CN119162037B - 一株枯草芽孢杆菌及其在人参抗铝胁迫中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及人参种植领域，具体而言，涉及一株枯草芽孢杆菌及其在人参抗铝胁迫中的应用。本发明涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.31921。所述的枯草芽孢杆菌YX1，分离自林下山参根际土壤中，表现出较强的耐铝特性，能够产生保外多糖并且有效的定殖在人参根系，对人参的抗盐胁迫具有积极作用，尤其是铝胁迫。
Description
技术领域
本发明涉及人参种植领域，具体而言，涉及一株枯草芽孢杆菌及其在人参抗铝胁迫中的应用。
背景技术
人参(Panax ginseng C.A.Mey)属五加科多年生草本植物。通常，农田栽培人参需要4～6年收获，长期单一栽培模式下，参地土壤酸化，当土壤pH小于5时，铝(Alminum，Al)将被溶解为可溶性Al3+，当Al3+浓度增大时，会干扰土壤微生物群落的代谢活动，对植物产生毒害作用。因此，随栽参年限的延长，活性Al3+含量逐渐增加，当超出一定阈值时，Al3+会对人参产生毒害作用，会成为酸性土壤上限制人参生长的主要因素之一。
根际微生物被称为植物的第二基因组，同时也具有多种耐铝特征，这些特征可能在缓解植物生长压力方面发挥重要作用。研究表明，根际微生物能耐受高浓度铝(如超过100μM或高达200mM)的微生物被称为耐铝微生物。目前，在农业生态系统中，筛选和应用耐铝微生物，从而缓解酸性土壤中铝毒害问题，已成为人参等药用植物栽培产业绿色可持续发展的主要策略之一。
现有的改善酸性土壤中铝对于植物影响的技术有化学肥料的施用如石灰，虽可显著提高土壤pH，但施加量不宜控制，一旦过多就会导致土壤变碱性，对于人参等喜微酸性的植物来说是不利的；同时石灰的施入会固定土壤中的营养元素，如磷，铁，新等，导致这些有益元素的有效性降低，影响人参对这些元素的吸收；施入石灰也有可能导致土壤结构恶化，对土壤中的有益微生物造成不良的效果，不仅会增加农业生长的经济负担，也可能会影响水质，对环境造成严重的影响。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一株枯草芽孢杆菌及其在人参抗铝胁迫中的应用，所述的枯草芽孢杆菌YX1，分离自林下山参根际土壤中，表现出较强的耐铝特性，能够产生保外多糖并且有效的定殖在人参根系，对人参的抗盐胁迫具有积极作用，尤其是铝胁迫。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明的一个方面，涉及一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.31921。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种广泛存在于土壤和植物根际的革兰氏阳性细菌，因其种类多、生长快、易繁殖等特点，目前，已成为安全性高、应用潜力强的菌种之一。枯草芽孢杆菌在生长的过程中能分泌枯草菌素和制霉菌素等物质，从而产生抑制病原菌的作用。本研究发现，枯草芽孢杆菌可产生胞外多糖，易于定殖在人参根系，且表现出较强的耐铝特性。本发明的枯草芽孢杆菌YX1是从吉林省辽源市东丰县云岫参业科技有限公司(125°14'23"E，42°22'40"N，435m)林下山参根际土壤中分离到的，通过施用枯草芽孢杆菌YX1或者含枯草芽孢杆菌YX1的有益微生物菌剂，能提高人参耐铝性，促进人参在酸性环境下的生长，对人参等药用植物栽培产业的健康可持续发展具有重要意义。
人参等药用植物根际土壤中常见的有益微生物包括芽孢杆菌、假单胞菌、链霉菌等。而微生物发挥作用的基础和前提是其能在环境中粘附、定殖及形成生物膜，目前，对于有益微生物定殖过程的机制研究较少，本发明是从林下山参根际土壤分离、培养与鉴定得到的一株枯草芽孢杆菌YX1，能够形成生物膜，可有效定殖在人参根系，通过产生胞外多糖鳌和铝，进而促进人参生长，有效解决人参受铝胁迫的问题，有效的缓解铝对人参的毒害作用，该菌株对人参在抗铝胁迫中具有积极的作用。
本发明的另一个方面，还涉及一种微生物菌剂，包括所述的枯草芽孢杆菌YX1。
采用所述的微生物菌剂对人参进行蘸根或灌根处理，能够有效提高人参的耐铝性，促进人参在盐胁迫的环境中生长，尤其是铝胁迫。
本发明对于微生物菌剂的剂型不做具体限定，本领域常规的剂型均可作为微生物菌剂的剂型，不同的剂型并不影响微生物菌剂的功效。在一些具体的实施方式中，所述微生物菌剂包括但不限于：固体菌剂或液体菌剂。
进一步地，所述的微生物菌剂还包括：辅料。所述辅料包括但不限于本领域常规的载体、溶剂或包覆剂等。
本发明的另一个方面，还涉及一种人参抗盐胁迫的方法，向人参施用所述的枯草芽孢杆菌YX1或所述的微生物菌剂。
