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CN116194818A - 观察装置和观察方法 - Google Patents

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CN116194818A
CN116194818A CN202180062034.1A CN202180062034A CN116194818A CN 116194818 A CN116194818 A CN 116194818A CN 202180062034 A CN202180062034 A CN 202180062034A CN 116194818 A CN116194818 A CN 116194818A
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light
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安彦修
竹内康造
山田秀直
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Hamamatsu Photonics KK
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Abstract

观察装置(1A)包括光源(11)、镜(22)、聚光透镜(24)、物镜(25)、分束器(41)、摄像部(43)和解析部(50)。解析部(50)包括干涉强度图像取得部(51)、第1复振幅图像生成部(52)、第2复振幅图像生成部(53)、2维相位图像生成部(54)、3维相位图像生成部(55)和折射率分布计算部(56)。解析部(50)通过使镜(22)的反射面的方位变化而对观察对象物(S)沿多个光照射方向分别照射光，关于多个光照射方向的各个从摄像部(43)取得基准位置上的干涉强度图像，通过基于这些干涉强度图像进行所需的处理来求取观察对象物的3维折射率分布。由此，能够实现降低了多重散射光的影响的3维折射率层析成像。

Description

观察装置和观察方法
技术领域
本发明涉及观察装置和观察方法。
背景技术
近年来，制作被称为球状体或类器官的3维的细胞组织的技术正在进展。此外，将这些3维细胞组织应用于药物研发和再生医疗等的研究正在进行。这些3维细胞组织是光学上透明的多重散射体。作为将这样的光学上透明的散射体成像的技术，迄今为止提出有多种多样的方法。其中作为使用荧光探针的成像技术，可列举共聚焦显微镜、多光子显微镜、光片显微镜。另一方面，作为不使用荧光探针的无染色/无创的成像技术，已知有光学相干层析成像(Optical Coherence Tomography，OCT)等。
虽然对于球状体和类器官等那样的观察对象物多期望无染色/无创的成像，但是在这些观察对象物的成像中应用了OCT这样的报告例并不多。作为其理由，考虑利用OCT的成像的分辨率低，和通过利用OCT的成像获得的信号的解释较难。因此，在当前时点，可以说还未确立能够成为黄金标准的无染色的3维细胞组织的成像技术。
作为能够以无染色/无创对观察对象物的光路长度进行成像的技术，还已知有定量相位成像(Quantitative Phase Imaging，QPI)。QPI因为能够取得观察对象物(例如细胞)的光路长度这一物理信息，在生物领域正在应用。使用利用QPI取得图像，能够生成微分干涉图像及相位差显微镜图像等其它种类的图像。QPI是能够取得信息量比较多的图像的技术，相较于现有的使用明场图像的解析，还被期待能够应用于高含量内容的解析中。此外，由于近年来的机器学习所致的图像识别精度的提高，使用无染色的成像技术的高含量内容的解析正被广泛研究，今后，期待多重散射体的无染色成像担负更重要的作用。但是，QPI因为取得的图像只不过是光路长度的向2维的投影，所以不能把握真的3维的构造。
此外，作为能够将观察对象物的光路长度无染色/无创地成像的技术，还已知有专利文献1中记载的光学衍射层析成像(Optical Diffraction Tomography，ODT)。ODT是使QPI向可3维成像的技术发展的技术，能够实现观察对象物的3维折射率层析成像。通过使用ODT进行细胞观察，能够进行细胞核和线粒体等细胞小器官的同定，此外，能够进行3维形态变化的追踪，期待能够进行比QPI更高含量内容的解析。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2017-219826号公报
非专利文献
非专利文献1：Sungsam Kang，et al，“Imaging deep within a scatteringmedium using collective accumulation of single-scattered waves，”NATUREPHOTONICS，Vol.9，pp.253-258(2015)。
发明内容
发明所要解决的问题
但是，现有的ODT虽然能够应用于由几个构成的细胞的观察，但在上述那样的3维细胞组织等多重散射体的观察中难以应用。这是因为，在现有的ODT中，在观察对象物产生的多重散射光多的情况下，所取得的图像中多重散射光的影响大幅显现。
光的散射是指由于光与对象物相互作用而光的行进方向被改变的现象。特别是在对象物的折射率的空间的不均匀性增大时，光在通过对象物的期间会与对象物多次相互作用。这样与对象物多次相互作用的光称为多重散射光。与此相对，与对象物仅相互作用一次的光称为单一散射光。已知多重散射光成为散斑的增大和单一散射-多重散射比(Single-scattering to Multi-scattering Ratio，SMR)的恶化的原因，成为测定的障碍。
散斑是在光在时间且空间上为相干时，由于多重散射光的干涉引起空间上强度或相位的大的变化而产生的。为了抑制散斑产生，使用输出时间或空间上为非相干的光的光源即可。例如，相位差显微镜等通常的明场显微镜通过使用卤素灯或发光二极管等在空间且时间上非相干的光源，取得无散斑的图像。
SMR的恶化是由于与单一散射光相比多重散射光更具支配性，单一散射光埋没在多重散射光中而产生的。当观察对象物越大而观察深度越深时，单一散射光的成分会指数函数地减少，另一方面，与此对照地多重散射光的成分会增大。单一散射光因为其散射方向与对象物的构造具有直接的对应关系，所以容易用于对象物的构造的测定。另一方面，多重散射光与对象物的构造的关系复杂，难以提取对象物的构造的信息。因此，已知在利用了单一散射光的成像技术中，在单一散射光被埋到多重散射光中时(即，当SMR恶化时)测定失败。
