CN1168694A

CN1168694A - 具有减弱的变应原性的多肽

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Publication number: CN1168694A
Application number: CN95196667A
Authority: CN
Inventors: A·A·奥尔森; L·B·L·翰森; T·C·贝克
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1994-12-07
Filing date: 1995-12-07
Publication date: 1997-12-24
Also published as: US6114509A; AU697440B2; JPH10510516A; CA2206852A1; FI972443A0; MX9704137A; FI972443A7; WO1996017929A1; EP0796324A1; AU4114496A; US6201110B1; FI972443L; US5981718A; US5856451A

Abstract

本发明涉及具有减弱的变应原性的修饰多肽，包括分子量在10-100kDa之间的亲代多肽，该亲代多肽与一种分子量(Mr)在1-60kDa范围内的聚合物缀合。所述修饰多肽是用这一种方法生产的：该方法包括将1-30个聚合物分子与亲代多肽缀合的步骤。本发明还涉及含有所述多肽和其它常用于洗涤剂中的成分的组合物，用于处理织物的和用于生产食品及饲料的组合物，所述洗涤剂包括洗碟用洗涤剂和皂条、家用物品、农用化学品、个人护理品、润肤剂、化妆品、口腔药和皮肤用药。最后，本发明涉及将具有减弱的变应原性的多肽或其组合物用于降低大量工业用产品的变应原性的用途。

Description

具有减弱的变应原性的多肽

本发明涉及具有减弱的变应原性的修饰多肽如蛋白或酶。本发明还涉及用于生产所述具有减弱的变应原性的修饰多肽及其组合物的方法。最后，本发明涉及所述具有减弱的变应原性的修饰多肽或其组合物的应用。

日益增多的多肽，包括蛋白和酶正由微生物进行工业化生产，以便用于工业、家用、食品/饲料、润肤剂或医药等用途。所述多肽在某些场合会产生潜在危险，特别是使处理生产出来的含有多肽的制品的雇员遭受危险，而且，还会在一定程度上对该产品的用户，如发型师和润肤剂和化妆品等的直接用户造成危害。

需要对这种潜在危险加以控制和/或限制。

多肽的变应原性

一般，多肽是人体免疫系统的潜在抗原，免疫系统在遇到它时会产生特异抗体。当这一过程能产生临床上的有益反应时被称为“免疫”，而这种反应导致过敏性时被称为“致敏”。在初次处理时，开始特异B细胞克隆的克隆选择和扩展，这意味着在进行下次处理之后在临床上的唯一表现为保护性反应或变态反应。变态反应可以定义为由在低浓度下无害的制剂引起的病态免疫反应。导致IV型过敏性的致敏，其特征是形成特异的IgE抗体。目前，对于控制亚类变化的机理尚不十分了解。

由激活的B细胞分泌的IgE能够与位于肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的Fce受体结合，所述粒细胞中含有很多由化学介体，如组胺包装的细胞质颗粒(J.Klein，“Immunology”，BlackwellSci.Pub.，London，1990；E.Benjamini&S.Leskowitz，“Immunology”，Wiley-Liss，N.Y.1991)。

在特应性个体中，上述细胞的每一个都具有大量的IgE分子同其表面结合，在这里它能在持续几周的时间里与变应原相互作用。当接触到变应原时，表面结合的IgE就与该变应原交叉接合，导致胞质颗粒释放到该细胞附近，从而引起发炎性变态反应。

业已证实IgE的作用与针对寄生虫感染的天然免疫防御系统有关，而且，已证实变态反应的发展是该防御系统的不利副作用。

可以根据其作用方式对能导致IgE介导的过敏性的天然变应原进行分类：吸入性变应原(花粉、尘螨等)、摄食性变应原(乳汁、蛋类等)；接触性变应原(如来自乳胶)和来自螯刺昆虫(如蜜蜂、火蚁等)的变应原。气源性变应原是迄今为止临床上的最大的一类，会形成所述工业多肽的高危区。

变态反应试验可以以体内刺激方式进行，最常见的是通过若干体外试验进行皮肤针刺试验，该试验主要基于外周血中的IgE含量。尽管已经对后一种方法做过大量研究，但诊断变态反应的最可靠的方法仍然是体内刺激，根据所选择的靶器官，体内刺激的敏感度也不相同。

例如，用变应原蛋白进行鼻内刺激可以引起变态反应，即使皮肤试验和对特异血清IgE的放射线变应原吸附测定(RAST)为阴性(IvanRoitt，“E-ssential Immunology”fifth edition，P.152和P.240，1984)。

多肽变应原性的减弱

目前，避免工业多肽产生的变态反应的方法是通过将所述产品固定、造粒、包衣或溶解，特别是避免形成气载材料。总之，上述方法仍然存在在处理和加工期间生成尘埃和气溶胶的危险，并随之出现变态致敏的危险。

总之，还有多肽尘埃或气溶胶形式的溶解多肽的危险。因此，某些酶的释放会导致可能的致敏并随之导致变态反应。

克服上述问题的其它方法是选择生产来源于人的多肽，例如，在细菌、真菌、酵母或哺乳动物细胞培养物中。这可以减轻人所遇到的一些问题，但对动物则不然。另外，在许多情况下不能找到具有理想特性且来源于人的多肽，因此，不得不考虑其它来源。它也可以是人的多肽，其分子上的一个或几个位置上作了改变，以产生想要的性能。它也可以是来自其它物种的分子，包括细菌、霉菌等。所有后一类产品都有在哺乳动物中进行免疫刺激的效力。

降低变应原性的另一种方案是降低所述蛋白分子的大小(例如，见日本专利公开号4,112,753，或检索公开号335,102)。然而，这种方案只有在所述蛋白的活性并不重要的场合才可行，或者在所述蛋白被降解但其活性依然被保存下来的罕见场合采用。

蛋白质工程的应用，提出了可通过表位作图随后改变变应原表位来减弱蛋白的变应原性(见WO92/10755(Novo Nordisk A/S))。该方法通常需要对生产和研究进行大的投入。

在医药领域曾经提出过通过将聚合物分子同多肽结合以减弱多肽的免疫原性的方案。但这样做通常会影响多肽与其它大分子结构的相互作用。这种缀合还可能产生新的特性：例如，EP38154(Beecham Group有限公司)中披露了将具有免疫抑制特性的聚肌氨酸同变应原缀合的方案。

US专利4,179,337(Davis等)涉及非免疫原性多肽，如与聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇结合的酶和肽激素。每摩尔多肽使用10-100摩尔的聚合物，而且至少保留15％的生理活性。另外，由于PEG缀合而增大了所述多肽的体积，循环的余隙时间得以延长。受保护的多肽以水溶液形式注射到哺乳动物的循环系统或肌内。通过皮肤内注射试验评价免疫原性。

US专利4,179,337涉及相应生理活性的治疗应用和保留。在治疗应用中，重要的是限制发生免疫原反应的危险，这种反应是因皮肤内、静脉内或皮下注射变应原所致。不过，控制呼吸变应原并不重要。另外，与多肽缀合所需的聚合物量使得该方法成本很高。

WO93/15189(Veronese等)涉及保持聚乙二醇修饰的蛋白酶的活性的方法，该方法是通过将所述蛋白酶与一种大分子化的抑制剂连接。这种缀合物可应用于医学目的。

业已发现，多肽与聚合物的接合一般会导致该多肽的活性减弱或引响该多肽与其底物之间的相互作用。EP183503(Beechan GroupPLC)披露了上述构思的一种发展，它提供了一种缀合物，该缀合物包括可以药用的蛋白，其通过可逆的连接基与至少一种水溶性聚合物连接。

GB专利1,183,257(Crook等)披露了通过三嗪环将酶与多糖缀合的化学方法。

EP471 125(Kanebo有限公司)披露了一种通过三嗪环同一种多肽连接的修饰蛋白酶，这样一来可产生对抗原性和皮肤过敏性的抑制作用。所采用的多糖其平均分子量不低于10kDa。修饰蛋白酶表面氨基酸基团的修饰量不低于30％。

一般认为，进入呼吸道的变应原其分子量必须低于约100kDa，以便能穿过质膜并引起变态反应。

Folkeson等(Acta Physiol.Scand，139，p.437-354，1990)证实，在滴入的蛋白标记的分子量与经呼吸道进入血流的转移量(生物有效性)之间呈负相关。

WO94/10191(Novo Nordisk A/S)披露了一种生产低变应原性蛋白的方法，其中，单体型亲代蛋白分子连接在一起形成低聚体。这种连接是通过诸如接头或间隔分子之类的结构实现的，或是通过第一个单体的C-末端和第二个单体的N-末端之间的肽键将单体型分子连接在一起。

EP215 662(Masda，Hiroshi)涉及修饰的或未修饰的来自微生物的蛋白酶，它可用于诸如抗肿瘤剂之类的药品中。对蛋白酶的修饰可以这样进行：例如，与糖结合，引入一个疏水聚合基团，与分子量低于2kDa的低分子量抗肿瘤剂缀合。

聚合物的激活

在文献中对聚合物激活及蛋白缀合的方法及化学原理已作过深入的介绍。激活不溶性聚合物的常用方法包括用溴化氰、高碘酸盐、戊二醛、双环氧化物、表氯醇、二乙烯基砜、碳化二亚胺、磺酰卤、三氯三嗪等激活官能团(见R.F.Taylor，(1991)，“Proteinimmobilisation.Fundamental and applications”，MarcelDekker，N.Y.；s.S.Wong，(1992)，“Chemistny of Protein Conjugation andCrosslinking”，CRC Press，Boca Raton；G.T.Hermanson等；(1993)，“Immobilized Affinity Ligand Techniques”，Academic Press，N.Y.)。上述方法中的一些涉及不可溶聚合物的激活，但也可应用于可溶性聚合物的激活，如高碘酸盐、三氯三嗪、磺酰卤、二乙烯基砜、碳化二亚胺等。所述官能团为聚合物上的氨基、羟基、硫羟基、羧基、醛基或巯基，而蛋白质上连接基团的选择在选择激活和缀合化学时必须考虑进去，这种选择的组成一般为：i)聚合物的活化，ii)缀合，和iii)残余活性基团的封闭。

关于活性聚乙二醇(PEGs)的合成已发表过几篇综述和专题研究(Harris，(1985)，JMS-REV.Macronol.Chem.Phys.C25，325-373；scouten，(1987)，Methods in Enzymology Vol.135，Mosbach，K.，Ed.，AcademicPress：Orlando，30-65；Wong等，(1992)，Enzyme Microb.Technol.，14，866-874；Delgado等，(1992)，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems，9，249-304；Zalipsky，(1995)，Bioconjugate Chem.，6，150-165)。

聚合物的激活方法还披露于下列文献中：WO94/17039，US5,324,844，WO94/18247，WO94/04193，US5,219,564，US5，122,614，WO90/13540(Enzon)和US5,281,698(Cetus)，以及WO93/15189(Veronese)，还披露了活化聚合物与酶之间的缀合方法，所述的酶如凝固因子VIII(WO94/15625)，血红蛋白(WO94/09027)、载氧分子(US4,412,989)、核糖核酸酶和超氧化物岐化酶(Veronese等，App.Biochem.Biotech.，11，P.141-45，1985)。

相关的现有技术涉及减弱多肽、蛋白和/或酶在用于治疗目的时的免疫反应或过敏性(变态反应)，这类反应与皮肤内、静脉内或皮下出现的变应原相关。然而，现有技术与工业应用中出现的变应原无关，当直接用户在使用时吸入或接触到多肽时会引发潜在的变态反应，例如，在使用洗涤剂、清洗制剂、化妆品和其它个人护理品时。

因此，希望能够提供用于非治疗用途的多肽、蛋白和/或酶，当其被吸入时具有减弱了的变态反应，而且，所述多肽能基本维持其催化活性。

本发明现已惊人地提供具有减弱的变应原性、保留了催化活性的修饰多肽。

首先，本发明涉及具有减弱的变应原性的多肽，它包括一种分子量在10-100kDa之间的亲代多肽，该亲代多肽与一种分子量在1-60kDa范围内的聚合物缀合。

在本发明的一种优选实施方案中，所述多肽是蛋白或酶。

本发明还涉及用于生产所述具有减弱的变应原性的多肽的方法，包括将1-30个聚合物分子与一种亲代多肽聚合的步骤。

另外，本发明提供了包括所述多肽和/或其它酶/多肽和/或常用成分的组合物，所述常用成分例如用于包括洗碟洗涤剂和皂条的洗涤剂、家用物品、农用化学品、个人护理品(包括清洗制剂，如用于隐形眼镜、润肤剂、化妆品)、口服和皮肤用药，提供了用于处理织物的组合物、用于生产食品，如用于焙烤，以及用于饲料的组合物。

最后，本发明涉及将具有减弱的变应原性的多肽、蛋白或酶用于众多的工业目的的用途。

图1是待在气管内用酶进行处理的一只大鼠的截面图。

图2表示在棕色挪威大鼠血清中IgE与修饰过的枯草蛋白酶Novo和亲代枯草蛋白酶Novo的特异反应。

图3表示在棕色挪威大鼠血清中IgE与修饰过的Lipolase^和亲代Lipolase^的特异反应。

图4表示在棕色挪威大鼠血清中IgE与修饰过的漆酶和亲代漆酶的特异反应。

图5表示在棕色挪威大鼠血清中IgE与修饰过的Carezyme^和亲代Carezyme^的特异反应。

本发明人业已令人吃惊地成功提供了具有减弱的变应原性的修饰多肽，其中，其催化活性起码被基本保留下来。

本发明的上述具有减弱的变应原性的修饰多肽能解决上述问题中的一些，上述问题就是在若干非治疗用途中的变应原被吸入时会引起变态反应。

就非治疗用途而言，必须强调的是，主要是吸入的变应原会引起变态反应的危险。

因此，可以理解的是，本发明的主要优点是本发明人解决了多肽的众多工业应用中的一些主要问题，如吸入问题，包括出现在气管内和鼻内的变应原，这是变应原性方面的主要问题。这与现有技术解决方案不同，现有技术方案主要涉及当皮肤内、静脉内或皮下出现的变应原成为主要问题时的治疗用途。此外，变应原的吸入是更为敏感的问题。

一般，当讨论治疗目的的生产时，其涉及的是公斤规模上的酶的生产，而工业目的的生产涉及的是好多个1000公斤规模上的生产。用于治疗目的的技术并不总是能很好地应用于工业目的。

“减弱的变应原性”是指与相应的亲代多肽相比，当吸入本发明的修饰多肽时所产生的能导致变应状态的IgE(对人而言，对特定动物而言则是具有相当作用的分子)的量降低了。

下面对“免疫原”、“抗原”和“变应原”进行定义。“免疫原”是一个含义较宽的词，它包括“抗原”和“变应原”。

“免疫原”可定义为当进入动物，包括人体内时能激起免疫反应的物质。

“抗原”是指那些在被识别为非自身分子后其本身能产生抗体的物质。

另外，可将“变应原”定义为能通过IgE抗体(对人而言，对特定动物则为具有相当作用的分子)引起变态致敏或变态反应的抗原。

如上所述，就包括用于工业目的的多肽在内的酶而言，区分能在诸如皮肤内引起变态反应的变应原和能通过接触呼吸道里的细胞结合IgE而引起变态反应的呼吸道变应原是重要的，因为即使通过吸入试验已引起了变态反应，皮内试验也可能呈阴性。

