CN118403155A

CN118403155A - 用于治疗脊髓损伤和疼痛的抗反义导向分子a（rgma）拮抗性抗体

Info

Publication number: CN118403155A
Application number: CN202311680427.6A
Authority: CN
Inventors: B.K.米勒; P.B.雅各布森
Original assignee: AbbVie Deutschland GmbH and Co KG; AbbVie Inc
Current assignee: AbbVie Deutschland GmbH and Co KG; AbbVie Inc
Priority date: 2016-06-01
Filing date: 2017-05-31
Publication date: 2024-07-30
Also published as: JP2022091967A; MX2018014920A; AU2024205014A1; TW202523689A; JP2024109776A; US20200347123A1; JP2019517480A; US20170349653A1; CA3025329A1; EP3464372A1; BR112018074966A2; US20250304672A1; CN109496218A; WO2017210278A1; AU2017273522A1; US20220025031A1; TW201803900A

Abstract

本发明涉及用于治疗脊髓损伤和疼痛的抗反义导向分子A(RGMA)拮抗性抗体。本文披露的是抗RGMa抗体，和使用这些抗体来治疗脊髓损伤、以及来治疗疼痛的方法，该方法包括促进轴突再生、功能恢复、或两者，该疼痛包括由脊髓损伤引起的神经性疼痛。

Description

用于治疗脊髓损伤和疼痛的抗反义导向分子A(RGMA)拮抗性抗体

相关申请

本申请是国际申请日为2017年5月31目的国际申请PCT/US2017/035183进入中国、申请号为201780046786.2的题为“用于治疗脊髓损伤和疼痛的抗反义导向分子A(RGMA)拮抗性抗体”的发明专利申请的分案申请。

本申请要求于2016年6月1目提交的美国专利申请序列号62/344,233的权益，其全部内容通过引用结合在此。

序列表

本申请含有序列表，该序列表已以ASCII格式经由EFS-Web提交且其全部内容通过引用结合在此。创建于2017年5月25日的所述ASCII复本命名为ABV12303WOO1_SEQ-LIST.txt且大小为28,672字节。

技术领域

本申请涉及抗RGMa抗体、以及使用这些抗体来治疗脊髓损伤和/或疼痛(包括由脊髓损伤或其他原因引起的神经性疼痛)的方法。

背景技术

脊髓损伤(SCI)是具有极大个人和社会成本的毁灭性病症。尽管临床护理取得了进展，但目前对严重SCI尚未存在有效治疗。在最初的创伤之后，存在一系列分子和退行性事件，这些分子和退行事件性包括细胞凋亡、局部缺血、兴奋毒性、和抑制性分子的上调。神经元死亡和轴突再生的抑制限制了损伤后的神经恢复。损伤的CNS轴突具有有限的再生能力并且经常从损伤部位缩回或由于损伤的脊髓的内在机制和抑制环境而经历继发性轴突变性。

SCI代表特征在于高医疗需求的医学指征，全世界每年发病率为15-40例/百万。SCI的最常见原因包括机动车事故、工伤事故、运动/反应事故、跌倒和暴力。在美国，每年估计有12,000例SCI新病例。

大多数脊髓损伤是挫伤或压迫性损伤，并且原发性损伤通常伴随着继发性损伤机制(如炎症介质，如细胞因子和趋化因子)，这使初始损伤恶化并导致病变区域显著增大(有时超过10倍)。

许多SCI是脊髓被压缩而不是切割的结果。对脊髓的损害经常导致椎骨、神经和血管损坏。出血、流体积聚和肿胀可发生在脊髓内或脊髓外，但发生在椎管内。来自周围骨骼和髓膜结构的压力可进一步损坏脊髓。此外，脊髓本身的水肿还可以加速次生组织损失。有大量证据表明，原发性机械损伤引发一系列继发性损伤机制，包括过度兴奋性神经递质积聚；水肿形成；电解质转移(包括增加的细胞内钙)；自由基(尤其是氧化剂自由基)生成；和类花生酸生成。因此，某些SCI可以被视为是两步过程。原发性损伤是机械性的，由于对脊柱的撞击、压迫或一些其他损害引起。继发性损伤是细胞和生物化学的，其中细胞/分子反应引起组织破坏。

SCI后发生的炎症反应是继发性损坏的主要原因之一。胶质细胞(小胶质细胞和星形胶质细胞)和巨噬细胞在SCI后的炎症反应过程中起关键作用。除继发性损伤外，反应性胶质和巨噬细胞导致CNS中轴突再生失败。反应性星形胶质细胞(例如，合成蛋白多糖)在抑制CNS中的轴突向外生长方面具有有效作用。小胶质细胞和巨噬细胞也有助于抑制轴突向外生长。

SCI是发生神经性疼痛风险最高的疾病之一，具有高达50％的患病率。神经性疼痛是SCI最使人衰弱的后果之一。炎症不仅通过诱导继发性损坏和轴突排斥而促成SCI后的功能丧失，而且还造成神经性疼痛的发展。

某些动物模型(例如，脊髓半切片)可能不会诱导通常与大多数临床脊髓损伤相关的显著创伤。此外，这些模型中脊髓水肿可能最少。因此，这些模型可能不代表大多数临床脊髓损伤。

发明内容

在一个方面，本披露提供了在有需要的受试者中治疗脊髓损伤的方法。在某些实施例中，该脊髓损伤是压迫、挫伤、或撞击伤。

在另一方面，本披露提供了在患有脊髓损伤的受试者中促进轴突再生、功能恢复、或两者的方法。在某些实施例中，该功能恢复是由神经行为测试进行评估的。在某些实施例中，该脊髓损伤是压迫、挫伤、或撞击伤。

在还另一方面，本披露提供了在有需要的受试者中治疗疼痛的方法。在某些实施例中，该疼痛是神经性疼痛，如由脊髓损伤引起的神经性疼痛。在某些实施例中，该脊髓损伤是压迫、挫伤、或撞击伤。

本文披露的方法包括给予治疗有效量的与反义导向分子A(Repulsive GuidanceMolecule A，RGMa)特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含：

(a)可变重链，该可变重链包含互补决定区(VH CDR)-1(包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列)、VH CDR-2(包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列)、和VH CDR-3(包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列)；以及

(b)可变轻链，该可变轻链包含互补决定区(VL CDR)-1(包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列)、VL CDR-2(包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列)、和VL CDR-3(包含选自由SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7组成的组的氨基酸序列)。在某些实施例中，VL CDR-3包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在某些其他实施例中，VL CDR-3包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列。在某些实施例中，可变重链包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，并且可变轻链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。在某些其他实施例中，可变重链包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，并且可变轻链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含恒定区，该恒定区包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、和SEQ ID NO：14。在某些实施例中，抗体包含SEQ ID NO：16的重链序列和SEQ ID NO：15的轻链序列。

在某些实施例中，抗体选自下组，该组由以下组成：人抗体、免疫球蛋白分子、二硫键连接的Fv、单克隆抗体、亲和性成熟的抗体、scFv、嵌合抗体、CDR移植的抗体、双抗体、人源化抗体、多特异性抗体、Fab、双重特异性抗体(dual specific antibody)、DVD、Fab’、双特异性抗体(bispecific antibody)、F(ab’)2、和Fv。在某些具体的实施例中，抗体是人抗体。

在某些实施例中，抗体是单克隆抗体。

在某些实施例中，全身性地给予抗体或其抗原结合片段。在某些具体的实施例中，静脉内给予抗体或其抗原结合片段。

在某些实施例中，在脊髓损伤的24小时内给予抗体。

本披露证明了在大鼠中临床相关的撞击-压迫SCI后，RGMa在多种细胞类型中上调。重要的是，本披露还证明在损伤后RGMa在人脊髓中相似地上调。为了中和抑制性RGMa，在急性胸部SCI的临床相关大鼠模型中，每周全身性给予人单克隆抗RGMa抗体，并在血清、CSF和损伤部位周围的组织中检测到。用抗RGMa抗体治疗的大鼠在旷场活动中显示出改善的神经行为恢复、在爬梯行走的脚步错误更少、以及改善的步态参数。RGMa中和经由减弱细胞凋亡促进神经元存活。此外，这种策略增强了下行皮质脊髓束轴突再生的可塑性，如通过顺行追踪所证明的。有趣的是，RGMa中和也减弱了神经病理性疼痛反应，并且与病变尾侧背角中更少的激活的小胶质细胞和减少的降钙素基因相关肽(CGRP)的表达有关。

本披露证明了全身给予抗RGMa抗体改善了非常严重的胸部非人灵长类(NHP)SCI半压迫模型中的神经运动功能。在全身给予抗RGMa抗体后观察到总体神经运动功能的显著改善。

这些发现显示了在SCI(特别是挫伤或压迫损伤)后中和抑制性RGMa的治疗潜力。

附图说明

图1A-1C说明了大鼠脊髓中的RGMa表达。图1A显示了神经元中的RGMa。图1B显示了少突胶质细胞中的RGMa。图1C显示了星形胶质细胞和小胶质细胞中的RGMa。损伤后，RGMa在脊髓中上调。损伤后，病灶周围神经元表达RGMa(图1A)。在正常和损伤大鼠脊髓中，少突胶质细胞表达RGMa(图1B)。在SCI之后，RGMa由星形胶质细胞表达，并且在病变部位内和周围的CSPG疤痕富集区域内(图1C)。激活的小胶质细胞和巨噬细胞也表达RGMa。

图2A-2F说明了成人脊髓中的RGMa表达。图2A显示了未损伤的人脊髓中的RGMa(低放大率)。图2B显示了图2A中标记为“B”的框住的区域的更高放大率。图2C显示了图2A中标记为“C”的框住的区域的更高放大率。图2D显示了损伤后3天的损伤的人脊髓中的RGMa(低放大率)。图2E显示了图2D中标记为“E”的框住的区域的更高放大率。图2F显示了图2D中标记为“F”的框住的区域的更高放大率。在未损伤的人脊髓中，RGMa以低水平表达(图2A-2C)。在损伤的人脊髓中(损伤后3天)，RGMa表达上调(图2D-2F)。

图3A-3C说明了小鼠皮层神经元中的RGMa表达。图3A描绘了显示小鼠皮层神经元裂解物中的RGMa的蛋白质印迹。图3B描绘了培养的小鼠原代皮层神经元中RGMa的免疫染色。图3C描绘了用RGMa和hIgG、AE12-1或AE12-1-Y孵育后的小鼠皮层神经元。

图4A是显示研究设计的示意图。图4B是显示在SCI后6周取样的CSF中的抗体浓度的图。图4C是显示在SCI后9周获得的血清中的抗体浓度的图。图4D描绘了用抗人IgG对大鼠脊髓的免疫染色。在血管周围(RECA-1，绿色)和疤痕组织内(CSPG，绿色)检测人IgG(红色)。

图5A-5D说明了SCI之后，在用AE12-1、AE12-1-Y、人IgG、或PBS治疗之后的大鼠中的功能恢复。图5A是显示旷场Basso、Beattie和Bresnahan(BBB)活动测试的评分的线图。图5B是显示了运动分项分数的线图。图5C是示了爬梯行走的后肢脚步错误的线图。图5D是显示成功的后肢步行的百分比的条形图。用单克隆抗体AE12-1治疗的大鼠相对于hIgG和PBS对照显示出对BBB的显著的改善(图5A)。AE12-1和AE12-1Y治疗的大鼠相对于对照显示出更高的运动分项分数，但这没有统计学意义(图5B)。在SCI后3周，与PBS对照相比，用AE12-1治疗的大鼠爬梯行走时显示出显著更少的后肢脚步错误，并且在6周时出现减少错误的趋势(图5C)。在SCI后6周，与对照相比，AE1 2-1治疗的大鼠显示出成功的后肢步行的显著更高百分比(图5D)。

图6A显示了获得自SCI前和获得自SCI后6周的每组的大鼠的猫步(CatWalk)的代表性足迹。图6B是显示SCI后用AE12-1、AEl2-1-Y、人IgG或PBS治疗的大鼠的规律性指数、后肢步幅长度、后肢摆动速度、和后肢强度值的一系列条形图。用两种单克隆抗体治疗的大鼠相对于对照组显示出规律性指数的显著改善(图6B)。单克隆抗体治疗的大鼠显示出改善的后肢步幅长度和摆动速度的趋势(图6B)。注射AE12-1的大鼠相对于对照显示出显著更高的后肢强度值(图6B)。

图7A-7D说明了在用AEl2-1、AEl2-1-Y、人IgG、或PBS治疗的大鼠中的神经元存活。图7A是SCI后9周损伤的脊髓的旁矢状切片的低放大率图像。图7B是显示SCI后9周的保留的病灶周围神经元数量的条形图。图7C描绘了SCI后7小时的神经元免疫染色。用NeuN(绿色)和TUNEL(红色)双标记鉴定了凋亡神经元(箭头)。图7D是显示在SCI后7小时每个切片计数的NeuN+/TUNEL+细胞的平均数的条形图。与接受hIgG和PBS的大鼠相比，给予单克隆抗体AE12-1或AE12-1Y的大鼠显示出显著更高的病灶周围神经元保留(图7B)。每个切片计数的NeuN+/TUNEL+细胞的平均数量在AE12-1治疗的大鼠中显著低于给予PBS媒介的大鼠(图7D)。

图8A-8E说明了SCI后用AE12-1、AE12-1-Y、人IgG、或PBS治疗的大鼠中的轴突再生。图8A描绘了用BDA进行顺行轴突追踪后脊髓的低放大率图像。图8B是显示BDA标记的CST纤维的平均最大长度的条形图。图8C是显示平均轴突数/切片数的条形图。图8D是SCI后4或6周时BDA标记的CST纤维的平均最大长度的条形图。图8E是SCI后4周或6周时平均轴突数/切片数的条形图。在AE1 2-1和AE12-1Y治疗后，BDA标记的CST纤维的平均最大长度增加(图8B)。定量的轴突/切片的平均数显示用单克隆抗体治疗的损伤大鼠中更多数量的轴突(图8C)。在用AE1 2-1Y治疗的损伤大鼠中，与4周时相比，平均轴突长度在6周时显著更大(图8D和图8E)。