SMR恶化的抑制能够通过选择性地检测单一散射光和多重散射光中的单一散射光的被称为选通的技术实现。因为通过选通抑制多重散射光，所以还能够在抑制SMR恶化的同时抑制散斑。选通使用空间、时间和偏振光等的自由度实现。共焦点显微镜是空间的选通的一个例子。OCT是时间和空间的选通的一个例子。
现有的ODT由于未除去多重散射光的影响，所以在观察对象物产生的多重散射光多的情况下，在取得的图像中散斑增大，此外，SMR恶化。因此，现有的ODT虽然能够应用于多重散射光的产生少的由几个构成的细胞的观察，但是难以应用于多重散射光的产生多的3维细胞组织等多重散射体的观察。
本发明是为了解决上述问题而完成的，其目的在于，提供即使在观察对象物为多重散射体的情况下，也能够实现降低了多重散射光的影响的3维折射率层析成像的观察装置和观察方法。
解决问题的技术手段
本发明的第1方式为观察装置。观察装置包括：(1)干涉强度图像取得部，其关于多个光照射方向的各个取得沿多个光照射方向的各个对观察对象物照射并经过了观察对象物的光与参照光的干涉所引起的基准位置的干涉强度图像；(2)第1复振幅图像生成部，其关于多个光照射方向的各个，基于基准位置的干涉强度图像生成基准位置的复振幅图像；和(3)2维相位图像生成部，其基于多个光照射方向各自的复振幅图像生成2维相位图像。
本发明的第2方式为观察方法。观察方法包括：(1)关于多个光照射方向的各个取得沿多个光照射方向的各个对观察对象物照射并经过了观察对象物的光与参照光的干涉所引起的基准位置的干涉强度图像的干涉强度图像取得步骤；(2)关于多个光照射方向的各个，基于基准位置的干涉强度图像生成基准位置的复振幅图像的第1复振幅图像生成步骤；和(3)基于多个光照射方向各自的复振幅图像生成2维相位图像的2维相位图像生成步骤。
本发明的第3方式为程序，该程序用于使计算机执行上述的观察方法的各步骤。本发明的第4方式为存储介质，该存储介质是存储了上述的程序的计算机可读取的存储介质。
发明的效果
根据本发明的各方式，即使在观察对象物为多重散射体的情况下，也能够实现降低了多重散射光的影响的3维折射率层析成像。
附图说明
图1是表示观察装置1A的结构的图。
图2是表示观察装置1B的结构的图。
图3是观察方法的流程图。
图4(a)～(c)是表示干涉强度图像取得步骤S1中的向观察对象物S的光照射方向的扫描的例子的图。
图5是说明内核函数g的图。
图6是2维相位图像生成步骤S4的第1方式的流程图。
图7是在干涉强度图像取得步骤S1中取得的干涉强度图像(垂直照射时)。
图8是在第1复振幅图像生成步骤S2中基于干涉强度图像(图7)生成的复振幅图像(实部，z＝0)。
图9是在第2复振幅图像生成步骤S3中基于复振幅图像(图8)生成的复振幅图像(实部，z＝10μm)。
图10是在2维相位图像生成步骤S4中的步骤S11中基于复振幅图像(图9)生成的复振幅总和图像(实部)。
图11是在2维相位图像生成步骤S4中的步骤S12中基于复振幅总和图像(图10)生成的2维相位图像。
图12是在折射率分布计算步骤S6中获得的3维折射率分布的某个z位置处的图像。
图13是2维相位图像生成步骤S4的第2方式的流程图。
图14是在干涉强度图像取得步骤S1中取得的干涉强度图像(垂直照射时)。
图15是在第1复振幅图像生成步骤S2中基于干涉强度图像(图14)生成的复振幅图像(实部，z＝0)。
图16是在第2复振幅图像生成步骤S3中基于复振幅图像(图15)生成的复振幅图像(实部，z＝20μm)。
图17是在2维相位图像生成步骤S4中的步骤S21中基于复振幅图像(图16)生成的复微分干涉图像(关于上下方向错切和左右方向错切的各个，实部和虚部)。
图18是表示在2维相位图像生成步骤S4中的步骤S21中生成的复微分干涉图像(图17)的总和的图像(关于上下方向错切和左右方向错切的各个，实部和虚部)。
图19是在2维相位图像生成步骤S4中的步骤S22中基于表示复微分干涉图像的总和的图像(图18)生成的相位微分图像(上下方向错切和左右方向错切)。
图20是在2维相位图像生成步骤S4中的步骤S23中基于相位微分图像(图19)生成的2维相位图像。
图21是在折射率分布计算步骤S6中获得的3维折射率分布的某个z位置处的图像。
图22是2维相位图像生成步骤S4的第3方式的流程图。
图23是在干涉强度图像取得步骤S1中取得的干涉强度图像(垂直照射时)。
图24是在第1复振幅图像生成步骤S2中基于干涉强度图像(图23)生成的复振幅图像(实部，z＝0)。
图25是在第2复振幅图像生成步骤S3中基于复振幅图像(图24)生成的复振幅图像(实部，z＝20μm)。
图26是在2维相位图像生成步骤S4中的步骤S31中基于复振幅图像(图25)生成的复振幅总和图像。
图27是在2维相位图像生成步骤S4中的步骤S34中生成的2维相位图像。
图28是在折射率分布计算步骤S6中获得的3维折射率分布的某个z位置处的图像。
图29是说明内核函数的图。
图30是表示观察装置1C的结构的图。
图31(a)、(b)是表示干涉强度图像取得步骤S1中的向观察对象物S的光照射方向的扫描的例子的图。
图32(a)～(c)是表示干涉强度图像取得步骤S1中的向观察对象物S的光照射方向的扫描的例子的图。
具体实施方式
以下，参照附图，详细地说明用于实施本发明的方式。另外，在附图的说明中对相同的要素标注相同的符号，省略重复的说明。本发明并不限定于这些例示，意图包含由权利要求书表示且与权利要求书等同的含义和范围内的所有变更。
图1是表示观察装置1A的结构的图。该观察装置1A包括光源11、透镜12、透镜21、镜22、透镜23、聚光透镜24、物镜25、分束器41、透镜42、摄像部43和解析部50等。
光源11输出在空间上/时间上相干的光，优选为激光光源。透镜12与光源11光学连接，将从光源11输出的光聚光于光纤14的光入射端13，使该光向光入射端13入射。光纤14将由透镜12入射于光入射端13的光向光纤耦合器15导光。光纤耦合器15在光纤14与光纤16、17之间将光耦合，将由光纤14导光而到达的光分为2支，使一个分支光由光纤16导光，使另一个分支光由光纤17导光。由光纤16导光的光从光出射端18作为发散光出射。由光纤17导光的光从光出射端19作为发散光出射。