因此，变应原性的评估可以通过吸入试验进行，比较气管内(进入气管)使用亲代多肽和本发明的相应具有减弱的变应原性的修饰多肽的效果。

现有多种用于评价多肽的变应原性的体外动物模型。这些模型中的一些为在人体中进行有害性评价提供了合适的基础。合适的模型包括豚鼠模型和大鼠模型。所述模型能鉴定呼吸道变应原，其作用方式为能引发在预先敏化的动物体内诱发的反应。按照所述模型，将推定的变应原经气管引入动物体内。

一种合适的豚鼠品系-Dunkin Hartly品系，在产生变态反应时不是像人体那样产生IgE抗体。然而，它能产生其它类型的抗体-IgG1A和IgG1B(例如，参见PrentΦ，AYLA，19，p.8-14，1991)，这些抗体在呼入包括酶在内的多肽时产生变态反应。因此，当采用DunkinHartley动物模型时，IgG1A和IgG1B的相对量是衡量变应原性水平的指标。

适于在气管内用多肽和酶处理的大鼠品系是棕色挪威品系。该棕色挪威品系在发生变态反应时产生IgE。

在例22中所披露的本发明的惊人发现是，多肽，在特定情形下为酶的变应原性可通过提高所述酶的分子量而减弱，例如，通过将若干聚合物分子连接在所述多肽分子上。

还可将其它诸如兔等类的其它动物用于比较研究。

本发明的第一方面涉及具有减弱的变应原性的多肽，它包括一种分子量在10-100kDa之间的亲代多肽，该多肽与一种分子量在1-60kDa范围内的聚合物缀合。

亲代多肽

根据本发明，亲代多肽可以是能用于工业目的的任何多肽。其包括蛋白、酶、抗微生物多肽、配体、抑制剂、增强子和辅因子。

在本发明的一种优选实施方案中，亲代多肽是一种酶，它可选择下文中提及的一组酶。

亲代蛋白酶

亲代蛋白酶(即：按照国际生物化学和分子生物学联合会(IUBMB)的建议(1992)可归在酶分类号E.C.3.4之下的酶)包括该组里的蛋白酶。

其例子包括是选自可归入以下酶分类(E.C.)号之下的蛋白酶：

3.4.11(即所谓氨肽酶)，包括3.4.11.5(脯氨酰氨肽酶)、3.4.11.9(X-原氨肽酶)、3.4.11.10(细胞亮氨酰氨肽酶)、3.4.11.12(嗜热氨肽酶)、3.4.11.15(赖氨酰氨肽酶)、3.4.11.17(色氨酰氨肽酶)、3.4.11.18(甲硫氨酰氨肽酶)。

3.4.21(即所谓丝氨酸内肽酶)、包括3.4.21.1(胰凝乳蛋白酶)、3.4.21.4(胰蛋白酶)、3.4.21.25(黄瓜蛋白酶)、3.4.21.32(Brachyurin)、3.4.21.48(塞里维率(cerevisin))和3.4.21.62(枯草蛋白酶)；

3.4.22(即所谓半胱氨酸内肽酶)，包括3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、3.4.22.3(无花果蛋白酶)、3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、3.4.22.7(萝摩蛋白酶)、3.4.22.14(弥猴桃蛋白酶)、3.4.22.30(番木瓜蛋白酶)和3.4.22.31(菠萝蛋白酶)；

3.4.23(即所谓天冬氨酸内肽酶)，包括3.4.23.1(胃蛋白酶A)、3.4.23.18(曲酶属胃蛋白酶I)、3.4.23.20(青霉属胃蛋白酶)和3.4.23.25(酵母属胃蛋白酶)；和

3.4.24(即所谓金属内肽酶)、包括3.4.24.28(Bacillolysin)。

相关枯草蛋白酶的例子包括枯草蛋白酶BPN’、枯草蛋白酶amylosacchariticus、枯草蛋白酶168、枯草蛋白酶肠系膜辅肽酶(mesentericopeptidase)、Carlsberg枯草蛋白酶、枯草蛋白酶DY、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147、thermitase、aqualysin、杆菌PB92蛋白酶、蛋白酶K、蛋白酶TW7、和蛋白酶TW3。

上述易于获得的商品化蛋白酶的具体例子包括Esperasa^、Alcalase^、Neutrase^、Dyrazyme^、Savinase^、Pyrase^、Pancreatic Trypsin Novo(PTN)、Bio-Feed^TMpro、Clear-Lens Pro(所有酶均可从Novo Nordisk A/S购买)。

其它商品化蛋白酶的例子包括由Gist-Brocades N.V.出售的Maxtase^、Maxacal^、Maxapem^，由Solvay et Cie出售的Opticlean^，和由Genencor International出售的Purafect^。

可以理解的是，蛋白酶的变体也可用作亲代蛋白酶。所述蛋白酶变体的例子披露于以下文献中：EP130.756(Genentech)、EP214.435(Henkel)、WO87/04461(Amgen)、WO87/05050(Genex)、EP251.446(Genencor)、EP260.105(Genencor)、Thomas等，(1985)，Nature.318，P.375-376；Thomas等，(1987)，J.Mol.Biol.，193，pp.803-813；Russel等，(1987)，Nature，328，p.496-500；WO88/08028(Genex)；WO88/08033(Amgen)；WO89/06279(Nove Nordisk A/S)；WO91/00345(Nove Nordisk A/S)；EP525 610(Solvay)和WO94/02618(Gist-Brocades N.V.)。

可按照如“Methods of Enzymatic Analysis”(第3版，1984，Verlag Chemie，Weinheim，Vol.5)记载的方法测定蛋白酶的活性。

亲代脂酶

亲代脂酶(即按照IUBMB的推荐(1992)可归入酶分类号E.C.3.1.1(羧酸酯水解酶)之下的酶)包括该组内的脂酶。

其例子包括选自归入以下酶分类(E.C.)号下的脂酶：

3.1.1(即所谓羧酸酯水解酶)，包括(3.1.1.3)三酰甘油酯脂酶、(3.11.4)磷脂酶A2。

脂酶的例子包括来自以下微生物的脂酶。所标出的专利被收作本文的参考：

腐质霉属(Humicola)，如短孢腐质霉(H.brevispora)、疏棉状腐质霉(H.lanuginosa)、短腐质霉的热变种(H.brevisvar.thermoidea)和H.insolens(US4,810,414)

假单胞菌属(Pseudomonas)、如草莓假单胞菌(Ps.fragi)、Ps.stutzeri、洋葱假单胞菌(Ps.cepacia)和荧光假单胞菌(Ps.fiuorescens)(WO 89/04361)、或Ps.plantarii或唐菖蒲假单胞菌(Ps.gladioli)(US4,950,417(Solvay酶))或产碱假单胞菌(Ps.alcaligenes)和类产碱假单胞菌(Ps.pseudoalcaligenes)(EP218,272)或门多萨假单胞菌(Ps.mendocina)(WO88/09367；US5,389,536)。

镰孢属(Fusarium)、如尖镰孢(F.oxysporum)(EP130,064)或皮塞腐皮镰孢(F.solani pisi)(WO90/09446)。

毛霉属(Mucor)(也被称为根毛霉属(Rhizomucor))，如米黑毛霉(M.miehei)(EP238 023)。

毛杆菌属(Chromobacterinm)(特别是粘稠色杆菌(C.viscosum))

曲霉属(Aspergillus)(特别是黑曲霉(A.niger))。

假丝酵母属(Candida)，例如，皱落假丝酵母(C.cylindracea)(也被称为(C.rugosa))或南极假丝酵母(C.antarctica)(WO88/027775)或南极假丝酵母脂酶A或B(WO94/01541和WO89/02916)。

地霉属(Geotricum)，如白地霉(G.candidum)(Schimada等，(1989)，J.Biochem.，106，383-388)。

青霉属(Penicillium)，如沙门柏干酪青霉P.camembertii(Yamaguchi等，(1991)，Gene103，61-67)。

Rhizopus，如R.delemar(Hass等，(1991)，Gene109，107-113)或R.niveus(Kugimiya等，(1992)Biosci.Biotech.Biochem.56，716-719)或R.oryzae。

芽胞杆菌属(Bacillus)、如枯草杆菌(B.subtilis)(Dartois等，(1993)，Biochemica et Biophysica acta 1131，253-260)或嗜热脂肪芽胞杆菌(B.stearothermophilus)(JP64/7744992)或短小芽胞杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)。

易获得的商品化脂酶的具体例子包括Lipolase^、Lipolase^TMUltra、Lipozyme^、Palatase^、Novozym^435，Lecitase^(均可自Novo Nordisk A/S购买)。

其它脂酶的例子有购自Genencor国际公司的Lumafast^TM，门多萨假单胞菌脂酶，购自Gist Brocades/Genencor国际公司的Lipomax^TM，类产碱假单胞菌脂酶；购自Unilever的腐皮镰孢脂酶(角质酶)；购自Solvay酶的芽胞杆菌脂酶。其它酶可自其它公司获得。

可以理解的是，脂酶的变体也可用作亲代酶。例如，这种酶的例子披露于WO93/01285和WO95/22615中。

可按照在“Methods of Enzymatic Analysis”(第3版，1984，Verlag Chemie，Weinhein，Vol.4)中披露的方法或按照在AF95/5GB(可以向Novo Nordisk A/S索取)中披露的方法测定脂酶的活性。

亲代氧化还原酶

亲代氧化还原酶(即按照IUBMB的推荐(1992)可归入酶分类号E.C.l(氧化还原酶)之下的酶)包括该组内的氧化还原酶。

其例子包括选自可归入以下酶分类(E.C.)号的氧化还原酶：

甘油-3-磷酸脱氢酶(NAD⁺)(1.1.1.8)，甘油-3-磷酸脱氢酶〔NAD(P)⁺〕(1.1.1.94)，甘油-3-磷酸1-脱氢酶〔NADP〕(1.1.1.94)，葡萄糖氧化酶(1.1.3.4)，己糖氧化酶(1.1.3.5)，邻苯二酚氧化酶(1.1.3.14)，胆红素氧化酶(1.3.3.5)，丙氨酸脱氢酶(1.4.1.1)，谷氨酸脱氢酶(1.4.1.2)，谷氨酸脱氢酶〔NAD(P)⁺〕(1.4.1.3)，谷氨酸脱氢酶〔NADP⁺〕(1.4.1.4)，L-氨基酸脱氢酶(1.4.1.5)，丝氨酸脱氢酶(1.4.1.7)，缬氨酸脱氢酶〔NADP⁺〕(1.4.1.8)，亮氨酸脱氢酶(1.4.1.9)，甘氨酸脱氢酶(1.4.1.10)，L-氨基酸氧化酶(1.4.3.2)，D-氨基酸氧化酶(1.4.3.3)，L-谷氨酸氧化酶(1.4.3.11)，蛋白赖氨酸6-氧化酶(1.4.3.13)，L-赖氨酸氧化酶(1.4.3.14)，L-天冬氨酸氧化酶(1.4.3.16)，D-氨基酸脱氢酶(1.4.99.1)，蛋白二硫键还原酶(1.6.4.4)，硫氧还蛋白还原酶(1.6.4.5)，蛋白二硫键还原酶(谷胱甘肽)(1.8.4.2)，漆酶(1.10.3.2)，过氧化氢酶(1.11.1.6)，过氧化物酶(1.11.1.7)，脂氧合酶(1.13.11.12)，超氧化物岐化酶(1.15.1.1)。

所述葡萄糖氧化酶可来自黑曲霉。

所述漆酶可来自Polyporus pinsitus，嗜热毁丝霉(Myceliophtorathermophila)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、Rhizoctonia praticola，Scytalidiumthermophilum和Rhus Vernicifera。胆红素氧化酶可获自疣孢漆斑菌(Myrothechecium Verrucaria)。

所述过氧化物酶可获自大豆、辣根或灰盖鬼伞。

所述蛋白二硫键还原酶可以是丹麦专利申请No.768/93,265/94和264/94(Novo Nordisk A/S)中任一次中提到的任一种还原酶，以上专利申请被收作本文的参考，所述还原酶包括来源于牛体内的蛋白二硫键还原酶，源于米曲霉(A.oryzae)或黑曲霉的蛋白二硫键还原酶，和源自大肠杆菌(E.coli)的DsbA或DsbC。

易于获得的商品化氧化还原酶的具体例子包括Gluzyme^TM(可从Novo Nordisk A/S购买)。不过，其它氧化还原酶可从其它公司购买。

可以理解的是，也可将氧化还原酶的变体用作亲代酶。

可按照在“Methods of Enzymatic Analysis”(第3版，1984，Verlag Chemie，Weinheim，Vol.3)中披露的方法测定氧化还原酶的活性。

亲代糖酶

亲代糖酶可定义为所有能够降解特别是5和6员环结构的糖链(如淀粉)的酶(即按照IUBMB的推荐(1992)可归入酶分类号E.C.3.2(糖苷酸)下的酶)。还可归入本发明的此类糖酶的有能够将碳水化合物，如D-葡萄糖之类的六员环结构异构化为如D-果糖之类的五员环结构的酶。

其例如包括选自归入以下酶分类(E.C.)号下的糖酶：

α-淀粉酶(3.2.1.1)，β-淀粉酶(3.2.1.2)，葡聚糖1，4-α-葡糖苷酶(3.2.1.3)，纤维素酶(3.2.1.4)，内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶(3.2.1.6)，内切-1，4-β-木聚糖酶(3.2.1.8)，葡聚糖酶(3.2.1.11)，壳多糖酶(3.2.1.14)，聚半乳糖醛酸酶(3.2.1.15)，溶菌酶(3.2.1.17)，β-葡糖苷酶(3.2.1.21)，α-半乳糖苷酶(3.2.1.22)，β-半乳糖苷酶(3.2.1.23)，淀粉-1，6-葡糖苷酶(3.2.1.33)，木聚糖-1，4-β-木糖苷酶(3.2.1.37)，葡聚糖内切-1，3-β-D-葡糖苷酶(3.2.1.39)，α-糊精内切-1，6-葡糖苷酶(3.2.1.41)，蔗糖α-葡糖苷酶(3.2.1.48)，葡聚糖内切-1，3-(α-葡糖苷酶(3.2.1.59)，葡聚糖1，4-β-葡糖苷酶(3.2.1.74)，葡聚糖内切-1，6-β-葡糖苷酶(3.2.1.75)，阿聚糖(arabinan)内切-1，5-α-阿糖苷酶(3.2.1.99)，乳糖酶(3.2.1.108)，壳多糖酶(Chitonanase)(3.2.1.132)和木糖异构酶(5.3.1.5)。

有关糖酶的例子包括获自Trichodenma harzianum的α-1，3-葡聚糖酶；获自一个拟青霉属(Paecilomyces)菌株的α-1，6-葡聚糖酶；获自枯草杆菌的β-葡聚糖酶；获自Humicola insolens的β-葡聚糖酶；获自黑曲霉的β-葡聚糖酶；获自一个木霉属(Trichoderma)菌株的β-葡聚糖酶；获自一个Oerskoviaxanthineolytica的β-葡聚糖酶；获自黑曲霉的外切-1，4-α-D-葡糖苷霉(葡糖淀粉酶)；获自枯草杆菌的α-淀粉酶；获自解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)的α-淀粉酶；获自嗜热脂肪芽胞杆菌的α-淀粉酶；获自米曲酶的α-淀粉酶；获自非致病性微生物的α-淀粉酶；获自黑曲霉的α-半乳糖苷酶；获自Humicola insolens的戊聚糖酶、木聚糖酶、纤维二糖酶、纤维素酶、半纤维素酶；获自Trichodermareesei的纤维素酶；获自非致病性霉菌的纤维素酶；获自黑曲霉的果胶酶、纤维素酶、阿糖酶(arabinase)、半纤维素酶；获自薄青霉菌的葡聚糖酶；获自非致病性霉菌的内切葡聚糖酶；获自Bacillusacidopullyticus的支链淀粉酶；获自脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)的β-半乳糖苷酶；获自Trichoderma reesei的木聚糖酶；

