z：325.0(M+H)+。
步骤3
向化合物102-4(4-{[6-氨基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苄腈(102-4，4.02g，12.394mmol))的1,4-二氧杂环己烷(50mL)溶液中添加亚硫烷基-λ^4-硼亚胺(2.65g，14.873mmol)及AIBN(0.183mL，1.239mmol)。将混合物在室温下搅拌3小时。将所得溶液浓缩并借由快速层析(矽胶，用0至10％MeOH/DCM洗脱)纯化，得到为淡黄色固体的产物102-5(4-{[6-氨基-8-溴-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苄腈(102-5，4.90g，12.152mmol，98％))。ESI m/z：404.1(M+H)+。
步骤4
向NaOMe(7.37g，136.395mmol)的MeOH(50mL)溶液中添加化合物102-5(4-{[6-氨基-8-溴-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苄腈(102-5，5.5g，13.640mmol))。将混合物回流搅拌3小时。将所得溶液用盐水洗涤并用DCM(50mL*3)萃取。将有机层经Na2SO4干燥并蒸发，得到产物102-6(4-{[6-氨基-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苄腈(102-6，3.5g，9.877mmol，72.46％))。ESI m/z：355.3(M+H)+。
步骤5
向化合物102-6(4-{[6-氨基-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苄腈(102-6，3.5g，9.877mmol))的MeOH(50mL)溶液中添加NaBH4(2.258mL，69.137mmol)及NiCl2(H2O)6(0.24g，0.988mmol)。将混合物在室温下搅拌3小时以完成(借由LCMS监测)。将所得溶液用水淬灭并用DCM(50mL*3)萃取。将收集的有机层经Na2SO4干燥及蒸发，得到为淡黄色固体的粗产物102-7(9-{[4-(氨基甲基)苯基]甲基}-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-6-胺(102-7，3.6g，10.045mmol，101.70％))，将其直接用于下一步骤。ESI m/z：359.3(M+H)+。
步骤6
向化合物102-7(9-{[4-(氨基甲基)苯基]甲基}-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-6-胺(102-7，3.5g，9.766mmol))的MeCN(20mL)溶液中添加ClSiMe3(1.06g，9.766mmol)及NaI(0.400mL，9.766mmol)。将混合物在室温下搅拌3小时。将所得溶液浓缩并借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为淡黄色固体的产物102-8(6-氨基-9-{[4-(氨基甲基)苯基]甲基}-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-8-醇(102-8，1.75g，5.082mmol，52.08％))。ESI m/z：345.3(M+H)+，保留时间4.359分钟(HPLC)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.131(s，1H)，8.141(s，3H)，7.413-7.393(d，J＝8.0Hz，2H)，7.340-7.319(d，J＝8.4Hz，2H)，6.560(s，2H)，4.872(s，2H)，4.259-4.235(t，J＝4.8Hz，2H)，4.005-3.992(d，J＝5.2Hz，2H)，3.593-3.570(t，J＝4.6Hz，2H),3.265(s，3H)ppm。揭示了TFA中的一个羧基质子。
步骤7
向化合物102-8(6-氨基-9-{[4-(氨基甲基)苯基]甲基}-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-8-醇(102-8，800mg，2.323mmol))的DMF(5mL)溶液中添加化合物102-9(4-硝基苯基碳酸{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-3-甲基丁酰氨基]戊烷酰氨基]苯基}甲酯(102-9，1781.31mg，2.323mmol))、HOBt(313.89mg，2.323mmol)及DIPEA(300.25mg，2.323mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时。将所得溶液借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为淡黄色固体的产物102-10(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-({4-[({[(4-{[6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苯基)甲基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)-4-(氨基甲酰基氨基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(102-10，450mg，0.463mmol，19.93％))。ESI m/z：972.5(M+H)+。
步骤8
向化合物102-10(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-({4-[({[(4-{[6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苯基)甲基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)-4-(氨基甲酰基氨基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(102-10，450mg，0.463mmol))的DMF(2mL)溶液中添加二乙胺(0.1mL，1.276mmol)。将混合物在室温下搅拌1小时。随后将所得溶液借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化以收集所需级分，将其冻干以得到不纯的产物。将粗产物在乙腈中研磨并过滤，得到为淡黄色固体的饼状物102-11(N-[(4-{[6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苯基)甲基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(102-11，70mg，0.093mmol，20.17％))。ESI m/z：375.8(M/2+H)+。
步骤9
向化合物102-11(N-[(4-{[6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苯基)甲基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(102-11，58mg，0.077mmol))的DMF(4mL)溶液中添加化合物102-12((2S)-6-{2,3-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]丙烷酰氨基}-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(102-12，178.73mg，0.077mmol))、HATU(29.28mg，0.077mmol)及DIPEA(9.95mg，0.077mmol)。将所得溶液在室温下搅拌1小时，随后借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到所需级分，将其冷冻干燥以得到为白色固体的化合物102-13(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-({4-[({[(4-{[6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苯基)甲基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)-4-(氨基甲酰基氨基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-{2,3-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]丙烷酰氨基}戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(102-13，120mg，0.040mmol，51.30％))。ESI m/z：761.3(M/4+H)+。
步骤10
向化合物102-13(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-({4-[({[(4-{[6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苯基)甲基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)-4-(氨基甲酰基氨基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-{2,3-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]丙烷酰氨基}戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(102-13，120mg，0.039mmol))的DMF(2mL)溶液中添加二乙胺(0.1mL，1.276mmol)。将混合物在室温下搅拌1小时。将所得溶液借由反相分离(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的产物102-14(N-[(4-{[6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苯基)甲基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-{2,3-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]丙烷酰氨基}己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(102-14，50mg，0.018mmol，44.95％))。ESI m/z：706.0(M/4+H)+。
步骤11
向化合物102-14(N-[(4-{[6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苯基)甲基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-{2,3-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]丙烷酰氨基}己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(102-14，50mg，0.018mmol))的DMF(1mL)溶液中添加化合物102-15(6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(102-15，6.56mg，0.021mmol))及DIPEA(3.44mg，0.027mmol)。将溶液在室温下搅拌2小时，直至所有起始胺耗尽。随后将所得溶液直接借由制备型HPLC(0.01％ TFA)纯化，得到产物级分，将其冻干以得到为白色固体的PB102(N-[(4-{[6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基]甲基}苯基)甲基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-{2,3-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28，31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]丙烷酰氨基}-2-[6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(PB102，20mg，0.007mmol，37.43％))。ESI m/z：754.5(M/4+H)+，1005.1(M/3+H)+，保留时间5.190分钟(HPLC)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.03(s，1H)，10.01(s，1H)，8.15-8.13(m，3H)，7.97(d，J＝8.0Hz，1H)，7.94(d，J＝4.0Hz，1H)，7.87-7.85(m，2H)，7.81-7.75(m，1H)7.66(d，J＝12.0Hz，1H)，7.58(d，J＝4.0Hz，2H)，7.29-7.19(m，6H)，7.00(s，2H)，6.50(s，2H)，6.01(t，J＝5.6Hz，1H)，5.44(brs，4H)，4.95(brs，2H)，4.82(brs，2H)，4.57-4.39(m，12H)，4.26-4.14(m，8H)，4.05-3.95(m，4H)，3.80-3.76(m，4H)，3.68-3.61(m，4H)，3.58-3.56(m，18H)，3.52-3.36(m，98H)，3.35-3.29(m，12H)，3.26-3.17(m，7H)，3.01-2.92(m，4H)，2.68-2.66(m，1H)，2.39(t，J＝6Hz，2H)，2.33-2.29(m，2H)，2.20-2.10(m，2H)，1.99-1.95(m，1H)，1.74-1.55(m，3H)，1.46-1.31(m，8H),1.25-1.10(m，4H)，0.85-0.81(m，6H)ppm。揭示了TFA上的两个羧基质子。
实例34：含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物连接子(PB103)的制备
含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB103)制备如下：
步骤1
向化合物103-1((2S)-2,5-双({[(三级丁氧基)羰基]氨基})戊酸(103-1，4.5g，13.538mmol))的DCM(20mL)溶液中添加HOSu(3.12g，27.076mmol)及EDCI(5.19g，27.076mmol)。将混合物在室温下搅拌3小时。将所得溶液用水淬灭并用DCM萃取。将有机层经Na2SO4干燥并蒸发，得到粗产物103-2((S)-2,5-双((三级丁氧基羰基)氨基)戊酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(103-2，6.0g，13.971mmol，103.27％))。ESI m/z：452.3(M+Na)+。
步骤2
向化合物103-2((S)-2,5-双((三级丁氧基羰基)氨基)戊酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(103-2，5.81g，13.528mmol))的DMF(20mL)溶液中添加化合物103-3((2S)-6-氨基-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(103-3，5.98g，16.234mmol))及DIPEA(1.75g，13.528mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时。将所得溶液借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的产物103-4((2S)-6-[(2S)-2,5-双({[(三级丁氧基)羰基]氨基})戊烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(103-4，8.5g，12.448mmol，91.99％))。ESI m/z：683.5(M+H)+。
步骤3
向化合物103-4((2S)-6-[(2S)-2,5-双({[(三级丁氧基)羰基]氨基})戊烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(103-4，8.5g，12.448mmol))的DCM(20mL)溶液中添加TFA(10mL，134.626mmol)。将混合物在室温下搅拌3小时。将所得溶液蒸发并借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的产物103-5((2S)-6-[(2S)-2,5-二氨基戊烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(103-5，5.7g，11.812mmol，94.84％))。ESI m/z：483.4(M+H)+。
步骤4
向2,2-二甲基-4-侧氧基-3,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-十三氧杂-5-氮杂四十四烷-44-酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(5.68g，6.970mmol)的DMF(15mL)溶液中添加DIPEA(0.90g，6.970mmol)及化合物103-5((2S)-6-[(2S)-2,5-二氨基戊烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(103-5，1.68g，3.485mmol))。将混合物在室温下搅拌1小时。将所得溶液借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为透明油状物的产物103-6((2S)-6-[(2S)-2,5-双(1-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)戊烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(103-6，5.9g，3.135mmol，89.94％))。ESI m/z：561.2((M-200)/3+H)+。
步骤5
向化合物103-6((2S)-6-[(2S)-2,5-双(1-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)戊烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(103-6，5.9g，3.135mmol))的DCM(10mL)溶液中添加TFA(5mL，67.313mmol)。将混合物在室温下搅拌隔夜。将所得溶液浓缩并借由借由反相分离(C18管柱，用含有TFA的0至40％的乙腈水溶液洗脱)纯化，得到为透明油状物的产物103-7((2S)-6-[(2S)-2,5-双(1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)戊烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(103-7，4.5g，2.675mmol，85.39％))。ESI m/z：561.6(M/3+H)+。
步骤6
向化合物103-7((2S)-6-[(2S)-2,5-双(1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24，27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)戊烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(103-7，4.5g，2.675mmol))的MeOH(30mL)溶液中添加D-葡萄糖(5.78g，32.104mmol)及NaBH3CN(1.949mL，32.104mmol)。将混合物在60℃下搅拌持续周末。将所得溶液借由反相快速层析(0.01％TFA)纯化，得到为白色胶状物的产物103-8((2S)-6-[(2S)-2,5-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(103-8，4.53g，1.937mmol，72.36％))。ESI m/z：780.4(M/3+H)+。
步骤7
向化合物103-8((2S)-6-[(2S)-2,5-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(103-8，330mg，0.141mmol))的DMF(5mL)溶液中添加化合物103-9(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(103-9，118.66mg，0.141mmol))、HATU(53.65mg，0.141mmol)及DIPEA(36.47mg，0.282mmol)。将混合物在室温下搅拌1.5小时。将所得溶液调节至pH 6并借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为淡黄色固体的产物103-10(N-[(1S)-5-[(2S)-2,5-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34，37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊烷酰氨基]-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(103-10，273mg，0.086mmol，61.19％))。ESI m/z：790.9(M/4+H)+。
步骤8
向化合物103-10(N-[(1S)-5-[(2S)-2,5-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊烷酰氨基]-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(103-10，273mg，0.086mmol))的DMF(2.5mL)溶液中添加二乙胺(0.5mL，6.378mmol)。将混合物在室温下搅拌1小时。将所得溶液借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为淡黄色固体的产物103-11(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[(2S)-2,5-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31，34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(103-11，123mg，0.042mmol，48.46％))。ESI m/z：735.7(M/4+H)+，980.7(M/3+H)+。
步骤9
向化合物103-11(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[(2S)-2,5-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(103-11，123mg，0.042mmol))的DMF(3mL)溶液中添加化合物103-12(6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(103-12，19.35mg，0.063mmol))及DIPEA(8.11mg，0.063mmol)。将混合物在室温下搅拌1小时。将所得溶液调节至pH 6并借由制备型HPLC(0.01％TFA)纯化，得到为淡黄色固体的产物PB103(N-[(10S，23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-[(2S)-2,5-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊烷酰氨基]-2-[6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(PB103，80mg，0.026mmol，61.03％))。ESI m/z：627.7(M/5+H)+，784.0(M/4+H)+，1044.9(M/3+H)+，保留时间5.614分钟(HPLC)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.05(s，1H)，8.16-8.14(m，3H)，8.09-8.07(d，J＝8.8Hz，1H)，7.99-7.98(d，J＝7.2Hz，2H)，7.86-7.83(m，2H)，7.80-7.77(d，J＝10.8Hz，1H)，7.67-7.65(d，J＝8.0Hz，1H)，7.61-7.59(d，J＝8.4Hz，2H)，7.37-7.35(d，J＝8.8Hz，2H)，7.311(s，1H)，7.00(s，2H)，6.55(s，1H)，6.03-6.01(t，J＝5.2Hz，1H)，5.45(brs，8H)，5.29-5.23(m，3H)，5.07(s，2H)，4.82(brs,4H)，4.62-4.37(m,12H)，4.24-4.16(m,3H)，3.98(brs，4H)，3.78-3.77(m，4H)，3.677(brs，4H)，3.61-3.54(m，18H)，3.50-3.43(m，98H)，3.29-3.23(m，7H)，3.17-2.94(m，6H)，2.43-2.41(m，5H)，2.30-2.26(m，3H)，2.24-2.08(m，4H)，2.00-1.83(m，3H)，1.66-1.59(m，4H)，1.49-1.42(m，7H)，1.36-1.45(m，6H)，1.29-1.14(m，4H)，0.89-0.80(m，9H)ppm。