图9A-9G说明了在SCI后用AE12-1、AE1 2-1-Y、人IgG、或PBS治疗的大鼠中的神经性疼痛和炎症反应。图9A是描绘2g von Frey单丝纤维实验中不良反应百分比的条形图。图9B是描绘4g von Frey单丝纤维实验中不良反应百分比的条形图。图9C是描绘响应于有害皮肤的甩尾潜伏期的条形图。图9D描绘了在T10处病变的尾侧的Iba-1+小胶质细胞。图9E描绘了T10水平处的Iba-1+小胶质细胞。图9F描绘了在T10处病变的吻侧的Iba-1+小胶质细胞。图9G描绘了在T10水平处的CGRP+细胞。在SCI后6周，相对于对照，AE12-1治疗的大鼠显示出对4g刺激的不良反应显著更少(图9B)。在SCI后2周和6周，单克隆抗体治疗的大鼠相对于对照显示出响应于有害皮肤加热的缩尾减少(图9C)。在T10水平，与正常脊髓相比，在对照的背角中计数了显著更多的Iba-1+细胞(图9D和9E)。相对于对照，AE12-1和AE12-1Y治疗的大鼠中CGRP+面积百分比显著降低(图9G)。

图10A-10C显示了损伤后成年大鼠脊髓中的RGMa表达。图10A描绘了正常完整脊髓中和SCI后1周的腹角灰质中的RGMa免疫染色。图10B描绘了SCI后ED-1+区域中的RGMa表达。图10C描绘了高放大率图像，其显示了正常完整脊髓的脊髓白质中少突胶质细胞(CC1)中的RGMa表达。％RGMa+面积的定量显示SCI后成年大鼠脊髓中RGMa表达的显著上调(图10A)。在SCI后，RGMa表达在ED-1+区域中是明显的(图10B)。

图11A-11D说明了成年人脊髓中RGMa和再生蛋白(Neogenin)的神经元表达。图11A描绘了正常成年人脊髓中的前角神经元中的RGMa表达。图11B描绘了用RGMa肽预吸收的RGMa抗体染色的相邻切片，显示染色的特异性。图11C描绘了正常成年人脊髓中的前角神经元中的再生蛋白表达。图11D描绘了相邻的阴性对照切片。

图12A-12B说明了RGMa受体再生蛋白的表达。图12A描绘了显示再生蛋白表达的成年大鼠脑裂解物的蛋白质印迹。图12B描绘了表达再生蛋白(红色)的培养的小鼠皮层神经元(3div；F-肌动蛋白，绿色)。

图13描绘了SCI前、和SCI后4和6周的大鼠重量。各组之间的大鼠体重没有显著差异。治疗没有改变大鼠体重。

图14A-14B说明了SCI后用AE12-1、AE12-1-Y、人IgG、或PBS治疗的大鼠中的空腔化。用单克隆抗体中和RGMa导致空腔化没有显著差异。

图15A-15C说明了抗RGMa抗体对星形胶质细胞增生和疤痕形成的作用。图15A描绘了SCI后9周与病变相邻的GFAP免疫反应性。图15B描绘了对损伤的吻侧的％GFAP+面积的定量。图15C描绘了损伤部位的％CSPG+面积。％GFAP+面积的定量显示在SCI后9周AE12-1Y治疗的大鼠中病变吻侧星形胶质细胞增生显著减少(图15B)。AE12-1和AE12-1Y治疗的大鼠显示出在病变部位处％CSPG+面积减少的趋势(图15C)。

图16A-16B说明了CST的BDA标记。图16A描绘了在水平C4处的背侧CST的BDA染色，以横向取向显示。图16B描绘了在病变的3mm吻侧的旁矢状方位，BDA标记的CST轴突被束在背侧CST纤维束中。

图17A-17B说明了5HT纤维。图17A描绘了病变尾侧的5HT免疫反应性纤维(箭头)。图17B描绘了对向尾部进入进行性距离的病变尾侧的5HT+轴突的平均数量的定量。病变尾侧的5HT+轴突向尾部进入进行性距离。在AE12-1治疗的大鼠中显著更高数量的5HT+纤维是明显的，并且注射AE12-1Y的大鼠显示出更高数量的5HT标记的轴突的趋势(图17B)。

图18A-18B说明了SCI后用AE12-1、AE12-1-Y、人IgG、或PBS治疗的大鼠中的小胶质细胞和巨噬细胞。图18A描绘了病变的尾侧Iba-1免疫反应性。图18B描绘了病变位点的吻侧或尾侧的％Iba-1+面积。在T8处与病变相邻，在病变部位的吻侧或尾侧的％Iba-1+面积的组之间没有显著差异(图18B)。

图19A是代表SCI后各个对照动物的神经运动评分(和估计的中心值曲线)的图示。图19B是SCI后接受IV AE-12-1-Y-QL治疗的各个动物的神经运动评分(和估计的中心值曲线)的图示。

图20A是描绘了在SCI后对照和IV AE12-1-Y-QL治疗组中通过部分各向异性(FA)评估的损伤外区域中的组织完整性的条形图。图20B是描绘在SCI后的对照和IV AE12-1-Y-QL治疗组中通过磁化转移率(MTR)评估的损伤外区域中的组织完整性的条形图。与IgG对照组相比，静脉内AE12-1-Y-QL在损伤外区域中表现出更大的组织完整性保留。

图21A和图21B分别描绘了个体神经运动评分(NMS)与个体FA值或个体MTR值之间的相关性。FA和MTR值通常随着神经运动功能的改善而增加。

图22A-22F是描绘脊髓切片的组织病理学分析的条形图。图22A和22D分别描绘了在吻侧和尾侧水平的RGMa表达。图22B和22E分别描绘了在吻侧和尾侧水平的离子化钙结合衔接分子1(IBA)表达。图22C和22F分别描绘了在吻侧和尾侧水平的髓磷脂的Weil染色。

图23A-23B说明了在SCI后在用AE12-1-Y-QL或IgG治疗的大鼠中的功能恢复。图23A是显示旷场Basso、Beattie和Bresnahan(BBB)活动测试的评分的线图。图23B是显示了运动分项分数的线图。

图24A-24D是显示SCI后在用AE12-1-Y-QL或IgG治疗的大鼠中的规律性指数(图24A)、后肢步幅长度(图24B)、后肢摆动速度(图24C)、和后肢强度值(图24D)的一系列条形图。

图25A-25C说明了SCI后用AE12-1-Y-QL或IgG治疗的大鼠中的神经性疼痛和炎症反应。图25A是描绘2g von Frey单丝纤维实验中不良反应百分比的条形图。图25B是描绘4gvon Frey单丝纤维实验中不良反应百分比的条形图。图25C是描绘响应于有害皮肤的甩尾潜伏期的条形图。

具体实施方式

本文提供的是通过向有需要的患者给予治疗有效量的一种或多种抗RGMa抗体来治疗脊髓损伤、促进脊髓损伤后轴突再生、促进脊髓损伤后功能恢复、和治疗疼痛(包括由脊髓损伤引起的神经性疼痛)的方法。

1.定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。在矛盾的情况下，应以本文件(包括定义)为准。虽然与本文描述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但以下描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用以其整体结合在此。本文披露的材料、方法以及实例仅是说明性的并且不旨在是限制性的。

如本文所用，术语“包含(comprise)”、“包括(include)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“可以(can)”、“含有(contain)”以及其变化形式旨在是不排除另外行为或结构的可能性的开放式连接词、术语、或词语。单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。本披露还涵盖“包含在此所呈现的实施例或要素”、“由在此所呈现的实施例或要素组成”以及“基本上由在此所呈现的实施例或要素组成”的其他实施例，无论是否明确地列出。

如本文所用，“约”可以指与所述值大约+/-10％的变化。应当理解，这种变化总是包括在本文提供的任何给定值中，无论是否有根据其的具体参考。

“亲和性成熟的抗体”在本文用于指在一种或多种CDR中具有一种或多种改变的抗体，与不具有一个或多个改变的亲本抗体相比，其导致抗体对于靶抗原的亲和力(即，K_D、kd或k_a)的改善。示例性亲和性成熟的抗体对靶抗原将具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。用于产生亲和性成熟抗体的多种程序是本领域已知的，包括筛选已经使用生物展示(bio-display)制备的组合抗体文库。例如，Marks等人，BioTechnology[生物技术]，10：779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域混编的亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机诱变由以下描述：Barbas等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，91：3809-3813(1994)；Schier等人，Gene[基因]，169：147-155(1995)；Yelton等人，J.Immunol.[免疫学杂志]，155：1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.[免疫学杂志]，154(7)：3310-3319(1995)；和Hawkins等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，226：889-896(1992)。在选择性诱变位置和在接触或超突变位置处的具有活性增强氨基酸残基的选择性突变描述在美国专利号6,914,128 B1中。

如本文所用，“抗体(Antibody和antibodies)”是指单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体(完全或部分人源化)、动物抗体(如但不限于鸟(例如，鸭或鹅)、鲨鱼、鲸、和哺乳动物(包括非灵长类(例如，牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠等)或非人灵长类(例如，猴、黑猩猩等))、重组抗体、嵌合抗体、单链Fvs(“scFv”)、单链抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab’)片段、F(ab’)₂片段、二硫键连接的Fvs(“sdFv”)、和抗独特型(“抗Id”)抗体、双结构域抗体、双可变结构域(DVD)或三可变结构域(TVD)抗体(双可变结构域免疫球蛋白(并且用于制得它们的方法描述在Wu、C.，等人，Nature Biotechnology[自然生物技术]，25(11)：1290-1297(2007)和PCT国际申请WO2001/058956中，其每篇文献的内容通过引用结合在此)，以及任何以上的功能活性表位结合片段。具体而言，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性的片段，即含有分析物结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类别。为简单起见，针对分析物的抗体在本文中通常称为“抗分析物抗体”或仅仅是“分析物抗体”(例如，抗RGMa抗体或RGMa抗体)。

如本文所用，“抗体片段”是指包含抗原结合位点或可变区的完整抗体的部分。该部分不包括完整抗体Fc区的恒定重链结构域(即，CH2、CH3或CH4，取决于抗体同种型)。抗体片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab’片段、Fab’-SH片段、F(ab’)₂片段、Fd片段、Fv片段、双抗、单链Fv(scFv)分子、仅含有一个轻链可变结构域的单链多肽、含有轻链可变结构域的三个CDR的单链多肽、仅含有一个重链可变区的单链多肽、和含有重链可变区的三个CDR的单链多肽。

“双特异性抗体”在本文用于指通过以下产生的全长抗体：杂交瘤技术(参见Milstein等人，Nature[自然]，305(5934)：537-540(1983))、通过两种不同单克隆抗体的化学缀合(参见，Staerz等人，Nature[自然]，314(6012)：628-631(1985))、或通过杵臼结构(knob-into-hole)或相似的方法(其在Fc区引入突变(参见Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，90(14)：6444-6448(1993))，这生成多种不同的免疫球蛋白种类，其中仅一种是功能性双特异性抗体)。双特异性抗体结合在其两个结合臂(一对HC/LC)之一上的一个抗原(或表位)，并结合在其第二臂(不同对的HC/LC)上的不同的抗原(或表位)。通过该定义，双特异性抗体具有两个不同的抗原结合臂(在特异性和CDR序列中)，并且对于其结合的每种抗原是单价的。

“CDR”在本文用于指在抗体可变序列内的“互补决定区”。重链及轻链的可变区中各自存在三个CDR，对于各可变区，此类CDR命名为“CDR1”、“CDR2”及“CDR3”。如本文所用，术语“CDR组”是指存在于结合抗原的单一可变区中的一组三个CDR。这些CDR的精确边界已根据不同系统不同地加以限定。由Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunologicalInterest[免疫学蛋白质的序列](美国国立卫生研究院(NationalInstitutes of Health)，贝塞斯达(Bethesda)，马里兰州(Md.)(1987)及(1991))描述的系统不仅提供适用于抗体的任何可变区的明确的残基编号系统，且还提供限定三个CDR的精确残基边界。这些CDR可称为“Kabat CDR”。Chothia及同事(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196∶901-917(1987)及Chothia等人，Nature[自然]342：877-883(1989))发现，Kabat CDR内的某些子部分采用几乎相同的肽主链构象，即使在氨基酸序列层面具有极大差异。这些子部分被指定为“L1”、“L2”、和“L3”或“H1”、“H2”、和“H3”，其中“L”及“H”分别被指定为轻链区及重链区。这些区可称为“Chothia CDR”，其具有与Kabat CDR重叠的边界。限定与Kabat CDR重叠的CDR的其他边界已由Padlan，FASEB J.[美国实验生物学会联合会期刊]9：133-139(1995)及MacCallum J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]262(5)：732-745(1996)描述。其他CDR边界限定可不严格遵循本文系统中的一者，但仍然将与Kabat CDR重叠，但其可根据特定残基或残基组或甚至全部CDR不显著影响抗原结合的预测或实验发现而缩短或延长。本文中所用的方法可利用根据这些系统中任一者限定的CDR，但某些实施例使用Kabat或Chothia限定的CDR。

如本文所用的抗体的“衍生物”可以指当与真实或亲本抗体相比时具有对其氨基酸序列的一个或多个修饰并且表现出修饰的结构域结构的抗体。衍生物仍然可以采用天然抗体(以及氨基酸序列)中发现的典型结构域配置，以及能够特异性地结合靶(抗原)。抗体衍生物的典型地实例是与其他多肽偶联的抗体、重排抗体结构域、或抗体的片段。衍生物也可包含至少一种另外的化合物，例如蛋白结构域，所述蛋白结构域通过共价键或非共价键链接。根据本领域已知的方法，连接可以基于遗传融合。存在于包含根据本发明使用的抗体的融合蛋白中的另外的结构域可优选通过柔性接头连接(有利地是肽接头连接)，其中所述肽接头包含长度足以跨越另一蛋白结构域的C末端与抗体的N末端之间的距离的多个亲水的肽键合的氨基酸，反之亦然。抗体可以与效应分子(例如，具有适合于生物活性或选择性结合固体支持物、生物活性物质(例如细胞因子或生长激素)、化学试剂、肽、蛋白质或药物的构象)连接。

