CN114517165A

CN114517165A - 一株产iaa及eps的耐盐促生细菌kvp3及其制备

Info

Publication number: CN114517165A
Application number: CN202111523180.8A
Authority: CN
Inventors: 赵飞; 张焕仕; 刘畅
Original assignee: NANJING INSTITUTE FOR COMPREHENSIVE UTILIZATION OF WILD PLANTS CHINA COOP
Current assignee: NANJING INSTITUTE FOR COMPREHENSIVE UTILIZATION OF WILD PLANTS CHINA COOP
Priority date: 2021-12-14
Filing date: 2021-12-14
Publication date: 2022-05-20

Abstract

本发明提供了一株产IAA和EPS的耐盐促生细菌KVP3及其制备，属于农业微生物技术领域，所述耐盐促生细菌KVP3保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.62042。本发明所述耐盐促生细菌KVP3能够在高盐浓度下促进植物种子的萌发及生长，且能够分泌IAA和EPS，IAA的分泌量最高可达305.9 mg/L，EPS分泌量最高可达0.37 g/100 mL，在环境NaCl浓度为200 mM时，所述耐盐促生细菌KVP3处理的白菜根长及茎长与对照组相比较分别增加453.1%及49%，能显著促进白菜的生长。因此，所述耐盐促生细菌KVP3可用于制备产IAA和/或EPS或具促生功能的耐盐浸种剂等新型微生物接种剂，从而应用于盐渍土中的作物促生和农作物产量提升。

Description

一株产IAA及EPS的耐盐促生细菌KVP3及其制备

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一株耐盐植物促生细菌KVP3及其制备与应用。

背景技术

盐渍土是我国最主要的中低产土壤类型之一，其生产力水平与其质量状况有非常密切的关系。如何有效防治与改良是加强盐渍土的合理利用、维持盐渍土壤地力可持续性的核心问题。近年来生物措施和技术在土壤盐碱障碍治理和修复中的重要性不断增加，耐盐植物（作物）种植、复合生物系统构建及生物有机肥应用等技术可在盐碱障碍治理和修复研究、盐碱地资源的有效利用等方面提供帮助，进而为农业发展、粮食安全以及生态环境安全提供参考依据。

植物与根际微生物联系较为紧密，其中细菌、真菌在植物根际微生物中最为常见且发挥着重要作用，他们不仅为植物持续提供养分，还能帮助植物缓解各类胁迫。植物根际促生细菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是指植物根际土壤中具有抑制植物病害和促进植物生长特性的有益细菌，有利于缓解盐胁迫对植物种子萌发、器官分化、生物量积累与分配以及作物产量与品质等方面造成的不良影响。

种子是农业生产中最基础、最重要的生产资料，而盐胁迫会使种子在萌发过程中出现多种不良的生理生化反应，损害幼苗的建成过程，进而对植物生长和农作物产量产生负面影响。因此，作物种子如何在盐胁迫生境下能够更快、更整齐地萌发、建成幼苗并达成从异养向光合自养的转换，是确保作物高产稳产的重要前提。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种筛选自滨海盐土上生长的耐盐先锋植物海滨锦葵根际的耐盐植物促生细菌KVP3，该菌高产吲哚乙酸IAA和胞外多糖EPS，可提高作物种子在高盐胁迫条件下的萌发和生长，实现农作物增产。

为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：提供了一株产IAA和EPS的耐盐促生细菌KVP3，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No. 62042。

优选的，在利用所述耐盐促生细菌KVP3制备IAA时，包括以下步骤：调节含有500mg/L的L-色氨酸的LB培养基的pH值为6.0-8.0，接种所述耐盐促生细菌KVP3的菌悬液的体积为所述LB培养基体积的1%；所述菌悬液的OD₆₀₀值为0.8-1.2。

优选的，在利用所述耐盐促生细菌KVP3制备EPS时，包括以下步骤：将液体发酵培养基调节pH值为7.0-8.0，接种所述耐盐促生细菌KVP3，振荡培养，所述耐盐促生细菌KVP3的接种体积为所述液体发酵培养基体积的1%；所述菌悬液的OD600值为0.8-1.2；所述液体发酵培养基包括以下浓度的原料：蔗糖 40 g/L，牛肉膏 3 g/L，蛋白胨 5 g/L，NaCl 5 g/L。