实例35：含有PEG单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物连接子(PB104)的制备
含有PEG单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物-连接子(PB104)制备如下：
步骤1
将化合物104-1((2S)-6-[(2S)-2,5-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(104-1，300mg，0.128mmol))、化合物104-2(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(104-2，144.10mg，0.128mmol))及DIPEA(33.02mg，0.256mmol)的无水DMF(3mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后缓慢添加HATU(48.79mg，0.128mmol)的无水DMF(1mL)溶液。将所得溶液再搅拌1小时，直至LCMS指示完全耗尽起始胺。随后将所得溶液借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的化合物104-3(N-[(1S)-5-[(2S)-2,5-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊烷酰氨基]-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(104-3，280mg，0.081mmol，63.51％))。ESI m/z：671.5((M-717-26-18)/4+H)+，862.0(M/4+H)+。
步骤2
将化合物104-3(N-[(1S)-5-[(2S)-2,5-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊烷酰氨基]-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(104-3，260mg，0.075mmol))的DMF(3.6mL)溶液在室温下搅拌，并且添加二乙胺(0.4mL，3.883mmol)。将所得溶液在再搅拌1小时，直至LCMS显示反应完成。真空蒸发掉挥发物(特别为二乙胺)，并且将残余物借由反相管柱层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的产物104-4(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[(2S)-2,5-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(104-4，160mg，0.050mmol，65.78％))。ESI m/z＝615.8((M-717-26-18)/4+H)+，806.3(M/4+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.10(s，1H)，8.43(d，J＝8.8Hz，1H)，8.35-8.33(m，1.5H)，8.17-8.09(m，5H)，8.03(d，J＝7.6Hz，1H)，7.97-7.78(m，3H)，7.66(d，J＝9.2Hz，0.5H)，7.59-7.57(m，2H)，7.49-7.40(m，1H)，7.32-7.24((m，6H)，7.20-7.13((m，1H)，6.04(d，J＝4.2Hz，1H)，5.52-5.36((m，7H)，5.11-4.94((m，3H)，4.89-4.69((m，5H)，4.69-4.39((m，16H)，4.30-4.17(m，4H)，4.04-3.93(m，7H)，3.88-3.81(m，2H)，3.79-3.76(m，5H)，3.72-3.62(m，6H)，3.62-3.49(m，88H)，3.43-3.25(m，20H)，3.25-3.06(m，12H)，3.06-2.83(m，11H)，2.40-2.38(m，2H)，2.30-2.22(m，3H)，2.14-1.92(m，4H)，1.84-1.62(m，6H)，1.62-1.21(m，16H)，1.05-0.97(m，6H)，0.97-0.75(m，26H)ppm。揭示了TFA上的三个羧基质子。
步骤3
将化合物104-4(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[(2S)-2,5-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25，28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(104-4，100mg，0.029mmol))及DIPEA(5.65mg，0.044mmol)的无水DMF(1.5mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加化合物104-5(6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(104-5，10.80mg，0.035mmol))的无水DMF(0.5mL)溶液。添加后，出于方便，将所得溶液在室温下搅拌隔夜，并且LCMS指示在早晨完全反应。将所得溶液直接借由制备型HPLC(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的PB104(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-[(2S)-2,5-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44，45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22，25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]戊烷酰氨基]-2-[6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(PB104，55mg，0.016mmol，55.11％))。ESI m/z：854.5(M/4+H)+；保留时间5.614分钟(HPLC)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.03(s，1H)，8.34-8.10(m，4H)，8.00-7.97(m，2H)，7.93-7.83(m，2.5H)，7.67-7.64(m，1.5H)，7.58(d，J＝8.0Hz，2H)，7.34-7.25(m，6H)，7.19-7.13(m，1H)，7.00((s，2H)，6.02-5.99((m，1H)，5.52-5.38((m，7H)，5.14-4.94((m，3H)，4.94-4.18((m，25H)，4.04-3.93(m，7H)，3.79-3.77(m，5H)，3.69-3.66(m，5H)，3.62-3.56(m，20H)，3.52-3.47(m，88H)，3.36-3.12(m，15H)，3.03-2.83(m，13H)，2.43-2.37(m，3H)，2.30-2.27(m，3H)，2.15-2.06(m，4H)，2.01-1.94(m，2H)，1.81-1.50(m，8H)，1.50-1.17(m，20H)，1.05-0.97(m，6H)，0.89-0.75(m，26H)ppm。揭示了TFA上的两个羧基质子。
实例36：含有PEG单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物连接子(PB105)的制备
含有PEG单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物-连接子(PB105)制备如下：
步骤1
将化合物105-1((2S)-2,6-双({[(三级丁氧基)羰基]氨基})己酸(105-1，5.0g，14.433mmol))、1-羟基吡咯啶-2,5-二酮(2.249mL，28.867mmol)及EDCI(5.53g，28.867mmol)的DCM(50mL)溶液在室温下搅拌2小时。随后将反应溶液用DCM(50mL)稀释并用水(50mL*2)洗涤。收集有机层并经硫酸钠干燥、过滤，并且真空浓缩滤液至干燥，得到粗化合物105-2(2,6-双(三级丁氧基羰基氨基)己酸(S)-2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(105-2，6.35g，14.318mmol，99.20％))，将其直接用于下一步骤。ESI m/z：466.3(M+Na)+。
步骤2
将化合物105-2(2,6-双(三级丁氧基羰基氨基)己酸(S)-2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(105-2，6.40g，14.44mmol))、化合物105-3((2S)-6-氨基-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(105-3，5.32g，14.440mmol))及DIPEA(3.73g，28.880mmol)的DMF(10mL)溶液在室温下搅拌2小时。随后将反应混合物借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到所需级分，将其冷冻干燥以得到为白色固体的化合物105-4((2S)-6-[(2S)-2,6-双({[(三级丁氧基)羰基]氨基})己烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(105-4，7.9g，11.337mmol，78.51％))。ESI m/z：719.4(M+Na)+。
步骤3
向化合物105-4((2S)-6-[(2S)-2,6-双({[(三级丁氧基)羰基]氨基})己烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(105-4，4.53g，6.501mmol))的DCM(20mL)溶液中缓慢添加TFA(10mL，134.626mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时。随后将反应溶液浓缩，并将粗混合物借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为无色油状物的化合物105-5((2S)-6-[(2S)-2,6-二氨基己烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(105-5，2.5g，5.034mmol，77.44％))。ESI m/z：497.3(M+H)+。
步骤4
将粗化合物105-5((2S)-6-[(2S)-2,6-二氨基己烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(105-5，1.94g，3.907mmol))的DMF(5mL)溶液逐滴添加至1-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21，24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(5.7g，6.995mmol)及DIPEA(1.01g，7.813mmol)的DMF(10mL)的溶液中。将所得溶液在室温下搅拌2小时并完成。将所得混合物借由反相快速层析(0.01％TFA)纯化，得到所需级分，将其冷冻干燥以得到为白色固体的化合物105-6((2S)-6-[(2S)-2,6-双(1-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)己烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(105-6，4.75g，2.505mmol，64.12％))。ESI m/z：566.2(M-200)/3+H)+、970.6(M/2+Na)+。
步骤5
向化合物105-6((2S)-6-[(2S)-2,6-双(1-{[(三级丁氧基)羰基]氨基}-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)己烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(105-6，4.75g，2.505mmol))的DCM(10mL)溶液中添加TFA(5mL，67.313mmol)。随后将溶液在室温下搅拌2小时、浓缩以移除有机溶剂，将粗残余物借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为无色油状物的化合物105-7((2S)-6-[(2S)-2,6-双(1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)己烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(105-7，3.95g，2.329mmol，92.97％))。ESI m/z：566.3(M/3+H)+。
步骤6
向化合物105-7((2S)-6-{[(2S)-2,6-双(1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24，27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酰氨基)己基]氨基}-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(105-7，3.95g，2.329mmol))的MeOH(90mL)溶液中分批添加D-葡萄糖(5.04g，27.948mmol)，并将混合物加热至回流，同时在N2氛围下搅拌30分钟。随后逐滴添加NaCNBH3(1.76g，27.948mmol)的MeOH(10mL)溶液。将反应混合物在该温度下搅拌18小时。随后将反应溶液借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到所需级分，将其冷冻干燥以得到为无色油状物的化合物105-8((2S)-6-[(2S)-2,6-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(105-8，4.13g，1.755mmol，75.36％))。ESI m/z：785.0(M/3+H)+。
步骤7
将化合物105-8((2S)-6-[(2S)-2,6-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44，45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19，22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(105-8，226.17mg，0.096mmol))、化合物105-9(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(105-9，90mg，0.080mmol))及DIPEA(20.64mg，0.160mmol)的无水DMF(3mL)溶液在室温下搅拌5分钟以允许起始酸充分溶解于溶剂，随后借由注射器逐滴添加HATU(36.55mg，0.096mmol)的无水DMF(1mL)溶液，历时10分钟。添加后，将所得溶液再搅拌2小时以实现完全反应。随后将反应溶液直接借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到所需级分，将其借由LabConc冻干以得到为白色固体的化合物105-10(N-[(1S)-5-[(2S)-2,6-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(105-10，180mg，0.052mmol，65.06％))的TFA盐。ESI m/z：865.5(M/4+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ10.07(s，1H)，8.36-8.08(m，4H)，7.98-7.88(m，5H)，7.83-7.79(m，1H)，7.74-7.65(m，3H)，7.58-7.56(m，3H)，7.43-7.39(m，2H)，7.34-7.24(m，8H)，7.20-7.13(m，1H)，6.00(t，J＝5.2Hz，1H)，5.51-5.36(m，6H)，5.09-4.94(m，2H)，4.94-4.70(m，4H)，4.70-4.38(m，14H)，4.33-4.14(m，7H)，4.04-3.93(m，6H)，3.79-3.73(m，4H)，3.68-3.64(m，4H)，3.61-3.55(m，18H)，3.52-3.46(m，96H)，3.25-3.12(m，13H)，3.06-2.83(m，13H)，2.43-2.37(m，3H)，2.30-2.26(m，3H)，2.16-2.04(m，2H)，2.04-1.91(m，2H)，1.83-1.15(m，25H)，1..05-0.97(m，6H)，0.97-0.73(m，26H)ppm。揭示了TFA中的一个羧基质子。
步骤8
将化合物105-10(((S)-1-(((S)-1-(((3S,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-侧氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧杂丁-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧杂丁-2-基)(甲基)氨基甲酸4-((2S,5S,8S,15S,62S,63R,64R,65R)-8-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-62,63,64,65,66-五羟基-5-异丙基-4,7,14,21-四侧氧基-15-((42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基)-60-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基)-2-(3-脲基丙基)-24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57-十二氧杂-3,6,13,20,60-五氮杂六十六烷酰氨基)苄基酯(105-10，180mg，0.052mmol))的DMF(1.8mL)溶液在室温下搅拌，并且添加二乙胺(0.2mL，1.941mmol)。将所得溶液搅拌1小时，直至反应完成。真空蒸发掉大部分二乙胺，并且将残余物借由反相快速层析(0.01％TFA)纯化，得到所需级分，将其冻干以得到为白色固体的化合物105-11(((S)-1-(((S)-1-(((3S,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-侧氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧杂丁-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧杂丁-2-基)(甲基)氨基甲酸4-((2S,5S,8S,15S,62S,63R,64R,65R)-8-氨基-62,63,64,65,66-五羟基-5-异丙基-4,7,14,21-四侧氧基-15-((42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基)-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31，34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基)-60-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基)-2-(3-脲基丙基)-24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57-十二氧杂-3,6,13,20,60-五氮杂六十六烷酰氨基)苄基酯(105-11，110mg，0.034mmol，65.31％))的TFA盐。ESI m/z：619.1(连接子片段，(M-717-26-18)/4+H))+，809.9(M/4+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO-d 6)δ10.10(s，1H)，8.43(d，J＝8.4Hz，1H)，8.36-8.33(m，1H)，8.15-8.10(m，5H)，8.01(d，J＝7.6Hz，1H)，7.94-7.91(m，1.5H)，7.85-7.83(m，1H)，7.67(d，J＝8.4Hz，0.5H)，7.59-7.57(m，2H)，7.35-7.24(m，6H)，7.20-7.13(m，1H)，6.07-6.05(m，1H)，5.53-5.38(m，6H)，5.09-4.94(m，2H)，4.94-4.42(m，18H)，4.30-4.13(m，4H)，4.04-3.93(m，6H)，3.85-3.81(m，1H)，3.81-3.73(m，5H)，3.73-3.64(m，5H)，3.61-3.55(m，18H)，3.55-3.48(m，88H)，3.39-3.29(m，10H)，3.24-3.12(m，12H)，3.06-2.83(m，11H)，2.44-2.38(m，3H)，2.38-2.22(m，4H)，2.15-2.05(m，2H)，2.05-1.94(m，2H)，1.85-1.64(m，6H)，1.64-1.41(m，6H)，1.41-1.16(m，12H)，1.05-0.97(m，6H)，0.97-0.75(m，26H)ppm。揭示了TFA上的三个羧基质子。
步骤9
将化合物105-11(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[(2S)-2,6-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25，28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(105-11，100mg，0.031mmol))及DIPEA(7.97mg，0.062mmol)的无水DMF(2mL)溶液在室温下搅拌，随后借由注射器逐滴添加6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(11.43mg，0.037mmol)的无水DMF(2mL)溶液，历时5分钟。添加后，将所得溶液再搅拌6小时，直至起始胺几乎耗尽。随后将所得溶液直接借由制备型HPLC(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的PB105(N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3S,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1R,2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯啶-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-侧氧基庚-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-[(2S)-2,6-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-2-[6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(PB105，65mg，0.019mmol，61.34％))的TFA盐。ESI m/z：667.8(连接子片段，(M-717-26-18)/4+H)+；858.3(M/4+H)+。保留时间6.042分钟(HPLC)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.05(s，1H)，8.38-8.30(m，0.5H)，8.17-8.10(m，3.5H)，7.99-7.91(m，2.5H)，7.91-7.82(m，2H)，7.68-7.65(m，1.5H)，7.59-7.57(m，2H)，7.34-7.24(m，6H)，7.19-7.15(m，1H)，7.00(s，2H)，6.08-5.96(m，1H)，5.53-5.37(m，6H)，5.14-4.36(m，22H)，4.29-4.13(m，5H)，4.04-3.93(m，7H)，3.82-3.73(m，5H)，3.73-3.66(m，5H)，3.62-3.55(m，20H)，3.52-3.41(m，88H)，3.36-3.24(m，10H)，3.24-3.12(m，12H)，3.12-2.83(m，11H)，2.43-2.35(m，3H)，2.29(t，J＝6.8Hz，2H)，2.14-1.92(m，6H)，1.83-1.46(m，16H)，1.46-1.16(m，12H)，1.05-0.97(m，6H)，0.89-0.75(m，26H)ppm。揭示了TFA上的两个羧基质子。
实例37：含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物连接子(PB106)的制备
含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB106)制备如下：
步骤1