“双特异性抗体”在本文用于指可以在其两个结合臂(一对HC/LC)中的每一个中结合两种不同抗原(或表位)的全长抗体(参见PCT公开WO 02/02773)。因此，双特异性结合蛋白具有两个相同的抗原结合臂，具有相同的特异性和相同的CDR序列，并且对于其结合的每种抗原是二价的。

“双可变结构域”在本文用于指在结合蛋白上两个或更多个抗原结合位点，该结合蛋白可以是二价(两个抗原结合位点)、四价(四个抗原结合位点)、或多价结合蛋白。DVD可以是单特异性的(即能够结合一种抗原(或一种特异性表位))、或多特异性(即能够结合两个或更多个抗原(即，相同靶抗原分子的两个或更多个表位或不同的靶抗原两个的或更多个表位)。优选的DVD结合蛋白包含两个重链DVD多肽和两个轻链DVD多肽并被称为“DVD免疫球蛋白”或“DVD-Ig”。此类DVD-Ig结合蛋白因此是四聚体并且使人联想到IgG分子，但是条件是与IgG分子相比，提供更多个抗原结合位点。因此，四聚体DVD-Ig分子的每一半都使人联想到IgG分子的一半，并包含重链DVD多肽和轻链DVD多肽，但不像提供单个抗原结合结构域的IgG分子的一对重链和轻链、提供两个或更多个抗原结合位点的DVD-Ig的重链和轻链。

DVD-Ig结合蛋白的每个抗原结合位点可以衍生自供体(“亲本”)单克隆抗体，并因此包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中每个抗原结合位点具有涉及抗原结合的总共六个CDR。因此，结合两种不同表位(即，两种不同抗原分子的两种不同表位或同抗原分子的两种不同表位)的DVD-Ig结合蛋白包含衍生自第一亲本单克隆抗体的抗原结合位点、和第二亲本单克隆抗体的抗原结合位点。

在PCT公开号WO 2007/024715、美国专利号7,612,181、和Wu等人，NatureBiotech.[自然生物技术]，25：1290-1297(2007)中提供了DVD-Ig结合分子的设计、表达、和特征的说明。此类DVD-Ig分子的优选的实例包含重链，该重链包含结构式VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n(其中VD1是第一重链可变结构域，VD2是第二重链可变结构域，C是重链恒定结构域，X1是接头(其条件是其不是CH1)，X2是Fc区，并且n是0或1(但优选是1))；和轻链，该轻链包含结构式VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n(其中VD1是第一轻链可变结构域，VD2是第二轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，X1是接头(其条件是其不是CH1)，并且X2不包含Fc区，并且n是0或1，(但优选是1))。此类DVD-Ig可包含两个此类重链和两个此类轻链，其中每条链包含串联连接的可变结构域，在可变区之间没有插入的恒定区，其中重链和轻链关联以形成串联功能性抗原结合位点，并且一对重链和轻链可以与另一对重链和轻链关联以形成具有四个功能性抗原结合位点的四聚体结合蛋白。在另一个实例中，DVD-Ig分子可包含重链和轻链，该重链和轻链每个包含以串联连接的三个可变结构域(VD1、VD2、VD3)，可变结构域之间没有插入恒定区，其中一对重链和轻链可以关联以形成三个抗原结合位点，并且其中一对重链和轻链可以与另一对重链和轻链关联以形成具有六个抗原结合位点的四聚体结合蛋白。

在实施例中，根据本发明的DVD-Ig结合蛋白不仅结合由其亲本单克隆抗体键合的相同靶分子，而且还具有一种或多种其亲本单克隆抗体的一种或多种所希望的特性。例如，此类另外的特性是一种或多种亲本单克隆抗体的抗体参数。可以有助于来自一种或多种其亲本单克隆抗体的DVD-Ig结合蛋白的抗体参数包括但不限于抗原特异性、抗原亲和力、效力、生物学功能、表位识别、蛋白稳定性、蛋白溶解度、生产效率、免疫原性、药代动力学、生物利用度、组织交叉反应性、和直系同源抗原结合。

DVD-Ig结合蛋白结合RGMa的至少一个表位。DVD-Ig结合蛋白的非限制性实例包括DVD-Ig结合蛋白(结合RGMa的一个或多个表位)、DVD-Ig结合蛋白(结合人RGMa的表位、和另一种物种(例如，小鼠)的RGMa的表位)、和DVD-Ig结合蛋白(结合人RGMa的表位和另一种靶分子(例如，VEGFR2或VEGFR1)的表位)。

“表位(Epitope或epitopes)”或“目的表位”是指在任何分子上的一个或多个位点，该分子被识别并且可以与其特异性结合配偶体上一个或多个互补位点结合。分子和特异性结合配偶体是特异性结合对的一部分。例如，表位可以在多肽、蛋白质、半抗原、碳水化合物抗原(例如但不限于糖脂、糖蛋白或脂多糖)、或多糖上。其特异性结合配偶体可以是但不限于抗体。

如本文所用，“框架”(FR)或“框架序列”可以指可变区减去CDR的剩余序列。因为CDR序列的精确限定可通过不同系统(例如，参见以上)确定，所以框架序列的含义相对应地需要不同解释。六个CDR(轻链的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3及重链的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)还将轻链及重链上的框架区在各链上分成四个子区(FR1、FR2、FR3及FR4)，其中CDRl位于FR1与FR2之间，CDR2位于FR2与FR3之间，且CDR3位于FR3与FR4之间。在不指定具体子区为FR1、FR2、FR3或FR4的情况下，如通过其他所提及的框架区表示单一天然产生的免疫球蛋白链的可变区内的组合的FR。如本文所用，FR表示四个子区之一，且FRs表示构成框架区的四个子区中的两者或两者以上。

本领域已知的人重链和轻链FR序列，其可用作重链和轻链“受体”框架序列(或简称“受体”序列)，以使用本领域已知的技术使非人抗体人源化。在一个实施例中，人重链和轻链受体序列选自公众可获得的数据库(如V碱基(V-base))或国际信息系统中列出的框架序列。

如本文所用，“功能性抗原结合位点”可以意指能够结合靶抗原的结合蛋白(例如抗体)上的位点。抗原结合位点的抗原结合亲和力可能不如衍生抗原结合位点的亲本结合蛋白(例如亲本抗体)强，但是结合抗原的能力必须使用已知用于评估蛋白(例如抗体)与抗原的结合的多种方法中的任何一种可测量。此外，本文中多价蛋白(例如多价抗体)的每个抗原结合位点的抗原结合亲和力不需要在数量上相同。

如本文所用，“人抗体”可包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区及恒定区的抗体。本文描述的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过活体外随机或位点特异性突变诱发或通过活体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用的术语“人抗体”不只在包括来源于另一哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已移植于人框架序列上的抗体。

“人源化抗体”在本文中用于描述包含来自非人物种(例如小鼠)的重链和轻链可变区序列的抗体，但其中至少一部分VH和/或VL序列已被改变为更“像人”，即更类似于人类种系可变序列。术语“人源化抗体”为免疫特异性结合至目的抗原且包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的框架(FR)区及基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)的抗体或其变异体、衍生物、类似物或片段。如本文所用，术语“基本上”在CDR的情况下是指CDR的氨基酸序列与非人抗体CDR的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一。人源化抗体基本上包含所有至少一个、以及通常两个可变域(Fab、Fab′、F(ab′)2、FabC、Fv)，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白(即，供体抗体)的CDR区且所有或基本上所有框架区为具有人免疫球蛋白共有序列的框架区。在实施例中，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少部分，该免疫球蛋白通常是人类免疫球蛋白。在一些实施例中，人源化抗体含有轻链以及重链的至少可变域。抗体还可包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3及CH4区。在一些实施例中，人源化抗体仅含人源化轻链。在一些实施例中，人源化抗体仅含人源化重链。在特定实施例中，人源化抗体仅含轻链和/或人源化重链的人源化可变域。

人源化抗体可选自任何类别的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE；及任何同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。人源化抗体可以包含来自一种以上类别或同种型的序列，且可以使用本领域中熟知的技术选择特定恒定域以使所需效应功能优化。

人源化抗体的框架区及CDR区不必准确对应于亲本序列，例如供体抗体CDR或共有框架可借由至少一个氨基酸残基的取代、插入和/或缺失而突变诱发，使得该部位的CDR或框架残基不对应于供体抗体或共有框架。然而，在一个优选实施例中，此类突变不多。通常，至少80％、优选至少85％、更优选至少90％且最优选至少95％的人源化抗体残基将对应于亲本FR及CDR序列的那些残基。如本文所用，术语“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。如本文所用，术语“共有免疫球蛋白序列”是指由相关免疫球蛋白序列家族中最频繁出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如，Winnaker，From Genes to Clones[从基因到克隆](Verlagsgesellschaft，Weinheim，1987))。因此，“共有免疫球蛋白序列”可以包含“一个或多个共有框架区”和/或“一个或多个共有CDR”。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的各位置由该家族中最频繁出现于该位置的氨基酸占据。若两个氨基酸同等频繁地出现，则共有序列中可包括任一个。

“连接序列”或“连接肽序列”是指与一个或多个目的多肽序列(例如，全长、片段等)连接的天然或人工多肽序列。术语“连接”是指连接序列与目的多肽序列的连接。此类多肽序列优选地通过一个或多个肽键连接。连接序列可以具有从约4至约50个氨基酸的长度。优选地，连接序列的长度是从约6至约30个氨基酸。可以通过氨基酸取代、添加或缺失修饰天然连接序列以产生人工连接序列。示例性连接序列包括但不限于：(i)组氨酸(His)标签(如6X His标签(SEQ ID NO：20)，其具有HHHHHH的氨基酸序列(SEQ ID NO：20))，可用作连接序列以促进目的多肽和抗体的分离和纯化：(ii)肠激酶切割位点(如His标签)，用于目的蛋白和抗体的分离和纯化。通常，将肠激酶切割位点与His标签一起用于目的蛋白和抗体的分离和纯化。各种肠激酶切割位点是本领域已知的。肠激酶切割位点的实例包括但不限于DDDDK的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)及其衍生物(例如，ADDDDK(SEQ ID NO：22)等)；(iii)杂项序列可用于连接(1ink或connect)单链可变区片段的轻链和/或重链可变区。其他连接序列的实例可以在以下中发现：Bird等人，Science[科学]242：423-426(1988)；Huston等人，PNAS USA[美国国家科学院院刊]85：5879-5883(1988)；和McCafferty等人，Nature[自然]348：552-554(1990)。还可以修饰连接序列以用于其他功能，如附接于药物或附接于固体支持物。在本披露的上下文中，单克隆抗体例如可以含有连接序列(如His标签)、肠激酶切割位点、或两者。

“多价结合蛋白”在本文用于指包含两个或更多个抗原结合位点(在本文中也称为“抗原结合结构域”)的结合蛋白。多价结合蛋白优选地经工程改造以具有三个或三个以上抗原结合位点，且一般不为天然产生的抗体。术语“多特异性结合蛋白”是指可结合两个或更多个相关或不相关的靶的结合蛋白，包括能够结合同一靶分子的两个或更多个不同表位的结合蛋白。

“重组抗体”和“重组抗体”是指通过一个或多个步骤制备的抗体，这些步骤包括通过重组技术将编码一个或多个单克隆抗体的全部或一部分的核酸序列克隆到适当的表达载体中，并随后在适当的宿主细胞中表达该抗体。这些术语包括但不限于重组产生的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体(完全或部分人源化)、由抗体片段形成的多特异性或多价结构、双功能抗体、异种缀合Abs、DVD-Ig、和如本文(i)中描述的其他抗体。(双可变结构域免疫球蛋白以及用于制得它们的方法描述在Wu，C.，等人，Nature Biotechnology[自然生物技术]，25：1290-1297(2007)中)。如本文所用，术语“双功能抗体”是指包含对一个抗原位点具有特异性的第一臂和对不同抗原位点具有特异性的第二臂的抗体，即，双功能抗体具有双重特异性。

如本文所用，“特异性结合”或“特异性地结合”可以是指抗体、蛋白质、或肽与第二化学物质的相互作用，其中该相互作用取决于化学物质上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合特定蛋白质结构而不是一般地结合蛋白质。若抗体对表位“A”具有特异性，则在含经标记“A”及该抗体的反应中，含表位A(或未经标记的游离A)的分子的存在将减少结合至该抗体的经标记A的量。

“治疗(Treat、treating或treatment)”在本文中彼此可互换使用，以描述疾病的逆转、减轻、或进展抑制、或这些术语适用的此疾病的一种或多种症状的逆转、减轻、或进展抑制。治疗可以按急性或慢性方式进行。该术语还指在疾病折磨之前降低疾病或与此类疾病相关症状的严重性。在患病之前这种疾病严重程度的降低是指将本文描述的抗体或药物组合物给予受试者，该受试者在给予时未患有该疾病。“治疗”和“治疗性”是指治疗的行为，如以上所定义的“治疗”一样。

本文使用“变体”描述通过氨基酸的插入、缺失或保守取代而在氨基酸序列上不同但保留至少一种生物活性的肽或多肽。“生物学活性”的代表性实例包括被特定抗体结合或促进免疫应答的能力。本文还使用变体来描述具有如下氨基酸序列的蛋白质，该氨基酸序列与具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列的参比蛋白质基本相同。氨基酸的保守取代，即，将氨基酸用具有相似特性(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸替换，被本领域认可为通常涉及小改变。正如本领域所理解的，通过考虑氨基酸的亲水指数可以部分地鉴定这些微小变化。Kyte等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]157：105-132(1982)。氨基酸的亲水指数是基于其疏水性和电荷的考量。本领域已知的是，可以取代具有相似亲水指数的氨基酸，而仍然保持蛋白质功能。在一方面，具有±2的亲水指数的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以用于揭示将产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的上下文中，考虑氨基酸的亲水性允许计算该肽的最大局部平均亲水性，这是已经据报道与抗原性和免疫原性良好关联的有用量度。美国专利号4,554,101，通过引用结合在此。如本领域所理解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以产生保持生物学活性(例如免疫原性)的肽。取代可以用彼此亲水性值在±2内的氨基酸进行。氨基酸的亲水性指数和亲水性值两者受氨基酸的特定侧链影响。应理解，与该观察结果一致，与生物功能相容的氨基酸取代取决于如通过疏水性、亲水性、电荷、大小、和其他特性揭示的氨基酸、并且特别是那些氨基酸的侧链的相对相似性。“变体”也可用于是指抗RGMa抗体的抗原反应性片段，其与氨基酸序列中的抗RGMa抗体的相应片段不同但仍具有抗原反应性并且可以与抗RGMa抗体的相应片段竞争结合RGMa。“变体”也可用于描述已经差异加工(例如通过蛋白水解、磷酸化、或其他翻译后修饰)，但仍保留其抗原反应性的多肽或其片段。