优选的，所述振荡培养的温度为28-30℃，振荡速率为180-200 r/min。

本发明提供了所述耐盐植物促生细菌KVP3在制备耐盐浸种剂中的应用。

优选的，所述耐盐浸种剂的类型为菌水剂；所述菌水剂在应用时，以所述耐盐植物促生细菌KVP3的量计，为10⁷-10⁸ CFU/mL，接种量为浸没种子即可，浸种时间2-6 h。

本发明提供了一株产IAA和EPS的耐盐植物促生细菌KVP3，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No. 62042。本发明所述耐盐植物促生细菌KVP3为革兰氏阴性菌，好氧，化能异养，菌落呈乳白色，表面光滑，不透明，边缘整齐微凸起。

本发明所述耐盐植物促生细菌KVP3能高产IAA，且产EPS能力较强，具有较高的植物促生及保肥保水能力，IAA的分泌量最高可达305.9 mg/L，EPS产量最高可达0.37 g/100mL。因此，可将所述耐盐植物促生细菌KVP3用于制备兼具促生功能的浸种菌剂，从而应用于盐渍土中促进作物种子萌发及增产。

本发明所述耐盐植物促生细菌KVP3能够一菌多用，发挥菌株的最大效能，一方面可以促进盐渍土中作物种子萌发及生长，增加作物产量；另一方面可保水保肥，提高肥料利用率，有作为功能微生物肥料的潜力，为推进农业绿色发展做贡献。

生物保藏信息

耐盐植物促生细菌KVP3，分类命名为维尼罗假单胞菌（Pseudomonas veronii），于2021年11月08日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市越秀区先烈中路100号广东省微生物研究所，保藏号为GDMCC 62042。

附图说明

图1为菌株KVP3在LB平板上生长2 d的菌落形态。

图2为供试菌株发酵液中IAA含量。

图3为菌株KVP3基于NJ法构建的系统发育树。

图4为菌株KVP3的最适生长pH（初始pH对菌株KVP3生长的影响）。

图5为菌株KVP3的最适生长温度（初始温度对菌株KVP3生长的影响）。

图6为菌株KVP3的最适生长盐浓度（初始盐浓度对菌株KVP3生长的影响）。

图7为不同盐浓度条件下菌株KVP3对青菜（白菜）苗期生物量的影响。

图8为200 mM盐浓度条件下菌株KVP3对青菜（白菜）苗期生长的影响。

注：上，KVP3处理；中，NaCl处理；下，水处理。

具体实施方式

本发明提供了一株耐盐植物促生细菌KVP3，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 62042。

本发明所述耐盐植物促生细菌KVP3从盐城市金海农场野外试验基地内采集海滨锦葵幼苗根际土中筛选得到，经验证后，所述耐盐植物促生细菌KVP3为为革兰氏阴性菌，好氧，化能异养；在LB培养平板上培养2 d的菌落形态如图1所示，圆形，直径2-3 mm，表面光滑，半透明，边缘整齐微凸起，乳白色。

本发明还提供了所述耐盐植物促生细菌KVP3在制备IAA和/或EPS的应用。

本发明在利用所述耐盐植物促生细菌KVP3制备IAA时，优选包括以下步骤：调节含有500 mg/L L-色氨酸的LB培养基的pH值为6.0-8.0，接种所述耐盐植物促生细菌KVP3的菌悬液，振荡培养；所述菌悬液是利用接种环从固体培养基上挑取一环菌体，将其接入含5 mLLB培养基中，随后将试管加塞置于30℃、180 r/min摇床中过夜培养所得；所述菌悬液的OD₆₀₀值为0.8-1.2，接种体积为所述LB培养基体积的1%。在本发明中，进行所述振荡培养时，培养基的装液量优选为50 mL/ 250 mL，培养时间优选为48 h，此时培育出的耐盐植物促生细菌KVP3产IAA的量最高且菌株生长能力最佳。本发明所述振荡培养的温度优选为28-30℃，振荡速度优选为180-200 r/min。