将化合物106-1((2S)-6-[(2S)-2,6-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44，45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16，19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-2-({[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}氨基)己酸(106-1，200mg，0.085mmol))、化合物106-2(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(106-2，71.49mg，0.085mmol))及HATU(32.32mg，0.085mmol)、DIPEA(21.97mg，0.170mmol)的DMF(2mL)溶液在室温下搅拌2小时至完成。将反应混合物借由反相快速层析(0.01％TFA)纯化，得到所需级分，将其冷冻干燥以得到为白色固体的化合物106-3(N-[(1S)-5-[(2S)-2,6-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯(106-3，144mg，0.045mmol，53.35％))。ESI m/z：794.8(M/4+H)+，1059.3(M/3+H)+。
步骤2
将化合物106-3(N-[(1S)-5-[(2S)-2,6-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酸化合物(9H-茀-9-基)甲酯(106-3，144mg，0.045mmol))及二乙胺(0.2mL，0.180mmol)的DMF(2mL)溶液在室温下搅拌2小时。随后将溶液借由反相快速层析(0.01％ TFA)纯化，得到为白色固体的化合物106-4(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[(2S)-2,6-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34，37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(106-4，70mg，0.024mmol，52.29％))。ESI m/z：985.3(M/3+H)+。
步骤3
将化合物106-4(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[(2S)-2,6-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(106-4，40mg，0.014mmol))、化合物106-5(6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二侧氧基吡咯啶-1-基酯(106-5，17.26mg，0.056mmol))及DIPEA(7.24mg，0.056mmol)的DMF(2mL)溶液在室温下搅拌2小时至完成。随后将反应混合物借由制备型HPLC(0.01％ TFA)纯化，得到所需级分，将其借由LabConc冷冻干燥以得到为淡黄色固体的PB106(N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二侧氧基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.0^{2,14}.0^{4,13}.0^{6,11}.0^{20,24}]二十四烷-1,6(11),12,14，16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-6-[(2S)-2,6-双[(42S,43R,44R,45R)-42,43,44,45,46-五羟基-40-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂-40-氮杂四十六烷酰氨基]己烷酰氨基]-2-[6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰氨基]己烷酰氨基]-3-甲基丁酰氨基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊烷酰氨基]苯基}甲酯(PB106，26mg，0.008mmol，59.02％))。ESI m/z：787.5(M/4+H)+，1049.9(M/3+H)+。保留时间5.626分钟(HPLC)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.05(s，1H)，8.22-8.05(m，4H)，8.01-7.93(m，2H)，7.89-7.77(m，3H)，7.66(d，J＝8.0Hz，1H)，7.60(d，J＝8.2Hz，2H)，7.36(d，J＝8.4Hz，2H)，7.32(s，1H)，7.00(s，2H)，6.56(s，1H)，6.01(d，J＝14.8Hz，1H)，5.50-5.39(m，8H)，5.33-5.24(m，3H)，5.08(s，2H)，4.88-4.67(m，4H)，4.67-4.38(m，12H)，4.38-4.13(m，4H)，4.00-3.94(m，4H)，3.83-3.77(m，4H)，3.72-3.63(m，4H)，3.63-3.56(m，18H)，3.55-3.46(m，88H)，3.38-3.14(m，9H)，3.14-2.91(m，10H)，2.38-2.30(m，5H)，2.28(t，J＝6.8Hz，2H)，2.23-2.08(m，5H)，2.02-1.83(m，4H)，1.72-1.53(m，5H)，1.46-1.28(m，13H)，1.28-1.12(m，7H)，0.90-0.80(m，9H)ppm。还揭示了TFA上的两个羧基质子。实例38：含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物连接子(PB107)的制备
含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB107)制备如下：
步骤1
将化合物107-1(0.5g，0.536mmol)及D-葡萄糖(0.77g，4.291mmol)的无水甲醇(50mL)溶液在50℃下加热30分钟，随后添加NaCNBH3(0.27g，4.291mmol)。将所得溶液在70℃下再搅拌4天，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物的质量。随后将反应溶液浓缩并借由反相液相层析纯化，得到为白色固体的化合物107-2(0.3g，0.189mmol，35.29％)。纯度＝85％-90％。
步骤2
将化合物107-3(0.16g，0.189mmol)、化合物107-2(0.3g，0.189mmol)及HATU(72mg，0.189mmol)的无水DMF(4mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加DIPEA(74mg，0.567mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析纯化，得到为白色固体的化合物107-4(140mg，0.058mmol，30.50％)。纯度＝90％-95％。
步骤3
将化合物107-4(140mg，0.058mmol)及TFA(1mL)的无水DCM(4mL)溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且形成所需产物(m/z＝1156＝2311/2+H)以及糖酯化产物(TFA与糖单元中的羟基基团稠合，单酯，m/z＝(2311+96)/3+H＝803)。将完成的反应溶液浓缩至干燥，随后再溶解于THF(4mL)及水(2mL)中，用饱和碳酸钠水溶液处理以调节pH至8-9。将所得溶液在室温下搅拌30分钟以实现完全水解。随后将溶液用稀释的HCl调节至pH至2-3并浓缩，将残余物借由反相液相层析纯化，得到为白色固体的化合物107-5(113mg，0.049mmol，84.32％)。纯度＝90％-95％。
步骤4
将化合物107-5(113mg，0.049mmol)及DIPEA(19mg，0.147mmol)的无水DMF(2mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加化合物107-6(23mg，0.074mmol)的无水DMF(1mL)溶液，历时5分钟。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物的质量。随后将反应溶液借由制备型HPLC纯化，得到为白色固体的PB107(12mg，0.005mmol，9.84％)。LCMS，m/z＝835.93(M/3+H)+。
实例39：含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物连接子(PB108)的制备
含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB108)制备如下：
步骤1
将化合物108-1(2g，3.646mmol)及HOSu(0.84g，7.291mmol)的无水DCM(30mL)溶液在室温下搅拌，随后添加EDCI(1.4g，7.291mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物。用水洗涤所得溶液，收集有机层，随后用DCM(40mL*2)萃取水相。将合并的有机层经硫酸钠干燥并过滤、浓缩至干燥，得到为白色固体的化合物108-2(1.8g，2.788mmol，76.60％)，将其原样用于下一步骤。纯度＝85％-90％。
步骤2
将化合物108-2(0.76g，1.182mmol)及化合物108-3(1g，1.182mmol)的无水DMF(5mL)溶液在室温下搅拌，随后添加DIPEA(0.3g，2.364mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物。将反应溶液终止并直接借由反相液相层析终止纯化，得到为白色固体的化合物108-4(1.4g，1.017mmol，85.89％)。纯度＝90％-95％。
步骤3
将化合物108-4(1.4g，1.017mmol)及DEA(5mL)的无水DMF(20mL)溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且检测到所需产物。随后将溶液浓缩至干燥，得到为黄色油状物的化合物108-5(0.9g，0.966mmol，94.74％)，将其原样用于下一步骤。纯度＝90％-95％。
步骤4
将化合物108-5(0.9g，0.966mmol)及D-葡萄糖(1.04g，5.793mmol)的无水甲醇(50mL)溶液在50℃下加热30分钟，随后添加NaCNBH3(0.36g，5.793mmol)。将所得溶液在70℃下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物的质量。随后将反应溶液浓缩并借由反相液相层析纯化，得到为白色固体的化合物108-6(0.7g，0.492mmol，50.72％)。纯度＝85％-90％。
步骤5
将化合物108-7(0.21g，0.250mmol)、化合物108-6(0.36g，0.250mmol)及HATU(93mg，0.250mmol)的无水DMF(4mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加DIPEA(95mg，0.750mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析纯化，得到为白色固体的化合物108-8(0.21g，0.093mmol，37.50％)。纯度＝90％-95％。
步骤6
将化合物108-8(0.21g，0.093mmol)及TFA(1mL)的无水DCM(4mL)溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且形成所需产物(m/z＝1074＝2147/2+H)以及糖酯化产物(TFA与糖单元中的羟基基团稠合，单酯，m/z＝(2147+96)/2+H＝1122)。将完成的反应溶液浓缩至干燥，随后再溶解于THF(4mL)及水(2mL)中，用饱和碳酸钠水溶液处理以调节pH至8-9。将所得溶液在室温下搅拌30分钟以实现完全水解。随后将溶液用稀释的HCl调节至pH至2-3并浓缩，将残余物借由反相液相层析纯化，得到为白色固体的化合物108-9(160mg，0.075mmol，80.65％)。纯度＝90％-95％。
步骤7
将化合物108-9(160mg，0.075mmol)及DIPEA(28.8mg，0.224mmol)的无水DMF(2mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加化合物108-10(34.4mg，0.113mmol)的无水DMF(1mL)溶液，历时5分钟。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物的质量。随后将反应溶液借由制备型HPLC纯化，得到为白色固体的PB108(15mg，0.006mmol，8.62％)。LCMS，m/z＝1171.24(M/2+H)+。
实例40：含有PEG单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物连接子(PB109)的制备
含有PEG单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物-连接子(PB109)制备如下：
步骤1
将化合物109-1(170mg，0.107mmol)、化合物109-2(120mg，0.107mmol)及HATU(41mg，0.107mmol)的无水DMF(4mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加DIPEA(41.4mg，0.321mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析纯化，得到为白色固体的化合物109-3(103mg，0.038mmol，35.76％)。纯度＝90％-95％。
步骤2
将化合物109-3(103mg，0.038mmol)及TFA(1mL)的无水DCM(4mL)溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且形成所需产物(m/z＝865＝2594/3+H)以及糖酯化产物(TFA与糖单元中的羟基基团稠合，单酯，m/z＝(2594+96)/3+H＝897)。将完成的反应溶液浓缩至干燥，随后再溶解于THF(4mL)及水(2mL)中，用饱和碳酸钠水溶液处理以调节pH至8-9。将所得溶液在室温下搅拌30分钟以实现完全水解。随后将溶液用稀释的HCl调节至pH至6-7并浓缩，将残余物借由反相液相层析纯化，得到为白色固体的化合物109-4(45mg，0.017mmol，45.45％)。纯度＝90％-95％。
步骤3
将化合物109-4(45mg，0.017mmol)及DIPEA(6.7mg，0.052mmol)的无水DMF(2mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加化合物109-5(8.0mg，0.026mmol)的无水DMF(1mL)溶液，历时5分钟。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物的质量。随后将反应溶液借由制备型HPLC纯化，得到为白色固体的PB109(6mg，0.002mmol，12.41％)。LCMS，m/z＝930.16(M/3+H)+。
实例41：含有PEG单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物-连接子(PB110或LD110)的制备
含有PEG单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物-连接子(PB110或LD110)制备如下：
步骤1
将化合物110-1(5g，8.671mmol)及HOSu(2.0g，17.342mmol)的无水DCM(150mL)溶液在室温下搅拌，随后添加EDCI(3.3g，17.342mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物。用水洗涤所得溶液，收集有机层，随后用DCM(100mL*2)萃取水相。将合并的有机层经硫酸钠干燥并过滤、浓缩至干燥，得到为白色固体的化合物110-2(4.7g，6.976mmol，80.48％)，将其原样用于下一步骤。纯度＝85％-90％。
步骤2
将化合物110-3(5g，5.953mmol)及DEA(5mL)的无水DMF(20mL)溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且检测到所需产物。随后将溶液浓缩至干燥，得到为无色油状物的化合物110-4(3.4g，5.504mmol，92.39％)，将其原样用于下一步骤。纯度＝90％-95％。
步骤3
将化合物110-2(1g，2.491mmol)及化合物110-4(1.5g，2.491mmol)的无水DMF(10mL)溶液在室温下搅拌，随后添加DIPEA(0.64g，4.982mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物。将反应溶液终止并直接借由反相液相层析终止纯化，得到为无色油状物的化合物110-5(1.3g，1.438mmol，57.78％)。纯度＝90％-95％。
步骤4
将化合物110-5(1.3g，1.438mmol)及TFA(4mL)的无水DCM(16mL)溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且检测到所需产物。随后将溶液浓缩至干燥，得到为黄色油状物的化合物110-6(910mg，1.293mmol，89.92％)，将其原样用于下一步骤。纯度＝85％-90％。
步骤5
将化合物110-6(910mg，1.293mmol)及D-葡萄糖(1.4g，7.771mmol)的无水甲醇(40mL)溶液在50℃下加热30分钟，随后添加NaCNBH3(488mg，7.766mmol)。将所得溶液在70℃下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物的质量。随后将反应溶液浓缩并借由反相液相层析纯化，得到为白色固体的化合物110-7(320mg，0.268mmol，20.70％)。纯度＝85％-90％。
步骤6
将化合物110-2(1g，2.491mmol)及化合物110-8(0.92g，2.491mmol)的无水DMF(10mL)溶液在室温下搅拌，随后添加DIPEA(0.64g，4.982mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物。将反应溶液终止并直接借由反相液相层析终止纯化，得到为白色固体的化合物110-9(1.4g，2.138mmol，85.89％)。纯度＝90％-95％。
步骤7
将化合物110-9(0.58g，0.886mmol)、化合物110-10(1g，0.890mmol)及HATU(0.34g，0.894mmol)的无水DMF(10mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加DIPEA(0.35g，2.708mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析纯化，得到为白色固体的化合物110-11(240mg，0.136mmol，15.29％)。纯度＝90％-95％。
步骤8
将化合物110-11(240mg，0.136mmol)及TFA(1mL)的无水DCM(4mL)溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且检测到所需产物。随后将溶液浓缩至干燥，得到为黄色油状物的化合物110-12(195mg，0.125mmol，91.68％)，将其原样用于下一步骤。纯度＝85％-90％。
步骤9
将化合物110-12(195mg，0.125mmol)、化合物110-13(299mg，0.250mmol)及HATU(95mg，0.250mmol)的无水DMF(5mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加DIPEA(97mg，0.751mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析纯化，得到为白色固体的化合物110-14(210mg，0.053mmol，42.89％)。纯度＝90％-95％。
步骤10
将化合物110-14(210mg，0.053mmol)及DEA(1mL)的无水DMF(4mL)溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且检测到所需产物。随后将溶液浓缩至干燥，得到为无色油状物的化合物110-15(175mg，0.047mmol，88.38％)，将其原样用于下一步骤。纯度＝90％-95％。
步骤11
将化合物110-15(175mg，0.047mmol)及DIPEA(12.2mg，0.094mmol)的无水DMF(2mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加化合物110-16(21.9mg，0.071mmol)的无水DMF(1mL)溶液，历时5分钟。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物的质量。随后将反应溶液借由制备型HPLC纯化，得到为白色固体的PB110(73mg，0.019mmol，39.63％)。LCMS，m/z＝972.82(M/4+H)+。
实例42：含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物连接子(PB111或LD111)的制备
含有PEG单元及连接至依喜替康的可裂解连接子的药物-连接子(PB111或LD111)制备如下：
步骤1
将化合物111-1(5g，14.433mmol)及HOSu(3.3g，28.673mmol)的无水DCM(60mL)溶液在室温下搅拌，随后添加EDCI(5.5g，28.690mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物。用水洗涤所得溶液，收集有机层，随后用DCM(50mL×2)萃取水相。将合并的有机层经硫酸钠干燥并过滤、浓缩至干燥，得到为白色固体的化合物111-2(4.8g，10.823mmol，75.00％)，将其原样用于下一步骤。纯度＝85％-90％。
步骤2
将化合物111-2(4.8g，10.823mmol)及化合物111-3(3.99g，10.829mmol)的无水DMF(20mL)溶液在室温下搅拌，随后添加DIPEA(2.8g，21.665mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物。将反应溶液终止并直接借由反相液相层析终止纯化，得到为白色固体的化合物111-4(5.1g，7.319mmol，67.64％)。纯度＝90％-95％。
步骤3
将化合物111-4(0.83g，1.191mmol)、化合物111-5(1g，1.189mmol)及HATU(0.45g，1.183mmol)的无水DMF(10mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加DIPEA(0.46g，3.559mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析纯化，得到为白色固体的化合物111-6(1.1g，0.724mmol，61.11％)。纯度＝90％-95％。
步骤4
将化合物111-6(1.1g，0.724mmol)及TFA(2mL)的无水DCM(8mL)溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且检测到所需产物。随后将溶液浓缩至干燥，得到为黄色油状物的化合物111-7(0.9g，0.682mmol，94.24％)，将其原样用于下一步骤。纯度＝85％-90％。
步骤5
将化合物111-7(150mg，0.114mmol)、化合物111-8(272mg，0.227mmol)及HATU(87mg，0.229mmol)的无水DMF(5mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加DIPEA(89mg，0.689mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析纯化，得到为白色固体的化合物111-9(110mg，0.030mmol，26.38％)。纯度＝90％-95％。
步骤6
将化合物111-9(110mg，0.030mmol)及DEA(1mL)的无水DMF(4mL)溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且检测到所需产物。随后将溶液浓缩至干燥，得到为无色油状物的化合物111-10(75mg，0.022mmol，72.82％)，将其原样用于下一步骤。纯度＝90％-95％。
步骤7
将化合物111-10(75mg，0.022mmol)及DIPEA(5.6mg，0.043mmol)的无水DMF(2mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加化合物111-11(10mg，0.032mmol)的无水DMF(1mL)溶液，历时5分钟。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物的质量。随后将反应溶液借由制备型HPLC纯化，得到为白色固体的PB111(22mg，0.006mmol，27.78％)。LCMS，m/z＝912.79(M/4+H)+。
实例43：含有PEG单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物连接子(PB112)的制备
含有PEG单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物-连接子(PB112)制备如下：
步骤1
将化合物112-1(100mg，0.046mmol)、化合物112-2(25.2mg，0.046mmol)及HATU(17.5mg，0.046mmol)的无水DMF(3mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加DIPEA(17.8mg，0.138mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析纯化，得到为白色固体的化合物112-3(85mg，0.031mmol，68.55％)。纯度＝90％-95％。