易获得的商品化糖酶的具体例子包括Alpha-Gal^TM，Bio-Feed^TMAlpha，Bio-Feed^TMBeta，Bio-Feed^TMPlus，Bio-Feed^TMPlus，Novozyme^188，Carezyme^，Celluclast^，Cellusoft^，Ceremyl^，Citrozym^TM，Denimax^TM，Dezyme^TM，Dextrozyme^TM，Finizym^，Fungamyl^TM，Gamanase^TM，Glucanex^，Lactozym^，Maltogenase^TM，Pentopan^TM，pectinex^TM，Promozyme^，Pulpzyme^，Novamyl^TM，Termamyl^，AMG(Amyloglucosidase Novo)，Maltogenase^，Sweetzyone^，Aquazym^(所有的酶均可自Novo Nordisk A/S购买)。其它糖酶可从其它公司购买。

可以理解的是，也可将糖酶的变体用作亲代酶。

可按照“Methods of Enzymatic Analysis”中记载的方法(第3版，1984，Verlag Chemie，Weinheim，vol.4)测定糖酶的活性。

亲代转移酶

亲代转移酶(即按照IUBMB的推荐(1992)可归入酶分类号E.C.2之下的酶)包括该组内的转移酶。

亲代转移酶可以是以下转移酶亚组内的任何转移酶：能转移一个碳基的转移酶(E.C.2.1)；能转移醛或残基的转移酶(E.C.2.2)；酰基转移酶(E.C.2.3)；葡糖基转移酶(E.C.2.4)；能转除甲基之外的烷基或芳基的转移酶(E.C.2.5)；能转移含氮基的转移酶(2.6)。

在一种优选实施方案中，亲代转移酶是一种转谷氨酰胺酶E.C.2.3.2.13(蛋白谷氨酰胺μ-谷氨酰转移酶)。

转谷氨酰胺酶是能够催化酰基转移反应的酶，在该反应中，一个肽结合的谷氨酰胺残基的γ-羧基酰胺基团是酰基供体。多种化合物里的伯氨基可以作为酰基受体，从而形成肽结合谷氨酸的单取代γ-酰胺。当肽链中赖氨酸的ε-氨基作为酰基受体时，所述转移酶形成分子内或分子间的γ-谷氨酰-ε-赖氨酰交联键。

转谷氨酰胺酶的例子披露于未决丹麦专利申请(DK)No.990/94(Novo Nordisk A/S)。

亲代转谷氨酰胺酶可来源于人、动物(如牛)或微生物。

所述亲代转谷氨酰胺酶的例子有来自动物的转谷氨酰胺酶，FXIIIa；来自多头绒泡菌(Physarum Polycephalum)的微生物转谷氨酰胺酶(Klein等，Journal of Bacteriology，Vol.174，p.2599-2605)；来自链霉菌(Streptomyces sp.)包括淡紫色链霉菌(S.lavendulae)、利嘉链霉菌(S.lydicus)(以前的S.libani)的转谷氨酰胺酶；和轮枝链霉菌(Streptoverticillium sp.)，包括S.mobaraense、S.cinnamoneum和S.griseocarneum的转谷氨酰胺酶(Motoki等，US5,156,956；Andou等，US5,252,469；Kaempfer等，Journal of General Microbiology，Vol.137，p.1831-1892；Ochi等，International Journal ofSystematic Bacteriologo，Vol.44，p.285-292；andou等，US5,252,469；Williams等，Journal of General Microbiology，Vol.129，p.1743-1813)。

可以理解的是，转移酶变体也可用作亲代酶。

可按照“Methods of Enzymatic Analysis”(第3版，1984，Verlag Chemie，Weinheim，Vol.1-10)中披露的方法测定转谷氨酰胺酶的活性。

亲代植酸酶

亲代植酸酶可归入按照IUBMB的推荐(1992)的酶分类号E.C.3.1.3(磷酸单酯水解酶)下的酶类。

植酸酶是由微生物产生的酶，它能催化植酸向肌醇和无机磷的转化。

能产生植酸酶的微生物包括细菌，如枯草杆菌、纳豆芽胞杆菌(B.natto)和假单胞菌；酵母，如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；和真菌，如黑曲霉、无花果曲霉(Aspergillus ficuum)，泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉、土曲霉(A.terreus)或构巢曲霉(A.nidulans)及各种其它曲霉菌。

亲代植酸酶的例子包括选自归入以下酶分类(E.C.)号下的植酸酶：3-植酸酶(3.1.3.8)和6-植酸酶(3.1.3.26)。

可按照“Methods of Enzymatic Analysis”(第3版，1984，Verlag Chemie，Weinheim，Vol.1-10)中披露的方法测定植酸酶的活性，或按照在EP-A1-0420358(例2A)中披露的方法测定。

亲代抗微生物多肽

亲代抗微生物多肽可以是任何具有抗微生物活性的多肽，如抗真菌活性、抗细菌活性和/或抗杀虫剂活性。

所述多肽也可具有其它活性、如酶解活性。

本发明的抗微生物多肽的例子包括：在WO94/01459中披露的来自霉菌的弯孢属(Curvularia)的具有杀真菌活性的多肽(Novo NordiskA/S)；在EP403.458(Kabigen AB)中披露的抗细菌多肽；在WO92/15691(Imperial Chem Ind.PLC)中披露的从Mirabilis种子中提取的抗微生物蛋白；在WO92/22578(Boman等)中披露的从猪小肠提取物中分离的抗细菌多肽；披露于JP-60130599中的由汉逊酵母菌(Hansenula spp.)产生的具有酵母致死作用的多肽；披露于US5,348,865(Jin Ro LTD)中的Phytolacca insularis抗病毒蛋白，可将其用作抗微生物剂；披露于US5,354,681(Novo Industri A/S)中的获自Nocardiopsis dassonvillei的溶菌酶制剂。

其它抗微生物多肽的例子有：爪蟾抗菌肽、protegrin、防卫素、假霉菌素(pseudomycin)、变溶菌素和N-乙酰溶菌酶。

本发明的相关亲代多肽、蛋白或酶是能引起变态反应的多肽、蛋白或酶。据信，所述多肽、蛋白或酶的分子量在10-100kDa之间，最好在15-80kDa之间，或在20-70kDa之间，或在25-60kDa之间，或在28-55kDa之间，或在30-50kDa之间。

采用不同于亲代酶的具有其它连接基团，如氨基的变体也落入本发明的范围。采用这种变体是有利的，因为这种变体能更有效地防止所述酶被免疫系统识别出来。

聚合物

合适的聚合物的例子包括选自下列一组聚合物中的聚合物：聚亚烷基氧化物(PAO)，如聚亚烷基二醇(PAG)，包括聚乙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(mPEG)和聚丙二醇，PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)，PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)，Star-PEGs，BrancedPEGs，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚-D，L-氨基酸，葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖，纤维素，包括甲基纤维素，羧甲基纤维素，乙基纤维素，羟乙基纤维素，羧乙基纤维素和羟丙基纤维素，脱乙酰壳多糖的水解产物，淀粉如羟乙基淀粉和羟丙基淀粉，糖原，琼脂糖及其衍生物，瓜耳胶，支链淀粉，菊粉，吨胶，角叉菜胶，果胶，藻胶水解产物和生物聚合物。

Star PEGs是多臂的PEG分子，它是由一个交联的二乙烯基苯核心通过乙醚分子的聚合而生成的(Gnanou等，(1988)，Makromol.Chem.198，2885；Rein等，(1993)，Acta Polymer，44，225)。Star PEGs和Branced PEGs可从Shearwater Inc.USA购买)。

Epox-PEGs(或PEG-缩水甘油醚)是一种在其末端有一个环氧化物作为活性偶联基团的PEGs。它能与蛋白的氨基、羟基和硫羟基发生反应/结合(Elling和Kula，(1991)，Biotech.Appl.Biochem.13，354)。Epox-PEG可从Shearwater Inc.购买，例如，以甲氧基-PEG-环氧化物和PEG-(环氧化物)₂形式获得。

CDI-PEGs(或PEG氧羰基咪唑)是以一个羰基咪唑作为活性端基的PEGs。所述活性/活化结合基通过氨基甲酸乙酯键与蛋白缀合(Beauchamp等，(1993)，Anal.Biochem.，131，125)。CDI-PEGs可从Shearwater Inc.USA购买，例如，以甲氧基-PEG-CDI和PEG-(CDI)₂形式获得。

上述合适的易于获得的聚合物(其中一些为活化聚合物)的例子包括聚乙二醇(如购自Merck)，其平均分子量在大约1-35kDa之间；甲氧基聚乙二醇(如，购自Sigma)，其平均分子量约为5kDa；和葡聚糖(如购自Fluka)，其平均分子量在约1-60kDa之间，甚至更多。

尽管所有上述聚合物均可用于本发明中，但优选采用甲氧基聚乙二醇。这是因为甲氧基乙二醇只有一个能与多肽缀合的活性末端。因此，交联的危险不那么明显。另外，它还使得该产品更均匀，而且聚合物与多肽的反应也更容易控制。

按照本发明，可采用分子量(Mr)在1-60kDa之间的聚合物。优选分子量(Mr)在2-35kDa之间的聚合物，尤其是分子量在2-25kDa之间的聚合物，如大约为5kDa或大约为15kDa。

注意，本申请所提到的聚合物分子量都是平均分子量。

在本发明的一种优选实施方案中，所述聚合物是一种聚乙二醇(PEG)，如甲氧基聚乙二醇(mPEG)。

聚合物的活化

如果用于同多肽缀合的聚合物是非活性的，就必须用合适方法将其活化。在“发明背景”部分提及的方法是可用于本发明的方法的例子。不过，最适方法可随分子不同而不同，这取决于例如多肽链上所具备的接合基团的不同。

在以下的其它方法中，将对合适的聚合物活化方法加以简要说明。不过，应当理解的是，其它方法也可以采用。

聚合物与酶的游离酸基的结合可以借助二酰亚胺实现，例如，氨基-PEG 或肼-PEG(Pollak等，(1976)，J.Amr.Chem.Soc.98，289-291)或重氮乙酸酯/酰胺(Wong等，(1992)，同上)。

一般，聚合物同羟基的结合是极为困难的，因为这种结合必须在水中进行。一般水解反应要超过与羟基的反应。

聚合物与游离巯基的结合可通过特殊基团，如马来酰亚胺基或邻吡啶基二硫化物实现。乙烯砜(US5,414,135，(1995)，Snow等)特选巯基，但其选择性不如所提到的其它基团强。

多肽链上可及的精氨酸残基可由包括两个邻位羰基的基团定向结合。

还可采用涉及将亲电子的活性PEGs与赖氨酸的氨基连接的技术。许多常见的醇的离去基团形成胺键。例如，可采用磺酸烷基酯，如三甲苯磺酸酯(tresylates)(Nilsson等，(1984)，Methods in EnzymologyVol.104，Jacoby，W.B.，Ed.，Academic Bress：Orlando，P.56-66；Nilsson等，(1987)，Methods in Enzymology Vol.135；Mosbach，K.，Ed.；AcademicPress：Orlando，pp.65-79；scouten等，(1987)，Methods in EnzymologyVol.135，Mosbach，K.，Ed.，Academic Press：Orlando，1987；pp.79-84；Crossland等，91971)，J.Amr.Chem.Soc.1971，93，pp.4217-4219)，甲磺酸酯(mesylates)(Harris，(1985)，同上；Harris等，(1984)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.22，pp341-352)，芳基磺酸酯，如甲苯磺酸酯和磺酸对硝基苯酯。

有机磺酰氯，如三氟乙磺酰氯能将多种聚合物，如PEG上的羟基转化成良好的离去基团(磺酸酯)，当该基团与多肽上的亲核体，如氨基反应时可在聚合物和多肽之间形成稳定的连键。除了高缀合产率之外，反应条件总体上是温和的(中性或稍偏碱性的pH，以避免变性并很少或不破坏其活性)，并能满足对多肽无破坏性的要求。

甲苯磺酸盐比甲磺酸盐更为活跃，但也更不稳定，能分解成PE，二噁烷和磺酸(Zalipsky，(1995)，同上)。环氧化物也可用于产生胺键，但不如上述基团活跃。

将PEG转化成氯甲酸酯与碳酰氯，能产生与细胞溶素的甲氨酸酯连键。这一过程可以很多变型进行，用N-羟基琥珀酰亚胺(US5,122,614，(1992)，Zalipsky；Zalipsky等，(1992)，Biotechnol-Appl.Biochem.，15，p.100-114；Monfardini等，(1995)，Bioconjugate Chem.6，62-60)、咪唑(Allen等，(1991)，Carbohydr.Res.213，pp309-319)、对硝基苯酚、DMAP(EP 632 082A1(1993)，Looze，Y.)等取代氯。其衍生物通常是用氯甲酸酯与想要的离去基团反应制成的。所有这些基团形成与肽的甲氨酸酯连键。

另外，可将异氰酸盐和异硫氰酸盐分别用于产生脲和硫脲。

可以用上面提到的离去基团和环状亚胺座(thrones)(US5,349,001，(1994)，Greenwald等)由PEG酸获得酰胺。这种化合物的活性极高，但也可能使得水解作用加快。

也可采用与琥珀酐反应制成的PEG琥珀酸酯，由此产生的酯基，使得所形成的缀合更易遭受水解(US5,122,614，(1992)，Zalipsky)。该基团能被N-羟基琥珀酰亚胺活化。

另外，还可引入一个特殊的接头。最古老的一种是氰尿酰氯(Abuchowski等，(1997)，J.Biol.Chem.，252，3578-3581；US4,179,337，(1979)，Davis等；Shafer等，(1986)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.，24，375-378)。

将PEG与一种芳香胺结合，随后再进行重氮化，能产生一种极为活跃的重氮盐，该重氮盐可在原位与肽发生反应。通过使PEG的一种吖内酯衍生物反应也可获得酰胺键(US5,321,095，(1994)，Greenwald，R.B.)从而引入另一个酰胺键。

由于某些肽中并不是含有很多赖氨酸，因此，将一个以上的PEG与同一个赖氨酸连接是有利的。例如，可以用1，3-二氨基-2-丙醇实现上述目的。

PEGs也可通过甲氨酸酯连键与多肽上的氨基结合(WO95/11924，Greenwald等)。也可将赖氨酸残基用作主链。

缀合物

按照本发明，修饰多肽缀合物的总分子量在50-500kDa范围内，较好为50-400kDa，更好为50-250kDa，尤其是100-250kDa，如80-200kDa。