透镜21与光出射端18光学连接，对从光出射端18作为发散光输出的光进行准直。镜22与透镜21光学连接，使从透镜21到达的光向透镜23反射。镜22的反射面的方位可变。透镜23与镜22光学连接。聚光透镜24与透镜23光学连接。透镜23和聚光透镜24优选地构成4f光学系统。透镜23和聚光透镜24从与镜22的反射面的方位相应的光照射方向对观察对象物S照射光。物镜25与聚光透镜24光学连接。在物镜25与聚光透镜24之间配置观察对象物S。物镜25输入从聚光透镜24输出并经过了观察对象物S的光(物体光)，将该光向分束器41输出。
分束器41与物镜25光学连接，此外，还与光出射端19光学连接。分束器41将从物镜25输出而到达的光(物体光)与从光出射端19输出而到达的光(参照光)合波，将两光向透镜42输出。透镜42与分束器41光学连接，对从分束器41到达的物体光和参照光分别进行准直而向摄像部43输出。摄像部43与透镜42光学连接，拍摄从透镜42到达的物体光与参照光的干涉所引起的干涉条纹像(干涉强度图像)。相对于向摄像部43的摄像面的物体光的入射方向、参照光的入射方向倾斜。物体光与参照光由分束器41合波的位置也可以相较于成像透镜为后级，但考虑到像差的影响时，优选如图所示为物镜25与透镜42之间。
解析部50与摄像部43电连接，输入由摄像部43拍摄的干涉强度图像。解析部50通过对该输入的干涉强度图像进行处理，计算观察对象物S的3维折射率分布。解析部50也可以为计算机。解析部50包括干涉强度图像取得部51、第1复振幅图像生成部52、第2复振幅图像生成部53、2维相位图像生成部54、3维相位图像生成部55、折射率分布计算部56、显示部57和存储部58。
干涉强度图像取得部51通过使镜22的反射面的方位变化，使光沿多个光照射方向的各个对观察对象物S照射。此外，干涉强度图像取得部51从摄像部43关于多个光照射方向的各个取得基准位置上的干涉强度图像。干涉强度图像取得部51包含CPU，具有输出用于使镜22的反射面的方位变化的控制信号的输出端口，此外，具有从摄像部43输入干涉强度图像的输入端口。不需要使物镜25沿光轴方向移动。基准位置是相对于摄像部43的摄像面处于共轭关系的像面位置。
第1复振幅图像生成部52、第2复振幅图像生成部53、2维相位图像生成部54、3维相位图像生成部55和折射率分布计算部56基于干涉强度图像进行处理，包括CPU、DSP或FPGA等处理装置。显示部57显示应该处理的图像、处理途中的图像和处理后的图像等，例如包括液晶显示器。存储部58存储各种图像的数据，包括硬盘驱动器、闪存、RAM和ROM等。第1复振幅图像生成部52、第2复振幅图像生成部53、2维相位图像生成部54、3维相位图像生成部55、折射率分布计算部56和存储部58也可以由云计算构成。
存储部58还存储用于使干涉强度图像取得部51、第1复振幅图像生成部52、第2复振幅图像生成部53、2维相位图像生成部54、3维相位图像生成部55和折射率分布计算部56执行各处理的程序。该程序既可以在观察装置1A的制造时或出厂时存储在存储部58，也可以在存储部58存储出厂后经由通信线路取得的内容，还可以在存储部58存储计算机可读取的存储介质2中存储的内容。存储介质2为软盘、CD-ROM、DVD-ROM、BD-ROM、USB存储器等任意的介质。
干涉强度图像取得部51、第1复振幅图像生成部52、第2复振幅图像生成部53、2维相位图像生成部54、3维相位图像生成部55和折射率分布计算部56各自的处理的详细情况在后面叙述。
图2是表示观察装置1B的结构的图。该图2所示的观察装置1B除了图1所示的观察装置1A的结构之外，还包括透镜31、镜32和透镜34等。
透镜31与光出射端19光学连接，对从光出射端19作为发散光输出的光(参照光)进行准直。镜32与透镜31光学连接，使从透镜31到达的光向透镜34反射。透镜34与镜32光学连接，将从镜32到达的光向分束器41输出。从透镜34输出的光在分束器41的跟前暂时聚光后，作为发散光向分束器41输入。分束器41将从物镜25输出而到达的光(物体光)与从透镜34输出而到达的光(参照光)合波，将两光同轴地向透镜42输出。摄像部43拍摄从透镜42到达的物体光与参照光的干涉所引起的干涉条纹像(干涉强度图像)。相对于向摄像部43的摄像面的物体光的入射方向、参照光的入射方向平行。
驱动部33使镜32向与镜32的反射面垂直的方向移动。驱动部33例如是压电致动器。通过该镜32的移动，使从光纤耦合器15中的光分支至分束器41中的合波为止的物体光和参照光各自的光路长度的差(相位差)变化。当该光路长度差不同时，由摄像部43拍摄的干涉强度图像也不同。
图3是观察方法的流程图。该观察方法在使用观察装置1A(图1)和观察装置1B(图2)的任一装置的情况下均能够实现。该观察方法包括干涉强度图像取得步骤S1、第1复振幅图像生成步骤S2、第2复振幅图像生成步骤S3、2维相位图像生成步骤S4、3维相位图像生成步骤S5和折射率分布计算步骤S6。
干涉强度图像取得步骤S1的处理由干涉强度图像取得部51进行。第1复振幅图像生成步骤S2的处理由第1复振幅图像生成部52进行。第2复振幅图像生成步骤S3的处理由第2复振幅图像生成部53进行。2维相位图像生成步骤S4的处理由2维相位图像生成部54进行。3维相位图像生成步骤S5的处理由3维相位图像生成部55进行。折射率分布计算步骤S6的处理由折射率分布计算部56进行。
在干涉强度图像取得步骤S1中，干涉强度图像取得部51使镜22的反射面的方位变化，由此使光沿多个光照射方向的各个对观察对象物S照射。然后，干涉强度图像取得部51从摄像部43关于多个光照射方向的各个取得基准位置上的干涉强度图像。
图1中和图2中为了便于说明表示xyz直角坐标系。z轴与物镜25的光轴平行。基准位置是相对于摄像部43的摄像面处于共轭关系的像面位置。令该位置为z＝0。向观察对象物S的光照射方向能够由该照射光的波数矢量(kx，ky，kz)中的kx和ky表示。
图4(a)～(c)是表示干涉强度图像取得步骤S1中的向观察对象物S的光照射方向的扫描的例子的图。在该图中，令横轴为kx且令纵轴为ky的kxky平面中各个圆圈的位置表示光照射方向。光照射方向的扫描既可以是如图4(a)所示在kxky平面上配置为矩形栅格状那样的扫描，也可以是如图4(b)所示在kxky平面上配置于同心的多个圆各自的圆周上那样的扫描，此外，还可以是如图4(c)所示在kxky平面上呈螺旋状配置那样的扫描。无论在哪种情况下，只要聚光透镜24的NA允许就能够进行光照射方向的扫描。也可以为光栅扫描和随机扫描的任一者。在光栅扫描的情况下，既可以有返回扫描也可以没有。