步骤2
将化合物112-3(85mg，0.031mmol)及DEA(1mL)的无水DMF(4mL)溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且检测到所需产物。随后将溶液浓缩至干燥，得到为无色油状物的化合物112-4(65mg，0.029mmol，91.47％)，将其原样用于下一步骤。纯度＝90％-95％。
步骤3
将化合物112-4(65mg，0.029mmol)及DIPEA(14.8mg，0.116mmol)的无水DMF(2mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加化合物112-5(26.5mg，0.087mmol)的无水DMF(1mL)溶液，历时5分钟。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物的质量。随后将反应溶液借由制备型HPLC纯化，得到为白色固体的PB112(11mg，0.004mmol，14.47％)。LCMS，m/z＝885.71(M/3+H)+。
实例44：含有PEG单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物连接子(PB113)的制备
含有PEG单元及连接至MMAE的可裂解连接子的药物-连接子(PB113)制备如下：
步骤1
将化合物113-1(20g，0.078mol)及RuCl3(0.4g，2％)的MeCN(100mL)及H2O(200mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后分几批添加NaIO4(66.52g，0.311mol)溶液。将所得溶液在50℃下再搅拌2小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且检测到所需产物。添加甲醇(20mL)，蒸发溶液并将残余物在乙腈(100ml)中在5℃下洗涤30分钟。过滤溶液并将滤液浓缩至干燥，以得到为白色固体的化合物113-2(9.5g，0.039mol，50.67％)。纯度＝50％-60％。
步骤2
将化合物113-2(5g，0.021mol)、化合物113-3(1g，1.95mmol)及HATU(0.74g，1.95mmol)的无水DMF(20mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加DIPEA(0.75g，5.85mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析纯化，得到为白色固体的化合物113-4(410mg，0.556mmol，28.67％)。纯度＝90％-95％。
步骤3
将化合物113-4(20.6mg，0.028mol)、化合物113-5(60mg，0.028mmol)及HATU(10.5mg，0.028mmol)的无水DMF(2mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加DIPEA(10.7mg，0.084mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析纯化，得到为白色固体的化合物113-6(41mg，0.014mmol，51.38％)。纯度＝90％-95％。
步骤4
将化合物113-6(41mg，0.014mmol)及DEA(1mL)的无水DMF(4mL)溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且检测到所需产物。随后将溶液浓缩至干燥，得到为黄色油状物的化合物113-7(31mg，0.012mmol，81.79％)，将其原样用于下一步骤。纯度＝90％-95％。
步骤5
将化合物113-7(31mg，0.012mmol)及DIPEA(4.5mg，0.035mmol)的无水DMF(1mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加化合物113-8(5.4mg，0.017mmol)的无水DMF(1mL)溶液，历时2分钟。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物的质量。用甲酸中和所得溶液以调节pH至6-7。随后将反应溶液借由制备型HPLC纯化，得到为白色固体的PB113(21mg，0.007mmol，63.25％)。LCMS，m/z＝957.42(M/3+H)+。
实例45：连接至依喜替康的药物-连接子(PB114)的制备
连接至依喜替康的药物-连接子(PB114)制备如下：
步骤1
将化合物114-1(5.8g，5.431mmol)及DIPEA(2.1g，16.249mmol)的无水DMF(30mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加化合物114-2(2.5g，8.109mmol)的无水DMF(10mL)溶液，历时5分钟。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物的质量。随后蒸发大部分的DMF及DIPEA，并且将残余物在乙腈(150ml)中在5℃下洗涤30分钟。过滤溶液，用乙腈洗涤滤饼，得到为黄色固体的化合物114-3(5.2g，4.122mmol，75.91％)。纯度＝85％-95％。
步骤2
将化合物114-3(5.2g，4.122mmol)及DCA(10mL)的无水DCM(90mL)溶液在室温下搅拌2小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且检测到所需产物。将反应溶液浓缩至干燥并且直接借由反相液相层析纯化，得到为黄色固体的化合物114-4(2.5g，2.488mmol，60.24％)。纯度＝85％-95％。
步骤3
将化合物114-4(500mg，0.497mmol)、化合物114-5(131mg，0.498mmol)及HATU(189mg，0.497mmol)的无水DMF(5mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加DIPEA(193mg，1.493mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析纯化，得到为黄色固体的化合物114-6(160mg，0.128mmol，25.72％)。纯度＝85％-95％。
步骤4
将化合物114-6(160mg，0.128mmol)及TFA(1mL)的无水DCM(4mL)溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且检测到所需产物。将反应溶液直接借由反相液相层析纯化，得到为黄色固体的化合物114-7(50mg，0.043mmol，33.97％)。纯度＝85％-95％。
步骤5
将化合物114-8(16.7mg，0.065mmol)及DIPEA(22.5mg，0.174mmol)的无水DMF(2mL)溶液在室温下搅拌10分钟，随后借由注射器逐滴添加化合物114-7(50mg，0.043mmol)的无水DMF(2mL)溶液，历时5分钟。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物的质量。随后将反应溶液借由制备型HPLC纯化，得到为黄色固体的PB114(20mg，0.014mmol，32.31％)。LCMS，m/z＝713.19(M/2+H)+。
实例46：连接至依喜替康的药物-连接子(PB115)的制备
连接至依喜替康的药物-连接子(PB115)制备如下：
步骤1
将化合物115-1(10g，0.012mol)及DIPEA(4.6g，0.036mol)的无水DMF(60mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加PNPC(3.67g，0.012mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物。随后蒸发大部分的DMF及DIPEA，并且将残余物在乙腈(200ml)中在5℃下洗涤30分钟。过滤溶液，用乙腈洗涤滤饼，得到为灰色固体的化合物115-2(8.4g，8.449mmol，70.06％)。纯度＝85％-95％。
步骤2
将化合物115-2(8.4g，8.449mmol)、依喜替康(4.5g，8.449mmol)及HOBT(1.1g，8.449mmol)的无水DMF(50mL)的溶液在室温下搅拌，随后添加DIPEA(3.3g，25.347mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物。随后蒸发大部分的DMF及DIPEA，并且将残余物在乙腈(100ml)中在5℃下洗涤30分钟。过滤溶液，用乙腈洗涤滤饼，得到为灰色固体的化合物115-3(9.3g，7.207mmol，85.32％)。纯度＝85％-95％。
步骤3
将化合物115-3(9.3g，7.207mmol)及DEA(10mL)的无水DMF(40mL)溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且检测到所需产物。随后蒸发大部分的DMF及DEA，并且将残余物在乙腈(200ml)中在5℃下洗涤30分钟。过滤溶液，用乙腈洗涤滤饼，得到为灰色固体的化合物115-4(5.8g，5.429mmol，75.32％)。纯度＝85％-95％。
步骤4
将化合物115-4(1.6g，1.498mmol)、化合物115-5(0.53g，1.498mmol)及HATU(0.57g，1.498mmol)的无水DMF(10mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加DIPEA(0.58g，4.494mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示反应完成。随后蒸发大部分的DMF及DIPEA，并且将残余物在乙腈(50ml)中在5℃下洗涤30分钟。过滤溶液，用乙腈洗涤滤饼，得到为灰色固体的化合物115-6(1.7g，1.210mmol，80.95％)。纯度＝85％-95％。
步骤5
将化合物115-6(1.7g，1.210mmol)及DEA(2mL)的无水DMF(8mL)溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且检测到所需产物。随后蒸发大部分的DMF及DEA，并且将残余物在乙腈(50ml)中在5℃下洗涤30分钟。过滤溶液，用乙腈洗涤滤饼，得到为灰色固体的化合物115-7(1.1g，0.930mmol，76.92％)。纯度＝85％-95％。
步骤6
将化合物115-7(1.1g，0.930mmol)及DIPEA(0.36g，2.791mmol)的无水DMF(5mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加化合物115-8(0.43g，1.396mmol)的无水DMF(5mL)溶液，历时2分钟。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物的质量。随后蒸发大部分的DMF及DIPEA，并且将残余物在乙腈(30ml)中在5℃下洗涤30分钟。过滤溶液，用乙腈洗涤滤饼，得到为灰色固体的化合物115-9(1.1g，0.800mmol，85.94％)。纯度＝80％-90％。
步骤7
将化合物115-9(1.1g，0.800mmol)及DCA(2mL)的无水DCM(18mL)溶液在室温下搅拌2小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且检测到所需产物。将反应溶液浓缩至干燥并且直接借由反相液相层析纯化，得到为白色固体的化合物115-10(310mg，0.277mmol，34.64％)。纯度＝85％-95％。
步骤8
将化合物115-10(141.9mg，0.554mmol)及DIPEA(143.2mg，1.108mmol)的无水DMF(2mL)溶液在室温下搅拌20钟，随后借由注射器逐滴添加化合物115-11(310mg，0.277mmol)的无水DMF(5mL)溶液，历时5分钟。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物的质量。随后将反应溶液借由制备型HPLC纯化，得到为白色固体的PB115(50mg，0.036mmol，12.95％)。LCMS，m/z＝697.66(M/2+H)+。
实例47：连接至帕博西尼的药物-连接子(PB116)的制备
连接至帕博西尼的药物-连接子(PB116)制备如下：
步骤1
将化合物116-1(685.4mg，0.894mmol)、帕博西尼(400mg，0.894mmol)及HOBT(120.8mg，0.894mmol)的无水DMF(60mL)的溶液在室温下搅拌，随后添加DIPEA(231mg，1.787mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物。随后蒸发大部分的DMF及DIPEA，并且将残余物在乙腈(20ml)中在5℃下洗涤30分钟。过滤溶液，用乙腈洗涤滤饼，得到为黄色固体的化合物116-2(720mg，0.670mmol，74.92％)。纯度＝90％-95％。
步骤2
将化合物116-2(720mg，0.670mmol)及DEA(1mL)的无水DMF(4mL)溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且检测到所需产物。随后蒸发大部分的DMF及DEA，并且将残余物在乙腈(50ml)中在5℃下洗涤30分钟。过滤溶液，用乙腈洗涤滤饼，得到为黄色固体的化合物116-3(510mg，0.598mmol，89.32％)。纯度＝95％-95％。
步骤3
将化合物116-3(300mg，0.352mmol)及DIPEA(136.5mg，1.056mmol)的无水DMF(3mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加化合物116-4(162.5mg，0.527mmol)的无水DMF(2mL)溶液，历时5分钟。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物的质量。随后将反应溶液借由制备型HPLC纯化，得到为黄色固体的化合物PB116(210mg，0.201mmol，57.08％)。LCMS，m/z＝1046.59(M+H)+。
实例48：含有PEG单元及连接至帕博西尼的可裂解连接子的药物连接子(PB117)的制备
含有PEG单元及连接至帕博西尼的可裂解连接子的药物-连接子(PB117)制备如下：
步骤1
将化合物117-1(207mg，0.176mmol)、化合物117-2(150mg，0.176mmol)及HATU(66.8mg，0.176mmol)的无水DMF(2mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加DIPEA(68.1mg，0.527mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析纯化，得到为黄色固体的化合物117-3(210mg，0.105mmol，59.49％)。纯度＝90％-95％。
步骤2
将化合物117-3(210mg，0.105mmol)及TFA(2mL)的无水DCM(8mL)溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且形成所需产物(m/z＝637＝1909/3+H)以及糖酯化产物(TFA与糖单元中的羟基基团稠合，单酯，m/z＝(1909+96)/3+H＝669)。将完成的反应溶液浓缩至干燥，随后再溶解于THF(4mL)及水(2mL)中，用饱和碳酸钠水溶液处理以调节pH至8-9。将所得溶液在室温下搅拌30分钟以实现完全水解。随后将溶液用稀释的TFA中和并浓缩，将残余物借由反相液相层析纯化，得到为黄色固体的化合物117-4(120mg，0.063mmol，60.15％)。纯度＝90％-95％。
步骤3
将化合物117-4(120mg，0.063mmol)及DIPEA(24.3mg，0.189mmol)的无水DMF(3mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加化合物117-5(29.0mg，0.094mmol)的无水DMF(2mL)溶液，历时5分钟。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物的质量。随后将反应溶液借由制备型HPLC纯化，得到为黄色固体的PB117(40mg，0.019mmol，30.30％)。LCMS，m/z＝1052.11(M/2+H)+。
实例49：连接至T7-2的药物-连接子(PB118)的制备
连接至T7-2的药物-连接子(PB118)制备如下：
步骤1
将T7-2(300mg，0.951mmol)及DIPEA(737.8mg，5.706mmol)的无水DMF(6mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加PNPC(868.26mg，2.853mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物。随后蒸发大部分的DMF及DIPEA，并且将残余物在乙腈(50ml)中在5℃下洗涤30分钟。过滤溶液，用乙腈洗涤滤饼，得到为白色固体的化合物118-1(270mg，0.562mmol，59.08％)。纯度＝90％-93％。
步骤2
将化合物118-1(270mg，0.562mmol)、N-Boc-N,N'-二甲基乙二胺(105.80mg，0.562mmol)及HOBT(75.94mg，0.562mmol)的无水DMF(5mL)的溶液在室温下搅拌，随后添加DIPEA(217.90mg，1.686mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物。将反应溶液终止并直接借由反相液相层析终止纯化，得到为白色固体的化合物118-2(210mg，0.397mmol，70.71％)。纯度＝90％-95％。
步骤3
将化合物118-2(210mg，0.397mmol)及TFA(1mL)的无水DCM(4mL)溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且检测到所需产物。随后将溶液浓缩至干燥，得到为黄色油状物的化合物118-3(170mg，0.397mmol，100％)，将其原样用于下一步骤。纯度＝85％-90％。
步骤4
将化合物118-3(170mg，0.396mmol)、化合物118-4(303.65mg，0.396mmol)及HOBT(53.51mg，0.396mmol)的无水DMF(5mL)的溶液在室温下搅拌，随后添加DIPEA(153.54mg，1.188mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物。将反应溶液终止并直接借由反相液相层析终止纯化，得到为白色固体的化合物118-5(95mg，0.090mmol，22.73％)。纯度＝80％-90％。
步骤5
将化合物118-5(95mg，0.090mmol)及DEA(1mL)的无水DMF(4mL)溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且检测到所需产物。随后将溶液浓缩至干燥，得到为无色油状物的化合物118-6(75mg，0.090mmol，100％)，将其原样用于下一步骤。纯度＝80％-90％。
步骤6
将化合物118-6(75mg，0.090mmol)及DIPEA(34.83mg，0.270mmol)的无水DMF(1mL)溶液在室温下搅拌1分钟，随后借由注射器逐滴添加化合物118-7(41.54mg，0.135mmol)的无水DMF(5mL)溶液，历时2分钟。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物的质量。用甲酸中和所得溶液以调节pH至6-7。随后将反应溶液借由制备型HPLC纯化，得到为白色固体的化合物PB118(10mg，0.001mmol，10.87％)。LCMS，m/z＝1028.55(M+H)+。
实例50：含有PEG单元及连接至T7-2的可裂解连接子的药物连接子(PB119)的制备
含有PEG单元及连接至T7-2的可裂解连接子的药物-连接子(PB119)制备如下：
步骤1
将化合物119-1(154.7mg，0.132mmol)、化合物119-2(110mg，0.132mmol)及HATU(50.1mg，0.132mmol)的无水DMF(2mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加DIPEA(51.1mg，0.395mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析纯化，得到为白色固体的化合物119-3(75mg，0.038mmol，28.63％)。纯度＝90％-95％。
步骤2
将化合物119-3(75mg，0.038mmol)及TFA(1mL)的无水DCM(4mL)溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且形成所需产物(m/z＝631＝1891/3+H)以及糖酯化产物(TFA与糖单元中的羟基基团稠合，单酯，m/z＝(1891+96)/3+H＝663)。将完成的反应溶液浓缩至干燥，随后再溶解于THF(4mL)及水(2mL)中，用饱和碳酸钠水溶液处理以调节pH至8-9。将所得溶液在室温下搅拌30分钟以实现完全水解。随后将溶液用稀释的TFA中和并浓缩，将残余物借由反相液相层析纯化，得到为白色固体的化合物119-4(41mg，0.022mmol，57.75％)。纯度＝80％-85％。
步骤3
将化合物119-4(41mg，0.022mmol)及DIPEA(8.5mg，0.066mmol)的无水DMF(2mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加化合物119-5(10.0mg，0.033mmol)的无水DMF(1mL)溶液，历时5分钟。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物的质量。随后将反应溶液借由制备型HPLC纯化，得到为白色固体的化合物PB119(9mg，0.004mmol，19.92％)。LCMS，m/z＝1043.05(M/2+H)+。
实例51：含有PEG单元及连接至T7-1的可裂解连接子的药物连接子(PB120)的制备
含有PEG单元及连接至T7-1的可裂解连接子的药物-连接子(PB120)制备如下：
步骤1
将T7-1(3g，9.574mmol)及DIPEA(7.4g，57.444mmol)的无水DMF(30mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加PNPC(8.7g，28.722mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物。随后蒸发大部分的DMF及DIPEA，并且将残余物在乙腈(50ml)中在5℃下洗涤30分钟。过滤溶液，用乙腈洗涤滤饼，得到为白色固体的化合物120-1(4.1g，8.569mmol，89.52％)。纯度＝90％-95％。
步骤2
将化合物120-1(4.1g，8.569mmol)、N-Boc-N,N'-二甲基乙二胺(1.61g，8.569mmol)及HOBT(1.16g，8.569mmol)的无水DMF(10mL)的溶液在室温下搅拌，随后添加DIPEA(3.3g，25.707mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物。将反应溶液终止并直接借由反相液相层析终止纯化，得到为白色固体的化合物120-2(2.3g，4.359mmol，50.88％)。纯度＝90％-95％。
步骤3
将化合物120-2(2.3g，4.359mmol)及TFA(4mL)的无水DCM(16mL)溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且检测到所需产物。随后将溶液浓缩至干燥，得到为黄色油状物的化合物120-3(1.8g，4.210mmol，96.77％)，将其原样用于下一步骤。纯度＝85％-90％。
步骤4
将化合物120-3(1.8g，4.210mmol)、120-4(3.2g，4.210mmol)及HOBT(0.57g，4.210mmol)的无水DMF(15mL)的溶液在室温下搅拌，随后添加DIPEA(1.6g，12.630mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物。将反应溶液终止并直接借由反相液相层析终止纯化，得到为白色固体的化合物120-5(270mg，0.256mmol，6.14％)。纯度＝85％-90％。
步骤5
将化合物120-5(270mg，0.256mmol)及DEA(1mL)的无水DMF(4mL)溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且检测到所需产物。随后将溶液浓缩至干燥，得到为无色油状物的化合物120-6(210mg，0.252mmol，98.59％)，将其原样用于下一步骤。纯度＝85％-90％。
步骤6
将化合物120-7(296mg，0.252mmol)、120-6(210mg，0.252mmol)及HATU(95.9mg，0.252mmol)的无水DMF(5mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后添加DIPEA(97.8mg，0.756mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至LCMS指示反应完成。将反应溶液直接借由反相液相层析纯化，得到为白色固体的化合物120-8(120mg，0.060mmol，23.95％)。纯度＝90％-95％。
步骤7
将化合物120-8(120mg，0.060mmol)及TFA(1mL)的无水DCM(4mL)溶液在室温下搅拌1小时，直至LCMS指示所有起始胺耗尽并且形成所需产物(m/z＝630＝1889/3+H)以及糖酯化产物(TFA与糖单元中的羟基基团稠合，单酯，m/z＝(1889+96)/3+H＝662)。将完成的反应溶液浓缩至干燥，随后再溶解于THF(4mL)及水(2mL)中，用饱和碳酸钠水溶液处理以调节pH至8-9。将所得溶液在室温下搅拌30分钟以实现完全水解。随后将溶液用稀释的TFA中和并浓缩，将残余物借由反相液相层析纯化，得到为白色固体的化合物120-9(45mg，0.024mmol，39.47％)。纯度＝90％-95％。