对于此处数值范围的叙述，明确考虑了具有相同程度的精度的介于两者之间的每个数字。例如，对于范围6-9，除了6和9之外还考虑了数字7和8，并且对于范围6.0-7.0，明确考虑了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

2.抗RGMa抗体

本文提供的是通过向有需要的患者给予一种或多种抗RGMa抗体来治疗脊髓损伤、促进脊髓损伤后轴突再生、促进脊髓损伤后功能恢复、和治疗疼痛(包括由脊髓损伤引起的神经性疼痛)的方法。用于本文描述的方法中的抗RGMa抗体结合RGMa，同时最小化或消除与反义导向分子c(“RGMc”)的反应性。因为针对RGMa产生的抗体通常可以与RGMc交叉反应，并且在高静脉内剂量下会导致肝细胞中的铁积累，本文描述的对于RGMa的抗体的特异性结合是具有治疗益处的。此外，这些抗体的高选择性提供了大的治疗剂量窗或治疗范围。

a.RGMa识别抗体

可以在本文描述的方法中使用的抗体是结合RGMa的抗体、其片段或变体。此类抗体描述在例如WO 2013112922中，其全部内容通过引用结合在此。该抗体可以是抗RGMa抗体的片段、或其变体或衍生物。该抗体可以是多克隆或单克隆抗体。该抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲和性成熟的抗体、人抗体、人源化抗体、完全人抗体或抗体片段(如Fab片段)、或其混合物。抗体片段或衍生物可包含F(ab’)₂、Fv或scFv片段。抗体衍生物可以通过模拟肽产生。此外，描述用于产生单链抗体的技术可以适用于产生单链抗体。

人抗体可以衍生自噬菌体展示技术或来自表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。人抗体可以作为人体内免疫应答的结果产生并分离。参见例如，Funaro等人，BMCBiotechnology[BMC生物技术]，2008(8)：85。因此，抗体可以是人而非动物谱系的产物。因为它是人来源的，所以可以最小化针对自身抗原的反应性的风险。可替代地，标准酵母展示文库和展示技术可用于选择和分离人抗RGMa抗体。例如，可以使用初始人单链可变片段(scFv)的文库来选择人抗RGMa抗体。可以使用转基因动物来表达人抗体。

人源化抗体可以为结合所需抗原的来自非人物种抗体的抗体分子，其具有来自非类物种的一或多个互补决定区(CDR)及来自人类免疫球蛋白分子的框架区。

抗体可以特异性结合RGMa。在某些实施例中，抗RGMa抗体结合位于RGMa的N-末端区域的表位。

抗体可以结合SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、或其片段或变体。如上描述，抗体可识别并特异性结合RGMa多肽或变体上存在的表位。表位可以是SEQ ID NO：17(全长人RGMa)、SEQ ID NO：18(对应于SEQ ID NO：17的氨基酸47-168的人RGMa片段)、SEQID NO：19(人RGMa片段)、或其变体，其序列在以下提供：

在某些实施例中，RGMa特异性RGMa抗体可包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、和6；SEQ IDNO：1、2、3、4、5、和7；SEQ ID NO：1、2、3、和9；SEQ ID NO：1、2、3、和10；SEQ ID NO：4、5、6、和8；SEQ ID NO：4、5、7、和8；SEQ ID NO：8和9；SEQ ID NO：8和10；SEQ ID NO：1、2、3、和15；SEQID NO：4、5、6、和16；SEQ ID NO：4、5、7、和16；或SEQ ID NO：15和16。

先前的数据表明AE12-1的表位位于RGMa的N-末端区域。在某些实施例中，抗体与人RGMa的氨基酸47-168内的RGMa表位结合。在某些实施例中，抗体与SEQ ID NO：18中列出的氨基酸内RGMa表位的结合。在某些实施例中，抗体与人RGMa的氨基酸47-69内的RGMa表位结合。在某些实施例中，抗体与SEQ ID NO：19中列出的氨基酸内RGMa表位的结合。

(1)抗体结构

(a)重链和轻链CDR

抗体可以免疫特异性结合RGMa(SEQ ID NO：17)、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、其片段、或其变体，并包含表1中显示的可变重链和/或可变轻链。抗体可以免疫特异性地结合RGMa、其片段、衍生物、或变体，并包含也在表1中显示的一个或多个重链或轻链CDR序列。抗体的轻链可以是κ链或λ链。例如，参见表1。用于制备表1中显示抗体的方法描述于WO 2013/112922中，其内容通过引用结合在此。

表1.抗RGMa单克隆抗体AE12-1和AE12-1-Y的VH和VL区的氨基酸序列的列表。

抗体或其变体或衍生物可以含有一个或多个氨基酸序列，这些氨基酸序列与SEQID NO：1-10或15-16中的一个或多个具有大于95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、或50％同一性。抗体或其变体或衍生物可以由一个或多个核酸序列编码，这些核酸序列与SEQ ID NO：1-10或15-16中的一个或多个具有大于95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、或50％同一性。例如，可以通过以下报道中描述的算法确定多肽的同一性和同源性：Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80，726-730(1983)。

抗体可以是IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY分子类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类别。例如，抗体可以是具有以下恒定区序列的IgG1分子：

SEQ ID NO：11中的以上恒定区在位置234和235处含有野生型恒定区序列的两个(2)突变。具体地，这些突变是位置234和235中的每一个处的亮氨酸至丙氨酸变化(其被称为“LLAA”突变)。这些突变在以上以黑体和下划线显示。这些突变的目的是消除效应子功能。

可替代地，IgG1分子可以具有含有一种或多种突变的以上恒定区序列(SEQ IDNO：11)。例如，SEQ ID NO：11的恒定区序列在氨基酸250处可以含有突变(其中苏氨酸被谷氨酰胺替换(SEQ ID NO：12))、在氨基酸428处含有突变(其中甲硫氨酸被亮氨酸替换(SEQID NO：13))、或在氨基酸250处含有突变(其中苏氨酸被谷氨酰胺替换)、以及在氨基酸428含有突变(其中甲硫氨酸被亮氨酸替换(SEQ ID NO：14))，如以下在表2中显示。

表2.

可替代地，IgG1分子可以含有如以下表3中显示的重链(包含：AE12-1-Y(VH)CDR-H1(SEQ ID NO：1)、AE12-1-Y(VH)CDR-H2(SEQ ID NO：2)、AE12-1-Y(VH)CDR-H3(SEQ ID NO：3))和轻链(包含：AEl2-1-Y(VL)CDR-L1(SEQ ID NO：4)、AE12-1-Y(VL)CDR-L2(SEQ ID NO：5)和AE12-1-Y(VL)CDR-L3(SEQ ID NO：7))以及SEQ ID NO：14的恒定序列(此抗体称为AE12-1-Y-QL，并具有SEQ ID NO：15的轻链序列和SEQ ID NO：16的重链序列)。

表3.

3.药物组合物

抗体可以是药物组合物的组分。药物组合物还可以含有药学上可接受的载体。包含本文描述的抗体的药物组合物用于治疗脊髓损伤，特别是促进轴突再生、功能恢复、或两者。包含本文描述的抗体的药物组合物还用于治疗疼痛，包括但不限于由脊髓损伤引起的神经性疼痛。在特定的实施例中，组合物包含本文描述的一种或多种抗体。根据这些实施例，组合物可进一步包含载体、稀释剂或赋形剂。

本文描述的抗体可并入适用于向受试者给予的药物组合物中。典型地，药物组合物包含本文描述的抗体(如例如，AE-12-1、AE-12-1-Y、或AE-12-1-Y-QL)和药学上可接受的载体。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等张剂及吸收延迟剂及其类似物。药学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇及其类似物中的一个或多个以及其组合。在许多情况下，在组合物中包括等张剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠将为优选的。药学上可接受的载体可进一步包含极少量的辅助物质，如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其可增加抗体的存放期或有效性。

在另外的实施例中，药物组合物包含用于治疗脊髓损伤或治疗疼痛(包括但不限于由脊髓损伤引起的神经性疼痛)的至少一种另外的治疗剂。

各种递送系统是已知的并可以用于给予本文描述的一种或多种抗体或本文描述的一种或多种抗体的组合，例如，囊封于脂质体、微粒、微胶囊、能够表达抗体或抗体片段的重组细胞中、受体介导的内吞作用(参见例如Wu和Wu，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]262：4429-4432(1987))、将核酸构建为反转录病毒或其他载体的一部分、等。给予预防剂或治疗剂的方法包括但不限于非经肠给予(例如皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、鞘内及皮下)、硬膜外给予、瘤内给予、及黏膜给予(例如鼻内及经口途径)。另外，还可使用肺部给予，例如通过使用吸入器或喷雾器，及用气雾剂配制。参见，例如美国专利号6,019,968；5,985,320；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；和4,880,078；和PCT公开号WO 92/19244；WO97/32572；WO97/44013；WO98/31346；以及WO99/66903，其每篇文献通过引用以其整体结合在此。在一个实施例中，使用Alkermes肺部药物递送技术(阿尔科姆斯公司(Alkermes，Inc.)，剑桥，麻萨诸塞州(Mass.))来给予本文描述的抗体、组合疗法、或本文描述的组合物。在特定实施例中，将本文描述的抗体的预防剂或治疗剂肌肉内、静脉内、瘤内、经口、鼻内、肺部或皮下给予。预防剂或治疗剂可通过任何便利途径给予，例如通过输注或快速注射，通过经上皮或黏膜皮肤衬层(例如口腔黏膜、直肠及肠黏膜等)吸收，且可与其他生物活性剂一起给予。给予可为全身性或局部的。

在特定的实施例中，可能需要将本文描述的抗体局部给予至需要治疗的区域；此可通过例如但不限于局部输注、注射或借助于植入物来达成，该植入物为多孔或无孔材料，包括膜及基质，如硅橡胶膜(silastic membrane)、聚合物、纤维基质(例如)或胶原蛋白基质。在一个实施例中，将有效量的一种或多种本文描述的抗体局部给予至受试者的受侵袭区域，从而预防、治疗、管理和/或改善障碍或其症状。在另一个实施例中，将有效量的一种或多种本文描述的抗体与有效量的一种或多种除本文描述的抗体以外的疗法(例如，一种或多种预防剂或治疗剂)组合局部给予至受试者的受侵袭区域，从而预防、治疗、管理和/或改善障碍或其一种或多种症状。

在某些实施例中，可以排除鞘内给予作为治疗选择(例如，在损伤的早期阶段，如果水肿阻碍CSF流动)。

将药物组合物配制成与其预期的给予途径相容。给予途径的实例包括但不限于非经肠，例如静脉内、鞘内、皮内、皮下、经口、鼻内(例如吸入)、经皮(例如局部)、经黏膜、及经直肠给予。在一个特定实施例中，组合物根据常规程序配制为适合于静脉内、皮下、肌肉内、经口、鼻内或局部给予给人类的药物组合物。通常，用于静脉内给予的组合物为于无菌等张水性缓冲剂中的溶液。必要时，组合物还可包括增溶剂及如利多卡因(1ignocaine)的局部麻醉剂以减轻注射部位的疼痛。

本文描述的方法可包括通过注射(例如通过快速注射或连续输注)给予经配制用于非经肠给予的组合物。用于注射的配制品可以按单位剂型而存在，例如在添加有防腐剂的安瓿中或在多剂量容器中。组合物可采用如于油性或水性媒介中的悬浮液、溶液或乳液的形式且可含有如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的配制剂。可替代地，活性成分可呈在使用之前用适合媒介(例如，无菌无热原质水)复原的粉末形式。本文描述的方法可另外包含给予配制为储槽式制剂的组合物。此类长效配制品可通过植入(例如，皮下、鞘内或肌肉内)或通过肌肉内注射来给予。因此，例如，组合物可用适合的聚合或疏水性物质(例如，如于可接受的油中的乳液)或离子交换树脂或微溶衍生物(例如，微溶盐)配制。

本文描述的方法涵盖给予经配制为中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的盐，如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐；及与阳离子形成的盐，如衍生自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等的盐。

一般而言，组合物的成分单独提供或以单位剂型混合在一起，例如呈于标明活性剂的量的气密密封式容器(如安瓿或药囊)中的干燥冻干粉末或无水浓缩物形式。当给予模式为输注时，组合物可用含有无菌药物级水或盐水的输注瓶分配。当给予模式为注射时，可提供一安瓿注射用无菌水或盐水以使得可在给予之前混合成分。

具体而言，将本文描述的方法还预期本文描述的一种或多种抗体或药物组合物封装于标明抗体的量的气密密封式容器(如安瓿或药囊)中。在一个实施例中，本文描述的一种或多种抗体、或药物组合物是以干燥无菌冻干粉末或无水浓缩物形式提供于气密密封式容器中且其可复原(例如用水或盐水)至适当浓度以向受试者给予。在一个实施例中，本文描述的一种或多种抗体或药物组合物是以至少5mg，例如至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、至少75mg、或至少100mg的单位剂量以干燥无菌冻干粉末提供于气密密封式容器中。本文描述的冻干的抗体或药物组合物应该在2℃与8℃之间储存于其初始容器内，并且本文描述的抗体、或药物组合物应该在复原后1周内，例如5天内、72小时内、48小时内、24小时内、12小时内、6小时内、5小时内、3小时内、或1小时内给予。在可替代的实施例中，将本文描述的一种或多种抗体或药物组合物以液体形式提供于标明抗体的数量及浓度的气密密封式容器中。在另外的实施例中，将液体形式给予的组合物以至少0.25mg/ml，例如至少0.5mg/ml、至少1mg/ml、至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、或至少100mg/ml提供于气密密封式容器中。液体形式应在2℃至8℃储存在其初始容器中。