在第1复振幅图像生成步骤S2中，第1复振幅图像生成部52关于多个光照射方向的各个，基于由干涉强度图像取得部51取得的基准位置的干涉强度图像，生成基准位置的复振幅图像。在观察装置1A(图1)的情况下，第1复振幅图像生成部52能够利用傅里叶条纹解析法，基于1个干涉强度图像生成复振幅图像。在观察装置1B(图2)的情况下，第1复振幅图像生成部52能够利用相移法，基于物体光与参照光之间的光路长度差(相位差)相互不同的3个以上干涉强度图像生成复振幅图像。
在第2复振幅图像生成步骤S3中，第2复振幅图像生成部53关于多个光照射方向的各个，基于由第1复振幅图像生成部52生成的基准位置(z＝0)的复振幅图像，生成多个z方向位置各自的复振幅图像。当令基准位置的复振幅图像u(x，y，0)的2维傅里叶变换为U(kx，ky，0)时，z＝d的位置的复振幅图像u(x，y，d)和该复振幅图像u(x，y，d)的2维傅里叶变换U(kx，ky，d)以下述式表示。i是虚数单位，k0是观察对象物中的光的波数。
[数1]
Figure BDA0004117300060000101
[数2]
u(x，y，d)＝∫U(kx，ky，d)exp(-ikxx-ikyy)dkxdky (2)
在2维相位图像生成步骤S4中，2维相位图像生成部54关于多个位置的各个，基于由第2复振幅图像生成部53生成的多个光照射方向各自的复振幅图像，生成2维相位图像。此处生成的2维相位图像相当于以对准了焦点的z方向位置为中心的相位图像。2维相位图像生成步骤S4的详细情况在后面叙述。
另外，在第2复振幅图像生成步骤S3中关于多个光照射方向的各个全部生成多个位置各自的复振幅图像后，也可以进行2维相位图像生成步骤S4以后的处理。此外，也可以在第2复振幅图像生成步骤S3中关于多个光照射方向的各个生成某1个z方向位置的复振幅图像，以在2维相位图像生成步骤S4中生成该位置的2维相位图像的处理为单位，扫描z方向位置并重复进行该单位处理。在后者的情况下，能够降低存储部58应该存储的图像数据的容量，因此优选。
在3维相位图像生成步骤S5中，3维相位图像生成部55基于由2维相位图像生成部54生成的多个位置各自的2维相位图像生成3维相位图像。此处生成的3维相位图像是以2维相位图像中的位置x、y和该2维相位图像的位置z为变量的图像。
在折射率分布计算步骤S6中，折射率分布计算部56基于由3维相位图像生成部55生成的3维相位图像，通过解卷积求取观察对象物的3维折射率分布。当令观察对象物的折射率分布为n(x，y，z)，令电感受率分布为f(x，y，z)，令背景的介质的折射率为nm时，两者之间存在下述(3)式的关系。由3维相位图像生成部55生成的3维相位图像Φ(x，y，z)如下述(4)式那样，以内核函数g(x，y，z)与电感受率分布f(x，y，z)的卷积表示。因此，观察对象物的3维折射率分布n(x，y，z)能够基于3维相位图像Φ(x，y，z)通过解卷积求取。
[数3]
Figure BDA0004117300060000111
[数4]
Φ(x，y，z)＝∫g(x-x′，y-y′，z-z′)f(x′，y′，z′)dx′dy′dz′ (4)
另外，内核函数g基于与波动方程式的解对应的格林函数。图5是说明内核函数g的图。在该图中，内核函数g的值最大的中心位置是原点，纵方向为z轴，横方向是与z轴垂直的方向。
接着，说明2维相位图像生成步骤S4的详细情况。在2维相位图像生成步骤S4中，2维相位图像生成部54关于多个位置的各个，基于由第2复振幅图像生成部53生成的多个光照射方向各自的复振幅图像生成2维相位图像。2维相位图像生成步骤S4能够为以下说明的3个方式。
图6是2维相位图像生成步骤S4的第1方式的流程图。在该第1方式中，2维相位图像生成步骤S4关于多个位置的各个，在步骤S11中，基于光照射方向校正多个光照射方向各自的复振幅图像的相位后，生成表示这些校正后的复振幅图像的总和的复振幅总和图像，在步骤S12中，基于该复振幅总和图像生成2维相位图像。
步骤S11的处理基于非专利文献1中记载的CASS(Collective Accumulation ofSingle Scattering(单次散射的集体积累))技术。沿某个光照射方向对对象物照射并经过了该对象物的光中，与对象物仅相互作用了一次的单一散射光的空间频率分布根据光照射方向偏移，相对于此，与对象物多次相互作用后的多重散射光的空间频率分布根据光照射方向不规则地变化。CASS技术利用这样的单一散射光和多重散射光各自的空间频率分布的光照射方向依赖性的差异。
即，在步骤S11中，基于光照射方向校正多个光照射方向各自的复振幅图像的相位(即，在空间频率区域中使复振幅图像的空间频率分布根据光照射方向平行移动)，由此，使复振幅图像中的单一散射光成分的空间频率分布为不依赖于光照射方向的形状和配置，另一方面，使复振幅图像中的多重散射光成分的空间频率分布为不规则的形状和配置。然后，在步骤S11中，通过生成表示这些校正后的多个复振幅图像的总和的复振幅总和图像(即，合成开口处理)，将复振幅图像中的单一散射光成分加到相干性，另一方面，使复振幅图像中的多重散射光成分相互抵消。
因此，在步骤S11中生成的复振幅总和图像降低了多重散射光的影响。于是，最终在折射率分布计算步骤S6中获得的3维折射率分布也降低了多重散射光的影响，抑制了散斑且SMR得到改善。
图7～图12是表示2维相位图像生成步骤S4的第1方式的情况下在各步骤中获得的图像的例子的图。这些图像是基于使用观察装置1A(图1)的傅里叶条纹解析法获得的图像。图7是在干涉强度图像取得步骤S1中取得的干涉强度图像(垂直照射时)。图8是在第1复振幅图像生成步骤S2中基于干涉强度图像(图7)生成的复振幅图像(实部，z＝0)。图9是在第2复振幅图像生成步骤S3中基于复振幅图像(图8)生成的复振幅图像(实部，z＝10μm)。
图10是在2维相位图像生成步骤S4中的步骤S11中基于复振幅图像(图9)生成的复振幅总和图像(实部)。图11是在2维相位图像生成步骤S4中的步骤S12中基于复振幅总和图像(图10)生成的2维相位图像。图12是在折射率分布计算步骤S6中获得的3维折射率分布的某个z位置上的图像。这样，所获得的3维折射率分布降低了多重散射光的影响，抑制了散斑，SMR得到改善。