步骤8
将化合物120-9(45mg，0.024mmol)及DIPEA(9.2mg，0.072mmol)的无水DMF(2mL)溶液在室温下搅拌5分钟，随后借由注射器逐滴添加化合物120-10(11.0mg，0.036mmol)的无水DMF(1mL)溶液，历时5分钟。将所得溶液在室温下再搅拌1小时，直至指示所有起始胺已耗尽并且检测到所需产物的质量。随后将反应溶液借由制备型HPLC纯化，得到为白色固体的PB120(15mg，0.007mmol，30.24％)。LCMS，m/z＝1042.19(M/2+H)+。
实例52：药物-连接子PB003及抗体的偶联物(PA003)的制备
将10mg/mL的抗体的pH 7.1PB 5mM EDTA缓冲液在25℃借由10mM TCEP还原120分钟。向还原的抗体溶液中添加6.5当量的5mM PB03的DMA溶液，将所得混合物在25℃下搅拌120分钟。用PD-10柱纯化ADC，将ADC命名为PA003。
实例53：药物-连接子PB004及抗体的偶联物(PA004)的制备
将10g/mL的抗体的pH 7.1PB 5mM EDTA缓冲液在25℃借由10mM TCEP还原120分钟。向还原的抗体溶液中添加6.5当量的5mM PB004的DMA溶液，将所得混合物在25℃下搅拌120分钟。用PD-10柱纯化ADC，将ADC命名为PA004。
实例54：药物-连接子PB008及抗体的偶联物(PA008)的制备
将10mg/mL的抗体的pH 7.1PB 5mM EDTA缓冲液在25℃借由10mM TCEP还原120分钟。向还原的抗体溶液中添加6.5当量的5mM PB08的DMA溶液，将所得混合物在25℃下搅拌120分钟。用PD-10柱纯化ADC，将ADC命名为PA008。
实例55：药物-连接子PB0038及抗体的偶联物(PA038)的制备
将10g/mL的抗体的pH 7.1PB 5mM EDTA缓冲液在25℃借由10mM TCEP还原120分钟。用PD-10管柱移除TCEP。向还原的抗体溶液中添加15当量的5mM PB038的DMA溶液，将所得混合物在25℃下搅拌120分钟。用PD-10柱纯化ADC。将ADC命名为PA038。
借由HIC-HPLC及SEC-HPLC分析ADC PA0038。
实例56：药物-连接子PB039及抗体的偶联物(PA039)的制备
将10g/mL的抗体的pH 7.1PB 5mM EDTA缓冲液在25℃借由10mM TCEP还原120分钟。用PD-10柱移除TCEP。向还原的抗体溶液中添加15当量的5mM PB039的DMA溶液，将所得混合物在25℃下搅拌120分钟。用PD-10柱纯化ADC。将ADC命名为PA039。
借由HIC-HPLC及SEC-HPLC分析ADC PA0039。
实例57：药物-连接子PB040及抗体的偶联物(PA040)的制备
将10g/mL的抗体的pH 7.1PB 5mM EDTA缓冲液在25℃借由10mM TCEP还原120分钟。用PD-10柱移除TCEP。向还原的抗体溶液中添加15当量的5mM PB040的DMA溶液，将所得混合物在25℃下搅拌120分钟。用PD-10柱纯化ADC。将ADC命名为PA040。
实例58：药物-连接子PB082及抗体的偶联物(PA082)的制备
将10mg/mL的抗体的PH7.1 PB 5mM EDTA缓冲液在25℃借由10mM TCEP还原120分钟。用PD-10管柱移除TCEP。向还原的抗体溶液中添加15当量的5mM PB082的DMA溶液，将所得混合物在25℃下搅拌120分钟。用PD-10柱纯化ADC。将ADC命名为PA082。
实例59：药物-连接子PB083及抗体的偶联物(PA082)的制备
将10mg/mL的抗体的pH 7.1PB 5mM EDTA缓冲液在25℃借由10mM TCEP还原120分钟。用PD-10柱移除TCEP。向还原的抗体溶液中添加15当量的5mM PB083的DMA溶液，将所得混合物在25℃下搅拌120分钟。用PD-10柱纯化ADC。将ADC命名为PA083。
实例60：ADC PA038的稳定性测试
当在37℃下储存长达15天或经历5个冻融循环时，ADC PA038似乎借由HIC及SEC均为稳定的。在37℃或多次冻融循环下随时间未观测到聚集的显著增加。在100mg/mL下，发现PA038为稳定的，无聚集(借由SEC)或沉淀。
实例61：借由HIC-HPLC测量的保留时间
在DAR8下的ADC PA038及ADC PA039的相对保留时间比相应的基于MC-VC-PAB-MMAE的ADC的DAR2物质的相对保留时间更短。
HIC-HPLC条件：管柱：TSKgel丁基-NPR、2.5μm、4.6mm x 100mm(PN：42168)；管柱温度：30℃；UV：280nm；流动相：A：50mM PB、1.5M(NH4)2SO4、pH＝7.0；B：50mM PB(pH＝7.0):IPA＝75:25(v:v)流速：0.5mL/min；梯度洗脱：0分钟→20分钟(0％B→100％B)、20分钟→21分钟(100％B→0％B)、21分钟→32分钟(0％B)。
实例62：抗-FOLR1免疫偶联物的体外细胞毒性测定
使用体外细胞毒性测定测量抗-FOLR1偶联物抑制细胞生长的能力。测定方法如下：收集OV90、OVCAR-3及NCI-H292细胞，并且在添加抗-FOLR1偶联物之前以指定量(根据细胞生长速率)接种至纯白色平底96孔板中。第二天，将细胞暴露于30μg/ml至0.37μg/ml或100μg/ml至0.015μg/ml的药物浓度范围的偶联物，其中1:3连续稀释且对孔一式双份。将板在37℃下培育120小时。培育后，将40μL CTG(Promega，G7572)/孔添加至板中，培育5分钟后在MD SpectraMax I3X上读板。使用Microsoft Excel及Prism软件将生长抑制计算为相对于未处理细胞的生长百分比。
借由将药物-连接子PA038与抗体F131结合以制得偶联物F131-LD038来制备抗-FOLR1偶联物。将在含有5mM EDTA的50mM磷酸钠缓冲液(pH＝6.9)中的2mL抗体(F131,10mg/mL)以TCEP:mAb＝8.0的摩尔比添加至10mM TCEP HCl(三(2-羧乙基)膦HCl)的水溶液中。还原反应在25℃下进行2小时。借由用50mM磷酸钠缓冲液(pH＝6.9)超滤除去过量的TCEP及其副产物。将LD038(TFA的盐)以20mg/mL的浓度溶解在水中并以7.7(LD038:F131)的摩尔比添加至还原的mAb(F131)中。将结合反应在25℃下搅拌2小时。用50mM磷酸钠缓冲液借由超滤移除过量的LD038及其杂质。将ADC储存在20mM组氨酸缓冲液中，该缓冲液含有6％蔗糖及0.02％(w/V)Tween 20(由UFDF制造)。借由SEC-HPLC判定的ADC纯度为97.5％，并且借由LC-MS判定的DAR值为7.6。载药量为约8。
结果如图1A、图1B及图1C中所示。与裸(未结合)抗体(F131 Ab)相比，抗-FOLR1偶联物对OV90、OVCAR-3及NCI-H292细胞具有显著更佳的细胞毒性。
实例63.抗-FOLR1偶联物在OV90异种移植模型中的体内功效
在雌性BALB/c裸鼠的皮下OV90人类卵巢癌异种移植模型中评价抗-FOLR1偶联物的体内抗肿瘤功效。在37℃下、在5％ CO2的空气氛围中，将OV90肿瘤细胞(ATCC，Manassas，VA，cat#CRL-11732)在体外保持为在补充有10％热灭活胎牛血清的RPMI 1640培养基中的单层培养物。将肿瘤细胞借由胰蛋白酶-EDTA处理每周两次常规传代培养。收集在指数生长阶段生长的细胞并计数肿瘤细胞接种。
借由将药物-连接子PA038与抗体F131结合以制得偶联物F131-LD038(如上所描述)来制备抗-FOLR1偶联物。载药量为约8。
在各小鼠的右侧皮下接种在0.1mL的补充有用于肿瘤发育的Matrigel(1:1)的1640中的OV90肿瘤细胞(2×106)。在肿瘤细胞接种后第8天，当平均肿瘤大小达到约117mm3时，开始治疗。使用基于Excel的随机化软件程式将动物分配至2个组中的一个，根据其的肿瘤体积进行分层随机化。每组由7只荷瘤小鼠组成。
将抗-FOLR1免疫偶联物以5mg/kg分4个剂量给药小鼠；在分组后的第0、3、7及10天进行给药。
在常规监测期间，每周检查动物对肿瘤生长及正常行为的任何影响，例如活动能力、食物及水消耗(仅借由观测)、体重增加/减轻(每隔一天测量体重)、眼睛/毛发消光及如方案中所描述的任何其他异常影响。根据各亚组内动物的数量记录死亡及观测到的临床表现。使用卡尺在两个维度上每周两次测量肿瘤大小，并且使用以下公式以mm3表示体积：V＝0.5a×b2，其中a及b分别为肿瘤的长径及短径。
不同治疗组的中值肿瘤体积绘制在图2中。与PBS对照组相比，用偶联物F131-LD038治疗导致中值肿瘤体积的显著减少。
实例64.抗-FOLR1偶联物在NCI-H292异种移植模型中的体内功效
在雌性BALB/c裸鼠的皮下NCI-H292人类肺癌异种移植模型中评价抗-FOLR1偶联物的体内抗肿瘤功效。在37℃下、在5％ CO2的空气氛围中，将NCI-H292肿瘤细胞(ATCC，Manassas，VA，cat#CRL-1848)在体外保持为在补充有10％热灭活胎牛血清的RPMI1640培养基中的单层培养物。将肿瘤细胞借由胰蛋白酶-EDTA处理每周两次常规传代培养。收集在指数生长阶段生长的细胞并计数肿瘤细胞接种。
借由将药物-连接子PA038与抗体F131结合以制得偶联物F131-LD038(如上所描述)来制备抗-FOLR1偶联物。载药量为约8。
在各小鼠的右侧皮下接种在用于肿瘤生长的0.1mL的RPMI 1640中的NCI-H292肿瘤细胞(10×106)。在肿瘤细胞接种后第11天，当平均肿瘤大小达到约123mm3时，开始治疗。使用基于Excel的随机化软件程式将动物分配至2个组中的一个，根据其的肿瘤体积进行分层随机化。每组由6只荷瘤小鼠组成。
将抗-FOLR1免疫偶联物以5mg/kg分4个剂量给药小鼠；在分组后的第0、3、7及10天进行给药。
不同治疗组的中值肿瘤体积绘制在图3中。与PBS对照组相比，用F131-LD038偶联物治疗导致中值肿瘤体积的显著减少。
实例65.抗-FOLR1偶联物在NCI-H292异种移植模型中的体内功效
在雌性BALB/c裸鼠皮下KB(人口腔表皮样癌细胞)异种移植模型中评价抗-FOLR1偶联物的体内抗肿瘤功效。在37℃下、在5％ CO2的空气氛围中，将KB肿瘤细胞(ATCC，CCL-17)在体外保持为在补充有10％热灭活胎牛血清的MEM培养基中的单层培养物。将肿瘤细胞借由胰蛋白酶-EDTA处理每周两次常规传代培养。收集在指数生长阶段生长的细胞并计数肿瘤细胞接种。
借由将药物-连接子PA038与抗体F131结合以制得偶联物F131-LD038(如上所描述)来制备抗-FOLR1偶联物。载药量为约8。
在各小鼠的右侧皮下接种在用于肿瘤生长的0.1mL的RPMI 1640中的KB肿瘤细胞(1×106)。在肿瘤细胞接种后第13天，当平均肿瘤大小达到约110mm3时，开始治疗。使用基于Excel的随机化软件程式将动物分配至2个组中的一个，根据其的肿瘤体积进行分层随机化。每组由6只荷瘤小鼠组成。
将抗-FOLR1免疫偶联物以5mg/kg分4个剂量给药小鼠；在分组后的第0、3、7及10天进行给药。
不同治疗组的中值肿瘤体积绘制在图4中。与PBS对照组相比，用F131-LD038偶联物治疗导致中值肿瘤体积的显著减少。治疗20天后，所有6只小鼠均有完全反应。
实例66.抗-FOLR-1偶联物在大鼠中的药物动力学(PK)
大鼠购自VR并且在饲养后1周使用。将大鼠分组饲养在无菌笼中并维持在特定的无病原体条件下。在实验室内，环境条件为：温度20℃～22℃，湿度59％～78％，人工光照12小时。大鼠笼为聚砜盒，经高压灭菌后使用，规格为325mm×210mm×180mm，每盒至多饲养3只动物。在笼卡上标明了实验编号、实验开始时间、项目负责人、实验员、动物来源、组别及动物数量。实验动物用耳标标记。给大鼠喂食FR-2饮食并提供自来水(在高压灭菌后使用)。其的体重在给药时为约290g。
用单剂量的F131-LD038免疫偶联物(如上所描述制备)或3mg/kg的裸抗体F131静脉内(IV)处理每组3只大鼠的2组。在给药后10分钟、4小时、1天、4天、7天、10天、14天及21天收集血样，随后离心(4℃，10000×g，3分钟)以分离血浆。借由ELISA检测血清中各偶联物或mAb的总抗体浓度，并借由GraphPad Prism软件分析。
将山羊抗-人类IgG Fc(Invitrogen，31125)以2μg/ml的PBS，100μL每孔包被在96孔微孔板(Thermo，cat：468667)上，在4℃隔夜。第二天，移除溶液，用350μL/孔TBST洗涤板两次。借由添加200μL/孔封闭缓冲液(3％ BSA/TBST)封闭板。将板在37℃置放2小时，随后用350μL/孔TBST洗涤两次。向各孔中添加一系列浓度的标准物及样品。将板在室温下置放2小时。移除溶液，用350μL/孔TBST洗涤板两次。用封闭缓冲液稀释山羊抗-人类κ轻链(HRP)(abcam，ab202549)，并以每孔100μL添加。将板在室温下培育1小时。随后将板用350μL/孔TBST洗涤4次。在各孔中添加100μL的TMB溶液A：溶液B，1:1溶液，并将反应物置于黑暗中3至10分钟。添加50μL终止溶液(2M H2SO4)，并读取450nm及630nm处的光密度。用GraphPadPrism5软件分析数据。
在单次静脉内给药3mg/kg的抗-huFOLR-1偶联物F131-LD038或裸抗体F131后，抗-huFOLR-1偶联物F131-LD038的PK曲线类似于裸抗体F131的PK曲线。结果显示于图5中。
实例67.产生抗人类FOLR1的人类抗体
使用完全人类抗体文库筛选靶向人类FOLR-1的抗体。该文库为半合成的人类抗体文库，其中Fab展示在噬菌体表面上。
遵循标准方案进行文库淘选。具体而言，以6μg/ml用0.5ml人类FOLR1(ACRO-FO1-H52H1)抗原包被PolySorp或MaxiSorp Nunc-Immuno Tubes(Nunc-MG Scientific)(参见淘选概述，表1)，并置于冰箱中隔夜。将管用PBS洗涤一次，用1％ BSA/PBS封闭，并在RT(室温)下置放1小时。将管与指示量(CFU，参见淘选概述，表1)的文库噬菌体样品在RT下培育1小时。将管用PBST缓冲液洗涤10次。为了洗脱结合的噬菌体，添加0.5ml的100mM TEA(三乙胺)，在室温下培育2分钟，并将洗脱物转移至新的管中，并立即借由在混合中添加0.25ml的1.0M Tris-HCL(pH8.0)来中和。将洗脱液(0.75ml)添加至10ml指数生长的大肠杆菌TG1(OD600～0.5)中，充分混合，并在37℃(水浴)下不摇动地培育30分钟。在2xTY培养基中制备培养物的10倍稀释液，并将10μL的每种稀释液铺板在TYE/amp/glu板上，并在30℃下培育隔夜。第二天，计数每种稀释液的菌落数，并计算淘选输出的CFU(菌落形成单位)。将剩余的培养物在2,800g下离心15分钟，重悬于0.5ml 2xTY培养基中，铺板在两个150mm TYE/amp/glu板上，并在30℃下培育隔夜。第二天，将3至5ml的2xTY/amp/glu培养基添加至各板中，并用细胞铺展器将细菌自板上刮下。借由混合1.5ml细菌及0.5ml 80％甘油制备甘油储备液，并将储备液置于-80℃。
为了制备用于下一轮选择的噬菌体颗粒，将甘油储备液接种至40ml的2xTY/amp/glu培养基中，自OD600～0.01-0.05开始。使培养物在37℃下在摇动(300rpm)下生长直至OD600达到0.4-0.6。借由将辅助噬菌体CM13以5-10:1的辅助噬菌体细菌比率添加至培养物中来感染培养物。将培养物在37℃下培育30分钟，同时在水浴中静置，偶尔混合，随后在37℃下摇动30分钟。将细菌培养物以3000rpm离心20分钟，移除上清液。将沉淀物重悬于100mL的2xTY/amp/kan中，随后在30℃下摇动地生长隔夜。借由以6,000g离心30分钟收集培养物。借由将1/5体积的PEG溶液添加至上清液中，随后在冰上培育1小时，随后在4℃下以4,000g离心20分钟来沉淀噬菌体颗粒。彻底弃去上清液。将噬菌体沉淀物重悬于1至2ml的冷PBS中。借由在4℃下以最高速度微离心5分钟来移除残留的细菌。以此方式制备的噬菌体可以立即用于选择，或在-80℃下以10％甘油的等分试样储存。借由用10倍稀释的噬菌体溶液(在2xTY中，低至10-11)感染100μL指数生长的大肠杆菌TG1来判定噬菌体制剂的滴度。自步骤1开始重复选择，总轮数为3～4轮。
总共进行4轮淘洗。第2、第3及第4轮中的洗涤缓冲液PBS-Tween20的浓度分别逐渐增加至0.2％、0.3％及0.4％。
经过4轮筛选后，目标阳性富集率达到1.5×104，与空白对照有显著差异，如表1中所示。挑选来自两个96孔板的克隆用于噬菌体ELISA验证；选择那些与FOLR-1具有高结合的克隆进行定序。
总共定序了69个克隆，获得了12个独特的VH序列。分析这12个VH序列并具有2组独特的HCDR3，如表2及表4中所示。对于具有12个独特VH序列的克隆，随后测定VL序列。用两组独特的LCDR3获得两个独特的VL序列，如表3及表4中所示。
使用CDR区的Kabat系统对克隆序列的进一步分析显示克隆F1/8/9/26/48/50/100/112/123/131/138具有相同的HCDR及LCDR，但具有不同的重链框架(HFR)及轻链框架(LFR)序列，如表5中所示。克隆F40具有不同的HCDR及LCDR，并且具有不同的HFR及LFR，如表5中所示。
表1.四轮淘洗的过程监测
表2.VL分组及排序
表3.VL分组及排序
克隆 VL分组 LCDR3分组
F1,8,9,26,48,50,100,112,123,131,138 VL-1 LCDR3-A
F40 VL-2 LCDR3-B
表4.抗-FOLR-1抗体可变区序列
表5.本发明的抗FOLR-1抗体的CDR序列
实例68.由HEK293细胞产生的抗体的验证
在获得抗体克隆的序列之后(如上所描述)，使用抗体克隆的完整IgG分子进行进一步分析。首先，在48孔或96孔微孔板中进行具有IgG1 Fc的全长抗体分子的表达，收集上清液用于检测表达量及抗原或细胞结合能力。
68.1抗体在48或96孔板中的表达。
将编码抗体F1、F8、F26、F40、F48、F50、F100、F112、F123、F131及F138的重链及轻链的cDNA序列构筑至载体pTT5中。收集HEK293细胞，调整细胞密度至1×106/ml，并以200或400μL/孔接种于48/96-孔细胞培养板，置于5％ CO2的37℃培养箱中以备后用。为了在96孔板中转染，将0.5μg质粒稀释在20μL OPTI培养基中，混合均匀，将2.5μL转染剂DT1(质粒:T1＝1:5)稀释在20μL OPTI培养基中，混合均匀，在室温下培育5分钟。将转染剂DT1稀释液添加至DNA中，充分混合，并在室温下培育30分钟。在培育期间形成转染复合物。将转染复合物添加至细胞中，充分混合，并在37℃下在5％ CO2培养箱中培育48小时。当在48孔板中转染时，质粒及转染剂的量加倍。在转染后的第二天，收集上清液，用ELISA或FACS检测抗体生物活性。
68.2IgG表达量。
借由标准ELISA测试96孔中的抗体表达量。简而言之，将抗人类IgG Fc抗体(Sigma，18885-2ML)用pH 9.6的碳酸包被溶液稀释至5μg/ml，并在4℃下将100μL包被在96孔微量滴定盘的各孔中，隔夜。弃去孔内液体，用PBST洗涤孔三次，用4％脱脂奶粉-PBS(Sigma，D5652-1L)封闭，每孔300μL，并在37℃下培育1小时。弃去孔内液体，随后用PBS洗涤孔三次。利用100μL/孔将样品添加至96孔微量滴定盘中。向对照组添加PBS。将板在37℃下培育1小时，随后弃去液体，并用PBST洗涤孔三次。利用100μL/孔添加HRP-山羊抗人类IgG(Sigma，I18885-2ML)(1:5000稀释)，并将板在37℃下培育1小时。随后弃去孔内液体，以及用PBST洗涤板五次。利用100μL/孔添加TMB溶液。随后向各孔中添加2M H2SO4，各孔使用50μL以在10～15分钟后终止反应。使用酶标仪读取A450值。结果显示在表6中。除克隆F50之外，所有抗体均具有正常表达。
68.3与人类及猕猴FOLR1蛋白结合的抗体。
借由标准ELISA测试抗体与人类FOLR1蛋白结合或与猕猴FOLR1蛋白交叉结合的能力。简而言之，将具有His标签的人类FOLR1(ACRO-FO1-H52H1)或猕猴FOLR1蛋白(ACRO，F01-C52H8)用pH 9.6的碳酸包被溶液稀释至5μg/ml，并在4℃下将100μL抗原包被在96孔微量滴定盘的各孔中，隔夜。弃去孔内液体，以及用PBST洗涤孔三次。随后用4％脱脂奶粉-PBS(Sigma，D5652-1L)利用300μL/孔封闭孔，并将板在37℃下培育1小时。弃去孔内液体，以及用PBS洗涤孔三次。利用100μL/孔添加样品；向对照组添加PBS。将板在37℃下培育1小时。弃去孔内液体，以及用PBST洗涤孔三次。添加HRP-山羊抗人类IgG(Sigma，I18885-2ML)(1:5000稀释，100μL/孔)，并将板在37℃下培育1小时。随后弃去孔内液体，以及用PBST洗涤孔五次。利用100μL/孔添加TMB溶液。使用50μL向各孔中添加2M H2SO4，以在10～15分钟后终止反应。使用酶标仪读取A450值。
表6示出了IgG在微量滴定盘中的表达量及与人类FOLR1蛋白的结合。除克隆F50之外，所有抗体均与人类FOLR1蛋白正常结合。
抗-FOLR1抗体与猕猴FOLR1蛋白交叉结合的结果示于表7中。除克隆F50之外，所有抗体均与猕猴FOLR1蛋白具有良好的交叉结合。
68.4与表达高FOLR1的肿瘤细胞系结合的抗体。
使用转染上清液借由流式细胞术测试抗体与Hela细胞(CCL-2，由COBIOER提供)及RPTEC/TERT1细胞(CRL-4031，由COBIOER提供)的结合活性。简而言之，用0.02％ EDTA-2Na消化目标细胞，以1500rpm离心3分钟，并用PBS重悬。计数后，将细胞以每管1×106个细胞添加至1.5ml离心管中，以1500rpm离心5分钟，弃去上清液。随后在冰浴上进行所有操作。向各1.5ml离心管中添加100μL的转染上清液。将空白细胞、空白细胞加二抗、培养基及HEK293上清液设为对照。反应在冰浴上进行1小时。随后将细胞成团并用PBS洗涤两次。稀释(1：200)二抗山羊抗-人类IgG(PE，abcam，ab98596)，每管添加100μL。反应在黑暗中在冰浴上进行1小时。将细胞再次成团并用PBS洗涤两次，重悬于300μL PBS中，并借由细胞计量术测量FL2荧光读数。借由FlowJoTM10软件分析结果。
抗-FOLR1抗体与Hela细胞结合的结果示于图6中。结果表明克隆F50对Hela细胞结合呈阴性。克隆F40及F138对Hela细胞结合呈弱阳性。其余八个克隆对Hela细胞结合呈阳性。
抗-FOLR1抗体与RPTEC/TERT1细胞结合的结果示于图7中。结果表明克隆F50对RPTEC/TERT1细胞结合呈阴性。克隆F138对RPTEC/TERT1细胞结合呈弱阳性。剩余的9个克隆对RPTEC/TERT1细胞结合呈阳性。
表6.抗体含量及与人类FOLR1蛋白结合的比较
表7.与猕猴FOLR1蛋白抗体交叉结合能力的比较
实例69.摇瓶中由HEK293细胞表达产生的抗-人类FOLR1抗体的表征
借由在悬浮细胞中表达抗体获得足够量的蛋白质，定量研究抗-FOLR1抗体的结合。将质粒转染至悬浮细胞中进行表达。收集上清液进行抗体纯化。使用高纯度抗体，以定量检测抗体与具有高FOLR1蛋白量的肿瘤细胞的结合及内化。
69.1抗体表达及纯化。
将编码抗体F8、F26、F40、F48、F100、F112、F123及F131的质粒转染至HEK293细胞中。简而言之，收集HEK293细胞，调整细胞密度至1×106/ml并在125mL摇瓶中在5％ CO2的37℃摇床上用30mL培养基培养以备后用。转染时，将30μg质粒稀释在1500μL KPM培养基中，混合均匀，并将150μL转染剂T1(质粒:T1＝1:5)稀释在1500μL KPM培养基中，混合均匀，并在室温下培育5分钟。将转染剂T1稀释液添加至DNA中，充分混合，并在室温下培育30分钟以形成转染复合物。将转染复合物添加至细胞中，充分混合，并在37℃下在5％ CO2摇床中培育48小时。24小时后添加TN1溶液至最终浓度为0.5％。在转染后第六天，收集上清液并纯化。
使用蛋白A或蛋白G借由标准方法进行抗体纯化。简而言之，各上清液借由0.22μm滤膜过滤，并上样至用结合缓冲液(PB，pH7.2)平衡的柱上。用结合缓冲液洗涤柱直至获得稳定基线，其中在280nm处无吸光度。用含有0.15M NaCl，pH3.4的0.1M柠檬酸缓冲液洗脱抗体，流速为1ml/min。收集约1.5～3.5ml的级分并借由添加10％体积的1M Tris-HCl，pH9.0进行中和。随后将抗体样品针对1xPBS透析隔夜两次并借由0.2μm滤膜过滤灭菌。使用12％SDS-PAGE测试纯度。
表达量及纯化结果示于表8中。抗体F8、F26及F131具有较高的表达量，而抗体F100具有最低的表达量。所有抗体均具有高纯度(数据未示出)。
表8.抗体表达量的比较
宿主细胞 克隆 浓度(μg/ml) 体积(ml) 定量(mg)
HEK293 F8 387.6 4.00 1.55
HEK293 F26 396.6 3.50 1.39
HEK293 F40 182.1 4.01 0.73
HEK293 F48 131.1 2.97 0.39
HEK293 F100 60.6 1.98 0.12
HEK293 F112 129.6 4.01 0.52
HEK293 F123 171.6 2.97 0.51
HEK293 F131 359.1 3.51 1.26
69.2与具有高FOLR1含量的肿瘤细胞系结合的抗体。
借由FACS测试抗-FOLR1抗体与Hela及RPTEC/TERT1细胞的结合。如以上所描述进行研究。在图8及图9中示出结果。所有抗体以剂量依赖性方式结合Hela及RPTEC/TERT1细胞。
69.3内化率表征。
使用pHAb测定测试抗-FOLR1抗体F8、F26、F40、F48、F100、F112、F123及F131内化至表达FOLR-1的肿瘤细胞系Hela及RPTEC/TERT1的能力，其中抗体用pHAb荧光染料标记。根据套组中的说明进行抗体标记。具体地，将50μL磁珠添加至1.5ml EP管中。将EP管置放在磁性架上10秒，移除磁珠上的保护溶液。用250μL PB洗涤每管磁珠，并将100μg抗体添加至磁珠的各管中(缓冲系统：柠檬酸/Tris-HCl钠(pH6.0))。用PB将体积补足至1ml，并且将反应溶液混合并在室温下旋转1小时。随后用250μL PB洗涤磁珠，用250μL NaHCO3平衡。将100μLNaHCO3及1.2μL制备的pHAb染料(在使用前制备)添加至各管中，并将反应物在黑暗中置放1小时。用250μL PB洗涤各管两次。在室温下使用100μL将50mM甘氨酸添加至各管中5分钟，随后洗脱标记的抗体。随后向洗脱物中添加2M Tris缓冲液进行中和。将最终的标记抗体储存在黑暗中以备后用。