本文描述的抗体可并入适用于非经肠给予的药物组合物中。在一个方面，抗体将被制备为含有0.1-500mg/ml抗体的可注射溶液。可注射溶液可由液体或冻干剂型构成，于燧石或琥珀小瓶、安瓿或预填充注射器中。缓冲剂可为L-组氨酸(1-50mM)，最优选地5-10mM，pH 5.0至7.0(最优选pH 6.0)。其他适合缓冲剂包括但不限于琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。可使用浓度为0-300mM(对于液体剂型，最优选为150mM)的氯化钠来修改溶液的毒性。对于冻干剂型，可包括低温保护剂，主要为0-10％蔗糖(最优选为0.5-1.0％)。其他适合的低温保护剂包括海藻糖及乳糖。对于冻干剂型，可包括膨化剂，主要为1-10％甘露糖醇(最优选为2-4％)。液体及冻干剂型中均可使用稳定剂，主要为1-50mM L-甲硫胺酸(最优选为5-10mM)。其他适合的膨化剂包括甘氨酸、精氨酸，可以0-0.05％聚山梨醇酯80(最优选为0.005-0.01％)形式包括。其他表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯20及BRIJ表面活性剂。制备为用于非经肠给予的可注射溶液的包含本文描述的抗体药物组合物可以进一步包含适用作佐剂的试剂，如用于增大抗体的吸收或分散的试剂。特别适用的佐剂为玻尿酸酶，如(重组人类破尿酸酶)。在可注射溶液中添加玻尿酸酶改善非经肠给予、尤其皮下给予后的人类生物利用度。其还允许伴随更少疼痛及不适的更大注射部位体积(即大于1ml)，且注射部位反应的发生率极小。(参见国际申请公开号WO 04/0781 40和美国专利申请公开号US2006104968，通过引用结合在此。)

本文描述的组合物能以多种形式存在。这些形式包括(例如)液体、半固体及固体剂型，如液体溶液(例如，可注射溶液及可输注溶液)、分散液或悬浮液、片剂、丸剂、散剂、脂质体及栓剂。优选形式视预期给予模式及治疗应用而定。组合物呈可注射或可输注溶液的形式，如与用于用其他抗体使人被动免疫的组合物类似的组合物。在一个实施例中，通过静脉内输注或注射给予抗体。在另一个实施例中，通过肌肉内或皮下注射给予抗体。

治疗组合物通常必须无菌且在制造及储存条件下稳定。组合物可配制为溶液、微乳液、分散液、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物(即，结合蛋白，例如本文描述的抗体)与以上所列成分中的一者或组合一起并入适当溶剂中、随后视需要过滤灭菌来制备。一般而言，分散液是通过将活性化合物并入含有基本分散介质及来自以上所列成分的所需其他成分的无菌媒介中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌冻干粉末的情况下，制备方法包括真空干燥及喷雾干燥，其得到活性成分加上来自先前经无菌过滤的活性成分溶液的任何其他所需成分的粉末。溶液的适当流动性可例如借由使用如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下借由维持所需粒度及借由使用表面活性剂来维持。可注射组合物的延长吸收可借由在组合物中包括例如单硬脂酸盐及明胶的延迟吸收剂来达成。

可以将本文描述的抗体通过本领域已知的各种方法来给予。例如，给予的途径/模式可以是皮下注射、静脉注射或输注。如本领域中的熟练技术人员应理解，给予途径和/或模式将视所需结果而变化。在某些实施例中，活性化合物可用将保护化合物不会快速释放的载体制备，如控制释放配制品，包括植入物、经皮贴片、及微囊封递送系统。可使用生物可降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、及聚乳酸。许多用于制备此类配制品的方法已获得专利或为本领域技术人员所公知。参见例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems[持续和控制释放药物递送系统]，J.R.Robinson编辑，马塞尔·德克公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约.1978。

在某些实施例中，可以将本文描述的抗体口服给予，例如与惰性稀释剂或可同化可食用载体一起。该抗体(及视需要选用的其他成分)还可包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，压缩成片剂，或直接并入受试者的饮食中。对于经口治疗性给予，可将抗体与赋形剂合并且以可摄取片剂、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸囊剂及其类似物的形式使用。为通过除非经肠给予以外的形式给予本文描述的抗体，可能需要将该抗体用防止其失活的材料包覆或将该抗体与防止其失活的材料共给予。

还可将补充活性化合物并入组合物中。在某些实施例中，将本文描述的抗体与一种或多种另外的治疗剂共配制和/或共给予对于治疗本文描述的障碍或疾病是有用的。例如，本文描述的抗RGMa抗体可以与一种或多种另外的抗体(其结合其他靶)(例如，结合其他可溶性抗原的或结合细胞表面分子的抗体)共配制和/或共给予。此外，本文描述的一种或多种抗体可以与前述治疗剂中的两种或更多种组合。此类组合疗法可以利用更低的治疗剂给予剂量，从而避免与各种单一疗法相关的可能毒性或并发症。

在某些实施例中，本文描述的抗体与本领域中已知的延长半衰期的媒介相关。此类媒介包括但不限于Fc域、聚乙二醇、及葡聚糖。此类媒介描述于例如美国申请序列号09/428，082及公开的PCT申请号WO 99/25044中，其出于任何目的通过引用结合在此。

应当理解，本文描述的抗体可以单独使用或与一种或多种另外的试剂(例如，治疗剂(例如，小分子或生物制品))组合使用，所述另外的试剂是由技术人员出于预期目标选择的。

应进一步理解，组合是适用于其预期目标的那些组合。以上列出的试剂是为了说明的目的，而不是意在限制。组合可以包含抗体和选自下表的至少一种另外的试剂。该组合也可以包括一种以上另外的试剂，例如两种或三种另外的试剂，只要这样的组合形成的组合物能够实现其预定作用。

药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的抗体。“治疗有效量”是指在必需剂量下及在必需时间内可有效达成所需治疗结果的量。治疗有效量的抗体可以由本领域技术人员确定，并且可以根据多种因素而变化，这些因素如个体疾病症态、年龄、性别和体重等因素以及抗体在个体中引发希望的应答的能力。治疗有效量也是其中抗体的毒性或有害作用(如果有的话)被治疗有益效果超过的量。“预防有效量”是指以剂量计并且持续所需的时间段以实现所希望的预防结果的有效的量。通常，由于预防剂量是在疾病之前或在疾病早期用于受试者，因此预防有效量将小于治疗有效量。

可调整给药方案以提供最优所需反应(例如治疗或预防反应)。举例而言，可给予单次快速注射，可随时间给予若干分次剂量，或可依治疗情况的紧急性所指示按比例减少或增加剂量。就易给予及剂量的均一性而言，将非经肠组合物配制成单位剂型尤其有利。如在此使用的单位剂型是指作为针对待治疗的哺乳动物受试者的单一剂量适合的物理上离散的单位；每个单位含有预确定量的活性化合物，经计算，该量产生与所需药物载体相关的所希望的治疗效果。单位剂型的规格由下列情况指定且直接取决于下列情况：(a)活性化合物的独特特征及欲达成的特定治疗或预防效果，及(b)混合此类活性化合物以治疗个体敏感性的技术中的固有限制。

治疗或预防有效量的抗体剂量的示例性非限制性范围是在0.1与200mg/kg之间，例如在0.1与100mg/kg之间、在5与50mg/kg之间、或在10与25mg/kg之间。抗体的治疗或预防有效量可以在1与200mg/kg、10与200mg/kg、20与200mg/kg、50与200mg/kg、75与200mg/kg、100与200mg/kg、150与200mg/kg、50与100mg/kg、5与10mg/kg、或1与10mg/kg之间。应注意，剂量值可随欲缓解的病症的类型及严重程度变化。此外，抗体剂量可以由本领域技术人员确定，并且可以根据多种因素而变化，这些因素如个体疾病症态、年龄、性别和体重等因素以及抗体在个体中引发希望的应答的能力。剂量也是其中抗体的毒性或有害作用(如果有的话)被治疗有益效果超过的量。此外应理解，对任何特定受试者而言，特定给药方案应根据受试者需要及给予组合物或监督组合物给予的人员的专业判断而随时调整，且本文所列出的剂量范围仅为示例性的，且不意欲限制所要求的组合物的范围或实践。

4.治疗方法

a.脊髓损伤(SCI)

在任何受试者中，可以评估受试者是否患有脊髓损伤或处于患脊髓损伤的风险中。评估可以指示适当的疗程，如预防性疗法、维持疗法、或调节性疗法。因此，本文提供的是通过给予治疗有效量的一种或多种本文描述的抗体(例如，抗体AE12-1、AE12-1-Y、或AE12-1-Y-QL)来治疗、预防、调节、或减弱脊髓损伤的方法。可以将抗体给予有需要的受试者。能以治疗有效量给予抗体。

在一个实施例中，脊髓损伤的原因是机动车辆事故、跌倒、暴力、运动损伤、血管疾病、肿瘤、传染病、颈椎病、医原性损伤(特别是在脊柱注射和硬膜外导管置入后)、骨质疏松症继发脊椎骨折、或发育障碍。

在某些实施例中，脊髓损伤可以由例如钝力创伤、压迫、位移等引起。在某些实施例中，脊髓被完全切断。在某些其他实施例中，脊髓被损坏，例如部分切断，但未完全切断。在其他实施例中，脊髓被压缩，例如，通过损坏脊柱的骨结构、一个或多个椎骨相对于其他椎骨的位移、相邻组织的炎症或肿胀等。

脊髓损伤包括称为四肢瘫痪(以前称为四肢麻痹)和截瘫的病症。因此，本文提供的治疗脊髓损伤的方法的一些实施例包括治疗四肢瘫痪患者或截瘫患者。

四肢瘫痪指的是颈部区域的脊髓损伤，其特征在于由于椎管内的神经元件损坏而在脊髓的颈段中损伤或丧失运动和/或感觉功能。四肢瘫痪导致手臂以及躯干、腿和盆腔器官的功能受损。它不包括臂丛神经病变或神经管外周围神经损伤。

截瘫是指继发于损坏椎管内神经元件，脊髓的胸椎、腰椎或骶骨(但不是颈椎)节段中的运动和/或感觉功能的损伤或丧失。截瘫时，手臂功能不受影响，但取决于损伤的水平，会涉及躯干、腿部和盆腔器官。该术语用于指马尾神经和脊髓圆锥损伤，但不用于腰骶神经丛病变或神经管外周神经损伤。

在一个实施例中，脊髓损伤位于颈椎的一个或多个处。在另一个实施例中，脊髓损伤位于胸椎的一个或多个处。在另一个实施例中，脊髓损伤位于腰椎的一个或多个处。在另一个实施例中，脊髓损伤位于骶椎的一个或多个处。在某些实施例中，脊髓损伤位于椎骨C1、C2、C3、C4、C5、C6或C7处；或位于椎骨T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11或T12处；或位于椎骨L1、L2、L3、L4或L5处。在某些其他实施例中，脊髓损伤是在以下之间离开脊柱的脊髓根的损伤：C1与C2之间；在C2与C3之间；在C3与C4之间；在C4与C5之间；在C5与C6之间；在C6与C7之间；在C7与T1之间；在T1与T2之间；在T2与T3之间；在T3与T4之间；在T4与T5之间；在T5与T6之间；在T6与T7之间；在T7与T8之间；在T8与T9之间；在T9与T10之间；在T10与T11之间；在T11与T12之间；在T12与L1之间；在L1与L2之间；在L2与L3之间；在L3与L4之间；或在L4与L5之间。在某些实施例中，损伤是对颈髓的损伤。在其他实施例中，损伤是对胸髓的损伤。在其他实施例中，脊髓损伤是对腰骶髓的损伤。在某些其他实施例中，脊髓损伤是对圆锥的损伤。在某些其他实施例中，CNS损伤是对马尾神经中一个或多个神经的损伤。在另一个实施例中，脊髓损伤是在枕骨的损伤。

一般来说，所给予的抗体的剂量将变化，这取决于患者的年龄、重量、身高、性别、总体医学状况以及先前医疗史等因素。可调整给药方案以提供最优所需反应(例如治疗或预防反应)。举例而言，可给予单次快速注射，可随时间给予若干分次剂量，或可依治疗情况的紧急性所指示按比例减少或增加剂量。就易给予及剂量的均一性而言，将非经肠组合物配制成单位剂型尤其有利。如在此使用的单位剂型是指作为针对待测试的哺乳动物受试者的单一剂量适合的物理上离散的单位；每个单位含有预确定量的活性化合物，经计算，该量产生与所需药物载体相关的所希望的治疗效果。本发明的单位剂型的规格由下列情况指定且直接视下列情况而定：(a)活性化合物的独特特征及欲达成的特定治疗或预防效果，及(b)混合此类活性化合物以治疗个体敏感性的技术中的固有限制。

应注意，剂量值可随欲缓解的病症的类型及严重程度变化。此外应理解，对任何特定受试者而言，特定给药方案应根据受试者需要及给予组合物或监督组合物给予的人员的专业判断而随时调整，且本文所列出的剂量范围仅为示例性的，且不意欲限制所要求的组合物的范围或实践。

向患者给予抗体可以是静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、胸膜内、鞘内、眼内、玻璃体内、通过局部导管灌注、或通过直接病灶内注射。当通过注射给予治疗性蛋白时，可通过连续输注或通过单次或多次快速注射进行给予。由于快速分布的抗体循环彻底，静脉内注射提供了有用的给予模式。抗体可以例如，与惰性稀释剂或可同化可食用载体一起口服给予。抗体和其它成分(如果需要)可以包封在硬壳或软壳明胶胶囊中、压制成片剂、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸囊剂等。

可以将抗RGMa抗体以低蛋白剂量给予，如20毫克至2克蛋白/剂量，非经肠给予一次或重复给予。可替代地，可以将抗体以20至1000毫克蛋白/剂量、或20至500毫克蛋白/剂量、或20至100毫克蛋白/剂量的剂量给予。