所述的人参抗盐胁迫的方法，向人参施用枯草芽孢杆菌YX1或者微生物菌剂，利用枯草芽孢杆菌YX1具有较强的耐铝性、可在人参根系定殖并且能够分泌产生大量的胞外多糖等特性，促进人参抗盐胁迫的能力，尤其是铝胁迫。
进一步地，所述施用的方式包括但不限于：蘸根和/或灌根。
蘸根是指将作物的根部浸入稀释成一定浓度的肥料或药液中的处理过程。
灌根是一种灌溉方式，具体来说，就是将药水或肥料等倒在植物的根部。
进一步地，所述盐胁迫包括但不限于：铝胁迫。
进一步地，所述铝胁迫包括但不限于：由Al3+引起的土壤酸化。
本发明的另一个方面，还涉及所述的枯草芽孢杆菌YX1或所述的微生物菌剂在人参抗盐胁迫中的应用。
进一步地，所述盐胁迫包括：铝胁迫。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX1，从吉林省辽源市东丰县云岫参业科技有限公司(125°14'23"E，42°22'40"N，435m)林下山参根际土壤中分离，表现出较强的耐铝特性，能够产生保外多糖并且有效的定殖在人参根系，对人参的抗盐胁迫具有积极作用，尤其是铝胁迫。
(2)本发明提供的微生物菌剂，对人参进行蘸根或灌根处理，能够有效提高人参的耐铝性，促进人参在盐胁迫的环境中生长，尤其是铝胁迫。
(3)本发明提供的人参抗盐胁迫的方法，向人参施用枯草芽孢杆菌YX1或者微生物菌剂，利用枯草芽孢杆菌YX1具有较强的耐铝性、可在人参根系定殖并且能够分泌产生大量的胞外多糖等特性，促进人参抗盐胁迫的能力，尤其是铝胁迫。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX1的形态图；
图2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX1的系统发育进化树；
图3为不同浓度铝处理下枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX1的形态图；
图4为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX1的耐铝性分析结果图；
图5为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX1在铝处理下生物膜形成的激光共聚焦显微镜成像图；
图6为不同浓度铝处理下枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX1产胞外多糖含量结果图；
图7为不同浓度铝处理下枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX1产IAA含量结果图；
图8为铝处理下枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX1对人参生长的表型图；
图9为铝处理下枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX1对人参生长的促进作用结果图。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1枯草芽孢杆菌YX1的分离与培养
本发明从吉林省辽源市东丰县云岫参业科技有限公司(125°14'23"E，42°22'40"N，435m)林下山参根际土壤中分离到一株枯草芽孢杆菌YX1，具体的分离培养方法如下：
(1)称取根际土壤10g，添加90mL无菌水于500mL锥形瓶中，于28℃，180rpm的摇床充分震荡30min，静置10min后制得稀释度为10-1土壤悬浊液。用无菌水将悬浊液按10倍的浓度梯度依次进行稀释，取稀释倍数为10-3、10-4、10-5的土壤悬液待用。
(2)将灭菌后的100mM的Al2(SO4)3溶液与配好的TSA培养基倒入培养皿中，使其铺满培养皿底部，使其凝固；吸取100μL不同浓度梯度的土壤悬浮液分别加入到TSA培养基中，用涂布棒将土壤稀释液均匀涂布到整个培养基上，使用封口膜封住培养皿，放置28℃恒温培养中培养7d。
(3)待TSA培养基长出菌落，选择性状、颜色、大小有差异的单菌落，将单菌挑选至背面划有方格线的TSA培养基中，28℃培养箱中继续培养7天，将单菌挑至含有1mL TSB液体培养基的1.5mL的离心管中，180r·min-128℃摇床上摇培备用。
实施例2枯草芽孢杆菌YX1的纯化与保存
在鉴定前用平板划线法对分离得到菌株进行纯化。取提前制备好的YX1浑浊菌液，在无菌操作内，使用灭菌的接种环蘸取菌液，在TSA平板上做“Z”字形划线，剩余菌液冻存于-80℃冰箱备用；将接种后的TSA平板于28℃恒温培养箱中倒置培养7d，期间观察菌落生长情况，是否有杂菌污染。
实施例3枯草芽孢杆菌YX1的初步鉴定
将菌种接种于TSA的培养基上，倒置于28℃培养箱中培养2～3d，出现单菌落后，观察菌落质地、形状和大小、边缘是否整齐、表面是否光滑、有无隆起形状、透明度、菌落及培养基的颜色等。由图1可见，YX1菌株呈现为微黄色，近圆形，边缘不规则，菌落粗糙，有褶皱。