Hela或RPTEC/TERT1细胞以15,000个细胞/孔接种100μL并在5％ CO2培养箱中在37℃下培养20至24小时。将pHAb-标记的测试抗体以10μg/ml的浓度添加至孔中。随后分别在0小时、1小时、4小时、6小时及23小时时，在具有520nm的激发波长及570nm的吸收波长的Thermo VARIOSKAN FLASH上读板。
结果示于图10及图11中。所有测试的抗-FOLR1抗体在表达FOLR1的Hela及RPTEC/TERT1细胞中均显示出pHAb荧光的时间依赖性增加。该结果表明每种抗体均内化至Hela及RPTEC/TERT1细胞中，其中抗体F8及F131具有最强的内化率。
实例70.抗-FOLR-1免疫偶联物的表征
进行作为免疫偶联物的抗-FOLR-1抗体的进一步表征。
70.1参考抗体及抗体F8、F26及F131的表达
使用ImmunoGen Inc.的抗-FOLR-1抗体米妥昔单抗(huFR107)作为对照。huFR107的VH及VL区的氨基酸序列得自美国专利号8,557,966(分别为SEQ ID NO：36及37)，并进行密码子最佳化。在载体pcDNA3.4中构筑编码huFR107及编码抗体F8、F26及F131的最佳化cDNA。随后使用标准ExpiFectamine CHO转染程式(Gibco，A29129)在锥形瓶中将质粒瞬时转染至ExpiCHO-S细胞中。将悬浮的瞬时转染物培育10天，随后借由蛋白A柱纯化澄清的上清液，随后如上所描述进行SDS-PAGE。
70.2抗-FOLR-1免疫偶联物的制备
借由添加0.5M磷酸氢二钠将抗体溶液的pH调节在pH7.0～7.5的范围内。添加指定量的0.5M EDTA以在抗体溶液中达到5mM的最终EDTA浓度。添加指定量的10mM TCEP(三(2-氯乙基)磷酸酯)溶液以实现所需的TCEP/mAb摩尔比。还原反应置于室温下90分钟。随后添加DMSO以达到10％v/v。将药物-连接子mc-VC-PAB-MMAE溶解在DMSO中以实现10mM的最终浓度，并且与可获得的半胱氨酸硫醇的莫耳数相比，以30％至50％的莫耳过量将指定量添加至反应溶液中。结合反应置于室温下30分钟。添加NAC(N-乙酰基-L-半胱氨酸)储备溶液以获得5的NAC/Mc-VC-PAB-MMAE摩尔比。淬灭反应置于室温下15分钟。借由PD10柱进行纯化。
使用Waters HPLC E2695&2489系统在TSK凝胶G3000SWXL，7.8x300 mm管柱(TosohBioscience)上用尺寸排阻层析法(SEC)评价抗-FOLR-1免疫偶联物的纯度。在25℃下使用50mM Na2PO4(pH6.7)及10％IPA的流动相进行操作，以0.8mL/min的流速运行20分钟。参考表9，所有四个ADC均具有高纯度。
使用Waters HPLC E2695&2489系统，在疏水作用TosoHaas TSK凝胶丁基-NPR管柱(4.6mm ID×3.5cm，粒径2.5μm)上，用疏水作用层析法(HIC)评价抗-FOLR-1免疫偶联物的疏水性。简而言之，HPLC系统在25℃下运行，流动相A：50mM Na2PO4/1.5M(NH4)2SO4 pH 7.0，及流动相B：50mM Na2PO4/25％ IPA，pH 7.0。将流动相借由0.22μm滤膜(Millipore)过滤，以0.5mL的流速运行30分钟。线性梯度的参数示于表10中。根据HIC数据测定抗-FOLR-1免疫偶联物的DAR(药物抗体比率)，并且在3～4的范围内(数据未示出)。
表9.抗-FOLR1免疫偶联物的纯度
F8-ADC F26-ADC F131-ADC FR107-ADC
纯度(％) 98％ 100％ 100％ 100％
表10.线性梯度的过程
实例71.借由BLI测试F131及F131-LD038对FOLR家族蛋白的亲和力数据
由连接至His标签的FOLR家族蛋白的胞外域组成的重组蛋白系购买的(来自ACRO系统)或内部合成的。为了借由生物层干涉法(BLI)进行结合研究，将F131(以16.67nM)固定在抗-人类IgG Fc生物感测器尖端(Fortebio)上。使用Octet RED(Fortebio)进行利用不同浓度(自500nM降至7.8nM)的重组抗原蛋白溶液的结合测定。结合时间设定为180秒，并且解离时间设定为300秒。使用ForteBio Data Acquisition 6.3软件(ForteBio)计算结合亲和力，并且借由利用全局拟合演算法将动力学数据拟合至1:1朗缪尔结合模型来导出亲和力。F131对人类FOLR1显示出高亲和力，而对人类FOLR2具有低回应，并且对人类FOLR3无回应，证明了F131的结合特异性(表11)。F131表明对人类及猕猴FOLR1的高结合亲和力，平衡解离常数(KD)分别为1.5及8.1nM。F131显示对大鼠FOLR1无交叉反应性，并且对小鼠FOLR1具有低交叉反应性(KD＝2.9μM)。
表11.借由BLI测试F131及F131-LD038对FOLR家族蛋白的亲和力数据
*低于定量范围的回应
表12.借由BLI测试F131及F131-LD038对物质FOLRα蛋白的亲和力数据
*低于定量范围的回应
实例72.肿瘤细胞系中的F131及F131-LD038内化
内化测定以时序进行。将3×105个细胞与10μg/ml的F131或F131-LD038的FACS缓冲液(含有0.1％BSA的1×PBS)在4℃下培育30分钟。将细胞在4℃下洗涤以移除未结合的材料并根据需要保持在冰上或转移至37℃。在渐进时间点(0、0.5、1、2、3、4小时)，细胞用PE-结合的抗-人Fc在4℃下染色30分钟，并借由流式细胞术分析。借由自在时间0时在4℃下细胞表面结合抗体的平均荧光强度(MFI)减去在各时间点时在37℃下细胞表面结合抗体的MFI，随后除以在时间0时在4℃下细胞表面结合抗体的MFI来计算内化率。
F131及F131-LD038在多个表达FOLRα的细胞系(OVCAR3、KB、JEG-3、NCI-H441)上显示出快速内化，而在非表达FOLRα的细胞(PC-3，对照)上未观测到内化(图12A及图12B)。
实例73.F131及F131-LD038在三种选择细胞系中的细胞毒性
在添加测试制品(F131或F131-LD038或依喜替康)前一天，收集细胞并铺板至96-孔纯白色平底板中。第二天，将细胞暴露于浓度为2000至0.305nM的F131及F131-LD038或100nM至1μM的依喜替康的测试制品。将板在37℃下培育96小时。随后，将每孔40μL Cell-titre Glo(CTG)添加至板中，在5分钟后收集荧光素酶读数，并借由酶标仪分析。将所有读数归一化为未处理的对照孔中活细胞的百分比，并借由Prism软件计算IC50值。
F131-LD038对表达FOLRα的KB、OVCAR3及JEG-3细胞产生强的细胞毒性，而裸抗体F131对这些目标肿瘤细胞无细胞毒性。F131-LD038的有效载荷(依喜替康)在对这些细胞的细胞毒性作用中似乎比F131-LD038更有效(图13A至图13C)。
实例74.F131-LD038在CDX中的体内功效
在具有一系列目标表达量的细胞系(例如NCI-H441、HCC827、OVCAR3、KB及OV90)中评价F131-LD038 ADC的体内抗肿瘤活性(图14A至图14E)。
NCI-H441(ATCC，HTB-174，NSCLC，47×103个拷贝/细胞)肿瘤模型借由注射悬浮在Matrigel/培养基(1:1)中的5×106个细胞来建立；HCC827(ATCC，Cat#CRL-2868TM，NSCLC，41×103个拷贝/细胞)肿瘤模型借由注射悬浮在Matrigel/培养基(1:1)中的4×106个细胞来建立；OVCAR3(ATCC，HTB-161，卵巢，290×103个拷贝/细胞)肿瘤模型借由注射悬浮在Matrigel/培养基(1:1)中的1×107个细胞来建立；KB(Co-bioer，口腔上皮，341×103个拷贝/细胞)肿瘤模型借由注射悬浮在0.1mL培养基中的1×107个细胞来建立；OV90(Truway-bio，卵巢，0.38×103个拷贝/细胞)肿瘤模型借由注射悬浮在Matrigel/培养基(1:1)中的2×106个细胞来建立。
在肿瘤接种后6至26天，选择平均肿瘤大小为110至180mm3的小鼠，并根据其肿瘤体积使用分层随机化将各模型分为2组或3组(每组n＝6-9)。在随机化(随机化日定义为D0)后一天开始治疗，并且采用单剂量(在第1天)或多剂量(在第1天/第4天/第8天/第11天)方案，借由静脉内注射5mg/kg的F131-LD038。
使用卡尺在两个维度上每周两次测量肿瘤大小及体重，并且使用以下公式以mm3表示体积：V＝0.5a×b2，其中a及b分别为肿瘤的长径及短径。肿瘤体积超过2000mm3被定义为实验结束。监测动物体重作为耐受性的间接指标。在任何治疗组中都无小鼠显示显著的体重减轻。在治疗期间无发病率及死亡。
与载剂对照组相比，在NCI-H441、HCC827、OVCAR3、KB肿瘤模型中，用单剂量及多剂量的F131-LD038的所有治疗组均产生显著的抗肿瘤活性，而在OV90肿瘤模型中，F131-LD038表现出中等至弱的抗肿瘤活性，在OV90肿瘤模型中，目标密度低于其他肿瘤。
借由QIFKIT(DAKO，K0078)测试目标拷贝数。简而言之，用针对目标抗原的初级小鼠单克隆抗体标记细胞。随后用荧光素结合的抗小鼠二抗平行标记套组的细胞、设置珠及校准珠。荧光与在细胞及珠粒上结合的一抗分子的数量相关。随后在流式细胞仪上分析样品，并基于自校准曲线得到的方程计算拷贝数(表13)。
表13
实例75.F131-LD038及其他F131-偶联物的体内效力
75.1F131-LD100、F131-LD111、F131-LD101、F131-LD110的产生：
F131-LD100
将在含有5mM EDTA的50mM磷酸钠缓冲液(pH＝6.9)中的2mL的抗体(10mg/mL)添加至10mM TCEP HCl(三(2-羧乙基)膦HCl)的水溶液中，TCEP与mAb的摩尔比为8.0。还原反应在25℃下进行2小时。借由用pH＝6.9的50mM磷酸钠缓冲液超滤移除过量的TCEP及其副产物。将药物连接子LD100(TFA的盐)以20mg/mL的浓度溶解在水中并以8.5(LD100/mAb)的摩尔比添加至还原的mAb中。将结合反应在25℃下搅拌2小时。用50mM磷酸钠缓冲液借由超滤移除过量的LD100及其杂质。将ADC储存在20mM组氨酸缓冲液中，该缓冲液含有6％蔗糖及0.02％(w/V)Tween 20(由UFDF制造)。借由SEC-HPLC判定的ADC纯度为97.1％，并且借由LC-MS判定的DAR值为7.9。
F131-LD111
将在含有5mM EDTA的50mM磷酸钠缓冲液(pH＝6.9)中的2mL的抗体(10mg/mL)添加至10mM TCEP HCl(三(2-羧乙基)膦HCl)的水溶液中，TCEP与mAb的摩尔比为8.0。还原反应在25℃下进行2小时。借由用pH＝6.9的50mM磷酸钠缓冲液超滤移除过量的TCEP及其副产物。将药物连接子LD111(TFA的盐)以20mg/mL的浓度溶解在水中并以8.5(LD111/mAb)的摩尔比添加至还原的mAb中。将结合反应在25℃下搅拌2小时。用50mM磷酸钠缓冲液借由超滤移除过量的LD111及其杂质。将ADC储存在20mM组氨酸缓冲液中，该缓冲液含有6％蔗糖及0.02％(w/V)Tween 20(由UFDF制造)。借由SEC-HPLC判定的ADC纯度为97.5％，并且借由LC-MS判定的DAR值为7.8。
F131-LD101
将在含有5mM EDTA的50mM磷酸钠缓冲液(pH＝6.9)中的2mL的抗体(10mg/mL)添加至10mM TCEP HCl(三(2-羧乙基)膦HCl)的水溶液中，TCEP与mAb的摩尔比为8.0。还原反应在25℃下进行2小时。借由用pH＝6.9的50mM磷酸钠缓冲液超滤移除过量的TCEP及其副产物。将药物连接子LD101(TFA的盐)以20mg/mL的浓度溶解在水中并以8.5(LD101/mAb)的摩尔比添加至还原的mAb中。将结合反应在25℃下搅拌2小时。用50mM磷酸钠缓冲液借由超滤移除过量的LD101及其杂质。将ADC储存在20mM组氨酸缓冲液中，该缓冲液含有6％蔗糖及0.02％(w/V)Tween 20(由UFDF制造)。借由SEC-HPLC判定的ADC纯度为98.0％，并且借由LC-MS判定的DAR值为7.5。
F131-LD110
将在含有5mM EDTA的50mM磷酸钠缓冲液(pH＝6.9)中的2mL的抗体(10mg/mL)添加至10mM TCEP HCl(三(2-羧乙基)膦HCl)的水溶液中，TCEP与mAb的摩尔比为8.0。还原反应在25℃下进行2小时。借由用pH＝6.9的50mM磷酸钠缓冲液超滤移除过量的TCEP及其副产物。将LD110(TFA的盐)以20mg/mL的浓度溶解在水中并以7.7(LD110/mAb)的摩尔比添加至还原的mAb中。将结合反应在25℃下搅拌2小时。用50mM磷酸钠缓冲液借由超滤移除过量的LD110及其杂质。将ADC储存在20mM组氨酸缓冲液中，该缓冲液含有6％蔗糖及0.02％(w/V)Tween 20(由UFDF制造)。借由SEC-HPLC判定的ADC纯度为97.8％，并且借由LC-MS判定的DAR值为7.5。
75.2在肿瘤细胞系KB中评价另外的F131偶联物(F131-LD100、F131-LD111、F131-LD101、F131-LD110)的体内抗肿瘤活性(图15A及图15B)。
KB(Co-bioer)肿瘤模型借由注射悬浮在0.1mL培养基中的1×107个细胞来建立。在肿瘤接种后12天，选择平均肿瘤大小为约137mm3的小鼠，并根据其肿瘤体积使用分层随机化分为8组(每组n＝8)。在随机化(随机化日定义为D0)后一天开始治疗，用单次(在第1天)静脉内注射3mg/kg的F131-LD100，或3mg/kg的F131-LD111，或1.5或3mg/kg的F131-LD101，或1.5或3mg/kg的F131-LD110治疗小鼠。
如前所描述测量肿瘤大小及体重。监测动物体重作为耐受性的间接指标。在任何治疗组中都无小鼠显示显著的体重减轻。在治疗期间无发病率及死亡。
与载剂对照组相比，用1.5或3mg/kg的F131-LD101及F131-LD110治疗在KB肿瘤模型中产生了显著的抗肿瘤活性(图15B)。F131-LD110的肿瘤生长抑制与剂量相关。用3mg/kg的F131-LD100、F131-LD111或F131-LD038治疗在KB肿瘤中产生中等抗肿瘤活性(图15A)。
表14
实例76.F131-LD038 F131、F131-LD038及其他偶联物的大鼠模型的PK研究
将F131及其偶联物(F131-LD038、F131-LD101、F131-LD110、F131-LD100、F131-LD111)以3mg/kg静脉内给药雄性Sprague Dawley大鼠(每组n＝3)。在给药后10分钟、4小时、1天、4天、7天、10天、14天及21天自各大鼠交叉取样眼眶血。血清中的总Ab浓度(代表F131及其偶联物)由Genscript制造的ELISA套组检测，并使用Winnonlin 8.2软件计算。
所有测试的F131-偶联物均表现出与未结合的亲本mAb，F131相当的优异PK特性(图16A至图16C)。实例77.F131-LD038的小规模猕猴毒性研究中的PK及耐受性
为了评价F131-LD038的毒性作用及毒代动力学特性，将F131-LD038以60mg/kg的单剂量静脉内给药一只雄性(M)及一只雌性(F)猕猴。在整个研究中监测临床表现、体重、食物消耗及临床病理学(表15)。在给药后第22天将动物安乐死，在此期间进行完全尸检。在给药后0小时、24小时、72小时、120小时、336小时及504小时自各动物收集毒代动力学样品。血清中的总Ab浓度(代表F131及其偶联物)由Genscript制造的ELISA套组检测，并使用Winnonlin 8.2软件计算。观测到ALT的瞬时升高(图17A)及中性粒细胞的瞬时降低(图17B)。F131-LD038在猕猴中显示出稳定及优异的血浆PK分布(图18)。
表15
本发明不限于本文描述的具体实施例的范围。实际上，除了本文所描述的之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言也是显而易见的。这些修改都属于所附权利要求书的范围。
上述各种实施例可以组合起来提供更多的实施例。本说明书中提到的和/或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物，包括2021年7月6日提交的国际专利申请号PCT/CN2021/104618和2022年7月4日提交的中国专利申请号202210777240.7，其全部内容通过引用并入本文。如有必要，可对本发明实施例的各个方面进行修改，以采用各种专利、申请和出版物中的概念，提供更多的实施例。
本文引用了各种出版物，包括专利、专利申请公开及科学文献，其公开的全部内容出于所有目的以引用方式纳入本文。

Claims (142)

1.一种具有以下式(V)的连接子中间体，
～(AA)s-[L2]≈
(V)
或其盐，其中：
AA为具有1个至12个氨基酸亚单元的氨基酸单元；
s为0或1；
L2为具有1个至4个用于药物单元的连接位点的连接子亚单元；以及
各波浪(～)线表示用于扩展单元的连接位点；以及
双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点，
其中至少一个极性单元存在于所述氨基酸单元、所述连接子亚单元或两者中，并且其中所述极性单元选自糖单元、PEG单元、羧基单元及其组合。
2.一种具有以下式(I)的连接子，
～L1-(AA)s-L2≈
(I)
或其盐，其中：
L1为具有用于靶向单元的连接位点的扩展单元；
AA为具有1个至12个亚单元的氨基酸单元；
s为0或1；
L2为具有1个至4个用于药物单元的连接位点的连接子亚单元；
所述波浪(～)线表示用于所述靶向单元的连接位点；以及
所述双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点；
其中至少一个极性单元存在于所述氨基酸单元、所述连接子亚单元、所述扩展单元或其组合中，并且其中所述极性单元选自糖单元、PEG单元、羧基单元及其组合。
3.如前述权利要求的连接子中间体或连接子，其中所述糖单元具有下式：
L3-**N(CH2-(CH(XR))k-X1(X2))2
(X)
或其盐，其中：
各X独立地选自NH或O；
各R独立地选自氢、乙酰基、单糖、二糖及多糖；
各X1独立地选自CH2及C(O)；
各X2独立地选自H、OH及OR；
k为1至10；以及
L3具有以下通式(XI)：
或其盐，其中：
L3a选自C1-C10伸烷基及具有1个至24个乙二醇亚单元的聚乙二醇；
p及o独立地为0至2；
各*及各#表示用于氨基酸单元(AA)、连接子亚单元L2或扩展单元(L1)的其他亚单元的连接位点；以及
L3a共价结合至式(X)中用**标记的N原子。
4.如前述权利要求中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中所述糖单元具有选自以下的式：
或者
或其盐，其中：
各R独立地选自氢、单糖、二糖及多糖；
p及o独立地为0至2；
m为1至8；n为0至4；以及
各*及各#表示用于所述氨基酸单元(AA)、所述连接子亚单元L2或所述扩展单元(L1)的其他亚单元的连接位点。
5.如前述权利要求中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中所述PEG单元具有选自以下的式：
(a)
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-NR24R25
(XX)
或其盐，其中：
R20为用于连接至所述氨基酸单元的亚单元或所述连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R21及R22各自独立地为视情况选用的C1-C3伸烷基；
R24及R25各自独立地选自H；多羟基基团；经取代的多羟基基团；-C(O)-多羟基基团；经取代的-C(O)-多羟基基团；视情况经取代的C3-C10碳环；视情况经取代的C1-C3伸烷基C3-C10碳环；视情况经取代的杂芳基；视情况经取代的碳环；经取代的-C1-C8烷基；经取代的-C(O)-C1-C8烷基；螯合物；-C(O)-R28，其中R28为式(XII)或式(XIII)的糖单元；或与-NR24R25一起形成C3-C8杂环；
所述波浪线(～)表示与R20的连接位点；以及
n20为1至26；
或
(b)
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-NR24R25
(XX)
或其盐，其中：
R20为用于连接至所述氨基酸单元的亚单元或所述连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R21及R22各自独立地为视情况选用的C1-C3伸烷基；
R24及R25中的一者选自H；多羟基基团；经取代的多羟基基团；-C(O)-多羟基基团；经取代的-C(O)-多羟基基团；视情况经取代的C3-C10碳环；视情况经取代的C1-C3伸烷基C3-C10碳环；视情况经取代的杂芳基；视情况经取代的碳环；经取代的-C1-C8烷基；经取代的-C(O)-C1-C8烷基；螯合物；-C(O)-R28，其中R28为式(XII)或式(XIII)的糖单元；并且R24及R25中的另一者为聚乙二醇，视情况具有1个至24个乙二醇亚单元；
所述波浪线(～)表示与R20的连接位点；以及
n20为1至26；
或
(c)
～R20-[-R26-[R29-[O-CH2-CH2-]n20R29]n21-R27-]n27-NR24R25
(XXI)
或其盐，其中：
R20为用于连接至氨基酸单元的亚单元和/或所述连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R26及R27各自视情况且独立地选自C1-C12伸烷基、-NH-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-NH-、-C(O)-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-C(O)-、-NH-C1-C12伸烷基-C(O)-及-C(O)-C1-C12伸烷基-NH-；
R24及R25中的一者选自H；多羟基基团；经取代的多羟基基团；-C(O)-多羟基基团；经取代的-C(O)-多羟基基团；视情况经取代的C3-C10碳环；视情况经取代的C1-C3伸烷基C3-C10碳环；视情况经取代的杂芳基；视情况经取代的碳环；经取代的-C1-C8烷基；经取代的-C(O)-C1-C8烷基；螯合物；-C(O)-R28，其中R28为式(XII)或式(XIII)的糖单元；并且R24及R25中的另一者选自H；多羟基基团；经取代的多羟基基团；-C(O)-多羟基基团；经取代的-C(O)-多羟基基团；视情况经取代的C3-C10碳环；视情况经取代的C1-C3伸烷基C3-C10碳环；视情况经取代的杂芳基；视情况经取代的碳环；经取代的-C1-C8烷基；经取代的-C(O)-C1-C8烷基；螯合物；-C(O)-R28，其中R28为式(XII)或式(XIII)的糖单元；及聚乙二醇，视情况具有1个至24个乙二醇亚单元；或与-NR24R25一起形成C3-C8杂环；
各R29视情况且独立地选自-C(O)-、-NH-、-C(O)-C1-C6伸烯基-、-NH-C1-C6伸烯基-、-C1-C6伸烯基-NH-、-C1-C6伸烯基-C(O)-、-NH(CO)NH-及三唑；
所述波浪线(～)表示与R20的连接位点；
n20为1至26；
n21为1至4；以及
n27为1至4。
6.如权利要求5所述的连接子中间体或连接子，其中R24及R25均不为H。
7.如权利要求5至6中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中R24及R25各自独立地选自H及多羟基基团，其限制条件为R24及R25不均为H。
8.如权利要求5至7中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中所述多羟基基团为线性单糖，视情况选自C6或C5糖、糖酸或氨基糖。
9.如权利要求8所述的连接子中间体或连接子，其中:所述C6或C5糖选自葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脱氧葡萄糖、甘油醛、赤藓糖、苏糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、醛糖及酮糖；
所述糖酸选自葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸及酮糖酸(ulosonic acid)；或
所述氨基糖选自葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、半乳糖胺及N-乙酰半乳糖胺。
10.如权利要求5至9中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中所述PEG单元选自以下，或其盐：
其中R39选自H、直链单糖及聚乙二醇，视情况具有1个至24个乙二醇亚单元；并且左侧的波浪线表示与所述氨基酸单元的亚单元或所述连接子亚单元的一部分的连接位点。
11.如权利要求5至6中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中R24及R25中的一者为线性单糖，并且另一者为环状单糖。
12.如权利要求11所述的连接子中间体或连接子，其中所述PEG单元选自以下，或其盐：
其中R41为环状单糖；并且左侧的波浪线表示与所述氨基酸单元的亚单元或所述连接子亚单元的一部分的连接位点。
13.如权利要求5至6中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中R24及R25独立地选自环状单糖、二糖及多糖。
14.如权利要求13所述的连接子中间体或连接子，其中所述PEG单元选自以下，或其盐：
其中各R45选自H及单糖、二糖或多糖；并且R46选自环状单糖、二糖或多糖；并且右侧的波浪线表示与所述氨基酸单元的亚单元或所述连接子亚单元的一部分的连接位点。
15.如权利要求5至6中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中R24及R25独立地选自线性单糖及经取代的线性单糖，其中所述经取代的线性单糖被单糖、二糖或多糖取代。