本发明的修饰多肽具有高度稳定性。

对于包括个人护理应用在内的大部分用途来说，所述修饰酶最好不可逆地与聚合物缀合，从而使得该产品具有极微弱的解离倾向，这种解离会导致回复到能引起变态反应的状态。

然而，在其它场合下，理想的是在生产和/或散装状态下酶保持与聚合物缀合，随后当该酶不再有接触人或动物的危险时解离。

本发明缀合的修饰多肽的解离可通过物理条件活化，如pH、离子强度、温度、氧化势或还原势等。其例子之一是溶解一种洗涤剂配方时解离。

另外，特殊化合物的存在也会导致其解离成诸如缀合度较小的分子和/或亲代形式的分子。

尤其是当多肽、蛋白或酶在缀合形式下活性减弱时，解离可能是有利的。

本发明还涉及一种用于生产具有减弱的变应原性的多肽的方法，该方法包括将亲代多肽与1-30个聚合物分子缀合的步骤，特别与1-25个，如1-10个聚合物分子缀合。

可用于本发明中的所述聚合物的例子如上文所述。

理想的是，每个多肽分子缀合1-25个聚合物分子。这一数量低于相关现有技术中的量。因此，聚合物方面的费用得以降低。它还在一定程度上使多肽、蛋白或酶的活性基本得到维持，正如所预料的，其活性与缀合在多肽链上的聚合物的数量和大小成反比例地变化。

按照本发明，多肽活性可保留5％以上，在大多数情况下保留大约20-50％，50-70％较好，70-80％更好，可高达80-90％，甚至达100％。

组合物

本发明还涉及一种包括至少一种本发明的多肽、蛋白或酶的组合物。

该组合物还可以包括其它多肽、蛋白或酶和/或常用成分，所述常用成分用于例如包括皂条的洗涤剂、家用物品、农用化学品、个人护理品，如洗涤制剂，例如用于隐形眼镜、润肤剂、化妆品、口服和皮肤用药物，还涉及处理织物用的组合物，用于生产食品，如烘烤和饲料等的组合物。

所述多肽/蛋白/酶的例子包括具有蛋白酶、脂酶、氧化还原酶、糖酶、转移酶、如转谷氨酰胺酶、植酸酶和/或抗微生物多肽活性的酶。这些酶可以活性减弱的缀合物形式存在。

按照本发明，还可组合使用具有相同活性和不同特异性的缀合酶。

洗涤剂组合物

如果本发明的多肽是一种酶，通常可将其用在洗涤剂组合物中。它可以以无粉尘颗粒、稳定化液体或被保护酶的形式包含在所述洗涤剂组合物中。无粉尘颗粒可按照披露于US4,106,991和4,661,452(均属Novo Industri A/S)中的方法生产，并可选择性地按照本领域的公知方法进行包衣。蜡质包衣材料的例子包括平均分子量为1000-20000的聚(环氧乙烷)制品(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂族醇，其中，该醇含12-20个碳原子，并且有15-80个环氧乙烷单位；脂族醇；脂肪酸；和脂肪酸的单-、双-和三甘油酯。在专利GB1483591中披露了适用于流化床技术的成膜包衣材料的例子。可将液体酶制剂稳定化，例如，可根据已建立的方法通过添加多羟基化合物，如聚丙二醇，糖或糖醇，乳酸或硼酸的方式将其稳定化。其它的酶稳定剂在本领域中广为人知。可按照披露于EP238,216中的方法制备被护酶。

该洗涤剂组合物可以为任何常见形式，例如，为粉状、颗粒状、糊状或液体。液体洗涤剂可以是含水的或不含水的，含水的液体洗涤剂通常含有高达70％的水和0-30％有机溶剂。

所述洗涤剂组合物含有一种或几种表面活性剂，各自为阴离子型、非离子型、阳离子型或两性离子型。该洗涤剂通常含有0-50％的阴离子表面活性剂，如直链烷基苯磺酸盐(LAS)、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烷基硫酸盐(脂族醇硫酸盐)(AS)、脂肪醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)、仲烷基磺酸盐(SAS)、α-磺基脂肪酸甲基酯，烷基-或烯基琥珀酸，或皂。它还可以含有0-40％的非离子型表面活性剂，如脂肪醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧基化脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基聚糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺，或多羟基烷基脂肪酸酰胺(如在WO92/06154中所披露的)。

所述洗涤剂组合物还可以包括-种或几种其它的酶，如蛋白酶、淀粉酶、脂酶、角质酶、纤维素酶、过氧化物酶、氧化酶，以及其它的抗微生物的多肽。

所述洗涤剂可以含有1-65％的洗涤助剂或配位剂，如沸石、焦磷酸盐、三磷酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基-或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(如购自Hoechst的SKS-6)。所述洗涤剂也可以是未复配的，如基本上无洗涤助剂。

所述洗涤剂可包括一种或几种聚合物。聚合物的例子包括羧甲基纤维素(CMC)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯基醇)(PVA)、聚羧酸酯，如聚丙烯酸酯，马来酸/丙烯酸共聚物和十二烷基异丁烯酸/丙烯酸共聚物。

所述洗涤剂可以包括一个漂白系统，该系统包括一个H2O2源，如过硼酸盐或过碳酸盐，它可以与一种过酸生成漂白激活剂，如四乙酰乙二胺(TAED)或壬酰基苯酚磺酸盐(NOBS)混合。另外，该漂白系统可包括诸如酰胺、酰亚胺或砜之类的过氧酸。

所述包括本发明多肽的洗涤剂组合物可以用常见的稳定剂稳定，例如，多羟基化合物，如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，如芳族硼酸酯，而且，该组合物可以按照在WO92/19709和WO92/19708中披露的方法配制。

所述洗涤剂还可以含有其它的常见洗涤成分，例如织物调理剂，包括粘土、泡沫促进剂、抑泡剂、抗腐蚀剂、污垢悬浮剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀菌剂、荧光增白剂或香料。

pH(在使用浓度下在水溶液中测得)通常为中性或碱性，例如在7-11范围内。

本发明范围内的洗涤剂组合物的具体形式包括：

1)一种制成颗粒状的洗涤剂组合物，其堆积密度至少为600g/l，它含有：

-直链烷基苯磺酸盐(以酸计算) 7-12％

-脂肪醇乙氧基硫酸盐(如C_12-18醇，1- 1-4％

2EO)或烷基硫酸盐(如C_16-18)

-脂肪醇乙氧基化物(如C_14-15醇，7EO) 5-9％

-碳酸钠(Na₂CO₃) 14-20％

-可溶性硅酸盐(Na₂O，2SiO₂) 2-6％

-沸石(NaAlSiO₄) 15-22％

-硫酸钠(Na₂SO₄) 0-6％

-柠檬酸钠/柠檬酸(C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇) 0-15％

-过硼酸钠(NaBO₃·H₂O) 11-18％

-TAED 2-6％

-羧甲基纤维素 0-2％

-聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物， 0-3％

PVP、PEG)

-酶 0-5％

-微量成分(如抑泡剂、香料、荧光增白剂 0-5％

光漂白剂)

2)一种制成颗粒状的洗涤剂组合物，其堆积密度至少为600g/l，它含有：

-直链烷基苯磺酸盐(以酸计算) 6-11％

-脂肪醇乙氧基硫酸盐(如C_12-18醇， 1-3％

1-2EO)或烷基硫酸盐(如C_16-18)

-脂肪醇乙氧基化物(如C_14-15醇，7EO) 5-9％

-碳酸钠(Na₂CO₃) 15-21％

-可溶性硅酸盐(Na₂O，2SiO₂) 1-4％

-沸石(NaAlSiO₄) 24-34％

-硫酸钠(Na₂SO₄) 4-10％

-柠檬酸钠/柠檬酸(C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇) 0-15％

-羧甲基纤维素 0-2％

-聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG) 1-6％

-酶 0-5％

-微量成分(如抑泡剂、香料) 0-5％

3)一种制成颗粒状的洗涤剂组合物，其堆积密度至少为600g/l，它含有：

-直链烷基苯磺酸盐(以酸计算) 5-9％

-脂肪醇乙氧基化物(如C_12-15醇，7EO) 7-14％

-皂，如脂肪酸(如C_16-22脂肪酸) 1-3％

-碳酸钠(Na₂CO₃) 10-17％

-可溶性硅酸盐(Na₂O，2SiO₂) 3-9％

-沸石(NaAlSiO₄) 23-33％

-硫酸钠(Na₂SO₄) 0-4％

-过硼酸钠(NaBO₃·H₂O) 8-16％

-TAED 2-8％

-膦酸盐(如EDTMPA) 0-1％

-羧甲基纤维素 0-2％

-聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG) 0-3％

-酶 0-5％

-微量成分(如抑泡剂，香料，荧光增白剂) 0-5％

4)一种制成颗粒状的洗涤剂组合物，其堆积密度至少为600g/l，它包括：

-直链烷基苯磺酸盐(以酸计算) 8-12％

-脂肪醇乙氧基化物(如C_12-15醇，7EO) 10-25％

-碳酸钠(Na₂CO₃) 14-22％

-可溶性硅酸盐(Na₂O，2SiO₂) 1-5％

-沸石(NaAlSiO₄) 25-35％

-硫酸钠(Na₂SO₄) 0-10％

-羧甲基纤维素 0-2％

-聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG) 1-3％

-酶 0-5％

-微量成分(如抑泡剂，香料) 0-5％

5)一种含水液体洗涤组合物，包括：

-直链烷基苯化物(以酸计算) 15-21％

-脂肪醇乙氧基化物(如C_12-15醇， 12-18％

7EO或C_12-15醇，5EO)

-皂，如脂肪酸(如油酸) 3-13％

-烯基琥珀酸(C_12-14) 0-13％

-氨基乙醇 8-18％

-柠檬酸 2-8％

-膦酸盐 0-3％

-聚合物(如PVP，PEG) 0-3％

-硼酸盐(B₄O₇) 0-2％

-乙醇 0-3％

-丙二醇 8-14％

-酶 0-5％

-微量成分(如分散剂，抑泡剂，香料，荧光增白剂) 0-5％

6)一种水结构液体洗涤剂组合物，包括：

-直链烷基苯磺酸盐(以酸计算) 15-21％

-脂肪醇乙氧基化物(如C_12-15醇， 3-9％

7EO或C_12-15醇，5EO)

-皂，如脂肪酸(如油酸) 3-10％

-沸石(NaAlSiO₄) 14-22％

-柠檬酸钾 9-18％

-硼酸盐(B₄O₇) 0-2％

-羧甲基纤维素 0-2％

-聚合物(如PVP，PEG) 0-3％

-粘固用聚合物，如十二烷基异丁烯 0-3％

酸/丙烯酸共聚物；摩尔比25∶1；MW3800

-甘油 0-5％

-酶 0-5％

-微量成分(如分散剂，抑泡剂，香料，荧光增白剂) 0-5％

7)一种制成颗粒状的洗涤剂组合物，其堆积密度至少为600g/l，它包括：

-脂肪醇硫酸盐 5-10％

-乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺 3-9％

-皂，如脂肪酸 0-3％

-碳酸钠(Na₂CO₃) 5-10％

-可溶性硅酸盐(Na₂O，2SiO₂) 1-4％

-沸石(NaAlSiO₄) 20-40％

-硫酸钠(Na₂SO₄) 2-8％

-过硼酸钠(NaBO₃·H₂O) 12-18％

-TAED 2-7％

-聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物，PEG) 1-5％

-酶 0-5％

-微量成分(如荧光增白剂，抑泡剂，香料) 0-5％

8)一种制成颗粒状的洗涤剂组合物，包括：

-直链烷基苯磺酸盐(以酸计算) 8-14％

-乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺 5-11％

-皂，如脂肪酸 0-3％

-碳酸钠(Na₂CO₃) 4-10％

-可溶性硅酸盐(Na₂O，2SiO₂) 1-4％

-沸石(NaAlSiO₄) 30-50％

-硫酸钠(Na₂SO₄) 3-11％

-柠檬酸钠(C₆H₅Na₃O₇) 5-12％

-聚合物(如PVP，马来酸/丙烯酸共聚物，PEG) 1-5％

-酶 0-5％

-微量成分(如抑泡剂，香料) 0-5％

9)一种制成颗粒状的洗涤剂组合物，包括：

-直链烷基苯磺酸盐(以酸计算) 6-12％

-非离子型表面活性剂 1-4％

-皂，如脂肪酸 2-6％

-碳酸钠(Na₂CO₃) 14-22％

-沸石(NaAlSiO₄) 18-32％

-硫酸钠(Na₂SO₄) 5-20％

-柠檬酸钠(C₆H₅Na₃O₇) 3-8％

-过硼酸钠(NaBO₃·H₂O) 4-9％

-漂白激活剂(如NOBS或TAED) 1-5％

-羧甲基纤维素 0-2％

-聚合物(如聚羧酸酯或PEG) 1-5％

-酶 0-5％

-微量成分(如荧光增白剂，香料) 0-5％

10)一种水成液体洗涤剂组合物，包括：

-直链烷基苯磺酸盐(以酸计算) 15-23％

-脂肪醇乙氧基硫酸盐(如C_12-15醇，2-3EO) 8-15％

-脂肪醇乙氧基化物(如C_12-15醇， 3-9％

7EO，或C_12-15醇，5EO)

-皂，如脂肪酸(如月桂酸) 0-3％

-氨基乙醇 1-5％

-柠檬酸钠 5-10％

-水溶助长剂(如甲苯磺酸钠) 2-6％

-硼酸盐(B₄O₇) 0-2％

-羧甲基纤维素 0-1％

-乙醇 1-3％

-丙二醇 2-5％

-酶 0-5％

-微量成分(如聚合物，分散剂， 0-5％

香料，荧光增白剂)

11)一种水成液体洗涤剂组合物，包括：

-直链烷基苯磺酸盐(以酸计算) 20-32％

-脂肪醇乙氧基化物(如C_12-15醇， 6-12％

7EO，或C_12-15醇，5EO)

-氨基乙醇 2-6％

-柠檬酸 8-14％

-硼酸盐(B₄O₇) 1-3％

-聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物，粘固用聚合 0-3％

物，如十二烷基异丁烯酸/丙烯酸共聚物)

-甘油 3-8％

-酶 0-5％

-微量成分(如水溶助长剂，分散剂，香料，荧光增白剂) 0-5％

12)一种制成颗粒状的洗涤剂组合物，其堆积密度至少为600g/l，它包括：

-阴离子型表面活性剂(直链烷基苯磺酸盐，烷基 25-40％

磺酸盐，α-烯烃磺酸盐，α-磺基脂肪酸甲基酯，

烷基磺酸盐，皂)

-非离子型表面活性剂(如脂肪醇乙氧基化物) 1-10％

-碳酸钠(Na₂CO₃) 8-25％

-可溶性硅酸盐(Na₂O，2SiO₂) 5-15％

-硫酸钠(Na₂SO₄) 0-5％

-沸石(NaAlSiO₄) 15-28％

-过硼酸钠(NaBO₃·4H₂O) 0-20％

-漂白激活剂(TAED或NOBS) 0-5％

-酶 0-5％

-微量成分(如香料，荧光增白剂) 0-3％

13)在1)-12)中所公开的洗涤剂配方，其中，全部或部分直链烷基苯磺酸盐被(C_12-18)烷基硫酸盐替代。

14)一种制成颗粒状的洗涤剂组合物，其堆积密度至少为600g/l，它包括：

-(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐 9-15％

-脂肪醇乙氧基化物 3-6％

-聚羟基烷基脂肪酸酰胺 1-5％

-沸石(NaAlSiO₄) 10-20％

-层状二硅酸盐(如购自Hoechst的SK56) 10-20％

-碳酸钠(Na₂CO₃) 3-12％

-可溶性硅酸盐(Na₂O，2SiO₂) 0-6％

-柠檬酸钠 4-8％

-过碳酸钠 13-22％

-TAED 3-8％

-聚合物(如聚羧酸酯和PVP) 0-5％

-酶 0-5％

-微量成分(如荧光增白剂，光漂白剂， 0-5％

香料，抑泡剂)