图13是2维相位图像生成步骤S4的第2方式的流程图。在该第2方式中，2维相位图像生成步骤S4关于多个位置的各个，在步骤S21中，基于多个光照射方向各自的复振幅图像生成多个光照射方向各自的复微分干涉图像，在步骤S22中，基于多个光照射方向各自的复微分干涉图像的总和生成相位微分图像，在步骤S23中，基于相位微分图像生成2维相位图像。
当令z＝d的位置的复振幅图像为u(x，y，d)时，在步骤S21中生成的复微分干涉图像q(x，y，d)以下述(5)式表示。δx和δy中的至少一者不是0。如果δx≠0，δy＝0，则得到以x方向为错切(shear)方向的复微分干涉图像q。如果δx＝0，δy≠0，则得到以y方向为错切方向的复微分干涉图像q。如果δx≠0，δy≠0，则得到以与x方向和y方向均不同的方向为错切方向的复微分干涉图像q。
[数5]
q(x，y，d)＝u*(x+δ，y+δy，d)·u(x，y，d) (5)
当令多个光照射方向各自的复微分干涉图像q的总和为qsum(x，y，d)时，在步骤S22中生成的相位微分图像φ(x，y，z)作为qsum(x，y，d)的相位以下述(6)式表示。在步骤S23中，能够通过对该相位微分图像φ(x，y，z)进行积分或解卷积，生成2维相位图像。
[数6]
φ(x，y，d)＝∠qsum(x，y，d) (6)
另外，在步骤S21中，也可以关于复振幅图像上的相互不同的多个错切方向的各个生成复微分干涉图像。在这种情况下，2维相位图像生成步骤S4关于多个位置的各个，在步骤S21中，基于多个光照射方向各自的复振幅图像，关于该图像上的相互不同的多个错切方向的各个生成多个光照射方向各自的复微分干涉图像，在步骤S22中，关于多个错切方向的各个，基于多个光照射方向各自的复微分干涉图像的总和生成相位微分图像，在步骤S23中，基于多个错切方向各自的相位微分图像生成2维相位图像。
在步骤S22中基于多个光照射方向各自的复微分干涉图像的总和生成的相位微分图像降低了多重散射光的影响。于是，最终在折射率分布计算步骤S6中获得的3维折射率分布也降低了多重散射光的影响，抑制了散斑。此外，在步骤S21中关于复振幅图像上的相互不同的多个错切方向的各个生成复微分干涉图像的情况下，能够抑制在步骤S23中获得的2维相位图像出现线状的噪声。
图14～图21是表示2维相位图像生成步骤S4的第2方式的情况下在各步骤中获得的图像的例子的图。这些图像是基于使用观察装置1A(图1)的傅里叶条纹解析法获得的图像。此外，在步骤S21中，关于复振幅图像上的相互不同的2个错切方向(上下方向错切和左右方向错切)的各个生成复微分干涉图像。图14是在干涉强度图像取得步骤S1中取得的干涉强度图像(垂直照射时)。图15是在第1复振幅图像生成步骤S2中基于干涉强度图像(图14)生成的复振幅图像(实部，z＝0)。图16是在第2复振幅图像生成步骤S3中基于复振幅图像(图15)生成的复振幅图像(实部，z＝20μm)。
图17是在2维相位图像生成步骤S4中的步骤S21中基于复振幅图像(图16)生成的复微分干涉图像(关于上下方向错切和左右方向错切的各个，实部和虚部)。图18是表示在2维相位图像生成步骤S4中的步骤S21中生成的复微分干涉图像(图17)的总和的图像(关于上下方向错切和左右方向错切的各个，实部和虚部)。图19是在2维相位图像生成步骤S4中的步骤S22中基于表示复微分干涉图像的总和的图像(图18)生成的相位微分图像(上下方向错切和左右方向错切)。图20是在2维相位图像生成步骤S4中的步骤S23中基于相位微分图像(图19)生成的2维相位图像。图21是在折射率分布计算步骤S6中获得的3维折射率分布的某个z位置处的图像。这样，所获得的3维折射率分布降低了多重散射光的影响，散斑得到抑制。
另外，此处，对通过在步骤S23中对相位微分图像进行积分或解卷积生成2维相位图像的情况进行了说明。但是，也能够将相位微分图像作为2维相位图像处理。在这种情况下，能够不进行步骤S23，而通过在折射率分布计算步骤S6的解卷积中使用包含步骤S23的解卷积中使用的内核的内核(图29)，从在步骤S22中生成的相位微分图像(2维相位图像)求取观察对象物的3维折射率分布。图29所示的内核通过将图5所示的内核与步骤S23的解卷积中使用的内核卷积积分而获得。
图22是2维相位图像生成步骤S4的第3方式的流程图。在该第3方式中，2维相位图像生成步骤S4关于多个位置的各个，在步骤S31中，将多个光照射方向各自的复振幅图像区分为多个批次(batch)，关于多个批次的各个，基于光照射方向校正该批次所包含的复振幅图像的相位后，生成表示这些校正后的复振幅图像的总和的复振幅总和图像，在步骤S32中，基于多个批次各自的复振幅总和图像生成多个批次各自的复微分干涉图像，在步骤S33中，基于多个批次各自的复微分干涉图像的总和生成相位微分图像，在步骤S34中，基于相位微分图像生成2维相位图像。
第3方式的步骤S31的处理相当于在将多个光照射方向各自的复振幅图像区分为多个批次后，关于多个批次的各个进行第1方式的步骤S11的处理。第3方式的步骤S32、S33的处理相当于关于多个批次的各个进行第2方式的步骤S21、S22的处理。第3方式的步骤S34的处理相当于进行第2方式的步骤S23的处理。
另外，也可以在步骤S32中，关于复振幅图像上的相互不同的多个错切方向的各个生成复微分干涉图像。在这种情况下，2维相位图像生成步骤S4在步骤S32中，基于多个批次各自的复振幅总和图像关于该图像上的相互不同的多个错切方向的各个生成多个批次各自的复微分干涉图像，在步骤S33中，关于多个错切方向的各个，基于多个批次各自的复微分干涉图像的总和生成相位微分图像，在步骤S34中，基于多个错切方向各自的相位微分图像生成2维相位图像。
第3方式中的散斑的抑制为与第1方式和第2方式相同程度。第3方式中的SMR的改善为第1方式与第2方式的中间的程度。
图23～图28是表示2维相位图像生成步骤S4的第3方式的情况下在各步骤中获得的图像的例子的图。这些图像是基于使用观察装置1A(图1)的傅里叶条纹解析法获得的图像。此外，在步骤S32中，关于复振幅图像上的相互不同的2个错切方向(上下方向错切和左右方向错切)的各个生成复微分干涉图像。图23是在干涉强度图像取得步骤S1中取得的干涉强度图像(垂直照射时)。图24是在第1复振幅图像生成步骤S2中基于干涉强度图像(图23)生成的复振幅图像(实部，z＝0)。
图25是在第2复振幅图像生成步骤S3中基于复振幅图像(图24)生成的复振幅图像(实部，z＝20μm)。图26是在2维相位图像生成步骤S4中的步骤S31中基于复振幅图像(图25)生成的复振幅总和图像。图27是在2维相位图像生成步骤S4中的步骤S34中生成的2维相位图像。图28是在折射率分布计算步骤S6中获得的3维折射率分布的某个z位置处的图像。这样，所获得的3维折射率分布降低了多重散射光的影响，抑制了散斑，SMR得到改善。