本发明在利用所述耐盐植物促生细菌KVP3制备EPS时，优选包括以下步骤：将液体发酵培养基调节pH值为6.0-7.0，接种所述耐盐植物促生细菌KVP3包括以下步骤：将液体发酵培养基调节pH值为7.0-8.0，接种所述耐盐促生细菌KVP3，振荡培养，所述菌悬液是利用接种环从固体培养基上挑取一环菌体，将其接入含5 mL LB培养基中，随后将试管加塞置于30℃、180 r/min摇床中过夜培养所得；所述耐盐促生细菌KVP3的接种体积为所述液体发酵培养基体积的1%；所述菌悬液的OD600值为0.8-1.2；所述液体发酵培养基包括以下浓度的原料：蔗糖 40 g/L，牛肉膏 3 g/L，蛋白胨 5 g/L，NaCl 5 g/L。在本发明中，进行所述振荡培养时，培养基的装液量优选为100 mL/ 500 mL，培养时间优选为48 h，此时培育出的耐盐植物促生细菌KVP3产EPS的量最高且菌株生长能力最佳。本发明所述振荡培养的温度为28-30℃，振荡速率为180-200 r/min。

本发明所述耐盐植物促生细菌KVP3在制备耐盐浸种剂中的应用。

本发明所述耐盐浸种剂的类型优选为菌水剂；所述菌水剂在应用时，以所述耐盐植物促生细菌KVP3的量计，为10⁷-10⁸ CFU/mL，其接种量优选为浸没种子即可，浸种时间2-6h。

下面结合实施例对本发明提供的一株产IAA和EPS的耐盐植物促生细菌KVP3及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、试剂准备：

LB培养基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，氯化钠 10 g，蒸馏水 1000 mL，调节pH 7.0-7.4，121℃灭菌20 min。

有氮培养基：蔗糖 10 g，硫酸铵 1 g，磷酸氢二钾 2 g，硫酸镁 0.5 g，氯化钠0.1 g，酵母膏 0.5 g，蒸馏水 1000 mL，调节pH 7.0-7.4，121℃灭菌20 min （固体培养基在此配方上加琼脂20 g）。

产糖培养基：蔗糖 40 g，牛肉膏 3 g，蛋白胨 5 g，NaCl 5 g，蒸馏水 1000 mL，调节pH 7.0-7.4，121℃灭菌20 min。

2、菌株筛选

称取江苏省盐城市金海农场野外试验基地内采集的海滨锦葵幼苗根际土10 g于90 mL无菌水中，28℃，180 r/min振荡30 min，后取1 mL土壤悬液稀释涂布于含5% NaCl的营养琼脂平板，倒置于28℃培养箱中培养。稀释平板法分离纯化耐盐菌株，筛选出的菌株分别采用甘油法及斜面法进行保藏。

供试土壤的基本性质如表1所示：

表1 供试土壤基本理化性质

IAA定性测定：将耐盐细菌接种于含有500 mg/L L-色氨酸的LB液体培养基，30℃，180 rpm，培养48 h，取100 μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加入100 μL Salkowski比色液（50 mL 35％HClO₄，1 mL 0.5 mol/L FeCl₃，遮光保存），将白色陶瓷板于25℃培养箱中放置30 min后对其进行观察，颜色变红者表示其能分泌吲哚乙酸，颜色的深浅代表着其产吲哚乙酸能力的高低，不变色代表其不产吲哚乙酸，阴性对照为100 μL未接种菌液的LB培养基加入100 μL Salkowski比色液。

IAA定量测定：对通过定性分析筛选出的具有分泌IAA能力的菌株进行定量测定，培养条件同定性测定，先用分光光度法测定菌悬液的OD₆₀₀值，然后吸取5 mL菌悬液于10000r/min离心10 min，取1 mL上清液加入50 μL10%的正磷酸，后加入2 mL Salkowski比色液，于25℃培养箱中放置30 min后，测定其OD₅₃₀值，通过IAA标准曲线计算菌悬液中IAA含量，结果见图2。

EPS定量测定：选择在有氮固体培养基上生长粘稠有光泽的供试菌株，接种到100mL产糖培养基的三角瓶中，180 rpm，30℃培养96 h。将发酵液10000 r/min，10 min离心后取上清液，加入3倍体积的乙醇。常温静置一夜后，过滤并低温烘干至恒重。