抗RGMa抗体可以在脊髓损伤后的不同时间(包括但不限于脊髓损伤后小于24小时)给予。在某些实施例中，将抗RGMa抗体在脊髓损伤后小于1、小于2、小于3、小于4、小于5、小于6、小于7、小于8、小于9、小于10、小于11、小于12、小于13、小于14、小于15、小于16、小于17、小于18、小于19、小于20、小于21、小于22、或小于23小时给予受试者。在某些特定的实施例中，将抗RGMa抗体在脊髓损伤后约1、约1.5、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5、约10、约10.5、约11、约11.5、或约12小时给予受试者。

抗RGMa抗体可以单独给予或它们可以与脂质体缀合，并可以根据已知方法配制以制备药学上有用的组合物，由此将抗体与药学上可接受的载体组合为混合物。“药学上可接受的载体”可以被受体患者耐受。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上可接受的载体的一个实例。其他合适的载体是本领域技术人员熟知的。参见例如，REMINGTON′S PHARMACEUTICALSCIENCES[雷明顿药物科学]，第19版(1995)中。

出于疗法的目的，将抗体以治疗有效量在药学上可接受的载体中给予患者。“治疗有效量的”是生理学上有意义的量。如果抗体的存在导致受体患者生理学的可检测变化，则该抗体是生理学上有意义。在本文中，如果抗体的存在导致例如来自CD4⁺T细胞的干扰素-γ(INF-γ)、白细胞介素-2(IL-2)、IL-4和/或IL-17的分泌减少，则该抗体可以是生理学上有意义。如果试剂的存在导致例如外周血单核细胞(PBMC)中的增殖反应和/或促炎细胞因子表达降低，则该试剂是生理学上有意义。

可以采用另外的治疗方法来控制抗体在治疗应用中的作用持续时间。可以通过使用聚合物来复合或吸附抗体来制备控释制剂。例如，生物相容性聚合物包括聚(乙烯-共-乙烯基乙酸酯)基质和硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酐共聚物的基质。Sherwood等人，Bio/Technology[生物/技术]10：1446(1992)。从这种基质中释放抗体的速率取决于蛋白的分子量、基质内抗体的量、和分散颗粒的尺寸。Saltzman等人，Biophys.J.[生物物理学杂志]55∶163(1989)；Sherwood等人，同上。其他固体剂型描述在REMINGTON′S PHARMACEUTICALSCIENCES[雷明顿药物科学]，第19版(1995)中。

(1)神经恢复

可以使用可用的测量来评估神经恢复，这些测量包括但不限于Frankel分级、运动评分、和美国脊髓损伤协会(ASIA)损伤量表(AIS)。AIS是评估运动和感觉神经完整性的临床工具。

在一些实施例中，根据脊髓损伤的神经学和功能分类国际标准评估SCI的一个或多个症状的改善、或SCI的一个或多个症状的进展的减少。由ASIA出版的脊髓损伤神经学和功能分类国际标准是被广泛接受的系统，该系统基于对神经功能的系统运动和感觉检查来描述SCI的水平和程度。参见International Standards For NeurologicalClassification Of Spinal Cord Injury[脊髓损伤神经学分类国际标准]，J SpinalCord Med.[脊髓医学杂志]34(6)：535-46(2011)，其披露内容通过引用以其整体结合在此。

(2)功能恢复

功能恢复可以与神经恢复结合或独立地实现。功能恢复可使用可获得的测量进行评估，这些测量包括但不限于脊髓独立测量(SCIM)、功能独立测量(FIM)、脊髓损伤行走指数(WISCI)、改良的Barthel指数(MBI)、四肢瘫痪功能指数(QIF)、伦敦障碍量表(LondonHandicap scale)、和简易格式36。参见例如，Anderson K.等人Functional RecoveryMeasures for Spinal Cord Injury：An Evidence-Based Review for ClinicalPractice and Research.[脊髓损伤的功能恢复措施：临床实践和研究的循证评价]J.Spinal Cord Med.[脊髓医学杂志]31，133-144(2008)。在其他实施例中，可以使用旷场Basso、Beattie和Bresnahan(BBB)活动测试，步态分析，爬梯行走分析，和/或形成组合行为评分(CBS)的测试来评估功能恢复。

b.疼痛

在任何受试者中，可以评估受试者是否患有(或有风险经历)任何类型的急性或慢性疼痛病症或障碍(包括伤害性疼痛、神经性疼痛或其组合)。此类疼痛病症或障碍可包括但不限于手术后疼痛、骨关节疼痛、由于炎症的疼痛、类风湿性关节炎疼痛、肌骨骼疼痛、烧伤疼痛(包括晒伤)、眼部疼痛、与牙齿状况相关的疼痛(如龋齿和龈炎)、产后疼痛、骨折、疱疹、HIV、创伤性神经损伤、中风、局部缺血后、纤维肌痛、反射交感性营养不良、疼痛综合征、脊髓损伤、坐骨神经痛、幻肢疼痛、糖尿病性神经病、痛觉过敏和癌症。评估可以指示适当的疗程，如预防性疗法、维持疗法、或调节性疗法。因此，本文提供的是通过给予治疗有效量的一种或多种本文描述的抗体(例如，抗体AE12-1、AE12-1-Y、或AE12-1-Y-QL)来治疗、预防、调节、或减弱脊髓损伤的方法。可以将抗体给予有需要的受试者。能以治疗有效量给予抗体。

抗RGMa抗体可以在脊髓损伤后的不同时间(其中存在发生神经性疼痛的风险，包括但不限于脊髓损伤后小于24小时)给予。在某些实施例中，将抗RGMa抗体在脊髓损伤后小于1、小于2、小于3、小于4、小于5、小于6、小于7、小于8、小于9、小于10、小于11、小于12、小于13、小于14、小于15、小于l 6、小于17、小于18、小于19、小于20、小于21、小于22、或小于23小时给予受试者。在某些特定的实施例中，将抗RGMa抗体在脊髓损伤后约1、约1.5、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5、约10、约10.5、约11、约11.5、或约12小时给予受试者。

抗体可以单独给予或它们可以与脂质体缀合，并可以根据已知方法配制以制备药学上有用的组合物，由此将抗体与药学上可接受的载体组合为混合物。“药学上可接受的载体”可以被受体患者耐受。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上可接受的载体的一个实例。其他合适的载体是本领域技术人员熟知的。参见例如，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES[雷明顿药物科学]，第19版(1995)中。

出于疗法的目的，将抗体以治疗有效量在药学上可接受的载体中给予患者。“治疗有效量的”是生理学上有意义的量。如果抗体的存在导致受体患者生理学的可检测变化，则该抗体是生理学上有意义。在本文中，如果抗体的存在导致例如来自CD4+T细胞的干扰素-γ(INF-γ)、白细胞介素-2(IL-2)、IL-4和/或IL-17的分泌减少，则该抗体可以是生理学上有意义。如果试剂的存在导致例如外周血单核细胞(PBMC)中的增殖反应和/或促炎细胞因子表达降低，则该试剂是生理学上有意义。

可以采用另外的治疗方法来控制抗体在治疗应用中的作用持续时间。可以通过使用聚合物来复合或吸附抗体来制备控释制剂。例如，生物相容性聚合物包括聚(乙烯-共-乙烯基乙酸酯)基质和硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酐共聚物的基质。Sherwood等人，Bio/Technology[生物/技术]10：1446(1992)。从这种基质中释放抗体的速率取决于蛋白的分子量、基质内抗体的量、和分散颗粒的尺寸。Saltzman等人，Biophys.J.[生物物理学杂志]55：163(1989)；Sherwood等人，同上。其他固体剂型描述在REMINGTON′S PHARMACEUTICALSCIENCES[雷明顿药物科学]，第19版(1995)中。

(1)神经性疼痛

如本文所用，术语“神经性疼痛”是指由神经、脊髓、或脑损伤引起的疼痛，并且通常涉及神经超敏性。神经性疼痛的实例包括慢性下腰疼痛、与关节炎相关的疼痛、癌症相关的疼痛、疱疹神经痛、幻肢疼痛、中枢性疼痛、阿片类药物耐药神经性疼痛、骨损伤疼痛、和分娩期的疼痛。神经性疼痛的其他实例包括手术后疼痛、丛集性头痛、牙痛、外科手术疼痛、由严重的例如三度烧伤引起的疼痛、产后疼痛、心绞痛疼痛、泌尿生殖道相关(并包括膀胱炎)的疼痛。

神经性疼痛可以与伤害性疼痛区分开。涉及伤害性机制的疼痛通常在组织修复期间受到限制，并且通常通过可用的镇痛剂或阿片类药物来缓解(Myers(1995)RegionalAnesthesia[局部麻醉]20：173)。神经性疼痛通常是持久的或慢性的，并且通常在初始急性组织损伤后数天或数月发展。神经性疼痛可涉及持续性、自发性疼痛以及异常性疼痛，这是对通常不疼痛的刺激的疼痛反应。神经性疼痛也可以通过痛觉过敏来表征，其中对通常是微不足道的疼痛刺激(例如针刺)具有强烈反应。与伤害性疼痛不同，神经性疼痛通常对阿片类药物疗法有抗性(Myers，同上，1995)。因此，本文披露的抗体可以用于治疗神经性疼痛。

如本文所用，术语“伤害性疼痛”是指穿过完整神经元通路传导的疼痛，即由对身体的损伤引起的疼痛。伤害性疼痛包括躯体感觉和疼痛的正常功能，并告知受试者即将发生的组织损坏。存在伤害感受途径以保护受试者，例如，响应于烧伤经历的疼痛。伤害性疼痛包括骨疼痛、内脏疼痛、和与软组织相关的疼痛。

5.实例

本发明具有多个方面，这些方面通过以下非限制性实例说明。

用于实例1的一般方法

研究设计的概述如图4A所示。对成年雌性Wistar大鼠进行预训练，并且然后根据公布的方案用改良的动脉瘤夹，在T8用20g力进行夹式冲击压迫SCI持续1min。简而言之，用夹钳施放器保持夹子打开，其中围绕脊髓，夹子的下叶在硬膜外并且在腹侧穿过。然后将夹子从施加器快速释放以产生双侧撞击力，然后持续进行背侧-腹侧压迫。这是反映人病理学的临床相关SCI模型。急性撞击和随后持续压迫的组合是SCI在人中最常见的机制；急性夹子压迫模型可以模拟这种撞击-压迫损伤。

夹子撞击-压迫之后立即进行局部脊柱内和全身静脉内注射(20mg/kg)AE12-1、AE12-1-Y、hIgG同种型对照、或PBS媒介，每周一次直至SCI后6周。

实例1.1

在SCI后，在大鼠和人脊髓中的RGMa表达

方法学：制备大鼠组织切片用于免疫组织化学染色，并在4℃与一抗孵育过夜。使用以下一抗：神经元的NeuN(1：500，密理博生物科学研究实际公司(Millipore BioscienceResearch Reagents)、星形胶质细胞的GFAP(1：200，密理博公司(Millipore))、激活的巨噬细胞/小胶质细胞的Iba-1(1：1000，和光化学公司(Wako Chemicals))、硫酸软骨素蛋白聚糖的CS56(1：500，西格玛公司(Sigma))、感觉纤维的降钙素基因相关肽(CGRP)(1：1000，密理博公司(Millipore))、5-羟色胺能纤维的5HT(1：3000，ImmunoStar公司)、和检测人IgG抗体的hIgG(1：500，密理博公司(Millipore))。将切片与在封闭溶液中稀释的一抗一起孵育过夜、洗涤、并与荧光缀合的二抗一起孵育。

制备人组织切片用于染色，并与在封闭溶液中稀释的一抗(1：200RGMa，艾博抗公司(Abcam)；或1：100再生蛋白，圣克鲁兹(Santa Cruz))一起孵育过夜。将切片洗涤、与生物素化的抗小鼠二抗(1：500，载体实验室公司(Vector Laboratories))一起孵育、洗涤、并与抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(Vectastain Elite ABC Kit Standard，载体实验室公司(Vector Laboratories))一起孵育。应用二氨基联苯胺(DAB)(Vectastain EliteABC Kit Standard，载体实验室公司(Vector Laboratories))作为色原体。

结果：在大鼠脊髓的夹子撞击-压迫损伤后，RGMa上调(图1、图10)。如通过双标记免疫染色所示，RGMa主要由正常大鼠脊髓中的神经元(RGMa+/NeuN+)和少突胶质细胞(RGMa+/CC1+)表达(图1A和B)。损伤后1周的定量显示RGMa表达增加15倍(图10A)。SCI后，RGMa在神经元(图1A)、少突胶质细胞(图1B，图10C)、星形胶质细胞(如由GFAP标记所示，图1C)、激活的小胶质细胞和巨噬细胞(如由Iba-1(图1C)和ED-1(图10B)所示)、并且在病变部位内和周围的CSPG富含疤痕区域内(图1C)表达。

在未损伤的人脊髓中，RGMa在神经元中以低水平表达，如通过中间灰质中的神经元(图2A和B)和背侧柱中的少突胶质细胞(图2C)的免疫染色所示。在SCI后3天损伤的人脊髓中，RGMa表达在神经元、轴突、少突胶质细胞、和富含髓鞘的白质区域中上调(图2D-F)。此外，RGMa受体再生蛋白由大鼠(数据未显示)和人脊髓中的神经元表达，并且在损伤后也上调(图11)。

实例1.2

在体外抗RGMa抗体对神经突向外生长的影响

方法学：对于神经突向外生长测定，将E18小鼠皮层神经元铺板于用层粘连蛋白(英杰公司(Invitrogen)；10mg/m1)和RGMa蛋白(5mg/ml)处理的聚-L-赖氨酸涂覆的玻璃盖玻片上，并在37℃用对照抗体(hIgG)或抗RGMa(1mg/m1)孵育24小时。对于神经突向外生长分析，皮质细胞用βIII-微管蛋白(西格玛公司(Sigma)；1：500)免疫染色。对于蛋白质印迹，将小鼠皮层神经元在RIPA缓冲液中裂解并加载到10％丙烯酰胺凝胶上，然后转移到硝基纤维素膜上。用抗RGMa抗体(AE12-1和AE12-1-Y)和抗再生蛋白(E20；圣克鲁兹(Santa Cruz)；10mg/ml)探测印迹。