16.如权利要求15所述的连接子中间体或连接子，其中所述PEG单元选自以下，或其盐：
其中R47为线性单糖；并且各R49选自单糖、二糖及多糖；并且左侧的波浪线表示与所述氨基酸单元的亚单元或所述连接子亚单元的一部分的连接位点。
17.如权利要求5至6中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中R24及R25独立地选自线性单糖及经取代的单糖，其中所述经取代的线性单糖被一个或多个选自烷基、O-烷基、芳基、O-芳基、羧基、酯或酰胺的取代基取代，并且视情况进一步被单糖、二糖或多糖取代。
18.如权利要求17所述的连接子中间体或连接子，其中所述PEG单元选自以下，或其盐：
或
其中各R42独立地选自线性单糖及经取代的线性单糖；各R43独立地选自烷基、O-烷基、芳基、O-芳基、羧基、酯及酰胺；并且左侧的波浪线表示与所述氨基酸单元的亚单元或所述连接子亚单元的一部分的连接位点。
19.如权利要求5至6中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中R24及R25中的一者为-C(O)-多羟基基团或经取代的-C(O)-多羟基基团，并且R24及R25中的另一者为H、-C(O)-多羟基基团、经取代的-C(O)-多羟基基团、多羟基基团或经取代的多羟基基团；其中所述经取代的-C(O)-多羟基基团及多羟基基团被单糖、二糖、多糖、烷基、-O-烷基、芳基、羧基、酯或酰胺取代。
20.如权利要求19所述的连接子中间体或连接子，其中所述PEG单元选自以下，或其盐：
其中左侧的波浪线表示与所述氨基酸单元的亚单元或所述连接子亚单元的一部分的连接位点。
21.如权利要求5至6中任一项的连接子中间体或连接子，其中R24及R25独立地选自H、经取代的-C1-C8烷基、经取代的-C1-C4烷基或经取代的-C1-C3烷基；其限制条件为R24及R25均不为H；其中经取代的-C1-C8烷基、-C1-C4烷基及-C1-C3烷基被羟基和/或羧基取代。
22.如权利要求21所述的连接子中间体或连接子，其中所述PEG单元选自以下，或其盐：
其中R48选自H、OH、CH2OH、COOH或被羟基或羧基取代的-C1-C6烷基；并且左侧的波浪线表示与所述氨基酸单元的亚单元或所述连接子亚单元的一部分的连接位点。
23.如权利要求5至6中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中R24及R25中的一者选自H、经取代的-C(O)-C1-C8烷基、经取代的-C(O)-C1-C4烷基及经取代的-C(O)-C1-C3烷基，并且R24及R25中的另一者选自经取代的-C(O)-C1-C8烷基、经取代的-C(O)-C1-C4烷基、经取代的-C(O)-C1-C3烷基、经取代的-C1-C8烷基、经取代的-C1-C4烷基及经取代的-C1-C3烷基，其中经取代的-C(O)-C1-C8烷基、经取代的-C(O)-C1-C4烷基、经取代的-C(O)-C1-C3烷基、经取代的-C1-C8烷基、-C1-C4烷基及-C1-C3烷基被羟基和/或羧基取代。
24.如权利要求23所述的连接子中间体或连接子，其中所述PEG单元选自以下，或其盐：
其中左侧的波浪线表示与所述氨基酸单元的亚单元或所述连接子亚单元的一部分的连接位点。
25.如权利要求5至6中任一项的连接子中间体或连接子，其中R24及R25选自H及视情况经取代的芳基；其限制条件为R24及R25均不为H。
26.如权利要求25所述的连接子中间体或连接子，其中所述PEG单元选自以下，或其盐：
其中左侧的波浪线表示用于所述氨基酸单元的亚单元或所述连接子亚单元的一部分的连接位点。
27.如权利要求5至6中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中R24及R25一起形成视情况经取代的C3-C8杂环或杂芳基。
28.如权利要求27所述的连接子中间体或连接子，其中所述PEG单元为：
或其盐。
29.如权利要求5至6中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中R24及R25独立地选自H及螯合物，其中所述螯合物视情况借由伸烷基、伸芳基、碳环、杂伸芳基或杂碳环连接至-NR24R25的氮；其限制条件为R24及R25均不为H。
30.如权利要求29所述的连接子中间体或连接子，其中所述螯合物选自乙二胺四乙酸(EDTA)、二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)、三伸乙基四胺六乙酸(TTHA)、苄基-DTPA、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N”,N”'-四乙酸(DOTA)、苄基-DOTA、1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N',N”-三乙酸(NOTA)、苄基-NOTA、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)及N,N'-二烷基取代的哌嗪。
31.如权利要求30所述的连接子中间体或连接子，其中所述PEG单元选自以下，或其盐：
其中左侧的波浪线表示与所述氨基酸单元的亚单元或所述连接子亚单元的一部分的连接位点。
32.如权利要求5至19中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中各单糖独立地选自：
C5或C6糖，所述C5或C6糖选自葡萄糖、核糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、2-脱氧葡萄糖、甘油醛、赤藓糖、苏糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、醛糖、酮糖、葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、半乳糖胺及N-乙酰半乳糖胺；
糖酸，所述糖酸选自葡糖酸、醛糖酸、糖醛酸及酮糖酸；或
氨基糖，所述氨基糖选自葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、半乳糖胺及N-乙酰半乳糖胺。
33.如权利要求5至32中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中R20选自卤基、醛、羧基、氨基、炔基、叠氮基、羟基、羰基、氨基甲酸酯、硫醇、脲、硫代氨基甲酸酯、硫脲、磺酰胺、酰基磺酰胺、烷基磺酸酯、三唑、氮杂二苯并环辛炔、肼、羰基烷基杂芳基或其受保护的形式。
34.如权利要求1至4中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中所述PEG单元具有选自以下的式：
(a)
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-R30
(XXX)
或其盐，其中：
R20为用于连接至所述氨基酸单元的亚单元(若存在)和/或连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R21及R22各自视情况且，若存在，独立地为C1-C3伸烷基基团；
R30选自视情况经取代的C3-C10碳环；硫脲；视情况经取代的硫脲；脲；视情况经取代的脲；磺酰胺；烷基磺酰胺；酰基磺酰胺、视情况经取代的烷基磺酰胺；视情况经取代的酰基磺酰胺；磺酰胺；视情况经取代的磺酰胺；胍，包括烷基胍及芳基胍；磷酰胺；或视情况经取代的磷酰胺；或
R30选自叠氮基、炔基、经取代的炔基、-NH-C(O)-炔基、-NH-C(O)-炔基-R65；环辛炔；-NH-环辛炔、-NH-C(O)-环辛炔或-NH-(环辛炔)2；其中R65选自视情况经取代的烷基、视情况经取代的烯基、
视情况经取代的炔基、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基、视情况经取代的杂碳环或视情况经取代的杂芳基；
所述波浪线(～)表示与R20的连接位点；以及
n20为1至26；
(b)
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-NH-C(O)-R31
(XXXI)
或其盐，其中：
R20为用于连接至所述氨基酸单元的亚单元(若存在)或所述连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R21及R22各自独立地为视情况选用的C1-C3伸烷基基团；
R31为支链聚乙二醇链，各支链具有1个至26个乙二醇亚单元，并且各支链在其末端具有R35；
R35为叠氮基、炔基、炔基-R65、环辛炔或环辛炔-R65，其中R65选自视情况经取代的烷基、视情况经取代的烯基、视情况经取代的炔基、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基、视情况经取代的杂碳环或视情况经取代的杂芳基；
所述波浪线(～)表示与R20的连接位点；以及
n20为1至26；
(c)
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-C(O)NH-R31
(XXXII)
或其盐，其中：
R20为用于连接至所述氨基酸单元的亚单元(若存在)或所述连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R21及R22各自视情况且独立地为C1-C3伸烷基基团；
R31为支链聚乙二醇链，各支链独立地具有1个至26个乙二醇亚单元，并且各支链在其末端具有R35；R35为叠氮基、炔基、炔基-R65、环辛炔或环辛炔-R65，其中R65选自视情况经取代的烷基、视情况经取代的烯基、视情况经取代的炔基、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基、视情况经取代的杂碳环及视情况经取代的杂芳基；
所述波浪线(～)表示与R20的连接位点；以及
n20为1至26；以及
(d)
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-N-(R33-R31)2
(XXXIII)
或其盐，其中：
R20为用于连接至所述氨基酸单元的亚单元(若存在)或所述连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R21及R22各自视情况且为C1-C3伸烷基基团；
R31为支链聚乙二醇链，各支链具有1个至26个乙二醇亚单元，并且各支链在其末端具有R35；
R33为C1-C3伸烷基、-C1-C3伸烷基-C(O)、-C(O)-C1-C3伸烷基或-C(O)-C1-C3伸烷基-C(O)；
R35为叠氮基、炔基、炔基-R65、环辛炔或环辛炔-R65，其中R65选自视情况经取代的烷基、视情况经取代的烯基、视情况经取代的炔基、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基、视情况经取代的杂碳环或视情况经取代的杂芳基；
所述波浪线(～)表示与R20的连接位点；以及
n20为1至26。
35.如权利要求1至4中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中所述PEG单元具有选自以下式，或其盐：
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-NH-C(O)-R31
(XXXI)，
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-C(O)NH-R31
(XXXII)，
或
～R20-R21-[O-CH2-CH2]n20-R22-N-(R33-R31)2
(XXXIII)；
其中R20为用于连接至所述氨基酸单元的亚单元(若存在)或所述连接子亚单元L2的一部分的官能基；R21及R22各自视情况且为C1-C3伸烷基基团；R31为支链聚乙二醇链，各支链具有1个至26个乙二醇亚单元，并且各支链在其末端具有R35；R33为C1-C3伸烷基、-C1-C3伸烷基-C(O)、-C(O)-C1-C3伸烷基或-C(O)-C1-C3伸烷基-C(O)；R35为叠氮基、炔基、炔基-R65、环辛炔或环辛炔-R65，其中R65选自视情况经取代的烷基、视情况经取代的烯基、视情况经取代的炔基、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基、视情况经取代的杂碳环或视情况经取代的杂芳基；所述波浪(～)线表示与R20的连接位点；
以及n20为1至26。
36.如权利要求35所述的连接子中间体或连接子，其中所述PEG单元选自以下：
其中R65选自视情况经取代的烷基、视情况经取代的烯基、视情况经取代的炔基、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基、视情况经取代的杂碳环或视情况经取代的杂芳基；并且左侧的波浪线表示与所述氨基酸单元的亚单元或所述连接子亚单元的一部分的连接位点。
37.如权利要求34至36中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中R20选自卤基、醛、羧基、氨基、炔基、叠氮基、羟基、羰基、氨基甲酸酯、硫醇、脲、硫代氨基甲酸酯、硫脲、磺酰胺、酰基磺酰胺、烷基磺酸酯、三唑、氮杂二苯并环辛炔、肼、羰基烷基杂芳基或其受保护的形式。
38.如权利要求1至4所述的连接子中间体或连接子，其包含具有选自以下的式的PEG单元：
～R40-(R43-R41-[O-CH2-CH2]n40-R42-R43-(NR44R45)n41)n42
(XL)
或其盐，其中：
R40为用于连接至所述氨基酸单元的亚单元或所述连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R41及R42不存在或各自独立地为C1-C6伸烷基；
各R43独立地不存在或选自C1-C12伸烷基、-NH-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-NH-、-C(O)-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-C(O)-、-NH-C1-C12伸烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C12伸烷基-NH-、-NH-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-C1-C12伸烷基、-C(O)-NH-C1-C12伸烷基、-杂伸芳基、杂芳基-C1-C12伸烷基、杂芳基-C1-C12伸烷基-C(O)-或-C(O)NR46R47，其中R46及R47中的一者为H或C1-C12伸烷基并且另一者为C1-C12伸烷基；
R44及R45各自独立地为H、多羟基基团、经取代的多羟基基团、-C(O)-多羟基基团或经取代的-C(O)-多羟基基团，其中视情况选用的取代基选自硫酸酯、磷酸酯、烷基硫酸酯及烷基磷酸酯；
所述波浪线(～)表示与R40的连接位点；
n40为1至26；
n41为1至6；以及
n42为1至6。
39.如权利要求1至4所述的连接子中间体或连接子，其包含具有选自以下的式的PEG单元：
～R40-(R41-[O-CH2-CH2]n40-R42-R43-(NR44R45)n41)n42
(XLI)
或其盐，其中：
R40为用于连接至所述氨基酸单元的亚单元或所述连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R41及R42不存在或各自独立地为C1-C6伸烷基；
R43不存在或选自C1-C12伸烷基、-NH-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-NH-、-C(O)-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-C(O)-、-NH-C1-C12伸烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C12伸烷基-NH-、-NH-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-C1-C12伸烷基、C(O)-NH-C1-C12伸烷基、-杂伸芳基、杂芳基-C1-C12伸烷基、杂芳基-C1-C12伸烷基-C(O)-或-C(O)NR46R47，其中R46及R47中的一者为H或C1-C12伸烷基，并且
另一者为C1-C12伸烷基；
R44及R45各自独立地为H、多羟基基团、经取代的多羟基基团、-C(O)-多羟基基团或经取代的-C(O)-多羟基基团，其中视情况选用的取代基选自硫酸酯、磷酸酯、烷基硫酸酯及烷基磷酸酯；
所述波浪线(～)表示与R40的连接位点；
n40为1至26；
n41为1至6；以及
n42为1至6。
40.如权利要求1至4所述的连接子中间体或连接子，其包含具有选自以下的式的PEG单元：
～R40-(R41-[O-CH2-CH2]n40-R42-R43-(NR44R45)n41)n42
(XLII)
或其盐，其中：
R40为用于连接至所述氨基酸单元的亚单元或所述连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R41及R42不存在或各自独立地为C1-C3伸烷基；
R43不存在或选自C1-C6伸烷基、-NH-C1-C12伸烷基、-C1-C6伸烷基-NH-、-C(O)-C1-C6伸烷基、-C1-C6伸烷基-C(O)-、-NH-C1-C6伸烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C6伸烷基-NH-、-NH-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-C1-C6伸烷基、-C(O)-NH-C1-C12伸烷基、-杂伸芳基、杂芳基-C1-C6伸烷基、杂芳基-C1-C6伸烷基-C(O)-或-C(O)NR46R47，其中R46及R47中的一者为H或C1-C6伸烷基，并且另一者为C1-C12伸烷基；
R44及R45各自独立地为H、多羟基基团、经取代的多羟基基团、-C(O)-多羟基基团或经取代的-C(O)-多羟基基团，其中视情况选用的取代基选自硫酸酯、磷酸酯、烷基硫酸酯及烷基磷酸酯；
所述波浪线(～)表示与R40的连接位点；
n40为1至16；
n41为1至4；以及
n42为1至4。
41.如权利要求38至40中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中R40选自卤素、醛、羧基、氨基、炔基、叠氮基、羟基、羰基、氨基甲酸酯、硫醇、脲、硫代氨基甲酸酯、硫脲、磺酰胺、酰基磺酰胺、烷基磺酸酯、三唑、氮杂二苯并环辛炔、肼、羰基烷基杂芳基或其受保护的形式。
42.如权利要求38至40中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中R40具有以下结构中的一种：
其中R＝H或C1-6烷基；并且
n＝0至12
或其立体异构体，其中(*)表示R40与所述氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分的连接位点，并且表示R40与所述PEG单元的其余部分的连接位点。
43.如权利要求至42所述的连接子中间体或连接子，其中R40具有以下结构中的一种：
其中n＝0至12
或其立体异构体，其中(*)表示R40与所述氨基酸单元的亚单元或连接子亚单元L2的一部分的连接位点，并且表示R40与所述PEG单元的其余部分的连接位点。
44.如权利要求38至40所述的连接子中间体或连接子，其中R43-(NR44R45)n41当存在NR43时具有以下结构中的一种：
其中R＝H、C1-6烷基、多羟基或经取代的多羟基
或其立体异构体，其中表示R43与所述PEG单元的其余部分的连接位点。
45.如权利要求44所述的连接子中间体或连接子，其中R43-(NR44R45)n41当存在NR43时具有以下结构中的一种：
或其立体异构体，其中表示R43与所述PEG单元的其余部分的连接位点。
46.如权利要求38至44中任一项的连接子中间体或连接子，其中-NR44R45具有以下结构中的一种：
或其立体异构体，其中表示-NR44R45与所述PEG单元的其余部分的连接位点。
47.如前述权利要求中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中所述PEG单元在连接至所述氨基酸单元或所述连接子亚单元L2的一部分之前具有以下结构中的一种：
其中R为H或烷基，并且n为1至12。
48.如权利要求1至4所述的连接子中间体或连接子，其包含具有选自以下的式的PEG单元：
～R40-(R43-R41--[O-CH2-CH2]n40-R46-[O-CH2-CH2]n40-R42-R43-(NR44R45)n41)n42
(XLIII)
或其盐，其中：
R40为用于连接至所述氨基酸单元的亚单元或所述连接子亚单元L2的一部分的官能基；
R41及R42不存在或各自独立地为C1-C6伸烷基；
各R43独立地不存在或选自C1-C12伸烷基、-NH-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-NH-、-C(O)-C1-C12伸烷基、-C1-C12伸烷基-C(O)-、-NH-C1-C12伸烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C12伸烷基-NH-、-NH-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-C1-C12伸烷基、-C(O)-NH-C1-C12伸烷基、-杂伸芳基、杂芳基-C1-C12伸烷基、杂芳基-C1-C12伸烷基-C(O)-或-C(O)NR46R47，其中R46及R47中的一者为H或C1-C12伸烷基并且另一者为C1-C12伸烷基；
R44及R45各自独立地为H、多羟基基团、经取代的多羟基基团、-C(O)-多羟基基团或经取代的-C(O)-多羟基基团，其中视情况选用的取代基选自硫酸酯、磷酸酯、烷基硫酸酯及烷基磷酸酯；
R46选自氨基、氨基-烷基-氨基或-NH-C(O)-NH-S(O)2-NH-；
所述波浪线(～)表示与R40的连接位点；
n40为1至26；
n41为1至6；以及
n42为1至6。
49.如权利要求48所述的连接子中间体或连接子，其中所述PEG单元在连接至所述氨基酸单元或所述连接子亚单元L2的一部分之前具有以下结构中的一种：
其中R为H或烷基，并且n为1至12。
50.如权利要求1至4所述的连接子中间体或连接子，其包含具有选自以下的式的PEG单元：
或其盐，其中：
各Y独立地为R76或
各R76独立地为H、乙酰基、-P(＝O)(OH)2或-(CH2)v-O-S(＝O)2(OH)；
各Ra及Rb独立地为H，或者Ra及Rb与其所连接的碳一起形成侧氧基基团；
各q独立地为1至26；
各m独立地为1至4；
各n独立地为1至4；
各v独立地为1至6；以及
各*表示用于所述氨基酸单元(AA)、所述连接子亚单元L2或所述扩展单元(L1)的亚单元的连接位点。
51.如权利要求50所述的连接子中间体或连接子，其包含具有选自以下的式的PEG单元：
或其盐，其中：
各R76独立地为H、乙酰基、-P(＝O)(OH)2或-(CH2)v S(＝O)2(OH)；
各q独立地为1至26；
各m独立地为1至4；
各n独立地为1至4；
各v独立地为1至6；以及
各*表示用于所述氨基酸单元(AA)、所述连接子亚单元L2或所述扩展单元(L1)的亚单元的连接位点。
52.如权利要求50或51所述的连接子中间体或连接子，其包含具有选自以下的式的PEG单元：
或其盐，其中：
各q独立地为1至26；
各m独立地为1至4；
各n独立地为1至4；以及
各*表示用于所述氨基酸单元(AA)、所述连接子亚单元L2或所述扩展单元(L1)的亚单元的连接位点。
53.如权利要求50所述的连接子中间体或连接子，其中Y为R76。
54.如权利要求50所述的连接子中间体或连接子，其中Y为
55.如权利要求50所述的连接子中间体或连接子，其中各Ra及Rb独立地为H。
56.如权利要求50所述的连接子中间体或连接子，其中Ra及Rb与其所连接的碳一起形成侧氧基基团。
57.如权利要求50至52中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中q为10至20。
58.如权利要求50至52中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中q为12。
59.如权利要求1至4、38至40或50至52中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中所述PEG单元选自以下，或其盐：
以及
其中各Z在*处连接并且分别选自：
以及
其中各表示用于所述氨基酸单元(AA)、所述连接子亚单元L2或所述扩展单元(L1)的其他亚单元的连接位点。
60.如权利要求1至4中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中所述羧基单元具有下式：
或其盐，其中：
(a)
L70选自C1-C8伸烷基、C1-C8伸烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C8伸烷基-及-C(O)-C1-C8伸烷基-C(O)-；
R70为～NR71(R72-R73)，其中R71选自H、C1-C12烷基、经取代的C1-C12烷基或聚乙二醇(视情况具有1个至12个乙二醇亚单元)，R72不存在或选自视情况经取代的C1-C3伸烷基、视情况经取代的醚、视情况经取代的硫醚、视情况经取代的酮、视情况经取代的酰胺、聚乙二醇(视情况具有1个至12个乙二醇亚单元)、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基或视情况经取代的杂芳基，并且R73为羧基或多羧基，其中多羧基包含1至10、或1至6、或1至4个羧基基团，其中所述羧基基团借由烷基、伸烷基、经取代的烷基、经取代的伸烷基、杂烷基、杂伸烷基、氨基和/或酰胺相互连接；
各波浪线(～)表示用于所述氨基酸单元(AA)、连接子亚单元L2或扩展单元(L1)的其他亚单元的连接位点；以及
p1及o1分别独立地选自0至2；
或
(b)
L70选自C1-C8伸烷基、C1-C8伸烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C8伸烷基-及-C(O)-C1-C8伸烷基-C(O)-；