另外，此处，对通过在步骤S34中对相位微分图像进行积分或解卷积生成2维相位图像的情况进行了说明。但是，也能够将相位微分图像作为2维相位图像处理。在这种情况下，能够不进行步骤S34，而通过在折射率分布计算步骤S6的解卷积中使用包含步骤S34的解卷积中使用的内核的内核(图29)，从在步骤S33中生成的相位微分图像(2维相位图像)求取观察对象物的3维折射率分布。
对在第1方式的情况下获得的3维折射率分布的某个z位置处的图像(图12)、在第2方式的情况下获得的3维折射率分布的某个z位置处的图像(图21)与在第3方式的情况下获得的3维折射率分布的某个z位置处的图像(图28)进行比较时，虽然散斑抑制的效果为相同程度，但是与第2方式相比第3方式的SMR改善的效果更大，与第3方式相比第1方式的SMR改善的效果更大。
另外，优选在本实施方式中计算相位时，根据需要进行相位展开。
观察装置并不限定于上述实施方式和结构例，能够进行各种各样的变形。在观察装置1A(图1)和观察装置1B(图2)的结构中以透过了观察对象物S的光为物体光，但是也可以如以下说明的观察装置1C(图30)的结构那样以被观察对象物S反射后的光为物体光。
图30是表示观察装置1C的结构的图。观察装置1C包括光源11、透镜12、透镜21、镜22、透镜23、物镜25、分束器41、透镜42、摄像部43和解析部50等。以下，主要对与观察装置1A(图1)的不同点进行说明。
透镜21与光纤16的光出射端18光学连接，对从光出射端18作为发散光输出的光进行准直。镜22与透镜21光学连接，使从透镜21到达的光向透镜23反射。镜22的反射面的方位可变。透镜23与镜22光学连接。物镜25与透镜23光学连接。在透镜23与物镜25之间配置有分束器41。透镜23和物镜25优选地构成4f光学系统。透镜23和物镜25从与镜22的反射面的方位相应的光照射方向对观察对象物S照射光。物镜25输入在观察对象物S反射后的光(物体光)，将该光向分束器41输出。
分束器41与物镜25光学连接，此外，还与光纤17的光出射端19光学连接。分束器41将从物镜25输出而到达的光(物体光)与从光出射端19输出而到达的光(参照光)合波，将两光向透镜42输出。透镜42与分束器41光学连接，对从分束器41到达的物体光和参照光分别进行准直而向摄像部43输出。摄像部43与透镜42光学连接，拍摄从透镜42到达的物体光与参照光的干涉所引起的干涉条纹像(干涉强度图像)。相对于向摄像部43的摄像面的物体光的入射方向、参照光的入射方向倾斜。物体光与参照光由分束器41合波的位置也可以相较于成像透镜为后级，但考虑到像差的影响时，优选如图所示为物镜25与透镜42之间。
在观察装置1C(图30)的结构中，也可以与观察装置1B(图2)一样设置使参照光的光路长度变化的机构(图2中的透镜31、镜32、驱动部33和透镜34)，使从光纤耦合器15中的光分支至分束器41中的合波为止的物体光和参照光各自的光路长度的差(相位差)变化。在这种情况下，相对于向摄像部43的摄像面的物体光的入射方向，参照光的入射方向也可以平行。
此外，第1复振幅图像生成步骤S2、第2复振幅图像生成步骤S3、2维相位图像生成步骤S4、3维相位图像生成步骤S5和折射率分布计算步骤S6的各处理既可以在每次在干涉强度图像取得步骤S1中取得规定数的光照射方向各自的干涉强度图像时进行(图31)，也可以在每次在干涉强度图像取得步骤S1中取得1个光照射方向的干涉强度图像时进行(图32)。
图31和图32是表示干涉强度图像取得步骤S1中的向观察对象物S的光照射方向的扫描的例子的图。在这些图中，在令横轴为kx且令纵轴为ky的kxky平面上，各个圆圈的位置表示光照射方向。在这些图所示的光照射方向的扫描的例子中，依次变更光照射方向，使第(N+n)干涉强度图像取得时的光照射方向与第n干涉强度图像取得时的光照射方向一致。n为正的整数，N为2以上的整数。
在图31所示的例子中，当在干涉强度图像取得步骤S1中取得第1～第N干涉强度图像时，基于这些第1～第N干涉强度图像进行步骤S2～S6的各处理(图31(a))。接着，当在干涉强度图像取得步骤S1中取得第(N+1)～第2N干涉强度图像时，基于这些第(N+1)～第2N干涉强度图像进行步骤S2～S6的各处理(图31(b))。接着，当在干涉强度图像取得步骤S1中取得第(2N+1)～第3N干涉强度图像时，基于这些第(2N+1)～第3N干涉强度图像进行步骤S2～S6的各处理。之后也一样。
在图32所示的例子中，当在干涉强度图像取得步骤S1中取得第1～第N干涉强度图像时，基于这些第1～第N干涉强度图像进行步骤S2～S6的各处理(图32(a))。然后，当在干涉强度图像取得步骤S1中取得第(N+1)干涉强度图像时，基于包含该第(N+1)干涉强度图像的最近的N个干涉强度图像(第2～第(N+1)干涉强度图像)进行步骤S2～S6的各处理(图32(b))。接着，当在干涉强度图像取得步骤S1中取得第(N+2)干涉强度图像时，基于包含该第(N+2)干涉强度图像的最近的N个干涉强度图像(第3～第(N+2)干涉强度图像)进行步骤S2～S6的各处理(图32(c))。之后也一样，当在干涉强度图像取得步骤S1中取得第(N+n)干涉强度图像时，基于包含该第(N+n)干涉强度图像的最近的N个干涉强度图像(第(1+n)～第(N+n)干涉强度图像)进行步骤S2～S6的各处理。
与图31所示的例子进行比较时，在图32所示的例子中，在每次在干涉强度图像取得步骤S1中取得1个光照射方向的干涉强度图像时，基于包含该干涉强度图像的最近的多个干涉强度图像进行步骤S2～S6的各处理，因此通过步骤S2～S6的各处理，每单位时间获得的各图像的数量多。
上述实施方式的观察装置包括：(1)干涉强度图像取得部，其关于多个光照射方向的各个取得沿多个光照射方向的各个对观察对象物照射并经过了观察对象物的光与参照光的干涉所引起的基准位置的干涉强度图像；(2)第1复振幅图像生成部，其关于多个光照射方向的各个，基于基准位置的干涉强度图像生成基准位置的复振幅图像；和(3)2维相位图像生成部，其基于多个光照射方向各自的复振幅图像生成2维相位图像。
在一个方面中，2维相位图像生成部(a)在基于光照射方向校正多个光照射方向各自的复振幅图像的相位后，生成表示这些校正后的复振幅图像的总和的复振幅总和图像，(b)基于复振幅总和图像生成2维相位图像。