实施例4枯草芽孢杆菌YX1的分子生物学鉴定
取4μL菌液作为PCR扩增的模板，利用细菌16S rDNA的通用引物799F(5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′)和1193R(5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′)对菌株序列进行扩增，50μL PCR反应体系为菌液模板4μL，2×Taq MasterMix(GenStar)25μL，799F/1193R各1.7μL，dd H2O 17.6μL。PCR反应条件94℃预变性2min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸5min。所得PCR产物通过1％的琼脂糖电泳，将能检测到目的条带的PCR原菌液送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测得的序列输入到NCBI中，应用Blast和DNAMAN软件进行比对分析，在GenBank中找到同源性非常高的相似菌株序列，在线BLAST结果显示，菌株YX1与Bacillus subtilis subsp.inaquosorum亲缘关系最近，相似性为96.18％，其次为Bacillus subtilis subsp.stercoris corrig和Bacillus subtilissubsp.spizizenii str.TU-B-10，相似性均为96.08％，基于16S rRNA基因序列并利用MEGA7.0做进化树分析，结果显示，菌株YX1与NR 116017Bacillus subtilis strain BCRC10255共处一个大的分支。综上，最终确定YX1为枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis)的成员，将其命名为Bacillus subtilis YX1，见图2。
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.31921，保藏日期为2024年9月10日。
16S rDNA测序结果如SEQ ID No.1所示：
SEQ ID No.1：
AGGAGGCTGCGGGGCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGAGCGAACAGGATTAGATACGCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCGAGGACTGAAACTCAAAGGATTTGACAGGGGCGCGGGCAAGCGTTGGAGCATGTGGTTTAGTTCTAAGCAACGCGCACAAGCTTACCAGGTCGTGGAGATGCGTCTGACATCGTAGAGATATACGGCCCGTTCCGGCAGAGTGACAGATGATCATGGGGTGTCGGCGCTCCTCTCATGAGATGTTGGGTTAGGTCCGACA。
实施例5枯草芽孢杆菌YX1的耐铝性的测定
将YX1菌株分别置于铝浓度为25mM、50mM、75mM、100mM、150mM、200mM的30mL LB液体培养基中，180r·min-1 28℃摇床上摇培；用移液枪吸取制备好的YX1菌液点接至铝浓度为25mM、50mM、75mM、100mM、150mM、200mM的LB平板上，28℃培养2d，对菌落形态进行拍照，同时测定摇培好的菌液的OD600，结果如图3和图4所示。结果表明，随着随铝浓度增大，YX1菌株的生长呈先促进后抑制的趋势；在铝浓度为200mM时，YX1菌株的生长受到抑制；铝浓度为100mM时，YX1菌株耐铝性较强。
实施例6枯草芽孢杆菌YX1产生物膜能力的测定
将YX1菌株转移至TSB液体培养基，28℃、180r/min摇床培养3d，将菌液分别划线活化于胰陈大豆培养琼脂(tryptone soy agar，TSA)平板；挑单菌落于胰大豆培养肉汤(typtone soy broth，TSB)摇菌；将菌液用生理盐水稀释至OD600为0.5，将稀释后的菌液加入六孔板底部放入盖玻片(经浓硫酸浸泡过夜，泡入75％乙醇备用)，后于恒温培养箱37℃培养；采用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的刀豆蛋白A(FITC-ConA)和碘化丙啶(PI)进行双荧光染色，在12h取出玻片，PBS反复冲洗，吸水纸吸干多余水分后，用2.5％的戊二醛固定1.5h，40％甘油封闭于洁净载玻片，激光扫描共聚焦显微镜观察并采集图像。结果表明，铝浓度为100mM时，YX1菌株形成生物膜的能力远高于对照，且显著增强(图5)。