结果：在小鼠皮层神经元裂解物的蛋白质印迹中，AE1 2-1和AE12-1-Y两者均特异性地检测到50kDa条带(图3A)。培养的小鼠原代皮层神经元也显示出表达RGMa，如用AE12-1-Y免疫染色所示(图3B，AE12-1免疫染色未显示)。在体外，抗RGMa抗体促进神经元向外生长。铺板于层粘连蛋白和抑制性RGMa上的培养的胚胎小鼠皮层神经元在与hIgG孵育时显示出神经突的最小延伸，而与仅铺板于层粘连蛋白上的细胞相比，用AE12-1和AE12-1-Y RGMa抗体孵育导致更广泛的神经突向外生长。在蛋白质印迹中，再生蛋白受体被检测为200kDa条带，并且再生蛋白也被培养的小鼠皮层神经元表达(图12)。

实例1.3

检测抗RGMa抗体血清、CSF、和脊髓

方法学：在SCI后6周，经由腰椎穿刺(LP)取样脑脊液(CSF)。在SCI后9周，在最后一次抗体给药后3周，收集血清并灌注大鼠。使用ELISA测定，确定来自AE12-1、AE12-1-Y、和hIgG治疗的大鼠的CSF和血清样品中的抗体浓度。

结果：注射AE12-1的大鼠的CSF中的抗体浓度范围从0.25-8.20μg/ml，并且对于AE12-1-Y，抗体浓度范围从0.33-6.77μg/ml(图4B)。相比之下，血清中的抗体浓度相当更高，大约比CSF中的大10倍，因为将抗体在SCI后立即初始脊柱内注射后进行静脉内注射(图4C)。此外，在最后一次给药后3周，抗体浓度在血清中持续升高。通过用抗人IgG免疫染色大鼠脊髓组织，在损伤大鼠脊髓中检测到人抗体。在来自用AE12-1(或AE12-1-Y，图中未显示)或hIgG对照抗体(但不在PBS媒介对照中)注射的大鼠的组织中检测到人IgG免疫反应性(图4D)。人IgG的染色在血管周围是明显的，并且在病变部位周围的CSPG阳性疤痕组织内是明显的(图4D)。在注射AE12-1或AE1 2-1-Y或hIgG的组织中染色没有差异。

实例1.4

抗RGMa抗体促进功能恢复

方法学：在损伤前进行功能测试以进行预训练并在SCI后1天再次获得基线评估分数，然后每周一次进行持续6周。使用BBB活动评定量表、运动分项分数和水平爬梯行走测试每周一次监测神经恢复。

使用Basso、Beattie和Bresnahan(BBB)活动评定量表来评估活动功能，其范围从0(无后肢运动)到21(正常运动)。运动分项分数用于评估另外的测量，例如脚趾间隙、优势爪位置、和不存在不稳定性。

爬梯行走分析用于评估精细运动功能。在SCI后每周一次，将BBB评分＞11的大鼠置于水平爬梯行走设备上并记录3次奔跑。以慢动作分析记录，并且对每次奔跑将每个后肢的脚步总数评分并取平均值。拖曳后肢的损伤大鼠评分得到最大脚步，6个脚步/后肢。未损伤大鼠每次穿越有0或偶尔1个脚步。

为了进一步阐明运动功能，使用CatWalk系统(诺达思信息技术公司(NoldusInformation Technology)，瓦赫宁恩(Wageningen)，荷兰)进行步态分析。在手术前获得基线计算机化步态评估，并与SCI后6周的评估进行比较。CatWalk分析系统已在别处详细描述。参见Hamers FP，Lankhorst AJ，van Laar TJ，Veldhuis WB，和Gispen WH.Automatedquantitative gait analysis during overground locomotion in the rat：itsapplication to spinal cord contusion and transection injuries.[大鼠地上部运动期间自动定量步态分析：其在脊髓挫伤和横断损伤中的应用]J Neurotrauma.[神经创伤杂志]2001；18(2)：187-201。

结果：与PBS或hIgG对照(其在试验期间维持)相比，用AE12-1急性治疗早在SCI后1周就显示出BBB的显著恢复(图5A)。相反，相对于对照，AE12-1-Y显示出BBB的延迟改善，在SCI后6周具有统计学显著差异(12.6比9.9PBS)(图5A)。AE12-1和AE12-1-Y的恢复曲线的差异可能是由于AE1 2-1的半衰期更长。与对照相比，AE12-1和AE12-1-Y都显示出更高的运动分项分数的趋势(图5B)。

在爬梯行走测试中，对脚步错误进行评分，因此，更高的分数反映出更差的协调。爬梯行走测试显示，用AE12-1或AE12-1-Y治疗的大鼠的脚步错误减少，其中AE12-1在SCI后3周有统计学差异(p<0.05)，第4、5和6周(p＝0.067、p＝0.089、p＝0.07)接近显著(图5C)。在SCI后6周，与对照(hIgG 41％、PBS29％)相比，AE12-1和AE12-1-Y治疗的大鼠显示出更高百分比的成功的后肢步行(68.4％和64.2％)(图5D)。

为了进一步表征RGMa中和对神经行为功能的影响，在SCI和治疗后6周使用CatWalk系统进行步态分析(图6)。相对于对照组，AE12-1和AE12-1-Y治疗的大鼠均显示出规律性指数的显著改善，反映出更好的爪间协调性(AE12-1：89.3％；AE12-1-Y：88.3％；hIgG：65.8％；PBS：63.4％)(图6)。AEl2-1和AE12-1-Y治疗的大鼠也显示出改善的后肢步幅长度和接近SCI前的值的摆动速度的趋势，尽管这没有达到统计学显著性。有趣的是，与对照相比，AE12-1治疗的大鼠中后爪与玻璃走道接触的平均强度显著增加(图6)。此外，用AE12-1或AE12-1-Y治疗不改变大鼠体重(图13)。

实例1.5

抗RGMa抗体促进神经元存活

方法学：在SCI后9周(即，在AE12-1或AEl2-1-Y治疗6周后)，用神经元标记物NeuN定量病灶周围神经元。

进行单独的实验，其中两组大鼠进行损伤并且用AE12-1或PBS注射(均完全地如上所述的脊柱内和静脉内)。在SCI/注射后7小时处死这些大鼠。进行用NeuN和TUNEL染色的双标记。

结果：与对照相比，用RGMa抗体治疗六周使病灶周围神经元的数量增加大约1.5倍(图7A和B)。

为了确定神经元保留是否是由于在损伤后经受细胞凋亡的神经元更少，在SCI/注射时间点后7小时评估神经元细胞死亡。相对于对照(2倍差异)，AE12-1治疗的大鼠中NeuN/TUNEL阳性神经元显著减少(图7C和D)。在空腔百分比或空腔体积方面，各组之间没有显著差异(图14A和14B)。

实例1.6

RGMa抗体减少星形胶质细胞增生和CSPG表达

方法学：对病变部位的吻侧和尾侧区域中的％GFAP阳性区域进行定量。为了定量GFAP免疫反应性，使用含有最大空腔区域的每个脊髓中的3个连续系列切片(间隔160μm)进行定量。类似地定量CSPG免疫反应性。

结果：在AE12-1-Y治疗的大鼠中观察到病变吻侧的星形胶质细胞增生显著减少(图15A和15B)。在AE12-1和AE12-1-Y治疗的大鼠中，在病变部位周围存在降低的CSPG表达的趋势(图15C)。

实例1.7

抗RGMa抗体促进轴突再生

方法学：为了使来自皮质脊髓束(CST)的轴突可视化，在完成功能评估后在SCI后6周进行了生物素化葡聚糖胺(BDA)的顺行轴突追踪。将BDA注射到感觉运动皮层(SMC)中以顺行标记CST。同时压迫脊髓背侧和腹侧的撞击-压迫损伤的SCI模型导致灰质和邻近白质的中心空腔，这切断背侧CST中的所有CST轴突，仅留下软膜下白质的保留的边缘。定量每个脊髓的吻侧区段中背侧CST的BDA染色强度，并且将该比率用于标准化BDA标记的纤维的计数以校正BDA标记效率的动物间变异。检查尾侧区段是否存在任何BDA标记的纤维。

在单独的实验中，如上所述对大鼠进行损伤并注射AE12-1-Y，然后在SCI后4周或6周注射BDA。注射后3周处死大鼠，如上所述定量BDA标记的轴突数和它们的长度。

结果：用AE12-1或AE12-1-Y治疗显示BDA标记的CST纤维在病变部位尾侧(图8A)。这些纤维显示出高度不规则的形态，不像BDA标记的CST纤维在病变吻侧或在未损伤大鼠中通常是长而直的(图16)。在注射AE12-1或AE12-1-Y的大鼠中，BDA标记的CST纤维的数量和平均最大长度两者均增加(图8C和D)。相反，在对照大鼠的病变部位尾侧没有观察到BDA纤维。与第4周相比，第6周时BDA标记的再生CST纤维更多，并且第6周时BDA标记的纤维显著更长(图8E)，表明在用AE12-1或AE12-1-Y治疗后CST轴突的再生。在对降低的5-羟色胺能途径的分析中，相对于对照，在AE12-1治疗的大鼠中在病变部位尾侧观察到显著更高数量的5HT+5-羟色胺能纤维(图17)。注射AE12-1-Y的大鼠显示出更高数量的5HT标记轴突的趋势，尽管AE12-1-Y组中5HT纤维计数的数量存在显著变异性，如大标准误差中所反映的(图17)。

实例1.8

抗RGMa抗体减弱神经性疼痛

方法学：对于神经性疼痛的测试，用vonFrey长丝纤维评估机械性异常性疼痛，并将甩尾测试用于热痛觉过敏。所有测试均由2名对治疗不知情(盲)的独立检查员进行。

将VonFrey长丝纤维(Stoelting)用于评估SCI后2周和6周的机械性异常性疼痛。将长丝纤维用于评估对通常无害的机械刺激的皮肤敏感性，并如Takahashi(2003)所述应用于皮节(dermatomes)，以确定SCI水平的机械性异常性疼痛。在每个时间点使用2g和4g长丝纤维。

通过甩尾测试、通过记录响应于有害皮肤加热的缩尾的潜伏期评估热痛觉过敏。使用自动镇痛计(IITC生命科学(IITC Life Science)，伍德兰山(Woodland Hills)，加利福尼亚州)将光束施加到尾巴的距离尖端4cm处的背侧面。

结果：有趣的是，用AE12-1或AE12-1-Y治疗降低机械性异常性疼痛和热痛觉过敏水平。在SCI后6周，与对照相比，给予AE12-1的大鼠显示出对4g vonFrey刺激的不良反应显著更少(图9A和9B)。与对照相比，用AE12-1或AE12-1-Y治疗的大鼠显示出对热刺激的缩尾潜伏期降低(图9C)。没有发现病变位点吻侧或尾侧的Iba-1+染色面积百分比的显著差异(图18)。定量包括所有Iba-1免疫染色细胞、激活的小胶质细胞和巨噬细胞(如图18A所示)，因此该定量反映了两种细胞类型。然而，Iba-1+巨噬细胞在病变部位吻侧或尾侧可以容易地形态学上区分，因此可以特异性量化病变尾侧的激活的小胶质细胞。在此分析中，仅计数Iba-1+小胶质细胞(图9D)。虽然没有统计学意义，但相对于对照，AE12-1或AE12-1-Y治疗的大鼠中在T10背角中存在更少的Iba-1+小胶质细胞。相反，与正常脊髓相比，在损伤对照的背角中计数显著更多的Iba-1+细胞(图9E)。在C4处的脊髓背角中Iba-1+小胶质细胞组之间没有显著差异(图9F)，突出显示在T10处的病变尾侧看到的差异(图9E)。此外，与AE12-1或AE12-1-Y治疗的大鼠相比，对照大鼠在背角中显示出显著更大的CGRP+免疫反应性纤维(图9G)，表明RGMa中和对背角疼痛传入(进入损伤水平尾侧)的可塑性的正面影响。

实例2

将成年雄性非洲绿猴随机地分成三个治疗组(n＝8只/组)。每只动物植入血管通路端口(VAP)和微量输注泵(Azlet)。在VAP/泵植入后，如以上普遍描述，将动物在T9/10处用760g力进行夹式半压迫SCI持续5或30min。

在夹子撞击-压迫后75分钟开始，用AE12-1-Y-QL(25mg/kg)治疗静脉内组中的动物。在SCI后24周，每两周一次用AE12-1-Y-QL继续治疗。静脉组中的动物另外通过连续鞘内输注接受对照IgG抗体。

对于鞘内组中的动物，在植入时激活微量输注泵，其中SCI后初始洗脱时间为4小时。将AE12-1-Y-QL(150μg/kg/天)连续输注四个月。如上所述，鞘内组中的动物另外静脉内接受对照IgG抗体。

对照组中的动物静脉内以及通过连续鞘内输注接受对照IgG抗体。

在手术前和SCI后1、2、4、8、12、16、20、和24周进行功能性评估。如前所述获得神经运动评分。简言之，评定量表的范围为0至20，如表4所示。

表4.