15)一种制成颗粒状的洗涤剂组合物，其堆积密度至少为600g/l，它包括：

-(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐 4-8％

-脂肪醇乙氧基化物 11-15％

-皂 1-4％

-沸石MAP或沸石A 35-45％

-碳酸钠(Na₂CO₃) 2-8％

-可溶性硅酸盐(Na₂O，2SiO₂) 0-4％

-过碳酸钠 13-22％

-TAED 1-8％

-羧甲基纤维素 0-3％

-聚合物(如聚羧酸酯和PVP) 0-3％

-酶 0-5％

-微量成分(如荧光增白剂，膦酸盐，香料) 0-3％

16)在1)-15)中所公开的洗涤剂配方，它含有一种稳定化的或包衣的过酸，或作为一种添加成分或作为一种已知漂白系统的替代品。

17)在1)、3)、7)、9)和12)中所公开的洗涤剂组合物，其中，过硼酸被过碳酸所替代。

18)在1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)中所公开的洗涤剂组合物，它还含有一种锰催化剂。该锰催化剂可以是bleaching”，Nature，369，p.637-639，1994中的化合物之一。

19)洗涤剂组合物，被制成一种无水洗涤剂液，它包括一种液体非离子型表面活性剂，如直链烷氧基化伯醇，一个助剂系统(如磷酸盐)、酶和碱。该洗涤剂还可以包括阴离子型表面活性剂和/或漂白系统。

本发明的酶可以在洗涤剂中以常用的浓度掺入。在本发明的洗涤剂组合物中，所述具有减弱的变应原性的酶能以相当于每升洗涤液0.001-100mg酶的用量加入。

洗碟用组合物

另外，本发明的修饰酶还可用于洗碟用洗涤剂中。

洗碟用组合物包括一种表面活性剂，它可以是阴离子型、非离子型、阳离子型、两性离子型或以上类型的组合。该洗涤剂含有0-90％的非离子型表面活性剂，如低泡至无泡乙氧基化、丙氧基化直链脂肪醇。

所述洗涤剂组合物还可以含有无机和/或有机类洗涤助剂盐。洗涤助剂可分为含磷型和无磷型。该洗涤剂组合物通常含有1-90％的洗涤助剂。

当存在含磷的无机碱性洗涤助剂时，其例子包括水溶性盐，特别是碱金属焦磷酸盐、正磷酸盐和多磷酸盐。当存在含磷的有机碱性洗涤助剂时，其例子包括水溶性膦酸盐。当存在无磷无机助剂时，其例子包括水溶性碱金属碳酸盐、硼酸盐和硅酸盐以及各种类型的水不溶性结晶或非晶形硅铝酸盐，其中，沸石是最广为人知的代表。

合适的有机助剂的例子包括碱金属、铵和取代铵、柠檬酸盐、琥珀酸盐、丙二酸盐、脂肪酸磺酸盐、羧甲氧基琥珀酸盐、聚乙酸铵、羧酸盐、聚羧酸盐、氨基聚羧酸盐、聚乙酰羧酸盐和多羟基磺酸盐。

其它合适有机助剂包括已知其具有助剂特性的高分子量的聚合物和共聚物，例如合适的聚丙烯酸、聚马来酸和聚丙烯酸/聚马来酸共聚物及其盐。

所述洗碟用洗涤剂组合物可含有氯/溴型或氧型漂白剂。无机氯/溴型漂白剂的例子有次氯酸锂、钠或钙和次溴酸锂、钠或钙，以及氯化磷酸钠。有机氯/溴型漂白剂的例子有杂环N-溴和N-氯酰亚胺，如三氯异氰尿酸、三溴异氰尿酸、二溴异氰尿酸和二氯异氰尿酸，及其具有水溶性阳离子，如钾和钠的盐。也可采用乙内酰脲化合物。

优选有氧漂白剂，例如无机过酸盐形式的漂白剂，最好具有一种漂白剂前体或为过氧酸化合物。合适的过氧漂白化合物的典型例子为碱金属过硼酸盐的四水合物和一水合物，碱金属过碳酸盐、过硅酸盐和过磷酸盐。优选的活化材料为TAED和三乙酸甘油酯。

本发明的洗碟用洗涤剂组合物可以用常用来稳定酶的稳定剂进行稳定，例如多羟基化合物，如丙二醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物，如芳族硼酸酯。

本发明的洗碟用洗涤剂组合物还可以含有其它常见的洗涤剂成分，如抗絮凝剂、填充材料、抑泡剂、抗腐蚀剂、污垢悬浮剂、螯合剂、抗污垢再沉积剂、脱水剂、染料、杀菌剂、荧光剂、增稠剂和香料。

最后，本发明的酶可用于常规洗碟用洗涤剂中，如用于披露于以下任一项专利中的洗涤剂：

EP 518719，EP 518720，EP 518721，EP 516553，EP 516554，

EP 516555，GB 2200132，DE 3741617，DE 3727911，DE 4212166，

DE 4137470，DE 3833047，WO 93/17089，DE 4205071，WO 52/09680，

WO 93/18129，WO 93/04153，WO 92/06157，WO 92/08777，EP 429124，

WO 93/21299，US 5141664，EP 561452，EP 561446，GB 2234980，

WO 93/03129，EP 481547，EP 530870，EP 533239，EP 554943，

EP 346137，US 5112518，EP 318204，EP 318279，EP 271155，

EP 271156，EP 346136，GB 2228945，CA 2006687，WO 93/25651，

EP 530635，EP 414197，US 5240632.

本发明范围内的洗碟用洗涤剂组合物的具体形式包括：

1)粉状自动洗碟用组合物

非离子型表面活性剂	0.4-2.5％
非离子型表面活性剂	0.4-2.5％	硅酸钠	0-20％
二硅酸钠	3-20％	硅酸钠	0-20％
二硅酸钠	3-20％	三磷酸钠	20-40％
碳酸钠	0-20％	三磷酸钠	20-40％
碳酸钠	0-20％	过硼酸钠	2-9％
四乙酰乙二胺(TAED)	1-4％	过硼酸钠	2-9％
四乙酰乙二胺(TAED)	1-4％	硫酸钠	5-33％
酶，包括修饰酶	0.0001-0.5％	硫酸钠	5-33％

2)粉状自动洗碟用组合物

非离子型表面活性剂(如脂肪醇乙氧基化物)	1-2％
非离子型表面活性剂(如脂肪醇乙氧基化物)	1-2％	二硅酸钠	2-30％
碳酸钠	10-50％	二硅酸钠	2-30％

膦酸钠	0-5％
膦酸钠	0-5％	二水合柠檬酸三钠	9-30％
次氮基乙酸三钠(NTA)	0-20％	二水合柠檬酸三钠	9-30％
次氮基乙酸三钠(NTA)	0-20％	一水合过硼酸钠	5-10％
四乙酰乙二胺(TAED)	1-2％	一水合过硼酸钠	5-10％
四乙酰乙二胺(TAED)	1-2％	聚丙烯酸聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物)	6-25％
酶，包括修饰酶	0.0001-0.5％	聚丙烯酸聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物)	6-25％
酶，包括修饰酶	0.0001-0.5％	香料	0.1-0.5％
水	5-10	香料	0.1-0.5％

3)粉状自动洗碟用组合物

非离子型表面活性剂	0.5-2.0％
非离子型表面活性剂	0.5-2.0％	二硅酸钠	25-40％
柠檬酸钠	30-55％	二硅酸钠	25-40％
柠檬酸钠	30-55％	碳酸钠	0-29％
碳酸氢钠	0-20％	碳酸钠	0-29％
碳酸氢钠	0-20％	一水合过硼酸钠	0-15％
四乙酰乙二胺(TAED)	0-6％	一水合过硼酸钠	0-15％
四乙酰乙二胺(TAED)	0-6％	马来酸/丙烯酸共聚物	0-5％
粘土	1-3％	马来酸/丙烯酸共聚物	0-5％
粘土	1-3％	聚(氨基酸)	0-20％
聚丙烯酸钠	0-8％	聚(氨基酸)	0-20％
聚丙烯酸钠	0-8％	酶，包括修饰酶	0.0001-0.5％

4)粉状自动洗碟用组合物

非离子型表面活性剂	1-2％
非离子型表面活性剂	1-2％	沸石MAP	15-42％
二硅酸钠	30-34％	沸石MAP	15-42％
二硅酸钠	30-34％	柠檬酸钠	0-12％
碳酸钠	0-20％	柠檬酸钠	0-12％

一水合过硼酸钠	7-15％
一水合过硼酸钠	7-15％	四乙酰乙二胺(TAED)	0-3％
聚合物	0-4％	四乙酰乙二胺(TAED)	0-3％
聚合物	0-4％	马来酸/丙烯酸共聚物	0-5％
有机膦酸盐	0-4％	马来酸/丙烯酸共聚物	0-5％
有机膦酸盐	0-4％	粘土	1-2％
酶，包括修饰酶	0.0001-0.5％	粘土	1-2％
酶，包括修饰酶	0.0001-0.5％	硫酸钠	平衡

5)粉状自动洗碟用组合物

非离子型表面活性剂	1-7％
非离子型表面活性剂	1-7％	二硅酸钠	18-30％
柠檬酸三钠	10-24％	二硅酸钠	18-30％
柠檬酸三钠	10-24％	碳酸钠	12-20％
单过硫酸盐(2 KHSO₅·KHSO₄·K₂SO₄)	15-21％	碳酸钠	12-20％
单过硫酸盐(2 KHSO₅·KHSO₄·K₂SO₄)	15-21％	漂白剂稳定剂	0.1-2％
马来酸/丙烯酸共聚物	0-6％	漂白剂稳定剂	0.1-2％
马来酸/丙烯酸共聚物	0-6％	二亚乙基三胺五乙酸盐，五钠盐	0-2.5％
酶，包括修饰酶	0.0001-0.5％	二亚乙基三胺五乙酸盐，五钠盐	0-2.5％
酶，包括修饰酶	0.0001-0.5％	硫酸钠，水	平衡

6)粉状和液体状具有清洁表面活性剂系统的洗碟用组合物

非离子型表面活性剂	0-1.5％
非离子型表面活性剂	0-1.5％	十八烷基N-氧化二甲胺二水合物	0-5％
十八烷基N-氧化二甲胺二水合物与十六烷基N-氧化二甲胺二水合物的80：20(wt)C₁₈/C₁₆混合物	0-4％	十八烷基N-氧化二甲胺二水合物	0-5％

无水十八烷基N-氧化二(羟乙基)胺与无水十六烷基N-氧化二(羟乙基)胺的70：30(wt)C₁₈/C₁₆混合物	0-5％
无水十八烷基N-氧化二(羟乙基)胺与无水十六烷基N-氧化二(羟乙基)胺的70：30(wt)C₁₈/C₁₆混合物	0-5％	平均乙氧基化度为3的C₁₃-C₁₅烷基乙氧基硫酸盐	0-10％
平均乙氧基化度为3的C₁₂-C₁₅烷基乙氧基硫酸盐	0-5％	平均乙氧基化度为3的C₁₃-C₁₅烷基乙氧基硫酸盐	0-10％
平均乙氧基化度为3的C₁₂-C₁₅烷基乙氧基硫酸盐	0-5％	平均乙氧基化度为12的C₁₃-C₁₅乙氧基化脂肪醇	0-5％
平均乙氧基化度为9的C₁₂-C₁₅乙氧基化脂肪醇的混合物	0-6.5％	平均乙氧基化度为12的C₁₃-C₁₅乙氧基化脂肪醇	0-5％
平均乙氧基化度为9的C₁₂-C₁₅乙氧基化脂肪醇的混合物	0-6.5％	平均乙氧基化度为30的C₁₃-C₁₅乙氧基化脂肪醇的混合物	0-4％
二硅酸钠	0-33％	平均乙氧基化度为30的C₁₃-C₁₅乙氧基化脂肪醇的混合物	0-4％
二硅酸钠	0-33％	三聚磷酸钠	0-46％
柠檬酸钠	0-28％	三聚磷酸钠	0-46％
柠檬酸钠	0-28％	柠檬酸	0-29％
碳酸钠	0-20％	柠檬酸	0-29％
碳酸钠	0-20％	一水合过硼酸钠	0-11.5％
四乙酰乙二胺(TAED)	0-4％	一水合过硼酸钠	0-11.5％
四乙酰乙二胺(TAED)	0-4％	马来酸/丙烯酸共聚物	0-7.5％
硫酸钠	0-12.5％	马来酸/丙烯酸共聚物	0-7.5％
硫酸钠	0-12.5％	酶，包括修饰酶	0.0001-0.5％

7)无水液体自动洗碟用组合物

液体非离子型表面活性剂(如脂肪醇乙氧基化物)	2.0-10.0％
液体非离子型表面活性剂(如脂肪醇乙氧基化物)	2.0-10.0％	碱金属硅酸盐	3.0-15.0％
碱金属磷酸盐	20.0-40.0％	碱金属硅酸盐	3.0-15.0％

选自高级乙二醇、聚乙二醇、多氧化物、乙二醇醚的液态载体	25.0-45.0％
选自高级乙二醇、聚乙二醇、多氧化物、乙二醇醚的液态载体	25.0-45.0％	稳定剂(如磷酸和C₁₆-C₁₈链烷醇的部分酯)	0.5-7.0％
抑泡剂(如硅氧烷)	0-1.5％	稳定剂(如磷酸和C₁₆-C₁₈链烷醇的部分酯)	0.5-7.0％
抑泡剂(如硅氧烷)	0-1.5％	酶，包括修饰酶	0.0001-0.5％

8)无水液体洗碟用组合物

液体非离子型表面活性剂(如脂肪醇乙氧基化物)	2.0-10.0％
液体非离子型表面活性剂(如脂肪醇乙氧基化物)	2.0-10.0％	硅酸钠	3.0-15.0％
碱金属碳酸盐	7.0-20.0％	硅酸钠	3.0-15.0％
碱金属碳酸盐	7.0-20.0％	柠檬酸钠	0.0-1.5％
稳定系统(如精细硅氧烷与低分子量二烷基聚乙二醇醚的混合物)	0.5-7.0％	柠檬酸钠	0.0-1.5％
稳定系统(如精细硅氧烷与低分子量二烷基聚乙二醇醚的混合物)	0.5-7.0％	低分子量聚丙烯酸酯聚合物	5.0-15.0％
粘土凝胶增稠剂(如膨润土)	0.0-10.0％	低分子量聚丙烯酸酯聚合物	5.0-15.0％
粘土凝胶增稠剂(如膨润土)	0.0-10.0％	羟丙基纤维素聚合物	0.0-0.6％
酶，包括修饰酶	0.0001-0.5％	羟丙基纤维素聚合物	0.0-0.6％
酶，包括修饰酶	0.0001-0.5％	选自高级乙二醇、聚乙二醇、多氧化物和乙二醇醚的液体载体	平衡

9)触变性液体自动洗碟用组合物

C₁₂-C₁₄脂肪酸	0-0.5％
C₁₂-C₁₄脂肪酸	0-0.5％	嵌段共聚物表面活性剂	1.5-15.0％
柠檬酸钠	0-12％	嵌段共聚物表面活性剂	1.5-15.0％
柠檬酸钠	0-12％	三聚磷酸钠	0-15％
碳酸钠	0-8％	三聚磷酸钠	0-15％
碳酸钠	0-8％	三硬脂酸铝	0-0.1％
枯烯磺酸钠	0-1.7％	三硬脂酸铝	0-0.1％