在另一个方面中，2维相位图像生成部(a)基于多个光照射方向各自的复振幅图像生成多个光照射方向各自的复微分干涉图像，(b)基于多个光照射方向各自的复微分干涉图像生成2维相位图像。此外，优选2维相位图像生成部(a)基于多个光照射方向各自的复振幅图像，关于该图像上的相互不同的多个错切方向的各个生成多个光照射方向各自的复微分干涉图像，(b)基于多个错切方向和多个光照射方向各自的复微分干涉图像生成2维相位图像。
在又一个方面中，2维相位图像生成部(a)将多个光照射方向各自的复振幅图像区分为多个批次，关于多个批次的各个，基于光照射方向校正该批次所包含的复振幅图像的相位后，生成表示这些校正后的复振幅图像的总和的复振幅总和图像，(b)基于多个批次各自的复振幅总和图像生成多个批次各自的复微分干涉图像，(c)基于多个批次各自的复微分干涉图像生成2维相位图像。此外，优选2维相位图像生成部(a)将多个光照射方向各自的复振幅图像区分为多个批次，关于多个批次的各个，基于光照射方向校正该批次所包含的复振幅图像的相位后，生成表示这些校正后的复振幅图像的总和的复振幅总和图像，(b)基于多个批次各自的复振幅总和图像，关于该图像上的相互不同的多个错切方向的各个生成多个批次各自的复微分干涉图像，(c)基于多个错切方向和多个批次各自的复微分干涉图像生成2维相位图像。
此外，在一个方面中，优选观察装置还包括：(4)第2复振幅图像生成部，其关于多个光照射方向的各个，基于由第1复振幅图像生成部生成的基准位置的复振幅图像生成多个位置各自的复振幅图像；(5)3维相位图像生成部，其基于由2维相位图像生成部生成的多个位置各自的2维相位图像生成3维相位图像；和(6)折射率分布计算部，其基于3维相位图像求取观察对象物的3维折射率分布。
上述实施方式的观察方法包括：(1)关于多个光照射方向的各个取得沿多个光照射方向的各个对观察对象物照射并经过了观察对象物的光与参照光的干涉所引起的基准位置的干涉强度图像的干涉强度图像取得步骤；(2)关于多个光照射方向的各个，基于基准位置的干涉强度图像生成基准位置的复振幅图像的第1复振幅图像生成步骤；和(3)基于多个光照射方向各自的复振幅图像生成2维相位图像的2维相位图像生成步骤。
在一个方面中，在2维相位图像生成步骤中，(a)在基于光照射方向校正多个光照射方向各自的复振幅图像的相位后，生成表示这些校正后的复振幅图像的总和的复振幅总和图像，(b)基于复振幅总和图像生成2维相位图像。
在另一个方面中，在2维相位图像生成步骤中，(a)基于多个光照射方向各自的复振幅图像生成多个光照射方向各自的复微分干涉图像，(b)基于多个光照射方向各自的复微分干涉图像生成2维相位图像。此外，优选在2维相位图像生成步骤中，(a)基于多个光照射方向各自的复振幅图像，关于该图像上的相互不同的多个错切方向的各个生成多个光照射方向各自的复微分干涉图像，(b)基于多个错切方向和多个光照射方向各自的复微分干涉图像生成2维相位图像。
在又一个方面中，在2维相位图像生成步骤中，(a)将多个光照射方向各自的复振幅图像区分为多个批次，关于多个批次的各个，基于光照射方向校正该批次所包含的复振幅图像的相位后，生成表示这些校正后的复振幅图像的总和的复振幅总和图像，(b)基于多个批次各自的复振幅总和图像生成多个批次各自的复微分干涉图像，(c)基于多个批次各自的复微分干涉图像生成2维相位图像。此外，优选在2维相位图像生成步骤中，(a)将多个光照射方向各自的复振幅图像区分为多个批次，关于多个批次的各个，基于光照射方向校正该批次所包含的复振幅图像的相位后，生成表示这些校正后的复振幅图像的总和的复振幅总和图像，(b)基于多个批次各自的复振幅总和图像，关于该图像上的相互不同的多个错切方向的各个，生成多个批次各自的复微分干涉图像，(c)基于多个错切方向和多个批次各自的复微分干涉图像生成2维相位图像。
此外，在一个方面中，优选观察方法还包括：(4)关于多个光照射方向的各个，基于在第1复振幅图像生成步骤中生成的基准位置的复振幅图像生成多个位置各自的复振幅图像的第2复振幅图像生成步骤；(5)基于在2维相位图像生成步骤中生成的多个位置各自的2维相位图像生成3维相位图像的3维相位图像生成步骤；和(6)基于3维相位图像求取观察对象物的3维折射率分布的折射率分布计算步骤。
上述实施方式的程序是用于使计算机执行上述观察方法的各步骤的程序。上述实施方式的存储介质是存储有上述的程序的计算机可读取的存储介质。
产业上的可利用性
本发明能够作为即使在观察对象物为多重散射体的情况下，也能够实现降低了多重散射光的影响的3维折射率层析成像的装置和方法来使用。
符号的说明
1A，1B…观察装置、2…存储介质、11…光源、12…透镜、13…光入射端、14…光纤、15…光纤耦合器、16，17…光纤、18，19…光出射端、21…透镜、22…镜、23…透镜、24…聚光透镜、25…物镜、31…透镜、32…镜、33…驱动部、34…透镜、41…分束器、42…透镜、43…摄像部、50…解析部、51…干涉强度图像取得部、52…第1复振幅图像生成部、53…第2复振幅图像生成部、54…2维相位图像生成部、55…3维相位图像生成部、56…折射率分布计算部、57…显示部、58…存储部。

Claims (14)

1.一种观察装置，其中，
包括：
干涉强度图像取得部，其关于多个光照射方向的各个取得沿所述多个光照射方向的各个对观察对象物照射并经过了所述观察对象物的光与参照光的干涉所引起的基准位置的干涉强度图像；
第1复振幅图像生成部，其关于所述多个光照射方向的各个，基于所述基准位置的所述干涉强度图像生成所述基准位置的复振幅图像；和
2维相位图像生成部，其基于所述多个光照射方向各自的所述复振幅图像生成2维相位图像，
所述2维相位图像生成部，
在基于光照射方向校正所述多个光照射方向各自的所述复振幅图像的相位后，生成表示这些校正后的复振幅图像的总和的复振幅总和图像，
基于所述复振幅总和图像生成所述2维相位图像。
2.一种观察装置，其中，
包括：
干涉强度图像取得部，其关于多个光照射方向的各个取得沿所述多个光照射方向的各个对观察对象物照射并经过了所述观察对象物的光与参照光的干涉所引起的基准位置的干涉强度图像；
第1复振幅图像生成部，其关于所述多个光照射方向的各个，基于所述基准位置的所述干涉强度图像生成所述基准位置的复振幅图像；和
2维相位图像生成部，其基于所述多个光照射方向各自的所述复振幅图像生成2维相位图像，
所述2维相位图像生成部，