通过IAA定性及定量分析，有13株菌具有分泌IAA能力，发酵液中IAA含量在177.3-577.34 mg/L之间，结果如图2所示。

通过EPS定量分析，有3株菌表现出较强的分泌EPS的能力，EPS干重在0.1-0.37 g/100 ml之间，结果见表2。

表2供试菌株EPS分泌能力

通过以上测定即可筛选出产IAA和EPS能力均较强的耐盐植物促生细菌KVP3，其菌株发酵液中IAA浓度可达305.9 mg/L， EPS含量可达0.37 g/100 mL。

将上述方法筛选分离出的菌株KVP3经通用生物公司进行测序，根据所获得的16SrDNA序列结果，在GenBank数据库中进行比对，Blast搜索同源序列，使用MEGA 5.0软件，用Neighbour-Joining法构建系统发育树。结合形态学分析及该菌株的生理生化结果特征，鉴定为维罗尼假单胞菌（Pseudomonas veronii）。该菌根据16S rDNA序列构建的KVP3菌株的系统发育树，如图3所示。

实施例2

针对不同pH、NaCl、温度测试对菌株生长的影响

1、培养基初始pH对菌株生长的影响

种子液制备：将供试菌株接种至4 mL LB培养液的试管中，在30 ℃、200 r/min条件的摇床上生长18 h。

吸取200 μL的种子液分别加入4 mL的pH为6.0、7.0、8.0、9.0的LB培养液的试管中，在30 ℃、200 rpm的摇床生长24 h后，在600 nm的波长处，以未接菌的对应pH的培养液调零，测定OD值，结果如图4所示。

2、培养基初始NaCl对菌株生长的影响

吸取200 μL的菌液分别加入4 mL的NaCl浓度为0.5%、1.0%、2.0%、3.0%的牛肉膏蛋白胨培养液的试管中，在30 ℃、200 rpm的摇床生长24 h后，在600 nm的波长处，以未接菌的对应NaCl浓度的培养液调零，测定OD值，结果如图5所示。

3、培养温度对菌株生长的影响

吸取200 μL的菌液至4 mL LB培养液的试管中。设置摇床的转速为200 rpm和不同的温度15 ℃、30 ℃、45 ℃，生长24 h后，在600 nm的波长处，以未接菌相同条件的培养液调零，测定OD值。结果如图6所示。

实施例3

菌剂的促生实验

试验过程：设置2个对照，6个处理，对照组为无菌水对照、100 mM NaCl溶液、150mM NaCl溶液及200 mM NaCl溶液。将供试菌株分别接入LB液体培养基中，180 rpm，30 ℃培养24 h，用相应的NaCl溶液制成1-9×10⁸ CFU/mL的菌悬液。

种子消毒：取饱满整齐的白菜种子500粒置于灭菌培养皿内，0.5% NaClO溶液对种子消毒12 min，无菌水洗涤3次，无菌水、菌液（浓度2×10⁸ CFU/mL）分别浸泡种子2小时。

接种及观察：每组处理用镊子将消毒的种子，均匀地放置在铺有灭菌滤纸9 cm直径的培养皿中，每皿10粒。每皿加入菌液5 ml作为实验组，对照组加入5 ml无菌水、各浓度NaCl溶液润湿滤纸。用封口膜封住培养皿避免水分散失。置于25 ℃恒温培养箱培养。

自培养之时开始，每隔24 h观察种子发芽情况（以根长0.2 cm作为萌芽标志），2 d时记录种子发芽率、茎长及根长，发芽率（U）=（n1/N1）×100%（n1为发芽种子数，N1为种子总数），结果如表3所示。

表3 不同盐浓度对各处理白菜种子发芽率（%）的影响

NaCl浓度为100 mM时，所述耐盐促生细菌KVP3处理的白菜根长及茎长显著低于对照组；NaCl浓度为150 mM时，耐盐促生细菌KVP3处理的白菜根长与对照组相比增加90.3%，茎长无差异；NaCl浓度为200 mM时，耐盐促生细菌KVP3处理的白菜根长及茎长与对照组相比较分别增加453.1%及49%，能显著促进白菜的生长，结果如图7所示。

其中，耐盐促生细菌KVP3对白菜幼苗的促生效果如图8。

本发明提供了一株产IAA及EPS的耐盐植物根际促生细菌KVP3及其应用，具有产IAA和EPS的能力，可在高盐条件下促进植物种子的萌发及植株的生长。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应该指出，对本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中华全国供销合作总社南京野生植物综合利用研究所