聚丙烯酸酯增稠剂	1.32-2.5％
聚丙烯酸酯增稠剂	1.32-2.5％	聚丙烯酸钠	2.4-6.0％
硼酸	0-4.0％	聚丙烯酸钠	2.4-6.0％
硼酸	0-4.0％	甲酸钠	0-0.45％
甲酸钙	0-0.2％	甲酸钠	0-0.45％
甲酸钙	0-0.2％	n-癸基二苯基氧二磺酸钠	0-4.0％
单乙醇胺(MEA)	0-1.86％	n-癸基二苯基氧二磺酸钠	0-4.0％
单乙醇胺(MEA)	0-1.86％	氢氧化钠(50％)	1.9-9.3％
1，2-丙二醇	0-9.4％	氢氧化钠(50％)	1.9-9.3％
1，2-丙二醇	0-9.4％	酶，包括修饰酶	0.0001-0.5％
抑泡剂，染料、香料、水	平衡	酶，包括修饰酶	0.0001-0.5％

10)液体自动洗碟用组合物

脂肪醇乙氧基化物	0-20％
脂肪醇乙氧基化物	0-20％	磺酸脂肪酸酯	0-30％
十二烷基硫酸钠	0-20％	磺酸脂肪酸酯	0-30％
十二烷基硫酸钠	0-20％	烷基聚糖苷	0-21％
油酸	0-10％	烷基聚糖苷	0-21％
油酸	0-10％	一水合二硅酸钠	18-33％
二水合柠檬酸钠	18-33％	一水合二硅酸钠	18-33％
二水合柠檬酸钠	18-33％	硬脂酸钠	0-2.5％
一水合过硼酸钠	0-13％	硬脂酸钠	0-2.5％
一水合过硼酸钠	0-13％	四乙酰乙二胺(TAED)	0-8％
马来酸/丙烯酸共聚物	4-8％	四乙酰乙二胺(TAED)	0-8％
马来酸/丙烯酸共聚物	4-8％	酶，包括修饰酶	0.0001-0.5％

11)含有被护漂白颗粒的液体自动洗碟用组合物

硅酸钠	5-10％
硅酸钠	5-10％	焦磷酸四钾	15-25％
三磷酸钠	0-2％	焦磷酸四钾	15-25％
三磷酸钠	0-2％	碳酸钾	4-8％

被护漂白颗粒，如氯	5-10％
被护漂白颗粒，如氯	5-10％	聚合增稠剂	0.7-1.5％
氢氧化钾	0-2％	聚合增稠剂	0.7-1.5％
氢氧化钾	0-2％	酶，包括修饰酶	0.0001-0.5％
水	平衡	酶，包括修饰酶	0.0001-0.5％

11)在1)、2)、3)、4)、6)和10)中所公开的自动洗碟用组合物，其中，过硼酸盐被过碳酸盐所替代。

12)在1)-6)中所公开的自动洗碟用组合物，它还含有一种锰催化剂。例如，该锰催化剂可以是在“Efficient manganese catalysts forlow-temperature bleaching”，Nature，369，(1994)，p.637-639)中所披露的化合物之一。

易于获得的用于洗涤剂的含蛋白酶的制品的例子包括Alcalase^、Esperase^、Savinase^和Durazym^(均可自Novo Nordisk A/S购买)；用于洗涤剂的脂酶包括Lipolase^和Lipolase^TMUltra(可从Novo NordiskA/S购买)；用于洗涤剂中的纤维素酶，如Celluzyme^；用于洗涤剂中的α-淀粉酶，如Termamyl^。

个人护理用途

本发明的缀合多肽也可用于个人护理目的。

蛋白酶

蛋白酶是用于清洗隐形眼镜的公知活性成分。它能水解镜片上的蛋白类污垢，并使其可溶。对配戴的舒适性而言，除去蛋白污垢是必不可少的。

蛋白酶也是皮肤清洗制品的有效成分，它能清除上层死亡的角蛋白酶类皮肤细胞，从而使得皮肤看上去更亮丽、更柔嫩。

蛋白酶还可用于口腔护理品，特别是用于清洁牙齿，也可用于牙粉中。

另外，蛋白酶还可用于化妆品、洗浴和淋浴用品，包括洗发水、护发素、洗剂、面乳、皂条、香皂和液体皂。

脂酶

脂酶可用于润肤剂中，作为皮肤清洁用品和抗痤疮用品的活性成分，用于清除多余的皮肤类脂，并作为皮肤护理的活性成分用在洗浴和淋浴用品中，如乳油和洗液。

脂酶还可用于洁发用品(如洗发水)中，用于有效清除头发表面的皮脂及其它脂类物质。

脂酶也是清洁隐形眼镜用品的有效成分，它可以除掉沉积在镜片表面上的类脂。

氧化还原酶

用于个人护理目的最常见的氧化还原酶是一种带有底物(如葡萄糖)的氧化酶(通常为葡萄糖氧化酶)，它能确保产生H₂O₂，由过氧化物酶(通常为乳糖过氧化物酶)开始对诸如SCN^-或I^-的氧化，将其氧化成抗微生物剂(SCNO^-或I₂)。这种酶促复合体本身是由例如乳和唾液得知的。

它被商品化应用于口腔护理用品(漱口水、牙粉、口香胶)，作为抗微生物系统，它还能与淀粉葡糖苷酶一起产生葡萄糖。该系统还被用于润肤剂的防腐。

抗微生物系统包括一种氧化酶与一种过氧化物酶的组合，它们是已知用于清洗隐形眼镜的酶。

氧化还原酶的另一种用途是用氧化酶、过氧化物酶和漆酶进行的氧化性染发。

已知在皮肤(和头发)表面形成的自由基与皮肤的衰老过程有关(头发变坏)。

自由基能激活导致脂膜、胶原和细胞破坏的链式反应。将自由基清除剂，如超氧化物歧化酶用于化妆品中的技术是众所周知的(R.L.Gol-demberg，DCI，Nov.93，p.48-52)。

蛋白二硫键异构酶(PDI)也是一种氧化还原酶。可将其用于卷发(还原和再氧化头发中的二硫键)和修复损坏的头发(这种损坏主要是由还原现有的二硫键造成的)。

糖酶

在牙齿表面形成的斑主要是由多糖组成。它附着在牙齿和微生物的表面。所述多糖主要为α-1，6键葡萄糖(葡聚糖)和α-1，3键葡萄糖(mutan)。不同类型葡聚糖酶，如mutanase和葡聚糖酶(dextranase)的应用有助于水解斑垢的粘性基质，使其能通过机械作用较容易地除去。

还可以通过葡聚糖酶的作用清除其它类型的生物膜，如在镜片上形成的生物膜。

抗微生物多肽

抗微生物多肽具有广泛的用途，如用于化妆品、抗痤疮用品、除臭剂和洗发水的防腐。此外，这种多肽还可用于隐形眼镜用品。

食品和饲料

另外，还可将本发明具有减弱的变应原性的缀合酶或多肽很好地用于食品和饲料的生产。

蛋白酶

小麦面粉里的谷蛋白是面粉可被用作焙制食品的必须成分。有时需要蛋白酶改变面团的谷蛋白的状态，例如，硬的小麦面粉可用蛋白酶软化。

Neutrase^是一种商品化的中性金属蛋白酶，它可用于保证均匀的面团质量和面包质地，并可以改善口味。所述谷蛋白被适中地或更深入地降解成肽，因此，为了避免面团的过分软化，必须进行精确控制。

蛋白酶还可用于乳蛋白改性。

在制酪时为了使乳里的酪蛋白凝固，可采用诸如粗制凝乳酶或凝乳酶之类的蛋白酶。

在啤酒酿造业中，蛋白酶被用于由未麦芽糖化的谷物酿酒，并用于控制氮的含量。

在动物饲料制品中，蛋白酶被用于扩大动物的消化系统。

脂酶

脂酶在焙烤业中的应用还相当新。添加脂酶会产生改善的面团特性，和改善的面包制造品质，体现在较大的体积、改进的面包瓤结构和较白的面包瓤颜色。所观察到的结果其机理可解释为脂酶在和面期间改变谷蛋白与某些类脂片段间的相互作用。由此可产生改进的面筋结构。

花色干酪(blue roan cheese)(如Danablue)、某些意大利式干酪及其它含乳脂肪的乳制品的香味形成取决于乳脂肪降解成游离脂肪酸。脂酶可用于在这类食品中产生香味。

在油脂制造业中，脂酶被用于，例如减少不需要的副产品的量，通过酯交换对脂肪进行改性并合成酯。

氧化还原酶

另外，本发明具有减弱的变应原性的氧化还原酶还可用于食品和饲料生产。

有几种氧化还原酶可用于焙烤业，如葡萄糖氧化酶、脂氧合酶、过氧化物酶、过氧化氢酶及其组合。通常，面包师通过添加抗坏血酸和溴酸钾来强化面筋。某些氧化还原酶可用于代替面团系统中的溴酸盐，这种酶可以氧化谷蛋白中的游离巯基。从而形成二硫键，使所得到的面团更坚韧、更有弹性，抗性也更大。

Gluzyme^TM(Novo Nordisk A/S)是具有过氧化氢酶活性的葡萄糖氧化酶制剂，可用它替代溴酸盐。对强化的面团进行测定，其对机械冲击的耐受力更强，具有更好的面团上烤炉性能和较大的面包体积。

糖酶

具有不同淀粉酶含量的面粉会产生不同的焙烤特性。为了使面粉标准化，必须添加淀粉酶。淀粉酶和戊聚糖酶通常能提供酵母发酵所需的糖，改善面包体积，延迟淀粉老化，降低变陈速度和由戊聚糖胶所产生的粘性。糖酶的例子如下文所述。

某些生麦淀粉酶可用于延长面包的货架寿命两天或两天以上，而不会导致产品里的粘合性。可以选择性地修饰凝胶化淀粉，切开淀粉分子的非还原端；并修饰低分子量糖类和糊精。对淀粉进行的修饰使其不易发生老化。所产生的低分子量糖类可以改善焙烤食品的保水能力而又不会产生中等长度的糊精，这种糊精会导致成品中的粘合性。在面包焙烤期间所述酶被失活，所以这种方法可被视为无须在标签上对以上情况加以说明的哪种。可基本排除Novamyl的超量问题。

可用真菌α-淀粉酶增加面包体积，它还能使面包瓤具有良好、均匀的结构。所述α-淀粉酶是能够产生麦芽糖、糊精和葡萄糖的胞内酶。在高于淀粉糊化温度的温度下可使谷类和某些细菌α-淀粉酶失活，因此，当其被加入小麦面团中时，会产生低的面包体积和粘的面包瓤。Fungamyl的优点是不耐热，并能在糊化温度以下失活。

具有若干戊聚糖酶和半纤维素酶活性的酶制剂可以改善面团的可操作性和稳定性，并能改善新鲜度、面包瓤结构和面包体积。

通过水解面粉中的戊聚糖成分，可使其丧失很大一部分水结合能力，这些水可为淀粉和谷蛋白所用。谷蛋白会变得更为柔韧、伸展性更大，而淀粉变得更易于糊化。戊聚糖酶可与乳化剂组合使用，或用于取代乳化剂。

另外，糖酶还可用于由淀粉生产糖浆，这种糖浆被普遍用于软饮料、甜食、肉制品、乳制品、面包制品、冰淇淋、婴儿食品、果酱等中。

淀粉转化一般是分三步进行的。首先将淀粉液化，使用α-淀粉酶。得到主要由寡糖和糊精组成的麦芽糖糊精。

然后用淀粉葡糖甘酶处理所述混合物，以便将寡糖和糊精水解成葡萄糖。由此获得一种较甜的产品。如果需要较高的麦芽糖糖浆，可以单用β-淀粉酶或组合使用β-淀粉酶和支链淀粉酶(脱枝酶)。

通过异构化使葡萄糖转化为果糖，可使上述葡萄糖混合物变得更甜。

在制糖业中，加快蔗汁中淀粉的降解是一种常用措施。从而使粗糖中的淀粉含量降低，在精制厂中进行的过滤便于进行。

另外，葡聚糖酶被用于降解原糖汁和糖浆中的葡聚糖。

在酒精业中，α-淀粉酶可很好地用于稀释馏出糖化醪中的淀粉。

在啤酒酿造业中，α-淀粉酶被用于辅助液化。

在乳品业中，在生产供患有乳糖吸收障碍的患者使用的低乳糖乳时使用β-半乳糖甘酶(乳糖酶)。

当用乳糖酶处理的乳生产香味乳品饮料时，可以减少糖的加入量而又不会降低产品的甜度。

在生产炼乳时，通过乳糖酶处理可以避免乳糖结晶，并由此降低由乳糖结晶中酪蛋白凝固所致的增稠的危险。

当用乳糖酶处理过的乳(或乳清)生产冰淇淋时，不会产生乳糖结晶，而且不会出现缺陷和砂状结晶。

另外，已知木聚糖酶可用于若干食品/饮料目的，如在WO94/21785(Novo Nordisk A/S)中所披露的。

在动物饲料业中，α-淀粉酶被添加到含谷物的饲料中，以改善淀粉的可消化性。

抗微生物多肽

某些溶菌酶被用于在肉类包装业中洗涤动物胴体(参见属于NovoIndustri A/S的专利US5,354,681)。

转移酶

本发明具有减弱的变应原性的转谷氨酰胺酶能很好地应用于食品及饲料的生产。

转谷氨酰胺酶具有交联蛋白的能力。

这一特性可用于含蛋白水相的糊化。可将其用于生产糊状食品(属于Novo Nordisk A/S的丹麦专利申请DK1071/84)。

转谷氨酰胺酶被用于改善面粉的焙烤性能，例如，对用于生产糕点的面粉进行改性，使其具有改善了的特性，如改善的味道、凹痕、口感和较高体积(见JP1-110147)。

另外，还可用于生产糊状食品，例如，在诸如冰淇淋、糕点装饰物、冰冻甜食、蛋黄酱和低脂肪涂抹食品之类的食品中用作脂肪的替代品(见属于Novo Nordisk A/S的WO93/22930)。

另外，还可用于由乳及乳状制品生产酸牛奶、木斯、干酪、布丁和橙汁的凝胶，并与肉馅结合以改善食品蛋白的口味和质地(见WO94/21120和WO94/21129，均为Novo Nordisk A/S所拥有)。

本发明的植酸酶能很好地用于生产食品，如早餐谷物食品、糕点、甜食、饮料、面包或汤等，并用于生产动物饲料。

植酸酶可用于利用存在于植物蛋白源中的植酸盐/植酸上结合的磷，或用于利用结合在植酸复合物上的重要营养矿物质。

可将来自微生物的植酸酶加入单胃动物的饲料中，以免向饲料中补充无机磷(US 3,297,548)。

另外，还可将植酸酶用于大豆加工。大豆粉中可能含有高水平的反营养因子植酸盐，它使得这种蛋白源不适于用作婴儿食品和鱼、牛及其它非反刍动物的饲料，因为植酸盐能螯合其中的基本矿物质(见EP0420358)。