使用录像带来获得神经运动评分，这些录像带例示了每个被评分的行为。每3个月用对照视频测试评分以确认一致性。

E_最大定义为猴将能够达到的最大神经运动评分。ET₅₀定义为猴达到E_最大(即最大恢复水平)的一半的时间。数据列于以下表5和表6中。来自对照组的六只动物和来自每个治疗组的七只动物包括在分析中。

表5.E_最大模型的统计分析

表6.治疗组之间E_最大的估计的差异

在图19A和19B中，对于每只个体动物，以图形表示观察到的神经运动评分。产生估计的中心值曲线。

在非人灵长类动物SCI的这种严重的胸部半压迫脊髓模型中，使用AE12-1-Y-QL的慢性静脉内治疗在基于盲法神经运动评分分析的6个月恢复期间显示出有益效果。用AEl2-1-Y-QL静脉内治疗的这些明确定义的功能改善与大鼠SCI模型中观察到的幅度相当。

然而，与对照相比，连续鞘内输注AE12-1-Y-QL显示神经运动评分的数值改善，但差异很小且无统计学意义。与未损伤的非人灵长类动物的鞘内试验研究不同，该研究表明AE12-1-Y-QL在CSF和血清中预测的24小时+暴露，经受SCI的动物在SCI后24小时在血清或CSF中几乎没有药物暴露，可归因于SCI后严重的脊柱水肿和CSF流动阻塞。

脊髓的MRI分析进一步支持用AE12-1-Y-QL静脉内治疗的功效。T2损伤阈值(T2^损伤)定义为T2加权图像强度，其中损伤分布的概率密度变得高于正常白质分布的概率密度。将基于条形图的自动分割方法用于定义胸部T2加权MR扫描的每个切片中的损伤的白质。在10片代表性T2加权扫描中定义正常(病变外)白质和损伤白质的区域。为每个组织构建体素强度的条形图，并用高斯函数拟合。基于T2定义的24周龄SCI胸部脊髓损伤的病变和病变外白质区域，与IgG对照组和鞘内AE12-1-Y-QL组(通过磁化转移率(MTR)和分数各向异性(FA)定量)相比，静脉注射AE12-1-Y-QL在损伤外区域表现出更大的组织完整性保持。数据的图形表示在图20A和20B中。这些结果表明，在损伤后75min静脉给予AE12-1-Y-QL治疗非人灵长类动物的SCI，保留了病变外脊髓组织的组织完整性，其程度大于IgG对照组或通过鞘内给予AE12-1-Y-QL所观察到的。

此外，神经运动评分值与病变外白质MTR和FA值正相关，这反映了微观结构的完整性。如图21A和21B所示，MTR和FA值通常随着神经运动功能的改善而增加。

总之，(i)在AE12-1-Y-QL静脉内治疗后24周，与对照组相比，通过在病变外白质中治疗，病变外白质中的MTR和FA显著增加，这表明结构/功能改善(或进一步的继发性损伤保留)。相反，在病变的白质中，在对照组与AE12-1-Y-QL治疗组之间的任何成像终点均未检测到显著变化；以及(ii)病变外自质FA或MTR与神经运动评分E_最大正相关，这表明更高的MTR和FA值，意味着通过AE12-1-Y-QL静脉治疗改善病变外白质与改善的神经运动功能有关。

脊髓切片的组织病理学分析揭示了RGMa表达的显著差异，但在激活的小胶质细胞(离子化的钙结合衔接分子1；IBA)或髓鞘的Weil染色的标记物方面没有显著差异。如图22A和22D所示，在用AE12-1-Y-QL静脉内治疗后，吻侧和尾侧RGMA表达显著降低。

实例3

如在实例1中，对大鼠进行预训练，然后根据公布的方案用改良的动脉瘤夹，在脊髓水平T8用20g力进行夹式冲击压迫SCI持续1min。将AE12-1-Y-QL(25mg/kg)或hIgG同种型对照(25mg/kg)经由尾静脉急性地静脉内给予(在损伤的5min内)，或在SCI后3hr、或在SCI后24hr，并且然后每周一次持续6周。该研究共有五组：i)急性AE12-1-Y-QL(在损伤的5min内注射)、ii)急性hIgG(在损伤的5min内注射)、iii)3hr AE12-1-Y-QL、iv)24hr AE12-1-Y-QL、和v)24hr hIgG。所有大鼠在SCI后每周一次接受尾静脉注射持续6周。

方法学：在SCI后1天使用Basso、Beattie和Bresnahan(BBB)活动评定量表评估活动功能，然后在SCI后每周一次评估持续9周。为了进一步阐明运动功能，使用CatWalk系统(诺达思信息技术公司(Noldus Information Technology)，瓦赫宁恩(Wageningen)，荷兰)进行步态分析。检查了以下步态参数：a)规律性指数，其是爪间协调的分数测量。在健康的正常动物中，规律性指数为100％；b)步幅长度，其是同一爪的连续放置之间的距离；c)摆动速度，其是摆动期间爪的平均速度；和d)爪强度，其是爪施加在玻璃板上的平均压力的量度，并取决于爪和玻璃板之间的接触程度。如上所述评估机械性异常性疼痛和热痛觉过敏。

结果：在SCI后的整个时程中，急性AE12-1-Y-QL组中的大鼠相对于对照组(急性hIgG)具有显著更高的BBB评分(图23A)。在损伤后3hr，用AE12-1-Y-QL治疗的大鼠的恢复具有改善的趋势。此外，与其他组相比，急性和3hr AE12-1-Y-QL组的评分尚未达到稳定水平。相对于对照组，在损伤后8和9周急性AE12-1-Y-QL组显示出显著更高的运动分项分数(图23B)。

在SCI后8周，相对于对照，急性和3hr AE12-1-Y-QL组具有显著更高的规律性指数评分(图24A)。规律性指数是衡量爪间协调的量度。在健康、完全协调的动物中，该值是100％。

在SCI后8周，用AE12-1-Y-QL治疗的大鼠在所有时间窗口间隔显示更大的步幅长度；与24hr IgG对照相比，急性和24hr AE12-1-Y-QL组的差异在统计学上显著(图24B)。步幅长度是同一爪的连续放置之间的距离，其在SCI后减小。

所有治疗组显示出更高的摆动速度，这在两个对照组中均具有统计学显著性(图24C)。摆动速度是摆动期间爪的速度，其在SCI后减少。

在SCI后8周，急性AE12-1-Y-QL组显示出后肢强度的SCI前值的趋势，这不与对照组在统计学上显著(图24D)。后肢强度是对后肢的重量支持的量度。

尽管与SCI后9周用2g长丝纤维和SCI后6周和9周用4g长丝纤维的对照相比，急性和3hr AE12-1-Y-QL组的不良反应更少，但在组间机械性异常性疼痛水平方面无显著差异(图25A和25B)。

在SCI和注射后6周，与急性IgG对照相比，急性AE12-1-Y-QL组显示出因热刺激缩回的潜伏期显著增加(图25C)。这种效果在SCI后9周维持。

6.示例性实施例

提供了以下示例性实施例：

1.一种在有需要的受试者中治疗脊髓损伤的方法，该方法包括给予治疗有效量的与反义导向分子A(RGMa)特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含(a)可变重链，该可变重链包含互补决定区(VH CDR)-1(包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列)、VH CDR-2(包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列)、和VH CDR-3(包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列)；以及(b)可变轻链，该可变轻链包含互补决定区(VL CDR)-1(包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列)、VL CDR-2(包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列)、和VL CDR-3(包含选自由SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：7组成的组的氨基酸序列)。

2.一种在患有脊髓损伤的受试者中促进轴突再生、功能恢复、或两者的方法，该方法包括给予治疗有效量的与反义导向分子A(RGMa)特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含(a)可变重链，该可变重链包含互补决定区(VH CDR)-1(包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列)、VH CDR-2(包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列)、和VH CDR-3(包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列)；以及(b)可变轻链，该可变轻链包含互补决定区(VLCDR)-1(包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列)、VL CDR-2(包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列)、和VL CDR-3(包含选自由SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7组成的组的氨基酸序列)。

3.如实施例2所述的方法，其中该功能恢复是通过神经行为测试评估的。

4.如实施例1-3中任一项所述的方法，其中该脊髓损伤是压迫或撞击伤。

5.如实施例1-4中任一项所述的方法，其中在脊髓损伤的24小时内给予该抗体。

6.一种在有需要的受试者中治疗疼痛的方法，该方法包括给予治疗有效量的与反义导向分子A(RGMa)特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含(a)可变重链，该可变重链包含互补决定区(VH CDR)-1(包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列)、VH CDR-2(包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列)、和VH CDR-3(包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列)；以及(b)可变轻链，该可变轻链包含互补决定区(VL CDR)-1(包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列)、VL CDR-2(包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列)、和VL CDR-3(包含选自由SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：7组成的组的氨基酸序列)。

7.如实施例6所述的方法，其中该疼痛是神经性疼痛。

8.如实施例7所述的方法，其中该神经性疼痛由脊髓损伤引起。

9.如实施例8所述的方法，其中在脊髓损伤的24小时内给予该抗体。

10.如实施例7所述的方法，其中该神经性疼痛由化学疗法引起。

11.如实施例7所述的方法，其中该神经性疼痛是疱疹后神经痛。

12.如实施例1-11中任一项所述的方法，其中全身性地给予该抗体或其抗原结合片段。

13.如实施例1-12中任一项所述的方法，其中静脉内(IV)给予该抗体或其抗原结合片段。

14.如实施例1-13中任一项所述的方法，其中该VL CDR-3包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

15.如实施例1-13中任一项所述的方法，其中该VL CDR-3包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列。

16.如实施例1-13中任一项所述的方法，其中该可变重链包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，并且该可变轻链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。

17.如实施例1-13中任一项所述的方法，其中该可变重链包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，并且该可变轻链包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

18.如实施例1-17中任一项所述的方法，该抗体选自下组，该组由以下组成：人抗体、免疫球蛋白分子、二硫键连接的Fv、单克隆抗体、亲和性成熟的抗体、scFv、嵌合抗体、CDR移植的抗体、双抗体、人源化抗体、多特异性抗体、Fab、双重特异性抗体、DVD、Fab’、双特异性抗体、F(ab’)₂、和Fv。

19.如实施例18所述的方法，其中该抗体是人抗体。

20.如实施例18所述的方法，其中该抗体是单克隆抗体。

21.如实施例1-13中任一项所述的方法，其中该抗体包含恒定区，该恒定区包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、和SEQ ID NO：14。

22.如实施例1-13中任一项所述的方法，其中该抗体包含SEQ ID NO：16的重链序列以及SEQ ID NO：15的轻链序列。

应理解，前述详细描述和随附的实例以及示例姓实施例仅仅是说明性的，并且不被视为对本发明的范围的限制，本发明范围仅由所附权利要求书及其等同物限定。

对于所公开的实施例的各种变化和修改对于本领域技术人员将是显而易见的。可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行此类变化和修改，包括但不限于与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、配制品或使用方法有关的那些变化和修改。

本发明进一步提供了如下实施方案：

1.一种在有需要的受试者中治疗脊髓损伤的方法，该方法包括给予治疗有效量的单克隆抗反义导向分子A(RGMa)抗体，其中该抗体包含

a.可变重链，该可变重链包含互补决定区(VH CDR)-1、VH CDR-2、和VH CDR-3，该VH CDR-1包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，该VH CDR-2包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，该VH CDR-3包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；以及

b.可变轻链，该可变轻链包含互补决定区(VL CDR)-1、VL CDR-2、和VL CDR-3，该VL CDR-1包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，该VL CDR-2包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，该VL CDR-3包含选自SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7组成的组的氨基酸序列。

2.如1所述的方法，其中该方法包括在脊髓损伤之后促进轴突再生、功能恢复、或两者。

3.如1或2所述的方法，其中该方法包括治疗由脊髓损伤引起的疼痛。

4.如3所述的方法，其中该疼痛是神经性疼痛。

5.如1-4中任一项所述的方法，其中该脊髓损伤是压迫、挫伤、或撞击伤。

6.如1-5中任一项所述的方法，其中在脊髓损伤后小于8小时给予该抗体。

7.如1-6中任一项所述的方法，其中全身性地给予该单克隆抗RGMa抗体。

8.如1-7中任一项所述的方法，其中静脉内(IV)给予该单克隆抗RGMa抗体。

9.如1-8中任一项所述的方法，其中该VL CDR-3包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

10.如1-8中任一项所述的方法，其中该VL CDR-3包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列。

11.如1-8中任一项所述的方法，其中该可变重链包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，并且该可变轻链包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。

12.如1-8中任一项所述的方法，其中该可变重链包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，并且该可变轻链包含SEQ ID NO：I 0的氨基酸序列。

13.如1-8中任一项所述的方法，其中该单克隆抗RGMa抗体是人抗体。

14.如1-8中任一项所述的方法，其中该抗体包含恒定区，该恒定区包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、和SEQ IDNO：14。

15.如14所述的方法，其中该单克隆抗RGMa抗体包含恒定区，该恒定区包含由SEQID NO：14组成的氨基酸序列。

16.如1-8中任一项所述的方法，其中该抗体包含SEQ ID NO：16的重链序列以及SEQ ID NO：15的轻链序列。

17.如1-16中任一项所述的方法，其中该单克隆抗RGMa抗体与位于RGMa的N-末端区域的RGMa表位结合、优选地与在SEQ ID NO：18的氨基酸内的RGMa表位结合、更优选地与在SEQ ID NO：19的氨基酸内的RGMa表位结合。

Claims

1.单克隆抗反义导向分子A(RGMa)抗体在制备用于在有需要的受试者中治疗脊髓损伤的方法的药物中的用途，该方法包括给予治疗有效量的单克隆抗反义导向分子A(RGMa)抗体，其中该抗体包含

a.可变重链，该可变重链包含互补决定区(VH CDR)-1、VH CDR-2、和VH CDR-3，该VHCDR-1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，该VH CDR-2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，该VHCDR-3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；以及

b.可变轻链，该可变轻链包含互补决定区(VL CDR)-1、VL CDR-2、和VL CDR-3，该VLCDR-1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，该VL CDR-2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，该VLCDR-3包含选自SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7组成的组的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的用途，其中该方法包括在脊髓损伤之后促进轴突再生、功能恢复、或两者。

3.如权利要求1或2所述的用途，其中该方法包括治疗由脊髓损伤引起的疼痛。

4.如权利要求3所述的用途，其中该疼痛是神经性疼痛。

5.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中该脊髓损伤是压迫、挫伤、或撞击伤。

6.如权利要求1-5中任一项所述的用途，其中在脊髓损伤后小于8小时给予该抗体。

7.如权利要求1-6中任一项所述的用途，其中全身性地给予该单克隆抗RGMa抗体。

8.如权利要求1-7中任一项所述的用途，其中静脉内(IV)给予该单克隆抗RGMa抗体。

9.如权利要求1-8中任一项所述的用途，其中该VL CDR-3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

10.如权利要求1-8中任一项所述的用途，其中该VL CDR-3包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。