<120> 一株产IAA及EPS的耐盐促生细菌KVP3及其制备

<141> 2021-11-18

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 1501

<212> DNA

<213> 维罗尼假单胞菌(Pseudomonas veronii)

<400> 3

tagagtttga tcctggctca gattgaacgc tggcggcagg cctaacacat gcaagtcgag 60

cggtagagag aagcttgctt ctcttgagag cggcggacgg gtgagtaatg cctaggaatc 120

tgcctggtag tgggggataa cgttcggaaa cggacgctaa taccgcatac gtcctacggg 180

agaaagcagg ggaccttcgg gccttgcgct atcagatgag cctaggtcgg attagctagt 240

tggtgaggta atggctcacc aaggcgacga tccgtaactg gtctgagagg atgatcagtc 300

acactggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattggac 360

aatgggcgaa agcctgatcc agccatgccg cgtgtgtgaa gaaggtcttc ggattgtaaa 420

gcactttaag ttgggaggaa gggcagttac ctaatacgtg attgttttga cgttaccgac 480

agaataagca ccggctaact ctgtgccagc agccgcggta atacagaggg tgcaagcgtt 540

aatcggaatt actgggcgta aagcgcgcgt aggtggttag ttaagttgga tatgaaatcc 600

ccgggctcaa cctgggaact gcattcaaaa ctgactgact agagtatggt agagggtggt 660

ggaatttcct gtgtagcggt gaaatgcgta gatataggaa ggaacaccag tggcgaaggc 720

gaccacctgg actgatactg acactgaggt gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga 780

taccctggta gtccacgccg taaacgatgt caactagccg ttgggagcct tgagctctta 840

gtggcgcagc taacgcatta gttgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca 900

aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg 960

aagaacctta ccaggccttg acatccaatg aactttctag agatagattg gtgccttcgg 1020

gaacattgag acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1080

gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta gttaccagca cgttatggtg ggcactctaa 1140

ggagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat catggccctt 1200

acggcctggg ctacacacgt gctacaatgg tcggtacaga gggttgccaa gccgcgaggt 1260

ggagctatcc cagaaaaccg atcgtagtcc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa 1320

gtcggaatcg ctagtaatcg cgaatcagaa tgtcgcggtg aatacgttcc cgggccttgt 1380

acacaccgcc cgtcacacca tgggagtggg ttgcaccaga agtagctagt ctaaccttcg 1440

gggggacggt taccacggag tgattcatga ctggggtgaa gtcgtaacaa ggtagccgta 1500

a 1501

Claims

1.一株产IAA及EPS的耐盐促生细菌KVP3，其特征在于，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 62042。

2.权利要求1所述耐盐促生细菌KVP3在制备IAA、EPS或浸种剂等促生菌剂中的应用。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，在利用所述耐盐促生细菌KVP3制备IAA时，包括以下步骤：调节含有500 mg/L L-色氨酸的LB培养基的pH值为6.0-8.0，接种所述耐盐促生细菌KVP3的菌悬液，振荡培养；所述菌悬液的体积为所述LB培养基体积的1%；所述菌悬液的OD₆₀₀值为0.8-1.2。

4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，在利用所述耐盐促生细菌KVP3制备EPS时，包括以下步骤：调节所述产糖培养基的pH值为6.0-8.0，接种所述耐盐促生细菌KVP3的菌悬液，振荡培养；所述菌悬液的体积为所述LB培养基体积的1%；所述菌悬液的OD₆₀₀值为0.8-1.2。

5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述振荡培养的温度为28-30℃，振荡速率为180-200 r/min。

6.根据权利要求2所述应用，其特征在于，在利用所述耐盐促生细菌KVP3在制备浸种剂等促生菌剂时，包括以下步骤：将液体发酵培养基的pH值为6.0-8.0，接种所述耐盐促生细菌KVP3的菌悬液，振荡培养；所述菌悬液的体积为所述培养基体积的1%；所述菌悬液的体积为所述培养基体积的1%；所述菌悬液的OD₆₀₀值为0.8-1.2。

7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述振荡培养的温度为28-30℃，振荡速率为180-200 r/min。

8.权利要求1所述耐盐促生细菌KVP3在植物促生中的应用。