植酸酶也可用于焙烤目的。将含有小麦面粉等和植酸酶的面团分割成片，可制成具有较好品质的面包(见JP-0-3076529-A)。

已知具有高植酸酶活性的日本清酒曲霉菌可用于生产精制清酒(见JP-0-6070749-A)。

织物应用

蛋白酶

蛋白酶被用于丝绸的脱胶和砂洗。

脂酶

在织物的整理阶段，脂酶被用于清除含有疏水酯类(如三甘油酯)的脂类物质(见WO93/13256，属于Novo Nordisk A/S)。

氧化还原酶

在对织物进行漂白清洗时，过氧化氢酶可用于清除多余的H2O2。

糖酶

纤维素裂解酶被广泛用于整理粗斜布服装，以便形成织物颜色密度的局部变化(能促进“石洗”的酶)。

纤维素裂解酶还可用于生物抛光工艺。生物抛光是对纱线表面的一种特殊处理，它能改善织物的手感和外观方面的品质，而又不会损失织物的可织性。可以采用诸如披露于WO93/20278中的方法实现生物抛光。

在织物的纺织过程中，纱线要承受相当大的机械拉力。为了防止断裂，通过涂敷(上浆)凝胶类物质(浆料)加强纱线。最常见的上浆剂是天然或改性形式的淀粉。只须除去织物上的浆料(所谓退浆)即可实现均匀持久的整理。用含有淀粉或改性淀粉的浆料上浆的织物的退浆最好是由淀粉裂解酶进行。

口服和皮肤用药物

蛋白酶

将不同的高度纯化的蛋白酶(如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)用于口服药物和皮肤用药物中，用于治疗炎症、水肿和损伤。

制革

转移酶

已知转谷氨酰胺酶可作为硬化剂用于皮革的酪蛋白整理(见WO94/13839，属于Novo Nordisk)。

硬表面清洗

清洗硬表面，如在食品业中清洗硬表面通常是困难的，因为用于生产乳品、肉、海产品、饮料等的设备通常具有复杂的形状。已证实采用凝胶和泡沫形式的含酶表面活性剂组合物能促进并改善对硬表面的清洗。可加入这种表面活性剂组合物中的酶最好是蛋白酶、脂酶、淀粉酶和纤维素酶。

这种含酶的表面清洗组合物也能很好地用于运输工具清洗，如清洗汽车和用于一般船只的清液。

最后，本发明涉及将本发明的缀合物或组合物用于含多肽的产品中。

首先，本发明的缀合物或组合物能很好地用于个人护理用品中，如头发护理和头发处理用品。其中包括洗发水、香脂、护发素、卷发组合物、染发组合物、生发油、发液、发油、洗发水、润丝剂、喷发剂。

另外，还可用于口腔护理品，如牙粉、漱口水、口香胶。

还可用于皮肤护理用品和化妆品，如护肤油、护肤乳、清洁霜、清洗液、清洁乳、冷霜、霜皂、营养香皂、皮肤洗液、乳状洗液、芦甘石洗剂、护手霜、皂粉、透明皂、防晒油(Sunoil)、防晒霜、剃须泡沫、剃须膏、婴儿用油、口红、唇膏、乳状粉底、面部用粉、粉状眼影、粉、粉底、化妆底霜、香粉、增白粉。

本发明的缀合物还能很好地用作隐形眼镜的卫生用品。该用品包括隐形眼镜清洗用品和消毒用品。

还可将其用于洗涤剂，如洗洁粉、皂、皂条、液体皂。

材料和方法

材料：

酶底物

Suc-AAPF-pNA(琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对-硝基苯胺。Sigma no.S-7388，Mw624.6g/mole)

二甲基酪蛋白(CM-酪蛋白)(Sigma)

三丁酸甘油酯(Merek 1958)

Cellazyme-C^(Megazyme)

羧甲基纤维素(Sigma)

聚合物：

聚乙二醇(PEG-35.000)，购自Fluka

聚乙二醇(PEG-5.000)，由三氟乙磺酰氯(2，2，2-三氟乙磺酰氯)活化(Sigma，St.louis，USA；M-3038)

单甲氧基聚乙二醇(mPEG-5.000)，购自Shearwater PolymerInc.USA。

单甲氧基聚乙二醇(mPEG-15.000)，购自Shearwater PolymerInc.USA.

mPEG-NH₂-5.000(Shearwater Polymer Inc.，USA)

酶：

Esperase^(可购自Novo Nordisk A/S)

枯草蛋白酶A(Novo Nordisk A/S)

枯草蛋白酶Novo(枯草蛋白酶BNP’)(Novo Nordisk A/S)Lipolase^：疏棉状腐质霉脂酶，披露于EP305216中(可自Novo NordiskA/S购买)

Lipolase^变型A：具有E87K/D254K突变的Lipolase^(可自NovoNordisk A/S购买)

南极假丝酵母脂酶B(可向Novo Nordisk A/S索取)。

披露于由Novo Nordisk生物技术公司申请的PCT/US95/07536中的Polyporus pinsitus漆酶。

灰盖鬼伞过氧化物酶(可向Novo Nordisk A/S索取)。

Carezyme^(Novo Nordisk A/S)

溶液：

终止溶液(DMG-缓冲液)

硼酸钠，硼砂(Sigma)

3，3-二甲基戊二酸(Sigma)

CaCl₂(Sigma)

三氟乙磺酰氯(2，2，2-三氟乙磺酰氯)(Fluka)

Tween20：聚氧乙烯山梨糖单月桂酸酯(Merck cat no.822184)

1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)(Fluka)

N-羟基琥珀酰亚胺(Fluka art.56480)

光气(Fluka art.79380)

示踪分子：

生物素酰化的小鼠抗大鼠IgE(zymed，no.03-9740)

染色底物：

OPD：邻苯二胺(Kementec cat no.4260)

动物：

棕色挪威大鼠(获自Charles River，DE)

设备：

XCEL II(Novex)

ELISA读数器(UVmax，Molecular Devices)

HPLC(Waters)

PFLC(Pharmacia)

Superdex柱，Mono-Q，MonoS，购自Pharmacia，SW.

Superdex-75柱(Pharmacia，SW)

SLT：Fotometer，购自SLT LabInstruments

大小排阻层析(Spherogel TSK-G 2000 SWG)

大小排阻层析(Superdex 200，Pharmacia，SW)

方法：

以酪蛋白为底物的蛋白酶活性

按照披露于“AF219/1-GB(获自Novo Nordisk A/S)中的方法，以酪蛋白为底物测定Esperase^的活性。

用Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA进行蛋白酶活性分析：

蛋白酶，尤其是胰凝乳蛋白酶裂解肽与对-硝基苯胺之间的连键，能在405nm处产生可见的黄色光吸收。

缓冲液：例如Britton和Robinson缓冲液，pH8.3

底物：将100mg Suc-AAPF-pNA溶于1ml二甲基亚砜(DMSO)中。用Britton和Robinson缓冲液将100μl的上述溶液稀释到10ml。

分析：将底物与蛋白酶溶液混合，并在405nm波长处以时间和ABS_405nm/分为函数监测光吸收。控制温度(20-50℃，取决于蛋白酶)。这是对样品中蛋白酶活性的测定。

脂酶活性

按照在“AF95/5GB(可向Novo Nordisk A/S索取)中披露的方法分析脂酶活性。

氧化还原酶活性

按照在“AF219/1-GB(获自Novo Nordisk A/S)中披露的方法，以酪蛋白为底物测定氧化还原酶活性。

漆酶活性

根据在需氧条件下对丁香醛连氮的氧化作用测定漆酶活性。在530nm处对所产生的紫色进行光测定。分析条件为19μM丁香醛连氮，23.2mM乙酸缓冲液，pH5.5，30℃，反应时间1分钟。1个漆酶单位(LACU)是在上述条件下每分钟催化1μmole丁香醛连氮转化的酶用量。

漆酶的漆酶活性披露于AF239GB中，其被收作本文的参考(可向Novo Nordisk索取)。

过氧化物酶活性

测定过氧化物酶的酶活性，以PODU(过氧化物酶单位)表示。1PODU是在一个系统中每分钟催化1μmol H₂O₂转化的酶用量，即氧化2，2’-连氮-双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]，ABTS。可以索取Novo Nordisk分析方法的详细说明(AF279/1GB)。

纤维素酶活性

根据从天青蛋白交联的HE-纤维素中释放的蓝色染料测定Carezyml^的酶促活性(Cellazyme-C^)。反应是在40℃下，在20mM磷酸钠(pH7)中进行10分钟。通过在一台UVmax^Elisa-读数器上在595nm处读取光吸收测染料的释放。另外，按照在“EAL-SM-0373.01/01”(可向Novo Nordisk索取)中披露的方法测定纤维素裂解活性。

ELISA IgE测试系统

将一种三层夹心ELISA用于测定特异抗体的相对浓度。

将免疫分子用作包被抗原，浓度为10μg/ml，用量为50μl/孔，溶于中性磷酸缓冲液中，在4℃下温育过夜。用2％的脱脂乳封闭残留在孔表面上的所有结合斑，每孔用量为200μl，用磷酸缓冲液配制，在室温(RT)下至少温育30分钟。用一个8-路移液管将所有待用该抗原测试的血清以每孔50μl的用量加至所述板上，进行10X和3X的系列稀释。稀释是在含有0.5％脱脂乳和0.05％Tween20的磷酸缓冲液中进行，在室温下，在振荡平台上温育2小时。“示踪”分子是生物素酰化的小鼠抗大鼠IgE，50μl/孔，并在含有0.5％脱脂乳和0.05％Tween20的磷酸缓冲液中稀释2000X，在室温下，在振动平台上温育2小时。对照(空白)的测试顺序相同，但没有大鼠血清。以50μl/孔的量加入稀释2000x的链霉亲和素辣根过氧化物酶，在振荡平台上温度1小时。染色底物为溶于每10ml柠檬酸缓冲液(pH5.2)中的OPD(6mg)和H₂O₂(4μl 30％的溶液)，用量为50μl/孔。每孔加100μl2N H₂SO₄终止反应。将在486nm和620nm处在SLT上所得到的所有读数作为参考。计算数据，并在Lotus中给出。

对大鼠的气管内(IT)刺激

将具有2.5”长金属探针的一次性注射器用于IT服用分子。该探针插入气管(见图1)，位于会厌下面约1cm处(见图1)，将0.1ml的分子溶液滴入气管。对动物进行4次刺激，在末次刺激与放血之间隔5天时间。动物为棕色挪威大鼠，分成4组。开始时的重量在250g以上，结束时的重量约为450g。

分子量测定

通过标准方法，用4-20％梯度SDS聚丙烯酰胺凝胶(Novex)进行蛋白质的电泳分离。通过银染检测蛋白。参比购自Novex的Mark 12^宽范围分子量标准的迁移率，测定分子量。

实施例

例1

用三氟乙磺酰氯活化PEG35.000

活化方法援自Nilson，K.等(1984)，同上。使用的所有溶剂均为Merck分析级。

将4.0g PEG 35.000溶于无水二氯甲烷(10ml)中。将吡啶(0.25ml)和三氟乙磺酰氯(0.22ml)加进去。在环境温度下搅拌90分钟后，将得到的黄色混合物蒸干，并溶于热乙醇(60ml)中，用HCl调至酸性。将该混合物放在冰箱中在-18℃下过夜，得到大量白色沉淀。400g离心20分钟，回收沉淀，用冷的酸性乙醇(60ml乙醇，0.5ml浓HCl)反复洗涤(6次)。将溶剂蒸发掉，直至为恒重，得到活化PEG-35.000的灰白色粉末，产率为77％。活化PEG-35.000的特征为：熔点59-61℃，NMR分析表明三氟乙磺酰化度(tresylation)为30-35％。

在以96％的产率进行上述方法的放大合成之后，得到熔点为59-60℃的淡黄色片状物。NMR分析显示，三氟乙磺酰化度在40％以上。

例2

用三氟乙磺酰氯活化mPEG15.000

将mPEG 15.000(10.0g)溶于二氯甲烷(无水，35ml)中，其中馏出15ml，以便除去任何微量水。冷却之后，将三乙胺(900μl，10当量)和三氟乙磺酰氯(350μl，5当量)加至表面以下。该溶液变为淡黄色，并有一些三乙胺氢氯化物析出。90分钟之后将该溶液倾入盛于细注射器里的乙醚(250ml)中并搅拌。搅拌3分钟之后将淡黄色沉淀滤掉，并用乙醚(20ml)洗涤，干至11.3g，NMR显示有80-90％被活化，并有大量NHEt₃Cl。在乙酸乙酯(325ml)中对其进行再结晶，热过滤，以除去大部分的盐。缓慢冷却至室温后，将该悬浮液放置在冰箱中进行进一步结晶。得到9.3g(93％)白色结晶。¹H-NMR(CDCl₃)δ1.42t(I＝6.5 CH₃ i HNEt₃Cl)，3.10dq(I＝4.6 CH₂ iHNEt₃Cl)，3.38s(I＝2.6 CH₃ i OMe)，3.40*dd(I＝4.5‰，¹³C伴峰)，3.64bs(I＝1364主峰)，3.89^*dd(I＝4.8‰，¹³C伴峰)，4.24q(I＝9.0Hz，I＝1.8，三氟乙磺酰基中的CH₂)，4.53^*dd(I＝1.5 CH₂-O-三氟乙磺酰基)。表明活化度为80-90％，仅有6‰(w/w)HNEt₃Cl。

例3

用N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化mPEG15.000

将mPEG15.000悬浮于甲苯(4ml/g mPEG)中，在常压下馏出20％，以便对反应物进行共沸干燥。当溶液冷却至30℃时加入二氯甲烷(干燥1ml/g mPEG)和溶于甲苯中的光气(1.93M 5mole/mole mPEG)，在室温下搅拌混合物过夜。将该混合物蒸干，得到想要的产物，呈蜡质块状。

蒸发之后，加入二氯甲烷和甲苯(1∶2；干3ml/g mPEG)，将白色固体再次溶解。加入固体形式的N-羟基琥珀酰亚胺(2mole/molemPEG)，再加入三乙胺(1.1mole/mole mPEG)。搅拌该混合物3小时，开始为不透明的，然后澄清，最后有少量沉淀。将混合物蒸干，并在乙酸乙酯(10ml)中进行再结晶，热过滤以除去盐和不溶性物质。将空白液体放在环境温度下缓慢冷却16小时，然后放在冰箱中过夜。将白色沉淀滤掉，并用少量冷的乙酸乙酯洗涤，干燥，得率为98％(w/w)。NMR显示活化度为80-90％，有5‰(w/w) HNEt₃Cl。对mPEG15000进行的¹H-NMR(CDCl₃)δ1.42t(I＝4.8 CH₃ iHNEt₃Cl)，2.84s(I＝3.7琥珀酰亚胺)，3.10dq(I＝3.4 CH₂ iHNEt₃Cl)，3.38s(I＝2.7 CH₃ i OMe)，3.40*dd(I＝4.5‰，¹³C伴峰)，3.64bs(I＝1364主峰)，3.89^*dd(I＝4.8‰，¹³C伴峰)，4.47dd(I＝1.8，PEG中的CH₂)。在22℃下，在干燥器中存放4个月未发生变化。

例4

用N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化mPEG5.000

按照例3中所述方法用N-琥珀酰亚胺碳酸酯对mPEG5.000进行活化。

例5

蛋白酶与由三氟乙磺酰氯活化的PEG35.000的缀合

将70mg高度纯化的Esperase^与855mg按例1方法制备的活化PEG35.000的混合物(7.5ml)在0.1M硼酸钠(pH9.2)中，在室温下温育过夜，并用磁力搅拌。加入乙醇胺(0.01ml)终止反应。