基于所述多个光照射方向各自的所述复振幅图像生成所述多个光照射方向各自的复微分干涉图像，
基于所述多个光照射方向各自的所述复微分干涉图像生成所述2维相位图像。
3.如权利要求2所述的观察装置，其特征在于，
所述2维相位图像生成部，
基于所述多个光照射方向各自的所述复振幅图像，关于该图像上的相互不同的多个错切方向的各个，生成所述多个光照射方向各自的复微分干涉图像，
基于所述多个错切方向和所述多个光照射方向各自的所述复微分干涉图像生成所述2维相位图像。
4.一种观察装置，其中，
包括：
干涉强度图像取得部，其关于多个光照射方向的各个取得沿所述多个光照射方向的各个对观察对象物照射并经过了所述观察对象物的光与参照光的干涉所引起的基准位置的干涉强度图像；
第1复振幅图像生成部，其关于所述多个光照射方向的各个，基于所述基准位置的所述干涉强度图像生成所述基准位置的复振幅图像；和
2维相位图像生成部，其基于所述多个光照射方向各自的所述复振幅图像生成2维相位图像，
所述2维相位图像生成部，
将所述多个光照射方向各自的所述复振幅图像区分为多个批次，关于所述多个批次的各个，基于光照射方向校正该批次所包含的所述复振幅图像的相位后，生成表示这些校正后的复振幅图像的总和的复振幅总和图像，
基于所述多个批次各自的所述复振幅总和图像生成所述多个批次各自的复微分干涉图像，
基于所述多个批次各自的所述复微分干涉图像生成所述2维相位图像。
5.如权利要求4所述的观察装置，其中，
所述2维相位图像生成部，
将所述多个光照射方向各自的所述复振幅图像区分为多个批次，关于所述多个批次的各个，基于光照射方向校正该批次所包含的所述复振幅图像的相位后，生成表示这些校正后的复振幅图像的总和的复振幅总和图像，
基于所述多个批次各自的所述复振幅总和图像，关于该图像上的相互不同的多个错切方向的各个，生成所述多个批次各自的复微分干涉图像，
基于所述多个错切方向和所述多个批次各自的所述复微分干涉图像生成所述2维相位图像。
6.如权利要求1～5中的任一项所述的观察装置，其中，
还包括：
第2复振幅图像生成部，其关于所述多个光照射方向的各个，基于由所述第1复振幅图像生成部生成的所述基准位置的所述复振幅图像生成多个位置各自的复振幅图像；
3维相位图像生成部，其基于由所述2维相位图像生成部生成的所述多个位置各自的所述2维相位图像生成3维相位图像；和
折射率分布计算部，其基于所述3维相位图像求取所述观察对象物的3维折射率分布。
7.一种观察方法，其中，
包括：
关于多个光照射方向的各个取得沿所述多个光照射方向的各个对观察对象物照射并经过了所述观察对象物的光与参照光的干涉所引起的基准位置的干涉强度图像的干涉强度图像取得步骤；
关于所述多个光照射方向的各个，基于所述基准位置的所述干涉强度图像生成所述基准位置的复振幅图像的第1复振幅图像生成步骤；和
基于所述多个光照射方向各自的所述复振幅图像生成2维相位图像的2维相位图像生成步骤，
在所述2维相位图像生成步骤中，
在基于光照射方向校正所述多个光照射方向各自的所述复振幅图像的相位后，生成表示这些校正后的复振幅图像的总和的复振幅总和图像，
基于所述复振幅总和图像生成所述2维相位图像。
8.一种观察方法，其中，
包括：
关于多个光照射方向的各个取得沿所述多个光照射方向的各个对观察对象物照射并经过了所述观察对象物的光与参照光的干涉所引起的基准位置的干涉强度图像的干涉强度图像取得步骤；
关于所述多个光照射方向的各个，基于所述基准位置的所述干涉强度图像生成所述基准位置的复振幅图像的第1复振幅图像生成步骤；和
基于所述多个光照射方向各自的所述复振幅图像生成2维相位图像的2维相位图像生成步骤，
在所述2维相位图像生成步骤中，
基于所述多个光照射方向各自的所述复振幅图像生成所述多个光照射方向各自的复微分干涉图像，
基于所述多个光照射方向各自的所述复微分干涉图像生成所述2维相位图像。
9.如权利要求8所述的观察方法，其中，
在所述2维相位图像生成步骤中，
基于所述多个光照射方向各自的所述复振幅图像，关于该图像上的相互不同的多个错切方向的各个，生成所述多个光照射方向各自的复微分干涉图像，
基于所述多个错切方向和所述多个光照射方向各自的所述复微分干涉图像生成所述2维相位图像。
10.一种观察方法，其中，
包括：
关于多个光照射方向的各个取得沿所述多个光照射方向的各个对观察对象物照射并经过了所述观察对象物的光与参照光的干涉所引起的基准位置的干涉强度图像的干涉强度图像取得步骤；
关于所述多个光照射方向的各个，基于所述基准位置的所述干涉强度图像生成所述基准位置的复振幅图像的第1复振幅图像生成步骤；和
基于所述多个光照射方向各自的所述复振幅图像生成2维相位图像的2维相位图像生成步骤，
在所述2维相位图像生成步骤中，
将所述多个光照射方向各自的所述复振幅图像区分为多个批次，关于所述多个批次的各个，基于光照射方向校正该批次所包含的所述复振幅图像的相位后，生成表示这些校正后的复振幅图像的总和的复振幅总和图像，
基于所述多个批次各自的所述复振幅总和图像生成所述多个批次各自的复微分干涉图像，
基于所述多个批次各自的所述复微分干涉图像生成所述2维相位图像。
11.如权利要求10所述的观察方法，其中，
在所述2维相位图像生成步骤中，
将所述多个光照射方向各自的所述复振幅图像区分为多个批次，关于所述多个批次的各个，基于光照射方向校正该批次所包含的所述复振幅图像的相位后，生成表示这些校正后的复振幅图像的总和的复振幅总和图像，
基于所述多个批次各自的所述复振幅总和图像，关于该图像上的相互不同的多个错切方向的各个，生成所述多个批次各自的复微分干涉图像，
基于所述多个错切方向和所述多个批次各自的所述复微分干涉图像生成所述2维相位图像。
12.如权利要求7～11中的任一项所述的观察方法，其中，
还包括：
关于所述多个光照射方向的各个，基于在所述第1复振幅图像生成步骤中生成的所述基准位置的所述复振幅图像生成多个位置各自的复振幅图像的第2复振幅图像生成步骤；
基于在所述2维相位图像生成步骤中生成的所述多个位置各自的所述2维相位图像生成3维相位图像的3维相位图像生成步骤；和
基于所述3维相位图像求取所述观察对象物的3维折射率分布的折射率分布计算步骤。
13.一种程序，其中，
用于使计算机执行权利要求7～12中的任一项所述的观察方法的各步骤。
14.一种计算机可读取的存储介质，其中，
存储有权利要求13所述的程序。
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