实施例7枯草芽孢杆菌YX1产胞外多糖能力的测定
将YX1菌株摇床培养48h后，用乙醇沉淀法提取发酵液粗多糖；将10mL发酵液置于50mL离心管中，低温离心去除菌体后，取上清液加入2倍体积的预冷乙醇，4℃静置12h后10000r/min离心10min。所得沉淀用蒸馏水溶解定容即为粗多糖溶液；苯酚-硫酸法测定其OD490吸光值；以不同浓度的葡萄糖标准溶液(0.20mg/mL、0.40mg/mL、0.60mg/mL、0.80mg/mL、1.00mg/mL)制作葡萄糖标准曲线，根据标准曲线计算菌株产多糖含量。结果发现，随着铝浓度增大，菌株产生EPS含量呈先增大后降低趋势；在铝浓度为100mM时，EPS含量最大(图6)。
实施例8枯草芽孢杆菌YX1产生长素能力的测定
用分光光度法测定菌悬液的OD600值，然后将菌悬液10000×g离心10min，取上清液加入等体积Salkowski比色液，避光静置30min，采用分光光度法测定其OD530值。计算菌浓度OD600值为1时，单位体积菌悬液中细菌分泌生长素(IAA)的量。随铝浓度增大，YX1菌株IAA含量呈先增大后下降趋势，且在铝浓度为25mM时，YX1菌株产IAA含量最大，且不同浓度铝处理下，YX1菌株IAA含量无显著差异(图7)。
实施例9枯草芽孢杆菌YX1对人参生长的促进实验
(1)枯草芽孢杆菌YX1的活化：将在4℃保存的菌株YX1菌种进行活化，吸取10μL冻存的菌液接种于1mL新的TSB液体培养基，28℃下180rpm·min-1摇床培养7d，至菌液浑浊；吸取2μL活化后的菌液于分光广度计上测量600nm的OD值，使用无菌水将菌液OD值调整为0.2，备用。
(2)将枯草芽孢杆菌YX1接种至人参根系：选取大小一致，芽孢未损坏且表面消毒的一年生人参苗，用蒸馏水冲洗干净，使用OD值为0.2的菌液将参苗提前浸泡30min待用。将土壤灭菌后，装入直径为18cm的花盆中，每盆装1.5kg土。将提前浸泡过菌液的人参移栽到土壤中，移栽后取10mL菌悬液进行灌根处理。4个处理分别为对照组土壤用等量无菌水处理、参苗单独接种YX1菌液、参苗用100mM铝处理、以及参苗接种菌液和100mM铝共处理，每7d浇一次水，进行观察。
(3)铝处理下，枯草芽孢杆菌YX1对人参生长的促进作用：将上述4个处理后的参苗生长90d后进行拍照，见图8。同时将人参苗分为地上部分和地下部分，测定人参株高、地上部鲜重、根长、地下部鲜重。结果表明，与对照相比，单独加入YX1菌株可显著促进人参苗的生长，100mM铝处理显著抑制人参生长，而在100mM铝处理下人参接种YX1菌株可缓解铝对人参生长的抑制作用(图9)。
因此，本发明认为，YX1菌株促进铝处理下人参生长的原因是该菌株分泌了胞外多糖，形成生物膜且胞外多糖的吸附作用降低了铝离子的浓度，从而缓解了铝对于人参生长的抑制作用。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；本领域的普通技术人员应当理解：在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围；因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些替换和修改。
Claims (8)
1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YX1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.31921。
2.微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的枯草芽孢杆菌YX1。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包括：固体菌剂或液体菌剂。
4.根据权利要求2或3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述的微生物菌剂还包括：辅料。
5.一种人参抗盐胁迫的方法，其特征在于，向人参施用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌YX1或权利要求2～4任一项所述的微生物菌剂；
所述盐胁迫为：铝胁迫。
6.根据权利要求5所述的人参抗盐胁迫的方法，其特征在于，所述施用的方式包括：蘸根和/或灌根。
7.根据权利要求5所述的人参抗盐胁迫的方法，其特征在于，所述铝胁迫为：由Al3+引起的土壤酸化。
8.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌YX1或权利要求2～4任一项所述的微生物菌剂在人参抗盐胁迫中的应用；
所述盐胁迫为：铝胁迫。
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