通过大小排阻层析纯化所得到的Esperase^PEG 35.000缀合物，方法是用Superdex-75柱进行HPLC。

与亲代酶相比，该缀合物在以Suc-AAPF-pNA为底物进行的肽分析中还保留有68％的残余酶活性，而在以酪蛋白为底物进行的分析中有39％的残余酶活性。

例6

采用与上述例1和6相同的方法和化学试剂，得到约10倍的活化PEG35.000，如42mg Esperase^和480mg活化PEG，与亲代酶相比，以Suc-AAPF-pNA为底物时的残余活性为80％，而以酪蛋白为底物时的残余活性为46％。

例7

蛋白酶与活化mPEG5.000的缀合

将200mg枯草蛋白酶Novo和1.8g由N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化的mPEG5.000(按例4方法制备)放入50mM硼酸钠(pH10)中温育，终体积为20ml。反应在室温下进行，用磁力进行搅拌。反应时间为1小时。加入DMG缓冲液终止反应，使终浓度为5mM戊二酸二甲酯，1mMCaCl₂和50mM硼酸盐，pH5.0。

所得衍生物的分子量约为100kDa，相当于每摩尔枯草蛋白酶Novo结合12摩尔的PEG。

与亲代酶相比，对肽底物(Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺)的残余活性接近100％，而对CM-酪蛋白的活性接近64％。

例8

蛋白酶与活化mPEG15.000的缀合

将200mg枯草蛋白酶Novo和5.5g由N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化的mPEG15.000(按例3方法制备)一起放入50mM硼酸钠(pH10)中温育，终体积为20ml。反应在室温下进行，用磁力进行搅拌。反应时间为1小时。加入DMG缓冲液终止反应，使终浓度为：5mM戊二酸二甲酯，1mM CaCl₂和50mM硼酸盐，pH5.0。

所得衍生物的分子量在200kDa以上，相当于每摩尔枯草蛋白酶Novo结合12摩尔的PEG。

与亲代酶相比，对肽底物(Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺)的残余活性接近100％，而对CM-酪蛋白的活性为71％。

例9

脂酶与三氟乙磺酰氯活化的PEG35.000的缀合

将40mg高度纯化的Lipolase^与440mg按例1方法制备的活化PEG35.000的混合物(3.4ml)放入0.1M硼酸钠中温育，在室温下过夜，用磁力搅拌。加入乙醇胺(0.01ml)终止反应。

通过大小排阻层析纯化所得到的Lipolase^-PEG 35.000缀合物，方法是用Superdex-75柱进行HPLC。

与亲代脂酶相比，以三丁酸甘油酯为底物时该缀合物有56％的残余酶活性。

例10

脂酶与三氟乙磺酰氯活化的PEG5.000的缀合

将25mg高度纯化的Lipolase^和363mg三氟乙磺酰氯活化的PEG5.000的混合物(2ml)一起放入0.1M硼酸钠(pH9.2)中温育，在室温下过夜，用磁力搅拌。加入乙醇胺(0.01ml)终止反应。

通过大小排阻层析纯化所得到的Lipolase^-PEG5.000缀合物，方法是用Superdex-75柱进行HPLC。

与亲代酶相比，以三丁酸甘油酯为底物时该缀合物有48％的残余酶活性。

例11

脂酶与三氟乙磺酰氯活化的mPEG15.000的缀合

将25mg南极假丝酵母脂酶B与2.82g由三氟乙磺酰氯按例2方法活化的mPEG15.000一起放在25ml 0.1M硼酸盐，1M NaCl，pH9.2中，在室温下温育3小时。加入1ml 2M甘氨酸终止反应，并通过大小排阻层析(Spherogel TSK-G2000 SWG)纯化所得衍生物。

与亲代南极假丝酵母脂酶B相比，在以三丁酸甘油酯为底物时该衍生物具有83％左右的残余酶活性。

例12

脂酶与三氟乙磺酰氯活化的mPEG15.000的缀合

将27mg Lipolase^变体A与417.4mg按例2方法由三氟乙磺酰氯活化的mPEG15.000一起放入6ml 0.1M硼酸盐，0.8MNaCl，pH9.2中，在室温下温育3小时。加入139μl 2M甘氨酸终止反应，并通过大小排阻层析(Spherogel TSK-G2000 SWG)纯化该衍生物。

与亲代Lipolase^变体相比，以三丁酸甘油酯为底物时该衍生物的残余酶活性为36％。

例13

脂酶与三氟乙磺酰氯活化的mPEG15.000的缀合

将170mg Lipolase^与2.19g按例2方法活化的mPEG15.000一起在17ml 0.1M硼酸盐，0.8M NaCl，pH9.2中，在室温下温育3小时。加入730μl 2M甘氨酸终止反应，通过大小排阻层析(Spherogel TSK-G2000 SWG)纯化该衍生物。

与亲代Lipolase^相比，以三丁酸甘油酯为底物时该衍生物具有64％的残余酶活性。

例14

脂酶与N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化的mPEG15.000的缀合

将100mg Lipolase^与按照例3方法用N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化的2.576g mPEG-15.000一起放入9ml 0.1M硼酸盐，1M NaCl，pH9.2中温育3小时。加入859μl 2M甘氨酸终止反应，并通过大小排阻层析(Spherogel TSK-G2000 SWG)纯化该衍生物。

与亲代Lipolase^相比，以三丁酸甘油酯为底物时该衍生物具有约60％的残余酶活性。

通过SDS-PAGE测得所得缀合物的分子量约为150kDa。

例15

由碳化二亚胺介导的脂酶与mPEG-NH2-5.000的缀合

将0.4mg Lipolase^与400mg mPEG-NH₂-5.000和125mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)一起放入5ml 50mMMES缓冲液，0.2M NaCl，pH5.0中，在室温下温育3小时。通过大小排除层析(Superdex200，Pharmacia)纯化该衍生物。

与亲代Lipolase^相比，以三丁酸甘油酯为底物时该衍生物具有约1％的残余酶活性。

例16

漆酶与N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化的mPEG15.000的缀合

将100mg Polyporus pintitus漆酶与按照例3方法用N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化的1.155g mPEG15.000一起放入10ml 0.1M硼酸盐，0.5MNaCl，pH9.2中，在室温下温育2小时，加入200μl 2M甘氨酸终止反应，并通过大小排阻层析(Superdex200)纯化该衍生物，并用50mM硼酸盐(pH9.0)透析。

由SDS-PAGE测得分子量在150-200kDa范围内。

与亲代漆酶相比，该衍生物具有55％左右的残余酶活性。

例17

灰盖鬼伞过氧化物酶与N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化的mPEG15。000的缀合

将75mg过氧化物酶与按照例3方法用琥珀酰亚胺碳酸酯活化的1.579g mPEG一起在7.5ml 0.1M硼酸盐，0.5NaCl，pH9.2中，在室温下温育2小时。加入200μl 2M甘氨酸终止反应，通过大小排阻层析(Superdex 200)纯化该衍生物，并用0.1M磷酸钠(pH7.0)透析。

由SDS-PAGE测得分子量范围为150-200kDa。

与亲代过氧化物酶相比，该衍生物保留了79％左右的残余酶活性。

例18

纤维素酶与三氟乙磺酰氯活化的PEG5.000的缀合

将27.2mg Carezyme^与115.2mg三氟乙磺酰氯活化的PEG5.000一起在50mM碳酸钠缓冲液(pH8.5)中温育。在室温下进行反应，用磁力搅拌。反应时间为1小时。

该衍生物的分子量(根据变性蛋白在SDS聚丙烯酰胺凝胶中的相对迁移率测得)为53-63kDa，相当于每摩尔Carezyme^结合2-4摩尔PEG。

与内标(亲代酶的高度纯化制剂)相比，该衍生物保持63％的残余活性。

例19

底物保护纤维素酶与活化mPEG5.000的缀合

为了在mPEG缀合期间保护酶的活性位点，将该酶在羧甲基纤维素溶液(0.5％w/v)中稀释至与例3相同的终缓冲液浓度和蛋白浓度(4ml碳酸钠，pH8.5，6.8mg/ml Carezyme^，115.2mg N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化的mPEG5.000)。该反应在4℃下进行1小时。

与例18相同，通过用4-20％的梯度聚丙烯酰胺凝胶进行SDS电泳测定衍生化程度，随后进行银染色。该衍生物的表观分子量为53-63kDa，相当于每摩尔Carezyme^结合2-4摩尔PEG。

该衍生物的催化活性相当于亲代酶的90％。

例20

产物稳定的纤维素酶与活化mPEG5.000的缀合

为了保护Carezyme^的活性位点，以80mM的终浓度加入Cellobiose(Sigma，C7292)，相当于以5.000倍的摩尔数超出。在有Cellobiose的条件下N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化的mPEG5.000与Carezyme^缀合，并按上文所述方法对所得产物进行鉴定。该衍生物的表观分子量为53-63kDa，相当于每摩尔Carezyme^结合2-4摩尔PEG。该衍生物保留100％的残余活性。

例21

纤维素酶与N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化的mPEG15.000的缀合

将20mg Carezyme^和54.3mg按例3方法用N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化的mPEG15.000一起放入1ml 0.1M硼酸盐，1mM CaCl₂，pH10.0中，在室温下温育3小时。加入18μl 2M甘氨酸终止反应，并通过大小排阻层析(Superdex 200)纯化该衍生物。

与亲代Carezyme^相比，修饰的Carezyme^保留了66％左右的残余酶活性。

例22

大鼠气管内(IT)试验

分别用修饰的枯草蛋白酶Novo、Lipolase^，Polyporus pinsitus漆酶和Carezyme^对棕色挪威大鼠进行气管内(IT)刺激，所有的酶均以上述方式与N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化的mPEG15.000缀合，并以相应的亲代酶为对照。

在一种特异IgE ELISA中测验来自免疫动物的血清(如上文所述)，以验证所述分子是否已渗透过肺上皮细胞并激活了免疫应答系统，产生特异的IgE反应(见图2，3，4和5)。

如图所示，与用亲代酶进行气管内刺激的大鼠相比，用修饰的酶进行气管内刺激的大鼠的反应减弱。

对本领域技术人员来说，显而易见的是，在以上说明的提示，在不脱离本发明的实质或范围的前提下实施本发明时可对本发明进行多种改变和改进。因此，本发明的范围是由所附的权利要求书限定的。

Claims

1.一种具有减弱的变应原性的修饰多肽，它包括与分子量在1-60kDa之间的聚合物缀合的分子量在5-100kDa之间的亲代多肽。

2.如权利要求1的修饰多肽，其中，所述多肽是一种蛋白质，特别是具有抗微生物活性或催化活性的蛋白质。

3.如权利要求2的修饰多肽，其中，所述多肽是一种酶。

4.如权利要求3的修饰多肽，其中，所述酶选自包括蛋白酶、脂酶、氧化还原酶、糖酶、转移酶、植酸酶的一组酶。

5.如权利要求1的修饰多肽，其中，所述聚合物选自下列一组聚合物：聚亚烷基氧化物(PAO)，如聚亚烷基二醇(PAG)，包括聚乙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(mPEG)和聚丙二醇，PEG缩水甘油醚(Epox-PEG)，PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)，Star-PEGs，Branced PEGs，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚-D，L-氨基酸，葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖，纤维素，包括甲基纤维素，羧甲基纤维素，乙基纤维素，羟乙基纤维素，羧乙基纤维素和羟丙基纤维素，脱乙酰壳多糖的水解产物，淀粉，如羟乙基淀粉和羟丙基淀粉，糖原，琼脂糖及其衍生物，瓜耳胶，支链淀粉，菊粉，呫吨胶，角叉菜胶，果胶，藻酸水解产物和生物聚合物。

6.如权利要求5的修饰蛋白酶，其中，所述聚合物是聚乙二醇(PEG)，特别是甲氧基聚乙二醇。

7.如权利要求5和6的修饰蛋白酶，其中，所述聚合物的分子量(Mr)在1-60kDa之间，优选为2-35kDa，特别是在2-25kDa之间。

8.如权利要求1-7中任一项的修饰蛋白酶，其中，所述缀合物的分子量范围为50-500kDa，优选为50-400kDa，50-250kDa更好，特别是100-250kDa，如80-200kDa。

9.一种用于生产权利要求1-8中任一项的具有减弱的变应原性的多肽的方法，包括将亲代蛋白酶同1-30个聚合物分子，尤其是1-25个分子，如1-10个聚合物分子聚合的步骤。

10.如权利要求9的方法，其中，所述亲代蛋白酶与2-15个聚合物分子缀合。

11.一种根据权利要求9和10的用于生产多肽的方法，其中，所述亲代多肽的分子量在10-100kDa之间。

12.一种根据权利要求10和11的用于生产多肽的方法，其中，所述活化聚合物与一种分子量在1-60kDa之间的活化聚合物反应。

13.一种根据权利要求9-12中任一项的用于生产多肽的方法，其中，所述亲代多肽与一种活化聚合物反应。

14.一种组合物，包括权利要求1-8中任一项的多肽，还包括其它多肽、蛋白或酶和/或常用成分，所述常用成分用于包括皂条在内的洗涤剂、家用物品、农用化学品、个人护理用品，包括用于隐形眼镜的清洗制剂和皮肤及头发清洗制剂，润肤剂、化妆品、口腔及皮肤用药物，用于处理织物的组合物，和用于生产食品和饲料的组合物。

15.如权利要求14的组合物，包括选自蛋白酶、脂酶、氧化还原酶、糖酶、转移酶，如转谷氨酰胺酶、抗微生物多肽和植酸酶中的至少一种多肽或酶。

16.将权利要求1-8的具有减弱的变应原性的多肽或其如权利要求14和15的组合物用于减弱含有多肽的工业应用的产品的变应原性的用途。

17.如权利要求16的用途，用于个人护理用品中。

18.如权利要求17的用途，用于头发护理或处理用品中。

19.如权利要求18的用途，用于洗发水、香脂、护发素、卷发组合物、染发组合物、生发油、发液、发油、洗发水、润丝剂、喷发剂。

20.如权利要求17的用途，用于口腔护理用品。

21.如权利要求20的用途，用于牙粉、濑口水、口香胶。

22.如权利要求17的用途，用于皮肤护理品。

23.如权利要求22的用途，用于护肤油、护肤乳、清洁霜、清洗液、清洁乳、冷霜、霜皂、营养香精、皮肤洗液、乳状洗液、芦甘石洗液、护手霜、皂粉、透明皂、防晒油、防晒霜、剃须泡沫、剃须膏、和婴儿用油。

24.如权利要求17的用途，用于润肤剂中。

25.如权利要求24的用途，用于口红、唇膏、乳状粉底、面部用粉、粉状眼影、粉、粉底、化妆底霜、香粉、增白粉。

26.如权利要求16的用途，用于隐形眼镜的卫生用品。

27.如权利要求26的用途，用于隐形眼镜的清洗及消毒用品。

28.如权利要求16的用途，用于洗涤剂中。

29.如权利要求28的用途，用于洗洁粉中。

30.如权利要求28的用途，用于液体洗涤剂中。

31.如权利要求28的用途，用于洗碟用洗涤剂中。

32.如权利要求28的用途，用于皂、皂条、液体皂中。

33.如权利要求16的用途，用于口腔及皮肤用药物。

34.如权利要求16的用途，用于农用化学品中。

35.如权利要求16的用途，用于食品或饲料中。

36.如权利要求35的用途，用于焙烤制品。

37.如权利要求16的用途，用于处理织物用产品中。

38.如权利要求16的用途，用于清洗硬表面用的组合物中。