R70为～NR71(R75-(R73)2)，其中R71选自H、C1-C12烷基、经取代的C1-C12烷基或聚乙二醇(视情况具有1个至12个乙二醇亚单元)，R75为支链的视情况经取代的C1-C3伸烷基、视情况经取代的醚、视情况经取代的硫醚、视情况经取代的酮、视情况经取代的酰胺、聚乙二醇(视情况具有1个至12个乙二醇亚单元)、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基或视情况经取代的杂芳基，并且各R73独立地为羧基或多羧基，其中多羧基包含1至10、或1至6、或1至4个羧基基团，其中所述羧基基团借由烷基、伸烷基、经取代的烷基、经取代的伸烷基、杂烷基、杂伸烷基、氨基和/或酰胺相互连接；
各波浪线(～)表示用于所述氨基酸单元(AA)、连接子亚单元L2或扩展单元(L1)的其他亚单元的连接位点；以及
p1及o1中的每一者独立地选自0至2；
或
(c)
L70选自C1-C8伸烷基、C1-C8伸烷基-C(O)-、-C(O)-C1-C8伸烷基-及-C(O)-C1-C8伸烷基-C(O)-；
R70为～N(R74-R73)(R72-R73)，其中R72及R74各自独立地选自视情况经取代的C1-C3伸烷基、视情况经取代的醚、视情况经取代的硫醚、视情况经取代的酮、视情况经取代的酰胺、聚乙二醇(视情况具有1个至12个乙二醇亚单元)、视情况经取代的碳环、视情况经取代的芳基或视情况经取代的杂芳基，并且各R73独立地为羧基或多羧基，其中包含1至10、或1至6、或1至4个羧基基团，其中所述羧基基团借由烷基、伸烷基、经取代的烷基、经取代的伸烷基、杂烷基、杂伸烷基、氨基和/或酰胺相互连接；
各波浪线(～)表示用于氨基酸单元(AA)、所述连接子亚单元L2或所述扩展单元(L1)的其他亚单元的连接位点；以及
p1及o1分别独立地选自0至2。
61.如权利要求1至60中任一项所述的连接子中间体或连接子，其包含至少一个糖单元。
62.如权利要求1至60中任一项所述的连接子中间体或连接子，其包含至少一个PEG单元。
63.如权利要求1至60中任一项所述的连接子中间体或连接子，其包含至少一个羧基单元。
64.如权利要求1至60中任一项所述的连接子中间体或连接子，其包含至少两个极性单元，各极性单元选自糖单元、PEG单元及羧基单元。
65.如权利要求1至60中任一项所述的连接子中间体或连接子，其包含至少一个糖单元及PEG单元或羧基单元。
66.如权利要求1至60中任一项所述的连接子中间体或连接子，其包含至少一个羧基单元及PEG单元。
67.如权利要求1至60中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中存在所述氨基酸单元(AA)(s＝1)。
68.如权利要求1至67中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中所述氨基酸单元包含至少一个极性单元。
69.如权利要求1至68中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中L2或AA-L2具有以下结构中的一种：
其中所述氨基基团上的波浪线表示用于扩展单元的连接位点，并且所述药物单元连接至苄醇。
70.如权利要求1至67中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中～AA-L2～具有选自以下的式：
～[SU-aa]-L2≈，
～[aa1(PEG)-aa]-L2≈，或
～[CU-aa]-L2≈
其中中括号表示所述氨基酸单元，各aa为AA的视情况选用的亚单元，L2为所述连接子亚单元，各波浪线(～)表示用于扩展单元的连接位点；aa1(PEG)为连接至AA的氨基酸亚单元的PEG单元，SU为连接至AA的亚单元的糖单元或连接至L2的糖单元，并且CU为连接至AA的亚单元的羧基单元或连接至L2的羧基单元；并且双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点，其中aa及aa1独立地选自α、β及γ氨基酸及其衍生物。
71.如权利要求1至67中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中～AA-L2～具有选自以下的式：
其中中括号表示所述氨基酸单元，各aa为AA的氨基酸亚单元，L2为连接至aa的侧链的所述连接子亚单元，波浪线(～)表示用于扩展单元的连接位点；aa1(PEG)为连接至aa的PEG单元，SU为连接至aa的糖单元，CU为连接至aa的羧基单元，并且双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点；其中aa及aa1独立地选自α、β及γ氨基酸及其衍生物。
72.如权利要求1至68中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中所述氨基酸单元包括至少两个极性单元。
73.如权利要求72所述的连接子中间体或连接子，其中～AA-L2～具有选自以下的式：
～[SU-aa-SU]-L2≈，
～[aa1(PEG)-aa-aa2(PEG)]-L2≈，或
～[CU-aa-CU]-L2≈
其中中括号表示所述氨基酸单元，aa为AA的视情况选用的亚单元，L2为所述连接子亚单元，波浪线(～)表示用于扩展单元的连接位点；aa1(PEG)及aa2(PEG)分别为连接至aa的PEG单元或连接至其他PEG单元的PEG单元；各SU为连接至aa的糖单元或连接至其他糖单元的糖单元，各CU为连接至aa的羧基单元或连接至其他羧基单元的羧基单元，并且双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点；其中aa、aa1及aa2独立地选自α、β及γ氨基酸及其衍生物。
74.如权利要求72所述的连接子中间体或连接子，其中～AA-L2～具有选自以下的式：
其中中括号表示所述氨基酸单元，aa为AA的氨基酸亚单元，L2为连接至aa的侧链的所述连接子亚单元，各波浪线(～)表示用于扩展单元的连接位点；aa1(PEG)及aa2(PEG)分别为连接至aa的PEG单元，各SU为连接至aa的糖单元；各CU为连接至aa的羧基单元；并且双波浪(≈)线表示用于药物单元的连接位点；其中aa、aa1及aa2分别独立地选自α、β及γ氨基酸及其衍生物。
75.如前述权利要求中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中连接子亚单元L2为可裂解的连接子单元。
76.如权利要求75所述的连接子中间体或连接子，其中连接子亚单元L2包括可被细胞内蛋白酶裂解的肽。
77.如权利要求76所述的连接子中间体或连接子，其中可裂解的肽包括缬氨酸-瓜氨酸肽、缬氨酸-丙氨酸肽、缬氨酸-赖氨酸肽、苯丙氨酸-赖氨酸肽或甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸肽。
78.如前述权利要求中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中连接子亚单元L2包含至少一个极性单元。
79.如前述权利要求中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中所述极性单元为糖单元(SU)。
80.如权利要求79所述的连接子中间体或连接子，其中所述可裂解的肽包含SU-缬氨酸-瓜氨酸肽、SU-缬氨酸-赖氨酸肽、SU-缬氨酸-丙氨酸肽、SU-苯丙氨酸-赖氨酸肽或SU-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸肽。
81.如权利要求78所述的连接子中间体或连接子，其中所述极性单元为羧基单元(CU)。
82.如权利要求81所述的连接子中间体或连接子，其中所述可裂解的肽包含CU-缬氨酸-瓜氨酸肽、CU-缬氨酸-赖氨酸肽、缬氨酸-(CU-赖氨酸)肽、CU-缬氨酸-丙氨酸肽、CU-苯丙氨酸-赖氨酸肽、苯丙氨酸-(CU-赖氨酸)肽或CU-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸肽，其中CU-赖氨酸为包含赖氨酸残基的羧基单元。
83.如权利要求78所述的连接子中间体或连接子，其中所述极性单元为PEG单元(PEG)。
84.如权利要求83所述的连接子中间体或连接子，其中所述可裂解的肽包含Lys(PEG)-缬氨酸-瓜氨酸肽、缬氨酸-Cit(PEG)肽、Lys(PEG)-缬氨酸-赖氨酸肽、缬氨酸-赖氨酸(PEG)肽、Lys(PEG)-缬氨酸-丙氨酸肽、Lys(PEG)-苯丙氨酸-赖氨酸肽、苯丙氨酸-Lys(PEG))肽或Lys(PEG)-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸肽，其中Lys(PEG)及Cit(PEG)分别包含连接至赖氨酸残基或瓜氨酸残基的PEG单元。
85.如权利要求75至84中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中所述可裂解的肽连接至对氨基苄醇自分解(self immolative)基团(PABA)。
86.如权利要求85所述的连接子中间体或连接子，其中～AA-L2≈具有以下结构中的一种：
其中所述氨基基团上的波浪线表示用于扩展单元的连接位点，并且所述药物单元连接至苄醇。
87.如权利要求1至2中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中～AA-L2～具有以下结构中的一种：
其中各Z在*处连接并且分别选自：
以及
其中所述氨基基团上的波浪线表示用于扩展单元的连接位点，并且所述药物单元连接至苄醇(亦即，苄醇的H被与所述药物单元的键替代)。
88.如权利要求75至85中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中L2连接至AA的亚单元的侧链。
89.如权利要求88所述的连接子中间体或连接子，其中～AA-L2≈具有以下结构中的一种：
或
其中所述氨基基团上的波浪线表示用于扩展单元的连接位点，并且所述药物单元连接至末端酸基团、所述苄醇，或者其中所述波浪(≈)线表示用于所述药物单元的连接位点。
90.如权利要求1至85中任一项所述的连接子中间体或连接子，其中所述氨基酸单元借由非肽连接基团连接至连接子亚单元L2。
91.如权利要求90所述的连接子中间体或连接子，其中所述非肽连接基团选自C1-C10伸烷基、C2-C10伸烯基、C2-C10亚炔基或聚乙二醇。
92.如前述权利要求中任一项所述的连接子中间体，进一步包含扩展单元。
93.如权利要求92所述的连接子，其中所述扩展单元选自以下：
其中R17为-C1-C10伸烷基-、-C1-C10杂伸烷基-、-C3-C8碳环-、-O-(C1-C8伸烷基)-、-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-(其中b为1至26)、-伸芳基-、-C1-C10伸烷基-伸芳基-、-伸芳基-C1-C10伸烷基-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8碳环)-、-(C3-C8碳环)-C1-C10伸烷基-、-C3-C8杂环-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8杂环)-、-(C3-C8杂环)-C1-C10伸烷基-、-C1-C10伸烷基-C(＝O)-、C1-C10杂伸烷基-C(＝O)-、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-C(＝O)-(其中b为1至26)、-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-C(＝O)-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-C(＝O)-(其中b为1至26)、-C3-C8碳环-C(＝O)-、-O-(C1-C8烷基)-C(＝O)-、-伸芳基-C(＝O)-、-C1-C10伸烷基-伸芳基-C(＝O)-、-伸芳基-C1-C10伸烷基-C(＝O)-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8碳环)-C(＝O)-、-(C3-C8碳环)-C1-C10伸烷基-C(＝O)-、-C3-C8杂环-C(＝O)-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8杂环)-C(＝O)-、-(C3-C8杂环)-C1-C10伸烷基-C(＝O)-、-C1-C10伸烷基-NH-、C1-C10杂伸烷基-NH-、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-NH-(其中b为1至26)、-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-NH-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-NH-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(C(＝O))-NH-(CH2-O-CH2)b-C(＝O)-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-(C(＝O))-NH-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-C(＝O)-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-NH-(C(＝O))-(CH2-O-CH2)b-NH-(其中b为1至26)、-C1-C8伸烷基-NH-(C(＝O))-(CH2-O-CH2)b-C1-C8伸烷基-NH-(其中b为1至26)、-C3-C8碳环-NH-、-O-(C1-C8烷基)-NH-、-伸芳基-NH-、-C1-C10伸烷基-伸芳基-NH-、-伸芳基-C1-C10伸烷基-NH-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8碳环)-NH-、-(C3-C8碳环)-C1-C10伸烷基-NH-、-C3-C8杂环-NH-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8杂环)-NH-、-(C3-C8杂环)-C1-C10伸烷基-NH-、-C1-C10伸烷基-S-、C1-C10杂伸烷基-S-、-C3-C8碳环-S-、-O-(C1-C8烷基)-S-、-伸芳基-S-、-C1-C10伸烷基-伸芳基-S-、-伸芳基-C1-C10伸烷基-S-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8碳环)-S-、-(C3-C8碳环)-C1-C10伸烷基-S-、-C3-C8杂环-S-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8杂环)-S-或-(C3-C8杂环)-C1-C10伸烷基-S-；或
其中所述扩展单元包含顺丁烯二酰亚胺基(C1-C10伸烷基-C(O)-、顺丁烯二酰亚胺基(CH2OCH2)p2(C1-C10伸烷基)C(O)-、顺丁烯二酰亚胺基(C1-C10伸烷基)(CH2OCH2)p2C(O)-或其开环形式，其中p2为1至26。
94.如权利要求92所述的连接子中间体或连接子，其中所述扩展单元选自以下：
以及
其中所述波浪线表示所述扩展单元与氨基酸单元的连接位点，并且与所述靶向单元的连接位点在顺丁烯二酰亚胺、伯胺或炔官能基上。
95.如权利要求93所述的连接子，其具有以下结构中的一种：
其中所述药物单元连接至末端酸基团、苄醇，或者其中所述波浪(≈)线表示用于所述药物单元的连接位点。
96.如权利要求92所述的连接子，其具有以下结构中的一种：
其中各Z在*处连接并且分别选自：
以及
其中药物单元视情况连接至末端酸基团、苄醇，或者其中所述波浪(≈)线表示用于所述药物单元的连接位点。
97.如前述权利要求中任一项所述的连接子，其进一步包含连接至连接子亚单元L2以形成药物-连接子的至少一个药物单元。
98.如权利要求97所述的药物-连接子，其中所述药物单元选自细胞毒性剂、免疫调节剂、核酸、生长抑制剂、PROTAC、毒素、放射性同位素及螯合配体。
99.如权利要求98所述的药物-连接子，其中所述药物单元为细胞毒性剂。
100.如权利要求99所述的药物-连接子，其中所述细胞毒性剂选自奥瑞他汀、美登素类化合物(maytansinoid)、喜树碱、倍癌霉素及卡奇霉素。
101.如权利要求100所述的药物-连接子，其中所述细胞毒性剂为奥瑞他汀。
102.如权利要求101所述的药物-连接子，其中所述细胞毒性剂为MMAE或MMAF。
103.如权利要求100所述的药物-连接子，其中所述细胞毒性剂为喜树碱。
104.如权利要求103所述的药物-连接子，其中所述细胞毒性剂为依喜替康或SN-38。
105.如权利要求104所述的药物-连接子，其中所述细胞毒性剂为依喜替康。
106.如权利要求99所述的药物-连接子，其中所述细胞毒性剂为卡奇霉素。
107.如权利要求99所述的药物-连接子，其中所述细胞毒性剂为美登素类化合物。
108.如权利要求107所述的药物-连接子，其中所述美登素类化合物为美登素、美登醇或安沙霉素-2。
109.如权利要求98所述的药物-连接子，其中所述药物单元为免疫调节剂。
110.如权利要求109所述的药物-连接子，其中所述免疫调节剂选自TRL7促效剂、TLR8促效剂、STING促效剂或RIG-I促效剂。
111.如权利要求110所述的药物-连接子，其中所述免疫调节剂为TLR7促效剂。
112.如权利要求111所述的药物-连接子，其中所述TLR7促效剂为咪唑并喹啉、咪唑并喹啉胺、噻唑并喹啉、氨基喹啉、氨基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-氨基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺、四氢吡啶并嘧啶、杂芳并噻二嗪(heteroarothiadiazide)-2,2-二氧化物、苯并萘啶、鸟苷类似物、腺苷类似物、胸苷均聚物、ssRNA、CpG-A、PolyG10或PolyG3。
113.如权利要求110所述的药物-连接子，其中所述免疫调节剂为TLR8促效剂。
114.如权利要求113所述的药物-连接子，其中所述TLR8促效剂选自咪唑并喹啉、噻唑并喹啉、氨基喹啉、氨基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-氨基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺、四氢吡啶并嘧啶或ssRNA。
115.如权利要求110所述的药物-连接子，其中所述免疫调节剂为STING促效剂。
116.如权利要求110所述的药物-连接子，其中所述免疫调节剂为RIG-I促效剂。
117.如权利要求116所述的药物-连接子，其中所述RIG-I促效剂选自KIN1148、SB-9200、KIN700、KIN600、KIN500、KIN100、KIN101、KIN400及KIN2000。
118.如权利要求98所述的药物-连接子，其中所述药物单元为螯合配体。
119.如权利要求118所述的药物-连接子，其中所述螯合配体选自铂(Pt)、钌(Ru)、铑(Rh)、金(Au)、银(Ag)、铜(Cu)、钼(Mo)、钛(Ti)或铱(Ir)；放射性同位素，例如钇-88、钇-90、锝-99、铜-67、铼-188、铼-186、镓-66、镓-67、铟-111、铟-114、铟-115、镥-177、锶-89、钐-153及铅-212。
120.如权利要求97所述的药物-连接子，其具有以下结构：
其中各Z在*处连接并且分别选自：以及
其中各Z在*处连接并且分别选自：
以及
121.一种偶联物，包含连接至权利要求97至120中任一项所述的药物-连接子的靶向单元。
122.如权利要求121所述的偶联物，其中所述靶向单元选自抗体或其抗原结合部分。
123.如权利要求122所述的偶联物，其中所述靶向单元为单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')、Fv、二硫键连接的Fc、scFv、单域抗体、双抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
124.如权利要求121所述的偶联物，其中所述靶向单元为双抗体、DART、抗运载蛋白、亲合体、阿维默(avimer)、DARPin或阿德内丁蛋白(adnectin)。
125.如权利要求121至124中任一项所述的偶联物，其中所述靶向单元为单特异性的。
126.如权利要求121至125中任一项所述的偶联物，其中所述靶向单元为二价的。
127.如权利要求121至124中任一项所述的偶联物，其中所述靶向单元为双特异性的。
128.如权利要求121至127中任一项所述的偶联物，其中所述偶联物的平均载药量(pload)为约1至约8、约2、约4、约6、约8、约10、约12、约14、约16、约3至约5、约6至约8或约8至约16。
129.如权利要求121至128中任一项所述的偶联物，其选自以下：
其中各Z在*处连接并且分别选自：
以及
其中各Z在*处连接并且分别选自：
以及
其中Ab为靶向单元并且n为pload。
130.如权利要求121、128或129中任一项所述的偶联物，其中所述靶向单元结合目标分子。
131.如权利要求130所述的偶联物，其中所述目标分子为CD19、CD20、CD30、CD33、CD70、LIV-1或EGFRv3。
132.如权利要求121、128或129中任一项所述的偶联物，其中所述靶向单元选自：scFv1-ScFv2、ScFv12-Fc-scFv22、IgG-scFv、DVD-Ig、triomab/quadroma、二合一IgG、scFv2-Fc、TandAb及scFv-HSA-scFv。
133.如权利要求121、128或129中任一项所述的偶联物，其中所述靶向单元为癌症相关抗原。
134.如权利要求121、128或129中任一项所述的偶联物，其中所述靶向单元为CD19、CD20、CD30、CD33、CD38、CA125、MUC-1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD44表面黏附分子、间皮素(MLSN)、癌胚抗原(CEA)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFRvIII、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、MAGE-A1、IL-13R-a2、GD2、1p19q、ABL1、AKT1、ALK、APC、AR、ATM、BRAF、BRCA1、BRCA2、cKIT、cMET、CSF1R、CTNNB1、FGFR1、FGFR2、FLT3、GNA11、GNAQ、GNAS、HRAS、IDH1、IDH2、JAK2、KDR(VEGFR2)、KRAS、MGMT、MGMT-Me、MLH1、MPL、NOTCH1、NRAS、PDGFRA、Pgp、PIK3CA、PR、PTEN、RET、RRM1、SMO、SPARC、TLE3、TOP2A、TOPO1、TP53、TS、TUBB3、VHL、CDH1、ERBB4、FBXW7、HNF1A、JAK3、NPM1、PTPN11、RB1、SMAD4、SMARCB1、STK1、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、ROS1、ERCC1、5T4(TPBG)、B7-H3、CCR7、CD105、CD22、CD46、CD47、CD56、CD70、CD71、CD79b、CDH6、CLDN6、CLDN18.2、CLEC12A、DLL3、DR5、ERBB3(HER3)、EPCAM、FOLR1、IGF1R、IL2RA(CD25)、IL3RA、ITGB6、LIV-1、LRRC15、间皮素(MSLN)、NaPi2b(SLC34A2)、黏连蛋白-4、PTK7、ROR1、SEZ6、SLC44A4、SLITRK6、组织因子(TF)、TROP2或B7-H4。
135.如权利要求121、128或129中任一项所述的偶联物，其中所述靶向单元为抗体或其片段，包括利妥昔单抗曲妥单抗帕妥珠单抗贝伐单抗兰尼单抗西妥昔单抗阿仑单抗帕尼单抗替伊莫单抗托西莫单抗伊匹单抗、扎芦木单抗、达雷妥尤单抗、芬妥木单抗、雷莫芦单抗、加利昔单抗、法妥组单抗、奥瑞组单抗、奥法木单抗替妥木单抗(tositumumab)、替伊莫单抗、CD20抗体2F2(HuMax-CD20)、7D8、IgM2C6、IgG12C6、11B8、B1、2H7、LT20、1FS或AT80、达利珠单抗或抗-LHRH受体抗体，包括克隆A9E4、F1G4、AT2G7、GNRH03或GNRHR2。
136.如权利要求121所述的偶联物，其中所述靶向单元为抗体F131并且所述药物-连接子为LD038。
137.如权利要求121、128或129中任一项所述的偶联物，其中所述靶向单元为抗体，包括：
重链可变(VH)区及轻链可变(VL)区，所述VH区包含位于重链可变区框架区中的互补决定区HCDR1、HCDR2及HCDR3，所述VL区包含位于轻链可变区框架区中的LCDR1、LCDR及LCDR3，所述VH及VL CDR具有选自以下列出的氨基酸序列组中的氨基酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34及SEQ ID NO:35；以及
(b)分别为SEQ ID NO：36、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39及SEQ ID NO:40。
138.如权利要求137所述的偶联物，其中所述VH及VL区具有选自以下列出的氨基酸序列对中的氨基酸序列：
分别为SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27；以及
其中所述重链及轻链框架区视情况经由所述框架区中的1个至8个氨基酸取代、缺失或插入来修饰。
139.如权利要求137所述的偶联物，其中所述抗体为F131并且所述药物-连接子为LD038。
140.一种偶联物，所述包含连接至药物-连接子的靶向单元，其中所述靶向单元为抗体F131，并且所述药物-连接子为LD038。
141.一种药物组合物，所述包含权利要求121至140中任一项的偶联物及医药学上可接受的载体。
142.一种权利要求121至140中任一项所述的偶联物或权利要求141所述的药物组合物的用途，所述用途为制备用于治疗患有癌症或自身免疫性疾病的受试者的药剂，其中所述偶联物结合与所述癌症或自身免疫性疾病相关的目标抗原。
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